治疗癌症
阅读：104发布：2020-05-11
专利汇可以提供治疗癌症专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于 治疗 癌症的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5或结合于直接或间接固定在载体上的Treg受体的一种或多种结合 试剂 ，从而从患者或受试者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5或Treg受体表达细胞。还描述了各种伴随诊断方法和有用的结合试剂。，下面是治疗癌症专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗癌症的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种结合试剂，因而从所述患者或受试者的所述外周血中除去一种或多种趋化因子受体，可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症治疗用来降低循环肿瘤细胞的水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述癌症治疗用来降低肿瘤转移的发生率。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是白血病。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述白血病选自慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的所述结合试剂分别是CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的激动剂或拮抗剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述趋化因子选自MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是MIP-3α(CCL20)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR6。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CCL19(MIP-3b)或
CCL21(SLC)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CCR7。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CXCL12(SDF-1a)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CXCR4。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CCL1(I-309)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR8。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CCR4，可选地其中所述趋化因子是MDC。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是白血病以及所述细胞是CCR7表达B细胞，或其中所述癌症可选地是PC或UBC以及所述细胞是CCR4表达调节性T细胞，或其中所述CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞选自肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR5、CCR6或CXCR4表达细胞是肿瘤细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述CXCR4表达细胞是肺肿瘤细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR7表达细胞是中央记忆T淋巴细胞。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR8或CCR4表达细胞是调节性T淋巴细胞。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，基于在获自所述患者或受试者的样品中检测到CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞中的一种或多种的水平增加，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5中的一种或多种的表达水平增加，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5中的一种或多种的高表达的细胞水平增加，选择所述患者或受试者以进行治疗。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单次治疗中，将约20-90%所述患者的血液施加于所述柱。
23.一种结合试剂，能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5，用于治疗癌症，其中所述结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对所述柱施加来自患者的外周血，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体，可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞。
24.根据权利要求23所述的结合试剂，其中，所述癌症治疗用来降低循环肿瘤细胞的水平。
25.根据权利要求23或24所述的结合试剂，其中，所述癌症治疗用来降低肿瘤转移的发生率。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的结合试剂，其中，所述癌症是白血病。
27.根据权利要求26所述的结合试剂，其中，所述白血病选自慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的所述结合试剂分别是所述CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的激动剂或拮抗剂。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
30.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子选自MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)。
31.根据权利要求30所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是MIP-3α(CCL20)，以及可选地所述趋化因子受体是CCR6。
32.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CCL19(MIP-3b)或CCL21(SLC)。
33.根据权利要求32所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CCR7。
34.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CXCL12(SDF-1a)。
35.根据权利要求23至29中任一项所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CXCR4。
36.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CCL1(I-309)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR8。
37.根据权利要求23至29中任一项所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CCR4，可选地其中所述趋化因子是MDC。
38.根据权利要求23至27中任一项所述的结合试剂，其中，所述癌症可选地是PC或UBC以及所述细胞是CCR4表达调节性T细胞，或其中所述CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞选自肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节淋巴细胞。
39.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR5、CCR6或CXCR4表达细胞是肿瘤细胞。
40.根据权利要求39所述的结合试剂，其中，所述CXCR4表达细胞是肺肿瘤细胞。
41.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR7表达细胞是中央记忆T淋巴细胞。
42.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR8或CCR4表达细胞是调节性T淋巴细胞。
43.根据权利要求23至42中任一项所述的结合试剂，其中，基于在获自所述患者的样品中检测到CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的水平增加，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的表达水平增加，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的高表达的细胞水平增加，选择所述患者以进行治疗。
44.根据权利要求23至43中任一项所述的结合试剂，其中，在单次治疗中，将20-90%所述患者的血液施加于所述柱。
45.一种用于诊断、监测癌症的进展、或监测癌症治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定：
a)趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平；
b)CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的表达水平；和/或
c)具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞水平，
其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达水平，或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的高水平，或与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的增加水平，与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的增加的表达水平，或与对照相比具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述癌症或癌症治疗选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。
47.根据权利要求45或46中任一项所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的较高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的较高表达水平，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，与更活动性的疾病相关。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的较低水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的较低表达水平，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的较低水平，与缺少活动性疾病或较低活动性疾病相关。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的降低水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的降低表达水平，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的高表达的细胞的降低水平，与成功治疗相关。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述治疗如在权利要求1至22中任一项所述。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的增加水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的增加表达水平，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表示疾病的进展。
53.一种用于选择癌症的适当治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定
a)趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平
b)CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的表达水平；和/或
c)具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞水平，
其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达水平，或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的高水平，或与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的增加水平，与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的增加表达水平，或与对照相比具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，导致选择如在权利要求1至22中任一项所限定的治疗，用于治疗所述癌症。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述治疗包括降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
56.一种用于治疗癌症的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在所述载体上的一种或多种调节性T细胞受体，尤其是皮肤淋巴细胞抗原(CLA)受体的一种或多种结合试剂，从而从所述患者的所述外周血中除去一种或多种调节性T细胞受体-表达细胞(Tregs)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述一种或多种受体包括趋化因子受体，可选地其中所述趋化因子受体包括CCR4和/或CCR8。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述癌症是胰腺癌或膀胱癌，可选地其中从所述患者的所述外周血中除去CCR4表达Tregs。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种结合试剂选自CCL17和CCL22(结合于CCR4)或CCL1(结合于CCR8)。
60.一种用于治疗白血病的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体的一种或多种结合试剂，所述趋化因子受体已被确定为连接于白血病，例如在白血病中被上调，直接或间接固定在所述载体上，因而从所述患者的所述外周血中除去一种或多种趋化因子受体表达细胞。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法，进一步结合根据权利要求1至55中任一项所述的特征。
62.一种加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体的结合试剂，以允许从患者的所述外周血中除去表达所述趋化因子受体的细胞，其中所述结合试剂不是趋化因子。
63.根据权利要求62所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂是所述趋化因子受体的激动剂或拮抗剂。
64.根据前述权利要求中任一项所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂选自抗体和化合物。
65.根据前述权利要求中任一项所述的柱，如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
66.一种用于治疗炎性病症的方法，包括将来自患者的外周血施加于如在权利要求62至65中任一项所限定的成分血分离柱，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
68.一种能够特异性地结合于趋化因子受体用于治疗炎性病症的结合试剂，其中，所述结合试剂固定在包含如在权利要求62至65中任一项所述的成分血分离柱内的固体载体上，对所述成分血分离柱施加来自患者的外周血，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
69.根据权利要求68所述的结合试剂，如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
70.一种修饰CCL8(MCP-2)趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
71.根据权利要求70所述的修饰CCL8趋化因子，其中，在SEQ ID NO:1的位置75处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
72.根据权利要求71所述的修饰CCL8趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的修饰CCL8趋化因子，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的修饰CCL8趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
75.一种修饰CCL5趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:6或4的氨基酸序列。
76.根据权利要求75所述的修饰CCL5趋化因子，其中，在位置67处的残基被生物素化。
77.根据权利要求75或76所述的修饰CCL5趋化因子，其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
78.根据权利要求75至77中任一项所述的修饰CCL5趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
79.一种修饰CCL20趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
80.根据权利要求79所述的修饰CCL20趋化因子，其中，在位置68处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
81.根据权利要求80所述的修饰CCL20趋化因子，其中，在SEQ ID NO:9的位置68处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
82.根据权利要求81所述的修饰CCL20趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的修饰CCL20趋化因子，其是CCR6活性的激动剂或拮抗剂。
84.一种截短的CXCL12趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
85.根据权利要求84所述的截短的CXCL12趋化因子，其中，在位置64处的残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
86.根据权利要求85所述的截短的CXCL12趋化因子，其中，在位置64处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的截短的CXCL12趋化因子，其是CXCR4和/或CXCR7活性的激动剂或拮抗剂。
88.一种修饰CCL22趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
89.根据权利要求88所述的修饰CCL22趋化因子，其中，在位置66处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
90.根据权利要求89所述的修饰CCL22趋化因子，其中，在位置66处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
91.根据权利要求90所述的修饰CCL22趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的修饰CCL22趋化因子，其是CCR4活性的激动剂或拮抗剂。
93.一种修饰CCL17趋化因子，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
94.根据权利要求93所述的修饰CCL17趋化因子，其中，在SEQ ID NO:16的位置72处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
95.根据权利要求93所述的修饰CCL17趋化因子，其中，在SEQ ID NO:16的位置72处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
96.根据权利要求95所述的修饰CCL17趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的修饰CCL17趋化因子，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的修饰CCL17趋化因子，其是CCR4活性的激动剂或拮抗剂。
99.一种修饰CCL19趋化因子，包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
100.根据权利要求99所述的修饰CCL19趋化因子，其中，在SEQ ID NO:19的位置78处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
101.根据权利要求100所述的修饰CCL19趋化因子，其中，在SEQ ID NO:19的位置78处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
102.根据权利要求101所述的修饰CCL19趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
103.根据权利要求99至102中任一项所述的修饰CCL19趋化因子，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
104.根据权利要求99至103中任一项所述的修饰CCL19趋化因子，其是CCR7活性的激动剂或拮抗剂。
105.一种修饰CXCL11趋化因子，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
106.根据权利要求105所述的修饰CXCL11趋化因子，其中，通过间隔基团添加在位置
74处的残基。
107.根据权利要求105或106所述的修饰趋化因子，其中，通过聚乙二醇(PEG)间隔基团添加在位置74处的残基。
108.一种修饰CXCL11趋化因子，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的修饰CXCL11趋化因子，其中，在位置74处的氨基酸残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
110.根据权利要求109所述的修饰CXCL11趋化因子，其中，生物素化是通过间隔基团。
111.根据权利要求105至110中任一项所述的修饰CXCL11趋化因子，其是CXCR7活性的激动剂或拮抗剂。
112.一种用于诊断、监测癌症的进展、或用于监测癌症治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定
a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平；
b)一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或
c)具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8，的高表达的细胞水平，其中，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。
113.根据权利要求112所述的方法，其中，所述癌症或癌症治疗选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
115.根据权利要求112至114中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的较高水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的较高表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，与更活动性的疾病相关。
116.根据权利要求112至115中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的低水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的低表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的低水平，与缺少活动性疾病或较低活动性疾病相关。
117.根据权利要求112至116中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的降低水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的降低表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的降低水平，与成功治疗相关。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述治疗如在权利要求1至22中任一项所述。
119.根据权利要求112至118中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的增加水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的增加表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表示疾病的进展。
120.一种用于选择癌症的适当治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定：
a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平b)一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或
c)具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平，其中，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，导致选择如在权利要求1至
22中任一项所限定的治疗，用于治疗所述癌症。
121.根据权利要求120所述的方法，其中，所述治疗包括降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病，慢性髓样白血病，用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。
122.根据权利要求120或121所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
123.一种修饰CCL27趋化因子，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
124.根据权利要求123所述的修饰CCL27趋化因子，其中，在位置87处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
125.根据权利要求124所述的修饰CCL27趋化因子，其中，在位置87处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
126.根据权利要求125所述的修饰CCL27趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
127.根据权利要求123至126中任一项所述的修饰CCL27趋化因子，包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
128.根据权利要求123至127中任一项所述的修饰CCL27趋化因子，其是CCR10活性的激动剂或拮抗剂。
129.一种修饰CXCL10趋化因子，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
130.根据权利要求129所述的修饰CXCL10趋化因子，其中，通过间隔基团添加在位置
78处的残基。
131.根据权利要求129或130所述的修饰趋化因子，其中，通过聚乙二醇(PEG)间隔基团添加在位置78处的残基。
132.根据权利要求131所述的修饰CXCL10趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3,6-二氧氨基辛酸。
133.根据权利要求129至132中任一项所述的修饰CXCL10趋化因子，其中，在位置78处的残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
134.根据权利要求129至133中任一项所述的修饰CXCL10趋化因子，其中，在位置78处的残基包括PEG-K-生物素。
135.根据权利要求129至134中任一项所述的修饰CXCL10趋化因子，其是CXCR3活性的激动剂或拮抗剂。
治疗癌症
技术领域
[0001] 本发明的各种实施方式涉及用于治疗癌症的产品和方法，尤其是通过降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病和慢性髓样白血病。所述产品和方法还可以用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗（debulking），在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。还描述了伴随诊断。
背景技术
[0002] 癌症是一种疾病，其特征在于由细胞DNA中基因突变累积导致的失控的细胞生长。按照从其中首先发展癌症或肿瘤的起源细胞归类，存在200种以上的不同癌症。另外，癌症可以宽泛地分类为实体瘤，例如乳腺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤，或血液恶性肿瘤如白血病和淋巴癌。
[0003] 实体瘤通常起始和生长为在局部部位处的异常团块。然而，在癌症进展的过程中，细胞可以获得侵入底层组织并从而进入循环和/或淋巴系统的能力。这些侵入性能最终允许实体瘤转移到体内的远端部位，并且它是与在继发部位处生长相结合的转移，这占癌症死亡的相当大部分。
[0004] 和实体瘤相对，癌症如白血病和淋巴癌源自血液起源的细胞，因此表现为系统性疾病。尤其是，慢性淋巴性白血病，白血病的最常见形式，发展自源自骨髓的恶性淋巴细胞。
[0005] 身体具有用来抵抗癌症发展的许多内在机制。在此方面，免疫系统被认为在消除包含基因突变的细胞方面具有关键作用。因此，接着癌细胞经常通过进化途径保持避免被免疫系统的细胞识别。尤其是，已表明，在外周循环中以及在肿瘤微环境中T调节细胞的升高水平是在癌症患者中看到的免疫抑制的基础。增加数目的调节性T细胞的存在还已被认为是成功实施癌症免疫疗法的障碍。
[0006] 成分血分离是用于清除血液成分，如抗体、低密度脂蛋白(LDL)和血细胞的治疗方法。白细胞去除法是用于除去白细胞（white blood cell）（白血球，leukocyte）的成分血分离治疗方法。将患者连接于体外血液循环系统，从一个臂的静脉中抽取血液，通过柱装置，然后返回到患者的另一个臂。WO2010/029317描述了用于治疗炎性病症的成分血分离柱，包括固定在固体载体上的趋化因子。
发明内容
[0007] 趋化因子是一类细胞因子分子，其涉及在炎症中的细胞募集和激活。趋化因子引起在免疫系统中细胞的各种亚群的趋化性和激活。主要通过紧密结合于它们在白细胞表面上的受体来介导趋化因子的活性。在某些实施方式中，本发明是基于认识到，在趋化因子和表达它们的受体的细胞之间的相互作用可以开发用于治疗各种癌症及其组分，如通过降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞(在本文中可以将其称作“Treg”)，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。本发明的发明人已确定，靶向特异性趋化因子受体表达细胞可以提供新的治疗方式来治疗所述疾病。此外，在所述疾病中，可以再次增加在每种细胞上的趋化因子受体表达，从而提供用来治疗所述疾病的治疗方式。本文中表明，癌症患者，尤其是患有UBC和PC的受试者，显示CCR4表达循环Treg的增加频率，以及这种反应对于Treg是特异性的(并且并不适用于其他T淋巴细胞)。因此可以靶向CCR4表达细胞，以治疗癌症。治疗可以依靠适宜的结合试剂如CCL22(MDC)及其衍生物（如本文中进一步详细描述的）。本文还表明，患有白血病（如CLL）的受试者具有高度增加数目的循环(白血病)B细胞。白血病B细胞表达特征性趋化因子受体，如CCR7。本文还表明，在白细胞去除法中，利用MIP3b作为特异性结合试剂，可以有效地清除CCR7表达B细胞。
[0008] 因此，在某些实施方式中，本发明用来降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病。在某些实施方式中，本发明还可以用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用来治疗淋巴瘤的白血病期。这是利用特异性结合试剂来捕捉来自患者特定的趋化因子受体表达癌细胞和调节性T淋巴细胞来实现的。因此，在某些实施方式中，在第一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体，尤其是趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，尤其是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种。然后可以将从其中除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此在某些实施方式中，本发明可以依靠连续体外回路（在一些实施方式中）。可替换地，在其他实施方式中，本发明可以包括以下步骤：从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者。
[0009] 在本文中，提及CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5旨在包括所列出的趋化因子受体的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4和/或CXCR7的组合作为单独的组，以包括CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4和CXCR7的任何一种或多种。
[0010] 因此，癌症的直接治疗依赖于除去表达CCR的肿瘤细胞。CCR可以限于/累积在白血病细胞上。在某些实施方式中，本发明还考虑(包括)除去(正常)调节性T细胞，其已被肿瘤诱导，作为肿瘤逃逸机制，作为一种治疗方式，除了直接治疗以外或作为直接治疗的替换方案其可以被实施。
[0011] 在某些实施方式中，本发明因此还提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种调节性T细胞受体（其可以被确定为在癌症中被上调，尤其是皮肤淋巴细胞抗原(CLA)受体或在Treg上表达的趋化因子受体如CCR4和CCR8）的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种调节性T细胞受体表达细胞。然后可以将从其中除去调节性T细胞受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此在一些实施方式中本发明可以依靠连续体外回路。可替换地，在其他实施方式中，本发明可以包括以下步骤：从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中已除去调节性T细胞受体表达细胞的外周血返回至患者。
[0012] 在本文中，提及CLA、CCR4和/或CCR8旨在包括所列出的趋化因子受体的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了CLA、CCR4和/或CCR8的组合作为单独的组（本文还描述CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5组）。
[0013] 通过趋化因子可以将Treg募集至肿瘤，如CCL17和CCL22结合于表达在Treg上的CCR4，或例如可以发生CCR8介导的募集（通过CCL1）。因此，在某些实施方式中，本发明还可以依靠能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体（如CCR4和CCR8）的一种或多种结合试剂。如下文所讨论的，结合试剂可以包括一种或多种趋化因子。CCL17和CCL22可以用来除去CCR4表达Treg以及CCL1可以用来除去CCR8表达Treg。
[0014] 趋化因子受体的表达可以因白血病而变化。例如，在具有循环细胞的白血病和具有淋巴结恶性细胞的淋巴瘤之间的差异可以在于CCR7的表达，从而允许进入淋巴结。当淋巴瘤进入白血病期时，它可能是由于CCR7的下调。因此，在其他实施方式中，本发明还提供了用于治疗白血病的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体（其已被确定为连接白血病，例如在白血病中被上调）的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体表达细胞。可以通过应用本文描述的方法来确定适宜的趋化因子受体表达细胞。
[0015] 如本文所述，可以直接或间接地将适宜的结合试剂固定在固体载体上，以产生适合用于捕捉相关趋化因子受体表达细胞的成分血分离柱。在观测到趋化因子受体表达的增加水平的情况下，可以利用本发明的各种实施方式的柱从外周血中优选地除去这样的细胞。因此，本发明的各种实施方式的方法可以优选地靶向如本文定义的CCR5hi、CCR6hi、CCR7hi、CCR8hi、CXCR4hi、CXCR7hi、CCR4hi、CCR9hi、CCR10hi、CXCR3hi或CXCR5hi细胞的一种或多种，以便从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。相对于在取自健康受试者的细胞中趋化因子受体的表达水平来测量所述水平。图5提供了选通策略的一个实例。
[0016] 在某些实施方式中，本发明进一步提供了能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体，尤其是结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的结合试剂，用于治疗癌症，其中将一种或多种结合试剂直接或间接固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。在其他实施方式中，本发明还提供了能够特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种结合试剂用于制造用于治疗癌症的成分血分离柱的用途，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。
[0017] 类似地，如本文所述，可以将适宜的结合试剂直接或间接固定在固体载体上，以产生适用于捕捉相关Treg受体表达细胞的成分血分离柱。在观测到Treg受体表达的增加水平的情况下，可以利用本发明的各种实施方式的柱从外周血中优选除去这样的细胞。因hi此，在某些实施方式中，本发明的各种实施方式的方法可以优选靶向如本文定义的CLA 、hi hi
CCR4 和/或CCR8 细胞的一种或多种，以从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。相对于在取自健康受试者的细胞中的Treg受体的表达水平来测量所述水平。图5提供了选通策略的一个实例。
CCR4 和/或CCR8 细胞的一种或多种，以从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。相对于在取自健康受试者的细胞中的Treg受体的表达水平来测量所述水平。图5提供了选通策略的一个实例。
[0018] 在其他实施方式中，本发明进一步提供了能够特异性地结合于一种或多种Treg受体，尤其是结合于Treg受体CLA、CCR4和/或CCR8的结合试剂，用于治疗癌症，其中将一种或多种结合试剂直接或间接固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种Treg受体表达细胞。在某些实施方式中，本发明还提供了能够特异性地结合于Treg受体/Treg受体CLA、CCR4和/或CCR8（待用）的一种或多种结合试剂在制造用于治疗癌症的成分血分离柱中的用途，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种Treg受体/CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。
[0019] 针对本发明的各种实施方式的治疗方法所描述的所有实施方式适用于这些方面（在细节上作必要的修改）并且为简洁起见不再重复。因此，参照治疗方法进行的以下讨论也适用于本发明的各种实施方式的医学用途方面。
[0020] 在某些实施方式中，本发明旨在治疗各种特定癌症、或癌症相关病症。特定病症可以选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。降低循环肿瘤细胞的水平可以适用于一定范围的癌症。该方面可以与某些实体瘤如乳腺癌、结肠癌或肺癌相关。降低肿瘤转移的发生率可以依靠防止转移细胞进入特定位置，因为这可以通过趋化因子-趋化因子受体相互作用来驱动。因此，在某些实施方式中，本发明的方法可以用来防止转移细胞进入骨、肺、淋巴结、皮肤和小肠的任何一种或多种。在具体实施方式中，靶向CXCR4表达细胞以防止转移细胞进入骨和/或肺。在其他实施方式中，靶向CCR7表达细胞以防止转移细胞进入淋巴结。在进一步的实施方式中，靶向CCR10表达细胞以防止转移细胞进入皮肤。在更进一步的实施方式中，靶向CCR9表达细胞以防止转移细胞进入小肠
[0021] 从外周血中除去调节性T淋巴细胞(在本文中可以将其称作“Treg”)可以帮助免疫系统识别癌症或肿瘤。T调节细胞(Treg)是T细胞的亚群，其抑制免疫系统以保持免疫稳态。在癌症中，Treg可以抑制针对肿瘤的有效免疫反应，因此除去Treg可以导致针对癌细胞的改善的免疫激活。因此在某些实施方式中，本发明的这个方面可以适用于治疗任何癌症。具体实例包括胰腺癌和膀胱癌，尤其是膀胱癌。
[0023] 白血病如慢性淋巴性白血病和慢性髓样白血病的治疗可以基于在外周血中直接除去癌性细胞。在AML和ALL中减体治疗的应用可以依靠通过本发明的各种实施方式实现的靶向细胞减少效应。类似地，在从受试者或患者体内收获骨髓或干细胞用于自体骨髓/干细胞移植以前，除去癌性细胞或有助于癌性病症的细胞(如Treg)可能是有用的。在某些实施方式中，当在外周血中发现过多淋巴细胞时，本发明还可以用于治疗淋巴瘤的白血病期。基于表达特定受体、尤其是趋化因子受体的细胞，可以除去过多的淋巴细胞，其可以包括Treg。
[0024] 通过靶向CXCR4和/或CXCR3表达细胞，可以治疗白血病，尤其是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。通过靶向CXCR4、CXCR5和/或CXCR3表达细胞，可以治疗白血病，尤其是慢性粒细胞性白血病(CML)。
[0025] 治疗是指，在患者的外周血中减少特定的趋化因子受体表达细胞。减少可以包括减少细胞，在病患者中所述细胞以增加的水平表达趋化因子受体，尤其是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种。患者通常是病人，但术语患者可以包括人和非人动物受试者（在一些实施方式中）。在本发明的各种实施方式的情况下，这通常涉及在患者的外周血中减少CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、hi hi hiCCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种，如CCR5 、CCR6 、CCR7 、hi hi hi hi hi hi hi hi
CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 表达细胞的一种或多种。在某些实施方式中，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞包含肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方式中，肿瘤细胞可以源自白血病，如慢性淋巴性白血病，尤其是B-CLL(B细胞慢性淋巴性白血病)、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
在某些实施方式中，本发明可以，例如，通常依赖除去白血病的B细胞。B细胞可以表征为CD19阳性细胞。
CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 表达细胞的一种或多种。在某些实施方式中，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞包含肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方式中，肿瘤细胞可以源自白血病，如慢性淋巴性白血病，尤其是B-CLL(B细胞慢性淋巴性白血病)、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
在某些实施方式中，本发明可以，例如，通常依赖除去白血病的B细胞。B细胞可以表征为CD19阳性细胞。
[0026] 在Treg针对的用途的情况下，治疗尤其依赖于在患者的外周血中特异性Treg受体表达细胞的减少。减少可以包括减少这样的细胞，在病患者中所述细胞以增加的水平表达Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种。在一些实施方式中，患者通常是病人，但术语患者可以包括人和非人动物受试者。在本发明的上下文中，这通常涉及在患hi hi者的外周血中减少CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种，如“CLA 、CXCR4 和/hi
或CXCR8 ”表达细胞的一种或多种。本文中表明，癌症患者显示CCR4表达循环Treg的增加频率，并且这种反应对于Treg是特异性的(并且并不适用于其他T淋巴细胞)。利用适宜的结合试剂如CCL22(MDC)及其衍生物，可以靶向CCR4表达细胞（如本文中进一步详细描述的）。
或CXCR8 ”表达细胞的一种或多种。本文中表明，癌症患者显示CCR4表达循环Treg的增加频率，并且这种反应对于Treg是特异性的(并且并不适用于其他T淋巴细胞)。利用适宜的结合试剂如CCL22(MDC)及其衍生物，可以靶向CCR4表达细胞（如本文中进一步详细描述的）。
[0027] 淋巴细胞的三种主要类型是T细胞、B细胞和天然杀伤(NK)细胞。术语“T淋巴细+ +胞”包括CD4T细胞如T辅助细胞(Th1细胞和Th2细胞)，以及CD8T细胞如细胞毒性T细胞。可以通过CCR5的表达和/或通过IFN-■的生产来表征Th1细胞。可以通过CCR3的表达和/或通过IL-4的生产来表征Th2细胞。调节性T细胞(Treg)在细胞表面上表达转录因子FoxP3并表达高水平的IL-2Ra(CD25)。另外，它们具有下调水平的IL-7a受体CD127。
因此，Treg可以被定义为CD4+CD25hiCD127lo/-和Foxp3阳性的。Treg的功能是通过由细胞因子介导的直接和间接接触来调节和调整T效应细胞反应。因此，肿瘤诱导Treg以避免被T效应细胞识别和清除（作为肿瘤逃逸机制）。
因此，Treg可以被定义为CD4+CD25hiCD127lo/-和Foxp3阳性的。Treg的功能是通过由细胞因子介导的直接和间接接触来调节和调整T效应细胞反应。因此，肿瘤诱导Treg以避免被T效应细胞识别和清除（作为肿瘤逃逸机制）。
[0028] 在某些实施方式中，除基于结合于趋化因子受体如CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5和/或Treg受体如CLA、CCR4和/或CCR8的去除以外，本发明的方法还可以涉及与这些另外的细胞表面(和细胞特异性)标志物的任何一种或多种的特异性结合相互作用。可以制备适宜的结合试剂以特异性地结合于这些细胞表面标志物。因此，(趋化因子受体，尤其是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体)特异性结合试剂的讨论是适用的（在细节上作必要的修改）。
[0029] CCR5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体5的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p21处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR5。该基因的同义词包括CC-CKR-5、CD195CKR-5、IDDM22和CKR5。CCR5的Entrez Gene参考序列是如于2011年6月13日可获得的1234，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0030] CCR6是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体6的基因符号。该基因的HGNC ID是1607。该基因位于染色体位置6q27处。该基因的先前的符号和名称是STRL22。该基因的同义词包括BN-1、CD196、CKR-L3、CMKBR6、DCR2、DRY-6、GPR-CY4、GPR29。CCR6的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U68030.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0031] CCR7是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体7的基因符号。该基因的HGNC ID是1608。该基因位于染色体位置17q12-q21.2处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR7、EBI1。该基因的同义词包括BLR2、CD197和CDw197。CCR1的RefSeq参考序列是如于2011年6月13日可获得的NM_001838.3，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0032] CCR8是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体8的基因符号。该基因的HGNC ID是1609。该基因位于染色体位置3p22处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR8、CMK。该基因的同义词包括CDw198、CKR-L1、CY6、GPR-CY6、TER1。CCR8的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的D49919.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0033] CXCR4是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)受体4的基因符号。该基因的HGNC ID是2561。该基因位于染色体位置2q21处。该基因的先前的符号和名称是"趋化因子(C-X-C基序)受体4(fusin)"。该基因的同义词包括CD184、D2S201E、融合受体、HM89、HSY3RR、LESTR、NPY3R、NPYR、NPYY3R。CXCR4的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AJ132337.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0034] CXCR7是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)受体7的基因符号。该基因的HGNC ID是23692。该基因位于染色体位置2q37.3处。该基因的先前的符号和名称是"趋化因子孤儿受体1"、CMKOR1。该基因的同义词包括GPR159和RDC1。CXCR7的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的BC008459.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0035] CCR4是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体4的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p24-p21.3处。该基因的同义词包括CC-CKR-4、CD194、ChemR13、CKR4、CMKBR4、k5-5。CCR4的Genbank参考序列是如于2012年4月4日可获得的X85740.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0036] 皮肤淋巴细胞抗原(本文中为CLA)是表达在皮肤归巢T细胞上的PSGL-1的特化形式，参见Fuhlbrigge et al.,Nature389,978-981(30October1997)|doi:10.1038/40166(全部内容以引用方式结合于本文)。渗透皮肤的记忆T细胞表达独特的皮肤归巢受体，称作皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)，一种碳水化合物表位，其促进T细胞靶向至发炎皮肤1（skin1），CLA是P选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的可诱导的碳水化合物修饰，一种已知的表面糖蛋白，其组成型表达在所有人外周血T细胞上。
[0037] CXCR3是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)受体3的基因符号。该基因的HGNC ID是4540。该基因位于染色体位置Xq13处。该基因的先前的符号和名称是"G蛋白耦联受体9"，GPR9。该基因的同义词包括CD183、CKR-L2、CMKAR3、IP10-R和MigR。CXCR3的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U32674.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0038] CXCR5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)受体5的基因符号。该基因的HGNC ID是1060。该基因位于染色体位置11q23.3处。该基因的先前的符号和名称是BLR1。"Burkitt淋巴瘤受体1、GTP结合蛋白(趋化因子(C-X-C基序)受体5)"、"Burkitt淋巴瘤受体1、GTP-结合蛋白"。该基因的同义词包括CD185、MDR15。CXCR4的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的X68829.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0039] CCR9是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体9的基因符号。该基因的HGNC ID是1610。该基因位于染色体位置3p22处。该基因的先前的符号和名称是GPR28。该基因的同义词包括CDw199、GPR-9-6。CCR9的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AJ132337.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0040] CCR10是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)受体10的基因符号。该基因的HGNC ID是4474。该基因位于染色体位置17p21.1-q21.3处。该基因的先前的符号和名称是"G蛋白耦联受体2"、GPR2。CCR9的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AF215981.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0041] 根据本发明的各种实施方式的治疗可以导致减轻或改善症状、防止进展、减退病症、或完全恢复。成功治疗的可测量参数包括以下的一种或多种，直至全部：循环CD4+CD25hiCD127lo/-和Foxp3阳性细胞的数目将减少以及在外周血中T效应细胞的功能性激活将增加，作为有效治疗的标志。循环趋化因子受体表达白血病或肿瘤细胞的数目可以减少，作为有效白细胞去除法的标志。在具体实施方式中，单次治疗足以引起从患者的外周血中清除约10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或更高达到80%、90%、95%或更多、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的特定趋化因子受体的一种或多种，尤其是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种。在具体实施方式中，在单次治疗中，实现至少约50%的清除。因此，可以参考CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种的清除来定义成功治疗。在某些实施方式中，治疗可以导致清除约100至500百万个CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞，如癌细胞和调节性T淋巴细胞，以及更具体地约100、150、200、250、300、350。400、450、或500百万个CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。类似的清除水平可以适用于这样的方法，其中靶向Treg受体表达细胞(CLA、CCR4和/或CCR8)。
[0042] 通过结合于柱（通过结合试剂-趋化因子受体相互作用）来固定趋化因子受体表达细胞。这些固定的细胞可以进一步表达未耦联的趋化因子受体（unoccupied chemokine receptor），其可以具有与用于捕捉的那些趋化因子受体相同或不同类型。这些另外的趋化因子受体可以允许从外周血中捕捉可以有助于病症的循环趋化因子。因此，循环(特定)趋化因子水平的降低可以提供成功治疗的度量，这是因为例如趋化因子下调可以减少Treg募集。
[0043] 本领域技术人员可以容易确定治疗的持续时间，并且这将取决于多种因素如外周血的流速。可以将治疗的持续时间结合于监测治疗本身，其中在治疗的可测量参数已达到限定的阈值以后则认为治疗完成。如本文讨论的，可以采用任何适宜的参数。因此，例如，当已实现CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种减少，如CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种50%减少时，可以认为治疗已完成。能够以约10-80mL/分钟的流率，更具体地约20-70mL/分钟，或约30-60mL/分钟，来操作成分血分离系统。在具体实施方式中，进行治疗持续约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟等时间期间，或这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。治疗通常并不旨在除去在外周血中的所有表达趋化因子受体的细胞，因为那些细胞的基本水平是健康受试者所需要的。然而，已发现，仅需要将低血液体积施加于本发明的柱以实现趋化因子受体表达细胞的有效清除水平。因此，在某些实施方式中，在单次治疗中，将约10-90%或更具体地约
20、30、40、50、60。70、80或90%、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的患者血液施加于柱。循环通过成分血分离柱或系统的血液体积可以为约1000-3000ml，如约1000、1200、1400、1600、1800或2000ml、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。在已循环所述体积的血液以后，可以认为治疗已完成。在每个治疗期以前，可以给予患者抗凝血剂。适宜的溶液，如无菌盐水溶液，可选地包括抗凝血剂如肝素，可以用来起动成分血分离(体外)系统。在每个治疗期开始时，可以将另外体积的抗凝血剂加入回路，例如作为推注液。相同因素可以适用于（在细节上作必要的修改）本发明的多个方面，其中靶向Treg表达细胞(如CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞)。
20、30、40、50、60。70、80或90%、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的患者血液施加于柱。循环通过成分血分离柱或系统的血液体积可以为约1000-3000ml，如约1000、1200、1400、1600、1800或2000ml、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。在已循环所述体积的血液以后，可以认为治疗已完成。在每个治疗期以前，可以给予患者抗凝血剂。适宜的溶液，如无菌盐水溶液，可选地包括抗凝血剂如肝素，可以用来起动成分血分离(体外)系统。在每个治疗期开始时，可以将另外体积的抗凝血剂加入回路，例如作为推注液。相同因素可以适用于（在细节上作必要的修改）本发明的多个方面，其中靶向Treg表达细胞(如CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞)。
[0044] 在某些实施方式中，本发明依赖于结合试剂，其能够特异性地结合于趋化因子受体，或结合于调节性T细胞受体（在一些实施方式中）。当血液通过在其上或其中固定有结合试剂的固体载体时，这种特异性结合反应允许从患者的外周血中除去表达趋化因子受体或调节性T细胞受体的细胞。感兴趣的特定的趋化因子受体包括CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(当治疗癌症如白血病时)和/或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8(当具体地旨在除去Treg时)。结合试剂可以是能够特异性地结合于所考虑的受体的任何结合试剂。“特异性结合”是指，结合试剂显示足够的结合特异性和适当的结合亲合力/动力学，以允许从外周血中除去表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的细胞(在适当的情况下)。虽然并不排除结合试剂能够结合于其他分子，如其他趋化因子受体，但结合试剂将优先结合于表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种，或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的细胞，尤其是结合于表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种，或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的增加水平的细胞(如本文中进一步定义的)。能够特异性地结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的结合试剂可以分别是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的激动剂或拮抗剂。因为疾病状态可以依靠CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的表达上调，或通过其发信号，所以在某些实施方式中，能够特异性地结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的结合试剂分别是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的拮抗剂。趋化因子通常是，虽然并不一定唯一地是(尤其是在截短或修饰形式的情况下)它们的同源受体的激动剂并且用来激活表达相关受体的细胞，如本领域技术人员应当理解的。针对相关趋化因子受体的抗体一般被认为是拮抗剂，如本领域技术人员应当理解的。结合试剂的具体实例包括蛋白质或多肽，如抗体和受体配体，尤其是趋化因子。在某些实施方式中，结合试剂可以是核酸分子。在一些实施方式中，核酸是适体。核酸适体是长度约15-40个核苷酸的多核苷酸。可以利用SELEX方法(通过指数式富集使配体系统地演化)或本领域技术人员已知的任何其他方法来制备核酸适体。对于CLA，结合试剂可以基于已知的结合剂如血管凝集素内皮细胞-白细胞黏附分子1(ELAM-1)。本文中关于修饰的截短趋化因子的讨论适用于针对CLA的ELAM-1结合试剂（在细节上作必要的修改）。
[0045] 在其他实施方式中，结合试剂可以是肽，以及在某些情况下，肽适体。肽适体是人工识别分子，其由插入恒定支架蛋白的可变肽序列组成(Baines IC,Colas P.Peptide aptamers as guides for small molecule drug discovery.Drug Discov Today.2006;11:334–341，以引用方式结合于本文)。许多方法，如噬菌体展示、核糖体展示和酵母菌双杂交筛选系统，可用于筛选潜在的基于肽的结合剂的文库。类似地，基于结构域的蛋白质支架，如纤连蛋白、锚蛋白重复序列、蛋白A、SH3结构域、脂质运载蛋白和泛素，可以用作结合剂。而且，许多技术如噬菌体展示和核糖体展示可用于筛选基于蛋白质的结合剂的文库。类似地，利用本领域中已知的适宜的筛选技术（在某些实施方式中其可以是高通量筛选），可以针对与相关的趋化因子受体特异性结合来筛选候选化合物的文库。可以将候选结合剂固定在固体载体上，并确定所述试剂特异性地保留表达感兴趣的趋化因子受体或标记趋化因子受体的细胞的能力。可以将一系列细胞类型施加于固体载体以证实结合的特异性，或可替换地可以将混合样品(如外周血)施加于固体载体。可以证实感兴趣的细胞类型(表达适当的趋化因子受体)的保留以确定合适的结合剂。
[0046] 在本发明的各种实施方式的情况下，术语“趋化因子”还包括生物素化或以其他方式标记的趋化因子。术语“趋化因子”还包括趋化因子的修饰和截短形式以及趋化因子片段，前提条件是修饰或截短形式保留其结合于它的同源受体的能力(因而，在本发明的情况下，保持功能)。趋化因子不一定需要保留生物活性，这是因为，针对CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5和/或针对CCR4和CCR8（其中特异性地靶向Treg）的特异性结合亲和力是所需要的。在某些实施方式中，趋化因子缺乏生物活性，例如就(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；或CCR4或CCR8，当特异性地靶向Treg时)受体的激活而言。
[0047] 可以进行修饰以改善蛋白质合成，例如产物和产量的均匀性。如本领域技术人员已知的，示例性修饰可以包括对在趋化因子中的一种或多种氨基酸的氨基酸添加、替代、缺失或其他修饰。修饰可以包括用非天然氨基酸如正亮氨酸(NLeu)和衍生氨基酸如焦谷氨酸(pyroGlu)来替代野生型氨基酸。可以进行这种修饰以在本发明的各种实施方式的柱的储存和使用期间将副产物形成降至最低。可以进行修饰以改善标记，例如包括聚乙二醇(PEG)间隔物以促进生物素化。以并不显著影响受体结合能力的方式，进行与趋化因子的荧光色素或其他标记基团的生物素化和/或结合。位点特异性生物素化或其他标记是优选的，这是因为趋化因子的非选择性标记性可以损害受体结合活性。生物素化或其他标记通常优选位于或朝向蛋白质的C端，因为本发明的发明人已发现，在此区域中的修饰通常是良好耐受的(就对于受体结合能力的最小影响而言)。可以在任何适宜的氨基酸处位点特异性地进行生物素化。适宜的氨基酸的实例包括赖氨酸和鸟氨酸。通常，可以参见Natarajan S et al,Int.J.Pept.Protein Res.,1992,40,567-74;Baumeister ndB,Int.J.Peptide Res.And Therapeutics,2005,11,139-141;Bioconjugate techniques2 edition,Greg T.Hermanson，全部内容以引用方式结合于本文。
[0048] 截短可以涉及N或C端氨基酸的缺失（在适当的情况下），或两者。通常，截短形式将保留趋化因子正确折叠所需要的残基，例如以保留趋化因子折叠结构，其与以下要求一致：截短形式必须保留结合于相关受体(由白细胞(在表面上)表达的)的能力。趋化因子分子通常包括分别在第一和第三以及第二和第四半胱氨酸残基之间的二硫键，如本领域技术人员理解的。在本文中提供序列的情况下，假设，这些二硫键将形成在折叠的蛋白质中(除非另有说明)。在某些实施方式中，截短形式可以包含比野生型氨基酸序列少1至100个氨基酸，如1、2、3、4、5个等氨基酸。当然，截短形式可以包含进一步的修饰（如本文详述的）。在某些实施方式中，修饰或截短形式可以与全长野生型趋化因子具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的总体氨基酸序列一致性(其中缺失被计算为氨基酸序列的差异)。在某些实施方式中，在分子之间的共同序列上(即，未被删除的氨基酸)，可以具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列一致性。可以利用已知算法，如BLAST或GAP分析(GCG程序)(采用默认设置)（其可免费获得），来确定序列一致性。趋化因子可以缺少N端信号肽，其在体内合成过程中被切割掉。
[0049] 在本发明的各种实施方式中用于结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的特定趋化因子包括MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)。在本文中，提及 MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC) 和 CCL22(MDC)旨在包括所列出的趋化因子的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11和CXCL12的组合作为单独的组，以包括MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11和CXCL12的任何一种或多种。另外，明确地考虑了CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(ITAC)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)的组合作为单独的组，以包括CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(ITAC)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)的任何一种或多种。
[0050] CCL3、CCL4、CCL5和CCL8结合CCR5。CCL20结合CCR6(仅)。CCL19和CCL21结合CCR7。CXCL12结合CXCR4。CCL1结合CCR8。CXCL11和CXCL12结合CXCR7。CCL17和CCL22各自结合于CCR4。CCL25(TECK)结合于CCR9、CCL27(CTACK)和CCL28(MEC)各自结合CCR10。CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)和CXCL11(ITAC)结合CXCR3。CXCL13(BCA-1)结合CXCR5。CCL17(TARC)和CCL22(MDC)仅结合CCR4。
[0051] 根据本发明的各种实施方式，可以各自应用在本文中更详细描述的修饰和截短的趋化因子(参考相关的氨基酸序列，如在SEQ ID NO和伴随的实验性实施例中提出的)。所述修饰形式可以指导技术人员可以适用于本发明的各种实施方式的相同和其他趋化因子的另外的修饰形式。趋化因子显示可变的序列同源性：从小于20%至90%以上，但均共享非常类似的三级结构，其由以下各项组成：无序的N端，接着长环(N环)，其终止于
310螺旋，3链β折叠和C端螺旋。通过二硫键来稳定总体拓扑结构。这种共同三级结构是趋化因子蛋白家族的共同特征(Fernandez EJ annd Lolis E.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,202,42,469-99;Allen SJ et al,Annu.Rev.Immunol.,2007,25,787-820，以引用方式结合于本文)。
310螺旋，3链β折叠和C端螺旋。通过二硫键来稳定总体拓扑结构。这种共同三级结构是趋化因子蛋白家族的共同特征(Fernandez EJ annd Lolis E.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,202,42,469-99;Allen SJ et al,Annu.Rev.Immunol.,2007,25,787-820，以引用方式结合于本文)。
[0052] 在该N端区内的截短可以保持结合于受体，但可以导致功能的改变或丧失(例如Zhang YJ et al,J.Biol.Chem.,1994,269,15918,;Gong J-H and Clark-Lewis I.,J.Exp.Med.,1995,181,631-640;Fernandez EJ annd Lolis E.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,202,42,469-99;Allen SJ et al,Annu.Rev.Immunol.,2007,25,787-820，其各自以引用方式结合于本文)。
[0053] 还可以制造在趋化因子C端的截短并保持受体结合活性(Treating Inflammatory Disorders,Ola Winqvist and Graham Cotton,WO2010/029317，全部内容以引用方式结合于本文)。
[0054] 在其他实施方式中，在如本文公开的装置和方法中使用趋化因子的片段和变体。更具体地讲，所述片段和变体保留特异性地结合于它们的同源趋化因子受体的能力。本领域技术人员已知，趋化因子共享特定受体结合域，包括类似的单体折叠，其特征在于例如，无序的氨基末端域，接着是保守核心区，其由所谓的“N环”、三个反向平行β-链、和羧基末端α-螺旋组成。虽然不受理论限制，认为趋化因子-趋化因子受体相互作用是两步机制，其中趋化因子的核心首先与由受体的胞外域形成的结合位点相互作用，同时在趋化因子N端和在受体上的第二结合位点之间形成另一种相互作用以触发受体激活。因此，“片段”，如趋化因子的功能片段，是指蛋白质的氨基酸序列的一部分，其保留针对其同源受体的结合。
片段可以包括，例如，单体折叠区、或其部分，如氨基末端域、保守核心区和/或“N环”、反向平行β链、和/或羧基末端α-螺旋、或它们的组合和部分。
片段可以包括，例如，单体折叠区、或其部分，如氨基末端域、保守核心区和/或“N环”、反向平行β链、和/或羧基末端α-螺旋、或它们的组合和部分。
[0055] 此外，认识到，多肽可以被显著突变而没有显著改变多肽功能的一种或多种，例如，没有改变蛋白质的特异性结合和/或折叠。众所周知，遗传密码是简并的，因此不同的密码子编码相同的氨基酸。甚至在引入氨基酸替代的情况下，突变也可以是保守的并且对蛋白质的基本功能没有重大影响(参见例如，Stryer,Biochemistry4th Ed.,W.Freeman&Co.,New York,NY,1995)。这包括，例如，蛋白质与其他蛋白质结合和相互作用的能力，如截短趋化因子结合于它的同源受体。
[0056] 在一些实施例中，可以删除多肽链的一部分而没有损害或清除所有它的功能。例如，在C和/或N端上约1至约20个氨基酸的缺失，如在C和/或N端约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的缺失，可以导致这样的趋化因子，其保留功能，如它的同源受体的特异性结合。所述截短可以保留整个蛋白质的全部功能，和/或可以允许保留的功能，如蛋白质-蛋白质相互作用，如在配体-受体相互作用的情况下。缺失少量的氨基酸的趋化因子，例如，小于约20%(如小于约18%、小于约15%、小于约
10%、小于约8%、小于约5%、小于约2%、或小于约1%)的氨基酸的总数（在野生型趋化因子中）也可以用于本文公开的方法和装置。此外，在多肽链中可以进行插入或添加，例如，添加附加表位，而没有损害或消除它的功能(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1998)。在没有显著损害多肽的一种或多种功能的情况下可以进行的其他修饰包括，例如，体内或体外化学和生化修饰或稀有氨基酸的结合。在一些实施例中，趋化因子的功能片段可以由趋化因子氨基酸序列的约10或更多、约25或更多、约50或更多、约75或更多、约100或更多、约125或更多、约
150、约175或更多、或约更多或200或更多个氨基酸残基组成。
10%、小于约8%、小于约5%、小于约2%、或小于约1%)的氨基酸的总数（在野生型趋化因子中）也可以用于本文公开的方法和装置。此外，在多肽链中可以进行插入或添加，例如，添加附加表位，而没有损害或消除它的功能(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1998)。在没有显著损害多肽的一种或多种功能的情况下可以进行的其他修饰包括，例如，体内或体外化学和生化修饰或稀有氨基酸的结合。在一些实施例中，趋化因子的功能片段可以由趋化因子氨基酸序列的约10或更多、约25或更多、约50或更多、约75或更多、约100或更多、约125或更多、约
150、约175或更多、或约更多或200或更多个氨基酸残基组成。
[0057] 在一些实施例中，趋化因子或其功能片段具有氨基酸，与参考序列（如本文详细描述的那些）相比（例如利用NCBI Blast2.0gapped BLAST设定为默认参数）在其全长上，其具有至少约60%或65%的序列一致性，约70%或75%的序列一致性，约80%或85%的序列一致性，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。还可以通过检查，手工进行比对。还可以在趋化因子氨基酸序列中进行一种或多种保守氨基酸修饰，无论是添加、缺失或修饰，其并不显著改变多肽的三维结构或它结合于同源受体的能力。例如，保守氨基酸替代并不影响趋化因子特异性地结合它的同源受体的能力。提供功能类似氨基酸的保守替代表是本领域中众所周知的。以下六组各自包含彼此是保守替代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0058] 可以通过各种各样的化学技术来修饰肽，如趋化因子及其片段，以产生这样的衍生物，其具有和未修饰肽基本相同的活性或功能，如结合于同源受体，以及可选地具有其他所期望的性能。例如，蛋白质的羧酸基团，不管是羧基末端或侧链，能够以药用阳离子盐形式来提供，或被酯化以形成C1-C16酯，或被转化为化学式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或被结合以形成杂环，如5或6元环。肽的氨基，不管是氨基末端或侧链，可以为药用酸加成盐的形式，如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐，或可以被修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基，或进一步被转化为酰胺。
[0059] 利用公认的技术，可以将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可以由一种或多种卤素原子，如F、Cl、Br或I，或由C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯、或所述羧酸的酰胺，来取代肽侧链的苯基和苯酚环。可以将肽侧链的亚甲基延伸成同系C2-C4亚烷基。可以用许多公认的保护基团中的任何一种，如乙酰胺基团，来保护巯基。本领域技术人员还将认识到用于将环状结构引入本公开肽的方法，以选择和提供对结构的构象限制，这导致增强的稳定性。例如，可以将C-或N-端半胱氨酸加入肽，以致当被氧化时，肽将包含二硫键，从而产生环肽。其他肽环化方法包括形成硫醚以及羧基末端和氨基末端酰胺和酯。
[0060] 肽模拟物和有机模拟物实施方式也在本发明的范围内，由此，该肽模拟物和有机模拟物的化学成分的三维排列模拟肽主链和组分氨基酸侧链的三维排列，从而导致本发明的蛋白质的该肽模拟物和有机模拟物。对于计算机建模应用，药效团是用于生物活性的结构要求的理想化的三维定义。肽模拟物和有机模拟物可以用目前的计算机建模软件(利用计算机辅助药物设计或CADD)设计成适合每种药效团。参见Walters,“Computer-Assisted Modeling of Drugs”,in Klegerman&Groves,eds.,1993,PharmaceuticalBiotechnology,Interpharm Press:Buffalo Grove,IL,pp.165174and Principles of Pharmacology Munson(ed.)1995,Ch.102,for descriptions of techniques used in CADD。在本发明的范围内还包括利用所述技术制备的模拟物。
[0061] 通过酰胺键(CONH)，通常将在肽、多肽、或蛋白质中的氨基酸化学结合在一起。另外，可以通过其他化学键，将氨基酸结合在一起。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CHH2SO-(这些和其他键可以参见Spatola,in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983);Spatola,A.F.,Vega Data(March1983),Vol.1,Issue3,Peptide Backbone Modifications(综论);Morley,Trends Pharm Sci pp.463-468,1980;Hudson,et al.,Int J Pept Prot Res14:177-185,1979;Spatola et al.Life
Sci38:1243-1249,1986;Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314,1982;Almquist et al.J.Med.Chem.23:1392-1398,1980;Jennings-White et al.Tetrahedron
Lett23:2533,1982;Holladay et al.Tetrahedron.Lett24:4401-4404,1983；以及Hruby Life Sci31:189-199,1982)。
Sci38:1243-1249,1986;Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314,1982;Almquist et al.J.Med.Chem.23:1392-1398,1980;Jennings-White et al.Tetrahedron
Lett23:2533,1982;Holladay et al.Tetrahedron.Lett24:4401-4404,1983；以及Hruby Life Sci31:189-199,1982)。
[0062] CCL20是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体20的基因符号，还称为MIP-3α。该基因的HGNC ID是10619。该基因位于染色体位置2q33-q37处。该基因的先前的符号和名称是SCYA20，"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员
20"。该基因的同义词包括CKb4、exodus-1、LARC、MIP-3a、ST38。CCL20的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的D86955.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
20"。该基因的同义词包括CKb4、exodus-1、LARC、MIP-3a、ST38。CCL20的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的D86955.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0063] CCL19是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体19的基因符号，还称为MIP-3b。该基因的HGNC ID是10617。该基因位于染色体位置9p13处。该基因的先前的符号和名称是SCYA19，"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员19"。该基因的同义词包括"β趋化因子exodus-3"、"CC趋化因子配体19"、"CKβ-11"、CKb11、"EBI1-配体趋化因子"、ELC、exodus-3、"巨噬细胞炎性蛋白3-β"、MIP-3b。CCL19的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AB000887.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0064] CCL21是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体21的基因符号。该基因的HGNC ID是10620。该基因位于染色体位置9p13处。该基因的先前的符号和名称是SCYA21，"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员21"。该基因的同义词包括6Ckine、"β趋化因子exodus-2"、CKb9、ECL、"淋巴细胞的高效的化学吸引物"、exodus-2、"次级淋巴样组织趋化因子"、SLC、TCA4。CCL21的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AB002409.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0065] CCL1是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体1的基因符号。该基因的HGNC ID是10609。该基因位于染色体位置17q11.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA1，"小的可诱导的细胞因子A1(I-309,与小鼠Tca-3同源)"。该基因的同义词包括I-309、"炎性细胞因子I-309"、P500、SISe、"T淋巴细胞分泌蛋白I-309"、TCA3。CCL1的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的M57506.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0066] CXCL11是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)配体11的基因符号。该基因的HGNC ID是10638。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是SCYB9B、SCYB11、"小的可诱导的细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员11"。该基因的同义词包括b-R1、H174、I-TAC、IP-9。CXCL11的Genbank参考序列是如于2011年
6月13日可获得的U66096.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
6月13日可获得的U66096.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0067] CXCL12是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)配体12的基因符号。该基因的HGNC ID是10672。该基因位于染色体位置10q11.1处。该基因的先前的符号和名称是SDF1、SDF1A、SDF1B、"基质细胞衍生因子1"。该基因的同义词包括PBSF、SCYB12、SDF-1a、SDF-1b、TLSF-a、TLSF-b、TPAR1。CXCL12的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的L36033.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0068] SELE是由HUGO基因命名委员会批准的用于选择素E的基因符号，还称为ELAM-1。该基因的HGNC ID是10718。该基因位于染色体位置1q22-q25处。该基因的同义词包括CD26E、ESEL。SELE的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的M30640.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0069] CCL17是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体17的基因符号。该基因的HGNC ID是10615。该基因位于染色体位置16q13处。该基因的先前的符号和名称是SCYA17、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员17"。该基因的同义词包括ABCD-2、TARC。CCL17的Genbank参考序列是如于2012年4月4日可获得的D43767.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0070] CCL22是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体22的基因符号。该基因的HGNC ID是10621。该基因位于染色体位置16q13处。该基因的先前的符号和名称是SCYA22、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员22"。该基因的同义词包括A-152E5.1、ABCD-1、DC/B-CK、MDC、MGC34554、STCP-1。CCL22的Genbank参考序列是如于2012年4月4日可获得的U83171.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0071] CCL25是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体25的基因符号。该基因的HGNC ID是10624。该基因位于染色体位置19p13.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA25、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员25"。该基因的同义词包括“Ckβ-15"、Ckb15、TECK、"TECKvar"、"胸腺表达的趋化因子"。CCL25的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U86358.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0072] CCL27是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体27的基因符号。该基因的HGNC ID是10626。该基因的先前的符号和名称是SCYA27、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员27"。该基因位于染色体位置9p13处。该基因的同义词包括ALP、"CC趋化因子ILC"、CTACK、CTAK、"皮肤T细胞吸引趋化因子"、ESkine、"IL-11Rα-基因座趋化因子"、ILC、PESKY、skinkine。CCL27的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AJ2433542.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0073] CCL28是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体28的基因符号，还称为MEC和CCK1。该基因的HGNC ID是17700。该基因位于染色体位置5p12处。该基因的同义词包括"CC趋化因子CCL28"、CCK1、MEC、"粘膜相关上皮趋化因子"、SCYA28、"小的可诱导的细胞因子A28"、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员28"。CCL28的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AF110384.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0074] CXCL9是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)配体9的基因符号。该基因的HGNC ID是7098。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是CMK、MIG、"由γ干扰素诱导的单核因子"。该基因的同义词包括crg-10、Humig、SCYB9。CXCL10的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的X72755.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0075] CXCL10是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)配体10的基因符号。该基因的HGNC ID是10637。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是INP10、SCYB10、"小的可诱导的细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员10"。该基因的同义词包括C7、crg-2、gIP-10、IFI10、IP-10、mob-1。CXCL10的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的X02530.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0076] CXCL13是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-X-C基序)配体13的基因符号。该基因的HGNC ID是10639。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是SCYB13、"小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys基序)，成员13(B细胞化学吸引物)"。该基因的同义词包括ANGIE、ANGIE2、"B细胞化学吸引物"、BCA-1、BLC、BLR1L。CXCL13的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AJ002211.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0077] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的实例(参见以下实施例3)。修饰CCL8(MCP-2)对应于全长成熟蛋白的残基1至76(并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在生理条件下，在蛋白质的N端处的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列的Gln1由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质(SEQ ID NO:1)。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基75，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:2)。通过生物素化来修饰在位置75处的自然发生的赖氨酸。可以在ε-氨基官能团和生物素之间结合PEG间隔物(SEQ ID NO:3)。
[0078] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:1的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVC ADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0079] X1=pyroGlu(但在一些实施方式中可以保持为Gln)
[0080] X75=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化。
[0081] 或SEQ ID NO:3
[0082] XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0083] X1=pyroGlu(但在一些实施方式中可以保持为Gln)
[0084] X75=K(PEG-生物素)。
[0085] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实施例(参见以下实施例4)。修饰CCL5(RANTES)对应于全长成熟蛋白的残基1至68(并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在序列内的单个甲硫氨酸(Met67)被突变为赖氨酸，以便在链装配期间减轻该残基的氧化(SEQ ID NO:4)。该Met至Lys的替代提供了在位置67处的赖氨酸，其可以通过生物素化来修饰。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基67，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:5)。生物素化形式包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0086] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:6的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0087] SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKN RQVCANPEKKWVREYINSLEXS[0088] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG(例如K(生物素))被生物素化。
[0089] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例5)。修饰CCL20(MIP-3α)对应于全长成熟蛋白的残基1至70(并且缺少被切割掉的26个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ ID NO:7)。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基68，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:8)。通过生物素化来修饰在位置68处的自然发生的赖氨酸。可以将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。因此最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0090] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:9的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0091] ASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVXNM
[0092] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)被生物素化。
[0093] 本文中详细描述包含截短和修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例6)。截短的CXCL12(SDF-1α)对应于全长成熟蛋白的残基1至67(并且缺少由总长度为93个氨基酸的不成熟蛋白质切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ ID NO:10)。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基64，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:11)。通过生物素化来修饰在位置64处的自然发生的赖氨酸。因而最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0094] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及截短/修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:12的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0095] KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNN NRQVCIDPKLKWIQEYLEXALN[0096] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG,，尤其是K(生物素)被生物素化
[0097] 或SEQ ID NO:10：
[0098] KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNN NRQVCIDPKLKWIQEYLEKALN[0099] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例7)。修饰CCL22(MDC)对应于全长成熟蛋白的残基1至69(并且缺少被切割掉的24个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ ID NO:13)。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基66，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:14)。通过生物素化来修饰在位置66处的自然发生的赖氨酸。可以将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。因此最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0100] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:15的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0101] GPYGANMEDSVCCRDYVRYRLPLRVVKHFYWTSDSCPRPGVVLLTFRDKEICADPRVPWVKMILNXLSQ
[0102] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)被生物素化。
[0103] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例8)。修饰CCL17(TARC)对应于全长成熟蛋白的残基1至71(并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在C端，在位置72处，可以插入另外的赖氨酸或等效残基。因而，趋化因子可以包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基72，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:17)。通过生物素化来修饰Lys(72)的ε-氨基侧链官能团。可以将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。因此，最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0104] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO:16或18的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0105] SEQ ID NO:16
[0106] ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVTVQGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSX
[0107] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)
[0108] SEQ ID NO:18
[0109] ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVTV QGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSK(PEG-生物素)
[0110] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例9)。修饰CCL19(MIP-3β)对应于全长成熟蛋白的残基1至77(并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因此保留趋化因子折叠。在C端，在位置78处，插入另外的赖氨酸。因此，趋化因子可以包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基78，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:20)。通过生物素化来修饰Lys(78)的ε-氨基侧链官能团。因而，最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0111] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO:19或21的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0112] SEQ ID NO:19
[0113] GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRG RQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX
[0114] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如，K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)[0115] SEQ ID NO:21
[0116] GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRG RQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX
[0117] X是K(生物素)
[0118] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例10)。修饰CXCL11(ITAC)对应于全长成熟蛋白的残基1至73(并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ ID NO:22)。在C端，可选地通过PEG间隔物，在位置74处，插入另外的赖氨酸。因此，趋化因子可以包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0119] SEQ ID NO:23：
[0120] FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLK ENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX
[0121] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG被生物素化。可以通过间隔分子如PEG来添加氨基酸残基，因而可以是“PEG-K”。
[0122] 结合FmocLys(ivDde)-OH，接着Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸，作为残基74，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:24)。通过生物素化来修饰另外的Lys(74)的ε-氨基侧链官能团。因此，最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0123] SEQ ID NO:25：
[0124] FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLK ENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX
[0125] X是PEG-K(生物素)。
[0126] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO:23或25的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0127] 本文中详细描述包含截短和修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例11)。人CCL25(TECK)的截短形式对应于成熟蛋白的残基1-74，其包括对应于趋化因子折叠的序列。全长成熟蛋白是127个氨基酸(信号肽是在150个氨基酸不成熟蛋白质中的23个氨基酸)。在序列内的单个甲硫氨酸被改变为正亮氨酸，以便在链装配期间减轻该残基的氧化，这在自然序列衍生物的合成过程中被观测到。在生理条件下，在蛋白质的N端的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列的Gln1由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。通过在树脂上生物素化来修饰在位置72处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0128] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:26的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0129] XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0130] X1=pyroGlu或Gln
[0131] X64=正亮氨酸
[0132] X72=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化
[0133] XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0134] X1=pyroGlu或Gln
[0135] X64=正亮氨酸
[0136] X72=K(ivDde)
[0137] 可以结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基72，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:27)。如在一般性方案部分中描述的，可以随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。因此，所期望的活性趋化因子可以包含以下SEQ ID NO:28的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
[0138] XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0139] X1=pyroGlu或Gln
[0140] X64=正亮氨酸
[0141] X72是K(PEG-生物素)
[0142] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例12)。对应于残基1-88的人CCL27(CTAC)最初表达为包含趋化因子折叠的112个氨基酸，以及被切割掉的24个氨基酸信号肽。在序列内的Met(87)被突变为赖氨酸，以提供在位置87处的赖氨酸，通过在树脂上生物素化对其进行修饰。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0143] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:29的氨基酸序列，基本上由其构成或由其构成：
[0144] FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0145] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化
[0146] FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0147] X=K(ivDde)
[0148] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基87，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:30)。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。因此，所期望的活性趋化因子可以包含以下SEQ ID NO:31的氨基酸序列，基本上由其构成或由其构成：
[0149] FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0150] X=K(PEG-生物素)
[0151] 本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例13)。修饰CXCL10(IP-10)对应于全长成熟蛋白的残基1至78(并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。例如，可以插入能够生物素化的氨基酸，如赖氨酸或鸟氨酸，作为残基78。插入可以通过间隔物，如PEG间隔物。示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:32)，在连接PEG间隔物、另外的赖氨酸和生物素分子之前：
[0152] VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
[0153] 因此，可以通过生物素化来修饰位置78。可以结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基78，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:33)。可以将合适的间隔物，如PEG间隔物，结合在ε-氨基官能团和生物素之间。生物素化形式包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0154] 因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含SEQ ID NO:34 的 氨 基 酸 序 列：VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKR CLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPX，基本上由其组成或由其组成。
[0155] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化，以及可以通过间隔分子，例如PEG-K(生物素)，进行连接
[0156] 在某些实施方式中，新合成的用于本发明的各种实施方式的方法的特定趋化因子，包括其衍生物（如本文所描述的），可以代表本发明单独的方面。生物素化被定位以允许固定同时保持受体结合能力。
[0157] 可以通过本领域中已知的任何合适的方式来合成可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。优选地，化学合成趋化因子，因为这有助于修饰和标记等。然而，根据需要，还可以与适当的标记和修饰技术结合来使用基于重组DNA的方法。因此，在某些实施方式中，本发明还提供了核酸分子，其编码本发明的各种实施方式的趋化因子。在其他实施方式中，本发明还涉及包含该核酸分子的载体以及包含该载体的宿主细胞。载体可以另外包含可操作地连接于核酸分子的适宜的启动子，以促进相应的mRNA分子的转录。通过编码本发明各种实施方式的趋化因子的核酸分子的转录和翻译，宿主细胞可以能够表达蛋白质。
[0158] 可以通过本领域中已知的方法（如WO00/50088A2所述，其全部内容以引用方式结合于本文），来生物素化可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。如上面所指出的，本发明的各种实施方式的趋化因子的位点特异性标记是优选的，虽然可以采用并不显著影响趋化因子的受体结合能力的任何标记技术。各种位点特异性地生物素化趋化因子和天然趋化因子是市售的，例如来自Almac,Craigavon,UK。在具体实施方式中，通过间隔基团来生物素化一种或多种趋化因子。可以使用间隔物来防止生物素基团影响趋化因子的活性，尤其是趋化因子与其同源受体结合。在本发明的各种实施方式中，可以采用任何适宜的间隔物，其促进趋化因子的受体结合性能的保留。因此，在以上描述的具体实施方式中，在适当的情况下，可以采用不同于PEG间隔物的间隔物。在具体实施方式中，间隔物是聚乙二醇(PEG)间隔物。已表明，PEG是有效间隔物，其允许生物素连接于趋化因子(然后可以通过与链霉亲合素相互作用，将其固定在固体载体上)而没有损害受体结合能力。
[0159] 在本发明的各种实施方式的情况下，术语“抗体”包括所有免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，其对于相关的趋化因子受体具有特异性结合亲和力(包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、它们的组合、以及在任何脊椎动物，例如，在哺乳动物如人类、山羊、兔和小鼠中的免疫反应期间产生的类似分子)。可用于本发明的各种实施方式的具体免疫球蛋白包括IgG同种型。可用于本发明的各种实施方式的抗体可以是单克隆或多克隆来源，但通常是单克隆抗体。抗体可以是人抗体、非人抗体、非人抗体的人源化形式、或嵌合抗体。用于抗体人源化的各种技术是众所周知的并且可以采用任何适宜的技术。术语“抗体”还指多肽配体，该多肽配体至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区，其特异性地识别和结合抗原的表位，并且它延伸到保留特异性地结合于相关趋化因子受体能力的所有抗体衍生物和片段。这些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、Fc片段等。术语抗体包括这样的抗体，其包括重链和轻链，但还有（仅）重链抗体。在具体实施方式中，可以设计抗体，以对于一种以上的趋化因子受体具有特异性，例如双特异性，以允许结合于两种不同的趋化因子受体。结合于感兴趣的趋化因子受体的合适的市售抗体列于以下表1中。它们可以被标记或未标记。一般性参考文献可以参见“Antibodies a laboratory manual:By E Harlow and D Lane.pp726.Cold Spring Harbor Laboratory.1988”，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0160]抗体 荧光团 供应商
CCR5 PE Biolegend
CXCR7 PE Biolegend
CCR6 PE BD Biosciences
CCR4 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CCR7 PerCP Cy5.5 Biolegend
CCR6 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CXCR4 APC R&D Systems
CCR8 APC R&D Systems
CCR5 PE Biolegend
CXCR7 PE Biolegend
CCR6 PE BD Biosciences
CCR4 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CCR7 PerCP Cy5.5 Biolegend
CCR6 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CXCR4 APC R&D Systems
CCR8 APC R&D Systems
[0161] 表1.针对特异性趋化因子受体的市售荧光团标记的抗体
[0162] 因此，可以利用可替代的结合剂，如抗体或其他化合物（如本文定义的），而不是天然趋化因子结合配偶体，来靶向趋化因子受体表达细胞。这种方式是用来治疗炎性病症的新方式。
[0163] 因此，在某些实施方式中，本发明还提供了加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的趋化因子受体的结合试剂，以允许从患者/受试者的外周血中除去表达趋化因子受体的细胞，其中结合试剂不是趋化因子。能够特异性地结合于趋化因子受体的结合试剂可以是趋化因子受体的激动剂或拮抗剂。在具体实施方式中，能够特异性地结合于趋化因子受体的结合试剂选自抗体和化合物。
[0164] 在其他实施方式中，本发明因此还提供了用于治疗炎性病症的方法，该方法包括将来自患者/受试者的外周血施加于如上文所定义的成分血分离柱(加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的趋化因子受体的结合试剂，以允许从患者的外周血中除去表达趋化因子受体的细胞，其中结合试剂不是趋化因子)，从而从患者/受试者的外周血中除去趋化因子受体表达细胞。所述方法可以包括将清除了趋化因子受体表达细胞的血液返回至患者/受试者。
[0165] 类似地，在其他实施方式中，本发明提供了能够特异性地结合于趋化因子受体的结合试剂，用于治疗炎性病症，其中将结合试剂固定在包含在如上文所定义的成分血分离柱内(加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的趋化因子受体的结合试剂，以允许从患者/受试者的外周血中除去表达趋化因子受体的细胞，其中结合试剂不是趋化因子)的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
[0166] 可以将本发明的各种实施方式的这些方面结合到本发明的各种实施方式的更有针对性的治疗方面(即治疗癌症及其各个方面)，因此本公开的剩余部分，包括所有具体实施方式，是适用的（在细节上作必要的修改）。
[0167] 用于固定本发明的各种实施方式的结合试剂的固体载体材料是本领域中已知的。“固体载体”是指，例如，这样的材料，其具有刚性或半刚性的一个或多个表面，并且可以具有珠粒、树脂、凝胶、微球体，或其他几何构型的形式。有用的载体材料是这样的载体材料，当将外周全血施加于装置时，其并不激活血细胞以使它们凝聚或附着于载体。在某些实施方式中，用试剂处理载体，以为它提供抗凝性能，尤其是采用肝素化载体。可替换地，在施加于载体以前，可以用抗凝剂如肝素来处理患者的血液。有用的载体材料包括高分子量碳水化合物，尤其是分子量为100kDa或更大的碳水化合物，如琼脂糖，为颗粒形式，可选地交联的，以及纤维素。其他优越的载体材料是聚合物，如羧基化聚苯乙烯，和玻璃。能够以颗粒或纤维的形式来提供本发明的各种实施方式的载体。载体颗粒可以具有规则形式，如球或珠粒，或不规则形式。它们可以是多孔或无孔的。载体的优选的平均粒径是50μm至2mm。
TM
在某些实施方式中，Sepharose ，琼脂糖的交联的珠粒形式，用作柱基质。它的选择是因为它的最佳分布能力并可以提供用于亲和结合的较大有效面积。能够以磁珠形式来提供固体载体，其中特异性结合试剂被固定在磁珠上。在从血液中捕捉(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；或CCR4、CCR8或CLA，其中特异性地靶向Treg)趋化因子受体和/或Treg受体表达细胞以后，可以通过适当的磁力分离器从血液中除去珠粒。
TM
在某些实施方式中，Sepharose ，琼脂糖的交联的珠粒形式，用作柱基质。它的选择是因为它的最佳分布能力并可以提供用于亲和结合的较大有效面积。能够以磁珠形式来提供固体载体，其中特异性结合试剂被固定在磁珠上。在从血液中捕捉(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；或CCR4、CCR8或CLA，其中特异性地靶向Treg)趋化因子受体和/或Treg受体表达细胞以后，可以通过适当的磁力分离器从血液中除去珠粒。
[0168] 用于在固体载体上固定结合试剂的方法是本领域中已知的。能够以直接或间接方式，将结合试剂，如趋化因子、抗体、肽、核酸或化合物，固定在载体上。在一些实施方式中，固定可以通过适宜的接头。用于间接固定结合试剂，如趋化因子，的优选方法依赖于在生物素和亲和素分子之间的相互作用。“亲和素”或“亲和素分子”是指任何类型的蛋白质，其特异性地结合生物素，以基本上排除可能存在于生物样品中的其他(小)分子。亲和素的实例包括这样的亲和素，其自然存在于蛋清、油籽蛋白(例如，大豆粉)、和谷物(例如，玉米/玉蜀黍)，以及链霉亲合素，其是细菌来源的蛋白。因此，结合试剂的生物素化和亲和素分子的应用如固定在固体载体上的链霉亲合素可以根据本领域已知方法可靠地将结合试剂连接于固体载体。具体地，这样的方法可以包括提供生物素化形式的结合试剂，提供具有固定在它的表面上的链霉亲合素的固体载体，使载体与生物素化结合试剂的水溶液接触，以及用水溶剂冲洗载体。另外，结合对相互作用，如抗体-抗原相互作用，也可以用来将结合试剂间接固定在载体上。在这样的实施方式中，可以用结合对的一个成员来衍生载体，如抗体或其片段或衍生物（如本文定义的），其对于特定肽序列或小分子半抗原具有已知的亲和力。在结合试剂上或其中掺入结合对的其他成员，如抗原、肽序列或半抗原，会促进固定在涂有相应的抗体或其片段或衍生物的固体载体上。因此，结合试剂可以被修饰以在线性分子中包括肽序列或半抗原或可以被添加为侧链或标记。可以采用任何适宜的抗体-抗原对。抗体片段或衍生物可以是任何片段或衍生物，其保留对适当抗原的特异性结合亲和力。实例包括Fab、F(ab’)2片段、scFV、VH域、单域抗体(如纳米抗体)、重链抗体和非人抗体的人源化形式等。其他高亲和力相互作用可以用于结合试剂的固定，只要可以用相互作用的配偶体之一来合成或衍生结合试剂以及用另一个相互作用的配偶体来合成或衍生固体载体，而没有损失结合活性(即，结合试剂与适当趋化因子受体的结合)。在一些实施方式中，可以通过基本上相同的相互作用以反向方式来进行固定。因此，结合试剂，其可以是例如趋化因子，可以被连接于抗体（如本文定义的），以及可以用抗原衍生的固体载体。趋化因子可以被产生为与抗体的融合蛋白。
[0169] 可替换地，利用在本领域中建立的生物结合技术，可以将结合试剂，如趋化因子和抗体，直接固定在固体载体上。例如，通过蛋白质的一级序列内的氨基官能团，将蛋白质直接固定在溴化氰活化的固体载体上。可替换地，在蛋白质内的巯基官能团可以用来将蛋白质直接固定于烷基卤化物衍生的载体或包含游离巯基官能团的载体。在进一步的实施方式中，利用天然化学连接反应，可以将包含α-硫酯官能团的蛋白质直接固定在包含1,2氨基巯基部分(例如N端半胱氨酸)的载体上。可替换地，利用腙/肟键形成连接反应，可以将用酮和醛修饰的蛋白质固定在用肼基、酰肼和氨氧基官能团衍生的固体载体上(反之亦然)。可替换地，‘Click’化学可用来将蛋白质固定在固体载体上，从而用适当的相互反应性化学官能团(叠氮化物和炔)来衍生蛋白质和载体。在其他实施方式中，Staudinger连接化学可用来将适当衍生的蛋白质固定在适当衍生的固体载体上。
[0170] 成分血分离柱包含或携带固体载体。因此，“加载”是指，柱以这样的方式携带或包含固体载体，使得(外周)血液可以流过柱（与固体载体接触）。因此，在某些实施方式中，固体载体提供了在柱内的基质，血液以连续方式通过其流动。这允许从通过柱的血液中除去表达特定的趋化因子受体的细胞，使得离开柱的血液被清除了特定的趋化因子受体表达细胞。在具体实施方式中，成分血分离柱加载有载体，该载体包含固定在载体上的链霉亲合素以及结合于载体上的链霉亲合素的一种或多种生物素化结合试剂，如趋化因子。固体载体可以包括高分子量碳水化合物，可选地交联的，如琼脂糖。
[0171] 如上文所讨论的，将结合试剂结合于载体。可以控制结合试剂的相对量以确保在固体载体和结合试剂之间的结合将是立即的，从而将结合试剂脱离固体载体的风险降至最低。因此，可以确保，针对固体载体上的结合试剂存在相对过量的固定部位。可替换地，或另外地，在固体载体上固定结合试剂以后，可以洗涤固体载体，以除去任何未结合的结合试剂。
[0172] 在本发明的各种实施方式中使用的成分血分离柱作为用于癌症的白细胞去除法治疗。通过利用在细胞表面上表达的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5和固定在包含在柱内或由其携带的固体载体上的特异性结合试剂之间的相互作用，柱可以用来特异性地除去一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。在其他实施方式中，通过利用在细胞表面上表达的Treg受体如CLA、CCR4以及CCR8和固定在包含在柱内或由其携带的固体载体上的特异性结合试剂之间的相互作用，柱用来特异性地除去一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。整个柱通常包含三种结合部件，由其构成，或基本上由其构成：1)外壳，其包含或携带2)固体载体和3)一种或多种结合试剂(固定在其上)，其特异性地结合一种或多种趋化因子受体。外壳可以由用于临床使用的任何适当的材料制造。在某些实施方式中，外壳由塑料材料构成。外壳包括用于血液进入的流入部位以及用于血液(清除了靶细胞)离开柱的流出部位。可以设计外壳以保持连续血液流过固体载体基质。外壳(像例如图1所示)可以包括顶部部分，其包括在流入部位(1)处的分配板(2)以将血液均匀地分布于整个基质区。分配板可以作为第一安全屏障来防止较大颗粒流过柱并进入患者体内。然而，分配板不是必需的，并且在一些实施方式中可以被除去，以降低系统中的总阻力。柱可以包括一个或多个安全过滤装置(3和4)，其被放置在塑料外壳的流入(1)和/或流出(5)部位处。这样的过滤装置可以用来防止大于血细胞的颗粒进入和/或离开柱。安全过滤装置可以包括多个过滤器，如两个、三个或四个过滤器，其被设计成坚固的屏障并阻止所有大于血细胞的颗粒通过柱。在柱两端处包括安全过滤器(3和4)用来将颗粒泄漏进入患者体内的风险降至最低，包括在装置不正确连接的情况下，其导致血液在与所期望的相反的方向上流动。安全过滤器可以包括任何适宜的孔径以防止大于血细胞的颗粒通过柱（如本领域技术人员容易理解的）。适宜的过滤器是可商购的。在具体实施方式中，一种或多种过滤器的孔径为大约60μm至100μm，更具体地大约80μm。本文进一步详细讨论了固体载体和结合试剂成分。
[0173] 外壳的体积可以变化，其取决于旨在通过柱的血液体积。通常，外壳的体积为大约40ml至200ml，更具体地50ml至150ml或60ml至120ml。对于白血病的治疗而言，外壳体积倾向于更大，这是由于要从血液中除去的大量细胞。在这样的实施方式中，外壳体积通常是大约100ml至500ml，如100ml至300ml或120ml至150ml。在具体实施方式中，外壳体积是大约120ml。
[0174] 柱通常以成分血分离回路的形式来使用。在本发明上下文中，整个系统包括成分血分离柱、管路和适当的泵以围绕回路泵送血液。所述系统示于图2。通过进入右臂和左臂静脉的无菌针，将患者(1)连接于体外回路。还连接盐水袋(3)并通过合适的泵(2)来泵送盐水溶液。通过无菌管道系统通过血液泵(4)，从患者的一个臂抽取血液，接着通过柱(6)，然后返回至患者。可以通过任何适宜的连接，如标准透析Luer锁定连接，将管道系统连接于柱。为正确装配，可以将柱上的连接物颜色编码。例如，红色管用于流入到红色柱顶部而蓝色管用于流出返回至患者。在回路中，可以存在空气检测器(8)。可以另外使用入口压力(5)和/或Pven传感器(7)来监测回路中的压力。
[0175] 成分血分离泵，如由Fresenius Medical Care制造的4008ADS泵，或Adamonitor泵，可以监测患者的流入和流出。泵还可以监测在体外循环中的压力。通过气泡捕获器和空气检测器，泵能够辨别空气。可以将血块捕获器过滤器安放在气泡捕获器内。泵还可以结合光学检测器来区分明亮（例如在管道系统中存在的盐水溶液或空气）以及黑暗（例如在管道系统中存在的血液）。
[0176] 图3示出合适的泵的示意图，其示出空气检测器和滤光片。如果泵系统检测到气泡和光学波动，或如果体外压力值超出设定范围，那么泵可以立即停止。可替换地或者另外地，可以发出视觉/声响报警。
[0177] 因此，本发明的各种实施方式的治疗方法可以依靠体外回路。所述方法可以被认为是离体或体外方法并且仅参照在患者以外进行的步骤来定义。然而，在一些实施方式中，所述方法进一步包括，在将血液施加于柱以前，从患者体内收集外周血。在进一步的实施方式中，所述方法进一步包括，在将血液施加于柱以后，将清除了(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5)趋化因子受体表达细胞或Treg受体，如CLA、CCR4或CCR8表达细胞(Treg)的血液输注至患者。于是这是完整的白细胞去除法治疗方法。因此，用于治疗癌症的白细胞去除法包括从患者体内收集外周血；将外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体，尤其是趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；或Treg受体CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞，或尤其是Treg（在一些实施方式中）；然后将清除(趋化因子受体表达细胞)的血液输注至患者。
[0178] 可以从患者中连续收集外周血。类似地，通过使用如本文所描述的适当的回路，可以将已清除血液连续输注至患者。因此，可以在血液通过其流动的柱中放置载体。这可以利用例如合适的泵（同样如本文中描述的）来实现。流过柱的血流使得固定在固体载体上的一种或多种结合试剂能够捕捉表达趋化因子受体的细胞，从而从血液中清除它们，并防止它们促进癌症相关病症。
[0179] 本发明的各种实施方式的方法以及用于本发明的各种实施方式的方法的结合试剂可能需要：基于在获自患者的样品中检测到趋化因子受体，尤其是一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞和/或Treg受体表达细胞，例如CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平增加来选择患者用于治疗。这种伴随诊断方法更详细描述于本文并且是基于，例如，以下观测结果：CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达可以存在于循环肿瘤细胞上以及CLA、CCR4和/或CCR8表达可以特异性地存在于调节性T细胞上(其有助于癌症避开免疫系统)。
[0180] 因此，(在本发明上下文中)在某些实施方式中，本发明还提供了用于癌症的诊断、监测癌症进展，或监测癌症治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
[0181] a)一种或多种趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平
[0182] b)一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平；和/或
[0183] c)具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞水平，
[0184] 其中，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的高水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达水平，或具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的增加的表达水平，或与对照相比具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。还可以研究趋化因子受体表达的水平（相对于细胞数目），这是因为趋化因子受体表达/细胞的增加水平也可以是诊断相关的。
[0185] 类似地，在其他实施方式中，本发明还提供了用于癌症的诊断、监测癌症的进展、或监测癌症治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
[0186] a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平
[0187] b)一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或
[0188] c)具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平，[0189] 其中，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加的表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。还可以研究Treg受体表达的水平（相对于细胞数目），这是因为Treg受体表达/细胞的增加水平也可以是诊断相关的。为免生疑问，“Treg受体表达细胞”可以包含Treg，尤其是表达特定的一种或多种受体的Treg，基本上由其组成或由其组成。这适用于本发明的各种实施方式的所有相关方面。
[0190] “诊断”在本文中被定义为包括筛选疾病/病症或疾病/病症的预指征，确定疾病/病症或疾病/病症的预指征，以及在治疗以后检查疾病/病症的复发。本发明的各种实施方式的方法还可以具有预后价值，并且这包括在术语“诊断”的定义内。本发明的各种实施方式的方法的预后价值可以用作对癌症潜在易感性的标志物（通过确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的水平）。因此，就在患者中可以确认的症状而言，在疾病有机会显现以前，可以确定存在风险的患者。在某些实施方式中，可以与癌症的其他客观指标结合来进行诊断。因此，在具体实施方式中，与一种或多种以下指标（如本领域中已知的临床指征）结合来进行诊断。另外，在癌症中，增加数量的Treg(CD4+CD25hiCD127lo/-和Foxp3阳性)是不良预后的诊断指标。确定循环白血病或肿瘤细胞的数目和它们的趋化因子受体曲线表达可以是与本发明的各种实施方式的方法结合使用的进一步的技术。
[0191] “监测进展”包括进行所述方法来监测癌症的阶段和/或状态以及进展。监测进展可以涉及对相同患者多次实施诊断方法，以在一定时期内确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平是否正在增加、降低或保持稳定。这可以是在治疗方案的情况下。
[0192] “监测特定治疗的成功”被定义为包括在治疗之前和之后确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平。治疗通常是针对治疗癌症的治疗并且可以是根据本发明的各种实施方式的方法之一（如本文定义的）的治疗。由于治疗，或在治疗以后，可以依据一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的减少，来确定成功治疗。因此，在这样的方法中，在治疗之前，确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平。在治疗以后，在预定时间，记录所述水平并进行进一步评估。一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平比较，可以监测治疗成功。在具体实施方式中，单次治疗足以引起从患者的外周血中清除约10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或更高、高达80%、90%、95%或更多、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的一种或多种特定的趋化因子受体，尤其是一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。在具体实施方式中，在单次治疗中，实现至少约50%的清除。因此，可以依据一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的清除来定义成功治疗。在某些实施方式中，治疗可以导致清除约100至500百万的一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞，如调节性T淋巴细胞和癌细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。可以包括另外的因素来确定成功治疗。例如，在治疗以后，缺少一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加，可以表明成功治疗（就防止病症的进一步进展而言，可选地与癌症的其他标志物或阶段的改善结合）。通过结合试剂-趋化因子受体相互作用，通过结合于柱，来固定趋化因子受体表达细胞。这些固定的细胞表达另外的未耦联的趋化因子受体，相对于用于捕捉的那些趋化因子受体，其可以具有相同或不同的类型。这些另外的趋化因子受体可以允许循环趋化因子，其有助于从外周血中捕捉癌症。因此，循环(特定)趋化因子水平的降低可以提供成功治疗的度量。
[0193] 在具体实施方式中，与癌症或癌症治疗相关的病症选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及(治疗)淋巴瘤的白血病期。
[0194] 样品，其中确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞水hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi平(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3hi
和/或CXCR5 )，可以包括任何适宜的组织样品或体液样品。通常，测试样品获自人类受试者。通常，样品是血液样品，尤其是外周血样品。在某些实施方式中，所述方法可以涉及确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达肿瘤细胞或调节性T淋巴细胞的水平。
和/或CXCR5 )，可以包括任何适宜的组织样品或体液样品。通常，测试样品获自人类受试者。通常，样品是血液样品，尤其是外周血样品。在某些实施方式中，所述方法可以涉及确定一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达肿瘤细胞或调节性T淋巴细胞的水平。
[0195] 类似地，样品，其中确定一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有hi一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平(定义为CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 )，可以包括任何适宜的组织样品或体液样品。通常，测试样品获自人类受试者。通常，样品是血液样品，尤其是外周血样品。在某些实施方式中，所述方法可以涉及确定一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达调节性T淋巴细胞的水平。
CCR4 、和/或CCR8 )，可以包括任何适宜的组织样品或体液样品。通常，测试样品获自人类受试者。通常，样品是血液样品，尤其是外周血样品。在某些实施方式中，所述方法可以涉及确定一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达调节性T淋巴细胞的水平。
[0196] 根据任何适宜的方法，可以确定CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、hi hiCXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞水平(定义为CCR5 、CCR6 、hi hi hi hi hi hi hi hi hi
CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )。类似地，根据任何适宜的方法，可以确定Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4hi hi hi
和/或CCR8的高表达的细胞水平(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )。
CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )。类似地，根据任何适宜的方法，可以确定Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4hi hi hi
和/或CCR8的高表达的细胞水平(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )。
[0197] 例如，可以采用流式细胞术，以确定在样品中表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的数目，确定CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的水平，和/hi hi hi hi hi hi hi或确定CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 和/或CXCR7 ，可选地和/或CCR4 ；和/或hi hi hi
CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平。本文描述了流式细胞技术以及适当标记用于流式细胞术的市售抗体的实例例如列于表1。可替换地，所述方法可以涉及以下步骤：在样品中收集和固定细胞，接着用适宜的结合试剂进行温育，所述结合试剂特异性地结合于样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5趋化因子受体表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。可以采用任何适宜的结合试剂（如本文定义的）。可以采用，例如，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8特异性抗体。在温育期以后，可以采用洗涤步骤以除去任何未结合的试剂。适宜的洗涤步骤和温育条件将是本领域技术人员众所周知的。可以直接标记结合试剂以允许直接确定抗体结合。可替换地，可以采用第二结合试剂，如抗体，其结合于第一结合试剂并携带标记。而且，适宜的温育条件和洗涤步骤对于本领域技术人员将是显而易见的。第一和第二结合试剂可以形成结合对的两个半部分。除非采用竞争性测定，否则结合相互作用不应阻止第一结合试剂结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；
和/或Treg尤其是CLA、CCR4和/或CCR8受体表达细胞。在某些实施方式中，结合对的两个半部分可以包括抗原-抗体、抗体-抗体、受体-配体、生物素-链霉亲合素对等。用来定量趋化因子(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8)受体表达细胞水平，用来定量CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受hi hi hi hi
体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达水平，和/或用来定量CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi
CXCR4 或CXCR7 ，可选地和/或CCR4 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平，的其他技术包括基于PCR的技术如QT-PCR和基于蛋白质的方法如蛋白质印迹。可以参照固定的细胞系，其携带已知数目的各种受体表达细胞和/或已知水平的受体表达/细胞，TM
来实现定量。这样的固定细胞系是市售的(例如ChemiScreen 细胞系，来自Millipore)。
还可以采用类似于本发明的各种实施方式的治疗方法的方法，其中在外周血通过柱以后确定CCR表达细胞与固体载体的结合。
CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平。本文描述了流式细胞技术以及适当标记用于流式细胞术的市售抗体的实例例如列于表1。可替换地，所述方法可以涉及以下步骤：在样品中收集和固定细胞，接着用适宜的结合试剂进行温育，所述结合试剂特异性地结合于样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5趋化因子受体表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。可以采用任何适宜的结合试剂（如本文定义的）。可以采用，例如，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8特异性抗体。在温育期以后，可以采用洗涤步骤以除去任何未结合的试剂。适宜的洗涤步骤和温育条件将是本领域技术人员众所周知的。可以直接标记结合试剂以允许直接确定抗体结合。可替换地，可以采用第二结合试剂，如抗体，其结合于第一结合试剂并携带标记。而且，适宜的温育条件和洗涤步骤对于本领域技术人员将是显而易见的。第一和第二结合试剂可以形成结合对的两个半部分。除非采用竞争性测定，否则结合相互作用不应阻止第一结合试剂结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；
和/或Treg尤其是CLA、CCR4和/或CCR8受体表达细胞。在某些实施方式中，结合对的两个半部分可以包括抗原-抗体、抗体-抗体、受体-配体、生物素-链霉亲合素对等。用来定量趋化因子(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8)受体表达细胞水平，用来定量CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受hi hi hi hi
体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达水平，和/或用来定量CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi
CXCR4 或CXCR7 ，可选地和/或CCR4 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平，的其他技术包括基于PCR的技术如QT-PCR和基于蛋白质的方法如蛋白质印迹。可以参照固定的细胞系，其携带已知数目的各种受体表达细胞和/或已知水平的受体表达/细胞，TM
来实现定量。这样的固定细胞系是市售的(例如ChemiScreen 细胞系，来自Millipore)。
还可以采用类似于本发明的各种实施方式的治疗方法的方法，其中在外周血通过柱以后确定CCR表达细胞与固体载体的结合。
[0198] 可以相对于适宜的对照来确定CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、hi hiCXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞水平(定义为CCR5 、CCR6 、hi hi hi hi hi hi hi hi hi
CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )。类似地，可以相对于适宜的对照来确定Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、hi hi hi
CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )。当诊断与癌症相关的病症时，可以设置细胞的阈值水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3hi hi
和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞(定义为CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，或在其上则作出阳性诊断。可以基于在获自病患者的样品中测量CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、hi hi hi hi hi hi hi
CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、hi hi hi hi hi
CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 ，可选地和/或CCR4 )的高表达的细胞水平，然后将这些水平与在获自健康受试者的样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、hi hi hi hi
CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi hi
CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )的高表达的细胞水平比较来确定该阈值。类似地，在诊断是特别地基于Treg的情况下，可以基于在获自病患者的样品中测量Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义hi hi hi
为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，并将这些水平与在获自健康受试者的样品中的Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义hi hi hi
为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平比较来确定该阈值。
CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )。类似地，可以相对于适宜的对照来确定Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、hi hi hi
CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )。当诊断与癌症相关的病症时，可以设置细胞的阈值水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3hi hi
和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞(定义为CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，或在其上则作出阳性诊断。可以基于在获自病患者的样品中测量CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、hi hi hi hi hi hi hi
CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、hi hi hi hi hi
CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 ，可选地和/或CCR4 )的高表达的细胞水平，然后将这些水平与在获自健康受试者的样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、hi hi hi hi
CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi hi
CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )的高表达的细胞水平比较来确定该阈值。类似地，在诊断是特别地基于Treg的情况下，可以基于在获自病患者的样品中测量Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义hi hi hi
为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，并将这些水平与在获自健康受试者的样品中的Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义hi hi hi
为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平比较来确定该阈值。
[0199] 在某些实施方式中，基于趋化因子受体表达细胞的水平来诊断癌症。基于在样品中存在大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以在受试者中作出阳性诊断。在其他实施方式中，相对于健康对照，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、
2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的趋化因子受体表达细胞来诊断癌症。
2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的趋化因子受体表达细胞来诊断癌症。
[0200] 在具体实施方式中，基于CCR7表达细胞的水平来诊断白血病如CLL。在CCR7表达细胞的水平足以干扰正常血细胞生成的情况下，则可以在受试者中做出阳性诊断。这可以是当大多数的循环细胞是白血病的，以及另外是CCR7阳性的时。因此，基于在样品中存在大于约50%，如大于约55%、大于约60%、大于约65%,、于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%或更多CCR7表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），则可以作出诊断。
[0201] 在其他实施方式中，基于测量Treg受体表达细胞的水平来诊断癌症。因此，相对于健康对照，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的Treg受体表达细胞，可以作出根据本发明的各种实施方式的阳性诊断。在具体实施方式中，基于测量CCR4表达细胞的水平来诊断癌症如胰腺癌和膀胱癌。在相对于健康对照，CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg的水平增加的情况下，可以在受试者中作出阳性诊断。因此，相对于健康对照，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、
2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg，可以作出根据本发明的各种实施方式的诊断。
2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg，可以作出根据本发明的各种实施方式的诊断。
[0202] 在某些实施方式中，基于在不同时间点趋化因子受体表达细胞的水平来监测癌症的进展，其可以是在治疗方案的情况下。相比于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于在样品中增加大于约10%，如大于约15%、大于约20%、大于约25%、大于约30%、大于约35%、大于约40%、大于约45%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以在受试者中指示癌症的进展。在其他实施方式中，相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的趋化因子受体表达细胞，来证实癌症的进展。
[0203] 在具体实施方式中，基于CCR7表达细胞的水平来监测白血病如CLL。在CCR7表达细胞的水平变得足以干扰正常血细胞生成的情况下，可以在受试者中指示所述疾病的进展，其可以是在治疗方案的情况下。这可以是当大多数的循环细胞是白血病的，以及另外是CCR7阳性的时。因此，相比于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于在样品中存在大于约50%，如大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%或更多CCR7表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），或在样品中增加大于约10%，如大于约15%、大于约20%、大于约25%、大于约30%、大于约35%、大于约40%、大于约45%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比）可以指示进展，其可以是在治疗方案的情况下。
[0204] 可以基于在不同时间点的类似的降低来监测减退或成功的治疗。例如，相比于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于在样品中降低约10%，如降低约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以在受试者中指示减退或成功的治疗。在其他实施方式中，相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于存在约1.2倍或更大降低，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数降低的趋化因子受体表达细胞，来证实癌症的消退。
[0205] 在具体实施方式中，基于CCR7表达细胞的水平来监测白血病如CLL。在CCR7表达细胞的水平不再足以干扰正常血细胞生成的情况下，则可以在受试者中减退或成功治疗该疾病。这可以是当大多数的循环细胞不再是白血病的(以及另外是CCR7阳性的)时。因此，相比于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于在样品中降低约50%，如降低约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或更多CCR7表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），或在样品中降低约10%，如降低约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以指示减退或成功的治疗。
[0206] 在其他实施方式中，基于测量Treg受体表达细胞的水平来监测癌症的进展，其可以是在治疗方案的情况下。相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的Treg受体表达细胞，可以指示癌症的进展。在具体实施方式中，基于测量CCR4表达细胞的水平来监测癌症如胰腺癌和膀胱癌。在某些实施方式中，基于在不同时间点Treg受体表达细胞的水平来监测癌症的进展，其可以是在治疗方案的情况下。相比于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于在样品中增加大于约10%，如增加大于约15%、大于约20%、大于约25%、大于约30%、大于约35%、大于约40%、大于约45%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%或更多Treg受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以在受试者中指示癌症的进展。
[0207] 相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，在CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg的水平增加的情况下，可以确定在受试者中癌症的进展，其可以是在治疗方案的情况下。因此，相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于存在约1.2倍或更大增加，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg，可以指示根据本发明的各种实施方式的进展。
[0208] 可以基于在不同时间点的类似降低来监测减退或成功的治疗。例如，在一些实施方式中，相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于1.2倍或更大降低，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数降低的Treg受体表达细胞，可以说明癌症的减退或成功的治疗。在其他实施方式中，与在较早时间点取自相同受试者的样品相比，基于在样品中降低约10%，如降低约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%或更多的Treg受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比），可以在受试者中说明减退或成功的治疗。
[0209] 在具体实施方式中，基于测量CCR4表达细胞的水平来监测癌症如胰腺癌和膀胱癌。相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，在CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg的水平降低的情况下，可以在受试者中确定减退或成功的治疗。因此，相对于在较早时间点取自相同受试者的样品，基于存在约1.2倍或更大降低，如约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数降低的CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg，则可以说明根据本发明的各种实施方式的减退或成功的治疗。
[0210] 适宜的软件可免费获得(如用于统计计算的R项目)用来对获得的数据进行必要的统计分析以计算有用的阈值。可以设定阈值以将测试的敏感性和/或特异性最大化。通过绘制接受者操作特征(ROC)曲线(敏感性相对于特异性)，可以测量在这些方面的测试性能。曲线下面积提供整体测试性能的指示。因此，在已为诊断病症设定阈值以后，每次测试样品时不一定必须运行单独的对照实验。而是可以简单地参考预先存在的阈值来确定诊断。然而，在某些实施方式中，连同取自健康受试者的对照样品一起来测试样品以提供基于基本上相同实验条件的比较器。通常与对照样品平行地测试测试样品。然后可以与对照样品比较CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的测试样品水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、hi hi hi hi hi hiCCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、hi hi hi hi hi
CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或hi hi hi
CCR8(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，以作出诊断。在某些实施方式中，还可以测试来自疾病患者的对照样品。参比对照允许在测试样品中容易确定CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的相对水平(“高”、“低”等)并解释其意义。参比对照还允许确定在细胞群体内CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的相对水平(“高”、“低”等)并解释其意义。这样的确定可以，例如，表示在测试样品中CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的平均水平。
CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或hi hi hi
CCR8(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，以作出诊断。在某些实施方式中，还可以测试来自疾病患者的对照样品。参比对照允许在测试样品中容易确定CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的相对水平(“高”、“低”等)并解释其意义。参比对照还允许确定在细胞群体内CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的相对水平(“高”、“低”等)并解释其意义。这样的确定可以，例如，表示在测试样品中CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的平均水平。
[0211] 因此，在具体实施方式中，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的较高或更高水平，或一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的较高或更高水平，例如平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞，或一种或多种CCR5hi、CCR6hi、CCR7hi、CCR8hi、CXCR4hi、CXCR7hi、CCR4hi、CCR9hi、hi hi hi
CCR10hi、CXCR3hi或CXCR5hi细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较高或更高水平，与活动性疾病或更加活动性的癌症相关。更加活动性的疾病一般涉及在癌症的情况下细胞增殖的更高水平，所以，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的较高或更高水平，或一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的较高或更高水平，例如平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞，或一hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和hi hi hi hi
/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较高或更高水平，可以预期与疾病的进展相关。类似地，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的较低或更低水平，或一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的较低或更低水平，例如平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞，或一hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 或hi hi hi hi
CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较低或更低水平，可以与缺少主动炎症或癌症相关。这可以定义为“较低活动性的疾病”。可以容易地设想，可以评估对照样品并且CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、hi hi hi hi hi hi
CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 ,CCR6 ,CCR7 ,CCR8 ,CXCR4 ,CXCR7 ,Chi hi hi hi hi
CR4 ,CCR9 ,CCR10 ,CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或hi hi hi
CCR8(定义为CLA ,CCR4 ,和/或CCR8 )的高表达的细胞水平可以横跨癌症严重性范围来确定。这可以有助于将在测试样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；
和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、hi hi hi
CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、hi hi hi hi hi hi hi hi
CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体hi hi hi
尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，与病症的相对严重性关联。
CCR10hi、CXCR3hi或CXCR5hi细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较高或更高水平，与活动性疾病或更加活动性的癌症相关。更加活动性的疾病一般涉及在癌症的情况下细胞增殖的更高水平，所以，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的较高或更高水平，或一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的较高或更高水平，例如平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞，或一hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和hi hi hi hi
/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较高或更高水平，可以预期与疾病的进展相关。类似地，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的较低或更低水平，或一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的较低或更低水平，例如平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞，或一hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 或hi hi hi hi
CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的较低或更低水平，可以与缺少主动炎症或癌症相关。这可以定义为“较低活动性的疾病”。可以容易地设想，可以评估对照样品并且CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、hi hi hi hi hi hi
CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 ,CCR6 ,CCR7 ,CCR8 ,CXCR4 ,CXCR7 ,Chi hi hi hi hi
CR4 ,CCR9 ,CCR10 ,CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或hi hi hi
CCR8(定义为CLA ,CCR4 ,和/或CCR8 )的高表达的细胞水平可以横跨癌症严重性范围来确定。这可以有助于将在测试样品中的CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；
和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有CCR5、CCR6、CCR7、hi hi hi
CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、hi hi hi hi hi hi hi hi
CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体hi hi hi
尤其是CLA、CCR4和/或CCR8(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平，与病症的相对严重性关联。
[0212] 当监测癌症的进展、或监测癌症治疗时，对照样品可以在较早时间点取自受试者。然而，它们可以基于已知参比值（如上文所讨论的）。因此，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的相对水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的相对水平，包括平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的相对水平，hi hi hi hi hi hi hi hi
或CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 或CXCR7 ,可选地和/或CCR4 细胞；和/或CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 细胞的相对水平，可以是参照在不同的时间点取自相同受试者的样品。
在某些实施方式中，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的降低水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的降低的相对水平，包括平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的降低的相对水平，或hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
一种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3hi hi hi hi
和/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的降低的相对水平，与成功治疗相关。治疗可以是任何适当的治疗，但在具体实施方式中是根据本发明的各种实施方式的治疗。
或CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 或CXCR7 ,可选地和/或CCR4 细胞；和/或CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 细胞的相对水平，可以是参照在不同的时间点取自相同受试者的样品。
在某些实施方式中，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的降低水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的降低的相对水平，包括平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的降低的相对水平，或hi hi hi hi hi hi hi hi hi hi
一种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3hi hi hi hi
和/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的降低的相对水平，与成功治疗相关。治疗可以是任何适当的治疗，但在具体实施方式中是根据本发明的各种实施方式的治疗。
[0213] 当监测癌症的进展时，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的增加的相对水平，包括平均CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达/细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达/细胞的增加
hi hi hi hi hi hi hi hi
的相对水平，或一种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、hi hi hi hi hi hi
CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的增加的相对水平，可以表明病症或疾病的进展。因此，如果在晚于相同患者的样品获取的样品中一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、hi hi hi hi
CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi hi
CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是hi hi hi
CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平增加，这可以表明病症的进展。
hi hi hi hi hi hi hi hi
的相对水平，或一种或多种CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、hi hi hi hi hi hi
CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 细胞；和/或CLA 、CCR4 、和/或CCR8 细胞的增加的相对水平，可以表明病症或疾病的进展。因此，如果在晚于相同患者的样品获取的样品中一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平，一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平，和/或具有一种或多种CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、hi hi hi hi
CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5(定义为CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、hi hi hi hi hi hi hi
CXCR4 、CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 和/或CXCR5 )；和/或Treg受体尤其是hi hi hi
CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞(定义为CLA 、CCR4 、和/或CCR8 )的高表达的细胞水平增加，这可以表明病症的进展。
[0214] 因为CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、hi hi hi hi hiCXCR3和/或CXCR5表达的一种或多种的水平，或CCR5 、CCR6 、CCR7 、CCR8 、CXCR4 、hi hi hi hi hi hi
CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 或CXCR5 细胞的一种或多种的水平，是诊断相关的，所以在获自受试者的样品中确定所述水平可以影响针对该受试者的治疗选择。因此，在某些实施方式中，本发明提供了用于选择对癌症的适当治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
CXCR7 、CCR4 、CCR9 、CCR10 、CXCR3 或CXCR5 细胞的一种或多种的水平，是诊断相关的，所以在获自受试者的样品中确定所述水平可以影响针对该受试者的治疗选择。因此，在某些实施方式中，本发明提供了用于选择对癌症的适当治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
[0215] a)趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平
[0216] b)CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种的表达水平；和/或
[0217] c)具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞水平
[0218] 其中，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种的较高水平，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种的较高表达水平，或具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的高表达的细胞的较高水平，或与对照相比CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种的增加水平，与对照相比CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种的增加表达水平，或与对照相比具有CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，导致选择如本文定义的治疗，用于治疗(病症相关的)癌症。在某些实施方式中，趋化因子受体表达细胞是高趋化因子受体表达细胞，尤其是高CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。
[0219] 在具体实施方式中，基于测量趋化因子受体表达细胞的水平来治疗癌症。因此，基于在样品中存在大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、或更多趋化因子受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比）可以应用根据本发明的各种实施方式的治疗。在其他实施方式中，基于相对于健康对照存在约1.5倍或更大增加，如约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的趋化因子受体表达细胞以根据本发明的各种实施方式来治疗癌症。
[0220] 在具体实施方式中，基于测量CCR7表达细胞的水平来治疗白血病如CLL。在受试者中在CCR7表达细胞的水平足以干扰正常血细胞生成的情况下，可以作出治疗受试者的阳性决定。这可以是当大多数的循环细胞是白血病，以及另外是CCR7阳性的时。因此，可以基于在样品中存在大于约50%，如大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%或更多CCR7表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比）应用根据本发明的各种实施方式的治疗。
[0221] 类似地，因为一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水hi平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达的水平，或一种或多种CLA 、hi hi
CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平，是诊断相关的，所以在获自受试者的样品中确定这种水平可以影响针对该受试者的治疗选择。因此，在一个相关方面，本发明提供了用于选择对癌症的适当治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
CCR4 、和/或CCR8 细胞的水平，是诊断相关的，所以在获自受试者的样品中确定这种水平可以影响针对该受试者的治疗选择。因此，在一个相关方面，本发明提供了用于选择对癌症的适当治疗的方法，该方法包括在获自受试者的样品中确定：
[0222] a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平
[0223] b)一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或[0224] c)具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平，
[0225] 其中，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加的表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，导致选择如本文定义的治疗，用于治疗(相关病症的)癌症。在某些实施方式中，趋化因子受体表达细胞是高趋化因子受体表达细胞，尤其是高Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。
[0226] 在一些实施方式中，基于测量Treg受体表达细胞的水平来治疗癌症。因此，可以基于存在约1.5倍或更大增加，如约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的Treg受体表达细胞（相对于健康对照）应用根据本发明的各种实施方式的治疗。在其他实施方式中，基于在样品中存在大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约55%、大于约60%、大于约65%、大于约70%、大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、或更多Treg受体表达细胞（作为在样品中总细胞的百分比）根据本发明的各种实施方式来治疗癌症。
[0227] 在具体实施方式中，基于测量CCR4表达细胞的水平来治疗多种癌症如胰腺癌和膀胱癌。在受试者中，相对于健康对照，在CCR4表达细胞，尤其是CCR4表达Treg的水平增加的情况下，可以作出治疗受试者的阳性决定。因此，可以基于存在约1.5倍或更多增加，如约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50或100或更大倍数增加的CCR4表达细胞尤其是CCR4表达Treg（相对于健康对照）应用根据本发明的各种实施方式的治疗。
[0228] 为免生疑问，就本发明的各种实施方式的方法而言描述的所有实施方式适用于这些方面（在细节上作必要的修改）并且为简洁起见不加以重复。特别地，可以与一种或多种临床指征（如本领域中已知的）结合来指示癌症。此外，在癌症中，增加数目的Treg(CD4+CD25hiCD127lo/-和Foxp3阳性的)是不良预后的诊断指标。确定循环白血病或肿瘤细胞的数目以及它们的趋化因子受体曲线表达可以是与本发明的各种实施方式的方法结合使用的另外的技术。
[0229] 癌症或癌症治疗可以选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。在具体实施方式中，样品是外周血样品。
[0230] 因此，基于本发明的各种实施方式的各种诊断方法，本发明的各种实施方式的方法和医学用途可以针对单个患者或患者组的需要来调节。通过从循环中除去CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种；和/或Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞，如肿瘤细胞和调节性T淋巴细胞（在癌症中上调），则可以控制疾病的一个重要因素。本发明的各种实施方式的方法可以有效地治疗或逆转病症，如通过降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。
[0232] 图1-塑料外壳和顶部，其示出分配板(2)和安全过滤装置(3和4)。
[0233] 图2-整体白细胞去除系统。
[0234] 图3-泵，其具有空气检测器和光学检测器(4)。
[0235] 图4–在生物素化MIP-3α偶联基质上进行的体外清除试验的结果，其显示从来自三位健康供体的血液中消除CCR6-表达淋巴细胞的能力。
[0236] 图5–用于CCR2表达单核细胞的选通标准的实施例
[0237] 图6–在慢性淋巴性白血病患者中以及在健康对照(HC)中不同白细胞群体的百分比。通过流式细胞术，分析了来自CLL患者和健康对照的血液的细胞特异性标志物的表达。B细胞被表征为CD19阳性的，T细胞被表征为CD3阳性的，粒细胞被表征为CD16阳性的，以及单核细胞被表征为CD14阳性的。
[0238] 图7–在来自慢性淋巴性白血病患者的B细胞上CCR7的表达。通过流式细胞术，分析了来自CCL患者的血液的各种趋化因子受体的表达。B细胞被表征为CD19+淋巴细胞。
[0239] 图8-生物素化趋化因子MIP3b(CCL19)与来自慢性淋巴性白血病患者的B细胞结合。用bMIP3b温育来自CLL患者的血液并通过流式细胞术加以分析。B细胞被表征为CD19+淋巴细胞。
[0240] 图9-使用与bMIP3b结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素基质来清除B细胞。用bMIP3b-琼脂糖凝胶链霉亲合素基质温育来自CLL患者的血细胞。通过用磷酸盐缓冲盐水洗涤基质来回收未结合的细胞。然后通过流式细胞术分析细胞(在清除以后)，并与未用MIP3b-基质温育的细胞比较(在清除以前)。
[0241] 图10–在8位健康对照(HC)，两位胰腺癌(PC)患者和一位膀胱癌(UBC)患者中CCR4阳性Treg的频率。通过流式细胞术，分析了趋化因子受体和特异性细胞标志物的表达。Treg被定义为CD4阳性、CD25阳性(hi)、CD127阴性细胞。
[0242] 图11–与UBC(左)和PC(右)中的T细胞相比，在Treg上的CCR4表达。通过流式细胞术，在两位PC患者和一位UBC患者中，分析了趋化因子受体和特异性细胞标志物的表达。
[0243] 图12-趋化因子bMDC与Treg结合。用生物素化趋化因子或抗CCR4抗体温育来自PC患者的血细胞，然后通过流式细胞术加以分析。
[0244] 图13-使用与生物素化MDC(bMDC)结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素-基质来清除CCR4表达T细胞。用生物素化趋化因子-琼脂糖凝胶链霉亲合素-基质温育来自UBC患者的血细胞。通过洗涤基质来回收未结合的细胞。然后，通过流式细胞术来分析未结合细胞(在清除以后)并与未用b趋化因子-基质温育的细胞比较(在清除以前)。
具体实施方式
[0245] 在特定器官中接种转移细胞背后的机制是通过在募集趋化因子受体表达肿瘤细胞的器官中表达趋化因子。例如，转移性结肠癌细胞表达CCR6并且它们归巢至肝脏，这是因为CCL20表达于肝脏中，从而允许CCR6表达癌细胞进入。
[0246] 在非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)中，CCR7的表达表示更高的淋巴散布（lymphatic dissemination），这证明朝向CCL21迁移（用于细胞进入淋巴样器官的优选趋化因子）。
[0247] 肺癌转移似乎取决于CXCR4在肿瘤细胞上的表达以及用于成功转移的相应趋化因子CXCL12(SDF-1)的局部表达。与这些发现一致，正在开发用于抑制CXCR4介导的转移的小分子。
[0248] 在许多癌症中，调节性T细胞(Treg)被上调，作为由肿瘤诱导的免疫逃逸机制。为了避免免疫识别和清除，肿瘤激活并募集Treg。由肿瘤生产趋化因子导致循环Treg的募集，因而避免免疫识别和清除。通过CCL17和CCL22结合于表达在Treg上的CCR4，Treg可以被募集到肿瘤上。另外，可以发生通过CCL1，CCR8介导的募集。因为通过化学治疗的许多治疗方案涉及免疫系统的激活，所以通过白细胞去除法清除循环中的Treg可以有利于肿瘤细胞的免疫识别和清除，从而增强癌症治疗。
[0249] 在慢性白血病疾病中，循环肿瘤细胞的数目抑制正常的血细胞生成，因而引起症状。趋化因子（如CCL3）增加的生产与不良预后相关(Blood.2011Feb3;117(5):1662-9.Epub2010Nov29)。因此，就症状和疾病进展而言，趋化因子受体表达白血病细胞的清除将有利地影响疾病。
[0250] 本文中表明，癌症患者，尤其是患有UBC和PC的受试者，显示CCR4表达循环Treg的频率增加，并且这种反应对于Treg(并且并不适用于其他T淋巴细胞)是特异性的。因而可以靶向CCR4表达细胞以治疗癌症。治疗可以依靠适宜的结合试剂如CCL22(MDC)以及其衍生物（如本文中进一步详细描述的）。本文还表明，患有白血病如CLL的受试者具有高度增加数目的循环B细胞。B细胞表达特征性趋化因子受体，如CCR7。本文还表明，在白细胞去除法中，利用MIP3b作为特异性结合试剂，可以有效地清除CCR7表达B细胞。
[0251] 实施例1-特制的白细胞去除法
[0252] 柱设计和特性
[0253] 介绍
[0254] 成分血分离是已建立的治疗方法，用于清除血液成分，如抗体、低密度脂蛋白(LDL)和血细胞。白细胞去除法是用于除去白细胞（white blood cell）（白血球，leukocyte）的成分血分离治疗方法。将患者连接于体外血液循环系统；从一个臂的静脉中抽取血液，通过柱装置并返回到患者的另一个臂中。白细胞去除法治疗的副作用是各种温和事件，如在0.1至5%的治疗患者中出现头痛、头晕、低血压、心悸和潮红。
[0255] 柱
[0256] 柱旨在用作用于癌症的白细胞去除法治疗方法。通过使用结合试剂，更具体地包含 MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC) 和 CCL22(MDC)的树脂，并利用CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5-趋化因子相互作用，它特异性地除去CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞，如肿瘤细胞和白细胞，如调节性T淋巴细胞。通过使用适当的结合试剂，更具体地包含SELE、CCL17、CCL22和/或CCL1的树脂，可以特异性地除去Treg受体表达细胞，如CLA受体、CCR4或CCR8表达细胞。柱由三种结合部件组TM成：塑料外壳、链霉亲合素(SA)Sepharose BigBead基质以及结合于基质的一种或多种生物素化MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12,CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)和/或SELE、CCL17、CCL22和/或CCL1。利用和标准成分血分离程序相同的技术进行治疗。
[0257] 塑料外壳(图1)
[0258] 塑料外壳，其被设计成保持连续血液流过基质，由透明的本体和红色顶部组成。顶部具有在流入部位(1)处的分配板(2)以将血液均匀地分布于整个基质区。所述分配板是第一安全屏障，用来防止较大的颗粒流过柱并且进入患者体内。将安全过滤装置(3和4)安置在塑料外壳的流入(1)和流出(5)部位处。安全过滤装置包含三个过滤器，其被设计成强大的屏障并阻止所有大于血细胞的颗粒通过柱。塑料外壳的设计示于图1。在柱装置的两端具有安全过滤器(3和4)的设计将颗粒泄漏进入患者的风险降至最低，包括在装置被倒置的情况下，其中血液在与预期相反的方向上流动。
[0259] 链霉亲合素琼脂糖凝胶TMBigBead
[0260] 在装置中的第二成分是亲合基质，称作链霉亲合素琼脂糖凝胶TM TM TM TM
BigBeads(Sepharose GE Healthcare，瑞典)。琼脂糖凝胶 （Sepharose ）是琼脂糖的TM
交联的珠粒状形式，其是从海藻中提取的多糖。在生物医学亲合技术中，琼脂糖凝胶 和琼脂糖通常用作柱基质。选择它是因为它的最佳分布能力以及可以为亲和结合提供较大可用面积。
BigBeads(Sepharose GE Healthcare，瑞典)。琼脂糖凝胶 （Sepharose ）是琼脂糖的TM
交联的珠粒状形式，其是从海藻中提取的多糖。在生物医学亲合技术中，琼脂糖凝胶 和琼脂糖通常用作柱基质。选择它是因为它的最佳分布能力以及可以为亲和结合提供较大可用面积。
[0261] 结合试剂
[0262] 偶联于基质的是装置的第三成分，特异性地结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5和/或特异性地结合于CLA受体、CCR4和/或CCR8（其中特异性地靶向Treg）的一种或多种结合试剂。可以采用选自由以下组成的组中的一种或多种趋化因子：MIP-3α(CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11、CXCL12、CCL25(TECK)、CCL27(CTACK)、CCL28(MEC)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和CCL22(MDC)。可替换地，可以采用SELE、CCL17、CCL22和/或CCL1来靶向Treg。这些肽可以是人趋化因子的合成的工程化形式，其被截短和生物素化，但保留与CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5受体(或CLA受体、CCR4和/或CCR8，其中靶向Treg)的结合活性。通过生物素化工程化的趋化因子，它能够结合于在琼TM脂糖凝胶 基质中的链霉亲合素分子。已知，生物素-链霉亲合素结合是最强的生物相互-14
作用之一，其中Kd约为4x10 M等级。在柱中链霉亲合素:生物素结合位点的计算比率是
10:1。因此，在基质和趋化因子之间的偶联将是立即的，从而将趋化因子与基质分离的风险降至最低。
作用之一，其中Kd约为4x10 M等级。在柱中链霉亲合素:生物素结合位点的计算比率是
10:1。因此，在基质和趋化因子之间的偶联将是立即的，从而将趋化因子与基质分离的风险降至最低。
[0263] 成分血分离系统
[0264] 为了进行白细胞去除法，需要以下部件：柱、管道系统、和4008ADS泵(Fresenius Medical Care)。
[0265] 回路
[0266] 系统示于图2。通过通往右臂和左臂的静脉的无菌Venflon针，将患者(1)连接于体外回路。还连接盐水袋(3)并通过ACD泵(2)来泵送盐水溶液。通过血液泵(4)，通过无菌管道系统，从患者的一个臂中抽出血液，接着通过柱(6)，然后返回至患者。通过标准透析Luer锁定连接物，将管道系统连接于柱。为正确装配起见，将柱上的连接物颜色编码：红色管用于流入到红色柱顶部而蓝色管用于流出返回至患者。存在空气检测器(8)。入口压力(5)和Pven传感器(7)用来监测回路中的压力。
[0267] 4008ADS泵
[0268] 来自Fresenius Medical Care的成分血分离泵监测患者的流入和流出、体外循环中的压力，并可以通过气泡捕获器和空气检测器来辨别空气。将血块捕获器过滤器安置在气泡捕获器内。泵还具有光学检测器用来区分明亮（例如在管道系统中存在的盐水溶液或空气）以及黑暗(例如在管道系统中存在的血液)。
[0269] 图3显示泵的示意图，示出空气检测器和滤光片。如果泵系统检测到气泡和光波动或如果体外压力值超出设定范围，那么泵立即停止并发出视觉/声响报警。
[0270] 图3的图例
[0271] 1.监测器
[0272] 2.用于废物袋的支架
[0273] 3.模块(从左至右–血液泵、ACD泵、空气检测器)
[0274] 4.用于另外模块的保留位置
[0275] 5.吸收器支架
[0276] 6.滴液检测器
[0277] 7.IV杆
[0278] 患者的准备
[0279] 在每个治疗期以前将抗凝剂给予患者。将包含5000IE肝素的无菌盐水溶液用于起动体外系统，其后，在每个治疗期开始时，将包含4000IE肝素的推注液加入回路。
[0280] 白细胞去除法时间和流率
[0281] 应以30-60mL/分钟的流率操作成分血分离系统。在循环1800mL血液以后结束治疗。
[0282] 储存条件
[0283] 应在1至25℃之间储存柱装置，从而避免冷冻和较高温度。>3个月的稳定性数据表示随着时间的推移或通过温度(室温和冷冻)在功能上没有差异。将柱保持在冷冻条件下直到使用。应避免机械损伤，如由剧烈震动和创伤产生的那些。不应使用在这些推荐条件以外储存的柱。
[0284] 运输条件
[0285] 应当在冷藏条件下运输柱装置，从而避免冷冻和较高温度。应避免机械损伤，如由剧烈震动和创伤产生的那些。
[0286] 靶细胞群体的体外清除
[0287] 为了研究清除CCR6表达细胞的能力，在生物素化MIP-3α偶联基质上进行体外试验。从血液供体收集血液并通过包含生物素化MIP-3α偶联基质的柱装置。在柱通过之前和之后获得血液样品，并通过流式细胞术(FACS)来分析CCR6表达细胞的清除。
[0288] 结果表明，在基质灌注以后，显著清除靶群体CCR6表达淋巴细胞。对来自三位健康供体的血液进行清除试验，结果示于图4。
[0289] 体外结果表明通过柱特异性地减少高达约15%的CCR6表达细胞。非CCR6表达细胞仍然不受影响(数据未示出)。
[0290] 实施例2A–慢性淋巴性白血病(CLL)患者的治疗
[0291] 材料和方法
[0292] 1.外周血的流式细胞分析
[0293] 将来自患者和健康对照的外周血收集在肝素管中。在37℃下，利用FixBuffer(磷酸盐缓冲盐水(PBS)柠檬酸盐，包含4%多聚甲醛)溶解红细胞4分钟然后在
37℃下利用溶解缓冲液(PBS，包含10mM Tris和160mMNH4Cl，pH7.5)溶解红细胞15分钟。
用包含2%牛生长血清的PBS洗涤细胞，在室温下(RT)用10%人血清温育15分钟，然后在
4℃下用抗体(表2)染色30分钟。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)，对细胞加以分析。
37℃下利用溶解缓冲液(PBS，包含10mM Tris和160mMNH4Cl，pH7.5)溶解红细胞15分钟。
用包含2%牛生长血清的PBS洗涤细胞，在室温下(RT)用10%人血清温育15分钟，然后在
4℃下用抗体(表2)染色30分钟。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)，对细胞加以分析。
[0294]抗体 荧光团 供应商
CD14 FITC Beckman Coulter
链霉亲合素 PE、APC Biolegend
CCR7 PerCP Cy5.5 Biolegend
CD16 PE Cy7 BD Biosciences
CD3 V450 BD Biosciences
CD19 V500 BD Biosciences
CD14 FITC Beckman Coulter
链霉亲合素 PE、APC Biolegend
CCR7 PerCP Cy5.5 Biolegend
CD16 PE Cy7 BD Biosciences
CD3 V450 BD Biosciences
CD19 V500 BD Biosciences
[0295] 表2.用于流式细胞分析的抗体列表
[0296] 2.趋化因子结合试验
[0297] 将来自患者和健康对照的外周血收集在肝素管中。在37℃下，利用FixBuffer(磷酸盐缓冲盐水(PBS)柠檬酸盐，包含4%多聚甲醛)溶解红细胞4分钟，并在37℃下利用溶解缓冲液(PBS，包含10mM Tris和160mMNH4Cl，pH7.5)溶解红细胞15分钟。用包含2%牛生长血清的PBS洗涤细胞，在室温下(RT)用10%人血清温育15分钟，然后在
4℃下用细胞特异性抗体连同生物素化趋化因子(1μM)或相应的趋化因子受体抗体一起染色30分钟(表2)。通过在生物素和荧光团结合的链霉亲合素之间的相互作用来检测生物素化趋化因子。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)来分析样品。
4℃下用细胞特异性抗体连同生物素化趋化因子(1μM)或相应的趋化因子受体抗体一起染色30分钟(表2)。通过在生物素和荧光团结合的链霉亲合素之间的相互作用来检测生物素化趋化因子。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)来分析样品。
[0298] 3.通过与生物素化趋化因子结合的基质来清除细胞
[0299] 由外周血制备细胞(第1部分)。在50mL PBS中洗涤与0.4mg/mL链霉亲合素(GE TMHealthcare)结合的1mL琼脂糖凝胶BigBead基质，并加入5mL聚苯乙烯管(BD Falcon )。
将生物素化趋化因子(1μM)加入所述管并在室温下温育20分钟，以能够通过生物素-链霉亲合素相互作用将趋化因子固定在基质上。接着，将细胞加入趋化因子-基质，并在室温TM
下温育20分钟。在无菌40μm尼龙过滤器(BD Falcon Cell Strainer)中通过用PBS洗涤基质来除去并未结合于基质的细胞。用抗体(表2)染色流过的细胞，通过流式细胞术加以分析，并与没有用趋化因子-基质温育的来自外周血的细胞比较。
将生物素化趋化因子(1μM)加入所述管并在室温下温育20分钟，以能够通过生物素-链霉亲合素相互作用将趋化因子固定在基质上。接着，将细胞加入趋化因子-基质，并在室温TM
下温育20分钟。在无菌40μm尼龙过滤器(BD Falcon Cell Strainer)中通过用PBS洗涤基质来除去并未结合于基质的细胞。用抗体(表2)染色流过的细胞，通过流式细胞术加以分析，并与没有用趋化因子-基质温育的来自外周血的细胞比较。
[0300] 结果和讨论
[0301] 1.外周血的流式细胞分析
[0302] 通过流式细胞术，分析了来自CLL患者的白细胞。与健康血液中大约2%相比，患者具有高度增加数目的循环B细胞（92%）(图6)。该发现在CLL中是常见的，其中恶性B细胞经历广泛的增殖，积累在骨髓和血液中并挤出健康血细胞。
[0303] 2.趋化因子结合试验
[0304] 基于流式细胞术数据和通过抗CCR7抗体结合，所有B细胞显示表达趋化因子受体CCR7(图7)。CCR7对于淋巴结归巢是重要的，其中所述淋巴结归巢是通过结合于趋化因子如MIP3b(CCL19)和SLC(CCL21)（其表达在淋巴样组织中）所介导。根据CCR7表达，所有B细胞结合于生物素化MIP3b(bMIP3b)(图8)。
[0305] 3.通过与生物素化趋化因子结合的基质来清除细胞
[0306] 利用bMIP3b-结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素基质，有效地清除了B细胞。在清除以前，B细胞占细胞的89.1%，而在清除以后，则占26.4%(图9)。
[0307] 我们的结论是，在CLL中的B细胞表达CCR7并且结合配体bMIP3b。另外，利用与bMIP3b结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素基质，可以除去大多数(62.7%)的CCR7表达B细胞。
[0308] 实施例2B–利用生物素化MDC(CCL22)通过除去CCR4表达Treg来治疗癌症
[0309] 材料和方法
[0310] 1.外周血的流式细胞分析
[0311] 将来自患者和健康对照的外周血收集在肝素管中。在37℃下利用FixBuffer(磷酸盐缓冲盐水(PBS)柠檬酸盐，包含4%多聚甲醛)溶解红细胞4分钟，并在37℃下利用溶解缓冲液(PBS，包含10mM Tris和160mMNH4Cl，pH7.5)溶解红细胞15分钟。用包含2%牛生长血清的PBS洗涤细胞，在室温下(RT)用10%人血清温育15分钟，然后在4℃下用抗体(表3)染色30分钟。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)，来分析细胞。
[0312]抗体 荧光团 供应商
CCR4 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CD127 PE Cy7 Biolegend
CD4 V500 Biolegend
CD25 APCCy7 Biolegend
CD3 太平洋蓝（Pacific blue） BD Biosciences
链霉亲合素 PerCpCy5.5 BD Biosciences
CD25 FITC BD Biosciences
CCR4 PerCP Cy5.5 BD Biosciences
CD127 PE Cy7 Biolegend
CD4 V500 Biolegend
CD25 APCCy7 Biolegend
CD3 太平洋蓝（Pacific blue） BD Biosciences
链霉亲合素 PerCpCy5.5 BD Biosciences
CD25 FITC BD Biosciences
[0313] 表3.用于流式细胞分析的抗体列表
[0314] 2.趋化因子结合试验
[0315] 将来自患者和健康对照的外周血收集在肝素管中。在37℃下利用FixBuffer(磷酸盐缓冲盐水(PBS)柠檬酸盐，包含4%多聚甲醛)溶解红细胞4分钟，并在37℃下利用溶解缓冲液(PBS，包含10mM Tris和160mMNH4Cl，pH7.5)溶解红细胞15分钟。用包含2%牛生长血清的PBS洗涤细胞，在室温下(RT)用10%人血清温育15分钟，然后在4℃下用细胞特异性抗体连同生物素化趋化因子(1μM)或相应的趋化因子受体抗体一起(表3)染色30分钟。通过在生物素和荧光团结合的链霉亲合素之间的相互作用来检测生物素化趋化因子。通过流式细胞术，在FACS Canto流式细胞仪上，通过FACSDiva软件(BD Biosciences)，来分析细胞。
[0316] 3.通过与生物素化趋化因子结合的基质来清除细胞
[0317] 由外周血制备细胞(第1部分)。在50mL PBS中洗涤与0.4mg/mL链霉亲合素(GE TMHealthcare)结合的1mL琼脂糖凝胶BigBeads基质并加入5mL聚苯乙烯管(BD Falcon )。
将生物素化趋化因子(1μM)加入所述管并在室温下温育20分钟，从而能够通过生物素-链霉亲合素相互作用将趋化因子固定在基质上。接着，将细胞加入趋化因子-基质，并TM
在室温下温育20分钟。通过在无菌40μm尼龙过滤器(BD Falcon Cell Strainer)中用PBS洗涤基质来除去并未结合于基质的细胞。用抗体(表3)染色流过的细胞，通过流式细胞术加以分析，并与没有用趋化因子-基质温育的来自外周血的细胞相比较。
将生物素化趋化因子(1μM)加入所述管并在室温下温育20分钟，从而能够通过生物素-链霉亲合素相互作用将趋化因子固定在基质上。接着，将细胞加入趋化因子-基质，并TM
在室温下温育20分钟。通过在无菌40μm尼龙过滤器(BD Falcon Cell Strainer)中用PBS洗涤基质来除去并未结合于基质的细胞。用抗体(表3)染色流过的细胞，通过流式细胞术加以分析，并与没有用趋化因子-基质温育的来自外周血的细胞相比较。
[0318] 结果和讨论
[0319] T调节细胞(Treg)是T细胞的亚群，其抑制免疫系统以保持免疫稳态。在癌症中，Treg可以抑制针对肿瘤的有效免疫反应，因此除去Treg可以导致针对癌细胞更好的免疫激活。通过流式细胞术，分析了来自膀胱癌(UBC)和胰腺癌(PC)患者的白细胞的趋化因子受体的表达。癌症患者显示增加频率的循环T调节细胞(Treg)，其表达趋化因子受体CCR4（基于流式细胞术数据以及通过抗CCR4抗体的结合）(图10)。
[0320] 在UBC和PC患者中，与总T细胞群体相比，在Treg上CCR4高度上调(图11)。
[0321] 用于CCR4的配体是趋化因子MDC(CCL22)。按照CCR4表达，Treg结合于生物素化MDC(bMDC)(图12)。
[0322] 使用bMDC-结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素基质，可以清除CCR4表达T细胞(图13)。
[0323] 我们的结论是，在PC和UBC中，表达CCR4的Treg的频率增加。这些细胞可以结合配体bMDC。Treg比常规T细胞表达显著更多的CCR4，因此可以使用与bMDC结合的琼脂糖凝胶链霉亲合素基质来特异性地除去。
[0324] 实施例3至10
[0325] 一般方案–趋化因子的合成
[0326] 装配：
[0327] 在ABI433肽合成仪上利用标准Fmoc固相肽合成(SPPS)技术，来进行趋化因子的化学合成。DIC(0.5M，在DMF中)和OxymaPure(0.5M，在DMF中)用于激活，乙酸酐(0.5M，在DMF中)用于加帽，以及处于DMF中的20%哌啶用于Fmoc脱保护。Rink Amide树脂用于产生C端酰胺趋化因子以及Wang树脂用于产生C端酸趋化因子。在装配以后，用DMF和DCM洗涤树脂，然后真空干燥。
[0328] Dde保护的除去：
[0329] 通过用处于DMF(200ml)中的2.5%肼溶液来处理树脂2小时以上，以除去Dde保护基团。然后用DMF洗涤树脂。
[0330] 标记步骤：
[0331] 1.偶联Fmoc-8-氨基-3,6-二辛酸(PEG)
[0332] 在DMF中溶胀树脂，然后添加Fmoc-8-氨基-3,6-二辛酸(0.38g,1mmol)的溶液、DIC溶液(2ml，0.5M，在DMF中)和OxymaPure溶液(2ml，0.5M，在DMF中)。超声处理混合物3小时，然后用DMF洗涤。
[0333] 2.加帽
[0334] 用乙酸酐溶液(0.5M，在DMF中，10ml)将树脂加帽5分钟，然后用DMF洗涤。
[0335] 3.Fmoc脱保护
[0336] 通过用处于DMF溶液中的20%哌啶(2x50ml)各自处理15分钟来进行Fmoc脱保护。用DMF洗涤树脂。
[0337] 4.偶联生物素-OSu
[0338] 将处于DMF(10ml)中的生物素-OSu(341mg,1mmol)和DIPEA(348 μl)的溶液加入树脂，并超声处理混合物3小时。用DMF充分洗涤树脂，然后真空干燥DCM。
[0339] 切割：
[0340] 用包含由以下各项组成的清除剂混合物的TFA(10ml)处理干燥树脂：TIS(500μl)、苯甲硫醚(500μl)、水(500μl)、DMS(500μl)、EDT(250μl)、NH4I(500μg)和苯酚(500μg)，并在室温下搅拌混合物5小时。将溶液过滤进入冷醚并用TFA冲洗树脂。
离心沉淀的肽，用醚洗涤，离心并冷冻干燥。
离心沉淀的肽，用醚洗涤，离心并冷冻干燥。
[0341] 纯化方案：
[0342] 通过反相HPLC(RP-HPLC)利用Jupiter C18,250x21mm柱，9ml/分钟，用优化梯度洗脱[缓冲液A：包含0.1%TFA的水，缓冲液B：包含0.1%TFA的乙腈]，来纯化粗制肽。
[0343] 折叠方案：
[0344] 将纯肽(10mg)溶解于6M GnHCl(16ml)，然后快速稀释至2M GnHCl浓度（通过添加包含0.3mM GSSG和3mM GSH的50mM TRIS pH8.5(84ml)）。在室温下搅拌混合物24小时，然后通过RP-HPLC(Jupiter C18,250x4.6mm柱，10-60%B，经过30分钟)加以分析。通过RP-HPLC利用优化梯度进行纯化以提供所期望的产物。
[0345] 实施例3-生物素MCP-2(CCL8)
[0346] 靶分子：在Lys(75)的ε-氨基侧链官能团处用PEG-生物素(TFA盐)衍生的MCP-2
[0347] 修饰：对应于残基1-76的人MCP-2最初被表达为包含趋化因子折叠的99个氨基酸，和被切割掉的23个氨基酸信号肽。在生理条件下，在蛋白质的N端处的Gln经历pyroGlu形成。因此，该序列的Gln1由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。通过在树脂上生物素化来修饰在位置75处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0348] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，在氨基酸75(K)处连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0349] H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKR GKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP-NH2
[0350] X1=pyroGlu或Gln
[0351] X75=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)被生物素化
[0352] 在固体载体(Rink Amide树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案来组装工程化MCP-2序列：
[0353] H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKR GKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP-NH2
[0354] X1=pyroGlu或Gln
[0355] X75=K(ivDde)
[0356] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基75，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:2)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:3)。
[0357] H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKR GKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP-NH2
[0358] X1=pyroGlu或Gln
[0359] X75=K(PEG-生物素)
[0361] 功能测定数据：
[0362] 在针对hCCR2b(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试生物素MCP-2的活性，并且表明是部分激动剂，其中EC50值为50.9nM。参考，重组天然MCP-2的EC50是23.5nM(部分激动剂)。
[0363] 实施例4–生物素RANTES(CCL5)
[0364] 靶分子：在Lys(67)的ε-氨基侧链官能团处用生物素(TFA盐)衍生的RANTES[0365] 修饰：对应于残基1-68的人RANTES最初被表达为包含趋化因子折叠的91个氨基酸，和被切割掉的23个氨基酸信号肽。在序列内的单个甲硫氨酸(Met67)被突变为赖氨酸，以在链装配期间减轻该残基的氧化，这在自然序列衍生物的合成过程中被观测到。这种Met至Lys替代提供了在位置67处的赖氨酸，通过在树脂上生物素化将其修饰。
[0366] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，在氨基酸67(K)处连接生物素分子之前：
[0367] H-SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEKS-OH
[0368] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案来组装工程化RANTES序列：
[0369] H-SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEXS-RESIN
[0370] X=K(ivDde)
[0371] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基67，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:5)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:6)。
[0372] H-SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEXS-OH
[0373] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)
[0374] 纯化折叠生物素RANTES的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8068.9Da；预期值8070.2Da。
[0375] 功能测定数据：
[0376] 在针对hCCR5(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试生物素RANTES的激动剂活性，并且报道了0.5nM的EC50值。
[0377] 实施例5–生物素 )
[0378] 靶分子：在Lys(68)的ε-氨基侧链官能团处用PEG-生物素(TFA盐)衍生的MIP-3α
[0379] 修饰：对应于残基1-70的人MIP-3α最初被表达为包含趋化因子折叠的96个氨基酸，和被切割掉的26个氨基酸信号肽。通过在树脂上生物素化，来修饰在位置68处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0380] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，在氨基酸68(K)处连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0381] H-ASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVKNM-OH
[0382] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化MIP-3α序列：
[0383] H-ASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVXNM-RESIN
[0384] X=K(ivDde)
[0385] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基68，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:8)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:9)。
[0386] H-ASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVXNM-OH
[0387] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)被生物素化
[0388] 纯化折叠生物素Mip-3α的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8396.4Da；预期值8397.0Da。
[0389] 功能测定数据：
[0390] 在针对hCCR6(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试生物素MIP-3α的激动剂活性，并且报道了1.6nM的EC50值。参考，重组天然MIP-3α的EC50是1.0nM。
[0391] 实施例6–生物素SDF-1α(CXCL12)
[0392] 靶分子：在Lys(64)的ε-氨基侧链官能团处用生物素(TFA盐)衍生的SDF-1α[0393] 修饰：对应于成熟蛋白的残基1-67的人SDF-1α的截短形式，其包括对应于趋化因子折叠的序列。全长成熟蛋白是72个氨基酸(信号肽是在93个氨基酸不成熟蛋白质中的21个氨基酸)。通过在树脂上生物素化来修饰在位置64处的自然发生的赖氨酸。
[0394] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:10)，在氨基酸64(K)处连接生物素分子之前：
[0395] H-KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALN-OH
[0396] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案来组装工程化SDF-1α序列：
[0397] H-KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKXALN-RESIN
[0398] X=K(ivDde)
[0399] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基64，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:11)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:12)。
[0400] H-KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEXALN-OH
[0401] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(生物素)被生物素化
[0402] 纯化折叠生物素SDF-1α的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8055.5Da；预期值8057.5Da。
[0403] 功能测定数据：
[0404] 在针对hCXCR4(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试了生物素SDF-1α的激动剂活性，并且报道了17.3nM的EC50值。参考，重组天然SDF-1α的EC50是12.0nM。
[0405] 实施例7–生物素MDC(CCL22)
[0406] 靶分子：在Lys(66)的ε-氨基侧链官能团处用PEG-生物素(TFA盐)衍生的MDC[0407] 修饰：对应于残基1-69的人MDC最初被表达为包含趋化因子折叠的93个氨基酸，和被切割掉的24个氨基酸信号肽。通过在树脂上生物素化来修饰在位置66处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0408] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:13)，在氨基酸66(K)处连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0409] H-GPYGANMEDSVCCRDYVRYRLPLRVVKHFYWTSDSCPRPGVVLLTFRDKEICADPRVPWVKMILNKLSQ-NH2
[0410] 在固体载体(Rink Amide树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化MDC序列：
[0411] H-GPYGANMEDSVCCRDYVRYRLPLRVVKHFYWTSDSCPRPGVVLLTFRDKEICADPRVPWVKMILNXLSQ-树脂
[0412] X=K(ivDde)
[0413] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基66，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:14)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:15)。
[0414] H-GPYGANMEDSVCCRDYVRYRLPLRVVKHFYWTSDSCPRPGVVLLTFRDKEICADPRVPWVKMILNXLSQ-NH2
[0415] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)被生物素化
[0416] 纯化折叠生物素MDC的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8456.1Da；预期值8456.9Da。
[0417] 功能测定数据：
[0418] 在针对hCCR4(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试生物素MDC的激动剂活性并且报道了4.5nM的EC50值。参考，重组天然MDC的EC50是3.6nM。
[0419] 实施例8–生物素TARC(CCL17)
[0420] 靶分子：在Lys(72)的ε-氨基侧链官能团处用PEG-生物素(TFA盐)衍生的TARC[0421] 修饰：对应于残基1-71的人TARC最初被表达为包含趋化因子折叠的94个氨基酸，和被切割掉的23个氨基酸信号肽。在C端，在位置72处，插入另外的赖氨酸，并通过在树脂上生物素化加以修饰。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0422] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:16)，在氨基酸72(K)处连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0423] H-ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVT VQGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSX-NH2
[0424] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)
[0425] 在固体载体(Rink Amide树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化TARC序列：
[0426] H-ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVTVQGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSX-树脂
[0427] X=K(ivDde)
[0428] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基72，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:17)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:18)。
[0429] H-ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVT VQGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSX-NH2
[0430] X=K(PEG-生物素)
[0431] 纯化折叠生物素TARC的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8577.2Da；预期值8577.8Da。
[0432] 功能测定数据：
[0433] 在针对hCCR4(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试了生物素TARC的激动剂活性，并且报道了3.1nM的EC50值。参考，重组天然TARC的EC50是2.6nM。
[0434] 实施例9–生物素MIP-3β(CCL19)
[0435] 靶分子：在Lys(78)的ε-氨基侧链官能团处用生物素(TFA盐)衍生的MIP-3β[0436] 修饰：对应于残基1-77的人MIP-3β最初被表达为包含趋化因子折叠的98个氨基酸，和被切割掉的21个氨基酸信号肽。在C端，在位置78处，插入另外的赖氨酸，并通过在树脂上生物素化加以修饰。
[0437] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:19)，在氨基酸78(K)处连接生物素分子之前：
[0438] H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTL RGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-NH2
[0439] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K(PEG-生物素)
[0440] 在固体载体(Rink Amide树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化MIP-3β序列：
[0441] H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTL RGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-树脂
[0442] X是FmocLys(ivDde)
[0443] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基78，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:20)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:21)。
[0444] H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTL RGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-NH2
[0445] X是K(生物素)
[0446] 纯化折叠生物素MIP-3β的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=9148.8Da；预期值9149.7Da。
[0447] 功能测定数据：
[0448] 在针对hCCR7(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试了生物素Mip-3β的激动剂活性，并报道了11.0nM的EC50值。参考，重组天然MIP-3β的EC50是1.6nM。
[0449] 实施例10–生物素ITAC(CXCL11)
[0450] 靶分子：在C端，在PEG间隔物(TFA盐)之后插入的另外的赖氨酸的ε-氨基侧链官能团处用生物素衍生的ITAC
[0451] 修饰：对应于残基1-73的人ITAC最初被表达为包含趋化因子折叠的94个氨基酸，和被切割掉的21个氨基酸信号肽。在C端插入PEG间隔物和另外的赖氨酸，并通过在树脂上生物素化加以修饰。在C端在蛋白质和另外的赖氨酸之间结合PEG间隔物。
[0452] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:22)，在连接PEG间隔物、另外的赖氨酸和生物素分子之前：
[0453] H-FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNF-OH
[0454] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化ITAC序列：
[0455] H-FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX-树脂
[0456] X是PEG-K(ivDde)
[0457] 在C端结合Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸，接着FmocLys(ivDde)-OH，以在另外Lys(SEQ ID NO:24)的ε-氨基侧链官能团处促进用生物素位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:25)。
[0458] H-FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITL KENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX-OH
[0459] X是PEG-K(生物素)
[0460] 纯化折叠生物素ITAC的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8866.5Da；预期值8860.6Da。
[0461] 功能测定数据：
[0462] 在针对hCXCR3(Euroscreen)水母发光蛋白测定中，测试生物素ITAC的激动剂活性，并报道了15.7nM的EC50值。参考，重组天然ITAC的EC50是0.7nM。
[0463] 实施例11–生物素TECK(CCL25)
[0464] 靶分子：在Lys72的ε-氨基侧链官能团处用PEG-生物素(TFA盐)衍生的TECK(Met至Nleu替代)
[0465] 修饰：对应于成熟蛋白的残基1-74的人TECK的截短形式，其包括对应于趋化因子折叠的序列。全长成熟蛋白是127个氨基酸(信号肽是在150个氨基酸的不成熟蛋白质中的23个氨基酸)。在序列内的单个甲硫氨酸被改变为正亮氨酸，以在链装配期间减轻该残基的氧化，这是在自然序列衍生物的合成过程中观测到的。在生理条件下，在蛋白质N端处的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列的Gln1由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。通过在树脂上生物素化来修饰在位置72处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0466] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:26)，在氨基酸72(K)处，连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0467] H-XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYL PKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF-OH
[0468] X1=pyroGlu或Gln
[0469] X64=正亮氨酸
[0470] X72=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化
[0471] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化TECK序列：
[0472] H-XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF-树脂
[0473] X1=pyroGlu或Gln
[0474] X64=正亮氨酸
[0475] X72=K(ivDde)
[0476] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基72，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:27)的该位置处的位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:28)。
[0477] H-XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYL PKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF-OH
[0478] X1=pyroGlu或Gln
[0479] X64=正亮氨酸
[0480] X72是K(PEG-生物素)
[0481] 纯化折叠生物素TECK(Met至Nleu替代)的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=8958.5Da；预期值8959.6Da。
[0482] 功能测定数据：
[0483] 在针对hCCR9(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试了生物素TECK(Met至Nleu替代)的激动剂活性，并报道了63.6nM的EC50值。参考，重组天然TECK的EC50是67.9nM。
[0484] 实施例12–生物素CTAC(CCL27)
[0485] 靶分子：在Lys(87)的ε-氨基侧链官能团处，用PEG-生物素(TFA盐)衍生的CTAC
[0486] 修饰：对应于残基1-88的人CTAC最初表达为包含趋化因子折叠的112个氨基酸，和被切割掉的24个氨基酸信号肽。在序列内的Met(87)被突变为赖氨酸以提供在位置87处的赖氨酸，在树脂上通过生物素化，将其修饰。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0487] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:29)，在连接PEG间隔物和生物素分子之前：
[0488] FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0489] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化
[0490] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmo方案，来组装工程化CTAC序列：
[0491] H-FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFV LHLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG-树脂
[0492] X=K(ivDde)
[0493] 结合FmocLys(ivDde)-OH作为残基87，以促进在蛋白质(SEQ ID NO:30)的该位置处位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子(SEQ ID NO:31)。
[0494] H-FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADGDCHLQAFV LHLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG-OH
[0495] X=K(PEG-生物素)
[0496] 纯化折叠生物素CTAC的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=10513.4Da；预期值10514.2Da。
[0497] 功能测定数据：
[0498] 在针对hCCR10(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中，测试了生物素CTAC的激动剂活性，并报道了49.4nM的EC50值。参考，重组天然CTAC的EC50是33.5nM。
[0499] 实施例13–生物素IP-10(CXCL10)
[0500] 靶分子：在C端在PEG间隔物(TFA盐)之后插入的另外的赖氨酸的ε-氨基侧链官能团处用生物素衍生的IP-10
[0501] 修饰：对应于残基1-77的人IP-10最初表达为包含趋化因子折叠的98个氨基酸，和被切割掉的21个氨基酸信号肽。在C端插入PEG间隔物和另外的赖氨酸，并通过在树脂上的生物素化加以修饰。将PEG间隔物结合在C端在蛋白质和另外的赖氨酸之间。
[0502] 示出线性氨基酸序列(SEQ ID NO:32)，在连接PEG间隔物、另外的赖氨酸和生物素分子之前：
[0503] H-VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK KGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP-OH
[0504] 在固体载体(Wang树脂)上，利用如在一般性方案部分中所描述的用于固相肽合成的Fmoc方案，来组装工程化IP-10序列：
[0505] H-VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK KGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPX-树脂
[0506] X是K(ivDde)，可选地通过间隔物如PEG，例如-PEG-K(ivDde)，加以连接[0507] 在C端结合Fmoc-8-氨基-3,6-二辛酸，接着FmocLys(ivDde)-OH，以促进在另外Lys(SEQ ID NO:33)的ε-氨基侧链官能团处用生物素进行位点特异性标记。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联生物素。如所描述的，进行切割、纯化和折叠方案，以提供所期望的活性趋化因子。因此，最终活性趋化因子具有以下序列(SEQ ID NO:34)：
[0508] H-VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK KGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPX-OH
[0509] X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，并且可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K(PEG-生物素)被生物素化并且可以通过间隔分子，例如PEG-K(Biotin)加以连接
[0510] 纯化折叠生物素IP-10的电喷射离子化串联质谱法(ESI-TOF-MS)数据：实验值=9141.0Da；预期值9141.9Da。
[0511] 功能测定数据：
[0512] 在针对hCXCR3(Euroscreen)的水母发光蛋白测定中测试了生物素IP-10的激动剂活性并且报道了8.7nM的EC50值。参考，重组天然IP-10的EC50是4.4nM。
[0513] 本发明的各种实施方式并不限于本文描述的具体实施方式的范围。实际上，对于本领域技术人员而言，依据以上描述和附图，可以清楚除本文描述的那些以外，本发明的各种实施方式的各种改进。这样的改进旨在落在所附权利要求的范围内。此外，本文描述的所有实施方式被认为是广泛适用的并且可与任何和所有其他一致的实施方式相结合（在适当的情况下）。
[0514] 本文引用了多种出版物，其公开的内容以引用方式整体结合于本文。
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