Cupredoxin家族多肽在癌症治疗中的用途
专利汇可以提供Cupredoxin家族多肽在癌症治疗中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于调节细胞死亡的细胞毒性因子，以及它们在 治疗 与 坏死 或凋亡相关病症的方法中的用途。本发明也涉及鉴定用于治疗与细胞死亡或不受控制的生长相关病症的活性剂的方法。本 发明人 发现不同 微 生物 产生具有抗 肿瘤 活性的不同细胞毒性因子。基本纯的细胞毒性因子可用于治疗感染性 疾病 或癌症的方法中。，下面是Cupredoxin家族多肽在癌症治疗中的用途专利的具体信息内容。
1.一种治疗与细胞死亡抗性相关的病症的方法，包括给予有效量 的cupredoxin，或其变体或衍生物，以在显示细胞死亡抗性的细胞中 促进细胞死亡。
2.权利要求1的方法，其中所述cupredoxin或其变体或衍生物结合 肿瘤抑制蛋白p53。
3.权利要求1的方法，其中所述cupredoxin选自由天青蛋白、假天 青蛋白、质体蓝素和铁硫菌蓝蛋白组成的一组。
4.权利要求3的方法，其中所述cupredoxin是天青蛋白。
5.权利要求4的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO：1 氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列相同性的氨基酸 序列的天青蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO：1 氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列相同性的氨基酸 序列的天青蛋白，并且其中所述cupredoxin结合肿瘤抑制蛋白p53。
7.权利要求4的方法，其中所述天青蛋白包含SEQ ID NO：6的氨 基酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述天青蛋白包含SEQ ID NO：7的氨 基酸序列。
9.权利要求3的方法，其中所述cupredoxin是质体蓝素。
10.权利要求9的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO：2 氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序 列的质体蓝素。
11.权利要求3的方法，其中所述cupredoxin是假天青蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO：4 氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少90％序列相同性的氨基酸序 列的假天青蛋白。
13.权利要求3的方法，其中所述cupredoxin是铁硫菌蓝蛋白。
14.权利要求13的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO：3 氨基酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少90％序列相同性的氨基酸序 列的铁硫菌蓝蛋白。
15.一种治疗与细胞死亡抗性相关的病症的方法，包括给予有效 量的细胞色素C551或其变体或衍生物，以在显示细胞死亡抗性的细胞 中促进细胞生长停止。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞色素C551包含SEQ ID NO：5 的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5具有至少90％的序列相同性的氨基 酸序列。
17.权利要求15的方法，其中与细胞死亡抗性相关的病症选自由 人黑素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、间质细胞癌、结肠癌和 呼吸消化道癌组成的一组。
18.权利要求17的方法，其中与细胞死亡抗性相关的病症是乳腺 癌。
19.权利要求15的方法，进一步包含给予有效量的选自由天青蛋 白、假天青蛋白、质体蓝素和铁硫菌蓝蛋白组成的一组的cupredoxin。
20.权利要求1的方法，其中与细胞死亡抗性相关的病症选自由人 黑素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、间质细胞癌、结肠癌和呼 吸消化道癌组成的一组。
21.权利要求20的方法，其中与细胞死亡抗性相关的病症是乳腺 癌。
发明领域
[003]本发明涉及由微生物分泌的细胞毒性因子和细胞毒性因子 抑制剂，以及它们在引起细胞生长停止和通过坏死和凋亡调节细胞死 亡中的用途。本发明也涉及这些细胞毒性因子的生产、分离和鉴别的 方法，涉及掺入基本纯细胞毒性因子的用于调节细胞死亡和导致细胞 生长停止的组合物。本发明也涉及治疗与凋亡相关疾病的方法。更具 体而言，本发明涉及基本纯细胞毒性因子在癌细胞中诱导凋亡或细胞 生长停止的方法中的用途，涉及细胞毒性因子抑制剂在治疗感染或其 他病原体诱发病症中的用途。
背景
[004]感染性疾病可以是许多环境因素的产物。任何感染性疾病 均涉及造成感染的因素。感染因素一般是致病微生物，例如致病细菌。 致病微生物击败防御机制并导致疾病的程度或能力与它的毒力相关。 已知致病性和非致病性微生物均表达细胞毒性因子，其允许微生物在 宿主免疫系统中防护自身并阻止吞噬细胞(例如巨噬细胞和肥大细胞) 从身体清除微生物。当致病微生物存活时，微生物可侵入宿主组织并 增殖，造成严重的疾病症状。致病细菌已被鉴定是许多虚弱性或致命 性疾病的根本原因，所述疾病例如结核病、霍乱、百日咳、鼠疫和类 似疾病。为治疗这些严重感染，施用药物(例如抗生素)则杀死感染因 素或消除细胞毒性因子，从而感染因素不再能够在对抗宿主免疫系统 中防护自身。然而，致病性细菌通常对抗生素产生抗药性，需要改良 药物来阻止由这些微生物引起的感染的蔓延。
[005]癌症是潜在的无限生长的恶性肿瘤。其主要是在人体内发 现的多种类型细胞的致病性复制(正常调控的丧失)。这些疾病的最初 治疗通常是外科手术、放射线治疗或这些疗法的组合，但时常发生局 部复发和转移疾病。对于一些癌症可采用化学治疗，但这些很少诱导 长期的消退。因此，它们经常是无法治愈的。通常，在称作多药耐药 发生的结果下，化学治疗变得对肿瘤及其转移难于治疗。在许多病例 中，肿瘤对一些类型的化学治疗药物具有本能的抗药性。此外，这些 威胁到非癌细胞的疗法对人体产生应激，并产生许多副作用。因此需 要改良药物来阻止癌细胞的扩散。
[006]已知当病人被致病性细菌感染时，许多肿瘤消退。然而， 对细菌感染如何引起人类癌症消退了解甚少。
概述
[007]本发明涉及细胞毒性因子，其通过坏死或凋亡刺激细胞死 亡，或者导致细胞生长停止。一方面，表征和分离了基本纯的细胞毒 性因子。通过对已暴露于致病性微生物的培养基的柱色谱分级分离得 到基本纯细胞因子。优选，在哺乳动物蛋白存在下在致病生物生长期 间刺激这些细胞毒性因子的生成和分泌。
[008]本发明的另一方面，作为描绘毒性和非毒性微生物的方法， 对哺乳动物蛋白受体的鉴定可导致提高疾病治疗的特异性。
[009]本发明的另一方面涉及治疗与细胞死亡抗性或易感性相关 疾病的方法，其包括的步骤是施用细胞毒性因子、细胞毒性因子抑制 剂或其变体或衍生物，这些物质任选掺入药物学载体中。
[010]细胞毒性因子或其变体或衍生物可掺入用于预防和治疗与 异常细胞增生相关疾病的药物学组合物中。例如，细胞毒性因子可用 于治疗癌症。
[011]通过阻止巨噬细胞死亡并因此允许宿主免疫体系同入侵病 原体斗争，细胞毒性因子抑制剂或其变体或衍生物可用于治疗细菌感 染。
[012]在本发明的另一个实施方案中，细胞毒性因子及其分泌系 统的组分可用作对抗感染因素的疫苗候选者。
[013]本发明也涉及调节细胞死亡的方法，其包含控制细胞毒性 因子分泌的步骤。在一个实施方案中，细胞毒性因子可用作对抗人癌 症细胞宿主的抗癌药。细胞毒性因子也可用作通过抑制剂的筛选或合 理设计进行的药物研发的靶标。
[014]本发明也涉及调节细胞死亡的方法，其包含使用细胞毒性 因子例如天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白 (pseudoazurin)或细胞色素c551，或这些细胞毒性因子突变体。
[015]本发明的这些和其它方面、优点和特征将通过下面的附图 和优选实施方案的详细说明而变得显而易见。
附图的简述
[016]图1：图表显示了在来自洋葱假单胞菌培养基的过滤的培养 基上清液(SUP)或羟基磷灰石滤过(HAFT)、ATP-琼脂糖滤过(AAFT)、 和Q-琼脂糖滤过(QSFT)的色谱柱级分存在或不存在下，1.0mM ATP 对巨噬细胞杀伤的影响。通过对细胞内酶乳酸脱氢酶(LDH)释放来测 定巨噬细胞的死亡程度。在测试中使用来自每种级分的2μg蛋白质。 所有的测试重复操作3次，并标明误差杆。
[017]图2：图表显示在ATP不存在下，洋葱假单胞菌的经过滤 的培养基上清液(SUP)和色谱柱级分(HAFT、AAFT和QSFT)对巨噬 细胞死亡的作用。通过对细胞内酶乳酸脱氢酶(LDH)释放来测定巨噬 细胞的死亡程度。所有的测试重复操作3次，并标明误差杆。
[018]图3：该图显示经洋葱假单胞菌QSAFT级分处理的J774巨 噬细胞胞浆提取物中胱天蛋白酶(图3A-胱天蛋白酶-3；图3B-胱天蛋 白酶-9)的活性。胞浆提取物从与洋葱假单胞菌QSFT级分培养过夜的 巨噬细胞和未处理的巨噬细胞制得。用于测定胱天蛋白酶-3活性的底 物是AcDEVD-pNA(N-乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺)。胱天蛋白 酶-9活性的底物是Ac-LEHD-pNA(N-乙酰-Leu-Glu-His-Asp-对硝基 苯胺)。在37℃将提取物与底物按照标明的时间培养。每组使用10μ g巨噬细胞胞浆蛋白。在405nm处用光谱光度测量pNA(对硝基苯胺) 的释放。
[019]图4：图表显示了在天青蛋白(Az)、细胞色素c551(Cyt C551) 和它们的组合存在下，用％乳酸脱氢酶(LDH)的释放来测定的巨噬细 胞中的细胞毒性。数字代表μg蛋白质。缓冲液对照(缓冲液)在右侧 显示。
[020]图5：图表显示在免疫前血清存在下，抗天青蛋白抗体和抗 细胞色素c551抗体对洋葱假单胞菌(A)和牛型分枝杆菌(B)QSFT级分 的细胞毒性影响。A，天青蛋白(50ug)；C，细胞色素c551(25ug)；ab， 抗天青蛋白抗体和抗细胞色素c551抗体的组合；P，免疫前血清。每 次测试使用2μg QSFT级分。ab和P后的数目代表抗体或免疫前蛋白 μg数。结果以重复三次试验的平均值±标准差来显示。
[021]图6：该图显示了诱导黑素瘤细胞(UISO-Mel-2)后，在裸鼠 中注射天青蛋白/细胞色素c551对肿瘤大小的影响。裸鼠皮下注射约 106UISO-Mel-2细胞，接着每周一次腹膜内注射柠檬酸缓冲液(对照)、 已知的抗黑素瘤药物DTIC(7.5ug)或每周三次高(150μg天青蛋白 /75μg细胞色素C551)或低(10μg天青蛋白/5μg细胞色素C551)剂量的 天青蛋白/细胞色素C551混合物，持续4周。在不同的时间，测定对 照组(缓冲液处理组)、DTIC处理组以及高和低剂量天青蛋白/细胞色 素C551处理组肿瘤大小(肿瘤体积)并作图。
[022]图7：该图显示了在图6描述的试验期间，小鼠体重的增加 或减少。在上述试验期间，用天平给小鼠称重，并将重量按克记录。
[023]图8：该图显示了在天青蛋白(AZ)存在或不存在下，用牛型 分枝杆菌QSFT级分处理的裸鼠中Mel-6肿瘤的消退。裸鼠皮下注射 约106UISO-Mel-2细胞。约一周后形成小肿瘤。然后在所述小鼠腹 膜内注射磷酸盐缓冲溶液(对照)、牛型分枝杆菌QSFT级分或牛型分 枝杆菌QSFT级分与天青蛋白的混合物。
[024]图9：该图显示了用各种浓度天青蛋白处理72小时后，天 青蛋白对MCF-7(■)和MDA-MB-157(□)细胞的细胞毒性。
[025]图10：该图显示了用天青蛋白(■)处理的裸鼠和对照组动物 (□)中MCF-7肿瘤的消退。
[026]图11(a)和(b)：图11(a)是显示铜绿假单胞菌天青蛋白氨基酸 序列与其它细菌天青蛋白的序列对比表。使用Genetyx软件进行氨基 酸序列对比。图11(b)是显示野生型天青蛋白(wt天青蛋白)和嵌和突 变天青蛋白的表格。
[027]图12(a)和(b)：图12(a)是显示野生型和氧化还原型突变天青 蛋白对巨噬细胞的细胞毒性的图。野生型天青蛋白(●)，去辅基天青 蛋白(apo-azurin)(○)，M44KM64E(▲)，C112D(△)。
[028]图12(b)是显示野生型和嵌和突变天青蛋白对巨噬细胞的细 胞毒性的图。野生型天青蛋白(●)，S1(○)，S2(▲)，S3(■)，S4(△)， S6(□)，wtS5()，wtS4S5S6(◆)，S3S5()。图12(b)也显示了突变 体的相对电子转移效率，表示为野生型天青蛋白的电子转移效率的百 分比。为计算细胞毒性的百分数，将未处理的存活细胞数目记作100 ％，并测量天青蛋白处理组样品中存活细胞数。
[029]图13：是显示天青蛋白、去辅基天青蛋白和天青蛋白突变 体对巨噬细胞的细胞凋亡活性。野生型天青蛋白(●)、去辅基天青蛋 白(○)，M44KM64E(▲)，C112D(△)。
[030]图14：图14是显示野生型天青蛋白(wt型天青蛋白▲)、铁 硫菌蓝蛋白(crude●)、去辅基铁硫菌蓝蛋白(apo-rus○)和假天青蛋 白(Paz□)细胞毒性的图。
[031]图15：是显示野生型天青蛋白(●)和质体蓝素(■)细胞毒性 的图。
实施方案的详细描述
定义
[32]根据本文说明书的意图，术语“细胞毒性因子”是指由致 病性或非致病性微生物分泌的因子，其通过坏死或凋亡促进细胞死 亡，或造成细胞生长停止。细胞毒性因子的实例包括天青蛋白、质体 蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白或细胞色素c551。术语“依赖ATP 的”，当用于修饰术语“细胞毒性因子”时，是指在5’-三磷酸腺苷 (ATP)存在下造成细胞死亡或细胞生长停止的细胞毒性因子。术语“不 依赖ATP的”，当用于修饰术语“细胞毒性因子”时，是指在5’-三 磷酸腺苷(ATP)不存在下造成细胞死亡或细胞生长停止的细胞毒性因 子。
[33]根据本文说明书的意图，术语“治疗”包含预防、降低、停 止或逆转待治疗的病症或症状的进展或严重性。同样地，术语“治疗” 酌情包括医疗性的、治疗性的和/或预防性的施用。
[34]如本文所用，术语“与细胞死亡抗性相关的病症”是指经理 智熟练的内科医生或临床医生检测，与健康的类似种类的细胞相比， 至少以延长细胞生命趋势为特征的疾病、状态或失调。术语“与细胞 死亡易感性相关的病症”，如本文所用，是指经理智熟练的内科医生 或临床医生检测，与健康的类似种类的细胞相比，至少以过早细胞死 亡趋势为特征的疾病、状态或失调。
[035]如本文所用，术语“具有功能性p53肿瘤抑制基因”是指 具有没有被失活、突变、丧失或减少生成的p53肿瘤抑制基因的细胞。
[036]如本文所用，术语“缺乏p53肿瘤抑制基因”是指具有被 失活、突变、丧失或减少生成的p53肿瘤抑制基因的细胞。例如，这 样的缺乏可能作为p53基因内的遗传畸变或与病毒和细胞致癌基因 相互作用的结果而发生。
[037]术语“基本纯”，当用作修饰术语“细胞毒性因子”时，如 本文所用，是指例如形式为基本不含或不掺杂活性抑制化合物的细胞 毒性因子，所述细胞毒性因子从分泌的培养基中分离。术语“基本纯” 是指以重量计因子在分离级分中的含量至少约75％，或至少“75％ 基本纯”。更优选，术语“基本纯”是指以重量计化合物中含至少约 85％的活性化合物，或至少“85％基本纯”。基本纯的细胞毒性因子 可与一种或多种其它基本纯化合物或分离的细胞毒性因子组合使用。
[038]如本文所用，术语细胞毒性因子的“变体或衍生物”是指 对细胞毒性因子或细胞毒性因子编码基因进行化学修饰或操纵所得 到的化合物或物质。细胞毒性因子的变体或衍生物可通过化学修饰所 述细胞毒性因子或操纵编码所述细胞毒性因子的基因来得到，例如通 过改变所述细胞毒性因子的基本构成或性状，但不改变其毒性进行。 与此类似，细胞毒性因子抑制剂的“变体或衍生物”可包含对所述抑 制剂的化学结构进行的化学修饰或对编码所述抑制剂的基因进行的 操纵。
[039]术语“氨基酸序列相同性百分数(％)”定义为当两个序列对 比时，细胞毒性因子的氨基酸残基与候选序列氨基酸残基相同性的百 分数。为测定氨基酸相同性％，进行序列对比，并且如果需要的话， 引入缺口以获得最大％序列相同性；保守取代不视为序列相同性的部 分。测定相同性百分数的氨基酸序列对比方法对于本领域技术人员是 公知的。通常使用可公开获得的计算机软件进行肽序列对比，例如 BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件。
[040]当进行氨基酸序列对比时，给定的氨基酸序列A同、与或 相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列相同性(其换句话说可表达 为具有或包含同、与或相对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列 相同性的给定氨基酸序列A)可计算为：
％氨基酸序列相同性＝X/Y·100
其中，
X是氨基酸残基数目，通过A和B的序列对比程序对比或序列对 比算法对比，该数目以相同匹配数来记分。
并且
Y是B中氨基酸残基的总数目。
[041]如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A 对B的％氨基酸序列相同性将不等于B对A的％氨基酸序列相同性。
[042]“治疗有效量”是对待治疗对象阻止病情发展或减轻现存 症状的有效量。确定治疗有效量属于本领域技术人员的能力范围。
总则
[043]本发明提供由致病性或非致病性微生物分泌，并通过坏死 或凋亡促进细胞死亡，或导致细胞生长停止的细胞毒性因子。当致病 性微生物侵入人或动物组织时，吞噬细胞成为宿主免疫系统中的第一 道防线。典型地，吞噬细胞寻找并破坏侵入体内的外源病原体。然而， 由微生物病原体分泌的细胞毒性因子在吞噬细胞中可刺激细胞死亡。 从而吞噬细胞被阻止行使其保护性免疫功能。
[044]发明人以前报道过，许多致病性细菌分泌可通过坏死引起 吞噬细胞死亡的依赖ATP的细胞毒性因子，例如利用ATP的酶。 [Zaborina O.等人，Infect.Immun.67：5231-5242(1999)；Melnikov A.等 人，Mol.Microbiol.36：1481-1493(2000)；和Punj V.等人，Infect. Immun.68：4930-4937(2000)，出于各种目的，其内容在此引作参考。] 利用ATP的酶可作用于多种与能量相关的核苷酸衍生物，例如ATP、 5’-二磷酸腺苷(ADP)、5’-腺苷酸(AMP)或腺苷，将它们转化为多种产 物，这些产物通过激活嘌呤受体来依次调节吞噬细胞例如巨噬细胞和 肥大细胞的死亡。
[045]本发明的一方面涉及发现不依赖ATP的细胞毒性因子，例 如氧化还原蛋白，也可由致病微生物的一些物种分泌，并且这些因子 通过凋亡引起吞噬细胞死亡。[Zaborina O.等人，Microbiology 146： 2521-2530(2000)，出于各种目的，其内容在此引作参考。]
[046]本发明的另一方面涉及令人惊奇地发现不依赖ATP的细胞 毒性因子在癌细胞中诱导凋亡或细胞生长停止。这些细胞毒性因子可 用于治疗与细胞死亡抗性相关的病症。这些病症可包括，例如，人黑 素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、间质癌、结肠癌和呼吸消化 道癌(例如胃癌、食管癌、喉癌和口腔癌)。
[047]通常癌细胞并不易于凋亡性死亡。这种对细胞凋亡性细胞 死亡的抗性可由编码p53肿瘤抑制蛋白的基因的失活突变造成。已知 哺乳细胞的凋亡要求p53蛋白的存在。然而，在50％人类癌症中， 在p53肿瘤抑制蛋白的编码基因上存在失活突变。
[48]尽管也已知p53在哺乳动物细胞中调节氧化还原蛋白的表 达，但是还没有发现哺乳动物氧化还原蛋白直接涉及肿瘤细胞凋亡或 生长停止的暗示。也没有发现微生物的不依赖ATP的细胞毒性因子 具有在癌症细胞中诱导凋亡或减小肿瘤大小的功能。
[049]本发明的另一方面涉及鉴别和鉴定由微生物分泌的细胞毒 性因子的方法。这些方法提供了发现细胞死亡的合适的抑制剂或刺激 剂的方法。抑制剂和刺激剂可研发成药用药物，并用于治疗以对细胞 死亡有抗性或易感性为特征的病症。
[050]本发明的另一方面涉及已被鉴定和分离的细胞毒性因子和 这些细胞毒性因子的抑制剂。依照本发明的方法，细胞毒性因子可被 激活或失活以预防或治疗与细胞死亡相关的病症。细胞毒性因子抑制 剂可用于治疗与细胞死亡易感性相关的病症。
细胞毒性因子的分泌
[051]在本发明的一方面中，本发明的细胞毒性因子可由一些不 同的致病性微生物分泌，包括细菌和原生动物。提供细胞毒性因子的 适宜的致病细菌的实例包括但不限于： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosam)(P.aeruginosa)，洋葱假单胞 菌(Burkholderia cepacia)(B.cepacia)，霍乱弧菌(Vibrio cholera)(V. cholera)，和牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(M.bovis)。此外，细 胞毒性因子可由病原体分泌，例如利什曼原虫亚马逊亚种(Leishmania amazonensis)和马来布鲁线虫(Brugia malayi)。
[052]已发现铜绿假单胞菌(一种条件致病菌)、洋葱假单胞菌(可 导致囊性纤维化病和慢性肉芽肿疾病患者致命感染)、霍乱弧菌(导致 霍乱的肠内病原体)和分枝杆菌的缓慢生长的致病群例如结核分枝杆 菌(M.tuberculosis)或牛型分枝杆菌(导致结核)能分泌利用ATP的酶。
[053]除了分泌利用ATP的酶，发明人发现铜绿假单胞菌分泌不依 赖ATP的细胞毒性因子。这些细胞毒性因子已被鉴定为两种氧化还原 蛋白：天青蛋白和细胞色素c551。洋葱假单胞菌也显示分泌氧化还原 蛋白。牛型分枝杆菌也显示分泌对吞噬细胞具有高度不依赖ATP的细 胞毒性的细胞毒性因子。
在哺乳动物蛋白存在下对细胞毒性因子分泌的刺激
[054]在本发明的另一方面，在哺乳动物蛋白存在下，细胞毒性 因子的产生和分泌在致病生物生长期间被刺激。例如，由致病微生物 例如铜绿假单胞菌、牛型分枝杆菌和洋葱假单胞菌分泌的细胞毒性因 子被哺乳动物蛋白例如κ-酪蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或α2-巨 球蛋白的存在所刺激。这提示致病微生物感受到特定哺乳动物蛋白的 存在作为哺乳动物宿主环境的指征，从而启动对细胞毒性剂的分泌系 统以反击并破坏宿主防御，但本文并不依赖于这种提示。
[055]发明人测定到一些洋葱假单胞菌的临床(有毒的)分离菌分 泌大量的利用ATP的酶，例如腺苷酸激酶或5’-核苷酸酶，而一些环境 (无毒的)分离菌只分泌减少量的这些酶。在临床分离菌例如洋葱假单 胞菌株38中，在生长培养基中存在α2-巨球蛋白情况下，细胞毒性因 子的分泌水平得到极大的提高。相比于环境分离菌，临床分离菌的分 泌物对巨噬细胞和肥大细胞具有更高水平的细胞毒性。在α2-巨球蛋 白存在下显示提高的细胞毒性因子分泌的临床分离菌也显示在它们 表面存在α2-巨球蛋白受体。
[056]在本发明的一个实施方案中，在哺乳动物蛋白存在下，不 依赖ATP的细胞毒性因子的产生和分泌在致病生物生长期间被刺激。 通过在含有哺乳动物蛋白的培养基上生长微生物生物体，可提高细胞 毒性因子的分泌。适宜的培养基例如L肉汤、营养肉汤、胰胨豆胨培 养液、胰蛋白胨-酵母提取物肉汤(Difco Laboratories，Maryland， U.S.A.)。典型地，约500-1000ml的无菌高压灭菌培养基以104至106细 胞/ml接种。然后，接种过的培养基在适合微生物生长的条件下培养， 通常处于30-37℃的旋转摇床上。对培养基、培养条件和其它影响细 菌和其它微生成功培养的因素的选择对于一名本领域技术人员显而 易见。发明人观察到培养基中细胞毒性因子的最大浓度出现在指数生 长期的晚期和稳定生长期的早期。
[057]在本发明的另一个实施方案中，对哺乳动物蛋白受体的鉴 定提供了描绘微生物有毒株和无毒株的方法。例如，α2-巨球蛋白受 体基本上存在于临床分离菌，而不存在于环境分离菌，不仅与前者分 泌细胞毒剂作为对抗宿主防御的武器的功能相关联，而且可用于在临 床有毒株和环境无毒株之间的描绘。因此，生物的有毒株可被鉴定， 然后针对其抗生素敏感性或其它临床目的进行测试。
不依赖ATP的细胞毒性因子的纯化
[058]在本发明的另一方面，基本纯的不依赖ATP的细胞毒性因子 可通过分泌型微生物的培养基的色谱柱分级分离获得。优选在分级分 离之前将细菌细胞从培养基中去除。这可通过对培养基最初的离心和 随后的过滤来实现。适宜的过滤器通常小于或等于约0.5μm的孔径， 优选约0.2μm。然而，其它去除病原体的方法对于本领域技术人员是 已知的。
[059]未分级分离的培养基不具有高度不依赖ATP的细胞毒活性， 因此色谱柱分级分离对增强凋亡诱导活性和使细胞生长停止的活性 是必需的。分级分离去除依赖ATP的细胞毒性因子。这提示分级分离 也可去除不依赖ATP的细胞毒性因子的抑制剂，该抑制剂可存在于未 分级分离的培养基中，但本文不依赖于此提示。
[060]用于纯化细胞毒性因子的色谱技术对于本领域技术人员 是已知的。这包括例如离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、亲和色谱和 凝胶过滤色谱。用于细菌培养基分级分离的色谱柱包括例如：羟基磷 灰石、Superdex 75或200、Superose 6或12、Sephacryl S、Sephadex G 或Sephadex LH、Mono Q或Mono S、Q-Sepharose、DEAE Sepharose 或CM Sepharose、Sepharose XL、ATP-Sepharose、Hi Trap Blue、Blue Sepharose、DNA Cellulose或Sepharose 2B、4B或6B，可从Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，(Sweden)或Bio-Rad Laboratories， Hercules，California，(U.S.A.)获得。
[061]利用ATP的酶可作为羟基磷灰石和ATP-琼脂糖柱的滤过或 洗脱级分通过色谱柱分级分离。在这些分级分离过程中，利用ATP的 酶，例如三磷酸腺苷酶(ATPase)或腺苷酸激酶，吸附于色谱柱，并可 被进一步去除或纯化。(参见，例如，Markaryan等人，J.Bacteriol.，183， pp 3345-3352，2001)
[062]在本发明的一个实施方案中，不依赖ATP的细胞毒性因子作 为Q-sepharose柱(QSFT)的滤过级分分离。Q-sepharose是一种季铵盐强 阴离子交换剂。这些柱子可从Amersham Pharmacia Biotech AB， Uppsala，(Sweden)获得。上清液(SUP)或其它柱级分例如羟基磷灰石柱 的滤过级分(HAFT)或ATP-琼脂糖柱滤过级分(AAFT)没有通常出现 显示高度不依赖ATP的细胞毒性。
不依赖ATP的细胞毒性因子的鉴定
[063]在本发明的其它方面，测试分级分离过的培养基中不依赖 ATP的细胞毒性因子的存在。细胞死亡的程度可通过细胞内酶乳酸脱 氢酶(LDH)的释放来测定，如描述于Zaborina等人，Infection and Immunity，67，5231-5242(1999)和Zaborina等人，Microbiology， 146，2521-2530(2000)，其内容引作参考。
[064]不依赖ATP的细胞毒性因子诱导凋亡的能力可通过使用 MITOSENSORTM APOLERTTM Mitochondrial Membrane Sensor试剂盒 (Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)的mitosensor ApoAlert共焦显微术观察到。在测试中，健康、非凋亡的细胞发红色 荧光而凋亡死亡的细胞发绿色荧光。红和绿的组合产生发黄色荧光细 胞，这代表凋亡性濒死细胞。参见Zaborina等人，Microbiology，146， 2521-2530(2000)，其内容引作参考。
[065]凋亡通过激活酶级联效应来介导，所述酶称作胱天蛋白酶 (caspase)，其为在天冬氨酸残基进行切割的半胱氨酸蛋白酶。因此， 凋亡也可通过测量两种重要的胱天蛋白酶(称作胱天蛋白酶-9和胱天 蛋白酶-3)的活性来测定，已知这两种酶在凋亡期间通过从线粒体中 释放的细胞色素c与胞浆蛋白Apaf-1的寡聚化被激活，所述测量使用 的方法描述于Zou等人，J.Biol.Chem.，274：11549-11556(1999)，其内 容引作参考。
[066]凋亡也可通过使用例如APOLERT DNA断裂(fragmentation) 试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)检测凋 亡诱导的细胞核DNA断裂来观察。该测试是基于末端脱氧核苷酸转 移酶(Tdt)介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)，其中Tdt催化在凋亡中 的细胞的断裂的DNA的游离3’-羟基末端引入荧光素-dUTP。在断裂的 细胞核DNA引入荧光素-dUTP产生绿色荧光，其可被共焦显微术检测 到。
[067]在本发明的一个实施方案中，测试分级分离过的培养基以 测定这些级分诱导凋亡或细胞生长停止的能力。这些方法可用于鉴别 和鉴定不依赖ATP的细胞毒性因子。
不依赖ATP的细胞毒性因子的鉴定
[068]在另一方面，本发明提供经鉴定的细胞毒性因子，所述因 子显示不依赖ATP触发凋亡的细胞毒性或导致细胞生长停止。发明人 发现，铜绿假单胞菌和洋葱假单胞菌的QSFT级分富含两种蛋白：天 青蛋白和细胞色素c551。这两种蛋白的鉴定是基于它们在SDS-PAGE 上的分离和它们的N-末端氨基酸序列的鉴定。相比下，牛型分枝杆菌 QSFT级分的SDS-PAGE分析显示一条65kDa的牛血清白蛋白(BSA)浓 条带，其为用于生长牛型分枝杆菌的7H9培养基的成分，以及一些超 过45kDa分子量的条带，但没有细胞色素c551或天青蛋白的特征条带。
(参见实施例9)
[069]天青蛋白和/或细胞色素c551以及QSFT级分显示出对吞噬 细胞触发凋亡的细胞毒性。在分离中，细胞色素c551引起细胞生长停 止。纯化的天青蛋白/细胞色素c551混合物或洋葱假单胞菌QSFT级分 用抗天青蛋白抗体和抗细胞色素c551抗体处理后，显示巨噬细胞细胞 毒性有极大减少。相比而言，牛型分枝杆菌QSFT级分当用抗天青蛋 白抗体/抗细胞色素c551抗体预处理后，显示在细胞毒性上几乎没有降 低，确证牛型分枝杆菌QSFT级分含有除天青蛋白或细胞色素c551以 外的细胞毒性因子。因而不同的病原体分泌不同诱导凋亡的或使细胞 生长停止的细胞毒性因子，它们都将成为药物研发中优良的目标。
不依赖ATP的细胞毒性因子
I.Cupredoxin化合物
[070]这些小蓝铜蛋白(cupredoxin)是参与细菌的氧化还原链、光 合作用或未知功能的电子转移蛋白(10-20kDa)。铜离子唯一地结合于 蛋白基质。铜周围两个组氨酸和一个半胱氨酸的配体具有特殊的扭曲 三角平面排列，引起在金属位点非常特殊的电学性质和强烈的蓝色。 一些cupredoxin已经在介质中以高分辨率进行了结晶学鉴定。
天青蛋白
[071]天青蛋白是具有128个氨基酸残基的含铜蛋白质，其属于 cupredoxin家族，涉及植物和一些细菌中的电子转移。天青蛋白包括 来自铜绿假单胞菌(PA)(SEQ ID NO：1)、木糖氧化产碱菌(A. xylosoxidans)、和反硝化产碱菌(A.denitrificans)的那些。Murphy，L.M. 等人，J.Mol.Biol.，vol.315，pp 859-71(2002)，其内容引作参考。尽管天 青蛋白间的序列同源性在60-90％变化，这些分子间的结构同源性是 高的。所有的天青蛋白具有独特的具有Greek key基序的β-夹层 (β-sandwich)，并且单个铜原子总是位于蛋白的同一区域。此外，天 青蛋白在铜位点周围具有基本中性的疏水区。(Murphy等人)
质体蓝素
[072]质体蓝素是真核植物中的可溶性蛋白，其在每个分子中含 有一个铜分子，并且它们的氧化型为蓝色。它们出现在叶绿体中，作 为电子载体发挥功能。自从在1978年测定了白杨质体蓝素的结构，藻 类(栅藻(Scenedesmus)，浒苔(Enteromorpha)，衣藻(Chlamydomonas)) 和植物(法国菜豆(French bean))质体蓝素的结构也用晶体学或NMR的 方法得到测定，并且白杨质体蓝素的结构已经精确到1.33的分辨率。 SEQ ID NO：2显示了来自层理席藻(Phormidium laminosum)的质体蓝 素的氨基酸序列。
[073]尽管在藻类和维管植物之间的质体蓝素序列趋异(例如在衣 藻蛋白和白杨蛋白之间序列相同性为62％)，但三维结构是保守的(例 如在衣藻蛋白和白杨蛋白之间Cα位置的0.76rms偏差)。结构特征包 括位于八股反平行β-桶一个末端的扭曲四面体型铜结合位点、显著的 负电区和平坦的疏水表面。铜的位置对于其电子转移功能是优化的， 负电和疏水区被设想涉及生理反应配偶体的识别。化学修饰、交联和 定位诱变试验已经证实负电和疏水区在与细胞色素f的结合相互作用 中的重要性，并证明在质体蓝素中有两个功能重要的电子转移路径模 型的正确。一个假定的电子转移路径是相对短的(约4)，并包括疏水 区中暴露于溶剂的铜配体His-87，而另一条更长(约12-15)，包括负 电区中几乎保守的残基Tyr-83，Redinbo等人，J.Bioenerg.Biomembr.， vol.26(1)，pp49-66(1994)，其内容引作参考。
铁硫菌蓝蛋白
[074]铁硫菌蓝蛋白是含有蓝铜的单链多肽，其得自一种硫杆 菌。利用多波长不规则衍射对来自氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的极其稳定和高氧化性的cupredoxin铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO：3)氧化型进行X射线晶体结构测定，精确到1.9分辨率。铁硫 菌蓝蛋白由核心β-夹层折叠构成，所述β-夹层折叠由六股和七股的b- 片层组成。与其它cupredoxin类似，铜离子同分布于扭曲四面体的四 个保守残基(His 85，Cys138，His143，Met148)组成的簇相配位。Walter， R.L.等人，J.Mol.Biol.，vol.263，pp-730-51(1996)，其内容引作参考。
假天青蛋白
[075]假天青蛋白是含有蓝铜的单链多肽家族。得自裂环无色杆 菌(Achrorraobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO：4。假天青蛋白的X射线结构分析显示它与天青蛋白具有 相似的结构，尽管这些蛋白质之间具有低序列同源性。在假天青蛋白 和天青蛋白的整体结构之间存在两个主要的不同。相对于天青蛋白， 假天青蛋白具有由两个α-螺旋组成的羧基末端延伸。在中部肽区域， 天青蛋白包含延伸的环，而在假天青蛋白中变短，其形成含有短α- 螺旋的瓣。在铜原子位点上唯一的主要不同是，MET侧链构象和 Met-S铜键长度，其在假天青蛋白中明显短于在天青蛋白中。
II.细胞色素C551
[076]来自铜绿假单胞菌的细胞色素C551(Pa-C551)是具有82个氨 基酸残基的单体氧化还原蛋白(SEQ ID NO：5)，作为亚硝酸还原酶的 生理电子供体涉及不同的脱氮作用。Pa-C551的功能性质已被广泛的 研究。与非生理性无机小氧化还原反应物和与其它大分子如蓝铜蛋 白、真核细胞色素c和生理亚硝酸还原酶配偶体的反应提供了蛋白- 蛋白间电子转移的测试。
[077]Pa-C551是细菌I型细胞色素的一员，其三维结构显示具有 His-Met连接的单一低自旋血红素以及典型的多肽折叠，然而该折叠 使得血红素吡咯环II和III的边缘暴露。(Cutruzzola等人，J.Inorgan. Chem.，vol 88，pp 353-61(2002)，其内容引作参考。)存在于哺乳动物 I型细胞色素中的20个残基的ω环的缺乏引起血红素边缘在丙酸盐13 水平下的进一步暴露。Pa-C551表面带电残基的分布是非常各向异性 的：一边富含酸性残基而另一边显示带正电荷侧链(主要是赖氨酸)的 环，其位于围绕着血红素间隙的疏水区的边缘。所述疏水区包含残基 Gly11，Val13，Ala14，Met22，Val23，Pro58，Ile59，Pro60，Pro62，Pro63和 Ala65。各向异性的电荷分布导致很大的双极力矩，这对电子转移复 合物的形成是重要的。
[078]上述对Pa-C551电荷分布的描述已用于报道其它电子转移蛋 白和它们的电子受体。此外，通过在疏水区或带电区内的残基定位诱 变的修饰已显示出表面互补性对不同蛋白的结合和电子转移的重要 性。作为实例，在残基Met44和Met64被改变为带正电和带负电的 氨基酸的突变体上进行的研究获得了铜绿假单胞菌天青蛋白疏水区 与其电子转移性质具有相关性的证据。(Cutruzzola等人) 利用不依赖ATP的细胞毒性因子在癌症细胞中诱导凋亡或生长停止
[079]本发明提供使用不依赖ATP的细胞毒性因子在癌细胞中诱 导凋亡性细胞死亡或生长停止的方法。不依赖ATP的细胞毒性因子， 例如cupredoxin化合物和细胞色素C551，可用于治疗与细胞死亡的异 常故障相关的病症。众所周知，癌细胞不倾向于进行凋亡。依照本发 明的一个方面，施用足以诱导癌细胞凋亡或细胞生长停止的量的细胞 毒性因子或刺激细胞毒性因子分泌的活性剂将有助于减少体内肿瘤 大小以及延缓肿瘤生长。例如，将天青蛋白和细胞色素C551与已知的 抗黑素瘤药物[5-(3，3′-N，N′-二甲基三氮烯-1-基)-咪唑-4-甲酰胺] (DTIC)进行测试比较，显示天青蛋白和细胞色素C551的混合物提供有 效无毒的组合物，该组合物促进裸鼠体内肿瘤消退。
[080]在本发明的一个实施方案中提供了一种方法，其中用 cupredoxin化合物例如天青蛋白的治疗诱导癌细胞的凋亡性细胞死 亡。不希望受限于理论，据信cupredoxin化合物的细胞毒活性是由于 其与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物并使之稳定。p53作为“肿瘤抑制 子”基因发挥作用，其通过突变造成的生成下降或失活可导致肿瘤发 展。
[081]p53在细胞中半衰期通常只有几分钟。p53的稳定使得活性 氧(ROS)显著生成，这是凋亡有力的诱导剂。天青蛋白与p53形成复 合物、使之稳定并提高它在细胞内的水平，因此通过依赖胱天蛋白酶 -3和胱天蛋白酶-9的线粒体途径诱导凋亡Yamada，T.等人，Infec. Immun.，vol.70，pp 7054-62(2002)，其内容引作参考。
[082]天青蛋白的氧化还原活性对其细胞毒活性并不是关键的。 在复合物形成期活性氧的生成才是凋亡的诱导因子。Goto，M.等人， Mol.Microbiol.，47，pp549-59(2003)，其内容引作参考。例如，具有 如SEQ ID NO：1的氨基酸序列但并不含有铜原子的去辅基天青蛋白 (apo-azurin)相比于天青蛋白具有低的多的氧化还原活性，但显示显著 的细胞毒活性。
[083]与p53形成复合物的重要性可通过两种突变体天青蛋白 C112D(SEQ ID NO.6)和双突变体M44KM64E(SEQ ID NO.7)的细胞 毒活性的不同来说明。铜与Cys-112残基的结合对于氧化还原活性是 重要的。与铜的配位有缺陷的C112D突变体具有天青蛋白约0.01％ 的氧化还原活性，但显示显著的细胞毒性。作为对比，M44KM64E 突变体具有天青蛋白约2％的氧化还原活性，但几乎不显示细胞毒性。
[084]天青蛋白分子中含有一个疏水区，其是生理配偶体细胞色 素C551和亚硝酸还原酶的相互作用位点(Cutruzzola等人)。疏水区没 有变化的C112D突变体能与p53形成复合物，并升高其细胞内水平。 然而，M44KM64E双突变体的疏水区中形成一个电偶极，其不能形 成如此稳定的复合物。因此，与细胞色素C551和亚硝酸还原酶相互作 用位点对于与p53复合物形成也是重要的。
[085]甘油梯度离心和谷胱甘肽S转移酶(GST)沉淀法已用于显示 cupredoxin化合物与p53的相互作用。Yamada等人(2002)，其内容引 作参考。已知p53形成寡聚复合物，以及GST-p53融合蛋白在各种甘 油级分例如5，10，15，20，或25％的甘油中沉淀，而天青蛋白在5％甘 油中沉淀。先将天青蛋白与GST-p53融合蛋白温育，然后在甘油梯度 中离心，证明天青蛋白在所有的甘油级分中存在，表明其与p53缔合。 C112D突变体，而不是M44KM64E突变体，显示相似的缔合。Yamada 等人(2002)。
[086]将GST-p53融合蛋白与天青蛋白M44KM64E突变体进行预 培养改变p53寡聚化，导致大多数GST-p53存在于5-10％的甘油中， 而突变体天青蛋白也被发现在这里。这表明天青蛋白的疏水区也涉及 与p53的相互作用。天青蛋白疏水性的丧失不仅导致细胞毒性的丧 失，而且干扰了寡聚化。尽管M44KM64E突变体几乎不显示诱导凋 亡，它确实显示了对细胞周期进展显著的抑制。因此，p53-cupredoxin 复合物性质的变化可将p53的特异性从对凋亡改变到细胞生长停止。
[087]天青蛋白的作用依赖于肿瘤细胞具有功能性p53肿瘤抑制 基因。然而，细胞毒性因子也可造成具有p53肿瘤抑制基因不足的细 胞生长延缓。例如，细胞色素C551不作用于p53，但其显著增强肿瘤 抑制蛋白p16的水平。C551在巨噬细胞中抑制细胞周期进展，也增强 天青蛋白的作用。此外，细胞毒性因子如天青蛋白和C551(或 M44KM64E)的组合通过既诱导凋亡又诱导生长停止而可以更有效的 抑制肿瘤进展。
[088]由于细胞色素C551的作用模式不依赖于细胞中p53的状态， 这提供了在缺乏p53肿瘤抑制基因的人类癌症的50％中的癌症退化 方法。除了C551，其它细胞色素，例如来自蓝藻(cyanobacteria)的细 胞色素，也证实有细胞毒性。
细胞毒性因子治疗感染性疾病
[089]在本发明的另一方面，细胞毒性因子的鉴定可用于鉴别例 如在感染性疾病中抑制细胞死亡的新物质。例如，抑制利用ATP的 细胞毒性因子的分泌或活性，或ATP的生成，可减少或消除致病病 原体的细胞毒活性。
[090]因此，合适的施用抑制细胞毒性因子分泌或活性的化合物 提供了抗感染发展的有用工具。用于抑制诱导细胞死亡的细胞毒性因 子的活性的活性剂的实例包括细胞毒性因子的抗体和阻止利用ATP 的酶的活化的ATP类似物。用于抑制或刺激细胞毒性因子分泌或表 达的细胞毒性因子和活性剂的实例包括但不限于利用ATP的酶、氧 化还原蛋白、ATP生成激活剂、ATP生成抑制剂、氧化还原蛋白激活 剂和氧化还原蛋白抑制剂。
包含细胞毒性因子的药物组合物
[091]包含细胞毒性因子的药物组合物可用任何常规方法制备， 例如常规混和、溶解、制粒、制糖衣(dragee-making)、乳化、包入胶 囊(encapsulating)、包封(entrapping)或冻干过程。基本纯的细胞毒性因 子或其它活性物质易于与本领域公知的药物学可接受载体组合。这些 载体可使制备物被配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、 糖浆、膏剂、混悬剂等等。合适的赋型剂也可包括例如填充剂和纤维 素制品。其它的赋型剂包括例如矫味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂和 其他可接受的添加剂、佐剂或黏合剂。
[092]本发明组合物可用于与细胞死亡相关病症的治疗或预防。 基本纯的细胞毒性因子可以以足以预防或治疗与细胞死亡相关病症 的量来施用。典型地，宿主生物是哺乳动物，例如人类或动物。
施用包含细胞毒性因子的组合物
[093]本发明的组合物可以以任何合适的途径给药，例如口服、 含服、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、经鼻腔、局部、经皮即透 皮或注射(包括静脉内、肌内、皮下和冠状动脉内)给药。所述组合物 及其药物学配制品可以以有效达到其预期目标的任何剂量来给药。更 特别地，所述组合物以治疗有效量给药。
[094]在各种实施方案中，所述细胞毒性因子组合物包括载体和 赋型剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽 或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、鳌合剂、助悬剂、增稠剂 和/或防腐剂)、水、油、盐溶液、水性葡萄糖和甘油溶液、为了近似 于生理条件所要求的其它药物学可接受的辅助物质，例如缓冲剂、张 力调节剂、湿润剂等等。应理解的是，当本领域普通技术人员已知的 任意合适载体被应用于给予本发明的组合物时，载体的类型将根据给 药模式而变化。化合物也可用公知的技术以脂质体来包封。也可应用 生物可降解微球作为本发明药物学组合物的载体。合适的生物可降解 微球已公开于例如美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647； 5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252。
[095]本发明的组合物可按照常规的、众所周知的灭菌技术来消 毒或无菌过滤。所得水性溶液可以其现有形式或冻干形式被包装，冻 干制剂在给药前与无菌溶液相组合。
[096]本发明的细胞毒性因子组合物可用多种方法给药，包括注 射(如真皮内、皮下、肌内、腹膜内等等)、吸入、局部给药、栓剂、 使用透皮贴剂或经口给药。
[091]当注射给药时，细胞毒性因子可在水性溶液中配制，优选 在生理相容性缓冲液中，例如Hanks溶液、Ringer′s溶液或生理盐缓 冲液。所述溶液可包含配制剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或 者，在使用前，所述细胞毒性因子组合物可以以粉末形式与合适的载 体例如无菌无热原水组合。
[098]当吸入给药时，所述细胞毒性因子可以以气溶胶喷剂形式 从承压包装中送递，或从带有使用合适抛射剂(例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体)的喷雾器送递。如果是承 压气溶胶，剂量单位可通过提供按计量量释放的阀门来确定。用于吸 入剂或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可被配制成包含蛋白和合适 粉末基质(例如乳糖或淀粉)的混合粉末。
[099]当局部给药时，所述细胞毒性因子组合物可被配制成溶液、 凝胶、油膏、乳剂、混悬剂等等，如本领域公知的。在一些实施方案 中，利用透皮贴剂来给药。当通过栓剂(例如直肠或阴道)给药时，细 胞毒性因子组合物也可配制成包含常规栓剂基质的组合物。
[100]当口服给药时，细胞毒性因子组合物可通过将细胞毒性因 子与本领域公知的药物学可接受载体组合而易于配制。可使用固体载 体，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等等；这些载体可使趋化因子配制 成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、混悬剂等 等，以用于待治疗对象口服吸收。对于口服固体配制品例如散剂、胶 囊和片剂，合适的赋型剂包括填充剂例如糖类、纤维素制品、制粒剂 和粘合剂。
实施例1利用哺乳动物蛋白刺激细胞毒性因子的分泌
实施例18对被注射乳腺癌肿瘤细胞的裸鼠用天青蛋白治疗减少肿瘤 大小
5′-TGGCCCGGGAAGGTGTCGAAGAACATGTACTGC-3′(SEQ ID NO：11)；对M44K：
5′-CCTGCCGAAGAACGTCAAGGGCCACAACTGGG-3′(SEQ ID NO：12)和5′-CCCAGTTGTGGCCCTTGACGTTCTTCGGCAGG-3′ (SEQ ID NO：13)；对M64E：5′-
GGTCACCGACGGCGAGGCTTCCGGCCTGG-3′(SEQ ID NO：14)和
5′-CCAGGCCGGAAGCCTCGCCGTCGGTGACC-3′(SEQ ID NO： 15)。通过DNA测序来确证突变。
天青蛋白的嵌合型突变体
5′-GAAGGGCACCCTGAagCTGAAGTGATGCGCG-3′(SEQ ID NO： 34)，和5′-GCGCATCACTTCAGctTCAGGGTGCCCTTCATC-3′(SEQ ID NO：35)；EP2内的T52K/A53S突变体使用
5′-AACTGGGTACTGAGCAagtCCGCCGACATGCAGGGC-3′(SEQ ID NO：36)和
5′-CTGCATGTCGGCGGactTGCTCAGTACCCAGTTGTG-3′(SEQ ID NO：37)；EP3内的G58P/V591突变体使用
5′-CCGCCGACATGCAGccCaTGGTCACCGACGGCATGGC-3′(SEQ ID NO：38)和
5′-GCCATGCCGTCGGTGACCAtGggCTGCATGTCGGCGG-3′(SEQ ID NO：39)；EP3内的M591N60A突变体使用
5′-CATGCAGCCCATcGcCACCGACGGCATGGC-3′(SEQ ID NO：40) 和5′-CATGCCGTCGGTGgCgATGGGCTGCATGTCG-3′(SEQ ID NO： 41)；EP4、EP5和EP6内的S66A/G67A/H83F/K85P/L861突变体使用5′- GTCACCGACGGCATGGCTgCCGcCCTGGACAAGGATTACCTGAA GCCCGACGACAGCCGTGTCATCGCCttCACccGaTcATCGGCTCGG GCGAGAAGG ACTCG-3′(SEQ ID NO：42)和 5′ GTCACCGAGTCCTTCTCGCCCGAGCCGATgAtCggGGTGaaGGC GATGACACGGCTGTCGTCGGGCTTCAGGTAATCCTTGTCCAGGg CGGcAGCCATGCCGTCG-3′(SEQ ID NO：43)，其中加下划线的是 BstE II位点，它们用于取代来自野生型的BstE II片段。寡核苷酸中的 小写字母表示诱变核苷酸。
[001]本申请要求2003年8月15日提交的美国临时专利申请 60/414,550的优先权，并且是于2002年1月15日提交的美国专利申 请序列号10/047,710的部分继续申请，该美国专利申请要求于2001 年2月15日提交的美国临时专利申请序列号60/269,133的优先权。 这些在先申请的所有内容全部在此引作参考。
政府权益声明
[002]本申请的研究主题得到来自美国马里兰州Bethesda的国立 卫生研究院(NIH)的研究基金的支持(基金号AI 16790-21，ES 04050-16，AI 45541，CA09432和N01-CM97567)。政府在本申请中可 具有某些权利。
序列表
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<120>Cupredoxin家族多肽在癌症治疗中的用途
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<150>60/414,550
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<150>10/047,710
<151>2002-01-15
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<160>53
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>1
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65 70 75 80
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<212>PRT
<213>Phormidium laminosum
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35 40 45
Tle Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Tle Asn Glu Asn Tyr
50 55 60
Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro
65 70 75 80
His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro
85 90 95
Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln
100 105 110
Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn
115 120
<210>5
<211>82
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>5
Glu Asp Pro Glu Val Leu Phe Lys Asn Lys Gly Cys Val Ala Cys His
1 5 10 15
Ala Ile Asp Thr Lys Met Val Gly Pro Ala Tyr Lys Asp Val Ala Ala
20 25 30
Lys Phe Ala Gly Gln Ala Gly Ala Glu Ala Glu Leu Ala Gln Arg Ile
35 40 45
Lys Asn Gly Ser Gln Gly Val Trp Gly Pro Ile Pro Met Pro Pro Asn
50 55 60
Ala Val Ser Asp Asp Glu Ala Gln Thr Leu Ala Lys Trp Val Leu Ser
65 70 75 80
Gln Lys
<210>6
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>C112D azurin mutant
<400>6
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Asp
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
115 120 125
<210>7
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>M44KM64E azurin mutant
<400>7
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Lys Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Glu
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
115 120 125
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>8
gcccaagctt acctaggagg ctgctccatg cta 33
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>9
tgagcccctg caggcgccca tgaaaaagcc cggc 34
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for C112D mutation
<400>10
cagtacatgt tcttcgacac cttcccgggc cac 33
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for C112D mutation
<400>11
tggcccggga aggtgtcgaa gaacatgtac tgc 33
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for M44K mutation
<400>12
cctgccgaag aacgtcaagg gccacaactg gg 32
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for M44K mutation
<400>13
cccagttgtg gcccttgacg ttcttcggca gg 32
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for M64E mutation
<400>14
ggtcaccgac ggcgaggctt ccggcctgg 29
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for M64E mutation
<400>15
ccaggccgga agcctcgccg tcggtgacc 29
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP1
<400>16
Ile Thr Val Asp Lys Ser
1 5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP2
<400>17
Val Leu Ser Thr Ala Ala
1 5
<210>18
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic Epitope，EP3
<400>18
Gly Val Val Thr
1
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP4
<400>19
Gly Met Ala Ser Gly
1 5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP5
<400>20
Arg Val Ile Ala His
1 5
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP6
<400>21
Lys Leu Ile Gly
1
<210>22
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Antigenic epitope，EP7
<400>22
Met Lys Gly Thr Leu Thr
1 5
<210>23
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>23
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
115 120 125
<210>24
<211>128
<212>PRT
<213>Alcaligenes faecalis
<400>24
Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr
1 5 10 15
Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu
20 25 30
Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val
35 40 45
Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys
50 55 60
Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile
65 70 75 80
Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe
85 90 95
Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys ser
100 105 110
Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser
115 120 125
<210>25
<211>129
<212>PRT
<213>Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans
<400>25
Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His
20 25 30
Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met
50 55 60
Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser
115 120 125
Asn
<210>26
<211>129
<212>PRT
<213>Bordetella bronchiseptica
<400>26
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp
1 5 10 15
Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile
50 55 60
Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val
65 70 75 80
Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val
115 120 125
Asp
<210>27
<211>129
<212>PRT
<213>Methylomonas sp.J
<400>27
Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala 5er Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn
20 25 30
Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp ValAla Lys Glu Gly Ala
50 55 60
His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys
85 90 95
Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu
115 120 125
Glu
<210>28
<211>166
<212>PRT
<213>Neisseria meningitidis
<400>28
Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala
1 5 10 15
Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser
35 40 45
Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala
50 55 60
Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys
65 70 75 80
Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Mer Asp
85 90 95
Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys
100 105 110
Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly
115 120 125
Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu
130 135 140
Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly
145 150 155 160
Lys Val Thr Leu Val Asp
165
<210>29
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas fluorescens
<400>29
Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn
1 5 10 15
Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu
20 25 30
Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu
35 40 45
Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu
50 55 60
Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys
115 120 125
<210>30
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas chlororaphis
<400>30
Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn
1 5 10 15
Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys
115 120 125
<210>31
<211>129
<212>PRT
<213>Xylella fastidiosa 9a5c
<400>31
Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp
1 5 10 15
Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr
20 25 30
Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu
50 55 60
His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val
65 70 75 80
Ile Aia His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr
85 90 95
Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly
115 120 125
Gly
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T21Q mutation within EP1
<400>32
caacaccaat gccatccagg tcgacaagag ctgcaagc 38
<210>33
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T21Q mutation within EP1
<400>33
agctcttgtc gacctggatg gcattggtgt tgaactgc 38
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T126K mutation within EP7
<400>34
gaagggcacc ctgaagctga agtgatgcgc g 31
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T126K mutation within EP7
<400>35
gcgcatcact tcagcttcag ggtgcccttc atc 33
<210>36
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T52K/A53S mutations within EP2
<400>36
aactgggtac tgagcaagtc cgccgacatg cagggc 36
<210>37
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for T52K/A53S mutations within EP2
<400>37
ctgcatgtcg gcggacttgc tcagtaccca gttgtg 36
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for G58P/V591 mutations within EP3
<400>38
ccgccgacat gcagcccatg gtcaccgacg gcatggc 37
<210>39
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for G58P/V591 mutations within EP3
<400>39
gccatgccgt cggtgaccat gggctgcatg tcggcgg 37
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for M591/V60A mutations within EP3
<400>40
catgcagccc atcgccaccg acggcatggc 30
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for M591/V60A mutations within EP3
<400>41
catgccgtcg gtggcgatgg gctgcatgtc g 31
<210>42
<211>104
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for S66A/G67A/H83F/K85P/L861 mutations within EP4
，EP5，and EP6
<400>42
gtcaccgacg gcatggctgc cgccctggac aaggattacc tgaagcccga cgacagccgt 60
gtcatcgcct tcacccgatc atcggctcgg gcgagaagga ctcg 104
<210>43
<211>105
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>oligonucleotide for S66A/G67A/H83F/K85P/L861 mutations within EP4
，EP5，and EP6
<400>43
gtcaccgagt ccttctcgcc cgagccgatg atcggggtga aggcgatgac acggctgtcg 60
tcgggcttca ggtaatcctt gtccagggcg gcagccatgc cgtcg 105
<210>44
<211>128
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>44
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
115 120 125
<210>45
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutant S1
<400>45
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys
115 120 125
<210>46
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutant S2
<400>46
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu 5er Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys
115 120 125
<210>47
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutanr S3
<400>47
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys
115 120 125
<210>48
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutant s3s5
<400>48
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Tle Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys
115 120 125
<210>49
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutant s3s5s4s6
<400>49
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Met
50 55 60
Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys
100 105 110
Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys
115 120 125
<210>50
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>chimeric azurin mutant S4
<400>50
Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn
20 25 30
Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp
35 40 45
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