鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域及其制备方法及用途
阅读：1029发布：2020-07-19
专利汇可以提供鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域及其制备方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种鱼类神经 坏死 病毒来源的蛋白转导域，其 氨 基酸序列如SEQ ID:1所示。本发明还提供了该蛋白转导域的制备方法，以及该蛋白转导域用于携带外源物质进入细胞的用途和应用与制备鱼类 疾病 防治药物。与 现有技术 相比，本发明的蛋白转导域具有更高的进入鱼类细胞的效率。，下面是鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域及其制备方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白转导域，其特征在于，所述鱼类为石斑鱼。
3.根据权利要求2所述的蛋白转导域，其特征在于，所述石斑鱼为斜带石斑鱼。
4.含有权利要求1至3任一项所述的蛋白转导域的组合物。
5.编码权利要求1至3任一项所述的蛋白转导域的核酸。
6.包括权利要求5所述的核酸的表达载体。
7.包括权利要求6所述的表达载体的重组宿主细胞。
8.权利要求1至3任一项所述的蛋白转导域的制备方法，其步骤如下：
(1)引物设计：
上游引物F：
AATTCCGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGTAACGA(EcoR I)
下游引物R：
AGCTTCGTTACTTGGTGGTCGCGGGTTTTGCCAATTTCTTCTCACCTTTGCGG(Hind III)
(2)获取目的基因：
将合成好的引物进行退火，在将引物干粉进行稀释时，加水至终浓度为20μM，配制
50μl的退火反应体系，分别加入上下游引物各20μl，然后加入5×LA Taqase Buffer
10μl，吹打混匀，设置梯度温度退火，98℃，5min，然后97℃，30s；96℃，30s；95℃，30s；
94℃，30s；93℃，30s；92℃，30s；91℃，30s；90℃,30s；89℃，30s；88℃，30s；87℃，30s；
86℃，30s；85℃，30s；84℃，30s；83℃，30s；82℃，30s；81℃，30s；80℃，30s；79℃，30s；
78℃，30s；77℃，30s；76℃，30s；75℃，30s；74℃，30s；73℃，30s；72℃，30s；71℃，30s，然后将退火的引物放到室温中，让其自然冷却，从而获得目的基因的脱氧核糖核苷酸序列；
(3)将目的基因构建到含GFP的pRSET-A原核表达载体上，选择EcoR I和Hind III作为酶切位点；
(4)将酶切好的目的基因和原核表达载体进行连接：
将配制好的目的基因和原核表达载体的双酶切反应体系放入37℃水浴锅中，3个小时，配制1％的琼脂糖核酸胶，将酶切好的目的基因和原核表达载体进行连接；酶切好的目的基因和原核表达载体按照摩尔比3:1进行连接；
(5)将连接好的原核表达载体转化到DH5α感受态细胞：
将连接好的含有改造过的目的基因的质粒转化到DH 5α感受态细胞中；
(6)挑选阳性克隆进行测序；
(7)将构建好的含有改造过的目的基因的pRSET-A原核表达载体进行提取：选取相应的阳性结果的菌株进行扩大培养然后进行保菌种和质粒的提取；
(8)将构建好的含有改造过的目的基因的pRSET-A原核表达载体转化到BL21感受态细胞中；
(9)将目的蛋白进行表达；
(10)对目的蛋白进行纯化。
9.权利要求1至3任一项所述的蛋白转导域用于携带外源物质进入细胞的用途。
10.权利要求1至3任一项所述的蛋白转导域在用于制备鱼类疾病防治药物中的应用。
鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域及其制备方法及用途
技术领域
背景技术
[0002] 石斑鱼作为一种名贵的海水经济鱼类。在其养殖过程中，特别是在其仔稚鱼阶段，鱼体本身的获得性免疫系统尚未发育完全，一旦感染鱼类神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV，一种β诺达病毒)，将导致接近100％的死亡率，给养殖户造成重大的经济损失。目前，虽然已经开发出多种防御和治疗NNV的药物，但药物到达靶部位需要经历一个很漫长的过程，特别是具有选择透过性的细胞膜的存在，使得治疗性分子和药物很难到达细胞内作用部位。因此，即使药物进入体内，可能由于作用位点没有特异性和难以达到有效浓度，使得药物的效果不理想。
[0003] 蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)的出现，可能为药物的导入提供了一种新的途径。PTD是一类一般少于30个氨基酸的短肽，这些肽段可以与货物(治疗性分子或药物)经过共价或者非共价结合，通过触发细胞的信号转导途径，通过巨胞饮、网格蛋白或者膜窖蛋白等途径，有效地进入细胞内部。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种导入效率高的新型蛋白转导域。
[0005] 本发明的另一个目的是提供上述蛋白转导域的制备方法。
[0006] 本发明的再一个目的是提供上述蛋白转导域的用途。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种鱼类神经坏死病毒来源的蛋白转导域，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示。
[0008] 优选地，所述鱼类为石斑鱼。更优选地，所述石斑鱼为斜带石斑鱼(orange-spotted grouper)。
[0009] 本发明还提供了含有上述蛋白转导域的组合物。
[0010] 本发明还提供了编码上述蛋白转导域的核酸。
[0011] 本发明还提供了包括上述核酸的表达载体。
[0012] 本发明还提供了包括上述表达载体的重组宿主细胞。
[0013] 本发明还提供了上述蛋白转导域的制备方法，其步骤如下：
[0014] (1)引物设计：
[0015] 上游引物F：
[0016] AATTCCGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGTAACGA(EcoR I)
[0017] 下游引物R：
[0018] AGCTTCGTTACTTGGTGGTCGCGGGTTTTGCCAATTTCTTCTCACCTTTGCGG(Hind III)[0019] (2)获取目的基因：
[0020] 将合成好的引物进行退火，在将引物干粉进行稀释时，加水至终浓度为20μM，配制50μl的退火反应体系，分别加入上下游引物各20μl，然后加入5×LA Taqase Buffer10μl，吹打混匀，设置梯度温度退火，98℃，5min，然后97℃，30s；96℃，30s；95℃，30s；
94℃，30s；93℃，30s；92℃，30s；91℃，30s；90℃,30s；89℃，30s；88℃，30s；87℃，30s；
86℃，30s；85℃，30s；84℃，30s；83℃，30s；82℃，30s；81℃，30s；80℃，30s；79℃，30s；
78℃，30s；77℃，30s；76℃，30s；75℃，30s；74℃，30s；73℃，30s；72℃，30s；71℃，30s，然后将退火的引物放到室温中，让其自然冷却，从而获得目的基因的脱氧核糖核苷酸序列；
94℃，30s；93℃，30s；92℃，30s；91℃，30s；90℃,30s；89℃，30s；88℃，30s；87℃，30s；
86℃，30s；85℃，30s；84℃，30s；83℃，30s；82℃，30s；81℃，30s；80℃，30s；79℃，30s；
78℃，30s；77℃，30s；76℃，30s；75℃，30s；74℃，30s；73℃，30s；72℃，30s；71℃，30s，然后将退火的引物放到室温中，让其自然冷却，从而获得目的基因的脱氧核糖核苷酸序列；
[0021] (3)将目的基因构建到含GFP的pRSET-A原核表达载体上，选择EcoR I和Hind III作为酶切位点；
[0022] (4)将酶切好的目的基因和原核表达载体进行连接：
[0023] 将配制好的目的基因和原核表达载体的双酶切反应体系放入37℃水浴锅中，3个小时，配制1％的琼脂糖核酸胶，将酶切好的目的基因和原核表达载体进行连接；酶切好的目的基因和原核表达载体按照摩尔比3:1进行连接；
[0024] (5)将连接好的原核表达载体转化到DH5α感受态细胞：
[0025] 将连接好的含有改造过的目的基因的质粒转化到DH 5α感受态细胞中；
[0026] (6)挑选阳性克隆进行测序；
[0027] (7)将构建好的含有改造过的目的基因的pRSET-A原核表达载体进行提取：选取相应的阳性结果的菌株进行扩大培养然后进行保菌种和质粒的提取；
[0028] (8)将构建好的含有改造过的目的基因的pRSET-A原核表达载体转化到BL21感受态细胞中；
[0029] (9)将目的蛋白进行表达；
[0030] (10)对目的蛋白进行纯化。
[0031] 本发明还提供了上述蛋白转导域用于携带外源物质进入细胞的用途。
[0032] 本发明还提供了上述蛋白转导域在用于制备鱼类疾病防治药物中的应用。
[0033] 本发明的蛋白转导域肽段中富含赖氨酸，通过对已知的蛋白转导域的研究发现，可能是这些赖氨酸触发了受体，进而激活细胞的信号途径，从而作为一种新的蛋白转导域，将外源物质携带进入细胞的内部，应用到鱼类疾病的预防和治疗中。
[0035] 与已知的蛋白转导域R8，Penetratin与GFP融合表达的蛋白进入鱼类细胞相比，该肽段GFP融合表达的蛋白利用更短的时间，而且具有更高的进入鱼类细胞的效率。
[0036] 根据试验结果，发现斜带石斑鱼神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV)的衣壳蛋白(capsid protein，CP)所形成的类病毒粒子(virus-like particle，VLP)可以有效地进入鱼类细胞及部分哺乳类动物细胞，最终确定了本发明的肽段，也就是RKGEKKLAKPATTK，可以作为一种新的PTD在鱼类细胞上使用。通过导入效率比较发现，该肽段比其他三种成熟PTD在鱼类细胞上的导入效率高达30％以上。附图说明
[0037] 图1是本发明的蛋白转导域的双酶切结果。
[0039] 图3是不同PTD在SB细胞的导入效率比较。
具体实施方式
[0040] 以下结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
[0041] 斜带石斑鱼神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV)的衣壳蛋白(capsid protein，CP)基因的开放阅读框(ORF)为1017个核苷酸碱基，编码含有338个氨基酸的衣壳蛋白。将3-16构建到含GFP的pRSET-A原核表达载体上，通过对pRSET-A的多克隆位点和斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白MCP基因的分析，酶切位点选择EcoR I和Hind III作为酶切位点。
[0042] 1.1引物的设计
[0043] 设计并合成以下引物：
[0044] F：AATTCCGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGTAACGA(EcoR I)[0045] R：AGCTTCGTTACTTGGTGGTCGCGGGTTTTGCCAATTTCTTCTCACCTTTGCGG(HindIII)[0046] 将设计好的引物发送到Invitrogen公司合成。
[0047] 1.2目的基因的获取
[0048] 通过引物退火的方式获取目的基因，步骤如下：将合成好的引物进行退火，在将引物干粉进行稀释时，加水至终浓度为20μM，配制50μl的退火反应体系，分别加入上下游引物各20μl，然后加入5×LA Taqase Buffer 10μl，吹打混匀，在PCR仪上设置梯度温度退火，98℃，5min，然后97℃，30s；96℃，30s；95℃，30s；94℃，30s；93℃，30s；92℃，30s；91℃，30s；90℃,30s；89℃，30s；88℃，30s；87℃，30s；86℃，30s；85℃，30s；84℃，30s；
83℃，30s；82℃，30s；81℃，30s；80℃，30s；79℃，30s；78℃，30s；77℃，30s；76℃，30s；
75℃，30s；74℃，30s；73℃，30s；72℃，30s；71℃，30s，然后将退火的引物放到室温中，让其自然冷却，从而获得目的基因的脱氧核糖核苷酸序列。
83℃，30s；82℃，30s；81℃，30s；80℃，30s；79℃，30s；78℃，30s；77℃，30s；76℃，30s；
75℃，30s；74℃，30s；73℃，30s；72℃，30s；71℃，30s，然后将退火的引物放到室温中，让其自然冷却，从而获得目的基因的脱氧核糖核苷酸序列。
[0049] 1.3将载体和目的基因进行双酶切
[0050] 将上述目的基因构建到含GFP(绿色荧光蛋白)的pRSET-A原核表达载体上，酶切位点选择的是EcoR I和Hind III作为酶切位点。
[0051] 双酶切反应体系(TAKARA内切酶)：
[0052]
[0053] 将配制好的酶切反应体系放到37℃的水浴锅，酶切为3个小时，然后将酶切好的样品跑1％的核酸胶，将跑好的核酸胶在凝胶成像系统下进行观察，然后进行胶回收。
[0055] 1、在紫外线照射下，将目的条带切下来，转移到2ml的EP管中，称重；
[0056] 2、按0.1g的目的条带加入100-300微升的融胶缓冲液GDP，将加入的融胶缓冲液GDP的含目的条带的EP管放在55℃的恒温条件下，10min左右，中间的过程中可以用手混匀几次；
[0057] 3、将回收柱放入收集管中，待得目的条带完全溶解后，将含有目的条带的融胶缓冲液 GDP每次700微升加入到回收柱中，离心，10,000g，1min,将过滤后的液体倒弃；
[0058] 4、重复步骤3，直到所有的含目的条带的融胶缓冲液GDP都转移到回收柱中；
[0059] 5、在回收柱中加入DW2缓冲液600微升，离心，10,000g，1min，将过滤后的液体倒弃；
[0060] 6、重复步骤5；
[0061] 7、将回收柱放到收集管中，离心，12,000g，2min，将过滤液弃掉；
[0062] 8、将预先预热的去离子水25微升加入到回收柱的滤膜处，放置2min，离心，12,000g，2min，将过滤液重新加到回收柱的滤膜处，放置2min，离心，12,000g，2min，测浓度。
[0063] 1.4将酶切好的目的基因和载体进行连接
[0064] 将酶切产物进行连接时，酶切好的目的基因和载体按照摩尔比3:1进行连接，连接体系如下：
[0065]
[0066] 将配制好的连接体系放置于16℃，过夜连接。
[0067] 1.5将连接好的质粒转化到DH5α感受态细胞
[0068] 将连接好的含有改造过的目的基因的质粒转化到DH 5α感受态细胞中。
[0069] 1.在超净工作台内部，将已经将目的基因和载体连接好的连接产物10μl加入到50μl的DH 5α感受态中；
[0070] 2.冰上孵育，将含有连接产物的DH 5α感受态冰上孵育30min，便于连接产物附着在感受态的表面；
[0071] 3.热激，将含有连接产物的DH 5α感受态放置于42℃水浴锅中90s热激，使得连接产物得以进入感受态细胞内部；
[0072] 4.冰上放置2min后，在超净工作台内，将含有连接产物的感受态细胞转入到含有1mlLB培养基的2ml的EP管内，于摇床中培养37℃，180rpm/min，1个小时，在没有抗生素的LB培养基中，便于感受态的快速复苏，增加转化的效率；
[0073] 5.将已经培养好的感受态细胞离心，1,000g，3min，在超净工作台内将多余培养基弃掉，剩余200μl的培养基，重悬感受态细胞；
[0074] 6.取100μl的重悬感受态细胞，将其滴在LA平板上，用已经用酒精灯火焰烧过的涂布棒将重悬感受态细胞均匀地在LA平板上涂开；
[0075] 7.将已经加好含有连接产物的感受态细胞的LA平板在室温正置5min，然后将LA平板倒置放到37℃恒温培养箱中，培养12-16小时。
[0076] 1.6挑选阳性克隆进行测序
[0077] 挑选单克隆菌落，构建好的质粒中挑取8个，做好标记进行摇菌和做菌液PCR。待LA平板上出现肉眼可见的单菌落的时候，在2ml的EP管中加入500μl的LA液体培养基，然后挑取8个单菌落(GFPT1-GFPT8)放到相应编号的2ml的EP管中，在摇床上，37℃，180rpm/min，6h。
[0078] 使用GENESTAR品牌的PCR MIX进行菌液PCR，25μl的反应体系如下：
[0079]
[0080] 将跑完PCR的GFPT1-GFPT8在1％的琼脂糖核酸胶上进行水平电泳，然后在凝胶成像系统下拍照，选择阳性结果的菌液200μl送到Invitrogen公司进行测序，剩余的菌液放到加终体积为20％的甘油于-20℃保存。
[0081] 1.7将构建好的含有改造过的CP(衣壳蛋白)的pRSET-A质粒进行提取
[0082] 根据公司的测序结果，分别选取相应的阳性结果的菌株进行扩大培养15ml，然后进行保菌种和质粒的提取，利用MAGEN质粒提取试剂盒。
[0083] 1.过夜活化：按1:1000的比例，将菌液接种到LA液体培养中，放在摇床上，37℃，180rpm/min；
[0084] 2.扩大培养：按1:100的比例，将过夜活化的菌接种到含15ml的LA培养基的50ml EP管中，放到摇床上，37℃，180rpm/min，6h，摇好菌之后，在2ml的EP管里对阳性菌进行保存；
[0085] 3.收菌：将摇好的菌通过高速离心机进行收菌，5,000g，10min，将培养基弃掉；
[0086] 4.在摇菌的50ml的EP管中加入500μl的P1，将菌体利用涡旋仪进行涡旋，使得菌体完全重悬；
[0087] 5.将涡旋好的菌体转移到2ml EP管中，然后加入700μl的P2，缓慢上下颠倒，室温静置，不超过2min，至液体变得透明，细菌得以充分裂解；
[0088] 6.往2ml的EP管中加入700μl的NP3，加入之后马上上下颠倒，将裂解液完全中和，然后离心，12,000，2min；
[0089] 7.将离心后的上清液转移到收集管，每次加入700μl，离心10,000g，1min，弃掉滤液， 直到所有的上清液完全都转移到收集管；
[0090] 8.向收集管中加入500μl的DW1，离心，10,000g，1min，弃掉滤液；
[0091] 9.向收集管中加入600μl的DW2，离心，10,000g，1min，弃掉滤液；
[0092] 10.重复步骤9；
[0093] 11.离心，12,000g，2min，弃掉滤液，将收集管转移到新的2ml的EP管中，做好标记；
[0094] 12.向收集管中加入80μl的已经预热的去离子水，室温放置2min，离心，12,000g，1min，将过滤液重新转移到收集管中，室温放置2min，离心，12,000g，1min,将收集管弃掉，然后将滤液通过紫外分光光度计测质粒的浓度。
[0095] 1.8将构建好的原核表达载体(质粒)转化到BL21感受态内
[0096] 将构建好的含有改造过的斜带石斑鱼神经坏死病毒的衣壳蛋白的pRSET-A原核表达载体转化到BL21感受态细胞中。
[0097] 1.在超净工作台内，将50ng的构建好的质粒加入到50μl原核表达菌BL21感受态(由本实验室保存)内；
[0098] 2.冰上孵育，将含有目的基因质粒的BL21感受态冰上孵育30min，便于构建好的质粒附着在感受态的表面；
[0099] 3.热激，将构建好的质粒的BL21感受态放置于42℃水浴锅中90s热激，使得含有目的基因的质粒得以进入感受态细胞内部；
[0100] 4.将热激后的含有目的基因的质粒的BL21感受态放置于冰上3min，然后在超净工作台内，将感受态细胞转移到LA固体平板上，然后用涂布棒缓慢的将感受态均匀涂开，室温正置5min，然后将LA平板倒置于37℃恒温培养箱，培养12-16小时。
[0101] 1.9将目的蛋白进行表达
[0102] 挑选单克隆菌落进行蛋白质表达，挑选8个，进行蛋白质表达，选择最佳的表达菌。
[0103] 1.活化，挑取单克隆菌落到含有1ml LA液体培养基的2ml EP中，过夜，37℃，180rpm/min；
[0104] 2.扩大培养，第二天，按1:100的比例将过夜活化的菌加入到10ml的LA液体培养基中，摇床，37℃，180rpm/min；
[0105] 3.诱导表达，当摇床摇到2.5～3.0个小时时，此时菌液的OD 600达到0.4～0.6时，此时细菌处于对数生长期，此时加入终体积浓度为1mM的IPTG进行诱导，此时摇床的温度要调到30℃，转速调到160rpm/min，以便于目的蛋白得以表达，并且是以可溶的形式存在；
[0106] 4.收菌，加入IPTG诱导表达3个小时后，进行收菌，用离心的方法进行收集，5,000g， 10min，离心过后将培养基弃掉，用PBS缓冲液将菌体进行重悬，以便接下来的破碎，重悬后的液体于-20℃保存。
[0107] 1.10表达好的蛋白产物跑SDS-PAGE蛋白胶和做Western Blot
[0108] 首先，利用超声波破碎的方法将菌体进行破碎，使用超声波破碎仪时，根据不同的样品选择不同的破碎杆，破碎大肠杆菌的时候选择六号杆，功率30％，温度20℃，破碎时间30min，工作时破碎6s，休息4s，破碎在冰上进行。
[0109] 然后，将菌体破碎液进行离心，12,000g，10min，然后将离心后的上清放-20℃保存。
[0110] 接着，取10μl的上清液加到10μl的PBS缓冲液中，加入终浓度为1×的蛋白胶上样缓冲液，在沸水中煮10min，离心。
[0111] 最后，跑SDS-PAGE蛋白胶，配制大孔，浓度为12％的SDS-PAGE蛋白胶，将样品按顺序加入到点样空中，加入终浓度为1×的跑胶缓冲液，先在80V的电压下进行电泳，待得样品于浓缩胶和分离胶的结合部位压缩成一条线时，将电压升高到120V，根据样品的分子量大小，选择合适的时间进行电泳。
[0112] 当SDS-PAGE蛋白胶停止跑胶时，将SDS-PAGE蛋白胶胶条取出，放入含有考马斯亮蓝的染色液的染色缸中进行染色，染色过程在水平摇床上进行，如果是新鲜配制的考马斯亮蓝染色液的话，染色时间为20min比较合适，如果是回收的使用过的考马斯亮蓝染色液的话，染色时间相应的进行延长。染色结束后，用脱色液进行脱色，直到有清晰条带出现为止，脱色的过程中可以对脱色液进行更换，便于更好的脱色。
[0113] 将跑完SDS-PAGE蛋白胶的胶条进行转膜，膜为醋酸纤维膜，根据在SDS的存在下蛋白整体带负电荷，这种情况下，将SDS-PAGE蛋白胶胶条处于负极，醋酸纤维素膜处于正极，在这种情况下蛋白质可以在电场的作用下，蛋白质向正极移动，从而蛋白质转移到醋酸纤维素膜上，转膜时电流为200A，时间为2.5个小时，在这种条件下可以保证目的蛋白完全转移到膜上，为接下来的实验打好基础。
[0114] 1.转膜：在电流为200A，时间为2.5个小时的条件下，按照SDS-PAGE蛋白胶在负极，醋酸纤维素膜在正极，因为电流比较大，在转膜时会产生大量的热量，转膜应在冰上进行；
[0115] 2.封闭：将已经转好的膜放到含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中进行封闭，此时封闭在水平摇床上，室温下进行，封闭时间为1个小时；
[0116] 3.一抗孵育：将封闭好的膜用TBST缓冲液洗3次，每次洗5min，然后将醋酸纤维素膜放到按1:5000的比例稀释的鼠源性抗His的单克隆抗体的TBST缓冲液中，在摇床上，室温，3个小时；
[0117] 4.二抗孵育：用TBST缓冲液洗3次，每次洗5min，然后将醋酸纤维素膜放到按1:5000 的比例稀释的携带辣根过氧化物酶(HRP)标签的兔抗鼠IgG(H+L)的二抗的TBST缓冲液中，在摇床上，室温，1个小时；
[0118] 5.显色：用TBST缓冲液洗3次，每次洗5min，然后利用DAB显色法进行显色，在培养皿中加入3ml的去离子水，然后按照A，B，C的顺序依次加入DAB显色试剂盒中的试剂进行显色，当目的条带明显的显现出来的时候，加去离子水将反应终止；
[0119] 6.拍照：显好色的醋酸纤维素膜在扫描仪下进行扫描，将结果保存。
[0120] 1.11对目的蛋白进行纯化
[0121] 因为pRSET-A原核表达载体含有6×His，可以通过Ni柱纯化的方法获得目的蛋白。
[0122] 1.在2ml的EP管中加入500μl的Ni柱柱料，首先用1.5ml的裂解缓冲液对Ni柱柱料进行洗涤，以去除Ni柱柱料中含有的乙醇，离心，1,000g，1min的条件下洗3次；
[0124] 3.离心，1,000g，1min，弃掉上清液，用洗涤缓冲液对Ni柱柱料进行洗涤，便于将杂蛋白去除，每次加洗涤缓冲液1.5ml，离心，1,000g，1min，重复12次，确保尽可能的取出杂蛋白，然后加入1ml的洗脱缓冲液(以达到将目的蛋白洗脱下来的目的)，然后将EP管放到水平旋转仪上进行旋转，便于目的蛋白与Ni柱柱料脱离，1个小时，此过程在4℃冰箱中进行；
[0125] 4.离心，1,000g，1min，收集上清液，为便于充分将目的蛋白从Ni柱柱料上洗脱下来，可以重复步骤3中的加入新的洗脱缓冲液然后将EP管放到水平旋转仪上进行旋转，便于目的蛋白与Ni柱柱料脱离，1个小时，此过程在4℃冰箱中进行；
[0126] 5.超滤，利用超滤管对洗脱液进行超滤，进而到达去除咪唑以及达到浓缩蛋白的目的，通过离心，6,000g，10min每次，离3次用PBS缓冲液置换洗脱液，已达到去盐离子以及浓缩的目的，将已经超滤好含有目的蛋白的液体在0℃的条件下进行保存。
[0127] 1.12在细胞上验证表达的目的蛋白能否进入细胞及不同PTD的导入效率
[0128] 将表达好的蛋白在GB(石斑鱼脑细胞)和SB细胞(海鲈上皮细胞)上做浸泡实验观察它们能否进入细胞内部。
[0129] 1.将生长在培养瓶的GB/SB细胞经过胰酶消化，然后传代，将GB/SB细胞铺在96孔板上，接着将96孔板放在培养箱进行过夜培养；
[0130] 2.将纯化的蛋白，通过跑SDS-PAGE蛋白胶通过与标准物作对照，测定目的蛋白的浓度，然后按每孔加15微克的目的蛋白与100微升含10％的血清的DMEM/MEM培养基，然后通 过0.22μm的滤膜进行过滤以除去细菌，然后将含有目的蛋白的培养基加入到已经用无血清DMEM/MEM培养基洗过的96孔板中，每个样品做3个重复；
[0131] 3.将含有目的蛋白的GB/SB细胞放在冰上30min，然后将96孔板放到26℃，3％ CO2的细胞培养箱中2个小时；
[0132] 4.用冷的PBS缓冲液清洗含有目的蛋白的96孔板中的孔，洗3次，然后在荧光显微镜下观察对含有GFP荧光蛋白标签的目的蛋白进行观察，观察目的蛋白能否进入细胞；
[0133] 5.固定，对没有GFP荧光蛋白标签的目的蛋白用放到-20℃的甲醇进行固定，每孔加入甲醇100微升，将加入甲醇的96孔板放到-20℃中20min；
[0134] 6.封闭，将甲醇弃掉，用TBST清洗3次，每次3min，然后每孔加入5％的牛血清蛋白封闭液，放在水平摇床上，1个小时；
[0135] 7.一抗孵育，将5％的牛血清蛋白封闭液弃掉，用TBST清洗3次，每次3min，然后每孔加入100μl的按1:5000的比例稀释的鼠源性抗His的单克隆抗体的TBST缓冲液，在摇床上，室温，3个小时；
[0136] 8.二抗孵育，将一抗弃掉，用TBST清洗3次，每次3min，然后每孔加入100μl的按1:5000的比例稀释的携带荧光标签标签的兔抗鼠IgG(H+L)的二抗的TBST缓冲液，在摇床上，室温，1个小时；
[0137] 9.染核，将二抗弃掉，用TBST清洗3次，每次3min，然后加入稀释好的PI染核试剂，染核20min；
[0138] 10.观察，将染核液弃掉，用TBST清洗3次，每次3min，然后在荧光显微镜下观察目的蛋白能否进入GB/SB细胞。
[0139] 2.1结果
[0140] 2.1.1质粒的构建
[0141] 通过设计特异性的引物，进行PCR获取目的基因，然后通过双酶切，连接，转化，筛TM选获得阳性克隆。双酶切结果见图1。其中，1为DS 2000Marker，2为目的基因的双酶切结果。
[0142] 2.1.2目的蛋白的考马斯亮蓝
[0143] 将通过IPTG诱导表达的获得含有目的蛋白的上清跑12％的SDS-PAGE蛋白胶，然后做考马斯亮蓝染色，对目的蛋白进行鉴定，考马斯亮蓝结果如图2所示，其中，1为蛋白Marker，
[0144] 3为目的蛋白的考马斯亮蓝结果。结果显示，所构建的目的蛋白均正确表达。
[0145] 2.1.3目的蛋白的Western Blot结果
[0146] 将通过IPTG诱导表达的获得含有目的蛋白的上清跑12％的SDS-PAGE蛋白胶，然后做 Western Blot对目的蛋白的性质进行鉴定，结果显示，所构建的目的蛋白的大小与预测的相符，目的蛋白得到正确表达。
[0147] 2.1.4目的蛋白的细胞进入结果
[0148] 将纯化好的目的蛋白在以VLP(类病毒粒子)为阳性对照的前提下在GB细胞上做入侵实验，观察不同目的蛋白的进入情况。
[0149] 2.1.4.1目的蛋白在GB细胞上的进入效率
[0150] 纯化好的目的蛋白在GB细胞上的免疫荧光结果显示，本发明的蛋白转导域(SEQ ID:1)可以在荧光显微镜下观察到荧光信号，根据实验结果，这一段肽段可以作为斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白来源蛋白转导域。
[0151] 2.1.4.2目的蛋白在SB细胞上的进入效率
[0152] 纯化好的目的蛋白在SB细胞上的免疫荧光结果显示，可以在荧光显微镜下观察到荧光信号。根据实验结果，本发明这一段肽段可以作为斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白来源蛋白转导域。
[0153] 2.1.4.3不同PTD在SB细胞的导入效率
[0154] 下表为不同PTD的进入效率(n＝3)：
[0155]
[0156] 将新发现的PTD与已知的Penetratin和R8这3种蛋白转导域和GFP的融合蛋白以150ng/μl，浸泡2个小时的条件在SB细胞进行研究不同蛋白转导域在鱼类细胞上的导入效率。结果如上表所示。结果显示，在鱼类细胞中，阳性对照VLP的进入效率最佳，其次是本发明的肽段(3-16)，本发明的蛋白转导域肽段携带GFP进入效率高于Penetratin和R8。以VLP为参照物，那么本发明的肽段携带GFP进入效率分别比Penetratin和R8携带GFP进入SB细胞的效率高29.5％和30.0％。
[0157] 本发明通过将蛋白转导域段与GFP蛋白在pRSET-A原核表达载体融合表达，将目的蛋白纯化后，在鱼类细胞GB/SB细胞中的浸泡结果显示蛋白转导域段可以在荧光显微镜下观察到荧光信号。这表明，本发明的蛋白转导域可以通过将外源物质携带进入细胞内部，应用到鱼类疾病的预防和治疗中。与已知的蛋白转导域R8，Penetratin与GFP融合表达的蛋白进入鱼类细胞SB相比，本发明的蛋白转导域与GFP融合表达的蛋白利用更短的时间，而且具有更高的进入鱼类细胞的效率。
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