脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途
阅读：94发布：2020-05-23
专利汇可以提供脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途，所述脂质体的直径为50~500nm。通过利用脂质体去除蛋白结合毒素，可以大大降低成本，且效果良好。，下面是脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途专利的具体信息内容。
1.一种脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途，所述脂质体的直径为50～500nm。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述蛋白结合毒素是指尿毒症患者体内的蛋白结合毒素。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述脂质体的直径为100～200nm。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物制剂是指在以下任意一个过程中使用的制剂：间隙性血液透析、腹膜透析、连续性肾脏替代疗法。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物制剂中清除蛋白结合毒素唯一有效成分或者主要有效成分为脂质体。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：使用时所述脂质体加入的浓度为30～50g/l。
7.一种透析液，其特征在于，所述透析液中包含脂质体。
8.根据权利要求7所述的透析液，其特征在于，所述透析液中脂质体的浓度为30～50g/l。
9.根据权利要求7所述的透析液，其特征在于：所述脂质体的直径为100～200nm。
10.根据权利要求7所述的透析液，其特征在于：所述透析液是间隙性血液透析透析液、腹膜透析液或者连续性肾脏替代治疗透析液中的任意一种。
脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途
技术领域
背景技术
[0002] 尿毒症是指随着肾功能的减退、肾脏对溶质的清除率下降时血液和组织中不断蓄积并具有毒性的物质。欧洲尿毒症毒素工作组根据其生化特点以及清除方式将其分为三大类：1)水溶性、不与蛋白结合的小分子物质，分子质量通常小于500，如尿素、肌酐等，此类物质容易被血液透析清除；2)中分子物质，分子量通常大于500，如甲状旁腺素，此类物质常规血液透析清除效果不理想，只能通过大孔径透析膜的血液净化方式清除；3)蛋白结合性毒素，如硫酸吲哚酚，硫酸对甲酚，大多数血液净化方式对此类物质的清除效果较差。目前研究表明蛋白结合毒素与CKD(慢性肾病)患者死亡的首要原因心血管事件密切相关。
[0004] 脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。
[0005] 目前尚未出现关于利用脂质体用于清除尿毒症患者体内蛋白结合毒素的报道和文献。
发明内容
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途，用于解决现有技术中透析液中添加白蛋白成本过高，效果不佳的问题。
[0007] 基于实验的发现，申请人发现脂质体能够结合蛋白结合毒素，且效果良好。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种脂质体在制备用于清除蛋白结合毒素的药物制剂中的用途，所述脂质体的直径为50～500nm。
[0009] 所述蛋白结合毒素可以是多种蛋白结合毒素，例如多脏器功能衰竭的重症急性肾损伤产生的蛋白结合毒素。
[0010] 进一步地，所述蛋白结合毒素是指尿毒症患者体内的蛋白结合毒素。
[0011] 所述脂质体可以按照现有技术中的方法制备。所述脂质体可以是单层的或者多层的，其可以是不同的大小，所带电荷也不受限制，可以是不同的特征的囊泡将含水介质包裹。
[0012] 优选地，所述脂质体中脂质层膜的主要成分选自天然磷脂或者合成磷脂。
[0013] 优选地，所述磷脂是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的任意一种或两种。
[0014] 进一步地，所述磷脂是二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的任意一种或几种。
[0015] 所述药物制剂可以直接加入现有技术中的血液透析液中用于在血液透析时清除蛋白结合毒素。
[0016] 优选地，所述脂质体的直径为100～200nm。
[0017] 优选地，所述脂质体的直径为200～300nm。
[0018] 进一步地，所述药物制剂是指在以下任意过程中使用的制剂：间隙性血液透析、腹膜透析、连续性肾脏替代疗法。
[0019] 所述间隙性血液透析是现有技术，具体是指急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的电解质溶液(透析液)在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分，并将经过净化的血液回输的整个过程。
[0020] 腹膜透析是利用人体自身的腹膜作为透析膜的一种透析方式。通过灌入腹腔的透析液与腹膜另一侧的毛细血管内的血浆成分进行溶质和水分的交换，清除体内潴留的代谢产物和过多的水分，同时通过透析液补充机体所必需的物质。通过不断的更新腹透液，达到肾脏替代或支持治疗的目的。
[0021] 连续性肾脏替代疗法又称连续性血液净化(CBP)，是开展的一种新的血液净化方法。1995年第一届国际连续性肾脏替代治疗会议规定，采用每天连续24小时或接近24小时的一种连续性血液净化疗法，替代受损的肾脏功能的净化方式，即为连续性肾脏替代治疗。连续性肾脏替代治疗包括连续性动静脉、静静脉血液滤过(CAVH、CVVH)，连续性动静脉、静静脉血液透析(CAVDH、CVVDH)，连续性动静脉、静静脉血液透析滤过(CAVHDF、CVVHDF)等模式。
[0022] 进一步地，所述药物制剂中清除蛋白结合毒素唯一有效成分或者主要有效成分为脂质体。
[0023] 进一步地，使用时所述脂质体加入的浓度为30～50g/l。
[0024] 具体是指将药物制剂加入到使用体系中时保证使用体系中脂质体的浓度为30～50g/l。所述使用体系一般是指透析液。
[0025] 经过实验发现以上剂量是最佳剂量，进一步增加脂质球浓度清除毒素的效率并不会进一步上升。
[0026] 优选地，所述脂质体加入的量为每升透析液中加入40g。
[0027] 本发明的另外一个方面提供了一种透析液，所述透析液中包含脂质体。
[0028] 优选地，所述透析液中脂质体的浓度为30～50g/l。
[0029] 优选地，所述脂质体的直径为100～200nm。
[0030] 优选地，所述透析液是间隙性血液透析透析液、腹膜透析液或者连续性肾脏替代治疗透析液中的任意一种。
[0031] 本发明的另外一个方面公开了上述透析液用于清除蛋白结合毒素用途。
[0032] 本发明的另外一个方面提供了一种用于清除蛋白结合毒素的药物制剂，所述药物制剂中的有效成份为脂质体，所述脂质体的直径为50～500nm。
[0033] 进一步地，所述脂质体的直径为100～200nm。
[0034] 优选地，所述脂质体中脂质层膜的主要成分选自天然磷脂或者合成磷脂。
[0035] 优选地，所述磷脂是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的任意一种或两种。
[0036] 进一步地，所述磷脂是二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的任意一种或几种。
[0037] 本发明的另外一个方面提供了一种清除患者体内蛋白结合毒素的方法，所述方法包括向患者的血液提供脂质体，利用脂质体清除蛋白结合毒素。
[0038] 进一步地，所述脂质体中脂质层膜的主要成分选自天然磷脂或者合成磷脂。
[0039] 优选地，所述磷脂是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的任意一种或两种。
[0040] 进一步地，所述磷脂是二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的任意一种或几种。
[0041] 进一步地，所述方法是指在间隙性血液透析、腹膜透析、连续性肾脏替代疗法过程中向透析液中加入脂质体。
[0042] 进一步地，所述蛋白结合毒素是指尿毒症患者体内的蛋白结合毒素。
[0043] 优选地，使用时所述透析液中脂质体加入的量为30～50g/l。
[0044] 优选地，所述脂质体的直径为50～500nm，更优选为100～200nm。
[0045] 如上所述，本发明的脂质体在制备用于清除尿毒症毒素的药物制剂中的用途，具有以下有益效果：
[0046] 由于脂质体的成本远远低于白蛋白，因此大大降低了透析时的成本，且效果较好，为广大患者大大降低了治疗费用。例如目前采用白蛋白透析的方法中一次透析需要花费的价钱约为1万元，若采用脂质体，其费用将会降低到一千元以下，十分有益于人类健康水平的提高。附图说明
[0047] 图1显示为脂质体对硫酸对甲酚PCS的吸附率。
[0048] 图2显示脂质体对硫酸吲哚酚IS的吸附率。
[0050] 图4脂质体吸附硫酸对甲酚p-cresyl sulfate的剂量效应曲线。
[0051] 图5脂质体吸附硫酸吲哚酚indoxyl sulfate的剂量效应曲线。
[0052] 图6脂质体吸附马尿酸hippuric acid的剂量效应曲线。
[0053] 图7 PCS在一次性快速平衡透析中的清除百分比。
[0054] 图8 IS在一次性快速平衡透析中的清除百分比。
[0055] 图9 IS在一次性快速平衡透析中的清除百分比。
[0056] 图10体外闭合循环模式图。
[0057] 图11a三种方式对对甲酚p-cresol的清除效果(A血液侧)。
[0058] 图11b三种方式对对甲酚p-cresol的清除效果(B透析液侧)。
[0059] 图12a三种方式对硫酸吲哚酚indoxyl sulfate的清除效果(A血液侧)。
[0060] 图12b三种方式对硫酸吲哚酚indoxyl sulfate的清除效果(B透析液侧)。
[0061] 图13a三种方式对马尿酸hippuric acid的清除效果(A血液侧)。
[0062] 图13b三种方式对马尿酸hippuric acid的清除效果(B透析液侧)。
[0063] 图14a三种方式对吲哚乙酸indole-3-acetic acid的清除效果(A血液侧)。
[0064] 图14b三种方式对吲哚乙酸indole-3-acetic acid的清除效果(B透析液侧)。
具体实施方式
[0065] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0066] 实施例1 脂质体制备
[0067] 分别称取0.6g吐温-80，0.6g胆固醇，0.6g去氧胆酸钠和2.4g大豆卵磷脂，加入100mL二氯甲烷使之完全溶解。将混合液加入干净无水的烧瓶中，在30度减压条件下旋转成膜(一夜使有机溶剂挥发彻底)。
[0069] 在薄膜完全水化后取出混合液后，将液体加入高雅均质仪(设定压力400bar，30min)均质30min。
[0070] 取出后冷冻干燥收集。经测定，脂质体的直径为100～200nm。
[0071] 实施例2 脂质体吸附蛋白结合尿毒症毒素概念的验证
[0072] I.初步选择3种具有代表性的蛋白结合尿毒症毒素：
[0073] 1.硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate，PCS，分子量188Da，白蛋白结合率～95％)[0074] 2.硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS，分子量212Da，白蛋白结合率～90-95％)；
[0075] 3.马尿酸(hippuric acid，HA，分子量179Da，白蛋白结合率～50％)[0076] II.脂质体吸附蛋白结合尿毒症毒素的初步测定：
[0077] 1.方法
[0078] (1)试剂
[0079] 牛血清白蛋白BSA(sigma，纯度≥98％)
[0080] 磷酸盐缓冲液1×PBS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.)
[0081] 硫酸对甲酚PCS(APExBIO)
[0083] 马尿酸HA(sigma)
[0084] (2)超滤管
[0085] Ultra 0.5mL超滤管(Millipore，分子截留量3KD)
[0086] (3)操作步骤
[0087] a.分别精确称量PCS 10mg，IS 11.4mg，HA18.9mg，溶于磷酸盐缓冲液中(1xPBS，PH7.2-7.4)，定容至265ml，放置于摇床上，室温避光，过夜摇匀，备用。
[0088] b.取上述溶液16ml，分装为8份，每份2ml，分别加入BSA和脂质体，配制最终浓度为BSA 40g/L，脂质体分别为10g/L,20g/L,40g/L,80g/L,120g/L,160g/L。
[0089] c.分别于30min后，60min后，120min后和240min后取上述含蛋白结合尿毒症毒素的BSA溶液或不同浓度的脂质体溶液0.4ml，加入0.5ml超滤管中，12000转/分，4℃，离心30分钟，取超滤液。
[0090] d.计算上述毒素的BSA结合率或脂质体吸附率
[0091] BSA结合率或脂质体吸附率＝100x(总浓度-超滤液浓度)/总浓度
[0092] e.重复上述步骤3次。
[0093] 2.检测方法
[0094] 利用高效液相色谱HPLC(high-performance liquid chromatography)测定蛋白结合毒素的浓度。
[0095] 3.统计学方法
[0097] 4.结果
[0098] 如图1所示，当BSA浓度为40g/L时，30min时PCS的BSA蛋白结合率为93.80％±0.92％，当BSA结合PCS后，随着时间的延长，基本无解离。30min时，10g/L的脂质体对PCS吸附率为79.1％±2.82％，且60min，120min，240min时分别与30min比较，脂质体对PCS的吸附率均无明显变化(p＞0.05)。30min时，随着脂质体浓度的增加，对PCS的吸附率亦逐渐增加。
[0099] 如图2所示，当BSA浓度为40g/L时，30min时IS的BSA蛋白结合率为94.07％±2.09％，当BSA结合IS后，随着时间的延长，基本无解离。30min时，10g/L的脂质体对IS吸附率为51.11％±1.40％，120min时的吸附率最高，可达63.81％±3.73％，60min，240min时吸附率与30min比较吸附率无统计学差异(p＞0.05)。30min时，随着脂质体浓度的增加，对IS的吸附率亦逐渐增加。
[0100] 如图3所示，当BSA浓度为40g/L时，30min时HA的BSA蛋白结合率为58.46％±4.18％，当BSA结合HA后，随着时间的延长，基本无解离。30min时，10g/L的脂质体对HA吸附率为57.30％±1.40％，且60min，120min，240min时分别与30min比较，脂质体对HA的吸附率均无明显变化(p＞0.05)。30min时，随着脂质体浓度的增加，对HA的吸附率并无明显增加(p＞0.05)。
[0101] 实施例3 脂质体吸附蛋白结合尿毒症毒素的浓度依赖性
[0102] 1.方法
[0103] (1)试剂
[0104] 牛血清白蛋白BSA(sigma，纯度≥98％)
[0105] 磷酸盐缓冲液1×PBS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.)
[0106] 硫酸对甲酚PCS(APExBIO)
[0107] 硫酸吲哚酚钾盐IS(sigma)
[0108] 马尿酸HA(sigma)
[0109] (2)超滤管
[0110] Ultra 0.5mL超滤管(Millipore，分子截留量3KD)
[0111] (3)操作步骤
[0112] a.以同样的方法取上述溶液10ml，分装为10份，每份1ml，分别加入脂质体，配制的脂质体最终浓度分别为5g/L,10g/L,20g/L,30g/L,40g/L,60g/L,80g/L,100g/L,120g/L,和160g/L。
[0113] b.于120min后取上述含蛋白结合尿毒症毒素的不同浓度的脂质体溶液0.5ml，加入0.5ml超滤管中，12000转/分，4℃，离心30分钟，取超滤液。
[0114] d.计算上述毒素的脂质体吸附率
[0115] 脂质体吸附率＝100x(总浓度-超滤液浓度)/总浓度
[0116] e.重复上述步骤3次。
[0117] 2.检测方法：同上。
[0118] 3.统计学方法
[0119] 运用SPSS 21.0统计软件进行处理，数据用平均值±标准差表示。两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
[0120] 4.结果
[0121] 如图4所示，当脂质体浓度为5g/L时，120min时对PCS的吸附率为70.38％±3.73％，且随着脂质体浓度的增加对PCS的吸附率逐渐增加，当脂质体浓度为60g/L时，对PCS的吸附率为90.70％±0.45％，当脂质体浓度增加至160g/L时，对PCS的吸附率为
98.58％±0.14％。
98.58％±0.14％。
[0122] 如图5所示，当脂质体浓度为5g/L时，120min时对IS的吸附率为39.60％±1.20％，且随着脂质体浓度的增加对IS的吸附率逐渐增加，当脂质体浓度为60g/L时，对IS的吸附率为83.63％±1.59％，之后随着脂质体浓度的增加对IS的吸附率逐渐趋于平缓，当脂质体浓度增加至160g/L时，对IS的吸附率为91.12％±1.76％。
[0123] 如图6所示，当脂质体浓度为5g/L时，120min时对IS的吸附率为59.06％±2.74％，随着脂质体浓度的增加对HA的吸附率并无明显规律，当脂质体浓度增加至160g/L时，对HA的吸附率为54.78％±4.61％。
[0124] 实施例4 体外静态透析
[0125] 1.方法
[0126] (1)试剂
[0127] 牛血清白蛋白BSA(sigma，纯度≥98％)
[0128] 磷酸盐缓冲液1×PBS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.)
[0129] 硫酸对甲酚PCS(APExBIO)
[0130] 硫酸吲哚酚钾盐IS(sigma)
[0131] 马尿酸HA(sigma)
[0132] (2)主要设备
[0133] Single-Use RED(rapid equilibrium dialysis)Plate(Thermo ScientificTM，分子截留量8000Da)
[0134] (3)操作步骤
[0135] a.精确称量0.8g BSA，用上述含PCS，IS和HA蛋白结合尿毒症毒素的溶液定容至20ml，BSA的最终浓度为40g/L，于摇床上室温过夜。
[0136] b.如表1所示，依次于Sample Chambers和Buffer Chambers中加入下述溶液，每个孔加样两次：
[0137]
[0138]
[0139] c.加完样后，用封口条覆盖该RED板，将RED板放置于摇床上，于37℃，250转/分，孵育4小时。
[0140] d.移除封口条，将Sample Chambers中的样品转移至1.5ml EP管中，计算孵育4h后样品中各毒素浓度。
[0141] 清除百分比(Percent removal,％)＝(C pre-incubation-C post incubation)/C pre-incubation in Sample Chambers
[0142] e.重复上述步骤3次。
[0143] 2.检测方法：同上。
[0144] 3.统计学方法
[0145] 运用SPSS 21.0统计软件进行处理，数据用平均值±标准差表示。两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
[0146] 4.结果
[0147] 以样品⑴为透析平衡时间的参照，37℃孵育4小时后，Sample Chamber中，PCS浓度清除百分比为46.53％±2.24％，IS浓度清除百分比为53.30％±1.10％，HA浓度清除百分比为49.09％±5.14％，表明4小时孵育可以达到平衡透析时间。
[0148] 如图7所示，PBS组Sample Chamber孵育4小时后，PCS清除百分比为2.34％±1.93％，5g/L脂质体组Sample Chamber孵育4小时后，PCS清除百分比为6.42％±1.64％，较PBS组有所增加(p＜0.05)，随着脂质体浓度增加，Sample Chambers中PCS的清除百分比逐渐增加，40g/L脂质体清除PCS百分比为27.74％±1.57％，与40g/L BSA清除PCS百分比效果类似(27.74％±1.57％vs.29.14％±5.01％)。
[0149] 如图8所示，PBS组Sample Chamber孵育4小时后，IS清除百分比为4.42％±1.39％，5g/L脂质体组Sample Chamber孵育4小时后，PCS清除百分比为7.41％±1.48％，较PBS组有所增加(p＝0.03)，随着脂质体浓度增加，Sample Chambers中IS的清除百分比逐渐增加，60g/L脂质体清除PCS百分比为29.72％±4.66％，与40g/L BSA清除PCS百分比效果比较无统计学差异(29.72％±4.66％vs.34.00％±2.55％)。
[0150] 如图9所示，PBS组Sample Chamber孵育4小时后，HA清除百分比为22.99％±2.97％，5g/L脂质体组Sample Chamber孵育4小时后，PCS清除百分比为28.47％±4.31％，与PBS组相比无统计学差异(p＝0.08)，随着脂质体浓度增加，Sample Chambers中HA的清除百分比逐渐增加，但增加趋势不如PCS和IS。60g/L脂质体清除PCS百分比为41.79％±
4.69％，与40g/L BSA清除HA百分比效果比较无统计学差异(41.79％±4.69％vs.47.99％±7.84％)。
4.69％，与40g/L BSA清除HA百分比效果比较无统计学差异(41.79％±4.69％vs.47.99％±7.84％)。
[0151] 实施例5 体外闭合循环
[0152] 1.方法
[0153] (1)试剂
[0154] 牛血清白蛋白BSA(sigma，纯度≥98％)
[0155] 磷酸盐缓冲液1×PBS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.)
[0156] 硫酸对甲酚PCS(APExBIO)
[0157] 对甲酚(p-cresol,sigma)
[0158] 硫酸吲哚酚钾盐IS(sigma)
[0159] 吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，3-IAA，分子量175Da，白蛋白结合率～75％)[0160] 马尿酸HA(sigma)
[0161] (2)主要仪器和设备
[0162] Ultra 0.5mL超滤管(Millipore，分子截留量3KD)；
[0164] 微滤器(威高集团有限公司)
[0165] 体外循环管路(美国VWR公司)
[0166] (3)操作步骤
[0167] I.硫酸对甲酚p-cresyl sulfate和对甲酚p-cresol与BSA结合率的比较[0168] 方法同前，利用 Ultra 0.5mL超滤管测得硫酸对甲酚p-cresyl sulfate的蛋白结合率约为93％-95％，对甲酚p-cresol的蛋白结合率为93％-95％，两者的蛋白结合率相似，故体外闭合循环采用对甲酚p-cresol代表蛋白结合毒素之一。
[0169] II.体外闭合循环
[0170] a.血液侧(B侧)溶液配制：
[0171] 精确称量牛血清白蛋白BSA 20g，对甲酚10.8mg，硫酸吲哚酚钾盐17.0mg，马尿酸35.8mg，溶于磷酸盐缓冲液PBS中，精确称量吲哚乙酸13.2mg，溶于500ml PBS中，取50ml加入上述含BSA，对甲酚，硫酸吲哚酚和马尿酸的PBS溶液中，最后定容至500ml，室温，摇床上过夜摇匀备用。每次循环的血液侧容量均为50ml。
[0172] b.透析液(D侧)组分
[0173] 每次循环的透析液容量均为100ml，按其成分不同分为三组，每组循环3次，分别为①PBS作为对照组，②40g/L BSA溶于PBS中，作为BSA组，③40g/L脂质体溶于PBS中作为脂质体组。
[0174] c.透析参数设置
[0175] 如图10所示，血液侧(B侧)血流量Qb＝5.0ml/min，透析液侧(D侧)透析液流量Qd＝5ml/min，每次循环进行360min。体外循环装置连接完毕后两侧均先以生理盐水预冲。两侧烧杯在透析过程中均置于磁力搅拌器上以保证溶液始终混合均匀。
[0176] d.标本采集和检测
[0177] 在体外循环的0min，10min，30min，60min，90min，120min，150min，180min，210min，240min，270min，300min，330min和360min于两侧分别抽取150ul样品，置于-80℃待测。含脂质体的样品处理方法：吸取样本溶液100ul,加入乙腈300ul使脂质体沉淀，于4℃，以12000转/分，离心30min，取上清液100ul送检。
[0178] 2.检测方法：同上。
[0179] 3.统计学方法
[0180] 运用SPSS 21.0统计软件进行处理，数据用平均值±标准差表示。两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
[0181] 4.结果
[0182] 1)体外闭合循环中p-cresol的清除效果
[0183] 如图11a和11b所示，配制的血液侧BSA溶液中，对甲酚p-cresol的起始浓度约为200umol/L，因对甲酚p-cresol的蛋白结合率可达93％-95％，透析开始时游离水平很低，为
12.80±1.44umol/L，在6小时的透析循环过程中，对照组(PBS)血液侧降低速度和透析液侧增加速度始终均较缓慢，6h时对照组血液侧p-cresol下降率为起始的8.01％±1.73％，透析液侧透析结束时p-cresol浓度为7.01±0.80umol/L。BSA组和liposome组血液侧p-cresol在透析前1h过程中下降速率最快，1h时下降率分别为起始的50.08％±5.04％和
49.44％±24.4％，透析第2h过程中下降速率则减慢，2h时BSA组和liposome组血液侧p-cresol下降率分别为起始的56.34％±2.47％和62.18±16.08％。2h后BSA组和liposome组血液侧p-cresol下降速率则明显减慢，4h下降率分别为64.89％±3.50％和70.18％±
10.7％。在透析4h后BSA组和liposome组血液侧p-cresol的浓度基本趋于稳定。同样，BSA组和liposome组透析液侧p-cresol浓度在循环起始第1h过程中增加速率最快，lh时两组透析液侧p-cresol浓度分别为40.26±4.78umol/L和43.16±10.69umol/L，循环第2h过程中两组透析液侧p-cresol浓度增加则明显减缓，2h时两组透析液侧p-cresol浓度分别为49.07±6.31umol/L和49.83±13.20umol/L，2h后两组透析液侧p-cresol浓度仍有缓慢上升，4h时两组透析液侧p-cresol浓度分别为60.06±7.66umol/L和64.81±10.86umol/L，之后透析液侧两组p-cresol的浓度基本趋于平缓。
12.80±1.44umol/L，在6小时的透析循环过程中，对照组(PBS)血液侧降低速度和透析液侧增加速度始终均较缓慢，6h时对照组血液侧p-cresol下降率为起始的8.01％±1.73％，透析液侧透析结束时p-cresol浓度为7.01±0.80umol/L。BSA组和liposome组血液侧p-cresol在透析前1h过程中下降速率最快，1h时下降率分别为起始的50.08％±5.04％和
49.44％±24.4％，透析第2h过程中下降速率则减慢，2h时BSA组和liposome组血液侧p-cresol下降率分别为起始的56.34％±2.47％和62.18±16.08％。2h后BSA组和liposome组血液侧p-cresol下降速率则明显减慢，4h下降率分别为64.89％±3.50％和70.18％±
10.7％。在透析4h后BSA组和liposome组血液侧p-cresol的浓度基本趋于稳定。同样，BSA组和liposome组透析液侧p-cresol浓度在循环起始第1h过程中增加速率最快，lh时两组透析液侧p-cresol浓度分别为40.26±4.78umol/L和43.16±10.69umol/L，循环第2h过程中两组透析液侧p-cresol浓度增加则明显减缓，2h时两组透析液侧p-cresol浓度分别为49.07±6.31umol/L和49.83±13.20umol/L，2h后两组透析液侧p-cresol浓度仍有缓慢上升，4h时两组透析液侧p-cresol浓度分别为60.06±7.66umol/L和64.81±10.86umol/L，之后透析液侧两组p-cresol的浓度基本趋于平缓。
[0184] 2)体外闭合循环中indoxyl sulfate的清除效果
[0185] 如图12a和12b所示，三组在透析过程中血液侧和透析液侧indoxyl sulfate的变化和p-cresol相似。配制的血液侧BSA溶液中，硫酸吲哚酚indoxyl sulfate的起始浓度约为150umol/L，其蛋白结合率为95.48％±1.79％，透析开始时血液侧其游离水平为7.83±2.31umol/L，在6小时的透析循环过程中，对照组(PBS)血液侧indoxyl sulfate的降低速度和透析液侧增加速度始终均较缓慢，6h时对照组血液侧p-cresol下降率为起始的8.75％±
1.80％，透析液侧透析结束时p-cresol浓度为8.55±1.64umol/L。BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate在透析前1h过程中下降速率最快，1h时下降率分别为起始的48.69％±
0.74％和47.76％±17.19％，透析第2h过程中下降速率则减慢，2h时BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate下降率分别为起始的56.74％±2.26％和55.82±9.44％。2h后BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate下降速率则明显减慢，4h下降率分别为起始时的
62.55％±1.70％和59.32％±7.75％。在透析4h后BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate的浓度也基本趋于稳定。同样，BSA组和liposome组透析液侧indoxyl sulfate浓度在循环起始第1h过程中增加速率最快，lh时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为
36.69±5.80umol/L和31.81±12.58umol/L，循环第2h过程中两组透析液侧p-cresol浓度增加则明显减缓，2h时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为41.14±8.14umol/L和
35.79±11.30umol/L，2h后两组透析液侧indoxyl sulfate浓度仍有缓慢上升，4h时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为49.98±6.71umol/L和43.08±4.75umol/L，之后透析液两组indoxyl sulfate的浓度基本趋于平缓。
1.80％，透析液侧透析结束时p-cresol浓度为8.55±1.64umol/L。BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate在透析前1h过程中下降速率最快，1h时下降率分别为起始的48.69％±
0.74％和47.76％±17.19％，透析第2h过程中下降速率则减慢，2h时BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate下降率分别为起始的56.74％±2.26％和55.82±9.44％。2h后BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate下降速率则明显减慢，4h下降率分别为起始时的
62.55％±1.70％和59.32％±7.75％。在透析4h后BSA组和liposome组血液侧indoxyl sulfate的浓度也基本趋于稳定。同样，BSA组和liposome组透析液侧indoxyl sulfate浓度在循环起始第1h过程中增加速率最快，lh时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为
36.69±5.80umol/L和31.81±12.58umol/L，循环第2h过程中两组透析液侧p-cresol浓度增加则明显减缓，2h时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为41.14±8.14umol/L和
35.79±11.30umol/L，2h后两组透析液侧indoxyl sulfate浓度仍有缓慢上升，4h时两组透析液侧indoxyl sulfate浓度分别为49.98±6.71umol/L和43.08±4.75umol/L，之后透析液两组indoxyl sulfate的浓度基本趋于平缓。
[0186] 3)体外闭合循环中hippuric acid的清除效果
[0187] 如图13a和13b所示，三组在透析过程中血液侧和透析液侧马尿酸hippuric acid的变化与p-cresol和indoxyl sulfate则有所不同。配制的血液侧BSA溶液中，马尿酸hippuric acid的起始浓度约为400umol/L，其蛋白结合率为60.89％±3.82％，透析开始时血液侧其游离水平为156.42±15.29umol/L，在6小时的透析循环过程中，对照组(PBS)血液侧hippuric acid的降低速度和透析液侧的增加速度与p-cresol和indoxyl sulfate相比，降低或增加幅度均明显增加。PBS组，BSA组和liposome组血液侧hippuric acid浓度在透析开始的第1h过程中下降速率均最快，PBS组血液侧1h时hippuric acid浓度下降率为起始的22.84％±6.70％，BSA组1h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的43.07％±
12.27％，与PBS组相比下降率明显增加(43.07％±12.27％vs.22.84％±6.70％，p＜
0.05)，liposome组1h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的33.01％±11.69％，效率介于其他两组之间。三组在第2h血液侧下降率均较第1h有所减慢，PBS组血液侧2h时hippuric acid浓度下降率为起始的32.08％±3.04％，BSA组2h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的62.74％±10.58％，与PBS组相比下降率也明显增加(62.74％±10.58％vs.32.08％±3.04％，p＜0.05)，liposome组2h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的49.94％±9.45％，效率介于其他两组之间，与PBS组相比下降率也明显增加(49.94％±
9.45％vs.32.08％±3.04％，p＜0.05)，与BSA组相比，无统计学差异(49.94％±9.45％vs.62.74％±10.58％，p＞0.05)。2h后三组血液侧hippuric acid浓度下降则明显减慢，4h时，PBS组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的50.95％±5.51％，BSA组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的77.18％±4.43％，与PBS组相比，仍有统计学差异(77.18％±4.43％vs.50.95％±5.51％，p＜0.05)。liposome组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的56.23％±5.19％，优于PBS组(56.23％±5.19％vs.50.95％±5.51％，p＜
0.05)，次于BSA组(56.23％±5.19％vs.77.18％±4.43％，p＜0.05)。透析4h后三组血液侧hippuric acid的浓度基本趋于稳定。三组透析液侧hippuric acid浓度在透析开始的第1h过程中增加速率均最快，PBS组透析液侧于透析起始1h时浓度为69.16±20.97umol/L，BSA组1h时浓度为69.16±20.97umol/L，较PBS组的增加有统计学意义(69.16±20.97vs.69.16±20.97umol/L,p＝0.02)，liposome组1h时透析液侧hippuric acid浓度为61.88±
21.39umol/L，介于PBS组和BSA组之间。透析第2h三组透析液侧hippuric acid浓度增加速率则减慢，BSA组2h时hippuric acid浓度为104.61±30.65umol/L，高于PBS组(104.61±
30.65vs.64.50±7.59umol/L，p＜0.01)，liposome组2h时hippuric acid浓度为87.68±
25.45umol/L,优于PBS组(p＝0.014)，与BSA组相比，无统计学差异(p＞0.05)。2h后三组透析液侧hippuric acid浓度增加则更加缓慢，4h时，PBS组透析液侧hippuric acid浓度为
99.56±13.71umol/L，BSA组为139.24±18.95umol/L，与PBS组相比，仍有统计学差异(p＜
0.05)。liposome组为111.71±21.16umol/L，介于两者之间。透析4h后三组透析液侧hippuric acid的浓度基本趋于稳定。
12.27％，与PBS组相比下降率明显增加(43.07％±12.27％vs.22.84％±6.70％，p＜
0.05)，liposome组1h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的33.01％±11.69％，效率介于其他两组之间。三组在第2h血液侧下降率均较第1h有所减慢，PBS组血液侧2h时hippuric acid浓度下降率为起始的32.08％±3.04％，BSA组2h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的62.74％±10.58％，与PBS组相比下降率也明显增加(62.74％±10.58％vs.32.08％±3.04％，p＜0.05)，liposome组2h时血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的49.94％±9.45％，效率介于其他两组之间，与PBS组相比下降率也明显增加(49.94％±
9.45％vs.32.08％±3.04％，p＜0.05)，与BSA组相比，无统计学差异(49.94％±9.45％vs.62.74％±10.58％，p＞0.05)。2h后三组血液侧hippuric acid浓度下降则明显减慢，4h时，PBS组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的50.95％±5.51％，BSA组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的77.18％±4.43％，与PBS组相比，仍有统计学差异(77.18％±4.43％vs.50.95％±5.51％，p＜0.05)。liposome组血液侧hippuric acid浓度下降率为起始的56.23％±5.19％，优于PBS组(56.23％±5.19％vs.50.95％±5.51％，p＜
0.05)，次于BSA组(56.23％±5.19％vs.77.18％±4.43％，p＜0.05)。透析4h后三组血液侧hippuric acid的浓度基本趋于稳定。三组透析液侧hippuric acid浓度在透析开始的第1h过程中增加速率均最快，PBS组透析液侧于透析起始1h时浓度为69.16±20.97umol/L，BSA组1h时浓度为69.16±20.97umol/L，较PBS组的增加有统计学意义(69.16±20.97vs.69.16±20.97umol/L,p＝0.02)，liposome组1h时透析液侧hippuric acid浓度为61.88±
21.39umol/L，介于PBS组和BSA组之间。透析第2h三组透析液侧hippuric acid浓度增加速率则减慢，BSA组2h时hippuric acid浓度为104.61±30.65umol/L，高于PBS组(104.61±
30.65vs.64.50±7.59umol/L，p＜0.01)，liposome组2h时hippuric acid浓度为87.68±
25.45umol/L,优于PBS组(p＝0.014)，与BSA组相比，无统计学差异(p＞0.05)。2h后三组透析液侧hippuric acid浓度增加则更加缓慢，4h时，PBS组透析液侧hippuric acid浓度为
99.56±13.71umol/L，BSA组为139.24±18.95umol/L，与PBS组相比，仍有统计学差异(p＜
0.05)。liposome组为111.71±21.16umol/L，介于两者之间。透析4h后三组透析液侧hippuric acid的浓度基本趋于稳定。
[0188] 4)体外闭合循环中indole-3-acetic acid的清除效果
[0189] 如图14a和14b所示，三组在透析过程中血液侧和透析液侧吲哚乙酸3-IAA的变化与p-cresol和indoxyl sulfate也不同。配制的血液侧BSA溶液中，3-IAA的起始浓度约为15umol/L，其蛋白结合率为75％±2.38％，透析开始时血液侧其游离水平为3.75±
1.29umol/L。三组血液侧3-IAA浓度均在透析开始的第1h过程中下降速率最快，PBS组血液侧30min时3-IAA浓度下降率为起始的30.19％±13.94％，BSA组30min时血液侧3-IAA浓度下降率为起始的53.27％±27.71％，liposome组30min时血液侧3-IAA浓度下降率为起始的
40.46％±24.46％，三组之间的差异无统计学意义(p＞0.05)。1h时三组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的34.91％±12.07％，55.45％±21.09％，47.28％±28.07％，三组之间的差异仍无统计学意义(p＞0.05)。循环第2h三组在血液侧的下降率均较第1h过程减慢，
2h时PBS组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的42.96％±9.20％，BSA组优于PBS组，差异具有统计学意义(60.75％±9.10％vs.42.96％±9.20％,p＝0.038)，liposome组2h血液侧3-IAA浓度的下降率为64.24±17.59％，高于PBS组(64.24±17.59％vs.42.96％±
9.20％,p＝0.03)。循环2h后三组血液侧3-IAA浓度下降则更加缓慢，4h时PBS组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的51.15％±7.95％，BSA组高于PBS组(68.82±3.31％vs.51.15％±7.95％,p＝0.012)liposome组也高于PBS组(75.19±10.24％，p＝0.01)，而BSA组和liposome组差异无统计学意义(p＞0.05)。循环第4h后三组血液侧3-IAA的浓度趋于平稳。同样地，三组透析液侧3-IAA浓度在循环起始第1h过程中增加幅度最快，1h时三组透析液侧3-IAA浓度分别为2.83±1.01umol/L，2.71±1.23umol/L，3.06±1.81umol/L，三组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。循环第2h过程三组透析液侧3-IAA浓度增加更加缓慢，2h时，liposome组透析液侧3-IAA浓度为4.33±1.06umol/L，高于PBS组(4.33±
1.06vs.3.36±0.66，p＝0.047),BSA组为3.39±1.47umol/L，与PBS组相比，差异无统计学意义(p＞0.05)。2h后三组透析液侧3-IAA浓度逐渐趋于平台，且liposome组透析液侧的3-IAA浓度始终高于PBS组(p均＜0.05)。BSA组透析液侧的3-IAA浓度与PBS组相比，直到透析结束时差异具有统计学意义(5.52±1.27vs.4.21±0.59umol/L,p＝0.031)。
1.29umol/L。三组血液侧3-IAA浓度均在透析开始的第1h过程中下降速率最快，PBS组血液侧30min时3-IAA浓度下降率为起始的30.19％±13.94％，BSA组30min时血液侧3-IAA浓度下降率为起始的53.27％±27.71％，liposome组30min时血液侧3-IAA浓度下降率为起始的
40.46％±24.46％，三组之间的差异无统计学意义(p＞0.05)。1h时三组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的34.91％±12.07％，55.45％±21.09％，47.28％±28.07％，三组之间的差异仍无统计学意义(p＞0.05)。循环第2h三组在血液侧的下降率均较第1h过程减慢，
2h时PBS组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的42.96％±9.20％，BSA组优于PBS组，差异具有统计学意义(60.75％±9.10％vs.42.96％±9.20％,p＝0.038)，liposome组2h血液侧3-IAA浓度的下降率为64.24±17.59％，高于PBS组(64.24±17.59％vs.42.96％±
9.20％,p＝0.03)。循环2h后三组血液侧3-IAA浓度下降则更加缓慢，4h时PBS组血液侧3-IAA浓度的下降率分别为起始的51.15％±7.95％，BSA组高于PBS组(68.82±3.31％vs.51.15％±7.95％,p＝0.012)liposome组也高于PBS组(75.19±10.24％，p＝0.01)，而BSA组和liposome组差异无统计学意义(p＞0.05)。循环第4h后三组血液侧3-IAA的浓度趋于平稳。同样地，三组透析液侧3-IAA浓度在循环起始第1h过程中增加幅度最快，1h时三组透析液侧3-IAA浓度分别为2.83±1.01umol/L，2.71±1.23umol/L，3.06±1.81umol/L，三组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。循环第2h过程三组透析液侧3-IAA浓度增加更加缓慢，2h时，liposome组透析液侧3-IAA浓度为4.33±1.06umol/L，高于PBS组(4.33±
1.06vs.3.36±0.66，p＝0.047),BSA组为3.39±1.47umol/L，与PBS组相比，差异无统计学意义(p＞0.05)。2h后三组透析液侧3-IAA浓度逐渐趋于平台，且liposome组透析液侧的3-IAA浓度始终高于PBS组(p均＜0.05)。BSA组透析液侧的3-IAA浓度与PBS组相比，直到透析结束时差异具有统计学意义(5.52±1.27vs.4.21±0.59umol/L,p＝0.031)。
[0190] 5)体外闭合循环过程中血液侧BSA浓度变化
[0191] 如表2所示，在体外循环过程中，三组血液侧BSA浓度在透析前30min内稍有下降，但未达统计学差别，30min后三组血液侧BSA浓度均无明显改变。
[0192] 表2 体外循环过程各组血液侧(B侧)BSA浓度变化
[0193]
[0194] 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
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