具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
阅读：1023发布：2020-06-30
专利汇可以提供具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 凝血 疾病 的经修饰的VWF分子。，下面是具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子专利的具体信息内容。
1.能够结合因子VIII的血管性血友病因子(VWF)分子，其包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的C1结构域。
2.权利要求1的VWF分子，其中存在于天然VWF中的位置2298的O-糖基化位点已经通过缺失或置换VWF氨基酸序列的位置2292至2303的一个或多个氨基酸而失活。
3.权利要求2的VWF分子，其中位置2298的苏氨酸已被缺失或被除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸置换。
4.权利要求3的VWF分子，其中所述除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
5.前述权利要求中任一项的VWF分子，其包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
6.前述权利要求中任一项的VWF分子，其包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
7.权利要求2的VWF分子，其中位置2295、2297或2302的脯氨酸已被缺失或被不同氨基酸置换。
8.前述权利要求中任一项的VWF分子，其具有比天然血浆衍生的VWF降低的体内清除。
9.前述权利要求中任一项的VWF分子，相比于与天然血浆衍生的VWF共同施用的因子VIII的半衰期，所述VWF分子能够增加与所述VWF分子共同施用的因子VIII的半衰期。
10.前述权利要求中任一项的VWF分子，其用于治疗凝血疾病。
11.权利要求10的VWF分子，其中所述凝血疾病是血友病A或血管性血友病。
12.权利要求10或11的VWF分子，其中所述治疗还包括施用因子VIII分子。
13.权利要求12的VWF分子，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子分开施用。
14.药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的VWF分子。
15.药盒，其包含(i)权利要求1至9中任一项的VWF分子和(ii)因子VIII分子。
16.权利要求15的药盒，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子包含在分开的组合物中。
17.药盒，其包含(i)权利要求1至9中任一项的VWF分子和(ii)因子VIII分子，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
18.权利要求1至9中任一项的VWF分子用于体内增加因子VIII的半衰期的用途。
19.如权利要求1至9中任一项所定义的VWF分子，其用于延长治疗性治疗中因子VIII的半衰期。
具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 存在由凝血因子缺陷引起的各种出血性疾病。最常见的疾病是血友病A和B，分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX的缺陷引起。另一种已知的出血性疾病是血管性血友病(von Willebrand's disease，VWD)。
[0005] 经典血友病或血友病A是遗传性出血性疾病。它是由凝血FVIII的染色体X连锁缺陷引起的，几乎完全影响每10,000人发生的1至2个个体的男性。X染色体缺陷由本身不患血友病的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向增加。
[0006] 在进行预防性治疗的严重血友病A患者中，FVIII必须每周静脉内(i.v.)约3次施用，因为FVIII的血浆半衰期短，约12至14小时。每次i.v.施用麻烦，与疼痛相关，并且具有感染的风险，特别是因为这主要由患者自己或被诊断患有血友病的儿童的父母在家进行。
[0007] 因此，非常希望增加FVIII的半衰期，使得含有FVIII的药物组合物不必太过频繁地施用。
[0008] 已经进行若干尝试以延长非活化的FVIII的半衰期：通过减少其与细胞受体的相互作用(WO 03/093313 A2、WO 02/060951 A2)，通过将聚合物共价连接到FVIII(WO 94/15625、WO 97/11957和US 4970300)，通过包封FVIII(WO 99/55306)，通过引入新的金属结合位点(WO 97/03193)，通过肽键(WO 97/40145和WO 03/087355)或二硫键(WO 02/
103024A2)将A2结构域共价连接到A3结构域或通过将A1结构域共价连接到A2结构域(WO2006/108590)。
103024A2)将A2结构域共价连接到A3结构域或通过将A1结构域共价连接到A2结构域(WO2006/108590)。
[0009] 增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通过FVIII的聚乙二醇化(WO 2007/126808、WO 2006/053299、WO 2004/075923)或通过VWF的聚乙二醇化(WO 2006/071801)，其中聚乙二醇化的VWF通过增加的半衰期将间接地也增加存在于血浆中FVIII的半衰期。还已经描述了FVIII的融合蛋白(WO 2004/101740、WO2008/077616和WO 2009/156137)。
[0010] VWF(其在不同形式的血管性血友病(VWD)中缺失、功能缺陷或仅以减少量可用)是存在于哺乳动物血浆中的具有多种生理功能的多聚体粘附糖蛋白。在初期止血期间，VWF作为血小板表面上的特异性受体和细胞外基质成分如胶原蛋白之间的介质。此外，VWF作为促凝血因子FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列公开于Collins et al.1987,Proc Natl.Acad.Sci.USA 84:4393–4397中。前体多肽pre-pro-VWF由22个残基的信号肽、741-残基的前肽(pro-peptide)和成熟血浆VWF中发现的2050残基的多肽组成(Fischer et al.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽切割后，在VWF的两个单体之间形成C末端二硫桥。在通过分泌途径的进一步运输期间，添加了13个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链(Canis et al.(2010)Journal of Thrombosis and Haemostasis,8:137-145；Canis et al.(2012)The Biochemical Journal,447:217-228)。更重要的是，VWF二聚体通过N-末端二硫桥多聚化，741个氨基酸长度的前肽在晚期高尔基体中被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。前肽以及VWF的高分子量多聚体(VWF-HMWM)存储在内皮细胞的怀布尔-帕拉德小体内或血小板的α-颗粒中。
[0011] 一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A1结构域内切割VWF。因此，血浆VWF由从500kDa的单个二聚体到由多达20多个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体的全范围的多聚体组成。据此VWF-HMWM具有最强的止血活性，其可以在瑞斯托菌素辅因子活性(VWF：RCo)中测定。VWF：RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。
[0012] VWF中的缺陷是血管性血友病(VWD)的原因，其特征在于具有或多或少明显的出血表型。3型VWD是VWF完全缺失的最严重形式，1型VWD涉及VWF的定量损失，其表型可能非常轻微。2型VWD涉及VWF的定性缺陷，可能与3型VWD一样严重。2型VWD具有许多子形式，其中一些与高分子量多聚体的损失或减少有关。2a型Von VWD的特征在于中间和大型多聚体的损失。2B型VWD的特征在于最高分子量多聚体的损失。
[0013] VWD是人中最常见的遗传性出血性疾病，可以通过用含有血浆或重组来源的VWF的浓缩物的替代疗法来治疗。
[0014] 在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，其保护其免于过早的分解代谢，因此，除了其在初期止血中的作用外，起到调节FVIII血浆水平的关键作用，因此也是控制第二期止血的核心因素。结合VWF的非活化FVIII的半衰期在血浆中约为12至14小时。在3型血管性血友病中，不存在或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约6小时，由于FVIII的浓度降低，导致这种患者的轻度至中度血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用也已经用于帮助在CHO细胞中重组表达FVIII(Kaufman et al.1989,Mol Cell Biol)。
[0015] 存在增加VWF、FVIII或这两个因子的半衰期的产品和方法的需要。
[0016] 发明概述
[0017] 在分开的发明中，已经发现VWF单体强烈结合到钙型凝集素结构域家族10成员A(CLEC10A)(其为存在于巨噬细胞上的受体蛋白)。特别是可以证明，CLEC10A在VWF清清除中起关键作用。在本发明中，还发现存在于VWF上的O-连接的聚糖位点2298与CLEC10A相互作用。因此，本发明提供在位置2298缺乏O-连接糖基化的经修饰的VWF分子，以延长体内VWF分子的半衰期。
[0018] 因此，本发明涉及在项目[1]至[21]中定义的主题：
[0019] [1]能够结合因子VIII的血管性血友病因子(VWF)分子，其包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的C1结构域。优选地，VWF分子不是鼠的。更优选地，VWF分子是人的。
[0020] [2]根据项目[1]的VWF分子，其中存在于天然VWF中位置2298的O-糖基化位点已经通过缺失或置换VWF氨基酸序列的位置2292至2303的一个或多个氨基酸而失活。
[0021] [3]根据项目[2]的VWF分子，其中位置2298的苏氨酸已被缺失或被除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸置换。
[0022] [4]根据项目[3]的VWF分子，其中所述除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0023] [5]根据前述任一项的VWF分子，其包含SEQ ID NO：10或11所示的氨基酸序列。
[0024] [6]根据项目[2]的VWF分子，其中位置2295、2297和2302之一的脯氨酸已被缺失或被不同氨基酸置换。
[0025] [7]根据前述项目中任一项的VWF分子，其具有比天然血浆衍生的VWF降低的体内清除。
[0026] [8]VWF的C1结构域，其包含氨基酸位置2298的O-糖基化位点，连接至半衰期延长部分，优选与人白蛋白融合。
[0027] [9]根据上述项目中任一项的VWF分子，相比于与天然血浆衍生的VWF共同施用的因子VIII的半衰期，所述VWF分子能够增加与所述VWF分子共同施用的因子VIII的半衰期。
[0028] [10]根据上述任一项的VWF分子，其用于治疗凝血疾病。
[0029] [11]根据项目[10]的VWF分子，其中所述凝血疾病是血友病A或血管性血友病。
[0030] [12]根据项目[10]或[11]的VWF分子，其中所述治疗还包括施用因子VIII分子。
[0031] [13]根据项目[12]的VWF分子，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子分别施用。
[0032] [14]药物组合物，其包含项目[1]至[9]中任一项的VWF分子。
[0033] [15]药盒，其包含(i)项目[1]至[9]中任一项的VWF分子和(ii)因子VIII分子。
[0034] [16]根据项目[15]的药盒，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子包含在分开的组合物中。
[0035] [17]药盒，其包含(i)项目[1]至[9]中任一项的VWF分子和(ii)因子VIII分子，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
[0036] [18]项目[1]至[9]中任一项的VWF分子用于增加体内VIII因子的半衰期的用途。
[0037] [19]根据项目[1]至[9]中任一项的VWF分子，其用于延长治疗性治疗中因子VIII的半衰期。
[0038] [20]体内增加半衰期因子VIII的方法，包括向受试者施用有效量的项目[1]至[9]中任一项的VWF分子。
[0040] 图1：成熟VWF单体的结构域结构、功能结合位点和聚糖位置
[0041] VWF单体的蛋白质结构显示称为A、C和D结构域的内部同源区域。VWF与具有一系列生物功能的大量配体相互作用。每个成熟VWF单体包含如图所示分布的13个N-连接(向上箭头)和10个O-连接(向下箭头)糖基化位点。给出参与糖苷键的氨基酸的序列号。对VWF成熟亚单位结构的修订注释改编和修改自Zhou et al.(2012)Blood 120(2):449-458。
[0042] 图2：用可溶性CLEC10A孵育胰蛋白酶消化VWF片段后在洗脱液级分中检测到的主要O-聚糖
[0043] (NeuGc＝N-羟乙酰神经氨酸；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺；Gal＝半乳糖；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)
[0044] 核心2聚糖(A)、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖(B)和用二糖GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2聚糖(C)被鉴定为存在于洗脱液级分中的主要O-聚糖结构。胰蛋白酶消化VWF片段与可溶性CLEC10A孵育后，洗涤和洗脱结合的VWF肽，游离聚糖的MALDI-TOF-MS分析显示，与CLEC10A孵育前的起始物质相比，聚糖结构A(浓缩因子>40)、B(因子9)和C(因子7)的显著富集。三种显示的O-聚糖占所有O-聚糖结构的约80％(与结构B相关的40％，而A和C分别占20％)。
[0045] 详述
[0046] 在第一方面，本发明涉及能够结合因子VIII的经修饰的血管性血友病因子(VWF)分子，其包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的C1结构域。
[0047] VWF
[0048] 本文所用的术语“血管性血友病因子”(VWF)包括天然存在的(天然的)VWF，还包括其变体，例如，片段，融合蛋白或缀合物，或其中一个或多个残基已被插入、缺失或被置换但保留天然存在的VWF的生物学活性的序列变体。如果VWF变体保留至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最优选至少75％的野生型VWF的至少一种生物活性，则生物活性在本发明的意义上得到保留。野生型VWF及其变体的生物活性可由本领域技术人员使用瑞斯托菌素辅因子活性的方法(Federici A B et al.2004.Haematologica 89:77-85)，VWF与血小板中的糖蛋白复合物Ib-V-IX的GP Ibα的结合(Sucker et al.2006.Clin Appl Thromb Hemost.12:305-310)，胶原结合测定(Kallas&Talpsep.2001.Annals of Hematology 80:466-471)，或因子VIII结合测定(Veyradier et al.(2011)Haemophilia,vol.17,pp 944-
951)来测定。
951)来测定。
[0049] 编码人天然VWF的基因被转录成9kb的mRNA，其被翻译成2813个氨基酸的前原多肽(pre-propolypeptide)，估计分子量为310,000Da。前原肽含有22个氨基酸的信号肽、741个氨基酸的前多肽(pro-polypeptide)(SEQ ID NO：2的氨基酸23-763)和成熟亚单位(SEQ ID NO：2的氨基酸764-2813)。来自N末端的741个氨基酸的前多肽切割导致由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前原多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2中。除非另有说明，否则本申请中VWF残基的氨基酸编号参考SEQ ID NO：2，即便VWF分子不包含SEQ ID NO：2的所有残基也是如此。除非另有说明，否则本文所用的术语“VWF”是指VWF的成熟形式。
[0050] 天然VWF的前多肽包含多个结构域。可以在文献中找到不同的结构域注释(参见例如Zhou et al.(2012)Blood 120(2):449-458)。在本申请中应用VWF的天然前多肽的以下结构域注释(参见图1)：
[0051] D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
[0052] 参考SEQ ID NO：2，D'结构域由氨基酸764-865组成；D3结构域由氨基酸866-1242组成；并且C1结构域由氨基酸2255-2328组成。
[0053] “经修饰的”VWF分子具有与成熟人天然VWF(SEQ ID NO：2所示氨基酸的氨基酸764-2813)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
[0054] 本发明的经修饰的VWF分子包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的VWF的C1结构域。包含在本发明的经修饰的VWF分子中的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸2255-22328具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列同一性。
[0055] 在优选的实施方案中，存在于SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328中的一个、两个或三个(但不是更多个)氨基酸在本发明的经修饰的VWF分子中包含的C1结构域中被缺失和/或置换。
[0056] 在第一个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328，除了三个氨基酸，其中所述三个氨基酸中的每一个已被缺失或被在SEQ ID NO：
2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于三个(并且不是更多个)氨基酸。
2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于三个(并且不是更多个)氨基酸。
[0057] 在第二个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328，除了两个氨基酸，其中所述两个氨基酸中的每一个已被缺失或被在SEQ ID NO：
2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于两个(并且不是更多个)氨基酸。
2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于两个(并且不是更多个)氨基酸。
[0058] 在第三个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2333，除了一个氨基酸，其中所述一个氨基酸已被缺失或被在SEQ ID NO：2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于一个(并且不是更多个)氨基酸。
[0059] 优选地，VWF氨基酸序列的位置2298的O-糖基化位点通过缺失位置2298的苏氨酸或用不同的氨基酸、优选用除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸置换而失活。
[0060] 因此，本发明在另一个实施方案中提供了包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的经修饰的VWF分子。在优选的方面，本发明的VWF分子包括：
[0061] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa不存在；
[0062] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是甘氨酸；
[0063] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是丙氨酸；
[0064] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是精氨酸；
[0065] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬酰胺；
[0066] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬氨酸；
[0067] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是半胱氨酸；
[0068] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酸；
[0069] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酰胺；
[0070] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是组氨酸；
[0071] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是异亮氨酸；
[0072] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是亮氨酸；
[0073] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是赖氨酸；
[0074] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是甲硫氨酸；
[0075] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是苯丙氨酸；
[0076] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是脯氨酸；
[0077] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是色氨酸；
[0078] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是酪氨酸；或者
[0079] -SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是缬氨酸。
[0080] 通常，本发明的经修饰的VWF分子还包含D'D3结构域。优选地，经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸764至1242，或与由SEQ ID NO：2的氨基酸764至1242组成的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
[0081] 在另一个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成。在优选的方面，本发明的VWF分子包含或由以下组成：
[0082] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa不存在；
[0083] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是甘氨酸；
[0084] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是丙氨酸；
[0085] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是精氨酸；
[0086] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬酰胺；
[0087] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬氨酸；
[0088] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是半胱氨酸；
[0089] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酸；
[0090] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酰胺；
[0091] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是组氨酸；
[0092] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是异亮氨酸；
[0093] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是亮氨酸；
[0094] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是赖氨酸；
[0095] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是甲硫氨酸；
[0096] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是苯丙氨酸；
[0097] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是脯氨酸；
[0098] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是色氨酸；
[0099] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是酪氨酸；或者
[0100] -SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是缬氨酸。
[0101] 或者，位置2298的O-糖基化位点通过缺失或置换参与由糖基转移酶识别糖基化位点的一个或多个氨基酸而失活。推定的糖基化基序包含VWF的氨基酸2292-2303。在一个实施方案中，位置2295、2297和/或2302的至少一个脯氨酸被缺失或被不同的氨基酸置换。或者，位置2292、2293和/或2303的至少一个苏氨酸缺失或被不同的氨基酸置换。
[0102] 本发明的经修饰的VWF分子能够结合至因子VIII分子，和/或其包含D'结构域和D3结构域(例如SEQ ID NO：3的D'结构域和D3结构域)。优选地，经修饰的VWF分子能够结合人天然因子VIII的成熟形式。在另一个实施方案中，经修饰的VWF分子能够结合由氨基酸序列SEQ ID NO：12组成的单链因子VIII分子。
[0103] 基于先前报道的方法描述(Veyradier et al.(2011)Haemophilia,vol.17,pp 944-951)，VWF与因子VIII的结合可以通过使用市售分布的即用型ELISA试剂盒(Asserachrom VWF：FVIIIB，Diagnostica Stago，Asnieres，France)来测定。样品用测试试剂盒供应商分别定义的即用型稀释缓冲液稀释。存在于待测试样品中的VWF被预先包被在微量滴定板上的兔抗人VWF多克隆抗体捕获。随后，潜在的内源性FVIII与VWF分离并消除。
在加入与捕获的VWF相互作用的重组FVIII后，与过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗人FVIII抗体与附着的FVIII结合，并且在5分钟的反应时间后用1M硫酸停止随后的底物反应在
450nm进行光度测定定量。测试结果通过使用测试试剂盒相关标准进行计算。
在加入与捕获的VWF相互作用的重组FVIII后，与过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗人FVIII抗体与附着的FVIII结合，并且在5分钟的反应时间后用1M硫酸停止随后的底物反应在
450nm进行光度测定定量。测试结果通过使用测试试剂盒相关标准进行计算。
[0104] 或者，例如，如Bendetowicz et al.(1998)Blood,vol 92,No 2:pp529-538所述，可以使用流式细胞计数/平衡结合测定。
[0105] 因子VIII
[0106] 术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中同义使用。“FVIII”包括FVIII的天然等位基因变异，可能存在并发生于从一个个体到另一个个体。使用熟知的生产和纯化方法，FVIII可以是血浆衍生的或重组产生的。糖基化、酪氨酸硫酸化和其他翻译后修饰的程度和位置可以变化，这取决于所选择的宿主细胞及其生长条件。
[0107] 术语FVIII包括FVIII类似物。本文所用的术语“FVIII类似物”是指与FVIII的野生型氨基酸序列(即由UniProt标识P00451定义的序列)相比，其中一个或多个氨基酸已被置换或缺失的FVIII分子(全长或B结构域截短/缺失或单链FVIII)，或对于B结构域截短/缺失的FVIII分子，该氨基酸序列的相应部分。FVIII类似物不是在自然界中发生，而是通过人类操作获得的。根据本发明使用的因子VIII分子也可以是B结构域截短/缺失的FVIII分子，其中剩余的结构域对应于FVIII野生型氨基酸序列的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。其他形式的B结构域缺失的FVIII分子在其a3结构域中另外具有部分缺失，这得到单链FVIII分子。
[0108] 因此，这些FVIII分子是在转化的宿主细胞(优选哺乳动物来源)中产生的重组分子。然而，B结构域缺失的FVIII(即三个A-结构域，两个C结构域以及a1，a2和a3区域)中的剩余结构域可能略有不同，例如与各自野生型氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)有约1％，2％，3％，4％或5％的氨基酸序列的不同。
[0109] 根据本发明使用的FVIII分子可以是双链FVIII分子或单链FVIII分子。包含在本发明组合物中的FVIII分子也可以是FVIII的生物活性片段，即其中除了B结构域之外的一个或多个结构域已被缺失或截短的FVIII，但其中缺失/截短形式的FVIII分子保留其支持血块形成的能力。可以使用本领域熟知的技术在体外评估FVIII活性。根据本发明的用于测定FVIII活性的优选测试是显色底物测定或一步测定(参见下文)。可以在其余的结构域中引入氨基酸修饰(置换，缺失等)，例如以修饰因子VIII与如下的各种其它成分的结合能力：例如，VWF，低密度脂蛋白受体相关蛋白(LPR)，各种受体，其他凝血因子，细胞表面等，或为了引入和/或消除糖基化位点等。不消除FVIII活性的其他突变也可以适用于本发明组合物中使用的FVIII分子/类似物。
[0110] FVIII类似物还包括FVIII分子，其中亲本多肽的一个或多个氨基酸残基已被缺失或被其它氨基酸残基置换，和/或其中另外的氨基酸残基已添加到亲本FVIII多肽中。
[0111] 此外，因子VIII分子/类似物可以在例如截短的B结构域中和/或在分子(“FVIII衍生物”)的一个或多个其他结构域中包括其它修饰。这些其它修饰可以是与因子VIII分子缀合的各种分子的形式，例如，聚合物化合物，肽化合物，脂肪酸衍生化合物等。
[0112] 术语FVIII包括糖基化的FVIII。在本发明的上下文中，术语“糖基化的FVIII”旨在表示其中一个或多个PEG基团已通过多肽的多糖侧链(聚糖)连接到FVIII多肽上的因子VIII分子(包括全长FVIII和B结构域截短/缺失的FVIII)。
[0113] 术语FVIII包括具有保护基或半衰期延长部分的FVIII分子。术语“保护基”/“半衰期延长部分”在本文中被理解为指连接至一个或多个氨基酸位点链功能度(例如-SH，-OH，-COOH，-CONH2，-NH2或一种或多种N-和/或O-聚糖结构)的一个或多个化学基团，并且当与许多治疗性蛋白质/肽缀合时可以增加这些蛋白质/肽的体内循环半衰期。保护基/半衰期延长部分的实例包括：生物相容性脂肪酸及其衍生物，羟烷基淀粉(HAS)，例如。羟基乙基淀粉(HES)，聚(Glyx-Sery)n(高氨基酸聚合物(HAP))，透明质酸(HA)，肝素前体(Heparosan)聚合物(HEP)，磷酰胆碱基聚合物(PC聚合物)， 聚合物(Mersana Therapeutics,MA,USA)，葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，聚乙二醇(PEG)，Fc结构域，转铁蛋白，白蛋白，弹性蛋白样肽， 聚合物(Amunix,CA,USA)，白蛋白结合肽，血管性血友病因子片段(vWF片段)，羧基末端肽(CTP肽，Prolor Biotech,IL)及其任何组合(参见例如McCormick,C.L.,A.B.Lowe,and N.Ayres,Water-Soluble Polymers,于Encyclopedia of Polymer Science and Technology.2002,John Wiley&Sons,Inc.)。衍生化的方式不是关键的，可以从上面内容得到阐明。
[0114] 可以根据本发明使用的FVIII分子包括融合蛋白，其包含与异源氨基酸序列、优选半衰期延长的氨基酸序列融合的FVIII氨基酸序列。优选的融合蛋白是Fc融合蛋白和白蛋白融合蛋白。术语“Fc融合蛋白”在本文中旨在涵盖与可以衍生自任何抗体同种型的Fc结构域融合的FVIII。由于IgG抗体的相对长的循环半衰期，IgG Fc结构域通常是优选的。此外可以修饰Fc结构域以便调节某些效应子功能，例如，补体结合和/或结合某些Fc受体。FVIII与具有结合FcRn受体能力的Fc结构域的融合通常会导致与野生型FVIII的半衰期相比，融合蛋白的循环半衰期延长。因此，用于本发明的FVIII分子也可以是FVIII类似物的衍生物，例如FVIII类似物的融合蛋白，聚乙二醇化或糖基化聚乙二醇化FVIII类似物，或与肝素前体聚合物缀合的FVIII类似物。本文中术语“白蛋白融合蛋白”意在涵盖与白蛋白氨基酸序列或其片段或衍生物融合的FVIII。异源氨基酸序列可以融合到FVIII的N-或C-末端，或者它可以内部插入FVIII氨基酸序列内。异源氨基酸序列可以是WO2008/077616A1中描述的任何“半衰期延长多肽”，其公开内容通过引用并入本文。
[0115] 用于本发明组合物的FVIII分子的实例包括例如在WO 2010/045568、WO 2009/062100、WO 2010/014708、WO 2008/082669、WO 2007/126808、US 2010/0173831、US 2010/
0173830、US 2010/0168391、US 2010/0113365、US 2010/0113364、WO 2003/031464、WO
2009/108806、WO 2010/102886、WO 2010/115866、WO 2011/101242、WO 2011/101284、WO
2011/101277、WO 2011/131510、WO 2012/007324、WO 2011/101267、WO 2013/083858和WO
2004/067566中描述的FVIII分子。
0173830、US 2010/0168391、US 2010/0113365、US 2010/0113364、WO 2003/031464、WO
2009/108806、WO 2010/102886、WO 2010/115866、WO 2011/101242、WO 2011/101284、WO
2011/101277、WO 2011/131510、WO 2012/007324、WO 2011/101267、WO 2013/083858和WO
2004/067566中描述的FVIII分子。
[0116] 可 用于 本 发明 组 合 物中 的 F VI I I 分子 的 实 例包 括的活性成分以及WO 2008/135501、WO 2009/
007451中所述的FVIII分子和WO 2004/067566的称为“dBN(64-53)”的构建体(SEQ ID NO：
12)。
007451中所述的FVIII分子和WO 2004/067566的称为“dBN(64-53)”的构建体(SEQ ID NO：
12)。
[0117] 治疗凝血疾病
[0118] 本发明的经修饰的VWF分子可用于治疗凝血疾病，包括但不限于血友病和血管性血友病。优选地，该疾病是血友病A或血管性血友病。
[0119] 术语“血友病A”是指功能性凝血FVIII缺乏症，其通常是遗传的。
[0120] 术语“血管性血友病”(VWD)是指与VWF的定性或定量缺乏有关的凝血异常症。
[0121] 疾病的治疗包括已经在任何临床阶段或症状时诊断为具有任何形式的疾病的患者的治疗；疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化的延缓；和/或预防和/或降低疾病的严重性。
[0122] 向其施用经修饰的VWF分子的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如猴或人)。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。
[0123] 本文描述了包含本发明的经修饰的VWF分子和任选的一种或多种另外的治疗剂如下述第二治疗剂的组合物。组合物通常作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。
[0124] 本发明的经修饰的VWF分子可以通过各种途径施用于患者，例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、鞘内、外用或局部。任何给定情况下最合适的给药途径将取决于待施用的具体分子、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用本发明的经修饰的VWF分子。
[0125] 在典型的实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子以足以允许以0.5mg/kg至20mg/kg静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，适用于本文所述的组合物和方法的抗体浓度包括但不限于0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、
14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg，或者在任何上述值之间的范围，例如1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或10mg/kg至18mg/kg。
14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg，或者在任何上述值之间的范围，例如1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或10mg/kg至18mg/kg。
[0126] 本发明的经修饰的VWF分子的有效剂量可以为每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用约0.001至约750mg/kg，或达到血清浓度为每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/ml血清浓度或其中根据所治疗的病症、施用途径和受试者的年龄、体重和状况的任何有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以为每千克体重约0.5mg至约50mg或每千克体重约3mg至约30mg。本发明的经修饰的VWF分子可以配制为水溶液。
[0127] 药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本发明的经修饰的VWF分子的单位剂量形式存在。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、750mg、1000mg，或者在任何上述值之间的范围，例如10mg至1000mg、20mg至50mg或30mg至300mg。药学上可接受的载体可以取决于例如待治疗的病症或施用途径的多种形式。
[0128] 用本发明的经修饰的VWF分子确定有效剂量、总剂量数和治疗长度完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。
[0129] 可以通过将具有所需纯度的经修饰的VWF分子与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子洗涤剂、抗氧化剂和其它各种添加剂混合制备适用于本文所述方法的本发明的经修饰的VWF分子的治疗剂型，作为冻干制剂或水溶液储存。参见Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980)。这样的添加剂所用的剂量和浓度必须对接受者无毒。
[0130] 缓冲剂有助于将pH值保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠柠檬酸盐混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡糖酸钠混合物，葡萄糖酸-氢氧化钠混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
[0131] 可以加入防腐剂以延迟微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量加入防腐剂。合适的防腐剂包括苯酚，苄醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苄基卤化铵(例如氯化物、溴化物和碘化物)，六氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；
亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质重量的0.1至10,000重量/份存在。
亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质重量的0.1至10,000重量/份存在。
[0132] 可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，普朗尼克多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚( -20、 -80等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
[0134] 除了本发明的经修饰的VWF分子之外，本文的制剂还可以含有第二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例提供如下。
[0135] 给药方案可以根据许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程度和患者对本发明的经修饰的VWF分子的敏感性)从每月一次到每天发生变化。在具体实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子以下面的方式施用：每天，每周两次，每周三次，每5天，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或在上述值中的任意两个值之间的任何范围，例如从每四个星期到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等。
[0136] 所施用的本发明的经修饰的VWF分子的剂量将根据具体的经修饰的VWF分子、受试者以及疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和所选择的施用途径；可以由本领域技术人员容易地确定合适的剂量。
[0137] 本领域技术人员将认识到，本发明的经修饰的VWF分子的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用形式、途径和部位以及受治疗的特定受试者的年龄和状况确定，以及医生将最终确定要使用的合适的剂量。每当合适时，该剂量可以重复。如果发展出副作用，剂量的量和/或频率可以根据正常的临床实践改变或减少。
[0138] 联合治疗
[0139] 优选地，用本发明的经修饰的VWF分子治疗的患者也用凝血疾病的常规疗法进行治疗。例如，患有血友病的患者通常也用凝血因子VIII(因子VIII)进行治疗。
[0140] 根据本发明使用的组合物中因子VIII的浓度通常在10-10,000IU/mL的范围内。在不同的实施方案中，本发明组合物中FVIII分子的浓度在10-8,000IU/mL、或10-5,000IU/mL、或20-3,000IU/mL、或50-1,500IU/mL的范围内或者是3,000IU/mL、或2,500IU/mL、或2,000IU/mL、或1,500IU/mL、或1,200IU/mL,1,000IU/mL、或800IU/mL、或600IU/mL、或500IU/mL、或400IU/mL、或300IU/mL、或250IU/mL、或200IU/mL、或150IU/mL、或100IU/mL。
[0141] “国际单位”或“IU”是通过FVIII活性测定测量的FVIII的凝血活性(效力)的量度单位，所述FVIII活性测定例如使用针对在“IU”中校准的国际标准制剂的标准校准的一步凝血测定或显色底物FVIII活性测定。一步凝血测定是本领域已知的，例如在N Lee,Martin L,et al.,An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates,Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中描述的。一步测定的原理：测试作为激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)-测定的修改版本进行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血系统因子的激活。加入钙离子会引发凝血级联。测定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。该测定在因子VIII缺乏血浆的存在下进行。缺乏血浆的凝血能力由待测样品中包含的凝血因子VIII恢复。凝血时间的缩短与样品中存在的因子VIII的量成正比。通过与国际单位中具有已知因子VIII活性的标准制剂直接比较来定量凝血因子VIII的活性。
[0142] 另一个标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例如coamatic FVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano,Italy)。显色测定的原理：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa激活成因子Xa。因子VIIIa作为辅因子刺激该反应。FVIIIa由反应混合物中的少量凝血酶从待测样品中的FVIII形成。当使用最佳浓度的Ca2+、磷脂和因子IXa和过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X从显色底物S-2765中释放发色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA的释放与所形成的FXa的量成比例，因此也与样品的因子VIII活性成比例。
[0143] 在一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和因子VIII施用于患有血友病、优选血友病A的患者。
[0144] 在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和能够结合CLEC10A的化合物施用于患有血友病、优选血友病A的患者。
[0145] 在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和因子VIII分子和能够结合CLEC10A的化合物施用于患有VWD或血友病、优选血友病A的患者。
[0146] 在一个具体实施方案中，同时施用本发明的经修饰的VWF分子和第二治疗剂(例如因子VIII和/或能结合CLEC10A的化合物)。在另一个实施方案中，分别施用本发明的经修饰的VWF分子和第二治疗剂(例如因子VIII和/或能结合CLEC10A的化合物)。施用本发明的经修饰的VWF分子和第二治疗剂(例如因子VIII和/或能够结合CLEC10A的化合物)之间的时间没有特别限制。优选本发明的经修饰的VWF分子在能够结合CLEC10A的化合物之前施用。
[0147] CLEC10A
[0148] CLEC10A(也称为巨噬细胞Gal型凝集素)是CLEC家族的人II型跨膜受体蛋白。其他同义词是C型凝集素超家族成员14，巨噬细胞凝集素2和CD301。CLEC10A与肝脏ASGPR蛋白密切相关，但由中等单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达。如本文所用，术语“CLEC10A”是指具有或由在标识Q8IUN9-1、Q8IUN9-2和Q8IUN9-3之一下的UniProt数据库中显示的氨基酸序列组成的人蛋白质。最优选地，CLEC10A包含在标识Q8IUN9-1下的UniProt数据库中显示的氨基酸序列或由其组成。
[0149] 能够结合CLEC10A的化合物
[0150] 能够结合CLEC10A的化合物(以下称为“该化合物”)的类型或类别没有特别限定。然而，优选地，该化合物是肽或多肽，最优选地，该化合物是抗体或其片段。
[0151] 本文所用的术语“抗体”是指与特定抗原结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程化和其他修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)、抗体的单域抗体(纳米抗体)和抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意在包括完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab')2片段)，其能够结合蛋白质。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的Fc片段，从动物或植物的循环中更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl et al,1983,J.Nucl.Med.24:316)。
[0152] 在本发明使用的抗体能够结合CLEC10A的至少一种变体。在其它实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的细胞外结构域，例如结合CLEC10A的氨基酸序列的氨基酸61-316内的表位。优选地，本发明的抗体与CLEC10A的凝集素结合位点结合。
[0153] 还优选抗体特异性结合CLEC10A。在一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合以下所有受体：ASGPR1、CLEC10A、COLEC12、CLEC4F、CLEC4M、SCARA5和MMR。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合ASGPR1(UniProt标识：P07306)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合COLEC12(UniProt标识：Q5KU26)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合CLEC4F(UniProt标识：Q8N1N0)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合CLEC4M(UniProt标识：Q9H2X3)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合SCARA5(UniProt标识：Q6ZMJ2)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合MMR(UniProt标识：P22897)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合以下受体中任何一种：ASGPR1、CLEC10A、COLEC12、CLEC4F、CLEC4M、SCARA5和MMR。
[0154] 在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的至少一种鼠直系同源物。在该实施方案中，抗体可能能够结合MGL1、MGL2或MGL1和MGL2两者。抗体可能能够结合具有或由UniProt标识P49300中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具有或由UniProt标识F8WHB7中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具有或由UniProt标识Q8JZN1中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0155] 在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的大鼠直系同源物。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的兔直系同源物。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的食蟹猴(macaca fascicularis)直系同源物和/或普通猕猴(macaca mulatta)直系同源物。
[0156] 由CLEC10A和抗体形成的复合物的解离常数KD优选小于100nM，更优选小于10nM，最优选小于5nM。通常，KD范围为约10pM至约100nM，或约100pM至约10nM，或约500pM至约5nM。
[0157] 优选地，在本发明中使用的抗体是单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，并且不是产生其的方法。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。(Harlow and Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual"CSH Press 1988,Cold Spring Harbor N.Y.)。
[0158] 在其他实施方案中，包括在人中体内使用抗CLEC10A抗体，可以使用嵌合、灵长类、人源化或人抗体。在优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体，更优选单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。
[0159] 本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制备方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi et al,1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies et al.,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。
[0160] 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他目标结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的对应于非人免疫球蛋白的CDR区域和全部或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的一部分。人源化是制备嵌合抗体的技术，其中人可变结构域的一个或多个氨基酸或部分已经被来自非人物种的相应序列所置换。人源化抗体是在非人物种中产生的结合期望的抗原的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架(FR)区域。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基置换，以改变(优选改善)抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过CDR和框架残基的相互作用的建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置处的异常框架残基。参见例如Riechmann et al.,1988,Nature332:323-7和Queen et al.的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过引用并入本文)。抗体可以使用本领域已知的各种技术进行人源化，包括例如CDR移植(EP239400；PCT公开WO 91/
09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP592106；EP519596；Padlan,1991,MoI.Immunol,28:489-498；Studnicka et al,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska et al,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-
973)和链置换(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所有这些的全部内容通过引用并入本文。
09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP592106；EP519596；Padlan,1991,MoI.Immunol,28:489-498；Studnicka et al,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska et al,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-
973)和链置换(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所有这些的全部内容通过引用并入本文。
[0161] 在一些实施方案中，如Queen et al的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过引用并入本文)中所述制备人源化抗体。
[0162] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是人抗体。完全“人”抗CLEC10A抗体对于人类患者的治疗性治疗可能是期望的。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上文所述噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，其各自的全部内容通过引用并入本文。也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如PCT公开WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；美国专利号5,413,923、5,625,126；5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,
885,793、5,916,771和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。可以使用称为“指导的选择(guided selection)”的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al,1988,Biotechnology 12:899-903)。
885,793、5,916,771和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。可以使用称为“指导的选择(guided selection)”的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al,1988,Biotechnology 12:899-903)。
[0163] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是灵长类化抗体。术语“灵长类化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570、5,681,722和5,693,780，其全部内容通过引用并入本文。
[0164] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是衍生化抗体。例如但不限于，已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接进行了修饰的衍生化抗体(参见下文关于抗体缀合物的讨论)等。许多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
[0165] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体或其片段可以是这样的抗体或抗体片段，其序列已被修饰以相对于相应的野生型序列减少至少一个恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰抗CLEC10A抗体，使得其表现出与Fc受体的结合降低，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在Fc受体(FcR)相互作用所需的特定区域突变(参见例如，Canfield and Morrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lund et al,1991,J.Immunol.147:2657-2662)。抗体的FcR结合能力的降低还可以降低依赖于FcR相互作用的其它效应子功能，例如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。
[0166] 另一方面，抗CLEC10A抗体或其片段可以是已被修饰以增加或降低其与胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的抗体或抗体片段。为了改变对FcRn的结合亲和力，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在FcRn相互作用所必需的特定区域突变(参见例如WO 2005/123780)。增加对FcRn的结合亲和力应该增加抗体的血清半衰期，降低对FcRn的结合亲和力应相反地降低抗体的血清半衰期。在具体实施方案中，抗CLEC10A抗体是IgG类的抗体，其中重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个被用未修饰抗体中存在的氨基酸残基不同的氨基酸残基置换。IgG类抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的抗体。置换可以在单独的位置250、314或428或其任何组合中进行，例如在位置250和428，或在位置250和314，或在位置314和
428，或在位置250、314和428，其中在位置250和428作为优选组合。对于每个位置，置换氨基酸可以是与未修饰抗体的该位置中存在的氨基酸残基不同的任何氨基酸残基。对于位置
250，置换氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置314，置换氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置428，置换氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。WO 2005/123780的表1中鉴定了合适的氨基酸置换的具体组合，该表全部内容通过引用并入本文。另见Hinton et al的美国专利号7,217,797、7,361,740、7,365,168和7,217,798，其全部内容通过引用并入本文。
428，或在位置250、314和428，其中在位置250和428作为优选组合。对于每个位置，置换氨基酸可以是与未修饰抗体的该位置中存在的氨基酸残基不同的任何氨基酸残基。对于位置
250，置换氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置314，置换氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置428，置换氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。WO 2005/123780的表1中鉴定了合适的氨基酸置换的具体组合，该表全部内容通过引用并入本文。另见Hinton et al的美国专利号7,217,797、7,361,740、7,365,168和7,217,798，其全部内容通过引用并入本文。
[0167] 在另一方面，抗CLEC10A抗体具有插入一个或多个其高变区的一个或多个氨基酸，例如US 2007/0280931中所述。
[0168] 抗体缀合物
[0169] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是通过例如任何类型的分子共价连接到抗体而被修饰的抗体缀合物，使得共价连接不干扰与CLEC10A的结合。将效应子部分与抗体缀合的技术在本领域中是熟知的(参见例如Hellstrom等人,Controlled Drag Delivery,2nd Ed.,于pp.623-53(Robinson等人,eds.,1987))；Thorpe et al,1982,Immunol.Rev.62:119-58和Dubowchik等人,1999,Pharmacology and Therapeutics83:67-123)。
[0170] 在一个实例中，抗体或其片段通过共价键(例如，肽键)在任选地N末端或C末端融合到另一种蛋白质(或其部分；优选在蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列。优选地，抗体(或其片段)在抗体恒定结构域的N末端与另一个蛋白质连接。可以使用重组DNA程序来产生这样的融合物(例如如WO 86/01533和EP0392745中所述)。在另一个实例中，效应子分子可以增加体内的半衰期。这种类型的合适的效应子分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物(例如在WO 2005/117984中描述的那些)。
[0171] 在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体可以连接到聚(乙二醇)(PEG)部分上。例如，如果抗体是抗体片段，PEG部分可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基基团)连接。这样的氨基酸可以天然存在于抗体片段中，或者可以使用重组DNA方法工程改造到片段中。参见例如美国专利5,219,996。可以使用多个位点来连接两个或更多个PEG分子。优选地，PEG部分通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。当巯基用作连接点时，可以使用适当活化的效应子部分，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。
[0172] 在另一个实例中，抗CLEC10A抗体缀合物是经修饰的Fab'片段，其是PEG化的，即具有共价连接到其上的PEG(聚(乙二醇))(例如根据EP0948544中公开的方法)。另见Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications,(J.Milton Harris(ed.),Plenum Press,New York,1992)；Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications,(J.Milton Harris and S.Zalipsky,eds.,American Chemical Society,Washington D.C,1997)；和Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences,(M.Aslam and A.Dent,eds.,Grove Publishers,New York,1998)；和Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。
[0173] 可用于阻断CLEC10A受体的另一个实施方案是VWF-C1结构域，其包含位置2298的O-糖基化位点，其连接到半衰期延长部分例如与白蛋白融合，优选通过接头连接。优选的实施方案是具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0174] 试剂盒
[0175] 本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的经修饰的VWF分子和(ii)选自因子VIII、能够结合CLEC10A的化合物(优选抗体)及其组合的多肽。优选地，经修饰的VWF分子和多肽包含在分开的组合物中。
[0176] 本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的经修饰的VWF分子和(ii)选自因子VIII、能够结合CLEC10A的化合物(优选抗体)及其组合的多肽，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
[0177] 本发明的另一方面是如上所定义的修饰的VWF分子用于增加半衰期或降低因子VIII的清除的用途。
[0178] 术语“半衰期”是指从体内循环中消除一半的蛋白质所需的时间。可以测定曲线下面积(AUC)以评估清除效果。清除的减少导致较高的AUC值和半衰期的增加。
[0179] 本发明的另一方面是上文定义的化合物(优选抗体)用于增加因子VIII的半衰期、优选在治疗性治疗中的用途。
[0180] 本发明还涉及在体内增加因子VIII的半衰期或降低因子VIII的清除的方法，包括向受试者施用有效量的如上文所定义的经修饰的VWF分子。
[0181] 本发明的另一方面是治疗凝血疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如上文所定义的经修饰的VWF分子。
[0182] 另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子在血友病A治疗中降低施用FVIII的频率的用途。静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到每周两次。或者，静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到每周一次。
[0183] 另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子在VWD治疗中降低施用VWF的频率的用途。静脉内或皮下施用VWF的频率可以减少到每周两次。或者，静脉内或皮下施用VWF的频率可以减少到每周一次。即，本发明的经修饰的VWF分子每周施用一次或两次。
[0184] 另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子用于降低在血友病A的治疗中待施用的剂量FVIII的用途。
[0185] 另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子用于降低在VWD治疗中待施用的剂量VWF的用途。
[0187]SEQ ID NO: 备注
1 编码人天然VWF前原肽的DNA序列
2 人天然VWF前原肽的氨基酸序列引物
3 引物
4 引物
5 引物
6 引物
7 引物
8 引物
9 通过Gly-Ser接头与人白蛋白融合的人VWF的C1结构域的氨基酸序列
10 具有T2298突变的经修饰的VWF的C1结构域
11 具有T2298突变的经修饰VWF的成熟形式
12 单链因子VIII分子
实施例
1 编码人天然VWF前原肽的DNA序列
2 人天然VWF前原肽的氨基酸序列引物
3 引物
4 引物
5 引物
6 引物
7 引物
8 引物
9 通过Gly-Ser接头与人白蛋白融合的人VWF的C1结构域的氨基酸序列
10 具有T2298突变的经修饰的VWF的C1结构域
11 具有T2298突变的经修饰VWF的成熟形式
12 单链因子VIII分子
实施例
[0188] 实施例1：存在于VWF上的特异性糖基化结构被鉴定为与CLEC10A进行相互作用，以及存在于VWF上O-连接的糖基位点2298
[0189] 为了鉴定CLEC10A在人VWF上的结合位点，VWF的胰蛋白酶消化片段与可溶性CLEC10A一起温育。洗涤后，结合的蛋白质片段分别在pH 11和使用含有100mM GalNAc的溶液洗脱。基于SPR预实验选择洗脱条件，所述SPR预实验指示所有与CLEC10A结合的组分在规定的条件下完全洗脱。随后，对各洗脱液级分进行MS分析。
[0190] 游离的N-和O-聚糖被全甲基化并通过MALDI-TOF-MS分析表征。得到的数据表明，CLEC10A在识别N-和O-聚糖时显著不同。与用作起始物质的VWF片段(聚糖分析观察到18％非唾液酸化O-聚糖的存在)相比，两种洗脱液级分均显示非唾液酸化O-聚糖的强烈富集，而含有一个或多个NeuAc残基的唾液酸化O-聚糖以及不管唾液酸化状态如何的N-聚糖都极度降低。不同的洗脱条件(碱性对GalNAc)导致仅略微不同的聚糖模式。可以在洗脱液级分中鉴定出三种主要的O-糖基化结构，其代表检测到的所有O-聚糖结构的约80％。各自的结构如图2所示。通过MALDI-TOF-MS分析鉴定了核心2聚糖(浓缩因子大于40)、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖(浓缩因子约9)和用二糖GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2聚糖(浓缩因子约为7)的富集。括号中提及的浓缩因子定量描述了与CLEC10A孵育前的起始物质相比，各自聚糖的富集。
[0191] 除了前述的研究之外，在VWF片段去糖基化后，通过纳米液相色谱电喷雾离子化MS/MS进行分析。在两种不同洗脱液级分中的每一种中检测到的肽模式是可比的，因此与所用的洗脱条件无关。结果，洗脱后清楚地鉴定了含有苏氨酸2298的VWF肽。基于获得的分析数据，可以排除其他糖基化VWF片段参与CLEC10A结合。因此，O-连接的聚糖位点T2298最有可能含有未被唾液酸化的聚糖结构，因此与CLEC10A相互作用。此外，存在于VWF上的该糖基化位点被专门鉴定为CLEC10A的主要相互作用配偶体，因此被认为是完全负责受体相互作用。所有其他VWF聚糖位点似乎不参与CLEC10A结合。
[0192] 总之，在从可溶性CLEC10A中洗脱胰蛋白酶消化的VWF片段后，MS分析表明，发现非唾液酸化O-聚糖结合CLEC10A，而唾液酸化O-聚糖以及无论唾液酸化状态如何的N-聚糖不与CLEC10A发生显著相互作用。存在于VWF上的三个主要O-糖基化结构(核心2聚糖、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖和用二糖GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2聚糖)被鉴定为负责相互作用。由于与两种其他结构相比，核心2聚糖检测到非常高的浓缩因子，VWF上存在的该聚糖似乎对CLEC10A具有很强的亲和力。另外，仅含有O-连接的聚糖位点2298的VWF肽被鉴定为与CLEC10A结合，因此含有未被唾液酸化的聚糖结构。最终，这些结果是出乎意料的，并表明聚糖位点T2298完全负责VWF-CLEC10A的相互作用。此外，观察到的糖基化模式似乎只存在于T2298。基于这些结果和CLEC10A介导的VWF清除的观察，可以认为CLEC10A对天然糖基化VWF的清除仅受O-连接的糖基化位点2298的影响。因此，为了防止CLEC10A结合，在操作相应的O-糖基化位点和/或鉴定存在于该聚糖位点的各自的碳水化合物结构之后，可以假设VWF突变体的清除降低。
[0193] 方法
[0194] 1)VWF的还原和羧甲基化
[0195] 在+4℃下，依照前面部分描述的方法纯化的体积30mL的VWF溶液进一步在1升还原缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH8.5)中透析过夜。再次重复该步骤，除了第二次透析在室温下进行4小时。随后，通过在轻轻搅拌(IKA，Staufen，Germany)下加入1M DTT的储备溶液将溶液调节至15mM DTT。通过在+37℃温育60分钟进行VWF的还原。然后通过加入1M储备溶液用40mM碘乙酰胺烷基化VWF，并将溶液在室温下孵育60分钟。
[0196] 2)从人血浆中纯化的单体VWF的酶消化
[0197] 在基于前述方法还原和烷基化后，通过Membra-Cel MD25-14透析管路(Serva，Heidelberg，Germany)在+4℃下将60mL单体VWF(蛋白质浓度为1mg/mL)针对20L的50mM NH4HCO3(pH 7.8)透析过夜。透析步骤重复2次。将固定的胰蛋白酶树脂(Promega，Mannheim，Germany)用50mM NH4HCO3(pH 7.8)洗涤，并加入到蛋白质溶液中，导致浓度为每8mg蛋白质1mL胰蛋白酶树脂。随后，将悬浮液在旋转混合器(Glaswarenfabrik Karl Hecht，Sondheim，Germany)上于+37℃孵育24小时。反应后，通过离心(Multifuge 3SR，Heraeus，Osterode，Germany)以2,000×g在+20℃离心15分钟来分离固定的胰蛋白酶。在另外的过滤步骤(孔径为0.45μm，Sterivex-HV，Millipore，Cork，Ireland)后，将反应混合物转移到Centricon Plus-70装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)并在室温下以3,000xg离心15分钟(Multifuge 3SR，Heraeus，Osterode，Germany)。通过SDS-PAGE证明了成功的切割反应(数据未显示)。通过施加显色底物证实胰蛋白酶的消耗(数据未显示)。将胰蛋白酶消化片段(约0.5mg/mL的蛋白质浓度)在SpeedVac真空浓缩器系统(Thermo Scientific，Langenselbold，Germany)中浓缩至终浓度约40mg/mL。最终，通过MS分析研究浓缩的VWF片段的肽谱，并与在第一离心步骤之前获得的中间体级分比较，从而提供两个样品具有相同组成的VWF片段的证据。
[0198] 3)与CLEC10A相互作用的胰蛋白酶消化VWF片段的鉴定
[0199] 为了鉴定VWF中存在的哪个聚糖链与CLEC10A相互作用，胰蛋白酶消化VWF片段与可溶性CLEC10A(R&D Systems，Wiesbaden，Germany)一起孵育。将1mg冻干的受体蛋白溶于2mL含有10mM HEPES、150mM NaCl和5mM CaCl2(pH 7.4)的反应缓冲液中。通过加入20倍浓缩的缓冲液储备溶液将蛋白质含量为0.5mg/mL的胰蛋白酶消化后20mL浓缩的VWF片段调节至相同的缓冲液条件，然后与含有受体蛋白的溶液混合。在+37℃，在轻轻混合下进行孵育过夜(Glaswarenfabrik Karl Hecht，Sondheim，Germany)。然后，以3,000×g(Multifuge
3SR，Heraeus，Osterode，Germany)离心(Amicon Ultra-15离心过滤器单元，NMWL 10kDa，Merck Millipore，Darmstadt，Germany)分离未结合的VWF片段并弃去。在室温下进行离心，直至达到0.5mL的剩余体积。然后将含有与VWF片段相互作用的受体蛋白的浓缩反应混合物用反应缓冲液洗涤并再次浓缩。在重复该浓缩溶液的洗涤步骤2次后，将反应混合物分成两等份，然后用两种不同的洗脱缓冲液处理。一方面，在pH 11(100mM甘氨酸/NaOH缓冲液，pH
11.0)下洗脱结合的蛋白质片段，另一方面，通过使用含有GalNAc(100mM GalNAc，pH 4.3)的溶液洗脱结合的蛋白质片段。将相应的洗脱缓冲液加入洗涤和浓缩的溶液中，并在轻轻混合下在室温下孵育过夜。通过离心分离后，收集含有洗脱的VWF片段的所得滤液并通过MS分析。
3SR，Heraeus，Osterode，Germany)离心(Amicon Ultra-15离心过滤器单元，NMWL 10kDa，Merck Millipore，Darmstadt，Germany)分离未结合的VWF片段并弃去。在室温下进行离心，直至达到0.5mL的剩余体积。然后将含有与VWF片段相互作用的受体蛋白的浓缩反应混合物用反应缓冲液洗涤并再次浓缩。在重复该浓缩溶液的洗涤步骤2次后，将反应混合物分成两等份，然后用两种不同的洗脱缓冲液处理。一方面，在pH 11(100mM甘氨酸/NaOH缓冲液，pH
11.0)下洗脱结合的蛋白质片段，另一方面，通过使用含有GalNAc(100mM GalNAc，pH 4.3)的溶液洗脱结合的蛋白质片段。将相应的洗脱缓冲液加入洗涤和浓缩的溶液中，并在轻轻混合下在室温下孵育过夜。通过离心分离后，收集含有洗脱的VWF片段的所得滤液并通过MS分析。
[0200] 4)胰蛋白酶消化VWF片段与清除受体相互作用的分析
[0201] 分离的胰蛋白酶片段通过PNGase F处理和β-消除进行去糖基化，然后通过应用纳米液相色谱电喷雾离子化MS/MS进行分析。此外，游离的N-和O-聚糖被全甲基化并通过MALDI-TOF-MS分析表征。基于发表的方法(Canis et al.(2010)Journal of Thrombosis and Haemostasis,8:137-145；Canis et al.(2012)The Biochemical Journal,447:217-228)进行分析。
[0202] 实施例2：生成VWF突变体T2298的表达载体
[0203] 先前已经产生了在其多克隆位点中含有全长VWF cDNA序列的表达质粒。该载体中包含的VWF cDNA序列显示为SEQ ID NO：1，其对应的蛋白质序列为SEQ ID NO：2。
[0204] 为了产生这样的表达载体，在本领域技术人员已知的标准条件下，使用引物组VWF+和VWF-(SEQ ID NO.3和4)，通过聚合酶链反应(PCR)从含有VWF cDNA的质粒(商业上可获得，例如来自ATCC，No.67122的pMT2-VWF)扩增VWF cDNA(并且如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel FM et al.(eds.)John Wiley&Sons,Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/中所述)。将得到的PCR片段用限制性内切核酸酶EcoRI消化，并连接到已经通过EcoRI线性化的表达载体pIRESneo3(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)中。得到的插入片段正确取向的表达质粒含有CMV启动子下游的VWF的野生型cDNA。
[0205] 为了将突变引入VWF序列中，定点诱变(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit，Stratagene，La Jolla，CA，USA)按照试剂盒制造商的建议，按照以下操作方案应用于上述质粒。每个诱变反应5μl的10×反应缓冲液、1μl质粒DNA(50ng)、各自1μl(10pmol/μl)的两种诱变寡核苷酸We4781和We4782(SEQ ID NO.5和6)、1μl的dNTP Mix、3μl的Quick-溶液，1μl的Turbo聚合酶(2,.5U/μl)和37μl的H2O混合并进行聚合酶链式反应，初始变性在95℃下进行2分钟，18个循环a)在95℃下变性50秒，b)在60℃退火50秒，c)在68℃下延伸17分钟，然后在68℃下进行7分钟的单末端延伸阶段。随后加入1μl来自该试剂盒的DpnI酶，反应物在37℃下再孵育60分钟。然后将3μl的诱变反应物转化到大肠杆菌中。分离克隆，提取质粒DNA，并通过DNA测序验证VWF序列中的突变。
[0206] 使用上述操作方案和质粒，并且通过应用本领域技术人员已知的分子生物学技术(并且如例如在Current Protocols in Molecular Biology，同上中所述)，可由本领域技术人员制备其他构建体用于突变其它氨基酸残基。
[0207] 实施例3：生成含有T2298残基的白蛋白融合的VWF片段的表达载体
[0208] 为了产生含有氨基酸残基2276至2326的VWF片段与人白蛋白融合的表达载体，包含N-末端信号肽和C-末端28氨基酸甘氨酸/丝氨酸接头的VWF片段的编码序列是通过基因合成(Eurofins MWG Synthesis，Ebersberg，Germany)制备的，其中在5'端具有NheI限制性位点和在3'端具有BamH1位点。将该片段从由NheI和BamH1消化提供的克隆载体中切下，纯化并克隆到NheI/BamH1消化的表达载体pIRESneo3(同上)中。
[0209] 白蛋白编码序列通过PCR扩增。对于该PCR扩增，1μl的含有野生型白蛋白cDNA的质粒DNA(50ng)、5μl的10×反应缓冲液、各自1μl(10pmol/μl)的两个PCR引物HA+和HA-(SEQ ID NO：7和8)、1μl的dNTP Mix、1μl的Turbo聚合酶(2,5U/μl)和40μl的H2O混合，并进行聚合酶链式反应，初始变性在95℃下进行2分钟，25个循环：a)在95℃下变性20秒，b)在61℃退火20秒，c)在68℃下延伸7分钟，然后在68℃下进行7分钟的单末端延伸阶段。将该片段纯化，用BamH1和NotI消化，并连接到含有VWF片段的上述载体的BamH1和NotI位点。将连接混合物转化大肠杆菌。分离克隆，提取质粒DNA，并通过DNA测序验证序列。表达构建体的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9中。
[0210] 实施例4：质粒转染和VWF突变体在CHO细胞中的表达
[0211] 将表达质粒在大肠杆菌TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中生长并使用标准操作方案(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用表达质粒转染CHO K1细胞。分离单克隆，并在无血清培养基(CD-CHO，Life Technologies)中在750μg/ml的Geniticin存在下生长。将克隆通过T培养瓶传到摇瓶和生物反应器中，从其中收获上清液以纯化相应的重组VWF蛋白。
[0212] 实施例5：VWF抗原的定量
[0213] 培养上清液中的VWF抗原通过ELISA测定，其性能是本领域技术人员已知的。简言之，将微孔板与100μL每孔的以1:2000稀释于缓冲液A(Sigma C3041，Sigma-Aldrich，Munich，Germany)中捕获抗体(兔抗人vWF-IgG，Dako A0082[Dako，Hamburg，Germany])在环境温度下过夜。用缓冲液B(Sigma P3563)洗涤板三次后，将各孔与200μL缓冲液C(Sigma P3688)在环境温度下一起温育1.5小时(封闭)。在用缓冲液B进行另外三个洗涤步骤之后，将测试样品在缓冲液B中的连续稀释液以及标准人血浆(ORKL21；20-0.2mU/mL；Siemens Healthcare Diagnostics，Marburg，Germany)在缓冲液B中的连续稀释液(每孔体积：100μL)在环境温度下孵育1.5小时。在用缓冲液B进行三个洗涤步骤之后，向每个孔中加入100μL在缓冲液B中1:16000稀释的检测抗体(兔抗人vWF-IgG，Dako P0226，过氧化物酶标记的)，并在环境温度下孵育1小时。在用缓冲液B进行三个洗涤步骤后，每孔加入100μL底物溶液(OUVF，Siemens Healthcare Diagnostics)，并在黑暗中在环境温度下孵育30分钟。加入100μL未稀释的终止稀释液(OSFA，Siemens Healthcare Diagnostics)制备样品，以在合适的酶标仪上在450nm波长进行读数。然后用标准人血浆作为参考的标准曲线，计算测试样品的浓度。
[0214] 实施例6：VWF T2298Q突变体的药代动力学分析
[0215] 实施例4的VWF-T2298Q和重组VWF(野生型)分别静脉内施用于总共4只CD大鼠的每一只。剂量为100U(VWF:Ag)/kg体重，注射体积为4mL/kg。
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