SDF-1结合核酸及其用途
阅读：506发布：2020-06-26
专利汇可以提供SDF-1结合核酸及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及结合SDF-1的核酸分子，其中所述核酸分子影响细胞迁移。，下面是SDF-1结合核酸及其用途专利的具体信息内容。
1.结合SDF-1的核酸分子，其中所述核酸分子影响细胞迁移。
2.权利要求1的核酸，其中所述细胞表达SDF-受体，其中所述SDF-1受体是优选选自CXCR4和CXCR7的受体。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中细胞迁移包括祖细胞、干细胞、癌细胞、长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞迁移到受试者外周血中，其中所述B细胞和/或T细胞优选为记忆B细胞和/或记忆T细胞。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述祖细胞和/或干细胞包括CD34+祖细胞。
5.权利要求3和4的核酸分子，其中所述祖细胞和/或干细胞的移动发生在造血组织中。
6.权利要求5的核酸分子，其中所述造血组织是骨髓组织和淋巴组织中的至少一种，其中所述骨髓组织优选位于骨髓内，且所述淋巴组织优选位于消化道、呼吸道、淋巴结、脾、胸腺和/或发炎组织的淋巴样滤泡的粘膜内。
7.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子抑制白细胞迁移。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述白细胞是T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞和/或肥大细胞。
9.权利要求7和8的核酸分子，其中所述白细胞迁移后，所述白细胞在组织中蓄积，其中所述白细胞蓄积优选导致所述组织发炎。
10.权利要求9的核酸分子，其中所述组织包括皮肤、粘膜、器官，所述器官选自但不限于：眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、骨和/或淋巴系统，优选皮肤和/或气道粘膜。
11.权利要求1～10的核酸分子，其中所述核酸分子选自：A型核酸分子、B型核酸分子、C型核酸分子和具有SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144中任意所示的核酸序列的核酸分子。
12.权利要求11的核酸分子，其中所述A型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
5’AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：19)，
其中XA无或为A。
13.权利要求12的核酸分子，其中所述A型核酸分子含选自下列的核心核苷酸序列：
●5’AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：20)，
●5’AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：21)，和
●5’AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：22)，
所述核心核苷酸序列优选含5’
AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ ID NO：22)。
14.权利要求12和13中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
15.权利要求12和13中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
16.权利要求14和15的核酸分子，其中所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
17.权利要求14～16中任一项的核酸分子，其中所述双链结构由4～6个碱基对，优选5个碱基对构成。
18.权利要求14～17中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1X2NNBV 3’(SEQ IDNO：44)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BNBNX3X4 3’(SEQ IDNO：45)，
其中，
●X1无或为R，X2为S，X3为S，且X4无或为Y；或
●X1无，X2无或为S，X3无或为S，且X4无。
19.权利要求14～18中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RSHRYR 3’(SEQ IDNO：23)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YRYDSY 3’(SEQ IDNO：24)，
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCUGUG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCAGC 3’。
20.权利要求14～18中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X2BBBS 3’(SEQ IDNO：42)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’SBBVX33’(SEQ IDNO：43)，
其中X2无或为S，且X3无或为S；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGUG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCAG 3’；
或
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCGC 3’。
21.权利要求12～20中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO：5～
18、25～41、133、137、139～141中任一所示的核酸序列。
22.权利要求11的核酸分子，其中所述B型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
5’GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG3’(SEQ ID NO：57)。
23.权利要求22的核酸分子，其中所述B型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG(SEQID NO：58)。
24.权利要求22和23中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
25.权利要求22和23中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
26.权利要求24和25中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
27.权利要求22～26中任一项的核酸分子，其中所述双链结构由4～6个碱基对，优选5个碱基对构成。
28.权利要求24～27中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1X2SVNS 3’(SEQ IDNO：77)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BVBSX3X43’(SEQ IDNO：78)，
其中，
●X1无或为A，X2为G，X3为C，且X4无或为U；或
●X1无，X2无或为G，X3无或为C，且X4无。
29.权利要求24～28中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1GCRWG 3’(SEQID NO：59)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’KRYSCX4 3’(SEQ IDNO：60)，
其中X1无或为A，且X4无或为U。
30.权利要求24～29中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1GCGUG 3’(SEQ IDNO：75)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGCX43’(SEQ IDNO：76)，
其中X1无或为A，且X4无或为U；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’AGCGUG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGCU 3’。
31.权利要求24～28中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X2SSBS 3’(SEQ IDNO：73)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BVSSX3 3’(SEQ IDNO：74)，
其中X2无或为G，且X3无或为C；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGC 3’。
32.权利要求22～31中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO：46～
56、61～72、和132中任一所示的核酸序列。
33.权利要求11的核酸分子，其中所述C型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG(SEQ ID NO：90)，
其中XA无或为A。
34.权利要求33的核酸分子，其中所述C型核酸分子含选自下列的核心核苷酸序列：
●5’GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’(SEQ ID NO：91)，
●5’GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’(SEQ ID NO：92)，和
●5’GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’(SEQ ID NO：93)，
所述核心核苷酸序列优选含5’GGUUAGGGCUHGAAGUCGG3’(SEQ ID NO：93)。
35.权利要求33和34中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
36.权利要求33和34中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
37.权利要求35和36的核酸分子，其中所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段的至少一部分和所述第二核苷酸片段的至少一部分任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
38.权利要求35～37中任一项的核酸分子，其中所述第一片段的长度和所述第二片段的长度各自分别为0～17个核苷酸，优选为4～10个核苷酸，且更优选为4～6个核苷酸。
39.权利要求37和38中任一项的核酸分子，其中所述双链结构含4～10个碱基对，优选为4～6个碱基对，更优选为5个碱基对。
40.权利要求39的核酸分子，其中所述双链结构含4～10个连续碱基对，优选为4～
6个连续碱基对，更优选为5个连续碱基对。
41.权利要求35～40中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RKSBUSNVGR 3’(SEQ ID NO：120)，且●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YYNRCASSMY 3’(SEQ ID NO：121)；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RKSBUGSVGR 3’(SEQ ID NO：122)，且●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YCNRCASSMY 3’(SEQ ID NO：123)。
42.权利要求35～40中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’XsSSSV 3’(SEQ IDNO：124)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BSSSXs 3’(SEQ IDNO：125)，
其中Xs无或为S。
43.权利要求35～40和42中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’SSSSR 3’(SEQ IDNO：130)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YSBSS 3’(SEQ IDNO：131)；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’SGGSR 3’(SEQ IDNO：126)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YSCCS 3’(SEQ IDNO：127)。
44.权利要求35～40、42和43中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCSGG 3’(SEQ IDNO：128)，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CCKGC 3’(SEQ IDNO：129)；
优选地，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCCGG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CCGGC 3’。
45.权利要求35～40中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUCACG 3’。
46.权利要求35～40中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’UGAGAUAGG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUCA 3’。
47.权利要求35～40中任一项的核酸分子，其中，
●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GAGAUAGG 3’，且
●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUC 3’。
48.权利要求33～47中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO：79～
89、94～119、和134～136中任一所示的核酸序列。
49.权利要求11的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO：142～144中任一所示的核酸序列。
50.权利要求1～49中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是针对SDF-1的拮抗剂。
51.权利要求1～49中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是SDF-1受体系统的拮抗剂，其中所述SDF-1受体系统的所述SDF-1受体优选为选自CXCR4和CXCR7的受体。
52.权利要求1～51中任一项的核酸分子，其中，
●所述SDF-1是人SDF-1，且/或
●所述SDF-1受体系统的所述SDF-1受体是人SDF-1受体。
53.权利要求1～52中任一项的核酸分子，其中SDF-1含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
54.权利要求1～53中任一项的核酸，其中所述核酸含修饰。
55.权利要求54的核酸，其中所述修饰选自HES部分和PEG部分。
56.权利要求55的核酸，其中所述修饰是由直链或分支的PEG构成的PEG部分，其中所述PEG部分的分子量优选为约2～180kD，更优选为约60～140kD，且最优选为约40kD。
57.权利要求55的核酸，其中所述修饰HES部分，其中所述HES部分的分子量优选为约
10～130kD，更优选为约30～130kD，且最优选为约100kD。
58.权利要求1～57中任一项的核酸，其中所述核酸的核苷酸是L-核苷酸，优选为SEQ ID NO：19、20、21、22、57、58、90、91、92和93所示序列的核苷酸。
59.药物组合物，含：权利要求1～58中任一项的核酸及任选至少一种附加成分，其中所述附加成分选自药学可接受的赋形剂和药学活性剂。
60.权利要求1～58中任一项的核酸用于制备药物的用途。
61.权利要求60的用途，其中所述药物，
●用于使祖细胞和/或干细胞移动到外周血中，和/或
●用于治疗优选选自下列的疾病和/或病症：
■伤口愈合；
■烧伤；
■由损伤的器官组织和/或损伤的血管所致，或与损伤的器官组织和/或损伤的血管关联的病症，其中该病症选自：视网膜和脉络膜损伤、中风、心肌损伤、心肌梗塞、器官移植后缺血和跌打损伤；和
■造血病症，其中该病症选自：再生障碍性贫血、白血病、药物引起的贫血和白细胞减少、和白细胞减少中的细菌感染。
62.权利要求60的用途，其中所述药物使癌细胞移动到受试者外周血中。
63.权利要求62的用途，其中所述癌细胞选自：白血病细胞、淋巴瘤细胞、癌干细胞、具有转移潜力和发生癌转移的癌细胞。
64.权利要求62和63中任一项的用途，其中所述药物与第二药学活性剂联用，其中所述第二药学活性剂适于使癌细胞移动到受试者外周血中，其中所述第二药学活性剂优选选自癌细胞移动剂。
65.权利要求62～64中任一项的用途，其中所述药物与第三药学活性剂联用，其中所述第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记外周血中的癌细胞，其中所述标记导致身体防卫活化。
66.权利要求62～65中任一项的用途，其中所述受试者随后或同时经历化学治疗和/或放射性治疗。
67.权利要求65～66中任一项的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防癌，所述癌优选为实体瘤和血液癌，更优选为白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
68.权利要求60的用途，其中所述药物使长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到受试者外周血中，其中所述B细胞和/或T细胞优选为记忆B细胞和/或记忆T细胞。
69.权利要求68的用途，其中所述药物与第二药学活性剂联用，其中所述第二药学活性剂用于使长寿浆细胞、B细胞和/或记忆T细胞移动到受试者外周血中，其中所述第二药学活性剂优选选自细胞移动剂。
70.权利要求68和69中任一项的用途，其中所述药物与第三药学活性剂联用，且所述第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记外周血中的长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞，其中所述标记导致身体防卫活化。
71.权利要求68～70中任一项的用途，其中所述受试者随后或同时经历化学治疗和/或放射性治疗。
72.权利要求68～71中任一项的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防：
●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；
●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病；
●移植器官的移植排斥，其中该器官选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管、胰腺；和/或
●骨髓移植后的移植物抗宿主病。
73.权利要求60的用途，其中所述药物用于抑制白细胞迁移。
74.权利要求73的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗移植器官的移植排斥，所述器官例如：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管和胰腺。
75.权利要求73的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防下列中发生或与下列关联的炎症：
●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；和/或
●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病。
76.权利要求73的用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防皮肤和/或气道粘膜的过敏反应，优选为花粉症、哮喘、气道高反应性和/或皮炎。
77.权利要求76的用途，其中所述皮炎是接触性皮炎和/或特应性皮炎。
78.从第一受试者获得祖细胞和/或干细胞的方法，所述方法包括：
(c)给受试者施用对于使所述祖细胞和/或干细胞移动到所述受试者外周血来说有效的量的权利要求1～58中任一项的核酸；
(d)随后从所述受试者中收获所述祖细胞和/或干细胞。
79.权利要求78的方法，其中所述祖细胞和/或干细胞的收获通过成分输血、白细胞去除术、细胞分选和/或流式细胞术进行。
80.权利要求78或79中任一项的方法，其中所述第一受试者或第二受试者随后或同时经历化学治疗和/或放射性治疗。
81.权利要求80的方法，其中在所述第一受试者或第二受试者的化学治疗和/或放射性治疗后，将收获的所述第一受试者或第二受试者的祖细胞和/或干细胞施用到所述第一受试者或第二受试者外周血中。
82.权利要求78～81中任一项的方法，其中所述收获的祖细胞和/或干细胞经扩增，且将扩增的祖细胞和/或干细胞施用给第一受试者或第二受试者，其中优选通过静脉内或局部注射施用所述扩增的祖细胞和/或干细胞。
83.权利要求78～82中任一项的方法，其中所述方法用于治疗癌，所述癌优选为实体瘤和血液恶性肿瘤。
84.权利要求1～58中任一项的核酸分子，用于权利要求78～83中任一项的方法。
85.从受试者除去长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的方法，所述方法包括：
(c)给受试者施用对于使所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到所述受试者外周血来说有效的量的权利要求1～58中任一项的核酸；
(d)随后从所述受试者中收获所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞，
其中所述除去和收获的T细胞优选为记忆T细胞。
86.权利要求85的方法，其中所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的收获通过成分输血、细胞分选和/或流式细胞术进行，优选通过使用适于所述细胞的表面标记物的流式细胞术进行。
87.权利要求78～83和85～86中任一项的方法，其中所述方法用于治疗和/或预防：
●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；
●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病；
●移植器官的移植排斥，其中该器官选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管、胰腺；和/或
●骨髓移植后的移植物抗宿主病。
88.权利要求1～58中任一项的核酸分子，用于权利要求85～87中任一项的方法。
89.权利要求11～58中定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防肾病，优选为糖尿病性肾病。
90.权利要求11～58中定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防高血压，优选为肺性高血压。
91.权利要求11～58中定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防纤维化，优选为特发性肺纤维化。
92.权利要求91的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防伤口愈合过程中的纤维化。
93.权利要求11～58中定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗涉及血管生成和/或新生血管形成的疾病和/或病症。
94.权利要求93的用途，其中所述药物用于与抑制VEGF的制剂联合治疗。
95.权利要求94的用途，其中所述药物用于弱应答于使用抑制VEGF的制剂的治疗的受试者。
96.权利要求93的用途，其中所述药物用于不应答于使用抑制VEGF的制剂的治疗的受试者。
97.权利要求93的核酸用途，其中所述疾病和/或病症涉及脉络膜新生血管形成，和/或与脉络膜新生血管形成关联。
98.权利要求93～97中任一项的用途，其中所述疾病和/或病症选自视网膜疾病，优选老年性黄斑退化症、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、黄斑水肿或视网膜水肿。
99.权利要求93～96中任一项的用途，其中所述疾病选自癌，优选实体瘤和转移。
100.权利要求60的用途，其中所述药物待施用给受试者，所述受试者经历治疗计划或待经历治疗计划，所述治疗计划除去所述受试者的祖细胞和/或干细胞，优选除去所述受试者外周血中的祖细胞和/或干细胞。
101.权利要求60或100中任一项的用途，其中所述药物待施用给受试者，所述受试者经历化学治疗和/或放射性治疗或者待经历化学治疗和/或放射性治疗。
102.权利要求60的用途，其中所述药物用于恢复或改善受试者的免疫系统。
103.用于制备药物的抑制SDF-1和SDF-1受体之间的信号转导的分子，其中所述药物用于治疗和/或预防肾病，优选为糖尿病性肾病。
104.权利要求103的分子，其中所述分子是SDF-1结合分子或SDF-1受体结合分子，且包括：靶-结合核酸，如适体和镜体，抗体和小分子。
105.权利要求103～104中任一项的SDF-1结合分子，其中所述分子是权利要求11～
58中任一项定义的核酸分子。
106.权利要求103的分子，其中所述分子是抑制SDF-1或SDF-1受体表达的分子，且包括：转录因子的siRNA分子、核酶、反义分子和抑制剂。
107.权利要求6～58中任一项的核酸分子，用于抑制白细胞迁移的方法。
108.不穿过血脑屏障的SDF-1结合分子，
●用于使源自干细胞的骨髓移动，或
●用于制备药物，优选为用于使源自干细胞的骨髓移动的药物。
109.权利要求108的SDF-1结合分子，其中所述药物
●用于改善中枢神经系统损伤，和/或
●用于促进中风后的组织修复，所述中风优选为缺血性中风。
110.权利要求109的SDF-1结合分子，其中所述SDF-1结合分子包括选自下列的靶-结合核酸：适体、镜体、抗体和小分子。
111.权利要求108～110中任一项的SDF-1结合分子，其中所述分子是权利要求10～
58中任一项定义的核酸分子。
112.权利要求1～58中任一项的核酸分子，用于治疗以上权利要求中任一项定义的疾病。
113.权利要求11～58定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防WHIM综合征。
114.权利要求11～58定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防癌生长和转移，和瘤生长。
115.权利要求11～58定义的核酸用于制备药物的用途，其中所述药物在化学治疗前施用给受试者，所述化学治疗优选为用于治疗癌而施用的化学治疗。
SDF-1结合核酸及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 趋化因子
[0003] 趋化因子是一个8～14kDa的、结构相关的、结合肝素的碱性小蛋白质家族。按照功能可将其分为促炎的、内环境稳定的或双重功能的趋化因子(Moser，Wolf et al.2004)。炎性趋化因子受病原体、细胞因子或生长因子诱导，并将效应白细胞募集到感染、炎症、组织损伤和肿瘤部位。所述趋化因子调控白血球细胞(白细胞)的募集、活化和增生(Schall and Bacon 1994；Springer 1995；Baggiolini 1998)。趋化因子选择性地诱导嗜中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞的趋化性。除趋化效应之外，其还可在应答细胞中选择性发挥其它作用，如改变细胞形状，瞬时升高胞内游离钙离子浓度，去粒，上调整联蛋白，形成生物活性脂(例如白三烯、前列腺素、血栓烷等)，或呼吸爆发(通过释放活性氧而破坏致病微生物或肿瘤细胞)。因此，趋化因子通过引起更多的促炎介质的释放及白细胞向感染或炎症灶的趋化和外渗来引发炎性应答的逐步升级。另一方面，内环境稳定趋化因子(Homeostaticchemokine)主要在骨髓和淋巴样组织组织中表达，参与血细胞生成、免疫监督和适应性免疫应答(Godessart 2005)。
[0004] 趋化因子的分类
[0005] 根据四个保守半胱氨酸残基中前两个的排列方式将趋化因子分成四类：CC或β-趋化因子(例如其中所述半胱氨酸串联)，CXC或α-趋化因子(其中所述半胱氨酸被一个额外的氨基酸残基隔开)，XC或γ趋化因子(只具有一个二硫桥)(是迄今为止淋巴细胞趋化因子/XCL1的唯一代表)及CX3C-趋化因子(以在所述半胱氨酸间有3个氨基酸残基为特征)(仅一个成员，膜结合的CXXXC趋化因子(fractalkin))(Bazan，Bacon et al.1997)。常见的趋化因子具有两个名字，一个因其功能署名，另一个是系统名。
[0006] CXC趋化因子
[0007] CXC趋化因子(尤其是在其氨基末端带有氨基酸序列ELR的CXC趋化因子)主要作用于嗜中性粒细胞。对嗜中性粒细胞具有活性的CXC趋化因子的实例是IL-8/CXCL8、GROα/CXCL1、GROβ/CXCL2和 GROγ/CXCL3、NAP-2/CXCL7、ENA-78/CXCL5、SDF-1/CXCL12和GCP-2/CXCL6。CXC趋化因子作用于多种白细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞及T和B淋巴细胞(Oppenheim，Zachariae et al.1991；Miller and Krangel 1992；Baggiolini，Dewald et al.1994；Jose，Griffiths-Johnson et al.1994；Ponath，Qin et al.1996)。所述趋化因子的实例是I-309/CCL1、MCP-1/CCL2、MCP-2/CCL8、MCP-3/CCL7、MCP-4/CCL13、MIP-1α/CCL3和MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5和嗜酸细胞活化趋化因子/CCL11。
[0008] CXC趋化因子受体
[0009] 趋化因子通过属于七跨膜G蛋白偶联受体(GPCRs；(Murphy，Baggiolini et al.2000)超家族的受体起作用。一般而言，趋化因子和趋化因子受体的相互作用是趋于混杂的，因为一个趋化因子可结合多种趋化因子受体，而反过来，单个趋化因子受体也可与几种不同的趋化因子相互作用。一些已知的CXC趋化因子受体包括CXCR1(结合GROα、GCP-2和IL-8)、CXCR2(结合包括GROα、GROβ、GROγ、ENA-78和IL-8在内的趋化因子)、CXCR3(结合包括PF4、MIG、IP-10和I-TAC在内的趋化因子)、CXCR4(迄今为止发现的唯一响应SDF-1而产生信号的CXC趋化因子受体)和CXCR5(已发现响应BCA-1而产生信号)(Godessart 2005)。除了CXCR4以外还鉴定出一种新的SDF-1受体，被称为RDC1/CXCR7(Balabanian，Laganeet al.2005，Burns，Summers et al.2006)。
[0010] SDF-1
[0011] SDF-1(基质细胞衍生因子-1；缩写：SDF-1；别名为CXCL12；PBSF[前B细胞生长刺激因子]；TPAR-1[TPA抑制基因1]；SCYB12；TLSF[胸腺淋巴细胞刺激因子]；hIRH[肝细胞瘤中减少的人内泌素(intercrine)])是不含IL-8样趋化因子特有的ELR基序(Salcedo，Wasserman等人1999；Salcedo和Oppenheim 2003)的、结合并激活G蛋白偶联受体CXCR4的血管生长CXC趋化因子。三个研究小组各自独立地发现了所述趋化因子，通过克隆带有N末端信号序列的cDNA(Tashiro，Tada等人1993)得到所述趋化因子，或通过基质细胞系PA6表达后刺激早期祖B细胞的能力得到所述趋化因子(Nagasawa，Kikutani等人1994)，或从cDNA文库(用蛋白质激酶C激活物四十二烷酰巴豆醇乙酸酯(TPA)处理小鼠胚胎成纤维细胞所构建的cDNA文库)中分离得到所述趋化因子(Jiang，Zhou等人1994)。作为可变剪接的结果，存在两种形式的SDF-1，SDF-1α(68个氨基酸)和SDF-1β，和SDF-1α不同，SDF-1β在C末端带有5个额外的残基(Shirozu，Nakano等人1995)。尚不完全清楚这两种剪接变体的生物学意义。
[0012] SDF-1的序列
[0013] 来自不同物种的SDF-1之间的序列保守性是显著的：人SDF-1α(SEQ ID NO：1)和小鼠SDF-1α(SEQ ID NO：2)事实上是相同的。仅存在第18位氨基酸由V到I的单个保守改变(Shirozu，Nakanoet al.1995)。
[0014] SDF-1的NMR结构
[0015] 已有SDF-1[8-68]的NMR结构模型(PDB access，1SDF)。发现SDF-1是具有无序N末端区域的单体。与其他趋化因子的差异主要见于疏水核心的包裹和表面电荷分布(Crump，Gong et al.1997)。
[0016] SDF-1的生理活性
[0017] SDF-1的生理活性：因为SDF-1受体CXCR4在白细胞、成熟内皮细胞、内皮细胞、脑细胞和巨核细胞中广泛表达，所以SDF-1的活性是多效的。所述趋化因子相比迄今已鉴定的任何其他趋化因子，尤其在免疫系统外，表现出最广泛的生物学功能。SDF-1的最重要的功能效应是：
[0018] 将上皮细胞复位(homing)并附着于视网膜的脉络膜部分的新生血管位点已显示SDF-1在眼组织的新生血管形成过程中参与将上皮细胞复位到脉络膜。对所述细胞的确切作用尚处于研究阶段，但有假说认为上皮细胞参与迷行血管形成(Sengupta，Caballero et al.2005)。
[0019] 干细胞
[0020] 需要SDF-1来维持干细胞和祖细胞，例如，成人骨髓中的造血祖细胞(通常是CD34+)。可将AMD3100(一种选择性CXCR4拮抗剂)用于造血干细胞移植中的CD34+细胞动员。CD34+细胞在体外和体内沿着由基质细胞产生的SDF-1梯度迁移(Aiuti，Webb et al.1997)。
[0021] B细胞发育和趋化
[0022] SDF-1支持前B细胞增生，且促进骨髓祖B细胞生长(Nagasawa，Kikutani et al.1994)；其在不作为成熟B细胞的有效趋化剂的情况下诱导前B细胞和祖B细胞(pro-B cell)的特定迁移，(D′Apuzzo，Rolink et al.1997；Bleul，Schultze et al.1998)。推测SDF-1在将B细胞定位于次生淋巴组织的过程中发挥重要作用。
[0023] T细胞趋化
[0024] SDF-1是最有效的T细胞趋化剂之一；CXCR4存在于多种T细胞亚群上(Bleul，Farzan et al.1996)。
[0025] 胚胎发育
[0026] SDF-1及其受体CXCR4在胚胎发育过程中必不可少。敲除SDF-1和CXCR4基因的小鼠将死于围产期；除发生B细胞和骨髓组细胞数减少外，还表现出心脏室间隔缺损或异常小脑发育(Nagasawa，Hirotaet al.1996；Ma，Jones et al.1998；Zou，Kottmann et al.1998)。胚胎发生期间的血液发育的正常个体发生过程中也需要SDF-1(Juarezand Bendall 2004)。
[0027] HIV感染
[0028] SDF-1能抑制T细胞嗜性HIV-1进入具有CXCR4的细胞系，且SDF-1的表达可在辅助AIDS发病中发挥重要作用，因为人SDF-1基因的多态性影响AIDS的发病(Bleul，Farzan et al.1996)。
[0029] 其它疾病
[0030] SDF-1或其受体CXCR4的表达水平变化或对所述分子的应答变化与许多人类疾病相关，所述人类疾病例如视网膜病(Brooks，Caballero et al.2004；Butler，Guthrie et al.2005；Meleth，Agron et al.2005)；乳腺癌(Muller，Homey et al.2001；Cabioglu，Sahin et al.2005)、卵巢癌(Scotton，Wilson et al.2002)、胰腺癌(Koshiba，Hosotani et al.2000)、甲状腺癌(Hwang，Chung et al.2003)、鼻咽癌(Wang，Wu et al.2005)；神经胶质瘤(Zhou，Larsen et al.2002)；成神经细胞瘤(Geminder，Sagi-Assif et al.2001)；B细胞慢性淋巴细胞白血病(Burger，Tsukada et al.2000)；WHIM综合征(疣、低丙种球蛋白血症、感染、先天性骨髓粒细胞缺乏症)(Gulino，Morattoet al.2004；Balabanian，Lagane et al.2005；Kawai，Choi et al.2005)；免疫缺陷综合征(Arya，Ginsberg et al.1999；Marechal，Arenzana-Seisdedos et al.1999；Soriano，Martinez et al.2002)；
病理性新生血管形成(Salvucci，Yao et al.2002；Yamaguchi，Kusano et al.2003；
Grunewald，Avraham et al.2006)；炎症(Murdoch 2000；Fedyk，Jones et al.2001；Wang，Guan et al.2001)；多发性硬化症(Krumbholz，Theil et al.2006)；类风湿性关节炎/骨关节炎(Buckley，Amft et al.2000；Kanbe，Takagishi et al.2002；Grassi，Cristino et al.2004)。
病理性新生血管形成(Salvucci，Yao et al.2002；Yamaguchi，Kusano et al.2003；
Grunewald，Avraham et al.2006)；炎症(Murdoch 2000；Fedyk，Jones et al.2001；Wang，Guan et al.2001)；多发性硬化症(Krumbholz，Theil et al.2006)；类风湿性关节炎/骨关节炎(Buckley，Amft et al.2000；Kanbe，Takagishi et al.2002；Grassi，Cristino et al.2004)。
[0031] 对SDF-1及其受体的拮抗作用
[0032] 已在实验动物中证明，SDF-1或其受体的拮抗剂可有效阻断不同来源的人癌细胞的生长和/或转移扩散，所述不同来源的人癌细胞例如来源于胰腺(Guleng，Tateishi et al.2005；Saur，Seidler et al.2005)、结肠(Zeelenberg，Ruuls-Van Stalle et al.2003；Guleng，Tateishi et al.2005)、乳腺(Muller，Homey et al.2001；Lapteva，Yang et al.2005)、肺(Phillips，Burdick et al.2003)、成胶质细胞瘤/成髓细胞瘤(Rubin，Kung et al.2003)、前列腺(Sun，Schneider et al.2005)、骨肉瘤(Perissinotto，Cavalloni et al.2005)、黑素瘤(Takenaga，Tamamuraet al.2004)、胃(Yasumoto，Koizumi et al.2006)、多发性骨髓瘤(Menu，Asosingh et al.2006)的人癌细胞。此外，抗SDF-1疗法在动物模型中的视网膜新生血管形成(Butler，Guthrie et al.2005，Mames，Mattheus et al.2006)、肾炎(Balabanian，Couderc et al.2003)和关节炎(Matthys，Hatse et al.2001；Tamamura，Fujisawa et al.2004；DeKlerck，Geboes et al.2005)的预防中发挥有益作用。而且，已将选择性CXCR4拮抗剂AMD3100用于造血干细胞移植中的CD34+细胞动员。CD34+细胞在体外和体内沿着由基质细胞产生的SDF-1梯度迁移(Aiuti，Webb et al.1997)。
[0033] SDF-1和眼疾
[0034] SDF-1参与眼后部疾病(back-of-the-eye disease)的病理过程，例如糖尿病性视网膜病(缩写：DR)(Fong，Aiello et al.2004)和老年黄斑变性(AMD)(Ambati，Anand et al.2003)。这两种疾病均损伤眼睛，并导致视力逐渐衰退至失明。所述损伤由眼后部的不当血管生长(此过程被称为脉络膜新生血管形成(CNV))所致。在CNV过程中，源于脉络膜的新血管通过布鲁赫膜(Bruch membrane)中的断裂处迁移进入视网膜下色素上皮(sub-RPE)或视网膜下间隙。所述异常血管可在视网膜下出血(视网膜内出血)或渗漏液体。这可留下伤疤，并可使斑增多，从而扭曲视觉。
[0035] 糖尿病性视网膜病是糖尿病的主要后遗症，经常在患有1型和2型糖尿病的患者中发病。美国有约1千6百万糖尿病患者，其中的近8百万患有一些形式的糖尿病性视网膜病。如果不治疗增生型糖尿病性视网膜病(PDR)，则约60％的患者会在5年内单眼或双眼失明。随着糖尿病在北美、欧洲和许多新兴国家令人担忧地日益普遍，患者群体也快速增长。例如，糖尿病患者中失明的发生率比普通人群高25倍。此外，糖尿病性视网膜病(DR)是中年受试者中最常见的失明病因，每年占美国所有新病例的至少12％。可通过配制筛选程序来监测糖尿病患者的视力，从而可及时提供如可获得的治疗。
[0036] 对糖尿病性视网膜病的直接原因尚知之甚少，但该病被人由下列多个成因的组合所致：视网膜血流自调节受损；视网膜细胞内山梨醇蓄积和细胞外液中高级糖基化终产物蓄积。所有这些因素直接或间接与高血糖症、血流中的糖丰度相关。
[0037] DR症状与AMD症状相似。患者损失视网膜细胞，在视网膜基底膜中发生微动脉瘤(血流)。此外，VEGF、IGF-1及其他血液因子(可能包括SDF-1)吸引新血管细胞，并促进损坏血管的形成。
[0038] 老年黄斑变性
[0039] 老年黄斑变性(AMD)破坏人的中央视觉。疾病的早期症状不明显，因为症状随患者而异。有时患者仅单眼受到影响。或双眼视力均减退，但不显著。疾病导致色觉失真或出错。在视野中央常有黑斑。
[0040] 对所述疾病的病因(意指发病过程)尚知之甚少。通常认为AMD是视网膜最外层的老化。在视网膜中央发生生理变化(也被称为斑)其为最敏锐视觉所依赖的视网膜部分。
[0041] 湿性AMD始于所述疾病的干性形式的后遗症。约90％的患者患干性AMD，其导致斑组织变薄和色素沉积紊乱。其余患有所述湿性形式，发生脉络膜新生血管化，并且常发生黄斑水肿和视网膜或视网膜下出血。所有这些都会导致视敏度快速衰退。
[0042] 湿性AMD是55岁以上的人失明的最常见原因，据估计，在美国大约4％～5％的65～74岁人群和近10％的75岁或更老人群患有湿性AMD。仅在美国就已有5百万患有所述疾病的80岁以上的人，并且预计到2020年还将有新增5百万患者。
[0043] 肿瘤
[0044] 肿瘤(包括实体瘤和血液瘤和恶性肿瘤)不仅仅是癌细胞聚集块：肿瘤被免疫细胞浸润是癌症的特征。许多人类癌症具有影响所述浸润的程度和表型及肿瘤生长、存活和迁移及血管发生的复杂的趋化因子网络。大多数实体瘤含许多非恶性基质细胞。事实上，有时基质细胞比癌细胞多。癌症中发现的占优势的基质细胞是巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞。
[0045] 肿瘤中的SDF-1
[0046] 来自不同癌症类型的恶性细胞具有不同的趋化因子受体表达谱，但所述SDF-1受体CXCR4最常见于小鼠和人：来自至少23个不同类型的人上皮、间充质细胞和造血来源的癌症的肿瘤细胞表达CXCR4(Balkwill 2004)。SDF-1是CXCR4的唯一已知配体。SDF-1除在骨髓和次生淋巴组织中组成型表达外，其还可见于淋巴瘤的原发性肿瘤(Corcione，Ottonello et al.2000)及神经元和星形细胞系的脑肿瘤中。此外，其以高水平存在于卵巢(Scotton，Wilson et al.2002)和胰腺癌(Koshiba，Hosotani et al.2000)中及存在于乳腺癌(Muller，Homey et al.2001)和甲状腺癌(Hwang，Chung et al.2003)、成神经细胞瘤和血液学恶性肿瘤(Geminder，Sagi-Assif et al.2001)的转移灶中。相反，CXCR4在正常乳腺(Muller，Homey et al.2001)、卵巢(Scotton，Wilson et al.2002)和前列腺上皮(Sun，Schneider et al.2005)中的表达水平很低或无。
[0047] 除了CXCR4以外，还鉴定出新的SDF-1受体：RDC1/CXCR7(Balabanian，Lagane et al.2005，Burns，Summers et al.2006)。前列腺癌细胞系的体外和体内实验表明，除了和生存优势相关以外，CXCR7/RDC1表达变化还和粘附和侵袭活性增强相关。此外，还观察到CXCR7/RDC1水平受CXCR4(Wang et al，2008)调控。体外和体内实验表明，在一些肿瘤中SDF-1的两个受体CXCR4和CXCR7能增加肿瘤生长、转移的潜力和对(化学诱导的)凋亡的抗性，所述肿瘤例如乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、神经细胞瘤、肺癌、结肠癌和前列腺癌(Burns et al，2006；Li et al，2008；Scotton et al，2002；Yang et al，2008；Zagzag et al，2008)。
[0048] 因此，CXCR4和CXCR7的表达似乎是一些肿瘤的共有特征。
[0049] 抑制趋化因子-受体信号转导作为癌症治疗的一种选择。如下证据表明，抑制肿瘤细胞上的趋化因子-受体信号转导在体内具有诱导生长停滞或凋亡及预防侵入和转移的潜能：
[0050] 通过siRNA产生的CXCR4基因抑制中止了乳腺肿瘤的生长(Lapteva，Yang et al.2005)；给小鼠静脉注射用阻止CXCR4表面表达的构建体转染的T杂交瘤细胞，可使其不再迁移至远处的器官(Zeelenberg，Ruuls-Van Stalle et al.2001)；在使用结肠直肠癌细胞的相似实验中，大大减少了肺和肝转移(Zeelenberg，Ruuls-Van Stalleet al.2003)；抗CXCR4抗体抑制乳腺癌异种移植物扩散到淋巴节(Muller，Homey et al.2001)；使用抗CXCR4或抗SDF-1抗体处理淋巴样干细胞延迟了(NOD)/SCID小鼠中的肿瘤生长(Bertolini，Dell′Agnola et al.2002)；抗SDF-1抗体抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞器官转移的发生(Phillips，Burdick et al.2003)；CXCR4拮抗剂AMD3100(AnorMED)的全身施用在24小时内抑制了颅内成胶质细胞瘤和成髓细胞瘤异种移植物的生长，并增加了肿瘤细胞凋亡(Rubin，Kung et al.2003)；抗SDF-1抗体抑制了与癌相关成纤维细胞混合的MCF-7乳腺癌细胞的生长(Orimo，Gupta et al.2005)；使用抗体中和CXCR4阻断了前列腺癌转移和骨灶生长(growth in osseous sites)(Sun，Schneider et al.2005)；通过施用肽CXCR4拮抗剂T134阻止了在注射骨肉瘤细胞后肺转移的发生(Perissinotto，Cavalloni et al.2005)。
[0051] 不同文献作者均提出，靶向SDF-1/CXCR4轴可给癌症患者提供新的治疗选择：
[0052] 人卵巢肿瘤强烈表达SDF-1，并以较低水平表达VEGF。两种蛋白受肿瘤中的低氧触发。病理浓度的其中任一蛋白质均不足以单独诱导体内血管发生，但如果组合在一起，病理浓度的SDF-1和VEGF可有效且协同诱导新生血管形成。因此，阻断所述协同轴，而非仅针对VEGF，可为治疗癌症的有效的抗血管生成新策略(Kryczek，Lange etal.2005)；
[0053] 当具有自分泌SDF-1/CXCR4信号转导通路时，乳腺癌细胞系便表现出攻击行为。这包括伴随加快生长的侵袭和迁移。因此，可从所述SDF-1/CXCR4轴获取预测所述攻击性的重要信息，也可将其用作治疗人乳腺癌的重要靶标(Kang，Watkins et al.2005)；
[0054] 表达高水平的CXCR4的小细胞肺癌(SCLC)细胞的迁移和转移受SDF-1调控。CXCR4的激活促进对肿瘤微环境中的辅助细胞(例如基质细胞)和胞外基质分子的附着。
这些粘着相互作用导致SCLC细胞对化学疗法的抗性增加。这样，所述SDF-1/CXCR4轴的抑制剂可增加SCLC细胞的化学敏感性，并给SCLC患者和其它肿瘤患者提供了新的治疗途径(Hartmann，Burger et al.2004)。
这些粘着相互作用导致SCLC细胞对化学疗法的抗性增加。这样，所述SDF-1/CXCR4轴的抑制剂可增加SCLC细胞的化学敏感性，并给SCLC患者和其它肿瘤患者提供了新的治疗途径(Hartmann，Burger et al.2004)。
[0055] 趋化因子-受体信号转导和干细胞运输
[0056] 所述SDF-1/CXCR4轴已被认为是在体内运输不同类型干细胞的关键调节通路。因为大多数(若非所有)恶性肿瘤源于干细胞/祖细胞区域，癌干细胞也在其表面表达CXCR4，从而所述SDF-1/CXCR4轴参与将它们指导运输/转移至表达SDF-1的器官(例如淋巴结、肺、肝、骨)。因此，针对调控SDF-1/CXCR4轴的策略可在将正常干细胞递送至组织的再生药物中和抑制癌干细胞的转移的临床肿瘤学中具有重要的临床应用(Kucia，Reca et al.2005)。
[0057] 干细胞动员
[0058] 白细胞(也被称为白血细胞)包括中性白细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞/肥大细胞、B细胞和T细胞。通过集落刺激因子(CSFs)和多种细胞因子对造血组织中的干细胞和祖细胞的作用，白细胞通过造血系统得到了持续替换。这些因子中得到最广泛认知的是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，已被批准用于通过刺激产生白细胞和祖细胞(外周血干细胞动员)来中和化疗的副作用。一些细胞表面抗原已被用作干细胞和祖细胞群的标志物。随着新的、特异性更好的标志物的发现，这些标志物随时会被更新。目前，造血干细胞被表征为CD34+、c-kit+、Sca-1+、CD45+、lin-和CD38-(CD 38也是一种谱系标志物，-因此冗余为lin)。骨髓还是其它一些非造血干细胞类型的宿主，这些干细胞可以发展为其它细胞和组织类型：间质干细胞的特征是CD34+、Sca-1+、lin-、BMPR+和/或STRO-1+，来自于骨髓的组织定向干细胞：目前其定义为CXCR4+、CD34+、CD45-。来自于骨髓的组织定向干细胞亚群为(Majka et al.2005)：
[0059] 骨骼干细胞：Myf5+，MyoD+
[0060] 心脏干细胞：NKx2.5+，GATA4+
[0061] 肝干细胞：CK19+，α-fetoprotein+
[0062] 神经干细胞：nestin+，GATA4+
[0063] 已经报道其它一些因子在受试人体和动物中能够增加白细胞和祖细胞。这些试剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素8(IL-8)、PIXY-321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)、巨噬细胞炎性蛋白质(MIP)，GROβ(CXCL2)和GROβT(CXCL2Δ4)、干细胞因子、血小板生成素和生长相关癌基因，可以作为单一试剂或联合用药(Broxmeyer，Benninger et al.1995；Glaspy，Davis et al.1996；Rosenfeld，Bolwell etal.1996；Glaspy，Shpall et al.1997；Vadhan-Raj，Murray et al.1997；Broxmeyer，Orazi et al.1998；Dale，Liles et al.1998；Pruijt，Willemzeet al.1999；King，Horowitz et al.2001)。
[0064] 虽然内源生长因子具有药理作用，但是使用蛋白质和肽作为药物的明显缺点，强调了向所述生长因子中加入更多的、到目前为止是有效的试剂的重要性，即，分别增加白细胞的祖细胞和干细胞，优选增加其在受试者外周血中的水平。因此，本申请的一个问题就是提供工具和方法，分别增加白细胞祖细胞和干细胞，更具体地，增加其中受试者外周血中的水平。本申请的进一步问题是提供工具和方法，来治疗低水平的白细胞祖细胞和干细胞各自引起的或相关的疾病。
[0065] 也可以动员干细胞，来直接快速修复受动员患者体内的受损组织，或者动员并从白细胞抗原(HLA)配伍的供体中收集干细胞，随后通过静脉内对患者给药或直接对受影响组织给药。后一种方法也适用于从患者自身动员得到的干细胞。在干细胞给药之前，它们在体外可能发生增生和/或分化。
[0066] 过敏性气道疾病和接触性变态反应
[0067] 已经发现了SDF-1充当成熟肥大细胞及其前体的趋化性剂的角色，尤其是当成熟肥大细胞释放出组胺的时候，例如，通过结合到成熟肥大细胞表面上的Fc-epsilon受体，通过IgE信号传导(Godot，Arock et al.2007)。在过敏性气道疾病小鼠模型中，抗体介导的CXCR4(如上述在白细胞上表达)中和能够降低气道的高应答性。该抗体还使嗜酸性细胞增多降低了一半，尤其是在支气管肺泡灌洗液和间质中，表明CXCR4介导的信号促进肺炎症。在肺过敏性炎症和气道高反应性中，SDF-1α中和也得到相似的缓解效果(Gonzalo，Lloydet al.2000)。还有证据表明，SDF-1促进血管发生。Hoshin等人在哮喘中通过支气管活检对血管发生和SDF-1表达进行分析，对此进行了明白的说明。在这些活组织检查切片中进行的免疫组织化学分析表明，和对照受试者相比，哮喘受试者具有高度多血管以及更多的SDF-1阳性细胞(Hoshino，Aoike et al.2003)。
[0068] 此外，临床和实验证据表明，皮肤浸润白细胞在特应性皮炎的发生和维持中扮演关键角色，并且发现SDF-1是T淋巴细胞和树突细胞募集的一种重要因子，尤其是兰格汉斯(Langerhans)型树突细胞(Gombert，Dieu-Nosjean et al.2005)。
[0069] 银屑病
[0070] 银屑病是一种具有潜在的自身免疫成分的炎性皮肤疾病。银屑病的特征是受影响皮肤具有强白细胞浸润，T细胞扮演主要角色。Zhou等人发现在银屑病皮肤病灶中SDF-1mRNA表达提高(Zhou，Kruegeret al.2003)。
[0071] 关节炎
[0072] 在文献中有证据表明SDF-1-CXCL4-轴参与了关节炎。Matthys等人发现，在IFN-gamma受体缺损小鼠中，一种有效的、特异性的CXCR4拮抗剂AMD3100能够抑制自身免疫关节炎(Matthys，Hatseet al.2001)。通过滑膜活检和RT-PCR，在脊椎关节病、风湿性关节炎、银屑病关节炎和变性关节病(骨关节炎)患者中也都发现了SDF-1的表达。但是，在所有病例中都未发现过表达(Gu，Marker-Hermannet al.2002)。使用RT-PCR也发现了CXCR4的相似结果。
[0073] 风湿性关节炎.
[0074] 最近，在风湿性关节炎患者的滑液中发现SDF-1水平高于骨关节炎患者(Kim，Cho et al.2007)。上述作者还发现，在细胞培养物中，成纤维细胞样滑膜细胞和T细胞共培养时，其SDF-1上调。在培养基中加入IL-17(一种T细胞细胞因子)后也发现该效果。
[0075] 对关节生检切片的免疫组织化学分析发现，SDF-1在银屑病关节炎患者的关节滑膜中表达。在用infliximab对所有9名患者进行治疗后获得快速并且明显的临床改善。相对于其它生长因子，上述临床效果还伴随滑液SDF-1水平的下降(治疗8周后生检)(Gu，Marker-Hermann et al.2002)。
[0076] 有现象表明，白细胞浸润是变态反应性疾病、变态反应和自身免疫疾病中的炎症所特有的，到目前为止这些疾病还没有有效的疗法。需要能够影响上述疾病进程、并较好地影响白血病浸润的更多药物。因此，本发明所涉及的进一步的一个问题是提供工具和方法来抑制或减少白血病浸润到组织中。本发明所涉及的进一步的一个问题是提供工具和方法来治疗白血病浸润到组织中所引起的或相关的疾病，或所述白血病浸润到组织中的水平升高所引起的或相关的疾病。
[0077] SDF-1及其受体的信号传导影响体内的细胞迁移，主要是从一种组织到另一种组织、从组织到外周血和/或从外周血到组织的迁移，导致数种疾病和病变。特异性地干扰(优选抑制)SDF-1和SDF-1受体或和多种受体之间的相互作用可以引起数种疾病和病变的缓解。如上所述，本发明所涉及的更进一步的、更广泛的问题是提供工具和方法来影响体内细胞的迁移，优选从一种组织到另一种组织、从组织到外周血和/或从外周血到组织的迁移，所述迁移导致数种疾病或和数种疾病相关。至此，本发明所涉及的进一步的一个问题是提供由于体内细胞迁移所引起的或相关的工具和方法，优选从一种组织到另一种组织、从组织到外周血和/或从外周血到组织的迁移，导致数种疾病和病变。
[0079] 更具体的，在第一方面，本发明通过结合SDF-1的核酸分子解决了本发明所涉及问题，其中所述核酸分子影响细胞的迁移。
[0080] 在第一方面的第1实施方式中，所述细胞表达SDF受体，其中所述SDF-1受体是优选选自CXCR4和CXCR7的受体。
[0081] 在第一方面的第2实施方式中(同时也是第一方面的第1实施方式的一实施方式)，所述细胞迁移包括祖细胞、干细胞、癌细胞、长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞迁移到受试者外周血中，其中所述B细胞和/或T细胞优选为记忆B细胞和/或记忆T细胞。
[0082] 在第一方面的第3实施方式中(同时也是第一方面的第二实施方式的一实施方式)，所述祖细胞和/或干细胞包括CD34+祖细胞。
[0083] 在第一方面的第4实施方式中(同时也是第一方面的第二和第三实施方式的一实施方式)，所述祖细胞和/或干细胞的移动发生在造血组织中。
[0084] 在第一方面的第5实施方式中(同时也是第一方面的第四实施方式的一实施方式)，所述造血组织是骨髓组织和淋巴组织中的至少一种，其中所述骨髓组织优选位于骨髓内，且所述淋巴组织优选位于消化道、呼吸道、淋巴结、脾、胸腺和/或发炎组织的淋巴样滤泡的粘膜内。
[0085] 在第一方面的第6实施方式中，所述核酸分子抑制白血病的迁移。
[0086] 在第一方面的第7实施方式中(同时也是第一方面的第六实施方式的一实施方式)，所述白细胞是T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞和/或肥大细胞。
[0087] 在第一方面的第8实施方式中(同时也是第一方面的第六个和第七实施方式的一实施方式)，所述白细胞迁移后，所述白细胞在组织中蓄积，其中所述白细胞蓄积优选导致所述组织发炎。
[0088] 在第一方面的第9实施方式中(同时也是第一方面的第八实施方式的一实施方式)，所述组织包括皮肤、粘膜、器官，所述器官选自但不限于：眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、骨和/或淋巴系统，优选皮肤和/或气道粘膜。
[0089] 在第一方面的第10实施方式中(同时也是第一方面和第一方面的第一到第九实施方式中的任意一个的实施方式)，所述核酸分子选自：A型核酸分子、B型核酸分子、C型核酸分子和具有SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144中任意所示的核酸序列的核酸分子。
[0090] 在第一方面的第十一实施方式中(同时也是第一方面的第十实施方式的一实施方式)，所述A型核酸分子含如下核心核苷酸序列：
[0091] 5’AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：19)
[0092] 其中XA无或为A。
[0093] 在第一方面的第12实施方式中(同时也是第一方面的第十一实施方式的一实施方式)，所述A型核酸分子含选自下列的核心核苷酸序列：
[0094] ●5’AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：20)，
[0095] ●5’AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：21)，和
[0096] ●5’AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ IDNO：22)，
[0097] 所述核心核苷酸序列优选含5’AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ ID NO：22)。
[0098] 在第一方面的第13实施方式中(同时也是第一方面的第十一和第十二实施方式的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0099] 在第一方面的第14实施方式中(同时也是第一方面的第十一和第十二实施方式的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0100] 在第一方面的第15实施方式中(同时也是第一方面的第十三和第十四实施方式的一实施方式)，所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
[0101] 在第一方面的第16实施方式中(同时也是第一方面的第十三到第十五实施方式中任意一个的一实施方式)，所述双链结构由4～6个碱基对，优选5个碱基对构成。
[0102] 在第一方面的第17实施方式中(同时也是第一方面的第十三到第十六实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0103] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1X2NNBV 3’(SEQ IDNO：44)，且[0104] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BNBNX3X43’(SEQ IDNO：45)，[0105] 其中，
[0106] ●X1无或为R，X2为S，X3为S，且X4无或为Y；或
[0107] ●X1无，X2无或为S，X3无或为S，且X4无。
[0108] 在第一方面的第18实施方式中(同时也是第一方面的第十三到第十七实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0109] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RSHRYR 3’(SEQ IDNO：23)，且[0110] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YRYDSY 3’(SEQ IDNO：24)，[0111] 优选地，
[0112] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCUGUG 3’且
[0113] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCAGC 3’。
[0114] 在第一方面的第19实施方式中(同时也是第一方面的第十三到第十七实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0115] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X2BBBS 3’(SEQ IDNO：42)，且[0116] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’SBBVX33’(SEQ IDNO：43)，
[0117] 其中X2无或为S，且X3无或为S；
[0118] 优选地，
[0119] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGUG 3’，且
[0120] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCAG 3’；
[0121] 或
[0122] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且
[0123] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CGCGC 3’。
[0124] 在第一方面的第20实施方式中(同时也是第一方面的第十一到第十九实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子具有SEQ IDNO：5～18、25～41、133、137、139～141中任一所示的核酸序列。
[0125] 在第一方面的第21实施方式中(同时也是第一方面的第十实施方式的一实施方式)，所述B型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
[0126] 5’GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG3’(SEQ ID NO：57)。
[0127] 在第一方面的第22实施方式中(同时也是第一方面的第二十一实施方式的一实施方式)，所述B型核酸分子含核心核苷酸序列：GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG(SEQ IDNO：58)。
[0128] 在第一方面的第23实施方式中(同时也是第一方面的第二十一到第二十二实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0129] 在第一方面的第24实施方式中(同时也是第一方面的第二十一到第二十二实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0130] 在第一方面的第25实施方式中(同时也是第一方面的第二十三到第二十四实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
[0131] 在第一方面的第26实施方式中(同时也是第一方面的第二十一到第二十五实施方式中任意一个的一实施方式)，所述双链结构由4～6个碱基对，优选5个碱基对构成。
[0132] 在第一方面的第27实施方式中(同时也是第一方面的第二十三到第二十六实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0133] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1X2SVNS 3’(SEQ IDNO：77)，且[0134] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BVBSX3X43’(SEQ IDNO：78)，[0135] 其中，
[0136] ●X1无或为A，X2为G，X3为C，且X4无或为U；或
[0137] ●X1无，X2无或为G，X3无或为C，且X4无。
[0138] 在第一方面的第28实施方式中(同时也是第一方面的第二十三到第二十七实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0139] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1GCRWG 3’(SEQID NO：59)，且[0140] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’KRYSCX43’(SEQ IDNO：60)，[0141] 其中X1无或为A，且X4无或为U。
[0142] 在第一方面的第29实施方式中(同时也是第一方面的第二十三到第二十七实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0143] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X1GCGUG 3’(SEQ IDNO：75)，且[0144] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGCX43’(SEQ IDNO：76)，[0145] 其中X1无或为A，且X4无或为U；
[0146] 优选地，
[0147] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’AGCGUG 3’，且
[0148] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGCU 3’。
[0149] 在第一方面的第30实施方式中(同时也是第一方面的第二十三到第二十七实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0150] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’X2SSBS 3’(SEQ IDNO：73)，且[0151] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BVSSX33’(SEQ IDNO：74)，
[0152] 其中X2无或为G，且X3无或为C；
[0153] 优选地，
[0154] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且
[0155] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’UACGC 3’。
[0156] 在第一方面的第31实施方式中(同时也是第一方面的第二十一到第三十实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子具有SEQID NO：46～56、61～72、和132中任一所示的核酸序列。
[0157] 在第一方面的第32实施方式中(同时也是第一方面的第十实施方式的一实施方式)，所述C型核酸分子含以下核心核苷酸序列：
[0158] GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG(SEQ ID NO：90)，
[0159] 其中XA无或为A。
[0160] 在第一方面的第33实施方式中(同时也是第一方面的第三十二实施方式的一实施方式)，所述C型核酸分子含选自下列的核心核苷酸序列：
[0161] ●5’GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’(SEQ ID NO：91)，
[0162] ●5’GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’(SEQ ID NO：92)，和
[0163] ●5’GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’(SEQ ID NO：93)，
[0164] 所述核心核苷酸序列优选含5’GGUUAGGGCUHGAAGUCGG3’(SEQ ID NO：93)。
[0165] 在第一方面的第34实施方式中(同时也是第一方面的第三十二到第三十三实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0166] 在第一方面的第35实施方式中(同时也是第一方面的第三十二到第三十三实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子以5’→3’方向含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0167] 在第一方面的第36实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十五实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子含第一和第二核苷酸片段，且所述第一核苷酸片段的至少一部分和所述第二核苷酸片段的至少一部分任选彼此杂交，其中在杂交后形成双链结构。
[0168] 在第一方面的第37实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十六实施方式中任意一个的一实施方式)，所述第一片段的长度和所述第二片段的长度各自分别为0～17个核苷酸，优选为4～10个核苷酸，且更优选为4～6个核苷酸。
[0169] 在第一方面的第38实施方式中(同时也是第一方面的第三十六到第三十七实施方式中任意一个的一实施方式)，所述双链结构含4～10个碱基对，优选为4～6个碱基对，更优选为5个碱基对。
[0170] 在第一方面的第39实施方式中(同时也是第一方面的第三十八实施方式的一实施方式)，所述双链结构含4～10个连续碱基对，优选为4～6个连续碱基对，更优选为5个连续碱基对。
[0171] 在第一方面的第四十实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0172] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RKSBUSNVGR 3’(SEQ ID NO：120)，且[0173] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YYNRCASSMY 3’(SEQ ID NO：121)；
[0174] 优选地，
[0175] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’RKSBUGSVGR 3’(SEQ ID NO：122)，且[0176] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YCNRCASSMY 3’(SEQ ID NO：123)。
[0177] 在第一方面的第41实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0178] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’XsSSSV 3’(SEQ IDNO：124)，且[0179] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’BSSSXs3’(SEQ IDNO：125)，[0180] 其中Xs无或为S。
[0181] 在第一方面的第42实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0182] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’SSSSR 3’(SEQ IDNO：130)，且[0183] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YSBSS 3’(SEQ IDNO：131)；
[0184] 优选地，
[0185] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’SGGSR 3’(SEQ IDNO：126)，且[0186] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’YSCCS 3’(SEQ IDNO：127)。
[0187] 在第一方面的第43实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0188] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCSGG 3’(SEQ IDNO：128)，且[0189] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CCKGC 3’(SEQ IDNO：129)；
[0190] 优选地，
[0191] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GCCGG 3’，且
[0192] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CCGGC 3’。
[0193] 在第一方面的第44实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0194] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’，且
[0195] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUCACG 3’。
[0196] 在第一方面的第45实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0197] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’UGAGAUAGG 3’，且
[0198] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUCA 3’。
[0199] 在第一方面的第46实施方式中(同时也是第一方面的第三十四到第三十九实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0200] ●所述第一核苷酸片段含核苷酸序列5’GAGAUAGG 3’，且
[0201] ●所述第二核苷酸片段含核苷酸序列5’CUGAUUCUC 3’。
[0202] 在第一方面的第47实施方式中(同时也是第一方面的第三十二到第四十六实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子具有SEQ ID NO：79～89、94～119、和134～136中任一所示的核酸序列。
[0203] 在第一方面的第48实施方式中(同时也是第一方面的第十实施方式的一实施方式)，所述核酸分子具有SEQ ID NO：142～144中任一所示的核酸序列。
[0204] 在第一方面的第49实施方式中(同时也是第一方面的一实施方式和第一个到第四十八实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子是针对SDF-1的拮抗剂。
[0205] 在第一方面的第50实施方式中(同时也是第一方面的一实施方式和第一个到第四十八实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸分子是SDF-1受体系统的拮抗剂，其中所述SDF-1受体系统的所述SDF-1受体优选为选自CXCR4和CXCR7的受体。
[0206] 在第一方面的第51实施方式中(同时也是第一方面的一实施方式和第一个到第五十实施方式中任意一个的一实施方式)，
[0207] ●所述SDF-1是人SDF-1，且/或
[0208] ●所述SDF-1受体系统的所述SDF-1受体是人SDF-1受体。
[0209] 在第一方面的第52实施方式中(同时也是第一方面的一实施方式和第一个到第五十一实施方式中任意一个的一实施方式)，所述SDF-1含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
[0210] 在第一方面的第53实施方式中(同时也是第一方面的一实施方式和第一个到第五十二实施方式中任意一个的一实施方式)，所述核酸含修饰。
[0211] 在第一方面的第54实施方式中(同时也是第一方面的第五十三实施方式的一实施方式)，所述修饰选自HES部分和PEG部分。
[0212] 在第一方面的第55实施方式中(同时也是第一方面的第五十四实施方式的一实施方式)，所述修饰是由直链或分支的PEG构成的PEG部分，其中所述PEG部分的分子量优选为约2～180kD，更优选为约60～140kD，且最优选为约40kD。
[0213] 在第一方面的第56实施方式中(同时也是第一方面的第五十四实施方式的一实施方式)，所述修饰HES部分，其中所述HES部分的分子量优选为约10～130kD，更优选为约30～130kD，且最优选为约100kD。
[0214] 在第一方面的第57实施方式中(同时也是第一方面的第一到第五十六实施方式中的任意一个的一实施方式)，所述核酸的核苷酸是L-核苷酸，优选为SEQ ID NO：19、20、21、22、57、58、90、91、92和93所示序列的核苷酸。
[0215] 第2方面，本发明通过含有依据第1方面及其任意实施方式的核酸、或可选择的至少一种附加成分的药物组合物解决了本发明所涉及问题，其中所述附加成分选自药学可接受的赋形剂和药学活性剂。
[0216] 第3方面，本发明通过依据第1方面及其任意实施方式的核酸在药物制备中的用途解决了本发明所涉及问题。
[0217] 在第3方面第1实施方式中，所述药物
[0218] ●用于使祖细胞和/或干细胞移动到外周血中，和/或
[0219] ●用于治疗优选选自下列的疾病和/或病症：
[0220] ■伤口愈合；
[0221] ■烧伤；
[0222] ■由损伤的器官组织和/或损伤的血管所致，或与损伤的器官组织和/或损伤的血管关联的病症，其中该病症选自：视网膜和脉络膜损伤、中风、心肌损伤、心肌梗塞、器官移植后缺血和跌打损伤；和
[0223] ■造血病症，其中该病症选自：再生障碍性贫血、白血病、药物引起的贫血和白细胞减少、和白细胞减少中的细菌感染。
[0224] 在第3方面第2实施方式中，其中所述药物使癌细胞移动到受试者外周血中。
[0225] 在第3方面第3实施方式中，同时也是第3方面的第2实施方式的一实施方式，所述癌细胞选自：白血病细胞、淋巴瘤细胞、癌干细胞、具有转移潜力和发生癌转移的癌细胞。
[0226] 在第3方面第4实施方式中，同时也是第3方面的第2到第3实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述药物与第二药学活性剂联用，其中所述第二药学活性剂适于使癌细胞移动到受试者外周血中，其中所述第二药学活性剂优选选自癌细胞移动剂。
[0227] 在第3方面第5实施方式中，同时也是第3方面的第2到第4实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，其中所述药物与第三药学活性剂联用，其中所述第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记外周血中的癌细胞，其中所述标记导致身体防卫活化。
[0229] 在第3方面第7实施方式中，同时也是第3方面的第5到第6实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述药物用于治疗和/或预防癌，所述癌优选为实体瘤和血液癌，更优选为白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
[0230] 在第3方面第8实施方式中，所述药物使长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到受试者外周血中，其中所述B细胞和/或T细胞优选为记忆B细胞和/或记忆T细胞。
[0231] 在第3方面第9实施方式中，同时也是第3方面的第8实施方式的一实施方式，所述药物与第二药学活性剂联用，其中所述第二药学活性剂用于使长寿浆细胞、B细胞和/或记忆T细胞移动到受试者外周血中，其中所述第二药学活性剂优选选自细胞移动剂。
[0232] 在第3方面第10实施方式中，同时也是第3方面的第8到第9实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述药物与第三药学活性剂联用，且所述第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记外周血中的长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞，其中所述标记导致身体防卫活化。
[0233] 在第3方面第11实施方式中，同时也是第3方面第8到第10实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述受试者随后或同时经历化学治疗和/或放射性治疗。
[0234] 在第3方面第12实施方式中，同时也是第3方面的第8到第11实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述药物被用于治疗和/或预防：
[0235] ●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
[0236] ●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
[0237] ●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
[0238] ●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
[0239] ●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
[0240] ●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；
[0241] ●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病；
[0242] ●移植器官的移植排斥，其中该器官选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管、胰腺；和/或
[0243] ●骨髓移植后的移植物抗宿主病。
[0244] 在第3方面第13实施方式中，所述药物用于抑制白细胞迁移。
[0245] 在第3方面第14实施方式中，同时也是第3方面的第13实施方式的一实施方式，所述药物用于预防和/或治疗移植器官的移植排斥，所述器官例如：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管和胰腺。
[0246] 在第3方面第15实施方式中，同时也是第3方面的第13实施方式的一实施方式，其中所述药物用于治疗和/或预防下列中发生或与下列关联的炎症：
[0247] ●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
[0248] ●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
[0249] ●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
[0250] ●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
[0251] ●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
[0252] ●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；和/或
[0253] ●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病。
[0254] 在第3方面第16实施方式中，同时也是第3方面的第13实施方式的一实施方式，所述药物用于治疗和/或预防皮肤和/或气道粘膜的过敏反应，优选为花粉症、哮喘、气道高反应性和/或皮炎。
[0255] 在第3方面第17实施方式中，同时也是第3方面的第16实施方式的一实施方式，所述皮炎是接触性皮炎和/或特应性皮炎。
[0256] 第4方面，本发明通过从第1个受试者中获得祖细胞和/或干细胞的方法解决了本发明所涉及问题，所述方法包括：
[0257] (a)给受试者施用对于使所述祖细胞和/或干细胞移动到所述受试者外周血来说有效的量的依据第1方面及其任意实施方式的核酸；
[0258] (b)随后从所述受试者中收获所述祖细胞和/或干细胞。
[0259] 在第4方面第1实施方式中，所述祖细胞和/或干细胞的收获通过成分输血、白细胞去除术、细胞分选和/或流式细胞术进行。
[0260] 在第4方面的第2实施方式中，同时也是第4方面的一实施方式和第4方面的第1实施方式的一实施方式，所述第一受试者或第二受试者随后或同时经历化学治疗和/或放射性治疗。
[0261] 在第4方面的第3实施方式中，同时也是第4方面的第2实施方式的一实施方式，在所述第一受试者或第二受试者的化学治疗和/或放射性治疗后，将收获的所述第一受试者或第二受试者的祖细胞和/或干细胞施用到所述第一受试者或第二受试者外周血中。
[0262] 在第4方面的第4实施方式中，同时也是第4方面的一实施方式和第4方面的第1到第3实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述收获的祖细胞和/或干细胞经扩增，且将扩增的祖细胞和/或干细胞施用给第一受试者或第二受试者，其中优选通过静脉内或局部注射施用所述扩增的祖细胞和/或干细胞。
[0263] 在第4方面的第5实施方式中，同时也是第4方面的一实施方式和第4方面的第1到第4实施方式中的任意一实施方式的一实施方式，所述方法用于治疗癌，所述癌优选为实体瘤和血液恶性肿瘤。
[0264] 第5方面，本发明通过依据第1方面及其任意实施方式的核酸分子解决了本发明所涉及问题，用于依据第4方面及其任意实施方式的方法。
[0265] 第6方面，本发明通过从受试者中除去长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的方法解决了本发明所涉及问题，所述方法包括：
[0266] (a)给受试者施用对于使所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到所述受试者外周血来说有效的量的依据第1方面及其任意实施方式的核酸；
[0267] (b)随后从所述受试者中收获所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞，
[0268] 其中所述除去和收获的T细胞优选为记忆T细胞。
[0269] 在第6方面的第1实施方式中，所述长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的收获通过成分输血、细胞分选和/或流式细胞术进行，优选通过使用适于所述细胞的表面标记物的流式细胞术进行。
[0270] 在第4方面的第6实施方式中，同时也是第4方面的一实施方式和第4方面的第1到第5实施方式中任意一实施方式的一实施方式；同时也是第六方面的第2实施方式，同时也是第六方面的一实施方式和第六方面的第1实施方式，所述方法用于治疗和/或预防：
[0271] ●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
[0272] ●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
[0273] ●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
[0274] ●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
[0275] ●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
[0276] ●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；
[0277] ●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病；
[0278] ●移植器官的移植排斥，其中该器官选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管、胰腺；和/或
[0279] ●骨髓移植后的移植物抗宿主病。
[0280] 第7方面，本发明通过依据第1方面及其任意实施方式的核酸分子解决了本发明所涉及问题，用于依据第六方面及其任意实施方式的方法。
[0281] 第8方面，本发明通过使用第1方面的第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，解决了本发明所涉及问题，其中所述药物用于治疗和/或预防肾病，优选为糖尿病性肾病。
[0282] 第9方面，本发明通过使用第1方面的第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，解决了本发明所涉及问题，其中所述药物用于治疗和/或预防高血压，优选为肺性高血压。
[0283] 第10方面，本发明通过使用第1方面的第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，解决了本发明所涉及问题，其中所述药物用于治疗和/或预防纤维化，优选为特发性肺纤维化。
[0284] 在第10方面的第1实施方式中，所述药物用于治疗和/或预防伤口愈合过程中的纤维化。
[0285] 第11方面，本发明通过使用第1方面的第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，解决了本发明所涉及问题，其中所述药物用于治疗涉及血管生成和/或新生血管形成的疾病和/或病症。
[0286] 在第11方面的第1实施方式中，所述药物用于与抑制VEGF的制剂联合治疗。
[0287] 在第11方面的第2实施方式中，同时也是第11方面的第1实施方式的实施方式，所述药物用于弱应答于使用抑制VEGF的制剂的治疗的受试者。
[0288] 在第11方面的第3实施方式中，所述药物用于不应答于使用抑制VEGF的制剂的治疗的受试者。
[0289] 在第11方面的第4实施方式中，所述疾病和/或病症涉及脉络膜新生血管形成，和/或与脉络膜新生血管形成关联。
[0290] 在第11方面的第5实施方式中，同时也是第11方面的1实施方式和第11方面的第1～4实施方式中任意一实施方式的实施方式，所述疾病和/或病症选自视网膜疾病，优选老年性黄斑退化症、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、黄斑水肿或视网膜水肿。
[0291] 在第11方面的第6实施方式中，同时也是第11方面的1实施方式和第11方面的第1～3实施方式中任意一实施方式的实施方式，所述疾病选自癌，优选实体瘤和转移。
[0292] 在第3方面的第18实施方式中，所述受试者经历治疗计划或待经历治疗计划，所述治疗计划除去所述受试者的祖细胞和/或干细胞，优选除去所述受试者外周血中的祖细胞和/或干细胞。
[0293] 在第3方面的第19实施方式中，同时也是第3方面的1实施方式和第3方面的第18实施方式，所述药物待施用给受试者，所述受试者经历化学治疗和/或放射性治疗或者待经历化学治疗和/或放射性治疗。
[0294] 在第3方面的第20实施方式中，所述药物用于恢复或改善受试者的免疫系统。
[0295] 第12方面，本发明通过用抑制SDF-1和SDF-1受体之间的信号转导的分子来制备药物，解决了本发明所涉及问题，其中所述药物用于治疗和/或预防肾病，优选为糖尿病性肾病。
[0296] 在第12方面的第1实施方式中，所述分子是SDF-1结合分子或SDF-1受体结合分子，且包括：靶-结合核酸，如适体和镜体，抗体和小分子。
[0297] 在第12方面的第2实施方式中，同时也是第12方面的1实施方式和第12方面的第1实施方式，所述分子是第1方面第10～57实施方式所定义的核酸分子。
[0298] 在第12方面的第3实施方式中，所述分子是抑制SDF-1或SDF-1受体表达的分子，且包括：转录因子的siRNA分子、核酶、反义分子和抑制剂。
[0299] 第13方面，本发明通过依据第1方面第5～57实施方式中任意一个的核酸分子，用于抑制白细胞迁移的方法中，解决了本发明所涉及问题。
[0300] 第14方面，本发明通过不穿过血脑屏障的SDF-1结合分子，用于使源自干细胞的骨髓移动，或用于制备药物，优选为用于使源自干细胞的骨髓移动的药物，解决了本发明所涉及问题。
[0301] 在第14方面的第1实施方式中，所述药物用于改善中枢神经系统损伤，和/或用于促进中风后的组织修复，所述中风优选为缺血性中风。
[0302] 在第14方面的第2实施方式中，同时也是第14方面的第1实施方式，所述SDF-1结合分子包括选自下列的靶-结合核酸：适体、镜体、抗体和小分子。
[0303] 在第14方面的第3实施方式中，时也是第14方面的1实施方式和第14方面的第1～2实施方式中任意一实施方式的实施方式，所述分子是第1方面第9～57实施方式中任意一个所定义的核酸分子。
[0304] 第15方面，本发明通过依据第1方面和第1方面第1～57实施方式中任意一个的核酸分子，用于治疗如前面所有项所定义的疾病，解决了本发明所涉及问题。
[0305] 第16方面，本发明通过使用依据第1方面第10～57实施方式的核酸分子来制备药物，其中所述药物用于治疗和/或预防WHIM综合征，解决了本发明所涉及问题。
[0306] 第17方面，本发明通过使用第1方面第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，其中所述药物用于治疗和/或预防癌生长和转移，以及瘤生长，解决了本发明所涉及问题。
[0307] 第18方面，本发明通过使用第1方面第10～57实施方式所定义的核酸分子来制备药物，其中所述药物在化学治疗前施用给受试者，所述化学治疗优选为用于治疗癌而施用的化学治疗，解决了本发明所涉及问题。
[0308] 无意受任何理论束缚，发明人假定本发明的核酸抑制SDF-1与其SDF-1受体的结合，因此，无论直接或间接，影响细胞的迁移，优选细胞从外周血迁移到一种组织或多种组织上，和细胞从组织迁移到外周血中。
[0309] 无意受任何理论束缚，发明人进一步假定本发明的、抑制SDF-1结合到SDF-1受体上的核酸分子通过抑制SDF-1和SDF-1受体间的相互作用，导致祖细胞、干细胞、癌细胞、长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞从组织迁移到外周血(优选通过动员)。
[0310] 此外，无意受任何理论束缚，发明人假定本发明的、抑制SDF-1结合到SDF-1受体上的核酸分子，避免白细胞的迁移，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性白细胞、嗜碱性粒细胞和/或树突细胞和肥大细胞，优选在例如皮肤或粘膜这样的组织中，并优选帮助缓解自身免疫性疾病以及皮肤和粘膜的变态反应。
[0311] 此外，仍然无意受任何理论束缚，发明人能够证明，使用SDF-1抑制试剂，例如本发明的核酸分子，能用于治疗肾病，优选糖尿病肾病；高血压，优选肺性高血压；纤维症，优选肺纤维化；以及用于治疗涉及新生血管形成的疾病和/或病症，优选脉络膜新生血管形成。
[0312] 对于可以通过使用本发明的核酸分子或组合物(优选包含相同成分的药物组合物)治疗或预防的多种疾病、状况和病症，已经公认所述疾病、状况和病症为此处所述，包括并尤其包括本申请介绍部分所述的那些。至此，各段落形成了本公开的整体部分，教导了所述核酸分子分别用于预防和治疗所述疾病、状况和病症的适合性。
[0313] 静脉注射SDF-1结合核酸分子(例如NOX-A12-JE40)后，细胞进入血液，使用血细胞计数器进行全血细胞计数后可观察到SDF-1结合核酸NOX-A12-JE40的效果(见实施例10)。造血干细胞/造血祖细胞只能代表被动员的白细胞的一小部分，其它类型的细胞也被释放到血液中。其中有单核细胞和中性粒细胞以及组织定向干/祖细胞、间质干细胞、长寿血浆B细胞，不局限为这些细胞。
[0314] 基于这些结果，发明人得出结论，通过本发明的SDF-1结合核酸分子抑制SDF-1到SDF-1受体的信号传导导致对细胞迁移的影响。优选细胞表达SDF-1受体。
[0315] 相应的，此处优选使用的术语迁移指的是从一种组织到另一种组织、从一种组织到外周血和/或从外周血到组织的移动和/或运动。可以如实施例5所示在TAX-测定中检测细胞的迁移(体外迁移)和/或如实施例10所示使用血细胞计数器和FACS测定检测细胞的迁移(体内迁移)。此外，可以进行组织的免疫组化，利用直接针对细胞特异性表面标志物的抗体检测迁移的细胞。如此处所使用的，术语SDF-1受体，无论使用单复数，都指的是SDF-1结合的任意受体。目前已知两种受体，CXCR 4(Godessart 2005)和CXCR7(Burns，Summers，等人2006)，它们是首选的SDF-1结合受体。
[0316] 血细胞发育
[0317] 血细胞的发育和成熟是一个复杂的过程。成熟的血细胞源自造血前体细胞(也被称为祖细胞)和存在于特殊的造血组织(包括骨髓)中的干细胞。在这些环境中造血细胞在进入循环系统之前发生增生并分化。在此过程中趋化因子受体CXCR4及其天然配体SDF-1显得较为重要(Maekawa and Ishii 2000；Nagasawa 2000)。有报道表明CXCR4或SDF-1敲除小鼠表现出造血缺陷(Ma，Jones等人1998；Tachibana，Hirota等人1998；Zou，Kottmann等人1998)。还已知CD34+祖细胞表达CXCR4，并且需要骨髓间质细胞产生的SDF-1来进行化学诱导和移植物移入(Peled，Petit等人1999)，并且在体外，SDF-1对CD34+细胞(Aiuti，Webb等人1997；Viardot，Kronenwett等人1998)和组/干细胞(Jo，Rafii等人2000)都有趋化性。对于其它数种定向祖细胞和成熟的血细胞(包括T淋巴细胞和单核细胞(Bleul，Fuhlbrigge等人1996)、原和前B淋巴细胞(Fedyk，Ryyan等人1999)和巨核细胞(Riviere，Subra等人1999；Abi-Younes，Sauty等人2000；Hodohara，Fujii等人2000；Majka，Janowska-Wieczorek等人2000；Gear，Suttitanamongkol等人2001))SDF-1还是一种重要的化学引诱物，通过CXCR4受体传递信号。由于不同细胞类型之间的关系，以及对SDF-1和SDF-1受体的牵涉，事实上可以利用本发明的核酸分子解决不同细胞类型。
[0318] 因此，总之，看似SDF-1能够控制带有SDF-1受体的细胞的位置和分化，所述SDF-1受体优选CXCR4受体，这些细胞或者是干细胞(即带有CD34+的细胞)和/或祖细胞，导致对特定刺激进行响应形成特殊类型克隆；可以是CD34+或CD34-，或者分化更高的某种细胞。
[0319] 最近，人们将相当大的关注集中于动员到外周血祖细胞群中的CD34+细胞的数量上，用于自体同源和异源移植干细胞移植。CD34+群体被认为在改善化疗后恢复时间中起主要作用，并且该细胞有可能在长期移植物移入和造血作用恢复中具有重要作用(Croop，Cooper等人2000)。CD34+细胞再移入的机制有可能是因为SDF-1对表达CXCR4的细胞的趋化作用(Ponomaryov，Peled等人2000；Voermans，Kooi等人2001)。最近在小鼠中发现成体造血干细胞能够恢复受损心肌组织(Jackson，Majka等人2001；Kocher，Schuster等人2001)。
[0320] 如本文中所优选使用的，术语祖细胞指的是对某种刺激响应，能够形成分化的造血或髓系细胞的细胞。可以通过细胞在样本中形成不同类型的克隆形成单位的能力判断祖细胞的存在，所述类型包括，例如，CFU-GM(意指克隆形成单位粒细胞-巨噬细胞)；CFU-GEMM(意指克隆形成单位，多潜能)；BFU-E(爆发集落形成单位，红细胞系)；HPP-CFC(意指高增生潜力克隆形成细胞)；或使用已知流程在培养中能够获得的其它类型的分化克隆。
[0321] 如本文中所优选使用的，干细胞是是分化较少形式的祖细胞。典型的，这种细胞经常是CD34阳性的。但是某些干细胞不含有这种标志物。可以使用荧光活化细胞分选(FACS)测定CD34+细胞，因此可以使用此技术测定样品中该细胞的存在。
[0322] 总之，CD34+细胞仅在血液中低水平存在，但是在骨髓中大量存在。虽然其它类型的细胞(例如内皮细胞和肥大细胞)也存在这种标志物，但是CD34仍被认为是存在干细胞的一种指标。
[0323] 无意受任何理论束缚，发明人发现除了干细胞和/或祖细胞以外，本发明的核酸对SDF-1及其受体之间的信号传导的抑制效果也能够影响癌细胞、长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞。B细胞和T细胞优选记忆B细胞和记忆T细胞。对SDF-1和SDF-1受体之间的信号传导的抑制导致迁移(包括动员)到外周血。
[0324] 干细胞、祖细胞、癌细胞、长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的动员优选发生于造血组织中，其中所述造血组织选自骨髓组织和淋巴组织。骨髓组织位于骨髓中。淋巴组织位于消化管和呼吸道的粘膜、淋巴结、脾和/或胸腺中。
[0325] 如本文中所优选使用的，癌细胞是赘生细胞，优选自白血病细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、肿瘤干细胞、具有转移潜力的癌细胞和癌症转移灶。典型的赘生细胞都具有遗传或后生异常，这是克隆形成能力的证据。对于某些类型的肿瘤，例如淋巴瘤和白血病，现在认为克隆形成能力的证实是定义细胞增生为瘤形成所必须的(但不是充分的)。
[0326] 在发生带有终末分化B细胞(浆细胞)所产生的活化抗体的急性免疫响应之后，这些细胞中的大部分都会随着疾病的消退和/或外源抗原(例如病毒蛋白)的清除而死亡。但是有小部分的记忆B细胞会在T细胞的协助下转化为造浆细胞(plasmablasts)。这些造浆细胞具有响应化学刺激迁移到适当位置的能力，在该位置所述细胞能够作为长寿“记忆”浆细胞生存数年。所述的这些位置可以在骨髓和外周血中，例如，在炎症组织中。这些长寿浆细胞最有可能是造成感染或注射疫苗后保护性抗体血浆滴度通常能够维持数年的原因(Tarlinton等人，2008)。
[0327] 祖细胞和/或干细胞的动员优选发生于造血组织，其中所述造血组织选自骨髓组织和淋巴组织。骨髓组织位于骨髓之中。淋巴组织位于消化管和呼吸道的粘膜、淋巴结、脾、胸腺和炎症组织中的淋巴小结。优选地，如前所述的细胞的动员包括如前所述的细胞迁移到外周血中。
[0328] 如前所述，已发现SDF-1对于成熟或前体肥大细胞起趋化性剂的作用，当成熟肥大细胞释放组胺时尤其如此，例如，通过IgE信号传导通过结合到肥大细胞表面Fc-epsilon受体上(Godot，Arock等人2007)。象皮肤和气道粘膜的变态反应这种疾病，例如花粉症和哮喘、皮炎、尤其是接触性皮炎和特应性皮炎，经常涉及白细胞迁移并聚集到受影响组织。通过滑膜活检和RT-PCR，在脊椎关节病、风湿性关节炎、银屑病关节炎和变性关节病(骨关节炎)患者中也都发现了SDF-1的表达。根据本发明，利用SDF-1结合核酸干扰SDF-1可以对这些关节炎患者产生阳性效果。
[0329] 因此，并考虑到SDF-1和SDF-1受体的参与概况，本发明的抑制SDF-1结合以及SDF-1和SDF-1受体之间相互作用的核酸分子能够帮助缓解这些疾病，其中利用本发明的核酸分子进行抑制会导致白细胞迁移的减少和/或抑制，其中所述白细胞优选为T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性白细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞和/或肥大细胞。
[0330] 白细胞的迁移导致在组织中的聚集，其中白细胞的聚集较多导致所述组织的炎症，其中所述组织包括皮肤和/或粘膜，优选气道粘膜，以及一些器官，选自但不限于眼睛、脑、肺、肾、心脏、肝、胃肠道、脾、骨和/或淋巴系统。
[0331] SDF-1拮抗剂是一种能够结合SDF-1并抑制SDF-1功能的分子，优选如实施例所述在基于细胞的测定或体内模型中。
[0332] 此外，本发明基于惊人的发现，即有可能制备出特异性结合SDF-1且与其具有高亲和力的核酸。在此处这种核酸被称为本发明的核酸、发明的核酸或发明的核酸分子。
[0333] SDF-1是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的碱性肽。经计算得到的SDF-1的pI为9.70。本文所用术语SDF-1指任何SDF-1，包括但不限于哺乳动物SDF-1。所述哺乳动物SDF-1优选选自小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猴和人SDF-1。所述SDF-1更优选是人SDF-1，也适用于SDF-1α(SEQ ID NO：1)和/或人SDF-1β(SEQ ID NO：2)，所述SDF-1最优选是人SDF-1α(SEQ ID NO：1)。
[0334] 发现可鉴定可以高亲和力SDF-1结合性核酸是令人惊讶的，因为Eaton等人(Eaton，Gold等人1997)观察到通常极难制备针对碱性蛋白质的适体(aptamer)(即结合靶分子的D-核酸)，因为此类靶标会产生高但非特异性的信噪比。所述高信噪比由核酸表现出的对碱性靶标(如SDF-1)的高非特异性亲和力所致。
[0335] 可在使用本发明的核酸的本发明的任何方面实现所述核酸的特征，其中可单独或任意组合使用所述核酸。
[0336] 无意受任何理论束缚，发明人假定所观察到的本发明的核酸结合SDF-1的特异性共有一些结构特征，且具体指被称为核心序列(将在下文中更详细地讨论)的核苷酸序列之一，请参照图1～8及实施例1。但需知，这些图和实施例1包括几个不必在每个和任一本发明的核酸中实现的所述结构特征。
[0337] 如在权利要求书和实施例1中的进一步详述，可分别基于所述框和一些结构特征和元件对各种人SDF-1结合性核酸分子进行分类。本文将如述定义的各种类别称为型，且更具体称为A型、B型和C型。
[0338] 在一个优选实施方式中，本发明的核酸是单个核酸分子。再一实施方式中，所示单个核酸分子以许多单个核酸分子的形式存在。除非另有说明，本文中的术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用。
[0339] 本领域技术人员将公认：本发明的核酸分子优选由相互共价连接(优选通过磷酸二酯连接或键连接)的核苷酸构成。
[0340] 本发明的核酸还应包括与本发明的特定序列基本同源的核酸。应将术语“基本同源”理解为，同源性至少75％，优选85％，更优选90％，及最优选大于95％、96％、97％、98％或99％。
[0341] 存在于本发明的核酸中的同源核苷酸的实际百分比将取决于存在于所述核酸中的核苷酸总数。修饰百分比可基于存在于所述核酸中的核苷酸总数。
[0342] 可根据本领域技术人员已知的方式测定所述同源性。所述方法更具体为序列比较算法，然后基于指定程序参数计算待测序列相对于参比序列的序列同一性百分比。所述待测序列优选为所述应与另一核酸分子同源或待测是否与另一核酸分子同源(且如果是，以何种程度同源)的序列或核酸分子，其中也将所述另一核酸分子称为参比序列。在一实施方式中，所述参比序列是本文所述核酸分子，更优选为具有SEQ ID NO：5～144所示任一序列的核酸分子。可根据下列方法进行用于比较的最佳序列比对，所述方法例如：Smith&Waterman的局部同源性算法(Smith&Waterman，1981)，Needleman&Wunsch的同源性比对算法(Needleman&Wunsch，1970)，Pearson&Lipman的相似性搜索方法(Pearson&Lipman，1988)，这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)或目测检查。
[0343] 适合于测定序列同一性百分比的算法的一个实例是在基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool，以下称为“BLAST”)中使用的算法，参见例如Altschul等人(Altschul等人1990andAltschul等人，1997)。用于进行BLAST分析的软件可在美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(以下称为“NCBI”)中公开获得。McGinnis等人描述了在使用可从NCBI获得的软件(例如BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸序列))进行序列同一性测定中采用的默认参数(McGinnis等人，2004)。
[0344] 术语“本发明的核酸”还应包括包含本文公开的核酸序列或其部分的那些核酸，至所述核酸或所述部分优选参与结合SDF-1。可例如通过裁减本文公开的核酸而产生所述核酸。可裁减本文公开的核酸的任一末端或两个末端。也可裁减内部核苷酸序列，即裁减5’和3’末端核苷酸之间的核苷酸。此外，裁减还应包括删除本文公开的核酸序列中的短至一个核苷酸。也可裁减不只一个本发明的核酸片段，其中所述片段可短至仅为一个核苷酸长。本领域技术人员可通过常规实验或通过使用或采用本文所述的方法(优选在本文实施例部分描述的方法)测定本发明的核酸的结合。
[0345] 本发明的核酸可为D-核酸或L-核酸。本发明的核酸优选是L-核酸。另外，也可能是所述核酸的一个或几个部分为D-核酸或所述核酸的至少一个或几个部分为L-核酸。术语所述核酸的“部分”应指短至一个核苷酸。本文通常将所述核酸分别称为D-核酸和L-核酸。因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明的核酸由L-核苷酸构成，并包含至少一个D-核苷酸。所述D-核苷酸优选附着于不同于定义本发明的核酸片段的部分，优选与所述核酸的其他部分相互作用的所述核酸的那些部分。所述D-核苷酸优选分别附着于本发明的任意片段末端和任意核酸末端。在再优选的实施方式中，所述D-核苷酸可被用作间隔物或连接物，优选将修饰物(如PEG和HES)附着于本发明的核酸。
[0347] 即述特征亦在本发明的范围内，即本发明的核酸是较长核酸的部分，其中所述较长核酸包含几个部分，其中至少一个所述部分是本发明的核酸或其部分。所述较长核酸的其他部分可为一个或几个D-核酸或L-核酸。本发明可使用任意组合。较长核酸的所述其他部分，可表现出不同于结合(优选结合SDF-1)的功能。一种可能的功能是允许与其他分子(其中所述其他分子优选与SDF-1不同)相互作用，例如，用于固定、交联、检测或扩增。在本发明的另一实施方式中，本发明的核酸单独或组合包含几个本发明的核酸。术语“较长核酸”也涵盖包含几个本发明的核酸的所述核酸。
[0348] 本文所用L-核酸是由L-核苷酸构成的核酸，优选完全由L-核苷酸构成的核酸。
[0349] 本文所用D-核酸是由D-核苷酸构成的核酸，优选完全由D-核苷酸构成的核酸。
[0350] 除非另有说明，术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。
[0351] 除非另有说明，本文中的所有核苷酸序列也均以5’→3’的方向表示。
[0352] 无论本发明的核酸由D-核苷酸构成、由L-核苷酸构成还是由两者的组合(所述组合是例如随机组合，或是由至少一个L-核苷酸和至少一个D-核酸构成的片段的特定序列)构成，所述核酸可由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合构成。
[0353] 将本发明的核酸设计成L-核酸具有诸多优点。L-核酸是天然核酸的对映体。但由于核酸酶的广泛存在，D-核酸在水溶液中(且尤其在生物系统或生物样品中)不很稳定。天然核酸酶(尤其是来自动物细胞的核酸酶)不能降解L-核酸。由此，L-核酸在所述系统(包括动物和人体)中的生物学半衰期显著增长。由于L-核酸不易降解，故无核酸酶降解产物产生，从而观察不到由其所致的副作用。所述方面事实上界定了所有其他化合物(其用于治疗涉及SDF-1的疾病和/或病症)的L-核酸。也将通过不同于Watson-Crick碱基配对机理特异性结合靶分子的L-核酸或或部分或完全由L-核酸构成的适体(尤其含有参与所述适体与靶分子的结合的所述适体部分)称为镜体(镜体)。
[0354] 即述特征亦在本发明的范围内，即连接到所述核心核苷酸序列两侧的所述第一和第二核苷酸片段原则上可相互杂交。在所述杂交后形成双链结构。本领域技术人员将公认：所述杂交可(尤其在体外和/或体内条件下)发生或不发生。如果发生杂交，则可至少基于碱基配对法则杂交形成双链结构，无需发生两个片段的全序列杂交。本文所用双链结构优选是由两个或多个独立链形成的部分分子或结构，其中存在至少一个(优选两个或多个)优选按照Watson-Crick碱基配对法则进行碱基配对的碱基对。本领域技术人员还将公认：其他碱基配对(例如Hoogsten碱基配对)可存在于所述双链结构中或形成所述双链结构。
[0355] 即述特征亦在本发明的范围内，即无论是以D-核酸、L-核酸或D，L-核酸存在的核酸，或无论它们是DNA或RNA，本发明的核酸可作为单链或双链核酸存在。通常，本发明的核酸是表现出由一级序列限定的二级结构，并由此也可形成三级结构的单链核酸。但本发明的核酸也可为双链核酸，即彼此互补或部分互补的两条链相互杂交。这赋予核酸以稳定性，尤其在所述核酸是以天然D-形式而非L-形式存在时有利。
[0356] 可修饰本发明的核酸。可对所述核酸的单个核苷酸进行所述修饰，且所述修饰为本领域所熟知。有关所述修饰的实例尤其见Venkatesan等人(Venkatesan，Kim等人2003)和Kusser(Kusser 2000)。所述修饰物可为在构成所述核酸的个别核苷酸的2’位置处的H原子、F原子或O-CH3基团或NH2-基团。此外，本发明的核酸也可包含至少一个LNA核苷酸。在一实施方式中，本发明的核酸由LNA核苷酸构成。
[0357] 在一实施方式中，本发明的核酸可为多分体(multipartite)核酸。本文所用多分体核酸是由至少两个核酸链构成的核酸。所述至少两个核酸链形成功能单元，其中所述功能单元是靶分子的配体。可通过将所述核酸切成两条链，或通过合成与本发明的(即整体)核酸的第一部分相对应的一条核酸和与整体核酸的第二部分相对应的另一条核酸而从本发明的核酸得到所述至少两个核酸链。应公认切割和合成两者均可被用于制备如上所述具有2个以上链的多分体核酸。换言之，尽管各个核酸部分间可一定程度互补，但所述至少两个核酸链通常不同于互补且相互杂交的两条链。
[0358] 即述特征亦在本发明的范围内，即最后实现了本发明的核酸的完全闭合(即环状)结构，即本发明的核酸是闭合的，优选通过共价连接闭合，其中所述共价连接更优选发生在本文公开的核酸序列的5’末端和3’末端之间。
[0359] 发明人已发现，本发明的核酸表现出非常有利的Kd值范围。
[0360] 通过使用所谓的biacore仪(Biacore AB，Uppsala，Sweden)进行的表面等离子共振测量是测定结合常数的一种可能方法，这也是本领域技术人员已知的。可优选通过使用实施例中描述的“pull-down测定法(pull-down binding assay)”测量本文所用亲和力。表示所述核酸与所述靶标(在当前情况下为SDF-1)之间的结合强度的合适量度即为所谓Kd值，本领域技术人员知晓该值及其测定方法。
[0361] 本发明的核酸通过某个KD值来表征。本发明的核酸表现出的KD值优选低于1μM。约1μM的KD值被认为是核酸与靶标非特异性结合的特征。如本领域技术人员将公认的一样，一组化合物(如本发明的核酸)的KD值在某个范围内。上述约1μM的KD是优选的KD值上限。结合靶标的核酸的KD的优选下限可为约10pM或更高。即述特征亦在本发明的范围内，即个别核酸与ghrelin结合的KD值优选在所述范围内。优选的范围可通过选择所述范围内的任意第一个数字和所述范围内的任意第二个数字来限定。优选的上限值是250nM和100nM，优选的下限值是50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。
[0362] 只要仍能结合靶分子，本发明的核酸分子可具有任意长度。本领域将公认，存在本发明的核酸的优选长度。所述长度一般为15～120个核苷酸。本领域技术人员将公认，15～120的任何整数是本发明的核酸的可能长度。本发明的核酸的长度的更优选范围是约
20～100个核苷酸、约20～80个核苷酸、约20～60个核苷酸、约20～50个核苷酸及约
20～40个核苷酸的长度。
20～100个核苷酸、约20～80个核苷酸、约20～60个核苷酸、约20～50个核苷酸及约
20～40个核苷酸的长度。
[0363] 即述特征亦在本发明的范围内，即本文公开的核酸包含优选为高分子量部分和/或优选使所述核酸尤其在动物体内(优选在人体内)的停留时间的特征发生改变的部分。所述修饰物的特别优选的实施方式是本发明的核酸的PEG化和HES化。本文所用PEG表示聚(乙二醇)，而HES表示羟乙基淀粉。本文所用PEG化优选为对本发明的核酸的修饰，其中所述修饰物由附着于本发明的核酸的PEG部分构成。本文所用HES化优选为对本发明的核酸的修饰，其中所述修饰物由附着于本发明的核酸的HES部分构成。欧洲专利申请EP
1306382中描述了所述修饰物及用所述修饰物修饰核酸的方法，将所述专利公开通过引用整体并入本文。
1306382中描述了所述修饰物及用所述修饰物修饰核酸的方法，将所述专利公开通过引用整体并入本文。
[0364] 优选情况下，由高分子量部分构成或包含高分子量部分的修饰物的分子量，尤其在PEG作为所述高分子量部分的情况下为约2,000～200,000Da，优选40,000～120,000Da，且尤其在HES作为所述高分子量部分的情况下优选为约3,000～180,000Da，更优选60,000～140,000Da。例如德国专利申请DE 12004006249.8中描述了HES修饰方法，将所述专利公开通过引用整体并入本文。
[0365] 即述特征亦在本发明的范围内，即如在专利申请WO2005074993和PCT/EP02/11950中进一步描述的那样，可以直链或支链形式使用PEG和HES中的任一者。原则上可在本发明的核酸分子的任何位置进行所述修饰。可优选在所述核酸分子的5’-末端核苷酸、3’-末端核苷酸和/或5’核苷酸和3’核苷酸之间的任意核苷酸上进行所述修饰。
[0366] 可将所述修饰物(且优选为PEG和/或HES部分)直接或通过连接子附着于本发明的核酸分子。即述特征亦在本发明的范围内，即本发明的核酸分子包含一种或多种修饰物，优选一种或多种PEG和/或HES部分。在一实施方式中，个别连接分子将一种以上的PEG部分或HES部分附着于本发明的核酸分子上。本发明中使用的连接子本身可为直链的或支链的。本领域技术人员知晓此类连接子，且专利申请WO2005074993和PCT/EP02/11950中也进一步描述了所述连接子。
[0367] 无意受任何理论束缚，通过用高分子量部分(如聚合物(且更尤其是本文公开的聚合物(其优选为生理学上可接受的)))修饰本发明的核酸，似乎改变了分泌动力学。更具体而言，似乎由于所述经修饰的本发明核酸的分子量增加，且由于所述核酸不经历代谢(尤其是在L形式时)，从而降低其从动物体内，优选从哺乳动物体内，及更优选从人体内分泌。由于一般通过肾脏进行分泌，因此发明人推测：经如述修饰的核酸的肾小球滤过率较不带此类高分子量修饰物的核酸显著减小，这导致其在体内的停留时间增长。与之相关，特别值得注意的是，尽管具有这种高分子量修饰，但本发明的核酸的特异性并未受到有害影响。如此这般，本发明的核酸具有令人惊讶的特征(所述特征通常不能从药学活性化合物中预期)，从而无需通过使用赋予持续释放特性的药物制剂来使其持续释放。而以其包含高分子量部分的修饰形式，本发明的核酸本身就可用作持续释放制剂。如此这般，如本文公开的核酸分子的修饰物和经如述修饰的核酸分子及任何包含其的组合物可提供不同的，优选受控的药物动力学及其生物分布。这还包括在循环中的停留时间和向组织的分配。专利申请PCT/EP02/11950中进一步描述了所述修饰。
[0368] 但即述特征亦在本发明的范围内，即本文公开的核酸不包含任何修饰，且尤其不包含高分子量修饰(例如PEG化或HES化)。当希望将核酸于施用后快速清出身体时，尤其优选所述实施方式。当需要使用本发明的核酸或包含所述核酸的药物进行体内成像或特定给药时可能希望所述快速清除。
[0369] 可将本发明的核酸和/或本发明的拮抗剂用于制药。所述药物包含任选与其他药学活性化合物组合在一起的至少一种本发明的核酸，其中本发明的核酸本身优选发挥药学活性化合物的作用。在一个优选实施方式中，所述药物至少包含药学可接受的载体。所述载体可为例如水、缓冲液、PBS、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、甘露糖溶液、优选5％的蔗糖平衡液、淀粉、糖、明胶或任何其他可接受的载体物质。所述载体通常是本领域技术人员已知的。本领域技术人员将公认，也可将本发明药物的任何实施方式、用途和方面或与之相关的实施方式、用途和方面应用于本发明的药物组合物，反之亦然。
[0370] 用本发明的或根据本发明制备的核酸、药物组合物和药物治疗和/或预防的适应症、疾病和病症是由SDF-1直接或间接参与各自致病机理所致。
[0371] 当然，由于本发明的SDF-1结合性核酸与人或鼠的SDF-1相互作用或结合，本领域技术人员通常将理解：可容易将本发明的SDF-1结合性核酸用于治疗、预防和/或诊断本文描述的任何人和动物疾病。与其相关，将公认本发明的核酸分子能用于治疗和预防此处所述任意疾病、病症或状况，无论所述疾病、病症或状况的作用方式如何。
[0372] 下面提供了本发明的核酸分子在多种疾病、病症或状况中的合理应用，因此描绘了本发明的核酸分子的治疗、预防和诊断适用性权利要求。为了避免任何不必要的重复，应承认，如其所概述，由于SDF-1-SDF-1受体轴的参与，可以利用本发明的核酸分子解决所述轴，因此实现权利要求的治疗、预防和诊断效果。应进一步承认，病人的疾病、病症或状况的详情及其所述治疗方案的细节属于本发明优选的实施方式。
[0373] 增加血液(更具体地说，外周血)中的干细胞和/或祖细胞可减少某些疗法(例如导致白血球减少症的那些疗法)对骨髓的副作用，有助于治疗。已知这是化疗和放疗的副作用。本发明的核酸还能增加骨髓移植的成功率，促进伤口愈合和有助于烧伤治疗，并有助于受损器官组织的恢复。它们还能对抗白血病中常发生的细菌感染。至此，本发明的核酸分子可用于任何此类目的，以及任何此类疾病和病症的治疗和预防。
[0374] 干细胞动员用于组织再生
[0375] 在器官修复中，例如，由于脉管系统机能障碍或创伤，希望进行组织再生但是经常无法实现。已发现在多种疾病动物模型中来自于骨髓的干细胞(优选自体干细胞)具有有益效果，并在一些人体实例中证明了其功效。
[0376] 修复视网膜和视网膜色素上皮
[0377] 在视网膜血管以及变性性疾病小鼠模型中研究了来自于骨髓的干细胞。发现静脉注射或皮下注射后，这些干细胞粘附在受损部位，稳定异常脉管系统并加速含氧量低区域中的新生血管形成(Friedlander等人，2007；Otani等人，2002)。其他一些人发现，用G-CSF动员源自骨髓的干细胞的一个亚群，会运动到受损部位的视网膜色素上皮中。除了全身用药，未发现有必要进行收集并眼内注射干细胞。相反，通过局部临时过表达趋化因子(例如SDF-1)可将其吸引到损伤/损害部位(Li等人，2007；Li等人，2006)。
[0378] 心脏修复
[0379] 积累的证据表明，心肌通过干细胞和/或祖细胞募集反应对生长或损伤进行响应，所述干细胞和/或祖细胞参与修复和再生过程。在心肌梗塞小鼠模型中，Fransioli等人证明c-kit+细胞(是干细胞)在梗塞后在梗塞区域积累1～2周，很有可能帮助修复过程(Fransioli等人，2008)。Dawn等人报道了骨髓衍生的Sca-1+/Lin-/CD45-非常小胚胎样干细胞(VSELs)的潜在治疗用途。在心肌梗塞(MI)小鼠模型中，移植相对少量的CD45-VSELs足以改善左心室功能并缓解MI后肌细胞肥大(Dawn等人，2008)。
[0380] 修复并缓解缺血性中风后炎症
[0381] Schwarting等人在缺血性脑注射小鼠模型中研究了绿色荧光肽标记的Lin(-)-造血干细胞注射在梗塞面积、凋亡细胞死亡、缺血后炎症和细胞因子基因转录中的影响。注射后24小时，在脾中发现了该细胞，随后在表达小神经胶质标志蛋白但不表达神经标志蛋白的缺血脑实质中发现了该细胞。组织注射评价表明，在Lin(-)-造血干细胞治疗的动物中，梗死体积显著变小，梗死区域周围凋亡神经细胞死亡减少。缺血半球中免疫细胞渗入分析表明，在接受治疗的小鼠中侵入T细胞和巨噬细胞减少(Schwarting等人，
2008)。早先，Imitola等人已经报道了神经元干细胞通过SDF-1α/CXCR4通路被吸引到中枢神经系统(CNS)损伤部位。
2008)。早先，Imitola等人已经报道了神经元干细胞通过SDF-1α/CXCR4通路被吸引到中枢神经系统(CNS)损伤部位。
[0382] 根据这些发现，从骨髓中动员足够数量的干细胞有可能有助于诱导修复过程(Tang等人，2007)。阻断SDF-1或其受体CXCR4是在该领域一种有前途的方法，因为该方法将多种干细胞从骨髓中动员出来。执行例行试验的本领域技术人员能够确定正确的剂量、给药方案以及动员试剂的可能定位，其中优选对所述干细胞进行动员，但其仍能够对趋化信号产生响应，因此能将它们募集到损伤组织部位。
[0383] 因为本发明的SDF-1结合核酸分子抑制SDF-1和SDF-1受体之间的信号传导，所以这种SDF-1结合核酸分子能用于制备药物，用于将祖细胞和/或干细胞动员到外周血中，和/或用于治疗疾病和/或病症，所述疾病和/或病症优选自伤口愈合、烧伤、损坏的器官组织和/或损坏的脉管系统所引起的或相关的疾病，所述疾病选自视网膜和脉络膜损伤、中风、心肌损伤、心肌梗塞、器官移植后缺血和跌打损伤；以及造血疾病，所述疾病选自再生障碍性贫血、白血病、药物所致贫血和白细胞减少，和白细胞减少中的细菌感染。
[0384] 对于祖细胞和/或干细胞的动员，所述药物能和第二种药物活性试剂联用，其中所述第二种药物活性试剂的功能是动员祖细胞和/或干细胞。细胞动员试剂选自但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(简称为GM-CSF)、白细胞介素8(IL-8)、巨噬细胞炎性蛋白质(简称为MIP)、生长相关癌基因、象AMD3001这样的CXCR4阻断试剂(Aiuti，Webb等人1997)和粒细胞集落刺激因子(简称为G-CSF)。
[0385] 对于CNS损伤，使用大分子SDF-1抑制剂来动员骨髓衍生干细胞有可能是特别有益的。同时，所述细胞仍然对SDF-1梯度敏感，只要体内维持足够高的大分子SDF-1抑制剂浓度，在周缘组织中将掩蔽这种敏感性。但是，因为大分子SDF-1抑制剂不能通过脑血屏障，CNS中继续存在源自于过表达SDF-1的CNS缺氧或损伤部位的SDF-1梯度，并将部分被动员的细胞吸引到损伤部位，在该部位这些细胞能发挥如上所述的功能。在优选的实施方式中，所述大分子SDF-1抑制剂是本发明的核酸分子。
[0386] SDF-1阻断和化学治疗的组合
[0387] 传统的化学治疗无法治疗约20％的B-系急性淋巴细胞性白血病。使用与基质细胞共培养的离体白血病细胞的临床前实验提供证据：成白血病细胞与骨髓成分的相互作用保护白血病细胞抵抗化学治疗(Mudry，Fortney et al.2000；Garrido，Appelbaum et al.2001；Tabe，Jin et al.2007)。还有有关小鼠模型的报道称：对于细胞粘附重要，由此对于(恶性)造血细胞归巢重要的细胞表面分子的抑制提升化学治疗的效力，并导致白血病干细胞的根除(Matsunaga，Takemoto et al.2003；Jin，Hope et al.2006)。已知SDF-1在骨髓小生境中干细胞的归巢和维持中发挥重要作用。不断增加的临床前证据和1个临床证据表明：阻断CXCR4(造血细胞上SDF-1的受体)还导致急性骨髓性成白血病细胞从骨髓释放到外周血中，在那里它们可被化学治疗(例如通过阿糖胞苷制剂)(Fierro，Brenner et al.2008)或其他导致肿瘤细胞死亡的制剂(例如仅生物制剂，或者与抗性依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性)靶向。此外，Jin等人最近发现，用酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼)治疗慢性髓性白血病导致白血病细胞上CXCR4的上调。这导致骨髓归巢增加，并诱导G0～G1循环(使细胞静止)阻断，并对进一步化学治疗方法不敏感(Jin，Tabe et al.2008)。本发明提示了化学治疗剂与CXCR4或SDF-1抑制剂(如本发明的SDF-1结合核酸分子，包括但不限于NOX-A12-JE40)的联合治疗，以降低白血病细胞的骨髓归巢，并移动尚未归巢到骨髓的静止的白血病细胞。由于丢失小生境信号，细胞可沿着细胞循环进展，从而对化学治疗更敏感。所用的化学治疗及相应制剂为本领域熟知，例如抗体(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗)；烷化剂(例如顺铂和卡铂，及奥沙利铂、氮芥)；环磷酰胺、苯丁酸氮芥；抗代谢剂(例如嘌呤硫唑嘌呤、巯基嘌呤)；植物碱和萜(例如长春花生物碱和紫杉烷)；鬼臼毒素；埃博毒素(Epothilone)；和拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱)。
[0388] 因此，本文公开的药物可用于使癌细胞移动到受试者外周血中，其中所述癌细胞选自但不限于：白血病细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、癌干细胞、具有转移潜力和发生癌转移的癌细胞。
[0389] 本发明的药物可与用于使癌细胞移动到受试者外周血中的第二药物或第二药学活性剂联用。所述第二药学活性剂包含本文以上公开的移动剂。
[0390] 本发明的药物可与第三药物或第三药学活性剂联用，其中所述第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记(所述)癌细胞。所述摧毁癌细胞的药剂优选选自但不限于：抗体(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗)；烷化剂(例如顺铂和卡铂，及奥沙利铂、氮芥)；环磷酰胺、苯丁酸氮芥；抗代谢剂(例如嘌呤硫唑嘌呤、巯基嘌呤)；植物碱和萜(例如长春花生物碱和紫杉烷)；鬼臼毒素；埃博毒素(Epothilone)；拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱)。
[0391] 所述第三药物或药学活性剂具有或可提供化学治疗功能。
[0392] 药物标记癌细胞导致机体针对由此标记的癌细胞的防御的活化，其中标记所述癌细胞的药物选自但不限于：单克隆抗体。它们通过靶向肿瘤特异性抗原而起作用，由此增强宿主针对制剂本身附着的肿瘤细胞的免疫应答。例子是曲妥珠单抗(商品名：赫赛汀)、西妥昔单抗、和利妥昔单抗(商品名：Rituxan或美罗华)。
[0393] 本发明的药物可与第二和/或第三药物进行联合治疗。
[0394] 经用于移动癌细胞的药物治疗的受试者可随后或同时经历放射性治疗。在一个实施方式中，放射性治疗可用作第三药物或第三药学活性剂的替代性治疗。
[0395] 本发明的药物(与或不与第二药物或第二药学活性剂联用，与或不与第三药物或第三药学活性剂联用，与或不与放射性治疗联用)可用于治疗和/或预防癌，优选为实体瘤和血液恶性肿瘤，更优选为白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，其中本发明的药物优选与第三药物或放射性治疗联用。
[0396] 自身免疫疾病中的长寿浆细胞、B细胞和记忆T细胞移动
[0397] B细胞、和/或记忆T细胞从身体回到骨髓或可能其他位置(例如淋巴结)，并以SDF-1梯度(通过基质细胞的SDF-1表达)保持在那里(Parretta，Cassese et al.2005；Zhang，Nakajima et al.2005；Radbruch，Muehlinghaus et al.2006)。在该小生境中，这些细胞处于休眠状态，它们对正常用于治疗自身免疫疾病的改善疾病的药物(例如细胞稳定药或甲氨蝶呤)不敏感。它们一旦离开所述小生境，它们就分化，并开始组建更新的免疫应答(如果遇到它们的识别抗原)导致续存的自身免疫疾病。用SDF-1结合核酸或CXCR4阻断干扰骨髓或其他小生境中的SDF-1梯度可导致B细胞和/或T细胞移动，并通过成分输血，或用合适的药物靶向它们而使它们从血中耗尽。
[0398] 在用通过终极分化的B细胞(浆细胞)的活性抗体产生的急性免疫应答后，大部分这些细胞由于炎症分解货外源抗体(例如病毒蛋白)消除而死亡。但有少部分记忆B细胞在T细胞的辅助下转回成浆细胞。这些成浆细胞具有响应趋化性刺激而迁移到小生境的能力，在那里它们作为长寿“记忆”浆细胞而存活数年。所述转变过程中，所述细胞丢失CXCR5和CCR7的表达，且不再向响应的配体迁移。但保持CXCR4的表达。因此，细胞向SDF-1表达位点移动，在那里它们遇到区别于或互补于SDF-1的长寿存活信号(Minges Wols et al，2007)。这些小生境可在骨髓和外围(例如发炎组织)中。所述长寿浆细胞最有可能负责保护性抗体血浆滴度的维持(其长在感染或接种后维持数年)(Tarlinton et al，2008)。浆细胞不如B或T细胞对疾病改善药物易感，最有可能由于它们不分裂。而且，它们不能被抗-CD20抗体治疗靶向，因为浆细胞不带有CD20。在浆细胞和长寿浆细胞分泌的自身抗体维持的自身免疫疾病中，除去这些细胞是有利的，由此免疫系统会停止攻击自身组织。可通过成分输血(例如使用亲和基质(例如层析柱或珠)上的抗CD138(多配体蛋白聚糖-1)抗体)实施从患者血中耗尽浆细胞的方法(Minges Wols&Witte，2008；Wijdenes et al，
1996)。为不仅消除循环浆细胞，还消除定居的长寿浆细胞，将后者从它们小生境中移除是有利的。这可通过全身施用本发明的SDF-1结合核酸来进行，所述本发明的SDF-1结合核酸摧毁SDF-1梯度，并将向SDF-1运动的细胞移动到外周血中。
1996)。为不仅消除循环浆细胞，还消除定居的长寿浆细胞，将后者从它们小生境中移除是有利的。这可通过全身施用本发明的SDF-1结合核酸来进行，所述本发明的SDF-1结合核酸摧毁SDF-1梯度，并将向SDF-1运动的细胞移动到外周血中。
[0399] 因此，本发明的药物可用于将长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到受试者外周血中。
[0400] 跟发明的药物可与第二药物或第二药学活性剂联用，所述第二药物或第二药学活性剂可用于将长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到受试者外周血中。所述第二药物或药学活性剂包含本文前述但不限于此的细胞移动剂。
[0401] 当仅用本发明的药物，或与上述第二药物或药学活性剂联用移动细胞时，可通过成分输血、细胞分选、和/或流式细胞术(例如用合适的长寿浆细胞、B细胞或T细胞表面标记物进行荧光活化的细胞分选【FACS】和/或磁活化的细胞分选【MACS】)从血中清除所述细胞。
[0402] 此外，本发明的药物可与第三药物或第三药学活性剂联用，其中所述第三药物或第三药学活性剂损伤、摧毁和/或标记外周血中的长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞。所述摧毁长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的药物选自但不限于疾病改善药物(例如甲氨蝶呤或细胞毒性剂)。产生机体针对标记的长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的防御活化的标记长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的药物的例子包括但不限于选自：利妥昔单抗、IL-6受体结合抗体或多配体蛋白聚糖-1结合抗体。
[0403] 可进行本发明的药物与第二和/或第三药物的联合治疗。
[0404] 用本发明的移动长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的药物根据本发明治疗的受试者可随后或同时经历损伤或摧毁患者免疫系统的分化细胞(最终攻击自身)的放射性治疗。放射性可用作第三药物的替代性治疗。本发明的药物(与或不与第二药物或第二药学活性剂联用，与或不与第三药物或第三药学活性剂联用，与或不与放射性联用)可用于治疗和/或预防自身免疫疾病，仅移动长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞，或在更复杂的治疗概念中可有利于治疗各种疾病包括但不限于：
[0405] ●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
[0406] ●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
[0407] ●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
[0408] ●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
[0409] ●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
[0410] ●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；和/或
[0411] ●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病。
[0412] 此外，本发明的药物(与或不与第二药物或第二药学活性剂联用)可用于治疗和/或预防骨髓移植后的移植物抗宿主病和移植器官的抑制排斥，其中该器官优选选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管和胰腺。
[0413] 在过敏性气道病小鼠模型中，靶向白细胞上的CXCR4抗体降低气道高应答性和肺嗜酸性粒细胞增多，表明CXCR4介导的信号贡献于肺炎(Gonzalo，Lloyd et al.2000)。还有证据证明SDF-1贡献于血管形成。临床和实验证据表明渗入皮肤的白细胞在特应性皮炎的发作和维持中发挥关键作用，且发现SDF-1是T-淋巴细胞和树突细胞的募集的重要因子(Gombert，Dieu-Nosjean et al.2005)。因为白细胞(特异性地为T细胞)表达SDF-1受体(CXCR4)，且趋化性地响应SDF-1梯度，由SDF-1结合破坏这些梯度，且本发明的中和核酸适于辅助具有超越炎症(是非细菌或病毒源)的炎症疾病，肺和/或皮肤炎症，优选银屑病。
[0414] 类风湿性关节炎是通常始于手和足的小关节的潜在的全身性自身免疫疾病。其标志是滑膜炎，其特征是白细胞(尤其是巨噬细胞、T细胞和B细胞)渗入膜和周围组织。此过程及蛋白酶和促炎细胞因子的分泌导致滑膜增厚，及海绵组织生长(称为血管翳)。它围绕关键增生，并侵入骨和软骨，导致不可逆的破坏。所述血管翳引发用于其自身供血的新生血管形成。Iwamoto等人最近发现在RA患者的滑膜组织和滑膜液中选择了大量趋化因子，SDF-1即在其中(Iwamoto et al，2008)。之前已显示通过将RA患者的滑膜液加入培养的成纤维细胞样滑膜细胞来体外上调SDF-1。所述液体或加入IL-17诱导了滑膜细胞的SDF-1mRNA表达。SDF-1表达的诱导可通过加入抗-IL17抗体来消除(Kim et al，2007)。在发炎的关节中，SDF-1可发挥三重作用。第一作为白细胞化学吸引剂，第二作为血管形成中需要的内皮祖细胞吸引剂，第三作为下游生长因子(例如VEGF)表达的引发剂，导致新生血管系统生长。
[0415] 基于这些实验，发明人推测，用于抑制白细胞优选从外周血迁移到组织的药物可治疗和/或预防下列疾病和/或病症。
[0416] 白细胞迁移可被移植器官的非自身抗原启动，其中所述移植器官选自：肝、肾、小肠、肺、心、皮肤、肢、角膜、胰岛、骨髓、血管和胰腺。因此，导致白细胞迁移抑制的药物可用于预防和/或治疗本文公开的移植器官的移植排斥。
[0417] 此外，白细胞迁移可被下列中发生或与下列的炎症启动：
[0418] ●全身性自身免疫疾病，其中该全身性自身免疫疾病优选选自：过敏、暖和冷自身免疫溶血性贫血、全身性炎症应答综合征、出血性休克、I型糖尿病、弥散性硬皮病、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、系统性红斑狼疮及其表现、类风湿性关节炎，眼、脑、肺、肾、心、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其他器官中的风湿病；
[0419] ●胃肠道自身免疫疾病，其中该胃肠道自身免疫疾病优选选自：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、谷蛋白耐受不良、炎性肠病、胰腺炎、嗜酸性粒细胞性食管炎；
[0420] ●皮肤自身免疫疾病，其中该皮肤自身免疫疾病优选选自：银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、局限性/线性硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎或杜林氏病、硬化性苔藓；
[0421] ●血管自身免疫疾病，其中该血管自身免疫疾病优选选自：血管炎类，优选为颞基动脉炎、血管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、变应性肉芽肿综合征、高安动脉炎、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、贝赫切特氏病，其中所述肺出血-肾炎综合征优选主要影响肾，更特异性地影响肾小球，及/或也主要影响肺；
[0422] ●神经系统自身免疫疾病，其中该神经系统自身免疫疾病优选选自：多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、神经认知性功能障碍、僵体综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征；
[0423] ●肌骨自身免疫疾病，其中该肌骨自身免疫疾病优选选自：强直性脊柱炎、结节病、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿性关节炎、莱姆病、反应性关节炎、脊椎关节炎、退行性关节病；和/或
[0424] ●其他自身免疫疾病，其中该其他自身免疫疾病优选选自：科根综合征、自身免疫性肾上腺炎、梅尼埃病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬化、 氏综合征、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、肾小球肾炎、抗-磷脂综合征、特发性肺纤维化、自身免疫性不育、免疫复体病和腹膜炎，其中所述硬皮病例如弥散性硬皮病、CREST综合征和/或局限性/线性硬皮病。
[0425] 因此，导致白细胞迁移抑制或降低的药物可用于预防和/或治疗本文公开的自身免疫疾病中发生或与本文公开的自身免疫疾病关联的炎症。
[0426] 如在过敏性气道病小鼠模型中显示，导致白细胞迁移抑制的药物可有效治疗和/或预防皮肤和/或气道粘膜的过敏反应(优选花粉症、哮喘、气道高应答和/或皮炎(优选为接触性皮炎和/或特应性皮炎))。
[0427] 用本发明的核酸移动祖细胞和/或干细胞提供从受试者获得这些细胞的方法。因此给受试者施用有效量的本发明的核酸分子，导致祖细胞和/或干细胞移动到受试者外周血中。可通过成分输血、白细胞去除术、细胞分选和/或流式细胞术分别从受试者，从受试者外周血中收获所述细胞。
[0428] 在从受试者收获祖细胞和/或干细胞，所述受试者(优选为第一受试者)可随后或同时经历化学治疗或放射性治疗。
[0429] 化学治疗和放射性治疗通常影响快速分裂的细胞。它们用于处理癌，因为癌细胞比大多数健康细胞更频分裂。但由于骨髓细胞也频分裂，高剂量治疗可严重损伤或摧毁患者骨髓。如果无健康骨髓，患者不再能制造携氧所需的血细胞，抵抗感染和防止出血。外周血干细胞移植置换被处理摧毁的干细胞。健康的移植的干细胞可恢复骨髓产生患者所需的血细胞的能力。
[0430] 外周血干细胞移植最常用于治疗白血病和淋巴瘤。当白血病或淋巴瘤缓解(癌体征和症状已消失)时它最有效。外周血干细胞移植常用于治疗其他癌，例如成神经细胞瘤(发生于未成熟神经细胞的癌，最常影响婴儿和儿童)和多发性骨髓瘤。研究者评估了临床试验(研究)中的外周血干细胞移植，用于治疗各种类型的癌(NCI，2001)。
[0431] 如图41和43所示，可通过同种异体和/或自体造血干细胞移植(简称为HSCT)来治疗各种类型的癌如白血病和实体瘤，淋巴增生性病症和良性病症(例如自身免疫疾病、造血病症)(Gratwohl，Baldomeroet al.2002)。
[0432] 如果优选在第一受试者中随后进行化学治疗或放射性治疗，其中优选进行或施用化学治疗或放射性治疗，以损伤或摧毁肿瘤细胞，可将收获的优选第一受试者的祖细胞和/或干细胞反施用到优选第一受试者的外周血中。另外，第二受试者可将其收获的祖细胞和/或干细胞贡献给第一受试者，所述第一受试者具有低水平的祖细胞和/或干细胞，或在之前例如通过化学治疗或放射性治疗摧毁那些祖细胞和/或干细胞。
[0433] 所述方法可用于治疗癌，优选实体瘤、血液瘤或恶性肿瘤。
[0434] 自身免疫疾病包括但不限于，例如，红斑狼疮、类风湿性关节炎(优选重症)，治疗方法之一是成髓细胞或更选择性的成淋巴细胞治疗方案，并随后将造血系统返回患者(Burt，Marmont et al.2006)。用本发明的核酸分子(包括但不限于SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40)或用其他阻断SDF-1或其相应受体CXCR4的策略来固定用于造血系统移植的造血干细胞和造血祖细胞。
[0435] 另外，从血中收获造血干细胞/造血祖细胞，并在通过化学治疗和/或放射性治疗除去造血系统(自身反应性淋巴细胞)后用于重构患者免疫系统。这在原则上构建了对自身免疫疾病的治愈性治疗。
[0436] 用本发明的核酸移动长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞提供从受试者耗尽这些细胞的方法。由此，将有效量的本发明的核酸分子施用给受试者，使长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞移动到受试者外周血中。收获的T细胞优选为记忆T细胞。可通过本文公开的成分输血、白细胞去除术、细胞分选和/或流式细胞术分别从受试者、受试者外周血中除去所述细胞。优选用适合于所述细胞的表面标记物通过流式细胞术除去。
[0437] 收获祖细胞和/或干细胞及相应的长寿浆细胞、B细胞和/或T细胞的方法可用于治疗和/或预防本文公开的全身性自身免疫疾病、胃肠道自身免疫疾病、皮肤自身免疫疾病、血管自身免疫疾病、神经系统自身免疫疾病、肌骨自身免疫疾病及其他自身免疫疾病。
[0438] 糖尿病性肾病(简称为DN)末期肾病的主要成因。尽管抑制血管紧张素可在多数情况下阻止疾病进展，但对无应答的患者没有有效的治疗方法。在DN中，肾小球丛经历缓慢但进行性的结构重建，其特征是肾小球肥大、胞外小球膜基质的结节性和弥散性积累、及足细胞损伤。后者被认为负责早期微量白蛋白尿进展为显性蛋白尿和DN的晚期肾小球硬化。DN发作和进展涉及多种病理机制，包括：高级糖基化终产物耗尽、内皮功能障碍、及生长因子和促炎介质的局部表达增加。一般而言，趋化因子属于后一因子组，因为特定趋化因子在如DN，在其他类型的肾病中通过募集和活化免疫细胞促进炎症。例如，靶向删除或治疗性阻断单核细胞化学吸引蛋白MCP-1/CCL2可通过阻断巨噬细胞募集来阻止患I型或II型糖尿病(T1D/T2D)的小鼠肾小球的肾小球硬化(Chow et al，2007；Chow et al，2006；Kulkarni etal，2007)。
[0439] 有关DN中的SDF-1尚无了解。DN缺乏足细胞增生或自身免疫，因此，上述研究很难预测DN中SDF-1的主要功能。但发明人有理由推测，肾小球结构进行性重建为肾小球硬化(创伤愈合的形态学变化)可涉及SDF-1信号转导。基于来自其他疾病状态的可用数据，似乎仍不清楚SDF-1是否主要例如通过维持组织整合和支持再生来抵抗DN，或SDF-1是否主要例如通过增强肾小球硬化来促进DN。在实施例12中，发明人的在糖尿病性肾病小鼠模型中将SDF-1结合核酸NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)用作本发明的核酸分子的代表性分子的数据支持后者，其揭示了肾小球硬化的新病理机制，并将SDF-1作为DN中潜在的治疗靶。因此，NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)可用作治疗或预防糖尿病性肾病的治疗剂。作用机制还可潜在被骨髓衍生的祖细胞和/或干细胞的移动调节(Ito et al，2001)。因此，本文公开的SDF-1核酸可用于制造药物，其中所述药物用于治疗和/或预防肾病，且优选为糖尿病性肾病。
[0440] 肺动脉高压
[0441] 肺性高血压(简称为PH)是一系列对病因知之甚少的疾病，其特征是肺动脉压升高，进行性右侧心力衰竭和最终死亡。PH由小肺阻力动脉内膜增厚所致，所述小肺阻力动脉内膜增厚至少部分由内皮和平滑肌细胞功能障碍和增生所致。增加的血管内皮细胞增生和血管肌组织化是肺血管重建的病理学特征，且还证实此过程与低氧诱导的血管生成因子、炎性介质和血管收缩剂的产生有关。Yamaji-Kegan等人发现，在离体培养小鼠肺器官研究中，CXCL12/SDF-1上调，且涉及通过过表达的低氧诱导的有丝分裂因子(简称为HIMF)的循环细胞的肺内募集(Yamaji-Kegan，Su et al.2006)。已经描述了SDF-1在通常血管重建河肺动脉高压中的作用(Schober and Zernecke2007)。因此，用本文公开的SDF-结合核酸阻断SDF-1可用于治疗和/或预防高血压，优选为肺性高血压，更具体为肺动脉高压。
[0442] 特发性肺纤维化
[0443] 描述患特发性肺纤维化的患者的肺组织的兼表达SDF-1和CXCR4的细胞数比正常肺多。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，Xu等人得到的数据显示施用CXCR4拮抗剂(TN14003)显著减缓肺纤维化(Xu，Mora et al.2007)。因此，用本文公开的SDF-结合核酸阻断SDF-1可用于治疗和/或预防特发性肺纤维化。
[0444] 创伤愈合中的纤维化
[0445] 灼伤后，大鼠、猪和人皮肤显示出SDF-1过表达。在伤后短期有益，但认为其促进白细胞吸引(例如嗜酸性粒细胞)和纤维化，而非促进上皮形成(Avniel，Arik et al.2006)。通过用本文公开的SDF-1结合核酸抑制CXCR4或SDF-1，可至创伤愈合中纤维化减少。
[0446] 如上所述，已知SDF-1涉及眼组织新生血管形成过程中内皮细胞向脉络膜归巢，其中这些细胞的实际作用仍待研究(Sengupta，Caballero et al.2005)。但发明人在2个独立的动物模型中显示，用本文公开的本发明的SDF-1结合核酸阻断SDF-1导致新生血管形成降低。
[0447] 使用“激光诱导的脉络膜新生血管形成”动物模型预测所研究药物对人视网膜和脉络膜新生血管形成的作用。其发生在疾病，如潮湿或“增生性”老年性黄斑退化(AMD)、糖尿病性视网膜病和视网膜静脉闭塞。发现CXCR4在激光诱导的CNV中表达(Lima e Silva et al.，FASEB J.21：，2007)。与表达CD45和F4/80的细胞共定位，提示这些细胞是源于BM的巨噬细胞。抑制CXCR4降低激光诱导的CNV。但未研究CXCR4细胞也表达SDF1的情况。如本文实施例11中所示，作为本发明的代表性核酸分子的SDF-1结合核酸NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)阻断CNV动物模型中的新生血管形成。
[0448] 氧-诱导的视网膜病小鼠模型是模拟低氧诱导的视网膜新生血管形成(如在DR(尤其是增生性DR)和AMD中观察到的)的模型(Smith，Wesolowski et al.1994)。所述模型还被称为早产儿视网膜病，因为放到医院育婴箱中的早产儿由于育婴箱中太高的氧暴露(在育婴箱期间，以及在回到含氧量正常的条件后)导致异常视网膜血管生长而眼盲。如实施例14中所述，作为本发明的代表性核酸分子的SDF-1结合核酸NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)在小鼠模型中显著抑制丛形成，从而如第17天所观察到的提高总视网膜评分。
[0449] 而且，如实施例9中所示，在标准血管形成器官培养测定(主动脉环萌发测定)中，作为本发明的代表性核酸分子的SDF-1结合核酸193-G2-012-5’-PEG(NOX-A12-JE40)(SEQ ID NO：132)阻断SDF-1诱导的萌发。
[0450] 因此，本文公开的SDF-1结合核酸可用于制备药物，其中所述药物用于治疗涉及血管形成和/或新生血管形成(优选为脉络膜新生血管形成)的疾病和/或病症。新生血管形成动物模型显示，本文公开的SDF-1结合核酸可用作治疗选自下列的疾病和/或病症的药物：视网膜病，优选老年性黄斑退化、糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、黄斑水肿和视网膜水肿。
[0451] 新生血管形成优选在本文中被定义为灌注红细胞的功能性微血管网络的形成。新生血管形成与血管形成的不同之处在于：血管形成的主要特征在于毛细管芽的突出和外生，及由预成血管的萌发。
[0452] 抑制视网膜血管水肿
[0453] 在老年性黄斑退化(AMD)、糖尿病性视网膜病和视网膜血管闭塞过程中常观察到黄斑水肿形成。通常情况下，局部血管渗透性增加是水肿形成的原因。这常是改变血管结构的炎症过程或未成熟的渗漏的新血管系统形成的结果。
[0454] 黄斑水肿形成可导致视敏度快速退化，因为视网膜营养供给及其他信号转导分子损伤。
[0455] SDF-1贡献于多种可导致水肿形成的因子。通过抑制紧密连接蛋白闭合素的表达(Butler et al，2005)，血管壁可松弛。其进一步引发白细胞入侵，其可生成促炎环境，且可刺激VEGF表达(Liang et al，2007；Salcedo et al，1999)，其最初被称为“血管渗透因子”，因其存在导致渗漏血管形成。
[0456] 还不清楚用本文公开的SDF-1-结合核酸抑制SDF-1会产生任何生理作用，因为仅SDF-1在健康眼中低水平表达(Limae Silva et al，2007)。
[0457] 在VEGF诱导的视网膜血管渗透性兔模型中检验了一种SDF-1-结合核酸。用荧光仪观察到的渗透性并非由玻璃体内VEGF注射的直接短期作用所致，而使级联(引发及应答更慢)所致(Edelman et al，2005)。SDF-1-结合核酸以剂量依赖性方式显著降低视网膜血管渗透性。
[0458] 互补于VEGF抑制失败或在VEGF抑制失败后的血管形成抑制
[0459] 最近，Reddy等人显示，SDF-1甚至在极少VEGF存在想也可促进肿瘤血管生长。这似乎是第二条不依赖于VEGF的促进新生血管形成的通路(Reddy，Zhou et al.2008)。用SDF-1结合核酸(例如本发明的SDF-1结合核酸)干扰SDF-1信号转导可作为抗血管形成治疗有利。这尤其可在抗-VEGF无应答者、抗-VEGF治疗难治患者，或在与抗VEGF药(用于所有涉及血管形成的并发症，更具体而言为增生性视网膜病，其中所述增生性视网膜病选自AMD、DR和视网膜静脉闭塞；及癌，优选为实体瘤和转移)的联合治疗中有优点。
[0460] 抑制VEGF功能的药物包括但不限于：贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)、哌加他尼(Macugen)和Ranibizumab(Lucentis)。
[0461] 目前，本文公开的SDF-1结合核酸可用于制备药物，其中所述药物用于与抑制VEGF的药物进行联合治疗，和/或用于对抑制VEGF的药物治疗反应弱或无的受试者。弱响应任意与本申请和任意方面和实施方式有关的治疗，诸手段在此情况下未实现疾病缓解。
[0462] WHIM综合征
[0463] WHIM综合征是一种免疫缺陷，常以截短形式的CXCR4受体为特征。这导致对受体陪体SDF-1(CXCR-12)的敏感度增加，从而导致更强的趋化性。因此，为实现正常干细胞运输，用SDF-1阻断剂(如本发明的SDF-1结合核酸)或用CXCR4受体阻断剂来降低体内生物学上有活性的SDF-1浓度是有利的(Lagane，Chow et al.2008)。
[0464] 可通过成分输血、细胞分选和流式细胞术从机体(优选从血液)分离和/或耗尽细胞(如祖细胞和/或干细胞、长寿浆细胞、记忆B细胞和/或记忆T细胞)。
[0465] 成分输血是使受试者血液通过分离出特定成分或成分组，并将其余部分返回循环系统的设备的技术。取决于待除去的物质和/或细胞，在成分输血中使用了不同方法，包括：干细胞收获、吸附及亲和层析。
[0466] 白细胞去除术是从血样中分离白细胞的实验室操作。可进行此操作减少患癌(白血病)的个体中极高的白细胞计数，或除去输液用白细胞。
[0467] 细胞分选是将混和细胞群分离成两个以上的群的方法，例如流式细胞术，优选荧光活化的细胞分选(FACS)和磁-活化的细胞分选(FACS)。
[0468] 流式细胞术是计数、检验和分选显微颗粒(如悬浮于液流中的不同细胞群)的技术。这使可对流过光学和/或电子检测设备的单个细胞的物理和/或化学特征进行同时多参数分析。荧光活化的细胞分选是特殊类型的流式细胞术。这提供将异源生物细胞混合物分选入两个以上的容器(一次一个细胞，基于各细胞的特定光散射和荧光特征)中的方法。可通过将颗粒/细胞与结合颗粒/细胞的荧光染料温育进行对颗粒/细胞的荧光染色。这是有用的科学仪器，因其提供快速、客观和定量的个体细胞的荧光信号及特定目的的细胞物理分离的记录。缩写FACS由Becton Dickinson注册商标及拥有。磁-活化的细胞分选(MACS)Miltenyi Biotec为依赖于表面抗原(CD分子)分离各种细胞群的方法注册的商标名。因此，将待分离细胞混合物育包被抗特定表面抗原的抗体的磁珠温育。这使表达所述抗原的细胞粘附到磁珠上。然后，将细胞溶液转移到置于强磁场的层析柱上。在此过程中，粘附到珠上的细胞(表达抗原)停留在层析柱上，而其他细胞(不表达抗原)流过。用此方法，可用相应的特定抗原阳性或阴性分离所述细胞。
[0469] 再一实施方式中，所述药物还包含药学活性剂。所述进一步的药学活性化合物可为本领域已知的药学活性化合物，优选选自趋化因子或细胞因子拮抗剂、皮质类固醇等。本领域技术人员已知，假设用本发明的核酸根据本发明治疗各种适应症，所述进一步的药学活性剂可为原则上适于治疗和/或预防所述疾病的任一药学活性剂。本发明的核酸分子(尤其是假设存在的或用作药物的)优选与下列单独制剂或它们的组合制剂联用：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、PIXY-321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、干细胞因子、血小板生成素和生长相关的癌基因。
[0470] 此外，所述其他药学活性剂也可为本发明的其他核酸。所述药物也可再包含至少一种与不同于SDF-1的靶分子结合或表现出不同于本发明的核酸之一的功能的核酸。
[0471] 本领域技术人员将公认：确实可在任何可通过将针对SDF-1的拮抗剂施用给需要所述结抗剂的患者，且所述拮抗剂适合于消除疾病或病症的病因或至少可减少来自疾病或病症的效应的疾病中使用本发明的核酸。所述效应包括但不限于：病理性新生血管形成、炎症和转移。本发明的核酸适用于所述及其他说明书导言部分所述尤其由SDF-1参与所致的疾病或病症(将其通过引用并入本文，以避免任何不必要的重复)。
[0472] 在本发明的药物的一实施方式中，将所述药物与其他疗法联合应用于本文公开的任一种疾病，尤其是待用本发明的药物进行治疗的疾病。
[0473] “联合疗法”(或“综合疗法”)包括施用本发明的药物和至少第二试剂(作为具体治疗方案的一部分)，以期望通过这些治疗剂(即本发明的药物和所述第二试剂)的共同作用提供有益效应。这种联合的有益效应包括但不限于由治疗剂的联合所致的药物动力学或药效动力学共同作用。通常在限定的时间内完成所述治疗剂的联合施用(通常为数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选联合)。
[0474] “联合疗法”可旨在包括(但通常不包括)分别独立施用两种或多种所述治疗剂，所述分别独立施用偶尔也可导致本发明的联合。“联合疗法”旨在包括连续施用这些治疗剂，即在不同时间施用其中各治疗剂，和基本上同时施用这些治疗剂或所述治疗剂中的至少两种。可例如通过给受试者施用以固定比例含有各治疗剂的单胶囊或多个各治疗剂的单、多胶囊实现基本上同时给药。
[0475] 可通过任何合适途径实现各治疗剂的依次给药或基本上同时给药，所述途径包括但不限于：局部途径、口服途径、静脉内途径、肌内途径和经过粘膜组织直接吸收。可通过相同途径或不同途径施用所述治疗剂。例如，可注射施用所选联合剂的第一种治疗剂，并可局部施用所述联合剂中的其他治疗剂。
[0476] 此外，也例如可局部施用所有治疗剂，或可注射施用所有治疗剂。除非另有说明，所述治疗剂的施用顺序不严格重要。“联合疗法”还可包括将上述治疗剂再与其他生物活性成分联合施用。如果联合疗法还包括非药物治疗，则可在能从治疗剂和非药物治疗的联合的共同作用中获得有益效应的任何合适时间实施所述非药物治疗。例如，在适当的情况下，在非药物治疗时隔治疗剂的施用或许有几天或甚至几周时，仍能达到有益效应。
[0477] 如在上述通用术语中所论述，原则上可以本领域技术人员已知的任何形式施用本发明的药物。优选的施用途径是全身施用，更优选通过肠胃外施用(优选通过注射)。此外，也可局部施用所述药物。其他施用途径包括肌内、腹膜内和皮下、经口、鼻内、气管内或肺部施用，优选侵入性最低并同时确保效力的施用途径。
[0478] 肠胃外施用通常被用于皮下、肌内或静脉内注射和输注。另外，一种用于肠胃外施用的方法采用了本领域技术人员熟知的缓释或持续释放系统的植入，其确保维持恒定的剂量水平。
[0479] 此外，可通过局部使用合适的鼻内媒介物(vehicle)、吸入剂以鼻内形式施用本发明的优选药物，或可采用那些本领域技术人员所熟知的透皮贴剂的形式通过经皮途径施用本发明的优选药物。欲以透皮递送系统形式给药，(当然)要在整个给药过程中连续而非间歇给药。其他优选的局部制剂包括乳膏剂、软膏剂、洗剂、气雾喷雾剂和凝胶剂，其中活性成分的浓度范围通常将是0.01％～15％(w/w或w/v)。
[0480] 除了对受试者直接给药以外，本发明优选的药物能用于离体(exvivo)治疗方案，用于制备细胞培养物，随后用于补充受试者血细胞。收集自外周血或骨髓的自体细胞或匹配的捐献者的异体移植物可用于离体治疗。本领域技术人员可以确定本发明优选药物或其与其它试剂(例如巨噬细胞炎性蛋白)联用的浓度。
[0481] 将对本发明的方法产生较好响应的受试者包括医学和兽医受试者，包括病人。可使用本发明的方法的其他受试者为猫、狗、大型动物、禽类(例如鸡)等。总之，所有受试者都会受益于祖细胞和/或干细胞升高，或者说，需要祖细胞和/或干细胞的干细胞移植受试者适合接受本发明的治疗。
[0482] 可以被本发明的方法缓解，或者说受益于本发明的方法的典型状况包括：造血疾病，例如再生障碍性贫血、白血病、药物所致贫血和化疗或放疗导致造血缺陷。本发明的方法还可用于增加免疫抑制治疗同时或之后进行的移植的成功率，并能使伤口愈合更高效，用于治疗细菌性炎症。本发明的方法还可进一步用于治疗免疫减弱的受试者，或免疫系统受到其它损伤的患者。可以被本发明的方法缓解，或者说受益于本发明的方法的典型状况包括反转录病毒感染的受试者，更具体的说是被人免疫缺陷病毒(HIV)感染的受试者。因此本发明的方法可用于广泛的状况，对于所述状况，受试者的祖细胞和/或干细胞增加是有益的，或者收集祖细胞和/或干细胞用于随后的干细胞移植将是有益的。
[0483] 在一实施方式中，还将通过本发明的核酸动员骨髓干细胞用于心肌再生。
[0484] 本发明的药物将通常包含溶解或分散于药学可接受的介质中的有效量的治疗活性成分，包括但不限于本发明的核酸分子。药学可接受的介质或载体包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。本领域熟知用于药学活性物质的所述介质和制剂的应用。也可将补充的活性成分掺入本发明的药物中。
[0485] 本发明再一方面涉及药物组合物。所述药物组合物包含至少一种本发明的核酸，且优选包含药学可接受的粘合剂。所述粘合剂可为本领域使用和/或已知的任何粘合剂。所述粘合剂更特别是任何有关本文公开的药物的制备过程中论述的粘合剂。再一实施方式中，所述药物组合物包含其他药学活性剂。
[0486] 根据本公开，本领域技术人员将知道药物和药物组合物的制备。通常可将所述组合物制成注射剂(作为液体溶液或悬浮液)；制成适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式；制成用于口服施用的片剂或其他固体剂；制成定时释放胶囊；或制成当前使用的任何其他形式，包括滴眼剂、乳膏剂、洗剂、油膏剂、吸入剂等。由外科医生、内科医生或卫生保健工作者使用无菌制剂(例如基于盐水的洗液)来处理手术区中的特定区域也特别有用。也可通过微型装置、微颗粒或海绵运输组合物。
[0487] 配制后，将药物以与剂量制剂相容的方式施用，并施用药理学有效量。可易于以各种剂型(例如上述可注射溶液的类型)施用所述制剂，但也可采用药物释放胶囊等。
[0488] 在所述情形中，待施用的活性成分的量和组合物体积取决于待治疗的个体或受试者。给药所需的活性化合物的具体量取决于从业者的判断，且特异于每个个体。
[0489] 通常利用分散活性化合物所需的最小体积的药物。合适的施用方案也是可变的，但可以开始施用所述化合物并监测结果，然后再以进一步的时间间隔提供进一步的受控剂量表示。
[0490] 例如，当以片剂或胶囊(例如明胶胶囊)形式口服施用时，可将活性药物成分(即本发明的核酸分子)和/或任何其他药学活性剂(在本文中也被称为治疗剂或活性化合物)与口服的、无毒的、药学可接受的惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)相组合。而且，当期望或需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入所述混合物。合适的粘合剂包括淀粉，硅酸镁铝，淀粉浆，明胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖类(例如葡萄糖或β-乳糖)，玉米增甜剂，天然和合成的树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠)，聚乙二醇，蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。崩解剂包括但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐、或泡腾混合物等。稀释剂包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸。
[0491] 还可以诸如定时释放和缓释片剂或胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂的口服剂型施用本发明的药物。有利地由脂肪乳浊液或悬浮液制备栓剂。
[0492] 药物组合物或药物可为经灭菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、促溶剂(solution promoter)、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可包含其他在治疗上有价值的物质。根据常规混合、粒化或包被方法制备组合物，且所述组合物通常含有约0.1％～75％，优选约1％～50％的活性成分。
[0493] 可通过例如溶解、分散等制备液体(尤其是可注射的)组合物。将活性化合物溶解于药学纯溶剂(例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等)中或与之混合，从而形成可注射的溶液或悬浮液。另外，可配制适合于在注射前溶解于液体中的固体形式。
[0494] 对于固体组合物，赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。还可用例如聚亚烷基二醇(如丙二醇)作为载体将上文限定的活性化合物配制成栓剂。在一些实施方式中，有利地由脂肪乳浊液或悬浮液制备栓剂。
[0495] 也可以脂质体递送系统(例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡)的形式分别施用本发明的药物和核酸分子。脂质体可由各种磷脂(包含胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱)构成。在一些实施方式中，将脂质成分的薄膜与药物水溶液水合而形成包裹所述药物的脂质层，这是本领域技术人员熟知的。例如，可以用本领域已知方法与亲脂化合物或非免疫原性高分子量化合物构建的复合物形式提供本文所述的核酸分子。另外，脂质体可在其表面携带所述核酸分子，以便用于靶向和在内部携带细胞毒性剂而介导细胞杀伤。美国专利6,011,020中提供了核酸相关复合物的实例。
[0496] 也可分别将本发明的药物和核酸分子与作为可定靶药物的载体的可溶聚合物相偶联。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或经棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，可分别将本发明的药物和核酸分子偶联至一类可用于实现药物的受控释放的可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛类、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯类及水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
[0497] 如需要，待施用的药物组合物和药物还可含有较少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂及其他物质，例如乙酸钠和三乙醇胺油酸酯。
[0498] 可根据多种因素选择分别使用本发明的核酸分子和药物的给药方案，包括：患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况；待治疗的病状的严重度；给药途径；患者的肾和肝功能；及所采用的具体适体或其盐。普通医师或兽医可容易确定和开出预防、对抗或阻止病状进展所需的药物有效量。
[0499] 在治疗本文公开的任何疾病中，本发明的核酸的有效血浆水平范围优选为500fM～500μM。
[0500] 可优选以单次日剂量、每两天或每三天、每周、每两周、以单次月剂量或每三个月剂量分别施用本发明的核酸分子和药物。
[0501] 即述特征亦在本发明的范围内，即本文所述药物构成了本文公开的药物组合物。
[0502] 本发明再一方面涉及用于治疗需要这种治疗的受试者的方法，其中所述方法包括施用药学活性量的至少一种本发明的核酸。在一实施方式中，受试者患有疾病或处于患所述疾病的风险中，其中所述疾病是任何本文公开的所述疾病，尤其是有关任何本发明的核酸在药物制备中的用途中公开的那些疾病中的任何一种。
[0503] 如本文中所优选使用的，术语治疗在一个优选实施方式中也包括预防和/或随访。
[0504] 如本文中所优选使用的，除非另有说明，术语“疾病”和“病症”应可互换使用。
[0505] 如本文使用的，术语“包含”优选无意限制所述术语之前的主题或由所述术语所描述的主题。但在备选实施方式中，应将术语“包含”理解为“含有”，从而理解为限制所述术语之前的主题或由所述术语所描述的主题。
[0506] 下表中概括了本文所使用的本发明的核酸分子和靶分子SDF-1的各序列标识号、化学性质，其实际序列及内部参考号。
[0507] 需知，已用生物素化的人D-SDF-1(SEQ ID NO：4)在适体(即D-核酸水平(D-RNA))水平表征了所述核酸，或用天然构型的SDF-1、L-SDF-1(人SDF-1α，SEQ ID NO：1)在镜体(即L-核酸(L-RNA))水平表征了所述核酸。不同的核酸共有一个内部参考名称(但分别以一个SEQ ID针对D-RNA(适体)分子，且一个SEQ ID针对L-RNA(镜体)分子)。
[0508]
[0509]
[0510]
[0511]
[0512]
[0513]
[0514]
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[0517]
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[0519]
[0520]
[0521]
[0522]
[0523]
[0525] 通过附图、实施例和序列表进一步说明本发明，从所述附图、实施例和序列表可获悉更多特征、实施方式和优点，其中：
[0526] 图1示结合人SDF-1的相关RNA配体的序列比对，其中标出了在一个优选实施方式中以其整体对于结合人SDF-1来说必不可少的序列基序(“A型”)；
[0527] 图2A示RNA配体192-A10-001的衍生物(“A型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0528] 图2B示RNA配体192-A10-001的衍生物(“A型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0529] 图3示结合人SDF-1的相关RNA配体的序列比对，其中标出了在一个优选实施方式中以其整体对于结合人SDF-1来说必不可少的序列基序(“B型”)；
[0530] 图4A示RNA配体193-C2-001和193-G2-001的衍生物(“B型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0531] 图4B示RNA配体193-C2-001和193-G2-001的衍生物(“B型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0532] 图5示结合人SDF-1的相关RNA配体的序列比对，其中标出了在一个优选实施方式中以其整体对于结合人SDF-1来说必不可少的序列基序(“C型”)；
[0533] 图6示RNA配体190-A3-001的衍生物(“C型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0534] 图7A示RNA配体190-D5-001的衍生物(“C型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0535] 图7B示RNA配体190-D5-001的衍生物(“C型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0536] 图8RNA配体197-B2的衍生物(“C型”序列基序的人SDF-1RNA配体)；
[0537] 图9示结合人SDF-1的其它RNA配体；
[0538] 图10示人SDF-1诱导性Jurkat人T细胞白血病细胞的趋化性，其中在Jurkat人T细胞白血病细胞向各种浓度的SDF-1迁移3小时后，获得了关于人SDF-1的剂量-反应曲线，表示为随SDF-1浓度改变而变化的荧光信号；
[0539] 图11示人SDF-1结合性适体192-A10-001与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的结合分析的结果，表示为随生物素化的人D-SDF-1浓度改变而变化的适体结合；
[0540] 图12示在趋化性测定实验中测得的人SDF-1结合性镜体192-A10-001的趋化效力；让细胞向的0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体192-A10-001预温育)迁移，表示为随镜体192-A10-001浓度改变而变化的对照的百分比；
[0541] 图 13 示 人 SDF-1 结 合 性 适 体 192-A10-001、192-F10-001、192-C9-001、192-E10-001、192-C10-001、192-D11-001、192-G11-001、192-H11-001、192-D10-001、
192-E9-001和192-H9-001与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的竞争性结合分析的结果，表示为在1nM和5nM的未标记的适体192-A10-001、192-F10-001、192-C9-001、
192-E10-001、192-C10-001、192-D11-001、192-G11-001、192-H11-001、192-D10-001、
192-E9-001和192-H9-001下，经标记的适体192-A10-001(用作被未标记的适体替代的参照)的结合；
192-E9-001和192-H9-001与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的竞争性结合分析的结果，表示为在1nM和5nM的未标记的适体192-A10-001、192-F10-001、192-C9-001、
192-E10-001、192-C10-001、192-D11-001、192-G11-001、192-H11-001、192-D10-001、
192-E9-001和192-H9-001下，经标记的适体192-A10-001(用作被未标记的适体替代的参照)的结合；
[0542] 图14示人SDF-1结合性适体192-A10-008与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的结合分析的结果，表示为随生物素化的人D-SDF-1浓度改变而变化的适体结合；
[0543] 图15Biacore 2000感 应图(sensorgram)，标 出了 人SDF-1结 合性 镜 体192-A10-008与人SDF-1(其被通过胺偶联过程固定在PioneerF1感应芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应值(RU)；另外列出镜体192-A10-008和192-A10-001的开关率及KD值；
[0544] 图16示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体192-A10-008的趋化效力；让细胞向的0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体192-A10-008预温育)迁移，表示为随镜体192-A10-008浓度改变改变而变化的对照的百分比；
[0545] 图17示Biacore 2000感应图，标出了镜体193-G2-01与人SDF-1(其被通过胺偶联过程固定在PioneerF1感应芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应值(RU)；另外列出镜体193-G2-001和193-C2-001的开关率及KD值；
[0546] 图18示人SDF-1结合性适体193-G2-012与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的结合分析的结果，表示为随生物素化的人D-SDF-1浓度改变而变化的适体结合；
[0547] 图19示人SDF-1结合性适体190-A3-001、190-A3-003、190-A3-004、190-A3-007、191-D5-001、191-D5-002、191-D5-003、191-D5-004、191-D5-005、191-D5-006和191-D5-007与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的竞争性结合分析的结果，表示为在500nM、50nM和
10nM的未标记的适体190-A3-001、190-A3-003、190-A3-004、190-A3-007、191-D5-001、
191-D5-002、191-D5-003、191-D5-004、191-D5-005、191-D5-006和191-D5-007下，经标记的适体190-A3-001或191-D5-001(用作被未标记的适体替代的参照)的结合；
10nM的未标记的适体190-A3-001、190-A3-003、190-A3-004、190-A3-007、191-D5-001、
191-D5-002、191-D5-003、191-D5-004、191-D5-005、191-D5-006和191-D5-007下，经标记的适体190-A3-001或191-D5-001(用作被未标记的适体替代的参照)的结合；
[0548] 图20示人SDF-1结合性适体190-A3-004和191-D5-007与生物素化的人D-SDF-1在37℃下的结合分析的结果，表示为随生物素化的人D-SDF-1浓度改变而变化的适体结合；
[0549] 图21示Biacore 2000感应图，标出了镜体191-D5-007与人SDF-1(其被通过胺偶联过程固定在PioneerF1感应芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应值(RU)；另外列出镜体191-D5-001、191-D5-007、190-A3-003和197-B2的开关率及KD值；
[0550] 图22示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体190-A3-004的趋化效力；让细胞向0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体190-A3-004预温育)迁移，表示为随镜体190-A3-004浓度改变而变化的对照的百分比；
[0551] 图23A示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体193-G2-012-5’-PEG、197-B2-006-5’-PEG、191-D5-007-5’-PEG 和191-A10-008-5’-PEG的趋化效力；让细胞向0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体193-G2-012-5’-PEG、197-B2-006-5’-PEG、
191-D5-007-5’-PEG 和 191-A10-008-5’-PEG预 温 育) 迁 移，表 示 为 随 镜 体
193-G2-012-5’-PEG、197-B2-006-5’-PEG、191-D5-007-5’-PEG和191-A10-008-5’-PEG浓度改变而变化的对照的百分比；
191-D5-007-5’-PEG 和 191-A10-008-5’-PEG预 温 育) 迁 移，表 示 为 随 镜 体
193-G2-012-5’-PEG、197-B2-006-5’-PEG、191-D5-007-5’-PEG和191-A10-008-5’-PEG浓度改变而变化的对照的百分比；
[0552] 图23B示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体197-B2-006-5’PEG和197-B2-006-31b-5’-PEG的趋化效力；让细胞向0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体197-B2-006-5’PEG和197-B2-006-31b-5’-PEG预温育)迁移，表示为随镜体197-B2-006-5’PEG和197-B2-006-31b-5’-PEG浓度改变而变化的对照的百分比；
[0553] 图 24A 示 Biacore 2000 感 应 图，标 出 了 镜 体 193-G2-012-5’-PEG、191-A10-008-5’-PEG和191-A10-001-5’-PEG与人SDF-1(其被通过胺偶联过程固定在PioneerF1感应芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应值(RU)；
[0554] 图 24B 示 Biacore 2000 感 应 图，标 出 了 镜 体 197-B2-006-5’PEG、197-B2-006-31b-5’-PEG和191-D5-007-5’-PEG与人SDF-1(其被通过胺偶联过程固定在PioneerF1感应芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应值(RU)；
[0555] 图25A示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-HES130 和 192-A10-001-5’-HES100 的 趋 化 效 力；让 细 胞 向
0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-HES130和 192-A10-001-5’-HES100 预 温 育 ) 迁 移，表 示 为 随 镜 体 192-A10-001、
192-A10-001-5’-HES130和192-A10-001-5’-HES100浓度改变而变化的对照的百分比；
0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-HES130和 192-A10-001-5’-HES100 预 温 育 ) 迁 移，表 示 为 随 镜 体 192-A10-001、
192-A10-001-5’-HES130和192-A10-001-5’-HES100浓度改变而变化的对照的百分比；
[0556] 图25B示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-PEG30和192-A10-001-5’-PEG40 的 趋 化 效 力；让 细 胞 向 0.3nM人SDF-1( 于37 ℃ 下 与 各 种 量 的 镜 体 192-A10-001、192-A10-001-5’-PEG30 和
192-A10-001-5’-PEG40预温育)迁移，表示为随镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-PEG30和192-A10-001-5’-PEG40浓度改变而变化的对照的百分比；
192-A10-001-5’-PEG40预温育)迁移，表示为随镜体192-A10-001、192-A10-001-5’-PEG30和192-A10-001-5’-PEG40浓度改变而变化的对照的百分比；
[0557] 图26示通过趋化性测定实验测得的对照镜体的趋化效力；让细胞向0.3nM人或鼠SDF-1(于37℃下与各种量的对照镜体预温育)迁移，表示为随对照镜体浓度改变而变化的对照的百分比；
[0558] 图27示鼠SDF-1诱导性Jurkat人T细胞白血病细胞的趋化性，其中在Jurkat人T细胞白血病细胞向各种SDF-1浓度迁移3小时后，获得了关于SDF-1的剂量-反应曲线，表示为荧光信号；
[0559] 图28示通过趋化性测定实验测得的人SDF-1结合性镜体192-A10-001和191-D5-007-5’PEG的趋化效力；让细胞向0.3nM人SDF-1(于37℃下与各种量的镜体192-A10-001和191-D5-007-5’PEG预温育)迁移，表示为随镜体192-A10-001和
191-D5-007-5’PEG浓度改变而变化的对照的百分比；
191-D5-007-5’PEG浓度改变而变化的对照的百分比；
[0560] 图29示SDF-1结合性镜体192-A10-001在使用人[125J]-SDF-1α(于37℃下与各种量的镜体192-A10-001预温育)的CXCR4-受体结合测定中的效力，根据镜体125
192-A10-001浓度标绘特异性结合的[ J]-SDF-1α；和
192-A10-001浓度标绘特异性结合的[ J]-SDF-1α；和
[0561] 图30示人SDF-1结合性镜体192-A10-001对使用1nM人SDF-1α产生的表达CXCR4的细胞的MAP激酶刺激的抑制；
[0562] 图31示主动脉环出芽测定(aortic ring sprouting assay)中人SDF-1结合性镜体193-G2-012-5’-PEG和PEG化的对照镜体对SDF-1诱导性出芽的抑制，其中来自大鼠主动脉的环被包埋在胶原基质中，且与含或不含镜体的SDF-1温育6天(a：对照；b：10nM SDF-1；c：10nM SDF-1+1μM人SDF-1结合性镜体193-G2-012-5’-PEG；d：10nMSDF-1+1μM PEG化的对照镜体)；
[0563] 图32示主动脉环出芽测定中人SDF-1结合性镜体193-G2-012-5’-PEG和PEG化的对照镜体对SDF-1诱导性出芽的抑制，其中以平均值+/-SD显示出芽指数(每条件5环)(＊：SDF-1值与对照显著不同(Mann-Whitney-检验；p＝0.009)；＊＊：SDF-1+结合人SDF-1的镜体193-G2-012-5’-PEG的值与SDF-1的值显著不同(Mann-Whitney-检验；p＝0.028)；
[0564] 图33图示了动物疗法和用于产生依据实施例10的干细胞释放数据的方法；
[0565] 图34显示了静脉注射NOX-A12-JE40、NOX-A12-NO30、revNOX-A12-JE40(对照镜体)AMD3100、G-CSF(优保津)或载体(5％葡萄糖)1-48小时后每微升血浆中的CD117+和Ly-6A/E+细胞(造血干细胞/造血祖细胞)的绝对数量；该图显示了平均值和标准差；
[0566] 图35如图例所示显示了注射NOX-A12-衍生物、AMD31006小时，或G-CSF(优保津)48小时以及和载体后，C57BL/6小鼠每μL的血集落形成单位；该图显示了5只小鼠的平均值和标准差(每只重复3次)；
[0567] 图36示小鼠激光诱导脉络膜新血管生成实验结果，其中，和相同动物中载体治疗眼睛(林格溶液)直接比较，在NOX-A12-JE40治疗眼睛中，NOX-A12-JE40减小了新形成血管区域(左图)；右图显示了进行激光损伤后，NOX-A12-JE40和载体治疗的小鼠眼睛的个体损伤新生血管区域的中位值；
[0568] 图37图示了使用载体、NOX-A12-JE40、revNOX-A12-JE40(对照镜体)对接受或未接受单肾切除的健康小鼠和糖尿病小鼠进行重复治疗的结果，其中NOX-A12-JE40增加了肾小球硬化得分；
[0569] 图38图示了玻璃体内给药VEGF进行诱导，并用不同浓度的SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40、载体或Kenacort retart对动物进行治疗的动物模型视网膜血管渗漏结果；在该模型中，在玻璃体内注射VEGF 48小时后，通过荧光光度测定检测视网膜脉管系统的通透性；
[0570] 图39图示了在氧诱导的视网膜病变小鼠模型(模拟缺氧所致视网膜新生血管形成的模型)中，小鼠个体的视网膜病变得分(载体治疗的眼睛【x轴】和镜体NOX-A12-JE40治疗的眼睛【y轴】进行比较)，所述结果观察自糖尿病视网膜病变或AMD；
[0571] 图40图示了在氧诱导的视网膜病变小鼠模型(模拟缺氧所致视网膜新生血管形成的模型)中，镜体NOX-A12-JE40治疗眼睛和载体治疗眼睛之间的、视网膜病变个体检测参数以及视网膜病变得分的统计学差异p值，所述结果观察自糖尿病视网膜病变或AMD；采用威氏符号等级检验(Wilcoxon signed-ranks test)确定p值；
[0572] 图41图示了静脉给药13.4mg(依据寡核苷酸部分计算)SDF-1结合核酸NOX-A12-JE40后的白血病计数，其中给药载体(5％葡萄糖)后只记录了一个时间点，因为已假定其为常数；但是，NOX-A12JE40以可逆的方式动员了大量的白细胞；
[0573] 图42图示了异源造血干细胞移植(简称为HSCT)的适应症概况以及1990-2000期间欧洲患者人数(Gratwohl，Baldomero等人2002)；
[0574] 图43图示了自体同源造血干细胞移植(简称为HSCT)的适应症概况以及1990-2000期间欧洲患者人数(Gratwohl，Baldomero等人2002)。
实施例
实施例
[0575] 实施例1：结合人SDF-1的核酸
[0576] 使用生物素化的人D-SDF-1作为靶，可产生多个结合人SDF-1的核酸，其核苷酸序列示于图1～图9。基于适体水平(即具有生物素化的人D-SDF-1的D-核酸水平)或镜体水平(即具有天然构型的SDF-1(L-SDF-1)的L-核酸)表征核酸。
[0577] 用生物素化的人D-SDF-1，使用竞争结合测定或下拉结合测定(pull-down binding assay)分析适体，所述测定使用生物素化的人D-SDF-1(实施例4)。通过使用Biacore2000仪器的表面等离子体共振测定(实施例6)和细胞培养体外化学毒性测定(实施例5)，用天然构型的SDF-1(L-SDF-1)检测镜体，
[0578] 由此产生的核酸分子表现出不同的序列基序，三种主要类型定义于图1、2A和2B(A型)，图3、4A和4B(B型)，图5、6、7A、7B和8(C型)。为定义核苷酸序列基序，使用了用于不确定核苷酸的IUPAC缩写。
[0579] S 强 G或C；
[0580] W 弱 A或U；
[0581] R 嘌呤 G或A；
[0582] Y 嘧啶 C或U；
[0583] K 酮基 G或U；
[0584] M 亚氨基 A或C；
[0585] B 非A C或U或G；
[0586] D 非C A或G或U；
[0587] H 非G A或C或U；
[0588] V 非U A或C或G
[0589] N 全部 A或G或C或U
[0590] 如无相反说明，任意核酸序列或者片段和盒的序列均以5’→3’方向显示。
[0591] 1.1：A型SDF-1结合核酸
[0592] 如图1所示，所有A型SDF-1结合核酸序列均含一个核苷酸序列，其两侧有可彼此杂交的5’-和3’-端片段。但该杂交并非所述分子所必需。
[0593] 使用直接和竞争下拉结合测定，用生物素化的人D-SDF-1，基于适体水平表征所述核酸，以根据它们的结合行为给它们排序(实施例4)。所选序列合成为镜体(实施例3)，且在细胞培养体外化学毒性测定中使用天然构型的SDF-1(L-SDF)(实施例5)及通过使用Biacore2000仪器的表面等离子体共振测定(实施例6)进行检测。
[0594] A型SDF-1结合核酸之间的所定义的盒或片段的序列可不同，其影响与SDF-1的结合亲和力。基于概称为A型SDF-1结合核酸的不同SDF-1结合核酸的结合分析，核心核苷酸序列及其以下所述的核苷酸序列各自，及更有选以其整体对于结合SDF-1是必需的：
[0595] 全 部 鉴 定 的A型 SDF-1结 合 核 酸 序 列 的 核 心 核 苷 酸 序 列 共 享序 列 ( A 型 式 - 1) ， 其中XA无或为‘A’。如果 无‘A’，所述核心核苷酸序列的序列可 概括为A型
式-2 在核 心核 苷酸序 列内 带
有另外的核苷酸‘A’且仍结合SDF-1的A型SDF-1结合核酸191-A6(核心核苷酸
序列： 得出替代性核心核苷酸序列
( A型式-3)。作为A型SDF-1结合核酸的
所有其他核酸的例子，A型SDF-1结合核酸192-A10-001的特征在于其与人SDF-1的结合亲和力。用下拉结合测定(KD＝1.5nM，图11)和通过表面等离子体共振测定(KD＝1.0nM，图15)测定了平衡结合常数KD。使用细胞培养体外化学毒性测定测定的192-A10-001的IC50(抑制浓度50％)为0.12nM(图12)。由此，在与192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析所有图1所示的A型SDF-1结合核酸(图13，并非所有被检A型SDF-1结合核酸显示于图
13)。A型SDF-1结合核酸192-B11和192-C10在这些竞争实验中显示出等于192-A10-001的结合亲和力。A型SDF-1结合核酸192-G10、192-F10、192-C9、192-E10、192-D11、192-G11、
192-H11和191-A69测定出较之弱的结合亲和力。A型SDF-1结合核酸192-D10、192-E9和
192-H9具有甚弱于192-A10-001的结合亲和力(图13)。
式-2 在核 心核 苷酸序 列内 带
有另外的核苷酸‘A’且仍结合SDF-1的A型SDF-1结合核酸191-A6(核心核苷酸
序列： 得出替代性核心核苷酸序列
( A型式-3)。作为A型SDF-1结合核酸的
所有其他核酸的例子，A型SDF-1结合核酸192-A10-001的特征在于其与人SDF-1的结合亲和力。用下拉结合测定(KD＝1.5nM，图11)和通过表面等离子体共振测定(KD＝1.0nM，图15)测定了平衡结合常数KD。使用细胞培养体外化学毒性测定测定的192-A10-001的IC50(抑制浓度50％)为0.12nM(图12)。由此，在与192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析所有图1所示的A型SDF-1结合核酸(图13，并非所有被检A型SDF-1结合核酸显示于图
13)。A型SDF-1结合核酸192-B11和192-C10在这些竞争实验中显示出等于192-A10-001的结合亲和力。A型SDF-1结合核酸192-G10、192-F10、192-C9、192-E10、192-D11、192-G11、
192-H11和191-A69测定出较之弱的结合亲和力。A型SDF-1结合核酸192-D10、192-E9和
192-H9具有甚弱于192-A10-001的结合亲和力(图13)。
[0596] 如上所述，A型SDF-1结合核酸192-B11和192-C10显示出等于192-A10-001的SDF-1结合亲和力。但它们显示出核心核苷酸序列的核苷酸序列稍不同。由此，三种以几乎相同的高亲和力结合SDF-1的分子的共有序列可概括为核苷酸序列(A型式-4)，其中192-A10-001的核心核苷酸
序列的核苷酸序列(核苷酸序列： )表示具有
A型SDF-1结合核酸的最佳结合亲和力的核苷酸序列。
序列的核苷酸序列(核苷酸序列： )表示具有
A型SDF-1结合核酸的最佳结合亲和力的核苷酸序列。
[0597] A型SDF-1结合核酸的5’-端片段的6个核苷酸中的5或6个核苷酸可与相应的A型SDF-1结合核酸的3’-端片段的6个核苷酸中的5或6个核苷酸杂交形成末端螺旋。尽管这些核苷酸的多个位置可变，但不同的核苷酸使5’-和3’-端片段的6个核苷酸中的5或6个核苷酸彼此杂交。如图1所示的A型SDF-1结合核酸的5’-和3’-端片段可概括为5’端片段通式(‘RSHRYR’，A型式-5-5’)和3’端片段通式(‘YRYDSY’，A型式-5-3’)。在与原分子192-A10-001和192-A10-008的竞争下拉结合测定中分析了A型SDF-1结合核酸192-A10-001的截短的衍生物(图2A和2B)。这些实验显示，可不减小结合亲和力地从192-A10-001的6个末端核苷酸(5’端：GCUGUG；3’端：CGCAGC)减少到衍生物192-A10-002的5个末端核苷酸(5’端：CUGUG；3’端：CGCAG)。但截断至4个末端核苷酸(5’端：UGUG；3’端：CGCA；192-A10-003)或更短(192-A10-004/-005/-006/-007)导致与SDF-1的结合亲和力减小(图2A)。所测定的如图2A和B所示的A型SDF-1结合核酸192-A10-001的衍生物的长5个和4个核苷酸的5’-端和3’-端片段可表示为5’端片段通式(‘X2BBBS’，A型式-6-5’)和3’端片段通式(‘SBBVX3’，A型式-6-3’)，其中X2无或为‘S’，且X3无或为‘S’。
[0598] 5’-和3’-端片段核苷酸对A型SDF-1结合核酸的结合亲和力有影响。这不仅体现在核酸192-F10和192-E10上，还体现在192-A10-001的衍生物上(图2B)。192-F10和192-E10的核心核苷酸序列同于192-B11和192-C10，但在5’-端片段的3’-端和3’-端片段的5’-段略含不同，导致结合力下降。
[0599] 用‘GCGCG’和‘CGCGC’(192-A10-015)取代A型SDF-1结合核酸192-A10-002的5’-和3’-端核苷酸‘CUGUG’和‘CGCAG’导致结合亲和力减小，然而用‘GCGUG’和‘CGCGC’(192-A10-008)取代导致结合亲和力与192-A10-002相同(图2B、图15、图12、图16)。此外，通过与192-A10-001或其衍生物192-A10-008(二者有相同的SDF-1结合亲和力)的结合亲和力，测试A型SDF-1结合核酸192-A10-001的9种分别带有4个5’-和3’-端核苷酸的衍生物(192-A10-014/-015/-016/-017/-018/-019/-020/-021/-022/-02
3)为适体。所有克隆显示出分别甚弱于或极甚弱于192-A10-001(6个核苷酸形成末端双螺旋)或具有5个末端核苷酸的192-A10-008的SDF-1结合亲和力(图2B)。由此得出，5’-和
3’-端片段的序列和核苷酸数对于与SDF-1有效结合是必需的。如A型SDF-1结合核酸
192-A10-002和192-A10-08所示，5’-和3’-端片段的优选组合是‘CUGUG’和‘CGCAG’(A型SDF-1结合核酸192-A10-002的5’-和3’-端片段)，和‘GCGUG’和‘CGCGC’(A型SDF-1结合核酸192-A10-008的5’-和3’-端片段)。
3)为适体。所有克隆显示出分别甚弱于或极甚弱于192-A10-001(6个核苷酸形成末端双螺旋)或具有5个末端核苷酸的192-A10-008的SDF-1结合亲和力(图2B)。由此得出，5’-和
3’-端片段的序列和核苷酸数对于与SDF-1有效结合是必需的。如A型SDF-1结合核酸
192-A10-002和192-A10-08所示，5’-和3’-端片段的优选组合是‘CUGUG’和‘CGCAG’(A型SDF-1结合核酸192-A10-002的5’-和3’-端片段)，和‘GCGUG’和‘CGCGC’(A型SDF-1结合核酸192-A10-008的5’-和3’-端片段)。
[0600] 但是，组合所有检测的A型SDF-1结合核酸5’-和3’-端片段，A型SDF-1结合核酸的5’端片段通式是‘X1X2NNBV’(A型式-7-5’)，而A型SDF-1结合核酸的3’端片段通式是‘BNBNX3X4’(A型式-7-3’)，其中，
[0601] X1是‘R’或无，X2是‘S’，X3是‘S’，且X4是‘Y’或无；或
[0602] X1无，X2是‘S’或无，X3是‘S’或无，且X4无。
[0603] 1.2：B型SDF-1结合核酸
[0604] 如图3所示，所有B型SDF-1结合核酸序列均含一个核心核苷酸序列，其两侧有可彼此杂交的5’-和3’-端片段。但该杂交并非所述分子所必需。
[0605] 使用直接和竞争下拉结合测定，用生物素化的人D-SDF-1，基于适体水平表征所述核酸，以根据它们的结合行为给它们排序(实施例4)。所选序列合成为镜体(实施例3)，且在细胞培养体外化学毒性测定中使用天然构型的SDF-1(L-SDF)(实施例5)及通过使用Biacore2000仪器的表面等离子体共振测定(实施例6)进行检测。
[0606] B型SDF-1结合核酸之间的所定义的盒或片段的序列可不同，其影响与SDF-1的结合亲和力。基于概称为B型SDF-1结合核酸的不同SDF-1结合核酸的结合分析，核心核苷酸序列及其以下所述的核苷酸序列各自，及更有选以其整体对于结合SDF-1是必需的：
[0607] 全部鉴定的B型SDF-1结合核酸序列的核心核苷酸序列共享序列(B 型式-1)。 在与A 型
SDF-1结合核酸192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析了核心核苷酸序列的一个位置不同的B型SDF-1结合核酸193-G2-001、193-C2-001和193-F2-001(下拉结合测定中测定的KD为1.5nM[图11]，通过表面等离子体共振测定测定的KD为1.0nM[图15]，IC50为
0.12nM；[图12])。所测试的3种B型SDF-1结合核酸的每种均显示相比A型SDF-1结合核酸192-A10-001更强的人SDF-1结合亲和力，其中193-G2-001的结合亲和力与193-C2-001和193-F2-001一样好(图3)。数据提示，B型SDF-1结合核酸193-G2-001、193-C2-001和
193-F2-001的核心核苷酸序列的核苷酸序列的不同对于SDF-1结合亲和力无影响。以B型SDF-1结合核酸193-G2-001为例，其特征在于与人SDF-1的结合亲和力。使用下拉结合测定(KD＝0.3nM)和通过表面等离子体共振测定(KD＝0.5nM，图17)测定平衡结合常数KD。使用细胞培养体外化学毒性测定测定的193-G2-001的IC50(抑制浓度50％)为0.08nM。相反，核心核苷酸序列的序列不同的B型SDF-1结合核酸193-B3-002、193-H3-002、193-E3-002和
193-D1-002具有更差的结合特性(图3)。结果，与SDF-1的结合亲和力提高的B型SDF-1结合核酸共享具有序列 (B型
式-2)的核心核苷酸序列。
SDF-1结合核酸192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析了核心核苷酸序列的一个位置不同的B型SDF-1结合核酸193-G2-001、193-C2-001和193-F2-001(下拉结合测定中测定的KD为1.5nM[图11]，通过表面等离子体共振测定测定的KD为1.0nM[图15]，IC50为
0.12nM；[图12])。所测试的3种B型SDF-1结合核酸的每种均显示相比A型SDF-1结合核酸192-A10-001更强的人SDF-1结合亲和力，其中193-G2-001的结合亲和力与193-C2-001和193-F2-001一样好(图3)。数据提示，B型SDF-1结合核酸193-G2-001、193-C2-001和
193-F2-001的核心核苷酸序列的核苷酸序列的不同对于SDF-1结合亲和力无影响。以B型SDF-1结合核酸193-G2-001为例，其特征在于与人SDF-1的结合亲和力。使用下拉结合测定(KD＝0.3nM)和通过表面等离子体共振测定(KD＝0.5nM，图17)测定平衡结合常数KD。使用细胞培养体外化学毒性测定测定的193-G2-001的IC50(抑制浓度50％)为0.08nM。相反，核心核苷酸序列的序列不同的B型SDF-1结合核酸193-B3-002、193-H3-002、193-E3-002和
193-D1-002具有更差的结合特性(图3)。结果，与SDF-1的结合亲和力提高的B型SDF-1结合核酸共享具有序列 (B型
式-2)的核心核苷酸序列。
[0608] B型SDF-1结合核酸的5’-端片段的6个核苷酸中的4、5或6个核苷酸可与相应的B型SDF-1结合核酸的3’-端片段的6个核苷酸中的4、5或6个核苷酸杂交形成末端螺旋。尽管核苷酸的多个位置可变，但不同的核苷酸使5’-和3’-端片段的6个核苷酸中的4、5或6个核苷酸彼此杂交。如图3所示的B型SDF-1结合核酸的5’-和3’-端片段可概括为5’端片段通式(B型式-3-5’；‘X1GCRWG’，其中X1为‘A’或无)和3’端片段通式(B型式-3-3’；‘KRYSCX4’，其中X4为‘U’或无)。B型SDF-1结合核酸193-G1-002、193-D2-002、
193-A1-002和193-D3-002具有较之弱的SDF-1结合亲和力，尽管它们与193-C2-001、
193-G2-001和193-F2-001共享相同的核心核苷酸序列(B型式-2)(图3)。B型SDF-1结合核酸193-G1-002和193-D2-002、193-A1-002和193-D3-002的不良结合特性可由5’-和
3’-端片段的核苷酸数和序列所致。
193-A1-002和193-D3-002具有较之弱的SDF-1结合亲和力，尽管它们与193-C2-001、
193-G2-001和193-F2-001共享相同的核心核苷酸序列(B型式-2)(图3)。B型SDF-1结合核酸193-G1-002和193-D2-002、193-A1-002和193-D3-002的不良结合特性可由5’-和
3’-端片段的核苷酸数和序列所致。
[0609] 在分别与193-G2-001和193-G2-012的竞争下拉结合测定中分析了B型SDF-1结合核酸193-G2-001、193-C2-001的截短的衍生物(图4A和4B)。这些实验显示，从B型SDF-1结合核酸193-G2-001和193-C2-001的6个末端核苷酸(5’端：AGCGUG；3’端：UACGCU)减少到5个核苷酸(5’端：GCGUG；3’端：UACGC)产生结合亲和力相近的分子(193-C2-002和193-G2-012)。用下拉结合测定测定了平衡解离常数KD(KD＝0.3nM，图
18)。截断至4个(5’端：CGUG；3’端：UACG；193-C2-003)或更少的核苷酸(193-C2-004、
193-C2-005、193-C2-006、193-C2-007)导致与SDF-1的结合亲和力减小，其通过用竞争下拉结合测定测定(图4A)。分别位于5’-和3’-端的5个末端核苷酸的核苷酸序列对B型SDF-1结合核酸的结合亲和力有影响。用‘GCGCG’和‘CGCGC’(193-G2-013)取代5’-和
3’-端核苷酸‘GCGUG’和‘UACGC’(193-C2-002、193-G2-12)导致结合亲和力减小。另外，测试了B型SDF-1结合核酸193-G2-001的具有长4个碱基对核苷酸的末端螺旋的4种不同衍生物(193-G2-014/-015/-016/-017)。它们全部显示减小的SDF-1结合亲和力(图
4B)。因此，5’-和3’-端核苷酸的序列及长度对于有效结合SDF-1是必需的。如图4A和
4B所示的B型SDF-1结合核酸的衍生物193-C2-003和193-G2-012的长5个和4个核苷酸的5’-端和3’-端片段可表示为5’端片段通式(‘X2SSBS’，B型式-4-5’)，其中X2无或为‘G’，和3’端片段通式(‘BVSSX3’，B型式-4-3’)，且其中X3无或为‘C’。如B型SDF-1结合核酸193-G2-001和193-C2-01及其衍生物193-G2-012和193-C2-002所示，5’-和
3’-端片段的优选组合是‘X1GCGUG’(5’-端片段；B型式-5-5’)和‘UACGCX4’(3’-端片段；B型式-5-3’)，其中X1为‘A’或无，及X4为‘U’或无。
18)。截断至4个(5’端：CGUG；3’端：UACG；193-C2-003)或更少的核苷酸(193-C2-004、
193-C2-005、193-C2-006、193-C2-007)导致与SDF-1的结合亲和力减小，其通过用竞争下拉结合测定测定(图4A)。分别位于5’-和3’-端的5个末端核苷酸的核苷酸序列对B型SDF-1结合核酸的结合亲和力有影响。用‘GCGCG’和‘CGCGC’(193-G2-013)取代5’-和
3’-端核苷酸‘GCGUG’和‘UACGC’(193-C2-002、193-G2-12)导致结合亲和力减小。另外，测试了B型SDF-1结合核酸193-G2-001的具有长4个碱基对核苷酸的末端螺旋的4种不同衍生物(193-G2-014/-015/-016/-017)。它们全部显示减小的SDF-1结合亲和力(图
4B)。因此，5’-和3’-端核苷酸的序列及长度对于有效结合SDF-1是必需的。如图4A和
4B所示的B型SDF-1结合核酸的衍生物193-C2-003和193-G2-012的长5个和4个核苷酸的5’-端和3’-端片段可表示为5’端片段通式(‘X2SSBS’，B型式-4-5’)，其中X2无或为‘G’，和3’端片段通式(‘BVSSX3’，B型式-4-3’)，且其中X3无或为‘C’。如B型SDF-1结合核酸193-G2-001和193-C2-01及其衍生物193-G2-012和193-C2-002所示，5’-和
3’-端片段的优选组合是‘X1GCGUG’(5’-端片段；B型式-5-5’)和‘UACGCX4’(3’-端片段；B型式-5-3’)，其中X1为‘A’或无，及X4为‘U’或无。
[0610] 但是，组合所有测试的B型SDF-1结合核酸的5’-和3’-端片段，B型SDF-1结合核酸的5’-端片段通式是‘X1X2SVNS’(B型式-6-5’)，而B型SDF-1结合核酸的3’端片段通式是‘BVBSX3X4’(B型式-6-3’)，其中
[0611] X1为‘A’或无，X2为‘G’，X3为‘C’，且X4为‘U’或无；或
[0612] X1无，X2为‘G’或无，X3为‘C’或无，且X4无。
[0613] 1.3：C型SDF-1结合核酸
[0614] 如图5所示，所有C型SDF-1结合核酸序列均含一个核心核苷酸序列，其两侧有可彼此杂交的5’-和3’-端片段。但该杂交并非所述分子所必需。
[0615] 使用直接和竞争下拉结合测定，用生物素化的人D-SDF-1，基于适体水平表征所述核酸，以根据它们的结合行为给它们排序(实施例4)。所选序列合成为镜体(实施例3)，且在细胞培养体外化学毒性测定中使用天然构型的SDF-1(L-SDF)(实施例5)及通过使用Biacore2000仪器的表面等离子体共振测定(实施例6)进行检测。
[0616] C型SDF-1结合核酸之间的所定义的盒或片段的序列可不同，其影响与SDF-1的结合亲和力。基于概称为C型SDF-1结合核酸的不同SDF-1结合核酸的结合分析，核心核苷酸序列及其以下所述的核苷酸序列各自，及更有选以其整体对于结合SDF-1是必需的：
[0617] 全部鉴定的C型SDF-1结合核酸序列的核心核苷酸序列共享序列(C型 式-1)，其中XA无 或为‘A’。 除C型 SDF-1
结合核酸197-D1之外，全部鉴定的C型SDF-1结合核酸序列的核心核苷酸序列
共 享 序 列 (C型 式-2)。C 型 SDF-1结 合 核 酸
197-D1 在核心核苷酸序列中丢失一个核苷酸‘A’，且
仍结合SDF-1，得出替代性核心核苷酸序列( C型式-3)。
首先，在与A型SDF-1结合核酸192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析了图5所示的全部C型SDF-1结合核酸(通过下拉测定和表面等离子体共振测定测定出KD＝1.5nM；IC50＝
0.12nM)。C型SDF-1结合核酸191-D5-001、197-B2、190-A3-001、197-H1、197-H3和197-E3在竞争实验中显示出弱于192-A10-001的结合亲和力。191-A5、197-B1、197-D1、197-H2和
197-D2测得甚更弱的结合亲和力(图5)。通过进一步的竞争下拉结合测定、表面等离子体共振测定和体外化学毒性测定进一步表征了所述分子及其衍生物。表征了C型SDF-1结合核酸191-D5-001其与人SDF-1的结合亲和力，而通过表面等离子体共振测定测定了平衡结合常数KD(KD＝0.8nM，图21)。用细胞培养体外化学毒性测定测得191-D5-001的IC50(抑制浓度50％)为0.2nM。通过表面等离子体共振测定测定了C型SDF-1结合核酸197-B2与人SDF-1的结合亲和力(KD＝0.9nM)，在细胞培养体外化学毒性测定中分析出其IC50(抑制浓度50％)为0.2nM。这些数据显示，C型SDF-1结合核酸191-D5-001和197-B2具有近似的SDF-1结合亲和力(图5和8)。
结合核酸197-D1之外，全部鉴定的C型SDF-1结合核酸序列的核心核苷酸序列
共 享 序 列 (C型 式-2)。C 型 SDF-1结 合 核 酸
197-D1 在核心核苷酸序列中丢失一个核苷酸‘A’，且
仍结合SDF-1，得出替代性核心核苷酸序列( C型式-3)。
首先，在与A型SDF-1结合核酸192-A10-001的竞争下拉结合测定中分析了图5所示的全部C型SDF-1结合核酸(通过下拉测定和表面等离子体共振测定测定出KD＝1.5nM；IC50＝
0.12nM)。C型SDF-1结合核酸191-D5-001、197-B2、190-A3-001、197-H1、197-H3和197-E3在竞争实验中显示出弱于192-A10-001的结合亲和力。191-A5、197-B1、197-D1、197-H2和
197-D2测得甚更弱的结合亲和力(图5)。通过进一步的竞争下拉结合测定、表面等离子体共振测定和体外化学毒性测定进一步表征了所述分子及其衍生物。表征了C型SDF-1结合核酸191-D5-001其与人SDF-1的结合亲和力，而通过表面等离子体共振测定测定了平衡结合常数KD(KD＝0.8nM，图21)。用细胞培养体外化学毒性测定测得191-D5-001的IC50(抑制浓度50％)为0.2nM。通过表面等离子体共振测定测定了C型SDF-1结合核酸197-B2与人SDF-1的结合亲和力(KD＝0.9nM)，在细胞培养体外化学毒性测定中分析出其IC50(抑制浓度50％)为0.2nM。这些数据显示，C型SDF-1结合核酸191-D5-001和197-B2具有近似的SDF-1结合亲和力(图5和8)。
[0618] C型SDF-1结合核酸190-A3-001(48nt)含17个核苷酸的5’-端片段和12个核苷酸的3’-端片段，其中，一方面，位于5’-端片段的5’-端的4个核苷酸与位于3’-端片段的3’-端的4个核苷酸可彼此杂交形成末端螺旋。另外，5’-端片段中的核苷酸‘UGAGA’可与3’-端片段中的核苷酸‘UCUCA’杂交形成末端螺旋。减少至分子190-A3-001的5’-端片(‘GAGAUAGG’)的8个核苷酸和3’-端片段(‘CUGAUUCUC’)的9个核苷酸(其中5’-和3’-端片段的8个/9个核苷酸中的6个核苷酸可彼此杂交)不影响与SDF-1的结合亲和力(190-A3-004；图6和图19)。用下拉结合测定测定了190-A3-004的平衡结合常数KD(KD＝4.6nM，图20)，及通过表面等离子体共振测定测定了190-A3-004的平衡结合常数KD(KD＝4.7nM)。用细胞培养体外化学毒性测定测得190-A3-004的IC50(抑制浓度50％)为0.1nM(图22)。但是，在5’-端片段截断至2个核苷酸导致结合亲和力极强减小(190-A3-007；图6和图19)。
[0619] C 型 SDF-1 结 合 核 酸 191-D5-001、197-B2 和 197-H1( 核 心 核 苷 酸序 列： )、197-H3/191-A5( 核 心 核 苷 酸 序列： ) 和 197-E3/197-B1( 核 心 核 苷 酸 序 列：
)共享几乎相同的核心核苷酸序列(C型式-4；核心核
苷酸序列： 191-D5-001、197-B2和197-H1不共享近
似的5’-和3’-端片段(197-H3和197-E3具有与197-B2相同的5’-和3’-端片段)。
但是，5’-端片段的各10个核苷酸(197-B2、197-E3、197-H3)或10个核苷酸中的9个核苷酸(191-D5-001、197-H1)可与3’-端片段的各10个核苷酸(197-B2、197-E3、197-H3)或10个核苷酸中的9个核苷酸(191-D5-001、197-H1)杂交(图5)。上述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3，及191-A5、197-B1、197-H2、197-D1和197-D2的5’-端片段含共同的核苷酸序列‘RKSBUSNVGR’(C型式-5-5’)。上述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3，及191-A5、197-B1、197-H2、
197-D1和197-D2的3’-端片段含共同的核苷酸序列‘YYNRCASSMY’(C型式-5-3’)，其中优选所述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3的5’-和
3’-端片段。这些优选的所述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和
197-H3的5’-和3’-端片段可概括为通式‘RKSBUGSVGR’(C型式-6-5’；5’-端片段)和‘YCNRCASSMY’(C型式-6-3’；3’-端片段)。
)共享几乎相同的核心核苷酸序列(C型式-4；核心核
苷酸序列： 191-D5-001、197-B2和197-H1不共享近
似的5’-和3’-端片段(197-H3和197-E3具有与197-B2相同的5’-和3’-端片段)。
但是，5’-端片段的各10个核苷酸(197-B2、197-E3、197-H3)或10个核苷酸中的9个核苷酸(191-D5-001、197-H1)可与3’-端片段的各10个核苷酸(197-B2、197-E3、197-H3)或10个核苷酸中的9个核苷酸(191-D5-001、197-H1)杂交(图5)。上述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3，及191-A5、197-B1、197-H2、197-D1和197-D2的5’-端片段含共同的核苷酸序列‘RKSBUSNVGR’(C型式-5-5’)。上述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3，及191-A5、197-B1、197-H2、
197-D1和197-D2的3’-端片段含共同的核苷酸序列‘YYNRCASSMY’(C型式-5-3’)，其中优选所述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和197-H3的5’-和
3’-端片段。这些优选的所述C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、197-E3和
197-H3的5’-和3’-端片段可概括为通式‘RKSBUGSVGR’(C型式-6-5’；5’-端片段)和‘YCNRCASSMY’(C型式-6-3’；3’-端片段)。
[0620] 构建了C型SDF-1结合核酸191-D5-001的截短的衍生物，并在与原分子191-D5-001的竞争下拉结合测定中对其进行了检测(图7A、图7B和图19)。首先，如图7A所示，将5’-和3’-端片段的长度从各10个核苷酸(191-D5-001)缩短至各7个核苷酸(191-D5-004)，其中5’-端片段和3’-端片段的10个核苷酸的9个核苷酸(191-D5-001)或7个核苷酸中的6个核苷酸(191-D5-004)分别可彼此杂交。5’-和3’-端片段分别缩短至7个核苷酸(其中7个核苷酸中的6个核苷酸可彼此杂交)导致与SDF-1的结合亲和力减小(191-D5-004)。修饰了C型SDF-1结合核酸191-D5-004的末端片段，其中用‘C’替换191-D5-004的3’-端片段中的非成对核苷酸‘A’(191-D5-005)。此修饰导致结合提高。此衍生物-C型SDF-1结合核酸191-D5-005显示出与191-D5-001近似的SDF-1结合。将5’-和3’-端片段进一步分别截断至5个核苷酸产生长共29个核苷酸的分子(191-D5-007)。从191-D5-001与C型SDF-1结合核酸197-B2、191-D5-001、197-H1、191-A5、
197-H3、197-B1、197-E3、197-D1、197-H2和197-D2的相似性，且从191-D5-007所示数据可推测，原则上可将5’-和3’-端片截断至5个核苷酸，其中成功测试了5’-端片段的核苷酸序列‘CGGGA’和3’-端片段的核苷酸序列‘UCCCG’(C型SDF-1结合核酸191-D5-007)。
令人惊讶的是，C型SDF-1结合核酸191-D5-007结合SDF-1有时优于191-D5-001(用竞争结合测定基于适体水平测得)。用下拉结合测定(KD＝2.2nM，图20)和表面等离子体共振测定(KD＝0.8nM，图21)测定了191-D5-007的平衡结合常数KD。用细胞培养体外化学毒性测定测得191-D5-007的IC50(抑制浓度50％)为0.1nM。将两个末端片段进一步截断至
4个核苷酸(191-D5-010，图7A)。
197-H3、197-B1、197-E3、197-D1、197-H2和197-D2的相似性，且从191-D5-007所示数据可推测，原则上可将5’-和3’-端片截断至5个核苷酸，其中成功测试了5’-端片段的核苷酸序列‘CGGGA’和3’-端片段的核苷酸序列‘UCCCG’(C型SDF-1结合核酸191-D5-007)。
令人惊讶的是，C型SDF-1结合核酸191-D5-007结合SDF-1有时优于191-D5-001(用竞争结合测定基于适体水平测得)。用下拉结合测定(KD＝2.2nM，图20)和表面等离子体共振测定(KD＝0.8nM，图21)测定了191-D5-007的平衡结合常数KD。用细胞培养体外化学毒性测定测得191-D5-007的IC50(抑制浓度50％)为0.1nM。将两个末端片段进一步截断至
4个核苷酸(191-D5-010，图7A)。
[0621] 分别带有4个核苷酸的5’-和3’-端片段的C型SDF-1结合核酸191-D5-001的别的衍生物(191-D5-017/-024/-029)还在与191-D5-007的竞争下拉结合测定中显示出见效的SDF-1结合亲和力(图7B)。还测试了具有分别5个核苷酸长度的5’-和3’-端片段(191-D5-017-29a、191-D5-017-29b、191-D5-019-29a、191-D5-024-29a、191-D5-024-29b)。这些衍生物的5’-端片段的通式是‘XSSSSV’(C型式-7-5’)，且3’-端片段的通式是‘BSSSXS’(C型式-7-3’)，其中XS无或为‘S’。5个测试的变体中的2个显示出与191-D5-007相同的SDF-1结合亲和力(191-D5-024-29a、191-D5-024-29b；图7B)。显示出最佳SDF-1结合亲和力，且含分别5个核苷酸的5’-端和3’-端片段的191-D5-001衍生物(191-D5-007、
191-D5-024-29a、191-D5-024-29b)的5’-端和3’-端片段序列可概括为通式(5’-端片段：‘SGGSR’，C型式-8-5’；3’-端片段：‘YSCCS’，C型式-8-3’)。
191-D5-024-29a、191-D5-024-29b)的5’-端和3’-端片段序列可概括为通式(5’-端片段：‘SGGSR’，C型式-8-5’；3’-端片段：‘YSCCS’，C型式-8-3’)。
[0622] 在与原分子197-B2和191-D5-007的竞争下拉结合测定中分析了C型SDF-1结合核酸197-B2的截短的衍生物(图8)。与191-D5-007的竞争下拉结合测定显示197-B2与191-D5-007具有相同的SDF-1结合亲和力。将5’-和3’-端片段从各10个核苷酸(197-B2)缩短至各5个核苷酸(197-B2-005)不损失结合亲和力，其中5’-端片段和3’-端片段的核苷酸可彼此完全杂交。如果用197-B2-006的‘GCCGG’(5’-端片段)和‘CCGGC’(3’-端片段)替换197-B2-005跌5’-端(GCGGG)和3’-端(CCUGC)片段，可完全保持与SDF-1的结合亲和力。因为197-B2和191-D5-001(及它们的衍生物)共享相同的核心核苷酸序列，及测试了191-D5的具有分别4个核苷酸长的5’-和
3’-端片段的几个衍生物，省略了进一步截断5’-和3’-端片段。涉及了另外2个在5’-和
3’-端(5’-和3’-端片段)分别含6个核苷酸的衍生物。2个分子(197-B2-006-31a和
197-B2-006-31b)的SDF-1结合亲和力与191-D5-007和197-B2-006所示的相同(图8)。
显示出最佳SDF-1结合亲和力，且含分别5个核苷酸的5’-端和3’-端片段的197-B2衍生物的5’-端和3’-端片段序列可概括为通式(5’-端片段：‘GCSGG’，C型式-9-5’；3’-端片段：‘CCKGC’，C型式-9-3’)。
3’-端片段的几个衍生物，省略了进一步截断5’-和3’-端片段。涉及了另外2个在5’-和
3’-端(5’-和3’-端片段)分别含6个核苷酸的衍生物。2个分子(197-B2-006-31a和
197-B2-006-31b)的SDF-1结合亲和力与191-D5-007和197-B2-006所示的相同(图8)。
显示出最佳SDF-1结合亲和力，且含分别5个核苷酸的5’-端和3’-端片段的197-B2衍生物的5’-端和3’-端片段序列可概括为通式(5’-端片段：‘GCSGG’，C型式-9-5’；3’-端片段：‘CCKGC’，C型式-9-3’)。
[0623] 组合C型SDF-1结合核酸191-D5-001(5’-端片段：‘SGGSR’，C型式-8-5’；3’-端片段：‘YSCCS’，C型式-8-3’)和197-B2(5’-端片段：‘GCSGG’，C型式-9-5’；3’-端片段：‘CCKGC’，C型式-9-3’)的截短的衍生物的优选的5’-和3’-端片段，共同的优选的5’-端和3’-端片段通式是‘SSSSR’(5’-端片段，C型式-10-5’)和‘YSBSS’(3’-端片段：C型式-10-3’)。
[0624] 1.4：另外的SDF-1结合核酸
[0625] 另外，还鉴定了3种不共享‘A型’、‘B型’和‘C型’SDF-1结合基序的SDF-1结合核酸。用下拉结合测定分析这些为适体(图9)。
[0626] 需知，图1～图9所示任意序列均为本发明的核酸，包括他们的截断形式，还包括它们的延伸形式，但前提是，分别截断和延伸核酸分子仍能结合靶。
[0627] 实施例2：40kda-PEG及SDF-结合镜体的其他修饰
[0628] 为延长镜体的体外血浆滞留时间，将镜体193-G2-012、192-A10-008、191-D5-007、197-B2-006和197-B2-006-31b如第3章所述在5’端共价偶联于40kDa聚乙二醇(PEG)部 分 (PEG化 的 克 隆：193-G2-012-5’-PEG、192-A10-008-5’PEG、191-D5-007-5’PEG、
197-B2-006-5’PEG和197-B2-006-31b-5’PEG)。
197-B2-006-5’PEG和197-B2-006-31b-5’PEG)。
[0629] 在细胞培养体外TAX测定(第5章)中及通过使用Biacore的等离子体共振测定(第6章)分析了PEG化的镜体分子。全部40kDa-PEG-修饰的镜体仍能抑制SDF-1诱导的化学毒性，并能以低的纳摩尔范围与SDF-1结合(图23A、23B、24A和24B)。
[0630] 此 外， 用 40kDa-PEG、30kDa-PEG、100kDa-HES 或 130kDa-HES(PEG 化 的克 隆：192-A10-001-5’PEG40、192-A10-001-5’PEG30、192-A10-001-5’HES100、192-A10-001-5’HES130；第3章中的偶联过程)修饰SDF-结合镜体192-A10-001。如图
25A和25B所示，PEG-部分或HES-部分均对镜体抑制SDF-1诱导的化学毒性的潜力无影响。
25A和25B所示，PEG-部分或HES-部分均对镜体抑制SDF-1诱导的化学毒性的潜力无影响。
[0631] 实施例3：适体和镜体的合成及衍生
[0632] 3.1：小规模合成
[0633] 用ABI 394合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，使用2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学(Damha和Ogilvie，1993)，通过固相合成法产生了适体和镜体。D-和L-构型的rA(N-Bz)-、rC(Ac)-、rG(N-ibu)-和rU-亚磷酰胺购自ChemGenes，Wilmington，MA。通过凝胶电泳纯化适体和镜体。
[0634] 3.2：大规模合成及修饰
[0635] 用 合 成 仪 (Amersham Biosciences ；GeneralElectricHealthcare，Freiburg)，使用2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学(Damha和Ogilvie，
1993)，通过固相合成法产生了镜体。L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-和L-rU-亚磷酰胺购自ChemGenes(Wilmington，MA，USA)。5’-氨基酸修饰剂购自AmericanInternational Chemicals Inc.(Framingham，MA，USA)。镜体合成分别 始于L-riboG、L-riboC、L-riboA、L-riboU，修饰的CPG孔径 (Link Technology，Glasgow，UK)。为偶联(每循环15分钟)，使用了乙腈中的0.3M苄硫基四唑(American International ChemicalsInc.，Framingham，MA，USA)和3.5当量的相应的乙腈中的
0.2M亚磷酰胺溶液。使用了氧化加帽循环。另外的寡核苷酸合成用标准溶剂和试剂购自Biosolve(Valkenswaard，NL)。DMT-ON合成镜体；去保护后，通过制备RP-HPLC(Wincott F.et al.，1995)使用Source15RPC液(Amersham)将其纯化。用80％乙酸除去5’DMT基团(室温下90分钟)。接下来，加入2M NaOAc水溶液，通过使用5K再生纤维素膜的正切流动过滤将镜体脱盐(Millipore，Bedford，MA)。
1993)，通过固相合成法产生了镜体。L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-和L-rU-亚磷酰胺购自ChemGenes(Wilmington，MA，USA)。5’-氨基酸修饰剂购自AmericanInternational Chemicals Inc.(Framingham，MA，USA)。镜体合成分别 始于L-riboG、L-riboC、L-riboA、L-riboU，修饰的CPG孔径 (Link Technology，Glasgow，UK)。为偶联(每循环15分钟)，使用了乙腈中的0.3M苄硫基四唑(American International ChemicalsInc.，Framingham，MA，USA)和3.5当量的相应的乙腈中的
0.2M亚磷酰胺溶液。使用了氧化加帽循环。另外的寡核苷酸合成用标准溶剂和试剂购自Biosolve(Valkenswaard，NL)。DMT-ON合成镜体；去保护后，通过制备RP-HPLC(Wincott F.et al.，1995)使用Source15RPC液(Amersham)将其纯化。用80％乙酸除去5’DMT基团(室温下90分钟)。接下来，加入2M NaOAc水溶液，通过使用5K再生纤维素膜的正切流动过滤将镜体脱盐(Millipore，Bedford，MA)。
[0636] 3.3：PEG化
[0637] 为延长镜体的体外血浆滞留时间，将镜体于5’端共价偶联于40kDa聚乙二醇(PEG)。
[0638] 为PEG化(PEG化方法的技术细节见欧洲专利申请EP 1306382)，将纯化的5’-氨基酸修饰的镜体溶解于H2O(2.5ml)、DMF(5ml)和缓冲液A(5ml；通过混合柠檬酸·H2O[7g]、硼酸[3.54g]、磷酸[2.26ml]、和1M NaOH[343ml]，并加水至终体积1l制成；用1M HCl调至pH＝8.4)的混合物中。
[0639] 用1M NaOH将镜体溶液的pH调至8.4。然后在37℃下，每30分钟将40kDa PEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)加入0.25当量的6个部分，直到达到最大产量75％～85％。在加入PEG-NHS酯的过程中用1M NaOH将反应混合物的pH保持在8～8.5。
[0640] 向反应混合物中混入4ml尿素溶液(8M)和4ml缓冲液B(水中的0.1M三乙铵乙酸盐)，并加热至95℃15分钟。然后通过RP-HPLC，用Source 15RPC液(Amersham)，使用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C：乙腈中的0.1M三乙铵乙酸盐)纯化PEG化的镜体。过量的PEG在5％的缓冲液中洗脱，PEG化的镜体在10％～15％缓冲液C中洗脱。将纯度＞95％(通过HPLC评估)的产物级分合并，并与40ml 3M的NaOAc混合。通过正切流动过滤(5K再生的纤维素膜，Millipore，Bedford MA)将PEG化的镜体脱盐。
[0641] 3.4：HES化
[0642] 为延长镜体的体外血浆滞留时间，将镜体共价偶联于各分子量(＞130kDa)的羟乙基淀粉(HES)，且取代度＞0.5。镜体的5’端是优选的缀合用位点。
[0643] 为HES化(核酸的HES化方法的技术细节见德国Offenlegungsschrift DE10112825A1，D/L-核酸的HES化方法的技术细节见PCT WO 02/080979A2)，将纯化的5’-氨基酸修饰的镜体溶解于碳酸氢钠(0.3M，1ml)，且将pH调至8.5。
[0644] 有关镜体，将5倍过量的自由的HES酸(3.3mmol，Supramol，Rosbach，Germany)和二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸盐(3.3mmol)加入到N，N-二甲基甲酰胺(1ml)来得到活化的HES的N-湖泊酰亚胺酯溶液。为溶解所有反应物，在60℃下短暂搅拌混合物，冷却至25℃，然后在25℃下搅拌1.5小时。将镜体溶液加入到活化的HES溶液中，并将得到的混合物在25℃和pH8.5下搅拌。通过分析IEX-HPLC监控反应。一般在1小时内缀合进展到＞75％。
[0645] 为经Source 15Q液(GE，Freiburg，Germany)的IEX-HPLC纯化，向反应混合物中混入10倍量的缓冲液A(1mM EDTA、25mMTris、水/乙腈中的10mM NaClO49∶1、pH 4)。以5％的缓冲液A(1mMEDTA、25mM Tris、水/乙腈中的500mM NaClO49∶1、pH 4)洗脱过量的HES，以20～30％的缓冲液B洗脱HES-镜体缀合物。将纯度＞95％(通过HPLC评估)的产物级分合并，并通过正切流动过滤(5K再生的纤维素膜，Millipore，Bedford MA)脱盐。
[0646] 实施例4：结合常数的测定(下拉结合测定)
[0647] 4.1：直接下拉结合测定
[0648] 在37℃下的下拉结合测定中测定了适体与人D-SDF-1的亲和力。适体经T4多核32
苷酸激酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)用[γ- P]-标记的ATP(Hartmann Analytic，Braunschweig，Germany)5’-磷酸标记。经标记的适体的特异性放射性为200,000～
800,000cpm/pmol。在变性和复性后，在37℃下，将10、20、30或40pM浓度的适体在选择缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％[w/vol]Tween-20)中与变化量的生物素化的人D-SDF-1温育4～12小时，以在低浓度下达到平衡。向选择缓冲液中补入10μg/ml人血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和10μg/ml酵母RNA(Ambion，Austin，USA)，以防止结合偶体与所用塑料器具或固定基质的吸附。生物素化的人D-SDF-1的浓度范围设为8pM～100nM；总反应体积设为1ml。将肽和肽-适体复合物固定在1.5μl用筛选缓冲液预平衡的抗生蛋白链菌素UltralinkPlus颗粒(Pierce Biotechnology，Rockford，USA)上，并重悬浮于总体积6μl。将颗粒在控温混合器中于相应温度下在悬浮液中保持30分钟。除去上清并适当洗涤后，在闪烁计数器中定量固定的放射性。根据生物素化的人D-SDF-1的浓度标绘结合百分比，并使用软件算法(GRAFIT；Erithacus Software；Surrey U.K)(假设1∶1化学计量学)得到解离常数。
苷酸激酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)用[γ- P]-标记的ATP(Hartmann Analytic，Braunschweig，Germany)5’-磷酸标记。经标记的适体的特异性放射性为200,000～
800,000cpm/pmol。在变性和复性后，在37℃下，将10、20、30或40pM浓度的适体在选择缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％[w/vol]Tween-20)中与变化量的生物素化的人D-SDF-1温育4～12小时，以在低浓度下达到平衡。向选择缓冲液中补入10μg/ml人血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和10μg/ml酵母RNA(Ambion，Austin，USA)，以防止结合偶体与所用塑料器具或固定基质的吸附。生物素化的人D-SDF-1的浓度范围设为8pM～100nM；总反应体积设为1ml。将肽和肽-适体复合物固定在1.5μl用筛选缓冲液预平衡的抗生蛋白链菌素UltralinkPlus颗粒(Pierce Biotechnology，Rockford，USA)上，并重悬浮于总体积6μl。将颗粒在控温混合器中于相应温度下在悬浮液中保持30分钟。除去上清并适当洗涤后，在闪烁计数器中定量固定的放射性。根据生物素化的人D-SDF-1的浓度标绘结合百分比，并使用软件算法(GRAFIT；Erithacus Software；Surrey U.K)(假设1∶1化学计量学)得到解离常数。
[0649] 4.2：竞争下拉结合测定
[0650] 为比较不同的D-SDF-1结合适体，进行竞争排序测定。为此，放射性标记可得到的最仿射适体(见上)，并作为参照。变性和复性后，在37℃下与生物素化的人D-SDF-1在1ml选择缓冲液中，在导致固定后约5～10％肽结合的条件下温育。并在不竞争下用NeutrAvidin琼脂糖或蛋白链菌素Ultralink Plus(二者均来自Pierce)洗涤。将过量的变性和复性非标记的D-RNA适体变体加入不同浓度(例如2、10和50nM)，经标记的参照适体加入平行结合反应。比较待测试适体与参照适体的靶结合，从而依赖其结合特征降低结合信号。此测定中发现的活性最大的适体作为另外的适体变体的比较分析的新参照。
[0651] 实施例5：SDF-1-结合镜体抑制SDF-1诱导的化学毒性的分析
[0652] 在37℃、5％CO2下，在RPMI 1640培养基中用含有10％的胎牛血清、100个单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素 (Invitrogen，Karlsruhe，Germany)的Glutamax(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)培养Jurkat人T细胞白血病细胞(从DSMZ
6 6
获得，Braunschweig)。在实验前一天，将细胞于新瓶中以0.3×10/ml(9×10/30ml)接种于标准培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。
6 6
获得，Braunschweig)。在实验前一天，将细胞于新瓶中以0.3×10/ml(9×10/30ml)接种于标准培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。
[0653] 为实验，离心细胞(以300g，5分钟)，重悬，计数，并用15mlHBH(含1mg/ml牛血清白蛋白和20mM HEPES的Hanks平衡盐溶液；Invitrogen，Karlsruhe，Germany)洗涤一6 6
次。然后以3×10/ml或1.33×10/ml重悬细胞，依赖于所用滤板类型。然后使细胞迁移通过滤板的多孔膜几个小时向含SDF-1和各种量的镜体的溶液。使用了Transwell板和具有多孔聚碳酸膜的垫圈，5μm孔径(Corning；3421)或MultiScreen MIC板(Millipore，MAMIC5S10)。
次。然后以3×10/ml或1.33×10/ml重悬细胞，依赖于所用滤板类型。然后使细胞迁移通过滤板的多孔膜几个小时向含SDF-1和各种量的镜体的溶液。使用了Transwell板和具有多孔聚碳酸膜的垫圈，5μm孔径(Corning；3421)或MultiScreen MIC板(Millipore，MAMIC5S10)。
[0654] 5.1：Transwell板的方案
[0655] 在Transwell板的低隔室中的达600μl的HBH中制备刺激溶液(SDF-1+各浓度的镜体)，并温育20～30分钟。所有条件下都制备至少2次。将垫圈转移到含刺激溶液的6 5
孔中，并将100μl的细胞悬液以3×10/ml添加到垫圈(3×10 细胞/孔)。然后使细胞在37℃下迁移3小时。
孔中，并将100μl的细胞悬液以3×10/ml添加到垫圈(3×10 细胞/孔)。然后使细胞在37℃下迁移3小时。
[0656] 之后，除去垫圈，将60μl刃天青(Sigma，Deisenhofen，Germany)工作溶液(PBS中440μM；Biochrom，Berlin，Germany)加入到孔中(也加入到校准孔中)。将板在37℃下温育2.5～3小时。温育后，将各孔中的200μl转移到空的96孔板。在544nm(激发)和590nm(发射)下用Fluostar Optima多检测板读取仪(BMG，Offenburg，Germany)进行荧光信号的测定。
[0657] 5.2：Millipore多筛选板的方案
[0658] 在0.2ml低架96管板中将刺激溶液(SDF-1+各浓度的镜体)制成10×溶液。将135μl的HBH移入多筛选板的低隔室中，并加入15μl刺激溶液。所有条件制为3个平行。
6
20～30分钟后，将滤板插入到含多刺激溶液的板中，并向滤板孔中以1.33×10/ml加入
5
75μl细胞悬液(1×10 细胞/孔)。然后使细胞在37℃下迁移3小时。
6
20～30分钟后，将滤板插入到含多刺激溶液的板中，并向滤板孔中以1.33×10/ml加入
5
75μl细胞悬液(1×10 细胞/孔)。然后使细胞在37℃下迁移3小时。
[0659] 然后移除插板，并将20μl刃天青工作溶液(PBS中440μM)加入到低孔中。将板在37℃下温育2.5～3小时。温育后，将各孔中的100μl转移到空的96孔板。如上所述进行荧光信号的测定。
[0660] 5.3：评估
[0661] 为评估，用背景荧光校正荧光值(孔中无细胞)。然后计算有无SDF-1的实验条件的差异。将无镜体(仅SDF-1)的样品值设为100％，将有镜体的样品值计算为所述无镜体(仅SDF-1)的样品值的百分比。作为剂量应答曲线，根据镜体浓度标绘百分比值，由所得曲线图确定IC50值(存在50％的无镜体的活性的镜体浓度)。
[0662] 5.4：结果
[0663] 5.4.1：由人SDF-1的剂量依赖的Jurkat细胞刺激
[0664] 发现人SDF-1以剂量依赖性方式刺激Jurkat细胞的迁移，在约0.3nM时有半最大刺激(图11)。
[0665] 5.4.2：由结合SDF-1的镜体的对人SDF-1诱导的化学毒性的剂量依赖性抑制[0666] 当使细胞向含人SDF-1和增加浓度的SDF-1结合镜体的溶液迁移时，观察到剂量依赖性抑制。所测镜体的相应IC50示于实施例1。当不用SDF-1结合镜体而是用非特异性对照镜体时，观察不到达到1μM的抑制作用(图26)。
[0667] 5.4.3：由结合SDF-1的镜体的对小鼠SDF-1诱导的化学毒性的剂量依赖性抑制[0668] SDF-1在物种间非常保守：源于小鼠的SDF-1与源于人的SDF-1α仅相差一个氨基酸(第18位为异亮氨酸，而非缬氨酸)。鼠SDF-1可刺激Jurkat细胞的化学毒性(图27)，但发现此作用被镜体192-A10-001和191-D5-007-5’-PEG以与人SDF-1相同的能力抑制(图28)。
[0669] 实施例6：通过表面等离子体测定的结合分析
[0670] 用Biacore2000仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)分析了镜体与人SDF-1α的结合。当待通过胺基实现SDF-1α偶联时，用水透析SDF-1α1～2小时(Millipore VSWP混合的纤维素酯；孔径，0.025μM)，以除去干扰性的胺。在偶联蛋白前，通过35μl注射0.4M NHS和0.1M EDC的1∶1稀释液，以5μl/分钟的流量活化CM4感应芯片(Biacore AB，Uppsala，Sweden)。以0.1～1.5μg/ml的浓度，以2μl/分钟的流量注射趋化因子，至仪器应答在1000～2000RU(相对单位)的范围内。通过以5μl/分钟的流量注射35μl乙醇胺盐酸溶液(pH 8.5)去活化未反应的NHS酯。将感应芯片用结合缓冲液预处理两次，并以10μl/分钟平衡1～2小时，至基线看起来稳定。通过在筛选缓冲液(Tris-HCl，20mM；NaCl，137mM；KCl，5mM；CaCl2，1mM；MgCl2，1mM；Tween20，0.1％[w/v]；pH 7.4)中的1000、
500、250、125、62.5、31.25和0nM浓度的一系列镜体的注射评估了所有蛋白的动力学参数和解离常数。在所有实验中如下进行分析：在37℃下，用Kinject命令定义结合时间为180秒，解离时间为360秒，流量为10μl/分钟。用BIAevaluation 3.0软件(BIACORE AB，Uppsala，Sweden)用Langmuir 1∶1拟合算法进行数据分析和解离常数(KD)计算。
500、250、125、62.5、31.25和0nM浓度的一系列镜体的注射评估了所有蛋白的动力学参数和解离常数。在所有实验中如下进行分析：在37℃下，用Kinject命令定义结合时间为180秒，解离时间为360秒，流量为10μl/分钟。用BIAevaluation 3.0软件(BIACORE AB，Uppsala，Sweden)用Langmuir 1∶1拟合算法进行数据分析和解离常数(KD)计算。
[0671] 实施例7：由结合SDF-1的镜体的对[125J]-SDF-1与CXCR4表达细胞的结合的抑制[0672] 7.1：方法
[0673] 编 码 人 CXCR4 受 体 的 cDNA 克 隆 (NM_003467.2) 购 自OriGeneTechnologies(Rockville，MD)，并克隆进pCR3.1-载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。将得到的载体用脂质体2000(Invitrogen)转染进CHO-K1细胞(DSMZ，Braunschweig，Germany)中，并通过用遗传霉素处理来筛选稳定表达的细胞系。通过RT-PCR确认受体的表达。
[0674] 为进行结合测定，将CXCR4表达细胞以1×105细胞/孔的密度接种到聚赖氨酸包被的24孔板中，并在37℃、5％CO2下，含50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和0.5mg/ml遗传霉素的CHO-超级培养基(Cambrex，Verviers，Belgium)中培养过夜。
[0675] 为进行结合实验，除去培养基，并用附含20mM HEPES、1mg/ml牛血清白蛋白、0.1mg/ml的杆菌肽(HBB)的Hanks平衡盐溶液洗涤细胞一次。将细胞在室温下与
125
50pM[ J]-SDF-1(PerkinElmer，Rodgau，Germany)和变化浓度的镜体在0.2ml HBB中温育
1小时。
125
50pM[ J]-SDF-1(PerkinElmer，Rodgau，Germany)和变化浓度的镜体在0.2ml HBB中温育
1小时。
[0676] 通过向多个孔中加入未标记的人SDF-1(R&D Systems，Wiesbaden，Germany)至终浓度0.5μM来测定非特异性结合。
[0677] 温育期后，除去上清，并用冰冷的HBB洗涤孔3次。然后用0.1ml0.1M NaOH裂解细胞。将裂解物转移到闪烁瓶中，并在加入4mlUnisafe 1Liquid Szintillation混合剂(Zinsser，Frankfurt，Germany)后，用Beckman LS6500闪烁计数器计数。
[0678] 因为非特异性结合(在高量的未标记SDF-1的存在下结合)值多少高于高浓度(500pM)镜体存在下的总结合值，将最大结合(“max”)与500pM镜体存在下的结合的差用于计算IC50值。
[0679] 7.2：结果
[0680] 根据镜体浓度表追结合的[125J]-SDF-1发现，SDF-1的结合可被镜体192-A10-001阻断，IC50约为60pM(图29)。
[0681] 实施例8：由结合SDF-1的镜体的对SDF-1诱导的MAP激酶活化的抑制
[0682] 8.1：方法
[0683] 将表达CXCR4的CHO细胞已0.5×106细胞/孔的密度接种于6孔平板中，并在37℃、5％CO2下，含50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和0.5mg/ml遗传霉素的CHO-超级培养基(Cambrex，Verviers，Belgium)中培养约3个小时。细胞贴壁后，除去培养基，代之以含50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素的Ham’s F12培养基。然后在37℃、5％CO2下温育细胞过夜。刺激前3小时时，再将培养基换成新鲜的Ham’s F12培养基。用1nM人SDF-1和各种量的镜体刺激细胞5或10分钟。然后除去培养基，用1ml冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)快速洗涤细胞，然后用SDS-样品缓冲液(Tris/HCl，pH 6.8，62.5mM；甘油，
10％；SDS，2％；溴酚蓝，0.01％；β-巯基乙醇，5％)裂解。向各孔中加入1μl 0.5u/μl Benzonase(Merck，Darmstadt，Germany)，并在室温下温育5～10分钟后，将裂解物转移到Eppendorf离心管中，在95℃下温育5分钟，并储存于-20℃待进一步分析。
10％；SDS，2％；溴酚蓝，0.01％；β-巯基乙醇，5％)裂解。向各孔中加入1μl 0.5u/μl Benzonase(Merck，Darmstadt，Germany)，并在室温下温育5～10分钟后，将裂解物转移到Eppendorf离心管中，在95℃下温育5分钟，并储存于-20℃待进一步分析。
[0684] 在10％的变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离25μl裂解物。然后将蛋白通过电转移印记转移至HybondECL硝酸纤维素膜(Amersham/GE Healthcare，Munich，Germany)上。印记后，用丽春红(在3％三氯乙酸中的0.2％)染色膜，用于控制蛋白上样和转移，再通过在2～8℃下，在含10％脱脂奶粉的TBS-T(含0.1％Tween 20的Tris-缓冲盐水(20mM Tris/HCl，pH 7.6，137mM NaCl))中温育过夜来阻断。
[0685] 然后在室温下将膜与兔抗-磷酸-MAP-激酶抗体(在TBS-T中的10％乳中以1∶1000)温育2小时。用TBS-T洗涤5分钟3次后，在室温下将膜与抗-兔-IgG-HRP-缀合物(在TBS-T中的10％乳中以1∶2000)温育1小时。然后将膜再用TBS-T洗涤5分钟R TM
3次后，随后在LumiGlo 化学发光剂中温育1分钟。通过曝光于Hyperfilm ECL化学发光胶片(Amersham/GE Healthcare)30秒钟～2分钟来检测发光。抗体和化学发光剂是Cell Signaling Technology(New EnglandBiolabs，Frankfurt a.M.，Germany)的PhosphoPlus p44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗体试剂盒的成分。
3次后，随后在LumiGlo 化学发光剂中温育1分钟。通过曝光于Hyperfilm ECL化学发光胶片(Amersham/GE Healthcare)30秒钟～2分钟来检测发光。抗体和化学发光剂是Cell Signaling Technology(New EnglandBiolabs，Frankfurt a.M.，Germany)的PhosphoPlus p44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗体试剂盒的成分。
[0686] 8.2：结果
[0687] 用1nM人SDF-1刺激表达CXCR4的细胞5分钟导致MAP-激酶的深度刺激，表现为反映活化的MAP-激酶的条带强度增强。MAP-激酶的活化可被镜体191-A10-001剂量依赖性地抑制(图30)。
[0688] 实施例9：主动脉环萌发测定中人SDF-1结合镜体193-G2-012-5’-PEG的功能分析
[0689] 为测试人SDF-1结合镜体193-G2-012-5’-PEG在标准血管生成器官培养测定中是否有功能，进行了主动脉环萌发测定。此测定(其中评估由移植物的血管样延伸的长度和丰度)已成为最广泛使用的血管生成器官培养模型(Auerbach et al.2003)。SDF-1在此类测定中显示出诱导萌发(Salcedo et al.1999)。
[0690] 将大鼠主动脉切成环形，包埋于胶原基质中，并与SDF-1和SDF-1+人SDF-1结合镜体193-G2-012-5’-PEG或SDF+非功能性PEG化的不结合SDF-1的对照镜体温育。6～7天后，通过照相和测定萌发指数来分析萌发(即内皮细胞生长晕)。
[0691] 9.1：方法
[0692] 从Bagheri Life sciences(Berlin，Germany)获得雄性大鼠主动脉。新鲜准备主动脉，并转移到冰上的含50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(二者均来自Invitrogen，Karlsruhe，Germany)和2.5μg/ml 两 性 霉 素B(Cambrex，USA)的 MCDB131-培 养 基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。
[0693] 实验中，将单个主动脉转移到细胞培养皿中，并除去培养基和残留结缔组织。然后用解剖刀将主动脉切成约1～2mm长的环形。在Medium199(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中精洗所述环(至少5次)，然后放到每孔含450μl胶原溶液的24孔板孔中。将9ml大鼠尾胶原(在0.1％乙酸中3mg/ml；Sigma，Deisenhofen，Germany)与1.12ml
10×Medium 199(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)、1.12ml10×胶原-缓冲液(0.05N NaOH，200mM HEPES，260mM NaHCO3)和0.6ml 200mM谷氨酰胺来制备该胶原溶液。将环放成修切边与孔底垂直。通过将板在37℃下温育至少1小时来使胶原固化。然后将含添加物(SDF-1和镜体)的MCDB131-培养基加入各孔。然后将环在37℃下温育6～7天。另外用VEGF(血管内皮生长因子)进行实验，作为萌发对照。
10×Medium 199(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)、1.12ml10×胶原-缓冲液(0.05N NaOH，200mM HEPES，260mM NaHCO3)和0.6ml 200mM谷氨酰胺来制备该胶原溶液。将环放成修切边与孔底垂直。通过将板在37℃下温育至少1小时来使胶原固化。然后将含添加物(SDF-1和镜体)的MCDB131-培养基加入各孔。然后将环在37℃下温育6～7天。另外用VEGF(血管内皮生长因子)进行实验，作为萌发对照。
[0694] 通过用数码照相机照相来记录萌发。在一些情况下，通过加入1ml10％多聚甲醛进行固定，并存储于2～8℃，为进一步记录。用ScionImage图处理软件分析照片。在由镜台测微器获取的照片的辅助下绘制标准曲线，在从环缘的距离0.33mm内绘线。通过软件生成沿该线的点直方图，打印直方图，并对峰(代表与线交叉的萌芽)进行计数。此数作为萌发指数。每个条件下评估4～5环。用Excel用WinSTAT进行统计学分析。
[0695] 9.2：结果
[0696] 可证实，SDF-1诱导萌发，且此作用可被人SDF-1结合镜体193-G2-012-5’-PEG阻断。未观察到非功能性PEG化的对照镜体阻断SDF-1诱导的萌发(图31和32)。
[0697] 实施例10：通过单次静脉内注射NOX-A12(用30或40kDa的PEG衍生化)的小鼠中造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HPC)的移动
[0698] 10.1：测试物质和施用方案
[0699] 给小鼠静脉内注射13.4mg/kg SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)、SDF-1结合镜体NOX-A12-NO30(SEQ ID NO：242)或无SDF-1结合活性的对照镜体rev NOX-A12(SEQ ID NO：243)。注射(每种物质和时间点5只小鼠)后1、6、24、48小时处死动物，并采血。给对照组注射媒质(5％葡萄糖)、AMD-3100(Sigma，France，5mg/kg s.c.)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF，优保津)(2.5μg/小鼠/注射，每12小时)。在与上述相同的时间点处死动物(见图33)。对于G-CSF(优保津)组，由于每12小时一次注射的注射方案，则注射后1和6小时处死的动物仅接受一次注射，注射后24小时时处死的组接受2次注射(在0和12小时)，注射后48小时时处死的组接受4次注射(在0、12、24和36小时)(见图33)。用血细胞计数器对血细胞进行计数。
[0700] 10.2：HSC/HPC检测
[0701] 将50μl全血首先与染色缓冲液(PBS[Ref 17-516F，Lonza]，0.2％BSA[Ref A7030，Sigma]，0.02％NaN3[Ref S2002，Sigma])中的FcR结合剂(Ref 130-092-575，Miltenyi Biotec，Paris，France)温育，再在室温下于黑暗中与缀合了FITC的抗-CD117抗体和缀合了PE的抗-Ly-6A/E抗体或者与相应的同种型(如下表所述)温育30分钟。
[0702]
[0703] 用“固定和裂解”过程裂解红细胞。简言之，通过将25μl IOTest溶液3(10×固定溶液[Ref A07800，Beckman Coulter，Villepinte，France])加入1ml VersaLyse[Ref A09777，Beckman Coulter]中而制备出“固定和裂解”缓冲液，并将1ml混合物加入到固定的细胞。在室温下黑暗中涡旋及温育10分钟后，离心细胞，并用3ml染色缓冲液洗涤1次，及重悬于1ml参照微珠溶液(PKH26，Ref P7458，220,000beads/ml，Sigma，1/2稀释于染色缓冲液)中。将样品存储于冰上，防止曝光，直至FACS分析。
[0705] 10.3：每μL中绝对细胞数的计数
[0706] 血样品的体积是50μl。在制备过程末，将白细胞(含于50μl血样品中)重悬于0.75ml微珠溶液(由1ml中含220,000珠的储存液的1/2稀释得到)中。后一溶液的每mL细胞数是：(CN/BN)×(220000/2)，且总细胞数是：(CN/BN)×(220000/2)×(0.75/1)，其中CN是细胞计数，BN是微珠计数。
[0707] 因此，该总细胞数含于50μl血液中，每μl血液中的绝对细胞数(ACN)是：(CN/BN)×(220000/2)×(0.75/1)×(1/50)。
[0708] 10.4：集落形成单位(CFU)的测定
[0709] 仅选择那些时间点中含有最大量造血祖细胞(HPC)/造血干细胞(HSC)进行CFU测定(每种物质全部小鼠相同时间点)。通过将10体积的10×裂解缓冲液(0.8％NH4Cl及0.1mM EDTA)(ref 07800，StemCell Technologies)加入到外周血中，通过颠倒管3～4次，并在冰上温育5～15分钟来进行正常外周血样品中红细胞(RBC)的耗尽。以1,200rpm离心7分钟后，用含2％热灭活的胎牛血清(FBS，RefDE14-802F，Lonza)的Iscove’s改良的Dulbecco′s培养基(IMDM)洗涤白细胞(WBC)两次。用含亚甲兰(Ref 07060，StemCellTechnologies)的3％乙酸1/20稀释后，用血细胞计数器(MS9-5计数器(Melet Schloesing，Osny，France))对有核的白细胞进行计数。
[0710] 将细胞以3个平行平铺于含0.9％甲基纤维素的IMDM(RefMetho M03434，StemCell Technologies)(已含2％热灭活的FBS、重组小鼠(rm)干细胞因子(SCF，肥大细胞和骨髓样和淋巴样祖细胞的生长)、rm IL-3和rh IL-6(所有谱系的早期骨髓样祖细胞的生长)、和重组人促红细胞生成素(rh EPO，红系祖细胞的生长))中。简言之，将10倍浓缩的WBC(0.4ml)稀释于甲基纤维素完全的IMDM中(在确认实验中待定义的终浓度)，全程涡旋，并静置2～5分钟，以在调配前消除泡沫。用luer-lock注射器和16G顿头针(Ref28110，StemCell Technologies)将1.1ml含细胞混合物的甲基纤维素培养基调配到3个35mm培养皿(Ref 27150，StemCell Technologies)中的每一个。轻轻倾斜皿，并旋转，以使甲基纤维素平均分散。将含另外的未覆盖的无菌水的大皿(含35mm皿)用于在37℃、5％CO2、95％湿度温育7～12天的过程中保持35mm皿。
[0711] 温育末，用倒置显微镜和60mm网格计分皿(gridded scoringdish，Ref 27500，StemCell Technologies)以BFU-E(爆发红系集落形成单位)、CFU-GM(粒细胞和/或巨噬细胞集落形成单位)、和CFU-GEMM(粒细胞、红系细胞、巨噬细胞和巨核细胞集落形成单位)手工对集落进行计数，用CFU/mL血校正集落数。
[0712] 10.5：流式细胞术的结果
[0713] 如在FACS测定中通过CD117和Ly-6A/E双染色所测定，SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40和NOX-A12-NO30导致HPC/HSC显著增加(见图34)。在施用镜体后6小+ +
时观察到峰值。NOX-A12-JE40导致每μL释放700CD117Ly-6A/E 细胞。SDF-1结合镜+ +
体NOX-A12-NO30每μL血释放300CD117Ly-6A/E 细胞。媒质组中，每μL血计数得+ +
100CD117Ly-6A/E 细胞。在接受4G-CSF注射，并在首次注射后48小时处死的小鼠中观察+ +
到G-CSF的HSC/HPC移动作用(每μL 250CD117Ly-6A/E 细胞)。AMD-3100和SDF-1结合镜体revNOX-A12-JE40不显示任何作用(见图34，全部时间点和全部组的坐标图示)。
时观察到峰值。NOX-A12-JE40导致每μL释放700CD117Ly-6A/E 细胞。SDF-1结合镜+ +
体NOX-A12-NO30每μL血释放300CD117Ly-6A/E 细胞。媒质组中，每μL血计数得+ +
100CD117Ly-6A/E 细胞。在接受4G-CSF注射，并在首次注射后48小时处死的小鼠中观察+ +
到G-CSF的HSC/HPC移动作用(每μL 250CD117Ly-6A/E 细胞)。AMD-3100和SDF-1结合镜体revNOX-A12-JE40不显示任何作用(见图34，全部时间点和全部组的坐标图示)。
[0714] SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40处理的结果，HSC/HPC的瞬时增加伴随总白细胞计数的瞬时增加，其主要由巨噬细胞、粒细胞和中性粒细胞数增加驱动，且被嗜酸性粒细胞驱动。发现优保津诱导白细胞计数(WBC计数)增加，伴随嗜酸性粒细胞[％]降低(见图41)。
[0715] 10.6：CFU测定的结果
[0716] 相 比 媒 质(0.8CFU/mL)，所 有 物 质 导 致 总CFU的 平 均 值 增 加。 但revNOX-A12-JE40(6小时)和AMD3100(6小时)仅显示出边缘效应(分别为1.1和1.5CFU/mL)。SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40的一次注射导致约如4次G-CSF注射高的6小时后血中CFU/mL(在首次注射后48小时和第4次注射后12小时测量)(分别为3.7和3.2CFU/mL)。这是媒质中观察到的值的4倍。SDF-1结合镜体NOX-A12-NO30相比媒质，CFU计数翻倍(1.9CFU/mL)。见图35概况。
[0717] 实施例11：脉络膜新生血管形成(CNV)抑制
[0718] 用“激光诱导的脉络膜新生血管形成”动物模型推测所研究药物对人视网膜和脉络膜新生血管形成的作用。其发生在疾病，如潮湿或“增生性”老年性黄斑退化(AMD)、糖尿病性视网膜病和视网膜静脉闭塞。发现CXCR4在激光诱导的CNV中表达(Lima e Silva et al.，FASEB J.21：，2007)。与表达CD45和F4/80的细胞共定位，提示这些细胞是源于BM的巨噬细胞。抑制CXCR4降低激光诱导的CNV。但未研究这些细胞也表达SDF1的情况。在这些研究中，我们评估了SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)是否阻断新生血管形成。
[0719] 11.1：方法
[0720] 麻醉不大于12周龄的22只C57/BL6J小鼠，并进行每眼3次激光灼伤。动物在激光位点发生脉络膜新生血管形成。1天后，将2μl溶于Ringer溶液的440μM的SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40溶液玻璃体内注射于一只眼(剂量：0.88nmol＝12.9μg[仅分子的寡核苷酸部分]＝48μg[包括PEG的总分子])，而另一只眼接受Ringer溶液作为对照。激光处理后14天，给动物灌注右旋糖酐荧光素，并制备脉络膜整装片。评估整装片的脉络膜血管变化和CNV膜面积。
[0721] 由于给一只眼注射镜体，各动物的另一只眼仅接受缓冲液，使用了威氏符号等级检验(其涉及各动物的经处理眼和对照眼的差异)。所述威氏符号等级检验分析两个相关测量(在本情况中是各动物的经处理眼和对照眼)的差异。其识别显著差异，即便经处理眼组和对照眼组并非统计学显著不同。使用如下R指令：wilcoxsign_test(V1～V2，数据＝d0，分布＝″exact″)p＜0.05是在95％水平的显著。
[0722] 11.2：结果
[0723] 可评估22只小鼠中的13只。经NOX-A12-JE40处理的眼的平均新生血管形成面积小于经Ringer溶液处理的眼的平均值，表明镜体减少CNV形成。经威氏配对符号等级检验计算得p值为0.021。由此得出，SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40显著降低CNV小鼠模型中激光诱导的脉络膜新生血管形成，提示了潜在的治疗益处(见图36)。
[0724] 实施例12：糖尿病性肾病中的功效
[0725] 肾小球硬化(例如糖尿病中的)仍是末期肾病的首因，因其靶向血管紧张素依赖性病理机制不总预防疾病进展。因此需要其他治疗策略来治疗肾小球硬化。近来实验数据将糖尿病小鼠和人中的肾小球硬化进展与肾内炎症联系起来。例如吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤，或辐射降低尿白蛋白分泌，和患链尿霉素诱导的糖尿病的大鼠中的肾小球硬化。但对糖尿病性肾病中的肾内炎症的分子和细胞机制仍知之甚少。患糖尿病性肾病的患者血清水平的急性期炎症标记增加，但这不代表肾内炎症。
[0726] 本研究中，在6周龄接受单侧肾切除的db/db小鼠中测试了用SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)迟发阻断SDF-1。在4月龄开始以50mg/kg s.c(相当于13.4mg/kg寡核苷酸部分)每周3次施用NOX-A12-JE40。2个月后，处死动物，测定肾小球硬化评分。
[0727] 通过所述评分，对个肾小球的白细胞渗入和组织瘢痕进行评分。0分表示健康的肾小球，4分表示完全纤维化形式(Ninichuk，Clauss etal.2008)。
[0728] 12.2：结果
[0729] 6月龄时野生型小鼠几乎无肾损伤，而同龄的db/db小鼠表现出显著的肾损伤。经单侧肾切除的6周龄的db/db小鼠中的肾损伤甚至更严重。
[0730] 反序列的SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40(SEQ ID NO：132)，而非非特异性对照镜体revNOX-A12-JE40(SEQ ID NO：243)显著改善了在6个月后的经单侧肾切除的db/db小鼠中观察到的肾损伤：显著降低数量的肾小球具有高损伤评分(3和4)。在增加数量的肾小球中观察到更微细的变化(白细胞渗入)(见图37)。
[0731] 实施例13：SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40抑制着色兔中VEGF-诱导的视网膜血管渗漏
[0732] 在多种眼病(如老年性黄斑退化和视网膜静脉闭塞)中发生视网膜血管的血管渗漏。这导致降低视力的黄斑水肿。
[0733] 13.1：方法
[0734] 在动物模型中，兔中视网膜血管渗漏可被玻璃体内VEGF注射诱导。此模型中，在玻璃体内注射VEGF后48小时通过荧光光度法测量视网膜血管系统的渗透性。在VEGF刺激5天前进行测验项目注射。认为施用VEGF两天后观察到的渗透性不与VEGF刺激后瞬时观察到的渗透性增加直接相关，其是由VEGF注射引发的持久的下游过程(Edelman，Lutz et al.2005)。
[0735] 本研究中，每组施用8只着色的兔(Fauve de Burgogne，2～3月龄)。
[0736] 这些组是：
[0737] ●4种剂量的NOX-A12-JE40组(105nmol，40nmol，8nmol，1.6nmol)、
[0738] ●参照物质组(Kenacort retard(R)(4％曲安奈德)，2mgi.vt.)、和
[0739] ●媒质(用于输注的5％的葡萄糖)。
[0740] 所有组的注射量是50μL。给右眼施用物质5天后，还仅给右眼施用VEGF：50μlPBS中的500ng重组人VEGF165。48小时后，用眼荧光测定法测定麻醉动物中的视网膜渗透性(静脉注射荧光素钠(在0.9％氯化钠中10％，50mg/kg)1小时后)。简言之，用Fluorotron仪(FM-2Fluorotron Master)沿光轴从双眼角膜到视网膜体内扫描荧光强度。
整合所得强度分布曲线，并计算经处理眼和未处理眼的曲线下面积(AUC)比。然后计算组平均值和标准偏差，并作图。
整合所得强度分布曲线，并计算经处理眼和未处理眼的曲线下面积(AUC)比。然后计算组平均值和标准偏差，并作图。
[0741] 13.2：结果
[0742] 注射重组人VEGF165(50μL中500ng)5天前玻璃体内注射50μL葡萄糖中的105和40nmol SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40在VEGF刺激后48小时显著抑制VEGF诱导的视网膜血管渗透。参照项去炎松还显示强烈降低血管渗透。之前进行的BiaCore实验证实，在所用浓度不发生SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40的VEGF结合。由此推测，NOX-A12-JE40阻断导致血管渗透延长的VEGF下游通路(例如作为SDF-1过表达的效应的白细胞募集、紧密内皮细胞连接松弛)(见图38)。因此，NOX-A12-JE40本身可用于治疗黄斑或视网膜水肿，还可用于治疗老年性黄斑退化或视网膜静脉闭塞。
[0743] 实施例14：SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40抑制氧诱导的视网膜病
[0744] 氧-诱导的视网膜病小鼠模型是用于模拟低氧诱导的视网膜新生血管形成(见于糖尿病性视网膜病，尤其是增生性糖尿病性视网膜病，和老年性黄斑退化)的模型(Smith，Wesolowski et al.1994)。该模型还被称为早产儿视网膜病，因为放到医院育婴箱中的早产儿由于育婴箱中太高的氧暴露(在育婴箱期间，以及在回到含氧量正常的条件后)导致异常视网膜血管生长而眼盲。
[0745] 14.1：方法
[0746] 在小鼠模型中，将新生的C57BL/6J小鼠在出生后第5～12天培养于75％氧中。在回到正常氧条件下后，动物由于相对低氧而发生视网膜新生血管形成。在第12天注射SDF-1结合镜体NOX-A12-JE40(在2μL Ringer溶液中880pmol)。在第17天给小鼠灌注右旋糖酐-荧光素，以显示视网膜血管系统。通过评分系统，用视网膜总量评估编码形式的视网膜血管系统的血管变化。FITC-右旋糖酐灌注使可评估仅灌注的血管。为显示未成熟的、未灌注的血管，染色整装片的异凝集素-B4，并随即在荧光显微镜下分析。个体间比较用SDF-1结合镜体处理的眼与媒质处理的眼。通过威氏符号等级检验计算显著性。p＝0.05对应于95％的可信度。
[0747] 对下列参数进行评分：
[0748] 1.血管簇数
[0749] 2.绝对簇区域大小
[0750] 3.相对簇区域大小
[0751] 4.萌发血管数(丛)
[0752] 5.无血管区的绝对大小
[0753] 6.无血管区的相对大小
[0754] 在FITC-右旋糖酐图中由这些参数计算视网膜病评分(Higgins，Yu et al.1999)。参数和视网膜病评分的显著性水平示于图40。
[0755] 14.2：结果
[0756] 在所检测的34只小鼠中，24个整装片可在FITC-右旋糖酐灌注后评估，15个可在异凝集素染色后评估。在第12天单次注射880pmolSDF-1结合镜体NOX-A12-JE40显著抑制丛形成，从而如第17天所观察到的提高总视网膜评分(见图39和40)。因此，NOX-A12-JE40可在具有低氧诱导的新生血管形成(尤其是眼的)的疾病(例如糖尿病性视网膜病，AMD)中具有有益效用。
[0757] 参考文献
[0758] 本文所引文献的完整书目数据(除非未相反指明)如下，将这些参考文献的公开通过引用并入本文。
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