癌细胞疫苗
专利汇可以提供癌细胞疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了Ii 蛋白质 表达的或免疫调节功能的一种专一性调节剂。特别公开了几种类型的Ii调节剂,包括那些其功能是通过与编码 哺乳动物 Ii蛋白质的RNA分子形成双螺旋分子对Ii蛋白质的合成在翻译 水 平上有抑制作用的。这类调节剂包括由核苷酸 碱 基组成的共聚物和可表达的逆基因构建物,组成共聚物的核苷酸碱基特别能与编码哺乳动物Ii蛋白质的RNA分子杂交。另一方面,还公开了包含表达Ii的专一性调节剂的MHC类型Ⅱ－正效 抗原 提呈细胞。例如,这样的细胞在显示与MHC类型Ⅱ蛋白质相关的自身决定簇肽方面是有用的。还发现了本 发明 的一些内容在 治疗 某些 疾病 方法方面的应用。例如,通过增强对不良细胞的免疫攻击 力 ,治疗病人 恶性 肿瘤 和自身免疫紊乱。另外的应用是从细胞中分离自我决定簇肽。，下面是癌细胞疫苗专利的具体信息内容。
1.一种Ii蛋白表达或免疫调节功能的专一性调节剂，寡核苷 酸CTCGGTACCTACTGG被排除在外。
2.如权利要求1所述的专一性调节剂，其通过与编码哺乳动 物Ii蛋白的RNA分子形成双螺旋分子而起作用，形成的双 螺旋分子功能为在翻译水平上抑制Ii蛋白合成。
3.如权利要求2所述的专一性调节剂，其包含有共聚物，它 由特征为能特别与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子杂交的 核苷酸碱基组成。
4.如权利要求2所述的专一性调节剂，其包含编码第一个RNA 分子的DNA分子，此第一个RNA分子与编码哺乳动物Ii蛋 白的第二个RNA分子片段互补，第一个RNA分子有能力 与第二个RNA分子杂交因而抑制第二个RNA分子的翻译。
5.如权利要求3所述的专一性调节剂，其中核苷酸碱基连接 于一个骨架，它包括从由磷酸二酯、硫代膦酸酯、烷基膦 酸酯、磷酸酰胺酯、磷酸三酯、2′-脱氧核糖、2′-O-烷基核 糖、2′O-链烯基核糖、2′-O-替代烷基核糖、吗啉、酰胺键以 及类似物组成的一组中选择出的部分。
6.如权利要求5所述的专一性调节剂，其中核苷酸碱基是从 由腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2，6-二 氨基嘌呤、5-丙烯基尿嘧啶、5-丙烯基胞嘧啶及其类似物组 成的一组中选择出来的。
7.如权利要求6所述的专一性调节剂，其包含一核苷酸碱基 序列，此序列与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子翻译起始 位点互补。
8.如权利要求7所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号54 的核苷酸碱基序列。
9.如权利要求7所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号53 的核苷酸碱基序列。
10.如权利要求7所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号52 的核苷酸碱基序列。
11.如权利要求7所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号40 的核苷酸碱基序列。
12.如权利要求7所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号55 的核苷酸碱基序列。
13.如权利要求6所述的专一性调节剂，其包含一核苷酸碱基 序列，此序列与结合于RNA分子剪接点的外显子部分互补。
14.如权利要求13所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号32 的核苷酸碱基序列。
15.如权利要求13所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号62 的核苷酸碱基序列。
16.如权利要求6所述的专一性调节剂，其抑制RNA分子的内 含子剪接。
17.如权利要求16所述的专一性调节剂，其与RNA分子的第 一个外显子3′端的部分和第一个内含子5′端的部分互补。
18.如权利要求6所述的专一性调节剂，其与RNA分子终止密 码子区域3′互补。
19.如权利要求18所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号64 的核苷酸碱基序列。
20.如权利要求6所述的专一性调节剂，其与RNA分子的起始 密码子区域5′互补。
21.如权利要求20所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号48 的核苷酸碱基序列。
22.如权利要求6所述的专一性调节剂，其与编码CLIP肽的区 域互补。
23.如权利要求22所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号11 的核苷酸碱基序列互补。
24.如权利要求6所述的专一性调节剂，其在终端或内部位点 结合一个或多个化学基团，这些基团将专一性调节剂交叉 连接于杂交的RNA分子上。
25.如权利要求24所述的专一性调节剂，其中化学基团是烷基 化基团。
26.如权利要求6所述的专一性调节剂，其结合于催化杂交RNA 分子剪切的化学基团。
27.如权利要求26所述的专一性调节剂，其中化学基团是螯合 剂。
28.如权利要求6所述的专一性调节剂，其为一种剪切RNA分 子的核酶。
29.如权利要求6所述的专一性调节剂，其结合于可嵌入编码 哺乳动物Ii蛋白的RNA分子核苷酸碱基的化学基团上，以 稳定杂交。
30.如权利要求6所述的专一性调节剂，其结合于增强细胞摄 取的化学部分。
31.如权利要求6所述的专一性调节剂，其结合于指向由专门 的细胞类型摄取的化学部分。
32.如权利要求6所述的专一性调节剂，其结合于改善毒性方 面药理学性质的化学部分。
33.如权利要求4所述的专一性调节剂，其中DNA分子是cDNA 分子。
34.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号68 的核苷酸碱基序列。
35.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号71 的核苷酸碱基序列。
36.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号72 的核苷酸碱基序列。
37.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号75 的核苷酸碱基序列。
38.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号77 的核苷酸碱基序列。
39.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号78 的核苷酸碱基序列。
40.如权利要求33所述的专一性调节剂，其包含序列鉴定号79 的核苷酸碱基序列。
41.如权利要求4所述的专一性调节剂，其由病毒表达载体表 达。
42.如权利要求41所述的专一性调节剂，其中病毒表达载体的 特征是能够增强对哺乳动物细胞内的转染。
43.如权利要求1所述的专一性调节剂，其包含由核苷酸碱基 组成的共聚物，此核苷酸碱基的特征是能够特别与编码哺 乳动物Ii蛋白的基因杂交。
44.如权利要求1所述的专一性调节剂，其包含20-1000道尔顿 的有机分子。
45.如权利要求1所述的专一性调节剂，其是以药学上可接受 的载体来配置的。
46.如权利要求45所述的专一性调节剂，其中药学上可接受的 载体增强Ii专一性调节剂向细胞群体的传递。
47.如权利要求46所述的专一性调节剂，其中药学上可接受的 载体是脂质体。
48.如权利要求45所述的专一性调节剂，其中药学上可接受的 载体增强Ii表达调节剂向专门细胞群体的传递。
49.如权利要求48所述的专一性调节剂，其中药学上可接受的 载体是带有附着分子的脂质体，此附着分子增强对专门细 胞群的传递。
50.一种包含专一性的Ii表达的MHC类型II正效抗原提呈细 胞的调节剂，寡核苷酸CTCGGTACCTACTGG特别被排除 在外。
51.如权利要求50所述的MHC类型II正效抗原提呈细胞，其 中Ii表达的专一性调节剂通过与编码哺乳动物Ii蛋白的 RNA分子形成双螺旋分子而起作用，双螺旋分子的形成有 在翻译水平上抑制蛋白Ii合成的功能。
52.如权利要求51所述的MHC类型II正效抗原提呈细胞，其 中Ii表达的专一性调节剂是由核苷酸碱基组成的共聚物， 此核苷酸碱基的特征是能特别杂交于RNA分子上。
53.如权利要求51所述的MHC类型II正效抗原提呈细胞，其 中Ii表达的专一性调节剂是一种可表达的逆基因构建物， 它包含一DNA分子，其编码与第二个RNA分子片段互补 的第一个RNA分子，第二个RNA分子编码哺乳动物Ii蛋 白，第一个RNA分子具有与第二个RNA分子杂交的能力， 因而可抑制第二个RNA分子的翻译。
54.如权利要求50所述的MHC类型II正效抗原提呈细胞，它 是恶性细胞。
55.如权利要求50所述的MHC类型II正效抗原提呈细胞，它 是非恶性细胞。
56.一种显示自我决定簇肽的方法，此自我决定簇肽于MHC类 型II正效抗原提呈细胞表面，与MHC类型II蛋白质相关， 此方法包括：
a)提供MHC类型II正效抗原提呈细胞；
b)将Ii蛋白表达的或免疫调节功能的专一性调节剂 导入到MHC类型II正效抗原提呈细胞中。
57.如权利要求56所述的方法，其中Ii专一性调节剂通过电造 孔技术被导入到MHC类型II正效抗原提呈细胞内。
58.如权利要求56所述的方法，其中Ii专一性调节剂通过与编 码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子形成双螺旋分子而起作用， 双螺旋分子的形成有在翻译水平上抑制蛋白合成的功能。
59.如权利要求58所述的方法，其中Ii专一性调节物是包含核 苷酸碱基的共聚物。
60.如权利要求56所述的方法，其中Ii表达的专一性调节剂是 一种可表达的逆基因构建物，它包含一DNA分子，其编码 与第二个RNA分子片段互补的第一个RNA分子，第二个 RNA分子编码哺乳动物Ii蛋白，第一个RNA分子具有与 第二个RNA分子杂交的能力，因而可抑制第二个RNA分 子的翻译。
61.一种通过增强对恶性肿瘤的免疫攻击，治疗病人恶性肿瘤 的治疗方法，它包括：
a)提供恶性细胞群，如有必要，诱导MHC类型II分 子的表达；
b)将Ii蛋白表达的专一性调节剂导入到步骤a)的表 达MHC类型II的恶性细胞内，以增强内源性抗原决定簇的 提呈；
c)将步骤b)产生的细胞导入到病人体内。
62.如权利要求61所述的治疗方法，其中在步骤c)之前，使 步骤b)产生的细胞失去复制能力。
63.如权利要求61所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是通过电造孔技术被导入到表达MHC类型II的恶性 细胞内。
64.如权利要求61所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂通过与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子形成双螺旋 分子而起作用，双螺旋分子的形成有在翻译水平上抑制蛋 白合成的功能。
65.如权利要求64所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是由核苷酸碱基组成的共聚物。
66.如权利要求61所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是一种可表达的逆基因构建物，它包含一DNA分子， 其编码与第二个RNA分子片段互补的第一个RNA分子， 第二个RNA分子编码哺乳动物Ii蛋白，第一个RNA分子 具有与第二个RNA分子杂交的能力，因而可抑制第二个 RNA分子的翻译。
67.如权利要求61所述的治疗方法，其中步骤a)的恶性细胞 群是从病人体内获得的。
68.一种通过增强对恶性肿瘤的免疫攻击来治疗病人恶性肿瘤 的治疗方法，它包括：
a)提供表达或包含恶性肿瘤抗原决定簇的细胞群，如 有必要，诱导MHC类型II分子的表达；
b)将Ii蛋白表达的专一性调节剂导入步骤a)的表达 MHC类型II的细胞内，以增强内源性抗原决定簇的提呈；
c)将步骤b)产生的细胞或其衍生物导入到病人体内。
69.如权利要求68所述的治疗方法，其中在步骤c)之前使步 骤b)产生的细胞失去复制能力。
70.如权利要求68所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是通过电造孔技术被导入到表达MHC类型II的细胞 内。
71.如权利要求68所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂通过与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子形成双螺旋 分子而起作用，双螺旋分子的形成有在翻译水平上抑制蛋 白合成的功能。
72.如权利要求71所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是由核苷酸碱基组成的共聚物。
73.如权利要求68所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是一种可表达的逆基因构建物，它包含一DNA分子， 其编码与第二个RNA分子片段互补的第一个RNA分子， 第二个RNA分子编码哺乳动物Ii蛋白，第一个RNA分子 具有与第二个RNA分子杂交的能力，因而可抑制第二个 RNA分子的翻译。
74.如权利要求68所述的，其中步骤a)的细胞群是从病人体 内获得的。
75.一种治疗病人恶性肿瘤的治疗方法，其包括给予病人一种Ii 蛋白表达的或免疫调节功能的专一性调节剂，给予足够的 剂量诱导抗癌免疫应答。
76.如权利要求75所述的治疗方法，其中每天给药量在10μg 与100μg之间。
77.如权利要求75所述的治疗方法，其中给药的方式是从由下 列方式组成的一组方式中挑选的：静脉内注入、体腔内注 入、通过皮肤吸收、通过黏膜表面吸收和通过胃肠道吸收。
78.如权利要求75所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的或免疫 调节功能的专一性调节剂是用药学上可接受的载体被给药 的。
79.一种通过增强对个体不良细胞群的的免疫攻击来治疗个体 非恶性病症的治疗方法，此方法包括：
a)提供从不良细胞群中得到的细胞，如有必要，诱导 MHC类型II分子的表达；
b)将Ii蛋白表达的专一性调节剂导入步骤a)表达MHC 类型II的细胞内，以增强MHC类型II对抗原决定簇的的 提呈；
c)再将步骤b)产生的细胞再导入此个体内。
80.如权利要求79所述的治疗方法，其中在步骤c)之前，使 步骤b)产生的细胞失去复制能力。
81.如权利要求79所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的专一性 调节剂是通过电造孔技术被导入到表达MHC类型II的细胞 内。
82.如权利要求79所述的治疗方法，其中不良细胞群包含与自身 免疫紊乱有关的自身反应T淋巴细胞。
83.如权利要求79所述的治疗方法，其中不良细胞群包含病毒 感染的细胞。
84.一种治疗病人自身免疫疾病的治疗方法，包括将Ii蛋白表 达的或免疫调节功能的专一性调节剂给药于病人，给予充 分剂量以诱导抗疾病的免疫应答。
85.如权利要求84所述的治疗方法，其中给药量每天在10μg 和100μg之间。
86.如权利要求84所述的治疗方法，其中给药的方式是从由下 列方式组成的一组方式中挑选的：静脉内注入、体腔内注 入、通过皮肤吸收、通过黏膜表面吸收和通过胃肠道吸收。
87.如权利要求84所述的治疗方法，其中Ii蛋白表达的或免疫 调节功能的专一性调节剂是用药学上可接受的载体被给药 的。
88.一种从细胞中分离抗原簇肽的方法，它包括：
a)提供细胞，如有必要，诱导MHC类型II分子的表 达；
b)将Ii蛋白表达专一性调节剂导入表达MHC类型II 细胞内；
c)增溶溶解由步骤b)产生的表达MHC类型II细胞；
d)从步骤c)的增溶的细胞中提纯MHC类型II分子 和结合的自我决定簇肽；
e)从步骤d)的MHC类型II分子中分离自我决定簇 肽。
89.如权利要求88所述的方法，其中Ii蛋白专一性调节剂是通 过电造孔技术被导入到表达MHC类型II分子的细胞内。
90.如权利要求88所述的方法，其中Ii蛋白表达的专一性调节 剂是共聚物，它是由核苷酸碱基组成的，其特征为能够特 别杂交于编码哺乳动物Ii蛋白的RNA上，因而抑制Ii表达。
91.一种治疗病人致病自身免疫应答的治疗方法，它包括：
a)提供从病人体内得到的细胞，如有必要，诱导表达 MHC类型II分子；
b)将Ii蛋白表达专一性调节剂导入到表达MHC类型II 的细胞内；
c)增溶溶解由步骤b)产生的表达MHC类型II的细胞；
d)从步骤c)增溶溶解的细胞中提纯MHC类型II分子 和连接的自我决定簇肽；
e)从步骤d)的MHC类型II分子中分离自我决定簇肽；
f)将步骤e)的自我决定簇肽的合成制备物导入到病人 体内，以作用于临床的改变。
92.如权利要求91所述的治疗方法，其中Ii蛋白的专一性调节 剂通过电造孔技术被导入到表达MHC类型II细胞内。
93.如权利要求91所述的治疗方法，其中细胞是T淋巴细胞， 它表达在致病过程中有活性的T细胞受体。
94.如权利要求91所述的治疗方法，其中细胞是致病自身免疫 应答的靶细胞。
95.如权利要求91所述的治疗方法，其中细胞是被病毒感染的。
96.一种治疗在个体中专门组织的自身免疫紊乱的治疗方法， 其冒着通过增加Ii在组织中的表达很可能激发个体内的自 身免疫反应的风险，它包括：
a)提供一表达构建物，它包含在启动子控制下的Ii基 因，此启动子在组织细胞中有活性；
b)在疾病发生前，将表达构件物导入到组织细胞内。
本发明的技术背景
对特异性抗原的免疫应答是通过T淋巴细胞对这些抗原的 肽片段的识别来调节的。在抗原提呈细胞中，经过处理的抗原 的肽片段结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子的抗原肽 结合部位。然后，这些肽-MHC复合体被转移到细胞表面，并 被辅助性T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞上的T细胞受体所 识别(外源肽和提呈MHC分子的相邻表面)。有两类传递肽的 MHC分子：MHC类型I和MHC类型II。
MHC类型I分子将抗原提呈给CD8-正效细胞毒性T淋巴细 胞，然后，此细胞被激活，可以直接杀死抗原提呈细胞。MHC 类型I分子专门从内源性合成蛋白质接受肽。例如：传染性病 毒，在它们合成期间，于内质网上。
MHC类型II分子将抗原提呈给CD4-正效辅助性T淋巴细 胞(T辅助性细胞)。一旦其被激活，T辅助性细胞作用于激活 细胞毒性T淋巴细胞(T杀伤细胞)并通过物理接触和细胞素 的释放激活B淋巴细胞。与MHC类型I分子不同，MHC类型 II分子结合外源性抗原，其通过非特异性或特异性的胞吞作用 被内在化。在合成期间，MHC类型II分子与内源性抗原的结合 受到阻断，而被结合的恒定链蛋白(Ii)所取代。这些MHC 类型II-Ii蛋白质复合体从内质网转移至后高尔基区室中，在那 里，Ii由于蛋白质水解而被释放。而外源性抗原肽被结合[Daibata 等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)，31：255-260(1994)； Xu等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)，31：723- 731(1994)]。
MHC类型I和MHC类型II分子在细胞中有明显的分 布。即使在不同类型的细胞中表达的水平有所不同，几乎所有 的有核细胞都表达MHC类型I分子。免疫系统的细胞在其表 面充分表达MHC类型I，而肝脏细胞表达水平相对较低。无核 细胞表达少或不表达MHC类型I。MHC类型II分子在B淋 巴细胞和巨噬细胞被高度表达，在其它组织细胞不被表达。但 是，许多其它细胞类型可由于暴露给细胞素被诱导表达MHC类 型II分子。
在正常情况下，由于Ii蛋白总是与新生的MHC类型II分 子一同合成，内源性肽(带有自我决定簇潜在性地导致自身免 疫疾病)不与MHC类型II分子结合。由于包含有自我决定簇 肽和MHC类型II分子的复合体从不被身体免疫监视系统发觉， 对这些决定簇的耐受力不会发生。如果在发育的个体中，MHC 类型II分子不被Ii抑制，那么，内源性自我决定簇就被MNC 类型II分子提呈，启动了对那些内源性抗原的自身免疫应答。 这就是某些自身免疫疾病的情况。在恶性肿瘤细胞中发生了这 样的效应时，对肿瘤内源性抗原的自身免疫应答可以用于治疗， 限制肿瘤细胞的生长或消除肿瘤细胞。
增加MHC类型II分子的表达而不伴随Ii蛋白增加的治疗 作用在MHC类型II-负效，Ii-负效肿瘤中显示出来。[Ostrand- Rosenberg等人，《免疫学杂志》(Journal of Immunol，144：4068-4071 (1990)；Clements等人，《免疫学杂志》(Joural of Immunol)， 149：2391-2396(1992)；Baskar等人，《细胞免疫学》(CellImmunol)， 155：123-133(1994)；Baskar等人，《医学实验杂志》(J.Exp.Med.)， 181：619-629(1995)；Armstrong等人，(Proc Natl.Acad.Sci USA94： 6886-6891(1997)]。在这些研究中，将MHC类型II分子基因转 染到MHC类型II-负效的鼠肉瘤中产生了MHC类型II正效， 但Ii-负效肿瘤细胞系。将这些细胞注射到MHC相容宿主导致 亲本肿瘤的延迟生长。Ii蛋白基因与MHC类型II基因共同转染 到鼠细胞系，由于Ii链阻断了内源性肿瘤抗原的提呈而抑制了 MHC类型II基因对肿瘤的治疗效果。类似的结果也在鼠黑素瘤 产生[Chen and Ananthaswamy，《免疫学杂志》(Journal of Immunology)151：244-255(1993)]。
这些治疗探索的成功被认为涉及到了树状细胞(dendritic cells)的自然活动。树状细胞是专门的清扫者，它把外源性抗 原加工成肽并从它们细胞表面的MHC抗原将其提呈给T淋巴 细胞。树状细胞有能力通过MHC类型I和MHC类型II提呈抗 原，能使它们激活T辅助细胞和T杀伤细胞。人们认为，激发 强有力的T杀伤细胞的应答需要有效的T辅助细胞应答，由树 状细胞产生的联合活动导致高强度的抗肿瘤应答[Ridge等人， 《自然》(Nature)193：474-477(1998)；Schoenberger等人，《自 然》(Nature)193：480-483(1998)]巨噬细胞系的树状细胞发现肿 瘤细胞、摄食和加工特异的肿瘤抗原和与肿瘤相关的抗原。树 状细胞移动到淋巴结，随之流动到肿瘤的所在位置，停留于那 里的淋巴结皮层附近，在此处，新的T细胞产生。于淋巴结皮 层，识别出树状细胞上肿瘤决定蔟的静止的T杀伤细胞被激活 和增殖，随后，作为有活性的抗肿瘤杀伤T细胞被释放于循环 系统中。
即使与T-辅助细胞的活动相互作用或合格的树状细胞通过 MHC类型I分子提呈抗原并因此激活T杀伤细胞，与T辅助细 胞和T杀伤细胞同时发生相互作用也不是必需的；在T辅助细 胞引起活化后的一些时间内，被激活的树状细胞仍保持它们激 发T杀伤细胞的能力。由MHC类型II或MHC类型I提呈的各 个抗原肽决定簇不需要从单一的抗原蛋白质中得来，从恶性肿 瘤细胞得来的两个或多个抗原可被加工和被树状细胞提呈。因 此，只许可一个大概不是肿瘤特异性的决定簇，携带着它而具 有能够激活T杀伤细胞的能力，这些T杀伤细胞作用于其它的 也许是多个肿瘤特异性决定簇。(Therefore，licensing to one determinants，perhaps not tumor specific，carries with it the power to license activation of T killer cells to other，perhaps tumor- specific，determinants)。这些较小的或隐蔽的决定簇被用于各 种各样的治疗目的[Moougdil等人，《免疫学杂志》 (J.Immunol.159：2574-2579(1997)]。
MHC类型II抗原提呈的实验中的改变被认为是对这些较小 的决定簇扩大的免疫应答。通常无法利用于对MHC类型II分 子作用的一系列肽提供了用于MHC类型II提呈的多种肽的丰 富来源。这一系列决定簇的开发导致应答的T辅助细胞数目的 扩大。这些扩大的群体可以激发树状细胞能力(licensing)，它 们一些直接朝向肿瘤特异性决定簇和与肿瘤相关的决定簇。虽 然，正常的细胞潜在地具有肿瘤细胞决定簇，对正常细胞仅仅 有少量的细胞损坏发生。这是因为抗肿瘤应答的多种效应器的 应答(大量的杀伤T细胞、周围活化的细胞素、有吞噬作用的 巨噬细胞和它们的产物)都不直接朝向正常细胞。
正常的MHC类型II抗原提呈可被MHC类型II分子与Ii蛋 白相互作用的抑制所替代。这是由减少Ii蛋白的总量(例如， 减少表达)或干扰Ii免疫调节功能来完成的。抑制Ii表达用各 种各样的反义技术来完成。反义寡核苷酸与mRNA的AUG部 位相互作用，据说可用于Ii蛋白减少MHC类型II对外源性抗 原的提呈。[Bertolino等人，《国际免疫学》(Internat. Immunology)3：435-443(1991)]。但是，Ii蛋白的表达效果和MHC 类型II分子对内源性抗原的提呈效果还没有得到检测。最近， Humphreys等人[美国专利5,726,020(1998)]证明了三个反义寡核 苷酸和一逆基因构件物，它们能导致表达MHC类型II分子的 抗原提呈细胞表达出对Ii蛋白表达的有效抑制。将用这种机理 使Ii受到抑制的肿瘤细胞植入小鼠体内，与植入未经处理的亲 本肿瘤细胞的小鼠相比，其存活期大大延长。此观察指出，Ii 蛋白的抑制使一系列抗原决定簇提呈增加，其可以激发更多的 对肿瘤细胞有效的免疫应答。
本发明的概述
本发明一方面涉及到Ii蛋白表达或免疫调节功能的专一性 的调节剂。特别公开了几种类型专一性的Ii调节剂，其中包括 那些调节剂，其功能为通过与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子 结合形成双螺旋分子，其在翻译水平上抑制Ii蛋白的合成。这 类包括由特别与编码哺乳动物Ii蛋白的RNA分子杂交的核苷酸 碱基组成的共聚物(例如，反义寡核苷酸)和可表达的逆基因 构建物，其编码特别使Ii RNA杂交的RNA分子。另一方面 涉及包含有Ii表达专一性调节剂的MHC类型II-正效抗原提呈 细胞。这样的细胞是有用的，例如，在与MHC类型II蛋白质 联合的自我决定簇肽的显示中。于另一个实施方案中，本发明 涉及到治疗疾病的方法。例如：恶性肿瘤和自身免疫性疾病， 在病人体内，增强对不良细胞的免疫攻击力。这些方法涉及提 供MHC类型II-正效抗原提呈细胞和导入Ii蛋白表达的专一性 调节剂，以增强内源性抗原决定簇提呈。因此，这些细胞或产 物可用于刺激病人的免疫系统。 本发明的详细叙述
上述发现的结合共同表明，在MHC类型II抗原提呈细胞中 Ii蛋白表达的抑制消除了Ii蛋白的功能，且深刻改变了由MHC 类型II分子提呈给免疫系统的抗原表位的范围和选择。前面也 表明，Ii蛋白在细胞中的表达可以被抑制，用专一性寡核苷酸 的反义技术或逆基因构建物，可使其得到专门和有效的抑制。 美国专利No 5,726,029(Humphreys等人)可作为从前工作的例 证，公开的这项专利在此通过引证被并入本文。本发明部分根 据对Ii蛋白表达产生抑制的另外成分的发现。这些成分以及它 们被鉴定的方法也于此公开。由这些发现而引起的是发现了抗 原决定簇提呈的增强导致了从个体清除相关细胞群的免疫应 答，抗原决定簇提呈的增强是由于阻断Ii蛋白表达或个体内细 胞免疫调节功能而产生的结果。这个发现在本发明中被利用于 实现几个有用的治疗目标，它们许多是直接用于从个体中清除 不良细胞群。
本发明的一个方面是Ii蛋白表达或免疫调节功能的专一性 调节剂(寡核苷酸CTCGGTACCTACTGG被专门排除在外)。 这个专一性的Ii调节剂对表达MHC类型II分子细胞的传递改 变了结合于细胞MHC类型II分子上的抗原决定簇的范围和选 择，这样就改变了那个细胞的抗原提呈。几种成分作为专一性 的Ii调节剂而起作用，可以根据它们的作用机理进行分类。
在一个实施方案中，Ii专一性的调节剂通过与编码哺乳动物 Ii蛋白的RNA分子形成双螺旋分子而起作用。双螺旋分子的形 成在翻译水平上抑制了Ii蛋白的合成。这个专一性的调节剂可 以包含若干核苷酸碱基，它们依照Watson-Crick碱基配对方式， 以核苷酸碱基与Ii RNA其它碱基进行结合的形式在聚合物骨 架上适当地有间隔地分布。参与形成双螺旋分子的Ii RNA序列 可以是无限制的，其在蛋白质编码片段(外显子)、在插入片段 (内含子)、在外显子和内含子间的重叠部位(拼接部位)、在 蛋白质翻译的起始部位(AUG部位)、在向AUG部位的上游区 (例如，CAP部位或其它的有顺序的专门调节部位)、在自编码 片段的下游区(于3′多腺苷酸化序列-专一的调节部位)。
两种一般类型的专一性的调节剂可被用于与Ii RNA形成双 螺旋分子。于第一种类型，包含有10-50核苷酸碱基的化学合 成共聚物已被利用。这些共聚物包含有核苷酸碱基序列，对RNA 分子的靶部分，它是互补的，其另外被称为反义序列。这样的 共聚物的一个例子是寡核苷酸。共聚物依据两种机理抑制从RNA 翻译蛋白质。一种方法是阻断到RNA部分的入口，RNA必需 与核糖体、拼接体以及RNA成熟和翻译必需的因子相互作用。 第二种方法涉及到一种酶即核糖核酸酶H效力的加强，此酶能 把被杂交到DNA上的RNA序列分成几小段。这样，DNA或类 似共聚物的DNA与RNA相应片段的结合导致在共聚物结合部 位的断裂。
依照Watson-Crick碱基配对原则，共聚物杂交到靶RNA上。 共聚物的序列由靶RNA互补序列限定。异分子聚合物通常与 一个长度的核苷酸序列化学合成，此长度起码为6个靶RNA互 补核苷酸，一般为12-25个。从统计学看，于细胞内的RNA群 体中，有15个序列的核苷酸就是独一无二的，这能使任何特别的 RNA被高度专一性地作为目标。对于包含20个碱基对的的共 聚物与RNA有着约10-17M的Kd值(Kd values)的也是非常 稳定的结合。
在一些情况下，培养的细胞自发地吸收足够量的共聚物，获 得有用的效应。这样的摄取呈现了需要生化能和有某些细胞表 面蛋白质的参与的活性过程。摄取也可能由胞饮作用而发生。 此途径可被培养于含有共聚物的高渗培养基的细胞增强，在此 之后，于稍低渗培养基中的细胞的重悬浮引起细胞内胞饮泡的 突然发生。在另外情况下，应用脂类或脂质体、用电造孔法或 用链球菌溶血素O处理去透过细胞膜等方法可以辅助摄取。与 培养的细胞相比，活体内细胞摄取共聚物常常更容易。细胞用 电造孔法摄取共聚物的最适条件于下列例2中揭示。靶RNA潜 在的部位是那些对与有功能的蛋白质复合体的结合开放的部 位，另外还有对与共聚物结合开放的部位。这样的部位可用核 糖核酸酶H(Rnase H)来鉴定，此酶可剪切杂交于DNA上的 RNA。在核糖核酸酶H存在的情况下，将DNA寡核苷酸单独 地或混合加入到以5′-放射性磷标签的RNA中，在用RNA的凝 胶体电造孔法和放射性显影照片之后，寡核苷酸和其它杂交的 共聚物被鉴定。在例1中提供了这样的用Ii反义寡核苷酸的实 验。本发明发现的Ii RNA部位对RNase H的剪切是最开放的， 此部位是AUG起始密码子的区域和前体mRNA第一拼接部位 区域。
本发明中“寡核苷酸”的术语是指包含若干核苷酸单位的 多核苷酸，核苷酸单位是由以磷酸二酯键连接的自然发生的碱 基和呋喃戊糖(pentofuranosyl sugars)形成的。“共聚物”的 术语包括寡核苷酸和从非自然发生的或寡核苷酸的修饰亚基形 成的结构相关的分子。这些修饰发生在核苷酸的碱基部分、核 苷酸的糖部分或核苷酸间键合群。另外的键合群也常取代自然 寡核苷酸的糖和磷酸骨架，产生共聚物，下面将详细讨论。
这样的寡核苷酸的修饰和产生的特征容易利用于本领域的 一种技术中。作为修饰的例证，在以下的专利中提供： 美国专利No.4,469,863(1984)；美国专利No.5,216,141(1993)；美 国专利No.3,264,564(1993)；美国专利No.3,514,786(1996)；美国 专利No.5,587,300(1996)；美国专利No.5,587,469(1996)；美国专 利No.5,602,240(1997)；美国专利No.5,610289(1997)；美国专利 No.5,614,617(1997)；美国专利No.5,623,065(1997)；美国专利 No.5,623,070(1997)；美国专利No.5,700,922(1997)；和美国专利 No.5,726,297(1998)；公开的这些专利在此通过引证被并入本文。
杂交到互补RNA上的寡核苷酸的能力具有化学修饰的很强 的耐受性。因此，许多不同功能的共聚物是可能的。尤其，糖 磷酸酯骨架在不丧失形成Watson-Crick碱基对能力的情况下可 以被广泛地改变。根据已明确的，核苷酸包含糖、含氮杂环物 和磷酸部分。一些合成的寡核苷酸类似物缺乏糖或磷酸部分， 但二者按照碱基配对以反义寡核苷酸相同的方式仍可以杂交以 及可以被用于同样的目的。这些包含核苷酸碱基的共聚物在功 能上是同与RNA杂交的寡核苷酸相等的。以下概述一些寡核苷 酸的修饰，其改变和改善了它们作为反义应用的性质。
1.磷酸酯非桥接(non-bridging)氧原子之一被硫取代 [Agrawal等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：7079-7083(1998)]，被 硒取代[Mori等人，《核酸研究》17：8207-8219(1989)]，被硼取代 [Porter等人，《核酸研究》25：1611-1617(1997)]，以此产生负电荷 的类似物。
2.两个非桥接的氧原子被硫取代[Vaughn等人，《核酸研 究》24：4558-4564(1996)]。
3.非桥接氧原子被酯化，或被甲基取代，或被氮原子取代 产生不带电荷的磷酸酯[Hayakawa等人，《有机化学杂志》 60：925-930(1995)；Iyer等人，Tetrahedron.52：1441-14436(1996)； Zhang等人，<生物有机医药化学>6：1911-1916(1996)]，膦酸酯 [Sarin等人，Proceedings of the NationalAcademy of Science USA 85：7448-7451(1988)]或磷酸酰胺酯[Agrawal等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：7079-7083(1988)]。
4.两个桥接的氧原子以不同的排列和结合被硫或氮取代 [Gryaznov等人，<核酸研究>24：1508-1514(1996)；Goodchild， Bioconjugate Chem.1：165-187(1990)]。
5.上述的取代作用是结合的(例如，产生硫代甲基膦酸酯) [Padmapriya & Agrawal，<生物有机医药化学>3：761-764(1993)]。
6.核苷间磷酸群被不包含磷和不带电荷的原子的其它排列 所取代[Sanghvi & Cook，Carbohydrates：<在反义疗法中合成的 方法和应用>.An overview.Chap.l.In：<反义研究中糖的修饰>。 (Sanghvi，Cook)(ACS Symposium Series，580).American Chemical Society，Washington，DC 1-22(1995)；De Mesmaeker等人，<化学 研究报道>28：366-374(1995)；Kiely，<核酸研究>20：1339- 1344(1994)]。
7.糖是核糖或2′-脱氧核糖。核糖的2′-羟基群被烷基化或 被卤素、氨基、碳取代基所替代[Kiely，<核酸研究>20：1339- 1344(1994)；De Mesmaeker等人，<化学研究报道>28：366-374 (1995)；Sanghvi & Cook，Carbohydrates：在反义疗法中，合成的 方法和应用。An Overview.Chap.l.In：反义研究中糖的修饰 (Sanghvi，Cook)(ACS Symposium Series，580)American Chemical Society，Washington DC 1-22(1995)；Freier & Altmann，<核酸研 究>25：4429-4443(1997)]或硫氢基所替代[Hamm & Piccirilli，<有 机化学杂志>62：3415-3420(1997)]。
8.糖环周围的立体化学在1′位置改变产生α-核苷系列 [Lavignon等人，<反义研究及其发展>2：315-324(1992)]，在2′位 置产生阿拉伯糖系列或在3′位置产生木糖系列[Seel等人， Helv.Chim.Acta.79：1451-1461(1996)]。
9.糖是呋喃糖或吡喃糖[Pitsch等人，Helv Chim Acta 78：1621-1635(1995)]，戊糖或己糖[Herdewijn，Liebigs Annalen 1996：1337-1348(1996)]。
10.对通过并和穿过C3-C5位置或于糖和碱基之间的第二 个环来改善杂交，呋喃核糖环是更牢固的[Tarkoy等人，Helv. Chim.Acta.77：716-744(1994)；Herdewijn，LiebigsAnnalen 1996：1337-1348(1996)]
11.核苷酸是通过3′-5′(如通常的)或2′-5′连接的[Maran 等人，<科学>265：789-792(1994)]。
12.糖被吗啉取代[Summerton等人，<反义核酸药物> D.7：63-70(1997)]。
13.糖磷酸骨架被肽骨架取代，产生“肽核酸”(pna) [Egholm等人，<自然>365：566-568(1993)]。
普遍地，下列的修饰的子集合(subset)是最常用的：
糖是2′-脱氧核糖或2′-O-甲基核糖[或2′-O-烯丙基核糖或2′- O-(2-甲氧基)乙基核糖]以及磷酸酯群为下列之一：
1.未修饰的磷酸二酯。
2.有被硫(硫代膦酸酯)、甲基(甲基膦酸酯)或取代氮[磷 酸酰胺酯(phosphoramidate)]所替代的非桥接的氧。
3.有桥接到被NH取代的[磷酸酰胺酯(phosphoramidate)) C3′的氧原子。
在寡核苷酸的等同物中，肽核酸和吗啉衍生物作为有效的 共聚物得到最普遍的应用。吡咯-咪唑聚酰胺也可被应用 [Gottesfeld，J.M.，<自然>387：202-205(1997)]。
每种修饰有不同的特性，各种修饰可以在一条单个的寡核 苷酸链上结合产生具有所需性质的共聚物。例如，可激活核糖 核酸酶的磷酸二酯键或硫代膦酸酯键的中心区组可被旁侧序列 结合，此旁侧序列对外切核酸酶更有抗性。[美国专利 No.5,491,133(1996)]共聚物的碱基可以是修饰提供，它不会被 Watson-Crick碱基配对干扰。这样的修饰通常用于增加杂交的稳 定性。实例为5-被取代的胞嘧啶或尿嘧啶，特别是5-丙基 (propynyl)胞嘧啶和5-丙基(propynyl)尿嘧啶，分别取代C或U 和T，氨基嘌呤取代A[Freier & Altmann，<核酸研究>25：4429- 4443(1997)]。
由于mRNA的二级结构和三级结构，分子的一些部分对于 共聚物杂交可能是不能进入和不可利用的。对蛋白质结合可利 用的RNA部位，对共聚物的结合更有可能进入。这些包括5′- 帽结构和发生核糖体的装配的AUG起始密码子，前体RNA的 拼接部位和聚腺苷酸化作用信号[Goodchild等人，Proceeding of the NationalAcademy of Science USA 85：5507-5511(1988)； Dominski & Kole，Mol.Cell.Biol.14：7445-7454(1994)]。在翻译 的脱细胞研究中，发现mRNA的5′-帽结构和AUG起始密码子 是特别有效的部位，也发现杂交到帽结构的寡核苷酸阻碍核糖 体的结合与多核糖体的装配[Goodchild等人，Arch.Biochem. Biophys.263：401-409(1988)]。
在下列1和3例证部分的实例详述的最初研究中，于表1 中序列鉴定号40(SEQ ID NO：40)列出的与AUG起始区域互 补的共聚物和序列鉴定号32列出的与在IimRNA中第一拼接供 体互补的共聚物在杂交及Ii抑制上显示出最大的活性。
根据对共聚物结合可利用区域的鉴定，另外的重叠共聚物 被合成并发现了以上述区域为目标的最具活性的序列(表5)。 这些共聚物此前已被测定，其对抑制作用的活性(表6A)和细 胞毒性(表6B)已被检测。按照这些标准最具活性的化合物， 序鉴定号54是与AUG起始物是互补的，也对MHC类型II的 表达及细胞的复原和生存能力产生最小的影响。序列号鉴定62 列出的共聚物也显示出强烈的活性，它与同结合RNA分子拼接 部位结合的外显予部分互补的序列相应，特别与在第一拼接供 体区域的序列相应。
如下列例证部分所提供的：专一性的共聚物杂交于专一性 的Ii RNA片段[如用RNase H测定揭示的]及抑制Ii蛋白的表达 [如用免疫荧光荧光激活细胞分类器(FACS)测定揭示的]。在与翻 译起始部位互补的共聚物中，序列鉴定号54(SEQ ID NO 54)， 序列鉴定号53(SEQ ID NO 53)，序列鉴定号52(SEQ ID NO 52)， 序列鉴定号40(SEQ ID NO 40)，序列鉴定号55(SEQ ID NO 55) 在RNase H的测定上是有效的，在抑制Ii的表达上特别具活性。 与结合拼接部位的外显子部分互补的共聚物，序列鉴定号32和 序列鉴定号62在测定上是有效的在抑制表达上也是具活性的。 结合于外显子和内含子拼接部分的交界处区域的另外共聚物抑 制内含子拼接，因而抑制代表Ii蛋白表达。特别是，与第一个 外显子3′端部分互补的和与第一个内含子5′端部分互补的寡核 苷酸抑制内含子拼接，因而也抑制Ii蛋白表达。在寡核苷酸中， 与终端密码子3′区域互补的，例如序列鉴定号64抑制Ii蛋白 表达。在寡核苷酸中，与起始密码子5区域互补的，例如序列 鉴定号48抑制Ii蛋白表达。在寡核苷酸中，与编码CLIP肽区 域互补的，例如序列鉴定号11抑制Ii蛋白表达。
除了上述的骨架修饰，其它基团可被连接与共聚物的部位 以各种各样的方式增强它的活性。这些基团被分为一些功能类 型。象烷基化物化学基团和其它有活性的种类，被连接与共聚 物的末端部位或内部部位成交联共聚物，与RNA分子杂交。 其它化学基团被连接，以催化剪切杂交RNA分子(例如，螯合 剂)。控制共聚物的核酶也促进Ii RNA的剪切。另外类型的连 接于共聚物的化学基团嵌入RNA分子的核苷酸碱基，以稳定共 聚物与Ii RNA的杂交。还有其它的化学部分增强共聚物的细胞 摄取(例如多聚赖氨酸)。还有其它的，直接传递或摄取共聚物 到专门的组织或细胞类型。这些不同的基团或者连接于共聚物 的终端羟基团，或连接于内部的磷酯。除此之外，它们可被连 接于结合在内部糖或碱基残基之上的接头，或者连接于插在于 链中的核苷酸之间的接头上[见review Goodchild，Bioconjugate Chem.1：165-187(1990)]交联和烷基化基团包含下列各项：
1.氮芥类衍生物[Knorre & Vlassov，<核酸研究和分子生物 学进展>32：291-320(1995)]。
2.重氮甲烷衍生物[Nakatani等人，<美国化学学会杂志> 119：7626-7635(1997)。
3.连接于通过间隔区链的核苷碱基上的各种部位的碘乙酰 胺或溴乙酰胺功能[Meyer等人.<美国化学学会杂志>111：8517- 8519(1989)；Kido等人，<核酸研究>20：1339-1344(1992)；Coleman & Pires，<核酸研究>25：4771-4777(1997)]。
4.吩嗪di-N-oxide[Nagai & Hecht，<生物化学杂志> 266：23994-23002(1991)]。
5.被光活化的或被细胞色素C还原酶活化成甲川基醌 (quinone methide)的萘醌[Chatterjee & Rokita，<美国化学学会 杂志>112：6397-6399(1999)]。
6.卟啉[Le Doan等人，<生物化学>1：108-113(1990)]和在 光活化作用后的钯(II)-粪卟啉[Fedorova等人，FEBS Letterrs 259：335-337(1990)]。
7.可能用于胞嘧啶部位的5-methyl-N，N-ethanocytosine [Webb & Matteucci，<核酸研究>14：7661-7674(1986)]。
8.被光活化的扫若仑[Bhan & Miller，Bioconjugate Chem.1： 82-88(1990)]。
连接于催化杂交结合RNA链水解作用的共聚物的基团包括 有：
1.葡萄球菌核酸酶[Zuckermann等人，<美国化学学会杂志> 110：1614-1615(1988)]。
2.咪唑和伯胺[Ushijima等人，J.Bba.Gen.Subjects 1379：217- 223(1998)]或二胺[Reynolds等人，<核酸研究>24：760- 765(1996)]。
3.组胺[Hovinen等人，<有机化学杂志>60：2205- 2209(1995)]。
连接于促进催化RNA水解作用的的共聚物促进金属上的螯 合物基团。包括下列一些实例：
1.亚氨基乙酸酯[Matsmura等人，<化学学会杂志> 1994：2019-2020(1994)]。
2.菲绕啉[Perrin等人，<生物化学>33：3848-3854(1994)]。
3. 2，2′-二吡啶和2，2′：6′，2″-三吡啶[Bashkin等人，<有机 化学杂志>61：2314-2321(1996)]。
4.texaphyrin[Magda，<美国化学学会杂志>119：2293-2294 (1997)]。
5.乙底酸(EDTA)[Joseph等人，<科学>278：1093-1098 (1997)]。
6.卟啉[Sigman，<生物化学>29：9097-9105(1990)]
7.博莱霉素[Bergstrom & Gerry，<美国化学学会杂志>116： 12067-12068(1994)]。
8. 2，6-吡啶二羧酸酯[Bergstrom & Gerry，<美国化学学会杂 志>116：12067-12068(1994)]。
9. 2，2′-dipocylylamine[Bergstrom & Gerry，<美国化学学会杂 志>116：12067-12068(1994)]。
从锤头和发夹有催化作用的活性部位核糖酶可被加入到共 聚物中，产生可催化互补Ii RNA剪切的人工核糖酶[Santoro andJoyce，
连接于共聚物的插入基团的实例包括：
1.荧光插入物[Endo & Komiyama，<有机化学杂志> 61：1994-2000(1996)]
2.吖啶[Lancelot等人，<生物化学>24：2521-2529(1985)； Asseline等人，Proceedings of the National Academy of Science USA 81：3297-3301(1984)；Asseline等人，EMBO J.3：795-800(1984)； Asseline等人，<生物化学杂志>260：8936-894l(1985)]
3.蒽醌[Deshmuk等人，Bioconjugate Chem.6：578- 586(1995)]
4.柔红霉素[Timofeev等人，Tetrahedron.Lett.37：8467-8470 (1996)]
5.Methidium[Timofeev等人，Tetrahedron.Lett.37：8467- 8470(1996)]
6.黄恶唑[Ishiguro等人，<核酸研究>24：4992-4997(1996)]
7.菲[Puri等人，Tetrahedron.53：10409-10432(1997)]
8.芘[Mann等人，Bioconjugate Chem.3：554-558(1992)]
连接于促进细胞摄取共聚物的基团包括：
1.通过生物膜转移的融合肽和其它肽[Bongartz等人，<核 酸研究>22：4681-4688(1994)；Allinquant等人，<细胞生物学杂 志>128：919-927(1995)；Chaloin等人，<生物化学生物物理研究> 243：601-608(1998)]
2.聚赖氨酸[Degols等人，<反义研究及其发展>2：293- 301(1992)]
3.胆固醇和胆酸[Chow等人，<反义研究及其发展>4：81- 86(1994)]
用于增加细胞摄取共聚物的复合体、佐剂和配制物 (formulations)其它类型的专一性调节剂包括：
1.脂质体[Zelphati & Szoka，<药物研究>13：1367-1372 (1996)；Juliano & Akhtar，<反义研究及其发展>2：165-176(1992)]
2.包含有非活性Sendai病毒或其它融合蛋白的脂质体 [Kitajima等人，《生物化学杂志》272：27099-27106(1997)； Morishita等人，Gene 149：13-19(1994)；Kitajima等人，Athritis. Rhem.40：2118-2127(1997)]
3.环状糊精[Zhao等人，Antidense.Res.Dev.5：185- 192(1995)]
4.Fusogenic肽[Hughes等人，《药物研究》13：404- 410(1996)；Morris等人，《核酸研究》25：2730-2736(1997)]
5.阳离子脂类[Zelphati & Szoka，《药物研究》13：1367- 1372(1996)；Capaccioli等人，《生物化学生物物理研究》 197：818-825(1993)]
6.包含结合于核酸的部分和结合于在细胞表面广泛表达 的整合蛋白受体的其它部分的肽[Bachmann等人，《分子医学免 疫学杂志》76：126-132(1998)
7.链球菌溶血素-O[Giles等人，《核酸研究》26：1567- 1575(1998)]
8.聚氮丙啶[Boussif等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7297-730l(1995)]
9.阳离子磷酸脂[Le Bolch等人，Tetrahedron Lett. 36：6681-6684(1995)]
10.dendrimers[Hughes等人，《药物研究》13：404-410 (1996)]
11.阳离子面亲水脂分子[Walker等人，Proc.Natl.Acad Sci. USA 93：1585-1590(1996)]
连接于促进选择摄取进入专一性细胞类型或组织的共聚物 的基团包括有：
1.被直接摄取入单核细胞和巨噬细胞的拟糖蛋白，这些 细胞具有使糖蛋白内化的膜凝集素[Bonfils等人，《核酸研究》 20：4621-4629(1992)]。
2.作为核运输信号的肽[Delatorre等人，Tetrahedron.Lett. 35：2733-2736(1994)]。
3.以中性白细胞为靶的胆固醇、胆酸和四肽，fMFLY[ChoW 等人，《反义研究及其发展》4：81-86(1994)]。
4.以具有甘露糖专一性表面凝集素的巨噬细胞为靶的甘 露糖[Akhtar等人，Tetraheadron Lett.36：7333-7336(1995)]。
5.以肝为靶的无唾液酸基糖蛋白[Rajur等人，Bioconjugate Chemistry 8：935-940(1997)]。
6.似胰岛素生长因子1(其增加被表达胰岛素生长因子1 受体的细胞的摄取)的肽类似物[Basu & Wickstrom，Bioconjugate Chemistry 8：481-488(1997)]。
7.增加被表达对白细胞介素-1β受体的细胞摄取的白细胞 介素-1β。
用于共聚物被直接摄取进入专一性细胞或组织类型的复合 体、佐剂和配制物包括有：
1.与连接于无唾液酸基血清类粘蛋白的聚赖氨酸或由以肝 专一性无唾液酸糖蛋白受体为靶的无唾液酸糖蛋白合成的寡 核苷酸[Bunnell等人，Somat.Cell.Mol.Genet.18：559-569(1992)； Wu & Wu，《生物化学》267：12436-12439(1992)；Lu等人，J.Nucl. Med.35：269-275(1994)]。
2.与连接于运铁蛋白并以高水平表达运铁蛋白受体的细胞 为靶的聚赖氨酸合成的寡核苷酸[Citro等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：7031-7035(1992)]。
3.与连接于叶酸并以快速分裂细胞为靶的聚赖氨酸合成的 寡核苷酸，这些细胞表达对维生素寡核苷酸的受体[Citro等人， 《英国癌症杂志》69：463-467(1994)；Leopold等人，《血液》 85：2162-2170(1995)]。
4.与抗生蛋白链菌素连接的甘露糖结合于被生物素酰基化 的寡核苷酸，其被直接摄取进入有甘露糖专一性表面凝集素的 巨噬细胞[Bonfils等人，Bioconjugate Chem.3：277-284(1992)]。
5.以肝细胞为靶的半乳糖基化的聚氮丙啶[Zant等人， Bioconjugate Chem.8：839-844(1997)]。
在优选的实施方案中，共聚物连接于一个或更多的上述的化 学部分，这些化学部分改善共聚物的药理学性质和毒性情况。 可以被影响的药理学性质包括(但不仅限于此)生物药效率、 稳定性、在血清和(或)在与生理学相关的区室中的半衰期、 毒性和可能有害或无害的对抗生物学效应。例如，共聚物的物 理性质可由于连接如胆固醇那样的亲脂的或带电荷的部分而改 变[Ojwang，J.Acq.Immun.Defic Syndrome 7：560-570(1994)]。这 种改变影响共聚物的生物学性质[Chow等人，《反义研究及其发 展》4：81-86(1994)；Demirhan等人，Virus Genes 9：113-119 (1995)]。另一个例子是连接于以后可以结合在抗生蛋白链菌素 上的生物素的共聚物。这个产物被肾清除比非连接的寡核苷酸 慢10倍以上，其降低系统清除率50％，并使更多的共聚物改为 朝向肝[Kang等人，Drug Metab.Dispos.23：55-59(1995)]。
其它类型与Ii RNA形成双螺旋分子抑制翻译的专一性调节 剂是可表达的逆基因构建物。本发明中的这样的逆基因构建物 是可表达的DNA构建物，它的表达指向与编码野生型Ii的RNA 分子片段互补的RNA的合成与翻译。当在产生Ii细胞中共表达 时，逆基因构建物的RNA产物可以杂交到编码Ii RNA上，因 而形成双螺旋结构。双螺旋结构的形成抑制编码Ii的m RNA的 翻译，从而减少了细胞中Ii蛋白的水平。
优选的是，逆基因构建物是用cDNA合成的或是编码有机 体中Ii的片段，这有机体与在其内逆基因构建物将表达的细胞 类型相应。本发明的方法和组成一般能应用于哺乳动物系统。 编码Ii蛋白的cDNA可从由各种各样哺乳动物系统中分离出的 mRNA产生，核酸序列已被测定[Singer等人，EMBO J.3：873- 877(1984)；Strubin等人，EMBO J.3：869-872(1984)；Henkes等 人，《核酸研究》16：11822(1988)]编码Ii的的哺乳动物基因已被 鉴定为是高度保守的。例如，编码小鼠和人Ii的cDNA序列已 被测定出大约85％是同源的。在小鼠和大鼠之间的保守程度大 于90％[Henkes等人，《核酸研究》16：11822(1988)]。根据哺乳 动物Ii基因的高度保守性，从实际上任何感兴趣的哺乳动物系 统得来的cDNA文库可用探针筛选(例如，来源于人或小鼠) 分离出相应的Ii基因。
用于构建逆基因构建物的表达载体选择背景是受到在其内 表达是需要的细胞类型的影响。极其多样的适当载体可被利用， 本领域的技术之一无需过分实验就能从许多有用载体中选择适 当的载体。同样，有效表达的调节信号在这样的细胞类型的基 础上进行选择，在此细胞类型中表达是需要的。在本领域中， 熟知需要这样的调节信号，并且一般也已知这样信号的非限制 来源。
在优选实施方案中，逆基因构建物是从病毒表达载体被表 达的。病毒表达载体具有增强转染哺乳动物细胞能力的特性。 这样的载体非限制地包括MFG逆转录病毒载体、如pLJ、pEm和 alphaSGC载体的逆转录病毒载体以及腺病毒载体。为了鉴定具 有表达的高功效和给定细胞功能的特殊构建物，这些载体在测 定系统中可有筛选一定数目逆基因构建物的特殊效用。除此之 外，这些载体可表达具有增强结合和(或)被特殊细胞类型摄 取性质的蛋白质。因为这样的载体包含增强在一般性质哺乳动 物的细胞中和(或)在特殊的细胞类型中逆基因构建物表达的 转录启动子，它们也可被优选。例如，从某个器官或组织类型 的癌中分离出来的那些。
逆基因构建物可通过将Ii cDNA或片段导入以逆向适当表 达的载体中产生，与野生型的方向相比，是与启动子相关的逆 向。根据这样的事实，即已知mRNA被假定有复杂的二级结构， 其可干扰它杂交于互补分子上的能力，全长逆基因构建物(即 编码mRNA分子的逆基因构建物，这种分子与编码Ii的全长 mRNA互补)不总是最有效的设计。为了开发用于Ii抑制的更 有效的构建物，经常需要进行常规实验以鉴别小于全长的cDNA 片段，并且当引入逆基因构建物时，这种片段在抑制Ii合成中 是有效的。这样实验的例子在这个应用的实例部分详细叙述。
在设计小于全长构建物时，经常需要鉴别编码Ii的mRNA 的功能重要区域，并且设计逆基因构建物以便由逆基因构建物 编码的mRNA与功能重要区域互补。例如，功能重要区域包括 涉及mRNA的核糖体识别区域、翻译起始部位、mRNA剪接点 和聚腺苷酸化需要的翻译末端密码子的3′区域。
在真核细胞中，起始核糖体与mRNA结合的机理不同于原 核生物的机理。在真核生物中，最靠近5′-端的甲硫氨酸特异性 密码子通常是用做翻译起始点的。真核mRNAs的5′末端具有 包括在5′-5′焦磷酸酯连接(经常称为5′帽结构)中连接第一个 未修饰核苷酸的甲基化鸟苷酸残基的修饰末端。例如，实验已 经证明，缺乏5′-帽结构的mRNA不能被有效翻译。因此，真 核生物中翻译起始似乎涉及5′-帽结构的识别及AUG密码子周 围的共有序列的定位。接近蛋白编码序列的核糖体识别的共有 序列是“5′-ACCAUGG-”。
通过将基因组的DNA序列(其编码初级转录物)与相应的 cDNA序列(从加工的转录物产生)比较，可以测定在初级转 录物中的剪接点的定位。在这种比较中鉴定的不连续性标记内 含子/外显子的边界。这种边界研究已经揭示了在内含子/外显子 边界的中等保守的，短共有序列及仅在3′剪接点上游的富含嘧 啶区域的趋势。另外，前两个(GU)最后两个(AG)内含子 位置发现完全保守的核苷酸碱基。
聚腺苷酸化需要多聚A信号，AAUAAA，以及自多聚A附 加部位往下游的约30个核苷酸。聚腺苷酸化稳定mRNA，因此 延长细胞中的半衰期。
在下面实例部分所述的实验中设计和试验了用于抑制鼠细 胞中Ii表达的逆基因构建物。鼠Ii蛋白由215个氨基酸的残基 组成[Singer等人，EMBO J.3：873-877(1984)]。因此，编码该分 子的全长cDNA包括645个碱基对的编码序列。
在以下例子中，设计和检测了几种逆基因构建物。发现它 们有一些抑制在SaI/CIITA细胞中Ii蛋白的表达。Ii蛋白表达 的抑制(达到60％的细胞)在一些但非所有mIi逆基因构建物的 转染子中被观察到。表中序列鉴定号(SEQ ID NOS)：68、71、 72、75、77、78和79的所列的逆基因构建物显著抑制Ii蛋白 表达。
如上所述，用逆基因构建物抑制蛋白质表达的效率在很大 程度上依赖于靶RNA的二级结构。在此所述的实验证明，Ii蛋 白对逆基因构建物引起的表达抑制特别敏感。这样的结论是基 于以下事实：几种逆基因构建物显示了显著的抑制Ii蛋白表达 的能力。而且，全长的逆基因构建物的截断变体甚至产生较高 度的抑制。此项实验工作结果与已知的在哺乳动物Ii基因之间 的高度保守性一起被认为可有确实根据地预见在其它哺乳动物 系统(包括人类系统)中逆基因构建物的活性。
在可替换的实施方案中，Ii专一性的调节剂是由专门杂交 于Ii基因的核苷酸碱基组成的共聚物。这个杂交阻断靶细胞Ii 基因的转录和表达调节。在两条反向平行DNA链的核苷酸碱基 Watson-Crick互补配对保持的时候，杂交是通过形成Hoogsteen 配对来进行的。可替换的是，治疗剂的核苷酸碱基配对可以通 过形成‘D环’，是与细胞DNA一条链核苷酸碱基序列反向平 行的。相应的共聚物成分及其传递给细胞的方法在上面已有论 述。
在另一个实施方案中，专一性的Ii调节剂是20-1000道尔 顿(Daltons)的有机分子。通过以增强结合MHC类型II子的内 源性抗原决定簇的方式改变Ii蛋白与MHC类型II分子的相互 作用，此有机分子抑制Ii蛋白功能，例如，于靶细胞的内质网 中。本发明中有机分子的例子包括(但不局限于)肽、拟肽和 小的有机分子。在对MHC类型II分子和Ii蛋白的晶体学和核 磁共振证据的基础上，通过合理设计的程序，鉴定具有专一性Ii 调节剂功能的有机分子。更加特殊的是，在Ii蛋白和MHC类 型II分子之间相互作用的部位也被测定，并且，模仿在相互作 用部位的此二种蛋白质肽片段的复合物也已被制备和测定，用 于破坏MHC类型II/Ii蛋白复合体的形成。可以替换的是，通 过准备复合物的(combinatorial)文库或者用多数的系统上各 种各样的化学基团来鉴定这样的小有机分子。然后，这样的复 合物以几种测定方式被检测。在于体外的化学水平上，在专一 性的组织蛋白酶和其它细胞内蛋白酶是否存在的情况下，Ii蛋 白与MHC类型II蛋白质的分离可被测定。从这样测定的候选 分子进一步测定其对内源性合成抗原决定簇提呈的增强，例如， 从以转染基因形式编码的鸡蛋溶菌酶中。主要的复合物然后要 进行功能上的测定，例如，在以下讨论的诱导肿瘤免疫原性在 癌细胞疫苗模型中的增强。
在优选的实施方案中，已用药理学合格的载体配制出Ii蛋 白表达免疫调节功能的专一性调节剂。此载体就以下方面有优 选的性质，例如(也不限于此)，防止变性作用、稳定性、通过 一般物理化学手段和(或)通过对细胞表面受体的粘附产生的 向靶细胞群体表面的吸附作用。药理学合格的载体也可增强Ii专 一性调节剂对细胞群体的传递。
在一个实施方案中，药理学合格的载体是脂质体，或是一 种或多种脂类的小泡状制备物，或是有一种或多种需要性质(例 如，保护作用、分室作用或向靶细胞群传递)的脂多糖。
在另一个实施方案中，药理学合格载体增强Ii专一性调节 剂向专门细胞群体的传递。这方面的一个例子是与束缚、吸附 或粘附其上的分子相互作用的配置物(例如，脂质体或其分子 具有通过与靶细胞表面互补受体分子相互作用而结合于靶细胞 群表面的性质的小泡状制备物)。
本发明的另一个方面与Ii蛋白表达或免疫调节功能的专一 性调节剂被导入其中的细胞有关。上述的Ii专一性调节剂向相 应的受体细胞的导入可通过各种各样的方法达到。采用的方法 取决于被传递的专一性调节剂、专一性调节剂的配制物和受体 细胞。这些细胞在疾病的治疗上和在从这样的细胞提呈的表位 中开发新型诊断和治疗试剂(抗原肽及其它们的衍生物)上有 几种用途。
相应的受体细胞是表达MHC类型II分子和表达通过MHC II类型分子提呈抗原功能的细胞。此细胞或可自然发生，或可 从处理一个或更多细胞产生。这些将在下面讨论。表达MHC类 型II分子的细胞在此被称为MHC类型II-正效。适应于上 述需要的细胞在此被称为MHC类型II正效抗原提呈细胞。
自然发生的起作用的抗原提呈细胞表达MHC类型II分子 和其它辅助功能，这些辅助功能是在它们朝向并入MHC类型II 肽结合部位的过程中加工、交换(trafficking)、结合和编辑抗原 肽所需要的。除此之外，这些细胞表达细胞表面相互作用的分 子，例如，B7、CD24、CD40、白细胞介素受体、白细胞介素 和其它这样对与MHC类型前后相关的(in the context)的抗原 肽识别有最适应答所需要的蛋白质。如果是非自然发生，所需 要辅助功能的表达可在细胞中被诱导，或是使用如干扰素γ (gamma)或粒细胞巨噬细胞群刺激因子的细胞素诱导，或是用任 何上述的免疫应答强化剂通过基因转染诱导。本发明包括这样 的细胞及其衍生物，以及它们的后代。
本发明的一个最终目的是产生能显示与MHC类型II蛋白 质相关的专一性抗原肽的细胞。因此，接受MHC类型-II正 效抗原的提呈细胞必须表达或者包含有这样的肽。在优选的实 施方案中，MHC类型II-正效抗原提呈细胞从细胞的融合发 生的，这是包含有抗原提呈机构和有关的MHC类型II分子的 细胞与包含有对其需要有免疫应答的决定簇抗原肽的细胞或此 细胞衍生物的融合。在多数的例子中，产物是一类专门的抗原 提呈细胞(例如，树状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞或某种多 效细胞)和表达有重要性抗原表位的细胞的融合。这样表达抗 原表位的细胞包括例如，恶性细胞、病毒感染或转变细胞、与 诱导自身免疫应答有关的细胞和通过抗个体基因型网状机理调 节自身免疫应答的细胞[例如，表达在类风湿性关节炎中与致病 相关的T细胞受体(TCR)]。融合产物可能是显著异原的细胞 制备物，或者是于体外新获得的，或者是在体外复制后获得的。 它们可能是从这样的体外融合中衍生出的细胞系或是从这样的 细胞系中衍生出克隆制备物。
可替换的是，可接受MHC类型II-正效抗原提呈细胞是 从导入遗传物质或蛋白质衍生物产生的，这样的导入是从携带 所需抗原表位的细胞到自然表达抗原提呈机理和相关MHC类型 II分子的细胞。例如，cDNA是由细胞内有多腺苷酸尾的 mRNA制备物合成的。此cDNA制备物是由已确立的程序传递 给需要合成抗原表位的另外细胞的。用基因枪或其它技术传递 DNA的方法被利用，并作为本领域一项技术可被成功应用[美国 专利No.5,593,972(1997)；美国专利No5,643,578(1997)；美国专 利No.5,716,613(1998)；美国专利No.5,741,486(1998)]。除此之 外，如美国专利No.5,627,025(1997)所揭示的(其内容在此被并 入本文)，与肿瘤相关的或肿瘤专一性蛋白质的基因，或者这样 蛋白质基因的片段可被传递到病人的树状细胞或其它的专一性 抗原提呈细胞群。从这样方法产生的细胞群可被用于在天然异 原细胞系水平或群体水平上的疫苗。
在一个实施方案中，可接受MHC类型II-正效抗原提呈 细胞是恶性细胞或包含从恶性细胞衍生出的成分。这样的细胞 包括(但不限于此)癌细胞和其它胃、结肠、直肠、乳腺、肺、 前列腺、膀胱、胰腺和脑部的肿瘤细胞，以及黑素瘤、白血病 和淋巴瘤细胞。在优选的实施方案中，细胞在细胞表面受体[例 如，与MHC类型I或MHC类型II分子相关的(in the context of)]表达个体基因型决定簇。这样的个体基因型决定簇可能从 如免疫球蛋白或T细胞受体中衍生，并被MHC分子提呈。由 于个体基因型肽是从细胞群专门受体中衍生的，抗原决定簇是 真正地肿瘤专一性的。B-淋巴恶性肿瘤的免疫球蛋白受体包含 在它们与抗原结合部位的个体基因型的肽序列。这样的受体和 它们个体基因型的肽对那些细胞群体是独一无二的。在另一个 实施方案中，可接受MHC类型II分子的抗原提呈细胞是非恶 性肿瘤细胞。那些细胞包括(不限于此)包含病毒、细菌、寄 生虫和其它病原体的细胞。也包括在免疫系统中具有功能的细 胞，例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、树状细胞和自然杀伤细 胞。
上述的细胞在疾病治疗和从由这样细胞提呈的表位取得的 新诊断试剂和治疗试剂的开发上有几种用途。沿着这条线索， 本发明也提供了治疗疾病的治疗试剂和治疗方法。本发明的一 个方面是显示自我决定簇肽的方法，此肽在MHC类型II-正 效抗原提呈细胞表面，与MHC类型II蛋白质有关。自我决定 簇肽在此定义为其可以结合于MHC类型II分子抗原肽结合部 位用于向T淋巴细胞提呈的肽。这样的肽可以从在抗原提呈细 胞本身内合成的蛋白质中衍生，或是从蛋白质传递到抗原提呈 细胞，例如，对于抗原或补体的细胞表面受体。此方法包括提 供在以上已详述的包含有所需要的自我决定簇肽的MHC类型 II-正效抗原提呈细胞。一旦提供此方法，Ii蛋白表达或免疫 调节功能的专一性调节剂就被导入到细胞中，影响与MHC类型 II蛋白质相关的自我决定簇肽的显示。Ii专一性的调节剂可以 是上述的任何形式。在优选方案中，Ii专一性调节剂或者是由 核苷酸碱基组成的共聚物，或者是可表达的逆基因构建物。导 入这样成分的细胞或是恶性细胞，或是非恶性细胞；或是从用 这样被处理细胞的内源性决定簇进行免疫接种能得到所需治疗 效果的个体中取得，或或是从其它个体中取得。除此之外，导 入这样成分的细胞或是从个体中刚刚获得的样本；或是在培养 之后，包括构建了细胞系或无性繁殖系(克隆)的样本。Ii专 一性调节剂首选用电造孔法导入受体细胞。
在另一方面，本发明提供了通过增强对恶性肿瘤的免疫攻 击力来治疗病人体内恶性肿瘤的方法。这是通过生产和使用肿 瘤细胞疫苗来实现的。肿瘤细胞疫苗是经过处理包含恶性肿瘤 抗原表位(通过MHC类型II分子提呈表位)的细胞来产生的， 其尽力引动病人的免疫系统朝向恶性肿瘤。这种类型的治疗是 通过两种方法之一来实现的：1)用活体外方法，此方法中，细 胞在体外得到处理并生产肿瘤疫苗细胞，然后再被导入到病人 体内。2)在活体内直接产生肿瘤疫苗细胞。在第一种方法中， 恶性肿瘤细胞群可从多样来源获得。这样的制备物可来自于从 病人获得的非选择性的肿瘤细胞群体，其可与相伴的正常细胞 分离或不分离，或来自于从细胞系或这样细胞系的克隆中获得 的。这样的细胞可从已建立的恶性细胞系中或新鲜恶性组织(例 如，直肠或卵巢腺癌)的移出物中获得。如有必要，获得的细 胞群体可在体外被扩大。可替换的是，也可用非恶性细胞。
无论是何来源，细胞必须表达或包含被处理的恶性细胞抗原 决定簇。除此之外，如果细胞不能自然表达足够量的MHC类型II 分子，必须诱导它们这样做。这可以用上述的方法来完成。
一旦获得或产生了适合的细胞群体，就可用前面已描述过 的方法将Ii表达的专一性调节剂导入细胞，首选的方法是电造 孔法。在专一性调节剂导入后，细胞一般被进一步培养一段时 间，在此期间需要Ii表达抑制剂在抑制Ii表达中施加它的作 用，需要带有内源性抗原决定簇的MHC类型，此后需要具有 表面表达的复合体。
经处理的细胞然后被导入到病人体内。可替换为，被处理 细胞的衍生物可被导入到病人体内。细胞的导入可以是静脉内 的、皮下的、腹膜内的或肌内的。在优选的方案中，在导入病 人体内前，已使被导入的细胞失去复制能力(例如，用放射处 理或固定法)。已确认的有关癌疫苗免疫治疗的科学实验报告已 在如下文献中讨论[Clements等人，《免疫学》149：2391-2396(1992)； Baskar等人，《细胞免疫学》155：123-l33(1994)；Baskar等人，《医 学实验杂志》181：619-629(1995)；Hersey，《药物》47：373(1994) 和Pardoll，《今日免疫学》14：310(1993)。
由本发明提供的治疗病人恶性肿瘤的第二个方面涉及到将 专一性的Ii调节剂导入到未从病人体内取出的可达到的肿瘤细 胞中，将Ii专一性调节剂以充足的量给以病人诱导抗癌免疫应 答。这种应答的特征是由活性的诱导和(或)T淋巴细胞的数 目来决定的，T淋巴细胞有杀伤癌细胞的功效和(或)调节其 它细胞去杀伤癌细胞的功效。诱导抗癌免疫应答需要的量将因 每个病人和专门的恶性肿瘤而异。在一个实施方案中，所需量 在每天10μg和100mg之间。
给药的适当途径包括但不限于静脉注入(例如，通过注射)、 通过皮肤或粘膜表面注入(例如，表面敷用)、用适当的载体颗 粒包被后用基因枪插入(例如，胶体金)。特别是，由放射学家 所做的用微注射注入内脏转移瘤，通过荧光镜透视检查使靶组 织显影的方法已被誉为典型的方法学。这样的给药也可通过注 入到体腔中或注入到腔中包含的腔液中，例如，在卵巢癌的病 例中。通过这些方法I专一性调节剂接触到和被导入到原发的 或转移的肿瘤细胞中，从而增强MHC类型II分子将内源性肿 瘤决定簇由肿瘤细胞提呈给免疫系统。
在一个实施方案中，专一性的Ii调节剂是用药理学可接受 的载体给予的。简言之，有很好确立的在全身或局部注入后保 护治疗用的寡核苷酸的方法，传递到目标的方法和进入到所选 细胞群的方法。全身或局部治疗的方法将适用于肿瘤和它的提 呈。例如，有腹部转移瘤和腹水的卵巢癌将用腹膜内注入寡核 苷酸来治疗，所给药剂以适当的配置形式增强恶性细胞对其的 摄取。这些方法已在于此引证的文献和专利中被提出，或于美 国专利5,098,890号(1992)；美国专利5,273,745号(1993)； 美国专利5,290,551号(1994)；美国专利5,637,483号(1997)； 美国专利5,648,223号(1997)；美国专利5,679,647号(1997)； 美国专利5,693,522号(1997)和美国专利5,788,963号 (1998)，其中有关内容通过在此引证被并入本文。
与以上描述类似的方法可被应用于启动个体免疫系统朝向 非恶性的然而是不良的细胞。本发明的另一方面是通过增强对 个体不良细胞群的免疫攻击力来治疗个体非恶性疾病的治疗方 法。不良细胞群的细胞通常是直接从病人体内获得，而如前面 所述的是在体外处理，使其产生MHC类型II正效抗原提呈细 胞，它包含一般针对不良细胞群的抗原决定簇。如上所述，一 旦适合的受体细胞群产生，Ii蛋白表达的专一性调节剂被导入 到受体细胞增强MHC类型II对抗原决定簇的提呈。这种导入 的优选方法是电造孔法。然后，细胞再被导入到个体内。这可 通过上述的方法来完成。如前所述，在优选的实施方案中，细 胞在再被导入到个体内之前，使其失去复制功能。
通常，不良细胞群是疾病发生的原因或是其产物。藏匿病 毒或其它细胞内病原体的的细胞群体就是一例。这样的细胞表 达由病原体编码的蛋白质并被激发对病原体的应答。涉及到病 原体免疫应答的细胞群是另外一例。
藏匿着病毒或其它细胞内病原体的的细胞对病原体感染表 达专一性的分子。宿主细胞结构基因的一些上游调节区域可以 被由病原体编码的反式作用因子激活或者被其激发。宿主细胞 蛋白质也可作为对病原体免疫应答的成分被激发，例如，细胞 素。这样的对被感染细胞有绝对或相对专一性的蛋白质可被加 工和由被感染细胞或宿主抗原提呈细胞提呈，例如，巨噬细胞 或树状细胞。当提呈病原体蛋白质的细胞或被激发对病原体做 出应答的细胞与靶向Ii蛋白的反义试剂适当接触的时候，通过 MHC类型II分子，另外的抗原决定簇被提呈，MHC类型II分 子引起T辅助细胞群的扩大，然后其又加强了MHC类型I对病 原体有限制的免疫应答。这种方法增强了MHC类型II对附加 的病毒抗原决定簇或者对病毒感染细胞有着绝对或相对专一性 的抗原决定簇的提呈。MHC类型II有限的辅助细胞的诱导引起 增强杀伤T淋巴细胞对病毒感染细胞的破坏和增强治疗性免疫 球蛋白的诱导。在这一点上，只有被病毒感染细胞的部分需要 用Ii反义疗法治疗并被重新导入到病人体内。特别是在Epstein- Barr病毒感染正常B细胞(在这样的细胞中，Ii显示出对抗-EBV 免疫应答抑制的非常过度的表达)的病例中，此治疗法在增强 抗-EBV免疫应答上是有效的。与其类似的是，在HIV感染的 可对表达MHC类型II抗原起作用的CD4＋T淋巴细胞的病例 中，通过用抗Ii构建物处理这些细胞，抗HIV免疫应答将会得 到增强。监测治疗效率的过程可采用现在通常使用的程序。将 病毒DNA导入到细胞和组织的方法是由美国专利4,689,320号 (1987)和美国专利5,620,896号(1997)提供的，它们的相关 内容在此通过在此引证被并入本文。
在另外的实施方案中，不良细胞群体包含自身反应T淋巴 细胞。涉及到致病的免疫应答的细胞也表达专门对这些细胞群 的抗原决定簇。这样，由自身反应T淋巴细胞引起的自身免疫 疾病可以用本发明的成分和方法来治疗。表达MHC类型II分 子的致病T细胞可通过这些分子提呈它们的T细胞受体(TCR) 的个体基因型肽。用上述的方法，这样的细胞群可被用于诱导 病人的对致病T细胞的免疫应答。从以上所述一些方法适合制 备癌细胞疫苗。这些方法特别包括但不限于扩增培养用做制备 T细胞疫苗的致病T细胞和用编码T细胞受体(TCR)链或片 段的核酸共聚物转染另外的细胞群，例如，树状细胞。诱导MHC 类型II有限的辅助细胞导致增强其它杀伤T淋巴细胞对致病T 细胞的破坏。在这一点上，只有部分致病T细胞或者其培养物 或克隆需要用Ii反义疗法处理以及重新导入到病人体内。
例如，类风湿性关节炎被提议用细胞毒素T细胞的破坏作 用来调解，这些细胞直接指向发炎关节处的抗原。这样的细胞 毒素T细胞具有独特的T细胞受体(TCR)，其可以被加工和提 呈给免疫系统。增强其它T细胞对这些TCR衍生的个体基因型 肽的免疫应答将改善类风湿性关节炎病人的临床状态。到这样 病理T淋巴细胞表达MHC类型II分子的程度，导入专一性的Ii 蛋白表达调节剂将导致启动辅助T细胞对相关TCR表位的应 答。如以上讨论，与产生受体MHC类型II正效抗原提呈细胞 相关联，这样的治疗可能也受到树状细胞进入(licensing)的增 强的影响。如上所述，这种治疗方式包括但不限于T细胞群的 分离和TCR基因对树状细胞的转染。
先前监察自身免疫病治疗的程序也适用于本治疗效果的监 察程序。这样有关的方法在包括于此引证的文献中被提出或被 美国专利5,614,192号提出或评论，其有关内容在此通过引证被 并入本文。
在另外的实施方案中，患有自身免疫疾病的病人的治疗是 通过在病程中的适当时间给予专一性的Ii表达调节剂来完成 的。这就是，治疗是按着调节对与自身免疫应答扩大的毒性期 相关的抗原决定簇的应答来安排时间的，而不是在抑制性T细 胞调节的自体免疫反应的缓解中。这样定时的治疗安排已有描 述，例如，在鼠辅助性(adjuvant)关节炎和实验性的过敏脑脊 髓炎的病例中。于此方法中，给病人足够量的Ii功能的专一性 调节剂以诱导抗病的免疫应答。抗病免疫应答的特征是：减少 对病理性免疫应答起作用的T淋巴细胞的活性和(或)数目， 和(或)诱导能调节对病理性免疫应答起作用细胞的活性和(或) 数目的T淋巴细胞的活性和(或)数目。诱导抗病免疫应答所 需给药量随每个病人和专门的疾病而有所变化。在一个实施方 案中，每日所需量在10μg和l00mg之间。适宜的给药途径包 括，例如，关节间隙的注射、静脉和体腔内注入和表面的敷用。 在疾病的进行过程中或在疾病急剧恶化阶段准确按时给药在一 定程度上诱导对疾病的抑制。
在一个实施方案中，Ii功能的专一性调节剂在给予病人时， 使用药理上可接受的载体，其可保护复合物和(或)增强对一 定组织的靶向和对其的摄取。已有很好确立的在局部或全身注 入时保护寡核苷酸的方法和传递给目标以及进入所选择细胞群 的方法。局部和全身的给药方法将适合于自身免疫疾病和它的 显示。例如，将Ii表达或免疫调节功能的专一性调节剂注入一 个关节间隙来治疗由类风湿关节炎引起的这个膝关节的急性发 炎。与共聚物和其它专一性的Ii功能调节剂的给药有关的方法 在上面已提出，并在于此引证的文献和专利中提出。这样的方 法在以下引证的文献或专利中提出，专利为：美国专利5,356,779 号(1994)；美国专利5,672,473号(1997)；美国专利5,731,160 号(1998)；美国专利5,736,507号(1998)，专利的有关内容通 过在此引证被并入本文。
本发明也提供了分离细胞中自我决定簇肽的方法。通过用 上述的方法诱导MHC类型II抗原提呈自我决定簇肽，然后溶 解和提纯与同它们有关联的自我决定簇肽共提纯的MHC类型II 分子，从而获得自我决定簇肽。
包含所需的自我决定簇肽的细胞可刚刚从病人体内获得或 从这些细胞的培养物中获得。如果细胞不是自然的抗原提呈细 胞，例如，不表达MHC类型II分子，可以通过上述的步骤使 其在体外得到处理，从而显示所需要的活性。一旦受体抗原提 呈细胞产生，上述的Ii蛋白表达专一性调节剂就被导入到细胞 中，细胞被培养足够的时间，使之能对专门的抑制剂表达和产 生增强MHC类型II抗原对抗原决定簇肽提呈的结果。细胞然后 按标准的程序被溶解，以及MHC类型II分子和相关的抗原决 定簇肽从溶解的细胞中提纯。提纯的步骤包括但不限于去污可 溶解的与植物凝集素有亲和力的富集膜蛋白的免疫提纯。自我 决定簇肽然后从免疫提纯的MHC类型II分子中释放出来，例 如，通过酸处理。释放的免疫决定簇肽再被分离和鉴定。通过 高压液体层析法来完成提纯，用质谱分析法来完成鉴定。推断 的自我决定簇肽的序列通过这样肽的化学合成，接着用物理化 学和生物学的分析来确定。这样的方法是在由Urbande等人，《免 疫学评论》17：387-397(1997)评论的文献中提出的。
本发明也找到了治疗病人病原性自身免疫应答的应用方 法。更特殊的是，为了降低对病原性自身免疫应答的调节，在 自身免疫病周期的某些阶段内源性抗原的提呈的增强受到了刺 激。并且还显示出[例如，在某些如鼠辅助(adjuvant)关节炎的 关节炎疾病的动物模型中]：在疾病侵入发展的起始阶段之后， 朝向启动病理过程的同样抗原决定簇的抑制性T淋巴细胞也抑 制这些免疫应答。在降低病程调节的第二个时期(临床上作为 缓解的指标)，由Ii抑制使细胞中内源性自身抗原提呈的治疗性 的增强将降低疾病的调节。并且，在缺少共同刺激信号的细胞 (例如，无B7的细胞，其中，B7的表达受到用B7反义构建物 处理的抑制)中，Ii的抑制将产生无反应性的应答。
用标准技术首先将细胞群(例如，表达T细胞受体的在病 理过程中具有活性的T淋巴细胞、或自身免疫疾病病程中的靶 细胞、或病毒感染的细胞)从个体中分离出来。如有必要，在 这样的细胞中用上述的技术可诱导MHC类型II分子。然后， 细胞群用专一性的Ii蛋白表达调节剂处理。细胞再被溶解以及 MHC类型II分子和相关的肽被提纯，例如，通过用单克隆抗体 对MHC类型II分子的免疫沉淀反应。肽从MHC类型II分子 中分离(例如，用酸处理)，再用如高性能液体层析分离之后， 具有特征的个体肽用质谱分析仪测定。从它的在质谱分析时离 子片段的模式中，推断出肽的序列，通过用推断的序列合成的 肽的质谱分析来确认。生物学测定可以进一步确定合成肽与病 的过程和它的消退的相关性。一种或多种形式的被鉴定肽，或 者称为同系物，然后被导入到此病人体内或其他有同样病理性 过程的病人体内，以影响临床上的改变。这些被治疗的病人被 监测到有缓解的迹象。
与这个步骤有关的方法在于此引证的文献中被提出，或由 美国专利5,356,779号(1994)；美国专利5,672,473号(1997)； 美国专利5,736,507号(1998)；美国专利5,773,570号(1998) 提出，其中相关内容在此通过引证被并入本文。
上面公开的方法的意义重要优点是：短暂地或偶而地使用 所公开的成分就可导致启动免疫系统对抗专门疾病或相关疾病 的决定簇。在这样的启动后，不用另外的反义治疗免疫系统就 能抵制肿瘤细胞或病源性的自身反应T细胞。与此相对照，在 最通常的应用反义治疗来控制疾病上(例如，象HIV那样的病 毒性疾病)，当中断使用反义药物时，疾病(或病毒)出现反弹。 这种方法另外的首选价值是：对免疫应答的抗疾病启动的诱导 可以用公开的反义成分在身体内外继续进行。
本发明的另一个方面与个体的遗传治疗有关，通过增加自 身免疫破坏被激发的组织中的Ii蛋白治疗组织专一性自身免疫 紊乱。这种治疗方法是在上面提出的通过减少Ii蛋白表达以增 强MHC类型II分子对自我决定簇提呈的方法在概念上的镜象。 相反，这种方法在细胞激活的活动中其结果是增加了Ii蛋白的 存在。在以上所谈的细胞激活活动中，MHC类型IIα链和β链 增加了的表达并无伴随着增加Ii蛋白的表达导致了增强自身抗 原的提呈。这个增加了的自身抗原的提呈导致破坏组织的自身 免疫应答。治疗上在组织中增加Ii减少了MHC类型II分子对 内源性抗原的提呈，同时减小了自身免疫反应，从而减小了组 织的破坏。通过增加Ii的基本表达，在靶组织中的Ii蛋白增加 了。这是通过导入在启动子控制下的Ii基因来完成的，在靶组 织细胞中此启动子具有活性。更好的是，启动子是组织专一性 的，在非靶组织中，其只有最微小的活性。Ii基因和启动子是 以表达构件物的形式提供。合适的表达构建物(例如，病毒载 体)和适当的将表达构建物导入病人细胞中的方法在上面已提 出。对基因治疗各种各样方法常见的步骤和成分将根据得到的 有用的临床效果来选择。
这种方法可被用于治疗(DM)糖尿病，此病的结果是胰腺 β细胞的破坏。在胰岛素启动子的控制下，将Ii基因插入敏感 的个体中导致增强Ii蛋白在胰腺β细胞中的表达。治疗结果是 保护了胰腺β细胞免受自身免疫诱导的破坏。除此之外，上述 的方法可用于治疗一些形式的可引起甲状腺小囊细胞破坏的甲 状腺炎。插入在甲状腺球蛋白启动子控制下的Ii基因将导致在 甲状腺小囊细胞中Ii表达的增强。保护它们免受自身免疫诱导 的破坏。
实施例1与反义寡核苷酸杂交的Ii RNA位点的鉴定
在RNA与DNA杂交的位点上核糖核酸酶H剪切RNA的 作用被用于鉴定与反义寡核苷酸杂交的Ii RNA的位点。一系列 去氧寡核苷酸被用于杂交测定，每个去氧寡核苷酸包含18个碱 基，它们的序列从头至尾与Ii RNA片段以交错重叠的模式互补 (见表1)。RNA被转录并在5′端用32P标记。这个用32P标记 的Ii mRNA样本在具有核糖核酸酶H的情况下分别与每个寡核 苷酸一起培养。杂交于RNA的寡核苷酸指导核糖核酸酶H在杂 交区域剪切RNA。剪切的位点由从RNA5′端度量的标记产物的 长度来表明。通过聚丙烯酰胺胶电泳法和放射自显影照片分析 反应的产物(见表2)。正如剪切产物的产生易于变化所表明的 那样，一些(但不是所有的)寡核苷酸有效地杂交于RNA上。 在不具有寡核苷酸的情况；或者具有寡核苷酸而缺乏核糖核酸 酶的情况；或者具有有意义的寡核苷酸的对照(序列鉴定号： 46)；或者具有带有一个内部缺失的反义寡核苷酸(序列鉴定号： 43，序列鉴定号：44和序列鉴定号：45)的情况，Ii RNA没有 剪切都可观察到。得到强烈剪切的寡核苷酸序列又通过硫代膦 酸酯键重新合成用于在例3、例4和例5中提出的反义效力的另 外研究。此项研究是用小鼠Ii P31 mRNA进行的，但杂交位点 分析的类似程序可应用于任何种RNA。 表1用核糖核酸酶H的反义磷酸二酯寡核苷酸序列定位实验 序列鉴 定号 序 列 核苷酸位置 5 5′-CAT GTT ATC CAT GGA CAT 318-301 6 5′-CAT GGA CAT TGG ACG CAT 309-292 7 5′-TGG ACG CAT CAG CAA GGG 300-283 8 5′-CAG CAA GGG AGT AGC CAT 291-274 9 5′-AGT AGC CAT CCG CAT CTG 282-265 10 5′-CCG CAT CTG GCT CAC AGG 273-256 11 5′-GCT CAC AGG TTT GGC AGA 264-247 12 5′-TTT GGC AGA TTT CGG AAG 255-238 13 5′-TTT CGG AAG CTT CAT GCG 246-229 14 5′-CTT CAT GCG AAG GCT CTC 237-220 15 5′-AAG GCT CTC CAG TTG CAG 228-211 16 5′-CAG TTG CAG GTT CTG GGA 219-202 17 5′-GTT CTG GGA GGT GAT GGT 210-193 18 5′-GGT GAT GGT CAG CTT GTC 201-184 19 5′-CAG CTT GTC TAG GCG GCC 192-175 20 5′-TAG GCG GCC CTG TTG CTG 183-166 21 5′-CTG TTG CTG GTA CAG GAA 174-157 22 5′-GTA CAG GAA GTA AGC AGT 165-148 23 5′-GTA AGC AGT GGT GGC CTG 156-139 24 5′-GGT GGC CTG CCC AGC CAA 147-130 25 5′-CCC AGC CAA GAG CAG AGC 138-121 26 5′-GAG CAG AGC CAC CAG GAC 129-112 27 5′-CAC CAG GAC AGA GAC ACC 120-103 28 5′-AGA GAC ACC GGT GTA CAG 111-94 29 5′-GGT GTA CAG AGC TCC ACG 102-85 30 5′-AGC TCC ACG GCT GCA CCT 93-76 31 5′-GCT GCA CCT TTC TGG CTC 84-67 32 5′-TTC TGG CTC TCT AGG GCG 75-58 33 5′-TCT AGG GCG GTT GCC CAG 66-49 34 5′-GTT GCC CAG TAT GGG CAA 57-40 35 5′-TAT GGG CAA CTG TTC ATG 48-31 36 5′-CTG TTC ATG GTT AGA GAT 39-22 37 5′-GTT AGA GAT GAG GTC GCG 30-13 38 5′-GAG GTC GCG TTG GTC ATC 21-4 39 5′-GCG TTG GTC ATC CAT GGC 15--3 40 5′-TTG GTC ATC CAT GGC TCT 12--6 41 5′-GTC CTC CAT GGC TCT AGC 9--9 42 5′-CAC AGG CGC TGC TGC TGC -23--40 43 5′-ATC CAT GGC TCT AGC C_CT (5′-ATC CAT GGC TCT AGC CTC)* 6--13(-11 deleted) (6--12) 44 5′-TCT AGC C_CT AGT TTT TCC (5′-TCT AGC CTC TAG TTT TTC)* -4--22(-11 deleted) (-4--21) 45 5′-AGT TTT T_CC CAC AGG CGC -14--31(-20 deleted) 46 5′-ATG GAT GAC CAA CGC GAC 1-18(sense) 47 5′-CTA GTT TTT CCC ACA GGC -12--29 48 5′-CTG CTG CTG TTG CTG CTG -40--57
Ii mRNA序列[Koch等人EMBO杂志6：1677-1683， (1987)]是这样编号的，以至第一个AUG密码子的A在核 苷酸序列序列鉴定号39，序列鉴定号40，序列鉴定号41，序 列鉴定号43和序列鉴定号46中是核苷酸1。作为负对照的包 括：寡核苷酸序列鉴定号43，序列鉴定号44和序列鉴定号45 (每个都有内部缺失)和具有有意义的序列定位作用的寡核 苷酸序列鉴定号46。对序列鉴定号43和44。*天然的序列 (无缺失)在括号中表示，其用于表4中的序列实验。
表2对小鼠Ii反义寡核苷酸易受影响位点的
核糖核酸酶H的定位 寡核苷酸 核苷酸位置 信号 序列鉴定号：5 318-301 - 序列鉴定号：6 309-292 + 序列鉴定号：7 300-283 + 序列鉴定号：8 291-274 ± 序列鉴定号：9 282-265 - 序列鉴定号：10 273-256 ± 序列鉴定号：11 264-247 +++ 序列鉴定号：12 255-238 + 序列鉴定号：13 246-229 + 序列鉴定号：14 237-220 - 序列鉴定号：15 228-211 - 序列鉴定号：16 219-202 + 序列鉴定号：17 210-193 + 序列鉴定号：18 201-184 +++ 序列鉴定号：19 192-175 - 序列鉴定号：20 183-166 - 序列鉴定号：21 174-157 - 序列鉴定号：22 165-148 ++ 序列鉴定号：23 156-139 ± 序列鉴定号：24 147-130 - 序列鉴定号：25 138-121 - 序列鉴定号：26 129-112 - 序列鉴定号：27 120-103 ++ 序列鉴定号：28 111-94 +++ 序列鉴定号：29 102-85 - 序列鉴定号：30 93-76 + 序列鉴定号：31 84-67 ++ 序列鉴定号：32 75-58 +++ 序列鉴定号：33 66-49 - 序列鉴定号：34 57-40 - 序列鉴定号：35 48-31 - 序列鉴定号：36 39-22 ± 序列鉴定号：37 30-13 +++ 序列鉴定号：38 21-4 +++ 序列鉴定号：39 15--3 +++ 序列鉴定号：40 12--6 +++ 序列鉴定号：41 9--9 - 序列鉴定号：42 -23--40 - 序列鉴定号：43 6--13(-11 deleted) - 序列鉴定号：44 -4--22(-11 deleted) - 序列鉴定号：45 -14--31(-20 deleted) - 序列鉴定号：46 1-18(sense) - 无寡核苷酸 - 无核糖核酸酶H -
每个寡核苷酸的反义寡核苷酸序列鉴定号、它们的核苷酸 在Ii mRNA的开始位置和以-、+到+++的级别判断的产物强度 均在表中表示出来。 实验
化合物磷酸二酯脱氧寡核苷酸是通过整合DNA技术合成 的，Inc.(Coralville，IA)。每个寡核苷酸的序列鉴定号、核苷酸序 列和在Ii mRNA中的核苷酸数目都在表1中列出。
Ii mRNA的制备根据制造的实验报告，包含鼠Ii P31 cDNA 的pBluescript KS质粒被Xho I线性化并用T7-Ribomax大规模 RNA生产系统在体外转录(Promega，Madison，WI)。DNA模 板通过用RQ1核糖核酸酶-游离的脱氧核糖核酸酶处理被去除 (Promega，Madison，WI)并且RNA产物用小牛肠碱性的磷 酸酯酶脱磷酸(Promega，Madison WI)。RNA用T4多核苷酸 激酶以[γ-32P]ATP在5′端标记(Progma，Madison，WI)。所有的 步骤都是根据标准的生物学技术来进行的(Sambrook，J.， E.F.Fritsh，T.Maniatis.1990.《分子克隆》第二版Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
杂交位点的核糖核酸酶H定位将32p-标记的小鼠Ii P31 mRNA(5×105cpm)与2mg酵母菌tRNA混合于1×核糖核酸 酶H缓冲液中，于70℃加热3分钟并在室温下缓慢冷却。加入 反义寡脱氧核糖核酸(0.2-1pmol)并在37℃培养30分钟，然 后加入0.5单位的E.coli核糖核酸酶H(Boehringer Mannheim， Indianapolis，IN)给予10ml的终反应容积。在37℃培养10分钟 后，通过加入8ml电泳负载缓冲液并在90℃加热5分钟后在冰 上冷却，使反应停止.将5ml的制备物在以后暴露于X射线胶片 的6％聚丙烯酰胺胶中并在50瓦下电泳2小时。主要的RNA剪 切产物通过检查放射自显影照片来鉴定，它们的强度在表2中 总结。
实施例2通过电造孔法将寡核苷酸传递到细胞中的适宜条件
在这里是用小鼠的SaI/CIITA细胞来进行上述的研究的，但 也可应用到任何哺乳动物细胞系。
将寡核苷酸传递进入哺乳动物细胞的电造孔法的不同条件 被测试，用以确定产生最大摄取和有着细胞最小损伤的条件。 用电压和电容的各种各样的结合，使SaI/CIITA小鼠肉瘤细胞被 电造孔。荧光素标记的硫代膦酸酯寡核苷酸(序列鉴定号64) 被用于探测核定量寡核苷酸的摄取。对照细胞是在没有荧光素 标记的寡核苷酸存在的情况下被电造孔的。电造孔细胞被培养 一个小时，然后用锥虫蓝染色排除法测量它的存活能力。用荧 光激活细胞分类器(FACS)测量对荧光素标记的寡核苷酸摄取。 荧光激活细胞分类器驱使单个细胞通过激光束，它可激活荧光 素标记的部分。通过光束的每个细胞的荧光强度用光电倍增管 来测量。为了排除死细胞和成群的细胞，从每个细胞向前和两 侧的分散光线同时被测量。在分析之后(例如，对一万个细胞)， 数据用电脑辅助以二维直方图显示出来，其中纵坐标是表示被 检测细胞数目的线性量，横坐标是表示每个细胞荧光量的对数 量。从电造孔法最优测定得出的数据在表3中表示，其中代表 具有荧光强度的所有细胞百分数的正效细胞百分数大于对照细 胞的百分数。最大的寡核苷酸摄取和细胞的存活率出现在用 200V和1200mF结合的情况(见表3A)。用2mM寡核苷酸， 超过90％的细胞在这样的条件下有最大的荧光(见表3B)。
表3用电造孔法摄取寡核苷酸的适宜条件 A 寡核苷酸 伏特 电容(mF) 正效细胞 存活率 - - - 1.0％ 75.9％ + - - 53.8％ 72.1％ - 200 1200 0.0％ 72.3％ + 100 600 60.2％ 72.7％ + 100 1200 75.0％ 70.5％ + 100 1800 76.7％ 70.4％ + 200 600 75.9％ 74.8％ + 200 1200 80.1％ 73.6％ + 200 1800 71.3％ 74.8％ + 300 600 69.1％ 67.9％ + 300 1200 52.0％ 53.9％ + 300 1800 21.2％ 47.8％ B 寡核苷酸 伏特 电容(mF) 正效细胞 存活率 - - - 0.4％ 54.1％ + - - 49.3％ 70.9％ - 400 1200 3.3％ 39.0％ + 200 300 64.5％ 72.6％ + 300 300 76.8％ 62.0％ + 400 300 71.7％ 52.0％ + 500 300 76.0％ 27.0％ + 200 400 84.7％ 59.1％ + 300 400 91.5％ 70.2％ + 400 400 37.9％ 43.3％ + 500 400 83.0％ 28.8％ + 200 1200 90.2％ 81.8％ + 300 1200 89.6％ 53.6％ + 400 1200 84.3％ 31.9％ + 500 1200 88.7％ 18.2％
两个实验如下进行：A)用0.017微摩尔荧光标记的硫代 膦酸酯寡核苷酸序列鉴定号64和2.15微摩尔磷酸二酯寡核苷 酸，以及B)用2微摩尔荧光标记硫代膦酸酯寡核苷酸序列鉴 定号64。 实验
化合物用于此项研究的硫代膦酸酯反义寡核苷酸序列号 64(见表5)是用荧光5′标记。它用整合DNA技术，Inc.合成 和HPLC提纯的(Coralville，IA)。
细胞培养SaI/CIITA小鼠肉瘤细胞系是在Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(IMDM，JRH《生物科学》，Lenexa，KS)中 维持。在37℃和5％ CO2以及湿润的大气条件下，用5％ FCS(FetalClone I，HyClone Laboratories，Logan，UT)、2mM L-谷 氨酰胺、200U/ml青霉素和200mg/ml链霉素补充。
电造孔法细胞被清洗两次，并在无补充的RPMI-1640培 养基中重悬浮。将于包含各种量的5′-荧光标记硫代膦酸酯寡核 苷酸序列鉴定号64的500μl培养基中的2-5×106细胞加入到4 mm-gap小杯中，在冰上培养10分钟并在电细胞操纵器ECM600 系统中进行造孔(BTX Inc.，San Diego，CA)。在电造孔后细胞在 室温中放置10分钟，与等量的有2X补充的IMDM混合，并在分 析前置于37℃，5％CO2中培养一小时。细胞的存活率用锥虫蓝染 色排除法测量。寡核苷酸的摄取用FACS细胞分析法测定，细 胞用0.2M甘氨酸(pH4.4)清洗一次，用Hanks′缓冲盐溶液清 洗两次，用2％甲醛水溶液于冰上放置15分钟固定。细胞的存 活率和显示寡核苷酸摄取的细胞百分率在表3中表示。
实施例3通过硫代膦酸酯反义寡核苷酸对Ii在细胞
中表达的专一性抑制
以上确定的对反义寡核苷酸混合的适宜方法也用于测定Ii 反义寡核苷酸在肿瘤细胞系Ii蛋白表达上的效果。SaI/CIITA鼠 肉瘤细胞系被用于这样的测定。这些细胞可通过包含MHC类型 II转录激活因子CIITA基因的质粒被稳定地转染，并高水平表 达MHC类型II和Ii蛋白。
在例1中测定的牢固地杂交于鼠Ii RNA上的第13序列是 作为硫代反义寡核苷酸被合成的。这些寡核苷酸通过电造孔法 被导入到SaI/CIITA细胞中。培养24小时后，用荧光抗体测定 Ii和MHC类型II蛋白质的水平。如例2所述，结合抗MHC类 型II抗体或抗Ii抗体的存在可用荧光激活细胞分类器(FACS) 定量。Ii蛋白或MHC类型II分子表达的抑制是以与对照Ii负 效细胞和MHC类型II负效细胞(无CIITA转染的SaI肉瘤母 细胞)显示同样的荧光强度并用反义寡核苷酸处理的细胞的百 分率来测量的。这个测量是根据被表明的蛋白质表达完全抑制 的细胞的反射部分来进行细胞计数的，由于Ii蛋白部分抑制的 细胞可能未被计算在内，此测量可能对抑制水平估计不足。
在表4中所表示的测定结果指明，不同的寡核苷酸产生各 种水平的Ii抑制。显示出最大活性的是：与AUG启动子区域互 补的寡核苷酸序列号40(表1)和与Ii RNA上第一个剪接受 体位点互补的寡核苷酸序列号32。具有有意义的寡核苷酸(序 列号46)和无寡核苷酸进行的对照反应不显示抑制。MHC类型 II蛋白质的表达在任何细胞中都是不受影响的，这说明由反义 寡核苷酸产生的抑制是专门针对Ii表达的。
然后另外重叠的寡核苷酸被合成以找到靶向这些区域的活 性最强的序列(表5)。这些寡核苷酸如前一样被测定，也要检 测它们对Ii抑制的活性(表6A)和细胞毒性(表6B)。最有活 性的复合物序列鉴定号54是与AUG启动子互补的，对MHC 类型II表达、细胞的复原和存活力也显示出最小的作用。在第 一个剪接受体区域最好的复合物是序列鉴定号62。在3′非翻译 区域与聚腺苷酸化部位互补的反义寡核苷酸序列鉴定号64也显 示出一些活性。
表4通过硫代膦酸酯反义寡核苷酸对Ii而非I-E表达的抑制 Ii负效细胞 I-E负效细胞 寡核 苷 酸 ％ FOLD ％ FOLD 序列 鉴定 号： 平均 值 标准 差 平 均 值 标 准 差 平均 值 标准 差 平均值 标准差 无 10.8％ 5.3％ 1.0 0.0 2.6％ 1.3％ 1.0 0.0 46 6.2％ 0.1％ 0.7 0.3 2.8％ 0.9％ 1.1 0.2 11 21.3％ 14.7％ 1.9 0.4 2.5％ 1.1％ 1.0 0.0 18 16.6％ 6.3％ 1.6 0.2 2.4％ 1.0％ 0.9 0.1 28 13.0％ 5.8％ 1.2 0.1 2.8％ 1.5％ 1.0 0.1 31 22.1％ 12.2％ 2.0 0.1 2.5％ 0.9％ 1.0 0.1 32 23.5％ 10.5％ 2.2 0.1 2.8％ 1.2％ 1.1 0.1 38 21.1％ 13.6％ 1.9 0.3 2.8％ 0.9％ 1.1 0.2 39 31.0％ 16.9％ 2.8 0.2 2.3％ 0.8％ 0.9 0.1 40 34.4％ 9.1％ 3.4 0.8 2.8％ 0.7％ 1.1 0.3 41 23.8％ 1.2％ 2.5 1.1 2.3％ 0.4％ 0.9 0.3 42 10.7％ 3.8％ 1.0 0.2 2.7％ 1.0％ 1.1 0.1 41 5.3％ 0.4％ 0.5 0.2 2.6％ 0.7％ 1.0 0.2 47 13.7％ 7.6％ 1.3 0.1 2.5％ 0.8％ 1.0 0.2 48 20.8％ 10.6％ 1.9 0.0 3.0％ 0.7％ 1.2 0.3
从两个独立的实验报告得出：Ii和I-E负效细胞百分率的平 均值和标准差(SD)以及与没有反义寡核苷酸存在处理的对照 细胞相比的负效细胞的倍数。
表5用于测定在敏感部位最有活性的复合物的反
义硫代膦酸酯寡核苷酸 序列 鉴定 号 序 列 核苷酸 位置 49 5′GTCGCGTTGGTCATCCAT 18-1 50 5′TCGCGTTGGTCATCCATG 17--1 51 5′CGCGTTGGTCATCCATGG 16--2 39 5′GCGTTGGTCATCCATGGC 15--3 52 5′CGTTGGTCATCCATGGCT 14--4 53 5′GTTGGTCATCCATGGCTC 13--5 40 5′TTGGTCATCCATGGCTCT 12--6 54 5′TGGTCATCCATGGCTCTA 11--7 55 5′GGTCATCCATGGCTCTAG 10--8 41 5′GTCATCCATGGCTCTAGC 9--9 56 5′CACGGCTGCACCTTTCTG 88-71 57 5′CGGCTGCACCTTTCTGGC 86-69 31 5′GCTGCACCTTTCTGGCTC 84-67 58 5′TGCACCTTTCTGGCTCTC 82-65 59 5′CACCTTTCTGGCTCTCTA 80-63 60 5′ACCTTTCTGGCTCTCTAG 79-62 61 5′CTTTCTGGCTCTCTAGGG 77-60 32 5′TTCTGGCTCTCTAGGGCG 75-58 62 5′CTGGCTCTCTAGGGCGGT 73-56 63 5′GGCTCTCTAGGGCGGTTG 72-54 64 5′GACAAGCTTGGCTGAGCA 1276- 1261
表6通过硫代膦酸酯反义寡核苷酸II对Ii而非I-E表达的抑制 A 寡核苷酸 Ii负效细胞 I-E负效细胞 序列鉴 定号 ％ 倍数 ％ 倍数 平均值 标准差 平均值 标准差 平均值 标准差 平均值 标准差 无 1.6％ 0.5％ 1.0 0.0 1.6％ 0.7％ 1.0 0.0 49 10.8％ 0.7％ 7.2 1.8 1.8％ 1.4％ 1.0 0.4 50 8.6％ 4.1％ 5.4 1.0 1.5％ 1.0％ 0.8 0.3 51 6.3％ 1.6％ 4.4 2.4 1.6％ 1.1％ 1.0 0.2 39 12.7％ 5.1％ 8.0 0.8 1.5％ 0.9％ 0.9 0.2 52 15.2％ 9.1％ 9.3 0.3 1.5％ 0.9％ 0.9 0.1 53 15.6％ 4.9％ 10.0 0.1 1.4％ 0.8％ 0.9 0.2 40 15.1％ 5.1％ 9.7 0.3 1.7％ 1.1％ 1.0 0.3 54 19.9％ 5.5％ 12.8 0.3 1.4％ 1.0％ 0.8 0.3 55 13.6％ 2.4％ 8.9 1.2 1.5％ 0.8％ 0.9 0.1 41 9.7％ 3.3％ 6.2 0.2 1.4％ 0.9％ 0.8 0.2 56 6.1％ 3.1％ 3.8 0.8 1.7％ 1.2％ 1.0 0.3 57 8.9％ 5.5％ 5.4 1.9 1.5％ 0.6％ 1.0 0.0 31 7.4％ 4.2％ 4.5 1.3 1.5％ 0.9％ 0.9 0.2 58 8.2％ 4.5％ 5.1 1.3 1.8％ 0.8％ 0.9 0.1 59 7.8％ 4.7％ 4.8 1.5 1.8％ 1.1％ 1.1 0.2 60 8.0％ 3.8％ 5.0 0.9 1.5％ 1.1％ 0.9 0.3 61 5.1％ 1.7％ 3.2 0.1 1.7％ 0.8％ 1.0 0.0 32 9.1％ 5.7％ 5.5 2.0 1.4％ 0.7％ 0.9 0.0 62 14.1％ 8.4％ 8.6 2.8 1.5％ 1.0％ 0.9 0.2 63 6.6％ 4.3％ 4.0 1.6 1.7％ 1.1％ 1.0 0.2 64 7.4％ 1.0％ 4.9 0.9 1.4％ 0.9％ 0.9 0.2 B 寡核苷酸序 列鉴定号 存活率 复原率 平均值 标准差 平均值 标准差 无 75.0％ 7.2％ 100.0％ 0.0％ 49 85.5％ 3.6％ 104.8％ 12.3％ 50 86.3％ 3.3％ 113.4％ 8.3％ 51 83.1％ 8.3％ 95.4％ 48.8％ 39 81.9％ 3.3％ 89.9％ 8.5％ 52 86.6％ 4.3％ 90.3％ 10.0％ 53 85.6％ 1.2％ 119.3％ 5.7％ 40 86.0％ 1.6％ 120.8％ 10.0％ 54 85.0％ 9.1％ 93.4％ 29.7％ 55 86.7％ 0.4％ 89.0％ 1.3％ 41 85.1％ 0.9％ 83.7％ 5.0％ 56 88.1％ 4.8％ 84.4％ 16.9％ 57 83.6％ 4.8％ 94.8％ 25.6％ 31 87.3％ 2.4％ 90.9％ 7.4％ 58 90.5％ 4.5％ 82.3％ 2.4％ 59 86.1％ 4.0％ 74.9％ 1.0％ 60 88.5％ 2.5％ 79.8％ 0.1％ 61 89.8％ 2.6％ 108.5％ 14.3％ 32 87.7％ 0.6％ 77.8％ 26.7％ 62 85.5％ 0.4％ 89.0％ 20.4％ 63 90.5％ 0.2％ 90.1％ 4.8％ 64 86.9％ 0.0％ 95.4％ 28.8％ 实验
化合物通过整合DNA技术，Inc.合成硫代膦酸酯反义寡 核苷酸和HPLC提纯(Coralville，IA)。
电造孔法如例2所述，在200V和1200μF的条件下，与 单个的寡核苷酸一起(50μM)，进行SaI/CIITA细胞的电造孔。 在确定MHC类型II和Ii蛋白的数量之前，细胞培养24小时。
测定结合MHC类型II蛋白质的膜细胞与20μg/ml鼠抗 小鼠I-Ek单克隆抗体MS/114.15.2一起(American Type Culture Collection，Rockville.MD)于冰上培养60分钟，用Hanks′平衡盐 溶液清洗两次，然后在室温下以1∶100的比例用山羊抗鼠IgG(南 方生物技术协会Inc，Birmingham，AL)的异硫氢酸荧光素(FITC 标记的F(ab′)2稀释30分钟。后用溶液冲洗细胞三次，再用2％ 甲醛水溶液于冰上固定15分钟。用荧光激活细胞分类器(FACS) 分析来测定表明存在MHC类型II蛋白质的荧光细胞的百分率。
对细胞内Ii蛋白的测定细胞用2％甲醛水溶液固定，用1M 甘氨酸冲洗一次，用包含20mM HEPES和0.2％皂角苷的Hanks′ 缓冲盐溶液冲洗两次。细胞首先用作为杂交瘤培养上清液的鼠 抗小鼠Ii单克隆抗体In.1(Koch，N.等人，《自然》299：644-645， 1982)沾染，清洗后与用异硫氢酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠 IgG的F(ab′)2一起培养。细胞如上一样再被清洗和固定。用荧 光激活细胞分类器(FACS)测定单个细胞的免疫荧光。
实施例4在抑制Ii蛋白表达上，各种骨架修饰的相关效力
在此项研究中，于例3中测定的最具活性的反义序列序列 鉴定号54被用于比较在Ii蛋白表达的抑制方面各种骨架修饰的 相关效力。预备了同样序列的四种骨架修饰(表7)：(1)硫代膦 酸酯(序列鉴定号54)，(2)于中间的磷酸二酯和在5′和3′端2′ 甲氧基(methyloxyl)修饰的硫代膦酸酯的混合骨架(序列鉴定 号65)，(3)于中间的硫代膦酸酯和在5′和3′端2′甲氧基修饰的硫 代膦酸酯的混合骨架(序列鉴定号66)，和(4)2′甲氧基修饰的 磷酸二酯(序列鉴定号67)。10mM和50mM的每种寡核苷酸 通过电造孔法注入到SaI/CIITA肉瘤细胞中，然后培养24或48 小时。Ii蛋白表达的抑制水平以及作用于MHC类型II蛋白质表 达的寡核苷酸的效能通过荧光激活细胞分类器(FACS)的分析 来定量。如表8所表示的，每个都具有硫代膦酸酯骨架的寡核 苷酸序列鉴定号54和序列鉴定号66引起对Ii蛋白的类似的抑 制而没有影响到MHC类型II的表达。其它两种有磷酸二酯骨 架的寡核苷酸对Ii表达显示出较少的抑制。在具有和不具有寡 核苷酸存在的情况下测试细胞的存活率，其显示出所有的寡核 苷酸都有最小的细胞毒性作用。由于硫代膦酸酯寡核苷酸的合 成消耗较低、高产和快速的更新，此类型骨架的共聚物被应用 于所有的序列实验中。
表7有不同骨架结构的寡核苷酸序列 序列鉴定号 序列和成分 54 5′TsGsGs TsCsAs TsCsCs AsTsGs GsCsTs CsTsA 3′ 所有为硫代膦酸酯。 65 5′TsGsGs TsCA TCC ATG GCsTs CsTsA 3′ || | | | | || 2′ OMe 2′OMe 第一和后4是硫代膦酸酯与2’甲氧基的。中央9 碱基是磷酸二酯。 66 5′TsGsGs TsCsAs TsCsCs AsTsGs GsCsTs CsTsA 3′ | | | | | | | | 2′OMe 2′OMe 所有为硫代膦酸酯。第一和后4是2甲氧基的。 67 5′TGG TCA TCC ATG GCT CTA 3′ ||| ||| ||| ||| ||| ||| 2′OMe2′OMe 2′OMe 2′OMe 所有为磷酸二酯，2为甲氧基的。
表8通过以不同骨架结构的反义寡核苷酸对Ii表达的抑制 寡核苷酸 Ii负效细胞 I-E负效细胞 存活率 序列鉴 定号 CONC 24小时 48小时 24小时 48小时 24小时 48小时 无 8.33％ 25.40％ 4.06％ 6.46％ 64.02％ 45.50％ 54 10mM 20.68％ 63.06％ 4.76％ 5.74％ 66.67％ 38.10％ 50Mm 32.36％ 60.16％ 4.36％ 6.14％ 62.35％ 44.90％ 65 10mM 10.56％ 45.30％ 3.72％ 5.58％ 63.86％ 49.09％ 50mM 18.84％ 46.88％ 3 48％ 6.96％ 62.79％ 48.57％ 66 10mM 20.66％ 62.24％ 4.10％ 6.26％ 72.13％ 44.83％ 50mM 29.78％ 62.82％ 4.30％ 7.46％ 69.12％ 47.73％ 67 10mM 7.84％ 46.90％ 3.90％ 6.18％ 61.90％ 48.57％ 50mM 8.79％ 41.24％ 4.36％ 6.68％ 66.20％ 47.06％ 实验
化合物如表7所列，通过整合DNA技术，Inc.反义寡 核苷酸被合成和被HPLC提纯(Coralville，IA)。电造孔法、细 胞培养和对细胞内Ii和表面I-E表达的荧光激活细胞分类器 (FACS)测定同例3。
实施例5通过逆基因构建物对Ii蛋白表达的抑制
在这些实验中，SaI肉瘤细胞首先被向上调节对MHC类型II 分子表达的CIITA反式作用因子的基因转染[Armstrong，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 94：6886(1997)]，从而产生SaI/CIITA细胞。 几种Ii逆基因构建物是通过将表9所列与Ii mRNA序列相应的 (已表明相应序列的编号)DNA序列插入表达载体而制成的。 逆基因构建物然后转染到SaI/CIITA细胞中。通过在包含培养基 的潮霉素中生长，挑选接受了表达载体的细胞。用单克隆抗体In 1. 使细胞在细胞内被沾染从而表达Ii。然后用荧光激活细胞分类 器(FACS)的分析来定量这些细胞对Ii的表达。
在一些mIi逆基因构建物的转染中，可观察到Ii蛋白表达 的抑制(上至60％的细胞)。于表10中总结的数据表明，由表 中所列序列鉴定号68，序列鉴定号71，序列鉴定号72，序列鉴 定号75，序列鉴定号77，序列鉴定号78和序列鉴定号79的序 列制成的逆基因构建物在被处理细胞的可观的部分明显地抑制Ii 蛋白的表达。
表9逆基因构建物的序列 序列鉴定号68 -26TGTG GGAAAAACTAGAGGCTAGAGCCATGGATGACCAACGCGAC CTCATCT CTAACCATGAACAGTTGCCC ATA CTGGGCAACC GCCCTAGAGAGCCAGAAAG77 序列鉴定号69 32ATACTGGGCAACCGCCCTAGAGAGCCAGAAAGGTGCAGCCGTG GAGCTCTGTA CACCGGTGTCTCTGTCCTGG TGG CTCTGCT CTTGGCTG136 序列鉴定号70 234ACCTGTGAGCCAGA TGCGGATGGCTACTCCCTTGCTGATGCGTCCAATGT CCATG GATAACATG CTCCTTGGGCCTGTGAAGAA CGTTACCAAG TACGGCAACA TGACCCAGGA CCATGTGATG CATATG CTCA368 序列鉴定号71 314AAGAA CGTTACCAAG TACGGCAACATGACCCAGGA CCATGTGATG CATCTG CTCA CGAGGTCTGG ACCCCTGGAGTACCCGCAGC TGAAGGGGAC CTTCCCAGAG AATCTGAAGC ATCTTAAGAACTCCATGGAT GTCGTGAACT458 序列鉴定号72 -92GGGTCCCAGA CACACAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGCAG CAGCAGCAGC AGCGCC TGTG GGAAAAACTA GAGGCTAGAG CCATGGATGA CCAACGCGACCTCATCTCTAACCATGAACAGTTGCCCATACT GGGCAACCGCCC TAGAGAGCCAGAAAG77 序列鉴定号73 -2 CCATGGATGACCAACGCGAC CTCATCTCTA ACCATGAACA GTTGCCC ATA CTGGGCAACC GCCCTAGAGAGCCAGAAAG gtatgtgtgaataccagcagagagcccttacctctgg aggacacagaatgcaggcctggggagggacacagagctctgttg81(内含子1) 序列鉴定号74 78GTGCAGCCGTG GAGCTCTGTA CACCGGTGTC TCTGTCCTGG TGG CTCTGCTCT TGGCTGGGCAGGCCACCACTGCTTACTT CCTGTACCAG CAACAGGGCCGCCTAGAC AAGCTGACCATCACCTCCCAGAACCTGCAACTGGAGAGCCT TCGCATGAAGCTTCCG AAATgcgtgctccacctgtccctcacctcacagacatcatttctccatttagccc ctcccgatctgcct67(内含子2) 序列鉴定号75 -92GGGTCCCAGA CACACAGCAG CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAG CAGCAGCAGCGCC TGTG GGAAAAACTAGAGGCTAGAG CCATGGATGACCAACGC15 序列鉴定号76 last13(内含子1)tccgtcccaacagATACTGGGCAACC GCCCTAGAGAGCCAGAAAGGT GCAG CCGTG GAG CTCTGTA CACCGGTGTCTCTGTCCTGG TGG CTCTGCT CTTGGCTG136 序列鉴定号77 -92GGGTCCCAGA CACACAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGCAG CA GCAGCAGC AGCGCC TGTG GGAAAAACTA GAGGCTAGAG CCATGGATGACCAACG CGACCTCATCTCTAACCATGAACAGTTGCCCATACTGGGCA ACCGCCCTAGAGAGCC AGAAAGGTGCAGCCGTG GAGCTCTGTA97 序列鉴定号78 50AACAGCAGCAGCAGCAGCAGCGCCTGTGGGAAAAACTA GAGGCTAGAGCCATGG ATGACCAACG CGACCTCATCTCTAACCATGAACAGTTTCCCATACTGGGCAA CCGCC CTAGAGAGCCAGAAAGGTGCAGCCGTG GAGCTCTGTA97 序列鉴定号79 26TGTGGGAAAAACTAGAGGCTAGAGCCATGGATGACCAAC G CGACCTCATCTCTA ACCATGAACAGTTGCCCATACTGGGCAACCGCC CTAGAGAGCCAGAAAGGTGCAGC CGTGGAGCTCTGTA97
表10逆基因构建物的活性 序列鉴 定号 RGC构建物 在Ii基因的位置 *Ii抑 制作用 68 pcDNA3.1(+)/mIi(-26，77) 5′UT至第一外显子 (+) 69 pcDNA3.1(+)/mIi(32，136) 第一和第二外显子 (-) 70 pcDNA3.1(+)/mIi(234，368) 第三和第四外显子 (-) 71 pcDNA3.1(+)/mIi(314，458) 第四和第五外显子 (+) 72 pcDNA3.1(+)/mIi(-92，77) 5′UT至第一外显子 (+) 73 pcDNA3.1(+)/mIi(-2，1 in81) 第一外显子和第一内含子 (-) 74 pcDNA3.1(+)/mIi(78，2 in67) 第二外显子和第二内含子 (-) 75 pcDNA3.1(+)/mIi(-92，15) 5′UT和AUG (+) 76 pcDNA3.1(+)/mIi(1 in13，136) 第二内含子至第三外显子 (-) 77 RSV.5/MIi(-92，97) 5′UT至第一外显子 (+) 78 RSV.5/MIi(-50，97) 5′UT至第一外显子 (+) 79 RSV.5/Ii(-26，97) 5′UT至第一外显子 (+)
*在用这些构建物的SaI/CIITA稳定转染的筛选中，Ii抑制 (上至约60％)被观察到(+)。 实验
逆基因构建物的产生各种Ii逆基因构建物是从两个质粒 之一制成的。由pcDNA3.1(+)制成的构建物(Invitrogen，Carlsbad， CA)利用巨细胞病毒启动子启动基因的表达。由RSV.5制成的 构建物则利用劳斯肉瘤病毒启动子[Long等人，《人类免疫学》 31：229-235(1991)]。两种质粒都包含潮霉素抗性基因，用它 挑选被转染的细胞。mIi逆基因片段是通过聚合酶链反应(PCR) 产生的。PCR片段被Nhel和Apal水解，然后在用同样的核酸 内切酶水解的pcDNA3.1(+)内被克隆。mIi逆基因片段的插入通 过Nhel和Apal水解被进一步证实。PCR片段被Sal1和BamH1 水解，然后在用同样的核酸内切酶水解的RSV.5质粒内被克隆。 所有mIi片段都被序列分析进一步证实。
细胞SaI/CIITA细胞(Maryland大学，Baltimore，MD， Ostrand-Rosenberg博士的贡献)被培养于包含5％FCS(FetalClone I，HvCloneLaboratories，Logan，UT)的IMDM(JRH生物科 学，Lenexa，KS)中。
转染依照制造指令，用lipofectin(GIBCO BRL)使mIi 逆基因构建物转染SaI/CIITA细胞。简言之，将10μl lipofectin 和3-5mg质粒DNA与100μl Opt.MEM I(GIBCO BRL)分别轻轻 地混合。反应保持在室温下40分钟。再将两种反应物轻轻地混 合在一起，在室温下保持15分钟。同时，将105 SaI/CIITA细 胞用Opt.MEM I清洗并在800μl Opt.MEM I内重悬浮。脂质体 /DNA反应物缓慢地在SaI/CIITA细胞内沉降，然后将细胞于37 ℃培养12-24小时。用2ml培养基取代转染介质，细胞被培养 24-48小时后，将800单位潮霉素B(ICN《药物学》，Inc.，Costa Mesa，CA)加入到于96-井形平皿内挑选出的被转染细胞中。
荧光激活细胞分类器(FACS)分析潮霉素对抗性细胞在 细胞内被沾染(见例3和例4的详述步骤)用于表达有单克隆 抗体，In.1.的Ii。被沾染细胞用荧光激活细胞分类器分析。
实施例6用Ii蛋白抑制的固定疫苗细胞对抗肿瘤攻击
进行了多项实验开发用Ii蛋白抑制的肿瘤细胞作为肿瘤细 胞疫苗保护宿主免受亲代肿瘤的攻击。在这些实验中，首先用 向上调节MHC类型II分子表达的CIITA反式作用因子基因转染 SaI肉瘤细胞，[Armstrong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6886 (1997)]从而产生SaI/CIITA细胞。被转染的细胞同样表达MHC 类型I和MHC类型II分子。没有转染CIITA基因，SaI细胞只 表达MHC类型I分子。SaI/CIITA细胞与表达MHC类型II分 子一起，也表达显著量的Ii蛋白。因为CIITA反式作用因子也 作用于从Ii蛋白结构基因上游(以及在第一个内含子内)基因 调节单位，所以发生了Ii蛋白与MHC类型II分子的共表达[Zhu 和Jones，《分子和细胞生物学》10：3906(1990)；Moore等人 《免疫学杂志》161：1844(1998)]。
为了抑制Ii蛋白的表达用指向Ii mRNA(序列鉴定号54) 的反义寡核苷酸处理细胞(表达MHC类型I分子、MHC类型 II分子和Ii蛋白)。用上面例3提出的方法来度量在SaI/CIITA 细胞中Ii蛋白抑制的程度和MHC类型II分子缺少抑制的程度。 反义寡核苷酸复合物序列鉴定号54在大约35％的SaI/CIITA细 胞中深深地抑制了Ii蛋白，而对MHC类型II分子表达的水平 没有显著影响。为了防止在被接种宿主体内复制，疫苗细胞用 甲醛固定。
接受了Ii抑制疫苗细胞的小鼠被分成三个亚组，每个亚组 用以每只小鼠2.5×105、7.5×105和20×105个细胞的量的SaI 肿瘤注入小鼠体内进行攻击。没有用抑制Ii的共聚物处理的固 定SaI/CIITA细胞处理过的对照小鼠也用上述浓度的肿瘤细胞攻 击。小鼠6个亚组的每一个亚组肿瘤的发病率在表11中表明。 在第13天，所有的有腹水肿瘤的对照小鼠(C)已有15-2.5ml 的腹水而死亡。在接种CIITA基因转染免疫细胞的小鼠(AS小 鼠)中，在每只2.5×105细胞的亚组和在每只7.5×105细胞的 亚组，都有一只小鼠以1.5-25ml的腹水死亡。在第61天，在 每只20×105细胞的亚组，没有小鼠发生肿瘤。
这些观察表明，带有表达MHC类型II分子但很少或没有表 达Ii蛋白肿瘤细胞的小鼠接种导致了保护性的肿瘤免疫。由于 保护是对抗表达MHC类型I而不表达MHC类型II分子的亲代 细胞，免疫是通过辅助细胞T来调节的，此细胞受MHC类型II 分子限制，对于最后效应物的发生和杀伤T细胞的应答也是需 要的。由于这些疫苗细胞诱导对抗具有MHC类型I正效但MHC 类型II和Ii蛋白负效的亲代SaI细胞，保护是由两种T细胞调 节的。首先，辅助T细胞被由没有免疫调节Ii蛋白的MHC类 型II分子提呈的抗原决定簇刺激。其次，由于辅助T细胞的作 用，受到MHC类型I分子限制的杀伤T细胞被刺激而扩增和具 有活性。
表11在用复合物序列鉴定号54处理或未处理 的固定的SaI/CIITA细胞接种的小鼠中，在用SaI
肿瘤攻击后，肿瘤的发病率 2.5×105 7.5×105 20×105 天数 C AS C AS C AS 9 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 11 2/5 0/5 4/5 0/5 5/5 0/5 13 2/5 0/5 4/5 0/5 5/5 0/5 15 2/5 0/5 4/5 1/5 5/5 0/5 17 2/5 0/5 4/5 1/5 5/5 0/5 19 2/5 1/5 4/5 1/5 5/5 0/5 21 2/5 1/5 4/5 1/5 5/5 0/5 31 2/5 1/5 4/5 1/5 5/5 0/5 41 2/5 1/5 4/5 1/5 5/5 0/5 61 2/5 1/5 4/5 1/5 5/5 0/5
在用序列鉴定号54处理(AS指反义的亚组)或未处理的 (“C”指对照的亚组)CIITA基因转染肿瘤细胞接种的小鼠中， 有等于或大于15ml容积的肿瘤腹水的发病率都有记录。 实验
转染CIITA基因转染SaI细胞是用50μM复合物序列鉴定 号54以2×106/ml个细胞被培养的，并在200V，1200μfd用BTX ECM600电造孔系统被电造孔。然后细胞被培养于有5％牛胎儿 血清的IMDM培养基中，培养20小时，后又对蛋白表达和固定 进行免疫荧光分析。
固定在室温下，于pH7.2的磷酸缓冲盐溶液中，用0.15％ 甲醛固定细胞15分钟并清洗。
接种以每只小鼠2.5×105细胞的量将疫苗细胞注射于15 只小鼠的腹膜内。用没有经过序列鉴定号54的共聚物处理的 SaI/CIITA细胞注射于平行组的15只小鼠体内。
肿瘤攻击在27天后，用经序列号54处理过的SaI/CIITA 细胞接种的三个亚组(每个亚组中有5只小鼠)中的小鼠，以 三种剂量的SaI亲代细胞对其进行攻击：分别为2.5×105、7.5 ×105和20×105个细胞。在平行组，用未经序列鉴定号54处理 的固定的SaI/CIITA细胞接种的三个亚组的小鼠也分别以同样的 三种剂量的SaI亲代细胞对其进行攻击。在前面的实验中，三 种攻击使用的剂量决定了滴定细胞剂量/肿瘤死亡率曲线。 实施例7用Ii蛋白抑制的和被辐射的疫苗细胞对抗肿瘤攻击
此例实验与例6的方略是类似的，但主要有两个要素除外。 首先，是在干扰素γ基因转染之后而不是在CIITA基因转染之 后，MHC类型II分子和Ii蛋白被诱导于SaI细胞。其次，疫 苗细胞的存活率是通过辐射维持，而恶性能力(复制能力)被 破坏。
优选通过干扰素的作用而不是CIITA来诱导MHC类型II 分子有几个实际的科学和经济的理由。例如，干扰素γ的作用 可以诱导另外的与肿瘤相关的抗原决定簇的适当加工和提呈所 需要的功能。除此之外，允许肿瘤细胞在导入宿主后继续生活 (没有复制)一些时间也是考虑了其有利的性质，例如，根据 抗原决定簇的持续暴露、累积抗原剂量、免疫系统多数辅助和 效应细胞相互作用的时期。
在这些实验中，SaI肉瘤是通过带有插入pGKNeo质粒内的 干扰素γ基因的电造孔技术来转染的[Chen和Ananthaswamy， 《免疫学杂志》151：244-255(1993)]。起始选择量是800μg/ml G418，维持量是400μg/ml G418。干扰素γ产生的细胞是通过 有限的稀释液的培养和克隆群体的扩增来选择的，此克隆群体 是通过有用可见免疫荧光法从ATCC杂交瘤T1B120得到的 5/114.15.2单克隆抗体的MHC类型分子表面表达来鉴定的。
制备了两种类型的疫苗保护细胞群：1)用序列鉴定号54 共聚物转染抑制I蛋白表达的细胞，和2)未转染的细胞。与50 μM共聚物序列鉴定号54一起，以2×106/ml个细胞培养CIITA 基因转染SaI细胞，并在200V、1200μfd下，于BTX ECM600 电造孔系统进行电造孔。随后，将细胞培养于有5％牛胎儿血清 的IMDM培养基中24或48小时，以后用对蛋白质表达或疫苗 制备进行免疫荧光分析。接种之前，细胞要在铯辐照器中接受 3500拉德(rads)的辐射。
以每剂2×106个细胞的剂量，将三种类型的受辐射的和经 干扰素γ基因转染的细胞注射于小鼠体内：1)干扰素γ基因转 染细胞(在表12中的“C”)，2)用复合物序列鉴定号54处理 后培养24小时的干扰素γ基因转染细胞，因而致使在约34％的 细胞中Ii蛋白受到抑制，对MHC类型II分子没有作用(在表12 中的“AS-24”)，3)用复合物序列鉴定号54处理后培养48小 时的干扰素γ基因转染细胞，因而致使在约45％的细胞中Ii蛋 白受到抑制，对MHC类型II分子没有作用(在表12中的 “AS-48”)。
在24小时后，使每个接种组小鼠的亚组受到三个水平之一 的SaI肉瘤细胞的攻击：2×106、5×106或12.5×106个细胞(表 12)。在第11天对照亚组的0/4、2/4和4/4发生了2-3ml腹水 并在第13天死亡。对于AS-24和AS-48小鼠在表12中报告的 结果表示了以大于2ml腹水的小鼠死亡的数据。在第31天，存 活的小鼠没有恶性肿瘤的证据。
这些结果表明，通过用“工程”衍生的在其中Ii蛋白受到 抑制而MHC II类型分子得到表达的肿瘤细胞接种，产生了对 MHC类型I正效而对MHC类型II负效的亲代细胞有效的肿瘤 保护性对抗。这也表明，在不存在Ii蛋白情况下由MHC类型II 分子提呈的扩增的全部“辅助”决定簇引起了抗肿瘤应答的增 强。
表1 在用有固定的干扰素γ基因转染的经过或未经
复合物序列鉴定号54处理的SaI细胞接种的小鼠中，
以SaI肿瘤攻击后的肿瘤发病率。 2×106 5×106 12.5×106 天数 C AS-24 AS-48 C AS-24 AS-48 C AS-24 AS-48 9 0/4 0/4 0/5 0/4 0/5 0/5 0/4 0/5 0/5 11 0/4 0/4 0/5 2/4 0/5 0/5 4/4 0/5 0/5 13 0/4 0/4 0/5 2/4 0/5 0/5 4/4 0/5 0/5 15 0/4 0/4 0/5 2/4 0/5 0/5 4/4 0/5 0/5 17 0/4 0/4 0/5 2/4 0/5 0/5 4/4 0/5 0/5 19 0/4 0/4 0/5 3/4 0/5 0/5 4/4 0/5 0/5 21 0/4 1/4 0/5 3/4 3/5 3/5 4/4 1/5 2/5 24 0/4 1/4 0/5 3/4 3/5 4/5 4/4 1/5 2/5 29 0/4 1/4 0/5 3/4 3/5 4/5 4/4 1/5 2/5 31 0/4 1/4 0/5 3/4 3/5 4/5 4/4 1/5 2/5
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