miR-26a在非小细胞肺癌中的应用
阅读：727发布：2020-05-14
专利汇可以提供miR-26a在非小细胞肺癌中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及miR-26a在非小细胞 肺 癌中的应用。miR-26a能够有效地抑制NSCLC细胞的增殖，促进肺癌细胞的凋亡。miRNA靶基因预测 软件 显示，WNK3是miR-26a的潜在靶点，其3′-UTR区域存在2个与miR-26a 种子 序列互补 配对 的结合位点。经检测，miR-26a可在蛋白 水 平抑制靶基因的翻译表达。双 荧光 报告基因系统证实了miR-26a与WNK3的直接靶向关系。深入研究后我们发现，miR-26a通过靶向WNK3蛋白，开启细胞凋亡的Caspase途径，最终发挥诱导细胞凋亡的功能，为精准 治疗 提供了重要的治疗靶标。本发明验证了miR-26a的作用机制，在临床上提供了一种潜在的具有抑癌功能的miRNA分子，为相关药物靶点的研究提供了理论依据,以及提供了一种新颖的精准治疗研究方向、应用指导。，下面是miR-26a在非小细胞肺癌中的应用专利的具体信息内容。
1.一种miR-26a基因制备诱导非小细胞肺癌细胞凋亡药物中的应用。
2.一种miR-26a基因制备调控靶向WNK3下游基因表达药物中的应用。
3.一种miR-26a基因制备抑制非小细胞肺癌增殖药物中的应用。
4.一种miR-26a基因在制备治疗非小细胞肺癌靶标药物中的应用。
5.一种miR-26a基因在制备治疗或预防WNK3基因异常表达的非小细胞肺癌药物中的应用。
6.如权利要求 5 所述的用途，miR-26a基因在制备非小细胞肺癌诊断、预防、治疗以及预后中的组合物或试剂盒中的用途。
7.miR-26a 抑制剂为 miR-26a的反义核酸,在制备非小细胞肺癌靶标药物中的应用。
8.miR-26a 抑制剂在制备治疗或预防WNK3基因异常表达的非小细胞肺癌药物中的应用。
9.如权利要求 9 所述的用途，miR-26a 抑制剂在制备诊断、预防、治疗以及预后中的组合物或试剂盒中的用途。
10.miR-26a基因的下游靶基因WNK3可作为PI3K抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
miR-26a在非小细胞肺癌中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种miR-26a在非小细胞肺癌中的应用。
背景技术
[0002] 肺癌是世界范围内最为常见、死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌可以分为小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小细胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）。在我国，约80%的肺癌被诊断为NSCLC，它主要包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌三大类。大部分肺癌患者在患病早期并无明显症状，从而导致确诊时间较晚，治疗效果较差，疾病预后率较低的特点。纵使治疗方法取得了巨大的发展，NSCLC的五年生存率仍然不高于15%。
[0003] 微小RNA（microRNA, miRNA）是一类能够调节细胞功能的非编码小RNA。miRNA长约20-25个核苷酸（nucleotide, nt），在细胞核中由双链RNA前体（pri-miRNA）经过一系列加工形成成熟的miRNA。miRNA主要与信使RNA（messenger RNA, mRNA）的3′非翻译区（3′-UTR）结合，通过降解mRNA或抑制mRNA翻译来发挥功能。经统计，人体内miRNA的数量占基因总数的1%，但有10-30%的基因转录组受miRNA直接调控，约85%的基因与miRNA有关。
[0004] miRNA在很多生物进程中发挥作用，包括控制发育、胚胎生成、细胞分化增殖及凋亡。研究表明，很多miRNA在不同肿瘤中异常表达，并在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角色。miRNA及其靶基因的功能在肿瘤的发生发展中非常重要，一些miRNA甚至有望成为肿瘤治疗的基因靶点。而miRNA的表达谱可能成为肿瘤诊断、预后、个性化治疗和疾病分类的潜在生物标记。目前肺癌中的miRNA表达一直是研究的热点之一。
[0005] 目前的研究结果显示：miR-26a的细胞功能非常复杂，它在多种疾病细胞中表达异常。例如在多形成性胶质瘤中，miR-26a靶向毛细血管扩张性共济失调症突变基因ATM，提升细胞的辐射敏感性，发挥辐射致敏剂的作用；在胰腺导管癌和前列腺癌中，miR-26a具有抑癌基因的功效；而在卵巢癌细胞中，miR-26a表达水平提升，能够促进肿瘤细胞的增殖和成瘤。
[0006] 本发明通过Solexa测序技术获得了小鼠NSCLC组织和正常组织之间的miRNA差异表达谱，检测了miR-26a在人NSCLC癌旁和肺癌组织中的表达差异，发现miR-26a可作为潜在的诊断标志物，为精准治疗提供了重要的实验依据和应用指导。本实践通过体外功能性实验观察miR-26a对于细胞增殖和凋亡能力的影响，并提出了可能存在的作用机制。
发明内容
[0007] 本发明的目的之一在于提供miR-26a基因在制备抑制非小细胞癌细胞增殖药物中的应用。
[0008] 本发明的目的之二在于提供miR-26a基因在制备加速非小细胞癌细胞凋亡药物中应用。
[0009] 本发明再一涉及miR-26a与WNK3之间的相互作用。在一优选实例中，本发明证明miR-26a可以直接靶向结合WNK3，抑制其翻译成熟。在另一优选实例中，本发明证实miR-26a的抑癌作用的分子机制与WNK3部分相关。miR-26a可通过WNK3发挥其细胞功能。
[0010] 本发明的实施步骤如下所述：第一，本发明根据针对小鼠诱导肺癌模型的测序结果，发现了miR-26a在正常组织与肿瘤模型间的表达差异。为了检测miR-26a的表达量，本实践通过qRT-PCR技术，检测了miR-
26a在人类NSCLC组织中的表达情况，并对常见NSCLC细胞系进行类似操作。
26a在人类NSCLC组织中的表达情况，并对常见NSCLC细胞系进行类似操作。
[0011] 第二，使用miRNA模拟物mimic在NSCLC细胞中高表达miR-26a，使用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术等手段检测miR-26a对于NSCLC细胞生长、增殖和凋亡等生理过程的影响。
[0012] 第三，根据靶基因在线预测软件寻找miR-26a的潜在靶基因，确定研究对象。将含有结合位点的靶基因3′-UTR序列装载至pGL-3荧光报告基因载体，并根据结合位点突变部分碱基，检测miR-26a与靶基因的调控关系。
[0014] 按照上述过程实施，本发明证实，miR-26a在NSCLC组织及细胞系中的表达量均出现降低。功能性细胞实验显示，miR-26a能够降低肺癌细胞存活率、抑制细胞增殖、阻滞细胞周期并促进细胞凋亡，发挥抑癌作用。分子实验显示，WNK3是miR-26a的直接靶标之一，miR-26a通过WNK3发挥促进细胞凋亡的功能。WNK3蛋白则能够抑制Caspase通路的激活与积累，从而发挥抗凋亡的作用。
[0016] 图1 miR-26a在人类NSCLC病例组织及常见NSCLC细胞系中的表达水平差异(A) miR-26a在BEAS-2B、HCC827、A549、H1299、SPCA1、95-D细胞系中的表达量。
[0017] (B) miR-26a在24对肺癌病例组织中的表达水平变化。
[0018] 图2 miR-26a对NSCLC细胞增殖的影响。
[0019] (A) 在H1299细胞中上调miR-26a的表达量后，活细胞增长速度变化。
[0020] (B) 在A549细胞中上调miR-26a的表达量后，活细胞增长速度变化。
[0021] (C) 在H1299和A549细胞中上调miR-26a后，细胞克隆形成染色示意图。
[0022] (D) 在显微镜下观察细胞克隆，计算直径＞1 mm的细胞克隆数量。
[0023] 图3 miR-26a对NSCLC细胞凋亡的影响。
[0024] (A) 在H1299细胞中上调miR-26a的表达量后，细胞凋亡情况变化。
[0025] (B) 在A549细胞中上调miR-26a的表达量后，细胞凋亡情况变化。
[0026] 图4 本发明所使用的pGL3-miReport萤光载体图谱。
[0027] 图5 miR-26a靶向作用于WNK3的3′-UTR。
[0028] (A) miR-26a与WNK3的3′-UTR结合位点及相应突变位点的示意图。
[0029] (B) 在H1299细胞中高表达miR-26a后，WNK3的蛋白表达水平下降。
[0030] (C) 双萤光素酶报告基因系统显示，miR-26a与WNK3的3′-UTR直接结合并发挥作用。
[0031] 图6 miR-26a通过抑制WNK3开启Caspase通路，引发细胞凋亡。
[0032] 通过WesternBlot，分别检测了WNK3、Caspase-8、pro-Caspase-3的蛋白水平变化。
具体实施方式
[0033] 下文内容将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验条件或实验方法，通常按照常规条件——即“分子克隆”（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.）中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件实施。
[0034] 实施例一：确定miR-26a在小鼠诱导NSCLC组织中的表达水平变化本发明所用到的基因突变型小鼠肺癌模型(L822T1、L703T2、L903T1)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。L1805为小鼠正常肺部组织，L703T2为p53-/-/Kras+/+的恶性肿瘤，L903T1为Lkb1-/-/Kras+/+的恶性肿瘤，L822T1为Kras+/+的良性肿瘤。对小鼠的肺组织和诱导癌变的小鼠肺组织分别取样，使用TaKaRa公司提供的Trizol试剂提取组织内总RNA，并使用TaKaRa公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Code No. D350A）进行逆转录，构建上述组织的cDNA文库，以oligo dt为引物进行逆转录，通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需的miRNA cDNA文库。
[0035] 针对小鼠cDNA样品的Solexa测序由华大基因公司完成。通过Solexa测序结果可见：miR-26a在肺癌模型中的表达丰度较正常组织有所降低（见表1）。相比正常小鼠肺部组织，miR-26a在所有肺癌组织中的表达水平皆有所下降。值得注意的是，miR-26a在p53-/-的L703T2样品中的降低最为明显。通过小鼠肿瘤组织测序结果可以推测，miR-26a可能与肺癌的生理进程有关，而且它可能与转录因子p53有所关联。
[0036] 实施例二：研究miR-26a在人类NSCLC细胞和组织中的表达水平变化根据小鼠肿瘤样品的测序结果，可以猜测miR-26a是一个与肺癌相关的细胞因子，为了确定这一结论是否也适用于人类，我们通过qRT-PCR的方法，检测miR-26a在人肺癌细胞系中的表达水平。
[0037] 本发明使用的细胞系包括：HCC827为EGFR+/+非小细胞肺癌细胞系，A549为Kras+/+非小细胞肺癌细胞系，H1299为p53-/-非小细胞肺癌细胞系，SPCA-1为亚洲人非小细胞肺癌细胞系，95-D为人迁移性大细胞肺癌细胞系，BEAS-2B为人肺上皮细胞系。本发明使用的24例NSCLC组织样品及相应的癌旁组织均来自上海市胸科医院。
[0038] 本实例使用Trizol试剂裂解并提取样品中的总RNA，使用TaKaRa公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Code No. D350A）逆转录，获得miRNA cDNA模板。该试剂盒可对样品中的miRNA及其它微小非编码RNA进行Poly(A)加尾反应，同时引入Uni-miR qPCR Primer结合位点，对样品中的任意miRNA和cDNA进行定量PCR反应。本实例所使用的引物包括：根据实验结果可知，以U6的内参，相比肺上皮细胞BEAS-2B，miR-26a在HCC827、A549、H1299和SPCA-1四种非小细胞肺癌细胞系中的相对表达水平都有所降低，而在95-D中，miR-
26a的表达量较上皮细胞有所提升，可以推测，miR-26a的成熟表达存在组织特异性，它在不同基因背景下的细胞系中的表达变化完全不同，见图1A。值得注意的是，H1299与L703T2模型、A549与L822T1模型具有类似的基因背景，这表明细胞系的检测结果与小鼠模型测序结果一致，针对小鼠模型进行的miRNA测序结果具有一定的参考价值，适用于人类细胞体系。
26a的表达量较上皮细胞有所提升，可以推测，miR-26a的成熟表达存在组织特异性，它在不同基因背景下的细胞系中的表达变化完全不同，见图1A。值得注意的是，H1299与L703T2模型、A549与L822T1模型具有类似的基因背景，这表明细胞系的检测结果与小鼠模型测序结果一致，针对小鼠模型进行的miRNA测序结果具有一定的参考价值，适用于人类细胞体系。
[0039] 对于人类NSCLC组织样品的检测结果显示：以癌旁组织为参照标准，NSCLC肿瘤组织中miR-26a的平均表达水平发生显著下降，其中12例样本miR-26a在肿瘤组织中的表达量是癌旁组织的0.5倍以下，仅有5例样品miR-26a在肿瘤组织的表达量较癌旁有所升高，见图1B。
[0040] 实施例三：miR-26a对于NSCLC细胞增殖的影响细胞增殖能力的检测使用了CCK-8分析法及克隆形成分析法完成，具体操作步骤如下：
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是由日本同仁化学研究所（DOJINDO）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒。CCK-8检测的具体操作步骤为：取对数生长期的细胞，以2000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，于37℃，5% CO2条件下培养。在不同时间点（24、48、
72、96 h），在每孔加入5 µl CCK-8溶液，37℃，5% CO2孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光值。为了保证实验可靠性，每组样品同时设置3个副孔。此外，为减缓培养基的蒸发速度，在将侧样品周围的培养孔中加入PBS保持湿度。
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是由日本同仁化学研究所（DOJINDO）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒。CCK-8检测的具体操作步骤为：取对数生长期的细胞，以2000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，于37℃，5% CO2条件下培养。在不同时间点（24、48、
72、96 h），在每孔加入5 µl CCK-8溶液，37℃，5% CO2孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光值。为了保证实验可靠性，每组样品同时设置3个副孔。此外，为减缓培养基的蒸发速度，在将侧样品周围的培养孔中加入PBS保持湿度。
[0041] 细胞克隆形成的具体操作方法为：取各实验组细胞，以400个/孔的密度均匀接种至6孔板，培养10-14天，直至肉眼可见细胞克隆团时终止培养。吸取培养皿中培养基，PBS清洗2次后，在每孔加入1 ml甲醇固定15 min，弃去固定液，以1%结晶紫染液染色15 min，使用无菌水洗净培养皿，晾干，拍照。根据实际情况，对每孔中直径大于1 mm（或含有10个以上细胞）的细胞克隆进行计数，计算克隆形成情况。
[0042] CCK-8分析结果显示：高表达miR-26a能够抑制非小细胞肺癌细胞系的细胞活性。相比参照组，转染miR-26a mimic（100 nM）的H1299和A549细胞的增值能力均有显著下降，在转染后的第三天，H1299实验组的活细胞数量比对照组降低24.79%（图2A），A549实验组的活细胞数量比对照组降低了24.67%，见图2B。
[0043] 克隆形成实验结果显示，在实验涉及的两组细胞H1299和A549中，过表达miR-26a的细胞的克隆数目明显低于对照组，其中H1299细胞的克隆数量较对照组少了49.24%（图2C），A549细胞的克隆数量减少了23.62%（图2D）。
[0044] 本实践结果最终证明：（1）miR-26a能够减弱非小细胞肺癌细胞的生存活性；（2）miR-26a能够抑制非小细胞肺癌的增殖能力。
[0045] 实施例四：miR-26a对于NSCLC细胞凋亡的影响本实例中，细胞凋亡的检测通过流式细胞术进行，其中需要使用细胞染料Annexin V和PI。PI（碘化丙啶）是一种常见的核酸染料，正常情况下，PI无法通过完整的细胞膜，然而对于中晚期凋亡细胞和死细胞而言，PI可以通过细胞膜，与核酸结合。配合使用Annexin V和PI染料，能够区分不同凋亡时期的细胞。
[0046] 本实例具体操作步骤如下：1. 使用胰酶收集待测细胞（1-5×106个），1000-2000 rpm离心5 min，弃去上清，收集细胞沉淀。
[0047] 2. 使用4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次。
[0048] 3.加入300 µl 细胞固定液（BD试剂盒提供），充分悬浮细胞。
[0049] 4.分别加入2.5 µl PI和Annexin V-FITC染色剂，避光室温孵育30 min。
[0050] 5. 使用200目尼龙网滤膜过滤细胞，除去细胞团，防止细胞团堵塞流式细胞仪的上样管道。
[0051] 6. 使用Beckman流式细胞分析仪分析细胞样品。
[0052] 7. 使用Beckman公司提供的Summit 5.2软件分析流式结果。
[0053] 通过实践结果可以观测到：miR-26a对于NSCLC凋亡水平的具有明显作用。在H1299细胞中，NC组的凋亡细胞比例为11.8%，而高表达miR-26a的实验组细胞的凋亡比例达到了24.6%，提高了近13%（图3A）。在A549细胞中，NC组的凋亡细胞比例为5.0%，高表达miR-26a的实验组细胞的凋亡率则高达12.6%，提高了约7.6%（图3B）。综上所述，miR-26a对NSCLC细胞的凋亡过程存在调控作用，它能促进细胞的凋亡进程，作为一个肿瘤抑制因子，发挥抑癌作用。
[0054] 实施例五：miR-26a对于WNK3基因的靶向调控作用本实例通过miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）可以获得miRNA的种子序列，其中miR-26a的成熟序列为：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU。本实例参考了3种常见的miRNA靶基因在线预测工具：
（1）miRanda：http://www.microrna.org/microrna/home.do；
（2）Targetscan：http://www.targetscan.org/；
（3）Starbase：http://starbase.sysu.edu.cn/。
（1）miRanda：http://www.microrna.org/microrna/home.do；
（2）Targetscan：http://www.targetscan.org/；
（3）Starbase：http://starbase.sysu.edu.cn/。
[0055] miRanda网站预测显示：miR-26a共有1100个人源的潜在靶基因；Targetscan显示：miR-26a共有1008个靶基因。两个数据库都出现的靶基因有501个。使用Starbase数据库的miR-function分析，可以发现，miR-26a的靶基因分别参与了内质网蛋白转移、细胞周期、Wnt通路、Akt通路等信号通路或分子进程。根据前期表型实验结果及预测软件数据，本实验发现WNK3是一个miR-26a的潜在靶点，miRanda在线预测软件显示，miR-26a与WNK3之间有两个潜在的结合位点。其中miR-26a的种子序列与WNK3的第一个结合位点有7碱基的完全互补配对，此外miR-26a的3′端非种子序列中也有7个与WNK3互补配对的连续碱基序列；在第二个预测结合位点中，miR-26a的种子序列与WNK3有8碱基的互补配对。
[0056] 为了证明二者是否直接作用，本实例进行荧光素酶（Luciferase）报告基因系统实验。荧光素酶报告基因系统是一种以荧光素为底物，检测萤火虫荧光素酶活性的系统，荧光素酶可以催化荧光素的氧化反应，发出生物荧光，这种生物发光体系可以灵敏地、高效地检测基因的表达。荧光素酶报告基因系统通常用来检测转录因子与目的基因启动子序列的相互作用。本实验所用的Promega报告系统结合了萤火虫和海洋肠腔荧光素酶双荧光系统。pRL载体可以诱导发出海洋腔肠荧光，以此作为内部参照控制实验稳定性。
[0057] 本实验需要检测miRNA与靶基因3′ UTR间的调控关系，其中所使用的质粒经本实验室改造，其图谱如图4所示。
[0058] 本实验把含有两个假定结合位点的WNK3 3′ UTR序列（约1500bp）装载至pGL3-miReport质粒。把pGL3质粒（400 ng）、pRL质粒（20 ng）和miRNA mimic（100 nM）共同转入293T细胞后，观测miRNA与靶基因3′-UTR间是否存在调控关系。为了进一步确认miRNA与靶基因的精确作用位点，本实验根据网址预测结果，在假定结合位点上引入了碱基突变，以确认miRNA与靶基因是否直接作用。实验所涉及的载体构建引物如表3所示。
[0059] 结果显示：miR-26a能够抑制WNK3的转录翻译，双荧光实验中的抑制水平约76.5%。预测软件显示miR-26a与WNK3存在两个潜在的结合位点（图5A），突变结果显示，并非两个位点都是有效的结合位点。当仅突变第一个结合位点时，miR-26a对于荧光载体的抑制效果并未出现回升，而仅突变第二个结合位点后，报告基因的荧光强度恢复（图5C）。对于同时含有两个突变位点的报告载体，miR-26a也对其荧光值没有明显抑制作用。miR-26a可以直接结合WNK3的3′ UTR并对其进行调控，但是这种调控机制是因为miR-26a的种子序列能够结合WNK3 3′ UTR上1204位上的序列，有且仅有这一位点能与miR-26a结合并影响WNK3 mRNA的转录后调控和翻译。
[0060] 实施例六：miR-26a对于WNK3及其下游蛋白的调控作用WNK3被证实是一种可以调控Caspase途径的蛋白激酶，WNK3形成的蛋白复合物能够控制细胞中Caspase-3前体的激活，而且WNK3的表达水平决定了细胞对于凋亡刺激因子的耐受能力。
[0061] 为了检测WNK3在miR-26a调控功能中发挥的作用，本实例检测miR-26a对于Caspase蛋白的影响效果。因为Caspase-8是Caspase-3的上游启动因子，所以本实例使用Western Blot法检测了NSCLC细胞中Caspase-8和pro-Caspase-3的蛋白水平。具体操作如下：在转染48h后，取4℃预冷的PBS洗涤细胞，在6孔板中每孔加入100μl RIPA裂解液，冰上裂解30min。12000g，4℃离心20min，收集上清液，储存于-80℃。在蛋白液中加入1/4体积的蛋白loading buffer，沸水煮5min，使蛋白变性。取30mg蛋白上样至8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，120V电泳2h，取出凝胶，130V/100min转印至PVDF膜，转印后的PVDF膜移入5%脱脂奶粉溶液中，摇床上封闭1h。一抗为Wnk3多克隆兔抗和GAPDH兔抗，1：1000稀释后4℃孵育过夜。二抗为羊抗兔IgG，1:10000稀释后室温孵育1h。洗膜后加入ECL发光试剂，置于Western凝胶成像系统（伯乐）曝光成像。
[0062] 结果显示：在H1299细胞中，高表达miR-26a以后，细胞中WNK3的表达水平发生明显下降，而同时，成熟Caspase-8的表达量则相应增加，另外，pro-Caspase-3的蛋白含量升高。另外在H1299细胞中转入WNK3表达载体后，则可以发现，Caspase-8的表达量相应减少，而被募集的pro-Caspase-3的含量也出现逆转。如图6，这意味着WNK3主要通过影响Caspase-8来开启细胞凋亡通路并诱导细胞凋亡。
[0063] 综上所述，本发明涉及一种具有抑癌功能的miRNA—miR-26a，它在NSCLC细胞中表达下调，提升它的表达水平能够显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能通过抑制其靶基因WNK3的转录翻译进行。因此，miR-26a可以作为NSCLC分子诊断的潜在标记，也能为NSCLC的诊断和治疗提供依据，为精准治疗提供新的研究方向。
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