一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠及其制备与应用
阅读：212发布：2023-01-04
专利汇可以提供一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫 磁珠 ，免疫磁珠包括羧基化四 氧 化三 铁 磁性 纳米粒子 和特异性 抗体 ，羧基化四氧化三 铁磁性 纳米粒子和特异性抗体的 质量 比为(2～5)：(0.1～0.5)，特异性抗体选自CD8、CD3E、IL2RA或CD4中的一种或多种；本免疫磁珠通过 水 热法制备粒径分布均匀、 水溶性 好、磁性能优异的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子，再偶联特异性抗体得到。与 现有技术 相比，本发明具有制备工艺简单、 稳定性 好；配套分选柱上样量大、阳选率高、成本低等优点，可获得足量高活性淋巴细胞，通过预存淋巴细胞，可择机复苏、培养、回输淋巴细胞。，下面是一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠及其制备与应用专利的具体信息内容。
1.一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠包括羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子和特异性抗体，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子和特异性抗体的质量比为(2～5)：(0.1～0.5)，所述特异性抗体选自CD8、CD3E、IL2RA或CD4中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠，其特征在于，所述的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子的粒径为7～10nm。
3.根据权利要求1所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠，其特征在于，所述的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法如下：
将有机铁盐、无机铁盐和添加剂以(0.5～2)：(0.5～5)：(0.01～0.03)的摩尔比混合，混合后的溶液中Fe2+和Fe3+的摩尔比1:(0.5～3)，在180～210℃温度下进行水热反应，反应时间为8～12h，干燥即得羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子。
4.根据权利要求3所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠，其特征在于，所述的有机铁盐选自柠檬酸铁、右旋糖酐铁或葡萄糖酸亚铁中的一种或两种；
无机铁盐选自硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸铁或氯化铁中的一种或两种；
添加剂选自聚丙烯酸、羧甲基纤维素、末端是羧基的聚乙二醇、海藻酸、聚甲基丙烯酸、柠檬酸、谷胱甘肽中的一种或几种。
5.一种如权利要求1～4任一所述用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备，其特征在于，该制备包括以下几个步骤：
(1)将羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子溶于水中，滴加氢氧化钠溶液至pH为8～12，然后用截留分子量为12K～14K的透析袋透析1～3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
(2)将步骤(1)所得MNPs-COOH分散纯化液置于截留分子量为10K超滤管中进行离心，加入SBB9定容至原体积，活化MNPs-COOH中的羧基，然后加入特异性抗体，混合反应后进行封闭，得到免疫磁珠分散液。
6.根据权利要求5所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备，其特征在于，步骤(2)所述离心的条件如下：离心温度为2～5℃，离心转速为10000～13000rpm，离心时间为3～10min。
7.根据权利要求5所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备，其特征在于，步骤(2)所述活化的工艺为：在MNPs-COOH分散液中加入EDC/NHS，使EDC/NHS与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)，在旋转振荡器上旋转30～60min。
8.根据权利要求5所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备，其特征在于，步骤(2)所述特异性抗体的加入量与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)；
所述反应的条件为在30～40℃下振荡3～5h或20～30℃下在旋转器上旋转12～24h。
9.一种如权利要求1～4任一所述用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：将血液稀释液与免疫磁珠以(1～10)：(0.5～1)的体积比混合，孵育15～30min后，置于分选柱中，以0.1～100mL/min的流速进行细胞分选，得到淋巴细胞。
10.根据权利要求9所述的一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的应用，其特征在于，所述血液稀释液中的细胞浓度为(4～100)×109个/mL；
所述分选的流速为0.7～80mL/min。
一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠及其制备与应用
技术领域
背景技术
[0002] 免疫微纳球技术是以免疫学为基础利用共价偶联连结有免疫活性物质的各种微纳球进行免疫学或其他生物学分析分离等方面应用的一项技术。自1956年起，因该技术具有简便、高效、实用的特点，在免疫学、微生物学、生物化学、分子遗传学及分子生物学等各个领域崭露头角。
[0003] 免疫磁性微纳球或叫做免疫磁性微纳珠简称免疫磁珠，作为新型的功能材料近年来已被广泛研究，其在生物医学及临床诊断等领域的应用引起了各国研究者的高度重视。免疫磁性微纳球是免疫微纳球的一种，是指连有抗体或抗原的磁性微纳球，它通过表面的抗体或抗原特异地与靶物质结合，从而赋予其磁响应性，在特定磁场的作用下，通过免疫磁性微纳球可以发生定向移动，从而实现其免疫学检测，分离纯化，药物传送等方面的目的。
[0004] 免疫磁性微纳球是磁性微纳球与抗体或抗原结合的产物。磁性微纳球通过适当的方法使其表面赋予多种反应性功能基团，如-OH，-COOH和-NH2等，使其具有良好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等，然后可在外加磁场中进行分离富集。
[0005] 但是，目前的免疫磁性纳米粒子用于目标细胞分选还存在许多问题。首先，免疫磁性纳米粒子普遍稳定性不足，容易发生团聚，样品存放半年后，均容易发生结块；其次，配套使用的分选柱一次性上样量少，吸附量低，从而使得分选成本大幅度增加。因此一种分离人外周血淋巴细胞的免疫磁珠及配套分选柱的开发在生物医学领域有着很大的市场需求和广泛的应用前景。
发明内容
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠，所述免疫磁珠包括羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子和特异性抗体，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子和特异性抗体的质量比为(2～5)：(0.1～0.5)，所述特异性抗体选自CD8、CD3E、IL2RA或CD4中的一种或多种。
[0008] 其中，带特异性抗体的四氧化三铁纳米粒子与外周血孵育后，特异性抗体与目标细胞(即：淋巴细胞)结合。当含有纳米粒子的外周血孵育液流经外磁场作用的分选柱时，偶联在免疫磁珠抗体上的目标细胞被吸附在分选柱中，外磁场去除后，外力助推下，将吸附在分选柱中的目标细胞推出，进行后续无菌培养。那么四氧化三铁纳米粒子的作用是：外磁场作用下，使得目标细胞被吸附在分选柱中；特异性抗体的作用是：特异性高效地靶向目标细胞，并与目标细胞共价偶联，从而达到目标细胞被高效分离的目的。
[0009] 所述的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子的粒径为7～10nm。
[0010] 所述的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法如下：
[0011] 将有机铁盐、无机铁盐和添加剂以(0.5～2)：(0.5～5)：(0.01～0.03)的摩尔比混合，混合后的溶液中Fe2+和Fe3+的摩尔比1:(0.5～3)，在180～210℃温度下进行水热反应，反应时间为8～12h，干燥即得羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子。无机盐和有机盐为反应体系提供亚铁离子和铁粒子，其中，有机盐还作为配体，控制水相合成磁性纳米粒子的粒径。添加剂可以使磁性纳米粒子羧基化，便于后期偶联靶分子等生物医学方面的应用。
[0013] 无机铁盐选自硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸铁或氯化铁中的一种或两种；
[0015] 使用有机无机铁盐作为前驱体，不仅可以得到水相中粒径分布均匀的磁性纳米粒子，而且在晶体生长的过程中，添加剂可赋予纳米粒子丰富的羧基，从而提高磁性粒子的水溶性和功能性。
[0016] 通过共价偶联，将特异性抗体与一步法羧基化的四氧化三铁磁性纳米粒子连结，得到特异性免疫磁珠。其中，添加剂外壳不仅使得水相中磁性粒子羧基化、减少粒子的团聚，而且增加了磁性粒子与外周血的相容性，从而大大提高了免疫磁珠的阳选率。
[0017] 一种如上所述用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备，包括以下几个步骤：
[0018] (1)将羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子溶于水中，滴加氢氧化钠溶液至pH为8～12，然后用截留分子量为12K～14K的透析袋透析1～3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0019] (2)将步骤(1)所得MNPs-COOH分散纯化液置于截留分子量为10K超滤管中进行离心，加入SBB9(用NaOH滴定pH为9的硼酸溶液)定容至原体积，活化MNPs-COOH中的羧基，然后加入特异性抗体，混合反应后进行封闭，得到免疫磁珠分散液。
[0020] 步骤(2)所述离心的条件如下：离心温度为2～5℃，离心转速为10000～13000rpm，离心时间为3～10min。
[0021] 步骤(2)所述活化的工艺为：在MNPs-COOH分散液中加入EDC/NHS，使EDC/NHS与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)，在旋转振荡器上旋转30～60min。
[0022] 步骤(2)所述特异性抗体的加入量与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)；
[0023] 所述反应的条件为在30～40℃下振荡3～5h或20～30℃下在旋转器上旋转12～24h。
[0024] 步骤(2)中封闭的工艺步骤为：用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000-13000rpm，3-10min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应30～60min或4℃冰箱中反应12～24h，重复洗涤2～4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存。
[0025] 得到的免疫磁珠分散液通过离心即可得到免疫磁珠，离心通常在冷冻离心机上进行，其工艺条件优选为：在4℃下，以10000～13000rpm的转速离心3～10min。
[0026] 一种如上所述用于外周血中淋巴细胞分离的免疫磁珠的应用，包括以下步骤：将血液稀释液与免疫磁珠以(1～10)：(0.5～1)的体积比混合，孵育15～30min后，置于分选柱中，以0.1～100mL/min的流速进行细胞分选，得到淋巴细胞。
[0027] 所述血液稀释液中细胞浓度为为(4-100)×109个/mL；
[0028] 所述分选的流速优选为0.7～80mL/min。
[0029] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞。
[0030] 可控化免疫磁珠用于分离人外周血淋巴细胞，可获得足量高活性淋巴细胞，通过预存淋巴细胞，可择机复苏、培养、回输淋巴细胞。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
[0032] (1)制备简单、快捷、合成工艺可控，只需使用少量几种试剂即可制得；
[0033] (2)通过一步法羧基化磁性纳米粒子与至少一种特异性抗体共价偶联可以直接得到分散性好、生物相容性优良的免疫磁性纳米粒子；
[0034] (3)制得的特异性免疫磁珠平均尺寸为7-10nm，且粒径分布均匀；
[0035] (4)制得的特异性免疫磁珠与配套的分选柱结合使用，阳选率可高达90％以上；
[0037] 图1为本发明制得的一步法羧基化磁性纳米粒子的XRD图；
[0038] 图2为本发明制得的免疫磁性纳米粒子的透射电镜图片；
[0039] 图3为本发明制得的免疫磁性纳米粒子的UV-Vis光谱图；
具体实施方式
[0040] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0041] 实施例1
[0042] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0043] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0044] 将柠檬酸铁、硫酸亚铁溶液及聚丙烯酸添加剂按摩尔比为：0.5:0.5:0.01混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至8，水热反应8h，温度为180℃，反应完成后用截留分子量为12K的透析袋透析1天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0045] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0046] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0047] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：2℃，10000rpm，3min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转30min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0048] ②特异性抗体偶联：
[0049] 在步骤①中加入特异性抗体CD8，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1，在30℃摇床中振荡3h或20℃下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转12h，转速为2转/分。
[0050] ③封闭及保存：
[0051] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，3min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应30min或4℃冰箱中反应12h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0052] (3)淋巴细胞分选：
[0053] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为1mL：1mL混合，室温孵育15min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.3mm)，以0.1rpm的流速进行目标细胞分选；
[0054] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率为90％。
[0055] 实施例2
[0056] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0057] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0058] 将柠檬酸铁、氯化亚铁溶液及羧甲基纤维素添加剂按摩尔比为：0.8:1:0.01混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至9，水热反应10h，温度为200℃，反应完成后用截留分子量为12K的透析袋透析1天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0059] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0060] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0061] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：5℃，11000rpm，5min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转45min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0062] ②特异性抗体偶联：
[0063] 在步骤①中加入特异性抗体CD3E，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在37℃摇床中振荡5h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转20h，转速为20转/分。
[0064] ③封闭及保存：
[0065] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，11000rpm，4min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应40min或4℃冰箱中反应12h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0066] (3)淋巴细胞分选：
[0067] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为2mL：0.5mL混合，室温孵育20min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.35mm)，以70rpm的流速进行目标细胞分选；
[0068] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率92％。
[0069] 实施例3
[0070] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0071] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0072] 将右旋糖酐铁、硫酸亚铁溶液及海藻酸添加剂按摩尔比为：1.5:0.5:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至12，水热反应12h，温度为210℃，反应完成后用截留分子量为14K的透析袋透析3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0073] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0074] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0075] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：5℃，13000rpm，10min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：3，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转60min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0076] ②特异性抗体偶联：
[0077] 在步骤①中加入特异性抗体IL2RA，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：3，在40℃摇床中振荡5h或30℃下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转24h，转速为50转/分。
[0078] ③封闭及保存：
[0079] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，13000rpm，10min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应60min或4℃冰箱中反应24h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0080] (3)淋巴细胞分选：
[0081] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为10mL：0.5mL混合，室温孵育30min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.5mm)，以100rpm的流速进行目标细胞分选；
[0082] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率90.5％。
[0083] 实施例4
[0084] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0085] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0086] 将柠檬酸铁、氯化亚铁溶液及聚甲基丙烯酸添加剂按摩尔比为：2:4：0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至10，水热反应10h，温度为200℃，反应完成后用截留分子量为14K的透析袋透析1天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0087] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0088] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0089] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，10000rpm，5min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转30min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0090] ②特异性抗体偶联：
[0091] 在步骤①中加入特异性抗体CD8，CD3E，IL2RA及CD4，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在37℃摇床中振荡3h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转24h，转速为30转/分。
[0092] ③封闭及保存：
[0093] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，3min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应50min或4℃冰箱中反应20h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0094] (3)淋巴细胞分选：
[0095] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为2mL：1mL混合，室温孵育30min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.5mm)，以80rpm的流速进行目标细胞分选；
[0096] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率98％。
[0097] 实施例5
[0098] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0099] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0100] 将柠檬酸铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁溶液及添加剂按摩尔比为：1.5:0.5:0.02混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至12，水热反应12h，温度为200℃，反应完成后用截留分子量为12K的透析袋透析3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0101] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0102] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0103] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，12000rpm，6min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转50min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0104] ②特异性抗体偶联：
[0105] 在步骤①中加入特异性抗体CD8和CD3E，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2，在37℃摇床中振荡5h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转20h，转速为25转/分。
[0106] ③封闭及保存：
[0107] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，4min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应60min或4℃冰箱中反应12-24h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0108] (3)淋巴细胞分选：
[0109] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为5mL：1mL混合，室温孵育30min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.5mm)，以50rpm的流速进行目标细胞分选；
[0110] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率91％。
[0111] 实施例6
[0112] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0113] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0114] 将右旋糖酐铁、氯化亚铁溶液及柠檬酸添加剂按摩尔比为：1.5:3:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至8～12，水热反应11h，温度为180-210℃，反应完成后用截留分子量为14K的透析袋透析3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0115] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0116] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0117] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，13000rpm，3min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转60min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0118] ②特异性抗体偶联：
[0119] 在步骤①中加入特异性抗体CD3E和IL2RA，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2，在37℃摇床中振荡3h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转12h，转速为25转/分。
[0120] ③封闭及保存：
[0121] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，8min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应60min或4℃冰箱中反应15h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0122] (3)淋巴细胞分选：
[0123] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为1mL：0.5mL混合，室温孵育15min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.3mm)，以100rpm的流速进行目标细胞分选；
[0124] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率93％。
[0125] 实施例7
[0126] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0127] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0128] 将葡萄糖酸亚铁、氯化铁溶液及添加剂按摩尔比为：1.5:4:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至10，水热反应10h，温度为210℃，反应完成后用截留分子量为14K的透析袋透析1天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0129] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0130] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0131] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，13000rpm，10min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：3，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转60min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0132] ②特异性抗体偶联：
[0133] 在步骤①中加入特异性抗体CD8和CD4，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)，在37℃摇床中振荡4h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转22h，转速为30转/分。
[0134] ③封闭及保存：
[0135] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，11000rpm，5min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应60min或4℃冰箱中反应24h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0136] (3)淋巴细胞分选：
[0137] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为5mL：0.8mL混合，室温孵育25min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.4mm)，以0.1-100rpm的流速进行目标细胞分选；
[0138] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率93％。
[0139] 实施例8
[0140] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0141] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0142] 将葡萄糖酸亚铁、硫酸铁溶液及谷胱甘肽添加剂按摩尔比为：2:3.5:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至11，水热反应9h，温度为210℃，反应完成后用截留分子量为12K的透析袋透析2天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0143] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0144] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0145] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，13000rpm，5min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2.5，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转50min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0146] ②特异性抗体偶联：
[0147] 在步骤①中加入特异性抗体CD8，CD3E和IL2RA，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)，在37℃摇床中振荡4h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转18h，转速为15转/分。
[0148] ③封闭及保存：
[0149] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，8min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应60min或4℃冰箱中反应20h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0150] (3)淋巴细胞分选：
[0151] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为8mL：1mL混合，室温孵育30min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.5mm)，以0.8rpm的流速进行目标细胞分选；
[0152] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率95％。
[0153] 实施例9
[0154] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0155] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0156] 将右旋糖酐铁、硫酸亚铁溶液及末端是羧基的聚乙二醇添加剂按摩尔比为：2:3:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至11，水热反应9h，温度为210℃，反应完成后用截留分子量为14K的透析袋透析3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0157] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0158] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0159] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，10000rpm，8min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：2.5，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转40min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0160] ②特异性抗体偶联：
[0161] 在步骤①中加入特异性抗体CD3E，IL2RA和CD4，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：(1～3)，在37℃摇床中振荡4h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转20h，转速为40转/分。
[0162] ③封闭及保存：
[0163] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，10000rpm，5min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应30min或4℃冰箱中反应12h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0164] (3)淋巴细胞分选：
[0165] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为5mL：0.6mL混合，室温孵育25min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.4mm)，以50rpm的流速进行目标细胞分选；
[0166] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率91％。
[0167] 实施例10
[0168] 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0169] (1)一步法羧基化磁性纳米粒子的制备：
[0170] 将柠檬酸铁、硫酸亚铁溶液及聚丙烯酸添加剂按摩尔比为：2:4:0.03混合，室温下磁力搅拌均匀，再缓慢滴加氢氧化钠溶液调pH值至10，水热反应10h，温度为180-210℃，反应完成后用截留分子量为12K-14K的透析袋透析3天，得到MNPs-COOH分散纯化液；
[0171] (2)特异性免疫磁珠的制备：
[0172] ①磁性纳米粒子活化羧基：
[0173] 取500微升MNPs-COOH纯化液，用500微升截留分子量为10K的超滤管离心，去除上清液，条件设为：4℃，13000rpm，5min；加SBB9定容至原体积，加入EDC/NHS，使其满足与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转60min，活化MNPs-COOH分散液中的羧基。
[0174] ②特异性抗体偶联：
[0175] 在步骤①中加入特异性抗体CD8，CD3E，IL2RA及CD4，其与MNPs-COOH上的羧基的摩尔比为1：1.5，在37℃摇床中振荡3h或室温下在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转12h，转速为15转/分。
[0176] ③封闭及保存：
[0177] 用500微升截留分子量为10K的超滤管纯化偶联液，去除上清液，条件为：4℃，11000rpm，3min；滤饼复溶于等体积的PBST(pH＝7.4，含1％BSA)，重悬后置于37℃的摇床，反应30min或4℃冰箱中反应20h，重复洗涤2-4次后，复溶于等体积的PBST溶液，得到至少一种免疫磁珠分散液，4℃冰箱中保存，备用。
[0178] (3)淋巴细胞分选：
[0179] 血液稀释液与免疫磁珠按体积比为1mL：1mL混合，室温孵育30min后，泵入分选柱(规格为体积2.5mL，内径10mm，填充铁球的直径0.5mm)，以80rpm的流速进行目标细胞分选；
[0180] 细胞分选时，分选柱上样量>1×109个细胞，最大吸附量>1×107个磁性标记细胞，阳选率98％。
[0181] 对上述制得的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子及免疫磁性纳米粒子进行检测，图1为本发明制得的羧基化四氧化三铁磁性纳米粒子的XRD谱图，可知，经简便的一步法可制得超顺磁性磁性纳米粒子，具有尖晶型结构；图2为本发明制得的免疫磁性纳米粒子的投射电镜图，可知，免疫磁珠具有良好的分散性，经过共价偶联后，没出现团聚现象；图3为本发明制得的免疫磁性纳米粒子的UV-Vis光谱，可知，羧基化磁性纳米粒子经羧基活化，共价偶联后，至少一种特异性抗体连结在磁性纳米粒子的表面，成功地合成了免疫磁性纳米粒子。
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