一氧化氮(NO)是一种重要的信号分子，且已开发了许多NO合成抑制 剂和清除剂以允许NO功能的研究，并降低疾病状态中过量的NO水平。
败血症性休克具有顽固性低血压的特征，且具有极高的死亡率。许多 细胞因子和信号分子促成此败血症性状态，在该低血压的发展中，一氧化 氮(NO)起了主要作用。NO由三种不同的NO合酶产生：神经元型 NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)。iNOS显著的诱导 是败血症中形成增加的NO水平的主要原因。非选择性的NOS抑制剂在 败血症的动物模型中显示了一些成功，但在大量III期试验中，这些药剂 中的一种导致副作用和死亡率增加。选择性的iNOS抑制剂已在动物模型 中显示更有希望，但还未在人类中试验。降低败血症中的NO水平的另一 途径是使用NO清除剂，且一些NO清除剂包括血红蛋白、二硫代氨基甲 酸盐衍生物，及维生素B12(钴胺素)已在败血症的动物模型中显示有益。 先前已证明钴胺素结合NO，并因此抑制维生素B12依赖的酶-甲硫氨酸 合成酶(Danishpajooh，J.Biol.Chem.276：27296-27303，2001)。
氰化物是一种高毒剂，其抑制线粒体的细胞色素C氧化酶，从而消耗 细胞的ATP。其促成火灾中的烟吸入死亡，并可用作一种大规模毁灭性武 器。由于目前常见的大量塑料材料，因此氰化物在家庭火灾中被产生。在 欧洲，钴胺素已用于治疗氰化物中毒，而尽管已显示出高度有效，它还未 被用于本国(美国)。类似地，一氧化碳(CO)在火灾中产生，且在火灾中最 常见的死亡原因是烟吸入，且特别是氰化物和CO的吸入。
因此，期望提供预防和治疗受治疗者的过量一氧化氮或过量氰化物， 且无不利的副作用的新方法及组合物。本发明的方法和药物组合物涉及这 些，以及其他重要的目标。
发明概述
本发明提供预防和治疗患者的过量一氧化氮或过量氰化物的方法。更 明确地，本发明涉及预防和治疗患者一种疾病状态或缓解患者一种疾病状 态的多种症状的方法，所述的患者疾病状态或患者疾病状态的多种症状是 在患者中由在该患者中的过量一氧化氮或过量氰化物的存在而引起或加 重。
在一方面，提供了一种用于治疗受治疗者由过量一氧化氮(NO)的存在 而引起或加重的疾病状态的方法，其包括：对受治疗者施用药学有效量的 钴啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或类似物。在一些方法中，该疾病状态 为败血症、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、 肝硬化性心肌病、血液透析相关的低血压、心源性休克、缺血-再灌注损 伤、缺氧，及创伤。在一些方法中，钴啉醇酰胺按1至500mg的剂量进 行给药。在一些这样的方面，此方法还包括进行药学有效量的钴胺素或其 生物活性衍生物或类似物的给药。
在一方面，本发明提供了一种用于缓解受治疗者由过量一氧化氮(NO) 的存在而引起或加重的疾病状态的症状的方法，其包括：进行药学有效量 的钴啉醇酰胺的给药，其中所述受治疗者被诊断为遭受由过量NO的存在 而引起或加重的疾病状态发展的痛苦或处于由过量NO的存在而引起或 加重的疾病状态疾病状态发展的危险。在一些方法中，所述疾病状态为败 血症、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、肝硬 化性心肌病、血液透析相关的低血压、心源性休克、缺血-再灌注损伤、 缺氧，及创伤。在一些这样的方法中，钴啉醇酰胺按1至500mg的剂量 进行给药。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受治疗者败血症的方法，其包括： 对所述受治疗者进行药学有效量的钴啉醇酰胺的给药。在一些方法中，所 述钴啉醇酰胺以1至500mg的剂量进行给药。在一些这样的方面，此方 法还包括进行药学有效量的钴胺素或其生物活性衍生物或类似物的给药。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗受治疗者由过量氰化物的存 在而引起或加重的疾病状态的方法，其包括：对受治疗者进行药学有效量 的钴啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或类似物的给药。在一些方法中，所 述受治疗者为吸烟者或血液透析患者。在其他方面，所述疾病状态为囊性 纤维病。在一些方法中，所述过量的氰化物由大规模毁灭性武器致使。在 其他方面，所述钴啉醇酰胺以1至500mg的剂量进行给药。在一些这样 的方法中，所述方法还包括进行药学有效量的钴胺素或其生物活性衍生物 或类似物的给药。
在另一方面，本发明提供了一种用于缓解受治疗者因过量氰化物的存 在而引起或加重的疾病状态的症状的方法，其包括：进行药学有效量的钴 啉醇酰胺的给药，其中所述受试者被诊断为遭受发展病状态的痛苦或处于 发展疾病状态的危险，所述疾病状态是由过量氰化物的存在而引起或加重 的。在一些方法中，所述受治疗者为吸烟者或血液透析患者。在其他方法 中，所述疾病状态为囊性纤维病。在一些方法中，所述过量的氰化物由大 规模毁灭性武器产生。在其他方法中，所述钴啉醇酰胺以100mg至1g的 剂量进行给药。在一些方面，所述方法还包括进行药学有效量的钴胺素或 其生物活性衍生物或类似物的给药。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受治疗者氰化物中毒的方法，其 包括：对所述受治疗者进行药学有效量的钴啉醇酰胺的给药。在一些方法 中，所述钴啉醇酰胺以100mg至1g的剂量进行给药。在一些方面，此 方法还包括进行药学有效量的钴胺素或其生物活性衍生物或类似物的给 药。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗受治疗者烟吸入的方法，其 包括：对所述受治疗者进行药学有效量的钴啉醇酰胺的给药。在一些方法 中，所述钴啉醇酰胺以500mg至5g的剂量进行给药。在一些方面，此 方法还包括进行药学有效量的钴胺素或其生物活性衍生物或类似物的给 药。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗对哺乳动物受治疗者施用硝 普盐有关的副作用的方法，其包括：对所述受治疗者进行药学有效量的钴 啉醇酰胺的给药。在一些方法中，所述钴啉醇酰胺以100mg至1g的剂 量进行给药。在一些方面，此方法还包括进行药学有效量的钴胺素或其生 物活性衍生物或类似物的给药。
在另一方面，本发明提供包括钴啉醇酰胺和药学上可接受的载体的药 物组合物。在一些方面，所述药物组合物还包括钴胺素与药学上可接受的 载体。在其他方面，所述药物组合物还包括钴胺素或其生物活性衍生物或 类似物，及药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括被配制成向受治疗 者递送的一或多种钴啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或类似物，其 中所述组合物可有效地治疗受治疗者因过量一氧化氮(NO)的存在而引起 或加重的疾病状态。在一些方面，所述药物组合物还包括被配制成递送的 钴胺素，或其生物活性衍生物或类似物。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括被配制成向受治疗 者递送的一或多种钴啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或类似物，其 中所述组合物可有效缓解受治疗者由过量一氧化氮(NO)的存在而引起或 加重的疾病状态的一或多种症状。在一些方面，所述药物组合物还包括被 配制成递送的钴胺素，或其生物活性衍生物或类似物。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括被配制成向受治疗 者递送的一或多种钴啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或类似物，其 中所述组合物可有效治疗受治疗者由过量氰化物的存在而引起或加重的 疾病状态。在一些方面，所述药物组合物还包括被配制成递送的钴胺素， 或其生物活性衍生物或类似物。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括被配制成向受治疗 者递送的一或多种钴啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或类似物，其 中所述组合物可有效缓解受治疗者由过量氰化物的存在而引起或加重的 疾病状态的一或多种症状。在一些方面，所述药物组合物还包括被配制成 递送的钴胺素，或其生物活性衍生物或类似物。
附图说明
图1.钴啉醇酰胺与钴胺素的结构。显示了钴胺素的结构。钴啉醇酰 胺缺少灰色显示的5，6-二甲基苯并咪唑核苷酸末端。
图2.钴啉醇酰胺的光谱分析。如典型的实施方案中所描述的，钴啉 醇酰胺从羟钴胺素制备，并在C18固相萃取柱上纯化。在浓缩后，试样 被回复至pH值为3.0，且二水合钴啉醇酰胺产物的光谱被记录在300与 700nm之间。
图3.钴啉醇酰胺对NO-刺激的马尔皮吉安氏小管分泌和亚硝酸盐及 硝酸盐浓缩物的影响。组A及组B：从野生型果蝇中除去马尔皮吉安氏小 管，且管的分泌率通过测量在10分钟间隔期间小管对的单输尿管的微滴 形成进行确定。测量基础的小管分泌率30分钟，并接着用10μM Deta-NO 亲核复合体(组A)或1μM的脂多糖(LPS，组B)处理小管；在两组中，药 物加入的时间被用楔形记录。最终浓度在10μM的钴啉醇酰胺被在60分 钟加入一些小管中(在组A及B中通过箭头和实心圈记录药物的加入)；一 些小管接收到10μM的钴啉醇酰胺加10μM的钴胺素(组A和组B中的 实心三角)。各数据点代表在20对马尔皮吉安氏小管上进行的至少三次 独立实验的平均值±标准差。组C：10对小管用10μM Deta-NO亲核复合 体或10μM的LPS，在无(空心柱)或有(实心柱)10μM钴啉醇酰胺(Cbi)情 况下，被温育在200μl的Schneider’s培养基中60分钟。培养基中的亚硝 酸盐和硝酸盐通过基于Griess试剂的方法进行测量，且通过与标准值比较 进行定量。该数据是三份中进行的至少两次独立实验的平均值±标准差； 左边的y轴用来表示Deta-NO亲核复合体的数据，右边的y轴用来表示 LPS的数据。培养基中检测不到未经处理的小管的亚硝酸盐或硝酸盐。
图4.喂养钴啉醇酰胺的果蝇对LPS具有衰减的流体分泌反应。野生 型果蝇在标准果蝇饲料或含250μM钴啉醇酰胺(Cbi)的果蝇饲料上生长 48小时。从对照和喂养钴啉醇酰胺的果蝇除去马尔皮吉安氏小管并将所 述小管用于如图3描述的流体分泌分析中。测量基础分泌率30分钟；接 着用1μM脂多糖(LPS)刺激该小管，且再测量流体分泌30分钟。结果被 表示为LPS刺激的读数超过基础读数的增长百分数，且为三次独立实验 的平均值±标准差。
图5.钴啉醇酰胺对VASP磷酸化及亚硝酸盐和硝酸盐浓度的影响。 大鼠C6神经胶质瘤细胞(组A-C)与CS-54血管平滑肌细胞(组D)使用 编码VSV表位标记的VASP的表达载体转染；C6细胞使用G-激酶I共 转染。16小时后提取该细胞，且使用单克隆抗VSV抗体对该提取物进行 蛋白质印迹分析。组A：细胞被放置不经处理(泳道1)或在提取前用100 μM钴啉醇酰胺(Cbi，泳道2、4、6及8)，和/或15μM(泳道3和4)、 30μM(泳道5和6)或60μM(泳道7和8)NO供体PAPA-NO亲核复 合体(Papa)处理30分钟。磷酸化的VASP(pVASP)比非磷酸化的VASP移 动得慢。组B：细胞被放置不经处理(泳道1)或在提取前用30μM PAPA-NO亲核复合体(Papa)(泳道2-5)处理30分钟；向有些细胞另外加入 30μM钴啉醇酰胺(泳道4)或30μM钴啉醇酰胺加30μM钴胺素(泳道 5)。组C：细胞被放置不经处理(泳道1)，或在提取前用30μM 8-pCPT-cGMP(泳道2-4)与30μM钴啉醇酰胺(泳道3)或30μM钴啉醇酰 胺与30μM钴胺素的组合物(泳道4)处理30分钟。组D：CS-54细胞被 放置不经处理(泳道1)，或在提取前用100μM钴啉醇酰胺(泳道2和3)， 和/或100nM的钙离子载体A23187(泳道3和4)处理60分钟。组E： C6细胞(图的左半部分)和CS-54(图的右半部分)被分别用15μM PAPA-NO 亲核复合体和300nM A23187处理30分钟。向一半的培养物再加入15μM 钴啉醇酰胺(实心柱)。收集培养基，且如图3的说明中所述测量亚硝酸 盐加硝酸盐的总和。该数据是三份中进行的至少两次独立实验的平均值± 标准差；左边的y轴用来表示PAPA-NO亲核复合体处理的C6细胞，且 右边的y轴用来表示A23187处理的CS-54细胞。在未经处理的细胞的培 养基中低亚硝酸盐和/或硝酸盐浓度是从那些处理的细胞提取出的。
图6.钴啉醇酰胺对BHK、C6及CS-54细胞生长的影响。在添加10 ％FBS的DME培养基中，BHK、C6及CS-54细胞被置于每孔1.5-3×105 细胞的六孔培养皿中，并持续三天每天计数。在缺少钴啉醇酰胺(连续线， 实心圈)或存在50μM、100μM或200μM钴啉醇酰胺情况下(分别用带 有空心三角、菱形和方块的虚线表示)培养细胞。主要的数字显示BHK细 胞的数据，插入的数字显示针C6和CS-54细胞的数据。一些使用200μM 钴啉醇酰胺处理的BHK细胞还接受了200μM钴胺素(点线，实心方块)。 该数据是来自代表性的实验的两份培养物的平均值。
图7.钴啉醇酰胺对甲硫氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶的体内 活性的影响。BHK细胞使用六孔培养皿在含10％FBS的DME培养基中 培养。该细胞被分别用10μCi的[14C]-甲酸盐(实心柱)或[14C]-丙酸(空 心柱)培养90分钟或16小时。在加入如指出的甲酸盐标记物之前6小 时及与加入丙酸标记物同时，加入浓度在100μM的钴啉醇酰胺(Cbi)。一 些培养物在加入钴啉醇酰胺时另外加入100μM钴胺素(Cbl)。在培养期的 最后，所述细胞用0.4N的高氯酸(甲酸盐标记物)或10％三氯乙酸(丙 酸标记物)提取，并如典型实施方案中描述的进行处理。该数据是两份中 进行的至少三次独立实验的平均值±标准差。结合甲酸盐评价在体内的甲 硫氨酸合酶活性，并结合丙酸评价在体内的甲基丙二酰辅酶A变位酶活 性。
图8.钴啉醇酰胺恢复氰化物处理的中国仓鼠细胞中的呼吸活性。以 约3×107细胞/毫升的浓度转移中国仓鼠细胞到代谢舱，并通过使用氧电 极测量氧消耗来评价呼吸活性。在未加入底物(sub，5mM琥珀酸钠及5 mM 3-磷酸甘油)时，氧消耗是低的——如在图A中描记的近乎水平线所 指示的，在指示的时间加入KCN、钴啉醇酰胺(Cbi)及钴胺素(Cbl)至最终 浓度为250μM。在图A中显示了两个标绘在相同曲线上的代表性的描记， 且在图B中显示了钴啉醇酰胺与钴胺素的恢复百分数；后者的数据是两 份中进行的至少五次独立实验的概要(平均值±S.D.)。
图9.在果蝇中摄取钴啉醇酰胺进行氰化物气体及KCN解毒。果蝇在 标准果蝇饲料糊(正常饲料，空心及实心柱)，或含有100μM钴胺素(Cbl， 左斜纹柱)或100μM钴啉醇酰胺(Cbi，交叉影线柱)的标准饲料上从第 一龄幼虫期生长。组A：在各标明的条件下，20只果蝇被以2.2ppm或 22ppm暴露于HCN 1分钟。HCN引起所有果蝇在20秒内虚脱不活动； 标绘于纵坐标上的是恢复并在暴露1小时后能走动或飞行的果蝇数目。未 暴露于HCN的果蝇被在最右端以实心柱示出。组B：如标明的，在各条 件下，对约10只果蝇注射1μl的10mM Na2CO3(pH 9.5，实心柱)或 Na2CO3中的100μM的KCN。该数据作为1小时后活动的果蝇的百分数 被提供。两组中的数据为两份中进行的至少三次独立实验的平均值±S.D.。
图10.在果蝇中注射或吸入钴啉醇酰胺进行氰化物气体解毒。通过注 射(1μl的水或500μM Cbl或Cbi，组A)或使用含水或100μM的Cbl 或Cbi(组B)的喷雾器进行吸入，使果蝇接受水(空心及实心柱)、钴 胺素(Cbl，左斜纹柱)，或钴啉醇酰胺(Cbi，交叉影线柱)。所述果蝇 在接受钴啉醇酰胺或钴胺素之前(各图右半部分的柱)或在接受钴啉醇酰 胺或钴胺素之后(各图左半部分的柱)被暴露于22ppm(组A)或2.2ppm (组B)的HCN 1分钟。被使用水喷雾但未暴露于HCN的果蝇被示于组 B的实心柱中。该数据是两份中进行的至少三次独立实验的平均值±S.D.。
图11.钴啉醇酰胺减少氰化物对马尔皮吉安氏小管分泌的抑制。从果 蝇中除去成对的马尔皮吉安氏小管，且流体分泌率通过测量在10分钟间 隔期间输尿管的微滴形成进行确定。在向全部小管加入100μM KCN前， 在三个10分钟间隔测量分泌率。组A：在零点时间向小管加入浓度为100 μM的钴啉醇酰胺(空心圈)与钴胺素(三角)。组B：在除去果蝇的马 尔皮吉安氏小管之前，它们在标准果蝇饲料(实心圈)，或含有100μM 钴啉醇酰胺(空心圈)或100μM钴胺素(三角)的饲料从第一龄幼虫期 生长。组C：在加入KCN(空心圈)10分钟后，向小管加入100μM浓度 的钴啉醇酰胺。数据是在20对马尔皮吉安氏小管上进行的至少三次独立 实验的平均值±S.D.。
发明详述
1.引言
本发明提供了许多方法、药剂及组合物，其可用于治疗受治疗者由过 量一氧化氮(NO)或过量氰化物的存在而引起或加重的疾病状态。
应该理解的是本发明不限于特定的方法、药剂、化合物、组合物或生 物系统，其当然可以改变。也应该理解的是用于此处的术语仅为了说明特 定的实施方案，并非意在限制。如用于此说明书及所附的权利要求中的， 单数形式的“一”、“一个”及“该”包括复数所指对象，文中另外指明的除外。 因此，例如，“细胞”包括两种或多种细胞的组合，等等。
如用于此处的“约”，当指可测量的值例如数量、短暂的时间持续等， 意味着包括自特定值的±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1 ％且还更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化对进行所述公开的方法是 合适的。
用于本发明的方法中的化合物可按本领域技术人员公知的许多方法 进行制备。贯穿文中描述的化合物可以可替代的形式使用或制备。例如， 许多含氨基的化合物可作为酸加成的盐使用或制备。通常，这样的盐改善 所述化合物的分离和处理性质。例如，根据试剂、反应条件等，此处所述 的化合物可例如作为它们的氢氯化物或甲苯磺酸盐被使用或制备。本发明 的范围内还意在包括同型的晶型、所有的手性和消旋形式、N-氧化物、水 合物、溶剂合物，及酸式盐水合物。所有与本发明有关的公开的方法意在 以任何数值范围进行实施，包括毫克、克、多克、千克、多千克或市售的 工业上的数值范围。
除非另外说明，否则用于此处的所有技术及科学术语具有与本发明所 属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的意思。尽管与那些此处描述 的方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于测试本发明的实践，但 优选的材料和方法是描述于此的。在说明和要求本发明的权利时，将使用 下列术语。
用于此处的一些缩写包括：BHK，幼仓鼠肾细胞；CoA，辅酶A； Deta-NO亲核复合体，(Z)-1-[2-(2-氨乙基)-N-(2-铵乙基)氨基]二氮烯-1-鎓 -1，2-二醇盐；DEM，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基；FBS，胎牛血清； G-激酶，依赖于cGMP的蛋白激酶；HPLC，高效液相色谱；LPS，脂多 糖；NO，一氧化氮；NOS，NO合酶；OH-Cbl，羟钴胺素；PAPA-NO亲 核复合体，(Z)-1-[N-(3-铵丙基)-N-(正丙氨基)氨基]二氮烯-1-鎓-1，2-二醇 盐；PBS，磷酸盐缓冲盐水；8-pCPT-cGMP，8-对氯苯基硫代环GMP；及 VASP，血管舒张剂刺激磷蛋白。
“败血症”或“败血症性休克”指的是由宿主对感染或创伤的免疫应答 引起的一系列临床情况，并以全身性炎症和血凝固为特征。其包括从全身 性炎症反应到器官功能异常到多器官衰竭，并最终到许多患者的死亡。特 别是在上了年纪的、免疫抑制的及重症患者中，败血症是在世界范围的重 症监护病房(ICUs)中的发病率和死亡率的主因。在美国，败血症是非冠脉 ICU患者的主要死亡原因，而来自疾病控制中心(CDC)1998年的数据显示 它在所有主要死亡原因中名列第11位(National Vital Statistics Report， 2000)。败血症与从28％到50％的死亡率有关。
“肝性脑病”描述了一种病症，其用于描述肝衰竭对中枢神经系统的有 害作用。其特征包括从精神混乱到反应迟钝(昏迷)。肝性脑病的常见原 因是酒精性肝硬化。
“肝肾综合征”描述了一种病症，其中急性肾功能衰竭的发生伴随肝或 胆管疾病，其原因被认为是肾血流量的减少或如四氯化碳中毒或钩端螺旋 体病对肝和肾两者的损伤。肝肾综合征也被认为是肝肾的综合征。
“肝肺综合征”描述了一种发生在慢性肝病患者的综合征，其典型的表 现是肺中的血管扩张和损伤的氧合作用。呼吸困难可为常见症状，指甲杵 状变及发绀为常见表现。
“肝硬化性心肌病”通常被定义为在高静息心排出量情况下对应激的 亚正常心室反应。肝硬化的实验动物模型中的机理研究表明多种因素是造 成肝硬化的原因，包括：异常的生物物理膜特征、损伤的β-肾上腺素能信 号转导及由cGMP介导的增强活性的心脏抑制剂系统。肝硬化性心肌病由 肝移植、经颈内静脉肝内门体分流术的插入以及感染促成或恶化。其能在 肝肾综合征的发病机制中起作用。
“血液透析诱导的低血压”指的是在肾替代治疗中最严重的并发症之 一。透析中低血压的主因是移出的流体量与血管内隔室再充填的容量间的 不平衡造成的血容量不足。当移出的过量流体完全超过血容量不足的代偿 机制时，将发生低血压。只要肾替代治疗被限制在每周仅几小时，透析中 低血压将继续是一个相关问题。“低血压”指的是动脉压(MAP)＜70mm Hg 的情况；收缩压(SBP)＜100mm Hg被用作次要结果。
“心源性休克”指的是心脏泵功能的基本衰竭导致的休克，如在心肌梗 塞、严重的心肌病，或心脏的机械梗阻或压迫中；临床特征类似于低血容 量性休克的那些。
“缺血-再灌注损伤”指的是在低氧状态下，流至组织的血流量恢复期 间发生的损伤。
“缺氧”指的是组织的氧供应减少的情况。
“创伤”在医学上指的是严重或危急的身体损伤、创伤，或休克。
“氰化物中毒”指的是氰化物作为中毒来源。住宅或工业火灾的烟吸入 患者中相对频繁地发生氰化物暴露。氰化物中毒也可在工业中发生，特别 是在金属贸易、采矿、电镀、珠宝生产及x光片回收中。也会在船舶、仓 库及其他结构的熏蒸消毒中遇到。氰化物也用作自杀剂，特别是在卫生保 健和实验室职工中。存在许多形式的氰化物，包括：气态氰化氢(HCN)、 水溶性的氰化钾和氰化钠盐，及水溶性差的氰化汞、氰化铜、氰化金，及 氰化银盐。此外，许多含氰化物的化合物，被称为氰，可在代谢期间释放 氰化物。这些包括，但不限于，氯化氰及溴化氰(具有潜在肺刺激效应的 气体)、腈(R-CN)，及硝普钠，其可在延长的或高剂量治疗期间产生 氰化物中毒。工业广泛应用腈作为溶剂及将其用在塑料的生产中。腈可在 燃烧期间或在皮肤或胃肠道吸收后进行代谢时释放HCN。许多合成的 (如：聚丙烯腈、聚氨基甲酸酯、聚酰胺、脲甲醛、三聚氰胺)及天然的 (如：羊毛、丝)化合物在燃烧时产生HCN。这些燃烧气体可能促成烟 吸入的发病率和死亡率。最后，长期消费含氰化物的食物，例如木薯，可 导致氰化物中毒。根据其形式，氰化物可通过吸入、摄食或皮肤吸收引起 中毒。
氰化物实际上影响所有的身体组织，其结合普遍存在的金属酶并致使 它们失活。它的主要毒性很可能由细胞色素氧化酶(细胞色素aa3)的失 活并因此细胞呼吸的失活而引起，甚至在足够氧储存的存在下也是如此。 因此，具有高需氧量的组织(如：脑、心脏、肝)最深受急性氰化物中毒 影响。
长期消费含氰化物的食物导致共济失调和视神经病变。不完全的氰化 物代谢引起遗传性视神经萎缩，导致失明。氰化物可引起与长期吸烟有关 的一些有害作用，如：烟草中毒性弱视。
“一氧化碳(CO)中毒”指的是作为燃烧有机化合物的副产物形成的一 氧化碳(CO)的中毒。排气系统发生故障或阻塞的炉、便携式加热器及汽车 废气可引起CO中毒。吸烟也是CO的重要来源。天然气不含CO，但不 适当排气的气水加热器、煤油空间对流加热器、木炭烤架、木炭火盆，及 Sterno炉都放出CO。CO中毒也通过吸入二氯甲烷蒸汽-一种在脱脂剂、 溶剂，及脱漆剂中发现的挥发性液体而发生。皮肤的二氯甲烷暴露不会导 致显著的全身效应，但能引起显著皮肤烧伤。肝代谢三分之一吸入的二氯 甲烷为CO。显著百分数的二氯甲烷被储存在组织中，且连续释放导致CO 水平比直接吸入CO时提高至少两倍。
“血液透析”指的是一种肾透析的类型(常用于患有肾衰竭的患者，但 也可用于在急性情况中快速排出药物或毒药)。血液透析经由专门的滤器 通过循环血液进行工作。血液量连同帮助从血液中去除毒素的溶液一起流 过半透膜(透析器或滤器)。血液透析通常需要每分钟400至500毫升 (ml/min)的血流量。
“囊性纤维病”指的是外分泌腺的遗传疾病，通常在幼童时期发展，并 主要累及胰腺、呼吸系统，及汗腺。其特征在于通过受累的腺体产生异常 的粘稠粘液，通常导致慢性呼吸道感染和胰脏功能受损。囊性纤维病也被 称为粘液粘稠病。
“肾衰竭”指的是肾不能适当起作用。其可被粗分为两类：急性肾功能 衰竭和慢性肾功能衰竭。“急性肾功能衰竭”是肾功能快速累进的降低，通 常以少尿(尿产生减少，定量为成人少于400-500毫升/天，儿童少于0.5 毫升/千克/小时或婴儿少于1毫升/千克/小时)、体液失调及电解质紊乱为 特征。必须确定根本原因以阻止该进展，且有必要进行透析以弥补处理这 些根本原因所需的时间缺口。慢性肾功能衰竭发展缓慢并最初产生很少的 症状。其可为许多肾脏疾病的并发症，所述肾脏疾病例如：IgA肾炎、肾 小球肾炎、慢性肾盂肾炎及尿潴留。终末期肾功能衰竭(ESRF)是最终的结 果，在病例中，当寻找供肾移植的供体时，通常需要透析。慢性肾功能衰 竭可由许多疾患引起，其包括长期高血压、糖尿病、充血性心力衰竭、狼 疮或镰状细胞性贫血。慢性肾功能衰竭可由许多急性疾病过程引发。例子 包括：败血症(感染)、休克、创伤、肾结石、肾脏感染、药物中毒(阿 司匹林或锂)、毒药或毒素(药物滥用)或用碘化的对比染料注射后(不 良反应)。两种形式的肾衰竭都导致威胁生命的代谢紊乱。
“大规模毁灭性武器”或“WMD”是被设计用于杀戮大量人类的武器， 典型的目标是平民和军事人员等。
http：//encyclopedia.1aborlawtalk.com/Weapons of mass destruction。
有些类型的WMDs被认为具有心理学的影响，而不是严格的军事用 途。尽管该术语被在1937年创造以描述大量通过常规爆炸的炸弹进行空 中轰击，目前认为属于此类的多种武器常常指的是如NBC武器或ABC武 器：核武器(包括放射学武器)、生物武器、化学武器，及爆炸物。WMDs 也被称为无差别毁灭性武器、大规模破坏性武器及大规模效应武器。
现代军事定义是“能够高度有序的毁灭和/或以毁灭大量人类的方式 使用的武器。大规模毁灭性武器可以是烈性炸药或核武器、生物武器、化 学武器，及放射性武器，但当运输或推进该武器的工具是该武器的可分离 和可分割部分时，则不包括这样的工具。”(来源：Joint Publication 1-02， http：//www.dtic.mil/doctrine/iel/new pubs/ipl 02.pdf)。化学WMD的一个例 子包括，但不限于，氰化物中毒。
如用于美国民防活动中的，该定义要广得多。此类别现包括CBRNE 武器——化学武器、生物武器、放射性武器、核武器，及爆炸武器。在此 列表中，“大规模毁灭性武器”已被定义为：“(1)任何爆炸武器、燃烧武器， 毒气、炸弹、手榴弹，或具有超过4盎司推进剂装料的火箭、具有超过四 分之一盎司的爆炸或燃烧装料的导弹，或地雷或与上述类似的装置。(2) 毒气。(3)任何包含疾病生物体的武器。(4)任何被设计用以危及人类生 命水平释放辐射的武器。”18U.S.C.§2332a。
“衍生物”指的是一种化合物，其通过被另一原子、分子或基团的取代 的置换，从类似结构的另一化合物中产生。例如：化合物的氢原子可被烷 基、酰基、氨基等取代，以产生该化合物的衍生物。
术语“稳定的”，如用于此处的，指的是其具有允许被生产的能力，且 在用于此处详述的目的的足够长的时间阶段保持其完整性。一般，本发明 的化合物在无水或无其他化学的反应条件时40℃或更低温度下至少持续 一周是稳定的。
“患者”、“受治疗者”，或“哺乳动物”可互换地使用，指的是哺乳动物， 例如人类患者和非人类的灵长类，以及实验动物，例如家兔、大鼠，及小 鼠，以及其他动物。动物包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物， 例如绵羊、狗、母牛、小鸡、两栖动物，及爬行动物。
“治疗”指的是在治疗或改善或预防疾病、病症或疾患中的任何成功的 标志，包括任何客观的或主观的参数，例如，减轻；缓和；症状的减少或 使病症对患者来说为更可容忍；恶化率或衰退率的减少；或使得恶化的终 点较不弱。症状的治疗或改善能以客观或主观的参数为基础；包括医生检 查的结果。因此，术语“治疗”包括进行本发明的化合物或药剂的给药以预 防或延迟、减轻，或阻止或抑制与此处描述的疾病、病症或疾患有关的症 状或病症的发展。术语“疗效”指的是减轻、消除或预防受治疗者疾病、疾 病的症状，或疾病的副反应。使用本发明的方法的“治疗”或“疗法”包括防 止受治疗者症状的发作(所述受治疗者可能处于与此处描述的疾病、病症 或疾患有关的疾病或疾患的增加的危险中，但未经历或表现症状)、抑制 疾病或疾患的症状(减慢或阻止其发展)、减轻疾病的症状或副反应(包 括姑息疗法)，以及缓解疾病的症状(引起消退)。治疗可以在表现疾病 或病症后，症状的预防性的(预防或延迟疾病的发作，或预防其临床的或 亚临床的症状的表现)或治疗的抑制或减轻。术语“疗法”，如用于此处的， 包括预防疗法(如：预防剂)、根治疗法或姑息疗法。
术语“给药”，如用于此处的，表示直接进行本发明的化合物或组合物 的给药，或者进行前药、衍生物或类似物的给药，所述前药、衍生物或类 似物将在体内形成等量的活性化合物或物质。术语“同时给药”或“联合给 药”或如此处使用的类似说法意思是包括对单个患者进行所选的治疗剂的 给药，且意在包括所述药剂不必要经由相同的给药途径或在相同的时间进 行给药的治疗方案。
“药学上可接受的赋形剂”表示用于制备通常安全、无毒及合乎需要的 药物组合物的赋形剂，并包括对兽用和人类药学用途可接受的赋形剂。这 样的赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气溶胶组合物的情况下为气体。
“药学上可接受的盐或酯”意思是药学上可接受的并具有理想的药理 性质的盐或酯。这样的盐包括在所述化合物中存在的酸性质子能与无机的 或有机的碱反应可形成的盐。合适的无机盐包括那些与碱金属如钠和钾、 镁、钙及铝形成的盐。合适的有机盐包括那些与有机碱例如胺碱形成的， 如：乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-泛影葡胺等。这样的盐 也包括与无机酸(如：氢氯酸和氢溴酸)和有机酸(如：乙酸、柠檬酸、 马来酸，及烷磺酸与芳烃磺酸例如甲磺酸及苯磺酸)形成的酸加成盐。药 学上可接受的酯包括从化合物如C1-6烷基酯中存在的羧基、磺酰氧基及 膦酰氧基形成的酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可为 单酸单盐或单酸单酯或双盐或双酯；且类似地，在存在超过两个酸性基团 时，一些或全部这样的基团可被成盐或酯化。本发明中命名的化合物可以 未成盐或未酯化的形式，或以成盐和/或酯化的形式存在，且这样的化合 物的命名意在包括最初的(未成盐且未酯化)化合物及其药学上可接受的 盐和酯。本发明中命名的某些化合物也能以超过一种的立体异构体形式存 在，且这样的化合物的命名意在包括这样的立体异构体的全部单个的立体 异构体和全部混合物(不论消旋与否)。
“药学上可接受的载体(或介质)”，其可与“生物相容的载体或介质” 互换使用，指的是药剂、细胞、化合物、材料、组合物，和/或剂型，其 在合理的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而使用并没有过 度的毒性、刺激、过敏反应，或与合理的利益/风险率相应的其他并发症。 如在此更详细描述的，适于在本发明中使用的药学上可接受的载体包括液 体、半固体(如：凝胶)及固体物质(如：细胞支架)。如用于此处的， 术语“可生物降解的”描述了物质在体内被分解(如：被降解、被蚀解、被 溶解)的能力。该术语包括从身体消除或不消除(如：通过再吸收)的情 况下在体内的降解。所述半固体和固体物质可被设计为在体内抗降解(不 能生物降解的)或它们可被设计为在体内降解(可生物降解的、可生物蚀 解的)。可生物降解的材料还可为可生物再吸收的或可生物吸收的，即： 其可被溶解或吸收进体液(水溶性的植入物是一个例子)，或降解并最终 从体内排出，经由转化为其他物质或者分解并经由自然途径排出。
贯穿本文描述的化合物可以可替换的形式使用或制备。例如：许多含 氨基的化合物可作为酸加成的盐使用或制备。常常是这样的盐改善了所述 化合物的分离和处理性质。例如：根据试剂、反应条件等，此处所述的化 合物可例如作为它们的氢氯化物或甲苯磺酸盐被使用或制备。本发明的范 围内还意在包括同型的晶型、所有的手性和消旋形式、N-氧化物、水合物、 溶剂合物，及酸式盐水合物。
本发明的某些酸性或碱性化合物可作为两性离子存在。本发明的范围 内意在包括所述化合物的所有形式，包括游离酸、游离碱及两性离子。本 领域众所周知的是，含氨基和羧基的化合物通常与它们的两性离子平衡存 在。因此，贯穿本文所描述的含有例如氨基和羧基的任何化合物，也包括 它们相应的两性离子。
术语“药学上可接受的”、“生理上允许的”及其语法变化，当它们指的 是组合物、载体、稀释剂及药剂时可互换使用，并表示所述物质能够给药 于人类而不产生阻止所述组合物给药的不希望的生理效应。
“治疗有效量”、“有效量”及其语法变化，当它们指的是本发明的药物 组合物时，可互换使用，并表示当给药于受治疗者以治疗疾病或病症时足 够影响所述疾病或病症治疗的量。此处所用的“治疗有效量”指的是在剂量 和必需的时间周期上有效实现理想效果的量。特别地，“治疗有效量”指的 是治疗在受治疗者由过量一氧化氮或氰化物中毒的存在而引起或加重的 疾病状态的化合物或化合物的组合物的量。
应该理解的是本发明的成分的有效量将不仅随所选的特定化合物、成 分或组合物、给药途径，及成分(单独或与一或多种复方药剂结合)在个体 中引起期望的反应的能力而在患者间不同，而且随一些因素例如将被减轻 的疾病状态或病症的严重度、个体的激素水平、年龄、性别、体重、患者 疾病状态及正被治疗的病理状态的严重度、由特定患者正遵循的并行的药 物疗法或特殊饮食，以及本领域技术人员将认识到的其他因素，而在患者 间不同，合适的剂量最终在监护医生的慎重考虑下。给药方案可被调整以 提供改善的治疗反应。治疗有效量也是这样一种量：即其中治疗的有益效 果超过成分的任何有毒或有害作用的量。
已知的治疗药物与本发明的药物组合物的“共同给药”表示所述药物 与包括钴啉醇酰胺或其生物活性衍生物或类似物的组合物的给药，此时已 知药物和所述组合物将均具有治疗效果。这样的共同给药可包括与本发明 的化合物给药同时(即：在相同的时间)、之前或之后进行抗微生物药物 的给药。本领域的普通技术人员将不难确定对于本发明的特定药物和组合 物的合适的给药周期、顺序及剂量。
术语“联合治疗”指的是两种或多种治疗剂或化合物的给药，用于治疗 本发明中描述的治疗学的病症或疾患，例如：败血症、慢性肝衰竭、肝硬 化、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、肝硬化性心肌病、血液透析相 关的低血压、心源性休克、缺血-再灌注损伤、缺氧，或创伤。其他描述 于本发明的治疗学的病症或疾患包括，例如氰化物中毒。这样的给药包括 以同时的方式进行这些治疗剂或化合物的共同给药，例如，以具有钴啉醇 酰胺活性的单个化合物，或以多种具有钴啉醇酰胺与钴胺素活性的独立的 化合物(包括单剂量单元的独立的化合物的给药)。此外，这样的给药也 包括以同时的方式使用各类型的治疗剂。在任一情况中，该治疗方案将在 治疗此处描述的病症或疾患中提供联合用药的有益效果。
通常，术语“良好耐受的”指的是没有作为治疗结果并将影响治疗决定 的病症不利变化。
“协同的相互作用”指的是一种相互作用，其中两种或多种药剂的合用 效果要大于它们的个别效果的代数和。
“长期”给药指的是以连续的方式而非急性方式进行药剂的给药，以保 持对于长期的时间阶段维持其最初的治疗效果(活性)。“间断”给药不是 没有间断的连续的治疗，而实际上是循环的治疗。
如用于此处的，“剂量单元”指的是适于作为用于将被治疗的特定个体 的单一剂量的物理分离单元。各单元可含有预定量的活性化合物，其经计 算与需要的药学载体联合以产生理想的治疗效果。对于本发明剂量单元形 式的说明可通过下述来描述：(a)活性化合物的独特特征与将实现的特 定治疗效果，及(b)在所述活性化合物的配药法中固有的局限性。
术语“成分”、“药物”、“生物活性剂”、“药理活性剂”、“活性剂”或“药 剂”在此处可互换使用，用来指有关的一种化合物或几种化合物或组合物， 当被给药于生物体(人类或动物)时，其通过局部的和/或全身作用引起 期望的药理学的和/或生理学的效应。
术语“调节”指的是增强或抑制生物活性或过程例如受体结合或信号 活动的功能。这样的增强或抑制可随特定事件例如信号转导途径活化的发 生而发生，和/或仅以特定的细胞类型出现。所述调节剂意在包含任何化 合物，如：抗体、小分子、肽、寡肽、多肽，或蛋白质，优选小分子，或 肽。
如用于此处的，“前药”指的是被特别设计以最大化达到理想的反应位 点的活性物的量，其自身对于理想的活性具有典型地无活性或最小活性的 性质，但通过生物转化被转变为生物活性代谢物。前药的许多形式是本领 域已知的，例如，如下述中所讨论：Bundgaard，(编)，DESIGN OF PRODRUGS(前药的设计)，Elsevier，1985；Widder等人(编)，METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)，第4卷，Academic Press，1985； Krogsgaard-Larsen等人(编)。″Design and Application of Prodrugs(前药的 设计与应用)，″TEXTBOOK OF DRUG DESIGN AND DEVELOPMENT(药 物设计与开发的教科书)，第5章：113-191，1991，Bundgaard等人，Journal of Drug Deliver Reviews 8：1-38，1992，Bundgaard，J.of Pharmaceutical Sciences 77：285，1988.；及Higuchi与Stella(编)PRODRUGS AS NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEMS(作为新型药物递送系统的前药)，American Chemical Society，1975。
用于本发明的方法中的化合物能以前药形式存在。如用于此处的，“前 药”意在包括任何共价结合的载体，当其被给药于哺乳动物时，在体内释 放活性母体药物或其他被应用于本发明的方法中的制剂或化合物。由于已 知前药提高药物的许多期望的性质(如：溶解度、生物利用度、生产等)， 如果期望的话，应用于本方法的化合物可按前药形式被递送。因此，本发 明意在设计递送前药的方法。用于本发明的化合物如钴啉醇酰胺的前药， 可通过修饰存在于化合物中的官能团进行制备，以这样的方式，所述修饰 物或者按常规处理或者在体内被裂解为母体化合物。
因此，前药包括，例如描述于此的化合物，其中羟基、氨基或羧基被 键合至任何基团，当该前药被给药于哺乳动物受治疗者时，分别裂解形成 游离羟基、游离氨基或羧酸。例子包括但不限于：醇的乙酸盐、甲酸盐和 苯甲酸盐衍生物及胺官能团；以及烷基、碳环、芳基，及烷基芳基酯，例 如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、 苯基、苄基，及苯乙基酯等。
2.概述
A.一氧化氮(NO)的清除及钴啉醇酰胺
一氧化氮(NO)具有多种细胞功能，包括细胞生长、分化及凋亡的调节， 以及许多生理作用包括血压、血小板聚集及突触可塑性的调节 (Lloyd-Jones与Bloch，Annu.Rev.Med.47：365-375，1996；Ignarro，L.与 Murad，F.(1995)Nitric oxide.Biochemistry，molecular biology and therapeutic implications，Academic Press，San Diego；Hlsher，Trends Neurosci.20：298-303，1997)。NO功能的研究已通过提高或降低NO水平 的药理剂进行辅助(Moncada等人，Pharmacol.Rev.43：109-142，1991)。 许多疾病状态包括败血症和肝衰竭以产生异常高的NO为特征，因此除去 过量的NO可具有有益效果(Shah等人，Gastroenterology 126：903-913， 2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.66：53-57，2004；Pfeilschifter等人， Pflugers Arch.442：479-486，2001)。
降低NO浓度的一个方法是减少NO合成。在哺乳动物中，存在四种 NO合酶(NOS)亚型：神经元型NOS(nNOS或NOS I)、诱导型NOS(iNOS 或NOS II)，内皮型NOS(eNOS或NOS III)，及一种近来描述的线粒体 NOS(mtNOS)(Nedvetsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99：16510-16512， 2002；Elfering等人，J.Biol.Chem.277：38079-38086，2002)。nNOS与eNOS 在许多组织中构成性表达，并在对细胞内钙增加的反应中产生皮摩尔或纳 摩尔浓度的NO(Clancy与Abramson，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.210：93-101， 1995)。iNOS在多种细胞类型中表达，且其水平可通过内毒素(脂多糖， LPS)和α-肿瘤坏死因子被成倍地诱导，伴随iNOS生成浓度高于nNOS 及eNOS几乎1000倍——即纳摩尔至微摩尔——的NO(Pfeilschifler等 人，Pflugers Arch.442：479-486，2001 Poon等人，Circulation 108：1107-1112， 2003；Morin等人，Crit Care Med.26：1258-1264，1998；Nathan，FASEB J.6： 3051-3064，1992)。人们对mtNOS了解较少，但它在鼠肝中占细胞NO 产量的50％，且低微摩尔的NO浓度已在鼠心脏线粒体中发现(Elfering 等人，J.Biol.Chem.277：38079-38086，2002；Saavedra-Molina等人，Amino Acids 24：95-102，2003)。已产生许多NOS抑制剂，其中的大多数是精氨 酸类似物，包括异硫脲衍生物，且因为精氨酸的多重生化作用，这些药剂 除NOS抑制外，还可具有其他作用(Garvey等人，J.Biol.Chem.269： 26669-26676，1994；El Mabrouk等人，Life Sci.67：1613-1623，2000； Hallemeesch等人，Clin.Nutr.21：111-117，2002)。
减少NO水平的另一方法是使用NO清除剂。例如，血红蛋白的血红 素部分以强烈的亲合力与NO结合，但和游离的细胞外血红蛋白可以是高 度毒性的，尤其是在整体动物中(Kim与Greenburg，Shock 17：423-426， 2002)。因此，其他NO清除剂已被认为包括二硫代氨基甲酸盐衍生物， 其螯合铁并因此结合NO，但这些也可具有有害作用(Menezes等人， Am.J.Physiol.277：G144-G151，1999；Nadler等人，Am.J.Physiol.281： G173-G181，2001)。钴胺素(维生素B12)在结构上类似于血红素，且也结 合NO，但具有比血红素小得多的效能(Greenberg等人，J.Pharmacol.Exp. Ther.273：257-265，1995)。钴胺素前体钴啉醇酰胺缺少钴胺素的二甲基 苯并咪唑核甘酸末端(图1)，对NO的亲和力超过钴胺素100多倍；此 外，与钴胺素仅结合一个NO分子相比，各个钴啉醇酰胺分子可潜在地中 和两个NO分子(Sharma等人，Biochemistry 42：8900-8908，2003)。如此 处公开的，提出了证明钴啉醇酰胺在果蝇模型与培养的哺乳动物细胞中被 用作NO清除剂用途的研究。钴啉醇酰胺在比在体内中和所产生的NO所 需要的高得多的浓度对细胞有毒，且该毒性是完全由钴胺素逆转的；钴胺 素不影响经由钴啉醇酰胺的NO清除，且因此这两种类咕啉的联合可为清 除NO的一种非常有效的方法。
B.氰化物中毒与钴啉醇酰胺
对于动物，氰化物具有KCN的LD50为2-8mg/kg范围的有效力的毒 素，且在人类中，仅仅50mg可为致命的(Salkowski与Penney， Vet.Hum.Toxicol.36：455-466，1994)。纵观历史，其被用作杀人剂和自杀 剂，且被用于第一次世界大战的化学战、第二次世界大战中纳粹进行的犹 太人的大规模中毒(被称为Zyklon B)中，且可能被用在20世纪80年代 早期的伊朗伊拉克战争期间(Way，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.24： 451-481，1984；2004.Fact Sheet，CDC.Dept.Health and Human Services)。 氰化物具有被用作大规模毁灭性武器的可能，尤其是在例如机场和火车站 的封闭空间中(Greenfield等人，Am.J.Med.Sci.323：326-340，2002； Rotenberg，Pediatr.Ann.32：236-240，2003；Eckstein，JEMS 29：suppl-31， 2004)。
氰化物气体在燃烧任何含碳和氮的材料期间被产生，所述材料包括棉 花、塑料、丝及羊毛，且因此，其在住宅和工业火灾中产生(Alcorta，JEMS 29：suppl-31，2004)。随着出现在建筑中的更多基于合成的材料的使用， 氰化物可为和一氧化碳一样多的源自烟吸入的死亡的主要原因(Alcorta， JEMS 29：suppl-15，2004；Alarie，Crit Rev.Toxicol.32：259-289，2002； Esposito与Alarie，J.Fire Sci.6：195-242，1988；Silverman等人，J.Trauma 28： 171-176，1988)。氰化物结合金属蛋白酶，且其基本的细胞内靶被认为是 细胞色素氧化酶，从而解偶联氧化磷酸化并消耗细胞的ATP。
有几种针对氰化物中毒的解毒剂，包括亚硝酸钠、硫代硫酸钠，及羟 钴胺素(维生素B12b)(Gracia与Shepherd，Pharmacotherapy 24：1358-1365， 2004；Cummings，Occup.Med.(Lond)54：82-85，2004；Megarbane等人，J. Chin Med.Assoc.66：193-203)。亚硝酸钠通过产生甲基血红蛋白(高铁血 红蛋白)起作用，其对氰化物具有高亲和力但不再与氧结合，且因此在烟 吸入的受害者中，亚硝酸钠可加重由一氧化碳诱导的携氧能力的降低 (Moore等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.242：70-73，1987)。硫代硫酸钠作为 硫氰酸生成酶的硫供体而起作用，硫氰酸生成酶转化氰化物为硫氰酸盐- 一种无毒的氰化物衍生物。羟钴胺素通过以比较高的亲和力(大约1012 的KA)结合氰化物而起作用，且因为氰基钴胺素的高度稳定性，它是在 维生素制品中钴胺素的常见形式。在美国，亚硝酸钠和硫代硫酸钠被用作 氰化物解毒剂，而在法国和其他一些欧洲国家，多用羟钴胺素(Fortin等 人，JEMS29：suppl-21，2004)。
钴啉醇酰胺是在钴胺素的生物合成中的次末级前体，其没有钴胺素的 二甲基苯并咪唑(DBZ)核苷酸末端。DBZ基团在下部的中轴位置与钴原子 配位，且因此，而钴胺素仅有一个上部的配体结合位点，钴啉醇酰胺同时 具有上部和下部的配体结合位点。此外，在钴胺素中，DBZ基团对上部 的结合位点具有负的反位效应，因此降低了钴胺素对配体的结合亲和力。 净效应是钴啉醇酰胺比钴胺素对氰化物离子具有大得多的亲和力，有约 1022的KA。如此处使用两种不同的生物系统所公开的，钴啉醇酰胺比钴 胺素更有效地进行氰化物解毒，且如前所示，钴啉醇酰胺的临床相应浓度 对哺乳动物细胞是无毒的(Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685， 2005)。因此，钴啉醇酰胺可被用作氰化物中毒的解毒剂。
3.疾病适应证
A.一氧化氮疾病状态
本发明的方法涉及治疗和预防受治疗者由过量一氧化氮(NO)的存在 而引起或加重的疾病状态，包括对受治疗者进行药学有效量的钴啉醇酰胺 或其生物活性衍生物或类似物的给药。
本发明的方法也涉及缓解受治疗者由过量一氧化氮(NO)的存在而引 起或加重的疾病状态的症状，包括进行药学有效量的钴啉醇酰胺的给药， 其中所述受治疗者被诊断为遭受由过量NO的存在而引起或加重的疾病 状态发展的痛苦或处于由过量NO的存在而引起或加重的疾病状态发展 的危险。
败血症性休克以药物难治性低血压为特征，且具有极高的死亡率。各 种细胞因子和信号分子促成败血症的状态，在严重低血压的发展中，一氧 化氮(NO)起了主要作用。NO由三种不同的NO合酶产生：神经元型 NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)。iNOS的显著的诱 导是败血症中NO水平增加的主要原因。非选择性的NOS抑制剂在败血 症的动物模型中显示了一些成功，但在大量III期临床试验中，这些药剂 中的一种导致死亡率增加。选择性的iNOS抑制剂已在动物模型中显示更 有希望，但还未在人类中试验。
降低败血症中的NO水平的另一途径是使用NO清除剂，且一些NO 清除剂包括血红蛋白和维生素B12(钴胺素)已在败血症的动物模型中显示 有益。如此处公开的，钴啉醇酰胺没有钴胺素的二甲基苯并咪唑(DBZ)核 苷酸末端，在生理缓冲液和人血清中比钴胺素结合NO更牢固约100倍。 如此处公开的，在培养的哺乳动物细胞和完善构建的果蝇模型中，钴啉醇 酰胺是一种有效的NO清除剂，且在败血症中，其在清除NO所需的浓度 未显示出毒性。
除休克外，几种其他的临床状态以过量NO的生成为特征。这包括： 肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、肝硬化性心肌病、血液透析相关的 低血压、心源性休克、缺血-再灌注损伤、缺氧，及创伤(Pfeilschifter等人， Pflugers Arch.442：479-486，2001；Shah等人，Gastroenterology 126： 903-913，2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.66：53-57，2004)。在这些情况 中的一些中，NO增加的机理是经由伴随增加的iNOS表达的全身炎症反 应(Shah等人，Gastroenterology 126：903-913，2004；Hochman，Circulation 107：2998-3002，2003)。因此，例如钴啉醇酰胺的NO清除剂可用于这些 病症。
因此，在某些方面，本发明的方法可用于治疗和预防败血症、慢性肝 衰竭、肝硬化、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、肝硬化性心肌病、 血液透析相关的低血压、心源性休克、缺血-再灌注损伤、缺氧，及创伤。
B.氰化物中毒
本发明的方法涉及治疗和预防受治疗者由过量氰化物的存在(即：氰 化物中毒)而引起或加重的疾病状态，包括对受治疗者进行药学有效量的 钴啉醇酰胺或其生物活性衍生物或类似物的给药。
本发明的方法也涉及缓解受治疗者由过量氰化物的存在而引起或加 重的疾病状态的症状，包括进行药学有效量的钴啉醇酰胺的给药，其中所 述受治疗者被诊断为遭受由过量NO的存在而引起或加重的疾病状态发 展的痛苦或处于由过量NO的存在而引起或加重的疾病状态发展的危险。
氰化物气体在燃烧任何含碳和氮的材料期间被产生，且因此在燃烧 纸、羊毛、丝及塑料期间产生(Alcorta，R.2004)。
烟吸入
氰化物气体在燃烧任何含碳和氮的材料期间被产生，且因此在燃烧 纸、羊毛、丝及塑料期间产生。火灾的大部分受害者死于烟吸入，且烟雾 中两种最多的毒气是氰化物和一氧化碳(Alcorta，JEMS 29：suppl-15，2004； Esposito与Alarie，J.Fire Sci.6：195-242，1988；Alarie，Crit Rev.Toxicol.32： 259-289，2002；Silverman等人，J.Trauma 28：171-176，1988)。火灾的大部 分受害者死于烟吸入，且烟雾中两种最多的毒气是氰化物和一氧化碳 (Alcorta，JEMS 29：suppl-15，2004；Esposito与Alarie，J.Fire Sci.6：195-242， 1988；Alarie，Crit Rev.Toxicol.32：259-289，2002；Silverman等人，J.Trauma 28：171-176)。随着出现在建筑中的更多基于合成的材料的使用，氰化物 已在住宅和工业火灾期间的死亡中承担渐增的重要性。
吸烟者
氰化物从烟草烟雾中产生，且已知吸烟者的血清和尿具有高的硫氰酸 根(SCN-)(氰化物的直接分解代谢产物)浓度(Michigami等人，Analyst 113： 389-392，1988；Abou-Seif，J.Biochem.Toxicol.11：133-138，1996)。确实， 血清和尿的硫氰酸根水平已被用于临床研究中区分吸烟者和非吸烟者，并 进行估计吸烟者消耗的香烟量。硫氰酸根通过硫氰酸生成酶从氰化物产 生，其在肝和呼吸道上皮中具有高浓度。硫氰酸根可被认为是拟卤化物， 且其对于过氧化物酶，特别是髓过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶， 及乳过氧化物酶是一种非常好的底物(Zhang等人，Blood 99：1802-1810， 2002；van Dalen与Kettle，Biochem.J.358：233-239，2001；Scanlon等人， Atherosclerosis 121：23-33，1996；Exner等人，Free Radic.Biol.Med.37： 146-155，2004)。在过氧化物酶反应中，H2O2被消耗，且在形成硫氰酸 根、低硫氰酸根(OSCN-)的情况下，氧原子被转移至受体。低硫氰酸根是 一个比较弱的氧化剂，但除低硫氰酸根外，更有效力的氧化化合物是在硫 氰酸根与H2O2的反应中生成的，特别是氰酸根(OCN-)、低硫氰酸 (HOSCN)、氰基亚硫酸(HO2SCN)，及氰基硫酸(HO3SCN)。这些化合物各 自可氧化血液中的低密度脂蛋白(LDLs)；被氧化的LDLs导致形成脂纹和 动脉中的粥样斑，并因此导致动脉粥样硬化(Zhang等人，Blood 99： 1802-1810，2002；van Dalen与Kettle，Biochem.J.358：233-239，2001； Scanlon等人，Atherosclerosis 121：23-33，1996；Exner等人，Free Radic.Biol.Med.37：146-155，2004)。有大量的流行病学数据提示在吸烟者 中增加的动脉粥样硬化疾病可能来自他们增加的硫氰酸根水平，且低硫氰 酸根和其他被氧化的硫氰酸衍生物的产生可能是增加的动脉粥样硬化形 成的基础。
慢性肾功能衰竭
在慢性肾功能衰竭的患者与血液透析的住院患者中，血清硫氰酸根水 平也增加(Hasuike等人，Nephrol.Dial.Transplant.19：1474-1479，2004)。 氰化物存在于一些食物中且还可通过生氰的细菌在肠中产生。推测在肾衰 竭中增加的硫氰酸根水平的基础是因为在自氰化物的正常生成率情况下 降低的尿分泌。因为不明的原因，硫氰酸根看起来通过血液透析被不充分 地除去。如同吸烟者，血液透析和肾衰竭患者在动脉粥样硬化性心血管疾 病中具有显著的增加，且对此的基础可能源自通过针对吸烟者进行描述的 机理所增加的硫氰酸根水平。因此，通过降低硫氰酸根水平，钴啉醇酰胺 可用于烟吸入的治疗，以及在吸烟者中降低动脉粥样硬化的风险，还可用 于肾衰竭患者。
在某些方面，本发明的方法也可用于治疗血液透析患者。在其他方面， 本发明的方法可用于治疗囊性纤维病，以及治疗由大规模毁灭性武器产生 的过量氰化物。
4.药物组合物的制剂与给药
用于本发明的方法的组合物可采用任何导致活性剂与患者体内药剂 的一个作用部位或多个作用部位相接触的方式进行给药。所述化合物可作 为单独的治疗剂或与几种治疗剂结合，采用与药物制剂协同加以使用的任 何常规方式进行给药。例如：它们可作为药物组合物中唯一的活性剂进行 给药，或它们可与其他治疗活性成分联合使用。
所述化合物优选地在所选的给药途径和所述的标准药物实践基础上 与所选择的药物载体结合，例如在最新版的Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA(″Remington′s″)中，其全部内 容通过引用并入本申请。
本发明的化合物可按适合所选的给药途径(如：口服的)的许多剂型 给药于哺乳动物宿主。其他可接受的给药途径是：肠胃外的包括静脉内的； 经上皮的包括经皮的、经鼻的、眼的、舌下的及口腔的；局部的包括眼的、 皮肤的、眼的、及直肠的；通过鼻吸入剂或气雾剂的鼻吸入或肺吸入；以 及直肠全身性系统的。
活性化合物可进行口服给药，如与惰性稀释剂或与可同化的食用载 体，其可被包在硬或软壳胶囊中，其可被压进片剂中，或其可直接与饮食 的食物混合。对于口服治疗给药，活性化合物可与赋形剂混合且被用于可 吸收的片剂、含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂 等。在这样的治疗上有用的组合物中的活性化合物的量为从约10毫克/天 至约1000毫克/天的活性化合物。
在本发明的一些方面，钴啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或类似物、 立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合 物、N-氧化物或其同形的结晶形式以下述水平进行给药：在至少约10毫 克/天的水平，更优选地在至少约100毫克/天的水平，甚至更优选地在至 少约500毫克/天的水平，且还甚至更优选地在至少约1000毫克/天的水平。
在本发明的一些方面，钴啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或类似物、 立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合 物、N-氧化物或其同形的结晶形式以下述水平进行给药：在少于约100 毫克/天的水平，更优选地在少于约500毫克/天的水平，甚至更优选地在 少于约1000毫克/天的水平，且还甚至更优选地在少于约2000毫克/天的 水平。
根据本发明的方法，所述钴啉醇酰胺化合物可以从约1毫克/天至约 1000毫克/天的剂量范围(及此处剂量范围和具体剂量的所有组合和亚组 合)给药于患者。
在本发明的一些方面，钴啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或类似物、 立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合 物、N-氧化物或其同形的结晶形式以下述时间进行给药：持续至少约1 天，更优选地持续至少约2天，甚至优选地持续至少约3天，且还甚至更 优选地持续至少约5天，且进一步更优选地持续至少约7天。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等可也含有下述的一或多种：粘合剂，如西 黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如 玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、 乳糖或糖精；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃油调味剂。当剂量单元形 式是胶囊，除上述类型的材料外，其可含有液体载体。各种其他材料可作 为包衣提供或修饰剂量单元的物理形式。例如：片剂、丸剂或胶囊可被虫 胶、糖或两者进行包衣。糖浆剂或酏剂可含有：活性化合物，作为甜味剂 的蔗糖，作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯与对羟苯甲酸丙酯，例如樱桃或橙 香料的染料和香料。当然，用于制备任何剂量单元形式的任何材料在所应 用的量上优选地是药用纯净的且基本无毒的。此外，活性化合物可被引入 缓释制剂和配方。
本发明的化合物，或其生物活性衍生物或类似物可以持续递送或缓释 机制进行给药，所述持续递送或缓释机制可在内部递送该制剂。本发明的 制剂可包括，例如，可生物降解的微球或胶囊或能持续递送肽的其他可生 物降解的聚合物构型。(例见：Putney，Nat.Biotechnol.16：153-157，1998)。
活性化合物也可肠胃外进行给药。作为游离碱或药理学上可接受的盐 的活性化合物的溶液可在水中制备，适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素 进行混合。分散相也可在丙三醇、液态聚乙二醇及其混合物及在油脂中制 备。在储存和使用的一般条件下，这些制剂可含有防腐剂以预防微生物的 生长。
适于注射使用的药物形式包括，例如，无菌水溶液或分散相及用于无 菌可注射的溶液或分散相的临时制剂的无菌粉末。在各种情况下，该形式 优选无菌及流体以提供便利的可注射性。该形式在生产和储存条件下优选 稳定的，且优选地被保存以抗微生物(例如：细菌和真菌)的污染作用。 该载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如：丙三 醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)，其合适的混合物，及植物油。适当的流 动性可通过下述而保持：例如通过使用包衣，如卵磷脂，通过在分散相中 保持所需粒径，及通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可通过各种抗 菌剂及抗真菌剂实现，如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫 柳汞等。在许多情况中，将优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。延长可 注射的组合物的吸收可通过使用延长吸收的药剂实现，例如单硬脂酸铝及 明胶。
无菌可注射的溶液可通过下述方法制备：在合适的溶剂中，引入需要 量的活性化合物，根据需要添加上述列举的各种其他成分，继之以过滤灭 菌。通常，分散相可通过在无菌载体中引入已灭菌的活性成分进行制备， 所述无菌载体含有那些以上列举的基本分散介质及必需的其他成分。在用 于无菌可注射的溶液制剂的无菌粉末的情况中，制剂的优选的方法可包括 真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自其先前无菌 过滤的溶液的任何其他理想成分。
本发明的治疗化合物可单独或与药学上可接受的载体掺入行给药。如 上文所述，活性成分与载体的相对比例可例如通过化合物的溶解度及化学 性质、所选的给药途径及规范的药学实践进行确定。
全身给药也可通过经粘膜的或经皮的方式。对于经粘膜的或经皮的给 药，适于将被透过的屏障的渗透剂可用于制剂中。这样的渗透剂是本领域 公知的，且包括，如：对于经粘膜给药，胆汁盐及夫西地酸衍生物。此外， 去污剂可用于促进渗透。经粘膜的给药可通过鼻腔喷雾或使用栓剂进行。 (例见：Sayani，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.13：85-184，1996。)对 于局部的、经皮给药，药剂可被配制成软膏剂、乳膏剂、软膏、散剂及凝 胶剂。经皮递药系统还可包括，例如：贴剂。
对于吸入法，本发明的化合物可使用本领域已知的任何系统进行递 送，包括干粉气雾剂、液体递送系统、空气喷射雾化器、喷射剂系统等。 例见：Patton，Biotechniques 16：141-143，1998；例如Dura Pharmaceuticals (San Diego，Calif.)，Aradigrn(Hayward，Calif.)，Aerogen(Santa Clara，Calif.)， Inhale Therapeutic Systems(San Carlos，Calif.)等的针对多肽大分子的产品 和吸入递送系统。例如：所述药物制剂可以气雾剂或烟雾剂的形式进行给 药。对于气雾剂给药，所述制剂可连同表面活性剂及喷射剂按细分的形式 被提供。在另一方面，递送所述制剂至呼吸组织的装置为吸入器，所述制 剂在其中汽化。其他液体递送系统包括，例如：空气喷射雾化器。
在制备本发明的药物制剂中，可使用和进行操作多种制剂修饰以改变 药代动力学和生物分布。许多改变药代动力学和生物分布的方法是本领域 的普通技术人员已知的。这样的方法的例子包括在小囊中保护本发明的组 合物，所述小囊由例如蛋白质、脂质(例如：脂质体，见下文)、碳水化 合物，或合成的聚合物(上文讨论的)组成。对于药代动力学的全面讨论， 例见：Remington′s。
所述药物组合物通常被配制成无菌、基本等渗的，且完全符合美国食 品与药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)的规定。
5.治疗方案与药代动力学
本发明的药物组合物可根据给药方法以多种剂量单元形式进行给药。 剂量是本领域技术人员熟知的。这样的剂量通常实际上是一般指导的且根 据特定的治疗背景、患者耐受性等进行调节。足以实现此目的的本发明的 化合物的用量被定义为“治疗有效量”。对此用途的剂量日程表及有效量， 即“给药方案”，将取决于许多因素，包括疾病或病症的发展阶段、疾病或 病症的严重度、患者健康的一般状态、患者的生理状态、年龄、药物配方 及活性剂的浓度等。在考虑针对患者的给药方案时，同样要考虑给药的方 式。所述给药方案也必须考虑药代动力学，即：该药物组合物的吸收率、 生物利用度、代谢、清除率等。例见：最新的Remington′s；Egleton，Peptides 18：1431-1439，1997；Langer Science 249：1527-1533，1990。
在治疗应用中，组合物被给药于遭受由过量一氧化氮(NO)或过量氰化 物的存在而引起或加重的疾病状态的患者，以至少部分地阻止所述病症或 疾病和/或其并发症。例如：在一方面，可溶的药物组合物用于静脉内(IV) 给药的剂量在几小时(通常1、3，或6小时)期间，将为约10毫克/小时 至约500毫克/小时，其可按间断的周期被重复几周。可使用相当高的剂 量(如：高达约1000毫克/小时的范围)进行给药，特别是当所述药物向 隔离的部位进行给药且不进入血流中时，例如进入体腔或进入器官的内 腔，如脑脊液(CSF)或关节腔或结构。
本发明提供的药物组合物包括与药学上可接受的载体共同配制的一 种化合物或几种化合物的组合，如钴啉醇酰胺与钴胺素。
在预防性的应用中，药物组合物或药剂被给药于对疾病或病症敏感、 或处于疾病或病症的危险中的患者(如：由过量一氧化氮引起的、败血症、 慢性肝衰竭、肝硬化、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、肝硬化性心 肌病、血液透析相关的低血压、心源性休克、缺血-再灌注损伤、缺氧， 及创伤、氰化物中毒，由过量氰化物引起的，患者为吸烟者、血液透析、 囊性纤维病、硝普盐，或由大规模毁灭性武器产生的过量氰化物)，其使 用量足以消除或减轻所述危险，减轻严重性，或延迟所述疾病的发作，包 括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症，及在所述疾 病的发展期间呈现的过渡的病理学表现。在治疗学的应用中，药物组合物 或药剂被给药于怀疑或已遭受这样一种疾病的患者，其使用量足以治疗、 或至少部分地阻止所述疾病的症状(生物化学的、组织学的，和/或行为 学的)，包括其并发症及在所述疾病的发展中的过渡的病理学表现。足以 实现治疗的或预防性的疗法的量被定义为治疗或预防的有效剂量。在预防 的及治疗方案中，药剂通常以若干剂量被给药直至取得足够的反应。一般 地，监测任何反应，并且如果所述反应开始减弱，那么给予定重复剂量。
6.有效剂量
将最适于预防或治疗的本发明的化合物的剂量将根据给药形式、选择 的特定化合物及经受治疗的特定患者的生理特征而不同。通常，最初可使 用小剂量且，如果必要，通过小的增量直至增加至达到所述情形的预期效 应。一般而言，口服给药可需要更高的剂量。
用于本发明的方法中的组合物，如包括钴啉醇酰胺，或其生物活性衍 生物或类似物，和另外的活性成分(如：钴胺素)的药物组合物可为如那 些描述于此的多种任何剂量形式，并也可按在此描述的多种方法进行给 药。在一优选的实施方案中，本发明的组合物被以单剂量形式(即：被共 同混合于一胶囊、片剂、粉末或液体等之中)进行共同配制。当组合物未 以单剂量形式被共同配制，所述钴啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或类似 物及另外的活性成分(如：钴胺素)可在相同时间或同时(即：一起)， 或按任何顺序给药。当未按相同时间或同时给药时，即当顺序给药时，优 选钴啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或类似物及另外的活性成分的给药发 生在间隔少于约1小时，更优选地少于约30分钟间隔，甚至更优选地少 于约15分钟间隔，且还更优选地少于约5分钟间隔。
尽管如上所述的其他给药途径，被意在包括在本发明的范围内，但优 选地，本发明的组合物的给药为经口的。尽管优选地钴啉醇酰胺、或其生 物活性衍生物或类似物及另外的活性成分均被以相同的方式进行给药 (即：例如都经口地)，但如果需要，它们可各自以不同的方式被给药(即： 例如组合物的一种成分可经口地给药，另一成分可由静脉内给药)。本发 明的组合物的剂量可根据多种因素而不同，例如特定药剂的药效学特征及 其给药模式与途径、受治疗者的年龄、健康状况及重量、症状的性质与程 度、同时治疗的种类、治疗的频率，及期望的效应。
特别是当作为单剂量形式被提供时，组合的活性成分间存在化学相互 作用的可能性。由于这个原因，本发明的组合物的优选的剂量形式被配制 成，这样尽管活性成分被以单剂量形式化合，但活性成分间的物理接触被 最小化(即：被降低)。
为了使接触最小化，产品被经口给药的本发明的一个实施方案，提供 一种组合物，其中一种活性成分是被肠溶包衣的。通过肠溶包衣一或多种 活性成分，可能不仅最小化了组合的活性成分间的接触，而且，可能控制 这些成分中的一种在胃肠道中的释放，这样这些成分中的一种不在胃中释 放，而在肠中释放。需要口服给药的本发明的另一实施方案，提供一种组 合物，其中活性成分中的一种被缓释材料包衣以在整个胃肠道起缓释的作 用，且也用于最小化组合的活性成分间的物理接触。此外，所述缓释成分 可被另外肠溶包衣以使这种成分仅在肠中释放。又一方法将包括组合物的 制剂，其中一种成分被用缓释的和/或肠溶释放的聚合物包衣，且其他成 分也用例如低粘度级别的羟丙基甲基纤维素(HPMC)或本领域已知的其他 合适的材料进行包衣，以进一步分隔活性成分。该聚合物包衣用来形成与 其他成分相互作用的一种附加屏障。
其中一种活性成分被肠溶包衣的本发明的组合物的剂量形式，可为片 剂形式，使得所述肠溶包衣成分与其他活性成分被混合在一起并接着压成 片剂，或使得所述肠溶包衣成分被压成一片剂层，且另一活性成分被压成 另一层。任选地，为了进一步分隔所述两层，可存在一或多种安慰剂层以 使所述安慰剂层在所述活性成分层之间。另外，本发明的剂量形式可为胶 囊形式，其中一种活性成分被压成片剂，或为许多微片、微粒、颗粒或小 丸母粒(non-pareils)的形式，其接着被肠溶包衣。这些肠溶包衣的微片、 微粒、颗粒或小丸母粒被接着置于胶囊中或连同颗粒化的其他活性成分被 压至胶囊中。
结合本发明的内容，这些以及其他最小化本发明的组合物的成分之间 接触的方法，是否以单剂量形式给药或以独立的形式但通过相同的方式在 相同的时间进行给药，将对本领域技术人员而言是显而易见的。
7.给药途径
用于治疗受治疗者由过量一氧化氮(NO)或过量氰化物的存在而引起 或加重的疾病状态的组合物可作为吸入剂经由肠胃外的、局部的、静脉内 的、经口的、皮下的、动脉内的、颅内的、腹膜内的、鼻内的，或肌内的 方式进行给药。给药也可为皮下的。其他途径可为等效的。另一通常的给 药途径为肌内注射。这种类型的注射最典型地在臂、肩，或腿部肌肉中进 行。在一些方法中，药剂被直接注射进特定组织，例如颅内注射或对流增 强的递送。肌内注射或静脉输注也被考虑。在一些方法中，本发明的组合 物被作为缓释组合物或装置例如MedipadTM装置进行给药。
8.药剂盒
用于本发明的方法的药剂盒也在本发明的范围内。容器的灭菌可使用 本领域技术人员熟知的常规灭菌方法进行。如期望的，材料的所述无菌容 器的灭菌可包含分离的容器，或一或多部件的容器，如通过UNIVIALTM二 部容器所示例的(从Abbott Labs，Chicago，Illinois可得)。所述钴啉醇酰胺， 或其生物活性衍生物或类似物，及任选的另外的活性成分可如上所述各自 分开，或被组合进单剂量形式。如果需要，这样的药剂盒还可包括一或多 种不同的常规药剂盒组成部分，如将对本领域技术人员来说是显而易见 的，如例如：一或多种药学上可接受的载体、另外的用于混合所述成分的 玻璃瓶等。作为嵌入物或作为标签的说明书也可被包括在本药剂盒中，其 指明将被给药的成分、给药指导方针，和/或混合所述成分的指导方针。
本发明的药剂可任选地与在治疗此处公开的疾病和疾患中至少部分 有效的其他药剂联合给药。
本发明提供了药物制品，如药剂盒，其包括：a)第一种药剂，其为 此处公开的本发明的一种化合物，为游离形式或药学上可接受的盐的形 式，及b)至少一种助剂(coagent)。所述药剂盒可包括针对其给药的说明 书。
典型实施方案
A.一氧化氮与钴啉醇酰胺
1.材料与方法
钴啉醇酰胺的生产与分析。在1ml浓盐酸中溶解约200mg的羟钴胺 素(OH-Cbl，Sigma Chemical Co.)，并在65℃加热8分钟以水解结合二甲基 苯并咪唑核苷酸部分至咕啉环的磷酸酯键[图1，(Hayward等人， J.Chem.Soc.6485-6493，1965)]。该溶液在冰上冷却并应用于1ml的C18 的固相萃取柱上(Fisher Scientific)。通过分别在水和10％的丙酮中分批洗 脱除去HCl和未处理的OH-Cbl，且二水钴啉醇酰胺(钴啉醇酰胺)产物 在20％丙酮中洗脱并在SpeedVac(真空离心蒸发浓缩器)(Savant Industries) 中减压浓缩。钴啉醇酰胺的纯度可通过与发表的光谱(数据)(Sharma等人， Biochemistry 42：8900-8908，2003，Baldwin等人，J.Chem.Soc.Dalton Trans. 217-223，1983，Ford等人，J.Inorg.Biochem.41：235-244，1991)进行比较的 分光光度法，以及通过在100mM NaH2PO4(pH 4.0)/15％甲醇(v/v)中(Ford 等人，J.Inorg.Biochem.41：235-244，1991；Boss，J.Biol.Chem.259： 2936-2941，1984)使用C18反相柱等度洗脱的高效液相色谱法(HPLC)进行 确定；柱流出液通过二极管阵列检测器在多波长进行检测。产率一般大于 80％或每批生成约160mg的钴啉醇酰胺。当在-20℃储存时，该钴啉醇 酰胺在光谱上和生物学上至少稳定一个月。
果蝇中马尔皮吉安氏小管分泌的评估。已设计出一种测量经由果蝇的 马尔皮吉安氏小管的流体转运的巧妙方法；小管分泌被NO供体和LPS 显著刺激，后者经由果蝇NOS基因的诱导(Broderick等人，Am.J.Physiol. 285：C1207-C1218，2003；Dow与Davies，Physiol.Rev.83：687-729，2003)。 简言之，从十只在冰上麻醉的野生型Oregon R成年果蝇切除两对马尔皮 吉安氏小管，各具有一个输尿管。该小管被固定在液体石蜡中，一小管的 远端被浸在10μl微滴的Schneider′s昆虫培养基中。在室温通过每10分钟 测量在输尿管的末端形成的液滴的大小来确定流体分泌率。持续三次10 分钟间隔进行测量基础流体分泌率，然后向Schneider′s培养基的微滴加入 10μM Deta-NO亲核复合体(Cayman Chemical Co.)或1μM LPS(Sigma Chemical Co.)；在三次以上的10分钟间隔后，将含有或不含10μM OH-Cbl 的10μM钴啉醇酰胺加至一些小管中，再持续30分钟。各数据点代表在 三次不相连的时机分析至少20对小管得到的平均值。在一些实验中，在 测量小管分泌率之前，果蝇靠添加250μM钴啉醇酰胺的饲料生长48小 时。所述添加的饲料通过加热标准果蝇饲料糊至约40℃使其液化产生， 且在加入钴啉醇酰胺后，使该饲料冷至室温。从果蝇中切除马尔皮吉安氏 小管，并如上所述，在缺失或存在1μM LPS情况下测量小管分泌率。
哺乳动物细胞的钴啉醇酰胺摄入的测量。为研究摄入哺乳动物细胞 的钴啉醇酰胺，通过加入2摩尔当量的[14C]-KCN(54mCi/mmol，Moravek Biochemicals)以形成[14C]-二氰基钴啉醇酰胺([57Co]-钴胺素不再市售可 得)来对钴啉醇酰胺进行放射标记。氰化物对钴啉醇酰胺的结合亲和力是 极高的(K总-1022M-1)(Pratt，J.M.(1972)Inorganic chemistry of vitamin B12(维生素B12的无机化学)，Academic Press，London-New York)，但为了确 保没有[14C]-KCN残留，pH值被降低至6以形成HCN(KCN的pKa为9.2)， 并接着向溶液中通入氩气以除去任何[14C]-KCN。[14C]-二氰基钴啉醇酰胺 产物的特定活性是104mCi/mmol(在348nm使用2.8×104的摩尔消光系 数)(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41：235-244，1991)。
在摄取研究中，在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改进的 Eagle(DME)培养基中培养的约1×106幼仑鼠肾(BHK)细胞在六孔板中生 长至亚融合。在37℃，用浓度从100nM至100μM的[14C]-二氰基钴啉醇 酰胺温育所述细胞5分钟。在温育结束时，用冰预冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)快速洗涤所述细胞4遍，用橡胶刮棒采集，并在10,000g离心15秒 进行收集。在500μl的0.1N的NaOH中溶解所述细胞沉淀，并通过液体 闪烁计数测量在样品等分部分中的放射性。钴啉醇酰胺摄取在温育2至 15分钟间是线性的，并为0.5-2×106细胞；在零时样品中得到的计数为 在2分钟样品中得到的计数的＜10％。
VASP磷酸化的评估。血管舒张剂刺激磷蛋白(VASP)在广泛的多种细 胞中表达(Reinhard等人，Trends Biochem.Sci.26：243-249，2001)；在对NO 及其他血管舒张剂如cGMP的反应中其被磷酸化，由于磷酸化延迟了蛋白 质的凝胶迁移率，通过蛋白质印迹法可方便地对磷酸化进行定量(Zhuang 等人，J.Biol.Chem.279：10379-10407，2004)。在12孔板中的约1×106大 鼠C6神经胶质瘤细胞或CS-54血管平滑肌细胞被用50ng如前所述的 VSV表位标记的VASP的表达载体转染；C6细胞另外接受25ng依赖于 cGMP的蛋白激酶(G-激酶)I″表达载体(Zhuang等人，J.Biol.Chem.279： 10379-10407，2004；Gudi等人，J.Biol.Chem.271：4597-4600，1996)。所述 细胞在添加10％FBS的DME培养基中培养36小时，并在最后的30分钟 期间，用指示浓度的NO供体PAPA-NO亲核复合体(Cayman Chemical Co.)处理，或在C6细胞情况下使用可透过膜的cGMP类似物 8-pCPT-cGMP(Biolog Inc.)处理，或在CS-54细胞情况下使用钙离子载体 A23187(Calbiochem)进行处理；所述培养物中的一些在接受所述PAPA-NO 亲核复合体的同时接受钴啉醇酰胺或人类血红蛋白(Danishpajooh等人，J. Biol.Chem.276：27296-27303，2001)]。所述细胞在含有1％十二烷基磺酸 钠的凝胶样品缓冲液中被原位提取，且溶胞产物被进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳和蛋白质印迹法。如前所述，使用小鼠抗VSV单克隆抗体(Sigma Chemical Co.)检测VASP(Zhuang等人，J.Biol.Chem.279：10379-10407， 2004)。显示的印迹被再现至少三遍。
亚硝酸盐与硝酸盐的测量。NO具有非常短的半衰期，且在生理条件 下被快速氧化成亚硝酸盐和硝酸盐。因此，最常用的评估NO产生的方法 之一是测量亚硝酸盐与硝酸盐的浓度，其通常使用Griess试剂进行 (Danishpajooh等人，J.Biol.Chem.276：27296-27303，2001；Idriss等人， J.Biol.Chem.274：9489-9493，1999)。在果蝇马尔皮吉安氏小管分泌系统 中和在C6与CS-54细胞中均测量亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。在果蝇系统 中，20例小管被温育在100μl的Schneider’s培养基中，且在无或存在10 μM钴啉醇酰胺的情况下时，所述小管用10μM Deta-NO亲核复合体或10 μM LPS刺激60分钟。在无或存在15μM钴啉醇酰胺时，C6与CS-54细 胞分别用15μM PAPA-NO亲核复合体与300nM A23187温育30分钟。 在所有情况中，在培养期结束时收集所述培养基，并使用来自Active Motif 的Nitric Oxide Quantitation Kit(一氧化氮定量试剂盒)进行测量，其为改 进的基于Griess试剂的方法。因为Deta-NO亲核复合体与PAPA-NO亲核 复合体将继续释放NO，甚至在小管和细胞的温育结束后也是如此，所以 在采集所述培养基后所有后续步骤立即在室温进行。
钴啉醇酰胺细胞毒性的评估。钴啉醇酰胺的不同浓度对BHK、CS-54， 及C6细胞，以及人包皮成纤维细胞和人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)的生 长的影响通过使用Model ZM Coulter Counter(库尔特粒度仪)(Coulter Electronics)，每天进行细胞计数，持续3天进行评估。除了HUVECs，所 有细胞在含10％FBS的DME中生长，HUVECs在含内皮细胞生长添加剂 及20％的FBS的M199培养基中生长(Kim等人，J.Biol.Chem.275： 33920-33928，2000)。细胞以每孔1.5-3×105细胞的初始密度被置于六孔 培养皿中。
甲硫氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶的体外活性的测量。如前 所述在含的100mM TrisHCl、5mM二硫苏糖醇、1mM EDTA及一种蛋 白酶抑制剂鸡尾酒(cocktail)的缓冲液(pH值7.4)中以约50×106/ml的密 度提取BHK细胞(Idriss等人，J.Biol.Chem.274：9489-9493，1999)。在无 或存在1-200μM钴啉醇酰胺情况下测量提取物中甲硫氨酸合酶及甲基丙 二酰辅酶A变位酶活性。根据Weissbach的方法(Weissbach等人， J.Biol.Chem.238：3318-3324，1963)在37℃测量甲硫氨酸合酶的活性，除 了从[14C]-甲硫氨酸产物中通过乙酸纤维素板上以丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5)显 层的薄层色谱分离[14C]-甲基四氢叶酸酯底物；底物和产物的Rf值分别为 0.26和0.44。对于甲基丙二酰辅酶A变位酶，提取物用5μM脱氧腺苷钴 胺素在37℃预培养10分钟以转化脱辅酶至全酶，继之以提取缓冲液10 倍稀释。根据Kikuchi的方法(Kikuchi等人，Clin.Chim.Acta 184：307-313， 1989)，在30℃测量酶活性，通过HPLC在C18反相柱上以含15％甲醇 的pH值为4.0的100mM磷酸钠洗脱，从琥珀酰辅酶A产物分离甲基丙 二酰辅酶A底物；底物和产物的量通过与已知的标准物比较进行确定。 两分析都是线性的，时间为从5-15分钟的，且蛋白质浓度为从0.1-0.5 mg/ml。
甲硫氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶的体内活性的评估。甲硫 氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶的活性在完整的BHK细胞中分别通 过下列的将[14C]-甲酸盐掺入嘌呤核苷酸及[14C]-丙酸掺入蛋白质进行评 估；这两种分析先前都已被用于酶的体内活性的代替测量(Danishpajooh 等人，J.Biol.Chem.276：27296-27303，2001；Willard等人，Hum.Genet.32： 277-283，1976)。简言之，约1×106的BHK细胞在六孔板中用10μCi[14C]- 甲酸盐温育90分钟或用20μCi[14C]-丙酸盐温育16小时；添加1-200μM 的浓度的钴啉醇酰胺，6小时后，添加甲酸盐标记物(持续总计8小时的 温育时间)及同时添加丙酸盐标记物。温育结束时，使用0.4N高氯酸提 取[14C]-甲酸盐温育的细胞，加热至100℃持续70分钟以转化嘌呤核苷酸 为碱基，并应用在Dowex 50阳离子交换柱上以从未掺入的[14C]-甲酸盐分 离嘌呤碱基(Boss与Erbe，J.Biol.Chem.257：4242-4247，1982)。使用冰 预冷的10％三氯乙酸提取[14C]-丙酸盐温育的细胞，加热至80℃持续30 分钟，溶解沉淀的核苷酸，并在再冷却至4℃后，在玻璃微纤维滤器上收 集沉淀的蛋白质(Boss与Erbe，J.Biol.Chem.257：4242-4247，1982)。两分 析随时间和0.5-2×106的细胞数都是线性的。
2.结果
钴啉醇酰胺的生产与分析。生产钴啉醇酰胺的标准方法以二水钴啉醇 酰胺开始，通过酸处理和暴露于强光除去氰化物(Hayward等人， J.Chem.Soc.6485-6493，1965)。如先前所述的，钴啉醇酰胺对氰化物具有 非常高的结合亲和力，并因此难于从钴啉醇酰胺制品中完全除去氰化物。 此外，经过延长时间的暴露会有可能改变咕啉环。羟钴胺素(OH-Cbl)被用 作起始底物，因为目的是生成用于生物系统的无氰化物的钴啉醇酰胺。二 甲基苯并咪唑核苷酸末端被通过简单的酸处理除去，且二水钴啉醇酰胺通 过在如描述于典型实施方案中的小样品制备柱上分批洗脱进行纯化。开始 于约200mg的OH-Cbl，得到约150-170mg的高纯度的钴啉醇酰胺。图2 显示了典型的钴啉醇酰胺制品在pH值3的吸收光谱，具有348nm的主 峰，且在494和520nm具有较小的相对相等的峰(Hayward等人，J. Chem.Soc.6485-6493，1965；Baldwin等人，J.Chem.Soc.Dalton Trans. 217-223，1983)；在含有污染物的制品中，所述494和520nm的峰倾向 于或者合并在一起成为一个宽峰或者所述520nm的峰变为主要的，且在 455nm的一个宽谱带变得明显(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41：235-244， 1991)。所述制品的高纯度的更多证据为：在pH值12，A344/A356的吸 光度比值为1.06，很好地处于先前报道的纯二羟钴啉醇酰胺的1.05-1.11 的范围中(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41：235-244，1991)，且当监测在 300和600nm之间的多波长时，钴啉醇酰胺产品的HPLC分析得到一个 单峰(Ford等人，J.Chromatogr.536：185-191，1991)。
钴啉醇酰胺作为NO清除剂在果蝇流体分泌模型中的效能。已清楚 的是果蝇对于人类疾病和药物开发是极好的模型(Tickoo与Russell， Curr.Opin.Pharmacol.2：555-560，2002；O′Kane，Semin.Cell Dev.Biol.14： 3-10，2003)。果蝇的马尔皮吉安氏小管为该昆虫的流体转运和调节渗透 的器官，相当于脊椎动物的肾。小管分泌率可从果蝇提取出小管后在体外 测量；NO经由可溶的鸟苷酸环化酶的激活来刺激分泌，从而增加细胞内 的cGMP浓度并激活cGMP/G-激酶转导途径(Broderick，Am.J.Physiol.285： C1207-C1218，2003；Dow与Davies，Physiol.Rev.83：687-729，2003)。研 究了钴啉醇酰胺对小管液分泌的影响，小管液分泌通过NO供体和LPS- 果蝇NOS基因的一种诱导物刺激。此外，为模拟整个动物中的病症，将 钴啉醇酰胺经由果蝇饲料给药于果蝇，接着测量LPS对小管液分泌率的 影响。
在用NO供体的实验中，用10μM Deta-NO亲核复合体处理小管， Deta-NO亲核复合体引起流体分泌率的快速和持续增加(图3，组A；在 30分钟基础期后将Deta-NO亲核复合体加入所有小管，如通过楔形标明 的)。向Deta-NO亲核复合体处理的小管加入10μM钴啉醇酰胺明显降 低了流体分泌率，几乎回复到基础的未受激的水平(图3，组A；在60 分钟将钴啉醇酰胺加入一些小管，如通过箭头及实心圈标明的)。单独向 所述小管加入钴啉醇酰胺是没有效果的。为增加经由小管的内源性NO产 生，使用LPS且观察到小管分泌的显著的刺激(图3，组B；在30分钟 加入LPS，如通过楔形标明的)。如在用Deta-NO亲核复合体的实验中， 钴啉醇酰胺快速降低小管分泌，使分泌率回复到接近基础状态(图3，组 B；在60分钟将钴啉醇酰胺加入一些小管，如通过箭头及实心圈标明的)。 因此，在果蝇整个器官系统中，钴啉醇酰胺清除细胞外给药的和细胞内产 生的NO。
作为这些研究的一部分，测量通过在Schneider’s培养基中温育小管 60分钟由Deta-NO亲核复合体释放的或LPS处理的小管所产生的NO的 量，并测量培养基中亚硝酸盐或硝酸盐的总量。在没有所述两种药物时， 在所述培养基中不能检测到亚硝酸盐或硝酸盐，提示了通过小管产生的 NO的基础水平是非常低的。用1、10或100μM的Deta-NO亲核复合体 处理小管增加了培养基中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度至超过所述药物起始 浓度的水平，其可能由于Deta-NO亲核复合体的每摩尔母体化合物释放两 摩尔的NO(图3C显示了对于10μM Deta-NO亲核复合体的数据)。所 述小管可能被暴露于略微较低的NO浓度，这是因为如前所述，在测量亚 硝酸盐和硝酸盐期间Deta-NO亲核复合体将继续释放NO。用10μM的 LPS处理小管诱导NOS水平也增加了培养基的亚硝酸盐和硝酸盐浓度， 但所述水平低于用10μM Deta-NO亲核复合体处理的小管中的水平(图 3C)。在Deta-NO亲核复合体和LPS处理的小管中，钴啉醇酰胺降低了 约50％结合的亚硝酸盐和硝酸盐的量(图3C)，其与我们的先前工作一 致，先前工作显示每个钴啉醇酰胺分子可中和两个NO分子，转化一个为 亚硝酸盐并与第二个结合(Sharma等人，Biochemistry 42：8900-8908， 2003)；因此，能期待亚硝酸盐和硝酸盐的最大50％的降低。
为确定是否全身进行钴啉醇酰胺的给药将影响小管流体分泌率，所述 果蝇被用含250μM的钴啉醇酰胺的饲料喂养两天；在该浓度，钴啉醇酰 胺没有明显的对果蝇的有害作用。在钴啉醇酰胺喂养的果蝇和用正常对照 饲料喂养的果蝇之间比较LPS刺激的马尔皮吉安氏小管的分泌率。与对 照组果蝇相比，在钴啉醇酰胺喂养的果蝇中小管分泌率降低了约50％(图 4)。此外，为提供钴啉醇酰胺作为NO清除剂的效果的进一步证据，这 些数据显示钴啉醇酰胺通过果蝇的肠被吸收并被转运至马尔皮吉安氏小 管。
哺乳动物细胞的钴啉醇酰胺摄入。一些NO清除剂，例如血红蛋白， 是单独在细胞外的且仅中和扩散出细胞的NO。果蝇的研究表明钴啉醇酰 胺可能被细胞吸收，但昆虫和哺乳动物的转运系统会不相同。为确定哺乳 动物细胞中是否钴啉醇酰胺可以到达细胞内的NO，制备了[14C]-二氰基钴 啉醇酰胺，并研究了其在BHK细胞中的摄取。在BHK细胞中，从100nM 至100μM的覆盖1000倍浓度范围的二氰基钴啉醇酰胺的放射性的累进 曲线线性增加提示二氰基钴啉醇酰胺的被动扩散和主动转运正在发生。因 为在细胞放射性中的累进的增加，所以不能计算KM。尽管可能钴啉醇酰 胺实际上不是被细胞吸收，而是仅与表面受体结合，但这好像不太可能， 这是因为放射活性以超过二氰基钴啉醇酰胺浓度的三个对数级(three log scale)连续增加。因此，这些数据提示在哺乳动物体系中，钴啉醇酰胺具 有用作细胞内的和细胞外的NO清除剂的可能。
钴啉醇酰胺在哺乳动物细胞中作为NO清除剂的效能。为确定钴啉 醇酰胺是否可在哺乳动物细胞中用作NO清除剂，在两种不同类型的培养 细胞中研究了NO刺激的VASP磷酸化。VASP是肌动蛋自动力学及细胞 进程例如细胞粘附和活力的一种重要调节剂(Zhuang等人，J.Biol.Chem. 279：10379-10407，2004)。其功能经由磷酸化进行调节，且通过cGMP/G- 激酶转导途径的活化，NO为VASP磷酸化的主要诱导物。为研究钴啉醇 酰胺对NO诱导VASP的磷酸化的影响，选择大鼠C6神经胶质瘤细胞与 CS-54血管平滑肌细胞，两者都具有活跃的NO/cGMP转导途径(Idriss 等人，J.Biol.Chem.274：9489-9493，1999；Chen等人，Mol.Cell.Biol.23： 4066-4082，2003)。在C6细胞中研究了钴啉醇酰胺对外源性产生的NO 的效应，且在CS-54细胞中研究了钴啉醇酰胺对内源性生成的NO的效应。
当C6细胞被用15至60μM的释放NO的化合物PAPA-NO亲核复合 体处理30分钟时，VASP磷酸化被诱导，正如通过具有降低的电泳迁移 率的VASP形式的产生所证明的(图5A，将无PAPA-NO亲核复合体的 泳道1与泳道3、5和7比较，分别显示15、30和60μM的PAPA-NO亲 核复合体)。在所有PAPA-NO亲核复合体浓度，向培养基加入100μM 钴啉醇酰胺，防止VASP磷酸化的增加(图5A，将泳道3、5和7与泳道 4、6和8相比，显示用钴啉醇酰胺和PAPA-NO亲核复合体处理的细胞)。 人类血红蛋白(100μM)产生与钴啉醇酰胺类似的结果，表明在实验条件 下，钴啉醇酰胺和血红蛋白是等效的NO清除剂。当以与PAPA-NO亲核 复合体等摩尔浓度使用时，钴啉醇酰胺也阻止VASP磷酸化的增加(图5， 泳道B显示各为30μM的PAPA-NO亲核复合体和钴啉醇酰胺，但类似的 结果也在15和60μM的各药剂中发现)。如在下文进一步讨论的， PAPA-NO亲核复合体释放2摩尔的NO，且因此如在果蝇马尔皮吉安氏 小管中，每个钴啉醇酰胺分子看来似乎中和两个NO分子。
因为可能钴啉醇酰胺可通过不同于NO清除的一些机理来抑制NO刺 激的VASP磷酸化，研究了钴啉醇酰胺对cGMP刺激的VASP磷酸化的影 响。检测了30μM浓度诱导VASP磷酸化的可透过膜的cGMP类似物 8-pCPT-cGMP，且没有发现从30至100μM浓度的钴啉醇酰胺的效应(图 5，组C，将仅CPT-cGMP的泳道2与CPT-cGMP加钴啉醇酰胺的泳道3 比较)。因此，钴啉醇酰胺不妨碍G-激酶的活化或VASP的磷酸化，且 因此，其看来似乎经由NO清除起作用。
因为钙活化I型和III型NOS，所以CS-54细胞用钙离子载体A23187 处理以增加内源性NO的产生。A23187被发现增加VASP磷酸化(图5D， 比较泳道4与泳道1)，而钴啉醇酰胺显著地减弱这种效应(图5D，比 较泳道3与泳道4)。因此，在哺乳动物细胞中，钴啉醇酰胺是一种有效 的细胞内和细胞外的NO清除剂。
如在马尔皮吉安氏小管的研究中，测量了亚硝酸盐和硝酸盐在C6和 CS-54细胞培养基中的浓度。如上所述，PAPA-NO亲核复合体，如同 Deta-NO亲核复合体，每摩尔母体分子释放两(摩尔)NO分子，且发现用 15μM的PAPA-NO亲核复合体处理C6细胞30分钟，增加了亚硝酸盐和 硝酸盐在培养基中的浓度至几乎30μM(当与未处理的细胞比较时，图 5E)。因为PAPA-NO亲核复合体的短半衰期——在37℃15分钟——绝 大部分的NO在温育期间被释放，且不在随后的亚硝酸盐和硝酸盐测量期 间释放。用300nM的A23187处理CS-54细胞提高了亚硝酸盐和硝酸盐 在培养基中的浓度至约12μM(图5E)。当15μM钴啉醇酰胺被加至 PAPA-NO亲核复合体处理的C6细胞或A23187处理的CS-54细胞时，亚 硝酸盐和硝酸盐浓度显著增加，CS-54细胞中具有比C6细胞中更大的效 应(图5E)。因此，两种细胞类型中的钴啉醇酰胺诱导的VASP磷酸化 降低通过亚硝酸盐和硝酸盐的降低表现，这提供了钴啉醇酰胺在降低 VASP磷酸化中作为NO清除剂作用的进一步的证据。
钴啉醇酰胺细胞毒性的研究。作为钴胺素类似物，钴啉醇酰胺通过干 扰钴胺素代谢或功能，可具有细胞毒性。此外，作为一种NO清除剂，钴 啉醇酰胺可干扰一些细胞类型中NO的前增殖(pro-proliferative)和抗凋亡 作用(Morbidelli等人，Am.J.Physiol.270：H411-415，1996；Ha等人，FASEB J.17：1036-1047，2003)。为研究钴啉醇酰胺在哺乳动物细胞中的潜在毒 性，进行了几组实验。钴啉醇酰胺对BHK、C6，及CS-54细胞，以及两 种原发的人类细胞系，即：包皮成纤维细胞和HUVECs的生长的影响； 包括后面的细胞以确定是否钴啉醇酰胺对原发的细胞比被评估的已建立 的细胞系有选择毒性。在1和50μM之间的浓度，钴啉醇酰胺对细胞生 长没有影响，但在50μM的浓度，虽然用50μM的最小量，钴啉醇酰胺 抑制全部五种细胞类型的生长(图6，显示了在BHK细胞，及C6和CS-54 细胞(插入)中，浓度为50、100及200μM的钴啉醇酰胺的数据；在两组 原发的细胞系中发现相似的结果)。在所有5种细胞类型的全部三个钴啉 醇酰胺浓度用等摩尔浓度钴胺素完全逆转了生长抑制(图6；显示了在 BHK细胞中200μM钴啉醇酰胺/钴胺素的数据(主要数据)。这些后面 的数据提示了毒性机理是通过钴胺素代谢或功能的竞争干扰，而不是通过 NO清除。因此，钴啉醇酰胺仅在比较高的浓度对细胞是有毒的，且其毒 性可被钴胺素完全逆转。
下组实验涉及确定钴啉醇酰胺是否抑制两种在哺乳动物细胞中的维 生素B12依赖的酶——甲硫氨酸合酶或甲基丙二酰辅酶A变位酶的活性。 在高达200μM的浓度，如在BHK细胞提取物中测量的，没有发现钴啉 醇酰胺对任一种酶活性的影响。甲硫氨酸合酶被假定为以全酶形式 (Oltean与Banerjee，J.Biol.Chem.278：20778-20784，2003)，且如典型实 施方案中描述的，甲基丙二酰辅酶A变位酶脱辅酶通过用5μM的脱氧腺 苷钴胺素温育，之后用10倍稀释提取物温育，被转化为全酶。因此，在 被试验的钴啉醇酰胺的最高浓度，所述钴啉醇酰胺的浓度为脱氧腺苷钴胺 素浓度的400倍。钴啉醇酰胺对任一种酶没有抑制与其他人所报道的关于 不同钴胺素类似物包括钴啉醇酰胺的研究相符合(Kolhouse等人， J.Biol.Chem.266：23010-23015，1991；Stabler等人，J.Clin.Invest.87：1422- 1430，1991)。
在最后一组实验中，评估了在[14C]-甲酸盐掺入嘌呤核苷酸及[14C]-丙 酸掺入蛋白质后钴啉醇酰胺对甲硫氨酸合酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶 的体内活性的影响；前者的测定是通过叶酸盐途径的碳流量的测量并依赖 甲硫氨酸合酶活性，而后者的测定依赖甲基丙二酰辅酶A变位酶活性。 在两种测定中，100μM钴啉醇酰胺降低了约50％的放射性标记的掺入(图 7；实心柱是对于[14C]-甲酸盐掺入的数据，且空心柱是对于[14C]-丙酸掺入 的数据)。酶活性的抑制是时间依赖的，且在甲硫氨酸合酶的情况中，在 90分钟的钴啉醇酰胺暴露后观察到最小抑制，可测量最短的时间点；抑 制随时间累进地增加，且图7中的数据是针对总共8小时的钴啉醇酰胺暴 露。对于甲基丙二酰辅酶A变位酶，观察到了酶抑制的类似的时间依从 性，但经过更长的时间标度。如在生长研究中的，钴啉醇酰胺的毒性效应 被通过等摩尔浓度的钴胺素完全阻止(图7)。这些后面的数据显示钴啉 醇酰胺毒性的机理可能是通过干扰钴胺素代谢的某些方面(如还在讨论中 考虑的)。此外，因为甲硫氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶是仅有 的两种哺乳动物依赖钴胺素的酶，钴胺素逆转的数据显示[14C]-甲酸盐和 [14C]-丙酸掺入法准确地反映了这两种酶的体内活性。
钴啉醇酰胺在存在钴胺素时作为NO清除剂的效能。尽管可能以无毒 的浓度使用钴啉醇酰胺，然而了解是否当清除NO时可共同使用钴啉醇酰 胺和钴胺素是有用的。钴胺素本身是一种弱NO清除剂(Greenberg等人， J.Pharmacol.Exp.Ther.273：257-265，1995)，且预期不会干扰钴啉醇酰胺 的NO清除。OH-Cbl对钴啉醇酰胺的NO清除没有影响，对果蝇马尔皮 吉安氏小管中的小管液分泌(图3，组A和B，比较单独钴啉醇酰胺的实 心圈与钴啉醇酰胺加钴胺素的实心三角)或对哺乳动物细胞中的VASP磷 酸化(图5，组B，比较仅钴啉醇酰胺的泳道4与钴啉醇酰胺加钴胺素的 泳道5)均无影响。钴啉醇酰胺加钴胺素的组合，类似于仅用钴啉醇酰胺， 对通过8-pCPT-cGMP诱导的VASP磷酸化没有影响(图5，组C，比较 泳道3和4)。
3.讨论
从1978年NO最初被描述为内皮源性舒张因子，已清楚的是NO具 有许多生理作用(Lloyd-Jones与Bloch，Annu.Rev.Med.47：365-375，1996； Ignarro与Murad，(1995)Nitric oxide.Biochemistry，molecular biology and therapeutic implications，Academic Press，San Diego；Hlsher，Trends Neurosci.20：298-303，1997)。还已清楚的是NO促成包括败血症性休克 和出血性休克、肝性脑病、肝肾综合征、血液透析相关的低血压及缺血- 再灌注损伤的一些疾病状态的病理生理学(Shah等人，Gastroenterology 126：903-913，2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.66：53-57，2004； Pfeilschifter等人，Pflugers Arch.442：479-486，2001)。在这些疾病的大部 分中，异常高的NO产生诱导严重的血管舒张和血管加压药难治性低血 压。iNOS的显著增加成为败血症中NO产生提高的基础(Moncada与Higgs， New Eng.J.Med.329：2002-2012，1993)，且非选择性NOS抑制剂增加了 败血症的动物模型的血压，但已具有对动物和人类中的败血症相关的死亡 率的混合的影响(Kim与Greenburg，Shock 17：423-426，2002；Vincent等人， Am.J.Respir.Crit.Care Med.161：1781-1785，2000)；这可部分地涉及导 致微血管的血管收缩及组织和器官灌注减少的eNOS抑制(Spain等人， J.Trauma 36：720-725，1994；Wright等人，Cardiovasc.Res.26：48-57，1992； Shultz与Raij，J.Clin.Inves 90：1718-1725，1992；Harbrecht等人， J.Leukoc.Biol.52：390-394，1992；Tribl等人，Am.J.Physiol 286：H340-H345， 2004)。选择性iNOS抑制剂应避免非选择性抑制剂遇到的一些问题，但 在一些组织中iNOS表达可为功能上重要的，如已对于肌细胞iNOS发现 的(Poon等人，Circulation 108：1107-1112，2003；Ichinose等人，Am.J. Physiol.285：H2524-H2530，2003；Szabo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91： 12472-12476，1994；Liaudet等人，J.Infect.Dis.177：127-132，1998；Price等人， Eur.J.Pharmacol.472：111-118，2003)。因此，甚至选择性的iNOS抑制 剂也可导致细胞和器官中的机能障碍变化，且一些小组的工作人员已力劝 在败血症中小心使用任何类型的NOS抑制剂(Vincent等人，Am.J.Respir. Crit.Care Med.161：1781-1785，2000，Hotchkiss等人，Lancet 339：434-435， 1992；Cobb，Crit.Care Med.27：855-856，1999)。
因此，明确需要可降低NO水平而不具有NOS抑制剂伴随的毒性的 药剂。NO清除剂具有下述理论上的优势：即仅中和部分与所述药剂接触 的合成前NO，而不直接地干扰NOS功能(Kim与Greenburg，Shock 17： 423-426，2002；Heneka等人，J.Clin.Invest 99：47-54)。已鉴定了一些NO 清除剂，但不是所有都被细胞吸收，且有些，特别是游离血红蛋白，显示 出不能接受的毒性(Braun等人，J.Exp.Med.131：443-460，1970)。因此， 看来似乎将需要非毒性的NO清除剂，其在临床上及实验室中均可被使 用。
在果蝇小管分泌模型及两种类型的培养的哺乳动物细胞中，发现钴啉 醇酰胺是一种有效的NO清除剂。在两种系统中，每个钴啉醇酰胺分子看 来似乎中和超过一个的NO分子，其符合我们先前的体外工作(Sharma 等人，Biochemistry 42：8900-8908，2003)。而所述先前的工作是在含水缓 冲液中进行的，当前工作是在含血清的培养基中进行，并发现钴啉醇酰胺 牢固地结合牛和人类的血清清蛋白。因此，钴啉醇酰胺对血清清蛋白的结 合看来似乎不妨碍其清除NO的能力。
在钴胺素的细菌生物合成期间，二甲基苯并咪唑核苷酸末端被最后加 入，且因此在钴胺素生物合成中，钴啉醇酰胺为次末级前体。因为其在钴 胺素合成中的位置，钴啉醇酰胺已显示污染细菌维生素B12制品，并在动 物组织和人类血清中存在(Kondo等人，J.Clin.Invest 70：889-898，1982； Kondo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 77：817-821，1980；Kolhouse等人， N.Engl.J.Med.299：785-792，1978)。在人类的类咕啉肝肠循环研究中，发 现钴胺素类似物，其主要是钴啉醇酰胺，构成总的胆汁类咕啉的45％(El Kholty等人，Gastroenterology 101：1399-1408，1991)。在向家兔进行肠胃 外给药后，钴啉醇酰胺和钴胺素的药代动力学的详细研究显示：通过肝脏 保留的钴啉醇酰胺比钴胺素多，但这两种类咕啉的尿和粪排泄是相似的 (Kolhouse与Allen，J.Clin.Invest 60：1381-1392，1977)。钴啉醇酰胺与血 液中的主要的钴胺素结合蛋白——钴胺素传递蛋白II弱结合，但其与先前 提到作为R粘合剂的另一重要的钴胺素结合蛋白——结合咕啉牢固结合 (Fedosov等人，Biochemistry 34：16082-16087，1995；Kanazawa等人， Proc.Soc.Exp.Biol.Med.183：333-338，1986；Fedosov等人，J.Biol.Chem.277： 9989-9996，2002)。因此，在血清和组织中钴啉醇酰胺的存在，及其药代 动力学类型，可能可归因于其对于结合咕啉以及还可能清蛋白的高度的结 合亲和力。
先前的研究已发现钴啉醇酰胺对哺乳动物细胞具有很小的毒性或无 毒性，但这些研究是在药物的低的微摩尔或亚微摩尔的浓度进行的 (Stabler等人，J.Clin.Invest.87：1422-1430，1991；Kondo等人，Int.J.Hematol. 56：167-177，1992；Weinberg等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.246： 393-397，1998)。类似地，未发现钴啉醇酰胺在低的微摩尔浓度对哺乳动 物细胞的毒性，但在约50μM的浓度开始观察到毒性。因为每个钴啉醇 酰胺分子可潜在地中和两个NO分子(Sharma等人，Biochemistry 42： 8900-8908，2003)，因此钴啉醇酰胺在显示出明显的毒性前可能能够中和 上至100μM的NO浓度。除了在NO的药理学给药期间，而在生理条件 下，任何时候NO的浓度都不可能超过10μM(Pfeilschifter等人，Pflugers Arch.442：479-486，2001；Clancy与Abramson，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.210： 93-101，1995；Poon等人，Circulation 108：1107-1112，2003)。此外，钴胺 素被发现完全阻止钴啉醇酰胺毒性，且在果蝇马尔皮吉安氏小管分泌模型 中或在哺乳动物细胞中，钴胺素不通过钴啉醇酰胺干扰NO清除，如前所 述，钴胺素本身是一种NO清除剂(Greenberg等人.，J.Pharmacol.Exp.Ther. 273：257-265，1995)。
在钴啉醇酰胺开始显示毒性的比较高的浓度，其看来似乎干扰钴胺素 代谢或功能。这个结论是基于下述发现：即钴啉醇酰胺对哺乳动物依赖钴 胺素的两种酶——甲硫氨酸合酶与甲基丙二酰辅酶A变位酶的体外活性 没有影响，而其在所述酶的体内分析中以时间依赖与钴胺素可逆转的方式 进行抑制。在体外分析中，所述酶为含钴胺素的全酶形式，表明钴啉醇酰 胺不能与结合的辅因子竞争。其他工作人员也发现在体外钴胺素类似物对 甲硫氨酸合酶全酶形式没有抑制，且事实上，钴啉醇酰胺可恢复甲硫氨酸 合酶全酶至完全活性，但不知道这是否在体内发生(Kolhouse等人， J.Biol.Chem.266：23010-23015，1991)。钴胺素类似物对甲基丙二酰辅酶A 变位酶的活性影响似乎未被研究，但5’-辅酶钴啉醇酰胺在恢复至甲基丙 二酰辅酶A变位酶的全酶功能中是无活性的(Chowdhury与Banerjee， Biochemistry 38：15287-15294，1999)。在体内分析中，酶活性的时间依赖 的抑制发生在几小时期间，提示新合成的酶是被抑制的；甲硫氨酸合酶的 半衰期为约12小时且甲基丙二酰辅酶A变位酶的半衰期看来似乎为约30 小时(Oltean与Banerjee，J.Biol.Chem.278：20778-20784，2003；Riedel等人， Biochem.J.341：133-138，1999)。因此，钴啉醇酰胺可干扰甲基钴胺素或 脱氧腺苷钴胺素分别掺入新合成的甲硫氨酸合酶及甲基丙二酰辅酶A变 位酶，或也许更可能，干扰羟钴胺素的细胞转运或其转化为两种辅酶形式。 关于钴胺素类似物的毒性机理的类似的结论被先前得出(Kolhouse等人.， J.Biol.Chem.266：23010-23015，1991)。不论钴啉醇酰胺细胞毒性的明确 机理是什么，其可通过钴胺素的同时给药被完全阻止。
因为其对氰化物的高结合亲和力，钴啉醇酰胺也可预期成为极好的氰 化物清除剂，且可用于氰化物中毒的临床状态中，如：烟吸入及硝普盐中 毒。钴胺素对氰化物的结合亲和力比钴啉醇酰胺小几个数量级，且已显示 在氰化物中毒中有效，并在法国被用于这一目的(Forsyth， J.Toxicol.Clin.Toxicol.31：277-294，1993；Hall与Rumack，J.Emerg.Med.5： 115-121，1987；Zerbe与Wagner，Crit.Care Med.21：465-467，1993)。
在果蝇马尔皮吉安氏小管及培养的哺乳动物细胞中，钴啉醇酰胺可为 一种有效的NO清除剂，并被用于动物研究中。其还可在过量NO的临床 状态中及在氰化物中毒中有益，并可在多种治疗方案中与钴胺素组合。
B.氰化物毒性与钴啉醇酰胺
1.材料与方法
钴啉醇酰胺的生产。如上所述，通过酸水解钴胺素(Sigma)生成钴 啉醇酰胺(Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)；在典型的 实施方案各处及此处公开的，“钴啉醇酰胺”及“钴胺素”指的是它们的羟基 衍生物。钴啉醇酰胺的纯度通过分光光度计测量进行评估，且通过在反相 柱上的高效液相色谱，经由洗脱液的洗脱，通过在348nm的紫外吸收监 测为一单峰(Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)。在10mM NaOH中溶解氰化钾(Fisher Scientific)，且如图9C中所示的实验，在使 用前稀释进pH 9.5、10mM的Na2CO3中。如上所述，室温使用来自布卢 明顿品系中心(Bloomington Stock Center)的野生型Oregon R果蝇 (Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)。如前所述，从美国 模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(CCL 16)得到的中 国仓鼠肺成纤维细胞(中国仓鼠细胞)在37℃培养(Yadava等人， J.Biol.Chem.277：21221-21230，2002)。斜角的33号计量注射针和2.5μl 注射器来自哈密尔顿公司(Hamilton Company)。
中国仓鼠细胞的呼吸活性的测量。如前所述，中国仓鼠细胞线粒体的 呼吸活性通过测量氧消耗进行评估(Yadava等人，J.Biol.Chem.277： 21221-21230，2002)。简言之，细胞通过胰蛋白酶消化进行采集，再悬浮 于pH 7.1的20mM Hepes-250mM蔗糖-10mM MgCl2中，并用100mg/ml 洋地黄皂甙透化处理。相当于～0.5mg的蛋白质的透化处理的细胞的量被 转至控温在37℃的代谢腔；该腔被Hepes-蔗糖-MgCl2缓冲液完全充满， 且小心确保没有气泡存在。细胞的氧消耗用Clark氧电极在基础条件下进 行极谱描记测量，在用5mM琥珀酸钠和3-磷酸甘油进行刺激，且在加入 250μM KCN后，继之以等摩尔量的钴啉醇酰胺和钴胺素
氰化物处理的中国仓鼠细胞的生长的测量。如前所述，细胞在添加 25mM半乳糖和10％胎牛血清的无葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle(DME) 培养基中生长(Soderberg等人，Somat.Cell Genet.5：225-240，1979)。在 培养基中平衡24小时后，加入100μM KCN(称为零时间)；在8和24 小时再加入KCN，且在48小时使用Model ZM Coulter Counter(库尔特粒 度仪)计数。对于一些培养物，在零时间加入10μM钴啉醇酰胺和钴胺素。
钴啉醇酰胺与钴胺素向果蝇的递送。钴啉醇酰胺与钴胺素的摄取。如 前所述，果蝇在含100μM钴啉醇酰胺或100μM钴胺素的饲料上生长 (Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)。简言之，通过加热 至40℃使标准果蝇饲料糊液化，且在加入钴啉醇酰胺或钴胺素达最终浓 度为100μM后，冷却所述饲料至室温。在实验中，在使用前，果蝇从第 一幼虫期在添加钴啉醇酰胺或添加钴胺素的培养基上生长。未从任一药剂 观察到毒性，甚至当果蝇在添加的饲料上生长超过10代时。
钴啉醇酰胺与钴胺素的注射。使用33号计量注射针和2.5μl注射器， 向在冰上麻醉的果蝇的胸腔中注射1μl的水，或溶解在水中的1μl的500 μM的钴啉醇酰胺或钴胺素。允许它们苏醒10分钟，并接着如下所述使 它们暴露于HCN。在一些实验中，它们首先暴露于HCN，并接着在暴露 于HCN的1分钟内进行注射。
钴啉醇酰胺与钴胺素的吸入。将市售可得的喷雾器(EasyMist，Prestige Medical)的接嘴与1×3cm(w×1)的塑料管构成的腔室连接；在腔室的近 端用带有药棉的纱布降低空气流率并使扰动最小化。果蝇被转至所述腔室 中，并在10分钟的平衡期后，含有100μM的钴啉醇酰胺或100μM的钴 胺素的喷雾器被启动。在2分钟喷雾之后，允许果蝇苏醒2分钟，并接着 将其转移至新的管形瓶中。
果蝇暴露于HCN及KCN。
暴露于HCN。将果蝇转移至10ml塑料管形瓶中，且在10分钟的平 衡期后，在管形瓶中通过在0.5×0.5平方厘米的华特门(Whatman)#1滤纸 上加样1ml的1mM或10mM KCN溶液，生成HCN，果蝇被立刻置于管 形瓶中。轻轻振摇该管形瓶20秒以迫使所述昆虫飞行并打开它们的呼吸 气孔，且在完全的HCN暴露1分钟后，除去该正方形纸。HCN引起所 有的果蝇，包括那些先前用钴啉醇酰胺或钴胺素处理过的，跌落到管形瓶 的底部，失去知觉。监测果蝇的活动，且那些在1小时之内能走或飞的被 认为苏醒了。对照实验显示点在华特门纸上的水，对果蝇没有影响，且用 10mM NaOH预先处理纸完全防止了任何随后的KCN毒性，表明纸被充 分酸化而产生HCN。与后者的点相一致，在对照实验中显示，通过在底 部有4M NaOH的管形瓶中放置滤纸持续1小时，点在该纸上(该滤纸被 悬吊在管形瓶中且不接触NaOH)的KCN，可在数量上恢复。因为不是 所有的KCN必需如HCN在所述果蝇的1分钟暴露期间被释放，且因为 一些生成的HCN气体可在室温冷凝成液体，HCN气体的所述浓度代表果 蝇被暴露的最大浓度。
用KCN注射。对于注射钴啉醇酰胺或钴胺素，如前所述，麻醉的果 蝇被注射1μl pH 9.5的10mM Na2CO3，或溶解在所述Na2CO3溶液中的1 μl 100μM KCN。
HCN的测量。通过在管形瓶底部0.2ml的100mM NaOH中收集 HCN，测量管形瓶中生成的氰化物气体，当心不要让含有KCN的纸接触 NaOH。通过在500μl 100mM的NaOH中提取果蝇来测量果蝇中的氰化 物。在两种情况中，如最初由Guilbault与Kramer所述，并由Gewitz等人 修改的对得到的NaCN进行测量，即：用对硝基苯甲醛和邻二硝基苯温育 NaCN，且在578nm测量有色产物(Guilbault与Kramer，Anal.Chem.28： 834-836，1966；Gewitz等人，Planta(Berl.)131：145-148，1976)。该分析在1 和15μM NaCN之间是线性的。
KCN对果蝇中的马尔皮吉安氏小管分泌的影响。果蝇的马尔皮吉安 氏小管是该昆虫的流体转运和调节渗透的器官，相当于脊椎动物的肾。如 前所述，测量小管分泌率(Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685， 2005)。简言之，从已在标准饲料或含100μM钴啉醇酰胺或钴胺素的饲 料上生长的10只成年果蝇中切除每只果蝇的两对马尔皮吉安氏小管。将 带有附随的输尿管的各小管对悬浮在矿物油中，将一小管的非输尿管末端 浸在10μl微滴的Schneider′s昆虫培养基中，且将其他小管的相应末端固 定在解剖针上。通过在室温每10分钟测量在输尿管末端形成的液滴大小 来确定经由浸在Schneider′s培养基中的小管转运的流体的量。在经过3 个10分钟间隔测量基础流体分泌率后，向Schneider′s培养基的小滴中以 100μM的最终浓度加入KCN，并测量另外3个10分钟间隔的流体分泌 率。在一些实验中，在加入KCN 10分钟后以100μM的最终浓度加入钴 啉醇酰胺。
2.结果
钴啉醇酰胺恢复氰化物处理的中国仓鼠细胞中的呼吸活性。先前已 显示在用琥珀酸盐和3-磷酸甘油透化处理的中国仓鼠细胞中，测量呼吸活 性准确的反映了细胞色素C氧化酶即线粒体的电子传递链的络合物IV的 活性(Way，Annu.Rev.Phannacol.Toxicol.24：451-481，1984)。氰化物是细 胞色素C氧化酶的有效抑制剂，且发现250μM的KCN几乎完全抑制中 国仓鼠细胞的呼吸活性(图8a)。在生理pH值，KCN将被转化为HCN， 这是因为后者的pKa为9.3；尽管HCN的沸点是25.7℃且实验在37℃进 行，但不可能任何生成的HCN都从缓冲液中逃逸出，这是因为在开始该 实验前温育腔被缓冲液完全充满。以与KCN等摩尔浓度加入钴啉醇酰胺， 诱导呼吸快速恢复至大约为对照的未经KCN处理的细胞的75％(图8a， 上图，及图8b，有交叉影线的柱)。以等摩尔为基础，钴胺素远不如钴 啉醇酰胺有效，诱导呼吸的42％的恢复(图8a，下图，及图8b，左斜纹 柱)。钴啉醇酰胺或钴胺素独自都不对氧消耗有任何影响。
钴啉醇酰胺恢复氰化物处理的中国仓鼠细胞的生长。培养的哺乳细 胞从糖酵解得到许多它们的ATP，且如果氧化磷酸化被抑制，所述细胞将 转变成无氧代谢(Scheffler，I.1986.Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells(在培养细胞中的碳水化合物代谢).Plenum Press，New York.77-109 pp)。因此，为研究氰化物对细胞生长的影响，含半乳糖的无葡萄糖培养 基被作为糖源(Soderberg等人，Somat.Cell Genet.5：225-240，1979)。因 为在生理条件下，KCN将被转变为HCN，且HCN是挥发性的，所以需 要将KCN连续加入培养细胞中以观察生长抑制。在零时间、8小时及24 小时用100μM KCN处理中国仓鼠细胞，在48小时抑制的生长为31±5％ (三次独立实验的平均值±S.D.)。在零时间向KCN处理的细胞加入10μM 钴啉醇酰胺，恢复它们的生长率至正常。推测这样低量的钴啉醇酰胺有效 的原因是大部分产生的HCN从培养基中蒸发。对于10μM钴胺素，发现 了类似的结果。
钴啉醇酰胺对果蝇中的氰化物气体的解毒。经由摄食的钴啉醇酰胺 的递送。果蝇目前被认为是人类疾病的出色模型，且在药物开发中的使用 渐增(Tickoo与Russell，Curr.Opin.Pharmacol.2：555-560，2002)。果蝇作为 一种飞行昆虫，具有比较高的代谢率；因此，预期其将对HCN高度敏感， HCN可在几秒钟内通过果蝇的螺旋纹气管的呼吸系统进入果蝇，且较缓 慢地历经几分钟通过跨角质层的转运(Biology of Drosophila(果蝇的生物 学)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1950)。暴露于浓度低至2.2ppm的 HCN 1分钟诱发了80％的果蝇死亡，且在22ppm，所有的果蝇死亡(图 9a，对于在正常饲料上生长的果蝇，分别为空心柱、在y轴零值上的实线)。 以在果蝇中约10μl的总的水体积为基础，在低和高暴露水平，果蝇中的 HCN浓度被发现分别为大约1和10μM(Biology of Drosophila(果蝇的生 物学)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1950)。当果蝇在含100μM钴 啉醇酰胺的饲料上生长若干天并接着暴露于2.2和22ppm的HCN，约90 ％的果蝇在该气体暴露中存活(图9a，交叉影线柱)。钴啉醇酰胺喂养 的果蝇的存活率类似于未暴露于HCN对照的果蝇的存活率，而以类似于 暴露于氰化物的果蝇的方式处理(图9a，实心柱)。因此，与适当的对 照果蝇相比，钴啉醇酰胺诱导了暴露于氰化物的果蝇的完全恢复。这将被 与100μM钴胺素喂养的果蝇相比，100μM钴胺素喂养的果蝇显示在2.2 ppm HCN恢复80％，而在22ppm仅恢复20％(图9a，左边的斜条纹柱)。 因此，在对果蝇的氰化物解毒上，钴啉醇酰胺比钴胺素有效得多。不能确 定在果蝇中取得的钴啉醇酰胺和钴胺素的浓度，这是因为它在描述于“方 法”中的高效液相色谱系统的检测限之下(100pmol)。
钴啉醇酰胺喂养的果蝇可暴露于22ppm HCN高达15分钟而没有死 亡率的任何显著增加，但暴露时间＞30分钟导致了所有果蝇死亡。这提 示除通过呼吸系统进入外，HCN能在更加延长的暴露期间，通过其他机 理进入果蝇，例如跨角质层的机理，从而获得更高的生物体内的水平。
作为暴露于氰化物的果蝇的另一方法，给果蝇注射溶解在10mM Na2CO3(pH 9.5)中的1μl的100μM KCN。假设KCN被均匀分布在果 蝇中，应获得约10μM的细胞内的KCN浓度，其与暴露于22ppm HCN 的果蝇中获得的浓度非常相似。仅注射Na2CO3对果蝇没有影响(图9b， 实心柱)，而注射KCN导致100％的死亡率(图9b，在y轴零值上的实 线)。靠100μM钴啉醇酰胺生长的果蝇对KCN相对耐受，显示65％的 存活率(图9b，交叉影线柱)，而靠100μM钴胺素生长的果蝇显示38 ％的存活率(图9b，左斜纹柱)。钴啉醇酰胺和钴胺素间的差别是统计 学上显著的(p＜0.01)。
钴啉醇酰胺经由注射的递送。因为在摄食研究中不能测量果蝇获得的 钴啉醇酰胺和钴胺素的浓度，所以给果蝇注入1μl的500μM钴啉醇酰胺 与钴胺素，得到果蝇中约50μM的浓度，并接着使所述果蝇暴露于22ppm 的HCN。类似于我们先前的发现，该浓度的HCN杀死几乎全部用水注射 的果蝇(图10a，空心柱)。这将被与注射了钴啉醇酰胺及钴胺素的果蝇 相比较，注射了钴啉醇酰胺及钴胺素的果蝇分别有65％和44％存活(图 10a，分别为在左侧的交叉影线柱和左斜纹柱)；钴啉醇酰胺和钴胺素间 的差别是统计学上显著的(p＜0.05)。
在HCN暴露的治疗中，将最有用的是具有一种解毒剂，其可被用于 暴露后，而不是暴露前，从而，实验设计被修改并首先使果蝇暴露于HCN， 继之给它们注射水、钴啉醇酰胺，或钴胺素。钴啉醇酰胺救起94％暴露 于HCN的果蝇，钴胺素救起62％暴露于HCN的果蝇，而注射水的果蝇 均死亡(图10a，与y轴零值上的实线相比，分别为在右侧的交叉影线柱 和左斜纹柱)。再次，钴啉醇酰胺和钴胺素间的差别是统计学上显著的(p ＜0.05)。与HCN暴露前相比，当在HCN暴露后进行钴啉醇酰胺和钴胺素 的给药时，更高的存活率的原因可反映程序上的差别：在HCN暴露前的 实验中，在注射钴啉醇酰胺/钴胺素前须在冰上麻醉果蝇，并接着使其苏 醒10分钟，而在HCN暴露后的实验中，果蝇在HCN暴露后被立即注射 钴啉醇酰胺/钴胺素，这是因为它们已经失去知觉了。在HCN暴露前实验 中的麻醉操作可降低随后的存活率，或钴啉醇酰胺/钴胺素在10分钟的苏 醒期间可能已被部分排泄。在HCN暴露后钴啉醇酰胺和钴胺素给药的高 存活率将是临床上有益的。
钴啉醇酰胺经由吸入的递送。在急性氰化物气体暴露中，经由胃肠途 径进行钴啉醇酰胺的给药将不太可能导致充分快速吸收有效，且经由注射 进行钴啉醇酰胺给药将需要有受过训练的卫生人员。对钴啉醇酰胺进行了 试验，当经由吸入提供时，其可降低氰化物毒性，这是因为这种方式的递 送是简单且快速的。开发出使用手持式喷雾器向果蝇经由吸入进行递送药 物的系统，并显示使用红色染料苋菜红使该染料经由果蝇的螺旋纹气管系 统被递送至内脏。据我们所知，过去没有工作人员经由喷雾法向果蝇给药。 即使在低流率，水喷雾法杀死约20％对照的未暴露于氰化物的果蝇，推 测是因为紊乱的空气流及剪力(图10b，实心柱)。当在水喷雾法后，果 蝇暴露于2.2ppm的HCN，80％的果蝇死亡(图10b，在左侧的每个柱)， 类似于先前在该HCN浓度发现的死亡率(图9a)。这将被与果蝇的仅18 ％的死亡率比较，其在HCN暴露前通过喷雾法接收钴啉醇酰胺(图10b， 在左侧的交叉影线柱)。因为后者的存活率类似于接收喷雾水未暴露于氰 化物的对照果蝇的存活率，所以该数据提示钴啉醇酰胺完全避免了死亡。 通过喷雾接受钴胺素的果蝇显示了免受HCN(伤害)的一些保护，具有55 ％的死亡率(图10b，在左侧的左倾斜纹柱)。
如上所述，如果钴啉醇酰胺可在氰化物气体暴露后，而不是暴露前被 给药，钴啉醇酰胺将是在氰化物气体暴露的情况中最有用的。所以，改变 实验设计且将果蝇暴露于2.2ppm HCN，并接着使它们经受水、钴胺素， 或钴啉醇酰胺的喷雾。发现钴啉醇酰胺在这些条件下如其在当在氰化物暴 露之前给药一样有效防止死亡(图10b，在右侧的交叉影线柱)。钴胺素 也显示出类似的如当其在氰化物暴露之前被给药时的结果，但用水喷雾的 果蝇显示较低的存活率，推测是因为在喷雾时它们已经被氰化物损伤了 (图10b，分别为在右侧的空心的及左斜纹柱)。
钴啉醇酰胺减少氰化物对马尔皮吉安氏小管分泌的抑制。昆虫的马 尔皮吉安氏小管的分泌是一个依赖ATP的过程，且因此，预期其可被氰 化物抑制(Dow与Davies，Physiol Rev.83：687-729，2003)。100μM的KCN 快速减少了果蝇马尔皮吉安氏小管的小管分泌率(图11a，实心圈)。已 被在时间零点用100μM钴啉醇酰胺或100μM钴胺素处理的小管显示了 对KCN的抑制效应的显著抵抗(图11a，分别为空心圈和三角)。钴啉 醇酰胺与钴胺素对如可在零至30分钟间隔观察的基础分泌率没有影响。 当相同的实验在被除去马尔皮吉安氏小管并测量小管分泌率之前已靠钴 啉醇酰胺生长的果蝇上进行时，发现KCN的毒性效应几乎完全逆转(图 11b，比较空心圈——喂养钴啉醇酰胺的果蝇与实心圈——对照的果蝇)。 在喂养钴啉醇酰胺的果蝇中的KCN毒性的更完全的逆转可能源于在后种 条件下钴啉醇酰胺的缓慢的细胞摄取；更长时间小管的钴啉醇酰胺预温育 可能不能完成，这是因为所述小管具有有限的实验时间。已靠钴胺素生长 的果蝇显示了中等程度的对KCN的抵抗(图11b，三角)。
为确定是否钴啉醇酰胺能逆转氰化物对小管分泌的抑制效应，在向小 管加入100μM KCN后，加入钴啉醇酰胺10分钟，并发现小管分泌率显 著提高(图11c，空心圈是钴啉醇酰胺处理的小管)。甚至在仅10分钟 的氰化物暴露后，观察到小管细胞的形态学变化，且这可以解释钴啉醇酰 胺未回复小管分泌至正常的原因。
3.讨论
过去的工作人员已指出HCN——在生理pH下氰化物存在的形式，与 纯化的细胞色素C氧化酶按两步进行反应：比较快速的形成一种酶-HCN 中间体，继之该中间体缓慢转化为一种稳定产物，可能是一种酶-氰化物 离子络合物(van Buuren等人，Biochim.Biophys.Acta 256：258-276，1972； Panda与Robinson，Biochemistry 34：10009-10018，1995)。第一步反应的 速率常数为0.03/秒，得到半衰期为23秒的中间体(van Buuren等人， Biochim.Biophys.Acta 256：258-276，1972；Panda与Robinson，Biochemistry 34：10009-10018，1995)。氰化物从最终产物的离解估计非常缓慢，≈10-6 /秒，且因此氰化物与细胞色素C氧化酶的总反应已被认为是不可逆的或 “半可逆的”(van Buuren等人，Biochim.Biophys.Acta 256：258-276，1972； Panda与Robinson，Biochemistry 34：10009-10018，1995)。使用钴啉醇酰 胺与钴胺素(其都具有对氰化物相对高的亲和力)，发现氰化物与细胞色 素C氧化酶的反应是可逆的，如通过测量在透化处理的中国仓鼠细胞中 的酶活性所表明的。此外，钴啉醇酰胺与钴胺素逆转了氰化物在中国仓鼠 细胞与果蝇中的致死效应，且钴啉醇酰胺很大程度地逆转了马尔皮吉安氏 小管转运-一种依赖ATP的过程。假设氰化物的这些后面的效应来自细 胞色素C氧化酶的抑制，这些数据提供了当在未受损的生物体或器官系 统评估时氰化物与细胞色素C氧化酶的反应可逆的证据。类似的结论已 从过去的工作人员得出，他们在氰化物中毒的其他动物模型以及遭受烟吸 入的患者的治疗中使用了钴胺素(Fortin等人，JEMS 29：suppl-21，2004； Hall与Rumack，J.Emerg.Med.5：115-121，1987；Posner等人，Anesthesiology 44：157-160，1976；Mushett等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.81：234-237， 1952)。
作为一级近似(first approximation)，通过钴啉醇酰胺与钴胺素的氰化 物解毒应遵循它们针对氰化物的相对亲和力常数，指示对氰化物的亲和力 比钴胺素高1010倍的钴啉醇酰胺应是一种比钴胺素更有效的氰化物解毒 剂。然而，细胞内的蛋白质能不同程度结合钴啉醇酰胺和钴胺素并妨碍得 出结合常数与解毒效应之间的明确关系。然而，在几乎所有进行的实验中， 钴啉醇酰胺比钴胺素更有效地进行氰化物解毒，提示了在结合亲和力和效 能间的直接关系。
在烟吸入受害者中的血液氰化物水平从2-250μM的范围变动，对于 高于40μM的水平与高死亡率有关(Baud等人.，N.Engl.J.Med.325：1761- 1766，1991)。这些数据与动物研究良好相关，根据动物种类，其已显示 了血液氰化物在20-100μM范围的LD50(Salkowski与Penney，Vet.Hum. Toxicol.36：455-466，1994)。因为发现钴啉醇酰胺比钴胺素更加有效地进 行氰化物解毒，人们预期较低量的钴啉醇酰胺可用于治疗烟吸入受害者。
当开发响应大规模毁灭性武器时，其将有助于具有可在暴露于毒剂后 进行给药的药物，这是因为通常预防疗法或许是不可能的。因此，发现钴 啉醇酰胺可在氰化物暴露后向果蝇施用且至少和氰化物暴露前施用同样 有效是有益的。可能甚至更加重要的是，钴啉醇酰胺可通过注射或吸入进 行给药，其将允许快速药物递送。
新近的数据提示氰化物可在一些疾病的发展中起作用。吸烟者具有高 水平的血和尿的氰化物及硫氰酸根水平，血液透析患者也是如此 (Abou-Seif，J.Biochem.Toxicol.11：133-138，1996；Hasuike等人，19： 1474-1479，2004)。在两种情况中，高的硫氰酸根水平可促成脂质氧化， 并因此促成动脉硬化，因为硫氰酸根是过氧化物酶的优选底物(Zhang等人， Blood 99：1802-1810，2002；van Dalen与Kettle，Biochem.J.358：233-239， 2001；Scanlon等人.，Atherosclerosis 121：23-33，1996；Exner等人，Free Radic.Biol.Med.37：146-155，2004)。粘液型铜绿假单胞菌(Mucoid Pseduomonas aeruginosa)是产生氰的，且从囊性纤维病患者的唾液中分离 出的细菌已显示产生氰化物(Carterson等人，J.Bacteriol.186：6837-6844， 2004)。因此，可能是氰化物促成了被铜绿假单胞菌感染的囊性纤维病患 者的肺破坏(Carterson等人，J.Bacteriol.186：6837-6844，2004)。对于这 些临床情况，具有一种可进行氰化物解毒，特别是一种在囊性纤维病的情 况中可通过吸入进行给药的药物将是有用的。
作为钴胺素的生物合成中的前体，钴啉醇酰胺是多种维生素制剂的污 染物，且至少在猪中，钴啉醇酰胺可不依赖于内因子被吸收穿过回肠 (Kondo等人，J.Clin.Invest 70：889-898，1982；Kanazawa等人， Proc.Soc.Exp.Biol.Med.183：333-338，1986)。一旦被吸收，钴啉醇酰胺牢 固地与结合咕啉结合(先前指的是R蛋白质以及钴胺素传递蛋白I和III)， 但与钴胺素传递蛋白II弱结合(Fedosov等人，J.Biol.Chem.277：9989-9996， 2002；Ermens等人，Clin.Mochem.36：585-590，2003；Fedosov等人， Biochemistry 34：16082-16087，1995)。因为结合咕啉和钴胺素传递蛋白II 的血清水平是类似的，显著量的钴啉醇酰胺可在血清中存在，且钴胺素类 似物包括钴啉醇酰胺已在动物及人类的血清、胆汁和组织中被检出，占总 的类咕啉的5-50％(Ermens等人，Clin.Biochem.36：585-590，2003；Kolhouse 等人，N.Engl.J.Med.299：785-792，1978；el Kholty等人，Gastroenterology 101：1399-1408，1991；Kondo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 77：817-821， 1980；Baker等人，J.Am.Coll.Nutr.5：467-475，1986)。静脉注射示踪量的放 射性的钴啉醇酰胺至家兔中，显示钴啉醇酰胺，与钴胺素相似，在几分钟 内被肝吸收，但不同于钴胺素的是，钴啉醇酰胺从肝释放得较慢，用150 小时；一旦从肝释放，钴啉醇酰胺与钴胺素的组织分布是相似的，且它们 都在尿和粪便中排泄(Kolhouse与Allen，J.Clin.Invest 60：1381-1392， 1977)。因此，虽有少数值得注意的例外，钴啉醇酰胺与钴胺素看来似乎 在哺乳动物系统中被类似地处理。
在3.7nM和200μM的浓度，钴啉醇酰胺分别对鼠白血病细胞、人类 单核细胞及淋巴细胞没有生长抑制效应(Kondo等人，Int.J.Hematol.56： 167-177，1992；Weinberg等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.246：393-397， 1998)。在整体动物中，当进行肠胃外给药时，钴胺素剂量40倍的钴啉 醇酰胺对童子鸡(baby chick)的生长没有影响；当经口施用时，它抑制小鸡 生长，提示其干扰钴胺素的吸收(Coates等人，Biochem.J.64：682-686， 1956)。类似地，当钴啉醇酰胺以4μg/h、持续14天的连续速率向鼠进 行皮下给药时，没有明显的毒性效应，钴啉醇酰胺也不抑制两种哺乳动物 钴胺素依赖酶：甲硫氨酸合酶或甲基丙二酰辅酶A变位酶(Stabler等人， J.Clin.Invest.87：1422-1430，1991)。对于培养的哺乳动物细胞，高达至少 50μM的钴啉醇酰胺是无毒的，且其毒性可被钴胺素完全逆转(Broderick 等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)。发现钴啉醇酰胺对甲硫氨酸合 酶或甲基丙二酰辅酶A变位酶的活性没有影响，提示了钴啉醇酰胺在干 扰钴胺素代谢(Broderick等人，J.Biol.Chem.280：8678-8685，2005)。进行 钴胺素和钴啉醇酰胺的给药应防止任何毒性，且向钴啉醇酰胺加入钴胺素 在氰化物解毒中应是有益的。
钴啉醇酰胺是一种对于氰化物解毒高度有效的药剂。其可能能够在多 种临床状态中使用，且可特别用作大规模氰化物中毒(即：工业事故或使 用WMD攻击而导致)的一种解毒剂。