纳滤浓缩纯化核酸酶P1及生产核苷酸的方法
专利汇可以提供纳滤浓缩纯化核酸酶P1及生产核苷酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种纳滤浓缩纯化核酸酶P1的方法，是选高活性的桔青霉菌株M71，在培养基中经液体深层 发酵 得到核酸酶P1；用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶P1的上清液；纳滤膜 透析 除去部分 水 、无机盐及色素。本发明还公开了用纳滤浓缩纯化核酸酶P1生产核苷酸的方法，是用浓缩纯化核酸酶P1降解核糖核酸；将降解液经过20nm～50nm的陶瓷膜 超滤 ；将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，除去无机盐、色素等杂物，得到浓缩的5′核苷 酸溶液 ；将所得到浓缩的5′核苷酸溶液经升膜浓缩塔进一步浓缩，使固形物含量为35～45％， 喷雾干燥 或 微波 干燥制成5′核苷酸粉状产品。具有工序简单、收率高、成本低、 质量 稳定、可大规模生产等优点。，下面是纳滤浓缩纯化核酸酶P1及生产核苷酸的方法专利的具体信息内容。
1. 一种纳滤浓缩纯化核酸酶P1的方法，其特征在于按如下步骤进行：a. 选高活性的桔青霉菌株M71，在培养基中经液体深层发酵得到核酸酶P1；b. 用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶P1的上清液；c. 纳滤膜透析除去部分水、无机盐及色素。
2. 根据权利要求1所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶Pi的方法，其特征在 于所述a步骤是以葡萄糖2°/。~10%为碳源，蛋白胨0.3%~0.8%为氮源。
3. 根据权利要求2所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶^的方法，其特征在于 所述a步骤的条件是：培养基所含成分及重量百分比是：葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HPO4 0.05%、 KH2P04 0.050/o、 MgSO40.04%、 CaCl2 0.040/o、 ZnSO40.02%; PH6.0; 培养条件：28°C~30°C，通风搅拌培养，培养25hr。
4. 根据权利要求2或3所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶Pi的方法，其特 征在于所述c步骤是经切割分子量为300〜10000道尔顿的纳滤膜透析。
5. 根据权利要求4所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶Pi的方法，其特征在 于所述c步骤是加入无离子水反复进行，使酶液浓缩倍数为5~16倍。
6. —种用如权利要求1〜5所述方法得到的浓縮纯化核酸酶Pi生产核苷酸 的方法，其特征在于按如下步骤进行-d. 用浓縮纯化核酸酶降解核糖核酸，底物核糖核酸质量浓度2%〜5°/。， 浓縮核酸酶Pi的用量为总体积1.4%〜4%， PH5.5~6.2，温度65°C〜70°C，降解 时间3〜5小时得降解液；e. 将降解液经过20nm〜50nm的陶瓷膜超滤；f. 将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，加入总体积 30%~50%的无离子水反复进行，纳滤除去无机盐、色素等杂物，浓縮并得到3~5 倍的5'核苷酸溶液；g. 将所得到浓縮3〜5倍的5'核苷酸溶液经升膜浓縮塔进一步浓縮，使固 形物含量为35~45%，喷雾干燥或微波干燥制成5'核苷酸粉状产品。
纳滤浓縮纯化核酸酶P,及生产核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸酶Pi的纯化的方法以及用纯化的核酸酶Pi生产核苷 酸的方法。尤其是使用现代的分子量级分离技术（纳滤)，将具有降解核糖核酸 成为5'核苷酸的核酸酶Pi浓縮、纯化成为高活性、稳定性的液体酶；使用这 种酶液制备了5'核苷酸溶液，并进一步使用分子量级分离技术（超滤和纳滤） 纯化、浓縮5'核苷酸溶液，以生产5'核苷酸成品。
背景技术-
5'核苷酸包含5'腺苷酸、5'鸟苷酸、5'胞苷酸、5'尿苷酸，它们不 仅是基因工程中合成生命的遗传物质核糖核酸（RNA)和寡核苷酸的基本原料， 而且是许多抗肿瘤、抗病毒药物的前体，在动物饲料中添加5'核苷酸具有提 高免疫功能、促进生长、代谢的功能，在农业上喷洒、灌溉、浸种使用，具有 促进植物生长、开花、结果增多的功效。从上世纪卯年代后国外大量报导5' 核苷酸是一类功能性辅助食品，具有显著的免疫功能，国内市场需求扩大，产 量明显提高。
同时生产四种5'核苷酸只能使用专一性的酶（核酸酶P》降解核糖核酸 的方法。迄今为止，在工业生产上要获得核酸酶Pi只有两条途径：第一是培养 一种菌株在细胞外分泌核酸酶Pn第二是从麦芽中浸提此酶。从麦芽中浸提涉 及麦芽资源的来源、保存、抽提体积庞大，工序繁复、酶活力不高，在工业生 产中使用不是最佳方案。对于核酸酶Pi的使用，国际上已发展到固定化酶、固 相化酶（干粉酶）及液体酶三种方式。以固定化酶及固体酶而言，不仅制备技 术要求很高，而且生产成本也很高，以干粉核酸酶Pi为例，进口价每公斤在 2500元〜3000元人民币，用于生产5'核苷酸，它将占主要原料成本价的30% 左右，不利于5'核苷酸的大规模生产。
目前，用液体核酸酶Pi生产5'核苷酸的方法都是直接用未经纯化的液体 核酸酶&降解核糖核酸得到5'核苷酸溶液，然后再经过离子交换树脂的分离 工艺进一步分离，去除杂质并得到5'腺苷酸、5'鸟苷酸、5'胞苷酸、5'尿 苷酸单体。虽然产品纯度很高，可达到98%~102%，但是却存在着成本高、收
率低的问题，也不利于5'核苷酸的大规模生产，尤其是对于不需要5'核苷酸 单体且不需要高纯度5'核苷酸产品的生产，此种方法更不适用。
发明内容：
本发明是针对现有技术所存在的成本高、收率低、不适合大规模生产等问 题，提供一种工序简单、收率高、成本低、质量稳定、适合大规模生产的纳滤 浓縮纯化核酸酶Pi及生产核苷酸的方法。
本发明的技术解决方案是： 一种纳滤浓縮纯化核酸酶Pi的方法，其特征在 于按如下步骤进行：
a. 选高活性的桔青霉菌株M71，在培养基中经液体深层发酵得到核酸酶
Pn
b. 用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶&的上清液；
所述a步骤是以葡萄糖2%~10%为碳源，蛋白胨0.3%~0.8°/。为氮源。 所述a步骤的条件是：培养基所含成分及重量百分比是：葡萄糖5%、蛋 白胨0.5%、 K2HP04 0.05%、 KH2P04 0.05%、 MgS04 0.04%、 CaCl2 0.04%、 ZnS04 0.02%; PH6.0;培养条件：28°C~30°C，通风搅拌培养，培养25hr。 所述c步骤是经切割分子量为300~10000道尔顿的纳滤膜透析。 所述c步骤是加入无离子水反复进行，使酶液浓縮倍数为5〜16倍。 一种用前述方法得到的浓縮纯化核酸酶Pi生产核苷酸的方法，其特征在于 按如下步骤进行：
d. 用浓縮纯化核酸酶^降解核糖核酸，底物核糖核酸质量浓度2%~5%， 浓縮核酸酶P!的用量为总体积1.4%~4%， PH5.5~6.2,温度65°C〜70°C，降解 时间3~5小时得降解液；
e. 将降解液经过20nm〜50nm的陶瓷膜超滤；
f. 将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，加入总体积 30%~50%的无离子水反复进行，纳滤除去无机盐、色素等杂物，浓縮并得到3~5 倍的5'核苷酸溶液；
g. 将所得到的浓縮3〜5倍的5'核苷酸溶液经升膜浓縮塔进一步浓縮，使 固形物含量为35~45%，喷雾干燥或微波干燥制成5'核苷酸粉状产品。
本发明是选一株桔青霉菌株M71 (尸emW〃/"mc/^7'"wm)，在深层发酵中产 生液体核酸酶Pp在发酵培养过程中细胞不结球，从而有高活力的酶表达，酶
活力可达1150〜1400单位/毫升；用纳滤法浓縮、纯化核酸酶Pp可除去部分水、 无机盐及色素，浓縮后单位酶活力提高，易于保存、酶活稳定；用此浓縮、纯 化核酸酶R对核糖核酸进行有效的降解及所用的分子量级的超滤、纳滤分离技 术，既可以除去杂蛋白、剩余核糖核酸、无机盐、色素等杂质，无需再用成本 高的离子交换树脂的分离工艺，即可制备完全满足纯度要求的5'核苷酸混合 体，具有工序简单、收率高、成本低、质量稳定、可大规模生产等优点。
具体实施方式：
实施例1:
a.液体核酸酶P,的制备：
菌种：桔青霉M71 c加/m/w)，上海工业微生物研究所公开销售。
培养基的成分及重量百分比：葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、 K2HPO4 0.05%、 KH2P04 0.05o/o、 MgSO40.04%、 CaCl2 0.04%、 ZnS04 0.020/0， PH6.0。
培养条件：28°C〜30°C，通风搅拌培养，培养25hr，酶活力1294U/ml。 b.纳滤浓縮核酸酶P"
将已培养好的发酵液，用常规篮式离心机离心除菌丝体后得到含核酸酶^ 的上清液；取2000ml上清液用10000道尔顿的纳滤膜进行透析，除去水分、 无机盐及色素，每片膜面积0.02m2的膜包，控制进口压力0.15Mpa，出口压力 0.05Mpa,经30分钟纳滤得浓縮酶液120ml，体积浓縮了 16.7倍，浓縮前酶活 力1188U/ml，浓縮后酶活力16740U/ml，酶活力每毫升是原酶活力的14.1倍。
纳滤膜切割分子量应保证达到满意的酶活力回收，并且浓縮酶在常温下保 存3个月酶活力保存在95%以上。最好是用切割分子量为300~10000道尔顿的 纳滤膜，为了达到纯化及浓縮目的可以加入适量无离子水继续纳滤，酶液浓縮 倍数可控制在5〜16倍范围内。
用所制得的浓縮型核酸酶Pp可高效降解核糖核酸成为5'核苷酸。
降解条件：
RNA溶液浓度2.5%，加酶量1.4% (V/V)，作用温度65°C~70°C，作用 PH5.5~6.2，降解时间4小时。
降解液经HPLC分析测定，降解率为78.65%。 实施例2:
a.核酸酶Pi的制备
菌种、培养基和培养条件同实施例1，培养23小时，酶活力1314U/ml。 b.纳滤浓縮核酸酶Pi
将已培养好的发酵液，用常规篮式离心机离心除菌丝体后得到含核酸酶Pj 的上清液；取685L上清液用300道尔顿、膜面积为30m2的纳滤机进行纳滤。 用时3小时，平均通量240L/hr，中途加纯水70L，控制压力l~1.2kg/cm2,电 导800us/cm2，得纳滤液110L，体积浓縮了6.23倍，每毫升酶活力是原酶活力 的5.9倍，达7776U/ml 。
浓縮酶在5"C〜2(TC贮藏，核酸酶Pi活力保存百分率如下表：
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