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用于治疗 口腔 疾病的类黄酮组合物

阅读：349发布：2023-01-18

专利汇可以提供用于治疗口腔疾病的类黄酮组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种包含两类特殊化合物——无取代B环类黄酮以及黄烷——的混合物在制备用于预防及治疗与口腔、牙龈及牙齿相关的疾病和病症的药物组合物中的应用。此组合物可以同时抑制环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的活性，并且可以在mRNA 水平减少正常、老化及损伤的牙周细胞和组织中细胞因子的合成。，下面是用于治疗口腔疾病的类黄酮组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物在制备用于预防或治疗口腔的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中所述无取代B环类黄酮分离自黄芩属中的一种或多种植物且含有黄芩苷，并且所述黄烷分离自金合欢或钩藤属中的一种或多种植物且含有儿茶素和表儿茶素。
2.至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物在制备用于预防或治疗牙龈或牙齿的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中所述无取代B环类黄酮分离自黄芩属中的一种或多种植物且含有黄芩苷，并且所述黄烷分离自金合欢或钩藤属中的一种或多种植物且含有儿茶素和表儿茶素。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中在所述组合物中的无取代B环类黄酮比黄烷的重量比例选自99∶1无取代B环类黄酮比黄烷到1∶99无取代B环类黄酮比黄烷的范围。
4.如权利要求3所述的应用，其中在所述组合物中无取代B环类黄酮比黄烷的重量比例为80∶20。
5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述无取代B环类黄酮选自具有下列结构的化合物中：
其中
+ -
R1、R2、R3、R4和R5独立地为-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-N(R)2、-N(R)3X、或者单个糖或多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫原子连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或多个糖的组合为戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、或己酮糖；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X为氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子或碳酸根。
6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述黄烷选自具有下列结构的化合物中：
其中
+
R1、R2、R3、R4和R5独立地为-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3-
X，前述取代基的酯或单个糖或者多个糖组合的糖苷，所述酯为没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰酯、羟基肉桂酰酯、三羟基苯甲酰酯或咖啡酰酯，且其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫原子连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或者多个糖的组合为戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖或己酮糖；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X为氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子或碳酸根。
7.如权利要求1或2所述的应用，其中所述无取代B环类黄酮和所述黄烷分离自选自以下组的植物部分：茎、茎皮、干、主干皮、嫩枝、根、根皮、嫩梢、种子、花及其他生殖器官、叶及其他气生部分。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述茎为块茎或根茎。
9.如权利要求1或2所述的应用，其中所述黄烷分离自选自以下组的植物属中：金合欢和钩藤。
10.如权利要求1或2所述的应用，其中所述无取代B环类黄酮分离自黄芩和/或木蝴蝶中，所述黄烷分离自儿茶和/或儿茶钩藤中。
11.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物以0.001到200mg/kg体重的剂量给药。
12.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物以在药物学可接受的载体中包含
0.001重量％到40.0重量％的所述无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的制剂给药。
13.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物的给药途径选自以下组中：气雾剂、栓剂、皮内、肌肉内和静脉内给药。
14.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物用于局部给药。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述组合物是利用选自以下组的方式给药：牙膏、凝胶、软膏、漱口水、口香糖、酊剂和饮料。
16.如权利要求1或2所述的应用，其中所述药物组合物包含赋形剂。
17.如权利要求1或2所述的应用，其中所述口腔、牙龈或牙齿的疾病或病症为牙周疾病，所述牙周疾病选自：牙龈炎、牙周炎、牙髓炎、白垢、菌膜、牙斑、牙结石和牙垢。
18.如权利要求1或2所述的应用，其中所述药物组合物包含佐剂或载体。
19.如权利要求1或2所述的应用，其中所述药物组合物包含控释载体。
20.如权利要求1或2所述的应用，其中所述口腔、牙龈或牙齿的疾病或病症为由于移植假牙、创伤、损伤、夜磨牙症、或肿瘤或其它退行性过程所引起的牙周病症。

说明书全文

用于治疗 口腔 疾病的类黄酮组合物

技术领域

[0001] 本发明总体而言涉及包含两类特殊的靶向于类花生酸(eicosanoid)和细胞因子途径的化合物——无取代B环类黄酮以及黄烷的混合物的新型组合物，其用于预防及治疗口腔、牙齿及牙龈的疾病和病症。具体而言，所述口腔、牙齿及牙龈的疾病和病症包括但不限于牙周病，例如牙龈炎、牙周炎、牙髓炎，由移植假牙(physical implantation of oral dentures)、创伤、损伤、夜磨牙症、肿瘤及其它退行性过程所引起的牙周病症；白垢、菌膜、牙斑、牙结石和牙垢。应用本文所述的组合物还可以提供以下好处：维持最佳的唾液生成和pH、最小化细菌生长、减少菌膜以及牙斑的形成、抑制牙齿脱钙和龋齿(蛀蚀)、促进矿质补充、形成健康的牙龈、洁白牙齿、保持健康口腔卫生及减少口腔恶臭(口臭)。

背景技术

[0002] 牙周病是某些或全部牙齿支持结构(齿龈、牙骨质、牙周韧带、牙槽骨及其它牙齿周围组织)的炎症和感染相结合的一类疾病。牙龈炎(牙龈)和牙周炎(牙龈和骨)是牙周病的两种主要形式。根据国家牙齿和颅面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research)发布的全国口腔信息(National Oral Information)，估计80％的美国成年人目前都患有某种形式的牙周病。当在一颗或多颗清洁牙齿上形成菌膜时开始生成牙周病。菌膜吸引需氧革兰氏阳性菌(大多为放线菌和链球菌)，它们附着于牙齿上形成菌斑。菌斑一天天加厚，潜在的细菌耗尽氧气且移动性的(motile)厌氧杆菌和螺旋体开始寄生于齿龈下部区域。由厌氧菌释放的内毒素引起炎症反应、牙龈组织损伤及甚至骨流失。牙周病经历个四个主要阶段，其特点如下所示。牙周病的破坏性影响超过了牙齿卫生和健康的范围，因为某些感染人群的肝、肾及大脑中发现了牙周病引起的微观损伤。

[0003] 牙周病的四阶段：

[0004]第一阶段炎症
第二阶段炎症、水肿、牙龈探诊出血
第三阶段炎症、水肿、牙龈探诊出血、释放脓疱—轻度到中度骨流失
第四阶段炎症、水肿、牙龈探诊出血、释放脓疱、移动性(motility)—严重骨流失[0005] 因牙周疾病引起的炎症主要与两种生物体系有关：类花生酸系统和细胞因子系统。花生四烯酸(AA)从细胞膜中的释放与代谢通过几种不同途径导致生成促炎(pro-inflammatory)代谢物。两种最重要的发炎途径都是由脂氧合酶(LOX)和环氧合酶(COX)酶介导的。这些平行通道分别导致白三烯和前列腺素的生成，它们在炎症反应的引发和发展中扮演重要角色。这些血管活性化合物为化学吸引素，其促进发炎细胞浸润入牙龈组织并使可能导致骨流失的炎症反应延长。因此，负责生成这些炎症介质的酶成为开发用于预防和治疗与口腔、牙齿和牙龈有关的疾病和病症的治疗性药物的目标。

[0006] 当网络局部激活时细胞因子系统在体内稳态中是十分强大的力量，并且细胞因子以表面结合或可扩散的形式在邻近发挥作用。但是，当细胞因子持续和/或全身产生时它就会产生炎症、感染、自身免疫和恶性疾病的迹象、症状及病理。TNF-α是由巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、NK细胞T和B细胞及肿瘤细胞产生的一种强力多效的细胞因子。IL-1β与TNF-α一同在炎症反应中起核心作用。将拮抗剂如IL-1ra(IL-1受体拮抗剂)、IL-1受体的可溶性片段、或TNF-α的单克隆抗体以及TNF的可溶性受体给药都会在炎症动物模型中阻断多种不同的急性或慢性反应。核因子κB(NFκB)是一种控制白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及其它多种蛋白质的基因表达的转录因子。其中某些拮抗剂开始作为抗炎剂应用于诸如败血病、牙周疾病及类风湿性关节炎的疾病中(Dinarello(2004)CurrOpin Pharmacol.4：378-385)。研究发现抗TNF-α抗体不仅显著缓解类风湿性关节炎，而且减轻炎性肠病克罗恩氏病(Maini和Feldmann.(2002)Arthritis Res.4 Suppl2：S22-8)。

[0007] 牙周韧带(PDL)细胞具有成骨细胞样特征并可分化成牙骨发生细胞或者成骨细胞谱系的细胞。这些细胞对于保持牙周组织的完整和再生非常重要(Somerman等，(1990)Arch Oral Bio.35：241-477；Pitaru等，(1994)J Periodontal Res.29：81-94)。由细菌建群引发的牙周组织慢性感染会诱导促炎细胞因子的合成，这些细胞因子潜在地影响PDL细胞的表型和功能。这些细胞因子不仅在感染部位激活和招募免疫细胞(Le和Vilcek(1987)J.Immunol.139：3330；Kunkel等，(1994)Ann，N.Y.Acad.Sci.730：134)，而且促使支持骨和韧带连接流失(Pitaru等，(1994)JPeriodontal Res.29：81-94)。例如，TNF-α经证实可以调节PDL细胞的成骨细胞样表型和功能(Agarwal等，(1998)Infect.Immun.66：932-937)。此外，TNF-α和IL-1β通过下调碱性磷酸酶(Kuroki等，(1994)Rheumatology33：224)及调节胶原蛋白、胶原酶、蛋白聚糖及前列腺素的合成(Agarwal等，(1998)Infect.Immn.66：
932-937)而改变成骨细胞的表型特征。

[0008] 在分离的PDL细胞中，IL-1β诱导表型改变(Agarwal等，(1998)Infect.Immun.66：932-937)。源于健康牙周组织的PDL细胞不识别细菌脂多糖(LPS)也不对LPS反应而产生促炎细胞因子。在经IL-1β处理后，PDL细胞失去其成骨细胞样特征而呈现对LPS反应的一种新型表型。因此，IL-1β是PDL细胞功能的重要调节因子，并引导这些细胞在感染过程中积极参与免疫反应。IL-1β刺激骨再吸收并抑制骨形成(Stashenko等，(1987)J Bone Miner Res.2：559-65；Nguyen等，(1991)LymphokineCytokine Res.10：
15-21；Tatakis(1993)J Periodontol(1991)64：416-31)。除此之外，IL-1β对TNF-α的骨再吸收作用有协同作用(Bertolini等，(1986)Nature319：516-18；van der Pluijm等，(1991)Endocrinology129：1596)。IL-1β在牙周炎病理进程中另一重要作用是诱导生成间质金属蛋白酶(MMP)(Havemose-poulsen和Holmstrup(1997)Crit.Rev.Oral.Biol.Med
8：217)。IL-1β引起齿龈成纤维细胞和PDL细胞中原胶原酶(procollagenase)的水平增加(Meikle等，(1989)J Periodontal Res.24：207-13；Lark等，(1990)Connect Tissue Res.25：49-65；Tewari等，(1994)Arch Oral Biol.39657-64)。此外，IL-1β刺激齿龈成纤维细胞中的纤溶酶原激活剂产生纤溶酶，这是若干间质金属蛋白酶的激活剂(Mochan等，(1998)J Periodontal Res.23：28-32)。此外，Stashenko及合作者报道了牙龈组织中IL-1β的水平与新近的(recent)附着丧失成正相关(Stashenko等，(1991)J Clin Periodontol18：548-54)。

[0009] TNF-α是免疫和炎症反应中另一种重要介质，并以可测得的量存在于活跃的牙周炎症反应区域(Rossomando等，(1990)Arch Oral Biol.35：431-34；Stashenko等，(1991)J Ciln periodontol18：548-54)。TNF-α改变PDL细胞的成骨细胞特性(Quintero等，(1995)J.Dent.Res.74：1802)。这通过其对LPS反应而表达其它促炎反应细胞因子如IL-1β、IL-6、和IL-8的能力而得到证实。TNF-α诱导成纤维细胞分泌胶原酶、软骨和骨组织再吸收，还与牙周炎中牙周组织的损伤有关(Elias等，(1987)J.Immunol.138：3812；Meikle等，(1989)J.Periodontal Res.24：207-13；Chaudhary 等，(1992)Endocrinology130：2528)。在静止巨噬细胞中，TNF-α诱导合成IL-1β和前列腺素E2。TNF-α还激活破骨细胞并因此诱导骨再吸收。TNF-α和IL-1β的骨再吸收作用有协同作用(van der Pluijm等，(1991)Endocrinology129：1596；Bertolini 等，(1986)Nature319：516-8；Johnson 等，(1989)Endocrinology124：1424)。

[0010] 经证实在牙周炎症损伤中，多种细胞如T细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞提高了IL-6在mRNA水平和蛋白质水平的表达(Kono等，(1991)J.Immunol.146：1812；Matsuki 等，(1992)Immunology76：42-47；Fujihashi 等，(1993)Am.J.Pathol.142：1239；
Yamazaki等，(1994)J OralPathol Med.23：347-53)。由于IL-6在人类B细胞反应中特别重要，人们推测在牙周炎损伤中观察到的B细胞/浆细胞膨胀可能是因疾患处IL-6生成增加所导致(Fujihashi等，(1993)J Periodontol64：400-406)。此外，IL-6在骨转换的局部调节中发挥重要作用(Lowik等，(1989)BiochemBiophys Res.Commun.162：1546-52；Ishimi等，(1990)J.Immunol.145：3297；Kurihara等，(1990)J.Immunol.144：4226)，而且似乎在雌激素缺乏引起的骨丢失中必不可少(Horowitz(1993)J Bone Miner Res.8：1163-71)。体外研究也表明用IL-6和可溶性IL-6受体同时处理小鼠的成骨细胞和骨髓细胞显著诱导破骨细胞的形成(Tamura等，(1993)PNAS90：11924)。而且，还提示IL-6可能通过刺激破骨细胞形成及破骨细胞再吸收活化从而作为自分泌和/或旁分泌因子在骨再吸收的病理状态发挥作用(Ohsaki等，(1992)Endocrinology131：2229)。这些发现提示在牙周炎的牙周组织损伤的病理过程中涉及IL-6。

[0011] 环氧合酶(COX)的抑制是大多数非甾体抗炎药(NSAID)的作用机制。存在两种不同的同种型COX酶(COX-1和COX-2)，它们共有大约60％的序列同源性，但表达模式以及功能不同。COX-1是与生理学重要的前列腺素的生成相联系的组成型酶，它协助调节正常生理功能如血小板凝集、保护胃中细胞功能以及维持正常肾功能(Dannhardt和Kiefer(2001)Eur.J.Med.Chem.36：109-26)。第二种同种型COX-2是可被促炎细胞因子如白细胞介素—1β(IL—1β)和其他生长因子诱导的酶的形式。(Herschmann(1994)Cancer Metastasis Rev.134：241-56；Xie等，(1992)Drugs Dev.Res.25：249-265)。该同种型催化从花生四烯酸(AA)生成前列腺素E2(PGE2)。COX的抑制是常规NSAID具有抗炎活性的原因。

[0012] 对COX和LOX表现出双重特异性的抑制剂将具有抑制花生四烯酸代谢的多重途径的明显好处。这种抑制剂可通过抑制其生成而阻断前列腺素(PG)以及多重白三烯(LT)的炎性作用。其包括也公知作为过敏反应(anaphalaxis)慢反应物质的PGE2、LTB4、LTD4以及LTE4的血管舒张、血管通透性和趋化性作用。其中，LTB4具有最有效的趋化性以及化学增活作用(chemokinetic effect)(Moore(1985)，Prostanoids：Pharmacological，Physiological and Clinical Relevance，CambridgeUniversity Press，N.Y.，pp.229-230)。

[0013] 由于COX抑制剂的作用机制与大多数常规的NSAID重叠，因此COX抑制剂被用于治疗许多相同症状包括发炎在其中起关键作用的短期症状和慢性疾病中与发炎有关的疼痛和肿胀。然而，大多数已知的NSAID由于其溶解度和生物利用度低而不适于牙周疾病。

[0014] 目前治疗牙周疾病的方法限制以控制感染为首要目的(Genco等，(1990)Contenporary Periodontics，The C.V.Mosby Company，St.Louis，pp.361-370)。常用的抗菌剂及抗牙斑剂包括氯己定、三氯生、氟化亚锡、李斯特灵(Listerine)、过氧化氢、十六烷基氯化吡啶鎓和血根碱生物碱。抗菌漱口剂、抗菌片、抗生素凝胶/微球及酶抑制剂—多西环素的处方药是治疗和控制牙周疾病的优选的非机械/物理方法。申请人未发现有任何报道以无取代B环类黄酮以及黄烷的组合作为靶向于类花生酸和细胞因子途径的主要生物活性成分的用于治疗口腔疾病和病症的制剂。

[0015] 类黄酮或生物类黄酮为广泛分布的天然产物，据报道其具有抗菌、抗炎、抗过敏、抗诱变、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓形成(anti-thrombic)及血管舒张活性。这组化合物共有的结构单元包括两个位于3-碳环两侧的苯环，如下结构通式所示：

[0016]

[0017] 连接至该总三环结构的羟基、糖、氧及甲基的各种组合产生多种类型的类黄酮，包括黄烷醇、黄酮、黄烷-3-醇(儿茶素)、花色苷和异黄酮。

[0018] 无取代B环黄酮及黄酮醇是一类特殊的类黄酮，其芳香B环上无取代基(下文称作无取代B环类黄酮)，由如下通式所示：

[0019]

[0020] 其中

[0021] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；

[0022] 其中

[0023] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0024] X选自药物学可接受的抗衡阴离子组中，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、氟离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、碳酸根等。

[0025] 无取代B环类黄酮相对稀少。在9,396种合成或自天然来源分离的类黄酮中，已知仅有231种无取代B环类黄酮(The Combined ChemicalDictionary，Chapman & Hall/CRC，Version5：1June2001)。据报道无取代B环类黄酮具有各种生物活性。通常，基于类黄酮的可用性随机测试其生物活性。偶尔地，特定生物活性强调需要B环上的取代，如与p-糖蛋白高亲和力结合(Boumendjel等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11(1)：75-77)、强心作用(Itoigawa等(1999)J.Ethnopharmacol.65(3)：267-272)、抗亚油酸过氧化氢诱导的毒性的对内皮细胞的保护作用(Kaneko和Baba(1999)Biosci Biotechnol.Biochem63(2)：323-328)、COX-1抑制活性(Wang(2000)Phytomedicine7：15-19)以及前列腺素内过氧化物合酶(Kalkbrenner等(1992)Pharmacology44(1)：1-12)需要B环上被取代。仅有为数不多的出版物提到无取代B环类黄酮中未取代的B环的重要性。一个实例为抑制NADPH醌受体氧化还原酶的2-苯基黄酮作为潜在的抗凝血剂的应用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)：1417-1427)。

[0026] 各种无取代B环类黄酮抗炎活性的作用机制存在争议。无取代B环类黄酮、柯因(Liang等(2001)FEBS Lett.496(1)：12-18)、汉黄芩素(Chi等(2001)Biochem.Pharmacol.61：1195-1203) 以及 halangin(Raso 等 (2001)Life Sci.68(8)：921-931)的抗炎活性通过过氧化物酶体增生物活化受体γ(PPARγ)的活化以及对脱粒和AA释放的影响从而与诱导型环氧合酶和一氧化氮合酶的抑制有关。(Tordera等(1994)Z.Naturforsch[C]49：235-240)。据报道，木蝴蝶素、黄芩黄素(baicalein)和汉黄芩素抑制12-脂氧合酶活性而不影响环氧合酶(You等(1999)Arch.Pharm.Res.22(1)：18-24)。
新近据报道，汉黄芩素、黄芩苷和黄芩黄素的抗炎活性通过由一氧化氮抑制剂和脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和cox-2基因表达的抑制而产生(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)：1417-1427)。还有报道显示木蝴蝶素通过抑制NFκB的活化起作用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)：1417-1427)。最后，有报道显示汉黄芩素抑制巨噬细胞中诱导型PGE2的生成(Wakabayashi和Yasui(2000)Eur.J.Pharmacol.406(3)：
477-481)。

[0027] 中国药用植物黄芩含有大量的无取代B环类黄酮，包括黄芩黄素、黄芩苷、汉黄芩素和baicalenoside。传统上，该植物用于治疗许多病症，包括清热、泻火、湿温和暑热病；高烧引起的烦渴；痈、溃疡和其他化脓的皮肤感染；上呼吸道感染如急性扁桃体炎、咽喉炎和猩红热；病毒性肝炎；肾炎；盆腔炎(pelvitis)；痢疾；呕血和鼻出血。该植物传统上还用于预防流产(见Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中国，1998)。临床上，黄芩现用于治疗病症如小儿肺炎、小儿细菌性腹泻、病毒性肝炎、急性胆囊炎、高血压、由伤口和外科手术引起的局部急性发炎、支气管哮喘和上呼吸道感染(Encyclopediaof Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中国，1998)。
黄芩根治疗支气管哮喘的药理学功效据报道与无取代B环类黄酮的存在以及其抑制作用有关，它们可以抑制嗜酸性细胞的与嗜酸性细胞趋化因子相关的补充(Nakajima等(2001)Planta Med.67(2)：132-135)。

[0028] 迄今为止，许多天然存在的无取代B环类黄酮得以商品化用于各种用途。例如，黄芩提取物的脂质体剂型用于护肤(美国专利No.5,643,598；5,443,983)。由于对致癌基因具有抑制作用，黄芩苷被用于预防癌症(美国专利No.6,290,995)。黄芩苷和其他化合物被用作抗病毒、抗菌和免疫调节剂(美国专利No.6,083,921和WO98/42363)并作为天然的抗氧化剂(WO98/49256和波兰专利公开No.9,849,256)。含萜类的类黄酮制剂曾被用作表面结合葡糖基转移酶的抑制剂用于治疗和抑制龋齿(US#20040057908)。日本专利No.63027435描述了黄芩黄素的提取及富集，日本专利No.61050921描述了黄芩苷的纯化。

[0029] 于2002年3月1日提交的序列号为10/091,362的名为“Identificationof Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2Inhibitors”以及于2003年7月22日提交的序列号为10/427,746的名为“Formulation of a Mixture ofFree-B-Ring Flavonoids and Flavans as a Therapeutic Agent”的美国专利申请都公开了通过向有此需要的主体给药含有无取代B环类黄酮的组合物或含有无取代B环类黄酮混合物的组合物来抑制环氧合酶COX-2的方法。这是首篇将无取代B环类黄酮与COX-2抑制活性相联系的报导。该申请于此全文并入作为参考。

[0030] 黄烷包括以下结构通式所表示的化合物：

[0031]

[0032] 其中

[0033] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2+ -、-NRH、-NR2、-NR3X，所述取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羟基肉桂酰酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它们的化学衍生物，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或者多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物以及其他聚合的黄烷；

[0034] 其中

[0035] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0036] X选自药物学可接受的抗衡阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。

[0037] 儿茶素是一种黄烷，主要发现于绿茶中，其具有下列结构：

[0038]

[0039] 儿茶素

[0040] 儿茶素既单独起作用又可与其他在茶中发现的类黄酮一同起作用，并且其既具有抗病毒又具有抗氧化活性。据证实，儿茶素对病毒性肝炎的治疗有效。其还显示可预防对心脏、肾、肺、脾的氧化损伤，并可抑制胃癌细胞的生长。

[0041] 儿茶素与其异构体表儿茶素抑制前列腺素内过氧化物合酶，IC50值为40μM。(Kalkbrenner等(1992)Pharmacol.44：1-12)。可从商业途径得到的纯(+)-儿茶素抑制COX-1的IC50值视试验条件而定，约为183到279μM，对COX-2不具有选择性(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.61：1-7)。绿茶儿茶素当补充加入至Sprague Dawley雄性大鼠的膳食中时，降低了血小板PLA2的活性水平并显著减少了血小板环氧合酶水平(Yang等(1999)J.Nutr.Sci.Vitaminol.45：337-346)。儿茶素和表儿茶素据报道可微弱抑制cox-2基因在人结肠癌DLD-1细胞中的转录(IC50＝415.3μM)。(Mutoh等(2000)Jpn.J.Cancer Res.91：
686-691)。来自红酒的(+)-儿茶素的神经保护能力源自儿茶素的抗氧化性能，而不是其对细胞内酶类如环氧合酶、脂氧合酶或一氧化氮合酶的抑制作用(Bastianetto等(2000)Br.J.Pharmacol.131：711-720)。由绿茶和红茶中纯化而得的儿茶素衍生物如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)和茶黄素显示可抑制人结肠粘膜和结肠肿瘤组织中AA的环氧合酶和脂氧合酶依赖性代谢(Hong等(2001)Biochem.Pharmacol.62：1175-1183)以及诱导型(induce)cox-2表达和PGE2生成(Park等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286：721-725)。

[0042] 金合欢是豆科树木和灌木属。金合欢属包括多于1000种属于豆科及含羞草亚科的物种。金合欢分布于全世界如中、南美洲、非洲、亚洲部分地区以及具有最多特有品种的澳洲的热带和亚热带地区。迄今为止，约从各种金合欢品种中分离出330种化合物。类黄酮为从金合欢中分离出的主要类型的化合物。已鉴定有大约180种不同的类黄酮，其中111种为黄烷。萜类是从金合欢属物种中分离出的第二大类化合物，已鉴定出48种化合物。从金合欢中分离出的其他类型化合物包括生物碱(28)、氨基酸/肽(20)、鞣质(16)、糖类(15)、含氧杂环(15)和脂肪族化合物(10)(Buckingham，The Combined Chemical Dictionary，Chapman &Hall CRC，5：2版，Dec.2001)。

[0043] 所有金合欢品种中具有中等到高浓度的酚类化合物，特别是黄烷(Abdulrazak等(2000)Journal of Animal Sciences.13：935-940)。在历史上，金合欢属的大多数植物和提取物被用作收敛药治疗胃肠道紊乱、腹泻、消化不良以及止血。(Vautrin(1996)Universite Bourgogne(France)European abstract58-01C：177；Saleem 等 (1998)Hamdard Midicus.41：63-67)。金合欢树皮提取物在日本被授予的专利为作为增白剂外部应用(Abe，JP10025238)、作为葡糖基转移酶抑制剂的牙科应用(Abe，JP07242555)、作为蛋白质合成抑制剂(Fukai，JP07165598)、作为活性氧清除剂用于外部皮肤制剂(Honda，JP07017847，Bindra美国专利No.6,1266,950)、以及作为透明质酸酶抑制剂用于预防炎症、花粉热和咳嗽(Ogura，JP07010768)。

[0044] 钩藤属包括34个种，其中许多熟知为药用植物。钩藤属植物被不同的民族用于治疗创伤、和溃疡、发烧、头痛、胃肠疾病和微生物/真菌感染。钩藤属植物包含大量的儿茶素和其他黄酮。钩藤属已报道的其它成分包括生物碱、萜类、喹喏酸苷、香豆素、和黄酮类化合物。儿茶钩藤(Uncaria gambir)是马来西亚、新加坡、印度和东南亚国家常见的物种。儿茶素是儿茶钩藤整株的主要成分。

发明内容

[0045] 本发明包括可同时既有效地抑制类花生酸系统又有效地抑制细胞因子系统的用于预防和治疗与口腔、牙齿和牙龈有关的疾病和病症的方法。该同时双重调节类花生酸系统及细胞因子系统的方法包括向有此需要的主体全身或局部给药包含合成和/或从单一植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。本文将该组合物称作UP676。该方法的功效和安全性用纯化酶在不同细胞系、多种动物模型并且最终于人体临床试验中得以证实。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9:0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1:99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的特定具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80和10:90。在本发明一个优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约80:20。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属或钩藤属植物中分离。

[0046] 本发明还包括用于预防和治疗口腔、牙齿和牙龈的疾病和病症的方法。这种用于预防和治疗口腔、牙齿和牙龈的所述疾病和病症的方法包括向有此需要的主体全身或局部给药有效量的包含合成和/或从单一植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药物学可接受的载体的组合物。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9:0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1:99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的特定具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80和10:90。在本发明一个优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约80:20。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属或钩藤属植物中分离。

[0047] 此处所述无取代B环类黄酮也指可根据以下的发明应用的无取代B环黄酮和黄酮醇，包括以下结构通式所示的化合物：

[0048]

[0049] 其中

[0050] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR+ -3X，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；

[0051] 其中

[0052] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0053] X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。

[0054] 本发明的无取代B环类黄酮可由合成方法获得，或从下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科(Annonaceae)、Asteraceae、紫葳科(Bignoniaceae)、使君子科(Combretaceae)、菊科(Compositae)、大戟科(Euphorbiaceae)、唇形科(Labiatae)、樟科(Lauranceae)、豆科(Leguminosae)、桑科(Moraceae)、松科(Pinaceae)、凤尾蕨科(Pteridaceae)、中国蕨科(Sinopteridaceae)、榆科(Ulmaceae)和姜科(Zingiberacea)。该无取代B环类黄酮可由下列高等植物属提取、浓缩和纯化，包括但不限于假鹰爪属(Desmos)、Achyrocline、木蝴蝶属(Oroxylum)、Buchenavia、香青属(Anaphalis)、山芫荽属(Cotula)、鼠麴草属(Gnaphalium)、蜡菊属(Helichrysum)、矢车菊属(Centaurea)、泽兰属(Eupatorium)、Baccharis、乌柏属(Sapium)、黄芩属(Scutellaria)、Molsa、羽萼木属(Colebrookea)、水苏属(Stachys)、牛至属(Origanum)、新塔花属(Ziziphora)、山胡椒属(Lindera)、黄肉楠属(Actinodaphne)、金合欢属(Acacia)、鱼藤属(Derris)、甘草属(Glycyrrhiza)、鸡血藤属(Millettia)、水黄皮属(Pongamia)、灰毛豆属(Tephrosia)、木波罗属(Artocarpus)、榕属(Ficus)、粉叶蕨属(Pityrogramma)、隐囊蕨属(Notholaena)、松属(Pinus)、榆属(Ulmus)和山姜属(Alpinia)。

[0055] 可根据以下发明应用的黄烷包括以下的结构通式所示的化合物：

[0056]

[0057] 其中

[0058] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2+ -、-NRH、-NR2、-NR3X，所述取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羟基肉桂酰酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它们的化学衍生物，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且所述单个糖或者多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物以及其他聚合的黄烷；

[0059] 其中

[0060] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0061] X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。

[0062] 本发明的黄烷可由选自金合欢属或钩藤属的一种或多种植物中获得。在一个优选的具体实施方案中，该植物选自以下组中：儿茶(Acaciacatechu)、Acacia concinna、金合欢(Acacia farnesiana)、阿拉伯胶树(Acacia Senegal)、Acacia speciosa、阿拉伯金合欢(Acacia arabica)、A.caesia、蛇藤(A.pennata)、藤金合欢(A.sinuata)、黑荆树(A.mearnsii)、A.picnantha、白粉金合欢(A.dealbata)、大叶相思(A.auriculiformis)、A.holoserecia和马占相思(A.mangium)，以及儿茶钩藤(Uncaria gambir)、恒春钩藤 (Uncaria lanosa)、毛钩藤 (Uncaria hirsute)、Uncaria africana、Uncaria elliptica、Uncaria orientalis、Uncaria attenuate、Uncaria acida、北越钩藤(Uncaria homomalla)、白钩藤 (Uncaria sessilifructus)、Uncariasterrophylla、Uncaria bernaysii、华钩藤(Uncaria sinensis)、Uncariacallophylla、钩藤(Uncaria rhychophylla)、Uncaria tomentosa、Uncarialongiflora、毛钩藤(Uncaria hirsute)、Uncaria cordata和Uncariaborneensis。

[0063] 在一个具体实施方案中，本发明包括预防及治疗许多与口腔、牙龈和牙齿有关的疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括但不限于牙周(牙龈)疾病如牙龈炎、侵袭性牙周炎、慢性牙周炎、根尖周炎、系统疾病所表现的牙周炎、以及坏死性牙周疾病，其中所述牙周疾病的起因包括但不限于慢性细菌感染、斑块堆积(plaque accumulation)、吸烟或咀嚼烟草、遗传易感性(genetically susceptibility)、怀孕或青春期、压力、药物、以及糖尿病、营养不良和其他系统疾病所引起。

[0064] 在另一个具体实施方案中，本发明包括用于预防和治疗敏感性牙龈和牙齿、后遗症、牙髓炎，因移植假牙、创伤、损伤、夜磨牙症和其他在口腔、齿龈或舌头上的小伤口引起的刺激、疼痛以及炎症，牙斑和结石、牙脱钙、蛋白酶解和龋齿(蛀蚀)的方法。

[0065] 本发明还包括含有本发明治疗剂的治疗组合物。除了用于预防和治疗上述口腔、牙和齿龈的疾病和病症以外，本文所述的治疗组合物还可用于维持最佳唾液生成、唾液pH值、最小化细菌生长、减少牙斑酸的生成、抑制矿物质流失、促进矿质补充、减少龋齿的患病率、形成健康牙龈、洁白牙齿、维持健康的口腔卫生并减少口腔恶臭(口臭)。

[0066] 本发明的预防和治疗方法包括向有此需要的主体全身或局部给药治疗有效量的从单一或多种来源分离的无取代B环类黄酮和黄烷的制剂。根据用于获得该化合物的方法，所述单一和/或多种无取代B环类黄酮及黄烷的混合物的纯度包括但不限于0.01％到100％。在一个优选的具体实施方案中，含有无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的剂量通常是选自基于组合物总重量的0.001％到100％范围中的有效、无毒的量。本领域技术人员采用常规的临床试验即可决定用于治疗特定疾病的最佳剂量。

[0067] 本发明包括采用酶促及体内模型对无取代B环类黄酮和黄烷的不同组合物进行评价以优化组合物并获得期望的生理活性。该组合物的有效性和安全性通过人类临床试验得以证实。本发明的组合物可通过本领域普通技术人员所知的任何方法给药。给药方式包括但不限于肠内(口服)给药、非胃肠道(静脉内、皮下和肌内)给药和局部施用。在一个具体实施方案中，本发明的治疗方法包括向有此需要的主体局部给药治疗有效量的合成和/或从单一植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。局部给药方法包括但不限于牙膏、凝胶、软膏、漱口水、口香糖、酊剂、饮料以及其他已知的药物剂型。

[0068] 至今为止，本发明的申请人尚未发现任何关于包含无取代B环类黄酮和黄烷的组合的制剂作为治疗与口腔、牙齿和牙龈有关的疾病和病症的主要生物活性成分的报道。无取代B环类黄酮的一个芳香环上不含取代基对这些化合物有效用于口腔护理起着非常重要的作用。不像许多其他的抗炎药物和天然存在的化合物，无取代B环类黄酮如黄芩苷在分子的一侧存在低极性的芳香环并在另一侧存在高极性的葡糖苷酸和两个羟基。这种结构安排使得这些化合物容易渗入并保持在牙龈组织。用于产生本文称之为UP676的组合物的无取代B环类黄酮与黄烷的组合为对类花生酸系统和细胞因子系统两者的协同和强效的调节剂，其有助于控制牙周组织炎症，包括牙周疾病所有四个阶段的炎症。此外，由于生物利用度的原因，即生物活性化合物渗入上皮细胞膜的速率和百分比以及生物活性化合物在牙周组织的局部浓度，这两种不同类型的化合物(高极性的黄烷vs.低极性的无取代B环类黄酮)的组合能够由生物活性的黄烷提供快速、就地(on-site)的缓解疼痛和急性炎症作用并由生物活性的无取代B环类黄酮提供对牙周组织的慢性炎症的持久的调节作用。最后，在一个优选的含显著量的无取代B环类黄酮(80重量％)与相对低浓度的黄烷(20重量％)的具体实施方案中，更有效的抗氧化剂黄烷将既作为对抗无取代B环类黄酮氧化降解的天然保存剂(preservative)，又中和并缓冲该组合物从而允许在最佳pH和电离条件下传递主要的活性化合物——无取代B环类黄酮。。

[0069] 应理解，前述总体描述及下述详细描述都仅是举例说明和解释，而并非是对所要求保护的本发明的限制。附图说明

[0070] 图1所示为从黄芩分离的标准化的无取代B环类黄酮(HPLC分析含83％黄芩苷)对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定提取物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50计算为0.24μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50为0.48μg/mL/酶单位。

[0071] 图2所示为从黄芩分离的纯化成分黄芩苷对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该化合物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50确定为0.44μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50为0.28μg/mL/酶单位。

[0072] 图3所示为从黄芩分离的纯化成分黄芩黄素对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该化合物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50确定为0.18μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50为0.28μg/mL/酶单位。

[0073] 图4所示为从儿茶(A.catechu)分离的含50％总黄烷的标准化黄烷提取物对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该提取物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50计算为0.17μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50计算为0.41μg/mL/酶单位。

[0074] 图5所示为包含大于90％的从儿茶分离的黄烷的组合物对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该提取物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50计算为0.11μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50计算为0.42μg/mL/酶单位。

[0075] 图6所示为从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物和从儿茶树皮分离的黄烷提取物以80：20的比例结合制成的制剂对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定下文称之为UP676的该组合物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50为2μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50为4μg/mL/酶单位。

[0076] 图7所示为从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物和从儿茶树皮分离的黄烷提取物以约50：50的比例结合制成的制剂对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该组合物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。对COX-1的IC50计算为0.38μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50确定为0.84μg/mL/酶单位。

[0077] 图8所示为从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物和从儿茶树皮分离的黄烷提取物以约20：80的比例结合制成的制剂对COX-1和COX-2的抑制曲线。测定该组合物对重组绵羊COX-1(◆)和绵羊COX-2(■)的过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)作图。该组合物对COX-1的IC50为0.18μg/mL/酶单位而对COX-2的IC50为0.41μg/mL/酶单位。

[0078] 图9所示为从儿茶分离的黄烷提取物对5-LO的抑制曲线。如实施例4所示，测定该组合物对重组马铃薯5-脂氧合酶活性(◆)的抑制作用。数据显示为在无抑制剂测试下的百分抑制率。对5-LO的IC50为1.38μg/mL/酶单位。

[0079] 图10所示为在实施例9所述条件下进行的包含80：20比例的从黄芩根分离的无取代B环类黄酮和从儿茶树皮分离的黄烷的混合物的典型制剂的高压液相色谱分析(HPLC)的色谱图。

[0080] 图11所示为如实施例10所示在THP-1或HT-29细胞(ATCC)经酶联免疫吸附法测定(ELISA)中增加UP676的浓度对于LPS诱导新合成的白三烯B4(LTB4)量的影响(◆)。UP676是通过将从黄芩根中分离的无取代B环类黄酮以及从儿茶树皮中分离的黄烷的标准提取物以80：20的比例相结合而制成。UP676制剂的活性以对诱导LTB4合成的抑制％来表示。

[0081] 图12所示为如实施例10中所示，将由ELISA测定的于未诱导的细胞中以3μg/mL UP676处理后残留在HT-29细胞中的LTB4水平同以3μg/mL布洛芬的处理结果的对比。结果证实该UP676制剂在处理两天后在HT-29细胞中抑制80％的LTB4生成。

[0082] 图13图示了如实施例12所示的用于衡量对炎症的抑制作用的耳肿胀数据。通过从黄芩根中分离的无取代B环类黄酮及从儿茶的树皮中分离的黄烷的标准提取物以80：20的比例混合而制成UP676，并与不经处理的小鼠和经喂饲法给予吲哚美辛(1.5mg/kg)的小鼠进行比较。数据显示为未处理组与处理组中每只小鼠耳垂的微米测量的差异。

[0083] 图14所示为如实施例13所示的经UV照射之后不同处理组间无毛小鼠(hairless mouse)皮肤红斑分值随时间的变化图。B-1、A-1、B-2和A-2组小鼠在照射之前(B-1、B-2组)或者照射之后(A-1、A-2)用UP676处理。UP676是通过从黄芩根中分离的无取代B环类黄酮及从儿茶的树皮中分离的黄烷的标准提取物以80：20的比例混合制成。参照图14，可以看出与对照组及标准治疗剂Sooth-a-Caine相比在照射前及照射后局部施用UP676均使红斑分值显著降低。

[0084] 图15所示为在实施例15所述条件下纯儿茶素在不同水溶液中在第1、3、6、8及13天时的浓度变化图。

[0085] 图16所示为多种可防止纯儿茶素在pH为7.5的水溶液中降解和颜色发生变化的化学保存剂。

[0086] 图17所示为10个健康受试者(n＝10，6位女性，4位男性)口服给予单剂量300mg UP676后，无取代B环类黄酮对时间的平均血清浓度。平均Cmax为0.93μg/ml(％RSD＝84.9)，平均Tmax约为5.8小时(％RSD＝43.4)。

具体实施方式

[0087] 此处所使用的各种术语涉及本发明的多个方面。提供以下定义以帮助阐明对本发明各成分的说明。

[0088] 应注意此处所用术语“a”或“an”实体是指一个或多个该实体；例如aflavonoid指一种或多种类黄酮。同样地，术语“a”或“an”、“一个或多个”和“至少一个”在此处可互相替换。

[0089] 此处所用的“无取代B环类黄酮”为一类特殊的类黄酮，如下列结构通式所示，其芳香B环无取代基：

[0090]

[0091] 其中

[0092] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR+ -3X，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；

[0093] 其中

[0094] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0095] X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。

[0096] 本文所述的“黄烷”为一类特殊的类黄酮，其通常可由下列结构通式代表：

[0097]

[0098] 其中

[0099] R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2+ -、-NRH、-NR2、-NR3X，所述取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羟基肉桂酰酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它们的化学衍生物，单个糖或者多个糖组合的糖苷，其中所述糖苷是通过碳、氧、氮或硫连接到7-羟基色酮上，并且其中所述单个糖或者多个糖的组合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物以及其他聚合的黄烷；

[0100] 其中

[0101] R是具有1-10个碳原子的烷基；以及

[0102] X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。

[0103] 本文所用“治疗的”包括治疗和/或预防。当使用时，治疗是针对人类以及其他动物。

[0104] “药物学或治疗有效的剂量或量”指足以引发所需生物学结果的剂量水平。该结果可以是病征、症状或疾病的起因的缓解或任何其他所需的生物学系统的改变。精确剂量根据各种因素而不同，包括但不限于对象的年龄及尺寸、疾病及所实施的治疗。

[0105] “安慰剂”指由非活性物质替代足以引发所需的可缓解病征、症状或疾病的起因的生物学结果的药物学或治疗有效的剂量或量。

[0106] “主体”或“患者”本文所述的组合物所要给药的活着的对象，其为人或动物。因此，本文所述的发明可以用于兽医以及人类应用，并且术语“患者”或“主体”不应该以限制性的方法来理解。就兽医应用而言，考虑到动物体重，其剂量范围可以按下文所述来确定。

[0107] 此处所用的“药物学可接受的载体”是指任何不干扰活性成分生物活性的有效性并对其所给药的主体无毒的载体。“药物学可接受的载体”的实例包括但不限于任何标准药物载体如盐水溶液即林格溶液、缓冲盐溶液、水、葡萄糖溶液、血清白蛋白，以及其它用于片剂和胶囊剂型的赋形剂和保存剂。

[0108] “基因表达”是指基因转录至mRNA。

[0109] “蛋白表达”是指将mRNA翻译成蛋白质。

[0110] 此处所用的“RT-qPCR”是指将mRNA分子逆转录(RT)为cDNA分子，之后使用聚合酶链式反应(PCR)并与荧光报道基团(fluorescentreporter)相结合对基因表达的水平加以定量评价的方法。

[0111] 注意本申请全文中提供各种引用。各个引用分别具体地全文并入此处作为参考。

[0112] 本发明提供用有机溶剂和含水溶剂提取含有无取代B环类黄酮的植物，包括黄芩属的三个种和木蝴蝶(Oroxulum indicum)以及含有黄烷的植物，包括儿茶和钩藤(Uncaria)属的三个种的方法(实施例1，表1)。测定该粗提物的环氧合酶抑制活性(实施例2，表2和3)。如实施例3和4以及表4所示，纯化的无取代B环类黄酮和黄烷分别对环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)显示抑制活性。该提取物的分析和定量方法如实施例5和6所示，并且从植物来源制备标准化的无取代B环类黄酮和黄烷的方法在实施例7和8中提供。

[0113] 在本发明的一个具体实施方案中，该标准化的无取代B环类黄酮提取物包含如实施例1、2、5和8中所定义的具有1—99重量％纯度的总无取代B环类黄酮活性化合物。黄芩苷是源自黄芩属的提取物中的主要活性成分，它占总无取代B环类黄酮的大约50—90重量％。在一个优选的具体实施方案(实施例9)，源自黄芩属的该标准化提取物包含>82％的总无取代B环类黄酮，其中以无取代B环类黄酮的重量计主要成分是黄芩苷(见表11)。

[0114] 在一个具体实施方案中，该标准化的黄烷提取物包含如实施例1、4、6和7中所定义的具有1—99重量％纯度的总黄烷活性化合物。儿茶素是源自儿茶和儿茶钩藤的提取物中的主要活性成分，它占总黄烷的大约30—95重量％。在一个优选的具体实施方案(实施例9)中，该源自儿茶的标准化黄烷提取物含>80％的儿茶素。

[0115] 在一个具体实施方案中，UF676是通过以99：1至1：99的比例混合上述两种提取物或者合成化合物来制备。如实施例9和表11所定义，无取代B环类黄酮与黄烷的优选重量比为80：20。

[0116] 无取代B环类黄酮在UP676中的浓度可以是从大约1％到99％，而黄烷在UP676中的浓度可以是从大约99％到1％。在本发明一个优选的具体实施方案中，如实施例9和表11所示，总无取代B环类黄酮在UP676中的浓度大约为75％，其中黄芩苷含量占UP676总重量的大约60％；而总黄烷在UP676中的浓度大约为10％，其中儿茶素含量占大约9.9％。
在这一具体实施方案中，总活性成分(无取代B环类黄酮加黄烷)在UP676中占总重量的>85％。

[0117] 本发明包括可同时既有效地抑制类花生酸途径又有效地抑制细胞因子途径的方法，其可用于预防和治疗牙周疾病和牙龈病症。该双重调节类花生酸及细胞因子途径的方法包括向有此需要的主体全身或局部给药包含合成和/或从单一植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。本文将该组合物称作UP676。该方法的功效用纯化酶在不同细胞系、多种动物模型并且最终于人体临床试验中得以证实。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9:0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1:99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的特定具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80和10:90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为80:20。在优选的具体实施方案中，无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。

[0118] 本发明还包括同时既有效地抑制环氧合酶(COX)活性又有效地抑制脂氧合酶(LOX)活性的方法。该同时抑制环氧合酶活性(COX)及脂氧合酶(LOX)活性的方法包括向有此需要的主体全身或局部给药有效量的包含合成和/或从一种或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药物学可接受载体的组合物。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9:0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1:99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80和10:90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为80:20。在优选的具体实施方案中，无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。

[0119] 本发明中还包括一种同时降低IL-1β、TNFα和IL-6以及与炎症相关的其它蛋白质的方法，用来预防和治疗与口腔、牙龈及牙齿相关的疾病或症状。尽管不受理论所限，可以相信降低这些蛋白质的机理是由于本发明组合物下调它们的基因表达所造成的。促炎细胞因子，尤其是IL-1β、TNFα和IL-6在牙周组织慢性感染中发挥重要作用。促炎细胞因子的诱导合成影响PDL细胞的表型和功能。这些细胞因子不仅在感染部位激活和募集免疫细胞，而且导致支持骨及韧带连接流失。同时抑制促炎细胞因子，尤其是IL-1β、TNFα和IL-6的基因表达的方法包括向有此需要的主体全身或局部给药包含合成和/或从一种或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。本文将该组合物称作UP676。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9:0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1:99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80和10:90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为
20:80。在另一优选具体实施方案中，无取代B环类黄酮是从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。

[0120] 在一个具体实施方案中，本发明包括一种预防及治疗许多与口腔、牙龈和牙齿有关的疾病和病症的方法，该疾病和病症包括但不限于牙周(齿龈)疾病如牙龈炎、侵袭性牙周炎、慢性牙周炎、根尖周炎、系统疾病所表现的牙周炎、以及坏死性牙周疾病，其中所述牙周疾病的起因包括但不限于慢性细菌感染、斑块堆积、吸烟或咀嚼烟草、遗传易感性、怀孕或青春期、压力、药物、以及糖尿病、营养不良和其他系统疾病所引起。

[0121] 在另一具体实施方案中，本发明包括一种用于预防和治疗敏感性牙龈和牙齿、后遗症、牙髓炎，由移植假牙或其它材料所引起的刺激和疼痛的方法，促进伤口愈合、减少由创伤、损伤、夜磨牙症及其它在口腔、牙龈或舌头上的小损伤所引起的疼痛和炎症的方法。在另一具体实施方案中，本发明包括预防和治疗牙斑、牙垢、牙齿脱钙、蛋白水解和龋齿(蛀蚀)的方法。

[0122] 本发明还包括含有本发明的治疗剂的治疗组合物。除了用于预防和和治疗上述口腔、牙和齿龈的疾病和病症以外，本文所述的治疗组合物还可用于维持最佳唾液生成、唾液pH值、最小化细菌生长、减少牙斑酸的生成、抑制矿物质流失、促进矿质补充、减少龋齿的患病率、形成健康牙龈、洁白牙齿、维持健康的口腔卫生并减少口腔恶臭(口臭)。

[0123] 可以根据本发明方法应用的无取代B环类黄酮包括上述结构通式所示的化合物。本发明的无取代B环类黄酮可由合成方法获得，或从下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、凤尾蕨科、中国蕨科、榆科和姜科。该无取代B环类黄酮可由如下高等植物属提取、浓缩并纯化，包括但不限于假鹰爪属、Achyrocline、木蝴蝶属、Buchenavia、香青属、山芫荽属、鼠麴草属、蜡菊属、矢车菊属、泽兰属、Baccharis、乌柏属、黄芩属、Molsa、羽萼木属、水苏属、牛至属、新塔花属、山胡椒属、黄肉楠属、金合欢属、鱼藤属、甘草属、鸡血藤属、水黄皮属、灰毛豆属、木波罗属、榕属、粉叶蕨属、隐囊蕨属、松属、榆属和山姜属。所述类黄酮存在于植物的不同部位中，包括但不限于茎、茎皮、嫩枝、块茎、根、根皮、嫩梢、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶及其他气生部分。

[0124] 于2002年3月1日递交的名为“Identification of Free-B-RingFlavonoids as Potent COX-2Inhibitors”的第10/091,362号美国专利申请以及于2003年8月27日递交的名为“Identification of Free-B-Ring Flavonoidsas Potent COX-2Inhibitors”的第10/469,275号美国专利申请公开了分离和纯化无取代B环类黄酮的方法，这两篇文献的全文都被并入此处作为参考。

[0125] 根据本发明方法可以应用的黄烷包括上述结构通式所示的化合物。本发明的黄烷可从选自金合欢或钩藤属的一种或者多种植物中提取。在一个优选的具体实施方案中，所述植物选自以下组中：儿茶、A.concinna、金合欢、阿拉伯胶树、A.speciosa、阿拉伯金合欢、A.caesia、蛇藤、藤金合欢、黑荆树、A.picnantha、白粉金合欢、大叶相思、A.holoserecia和马占相思；或者儿茶钩藤、恒春钩藤、毛钩藤、Uncaria africana、Uncariaelliptica、Uncaria orientalis、Uncaria attenuate、Uncaria acida、北越钩藤、白钩藤、Uncaria sterrophylla、Uncaria bernaysii、华钩藤、Uncariacallophylla、钩藤、Uncaria tomentosa、Uncaria longiflora、毛钩藤、Uncariacordata、和Uncaria borneensis。所述黄烷存在于植物的不同部位中，包括但不限于茎、茎皮、干、主干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、嫩梢、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶及其他气生部分。

[0126] 于2002年3月22日递交的名为“Isolation of a Dual Cox-2and5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia”的第10/104,477号美国专利申请公开了黄烷的分离和纯化方法，其全文并入此处作为参考。

[0127] 本发明采用若干体内炎症和毒性研究及体外生化、细胞和基因表达筛选相结合的策略鉴定能特异性地抑制COX和LOX酶活性、影响mRNA基因表达以及减轻炎症的活性植物提取物。本文用于鉴定能特异性地抑制COX和LOX的活性植物提取物的方法记载于实施例1和2中，还记载于2002年3月1日提交的序列号为10/091,362的、名为“Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2Inhibitors”以及2002年3月22日递交的名为“Isolation of a Dual Cox-2and5-LipoxygenaseInhibitor from Acacia”的第
10/104,477号美国专利申请，以及于2003年4月30日提交的名为“Formulation With Dual Cox-2And5-LipoxygenaseInhibitory Activity”的第10/427,746号美国专利申请中，其分别全文并入此处作为参考。

[0128] 本发明的组合物的各种应用记载于2004年2月24日提交的序列号为10/785,704的名为“Inhibition of Carbohydrate Induced Obesity with aDefined Plant Extract”美国专利申请、2004年4月2日递交的名为“Formulation of Dual COX-2and5-Lipoxygenase Inhibitors for mammalSkin Care”的第10/817,330号美国专利申请、2004年9月1日提交的名为“Formulation With Dual COX-2and5-Lipoxygenase Inhibitory Activityfor Use in the Prevention and Treatment of Cognitive Decline andAge-Relatd Memory Impairment”的第10/932,517号美国专利申请、以及于2004年8月
27日提交的序列号为60/605,110的名为“Therapeutic Agentfor the Down-Regulation of Multiple Cytokine Genes”的美国专利申请中，这些申请各自全文并入此处作为参考。

[0129] 用于测定COX抑制的生化试验取决于在血红素和花生四烯酸存在下的蛋白质过氧化物酶活性。实施例3所述的该项研究表明从黄芩中分离的纯化的无取代B环类黄酮、黄芩苷和黄芩黄素和从儿茶中分离的黄烷提取物以及含有高浓度的无取代B环类黄酮和黄烷的各个单独的标准化提取物抑制COX活性(图1-5)。此外，按照实施例9所示制备的具有不同比例的各种单独的标准化提取物(即，80：20、50:50和20:80无取代B环类黄酮：黄烷)的组合物在体外都能高度有效地抑制COX活性(图6—8)。

[0130] 本文还清楚地证实无取代B环类黄酮和黄烷的组合能更加平衡地调节COX-1和COX-2酶。例如，对COX-1比对COX-2更有效150倍的COX-1选择性抑制剂阿司匹林会导致胃肠道副作用。相反，对COX-2酶比对COX-1酶更有效50-200倍的COX-2抑制剂万络(vioxx)、西乐葆(celebrex)和Bextra不会导致如此严重的胃肠道损伤，然而，这些COX-2选择性药物增加心血管危险。另一方面，无取代B环类黄酮和黄烷的制剂在黄芩苷较强的COX-2活性和儿茶素较强的COX-1活性之间达到平衡。在UP676制剂中儿茶素对COX-1酶的中等选择性(2.3倍)起到降低选择性COX-2抑制剂导致的心血管危险的作用。

[0131] 还很重要的是上述引用的目前可用的药物和天然制剂——UP676的作用机理完全不同。阿司匹林、万络、西乐葆和Bextra都是通过共价键与COX酶不可逆地结合，以形成紧密结合的酶—抑制剂复合物。如此强大的相互作用完全改变了酶的活性位点及侧袋(side pocket)而损伤酶(Walker Mc.，Kurumbal RG.，等.(2001)Biochem.357：709-718)。另一方面，在UP676中的类黄酮由于具有抗氧化性而通过较弱及可逆的结合抑制COX酶。在此相互作用的过程中，COX酶的结构和功能没有发生不可逆的改变，这导致UP676具有更好的耐受性和安全性。

[0132] 如实施例4所述，采用脂氧合酶体外筛选试验来评价从儿茶中分离的黄烷提取物对LOX活性的抑制。结果如图9所示。通过向无取代B环类黄酮中加入黄烷，UP676也可抑制5-LOX的活性。对5-LOX的抑制作用导致吞噬性(phagocytic)白三烯的积累减少，其与慢性炎症的症状有直接关系，并且可以减少潜在的胃肠道副作用。这种效力在实施例10和图11、12中得以证实。简而言之，如实施例10所述，使用UP676样品进行目标为抑制LOX途径中花生四烯酸分解产生的化合物即LTB4的细胞试验。UP676对LTB4的抑制作用如图12所示。根据此图所示结果，明显可见无取代B环类黄酮与黄烷的组合对减少细胞白三烯生成提供了额外的好处。目前，这种减少细胞白三烯生成的作用优于传统的非甾体抗炎药如布洛芬。

[0133] 实施例11表明UP676可有效地抑制人体细胞中包括IL-1β、TNFα和IL-6的一组促炎细胞因子的基因表达。本实验是采用脂多糖(LPS)刺激的人外周血单细胞(PBMC)而进行，这是一种完善的炎症细胞模型。当细胞与不同浓度(0、10、30、和100μg/mL)的UP676共同温育时，促炎细胞因子的基因表达受到剂量依赖性的抑制。(表12)。

[0134] 促炎细胞因子特别是IL-1β、TNFα和IL-6在牙周组织慢性感染中发挥重要作用。它们不仅在感染部位激活和募集免疫细胞，而且诱导支持骨及韧带连接流失。已确定病变的牙周组织中这些细胞因子基因的mRNA水平升高且促炎细胞因子的合成影响PDL细胞的表型和功能。由于UP676在mRNA水平同时强烈抑制包括IL-1β、TNFα和IL-6的促炎细胞因子，因此它为治疗牙周疾病提供了有效的方法。

[0135] 如实施例12所述，通过将皮肤刺激物如AA施用于小鼠耳部或踝关节(以模仿牙周组织对细菌感染和牙斑的生物反应)并测量用UP676处理的小鼠肿胀降低的情况验证体内效力。结果如图13所示。根据该图可见，以50mg/kg到200mg/kg的剂量口服给药UP676显著地降低了由局部刺激所引起的小鼠耳肿胀。

[0136] 如实施例13和图14所述，局部施用UP676的效力是利用另一动物模型通过其预防和治疗UV诱导的皮肤红斑的作用得以进一步证实。在实施例13所述的研究中，将混合比例为无取代B环类黄酮：黄烷为80：20的UP676溶于水中，并在暴露于UV前和暴露后分别使用两种浓度局部施用于无毛小鼠皮肤处。与对照组和经Sooth-A Cain处理组显示出严重而扩大的红斑对比，来自经UP676处理的四组无毛小鼠的红斑得分，无论施用时间是UV暴露之前还是之后，在两种浓度下均显示出形成红斑的红色程度较低，皮肤面积较小。该研究表明UP676可渗入无毛小鼠皮肤以降低炎症反应。尽管不受理论所限，可以相信这一结果是通过同时抑制类花生酸和细胞因子途径实现的。

[0137] 实施例14(表13)描述了采用药理学、皮肤病学及美容学适用的赋形剂制备UP676乳剂的通法。为了举例说明，该实施例提供了制备0.5重量％UP676局部用乳剂的详细过程。本发明的组合物还可以配制成药物组合物，其包括其它成分如从药物学和/或美容学可接受的赋形剂、佐剂、调味剂和/或载体。例如，本发明的组合物可以在所要治疗的主体对其耐受的赋形剂中配制。赋形剂是用作药物的稀释剂或载体的惰性物质。所述赋形剂的例子包括但不局限于水、醇(乙醇或乙二醇、丙二醇)、缓冲液、盐水、水化二氧化硅、葡萄糖溶液、羧甲基纤维素(cellulose gum)、山梨醇、甘露醇、保存剂和其它水性生理平衡盐溶液。该治疗组合物还可以含有少量添加剂，例如提高等渗性和化学稳定性的物质。如实施例17所述，所述保存剂包括但不限于BHA、BHT、柠檬酸二铵(DAC)、丁羟甲苯、乙二胺四乙酸(EDTA)、H2O2、没食子酸丙酯(PG)、葡萄糖酸钠(SG)、硫酸氢钠/焦亚硫酸钠(SBS)、月桂基硫酸钠、氯化亚锡、氟化亚锡、苯甲酸钠、苯甲酸。非水载体如不挥发油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酸酯都可以使用。其它可用的剂型包括含有增粘剂如羧甲基纤维素钠、山梨醇、黄原胶、甲基纤维素或葡聚糖的混悬剂。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、组氨酸、柠檬酸盐和甘氨酸或其混合物，而保存剂的实例包括但不限于硫柳汞、间-或邻-甲酚、福尔马林和苄醇。标准制剂可以是液体或凝胶或糊剂或固体，它们可以作为混悬液或溶液制成适当的形式用于给药。

[0138] 在一个具体实施方案中，该组合物制备成为控释剂型，它可以将本发明的组合物缓慢地释放于主体内。本文所使用的控释剂型包括控释载体中的本发明组合物。适合的控释载体为本领域中的技术人员所知。优选的控释制剂是可生物降解的(即可生物侵蚀的)。

[0139] 实施例15举例说明了儿茶素在不同pH和保存剂的溶液中的稳定性。儿茶素含有四个酚羟基，这使得这个化合物具有较强的酸性并对氧化应激敏感。儿茶素氧自由基吸收容量极高(ORAC为20,000)，说明其具有抗氧化性。如图15所述，基于纯儿茶素在不同条件如pH、H2O2和金属离子的存在下的应激实验，确定儿茶素在中性条件并且在4℃和40℃时稳3+
定而在碱性条件下或暴露于金属离子如Fe 中不稳定。甚至在弱碱条件下(pH＝7.5)儿茶素也会分解。但是，它能够保存于多种保存剂中，包括但不局限于氯化亚锡(SnCl2)、硫酸氢钠/焦亚硫酸钠(SBS)和图16中所列的其它保存剂。

[0140] 在优选的具体实施方案中，将此两类化合物相组合的另外一个优点在于，含有大量的无取代B环类黄酮(80重量％)与相对低浓度的黄烷(20重量％)的制剂中，更有效的抗氧化剂黄烷起抗氧化降解的天然保存剂的作用，并在制剂中作为中和剂和缓冲剂用于在最适pH和电离条件下传递主要活性成分——无取代B环类黄酮。

[0141] 实施例16举例说明了在人体口服给药之后UP676中的活性成分的生物利用度。结果如图17所示。根据图17，该分析中看到的宽的误差柱(error bar)是由于实验对象之间的个体差异造成的。性别和体重的差异与Cmax和Tmax或吸收和清除所观察到的差异不相关。可以清楚的证实UP676中的无取代B环类黄酮可以渗入表皮细胞。但是，无取代B环类黄酮在人体液如血清中并不是以苷元如黄芩黄素的形式存在，而是以如黄芩苷或硫酸黄芩黄素的结合结构存在。为了定量血清中无取代B环类黄酮的总浓度，利用两种酶将所有结合化合物水解从而释放苷元——黄芩黄素，然后利用HPLC对其进行定量测定。

[0142] 表14显示每个对象所观察到的最大黄芩黄素浓度(Cmax，μg/mL)和观察到的时间(Tmax，小时)。该数据显示，大多数对象在给予首剂量后的4到8小时之间达到最大浓度。平均Cmax为0.93μg/mL(％RSD＝84.9)，平均Tmax大约为5.8小时(％RSD＝43.4)。根据该数据，可以计算出吸收和清除的平均时间，并对整个研究组做图(图17)。如图6所示，由于UP676对COX酶抑制作用的IC50在0.2—0.4μg/mL之间，因此UP676在口服给药两个小时后达到有效浓度。但是在口服给药后大约10小时，血清中无取代B环类黄酮的浓度将保持治疗水平之上。为了补偿无取代B环类黄酮不能快速生物利用的问题，儿茶素型黄烷制剂提供了有益的补充。关于儿茶素、槲皮素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯生物利用度的研究(Kao等，(2000)Endocrinology141(3)：980-987；Koga和Meydani(2001)Am.J.Clin.Nutr.73：941-948；Lee等，(2002)CancerEpidemiol.Biomarker Prevention11：1025-1032)表明儿茶素的Cmax和Tmax迅速出现(大约45分钟)而半衰期据报道为2小时。因此，通过无取代B环类黄酮与黄烷的结合，渗透快的儿茶素在口服给药后
0.5小时达到有效血清浓度。当儿茶素浓度下降时，第二种活性成分无取代B环类黄酮达到生物活性浓度并将维持至口服给药后12个小时。总而言之，UP676制剂设计成既具有由黄烷如儿茶素导致的快速就地减轻牙周疼痛及抗炎作用，又具有由无取代B环类黄酮如黄芩苷导致的持久效果。这种协同和互补作用还可以通过制剂的局部传递来实现。

[0143] 实施例17阐明了对人体皮肤局部施用UP676的安全性。对如实施例9和14所述配制的UP676对人体皮肤潜在的刺激性和接触致敏的诱导进行评价。分别有总数为97和101个受试者完成了以0.5％和1.5％U676乳膏进行诱导和刺激。实验结果表明UP676乳膏在0.5％和1.5％浓度下产生的刺激很小并且不引发诱导接触致敏的迹象。

[0144] 总之，本发明的组合物可通过本领域技术人员所知的任何方法给药。给药方法包括但不限于肠内(口服)给药、非胃肠道(静脉内、皮下和肌内)给药和局部施用。本发明的治疗方法包括向有此需要的患者体内(internally)或局部给药治疗有效量的合成和/或自一种或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。在一个具体实施方案中，该组合物是经局部给药。本发明的治疗剂可通过本领域技术人员所知的任何适宜局部给药治疗组合物的方式局部给药，所述给药方式包括但不限于作为糊剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂或漱口液或膏基，或作为乳剂、贴片、敷料或面膜、不粘的纱布、绷带、药签、或抹布(cloth wipe)。这种局部施用可以使用任何已知的局部给药的标准方法比如用牙刷刷、涂敷在牙线上、或用药签施用或用液体或凝胶剂清洗来局部地给药于任何疾患部位。根据给药方法不同，治疗组合物可以各种单位剂量形式给药。对于特殊的传递方法，本发明的治疗组合物可以在本发明的赋形剂中配制。本发明的治疗试剂可以对任何主体，优选为哺乳动物，更优选为人类给药。具体给药方法将取决于所治疗的病症。

[0145] 在一个具体实施方案中，适宜的软膏包含的所需浓度的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物是有效、无毒的量，其通常选自局部制剂总重量的0.001％到100％、牙膏的0.05％到5％(优选为0.1％到0.5％)、漱口液的0.01％到5％(优选为0.2％到1％)、乳剂、凝胶或乳膏的0.1％到25％(优选为0.5％到5％)的范围内。

[0146] 不管给药方式如何，具体剂量均根据主体的大致体重来计算。确定上述每种制剂用于治疗的适宜剂量所必需的进一步的精细计算通常是由本领域普通技术人员常规地完成的，并在他们通常进行的任务范围内，而无需过多的实验，特别是在根据本文公开的剂量信息和试验的情况下。这些剂量可以通过应用已建立的与适当的剂量反应数据联合应用的用于确定剂量的试验来确定。

[0147] 应注意的是，此处公开的发明可以用于兽医以及人类应用，并且术语“主体”不应被限制性地解释。就兽医应用而言，考虑到动物体重，其剂量范围可如上所述确定。

[0148] 下列实施例仅供举例说明目的而并非意图限制本发明的范围。

[0149] 实施例

[0150] 实施例1由金合欢和黄芩属植物制备有机及水提物。

[0151] 将源于儿茶树皮、直萼黄芩根、黄芩根或美黄芩(Scutellarialateriflora)整株及各种木蝴蝶及钩藤属的植物原料磨成粒径不大于2mm。然后将干燥的磨碎的植物原料(60g)转移至锥形瓶中并加入甲醇：二氯甲烷(1:1)(600mL)。混合物振摇一小时，过滤并用甲醇：二氯甲烷(1:1)(600mL)再次提取生物质。合并有机提取物且真空蒸发得到有机提取物(见下表1)。经有机提取后，将生物质风干并用超纯水(600mL)提取一次。水溶液经过滤和冻干得到水提物(见下表1)。

[0152] 表1.各种植物中有机及水提物的产率

[0153]植物来源植物部位有机提取物水提物
儿茶树皮 27.2g 10.8g
直萼黄芩根 4.04g 8.95g
黄芩根 9.18g 7.18g
美黄芩整株 6.54g 4.08g
木蝴蝶种子 6.58g 4.04g
毛钩藤气生部分 2.41g 0.90g
华钩藤气生部分 3.94g 1.81g
Uncaria tomentosa 树皮 6.47g 2.31g

[0154] 实施例2、来源于儿茶、各种黄芩属植物及其它植物的植物提取物对COX-2和COX-1过氧化物酶活性的抑制

[0155] 如下所述，用于鉴定特异性COX-2抑制剂的生物测定指导的筛选方法设计为测定该酶的过氧化物酶活性。

[0156] 过氧化物酶测定。修改检测COX-2抑制剂的试验用于高通量平台(Raz)。简而言之，将过氧化物酶缓冲液(100mM TBS，5mM EDTA，1μM血红素，1mg肾上腺素，0.094％苯酚)中的重组绵羊COX-2(Cayman)与提取物(1：500稀释)一同温育15分钟。加入Quantablu(Pierce)底物并在25℃显色45分钟。用Wallac Victor2读板器读取荧光。结果如表2所示。

[0157] 表2显示从三种植物包括儿茶树皮、两种黄芩根中获得的包含结构相似的无取代B环类黄酮物的有机提取物(20μg/mL)和水提物(20μg/mL)对COX-2酶的抑制。数据是以相对于重组绵羊COX-2酶和单独底物的过氧化物酶活性的百分数来表示。有机提取物的抑制百分数范围为30％到90％。

[0158] 表2.各种不同种的植物对COX-2过氧化物酶活性的抑制

[0159]有机提取物对COX-2的水提物对于COX-2的
植物来源
抑制抑制
儿茶(树皮) 75％ 30％
直萼黄芩(根) 55％ 77％
黄芩(根) 75％ 0％

[0160] 比较COX-1和COX-2同种型的相对抑制需要得到每种酶的IC50值。IC50值定义为特定抑制剂达到相对于对照而言抑制50％酶活性时的浓度。如表3所示，在这些实验中发现对COX-2和COX-1酶的IC50值的范围分别为6—50μg/mL及7—80μg/mL。比较COX-2和COX-1的IC50值证实了来源于各种植物的有机提取物对于每种酶的特异性。例如美黄芩的有机提取物对COX-2的抑制优先于对COX-1的抑制，其IC50值分别为30和80μg/mL。尽管一些提取物显示出优先抑制COX-2，但其它并不如此。检测HTP部分及从这些部分获得的纯化的化合物对于测定这些提取物和化合物真实的抑制特异性是必要的。

[0161] 表3.有机提取物对于人和绵羊COX-2及COX-1的IC50值

[0162]植物来源人COX-2IC50 绵羊COX-2 绵羊COX-1
(μg/mL) IC50(μg/mL) IC50(μg/mL)
儿茶(树皮) 3 6.25 2.5
直萼黄芩(根) 未测 10 10
黄芩(根) 30 20 20
美黄芩(整株) 20 30 80
华钩藤(整株) 未测 2.2 72.0
木蝴蝶(种子) 未测 2.48 8.4

[0163] 实施例3、COX-1和COX-2过氧化物酶活性的抑制

[0164] 为了筛选抑制COX-1和COX-2活性的化合物，开发了一种利用对两种酶过氧化物酶活性的抑制作用的高通量体外试验(Needleman等.(1986)Annu RevBiochem.55：69)。简而言之，用待测的组合物或化合物滴定固定量的COX-1和COX-2酶。试验中包括可裂解的过氧化物生色团，以在花生四烯酸作为辅因子存在下使每种酶的过氧化物酶活性可视化。通常，试验以96孔格式进行。将取自10mg/mL溶于100％DMSO中的储备液的每种抑制剂在室温条件下用以下浓度各测量三次：0、0.1、1、5、10、20、50、100及500μg/mL。每孔加入150μL100mM Tris-HCl(pH7.5)以及10μL22μM稀释于三羟甲基氨基甲烷缓冲液的高铁血色素、10μL稀释于DMSO中的抑制剂及25个单位的COX-1或COX-2酶。将各成分在旋转台上混合10秒后加入20μL2mM的N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺二盐酸盐(TMPD)及
20μL1.1mM的花生四烯酸以启动反应。将板振摇10秒钟，然后在温育5分钟后于570nm处读取吸光度。用抑制剂浓度对抑制％作图，并通过沿等温线取半数最大值点并和X轴上的浓度相交以确定IC50。实验中将IC50对酶单位数归一化。20μg/mL的纯无取代B环类黄酮的COX-1/COX-2抑制活性总结在表4中。

[0165] 表4.纯化的无取代B环类黄酮对COX酶活性的抑制作用

[0166]无取代B环类黄酮对COX-1的抑制率对COX-2的抑制率
黄芩苷 95％ 97％
黄芩黄素 107％ 109％
5，6-二羟基-7-甲氧基黄酮 75％ 59％
7，8-二羟基黄酮 74％ 63％
汉黄芩素 16％ 12％

[0167] 从黄芩根中分离的标准化的无取代B环类黄酮提取物、黄芩苷及黄芩黄素的剂量反应和IC50值分别提供在图1、2和3中。从儿茶心材中分离的两种标准化的黄烷提取物(分别为50％及>90％黄烷)的剂量反应和IC50值分别提供在图4和图5中。不同组分的无取代B环类黄酮和黄烷的三种制剂的剂量反应和IC50值分别提供在图6(80：20混合)、图7(50：50混合)和图8(20：80混合)中。

[0168] 实施例4.从儿茶分离的儿茶素对5—脂氧合酶的抑制

[0169] 炎症反应中涉及的最重要的途径之一是由非血红素的、含铁的脂氧合酶(5-LO，12-LO及15-LO)所产生，其催化分子氧加成到脂肪酸例如AA(AA)上产生氢过氧化物5-、
12-及15-HPETE，其然后转化为白三烯。初步的迹象显示源自儿茶的黄烷提取物能提供一定程度的LOX抑制，从而阻止5-HPETE的生成。采用脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒(Cayman Chemical，Inc.，Cat#760700)以评价自儿茶分离的包含>90％黄烷的提取物是否直接在体外抑制LOX。在通过微孔过滤完成由磷酸盐到基于三羧甲基氨基甲烷的缓冲液的缓冲液更换后，用马铃薯LOX代替源自大豆的通常用于试剂盒中的15-LO。该测定通过氧敏产色(oxygensensing chromagen)检测氢过氧化物的生成。简而言之，加入0.17单位/μL的马铃薯5-LO90μL、1.1mM的AA20μL、氧敏产色剂100μL以及10μL纯化的黄烷抑制剂至最终浓度在0到500μg/mL范围，以此一式三份进行测定。该组合物抑制5-LO的IC50经测定为1.38μg/mL/酶单位。结果如图9所示。

[0170] 实施例5.自直萼黄芩(根)和黄芩(根)分离的活性提取物中无取代B环类黄酮的HPLC定量分析

[0171] 通过HPLC测定如实施例1和2所述从三种不同植物分离的五种活性提取物中的无取代B环类黄酮的存在和定量，结果如下表5所示。无取代B环类黄酮是通过HPLC在Luna C-18柱(250×4.5mm，5μm)上用1％的磷酸和乙腈从80％到20％梯度洗脱22分钟来进行定量分析。利用紫外检测器在245nm检测无取代B环类黄酮并通过与黄芩苷、黄芩黄素及其它无取代B环类黄酮标准品比较保留时间来鉴别。

[0172] 表5.活性植物提取物中的无取代B环类黄酮含量

[0173]提取物重可从生物质中无取代B环类提取物中的％
活性提取物无取代B环类
量提取的％黄酮总量
黄酮
直萼黄芩
(水提物) 8.95g 14.9％ 0.2mg 0.6％
直萼黄芩
(有机提取物) 3.43g 5.7％ 1.95mg 6.4％
黄芩
(水提物) 7.18g 12.0％ 0.03mg 0.07％
黄芩
(有机提取物) 9.18g 15.3％ 20.3mg 35.5％

[0174] 实施例6.儿茶活性提取物的HPLC定量分析

[0175] 通过HPLC使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和Luna C18柱(250×4.5mm)定量分析如实施例1和2所述的自儿茶分离的有机及水提物中的黄烷。用乙腈梯度洗脱，从10％到30％乙腈洗脱20分钟，接下来用60％乙腈洗脱5分钟从而将黄烷自色谱柱上洗脱。结果如表6所示。根据保留时间和PDA数据以儿茶素和表儿茶素作为标准品对黄烷进行定量。这两种主要的黄烷的保留时间分别为12.73分钟和15.76分钟。

[0176] 表6.活性植物提取物中的儿茶素含量

[0177]儿茶树皮活性提取物提取物重量可自生物质中提取的％提取物中的％黄烷
水提物 10.8g 18.0％ 0.998％
有机提取物 27.2g 45.3％ 30.37％

[0178] 实施例7.源自儿茶的标准化提取物的制备

[0179] 将儿茶(500mg磨碎的根)用25mL(2×25mL)下列溶剂系统提取两次。(1)100％水，(2)80:20水：甲醇，(3)60:40水：甲醇，(4)40:60水：甲醇，(5)20:80水：甲醇，(6)100％甲醇，(7)80:20甲醇:THF，(8)60:40甲醇:THF。将各个分别提取的两次提取物合并浓缩并在低真空下干燥。通过HPLC使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm的C18柱来鉴定每种提取物中的化学成分。根据保留时间和PDA数据以儿茶素和表儿茶素作为标准品定量各化学成分。结果如表7所示。如表7所示，用80％甲醇/水溶剂提取得到的黄烷提取物具有最高浓度的黄烷成分。

[0180] 表7.用于从儿茶中获得标准化黄烷提取物的溶剂

[0181]可自生物质中提取物中的％
提取溶剂提取物重量儿茶素总量
提取的％儿茶素
100％水 292.8mg 58.56％ 13mg 12.02％
水：甲醇
(80：20) 282.9mg 56.58％ 13mg 11.19％
水：甲醇
(60：40) 287.6mg 57.52％ 15mg 13.54％
水：甲醇
(40：60) 264.8mg 52.96％ 19mg 13.70％
水：甲醇
(20：80) 222.8mg 44.56％ 15mg 14.83％
100％甲醇 215.0mg 43.00％ 15mg 12.73％
甲醇：THF 264.4mg 52.88％ 11mg 8.81％
(80:20)
甲醇：THF
(60:40) 259.9mg 51.98％ 15mg 9.05％

[0182] 通过从儿茶钩藤整株中用醇/水溶剂提取生物质得到标准化的提取物。使用相同的方法对自儿茶钩藤中提取的标准化提取物中的黄烷含量进行定量。结果如表8所示。根据保留时间和PDA数据以儿茶素为标准品对黄烷进行定量。

[0183] 使用醇/水和/或水性溶剂作为重结晶溶剂对儿茶素含量在8％—15％之间的提取物进行重结晶可得到较高纯度的物质。在重结晶之前可能有必要向提取物的热的饱和溶液中加入活性碳或其它脱色剂以脱色。然后冷却热的饱和溶液结晶高纯度的儿茶素。晶体然后经过滤除去溶剂，干燥并研磨成细粉。若需要可重复重结晶以获得所需的纯度水平(60％-100％的儿茶素黄烷)。

[0184] 实施例8.标准化的无取代B环类黄酮提取物自各种黄芩中的制备

[0185] 将直萼黄芩(500mg磨碎的根)用25mL的下列溶剂系统提取两次。(1)100％水，(2)80:20水：甲醇，(3)60:40水：甲醇，(4)40:60水：甲醇，(5)20:80水：甲醇，(6)100％甲醇，(7)80:20甲醇：THF，(8)60:40甲醇：THF。提取物经合并、浓缩并在低真空下干燥。通过HPLC使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm的C18柱来鉴定各提取物中的化学成分。根据保留时间和PDA数据以黄芩黄素、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素为标准品定量各化学成分。结果如表9所示。

[0186] 表9.源自直萼黄芩的无取代B环类黄酮提取物的定量

[0187]可自生物质中提取物中的％类
提取溶剂提取物重量类黄酮总量
提取的％黄酮
100％水 96mg 19.2％ 0.02mg 0.20％
水：甲醇
(80：20) 138.3mg 27.7％ 0.38mg 0.38％
水：甲醇
(60：40) 169.5mg 33.9％ 0.78mg 8.39％
水：甲醇
(40：60) 142.2mg 28.4％ 1.14mg 11.26％
水：甲醇
(20：80) 104.5mg 20.9％ 0.94mg 7.99％
100％甲醇 57.5mg 11.5％ 0.99mg 10.42％
甲醇：THF
(80:20) 59.6mg 11.9％ 0.89mg 8.76％
甲醇：THF
(60:40) 58.8mg 11.8％ 1.10mg 10.71％

[0188] 将黄芩(1000mg磨碎的根)用50mL的如下甲醇和水的混合物提取两次。(1)100％水，(2)70:30水：甲醇，(3)50:50水：甲醇，(4)30:70水：甲醇，(5)100％甲醇。提取物经合并、浓缩并在低真空下干燥。通过HPLC使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm的C18柱来鉴定各化学成分。根据保留时间和PDA数据利用黄芩黄素、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素为标准品定量各提取物中的化学成分。结果如表10所示。

[0189] 表10.源自黄芩的无取代B环类黄酮提取物的定量

[0190]可自生物质中提取物中的％类
提取溶剂提取物重量类黄酮总量
提取的％黄酮
100％水 277.5mg 27.8％ 1mg 0.09％
水：甲醇
(70：30) 338.6mg 33.9％ 1.19mg 11.48％
水：甲醇
(50：50) 304.3mg 30.4％ 1.99mg 18.93％
水：甲醇
(30：70) 293.9mg 29.4％ 2.29mg 19.61％
100％甲醇 204.2mg 20.4％ 2.73mg 24.51％

[0191] 使用醇/水作为重结晶溶剂对无取代B环类黄酮含量在8％—15％之间的提取物进行重结晶可得到较高纯度的无取代B环类黄酮。在重结晶之前可能有必要向提取物的热的饱和溶液中加入活性碳或其它脱色剂进行脱色。无取代B环类黄酮冷却结晶。晶体经过滤、干燥并研磨成细粉。若需要可重复重结晶以达到所需的纯度水平(60％-100％的无取代B环类黄酮)。

[0192] 实施例9.用源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化的黄烷提取物制备制剂

[0193] 用分别自金合欢和黄芩属中分离的两种标准化提取物与一种或多种赋形剂配制本文称之为UP676的新型组合物。制备该组合物的一般实例如下所示。在本实施例中使用的金合欢提取物包含>80％的总黄烷，为儿茶素和表儿茶素，而黄芩提取物包含>80％的无取代B环类黄酮，主要是黄芩苷。该黄芩提取物中还包含其它少量的如表11所示的无取代B环类黄酮。组合物中也可以加入一种或多种赋形剂/保存剂。黄烷及无取代B环类黄酮的比例可以根据适应症和对抑制COX vs.LO的具体要求、皮肤渗透的要求以及对产品效能的要求如所要求的功效持续时间等进行调整。赋形剂的量可以根据各成分的实际活性含量进行调整。每一批独立产品的混合列表必须根据产品规格及每批独立的成分的QC结果来产生。推荐2—5％额外量的活性成分以达到产品规格。

[0194] 将无取代B环类黄酮含量为82.8％(黄芩苷)的黄芩根提取物(38.5kg)(批号RM052302-01)；总黄烷含量为80.4％的儿茶树皮提取物(6.9kg)(批号RM052902-01)；以及赋形剂(Candex5.0kg)相混合制成活性无取代B环类黄酮与黄烷的重量混合比为85：15的UP676制剂(50.4kg)。表11提供了用实施例6和8所提供的方法测定的特定批次的UP676(批号G1702-COX-2)中的活性无取代B环类黄酮和黄烷的量。根据表11，该特定批次的UP676中含有86％总活性成分，包括75.7％的无取代B环类黄酮和10.3％的黄烷。图10所示为典型的UP676样品的HPLC色谱图，其活性无取代B环类黄酮和黄烷的重量混合比例为80：20。

[0195] 表11.UP676制剂中的无取代B环类黄酮和黄烷含量

[0196]活性成分％含量
1.类黄酮
a.黄芩苷 62.5％
b.低含量的类黄酮
i.汉黄芩素-7-葡糖苷酸 6.7％
ii.木蝴蝶素A7-葡糖苷酸 2.0％
iii.黄芩黄素 1.5％
iv.汉黄芩素 1.1％
v.柯因-7-葡糖苷酸 0.8％
vi.5-甲基-汉黄芩素-7-葡糖苷酸 0.5％
vii.黄芩素苷 0.3％
viii.去甲汉黄芩素(Norwogonin) 0.3％
ix.柯因 <0.2％
x.木蝴蝶素A <0.2％
c.总无取代B环类黄酮 75.7％
2.黄烷
a.儿茶素 9.9％
b.表儿茶素 0.4％
c.不完全黄烷 10.3％
3总活性成分 86％

[0197] 以下批UP676是使用相同的方法用源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物分别以12：88及15：85的混合比例混合制备。

[0198] 将无取代B环类黄酮含量为87.9％(为黄芩苷)的黄芩根提取物(58.0g)(批号RM021203-01)和总黄烷含量为84.9％的儿茶树皮提取物(442.0g)(批号RM050603-01)混合制成重量混合比为12：88的UP676(500g，批号QJ205-19)。利用实施例6和8所提供的方法，在该特定批次的UP676(批号QJ205-19)中无取代B环类黄酮含量(黄芩苷)为9.65％而黄烷含量(总儿茶素和表儿茶素)为73.2％。

[0199] 将无取代B环类黄酮含量为82.9％(为黄芩苷)的黄芩根提取物(300g)(批号RM060403-01)和总黄烷含量为90.8％的儿茶树皮提取物(1700g)(批号RM050603-01)混合制成重量混合比为15：85的UP676组合物(2000g，批号A1904)。利用实施例6和8所提供的方法，该特定批次的UP676(批号A1904)中无取代B环类黄酮(黄芩苷)的含量为15.6％而黄烷(总儿茶素和表儿茶素)含量为75.0％。

[0200] 实施例10.UP676制剂对5-LO酶抑制的剂量反应和IC50值的测定

[0201] 根据实施例9所述利用源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物以80：20的混合比例混合制备UP676制剂(80:20)。将样品在含有THP-I或HT-29细胞、表达COX-1、COX-2和5-LOX的单核细胞系的组织培养物中滴定。采用用于白三烯B4的竞争性ELISA(LTB4；Neogen，Inc.，Cat#406110)评价该UP676制剂对于存在于各细胞系中的新合成的LTB4水平的影响作为评价UP676抑制5-LOX途径的效果的方法。此试验是在6孔板中通过每孔加入160,000—180,000个细胞来重复操作。以
3、10、30和100μg/mL的浓度将UP676制剂加入THP-I培养物中并在37℃含5％CO2的潮湿环境中温育过夜(～12-15小时)。结果如图11所示，通过向THP-1培养物中加入浓度为3—10μg/mL之间的UP676几乎完全抑制了LPS诱导的LTB4的新的生成。

[0202] 将UP676和另一种已知的5-LOX抑制剂布洛芬以3μg/mL浓度加入到HT-29细胞中并在37℃含5％CO2的潮湿环境中温育48小时。之后通过离心收集各经处理的细胞系并以柔和的杜恩斯匀浆(douncehomogenization)使之破碎并溶于生理缓冲液中。如图12所示，UP676抑制HT-29细胞中80％的新合成的LTB4产生。在相同时间内布洛芬显示LTB4量只减少20％。

[0203] 实施例11.UP676在mRNA水平下调促炎细胞因子及其它与炎症相关的蛋白质的基因表达

[0204] 外周血单核细胞(PBMC)是已经建立的用于炎症相关疾病的细胞模型。在不含和含有不同浓度的UP676(0、10、30和100μg/mL)的存在下用10ng/mL脂多糖(LPS)刺激来自3个健康人类受试者的PBMC。将细胞在37℃、5％CO2温育18小时，之后收获用于RNA纯化。用QiagenRNeasy试剂盒制备RNA并用ABI cDNA Archive试剂盒合成cDNA。用ABI棱镜序列检测器进行实时定量-PCR检测。18S rRNA基因或亲环蛋白A用作用于归一化的内对照。来自三个实验的数据总结如表12所示。对于IL-1β、TNFα及IL-6基因表达的平均抑制分别为45倍、3倍和27倍。此外，在PBMC中，在用LPS刺激后18小时检测到UP676对pparγ抑制超过10倍而对nfκb mRNA抑制为2倍，。

[0205] 表12.UP676在PBMC中的基因抑制作用(数字代表在用100μg/mL和0μg/mL的UP676处理的样品之间mRNA水平倍数变化)

[0206]基因受试者1 受试者2 受试者3 平均
cox1 3 -3 -5 -0.8
cox2 -71 -84 -35 -63
i1-1β -108 -11 -16 -45
tnfα -6 -1.5 -2.5 -3.3
i1-6 nd -40 -34 -27
pparγ nd -7 -13 -10
nfκb -2.7 -2.2 -1.6 -2.2

[0207] 实施例12.用体内小鼠耳肿胀模型评价UP676的有效性

[0208] 如实施例9所述，利用源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物以80：20混合比混合制备UP676制剂。为了检验这种组合物是否可用于体内治疗炎症，将该组合物经口服强饲法对4-5周龄的ICR小鼠(Harlan Labs)给药，一天后用花生四烯酸(AA)处理小鼠耳朵。实验组小鼠喂饲相当于50、100及200mg/kg混悬在橄榄油中的UP676的剂量，其对照组小鼠只喂饲橄榄油。第二天，将330mM溶于95％乙醇中的AA20μL施用至每只小鼠的一只耳朵，而将乙醇施用至另一只耳朵作为对照。如图13所示，经UP676处理的小鼠随着UP676剂量增加显示出可测量的剂量反应。根据图13，200mg/kg的剂量与“未处理”的对照组相比肿胀降低50％。剂量为50mg/kg的UP676与剂量为50mg/kg的另一强效抗炎药——吲哚美辛效果相当。

[0209] 实施例13.UP676在预防和治疗皮肤暴露于UV照射导致的损伤的有效性评价[0210] 将六组无毛雌性小鼠(每组五只)(SKH-I品系，Harlan Labs)在麻醉情况下用2
0.626mW/cm 连续三天每天照射三分钟来检测UP676制剂在预防和治疗皮肤暴露于UV照射导致的损伤方面的效果。如实施例9所述，将源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物与源自儿茶树皮标准化的黄烷提取物以80：20混合比混合来制备UP676制剂。六个治疗组如下所示：

[0211] 组#

[0212] 1 对照组：UV照射前或后均不做处理

[0213] 2 阳性对照组：UV照射后局部施用Sooth-A-Caine(Banana Boat) 处理[0214] 3 UP676处理组B-1：UV照射前局部施用含1mg/mL UP676的水溶液处理[0215] 4 UP676处理组A-1：UV照射后局部施用含1mg/mL UP676的水溶液处理[0216] 5 UP676处理组B-2：UV照射前局部施用含5mg/mL UP676的水溶液处理[0217] 6 UP676处理组A-2：UV照射后局部施用含5mg/mL UP676的水溶液处理[0218] 经三天UV照射及处理之后，对小鼠红斑(发红)水平用下述尺度评分：0-无可见红斑；1-轻微红斑；2-明显红斑；3-严重红斑；4-肿瘤形成。经人眼对每组红斑进行评分。结果如图14所示。根据图14可见对照组(1组)在第3天(暴露于UV照射之后72小时)
出现严重红斑。Sooth-A-Caine组在第3天也出现了最大红斑(2组)。UP676处理组(3-6组)的红斑从不超过2分。这些评分尽管有主观性，但仍表明UP676对于预防和治疗UV引起的皮肤红斑均有效果。

[0219] 典型的小鼠在第4天时的照片清楚地证明对照组、Sooth-A-CaineTM处理组及UP676处理组之间的不同(没有显示数据)。与在UV暴露前和后均用UP676制剂处理的动TM物相比，对照组和Sooth-a-cain 处理组显示红斑模式及红色十分广泛。在UV暴露前用
5mg/mL UP676处理的动物与其它所有动物相比显示最小量的红斑。

[0220] 实施例14.将UP676组合物制成乳膏

[0221] 如下列过程及表13所示将UP676(0.5重量％的UP676)(如实施例9中所述的批号A1904)制成乳膏。

[0222] 室温下将UP676(批号A1904)溶于水且用混合器匀化直到其完全分散在溶液中(大约5分钟)。室温下不搅拌或搅动溶液，通过洒于溶液表面加入Ultrez-21卡波姆，且允许其完全湿润(无可见白色区域)并沉入溶液中。轻微搅拌下将溶液加热到40℃然后加入甘油(A部分)。然后将该混合物再搅拌5分钟。将剩余组分(B部分)称重并在搅拌下加热到40℃。在40℃将剩余组分(B部分)加入到A部分中并将所得组合物充分混合直到均匀(大约5分钟)。将该乳剂冷却到30℃且通过搅拌棒和/或刮铲搅拌下用中和剂滴定，将pH值调整到约5.5(5.3到5.7)。由于中和诱导的卡波姆的构型变化使得该乳剂变得十分粘稠。乳剂最终达到乳膏适合的粘度。然后将该乳剂混合直到均匀，之后将其倒入洁净容器内在2℃到8℃保存一个月。

[0223] 表13.0.5％UP676乳膏的成分列表

[0224]

[0225] 实施例15.溶液中儿茶素的稳定性评价

[0226] 将纯儿茶素溶于70％甲醇水溶液中，在与下列详述的溶液混合之后至最终浓度为0.05％(w/v)。共选择6种不同条件(不包括对照溶液)用于该45℃下的稳定性研究。K2HPO4(0.5M)或KH2PO4(0.5M)水溶液用于制备pH值分别为5或8的缓冲溶液。将H2O2、SnCl2，、FeCl3或EDTA分别加入儿茶素溶液中直至浓度分别为0.6％H2O2、或0.05％SnCl2、或0.05％FeCl3或0.05％EDTA。将七种溶液在密封瓶子中于45℃贮存。如实施例6所示在第0、1、3、6、8、10、13、20、及28天用HPLC测定各样品的儿茶素含量。结果如图15所示。

[0227] 将下列保存剂：BHA、BHT、柠檬酸二铵(DAC)、H2O2、没食子酸丙酯(PG)、葡萄糖酸钠(SG)及硫酸氢钠/焦亚硫酸钠(SBS)加入缓冲的(pH7.5)0.05％儿茶素甲醇/水溶液中得到0.05％的浓度。将八种溶液置于密闭瓶子中于45℃贮存。如实施例6所述在第0、1、3、6、8、10、13、20、及28天测定各样品的儿茶素含量。结果如图16所示。

[0228] 实施例16.经口服给药后UP676中黄芩苷生物利用度的评价

[0229] 该临床研究为单中心、开放性研究，其中招募10名健康受试者参与(n＝10，6位男性，4位女性)。受试者禁食过夜并在第二天上午8:00到临床试验中心报告。在基线静脉穿刺后，各受试者马上接受300mg剂量的如实施例9所述制备的UP676。接下来在1/2、1、2、4及8小时采集血浆样品。在第两天的第24小时及在第七天采集额外的样品。通过将血液收集到含有肝素的试管内来处理每个血浆样品。之后将血液在2,500rpm离心10分钟。分离各管的上清液，转移至转移管中并在最终收集之后测定无取代B环类黄酮水平之前于-70℃贮存用于分析。经分析确定：(i)无取代B环类黄酮吸收和清除的曲线下面积(AUC)；(ii)无取代B环类黄酮的最大血浆浓度(Cmax)；(iii)无取代B环类黄酮达到最大血浆浓度的时间(Tmax)；(iv)无取代B环类黄酮的血浆消除半衰期(T1/2)；及(v)24小时尿
24Hr
清除率AU 。

[0230] 对若干血清等分试样的HPLC初步研究表明，由于通过葡糖醛酸化及硫酸化结合无取代B环类黄酮处于检测限之下(<4μg/mL)。因此，将血清用2,000u/mL的β-葡糖醛酸糖苷酶及170u/mL的硫酸酯酶消化使所有结合型无取代B环类黄酮转变成为苷元分子黄芩黄素。之后通过HPLC用纯黄芩黄素作标准品对总黄芩黄素代谢产物进行分析。加入抗坏血酸防止类黄酮在37℃7小时的消化过程以及之后的HPLC分析过程中氧化。

[0231] 血浆经β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶消化之后，用乙酸乙酯提取类黄酮，然后在进行HPLC分析前迅速用氮气流及微热(35℃)蒸发至干。用含有1mg/mL抗坏血酸缓冲液的甲醇：四氢呋喃80：20溶液复溶样品。黄芩黄素的含量测定是通过反相色谱使用等度的(isocratic gradient)0.1％磷酸(v/v)(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)在1mL/min流速下用纯黄芩黄素作标准物来校正质量并用保留时间鉴定。用在线UV检测器在275nm监控洗脱物质的检测。

[0232] 结果如图17所示。根据图17，黑体显示的数据代表用来计算黄芩黄素血浆清除率的点。当对所有受试者的数据取对数作图，这些数据代表与时间的线性函数(数据没有显示)。受试者间存在个体差异。表14显示对每个受试者所观察到的黄芩黄素浓度最大值(Cmax，μg/mL)及时间(Tmax，小时)。数据表明对于大多数受试者来说，在首次剂量后4小时到8小时间达到最大浓度。平均Cmax为0.93μg/mL(％RSD＝84.9)且平均Tmax约为5.8小时(％RSD＝43.4)。根据此数据，可计算并作图整个研究组的吸收及清除平均值(图17)。

[0233] 表14.在各个受试者中所观察到的黄芩黄素浓度的最大值(Cmax，μg/mL)和时间(Tmax，小时)。

[0234]A B C D E F G H I J
Cmax 1.1 0.80 0.38 0.58 0.44 2.8 0.88 0.47 0.14 0.26
(μg/mL)
Tmax 2.0 8.0 4.0 8.0 8.0 4.0 8.0 4.0 8.0 8.0
(小时)

[0235] 实施例17.对UP676乳膏反复施用于人体皮肤引起的刺激性和诱导接触致敏的评价

[0236] 使用改良的Draize Patch Test测试法在人体皮肤上对UP676进行测试(Marzulli 和 Maibach(1977)Contact Allergy：Predictive Testing inHumans.In Advances in Modern Toxicology，Dermatotoxicology andPharmacology.Eds.Marzulli，F.N和Maibach，H.I.4，353-372)。测试部位位于上臂或后背椎旁(paraspinal)区域。每个测试品都有诱导部位和激发部位。诱导部位包括两个亚部位：原始部位及转移部位。将如实施例14所述制备的含有0.2mL UP676乳膏/片的贴片反复应用于原始部位，除非发生足够严重的刺激性而需要将贴片施用于转移部位。由临床研究所施用贴片并在约24或
48/72小时后由受试者移除并弃去贴片。在诱导阶段将测试品反复施用于同一皮肤部位并在4周内共施用9片诱导贴片。在施用最后一片诱导贴片和施用激发贴片之间的间期(rest period)为10到21天。在此期间内，无测试品或任何其他物质施用于测试部位。在激发阶段，将测试品施用于身体对侧的未实验部位并在约24或48小时后由受试者弃去。

[0237] 检测施用各贴片的皮肤反应并在100瓦的白炽蓝灯泡光源下根据指定的评分尺度评分。在强烈刺激反应使得将测试品施用到转移部位的情况下，对于所有先前暴露的部位直到诱导结束均记录剩余的分数(或如果反应持续至诱导结束后则直至消退)。记录所有皮肤反应。在激发阶段，在施用贴片约48及72或96小时后评价皮肤反应。关于诱导致敏(induced sensitivity)的结论主要源于激发评价。

[0238] 实施例14所制备的浓度为0.5％和1.5％的两种UP676乳膏根据上述方案进行评价。每组共招募120名受试者。97名受试者完成了0.5％UP676组的研究而101名受试者完成了1.5％UP676组的研究。没有观察到任何0.5％和1.5％UP676乳膏的致敏反应。0.5％UP676在诱导过程中，16名受试者显示偶尔发生的轻微到轻度的红斑(评分为+和/或1)。在激发阶段，4名受试者在48小时时显现轻微到轻度红斑，并在96小时时消失。
1.5％UP676在诱导阶段，26名受试者偶尔发生轻微到轻度红斑(评分为+和/或1)。在激发阶段，1名受试者在48小时时显现轻微到轻度红斑，并在96小时时消失。

[0239] 该研究表明UP676是可以以有效浓度局部施用于人类皮肤而不引起刺激或致敏的安全成分。

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