一、技术领域

本发明涉及嵌合蛋白质化合物，尤其涉及一种长效广谱的趋化因子受体 抑制物。

二、背景技术

研究发现，细胞趋化因子的蛋白质(Chemokine)及其受体对许多疾病的病 理过程起着重要作用：爱滋病毒是利用趋化因子的受体感染人体的，所以，如 能封闭这些受体，便可阻止爱滋病毒的感染；另外某些肿瘤细胞向一些特定的 器官的转移也是通过肿瘤细胞表面带有的趋化因子受体完成的；各种非特异炎 症疾病发生时，都有趋化因子介导的白细胞向病灶渗入的现象。因而，有效地 抑制趋化因子的受体便能抑制细胞移动，达到治疗和预防非特异性炎症疾病和 肿瘤转移的效果。

研究还发现，许多疾病都涉及到多种不同的趋化因子受体。如艾滋病主要 的HIV-1病毒利用CCR5和CXCR4趋化因子受体感染人类，但还有许多HIV-1 病毒可利用CCR1，CCR2、CCR3等受体感染；乳腺癌细胞表面带有CXCR4和CCR7 两种受体，从而决定了这些癌细胞转移到骨髓，淋巴结和肺部；溃疡性结肠炎 造成病理损害的主要因素是单核细胞(通过CCR2受体)和中性粒细胞(通过 CXCR1，CXCR2受体)等。目前药物筛选原则都是一种药物只针对一种受体。这 些药物可以抑制这一种受体，却不能抑制疾病。举例来讲，多肽化合物SDF-1P2G 被证明高效特异抑制CXCR4受体，可以抑制晚期艾滋病人的病毒，然而却不能 抑制早期病人和许多其它亚型的HIV-1病毒，因为这些病毒利用上面所提到的 其它受体。而艾滋病问题解决的最大难题就是HIV-1病毒本身会随着病程不断 产生突变，因而感染所用的受体也在不断改变。不能抑制所有的受体就不可能 做到真正抑制病毒感染，也就没有广泛的临床价值。正是由于这个原因，到目 前为止，世界上还没有办法来预防HIV-1的感染。又比如乳腺癌细胞，如果只 抑制它两种受体之中的一种，癌细胞依然可以通过另外一种受体而转移(参考 例证7)，类似的情况还有许多其它疾病。因而，为了防治这类疾病，需要研发 能够同时抑制多种不同趋化因子受体的多靶性药物。此外，多靶性的药物的另 一优势就是开发时节约大量资金和时间。因为开发一个由几种不同的化合物组 成的复合药物，其临床试验要求必须对每单个药物先分别作临床试验，再作综 合临床试验，无论时间和费用都耗费巨大，不可行，而一个多靶性的药物的开 发只需一次临床试验。

另一方面，趋化因子受体的有效抑制依赖于药品有效浓度的维持，因为趋 化因子受体是依赖G蛋白受体，其特点是在受到抑制后可通过再循环及生物合 成再生，需要重新抑制(文献8)，只有维持抑制剂在体内的有效浓度才可做到 对受体彻底的抑制，从而有效地阻止HIV-1病毒的感染和肿瘤的转移，所以体 内的长药效也是此类药物的另一重要因素。

三、发明内容

本发明的主要目的在于鉴于目前所研制的抑制趋化因子受体的化合物要 么太专一不广谱、要么在体内太不稳定的问题，而已发现的几个来源于病毒 的多靶性蛋白抑制剂由于是一个结构固定的分子，既无法选择抑制的范围， 又可引起过敏反应(因为它是病毒蛋白)，不适合临床反复使用的现状，而 提供一种长效广谱的趋化因子受体抑制物，其在体内长效、广谱、高效，没 有副作用(同时具有特异性和多样性)，是一种可以长期反复使用的新药。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物，其特征在于，能够拮抗两种或 多种趋化因子受体的嵌合蛋白质，其包含有如下的蛋白质片段：

a、人体免疫球蛋白恒定区；

b、两种不同的对细胞趋化因子受体有拮抗作用的蛋白质片段；

e、其中每个受体拮抗剂通过其分子的C-末端与人体免疫球蛋白恒定 区的N-末端相连，形成融合蛋白单体；

d、这些含有不同受体的拮抗剂的融合蛋白单体彼此之间再以共价相连， 可以双倍体，四倍体，或多聚体的形式产出。

前述的述的长效广谱的趋化因子受体抑制物，其特征在于，所述的融合 蛋白单体的人体免疫球蛋白恒定区部分是指人体免疫球蛋白的重链的恒定区 和/或轻链的恒定区片段；所述融合蛋白单体的受体拮抗剂部分包括下述任 意两个针对不同受体的蛋白质：

a.XR4拮抗剂1，即SDF-1P2G(见附件1，蛋白质序列1.1；1.2；以及基因 编码ND.1)；

b.XR4拮抗剂2，即SDF-1(2-67)(见附件1，蛋白质序列2.1；2.2，以及 基因编码ND.2)；

c.氨基末端头两个氨基酸经化学修饰而产生的，具有抑制受体CXCR4作 用的SDF-1衍生物；

d.R5拮抗剂1，即RANTES(9-68)(见蛋白质序列3.1，3.2，4.1，4.2以及 基因编码ND.4)；

e.R5拮抗剂2，即RANTES(8-68)(见蛋白质序列4.1，4.2以及基因编码 ND.3)；

f.XR3拮抗剂1，即ITAC(4-73)(见蛋白质序列5.1，5.2以及基因编码 ND.5)；

g.XR3拮抗剂2，即ITAC(3-73)(见蛋白质序列6.1，6.2以及基因编码 ND.6)；

h.氨基末端头3个氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CXCR3 作用的ITAC衍生物；

i.R7拮抗剂1，即MIP-3β(8-77)(见蛋白质序列7.1，7.2以及基因编 码ND.7)；

j.氨基末端头两7氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CCR7作 用的MIP-3β衍生物；

k.R7拮抗剂2，即6CKine(8-79)(见蛋白质序列8.1，8.2以及基因编码 ND.8)；

l.氨基末端头7个氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CCR7作 用的6CKine(1-79)片断的衍生物；

m.XR1拮抗剂1，即IL-8(6-72)(见蛋白质序列9.1，9.2以及基因编码 ND.9)；

n.R2拮抗剂1，即MCP-3(9-76)(见蛋白质序列10.1，10.2以及基因编 码ND.11)；

o.R2拮抗剂2，即MCP-3(8-76)(见蛋白质序列11.1，11.2以及基因编 码ND.10)；

p.氨基末端头9氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CCR2作用 的MCP-3衍生物；

q.R2拮抗剂3，即MCP-1(9-76)(见蛋白质序列12.1，12.2以及基因编码 ND.13)；

r.R2拮抗剂4，即MCP-1(8-76)(见蛋白质序列13.1，13.2以及基因编码 ND.12)；

s.氨基末端头9个氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CCR2作 用的MCP-1的衍生物；

t.XR2拮抗剂1，即GROa(8-73)(见蛋白质序列14.1，14.2以及基因编码 ND.14)；

u.氨基末端头7个氨基酸经过化学修饰而得到的，具有抑制受体CXCR2 作用的GROα的衍生物；所述两种不同的融合蛋白单体彼此之间相连接的方式 最好是通过二硫桥，也可通过多肽链，或多糖分子等共价键；所述的相连的 两种不同融合蛋白单体包括两种不同的含有重链的融合蛋白单体之间，或含 有重链和含有轻链的融合蛋白单体之间。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物，其中人体免疫球蛋白的重链恒 定区包含有绞链区以及CH3片段；所述的人体免疫球蛋白的重链恒定区包含 有绞链区和CH1，CH2及CH3片段；人体免疫球蛋白的重链恒定区包含IgGγ1 和IgGγ4的重链恒定区；所述的轻链的恒定区片段包含人体免疫球蛋白轻链 的κ和λ的恒定区。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中拮抗两种或多种趋 化因子受体的嵌合蛋白质可用于治疗自身免疫病和非特异性炎症疾病、治疗 肿瘤相关疾病、治疗/预防器官移植导致的排斥以及移植物抗宿主病、治疗 HIV-1病毒感染和艾滋病；所述的拮抗两种或多种趋化因子受体的嵌合蛋白 质与其它方法或药物做联合治疗。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中治疗/预防时的使 用剂量为3-300毫克/公斤体重范围；肌肉注射剂量应为该剂量的数倍。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的生产方法，其中能够拮抗两种 或多种趋化因子受体的嵌合蛋白质的方法，包括：利用基因重组技术构建包 含有拮抗不同种趋化因子受体的嵌合蛋白质单体的载体；利用上述不同的载 体，组建表达和分泌能够拮抗两种或多种趋化因子受体的嵌合蛋白质的细胞 株或菌株；培养上述细胞或菌株，收集并纯化分泌出的嵌合蛋白质。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的生产方法，其中能够拮抗趋化 因子受体CCR5，CCR1，CCR2，CCR3，CXCR4的嵌合蛋白质XR4/R5/R1，其方 法包括：利用基因重组技术按照款1所指构建包含有核酸序列ND.1，ND.2， ND.3，ND.4或表达蛋白相当于序列(1)，(2)，(3)，(4)的嵌合蛋白质单 体的载体；利用上述不同的载体，组建表达和分泌能够拮抗趋化因子受体 CCR5，CCR1，CCR2，CCR3，CXCR4的嵌合蛋白质的细胞株；培养上述细胞， 收集并纯化分泌出的嵌合蛋白质。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质 XR4/R5/R1用于治疗/预防HIV病毒感染、艾滋病以及涉及到上述受体的自身 免疫病；所述的嵌合蛋白质XR4/R5/R1用于与其它方法或药物做联合治疗； 所述的嵌合蛋白质XR4/R5/R1及其核酸编码用于疫苗治疗方法。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中的嵌合蛋白质 XR4/R5/R1用于治疗/预防时的使用剂量为3-300毫克/公斤体重；肌肉注射 剂量为上述剂量的数倍；使用剂型包括注射剂型和粘膜局部用药剂型；所述 嵌合蛋白XR4/R5/R1核酸编码的基因治疗方法和剂量为0.4-4毫克/公斤体 重。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的生产方法，其中能够拮抗趋化 因子受体CCR1，CCR5，CXCR3的嵌合蛋白质XR3/R5/R1的方法包括：利用基 因重组技术构建包含有核酸序列ND.3，ND.4 ND.5，ND.6，或它们相应的蛋白 序列(3)，(4)，(5)，(6)的嵌合蛋白质单体的载体；利用上述不同的载 体，组建表达和分泌能够拮抗趋化因子受体CCR5，CCR1，CXCR3的嵌合蛋 白质的细胞株；培养上述细胞，收集并纯化分泌出的嵌合蛋白质。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质 XR3/R5/R1用于治疗/预防器官移植导致的排斥，移植物抗宿主病以及涉及到 上述受体的自身免疫病；所述嵌合蛋白质XR3/R5/R1用于与其它方法或药物 做联合治疗；嵌合蛋白质XR3/R5/R1及其核酸编码的疫苗治疗方法。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质 XR3/R5/R1用于治疗/预防时的使用剂量为3-300毫克/公斤体重范围，肌肉 注射，剂量应为该剂量的数倍；所述嵌合蛋白质XR3/R5/R1用于治疗/预防 时的使用剂型，包括注射剂型；所述的各种嵌合蛋白质的核酸编码的基因治 疗方法和剂量为0.4-4毫克/公斤体重。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的生产方法，其中能够拮抗趋化 因子受体CCR7，CXCR4的嵌合蛋白质R7/XR4的方法包括：利用基因重组技 术构建包含有核酸序列ND.1，ND.2，ND.7，ND.8，或它们相应的蛋白序列 (1)，(2)，(7)，(8)的嵌合蛋白质单体的载体；.利用上述不同的载体， 组建表达和分泌能够拮抗趋化因子受体CCR7，CXCR4的嵌合蛋白质的细胞 株；.培养上述细胞，收集并纯化分泌出的嵌合蛋白质。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质R7/XR4 用于治疗肿瘤及治疗和预防肿瘤转移，以及涉及到上述受体的自身免疫病； 所述的嵌合蛋白质R7/XR4用于与其它方法或药物做联合治疗；所述的嵌合 蛋白质R7/XR4及其核酸编码的疫苗治疗方法。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质R7/XR4 用于治疗/预防时的使用剂量为3-300毫克/公斤体重；肌肉注射剂量为该剂 量的数倍；所述的嵌合蛋白质R7/XR4用于治疗/预防时的使用剂型包括注射 剂型；所述的各种嵌合蛋白质的核酸编码的基因治疗方法和剂量为0.4-4毫 克/公斤体重。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的生产方法，其中能够拮抗趋化 因子受体CCR2，CXCR1，CXCR2的嵌合蛋白质XR1/R2的方法包括：利用基因 重组技术构建包含有核酸序列ND.9，ND.10，ND.11，ND.12，ND。13，No.14 或它们相应的蛋白序列(9)，(10)，(11)，(12)(13)(14)的嵌合蛋白质单 体的载体；利用上述不同的载体，组建表达和分泌能够拮抗趋化因子受体 CCR2，CXCR1/CXCR2的嵌合蛋白质的细胞株或菌株；培养上述细胞或菌株， 收集并纯化分泌出的嵌合蛋白质。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质XR1/R2 用于治疗自身免疫性疾病和非特异炎症；所述的嵌合蛋白质XR1/R21用于与 其它方法或药物做联合治疗；所述的嵌合蛋白质R2/XR1及其核酸编码的疫 苗治疗方法。

前述的长效广谱的趋化因子受体抑制物的用途，其中嵌合蛋白质XR1/R2 用于治疗/预防时的使用剂量为3-300毫克/公斤体重范围；肌肉注射剂量为 该剂量的数倍；所述的嵌合蛋白质XR1/R2用于治疗/预防时的使用剂型，包 括肠道吸收剂型、注射剂型；所述的各种嵌合蛋白质的核酸编码的基因治疗 方法和剂量为0.4-4毫克/公斤体重。

四、附图说明

图1A至图1E是本发明嵌合蛋白质化合物的组成方式示意图。

图2是本发明分泌与抗人源免疫球蛋白抗体结合滴定曲线示图。

图3A是本发明与受体结合的趋化因子数量百分比示图。

图3B是本发明与受体结合的趋化因子百分比示图。

图4是本发明诱导细胞移动数量的百分比示图。

图5是本发明与受体结合的趋化因子数量百分比示图。

图6A是本发明趋化因子诱导移动的细胞数量的百分比示图。

图6B是本发明诱导肿瘤细胞移动的百分比示图。

图7是本发明与受体结合的趋化因子数量百分比示图。

图8是本发明趋化因子诱导移动的细胞数量的百分比示图。

图9是本发明与受体结合的趋化因子数量百分比示图。

图10是本发明趋化因子诱导移动的细胞数量的百分比示图。

五、具体实施方式

本发明设计并制备的是一些含有针对多种不同的趋化因子受体高效拮抗物 的嵌合蛋白质化合物。这些含有针对不同的趋化因子受体拮抗物的融合蛋白质 单体彼此之间共价相连，可以双倍体，四倍体，或多聚体的形式产出。图1A-一 E说明了这些嵌合蛋白质化合物的组成方式。

具体地说，上述趋化因子受体拮抗物部分包括(但不限于)氨基末端修饰 的ITAC，氨基末端修饰的SDF-1，氨基末端修饰的RANTES，氨基末端修饰的 MCP-1，氨基末端修饰的MCP-3，氨基末端修饰的MIP-3β，氨基末端修饰的GRO， 和6Ckine蔼的一个片段，等突变的无趋化因子功能的多肽化合物，以及它们 的衍生物或片段。有关的序列见附件1。比方，嵌合蛋白质XR4/R5/R1的拮抗 物部分包括蛋白序列1(或序列2)和序列3(或4)；嵌合蛋白质XR3/R5/R1 拮抗物部分包含蛋白序列3(或4)与蛋白序列5(或6)；嵌合蛋白质R7/XR4 拮抗物部分包含有蛋白序列1(或2)和序列7(或8)；嵌合蛋白质XR1/R2 包括蛋白序列9(或序列14)和序列10(或11或12或13)

上述与受体拮抗物相融合部分是人源免疫球蛋白的重链及轻链的恒定区 域。根据需要，融合可是不同的受体拮抗物与重链恒定区，主要是 IgG1，IgG4，IgG2的恒定区(其序列见附件1)，或轻链恒定区中的任何一个。 此外，还可利用其它的免疫球蛋白的恒定区序列(见世界基因库和EMBL数据 库)。由于与IgG1嵌合的化合物可以结合补体，引起ADCC反应，因而可以杀 伤与其结合的靶细胞。相反，与IgG4嵌合的化合物不结合补体，不会引起ADCC 反应。融合是在基因水平上进行的，含有针对不同受体拮抗物的融合蛋白单体 之间以共价相连。连接方式包括二硫桥，多肽，有机化合物等结构。这里可以 是两个重链之间相连，也可是重链与轻链之间相连。产物可以是双倍体，四倍 体，或多聚体的形式。

本发明的功能特征是嵌合蛋白全部采用人源的蛋白质的片段，不会在体内 引起明显的过敏反应。每种嵌合蛋白质都对两种或以上不同的趋化因子受体都 有显著的抑制作用。这里的受体包括(但不限于)趋化因子受体CCR1，CCR2， CCR3，CCR5，CCR7，CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4。显著的抑制作用指的是这 些嵌合蛋白质本身不具有活性，但可与各自相应的受体紧密结合(具有高亲和 力)，通过占有受体而抑制趋化因子的活性。此处趋化因子的活性指的是它们 可诱导人体的血液白细胞，主要包括T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，单核细胞，嗜 酸性粒细胞，中性粒细胞等，或某些肿瘤细胞，比如乳腺癌细胞的移动。另外， 趋化因子的刺激还具有使细胞内钙离子浓度增加，和/或一些胞内酶的释放等 功能。不同的趋化因子通过与特定的受体结合和刺激来诱导携带受体的靶细胞 产生移动，比如IP-10通过T-淋巴细胞表面的CXCR3受体来诱导T-细胞的移 动。例如，嵌合蛋白XR4/R5/R1抑制CCR5，CCR1，CCR3，CCR2和CXCR4受体； 嵌合蛋白XR3/R5/R1抑制CXCR3，CCR1和CCR5受体；嵌合蛋白XR4/R7抑制CCR7 和CXCR4受体，嵌合蛋白XR1/R2抑制CCR2和CXCR1，CXCR2受体。如果用纯 化好的嵌合蛋白质与同等克分子量的受体拮抗物来比较与受体的结合能力，则 嵌合蛋白质XR4 R5/R1比未嵌合的拮抗物的结合能力都高约1.5-3倍。

上述嵌合蛋白质的另一特征是在动物体内的半寿期都比受体拮抗物本身明 显提高，提高的倍数可达百倍以上。本文中例证12显示嵌合蛋白XR4/R5/R1 经静脉注射，在兔子血浆中的半寿期约为45小时，比未嵌合的受体拮抗物在 体内半寿期(0.25小时)长近180倍。已知人的IgG1抗体在兔子血浆中的半 寿期约为100小时，但在人体内的半寿期长达21天(由于人体血液循环比兔 慢得多)。因而，本发明的嵌合蛋白在人体内的半寿期应当接近人抗体IgG1的 半寿期(人抗体IgG1在人体内的半寿期为21天)。

本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的制备方法是，上述多靶性趋化因 子抑制剂嵌合蛋白质可利用基因重组方法构建。由于上述受体拮抗物都是基因 突变的无功能的趋化因子衍生物，可根据已发表的论文由人体的核酸库利用 RT-PCR方法先克隆各种趋化因子的基因片段，再利用克隆技术和基因突变技术 将这些趋化因子的基因序列加以改造。

关于其中与上述受体拮抗物相融合的人源免疫球蛋白的重链及轻链的恒定 区域部分，其基因序列可根据已发表的学术论文从人体的核酸库中通过RT-PCR 方法获得。将此重链或轻链的基因片段5‘端与上述受体拮抗物基因片段3’ 端分连接形成融合蛋白质。

此外，本发明提供了为表达上述嵌合蛋白质所必要的表达载体。表达载体 可利用质粒载体，如实施例1所示，也可是病毒载体，或其它通用的载体。载 体中带有启动子(如CMV启动子)，和增强子(如EU增强子)等等重要基因调 控片段。当然也可装入作为基因治疗用的载体，为了筛选方便，载体还可装进 针对不同抗菌素的阻抗基因，如此处利用的抗Neomycin和抗Puromycin的基 因。

本发明还提供了为表达上述嵌合蛋白基因所必需的宿主。上述构建好的两 个或三个含有不同融合蛋白基因的表达载体通过电击或其它方法同时被导入同 一个合适的宿主中进行表达。这里的宿主最好是用真核细胞，比方此处选择使 用的CHO细胞。它的长处是1.利用CHO表达生产蛋白制剂是目前世界上最成熟 和受欢迎的办法。大工业化生产工艺已成熟；2.CHO细胞可在无血清培养液中 生长传代。这使得整个生产过程无需使用任何动物制剂，从而避免了病毒污染； 3.用CHO细胞生产蛋白质工艺已得到美国FDA认可。若干种用此方法生产出 的蛋白制剂已完全达到临床合格标准。此外，常用的还有HEK293细胞，COS细 胞，NS/O或HELA细胞，还可是昆虫细胞，如Rf9细胞，或者是酵母细胞等等； 原核细胞如大肠杆菌E.Coli等也可作为宿主表达这些基因。所不同的是后者 生产出的嵌合蛋白质不能被糖化。稳定表达的细胞株通过筛选载体的抗菌素阻 抗基因而得到。

本发明还提供了如何提高产品产量的办法。比如此处使用的利用提高MTX 的办法筛选出高表达细胞株，以供生产使用。另外，可将GK酶基因接到嵌合蛋 白基因的同一载体中，通过提高酶底物将产量提高。

本发明提供了如何将上述多靶性趋化因子受体抑制剂嵌合蛋白以分泌蛋白 形式生产表达的方法，既在蛋白基因的氨基末端加上先导序列，使表达的产物 分泌到培养细胞的上清液中。先导序列在蛋白质分泌过程中被截掉。附件1给 出了一些先导序列的例子。此法好处是下游蛋白质产物纯化相对容易。除此之 外，也可以内源性蛋白形式表达。

本发明列举的实施例显示生产分泌出的嵌合蛋白产量可达15毫克/升上清 /109细胞每天。通过筛选细胞克隆还可进一步提高产量。本发明进一步提供了 如何将生产分泌的产物蛋白质分离纯化的方法。此处采用的是亲合层析的分离 法。亲合层析可使用蛋白质A，将其偶连到载体支撑物上，它与嵌合蛋白的免疫 球蛋白片段特异结合；或者使用抗嵌合蛋白受体拮抗物部分的抗体，都可达到 理想的分离纯化结果。

对本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的改变和修饰，如下的各种对专 利物的改变和修饰应当包括在本发明之内。

基本上说，如果对上述专利物的改变和修饰是为了达到增强治疗或预防效 应；或是为了提高产品在体外的稳定性(对体内蛋白酶的抵御能力)；或对专利 蛋白质在翻录合成后所做的修饰，如改变糖化或磷酸化成分，由这些变化衍生 出的产物只要保留有本专利物的主要特征，既应当包括在本发明之内。

这种修饰包括对专利物的氨基酸或它们的核酸序列通过取代，增加或截短 来加以改变，但改变的产物仍旧保留专利物的主要特征。比如亮氨酸可被异亮 氨酸或颉氨酸取代，酸性氨基酸之间(或碱性氨基酸之间，中性氨基酸之间， 极性氨基酸之间或非极性氨基酸之间，芳香性氨基酸之间)等等可相互取代。 一般认为，只要改变后的产物与本发明的各种蛋白的序列，尤其是趋化因子受 体拮抗剂片段的氨基末端的头40个氨基酸，有70％以上相同，就应属于本发明 范围之内。

另外，专利物蛋白质或它们的核酸序列亦可在其侧链化学基团上加上其它 化合物而保留专利物的主要特征，如盐基，从而增加其可溶性；或同位素，如 钴60，碘125，硫35等等，或荧光物，以达到杀伤靶细胞的作用(生物导弹)或 体内对靶细胞(如肿瘤细胞)的跟踪作用，从而增强疗效或应用于体内诊断。 另外，专利物蛋白质或它们的核酸序列亦可与其它功能的蛋白质或它们的核酸 序列嵌合杂交，如毒素片段，以达到杀伤靶细胞的作用。这些都是普遍运用的 保留专利物主要特征的方法。

最后，根据需要，融合可以是不同的受体拮抗物分别与下面任意一个：人 体免疫球蛋白重链恒定区，主要是(但不限于)IgG1，IgG4，IgG2的恒定区，或 轻链的恒定区中。比方CCR2受体拮抗物可与IgG1恒定区嵌合，或与IgG4恒定 区嵌合，或与轻链的恒定区融合。这里重链恒定区所指的是包含有绞链区(hinge region)可以加上CH1，CH2及CH3片段，或绞链区加CH1及CH2的片段，或绞 链区加CH2及CH3的片段。轻链的恒定区片段所指的包含人体免疫球蛋白轻链 的κ或λ的恒定区。

本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的测试方法。

本发明的多靶性趋化因子受体抑制嵌合蛋白可通过如下的实验方法加以鉴 定：测定其与两种或多种不同的趋化因子受体结合能力选出带有待测受体的靶 细胞(例如人的单核细胞株带有CCR1受体，可作为CCR1的靶细胞；还带有CCR2 受体，因而也可作为CCR2的靶细胞)。将所要测定受体的配体趋化因子(比方 针对CCR1受体的配体趋化因子是MIP-1α，CCR2的受体的配体趋化因子是MCP-1， 详情见表1)用同位素(比如碘125)加以标记。另一方面将固定量的标记配体趋 化因子与不同量的待测嵌合蛋白一起与受体靶细胞保温。如果嵌合蛋白与这个 受体结合，则同位素标记的配体趋化因子受到嵌合蛋白的竞争，与受体结合量 必定减少。所以通过测定与不同靶细胞结合的量来鉴定待测嵌合蛋白是否与它 们的配体趋化因子竞争结合受体，以及竞争的能力(亲合力)。

测定嵌合蛋白对两种或多种不同的趋化因子受体的抑制作用可用下述任意 一种办法：配体趋化因子可以诱导其受体靶细胞朝着趋化因子方向移动。通过 测定对细胞移动的作用可检测嵌合蛋白的功能。方法是取一个透膜测试板，将 趋化因子和待测嵌合蛋白加在测试板下面的孔里，上面孔里则只加受体靶细胞。 保温一定时间后，受趋化因子诱导受体靶细胞移动穿过两孔之间的膜进入下面 孔里。如果待测嵌合蛋白抑制受体的功能，则配体趋化因子诱导作用减低，导 致移动的靶细胞数量减少。

另外，配体趋化因子还可以诱导其受体靶细胞内钙离子浓度提高。方法是 先将受体靶细胞与特定荧光试剂一起保温，使其进入细胞。配体趋化因子的刺 激可引起受体的激活，从而导致胞内钙离子浓度提高，表现为荧光吸收度的瞬 间升高。受体抑制剂本身由于不能激活受体，所以没有上述效应，但可以抑制 配体趋化因子的这种作用。

测定体内半寿期。测定待测嵌合蛋白注射到动物体内(或其它方法给药) 后，在血液中的量减到注射量的一半所需要的时间。详情见实施例12。

本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的应用：

本发明包括了这些嵌合蛋白质或它们的基因片段(DNA，RNA)的应用。 a).作为药物应用于临床治疗，已发表的大量研究成果证明趋化因子的蛋白质 及其受体对许多疾病的病理过程都起到重要的作用。研究还发现，不少疾病都 涉及到多种不同的趋化因子受体。比方爱滋病毒感染，异体器官移植排斥反应， 某些肿瘤细胞的转移，各种自身免疫疾病，非特异性炎症疾病(见上)。还有其 它许多疾病在此不一一列举。这里发明的嵌合蛋白，由于能够高效地抑制多种 不同的趋化因子受体，克服了疾病病理的多样性复杂性。同时，由于嵌合蛋白 在体内的半寿期很长，能够维持药品有效浓度，所以从根本上克服了趋化因子 受体不断再生而造成的抑制不彻底的困扰。以上两个优点显然大大地提高了嵌 合蛋白的临床应用价值，适用于这类疾病的治疗和预防。具体举例(但不限于) 如下：艾滋病的HIV-1病毒主要利用CCR5和CXCR4趋化因子受体感染人类，此 外，许多HIV-1病毒还可利用CCR1，CCR2、CCR3等受体感染。因而本发明的嵌 合蛋白XR4/R5/R1因其可高效抑制上述所有受体(实施例4、实施例5)，因而 可抑制各种不同类型的HIV-1病毒感染。此外，嵌合蛋白XR4/R5/R1在体内稳 定长寿的性能保证体内的有效浓度的长久维持(实施例10)，真正有效地阻止 HIV-1病毒的感染。正是嵌合蛋白XR4/R5/R1的这些特点，使它必定成为目前 世界上最有效的预防HIV-1病毒感染的药物之一。可用于艾滋病的治疗和预防， 尤其应该适用于预防艾滋病妇对胎儿的感染，或是与HIV病毒携带者性交后防 止感染的急速补救。

又如，乳腺癌细胞表面几乎全都带有CXCR4和CCR7两种受体，从而决定了 这些癌细胞转移到骨髓，淋巴结和肺部，并在那里得以固定下来，迅速增长。 本发明的嵌合蛋白XR4/R7可长效地抑制上述两种受体(实施例6、实施例7)， 故可有效地抑制乳腺癌细胞向这些器官的转移。此应用还适用于其它一些肿瘤 细胞的转移(实施例6)。

又如，异体组织器官移植的排斥现象，象具有代表性的心脏移植的排斥， 动物试验显示是由于带有CXCR3，CCR5，CCR1受体的白细胞在起作用。本发明 的嵌合蛋白XR3/R5/R1(实施例8和实施例9)可高效，长效地抑制上述三种受 体(实施例10)，故可用于防止组织器官的被排斥，以及移植物抗宿主病。

又如自身免疫性疾病，还有非特异性炎症，研究发现造成病理损害的主 要因素是单核细胞和中性粒细胞(分别通过CCR2，CXCR1和CXCR2受体)。本 发明的嵌合蛋白XR2/R2可高效抑制上述三种受体(例证10和11)，而且体内 药效长，故可有效地抑制这两种细胞，减轻症状。 b).作为药物组成部分

本发明包括上述专利物被制备成不同的剂型用于治疗。单独或与其它成分一 起，作为药品的剂型可以是注射药品，口服药品或局部用药(包括直肠给药， 或喷雾给药的剂型如鼻部喷雾或口吸喷雾等)的各种剂型。例证12是作为溶液 静脉给药的例子。

本发明还包括上述专利物用于治疗的有效剂量。比如嵌合蛋白静脉给药，根 据疾病的情况，剂量在3-300毫克/公斤体重范围；如肌肉注射，剂量应为上述 的数倍；如是作基因治疗，质粒载体的剂量在0.4-4毫克/公斤体重；等等。 c).应用于基因治疗

本发明中的核酸序列可以用做基因治疗。这些序列可被装在不同的用于基因 治疗的载体中，比如已知的nacked DNA载体或病毒载体(比如腺病毒载体或逆 转录病毒载体)。基因被导入体内，通过在体内自行表达而达到治疗效果。治疗 的疾病包括(但不限于)艾滋病，肿瘤和异体组织器官排斥，各种自身免疫性 疾病。 d).应用于与其它方法或药物一起的联合治疗

这里发明的嵌合蛋白还可用于与其它方法或药物一起的联合治疗。比方(但 不限于)嵌合蛋白XR4/R7可与化疗和放射治疗一起使用，达到不仅抑制肿瘤转 移，还杀死肿瘤细胞的效果；嵌合蛋白XR4/R5/R1可与鸡尾酒疗法联合使用， 通过多种不同的作用渠道抑制HIV-1病毒的增长率，以达到更好的治疗效果； 嵌合蛋白XR3/R5/R1可与少量类固醇激素合用，对移植异体组织器官的排斥起 到更好的治疗效果；嵌合蛋白XR1/R2可与少量类固醇激素或其它免疫抑制剂合 用，共同对付顽固且严重的自身免疫性疾病等。 e).应用于体内诊断

这里发明的嵌合蛋白还可用于诊断。比方(但不限于)将嵌合蛋白经同位 素标记后用于乳腺癌细胞在病人体内转移的追踪。

为了便于对本项发明的了解，以下列举出一些有关本发明的具体实施例。 实施例1 嵌合蛋白XR4/R5/R1的基因重组

趋化因子SDF-1和RANTES的cDNA(包括先导序列)通过RT-PCR方法从人 组织的RNA中获得。将cDNA克隆到PCR2.1载体中。利用基因突变法将趋化因 子的基因改造，组成另外的核酸序列。另一方面，将人源免疫球蛋白IgG4的重 链恒定区的cDNA利用已经发表的序列从人脾脏的cDNA库中获得，并将这一片 段接到表达的载体中(这里用的是改造的pCR3.1载体pHC，利用CMV为启动子， EU为增强子，neomycin不敏感基因为筛选标志)。将上述基因工程改造的RANTES 序列片段和改造的SDF-1的序列片段的3’端通过限制性酶切点分别与IgG4的重 链恒定区(IgGγ4)的CH1段的5’端连接。另一方面，将利用已经发表的序列从 人脾脏的cDNA库中获得的人源免疫球蛋白轻链κ恒定区的cDNA片段接到表达载 体中(这里用的是改造的pCR3.1载体pLC，Puromycin不敏感基因为筛选标志)。

融合的方向是拮抗物的基因片段的3’末端与免疫球蛋白恒定区的5’末端连接 (相应地，其表达的蛋白质产物必须是通过受体拮抗物分子的羧基末端与免疫 球蛋白的重链及轻链的恒定区域的氨基末端肽键连接)(图3B)。

实施例2 嵌合蛋白XR4/R7的基因重组

趋化因子MIP-3β的基因通过PCR方法从人组织的cDNA库中获得，并克隆到 PCR2.1载体中。利用基因突变法将其改造成新的核酸序列。另一方面，将人源 免疫球蛋白IgG1的重链恒定区的cDNA(利用已经发表的序列从人脾脏的cDNA 库中获得)片段接到表达的载体中(这里用的是载体pHC，利用CMV为启动子， EU为增强子，neomycin不敏感基因为筛选标志)。将基因工程改造的MIP-3β的 序列片段和SDF-1的序列片段3’端分别与IgGγ1的5’端通过酶切点连接。另外， 制作人源免疫球蛋白轻链κ恒定区片段表达载体，同实施例1。 实施例3  嵌合蛋白XR4/R5/R1基因在真核细胞CHO里的表达

将带有上述CCR5拮抗物-IgGγ4序列和带有CXCR4拮抗物-IgGγ4序列，以 及轻链恒定区κ的三种不同的基因表达载体的DNA，线性化后同时导入CHO细胞 中加以表达。经过用G418(1毫克/毫升)，和Purimycin(3微克/毫升)3周的筛 选，得到稳定表达细胞株。为了获得高产细胞株，利用提高MTX的办法筛选出 高表达细胞株。将筛选的细胞株培养一天后收集细胞的培养上清。

通过ELISA方法鉴定转基因的细胞是否合成并分泌嵌合蛋白。具体说来，将 收集的培养上清液与制备好的鼠抗人IgG抗体作结合试验。图2显示克隆的基 因已已被插入CHO细胞基因并成功表达，合成的嵌合蛋白已分泌到培养液中， 因而可以与抗人体IgG抗体呈剂量依赖的结合竞争。

通过对不同趋化因子受体的结合试验(见实施例4)证明，其中大约20％的 克隆分泌嵌合蛋白分别与CXCR4和CCR5等多种受体结合，说明这些嵌合蛋白含 有两种不同单体。扩大并冷冻保存几个克隆。

分泌上清经分离纯化测定，产量为每106细胞每天分泌15-25微克/毫升嵌 合蛋白质。其主要分子约75kDa大小，加上表达细胞对Puromycin和Neomycin 都不敏感，说明嵌合蛋白是由重链和轻链嵌合蛋白组成的四倍体。

上述实验结果显示，无论是两个重链嵌合蛋白之间形成的的双倍体，还是 由重链和轻链嵌合蛋白组成的四倍体，既如图1A所描述的结构，都可成功表达。

为了鉴定嵌合蛋白XR4/R5是否有受体抑制剂的功能，共做了如下两个实 验： 实施例4  对生产表达的嵌合蛋白XR4/R5/R1特征的鉴定-对不同趋化因子受体 的结合。

首先测定上述基因工程制作和分泌的嵌合蛋白R5/XR4是否能与CCR5，CCR1， CCR2，CCR3，和CXCR4受体高亲合力地结合。为此做了受体结合竞争实验。人 的单核细胞表面带有CCR1，CCR2，CCR5受体，人的嗜酸性粒细胞表面带有CCR3 受体，人的T-淋巴细胞株带有CXCR4受体。这三个细胞株作为这些受体的靶细 胞。将含有嵌合蛋白XR4/R5/R1的培养上清液与固定剂量的同位素I125标记的 配体趋化因子混合，并与这些受体竞争结合：其中，MIP-1α是CCR1的配体趋化 因子，MCP-1是CCR2的配体，Eotaxin是CCR3的配体，RANTES是CCR5的配体， SDF-1α则是CXCR4受体的配体。图3显示嵌合蛋白XR4/R5/R1与上述受体表现 很强的结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。利用蛋白 质A做亲合层析，将上清中的分泌蛋白分离纯化。之后，以相同克分子浓度比 较，嵌合蛋白XR4/R4比未融合的拮抗剂的亲合力为高。 实施例5  对生产表达的嵌合蛋白XR4/R5/R1特征的鉴定-对不同趋化因子受体 功能的抑制。

利用细胞移动抑制试验来检测基因工程制作的嵌合蛋白XR4/R5/R1对受体 的抑制作用。配体趋化因子可诱导带有它们受体的靶细胞定向移动。将人的单 核细胞，人的嗜酸性粒细胞和T-淋巴细胞株这三个细胞株作为这些受体的靶细 胞。如图4所示，各种配体趋化因子分别诱导各自的靶细胞移动(定为移动的 100％)。含有不同浓度的嵌合蛋白XR4/R5/R1培养上清液的加入呈剂量依赖状 地抑制细胞的移动：通过抑制CCR1，CCR2和CCR5受体而抑制由MIP-1α，MCP- 1和RANTES诱导的THP-1细胞的移动；通过抑制CCR3受体抑制Eotaxin诱导 的嗜酸性粒细胞的移动；通过对CXCR4受体的抑制而抑制SDF-1α诱导的CEM-M3 细胞的移动。抑制程度与嵌合蛋白XR4/R5/R1对受体的结合能力相吻合。 实施例6 对生产表达的嵌合蛋白XR4/R7特征的鉴定-对不同趋化因子受体的结 合。测定基因工程制作和分泌的嵌合蛋白XR4/R7是否能与CCR7，CXCR4受体高 亲合力结合。为此做了受体结合竞争实验。人的T-淋巴细胞株(CXCR4受体) 和人的带有CCR7受体的T细胞株作为受体的靶细胞。将含有嵌合蛋白XR4/R7 的培养上清液分别与同位素I125标记的配体趋化因子SDF-1α和6Ckine或MIP-3β 混合，并与这些受体作竞争结合。图5显示嵌合蛋白XR4/R7与上述受体紧密结 合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。若以相同克分子浓 度比较，嵌合蛋白XR4/R7比未融合的拮抗剂的亲合力都明显高。 实施例7  嵌合蛋白XR4/R7抑制乳腺癌细胞株的移动

利用两个人的乳腺癌细胞株T-47D和MDA-7作为靶细胞，测试了嵌合蛋白 XR4/R7对乳腺癌细胞移动的抑制作用。如图6所示，CCR7受体的配体趋化因子 6CKine或MIP-3β，以及CXCR4的配体SDF-1都诱导这两个乳腺癌细胞株的移动 (此处只示出T-47D的结果)。含有不同浓度的嵌合蛋白XR4/R7的培养上清液 的加入呈剂量依赖状地抑制SDF-1α和6CKine(或MIP-3β)诱导的乳腺癌细胞 的移动。抑制程度与嵌合蛋白XR4/R7对受体的结合能力相吻合。 实施例8  对生产表达的嵌合蛋白XR3/R5/R1特征的鉴定-对不同趋化因子受体 的结合。测定基因工程制作和分泌的嵌合蛋白XR3/R5/R1是否能与CCR1，CCR5 和CXCR3受体高亲合力结合。用激活的人外周血的T细胞作为CXCR3和CCR5的 靶细胞，单核细胞做为CCR1受体的靶细胞。将分离得到的T细胞与细胞因子白 介素-2一起保温，使T细胞得到激活。激活的T细胞和单核细胞与嵌合蛋白XR3/ R5/R1的培养上清液，以及分别与同位素I125标记的配体趋化因子IP-10或RANTES， 或MIP-1α混合一起，与这些受体作竞争结合。图7显示嵌合蛋白XR3/R5/R1与 上述受体紧密结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。 实施例9  对生产表达的嵌合蛋白XR3/R5/R1特征的鉴定-通过对不同趋化因子 受体的抑制来抑制靶细胞移动。

利用激活的人外周血的T细胞作为CXCR3和CCR5的靶细胞，单核细胞做为 CCR1受体的靶细胞。细胞的制备如例证8。如图8所示，CCR1受体的配体趋化 因子MIP-1α，以及CXCR3的配体IP-10和CCR5的配体RANTES都诱导上述靶细 胞的移动。含有不同浓度的嵌合蛋白XR3/R5/R1的培养上清液的加入呈剂量依 赖状地抑制IP-10，MIP-1α或RANTES诱导的靶细胞的移动。抑制程度与嵌合蛋 白XR3/R5/R1对受体的结合能力相吻合。 实施例10  对生产表达的嵌合蛋白XR1/R2特征的鉴定-对不同趋化因子受体的 结合。

测定基因工程制作和分泌的嵌合蛋白XR2/R2是否能与CCR2，CXCR1和CXCR2 受体高亲合力结合。用人外周血的中性粒细胞作为CXCR1和CXCR2的靶细胞， 单核细胞做为CCR2受体的靶细胞。将分离得到的中性粒细胞和单核细胞立即与 嵌合蛋白XR2/R2的培养上清液，以及分别与同位素I125标记的配体趋化因子IL-8 或GRO-α，或MCP-1混合一起，与这些受体作竞争结合。图9显示嵌合蛋白XR2/R2 与上述受体紧密结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。 实施例11   对生产表达的嵌合蛋白XR1/R2特征的鉴定-通过对不同趋化因子受 体的抑制来抑制靶细胞移动。利用人体外周血的中性粒细胞作为CXCR1和CXCR2 受体的靶细胞，单核细胞做为CCR2受体的靶细胞测试了嵌合蛋白XR1/R2对CCR2 和CXCR1，CXCR2受体介导的细胞移动的抑制作用。如图10所示，CCR2受体的 配体趋化因子MCP-1，以及CXCR1的配体IL-8和CXCR2的配体GROα都诱导上述 靶细胞的移动。含有不同浓度的嵌合蛋白XR1/R2的培养上清液的加入呈剂量依 赖状地抑制IL-8，GROα或MCP-1诱导的靶细胞的移动。抑制程度与嵌合蛋白 XR1/R2对受体的结合能力相吻合。 实施例12  嵌合蛋白R5/XR4在动物体内的药代动力实验

50微克纯化并用I125标记的嵌合蛋白XR4/R5/R1(二倍体)，嵌合蛋白XR4 /R5/R1(四倍体)或未融合的拮抗蛋白质由左耳静脉分别打入体重2公斤的兔 子体内。每隔10分钟从兔子的右耳静脉取5-10毫升血。通过测定同位素检测 血液中人的免疫球蛋白重链的含量。由于未融合的拮抗蛋白质消失非常快，而 嵌合蛋白在血中浓度稳定，从第而天开始，改为每隔1-2天抽从后者取一次样。 如下面表2所示，I125标记的非融合拮抗蛋白在兔外周血中的半寿期仅有大约15 分钟，而I125标记的嵌合蛋白XR4/R5/R1(二倍体)的半寿期大约为45小时，I125 标记的嵌合蛋白XR4/R5/R1(四倍体)的半寿期大约为110小时，是未融合的 拮抗蛋白质的大约180-400倍。

本发明中涉及的定义

1.趋化因子：体内自然存在的一大家族蛋白质，它们特异地诱导各种白细胞定 向移动。其中一些参与炎症反应，另一些负责白细胞在体内定位。每个趋化 因子都有自己相应的受体。具体情况见表1。

2.趋化因子受体拮抗物(简称受体拮抗物)：可与趋化因子受体结合，本身没 有功能，却可抑制趋化因子功能的化合物。这里，受体拮抗物指的都是一些 突变的无功能的趋化因子衍生物。

3.人源免疫球蛋白：共分为IgG，IgA，IgM，IgD，IgE5大类。其中IgG又分 为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4亚类，(由重链和轻链组成)，它们的重链被相应地 命名为IgGγ1，IgGγ2，IgGγ3，IgGγ4，轻链则有κ或λ两种。

4.多靶性趋化因子抑制剂：可以抑制至少两个不同的趋化因子受体的化合物。

5.融合蛋白：将两个不同蛋白质的基因片断相连接，其表达产物是一条由两个 不同蛋白质彼此之间以肽键相连接的单链蛋白质。

6.嵌合蛋白质化合物(简称嵌合蛋白)：两个不同的蛋白质的基因片段在同一 宿主内表达，生产出的是两个不同的蛋白质单体，彼此之间再共价连接的产 物。

7.配体趋化因子：与某种受体特异结合并产生生物效应的趋化因子被称为这种 受体的配体趋化因子(表1)

表1  与本文相关的配体趋化因子及相应的受体

趋化因子惯用         趋化因子国际新              受体名称 名                    命名

MCP-1                CCL2                        CCR2

MCP-3                CCL7                        CCR2

MIP-1α                              CCL3                        CCR1

RANTES               CCL5                        CCR5

TP-10                CXCL10                      CXCR3

I-TAC                 CXCL11               CXCR3

Eotaxin               CCL11                CCR3

MIP-3β                                CCL19                CCR7

6CKine                CCL21                CCR7

SDF-1                 CXCL12               CXCR4

IL-8                  CXCL8                CXCR1/CXCR2

GROα                                    CXCL1                CXCR2

表2

                      嵌合蛋白质的某些特征     名称   单位的结构 在兔血浆中的 半寿期(小时)   与补体结合 与蛋白质A结合 趋化因子蛋白质 非嵌合蛋白质     0.25     不结合     不结合   嵌合蛋白质   双倍体   重链2     45     不结合     结合   嵌合蛋白质   四倍体 重链2轻链2     110     结合     结合 本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的特征 化学结构特征

本发明设计并制备的是一些含有针对多种不同的趋化因子受体高效拮抗物的 嵌合蛋白质化合物。这些含有针对不同的趋化因子受体拮抗物的融合蛋白质单 体彼此之间共价相连，可以双倍体，四倍体，或多聚体的形式产出。图1A-一E 说明了这些嵌合蛋白质化合物的组成方式。

具体地说，上述趋化因子受体拮抗物部分包括(但不限于)氨基末端修饰的 ITAC，氨基末端修饰的SDF-1，氨基末端修饰的RANTES，氨基末端修饰的MCP-1， 氨基末端修饰的MCP-3，氨基末端修饰的MIP-3β，氨基末端修饰的GRO，和 6Ckine蔼的一个片段，等突变的无趋化因子功能的多肽化合物，以及它们的衍 生物或片段。有关的序列见附件1。比方，嵌合蛋白质XR4/R5/R1的拮抗物部 分包括蛋白序列1(或序列2)和序列3(或4)；嵌合蛋白质XR3/R5/R1拮抗物 部分包含蛋白序列3(或4)与蛋白序列5(或6)；嵌合蛋白质R7/XR4拮抗物 部分包含有蛋白序列1(或2)和序列7(或8)；嵌合蛋白质XR1/R2包括蛋白 序列9(或序列14)和序列10(或11或12或13)

上述与受体拮抗物相融合的部分是人源免疫球蛋白的重链及轻链的恒定区 域。根据需要，融合可以是不同的受体拮抗物与重链恒定区，主要是 IgG1，IgG4，IgG2的恒定区(其序列见附件1)，或轻链的恒定区中的任何一个。 此外，还可利用其它的免疫球蛋白的恒定区序列(见世界基因库和EMBL数据 库)。由于与IgG1嵌合的化合物可以结合补体，引起ADCC反应，因而可以杀伤 与其结合的靶细胞。相反，与IgG4嵌合的化合物则不结合补体，不会引起ADCC 反应。融合是在基因水平上进行的。含有针对不同受体拮抗物的融合蛋白单体 之间以共价相连。连接方式包括二硫桥，多肽，有机化合物等结构。这里可以 是两个重链之间相连，也可是重链与轻链之间相连。产物可以是双倍体，四倍 体，或多聚体的形式。 功能特征

由于嵌合蛋白全部采用人源蛋白质片段，不会在体内引起明显的过敏反应。

每种嵌合蛋白质都对两种或以上不同的趋化因子受体都有显著的抑制作用。 这里的受体包括(但不限于)趋化因子受体CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CCR7，CXCR1， CXCR2，CXCR3，CXCR4。显著的抑制作用指的是这些嵌合蛋白质本身不具有活性， 但可与各自相应的受体紧密结合(具有高亲和力)，通过占有受体而抑制趋化因 子的活性。此处趋化因子的活性指的是它们可诱导人体的血液白细胞，主要包 括T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞等，或某 些肿瘤细胞，比如乳腺癌细胞的移动。另外，趋化因子的刺激还具有使细胞内 钙离子浓度增加，和/或一些胞内酶的释放等功能。不同的趋化因子通过与特定 的受体结合和刺激来诱导携带受体的靶细胞产生移动，比如IP-10通过T-淋巴 细胞表面的CXCR3受体来诱导T-细胞的移动。例如，嵌合蛋白XR4/R5/R1抑制 CCR5，CCR1，CCR3，CCR2和CXCR4受体；嵌合蛋白XR3/R5/R1抑制CXCR3，CCR1 和CCR5受体；嵌合蛋白XR4/R7抑制CCR7和CXCR4受体，嵌合蛋白XR1/R2抑 制CCR2和CXCR1，CXCR2受体。

如果用纯化好的嵌合蛋白质与同等克分子量的受体拮抗物来比较与受体的结 合能力，则嵌合蛋白质XR4 R5/R1比未嵌合的拮抗物的结合能力都高约1.5-3 倍。

上述嵌合蛋白质的另一特征是在动物体内的半寿期都比受体拮抗物本身明 显提高，提高的倍数可达百倍以上。本文中例证12显示嵌合蛋白XR4/R5/R1 经静脉注射，在兔子血浆中的半寿期约为45小时，比未嵌合的受体拮抗物在体 内半寿期(0.25小时)长近180倍。已知人的IgG1抗体在兔子血浆中的半寿期 约为100小时，但在人体内的半寿期长达21天(由于人体血液循环比兔慢得多)。 因而，本发明的嵌合蛋白在人体内的半寿期应当接近人抗体IgG1的半寿期(人 抗体IgG1在人体内的半寿期为21天)。

本发明长效广谱的趋化因子受体抑制物的序列(附件1，例证，不仅限于此)

包括表达蛋白的核酸序列，表达蛋白的氨基酸序列及带有先导序列的氨基 酸序列。 趋化因子受体拮抗物蛋白质序列： (1)XR4拮抗物1(SDF-1P2G) 1.1带先导序列    MNAKVVVVLVLVLTALCLSDGKGVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLK    NNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM 1.2分泌蛋白质序列 KGVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNK RFKM (2)XR4拮抗物2 2.1带先导序列    MNAKVVVVLVLVLTALCLSDGPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKN    NNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM 2.2分泌蛋白质序列(SDF-1(2-72)) PVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKR FKM (3)R5拮抗物1(RANTES(9-68)) 3.1带先导序列

MKVSAAALAVILIATALCAPASAPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVC ANPEKKWVREYINSLEMS 3.2分泌蛋白质序列

PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS (4)R5拮抗物2(RANTES(8-68)) 4.1带先导序列

MKVSAAALAVILIATALCAPASATPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQV CANPEKKWVREYINSLEMS 4.2分泌蛋白质序列 TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS (5)XR3拮抗物1(ITAC(4-73)) 5.1带先导序列

MSVKGMAIALAVILCATVVQGFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKE NKGQRCLNPKSK QARLIIKKVE RKNF 5.2分泌蛋白质序列

FKRGRCLCIGPGVKAV KVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNF (6)XR3拮抗物2(ITAC(3-73)) 6.1带先导序列

MSVKGMAIALAVILCATVVQGMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLK ENKGQRCLNPKSK QARLIIKKVE RKNF 6.2分泌蛋白质序列

MFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKK VERKNF (7).R7拮抗物1(MIP-3β(8-77)) 7.1带先导序列 MALLLALSLLVLWTSPAPTLSCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPD QPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS 7.2分泌蛋白质序列

CCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKM KRRSS (8)R7拮抗物(6CKine(8-79)) 8.1带先导序列 MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELC ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG 8.2分泌蛋白质序列    CCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPS PQKPAQG

(9)XR1拮抗物1(IL-8(6-72)) 9.1带先导序列

MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPR--- RCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS″ 9.2分泌蛋白质序列    RCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAE NS″ (10)R2拮抗物1(MCP-3(9-76)) 10.1带先导序列 MKASAALLCLLLTAAAFSPQGLA--- TTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHLDKKTQTPKL 10.2分泌蛋白质序列 TTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHLDKKTQTPKL (11)R2拮抗物2(MCP-3(8-76)) 11.1带先导序列 MKASAALLCLLLTAAAFSPQGLA--- STTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHLDKKTQTPK L 11.2分泌蛋白质序列 STTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHL (12)R2拮抗物(MCP-1(9-76)) 12.1带先导序列 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA-- VTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT 12.2分泌蛋白质序列

VTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQT PKT (13)R2拮抗物4(MCP-1(8-76)) 13.1带先导序列 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA-- PVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPK T 13.2分泌蛋白质序列

PVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQ TPKT (14)XR2拮抗物1(GROα(8-73)) 14.1带先导序列 MARAALSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAAGRRAAG ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNG

RKACLNPASPIVKKIIEKMLN SDKSN 14.2分泌蛋白质序列

ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNG RKACLNPASPIVKKIIEKMLN SDKSN 嵌合的蛋白序列(例子，但不局限于)： 15.人源免疫球蛋白IgG1的定区：

ASFKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 16.人源免疫球蛋白IgG2的定区：

ASFKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTWVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFCVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 17.人源免疫球蛋白IgG4的定区：

ASFKGPSVFPLVPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSCALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQF NWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVRVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK″ 18.人源免疫球蛋白轻链κ的定区：

TAAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 趋化因子受体拮抗物的核酸序列(例子，但不局限于)： (ND.1)XR4拮抗物1(SDF-1P2G) atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac gggaagGGcg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatgtga (ND.2)XR4拮抗物2(SDF_1(2-73) atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac gggcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatgtga (ND.3)R5拮抗物1 RANTES(8-68) atgaaggtc tccgcggcag ccctcgctgt catcctcatt gctactgccc tctgcgctcc tgcatctgcc acaccctgc tgctttgcct acattgcccg cccactgccc cgtgcccaca tcaaggagta tttctacacc agtggcaagt gctccaaccc agcagtcgtc tttgtcaccc gaaagaaccg ccaagtgtgt gccaacccag agaagaaatg ggttcgggag tacatcaact ctttggagat gagctag (ND.4)R5拮抗物2(RANTES(9-68)) atgaaggtc tccgcggcag ccctcgctgt catcctcatt gctactgccc tctgcgc ccc tgcatctgcc tcctgc tgctttgcct acattgcccg cccactgccc cgtgcccaca tcaaggagta tttctacacc agtggcaagt gctccaaccc agcagtcgtc tttgtcaccc gaaagaaccg ccaagtgtgt gccaacccag agaagaaatg ggttcgggag tacatcaact ctttggagat gagctag (ND.5)XR3拮抗物1(ITAC(4-73)) atgag tgtgaagggc atggctatag ccttggctgt gatattgtgt gctacagttg ttcaaggc---ttc aaaagaggac gctgtctttg cataggccct ggggtaaaag cagtgaaagt ggcagatatt gagaaagcct ccataatgta cccaagtaac aactgtgaca aaatagaagt gattattacc ctgaaagaaa ataaaggaca acgatgccta aatcccaaat cgaagcaagc aaggcttata atcaaaaaag ttgaaagaaa gaatttttaa (ND.6)XR3拮抗物2(ITAC(3-73)) atgag tgtgaagggc atggctatag ccttggctgt gatattgtgt gctacagttg ttcaaggc ---atgttc aaaagaggac gctgtctttg cataggccct ggggtaaaag cagtgaaagt ggcagatatt gagaaagcct ccataatgta cccaagtaac aactgtgaca aaatagaagt gattattacc ctgaaagaaa ataaaggaca acgatgccta aatcccaaat cgaagcaagc aaggcttata atcaaaaaag ttgaaagaaa gaatttttaa (ND.7)R7拮抗物1(MIP-3β(8-77)) at ggccctgcta ctggccctca gcctgctggt tctctggact tccccagccc caactctgag t__tgctgcct gtctgtgacc cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg aacttccact accttctcat caaggatggc tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca gaccagccct gggtagaacg catcatccag agactgcaga ggacctcagc caagatgaag cgccgcagca gttaa (ND.8)R7拮抗物2(6CKine(8-79)) atggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac ccaaggctg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca gggc (ND.9)XR1拮抗物1(IL-8(6-72)) atgacttcca agctggccgt ggctctcttg gcagccttcc tgatttctgc agctctgtgt gaaggtgcag ttttgccaag g ---agat gtcagtgcat aaagacatac tccaaacctt tccaccccaa atttatcaaa gaactgagag tgattgagag tggaccacac tgcgccaaca cagaaattat tgtaaagctt tctgatggaa gagagctctg tctggacccc aaggaaaact gggtgcagag ggttgtggag aagtttttga agagggctga gaattcataa (ND.10)R2拮抗物1(MCP-3(8-76)) atgaaagcct ctgcagcact tctgtgtctg ctgctcacag cagctgcttt cagcccccag gggcttgct ---tcaactacct gctgctacag atttatcaat aagaaaatcc ctaagcagag gctggagagc tacagaagga ccaccagtag ccactgtccc cgggaagctg taatcttcaa gaccaaactg gacaaggaga tctgtgctga ccccacacag aagtgggtcc aggactttat gaagcacctg gacaagaaaa cccaaactcc aaagctttga (ND.11)R2拮抗物2(MCP-3(9-76)) atgaaagcct ctgcagcact tctgtgtctg ctgctcacag cagctgcttt cagcccccag gggcttgct ---actacct gctgctacag atttatcaat aagaaaatcc ctaagcagag gctggagagc tacagaagga ccaccagtag ccactgtccc cgggaagctg taatcttcaa gaccaaactg gacaaggaga tctgtgctga ccccacacag aagtgggtcc aggactttat gaagcacctg gacaagaaaa cccaaactcc aaagctttga (ND.12)R2拮抗物3(Mcp-1(8-76)) atgaaag tctctgccgc ccttctgtgc ctgctgctca tagcagccac cttcattccc caagggctcg ct ----ccagtca cctgctgtta taacttcacc aataggaaga tctcagtgca gaggctcgcg agctatagaa gaatcaccag cagcaagtgt cccaaagaag ctgtgatctt caagaccatt gtggccaagg agatctgtgc tgaccccaag cagaagtggg ttcaggattc catggaccac ctggacaagc aaacccaaac tccgaagact tgaa (ND.13)R2拮抗物4(Mcp-1(9-76)) atgaaag tctctgccgc ccttctgtgc ctgctgctca tagcagccac cttcattccc caagggctcg ct ----gtca cctgctgtta taacttcacc aataggaaga tctcagtgca gaggctcgcg agctatagaa gaatcaccag cagcaagtgt cccaaagaag ctgtgatctt caagaccatt gtggccaagg agatctgtgc tgaccccaag cagaagtggg ttcaggattc catggaccac ctggacaagc aaacccaaac tccgaagact tgaa (ND.14)XR2拮抗物1 GROα(8-73) a tggcccgcgc tgctctctcc gccgccccca gcaatccccg gctcctgcga gtggcactgc tgctcctgct cctggtagcc gctggccggc gcgcagcagg a-cgctgcca gtgcttgcag accctgcagg gaattcaccc caagaacatc caaagtgtga acgtgaagtc ccccggaccc cactgcgccc aaaccgaagt catagccaca ctcaagaatg ggcggaaagc ttgcctcaat cctgcatccc ccatagttaa gaaaatcatc gaaaagatgc tgaacagtga caaatccaac tga 嵌合的核酸序列(例子，但不局限于)： ND15.人源免疫球蛋白IgG1的定区： 1   gcaagcttca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 61  ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 181 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 241 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 301 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 361 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 421 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 481 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 541 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 601 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 661 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 721 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 781 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 841 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 901 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 961 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa ND16.人源免疫球蛋白IgG2的定区： 1   gcaagcttca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 61  agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 181 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 241 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 301 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 361 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgg 421 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 481 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttctgt 541 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 601 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 661 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 721 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 781 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 841 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 901 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 961 tccctgtctc cgggtaaa ND 17.人源免疫球蛋白IgG4的定区：   1 gcaagcttca agggcccatc ggtcttcccc ctggtgccct gctccaggag cacctccgag  61 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcat gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 181 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 241 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 301 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 361 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 421 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 481 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 541 cgtgtggtca gggtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 601 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 661 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacaccc tgcccccat cccaggagga gatgaccaag 721 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 781 tgggagagca atgggcagcc ggaggacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 841 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 901 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 961 ctctccctgt ctccgggtaa actctccctgtctctgggtaaa ND 18.人源免疫球蛋白轻链κ的定区：   1 actgcggccg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga  61 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 121 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 181 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 241 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 301 ttcaacaggg gagagtgttga 有关主要发明的图表说明

图1A-C是本发明设计并制造的某些嵌合蛋白质的示意图。这里的拮抗物 1，2，3可分别代表本发明所包括的任意四种不同的拮抗物。同样地，这里的 重链可以是人源免疫球蛋白包括IgG1，IgG4，IgG2的任意一种重链；这里的轻链 可以是κ或λ中的任何一种。这里的CH1，CH2，CH3是指重链的恒定区的三个片段； CL代表的是轻链的恒定区；这里嵌合蛋白单体之间的连接或二硫桥所代表的是 包括二硫桥键在内的不同种共价连接物。详情见发明的详细说明。

图2用ELISA方法做抗人体IgG抗体的结合竞争试验。

结果显示克隆的嵌合蛋白XR4/R5/R1基因已被插入CHO细胞基因并成功表 达，合成的嵌合蛋白已分泌到培养液中，因而可以与抗人体IgG抗体呈剂量依 赖的结合竞争。

图3A不同趋化因子与其受体的结合竞争试验。

人的单核细胞表面带有CCR1，CCR2，CCR5受体，人的嗜酸性粒细胞表面带 有CCR3受体，人的T-淋巴细胞带有CXCR4受体。这三个细胞株作为这些受体 的靶细胞。将含有嵌合蛋白XR4/R5/R1的培养上清液与固定剂量的同位素I125 标记的配体趋化因子混合，并与这些受体竞争结合：其中，MIP-1α是CCR1的 配体趋化因子，MCP-1是CCR2的配体，Eotaxin是CCR3的配体，RANTES是CCR5 的配体，SDF-1α则是CXCR4受体的配体。结果显示嵌合蛋白XR4/R5/R1与上 述受体表现很强的结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。

图3B不同融合的蛋白与受体的结合试验

将含有核酸序列ND.1的3’末端(相当于SDF-1P2G蛋白的羧基末端)与 核酸序列ND.14的5’末端连接融合的蛋白质(C-N融合，环形标志)和核酸 序列ND.1的5’末端与核酸序列ND.14的末端连接融合的蛋白质(三角形标志) 的转基因细胞所分泌上清与固定量的碘125标记的趋化因子SDF-1做受体结合 竞争试验。结果显示C-N融合蛋白具有受体结合能力。

图4细胞移动抑制试验。

将人的单核细胞，人的嗜酸性粒细胞和T-淋巴细胞株这三个细胞株作为这 些受体的靶细胞。如图所示，各种配体趋化因子分别诱导各自的靶细胞移动(定 为移动的100％)。含有不同浓度的嵌合蛋白XR4/R5/R1培养上清液的加入呈剂 量依赖状地抑制细胞的移动：通过抑制CCR1，CCR2和CCR5受体而抑制由MIP- 1α，MCP-1和RANTES诱导的THP-1细胞的移动；通过抑制CCR3受体抑制Eotaxin 诱导的嗜酸性粒细胞的移动；通过对CXCR4受体的抑制而抑制SDF-1α诱导的 CEM-M3细胞的移动。

图5受体结合竞争实验。

人的带有CXCR4受体的T-淋巴细胞株和人的带有CCR7受体的细胞株()作 为受体的靶细胞。将含有嵌合蛋白XR4/R7的培养上清液分别与同位素I125标记 的配体趋化因子SDF-1α和6Ckine或MIP-3β混合，并与这些受体作竞争结合。 如显示嵌合蛋白XR4/R7与上述受体紧密结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大 部分趋化因子的结合)。

图6嵌合蛋白XR4/R7抑制乳腺癌细胞株的移动

利用两个人的乳腺癌细胞株T-47D作为靶细胞，测试了嵌合蛋白XR4/R7对 乳腺癌细胞移动的抑制作用。如图所示，CCR7受体的配体趋化因子6CKine或 MIP-3β，以及CXCR4的配体SDF-1都诱导这两个乳腺癌细胞株的移动。图6A：含 有不同浓度的嵌合蛋白XR4/R7的培养上清液的加入呈剂量依赖状地抑制SDF-1α 和6CKine(或MIP-3β)诱导的乳腺癌细胞的移动。图6B：CXCR4受体拮抗剂 SDF-1P2G只能通过抑制CXCR4受体来抑制SDF-1诱导的T47乳腺癌细胞移动， 却不能抑制6Ckine(通过CCR7受体)诱导的乳腺癌细胞移动。说明只有当乳 癌细胞T47D的两个受体都受到抑制，才能阻止癌细胞的移动。

图7测定基因工程制作和分泌的嵌合蛋白XR3/R5/R1是否能与CCR5，CCR1， 和CXCR3受体高亲合力结合。

用人外周血的T-淋巴细胞和单核细胞株作为受体的靶细胞。先将分离得到 的T-细胞用细胞因子白介素-2激活。后将含有嵌合蛋白XR3/R5/R1的培养上清 液分别与同位素I125标记的配体趋化因子IP-10或RANTES，或MIP-1α混合一起， 与这些受体作竞争结合。图示嵌合蛋白XR3/R5/R1与上述受体紧密结合的能力 (50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。

图8 T-淋巴细胞和单核细胞移动抑制试验

利用激活的人体T-淋巴细胞和单核细胞株作为靶细胞，测试了嵌合蛋白 XR3/R5/R1对CCR1，CCR5和CXCR3受体介导的细胞移动的抑制作用。如图所示， CCR5受体的配体趋化因子RANTES，以及CXCR3的配体IP-10都诱导激活的T- 淋巴细胞的移动，CCR1受体的配体趋化因子MIP-1α诱导单核细胞移动，。含有 不同浓度的嵌合蛋白XR3/R5/R1的培养上清液的加入呈剂量依赖状地抑制IP-10， MIP-1α或RANTES诱导的靶细胞的移动。

图9测定基因工程制作和分泌的嵌合蛋白XR1/R2与CCR2，CXCR1和CXCR2 受体的结合。

用人外周血的中性粒细胞作为CXCR1和CXCR2的靶细胞，单核细胞株做为 CCR2受体的靶细胞。将分离得到的中性粒细胞和单核细胞立即与嵌合蛋白 XR1/R2的培养上清液，以及分别与同位素I125标记的配体趋化因子IL-8或 GRO-α，或MCP-1混合一起，与这些受体作竞争结合。结果显示嵌合蛋白XR1/R2 与上述受体紧密结合的能力(50％细胞上清可抑制绝大部分趋化因子的结合)。

图10人的中性粒细胞细胞和单核细胞移动抑制试验

利用人体外周血的中性粒细胞作为CXCR1和CXCR1受体的靶细胞，单核细 胞株做为CCR2受体的靶细胞测试了嵌合蛋白XR1/R2对CCR2和CXCR1，CXCR2 受体介导的细胞移动的抑制作用。如图所示，CCR2受体的配体趋化因子MCP-1， 以及CXCR1的配体IL-8和CXCR2的配体GROα都诱导上述靶细胞的移动。含有 不同浓度的嵌合蛋白XR2/R2的培养上清液的加入呈剂量依赖状地抑制IL-8， GROα或MCP-1诱导的靶细胞的移动。

表2 嵌合蛋白质的一些特征

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。