本发明涉及由于蛋白质和葡萄糖或其它还原糖反应而引起的蛋白质老 化，更具体地讲，本发明涉及抑制非酶促糖基化蛋白的反应以及裂解由于随后 高级糖基化终产物的形成而引起的交联。

人们对于葡萄糖和蛋白质之间的反应已有了一段时间的认识。最初的发现 是在烹调食物时出现棕色的色素，Maillard于1912年对其进行了鉴定，他发现 葡萄糖或其它还原糖可与氨基酸反应生成加合物，形成的加合物经历一系列的 脱水和重排过程形成稳定的棕色色素。进一步的研究表明，储藏和加热处理过 的食物由于葡萄糖和多肽链之间的反应而经历非酶促的褐变，并且蛋白质也会 因此发生交联而相应地表现出降低的生物活性。

在体内也存在着还原糖和食物蛋白之间的反应。已证实血红蛋白可以发生 葡萄糖与蛋白质上游离氨基之间形成稳定的1-脱氧酮糖基加合物(称为 Amadori产物)的非酶促反应，其中血红蛋白β链上的氨基末端通过与葡萄糖 的反应而发生重排，形成被称为血红蛋白A1c的加合物。还发现多种其它的体 内蛋白，如晶状体、胶原和神经蛋白也可以发生这种反应。参见Bucala等，“高 级糖基化；糖尿病和衰老的化学、生物学及有关因素”， 药理学进展，23卷， 1-34页，Academic Press(1992)。

此外，在许多长寿命的蛋白质(例如老年个体的晶状体蛋白和胶原蛋白) 内也观察到了与后期的Maillard产物具有相似波谱和荧光特性的棕色色素。在 20至90岁之间，可以在人硬脑膜胶原内观察到色素随年龄的线性增加。令人 感兴趣的是，可以在体外通过葡萄糖诱导的交联来模仿胶原的老化；并且还注 意到胶原可以俘获其它蛋白并形成加合物，这被认为是通过交联反应而发生 的，并且确信这是在肾基膜内观察到白蛋白和抗体积累的原因。

在美国专利4,758,583中，公开了用于抑制高级糖基化终产物形成的方法 及有关试剂，该方法包括将所述试剂与靶蛋白和葡萄糖之间的最初反应所形成 的早期糖基化产物进行反应。于是，推定产生了抑制作用，因为抑制剂和早期 糖基化产物之间的反应似乎中断了随后糖基化蛋白和加入的蛋白物质形成交联 的后期产物的反应。被确认为抑制剂的试剂之一是氨基胍，进一步的试验结果 证实了其在该方面的效果。

尽管在氨基胍以及相似化合物上取得的成功大有前途，但仍需寻找和开发 其它抑制剂，以扩展可用度和该潜在活性的范围，以及其在诊断和治疗中的用 途。此外，还需要寻找不仅能够抑制该反应及其后果，并且还能够裂解由已存 在的高级糖基化终产物所形成的交联物从而逆转其产生的影响的试剂。

                          发明概述

根据本发明，公开了抑制蛋白质高级糖基化(蛋白质老化)并裂解高级糖 基化终产物(AGEs)之间或AGEs与其它蛋白质之间形成的交联物的方法和组合 物。本发明的方法和组合物还可预防和逆转由体内或食物中存在的其它活泼糖 (包括核糖、半乳糖和果糖)所引起的高级糖基化终产物和交联。

具体地讲，该组合物含有用于抑制高级糖基化终产物形成并逆转已形成的 高级糖基化终产物、并裂解所形成的交联物的试剂。尽管不愿受到任何理论的 束缚，但我们确信已形成的高级糖基化终产物及交联物的裂解是由于高级糖基 化终产物中存在的α-二羰基蛋白交联物的裂解。因此，本发明的方法和组合物 涉及具有产生上述裂解能力的试剂，该试剂可同时在体外和体内用于裂解已形 成的高级糖基化终产物和交联物，并消除它们所产生的有害作用。

可用于本发明的试剂是一类被称为的化合物。

该试剂包括具有如下结构式的噻唑鎓化合物及其混合物：

其中R1和R2彼此独立地选自氢、羟基(低级)烷基、乙酰氧(低级)烷基、 低级烷基、低级链烯基，或R1和R2与其环上的碳原子一起可以是芳香稠环， 该稠环被一个或多个氨基、卤素或亚烷基二氧基团选择性取代；

Z是氢或氨基；

Y是氨基、下式的基团

其中的R是低级烷基、烷氧基、羟基、氨基或芳基，所述芳基被一个或多

个低级烷基、低级烷氧基、卤素、二烷氨基、羟基、硝基或亚烷基二氧基

团选择性取代；

    下式的基团

        -CH2R’

其中的R’是氢或低级烷基、低级炔基或芳基；

    或下式的基团

其中的R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳

基被一个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是

低级烷基；

X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或均三甲苯磺酸盐离子；

以及加入的载体。

本发明所用的化合物及其组合物似乎可以和早期的糖基化产物反应，从而 防止该产物进一步形成高级糖基化终产物，所述高级糖基化终产物可导致交联 物、分子和蛋白质老化以及其它不利的分子结果。另外，它们还可与已形成的 高级糖基化终产物反应从而减少该产物的量。

本发明还涉及抑制蛋白质老化以及其它不利的分子结果的方法，该方法包 括将早期糖基化产物阶段的最初的糖基化分子与一定量的一种或多种本发明的 试剂或含有该试剂的组合物接触；本发明还涉及裂解已形成的高级糖基化终产 物以减少该产物量的方法，该方法包括裂解高级糖基化终产物中存在的α-二羰 基交联物。当本发明的方法在工业中应用时，可考虑对蛋白施用一种或多种试 剂，例如，将试剂加入到蛋白提取物形式的蛋白质的混合物中，或将试剂施用 或加入到易于发生高级糖基化和交联的食物中，这些均是为了防止食物的提前 老化和变质，并逆转已形成的高级糖基化终产物的影响。

在体内抑制高级糖基化终产物形成并逆转已形成的高级糖基化产物的能 力使其可应用于所有高级糖基化及伴随的分子交联是严重损害的情况。因此， 例如在食品加工领域，通过使那些较不稳定的食物变得不易变质来阻止食物变 质从而使消费者更易得到，将会带来显著的经济和社会效益。减少变质的同时， 检查、移走和替换的费用将会降低，并且食物可被更多的人得到，这些将有助 于市场上食物价格的稳定。同样，在存在蛋白质变质问题的其它工业应用中， 在含有所述蛋白质的物质中加入本发明试剂的混合物将有助于所述物质的有效 期延长。已知目前使用的食物防腐剂和变色预防剂如二氧化硫可以产生毒性， 包括在动物中引起过敏和哮喘，这些物质可用例如文中所述的化合物代替。

本发明的方法作为Maillard方法，迅速影响体内的数种显著蛋白质量有特 别的治疗应用，所述蛋白质是胶原，弹性蛋白，晶状体蛋白和肾小球基膜。这 些蛋白质随年龄(因此有“蛋白质老化”的应用术语)和糖尿病的结果而变质。 因此，延缓或基本上抑制体内高级糖基化终产物的形成，并减少高级糖基化终 产物与其它蛋白质之间形成的交联物量给治疗糖尿病并发症和例如衰老，并由 此改善生活质量，而且可能延长动物和人的生命带来了希望。

本发明的试剂还用于个人美容和卫生，因为他们通过有抗-斑特性的阳离子 抗微生物剂，如洗必泰可以抑制并逆转牙齿菌斑。

本发明还包括新的分析方法，用于确定生成的非酶促终产物的“裂解”或 逆转。在本文中，本发明还扩大到鉴定并使用新交联结构，认为所述交联结构 是作为体外和体内高级糖基化结果而形成的显著数量的分子交联物。更具体地 说，所述交联结构包括能够经二亲核的噻唑鎓类化合物裂解的糖衍生的α-二羰 基片段或部分，如二酮。具体说，所述交联结构可以是下式：

其中A和B分别独立地是与生物分子的亲核原子结合的位点。

因此，本发明的主要目的是通过相应地抑制高级糖基化终产物的形成以及 裂解已发生的高级糖基化介导的交联，而提供抑制高级糖基化终产物形成和分 子广泛交联的方法，和裂解由已存在的高级糖基化终产物形成之交联物的方 法，所述高级糖基化终产物是由于敏感性分子如蛋白质与葡萄糖和其它活泼糖 反应而产生的。

本发明的另一目的是提供前述方法，其特征在于鉴定为早期糖基化产物的 初始糖基化蛋白质反应。

本发明的另一目的是提供前述方法，所述方法抑制所述早期糖基化产物为 形成所述高级糖基化重产物而进行的重排和交联。

本发明的另一目的是提供能够参与与前述方法中所述早期糖基化产物反应 的试剂。

本发明的另一目的是提供通过裂解高级糖基化终产物中的α-二羰基蛋白 质交联物而裂解或逆转作为前述高级糖基化反应的结果而形成的高级糖基化终 产物的试剂。

本发明的另一目的是借助前述方法和试剂，提供治疗分子不利结果或蛋白 质老化的治疗方法。

本发明的另一目的是借助前述方法和试剂，提供抑制和逆转、使牙齿脱色 的方法。本发明的另一目的是提供组合物、包括药物组合物，它们均掺有本发 明的试剂。

本发明的另一目的是提供用于本发明方法和组合物中的新化合物以及其制 备方法。

本发明的另一目的是提供新的分析方法，用于测定具有“裂解”或逆转生 成的非酶促糖基化终产物和其随后产生的交联物之能力的化合物。

本发明的另一目的是提供用本文所述能够用裂解或逆转生成的高级糖基化 终产物的试剂裂解的交联结构，所述交联结构特异性抗体及其诊断和治疗用 途。

参考下列说明性附图和描述，其它目的和优点对于本领域专业人员来说是 显而易见的。

                          附图概述 图1为SDS-PAGE凝胶，它显示与本发明的3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物 (命名为ALT-766)一起保温的正常和糖尿病小鼠尾腱胶原的CNBr肽图。 图2为SDS-PAGE凝胶，它显示本发明的化合物3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴 化物裂解交联的AGE-BSA的物理证据。

                     优选实施方案的详细描述

根据本发明，开发了确信可以在大量靶分子(包括尤其是存在于动物和植 物中的蛋白质)中抑制高级糖基化终产物形成并逆转已形成的高级糖基化终产 物的试剂、含有所述试剂的组合物(包括药物组合物)及有关方法。具体地讲， 本发明涉及含有一种或多种试剂的组合物，所述试剂包括具有裂解高级糖基化 终产物中存在的α-二羰基分子交联物能力的化合物。例如，可使用的试剂包括 具有如下结构式的化合物及其混合物：

其中R1和R2彼此独立地选自氢、羟基(低级)烷基、乙酰氧(低级)烷基、 低级烷基、低级链烯基，或R1和R2与其环上的碳原子一起可以是芳香稠环， 该稠环被一个或多个氨基、卤素或亚烷基二氧基团选择性取代；

Z是氢或氨基；

Y是氨基、下式的基团

其中的R是低级烷基、烷氧基、羟基、氨基或芳基，所述芳基被一个或多

个低级烷基、低级烷氧基、卤素、二烷氨基、羟基、硝基或亚烷基二氧基

团选择性取代；

    下式的基团

        -CH2R’

其中的R’是氢或低级烷基、低级炔基、或芳基；

    或下式的基团

其中的R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳

基被一个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是

低级烷基；

X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或均三甲苯磺酸盐离子；

以及加入的载体。

上述低级烷基含有1-6个碳原子，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、 己基，及其相应的支链异构体。低级炔基含有2至6个碳原子。同样，低级烷 氧基也含有1至6个碳原子，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基 和己氧基，及其相应的支链异构体。这些基团被一个或多个卤素、羟基、氨基 或低级烷氨基选择性地取代。

上式所包含的低级酰氧基(低级)烷基包括在酰氧基部分含有2至6个碳 原子并且在低级烷基部分含有1至6个碳原子的基团。酰氧基部分一般为乙酰 氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基，及其相应的支链异构体。 低级烷基部分如上所述。

上式所包含的芳基为含有6-10个碳原子的基团，例如萘基、苯基和低级烷 基取代的苯基(如甲苯基和二甲苯基)，并且该基团被1-2个卤素、羟基、低 级烷氧基或二(低级)烷氨基选择性地取代。优选的芳基是苯基、甲氧苯基和 4-溴苯基。

上式中的卤原子可以是氟、氯、溴或碘。

为了本发明的目的，将式(I)化合物制成生物及药物可接受的盐。可应用的 盐形式是卤化物(特别是溴化物和氯化物)、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐和均三甲 苯磺酸盐。其它的相关盐可用类似的无毒并且生物及药物可接受的阴离子制 成。

在式I所包括的化合物中，某些取代基为优选。例如，其中的R1或R2是 低级烷基的化合物为优选。还特别优选其中Y是氨基、2-氨基-2-氧乙基、2- 苯基-2-氧乙基或2-[取代苯基]-2-氧乙基的化合物。

本发明的代表性的化合物是：

3-氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；

3-氨基-4甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物；

3，4-二甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓碘化物；

3-乙基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物；

2，3-(二氨基)苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物；

3-氨基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物；

3-氨基-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物；

2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；

2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；

2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(2’，4’-二甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(2’，4’-二氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-炔丙基-噻唑鎓溴化物；

3-炔丙基-4-甲基噻唑鎓溴化物；

3-炔丙基-5-甲基噻唑鎓溴化物；

3-炔丙基-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；

3-炔丙基-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物；

2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，6-二氨基苯并噻唑鎓二盐酸盐；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

2，6-二氨基-3-[2-(3’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

2，6-二氨基-3-(2-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；

3-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑基-乙基乙酸酯均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物；

3-[2-(2’，6’-二氯苯乙氨基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(2’，6’-二异丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯苄氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-[2-(4’-甲酯基-3’-羟基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物；

2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基-4-甲基-5-羟乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐；

3-[2-(1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物；

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-[1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-苯并噻唑鎓溴化物；

1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物；

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-(3’-甲氧苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物；

3-(2’，6’-二氯苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物；

3-(2’-硝基苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；

3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物；和 3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物。

式I所代表的某些化合物是新化合物，这些化合物代表本发明的另一个实 施方案。这些化合物由下式表示

其中R1和R2彼此独立地选自氢、羟基(低级)烷基、乙酰氧(低级)烷基、 低级烷基、低级链烯基，或R1和R2与其环上的碳原子一起可以是芳香稠环， 该稠环被一个或多个氨基、卤素或亚烷基二氧基团选择性取代；

Z是氢或氨基；

Y是氨基、下式的基团

其中的R是低级烷基、烷氧基、羟基、氨基或芳基，所述芳基被一个或多

个低级烷基、低级烷氧基、卤素、二烷氨基、羟基、硝基或亚烷基二氧基

团选择性取代；

        下式的基团

            -CH2R’

其中的R’是氢或低级烷基、低级炔基或芳基；

    或下式的基团

其中的R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳

基被一个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是

低级烷基；

条件是Y和Z中至少有一个是氨基，并且另一个条件是当Y是氨基并且R2是 Z均是氢时，则R1不是低级烷基；并且X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或 均三甲苯磺酸盐离子。

其它的新化合物是下式的化合物

其中R1和R2彼此独立地选自氢、羟基(低级)烷基、乙酰氧(低级)烷基、 低级酰氧基(低级)烷基、低级烷基，或R1和R2与其环上的碳原子一起可以 是芳香稠环；

Z是氢或氨基；

Y是炔甲基、或下式的基团

其中R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳基被一 个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是低级烷基； 并且

X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或均三甲苯磺酸盐离子。

上述化合物能够抑制靶分子，包括例如蛋白质上高级糖基化终产物的形成 并能够裂解或逆转所述蛋白质上已形成的高级糖基化终产物。因高级糖基化终 产物形成而引起的蛋白质交联对其它蛋白质的捕获产生影响，而且导致体内疾 病的发展，如皮肤的弹性降低并起皱，某些肾病，动脉粥样硬化，骨关节炎等。 相似的，经非酶促褐变的植物物质变质，在食品的情况下，会腐败或变硬，结 果不能食用，难吃或失去营养。因此本发明所用的化合物可以抑制所述后期的 Maillard反应并干预上述的有害变化，降低已经在蛋白质物质中存在的高级糖 基化终产物的水平。

本发明的基本原理是使用阻断并逆转糖基化后步骤，如荧光色基和交联物 的形成的试剂，所述荧光色基和交联物的存在是与糖尿病和衰老相关并导致糖 尿病和衰老的有害后发症。理想的试剂是抑制所述色基和蛋白质链之间交联物 的形成以及蛋白质捕获到其它蛋白质上，如在关节炎和肾中所发生的，并逆转 已存在的所述交联形成的水平。

认为本发明化合物可与之反应的早期糖基化产物的化学性质可以改变，因 此本文用术语“早期糖基化产物”来包括任何和所有在其范围内的变化。据推 断，通过与本发明化合物反应可以阻断高级糖基化终产物形成中不可缺少的羰 基部分的早期糖基化产物。在一实施方案中，预计早期糖基化产物可以包括 Amadori产物的活泼羰基部分或其进一步的缩合，脱水和/或重排产物，它们可 以缩合形成高级糖基化终产物。在另一方案中，Amadori或其它早期糖基化终 产物的裂解可以形成含一个或多个羰基部分的活泼羰基化合物(糖醛，甘油醛 或葡糖醛酮)，随后再与胺或Amadori产物反应，可以形成含羰基的高级糖基 化产物如烷基甲酰基-糖基吡咯。

一些研究人员已经研究了高级糖基化产物形成的机制。Eble等在体外的 研究中(1983)“非酶促糖基化和葡萄糖依赖的蛋白质交联”，生物化学杂志， 258：9406-9412，研究了在不存在葡萄糖的条件下，糖基化蛋白质与非糖 基化蛋白质的交联。Eble等寻求阐明Maillard反应的机制，因此用控制的RNase 的初始糖基化作为模型系统，然后在不同的条件下检测。在一方面，分离糖基 化蛋白物质，然后放在无葡萄糖的环境中，由此观察以确定交联的程度。

由此，Eble等观察不仅与糖基化蛋白质而且与非糖基化蛋白质也继续发 生交联。Eble等的一个观察结果是糖基化蛋白质与蛋白质物质之间的反应似 乎发生在所述蛋白质的氨基酸侧链上。就此而论，Eble等完成的证明性试验表 明游离赖氨酸与RNase上的赖氨酸竞争结合糖基化蛋白质。因此，从这些数据 可以推知，赖氨酸可以作为高级糖基化抑制剂，但该结论和导致该结论的基本 观察结果应限于Eble等制备和检测的模型系统内。显然，就抑制体外和体内的 蛋白质高级糖基化而言，Eble等没有意识到，也未表明作为本发明基础的发 现。

Eble等的试验未说明在总是存在葡萄糖的情况下，体内形成的高级糖基化 终产物的活泼裂解产物机制或任何其它机制。事实上，其它研究人员支持所述 解释体内高级糖基化形成的机制(例如参见Hayase等，生物化学杂志，263： 3758-3764(1989)；Sell和Monnier，生物化学杂志，264：21597- 21602(1989)；Oimomi等，农业生物化学，53(6)：1727-1728(1989)；和糖尿病 研究和临床实践，6：311-313(1989))。因此，在Eble等的模型中，用赖 氨酸作为抑制剂，在体内存在葡萄糖的条件下，与用本发明化合物抑制高级糖 基化终产物形成和糖尿病和衰老并发症的恶化无关。

尽管不希望局限于任何特定的理论来说明本发明化合物逆转已形成的高级 糖基化终产物的机制，但还是进行了研究以阐明可能的机制。早期检测Amadori 产物(AP)结果的研究已确定了一种可能导致共价葡萄糖衍生的蛋白质交联 物形成的途径。如下方案A所示，该途径经AP连续的β消除而完成脱水。因 此AP脱掉4-羟基(1)就得到了1，4-二脱氧-1-烷氨基-2，3-己二酮糖(AP- 二酮)(2)。通过用AGE-抑制剂氨基胍捕获模型AP分离了具有氨基-1，4- 二脱氧酮结构的AP二酮。随后消除5-羟基得到1，4，5-三脱氧-1-烷氨基-2，3-己酮 糖-4-烯(AP-烯-二酮)(3)，该物质以其1，2-烯醇的三乙酰基衍生物的形式 分离得到。预计Amadori-二酮，特别是AP-烯-二酮对于蛋白交联反应是高度活 泼的，可以作为与蛋白质中含有胺(Lys，His)或巯基(Cys)的亲核物质加 成的靶分子，由此生成形式(4)的稳定交联物。

应当注意到，尽管在上述方案A中只给出了6-员环的形式，但是线性AP- 烯-二酮(3)及稳定交联物(4)可以环化形成5-或者6-员的邻羟基内醚环。

通过设计试验以检测体内该途径的出现率，以及对所得α-二羰基蛋白交联 物的特异性裂解的作用，研究了葡萄糖衍生的交联物形成的主要途径是通过 AP-烯-二酮中间产物这种可能性。因此认为本发明的噻唑鎓化合物可作为新的 “二配位基”亲核物质，特别旨在作用于交联物两个羰基之间的碳-碳裂解反 应，例如下方案B所示的生理条件下的裂解。该方案给出了质子转移的式Iα- 二酮裂解剂(N-苯酰噻唑鎓溴化物)与AP-烯-二酮衍生的交联物的反应。

为了阐明该反应的进一步的试验涉及式I化合物N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化 物与1-苯基-1，2-丙二酮生成预计的裂解产物苯甲酸的反应。N-苯甲酰甲基噻唑 鎓溴化物和1-苯基-1，2-丙二酮之间的反应迅速并且很容易地进行，从而证明了 该可能的机制。

在蛋白质上一旦形成早期葡萄糖衍生的加成产物，接着还可以发生其它反 应以导致共价蛋白质-蛋白质交联反应。就这点而言，当AGE-修饰的BSA (AGE-BSA)与未修饰的天然胶原反应时，可以使式I的化合物，N-苯甲酰 甲基噻唑鎓溴化物与形成的AGE交联物反应。这会导致从预形成的AGE-介导 的复合物中以浓度依赖方式释放BSA。另外，该研究证明，在试验条件下形成 的大部分AGE-交联物由对裂解敏感的α-二酮或相关结构组成，所述裂解有益 的是由式I的二配位基型分子化合物在生理条件下进行的。

为了证明体内的相同情况，在溴化氰消化和凝胶电泳分析前，用式I的化 合物(N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物)处理患糖尿病32周之大鼠尾腱的分离的 胶原。随后的电泳表明处理过的胶原与未处理的非糖尿病(对照)胶原难以区 分，与通常从糖尿病动物中分离的AGE-修饰的高度交联的，消化抗性胶原明 显相反。

本发明还涉及抑制高级糖基化终产物形成并逆转已形成的高级糖基化终产 物水平的方法，所述方法包括将靶分子与本发明的组合物接触。在食品中含所 述靶蛋白质的情况下，无论是植物还是动物源的，都可以通过各种常规方法， 将含本发明试剂的组合物应用于所述食品。

在食品工业中，数年前，发现亚硫酸盐可以抑制Maillard反应，因此常将 其用于食品加工和贮存。但最近，食品中的亚硫酸盐与哮喘病中严重甚至致命 的反应有关。结果，禁止用亚硫酸盐处理新鲜水果和蔬菜。该致敏反应的机制 尚未可知。因此，本发明组合物和试剂提供了代替亚硫酸盐的非毒性方法，用 所述方法可以处理食品。

从本发明的讨论情况可以看出，本发明方法和组合物给抑制、以及某种程 度逆转动物和植物中关键蛋白的老化带来了希望，并同时可推知其结果将产生 经济和医疗效益。在食品的情况下，施用本发明组合物给延缓食物变质，由此 食品的上架期延长，而且更易被消费者得到带来了希望。用非毒性的生物相容 化合物代替目前施用的防腐剂，如已知引起人过敏和哮喘的二氧化硫是本发明 的另一优点。

本发明治疗的并发症涉及抑制、并且在某种程度逆转因高级糖基化和交联 而引起的衰老过程，所述衰老过程如上文说明的，已经得到鉴定并用关键蛋白 质的老化来举证。因此，体内蛋白，特别是结构体内蛋白，如胶原，弹性蛋白， 晶状体蛋白，神经蛋白，肾小球基膜和其它血管外基质组分均可由于本发明的 实践而在其寿命和运作方面受益。因此，本发明降低了与因交联靶蛋白而引起 的蛋白质沉积有关的疾病发病率，如视网膜病、白内障、糖尿病性肾病、肾小 球硬化症、外周血管疾病、闭塞性动脉硬化、外周神经病、中风、高血压、粥 样硬化、骨关节炎、关节周强直、皮肤失去弹性和起皱、关节强直、肾小球肾 炎等。同样，所有这些疾病在患有因高血糖而引起的糖尿病的患者中，都是显 而易见的，而且一般会加速发生。因此本发明治疗方法适用于治疗高龄患者中 的上述和相关疾病或患有所述病理学的那些疾病。

通过高级糖基化产物形成而发生的分子交联会降低结构蛋白如胶原在血管 壁中的可溶性而且还会将血清蛋白，如脂蛋白捕获到胶原上。这样还会导致内 皮渗透性的增加，从而使渗出的血浆蛋白与次内皮基质共价结合，降低了血浆 和基质蛋白对酶促生理降解的敏感性。出于这些原因，已经推测因慢性高血糖 引起的渐进性糖尿病性血管堵塞是由于糖衍生的，特别是葡萄糖衍生的交联物 的过量形成而引起的。用本发明的组合物和方法，通过化学抑制逆转高级糖基 化产物的形成，可以有效地防止并逆转所述糖尿病性微血管改变和微血管堵 塞。

研究表明靶器官中的慢性糖尿病性损伤的发展主要与高血糖有关，因此严 格的代谢控制可以延缓或甚至防止终器损伤。参见Nicholls等，实验室研究； 60第4期，486页(1989)，其中讨论了在鼠糖尿病性肾病中，胰岛异体移植和 氨基胍的作用。这些研究进一步说明氨基胍消除了糖尿病大鼠中主动脉壁的蛋 白质交联，而且证实了Brownlee等人〔科学，232：1629-1632(1986)〕 对糖尿病的这种其它器官并发症所进行的早期研究。此外，其它研究表明氨基 胍减少在肾中捕获的免疫球蛋白〔Brownlee等人，糖尿病，35(1)： 42A(1986)〕。

Brownlee等人(1988，同上文)从肾形态学变化(这是糖尿病性肾病的 标志)说明，在链尿菌素-糖尿病大鼠模型中，施用氨基胍干扰了糖尿病肾病的 发展。这些研究人员报道用氨基胍阻止了肾小球基膜厚度的增加(这是糖尿病 性肾病的主要结构失常特征)。

综合考虑，这些数据清楚地表明根据本发明的教导，抑制并逆转高级糖基 化终产物(AGE)的形成可以防止以及在某种程度上逆转因糖尿病引起的晚期 及早期结构损伤，和因AGE形成而引起的衰老过程中的改变。

糖尿病诱导的红细胞变形能力的改变(导致细胞膜更不易弯)是交联和氨 基胍的另一特征，已经表明在体内得到抑制。在所述研究中，用患诱导性长期 糖尿病的新西兰白兔研究试验化合物对红细胞(RBC)变形能力(df)的影 响。以100mg/kg的速率将试验化合物经口管饲于糖尿病大鼠。

糖尿病的另一后果是高血糖诱导的骨基质分化，这导致通常与慢性糖尿病 有关的骨形成减少。在动物模型中，糖尿病诱导70％诱导性的骨基质分化。

在将本发明组合物用于体内或治疗目的情况下，需要注意其中所用的化合 物或试剂是生物相容的。可以用治疗有效量的本发明试剂或化合物制备药物组 合物，而且所述药物组合物可以包含选自已知用于该目的的可药用载体。根据 施用方法，可以以各种形式制备所述组合物。另外，还可以使用式I化合物的 各种可药用加成盐。

在通过静脉内，肌肉内或腹膜内注射施用的情况下，可以使用液体形式。 适宜时，可以制备固体剂型，如片剂，胶囊或液体剂型，如溶液和悬浮液等以 用于口服。对于用于皮肤或眼的局部或经皮给药，可以将试剂配制在适宜载体 如水、乙醇、丙二醇(可以包括有助于透过皮肤或眼的载体)中制备溶液、洗 剂或软膏。例如局部制剂可包括高达约10％的式I的化合物。对其它身体组织 而言，还可以考虑使用适宜的给药形式。

在本发明方法是治疗应用的情况下，以适宜的药物形式，给待治疗的动物 施用一定量的一种或多种试剂。施用可通过已知技术如口服、局部和非肠道技 术，如真皮内、皮下、静脉内或腹膜内注射，以及其它常规方法来完成。可以 以高达30mg/kg的剂量水平，在较长的期间施用试剂。

如上文说明的，本发明还包括抑制和逆转因口腔中的非酶促褐变而引起的 牙齿色变，所述方法包括给治疗对象按治疗需要施用有效量含式I结构试剂的 组合物以抑制并逆转高级糖基化终产物的形成。

在口腔中发生的非酶促褐变反应导致牙齿色变。目前所用的抗-齿斑剂加速 了这种非酶促褐变反应和牙齿色斑。最近，用有显著抗齿斑特性的阳离子抗微 生物剂配制了一种漱口水，用于日常使用杀灭口中的细菌。这些阳离子抗菌剂 包括双胍啶、鲸蜡基吡啶鎓氯化物、葡萄糖酸洗必泰、双辛氢啶和洁尔灭。

因洗必泰和其它抗齿斑剂产生的牙齿色斑显然起因于Maillard反应的增 加。Nordbo(牙科研究杂志，58：1429(1979))报道了洗必泰和洁尔灭可催 化体外褐变反应。将洗必泰加入含有糖衍生物和氨基源的混合物中可增加由 Maillard反应引起的颜色形成。还已知使用洗必泰可导致牙表膜的增加。 Nordbo认为洗必泰以两种方式导致牙齿色斑：第一种，增加含更多氨基的表膜 形成，第二，催化导致有色产物的Maillard反应。

根据所述方法，将式I的化合物配制成适用于口腔的组合物。特别适宜的 制剂是掺入了活性试剂的漱口水和牙膏。

在本发明的实践中，使用了常规的配制技术以及无毒、可药用的载体，所 述载体一般以漱口水和牙膏的配制中公知的量和组合进行应用。

将式I的试剂以有效抑制并逆转高级糖基化终产物形成的量配制在组合物 中。当然，所述量可随所用的特定试剂和特定剂量形式而变化，但通常为特定 制剂重的0.01％-1.0％。

式I所包含的化合物可用本领域公知的化学合成法制备。式I所包含的某 些化合物是公知化合物，可以从化学物质供应商处方便地购得和/或可以用为其 具体公开的合成方法制得。例如，3，4-二甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓碘化物、3- 乙基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物、3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓氯 化物和3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物可以从Aldrich Chem.Co.购得。

式I中所包含的记载于化学和专利文献中、或可以通过其中记载的方法直 接制得化合物是，例如3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物和3-苄基-5-(2- 羟乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物[Potts等，有机化学杂志，41：187-191(1976)]。

式(I)中的一些化合物是新化合物，是现有技术中未知的。这些化合物是由 式Ia所表示的化合物

其中R1和R2彼此独立地选自氢、羟基(低级)烷基、乙酰氧(低级)烷基、 低级烷基、低级链烯基，或R1和R2与其环上的碳原子一起可以是芳香稠环， 该稠环被一个或多个氨基、卤素或亚烷基二氧基团选择性取代；

Z是氢或氨基；

Y是氨基、下式的基团

其中的R是低级烷基、烷氧基、羟基、氨基或芳基，所述芳基被一个或多

个低级烷基、低级烷氧基、卤素、二烷氨基、羟基、硝基或亚烷基二氧基

团选择性取代；

    下式的基团

        -CH2R’

其中的R’是氢或低级烷基、低级炔基或芳基；

    或下式的基团

其中的R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳

基被一个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是

低级烷基；

条件是Y和Z中至少有一个是氨基，并且另一个条件是当Y是氨基并且R2是 Z均是氢时，则R1不是低级烷基；

并且X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或均三甲苯磺酸盐离子。

其它的新化合物是如下的式I化合物，其中Y是炔甲基或下式的基团

其中R″是氢并且R是被芳基选择性取代的低级烷基、或芳基，所述芳基 被一个或多个低级烷基、卤素或烷氧羰基选择性取代；或R″和R均是低级烷 基。

如下的式I化合物，其中Y是下式的基团

其中R是低级烷基、烷氧基、羟基、氨基或芳基；

    或下式的基团

        -CH2R’

其中R’是氢或低级烷基、低级炔基或芳基；

X是卤化物、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或均三甲苯磺酸盐离子； 可以根据Potts等，有机化学杂志，41：187(1976)；和Potts等，有机化学杂志， 42：1648(1977)中所记载的方法，或按照以下方案I所示进行制备。

                          方案I

其中的R1、R2、Z和R如上所定义，并且X是卤原子。

在反应方案I中，将适当取代的式II噻唑化合物(其中的R1、R2和Z如 上所定义)与适当式III的卤代化合物(其中的R和X如上所定义)反应，生 成所述的式I化合物，其中的R1、R2、Z、R和X如上所定义。

该反应一般在回流温度下进行大约1-3小时。

进行该反应时一般使用极性溶剂例如乙醇。

其中Y是氨基的式I化合物可以根据Tamura等，合成，1(1977)中所记载 的方法，或按照以下方案II所示进行制备。

                          方案II

其中的R1、R2和Z如上所定义。

方案II所示的反应一般在室温下和无水极性溶剂中进行，一般的反应温度 范围是从室温至回流温度，一般的时间从1小时至大约4小时。该反应可生成 均三甲苯磺酸盐，通过一般的交换反应可将其选择性地转变为其它的噻唑鎓 盐。

本发明还涉及新的夹心酶免疫检测方法，该方法可通过检测AGE-交联蛋 白上AGE(高级糖基化终产物)部分的裂解来确定试验化合物“裂解”或逆转 已形成的高级糖基化终产物的能力。该方法包括：

a)将AGE-修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)在微滴定板的胶原包被孔中于37℃ 下保温2-6小时；

b)用PBS-吐温洗涤孔；

c)向洗涤后的步骤b的孔中加入试验化合物；

d)在约37℃下将加到洗涤孔中的试验化合物再保温12-24小时；然后

e)用抗AGE-核糖核酸酶抗体检测AGE-裂解，或用抗BSA抗体检测交联物的裂 解。

以下实施例是对本发明的说明。

                          实施例1

            3-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物

将噻唑(850mg，10mmol)、溴乙酸甲酯(1.52g，10mmlol)和无水乙醇(50ml)回 流2小时。在冷却过程中析出盐，将其用无水乙醇重结晶得到标题化合物 (1.59g)，m.p.189-190℃(分解)。

                          实施例2

            3-氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐

向冰冷的4，5-二甲基噻唑(2.26g，20mmol)的无水二氯甲烷(15ml)溶液中滴 加O-均三甲苯磺酰基羟胺(4.3g，20mmol)的无水二氯甲烷(15ml)溶液。室温下搅 拌2小时后，加入无水乙醚(10ml)。在冷却过程中析出无色针状的标题化合物， 3-氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐(3.48g)，m.p.165-168℃。

                           实施例3

使用以上实施例1和2中所述的方法，制得以下化合物。

3-氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.102-104℃；

2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.173-175℃；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.184-185℃(分解)；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.149-151℃(分解)；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.218-220℃(分解)；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.212-213℃(分解)；

3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.143-144℃；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.193-194℃(分解)；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.193-194℃；

3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.269-270℃(分解)；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.248-249℃(分解)；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.216-217℃；

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.223-224℃(分解)；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.137-138℃；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.180-181℃；

3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.251-252℃ (分解)；

3，4-二甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓碘化物，m.p.85-87℃；

3-乙基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.84-85℃；

3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物，m.p.144-146℃；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.144-145℃(分解)；

3-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.240-241℃(分解)；

3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.261-262℃(分解)；

3-(羧甲基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.250℃(分解)；

2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.212-214℃(分解)；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.205-206℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.220-222℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.179-180℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.147-148℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.223-223℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.182-183℃；

3-氨基-5-(2-羟乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.94-95℃(分解)；

3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物，m.p.178-179℃；

3-氨基-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.118-120℃；

3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.217-218℃；

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.217-218 ℃；

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.233-234℃；

2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.191-192℃；

2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.236-237℃；

2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.209-210℃；

2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.234-235℃；

3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.248-249℃(分解)；

3-[2-(2’，4’-二甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.214-216℃(分解)；

3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.209-210℃(分解)；

3-[2-(2’，4’-二氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.226-228℃(分解)；

3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.233-235℃(分解)；

3-炔丙基-噻唑鎓溴化物，m.p.64-66℃；

3-炔丙基-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.213-215℃；

3-炔丙基-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.127-129℃；

3-炔丙基-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.198-200℃；

3-炔丙基-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.132-134℃；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.224-225℃；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.164-165 ℃；

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.215-217℃；

2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.228-230℃；

2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.204-205℃；

3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.145-147℃；

2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.224-246℃；

2，6-二氨基苯并噻唑鎓二盐酸盐，m.p.318-320℃(分解)；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.243-245℃(分 解)；

2，6-二氨基-3-[2-(3’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.217-218℃(分 解)；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.223-225 ℃(分解)；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.258-259℃(分 解)；

2，6-二氨基-3-(2-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.208-210℃(分解)；

2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物， m.p.251-252℃(分 解)；

3-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑基-乙基乙酸酯均三甲苯磺酸盐，m.p.糖浆状物质；

2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.149-152℃；

3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.219-220 ℃；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物，m.p.206-207℃；

3-[2-(2’，6’-二氯苯乙氨基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.193-195℃；

3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.78-80℃；

3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.204-206℃；

3-[2-(2’，6’-二异丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.166-168℃；

3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯苄氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.164- 166℃；

3-[2-(4’-甲酯基-3’-羟基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物，m.p.222-223℃；

2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.166-168℃；

2，3-二氨基-4-甲基-5-羟乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.132-134℃；

2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐，m.p.224-226 ℃；

3-[2-(1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化 物，m.p.196-198℃；

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.164-166℃；

3-(2-[1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.238-239 ℃；

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.246-248℃；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.226- 228℃(分解)；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.210- 211℃；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物， m.p.243-244℃(分解)；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.239-294 ℃(分解)；

1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化物，m.p.148- 150℃；

3-[2-(4’-正戊基苯基)2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.218-220℃(分解)；

3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.178- 180℃(分解)；

3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.184-186℃(分解)；

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物，m.p.176-177℃；

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物， m.p.208-209℃；

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物， m.p.211-212℃；

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.186-187℃；

3-(3’-甲氧苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物，m.p.135-136℃；

3-(2’，6’-二氯苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物，m.p.192-194℃；

3-(2’-硝基苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.215-216℃；

3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.239-241℃(分解)；

3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.240-251 ℃(分解)；和

3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.229-231 ℃(分解)。

                              实施例4

                              mg/片

式I化合物                     50

淀粉                          50

甘露糖醇                      75

硬脂酸镁                      2

硬脂酸                        5

将化合物、部分淀粉和乳糖合并并用淀粉糊湿法制粒。将湿的颗粒置于托 盘上并在45℃下干燥过夜。将干燥的颗粒在造粒机中粉碎至颗粒大小为大约 20目。加入硬脂酸镁、硬脂酸以及余量淀粉并将整个混合物进行混合，然后用 合适的压片机压片。用11/32″的冲以232mg的重量进行压片，硬度为4kg。根 据USP XVI中所述的方法，这些药片在半小时内崩解。

                              实施例5

洗剂                         mg/g

式I化合物                     1.0

乙醇                          400.0

聚乙二醇400                   300.0

羟丙基纤维素                  5.0

丙二醇                        加至1.0g

                              实施例6

漱口水

式I化合物                     1.4％

葡萄糖酸洗必泰                0.12％

乙醇                          11.6％

糖精钠                            0.15％

FD&C Blue No.1                    0.001％

薄荷油                            0.5％

甘油                              10.0％

吐温60                            0.3％

水                                至100％

                                  实施例7

牙膏

式I化合物                         5.5％

山梨糖醇，70％水溶液              25％

糖精钠                            0.15％

十二烷基硫酸钠                    1.75％

聚羰乙烯934，6％分散液            15％

薄荷油                            1.0％

氢氧化钠，50％水溶液              0.76％

二碱价磷酸钙二水合物              45％

水                                至100％

                             实施例8

                           交联抑制试验

用下列方法评估本发明化合物抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)与 大鼠尾腱胶原包被的96孔平板交联的能力。

通过在37℃将200mg/ml的BSA与200mM葡萄糖在0.4M pH7.4的磷酸钠 缓冲液保温12星期来制备AGE-BSA。将糖基化BSA在磷酸缓冲溶液(PBS) 彻底透析48小时，换5次缓冲液。首先用300ul的superbloc阻断缓冲液(Pierce #37515X)将大鼠尾腱胶原包被的平板阻断1小时。用NUNC-多探头或Dynatech ELISA-平板洗涤器，通过用PBS-吐温20(0.05％吐温20)将平板洗涤两次而 从中除去阻断溶液。37℃，通过加入各50ul PBS或试验化合物溶液稀释的 AGE-BSA，用和不用以所需浓度溶解在pH7.4的PBS缓冲液中的试验化合物， 使AGE-BSA(根据AGE-BSA的批次，每孔1-10ug)与大鼠尾腱胶原包被平 板交联4小时。将含有或不含有试验化合物的PBS缓冲液中的未褐变BSA加 到不同孔中作为空白。然后通过用PBS-吐温缓冲液将孔洗涤三次而除去未交联 的AGE-BSA。接着用抗AGE-RNase的多克隆抗体定量分析与尾腱胶原包被平 板交联的AGE-BSA的量。在保温1小时后，通过用PBS-吐温洗涤4次除去 AGE抗体。

然后通过加入辣根过氧化物酶-结合的二级抗体-山羊抗-兔免疫球蛋白，并 保温30分钟来检测结合的AGE抗体。加入底物2，2-连氮基-二(3-乙基苯并 噻唑鎓啉磺酸)(ABTS-色原)。使反应再进行15分钟，用Dynatech平板阅 读器读出410nm的吸收值。

如下计算各试验化合物的％抑制。

％抑制＝{[光密度(没有化合物)-光密度(有化合物)]/光密度(没有化合物 的))×100％

  试验化合物的IC50值或在各浓度的抑制作用如下：

试验化合物                                              IC50         交联抑制的

                                                         (mM)          相对值

                                                                       (10mM)

                                         抑制数据

3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                 2.8

2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                         ＞0.10        27％

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物                       0.25

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物            0.48

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物                               58％

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物                   5.6

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物                            37％

3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                      46％

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物                 3.2

3-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物                   12.6

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物                        37％

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物      2.92

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物                 38％

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑鎓溴化物                ＞10     36％

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物         2.95

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物                               ＞10     35％

3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物                                                   16％

2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                0.0749

3-(2-氨基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物                                    0.53

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物                             0.7

3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物                             0.0289

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物                        9.9

3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物                                0.02

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物                 1.42

3-氨基-5-(2-羟乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                     3.6×10-5

3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物                                     11.1     34％

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物                                    29％

2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                     33％

2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                      40％

3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                         11.3

2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                 23.2％(2mm)

2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物

2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物

2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物

2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐

3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物             61％

3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物               0.8％(10mm)

3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴         8.8％(1mm)

化物

3-[2-(2’，6’-二异丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑      19％

鎓溴化物

3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯苄氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸         26.5％(3mm)

盐

3-[2-(4’-甲酯基-3’-羟基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-    17.6

噻唑鎓溴化物

2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                              39％

2，3-二氨基-4-甲基-5-羟乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                         18％

2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐           40％@3mM

3-[2-(1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙       13％

基)-噻唑鎓溴化物

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻          4.4％

唑鎓溴化物

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物                      45％

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化            24％@0.3mM

物

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化    0.78    69％@1mM

物

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓   0.16

溴化物

1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化    4.5

物

3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物                                 ND

3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化     1.53    52％@3mM

物

3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴     2.8

化物

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物                     ND

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻   ND

唑鎓溴化物

上述试验表明这种类型的药物治疗有益于降低与蛋白质的高级糖基化和 蛋白质与其它大分子形成交联物有关的病理学。可用药物治疗预防在糖尿病和 导致后发症如视网膜损伤及血管外的腱，韧带和其它关节损伤的衰老中发生的 蛋白质捕获增加和交联增加。这种治疗可以延缓随糖尿病和衰老发生的动脉粥 样硬化和结缔组织改变。可考虑经局部、口服和非肠道途径给药以提供局部和 系统治疗。

                          实施例9

                       交联物裂解试验

为了确定本发明化合物“裂解”或逆转已形成的高级糖基化终产物的能力， 开发了一种新的可以检测从AGE-交联蛋白上裂解AGE(高级糖基化终产物) 部分的夹心酶免疫检测法。该检测利用市售的胶原包被的96孔微滴定平板。在 胶原包被的孔中，将按照例如实施例8所述制备的AGE-修饰蛋白(AGE- BSA)保温4小时，用PBS-吐温洗涤所述孔，然后加入试验化合物溶液。在保 温16小时(37℃)后，用抗AGE-核糖核酸酶抗体或用抗BSA抗体检测交联 物裂解情况。在该检测中的阳性结果表明化合物通过裂解交联物并释放在随后 的洗涤步骤中被洗去的物质，能够减少已与胶原交联的AGE-BSA量。该检测 的详细内容如下：

材料

免疫化学物质和化学物质

牛血清白蛋白(V型)，(BSA)Calbiochem

右旋糖

Superbloc，Pierce，Inc.

兔抗-牛血清白蛋白

辣根过氧化物酶(HRP)-山羊-抗兔，Zymed

HRP底物缓冲液，Zymed

ABTS色原，Zymed

磷酸缓冲盐

吐温20，Sigma

仪器

ELISA平板洗涤器，Dynatech

ELISA平板阅读器，Dynatech

精确水浴

Corning数字pH测量仪

玻璃仪器和塑料仪器

Finneppette Multichannel Pipettor，Baxter

Eppendorf移液管，Baxter

Eppendorf转换移液管，Baxter

用于Finneppetter的移液管冲头，Baxter

用于Eppendorf的移液管冲头，Baxter

玻璃试验试管，13×100mm，Baxter

用于96孔平板的Mylar密封带，Coming

Biocoat Cellware大鼠尾胶原1型包被的96孔平板，Collaborative Biomedical Products

方法

制备溶液和缓冲液

1.按如下制备AGE-BSA原种溶液。通过将一碱价6克磷酸钠溶解在100ml 蒸馏水中，将7克二碱价磷酸钠(0.4M)溶解在100ml蒸馏水中，然后用一 价酸盐溶液将二价酸盐溶液的pH调到7.4，来制备磷酸钠缓冲液(0.4M)。 每100ml体积加入0.02g叠氮化钠以抑制细菌生长。按如下制备BSA：将 400mgV型BSA(牛血清白蛋白)加到每ml磷酸钠缓冲液(上述)中。通过 将7.2g右旋糖溶解在100ml磷酸钠缓冲液(上述)中来制备400mM葡萄糖溶 液。将BSA和葡萄糖溶液以1∶1混合，然后在37℃保温12个星期。每星期 监测所述保温化合物的pH，如果需要，将pH调到7.4。12个星期后，将 AGE-BSA溶液对PBS透析48小时，换4次缓冲液，每次溶液与透析缓冲液的 比例为1∶500。用大Lowry法确定蛋白质浓度。将AGE-BSA原种溶液分成小 份，于-20℃贮存。于-20℃贮存时，AGE-BSA的稀释溶液不稳定。

2.按如下制备用于交联和裂解研究的研究溶液。将试验化合物溶解在PBS 中，如果需要，将pH调到7.4。为了测量最大交联，将AGE-BSA原种溶液用 PBS和用于检测化合物抑制活性的抑制剂溶液稀释。通过初始滴定各组AGE- BSA来确定达到最佳敏感性所需的AGE-BSA浓度。

3.按如下制备洗涤缓冲液(“PBS-吐温”)。通过将下列盐溶解在1升蒸馏 水中来制备PBS：NaCl，8g；KCl，0.2g，KH2PO4，1.15g；NaN3，0.2g。 加入吐温20达到0.05％(v/v)的终浓度。

4.通过用蒸馏水以1∶10稀释HRP底物缓冲液，然后在使用前以1∶50与 ABTS色原混合来制备用于检测二级抗体结合的底物。

检测过程

1.用300ul“Superbloc’阻断Biocoat平板。在室温将平板阻断1小时，然后 在加入试验试剂之前，用Dynatech平板洗涤器，经PBS-BSA洗涤三次。

2.用下列方法完成各试验。用Biocoat平板的前三个孔作为试剂空白对照。将 50ulGAE-BSA溶液一式三份加到试验孔中，在空白孔中只加PBS。将所述平 板在37℃保温4小时，然后用PBS-吐温洗涤三次。将50ulPBS加到对照孔中， 同时将50ul的试验“AGE交联裂解剂”化合物加到试验孔和空白孔中。将平 板与“试验AGE交联裂解剂”化合物保温过夜(约16小时)，在加入一级抗 体前用PBS洗涤(下文)。

3.在该检测中，通过制备系列稀释物(1∶500-1∶2000)，然后将50ul 的各稀释物铺在Biocoat平板中来检测各组一级抗体、抗BSA或抗-RNase的最 佳结合能力。从饱和动力学确定最佳一级抗体。加入通过初始滴定确定的适当 稀释度的50ul一级抗体，在室温保温1小时。然后用PBS-吐温洗涤平板。

4.将平板与用PBS以1∶4000稀释的并作为最终二级抗体的二级抗体HRP- (山羊-抗-兔)保温。在室温保温30分钟。

5.按如下检测最佳交联和AGE交联的裂解。将HRP底物(100ul)加到平 板的各孔中，然后在37℃保温15分钟。用Dynatech ELISA-平板阅读器读数。 将样品滤纸定为“1”，将参考滤纸定为“5”。

标准操作过程

预备步骤

1.按表4所述滴定各新组的AGE-BSA制品，并从饱和动力学确定ELISA试 验的最佳AGE-BSA浓度。

2.在那天开始时，用热水冲洗平板洗涤器的头，用蒸馏水和50％乙醇漂洗。 用PBS-吐温(0.05％)添满平板洗涤器的容器，在使用前将该系统清洗三次。

3.按下文“试验方案”第2中所述制备用于启始试验的检测模板。

试验方案

1.将Superbloc试剂加热到37℃。将300ul Superbloc加到Biocoat平板的各孔 中，然后在37℃放置60分钟。用PBS-吐温(0.05％)将孔洗涤三次。将平板 转翻180度，然后重复该洗涤循环。

2.用PBS稀释AGE-BSA以便使50μl稀释样品含有最小交联和用pimagedine (氨基胍)最低抑制所需量的AGE-BSA，该量是用上述的初始滴定确定的。 通过将非褐变BSA以与GAE-BSA相同的浓度溶解在PBS中来制备阴性对照。 将50ul AGE-BSA或BSA加到相当于模板上“AGE-BSA”和“BSA”标记 的各孔中。

3.以30mM的浓度将试验化合物溶解在PBS中以进行初级评估。必须检测 pH并将其调至7.4(如需要的话)。用AGE-BSA预处理胶原包被的平板以获 得最大交联。通过以与用于AGE-BSA相同的蛋白质浓度，将BSA溶解在抑制 溶液中来制备用于抑制试验的阴性对照。将50ul AGE-BSA或BSA的抑制剂溶 液加到模板上分别相当于“ALT#+AGE-BSA”和“ALT#空白”的孔中。将平 板在37℃保温4小时。AGE-BSA与平板共价结合后，在准备检测反应(见下) 时用PBS-吐温洗涤平板。

4.按如下完成一级抗体与Biocoat平板的结合。在保温4小时结束时，用PBS- 吐温洗涤孔。用PBS制备适当稀释度(如由初始滴定确定)的兔-抗-AGE-RNase 或兔-抗-BSA抗体，向各孔中加入50ul，将所述平板在室温下放置60分钟。 5.用PBS-吐温洗涤二级抗体结合孔，将50ul用PBS稀释到1-4000的HRP (辣根过氧化物酶)(山羊抗-兔血清)加到各孔中。将所述平板在室温放置30 分钟。

6.按如下完成显色。按上述步骤4洗涤平板。用水稀释HRP-底物缓冲液。加 入200ul的ABTS溶液，搅拌，将100ul的该试剂加到各孔中。在37℃保温 15分钟。在Dynatech ELISA平板阅读器上，用定到“1”和样品滤纸和定到 “5”的参考滤纸读出410nm的光密度。按上述计算所述化合物的抑制百分比。 就其逆转并降低了高级糖基化终产物的水平而言，认为减少了免疫活泼量的化 合物是有治疗用途的。

试验化合物                                               IC50 (mM)        裂解

                                                        抗AGE/抗BSA    抗AGE/抗BSA

                                                                           (mM)

3-氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                               0.005/3.0     71％/67％(30)

3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                               63％/44％(10)

2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                         0.28/0.18     79％/90％(10)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物                                     38％/41％(30)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物                          63％/47％(30)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物                               54％/51％(30)

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物                   0.23/0.30     68％/66％(30)

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物                            56％/ND(30)

3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                      55％/ND(30)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物                               72％/27％(30)

3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]噻唑鎓溴化物                                76％/25％(30)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物    14.3/112.0    67％/13％(30)

3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基-噻唑鎓氯化物                  0.42/0.55     65％/61％(30)

3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物                    1.20/25.9     66％/37％(30)

3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物                                             63.7％/17.9％(30)

2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                   87％/54％(30)

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物                  4.70/38.6     89％/44％(30)

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物                                   61％/16％(30)

3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物                            0.4/0.52       77％/65％

3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羟乙基)噻唑鎓溴化物             0.012/0.120    65％/57％

3-氨基-5-(2-羟乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                 0.18/0.50      76％/48％

3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物                                 0.83/0.75      56％/93％

3-(2-苯基-氧乙基)噻唑鎓溴化物                                   0.020/0.014    73％/98％

3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物                                      22％/44％(10)

2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                       21％/26％(10)

2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                        25％/30％(10)

3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                     ND/2.0         51％/74％(10)

2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                       25％/51％(10)

2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物                      29％/35％(10)

2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物                        27％/44％(10)

2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物                        24％/40％(10)

2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                                         14％/17％(10)

3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物                   52％/61％(10)

3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化                       25％/38％(10)

物

3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻                     48％/57％(10)

唑鎓溴化物

3-[2-(2’，6’-二异丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙               31％/48％(10)

基)-噻唑鎓溴化物

3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯苄氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲                31％/54％(10)

苯磺酸盐

3-[2-(4’-甲酯基-3’-羟基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙             24％/18％(10)

基)-噻唑鎓溴化物

2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                               24％/23％(10)

2，3-二氨基-4-甲基-5-羟乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸盐                          20％/18％(10)

2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺                13％/42％(1)

酸盐

3-[2-(1’，4’-苯并二氧杂环己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-            11％/21％(3)

羟乙基)-噻唑鎓溴化物

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羟乙             34％/0％(10)

基)-噻唑鎓溴化物

3-[2-(3’，4’-三亚甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物                   17％/18％(10)

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓             14％/2％(0.3)

溴化物

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓    3/0.74   65％/69％(1)

溴化物

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻                 48％/49％(10)

唑鎓溴化物

1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓                  56％/38％(10)

溴化物

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物                 ND/0.1        62％/82％(1)

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯    ND/0/60％     32％/50％(0.3)

基-噻唑鎓溴化物

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物                                             28％/37％(10)

3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物                       4％/19％(10)

3-(3’-甲氧苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物                            14％/25％(10)

3-(2’，6’-二氯苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓氯化物                       6％/27％(10)

3-(2’-硝基苄基)-4-甲基-5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物                            11％/13％(10)

                          实施例10

为了确定在链尿菌素诱导的糖尿病大鼠中，本发明化合物降低与循环红细 胞交联的IgG量的能力，用下列试验测量。将试验化合物口服或腹膜内给予试 验动物，在给药后的不同时间如4，7或19天收集试验的血样以评估效力。

RBC-IgG试验方法

A.制备红细胞

将大鼠的血液收集在肝素化试管中，然后以2000xg离心10分钟，仔细取 出血浆。然后，每ml血液加入约5ml PBS，缓慢混合，再离心。吸出上清液。 将所述洗涤过程重复两次以上。然后，用移液管从试管底部取出0.2-0.3ml的 RBC，加到PBS中以得到1∶10的稀释液。再用PBS将所述稀释物以1∶25和1∶50 稀释。

B试验方案

1.将Superbloc温热到37℃。

2.取一Multiscreen-HA，0.45u平板，纤维素酯膜-密封的96孔平板(Millopore MAHAS 45)。

3.用100ul PBS将孔润湿。

4.将300ul Superbloc加到各孔中，然后在37℃保温1小时

5.将平板放在Millititer Vacuum支持器上，转到真空，将平板向下紧压一次。 抽吸掉孔中的液体。用300ul PBS-吐温0.05％洗涤孔。

6.关掉真空，将100ul PBS加到各孔中。

7.缓慢旋转RBC样品，吸50ul放到孔中，作出记录表，用前三个孔作为试 剂空白。剩另三个孔作为抗体空白。

8.按上述抽吸掉液体，然后用PBS将RBC洗涤两次。

9.用PBS以1∶25000稀释AP(Rb-抗-大鼠)(Sigma A-6066)。

l0.向孔中加50ul，然后在室温放置2小时。

11.按上述抽吸掉液体，然后用PBS将RBC洗涤两次。

12.加入pNPP底物(1mg/ml DEA缓冲液中)，每孔100ul。

13.37℃显色2小时。

14.将96孔corning微滴定板放在真空室中。

15.将样品平板放在真空支管上。确保平板底部完全干燥。

16.施加真空约5分钟。将100ul PBS加到所有孔中，再施加5分钟真空。轻 拿起平板，确保在平板底部未挂上液体珠。如果需要的话，再施加几分钟真空。 在Dynatech平板阅读器上读出收集在Corning平板中的溶液的OD，样品滤纸 定为1，参考滤纸定为4。

17.计算裂解百分比：100*(OD410对照-OD410处理的)/OD410对照。

以10mg/kg体重的口服剂量，在动物中的抑制百分比如下：

3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均                11±1@19天

三甲苯磺酸盐

3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-              40±24@19天

5-(2’-羟乙基)-噻唑鎓溴化物

3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羟基-苯            65±15@19天

基)-2-氧乙基-5-甲基-噻唑鎓溴化

物

3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙                58±21@19天

烯基-噻唑鎓溴化物

申请人从这些研究中所观察到的逆转交联的广泛程度强调了两个重要结 论。首先，体内形成的较大百分比的交联物对本发明二亲核的噻唑鎓化合物的 攻击和裂解均很敏感，因此得出结论，这些交联物含有与方案A和B中所示模 型一致的α-二酮片段。第二，本发明的交联裂解剂是以催化形式起作用的，从 这个意义上说，本发明的一个二亲核的噻唑鎓分子可以攻击并裂解不止一个糖 基化交联物。

                          实施例11

本实施例描述了来自正常和用式I化合物，即3-(2-苯基-2氧代乙基)噻 唑鎓溴化物(ALT766)治疗后的糖尿病动物的大鼠尾腱胶原的CNBr肽图谱。 将来自链尿菌素糖尿病大鼠和年龄匹配的对照动物的胶原纤维(5mg)用land PBS在60℃水合1小时，除去可溶性胶原，沉淀用PBS洗涤数次，然后用浓 度为30mM的3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物处理16小时。保温后，将 沉淀离心，洗涤，用CNBr(在甲酸中，40mg/ml)于30℃处理48小时。重 复冻干CNBr消化物以除去CNBr和酸，然后在减压条件下除去SDS-PAGE (20％丙烯酰胺)(道1、2和9，MWS；道3、4和5，3和5是用3-(2- 苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物处理的非糖尿病动物的尾腱胶原，4是用PBS处 理的；道6、7和8，6和8是用3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物处理的 糖尿病动物的尾腱胶原，7是用PBS处理的)。所得的凝胶示于图1中。

                          实施例12

                   制备AGE-BSA和交联的AGE-BSA 制备下列溶液

1.缓冲液：0.4M磷酸钠，pH7.4。

      NaH2PO4：  6g/100ml    

      Na2HPO4：  7g/100ml

用二碱价盐将一碱价磷酸钠的pH调到7.4，每100ml缓冲液加入0.02g叠氮化 钠。

2.BSA溶液

BSA：CalbiochemV型；在缓冲液1中为400mg/ml。共制备50g/125ml。通 过0.45u滤纸过滤到灭菌的1升Corning烧瓶中。

3.葡萄糖溶液，400uM

葡萄糖：400mM，9g/125ml的缓冲液。通过0.45u滤纸过滤到灭菌的1升 Corning烧瓶中。

反应方案：

在1升Corning灭菌烧瓶中，将BSA和葡萄糖溶液(各100ml)混合，盖 紧盖子，然后56℃保温，不振荡。将该瓶每星期打开一次，以取出等分试样用 于试验。反应持续9个星期，直到观察到形成了AGE-BSA聚合物。

裂解聚合物：

用PBS洗涤AGE-BSA凝胶片，直到在上清液中不再有蛋白滤出，用纸巾 印干。将约50mg洗涤的凝胶与PBS或10mM 3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴 化物(ALT766)于37℃保温过夜。用SDS-PAGE分析上清液，用考马斯蓝染色。 图2显示了所得凝胶。

                          实施例13

为了进一步研究本发明的AGE交联抑制和逆转剂防止表面，如在牙齿表面 发生的蛋白质变色，将进行下列表面褐变试验。作为表膜覆盖的牙齿表面的替 代物，使用为曝光和显色的照片纸以便在纸背面提供固定蛋白质(明胶，即胶 原)的表面。冲压出5mm的环，然后在50℃，含3mM叠氮化钠的100mM葡 萄糖-6-磷酸盐的0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中浸一星期。葡萄糖-6-磷酸 盐是一种能够以比葡萄糖更快的速率参与非酶促褐变的糖。除葡萄糖-6-磷酸盐 外，还包含了洗必泰和/或式I的化合物。保温后，用水漂洗明胶/纸盘，观察褐 色并照相。

仅在葡萄糖-6-磷酸盐中保温与仅浸在缓冲液中保温的盘相比显出淡褐 色。包含了洗必泰(洗必泰终浓度为0.04％的Peridex形式)有明显的褐色。将 式I化合物加到洗必泰中完全抑制了明胶的褐变，与没有洗必泰而包含式I化 合物时的一样。葡萄糖-6-磷酸盐单独作用于明胶表面而形成的淡褐色和其受到 式I化合物的抑制表明，本发明实用性在于抑制牙齿表明的非酶促褐变。存在 洗必泰褐变程度增加和其受到式I化合物的抑制表明，本发明可用于抑制因洗 必泰而发生的抗齿斑剂增强的非酶促褐变。

                          实施例14

为了证明本发明化合物在医学相关生物分子中裂解有害交联物的通用性， 申请人用老年性痴呆症的类淀粉肽进行了下列试验。所述的14kDa肽主要成分 是在老年性痴呆症患者的脑实质中形成的大斑样聚集物。认为所述类淀粉物斑 的逐渐积累和其它不正常特征如血管周的类淀粉物和神经纤维缠结是这种痴呆 的特定神经毒和其它致病过程的原因，而这些总是致命的而且目前是无法治愈 的。已知老年性痴呆症的类淀粉肽在体内积累AGE修饰物，而且在体内暴露于 生理学相关浓度的葡萄糖后，糖基化增强了不溶性肽聚集物的形成，使人想起 老年性痴呆症的类淀粉斑。

基本上按用于制备AGE-BSA的制备方法，除用β-肽代替BSA作为糖基化 底物外，通过将一份可溶性β-类淀粉肽(合成制备的并相当于老年性痴呆症典 型斑中所发现的β-类淀粉肽)在中性缓冲葡萄糖溶液中保温3个月制备AGE- β-肽。在体内延长暴露于葡萄糖后，将糖基化和和交联的AGE-β-肽通过大小 排阻色谱(例如过PFD-10柱)与低分子量反应物分开，然后通过标准方法碘 化以得到125I-AGE-β-肽，将其作为所需的放射性标记的试剂用于按照下列方法 试验或筛选有分子AGE-裂解活性的化合物。将等分125I-AGE-β-肽与或不与所 加的预定浓度(如10mM化合物766)的本发明试验化合物保温预定的时间(如 过夜)，此后，制备保温混合物样品用于变性凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后 进行分析以便按照公知的方法确定表观分子量。将在所得电泳凝胶上暴露的放 射自显影扫描成数字射线照相成像，用分析系统记录放射性，作为表观分子量 的函数(在含SDS缓冲液中的电泳迁移率)。研究该试验的结果表明如果不将 125I-AGE-β-肽暴露于本发明的“AGE-裂解剂”化合物，则会洗脱一高分子量 (＞40kDa)的带，这说明其糖基化伴有稳定共价交联物的聚集和形成。但如果 首先在本发明的AGE交联-携带剂溶液中保温125I-AGE-β-肽，则在终射线照片 上呈现的低分子量(＞18kDa)碘化物质表明125I-AGE-β-肽不显著聚集。该试 验表明不仅可以用本发明的二亲核噻唑鎓类试剂水解蛋白质链之间的共价 AGE-介导的交联物，而且AGE的所述抑制和逆转可以逆转与人类疾病有关的 蛋白上AGE积累的有害分子后果。

                          实施例15

还发现本发明的交联结构和相关化合物可用作抗原或半抗原以引发针对其 的特异性抗体。而且本发明的所述抗体可用于鉴定本发明的AAA结构。通过 建立使用本发明抗-交联结构抗体的免疫检测方法，例如可以测量所述交联物修 饰蛋白质的程度。如上所讨论的，根据所修饰之蛋白质的半衰期，蛋白质样品， 如血红蛋白上交联表位的免疫化学测量可以作为最新AGE形成的指标。同样， 也可以通过循环和/或组织蛋白质上交联表位的免疫化学检测来监测用本发明 药物的治疗进程，其中所述试剂直接抑制高级糖基化并使其裂解。

用许多公知的二价偶联剂，如象EDC的碳化二亚胺，通过将交联结构与牛 血清白蛋白(BSA)偶联可以制备用作免疫原的交联修饰的BSA。通过从保 温混合物中分离或直接合成的方法，可以很方便地制备各种其它半抗原、抗原 和相应于本发明交联结构(包括但不限于本文具体描述的那些)的结合免疫原。 然后可以用所述交联结构作为免疫原得到识别特异性表位或其分子特征的各种 抗体。

在优选的实施方案中，可以认为交联结构本身就是半抗原，按照本领域广 泛使用的方法，可将其相应地与任何数种优选载体蛋白偶联，载体蛋白包括例 如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白和最优选的牛血清白蛋白(BSA)。

由于用于交联结构的分子特征之抗体特异性，可以在任何熟知的免疫方法 中使用交联结构(无论单独或与载体蛋白结合)以产生具有许多应用的抗体和 相关免疫试剂。

根据优选的方法，可以免疫任何数种动物以产生直接抗交联结构蛋白结合 物的多克隆抗血清，所述动物包括例如小鼠，大鼠，仓鼠，山羊，兔和鸡。上 述的前三种动物特别适用于生产分泌半抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤。用本 领域常用的方法通过与适宜的细胞系，如骨髓瘤细胞系融合，可以很方便地产 生来自免疫动物脾细胞的所述杂交瘤，所述方法描述了适用于使免疫脾细胞不 死的条件。生产杂交瘤的所述方法还提供了筛选并克隆免疫脾细胞/骨髓瘤细胞 杂交瘤和鉴定杂交瘤克隆的方法，所述杂交瘤克隆稳定地分泌抗所需表位的抗 体。象兔和山羊这样的动物种更常用于生产多克隆抗血清，但无论最终需要的 是多克隆抗血清还是单克隆抗体，开始将半抗原修饰的载体蛋白质与佐剂如完 全弗氏佐剂一起施用。通过几种途径，通常以腹膜内，肌肉内或皮内进行免疫 接种；在本领域中根据待接种的种和最终待产生的抗体类型来确定途径是优选 的。随后，通常与佐剂如明矾或不完全弗氏佐剂一起进行加强免疫。在开始接 种后隔一段时间进行加强免疫；通常一个月是适宜的间隔，在每次加强接种后 1到2星期之间取血样。另外，有时用各种所谓超免疫方法以试图优先于抗-载 体蛋白质抗体产生抗-半抗原抗体，超免疫通常及时使加强免疫在空间上更接 近。

可以用数种方便的方式，包括例如Ouchterlony扩散凝胶和直接ELISA法 可以将加强后血样的抗体滴定度与半特异性免疫滴定度进行比较。在典型的直 接ELISA中，将确定的抗原固定在检测孔表面，通常用96孔或微滴定平板， 然后进行一系列的保温，并分别以漂洗检测孔表面以除去未结合的配对物。作 为非限制性实施例，将接受稀释的、缓冲的半抗原/载体结合物的水溶液加到检 测平板孔中，优选其中载体蛋白不同于用于免疫产生抗体的待试验动物蛋白； 例如可以检测来自AAA/KLH结合物免疫之动物的血清抗装有固定AAA/BSA 结合物检测孔的情况。另外，可以通过单独与半抗原保温来装饰检测表面。通 常，然后将检测孔的表面暴露于非相关蛋白溶液，如酪蛋白以阻断塑料表面上 的未占据的位点。用通常含盐和洗涤剂以使非特异性作用最小的中性缓冲溶液 漂洗后，将孔与一种系列稀释的从所需血样制备的血清(一级抗血清)接触。 再次漂洗后，经与所需半抗原或半抗原/载体结合物的相互作用，固定在检测孔 上的试验抗体的程度可以通过与市售酶-抗体结合物一起保温来评估，其中该二 级结合物的抗体部分抗用于产生一级抗血清的种，例如，如果一级抗血清是在 兔中产生的，就可以用在山羊中产生的并与数种酶中的一种，如辣根过氧化物 酶结合的抗兔抗体的市售制剂作为二级抗体。按照制造商说明的方法，通过在 比色试验中相关结合物酶的活性就可以定量分析所述二级抗体的量。还可以使 用许多相关ELISA或放射性免疫测量方法，如竞争性ELISA或夹心ELISA(所 有这些均是本领域公知的)以鉴定该滴定度的所需抗血清；即在高稀释度(大 于1/1000，而且优选大于1/10000)得出阳性结果的特定抗血清。

可以用相似的免疫测量方法评估杂交瘤培养上清液中抗体的滴定度，所述 杂交瘤是从免疫动物的脾细胞制备的。这时表征抗血清或杂交瘤上清液，就要 用各种对照保温，例如与不同的载体蛋白、相关但结构不同的半抗原或抗原和 在免疫测量方法中删去各种试剂以使检测中的非特异性信号最小并鉴定抗体特 异性的确定决定基和来自假阳性和假阴性结果的滴定度。就该方面所用的对照 保温的类型也是公知的。还可以用经上述方法鉴定的的抗血清，使用相同的免 疫测量方法，所述抗血清是高滴定度的而且抗交联结构中的特异性结构决定 基，所述交联结构在生物样品、食品或其它可食物，或其它携带胺的物质和所 研究的生物分子上。为了方便操纵者，可以以试剂盒形式提供所需抗-醛-修饰 Amadori产物抗体(多克隆或单克隆)与说明书以及可选的其它有用的试剂和 稀释剂，包括但不限于一组交联结构的分子标准物一起的所述后种应用。

可以用其它形成概括或用其它方式完成本发明而不偏离本发明的精神或基 本特征。因此，本发明公开在所有意义上讲是说明性的，而不是限制性的，权 利要求所表明的本发明范围和等同意义和范围内的所有改变均包括在本发明公 开中。

                          发明背景