防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法
阅读：549发布：2020-05-15
专利汇可以提供防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种防治肾缺血 再灌注 损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草50‑70份、三七8‑12份、薏苡仁12‑18份、制大黄8‑12份、黄芪12‑18份和甘草4‑8份；一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，主要包括八仙草干燥；将制大黄、黄芪和甘草混合 粉碎 后采用 乙醇 进行梯度回流提取；将八仙草粉碎后先 超 声波 辅助 水 提再乙醇回流提取；将三七和薏苡仁 超微粉碎 后采用 超声波 辅助醇提；以及提取液合并浓缩等步骤。本发明的中药组合物以清热利湿，活血化瘀为主，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，对肾缺血再灌注损伤具有显著防治作用。，下面是防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草50-70份、三七8-12份、薏苡仁12-18份、制大黄8-12份、黄芪12-18份和甘草4-8份，制备方法包括如下步骤：
步骤一：每年7-9月采集新鲜八仙草，将其平铺在带孔托盘中，过热蒸汽干燥至其含水量小于12％，得八仙草；
步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至30-50目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至60-80目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至200-300目，得第二混合粉；
步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％-60％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的体积分数为70％-80％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取1-
3h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重量的10倍量体积分数为80％-95％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
步骤五、向所述第二混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为30-50％的乙醇，采用超声波-浸泡结合法提取2-4h，得混合液；
步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
2.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草60份、三七10份、薏苡仁15份、制大黄10份、黄芪15份和甘草
6份。
3.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，所述步骤一中，过热蒸汽干燥的干燥条件为：干燥温度115-125℃、干燥时间30-40min。
4.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度70-80℃，回流次数2-3次，每次回流提取时间0.5-1.5h。
5.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度60-65℃，超声时间20min/h，超声功率400-
450w；回流提取条件为：提取温度50-70℃，回流次数2-3次，每次回流提取时间0.5-1.5h。
6.如权利要求5所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，所述步骤四中，回流提取的回流次数为3次，其中，第一次回流的提取温度为50℃、提取时间为1.5h，第二次回流的提取温度为58℃，提取时间为1h，第三次回流的提取温度为70℃，提取时间为
1h。
7.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度70-80℃，超声时间20min/h，超声功率500-
550w。
8.如权利要求1所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药制剂领域。更具体地说，本发明涉及一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法。
背景技术
[0002] 缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)临床上多见于失血或者中毒性休克、血管内凝血、肾移植、肾部分切除及肾实质切开取石等手术中。缺血后恢复肾脏血流会加剧细胞代谢紊乱，导致肾脏损伤加重。缺血再灌注损伤是缺血性急性肾损伤的重要环节，也是预防和治疗急性肾功能衰竭的关键环节，更是肾移植中影响肾早期功能恢复和长期存活的主要因素；防治肾缺血再灌注损伤已成为肾移植亟待解决的关键问题之一。
发明内容
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0004] 本发明还有一个目的是提供一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法。该组合物以清热利湿，活血化瘀为主，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，对肾缺血再灌注损伤具有显著防治作用。
[0005] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草50-70份、三七8-12份、薏苡仁12-18份、制大黄8-12份、黄芪12-18份和甘草4-8份。
[0006] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草60份、三七10份、薏苡仁15份、制大黄10份、黄芪15份和甘草6份。
[0007] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至30-50目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至60-80目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至200-300目，得第二混合粉；
[0010] 步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％-60％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的体积分数为70％-80％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
[0011] 步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取1-3h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重量的10倍量体积分数为80％-95％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
[0013] 步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
[0015] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度70-80℃，回流次数2-3次，每次回流提取时间0.5-1.5h。
[0016] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度60-65℃，超声时间20min/h，超声功率400-450w；回流提取条件为：提取温度50-70℃，回流次数2-3次，每次回流提取时间0.5-1.5h。
[0017] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，回流提取的回流次数为3次，其中，第一次回流的提取温度为50℃、提取时间为1.5h，第二次回流的提取温度为58℃，提取时间为1h，第三次回流的提取温度为70℃，提取时 间为1h。
[0018] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度70-80℃，超声时间20min/h，超声功率500-550w。
[0019] 优选的是，所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果：
[0021] 第一、本发明的中药组合物全方以清热利湿，活血化瘀为主，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，其中，八仙草味辛，微苦，归少阴，太阴经，有清热解毒，利尿通淋，消肿止痛的功效；三七，味微苦，性温，归肝经，胃经，心经，肺经，大肠经，有散瘀止血，消肿止痛，补血活血，滋补强壮等功效；薏苡仁性甘淡，凉，入脾、肺、肾经，有健脾，补肺，清热，利湿的疗效；制大黄，味苦，性寒，归胃、脾、大肠、肝、心包经，有清热除湿之效；黄芪性甘，温，归肺、脾经，有益气健脾，利水消肿之功效；通过将八仙草、三七、薏苡仁、制大黄、黄芪和甘草以合适的比例进行配伍，达到显著防治肾缺血再灌注损伤的目的；
[0023] 第三、本发明的制备方法充分考虑各原料中的有效成分的性质，将制大黄、黄芪和甘草混合粉碎后采用乙醇进行梯度回流提取，将八仙草粉碎后先超声波辅助水提再乙醇回流提取，将三七和薏苡仁超微粉碎后采用超声波辅助醇提，使各原料中的有效成分完全浸出，进而使该中药组合物的药效得以充分发挥。
[0025] 图1为各组大鼠肾脏组织HE染色结果
[0026] 图2为中药组合物对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 其中，与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，##P<0.01。
具体实施方式
[0028] 需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0029] 实施例1：
[0030] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草50份、三七8份、薏苡仁12份、制大黄8份、黄芪12份和甘草4份。
[0031] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0032] 步骤一：每年7-9月采集新鲜八仙草，将其平铺在带孔托盘中，过热蒸汽干燥至其含水量小于12％，得八仙草；
[0033] 步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至30目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至60目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至200目，得第二混合粉；
[0034] 步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为60％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的体积分数为80％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
[0035] 步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取3h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重量的10倍量体积分数为95％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
[0036] 步骤五、向所述第二混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％的乙醇，采用超声波-浸泡结合法提取4h，得混合液；
[0037] 步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
[0038] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤一中，过热蒸汽干 燥的干燥条件为：干燥温度115℃、干燥时间40min。
[0039] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度70℃，回流次数2次，每次回流提取时间1.5h。
[0040] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度60℃，超声时间20min/h，超声功率400w；回流提取条件为：提取温度50℃，回流次数2次，每次回流提取时间1.5h。
[0041] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度70℃，超声时间20min/h，超声功率500w。
[0042] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
[0043] 实施例2：
[0044] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草60份、三七10份、薏苡仁15份、制大黄10份、黄芪15份和甘草6份。
[0045] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0046] 步骤一：每年7-9月采集新鲜八仙草，将其平铺在带孔托盘中，过热蒸汽干燥至其含水量小于12％，得八仙草；
[0047] 步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至40目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至70目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至250目，得第二混合粉；
[0048] 步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为55％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的体积分数为75％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
[0049] 步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取2h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重量的10倍量体积分数为85％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
[0050] 步骤五、向所述第二混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为40％的乙醇，采用超声波-浸泡结合法提取3h，得混合液；
[0051] 步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
[0052] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤一中，过热蒸汽干燥的干燥条件为：干燥温度120℃、干燥时间36min。
[0053] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度73℃，回流次数3次，每次回流提取时间1h。
[0054] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度62℃，超声时间20min/h，超声功率430w；回流提取条件为：提取温度60℃，回流次数3次，每次回流提取时间1h。
[0055] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度75℃，超声时间20min/h，超声功率530w。
[0056] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
[0057] 实施例3：
[0058] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草70份、三七12份、薏苡仁18份、制大黄12份、黄芪18份和甘草8份。
[0059] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0060] 步骤一：每年7-9月采集新鲜八仙草，将其平铺在带孔托盘中，过热蒸汽干燥至其含水量小于12％，得八仙草；
[0061] 步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至50目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至80目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至300目，得第二混合粉；
[0062] 步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的体积分数为70％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
[0063] 步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取1h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重 量的10倍量体积分数为80％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
[0064] 步骤五、向所述第二混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为30％的乙醇，采用超声波-浸泡结合法提取2h，得混合液；
[0065] 步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
[0066] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤一中，过热蒸汽干燥的干燥条件为：干燥温度125℃、干燥时间30min。
[0067] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度80℃，回流次数2次，每次回流提取时间0.5h。
[0068] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度65℃，超声时间20min/h，超声功率450w；回流提取条件为：提取温度70℃，回流次数3次，每次回流提取时间0.5h。
[0069] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度80℃，超声时间20min/h，超声功率550w。
[0070] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
[0071] 实施例4：
[0072] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物，主要由按重量份计的如下原料制成：八仙草60份、三七10份、薏苡仁15份、制大黄10份、黄芪15份和甘草6份。
[0073] 一种防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0074] 步骤一：每年7-9月采集新鲜八仙草，将其平铺在带孔托盘中，过热蒸汽干燥至其含水量小于12％，得八仙草；
[0075] 步骤二、称取上述重量份的八仙草，并将其粉碎至30目，得八仙草粉；称取上述重量份的制大黄、黄芪和甘草，混合后粉碎至80目，得第一混合粉；称取上述重量份的三七和薏苡仁，混合后粉碎至300目，得第二混合粉；
[0076] 步骤三、向所述第一混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％的乙醇回流提取，过滤，得第一滤液和第一滤渣，再向所述第一滤渣中加入所述混合粉重量的8倍量的 体积分数为80％的乙醇回流提取，过滤，得第二滤液和第二滤渣；
[0077] 步骤四、向所述八仙草粉中加入其重量的20倍量的水，采用超声波-浸泡结合法提取2h，提取完成后过滤，得第三滤液和第三滤渣，再向所述第三滤渣中加入所述八仙草粉重量的10倍量体积分数为95％的乙醇回流提取，过滤，得第四滤液和第四滤渣；
[0078] 步骤五、向所述第二混合粉中加入其重量的15倍量的体积分数为50％的乙醇，采用超声波-浸泡结合法提取3h，得混合液；
[0079] 步骤六、将所述第一滤液、所述第二滤液、所述第三滤液、所述第四滤液和所述混合液合并，并减压浓缩，即得所述防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物。
[0080] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤一中，过热蒸汽干燥的干燥条件为：干燥温度115℃、干燥时间40min。
[0081] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤三中，回流提取的条件为：提取温度70℃，回流次数3次，每次回流提取时间1.2h。
[0082] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤四中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度65℃，超声时间20min/h，超声功率450w；回流提取条件为：回流次数为3次，其中，第一次回流的提取温度为50℃、提取时间为1.5h，第二次回流的提取温度为58℃，提取时间为1h，第三次回流的提取温度为70℃，提取时间为1h。
[0083] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，所述步骤五中，超声波-浸泡结合法的提取条件为：提取温度80℃，超声时间20min/h，超声功率500w。
[0084] 所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物的制备方法，还包括，向所述的防治肾缺血再灌注损伤的中药组合物中添加适量的药学上可接受的辅料，制备成治疗急性肾病的中药口服制剂。
[0085] 实施例5：中药组合物药效验证试验
[0086] 1实验材料
[0087] 1.1实验动物
[0088] 选用健康SPF级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠30只，8周龄，体质量(210±10)g，广西医科大学实验动物中心(合格证号：SCXK桂2009-0002)，大鼠饲养于SPF级实验动物环境中，温度为23～26℃，相对湿度为 55％～65％，自由进食纯净水及高压消毒灭菌不含致敏原的饲料，每周更换垫料2次。所有实验动物按照“国际实验动物管理条例”进行喂养和处理，对动物的处置符合医学伦理学标准。
[0089] 1.2药品与试剂
[0090] 以实施例4制备的中药组合物为供试药品，每份相当于原药材八仙草20g、薏苡仁5g、黄芪5g、三七3.3g、制大黄3.3g、甘草2g，每份重30g。
[0091] BUN、Cr试剂盒均购自上海生物研究所，MDA、SOD、GSH-PX、总蛋白(TP)试剂盒购自南京建成生物土程研究所(批号：20130517，20130315，20130412，20130220)，蛋白检测抗体BcL-2；Bax和β-actin均购自迈阿密的Cell Signaling Technology，SP二抗免疫组化试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司，四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0092] 1.3仪器与设备
[0093] 高速低温离心机(德国Biofuge Stoucctos)；全自动生化分析仪(德国Bio-Asia公司生产)；水平电泳仪(北京六一仪器厂JY-SPGT)；垂直电泳仪及电转膜系统(广州市昊洋贸易有限公司)；HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告分析系统(西安金马医疗器械有限公司)。
[0094] 1.4动物分组、模型制备、给药方法
[0095] 模型制备将SD大鼠术前饲养1周，手术前禁食6h，将实验动物随机(随机数字表法)分为三组(n＝10)，模型组为缺血再灌注组，治疗组为中药组合物治疗组，对照组为假手术组。模型组先注射1.2ml·100g-1NS进入门静脉，10分钟后夹闭肾动脉，当阻断45分钟后去除肾动脉夹再灌注，肉眼观察肾脏由暗红色变为鲜红色，说明肾脏再灌注成功，缝合切口，24h后采血并连续7天灌胃生理盐水。治疗组为再灌注组基础上进行中药组合物灌胃40mg·kg-1·d-1连续7天；对照组为假手术组，从门静脉注入NS 1.2ml·100g-1，但不夹闭肾动脉，等暴露45分钟后缝合切口。继续喂养7天，自由摄水，进食。7天后用10％水合氯醛溶液3ml·kg-1麻醉，取血，检测相关指标。取大鼠肾脏，用4％低聚甲醛溶液固定，编号，石蜡包埋，再进行病理形态学检查。
[0096] 1.5测量或者观察指标
[0097] 1.5.1肾功能参数测定
[0098] 血清肌酐Cr和尿素氮BUN是反应肾功能的常用血生化指标，用全自动生化分析仪测定各组血肌酐Cr、尿素氮BUN含量，按试剂盒说明书中进行操作，以评估大鼠肾功能。
[0100] 取肾脏约0.5克，用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，在冰浴的平皿上剪碎，按肾组织(g)：生理盐水(ml)为1：9比例稀释，用超声细胞粉碎机匀浆(3500r·min-1、工作10s间歇20s)，所得匀浆液低温离心(4000r·min-1)，取10％肾组织匀浆上清按GSH-PX(二硫代二硝基甲苯法)、SOD(黄嘌呤氧化酶法)、MDA(硫代巴比妥酸盐法)、总蛋白(TP，考马斯亮蓝法)试剂盒说明书所述方法测定肾组织匀浆中SOD、GSH-PX活性及MDA、TP含量。
[0101] 1.5.3肾脏组织形态学检査
[0102] 另取大鼠肾脏，用4％低聚甲醛溶液固定，石蜡包埋并编号的标本，切片，HE染色，通过Nikon80i显微镜进行观察和图像采集，观察肾组织形态学变化并进行病理学评分。普通光镜下观察肾脏形态学变化，按Paller法对肾小管损伤进行评分：于高倍视野从10个不同区域选择100个肾小管计分，评分越高，表示肾小管损伤越严重。评分标准：肾小管明显扩张为1分，细胞扁平为1分；刷状缘丢失或脱落为1分；肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞未成管型或细胞碎片为1分；管型为2分。
[0103] 1.5.4 Western blot检测Bcl-2和Bax的蛋白表达
[0104] 取100mg肾组织置于冰上，用含0.1％蛋白酶抑制剂的冷生理盐水冲洗，加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，进行冰上裂解后，超声匀浆，低温离心(4℃)30分钟，取上清液测蛋白浓度。取30mg蛋白煮沸5分钟后，经6％～15％SDS-PAGE电泳，电转移至NC膜上，在5％脱脂奶粉PBST溶液4℃封闭过夜，洗膜后加入兔抗大鼠(1:1000)Bcl-2，Bax和β-actin 4℃过夜，洗膜后再用HRP标记的二抗(1:2000)杂交，37℃，1h。洗膜后在暗室中加ECL发光试剂，X线胶片曝光1～2分钟后显影、定影。杂交信号在Gel.Doc2000仪器中成像通过ImageJ软件进行图像的灰度分析。以管家基因β-actin为蛋白上样量正常，其余组与其相比得到相对量，取均值。
[0105] 1.6统计学方法
[0106] 所有数据均采用SPSS 19.0for windows统计分析软件进行数据处理，计量资料采用t检验，以均数±标准差 表示，计数资料用χ2检验，等级资料用秩和检验。P＜0.05 视为差异有统计学意义。
[0107] 2结果
[0108] 2.1大鼠一般情况
[0109] 对照组大鼠活动、饮食、大小便正常，毛光泽，生长状态良好，体重增长明显，对外界反应灵敏；模型组活动减少，食欲差，鼠毛稀疏，粗糙，无光泽，饮食量减少，精神较萎靡；造模1W后，部分大鼠大便软或不成形，体重增加较慢，对外界反应灵敏性稍差；治疗组大鼠一般状态均好于模型组。
[0110] 各组大鼠实验前后的平均体重比较，实验前各组大鼠平均体重无差异(P>0.05)；实验后模型组及治疗组大鼠平均体重较正常组明显降低(P<0.05)。见表1。
[0111] 表1各组大鼠实验前后的体重情况
[0112]
[0113] 与对照组比较，*1P<0.05；与模型组比较，*2P<0.05。
[0114] 2.2中药组合物对肾缺血再灌注损伤大鼠血清中BUN、Cr的影响
[0115] 模型组血清BUN、Cr水平显著升高，与对照组比较，P<0.01，说明模型建立成功；
[0116] 与模型组比较，治疗组BUN、Cr水平显著下降，P<0.05，说明中药组合物对肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏有一定的保护作用。见表2。
[0117] 表2三组肾缺血再灌注损伤大鼠血清中BUN、Cr比较
[0118]
[0119] 对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与模型组比较，*3P<0.05。
[0120] 2.3中药组合物对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织MDA、SOD、GSH-PX的影响
[0121] 与对照组比较，模型组SOD、GSH-PX均显著降低(P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.01)，说明模型建立成功；与模型组比较，治疗组能不同程度地降低肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织匀浆MDA的含量，同时均能明显升高大鼠肾组织匀浆SOD、GSH-PX活性，P<0.05。说明中药组合物能降低肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织匀浆MDA的含量，并能使降低的肾组织匀浆SOD、GSH-PX活性升高。提示中药组合物肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织有很好的抗脂质氧化作用，其护肾作用与抗脂质氧化有关。见表3。
[0122] 表3三组肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织中MDA、SOD、GSH-PX的影响
[0123]
[0124] 对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与模型组比较，*3P<0.05。
[0125] 2.4肾脏组织在光镜下病理变化
[0126] 对照组肾小管结构完整，清楚，排列整齐，上皮细胞无变性坏死,腔内未发现管型，肾小球形态正常；与对照组比较，模型组肾小管上皮细胞损伤严重，广泛坏死，结构欠清，有刷状缘脱落，有管型形成，可见局部出血、水肿，炎性物质渗出；与模型组相比，治疗组肾小管病变明显减轻，但细胞肿胀明显，空泡可见变性，局部见到坏死脱落，间质可见出血。说明中药组合物能明显减轻肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织的病理改变。见图1。
[0127] 2.5肾小管评分
[0128] 肾小管损伤评分结果 为：对照组8.2±2.46、模型组47.3±5.28、治疗组31.4±3.55。与对照组比较，模型组和治疗组肾小管损伤评分均较高(P<0.01)；与模型组比较，治疗组肾小管损伤评分较低(P<0.05)，差异具有显著性。提示中药组合物能明显减轻肾缺血再灌注损伤大鼠肾小管的损伤。
[0129] 2.6中药组合物对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[0130] 与对照组比较，模型组Bcl-2蛋白的表达显著增多，P<0.05；与模型组比较，治疗组Bcl-2蛋白的表达显著性升高，P<0.01；说明中药组合物可以通过增加Bcl-2的表达量来阻止细胞凋亡的产生。
[0131] 与对照组比较，模型组Bax蛋白的表达显著增高，P<0.05；与模型组比较，治疗组Bax蛋白的表达显著性降低，P<0.01；说明Bax蛋白随着中药组合物的治疗有显著降低，提示中药组合物可以通过抑制Bax的表达量来阻止细胞凋亡的产生。见图2。
[0132] 3结论
[0133] 近年来对细胞凋亡防治的研究已成为防治肾脏缺血再灌注损伤的热点。细胞凋亡不但参与了肾脏缺血再灌注损伤，还是肾脏缺血再灌注损伤的重要环节，更是缺血再灌注组织和器官损伤的重要发病机制之一；抑制细胞凋亡能有效地减轻肾脏缺血再灌注损伤。也可以通过促进Bcl-2蛋白表达同时抑制Bax蛋白表达来调节Bcl-2和Bax的比例，来保护大鼠的肾功能。
[0134] 本实验通过肾脏组织脂质氧化指标测定，结果显示：治疗组肾组织MDA含量指标显著降低，与模型组比较，差异具有显著性意义(P<0.05)；治疗组SOD、GSH-PX水平显著降低，与模型组比较，差异具有显著性意义(P<0.05)；证实中药组合物可以降低肾缺血再灌注损伤大鼠的MDA含量和升高SOD、GSH-PX水平，提示中药组合物对肾脏缺血再灌注损伤大鼠的肾功能具有抗脂质过氧化作用。本实验通过Western蛋白免疫印迹等半定量检测分析，结果显示：对照组Bcl-2、Bax表达极少，模型组Bcl-2、Bax表达均明显增强(Bcl-2：P<0.05、Bax：P<0.01)；与模型组比较，治疗组Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl-2表达显著增强(P<0.01)；进一步证明中药组合物可以减少肾小管上皮细胞凋亡。其可能主要通过对内源性线粒体凋亡途径启动分子Bcl-2，Bax表达的调节来发挥抑制肾小管上皮细胞凋亡的作用。
[0135] 综上所述，本实验结果显示中药组合物对肾脏缺血再灌注损伤具有显著防治作用，其作用机制可能与抗脂质过氧化和影响凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达有关。
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