Mindin基因在肝脏缺血再灌注损伤中的应用
阅读：938发布：2020-05-12
专利汇可以提供Mindin基因在肝脏缺血再灌注损伤中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种Mindin及其 抑制剂 在肝脏缺血 再灌注 损伤中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以Mindin基因敲除小鼠和 肝细胞 特异性Mindin转基因小鼠为实验对象，通过肝脏缺血再灌注损伤模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，Mindin基因敲除小鼠肝脏 坏死 明显被抑制，肝功能也明显好转，而肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的肝脏坏死则明显增加，且肝功能明显恶化。因此Mindin基因具有恶化肝功能的作用，特别是Mindin基因能够恶化肝脏缺血再灌注损伤的作用。针对Mindin的上述功能，提供Mindin可作为药物靶标筛选 治疗 肝脏缺血再灌注损伤的药物，Mindin的抑制剂可用于制备治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物。，下面是Mindin基因在肝脏缺血再灌注损伤中的应用专利的具体信息内容。
1.Mindin作为药物靶标在筛选保护肝脏功能的药物中的应用。
2.Mindin作为药物靶标在筛选治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中
的应用。
3.Mindin的抑制剂在制备保护肝脏功能的药物中的应用。
4.一种保护肝脏功能的药物，其特征在于：包含Mindin的抑制剂。
5.Mindin的抑制剂在制备治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
6.一种治疗肝脏缺血疾病的药物，其特征在于：包含Mindin的抑制剂。
7.根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于：所述的Mindin的抑制剂优选为Mindin 基因的siRNA、Mindin基因的RNA干扰载体或Mindin的抗体及其他能够抑制Mindin表达的抑制剂中的一种。
8.根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的Mindin的抑制剂优选为Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干扰载体或Mindin的抗体及其他能够抑制Mindin表达的抑制剂中的一种。
Mindin基因在肝脏缺血再灌注损伤中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Mindin（Spondin 2）作为药物靶标在筛选治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中应用, 以及Mindin的抑制剂在制备治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中应用。
背景技术
[0002] 缺血再灌注损伤是指组织缺血缺氧达到一定的时间和程度引起细胞发生病理改变，在恢复血液供应后不一定使病变的细胞恢复功能，反而在一定条件下出现进一步加重的现象。临床上广泛的肝叶切除术以及肝移植术等常需部分或完全阻断肝脏血流，而肝脏是一个对缺血缺氧非常敏感的器官，因此不可避免地发生缺血再灌注损伤。肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia Reperfusion Injury，HIRI)机制相当复杂，确切的发病机制仍不十分清楚。目前，对于肝脏缺血再灌注损伤发生机制的研究己成为移植界关注的热点。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸
2+ 2+
化功能低下，引发代谢性酸中毒；ATP含量的下降，导致肝细胞内外Ca 重新分布，即Ca 内流，引起线粒体的损伤；肝脏缺血再灌注损伤可以分为两个时限，早期阶段以Kupffer细胞激活为主要特征。Kupffer细胞可以释放大量的氧自由基或超氧阴离子，可以引起肝细胞的急性损伤。在缺血再灌注损伤的第二阶段，Kupffer细胞激活以后，可以引起大量的炎症因子的释放，激活炎症反应通路，使大量的中性粒细胞在肝脏内浸润。中性粒细胞在肝脏内浸润后可以通过释放氧自由基和蛋白酶，引起严重的肝功能损害。
2+ 2+
化功能低下，引发代谢性酸中毒；ATP含量的下降，导致肝细胞内外Ca 重新分布，即Ca 内流，引起线粒体的损伤；肝脏缺血再灌注损伤可以分为两个时限，早期阶段以Kupffer细胞激活为主要特征。Kupffer细胞可以释放大量的氧自由基或超氧阴离子，可以引起肝细胞的急性损伤。在缺血再灌注损伤的第二阶段，Kupffer细胞激活以后，可以引起大量的炎症因子的释放，激活炎症反应通路，使大量的中性粒细胞在肝脏内浸润。中性粒细胞在肝脏内浸润后可以通过释放氧自由基和蛋白酶，引起严重的肝功能损害。
[0003] 众多文献资料表明缺血再灌注损伤可能与下列因素有关：1．氧自由基的生成；2．钙超载；3．细胞因子的参与；4．Kupffer细胞及中性粒细胞激活；5．内皮素和一氧化氮浓度的失衡。总之，肝脏缺血再灌注损伤是由各种机制相互影响，综合作用的结果，进一步了解及明确其作用机制，将对临床防治肝脏缺血再灌注损伤有着重要的意义。
[0004] Mindin又称为Spondin 2，属于Mindin-F-Spondin细胞外基质蛋白家族，于1997年由Higashijima等首次在斑马鱼中克隆，并发现其能促进海马神经元的粘附与生长。随后的研究证实Mindin广泛表达于哺乳动物的各组织，其结构包含一个氨基末端的F底板反应蛋白（F-spondin, FS）结构域和一个羧基末端的血小板反应蛋白1型重复序列结构域（thrombospondin type 1 repeat，TSR）。Mindin在不同种属间结构高度保守，例如小鼠和人的Mindin氨基酸序列的同源性达85%，提示Mindin可能具有重要的生物学功能。Mindin是一种模式识别分子，能够与病原体和PAMPs结合，并作为一种噬菌素调控巨噬细胞的吞噬功能，参与调节天然免疫的宿主防御反应。研究发现Mindin通过整合素与中性粒细胞结合，调控中性粒细胞的募集、粘附和迁移功能；而Mindin基因敲除使骨髓来源的树突状细胞中小分子G蛋白Rac-1与Rac-2的表达下调，导致其活化T细胞能力受损，而Mindin仍然是通过整合素与树突状细胞结合并介导细胞内信号转导的调控；进一步分析Mindin的蛋白结构，确定了Mindin识别PAMPs的结构为TSR结构域，而F-spondin结构域则是Mindin与整合素的结合位点。越来越多的研究证明Mindin不仅在免疫调节和炎症反应中发挥重要作用（JIA W et al, The extracellular matrix protein mindin serves as an integrin ligand and is critical for inflammatory cell recruitment. Blood (2005); 106( 12) :3854-2859），而且还参与多种疾病的病理过程。我们已有研究表明Mindin在心肌肥厚、脑卒中及糖尿病疾病模型中发挥着重要的作用：在心肌肥厚模型中，Mindin作为内源性保护因子，通过抑制AKT/GSK3β信号通路，从而抑制因适应不良引起心脏重构而导致的心力衰竭（Bian ZY etl，Disruption of mindin exacerbates cardiac hypertrophy and fibrosis. J Mol Med (Berl)（2012）；90(8):895-910）；在缺血性脑损伤中Mindin通过Akt信号通路从而发挥生物学功能（Wang L et al，Mindin is a critical mediator of ischemic brain injury in an experimental stroke model. Exp Neurol（2013）；247:506-516）；在糖尿病模型中，Mindin通过与PPARα作用，从而调节小鼠的肝脏脂质代谢以及减轻肝脂肪变性、肥胖、炎症等（Zhu LH et al，Mindin/Spondin 2 inhibits hepatic steatosis, insulin resistance, and obesity via interaction with peroxisome proliferator-activated receptor α in mice. J Hepatol（2014）；60(5):1046-1054）。由于肝脏缺血再灌注损伤机制中涉及炎症等反应，推测Mindin在其中发挥重要作用。到目前为止国际上无文献报道有关Mindin基因在肝脏缺血再灌注损伤中应用的内容。
发明内容
[0005] 为解决临床防治肝脏缺血再灌注损伤现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定Mindin基因的表达与肝脏缺血再灌注损伤之间的相互关系，提供一种Mindin作为药物靶标在筛选防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用，进而提供一种Mindin的抑制剂在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明以Mindin基因敲除小鼠和肝细胞特异性Mindin转基因小鼠为实验对象，通过肝缺血再灌注损伤模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，Mindin基因敲除小鼠肝脏坏死面积明显被抑制，而肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的肝脏坏死面积则明显增加。这提示Mindin基因具有恶化肝功能的作用，为Mindin在研究防治肝缺血的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。
[0007] 因此，Mindin基因可作为药物靶点，构建Mindin基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/ 或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物；Mindin基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/ 或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物和/ 或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/ 或治疗肝脏缺血再灌注损伤的目的。例如以Mindin为靶基因，设计可干扰Mindin表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA 干扰的方法使Mindin基因沉默来治疗肝脏缺血再灌注损伤；还可以设计并构建Mindin的突变体，注射后进入细胞，竞争Mindin原形的作用底物，从而抑制Mindin的功能，起到治疗目的；此外，还可以以Mindin为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用Mindin基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制Mindin的分子，从而为肝脏缺血再灌注损伤的治疗提供新的治疗性分子。
[0008] 针对Mindin的上述功能，提供Mindin作为药物靶标在筛选治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
[0009] 针对Mindin的上述功能，提供Mindin的抑制剂在制备治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
[0010] 一种保护肝功能的药物，包含Mindin的抑制剂。
[0011] 一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物，包含Mindin的抑制剂。
[0012] 所述的Mindin的抑制剂优选为Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干扰载体，Mindin的抗体及其他能够抑制Mindin表达的抑制剂中的一种。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本发明发现Mindin基因的新功能，即Mindin基因能够恶化肝脏缺血再灌注损伤的作用。
[0014] 2.基于Mindin在恶化肝脏缺血再灌注损伤中的功能，为肝脏缺血再灌注损伤的药物提供靶标。
[0016] 图1 肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的构建及鉴定结果图A为Mindin载体的构建图；
B为肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的鉴定结果图。
B为肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的鉴定结果图。
[0017] 图2小鼠在不同时间点肝脏的坏死情况对比图。
[0018] A为WT和Mindin-KO小鼠在不同时间点肝脏HE染色图及坏死面积统计柱状图；B为NTG和Mindin-TG小鼠在不同时间点肝脏HE染色图及坏死面积统计柱状图。
[0019] 图3小鼠在不同时间点血清中ALT及AST的含量统计比较图。
[0020] A为WT和Mindin-KO小鼠在不同时间点肝脏血清中ALT及AST的含量统计柱状图；B为NTG和Mindin-TG小鼠在不同时间点肝脏血清中ALT及AST的含量统计柱状图。
[0021] 图4小鼠缺血在再灌注12h时TUNEL细胞数的柱状统计图。
[0022] A为WT和Mindin-KO小鼠在再灌注12h时TUNEL免疫荧光柱状统计图；B为NTG和Mindin-TG小鼠在再灌注12h时TUNEL免疫荧光柱状统计图。
具体实施方式
[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024] 实验用动物及饲养实验动物：选用8-10周龄、体重在24g-27g，背景为雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，购自北京华阜康生物科技有限公司）、Mindin基因敲除小鼠（Mindin-KO，由杜克大学医学中心免疫学（Department of Immunology, Duke University Medical Center）何有文构建，并友情赠送）。（上述Mindin基因敲除小鼠制造参考以下文献：You-Wen He1 et al, The extracellular matrix protein mindin is a pattern-recognition molecule for microbial pathogens. Nature immunology (2004), 5(1):88-97）
饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在
40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在
40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0025] 【实施例1】肝细胞特异性Mindin转基因小鼠的构建：为进一步研究Mindin过表达对于肝脏缺血再灌注损伤的影响，我们构建了几株肝细胞特异性Mindin转基因小鼠（Mindin-TG）。转基因载体构建信息：用上游引物，即5’- GAACTCGAGCCACCATGGAAAACTTGAGTCTTGC -3’；下游引物，即5’- GAATGCGGCCGCTTAGACGCAGTTATCTGGGG-3’，扩增小鼠Mindin全长基因 (NCBI， Gene ID: 100689，NM_133903.3)，把 cDNA插入白蛋白（Albumin）启动子下游，将构建的载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到肝细胞特异性Mindin转基因小鼠。
[0027] 肝细胞Mindin的表达由Albumin（ALB）启动子驱动（图1A），并通过 Western Blot 实验验证 Mindin过表达（图1B）。为了反映病理生理状态下Mindin的改变，我们选择了Mindin-TG 4小鼠，Western Blot及定量分析显示，其肝脏组织中Mindin表达量约为正常组织2.63倍。
[0028] 【实施例2】 小鼠肝缺血再灌注损伤模型（ischemia/reperfusion injury，I/R）获得1. 实验动物分组：雄性8-10周龄，体重22-27克 纳入实验
C57BL/6品系野生型小鼠、Mindin基因敲除小鼠及Mindin转基因小鼠和非转基因小鼠，通过肝脏缺血再灌注建立肝缺血模型（I/R）。随机分为8组：C57BL/6J品系野生型小鼠假手术组（WT SHAM）及I/R手术组（WT I/R）、Mindin基因敲除小鼠假手术组（KO SHAM）及I/R手术组（KO I/R）、非转基因小鼠假手术组（NTG SHAM）及I/R手术组（NTG I/R）、肝细胞特异性Mindin转基因小鼠假手术组（TG SHAM）及I/R手术组（TG I/R）。
C57BL/6品系野生型小鼠、Mindin基因敲除小鼠及Mindin转基因小鼠和非转基因小鼠，通过肝脏缺血再灌注建立肝缺血模型（I/R）。随机分为8组：C57BL/6J品系野生型小鼠假手术组（WT SHAM）及I/R手术组（WT I/R）、Mindin基因敲除小鼠假手术组（KO SHAM）及I/R手术组（KO I/R）、非转基因小鼠假手术组（NTG SHAM）及I/R手术组（NTG I/R）、肝细胞特异性Mindin转基因小鼠假手术组（TG SHAM）及I/R手术组（TG I/R）。
[0029] 2. 肝缺血再灌注损伤模型I/R手术（采用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血）模型操作流程：1）手术前12h给小鼠禁食，可自由饮水。
[0030] 2）手术前用3%戊巴比妥钠成功麻醉小鼠后，将其平卧固定肢体，用剃毛器将小鼠腹部术区毛刮净 ，用10％碘酒和75％乙醇对术区消毒。
[0031] 3）取腹正中切口进腹，暴露肝脏左、中叶之肝蒂。
[0032] 4）用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，可见阻断叶变白，说明阻断成功。此时，注意记录缺血开始时间，维持缺血约60分钟，期间用湿的盐水纱布覆盖切口，并注意小鼠的保温（Sham组的小鼠在阻断成功即刻去除血管夹，恢复缺血肝血流）。
[0033] 5）缺血60分钟后去除血管夹，恢复缺血的肝脏血流，然后关闭腹腔，分两层关腹，先把内层缝好，再缝皮，将手术后的小鼠置于干净的笼子中单独饲养，观察。
[0034] 【实施例3】 肝脏坏死面积及肝功能指标（AST，ALT）测定肝脏缺血再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括肝脏坏死面积和肝功能指标（AST，ALT），这些指标均与肝脏缺血再灌注损伤严重程度正相关。
[0035] 1.取材术后分别在假手术组（Sham），以及缺血再灌注12h，24h，48h时颈椎脱臼处死小鼠，立即自下腔静脉取血1ml，分离血清。同时统一取缺血区肝左叶组织大小约
1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后进行HE染色。（分离血清：收集血液的EP管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃，4000rpm/min，离心30min，充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清20μL，20μL，30μL，30μL置
0.2mL无菌EP管中，对EP管进行标记，随后保存于-80℃冰箱）。
1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后进行HE染色。（分离血清：收集血液的EP管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃，4000rpm/min，离心30min，充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清20μL，20μL，30μL，30μL置
0.2mL无菌EP管中，对EP管进行标记，随后保存于-80℃冰箱）。
[0036] 2.制备石蜡标本切片1）主要操作程序包括：包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。
[0037] 2）用石蜡切片机的标准程序切5μm的石蜡切片备用。
[0038] 3.HE染色主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精
1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1%盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL）1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。
1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1%盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL）1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。
[0039] 4.小鼠血清ALT、AST含量测定① 从-80℃冰箱中取出血清样本，迅速置于冰上，在室温下待样品融化；
② 在室温下，4000转/分钟离心1分钟，让EP管壁的血清聚集至管底。
② 在室温下，4000转/分钟离心1分钟，让EP管壁的血清聚集至管底。
[0040] ③ 按照操作流程，打开全自动生化分析仪（Sysmex，Chemix 180i），清洗加样器。
[0041] ④ 按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序，逐一放入待测的EP管。
[0042] ⑤ 准确安装试剂检测盘，开始使用全自动生化分析仪检测ALT、AST水平。
[0043] WT和Mindin-KO组在肝脏缺血再灌注损伤后的HE染色结果见图2A：显微镜下可见Sham组肝组织基本正常，肝组织结构整齐，无明显的纤维组织增生。I/R组随着再灌注的时间的延长，肝组织结构模糊，排列紊乱。其内有大小不等、形状不规则的坏死灶，坏死灶内肝细胞结构模糊，排列紊乱，离断，与正常肝脏比较，坏死肝脏的肝小叶内见大片坏死灶，坏死组织边缘可见炎性反应带，肝细胞核发生典型的坏死改变，可见核固缩。这种现象在缺血再灌注后24h达到高峰。实验结果表明，给予Mindin-KO小鼠I/R后的梗死面积明显低于WT组小鼠（图2A）；同样Mindin-TG小鼠I/R后的梗死面积明显大于NTG组小鼠（图2B），因此，Mindin在肝脏缺血再灌注引起的损伤中起到重要作用。
[0044] 血清中ALT及AST的含量统计结果见图3。经血清ALT、血清AST检测水平表明，在I/R组各时间点ALT、AST水平均明显高于Sham组，在再灌注后12h达到高峰，随后下降，Mindin KO小鼠I/R后的ALT、AST水平明显低于WT组小鼠（图3A）；Mindin TG小鼠I/R后的ALT、AST水平显著高于NTG组小鼠（图3B）。
[0045] 【实施例4】 缺血再灌注后肝细胞凋亡情况测定用TUNEL试剂盒染色检测凋亡。 (TUNEL试剂盒：ApopTag® Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit（ S7111，Chemicon）):
1）将石蜡切片置于烤箱中，60℃烤片30分钟；
2）二甲苯，5分钟×3次；
3）100%乙醇，5分钟×2次；95%乙醇，5分钟；70%乙醇，5分钟；
4）ddH2O漂洗，5分钟×2次；
5）蛋白酶K 37℃孵育15分钟；
6）PBS漂洗5min×2次；
2
7）直接滴加Equilibration Buffer于组织上（13μL/cm），室温孵育至少10s；
8）弃 去Equilibration Buffer，滴加TdT Enzyme工作 液（77ulReaction Buffer
2
+33ulTdT Enzyme）于组织上（11μL /cm），置湿盒于37℃孵育1h；
9）将切片置于盛有Stop/Wash Buffer工作液(1mlLStop/Wash Buffer
+34mlLddH2O)的染色缸中振荡15s后室温孵育10min（等待过程中，将适当量的Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室温下，使其平衡至室温）；
10）PBS漂洗1min×3次；
11）轻轻甩去组织多余残留的液体，将组织周围液体吸3滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液（53%Blocking Solution+ 47%Anti-Digoxigenin Conjugate）于组织上
2
（13μL/cm），置湿盒中室温避光孵育30min；
12）PBS漂洗2min×4次(每次换新的PBS)；
13）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen ，S36939）封片；荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。
1）将石蜡切片置于烤箱中，60℃烤片30分钟；
2）二甲苯，5分钟×3次；
3）100%乙醇，5分钟×2次；95%乙醇，5分钟；70%乙醇，5分钟；
4）ddH2O漂洗，5分钟×2次；
5）蛋白酶K 37℃孵育15分钟；
6）PBS漂洗5min×2次；
2
7）直接滴加Equilibration Buffer于组织上（13μL/cm），室温孵育至少10s；
8）弃 去Equilibration Buffer，滴加TdT Enzyme工作 液（77ulReaction Buffer
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+33ulTdT Enzyme）于组织上（11μL /cm），置湿盒于37℃孵育1h；
9）将切片置于盛有Stop/Wash Buffer工作液(1mlLStop/Wash Buffer
+34mlLddH2O)的染色缸中振荡15s后室温孵育10min（等待过程中，将适当量的Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室温下，使其平衡至室温）；
10）PBS漂洗1min×3次；
11）轻轻甩去组织多余残留的液体，将组织周围液体吸3滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液（53%Blocking Solution+ 47%Anti-Digoxigenin Conjugate）于组织上
2
（13μL/cm），置湿盒中室温避光孵育30min；
12）PBS漂洗2min×4次(每次换新的PBS)；
13）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen ，S36939）封片；荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。
[0046] 肝组织细胞凋亡情况测定结果见图4所示，检测了Mindin-KO小鼠和野生型小鼠I/R术后12小时肝细胞凋亡情况。TUNEL细胞凋亡检测显示，Mindin-KO小鼠肝细胞凋亡数量明显比野生型小鼠降低，Mindin-TG小鼠肝细胞凋亡数量明显比非转基因小鼠增加，这表明Mindin与肝细胞缺血再灌注时凋亡相关。这些结果表明，抑制Mindin表达可以改善肝组织缺血再灌注损伤，且可能与肝细胞凋亡密切相关。
[0047] 研究成果表明，Mindin基因敲除小鼠在肝脏缺血再灌注引起的损伤中，小鼠肝脏坏死面积显著减少，肝功能明显改善，肝细胞凋亡数量也明显减少。证明 Mindin 基因在肝脏缺血疾病模型中有着重要的恶化作用。
[0048] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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