用于检测唾液中分析物的设备和方法
阅读：1027发布：2020-05-28
专利汇可以提供用于检测唾液中分析物的设备和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于检测 药物滥用 或者唾液中其它化合物的设备。因此，本发明提供了用于检测唾液样品中一种或多种分析物存在的设备，包括：(a)一个或多个预处理区域，用于特异性或者非特异性移除干扰一种或多种分析物检测的唾液样品成分的至少一部分；以及(b)包括 生物 传感器 表面的 检测区域 ，该表面包括：能够特异性结合一种或多种分析物的分子；或者一种或多种分析物和/或分析物类似物。，下面是用于检测唾液中分析物的设备和方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测唾液样品中一种或多种分析物的存在的设备，包括：
(a)一个或多个预处理区域，用于特异性或者非特异性移除所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的组分的至少一部分；以及
(b)包括生物传感器表面的检测区域，所述表面包括：
-能够特异性结合所述一种或多种分析物的分子；或者
-所述一种或多种分析物和/或分析物类似物。
2.如权利要求1所述的设备，其是微流体设备。
3.如权利要求1所述的设备，其中，所述一个或多个预处理区域被包括在容纳可磁化粒子的一个或多个分离室内，该可磁化粒子涂覆有能够特异性或者非特异性结合到所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的成分的分子。
4.如权利要求1所述的设备，其中，所述一个或多个预处理区域包括表面，该表面包括能够特异性或者非特异性结合到所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的成分的分子。
5.如权利要求4所述的设备，其中，所述表面是多孔的。
6.如权利要求5所述的设备，其中，所述表面是烧结多孔结构。
7.如权利要求4所述的设备，其中，结合到所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物检测的成分的所述分子是羟基磷灰石。
8.如权利要求7所述的设备，其中，所述抗体是抗粘蛋白抗体。
9.如权利要求1所述的设备，其还包括中间区域，用于在使所述样品与所述检测区域接触之前容纳所述唾液样品。
10.如权利要求1或权利要求9所述的设备，其中，所述检测区域或者所述中间区域是容纳可磁化粒子的分离室，该可磁化粒子涂覆有能够特异性结合所述一种或多种分析物的分子，该分子与所述生物传感器表面上的所述分子不同。
11.如权利要求1所述的设备，其为用于单次使用的设备。
12.一种用于检测唾液样品中一种或多种分析物的存在的方法，其包括使所述唾液样品与设备接触的步骤，该设备包括：
(a)一个或多个预处理区域，用于特异性或者非特异性移除所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的组分的至少一部分；以及
(b)包括生物传感器表面的检测区域，所述表面包括：
-能够特异性结合所述一种或多种分析物的分子；或者
-所述一种或多种分析物和/或分析物类似物，
该方法包括在竞争或者非竞争化验中检测所述检测区域中所述分析物的存在。
13.如权利要求12所述的方法，其中，在所述一个或多个预处理区域中的至少一个中，利用可磁化粒子培养所述唾液样品，该可磁化粒子涂覆有能够特异性或者非特异性结合到所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的成分的分子。
14.如权利要求13所述的方法，其中，结合到所述唾液样品中干扰所述一种或多种分析物的检测的成分的所述分子是羟基磷灰石。
15.一种用于检测唾液样品中分析物的方法，其包括在执行所述分析物的检测之前使所述唾液样品与羟基磷灰石接触。
用于检测唾液中分析物的设备和方法
技术领域
[0002] 本发明涉及用于对唾液样品中的分子进行检测和/或量化的设备和方法。该方法和设备结合了预处理和检测。
背景技术
发明内容
[0004] 目前，在商业上可用的许多设备和方法可执行路边药物测试。这些设备和方法中的大部分是基于目标的免疫学检测，该检测直接在样品上执行，在WO 02/082040中，描述了用于确定体液中不同分析物特别是药物的“一个设备”的系统。经具有吸收垫的设备的收集端收集体液，(随着设备的收集端通过压力头)收集设备的盖(cap)内部的一系列压力头迫使样品进入包括用于药物检测的诊断条的免疫测定系统的核心。样品中的药物与固定在对彩色微球体上的受限抗体位置的薄膜支撑上的药物配合物(conjugate)竞争。彩色线指示相关药物存在或者不存在于样品中。将一部分样品保留在确认样品保留孔(well)中，将其与外部密封并且存储用于进一步测试。
[0005] 然而，已经证明这些测试中的大多数是不令人满意的，主要是对于化验的灵敏度。这部分是由于唾液中的大多数药物浓度总是在某种程度上低于血液或者尿液中的浓度的事实造成的。然而，更重要的是，唾液包含干扰许多检测方法的成分。虽然唾液大部分由水组成，但是它另外包含许多不同的物质。这些物质包括电解质(例如，钠、钾、钙、镁、氯化物、碳酸氢盐、磷酸盐)、抗菌化合物(例如，硫氰酸盐(thyocyanate)、过氧化氢、免疫球蛋白A)、酶(例如，淀粉酶、溶菌酶、脂酶、磷酸酶、酰胺酶、脱氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、转移酶、异构酶)、细胞(即，产生唾液的动物或人的细菌细胞和宿主细胞)、以及诸如荷尔蒙的其它化合物。然而，最重要的是，唾液包含主要由粘多糖和糖蛋白组成的粘液。
[0006] 唾液中发现的一类重要的糖蛋白是粘蛋白。其是大的重糖基化蛋白质家族。至少19个人类粘蛋白基因以cDNA克隆为特征——MUC1 1、2、3A、3B、4、5AC、5B、6-9、11-13和15-
19。粘蛋白被分泌为具有大约0.1至1000万多巴胺(Da)分子量的蛋白质的大聚合物。在这些聚合物内，虽然分子间二硫键也可以在该过程中发挥作用，但是主要通过非共价键相互作用将单体彼此联接。已经证明粘蛋白是大多数唾液样品的假阳性测试的原因。
19。粘蛋白被分泌为具有大约0.1至1000万多巴胺(Da)分子量的蛋白质的大聚合物。在这些聚合物内，虽然分子间二硫键也可以在该过程中发挥作用，但是主要通过非共价键相互作用将单体彼此联接。已经证明粘蛋白是大多数唾液样品的假阳性测试的原因。
[0007] 为了精确地确定唾液中药物的存在，需要事先提取分析物或者移除干扰成分(如粘蛋白)。典型情况下，使用固相清除系统移除干扰化合物或者通过结合到静止相来隔离感兴趣的分析物。未结合的化合物被冲走并且冲出镜筒外。在分析物结合到镜筒的位置处，其后就使用能够使被吸附的分析物从静止相脱落的适当缓冲剂洗脱分析物。备选地，在结合了干扰化合物的情况下，直接收集包含分析物的洗脱液。在使用诸如但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、高性能液体色谱分析法(HPLC)、液相色谱-质谱测定法(LC-MS)和气相色谱-质谱测定法(GC-MS)的方法进行分析之前，为了预先浓缩，可选地蒸发洗脱液，并且将其重新溶解在较小体积中。
[0008] 然而，传统的分析方法具有若干缺点。首先，这些方法耗时又费钱。此外，它们往往需要复杂的仪器和执行分析的人员方面相对较高的技能。
[0009] 因此，存在对测试设备和方法的需求，其允许对唾液中分析物的准确并且灵敏的检测而不需要大量装备或者训练有素的技术人员。
[0010] 本发明提供了由其在相同设置中顺序执行样品的预处理和检测的设备和方法，其提供了易于操控性、以及高专业性和灵敏度。这些方法和设备尤其用于唾液中分析物的检测。此外，这些方法和设备允许在实验室环境之外使用。
[0011] 将预处理区域与检测区域集成在一台设备中提供了若干优点。存在更少的用户干预样品的需求。因此，存在更少由样品操控引入误差的机会。同时，需要更少的样品材料。事实上，在当把样品材料从一个设备转移到另一个设备时的情况下，没有样品损失。此外，这确保了用户与样品材料的最小接触，最小化样品污染的风险。
[0012] 本发明的方法和装置设想了检测之前的样品预处理，由此移除干扰检测的成分。这允许在设备中使用可磁化粒子而不影响灵敏度或特异性。事实上，在与可磁化粒子接触之前移除通常引起可磁化粒子聚合的干扰组分。这导致背景信号减少或者非特异性结合减少。此外，本发明的方法和设备允许基于磁激励的检测。由于能够使用磁激励进一步加快诊断测试并且简化诸如微流体设备中的射流技术，所以这特别重要。因此，本发明中所描述的方法和设备提供了用于确定唾液中分析物的快速、灵敏、并且鲁棒的工具。
[0013] 这里所描述的设备和方法还特别适合于在间接检测方法中使用，即在其中检测未结合的分析物或者分析物特异性试剂作为对样品中存在分析物以及可选地分析物数量的测度的方法，例如竞争化验。
[0014] 能够将本发明的设备和方法用于需要最少处理的测试，特别是在实验室环境之外(例如，路边测试，即时护理测试)。因此，可以将设备提供为一次性使用的设备、或者作为微流体设备中的料盒。
[0015] 因此，本发明提供了用于检测唾液样品中一种或多种分析物的存在的设备，其包括：
[0016] (a)一个或多个预处理区域，用于特异性或者非特异性移除干扰唾液样品中一种或多种分析物检测的组分的至少一部分；以及
[0018] -能够特异性结合一种或多种分析物的分子；或者
[0019] -该一种或多种分析物和/或分析物类似物。
[0020] 根据特定实施例，提供了是微流体设备的设备。根据备选的特定实施例，提供了是侧流设备的设备。
[0021] 根据特定实施例，提供了这样的设备，其中，一个或多个预处理区域包括在容纳涂覆有这样的分子的可磁化粒子的一个或多个分离室中，该分子能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分。特别地，这些可磁化粒子是顺磁性或者超顺磁性粒子。
[0022] 在备选实施例中，给设备提供一个或多个包括表面的预处理区域，该表面包括能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子。可以将结合到唾液样品中的成分的分子结合到该表面，或者该表面可以大部分或者本质上由这样的分子组成。前者是设想使用能够特异性结合的分子时的典型情况，后者是设想使用非特异性结合到唾液样品中成分的分子时的情况。然而，这仅仅是一般规则，并且不应该解释为限制该实施例。
[0023] 根据另一个特定实施例，提供了包括表面的设备，该表面包括能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子，该表面是多孔的。根据另一个特定实施例，多孔表面是烧结多孔结构。
[0024] 根据特定实施例，提供了包括结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子的设备，其为羟基磷灰石。
[0025] 根据特定实施例，提供了包括特异性结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子的设备，该分子是抗体。根据另一些特定实施例，抗体是对抗聚合因子的抗体。根据大多数特定实施例，抗体是抗粘蛋白抗体。
[0026] 根据特定实施例，提供了包括用于在样品与检测区域接触之前容纳唾液样品的中间区域的设备。该中间区域可以简单地用于传输样品(例如，诸如微流体设备中的微流体通道的通道；或者测流设备中的惰性区域)。然而，中间区域还可以具有另一种功能，例如，在样品与检测区域接触之前使样品与一种或多种试剂接触。
[0027] 根据特定实施例，提供了这样的设备，其中，设备的检测区域或者中间区域是容纳涂覆有能够特异性结合一种或多种分析物的分子的可磁化粒子的分离室，该分子与生物传感器表面上的分子不同。
[0028] 根据特定实施例，提供了适合于一次性使用的设备。
[0029] 还设想了使用诸如这里所描述的那些设备的方法。根据特定实施例，提供了用于检测唾液样品中存在一种或多种分析物的方法，其包括使唾液样品与设备接触的步骤，该设备包括：
[0030] (a)一个或多个预处理区域，其用于特异性或者非特异性移除唾液样品中干扰一种或多种分析物检测的组分的至少一部分；以及
[0031] (b)包括生物传感器表面的检测区域，该表面包括：
[0032] -能够特异性结合一种或多种分析物的分子；或者
[0033] -一种或多种分析物和/或分析物类似物。
[0034] 该方法包括在竞争或者非竞争化验中在检测区域中检测分析物的存在。
[0035] 根据特定实施例，提供了包括在一个或多个预处理区域的至少一个中培养具有可磁化粒子的唾液样品的步骤的方法，该可磁化粒子涂覆有能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子。
[0036] 根据特定实施例，提供了这样的方法，其中，结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子是羟基磷灰石。
[0037] 根据备选的特定实施例，提供了这样的方法，其中，结合到唾液样品中干扰一种或多种分析物的检测的成分的分子是抗体。根据另一些特定实施例，抗体是对抗聚合因子的抗体。根据大多数特定实施例，抗体是抗粘蛋白抗体。
[0038] 根据特定实施例，提供了这样的方法，其包括使样品与一个或多个预处理区域接触的步骤、以及其后使样品与检测区域接触的步骤、并且由此在与处理区域接触之后使样品与可磁化粒子接触，该可磁化粒子涂覆有能够特异性结合一种或多种分析物的分子，其与生物传感器表面上的分子不同。
[0041] 从下列详细说明，结合附图，本发明的上述以及其它特性、特征和优点将变得显而易见，附图通过举例的方式说明了本发明的原理。仅通过示例给出该描述，而不是要限制本发明的范围。下面引用的参考图是指附图：
[0042] 图1示出了根据本发明的特定实施例的设备(1)的示意性表示，其包括预处理区域(2)和检测区域(4)。检测区域(4)包括生物传感器表面(5)，在本实施例中，其包括能够特异性结合一种或多种分析物的分子(6)。
[0043] 图2示出了根据本发明的特定实施例的设备(1)的示意性表示，其包括预处理区域(2)和检测区域(4)。检测区域(4)包括生物传感器表面(5)，在本实施例中，其包括能够特异性结合一种或多种分析物的分子(6)。在这里所示出的特定实施例中，设备包括用于使检测区域(4)与涂覆有能够特异性结合一种或多种分析物的分子的可磁化粒子(7)接触的工具。在使用设备(1)的特定实施例中，将唾液样品施加在预处理区域(2)上，该预处理区域(2)包括特异性或者非特异性移除干扰一种或多种分析物的检测的唾液样品组分的至少一部分的分子。随后，在该特定实施例中，将预处理后的样品通过微流体通道(3)传输到检测区域(4)。允许存在于样品中的分析物(8)结合到分子(6)，该分子(6)能够特异性结合生物传感器表面(5)上所包括的分析物。磁场的应用使未结合的可磁化粒子(7)朝着生物传感器表面(5)移动，能够在该生物传感器表面(5)把它们结合到所存在的分析物(8)。在预定时间之后，移除磁吸引力场。施加另一个磁场把未结合的可磁化珠拉离生物传感器表面(5)。随后，通过合适的检测工具检测生物传感器表面上标记的可磁化粒子的存在(指示分析物的存在)。A:在使用之前的设备。B:在样品中的分析物检测期间的设备。
[0044] 图3示出了在预处理区域中羟基磷灰石过滤之后的化验功能性。感兴趣的分析物是鸦片剂。在该实验中，生物传感器表面涂覆有BSA鸦片剂，并且利用涂覆有抗鸦片剂抗体的超顺磁性粒子执行检测。不采用预处理(利用30％缓冲剂稀释)、经过过滤的预处理以及经过与羟基磷灰石预处理结合的过滤的预处理，来执行竞争化验以确定样品中鸦片剂的可检测性。示出了来自三位测试者的唾液样品的结果。％光信号变化是指在添加了超顺磁性粒子之后信号中的变化。
[0045] 图4示出了在预处理区域中羟基磷灰石过滤之后的化验功能性。感兴趣的分析物是鸦片剂。在该实验中，生物传感器表面涂覆有BSA鸦片剂，并且利用涂覆有单克隆抗鸦片剂抗体的超顺磁性粒子执行检测。执行竞争化验，以确定经过过滤而预处理的或者经过羟基磷灰石预处理与过滤结合而预处理的样品中鸦片剂的可检测性。示出了来自五位测试者的唾液样品的结果。％光信号变化是指在添加了超顺磁性粒子之后信号中的变化。
具体实施方式
[0046] 将关于特定实施例并且参考一些附图描述本发明，但是本发明不限于这些描述，而仅由权利要求所限定。不应该将权利要求中的任何参考符号解释为限制范围。所描述的附图仅仅是示意性而不是限制性的。在附图中，为了说明性目的，可以增大一些要素的大小并且不按比例绘制。
[0048] 此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于在相似要素之间进行区分，并且不一定用于描述顺序或者时间排序的次序。应该理解，如此使用的术语在适当环境下是可互相交换的，并且这里所描述的本发明的实施例能够以除了这里所描述或者所说明的顺序之外的其它顺序工作。
[0049] 单独提供这里所使用的术语或者定义帮助理解本发明。
[0050] 定义
[0051] 如这里所使用的术语“分析物”是指样品中期望检测其存在和/或浓度的化合物。
[0052] 如这里所使用的术语“分析物类似物”是指由于结合了分析物特异性探针而类似于分析物的分子。然而，分析物类似物比分析物更微弱地结合到分析物特异性探针，使得分析物类似物与探针的结合能够被存在的分析物取代。例如，如这里所使用的分析物类似物是指例如在竞争化验中使用的分子。在该类型的化验中，仅使用一种分析物结合分子(典型地，抗体)。分析物类似物是与分析物结构上不同但是结构上相关的化合物，并且其同样通过分析物结合分子来结合。
[0053] 在该竞争化验中，分析物和分析物类似物将为了结合到同一个分析物结合分子而竞争。这里，分析物类似物结合分子与分析物自身相比对于分析物结合分子以相同的亲合力、或者以较低亲合力结合，使得分析物能够取代结合到分析物结合分子的分析物类似物。典型地，对于分析物结合抗体，分析物类似物与分析物共享相同的抗原决定基。在该竞争化验中使用分析物类似物而不是分析物自身的原因是(例如)其便于合成、便于耦合到衬底、具有增强的稳定性和/或保存期限、或者更低检测设备制造风险，例如比分析物自身更低毒性或者更低药物行为(例如，细菌毒素、药物滥用)。
[0054] 如这里所使用的短语“检测存在”是指分析物存在的定性和/或定量检测。检测存在还包括检测分析物的不存在，即发现不存在可检测的分析物。类似地，分析物的定量检测包括对应于零级别的分析物不存在的检测，以及分析物可计量级别的检测。
[0055] 如这里所使用的术语“预处理”是指以优化检测为目标在检测之前在样品上执行的操控(典型地，提纯)。该预处理能够包括基于这些分子(例如，特异性或者非特异性结合到基质的分子)的物理(例如，尺寸、粘性)或者生物化学属性从样品中移除分子。另外或者备选地，“预处理”能够包括改变样品中分子的物理和/或生物化学属性。当提到设备时的“预处理区域”是设备中设想用于确保样品预处理的区域。
[0056] 如这里所使用的“聚合因子”是指引起分子聚合的一种或多种物质。聚合可以是聚合因子自身的聚合、将要检测的分析物的聚合、在检测过程中使用的化验分子(例如，抗体或者诸如可磁化粒子的粒子)的聚合、或者在样品中存在的或在分析物检测期间使用的任何其它物质的聚合。典型地，由聚合因子造成的聚合导致减小的分析物检测效率或精度。已知唾液包括不同的聚合因子(例如，见Van Nieuw Amerongen等的Bohn Stafleu Van Loghum(Houten,荷兰)2004)，并且这些聚合因子构成了唾液样品可能干扰一种或多种分析物的检测的组分的一部分。唾液中聚合因子的典型例子包括S-IgA、粘蛋白、诸如凝集素的高分子糖蛋白、富脯氨酸糖蛋白(PRG)、以及溶菌酶。
[0057] 当在这里提到设备时，术语“检测区域”是指设备内这样的区域，在其中，通过能够记录检测区域内所产生的信号的检测器的方式进行样品中存在分析物的检测。
[0058] 如这里所使用的术语“生物传感器表面”是指设备或者料盒的检测区域内的区域，其中，通过检测工具确保检测。生物传感器表面包括生物成分和传感器成分。
[0059] 如这里所使用的术语“可磁化粒子”是指在存在磁场时(外部施加的)有磁性、并且能够受外部施加的磁场操纵、但是在该磁场不存在时不保持磁化的粒子或者珠。这包括顺磁性粒子或者超顺磁性粒子。非常小的磁性粒子(例如，在1-20nm直径的数量级)将很快由于热效应失去它们的磁化。在本发明的上下文中，还可以将这些粒子视为相当于顺磁性粒子的可磁化粒子。
[0060] 本发明提供了用于在特别是唾液样品的样品中检测一种或多种分析物存在的设备和方法。根据特定方面，设备包括一个或多个用于特异性或者非特异性移除干扰一种或多种分析物的检测的唾液样品组分的至少一部分的预处理区域，并且将其连接到检测区域。
[0061] 本发明的设备和方法中的一个或多个预处理区域特别旨在增大在检测区域中的唾液中存在的可能分析物检测的灵敏度。唾液中发现的许多物质可能干扰分析物的检测。本发明的设备和方法允许样品的预处理，以移除可能干扰分析物检测的物质的至少部分。
根据特定实施例，唾液样品的预处理必需移除聚合因子。聚合因子实际上是干扰一种或多种分析物检测的唾液样品组分的部分。根据特定实施例，从由S-IgA、粘蛋白、诸如凝集素的高分子糖蛋白、富脯氨酸糖蛋白(PRG)、以及溶菌酶组成的组中选择聚合因子。根据其它特定实施例，聚合因子是(或者多个聚合因子是)粘多糖、糖蛋白、或者其组合。根据另一些特定实施例，聚合因子是粘蛋白或者粘蛋白的组合。
根据特定实施例，唾液样品的预处理必需移除聚合因子。聚合因子实际上是干扰一种或多种分析物检测的唾液样品组分的部分。根据特定实施例，从由S-IgA、粘蛋白、诸如凝集素的高分子糖蛋白、富脯氨酸糖蛋白(PRG)、以及溶菌酶组成的组中选择聚合因子。根据其它特定实施例，聚合因子是(或者多个聚合因子是)粘多糖、糖蛋白、或者其组合。根据另一些特定实施例，聚合因子是粘蛋白或者粘蛋白的组合。
[0062] 本发明的方法和设备对诸如唾液样品的包括粘蛋白的样品中的分析物检测特别感兴趣。
[0063] 对在本发明的上下文中设想的一个或多个预处理区域进行扩展，以确保以一种或多种不同方式对样品进行预处理。在特定实施例中，一个或多个预处理区域确保移除干扰检测的唾液样品的组分的至少部分。
[0064] 在特定实施例中，通过特异性或者非特异性固定这些分子、同时将样品(包括分析物)的剩余部分维持在流动相来确保移除干扰检测的分子。因此，一个或多个预处理区域包括结合到存在于唾液中、但是对将要检测的分析物没有亲合力或者具有可忽略亲合力的干扰组分的分子。
[0065] 在特定实施例中，使用预处理区域，其包括这样的材料和/或分子，该材料和/或分子结合唾液样品组分或者其中的一种或多种干扰检测的分子的至少部分。在另一些特定实施例中，使用结合唾液中存在的聚合因子的分子。
[0066] 在本发明的上下文中设想的用于在预处理中使用的材料的例子包括但不限于羟基磷灰石、金属氧化物、金属氢氧化物(特别是带负电的金属氢氧化物)、氢氧化铝、金属(诸如钛、铁)，聚合物(诸如但不限于，诸如聚环氧乙烷的聚乙烯衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯等)。羟基磷灰石(HAP)是牙釉的主要组成部分。已知该无毒材料对唾液的不同组成部分具有某种亲合力。特别地，唾液粘蛋白附着到羟基磷灰石。同时，已知细菌(例如，链球菌种)吸附到羟基磷灰石。根据特定实施例，在本发明的方法和设备中设想的一个或多个预处理区域包括羟基磷灰石。在另一些特定实施例中，预处理区域包括羟基磷灰石过滤器。在备选地特定实施例中，预处理区域包括用于在样品的羟基磷灰石处理中的后续过滤的过滤器(特别是无羟基磷灰石过滤器)和羟基磷灰石。
[0067] 在本发明的方法和设备的特定实施例中，设想特异性移除干扰分析物检测的唾液样品的组分的至少一部分。在特定实施例中，使用对唾液中的干扰物质具有特异性亲合力的分子。在另一些特定实施例中，存在于一个或多个预处理区域中的、能够特异性结合干扰唾液中分析物检测的一种或多种化合物的分子是能够基于特异性生物化学相互作用捕获化合物的分子。典型的特异性相互作用包括但不限于DNA/DNA或者DNA/RNA结合、蛋白质/蛋白质、蛋白质/DNA和蛋白质/碳水化合物相互作用、抗体/抗原相互作用、以及受体/配位体结合。
[0068] 同时，能够使用合成分子结合干扰化合物(例如，改良的酶抑制剂、小分子)。
[0069] 根据特定实施例，在一个或多个预处理区域中使用的、对唾液中的一种或多种干扰物质具有特异性亲合力的分子是抗体。合适的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体、纳米抗体以及能够结合到抗原的这样的抗体的片断或者衍生物，其中，针对该抗原给出对应的抗体。抗体片断包括但不限于单链可变片断(scFvs)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片断或者诸如重链或轻链的互补决定区域(CDR，例如：CDR1、CDR2和CDR3)的更小片断、以及/或者其中两种或多种及其它衍生物的组合。根据另一些特定实施例，抗体是抗粘蛋白抗体。
[0070] 另外地或者备选地，基于物理属性移除干扰分析物检测的分子。例如，在分析物是小分子时，通过过滤确保物理移除干扰检测的较大分子或者成分(例如，细胞)。可以将不同的生物化学和物理方法组合到本发明的设备和方法的一个或多个预处理区域内。在特定实施例中，例如，首先以非特异性方式对样品进行过滤，并且然后(例如，使用抗体)特异性地移除成分。这样，在特定实施例中，样品的预处理可以包括多于一个预处理步骤和/或样品跨或者经过多于一个预处理区域的移动。当提供分离的后续预处理区域时，可能确保更加完全地移除干扰组分。
[0071] 在另一些特定实施例中，一个或多个预处理区域是使样品与一种或多种化合物接触的区域或者能够改变干扰分子的物理和/或生物化学性质的条件，例如，中和某些唾液成分的化合物或者减小粘性的化合物或条件(例如，热处理、酶处理)。
[0072] 取决于如何执行预处理步骤，本发明的方法和设备中设想的一个或多个预处理区域能够采取若干种形式。根据特定实施例，将一个或多个预处理区域包括在设备的一个或多个室内，可选地该室与检测区域物理分离。在另一些特定实施例中，一个或多个预处理区域存在于容纳涂覆有一种或多种分子的可磁化粒子的室内，该一种或多种分子能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中干扰检测的成分。当把唾液样品引入该一个或多个预处理室中时，唾液样品中存在的干扰成分结合到可磁化粒子上的分子。磁场的施加能够确保移除结合到可磁化粒子上的干扰检测的组分(至少部分)。在使用多个室的情况下，将经预处理的样品从一个预处理室移动到下一个，以确保干扰因子的最佳移除。将不在分析物检测中使用用于移除干扰成分的可磁化粒子。
[0073] 在备选实施例中，一个或多个预处理区域包括一表面，该表面具有能够特异性或者非特异性结合到唾液样品中与待检测的一种或多种分析物的检测相干扰的成分的分子。
[0074] 根据另一个特定实施例，一个或多个预处理区域中的一个或多个具有诸如样品衬垫的表面，其上涂覆有特异性结合到唾液样品中干扰分析物检测的成分的分子。根据特定实施例，这些特异性结合干扰成分的分子是抗体、或者其片断或衍生物。根据另一个特定实施例，抗体(或者其片断或衍生物)是抗粘蛋白抗体。
[0075] 根据特定实施例，一个或多个预处理区域中的一个或多个包括分子所结合到的表面，该分子非特异性结合到唾液样品中干扰分析物检测的成分。根据另一个特定实施例，一个或多个预处理区域包括羟基磷灰石所结合到的表面。另外或者备选地，一个或多个预处理区域包括诸如氢氧化铝的金属氧化物或者氢氧化物所结合到的表面。
[0076] 不应该以限制性方式解释如该上下文中所使用的术语“结合”。事实上，非特异性结合到唾液样品中干扰分析物检测的成分的材料的形式(例如，羟基磷灰石)可以相当大地改变。例如，可以把它们作为浸渍到合适载体内或者载体上的粉末提供，或者它们甚至可以是通过烧结的多孔结构。这样，还可以使一个或多个预处理区域中分子(该分子非特异性结合到唾液样品中干扰分析物检测的成分)所结合到的表面大部分、本质上完全或者完全在非特异性结合到唾液样品中成分的分子之外。根据特定实施例，预处理区域中的至少部分表面是由非特异性结合到唾液样品中干扰分析物检测的成分的分子所组成的多孔烧结结构。备选地，将非特异性结合到唾液样品中成分的分子提供为样品能够流经的粉末，使得该粉末构成了预处理区域的表面。这样，可以将非特异性结合到唾液样品中成分的分子结合到该表面以及作为该表面的一部分。
[0077] 在一个或多个预处理区域中存在的表面可以是多孔的，使得样品可以流经它，或者可以是无孔的，其允许样品移动经过其上。根据特定实施例，为了减少需要用于加速样品流经过多孔表面的最终压力，多孔表面具有足够大的孔。根据另一个特定实施例，多孔表面的孔径大小至少是200nm，更具体是至少500nm。根据另一个实施例，孔在微米级别(即，在1-1000μm之间)。这样，在预处理唾液样品时，可以将干扰成分(诸如聚合因子)到预处理表面的吸附与基于孔尺寸的尺寸排除相结合。事实上，诸如粘蛋白的聚合因子往往构成不能通过孔的大聚合物。
[0078] 如上所述，本发明的设备和方法特别适合于包含干扰成分的唾液或者其它样品中分析物的检测。
[0079] 在本发明的方法和设备中，典型地，将唾液样品施加到设备的预处理区域或者直接与其连接的区域。它能够以纯净形式或者在经历了一个或多个处理步骤之后施加。根据本发明的方法和设备的特定实施例包括另一个操控步骤和/或样品操控区域。所设想的要在把样品施加到(第一或者唯一)预处理区域之前在样品上执行的操控包括但不限于(利用水或者特定缓冲剂)稀释唾液样品、过滤唾液样品(特别是非特异性过滤样品、或者以与预处理区域中所设想的预处理不相同的方式非特异性或特异性过滤样品)。然而，根据特定实施例，设想提供快速并且简单的方法，并且把唾液样品施加到对应于如这里所描述的预处理区域的区域或者指向该区域，而不经历之前的操控。
[0080] 可以将施加于设备的样品直接以流体形式(例如，作为唾沫样品、或者经唾液移液)施加，或者可以从吸附固体介质(例如，棉签)间接施加。适合于吸附唾液的吸附介质在本领域中是已知的。可以使用的示例性介质包括但不限于胶体、泡沫、玻璃纤维、棉花、纤维素、人造纤维以及其它合成材料。根据特定实施例，本发明的方法和设备包括将唾液样品直接施加到预处理区域的工具。
[0081] 本发明的方法和设备还使用在其中确保对一种或多种感兴趣分析物检测的检测区域。
[0082] 在特定实施例中，该方法和设备在检测区域中使用生物传感器表面。生物传感器表面包括确保一种或多种分析物检测的分子。通过检测所基于的原理确定这些分子的性质。根据本发明，对检测区域中一种或多种分析物的化验方法包括直接(非竞争性)和竞争性化验。根据特定实施例，直接检测分析物。根据备选的特定实施例，间接检测分析物。在两种类型的化验中，检测能够测量结合或者未结合的分析物或者抗原特异性分子。
[0083] 在设想了直接检测的情况下，生物传感器表面包括分析物特异性分子，即能够特异性结合一种或多种分析物的分子。在设想了竞争即间接检测的情况下，生物传感器表面包括分析物或者分析物类似物。
[0084] 用于在本发明的上下文中使用的、能够特异性结合一种或多种分析物的适当分子与可以用于特异性移除干扰检测的成分的分子本质上具有相同的性质，即，使分析物特异性分子特异性地与分析物相互作用。典型的特异性相互作用包括DNA/DNA或DNA/RNA结合、蛋白质/蛋白质、蛋白质/DNA和蛋白质/碳水化合物相互作用、抗体/抗原相互作用、以及受体/配位体结合。还能够使用合成分子检测分析物(例如，从库筛选中离析出的酶抑制剂、制药化合物、铅化合物)。因此，分析物特异性探针的例子包括但不限于寡核苷酸、抗体、酶基质、受体配体、凝集素等。
[0085] 根据特定实施例，分析物特异性分子是单克隆抗体或者多克隆抗体，纳米抗体或者其片断或衍生物(如上这里所述)。
[0086] 典型地，在表面(生物传感器表面)上提供分析物特异性分子，其中，能够通过检测器直接或者间接检测分析物到分析物特异性分子的结合。备选地，给检测区域提供用于使样品与分析物特异性分子接触的工具。能够通过捕获表面上的复合体(例如，使用能够结合分析物特异性分子的分子)检测分析物与分析物特异性分子的结合。另外或者备选地，由于在分析物特异性分子上存在的标记，在检测区域中对该复合体进行检测。
[0087] 可以将分析物或者分析物特异性探针直接或者间接涂覆在生物传感器表面上。用于给表面涂覆上生物分子的方法在本领域中是已知的，并且下面在这里对例子进行了描述。
[0089] 根据方法和设备的特定方面，检测包括磁激励(典型地，其包括使用可磁化粒子)。该磁激励可以用于局部集中将要检测的分子，从而有助于检测；并且/或者可以通过测量磁场的变化用于实际检测过程。例如，可以通过诸如接近于表面并且嵌入材料(其中该表面是其外部部分)内的磁传感器元件感测成分(诸如粒子)的存在。备选地，能够设想使用FTIR(傅立叶变换红外光谱学)的粒子光学检测，其中，材料(该表面是其外部)对于电磁辐射(诸如光)是透明的。典型地，使用可磁化粒子的磁检测或者光学检测的这种方法能够感测接近表面或者结合到表面的成分(典型地，在10-5000nm数量级)。
[0090] 这样，在本发明的设备和方法的特定实施例中，设想使用磁性或者可磁化粒子。最特别的是，检测包括确定检测区域中可磁化粒子的存在和/或数量。在检测区域中使用的可磁化粒子与能够在预处理区域中使用的可磁化粒子不同。
[0091] 在本发明的上下文中使用的可磁化粒子的性质不是绝对的。合适的可磁化粒子包括完全无机的粒子以及是无机和有机材料混合的粒子(例如，聚合物)。
[0092] 在诸如在高吞吐量临床免疫测定仪器、样品提纯、细胞提取等中的生物分析中广泛使用可磁化粒子特别是顺磁性粒子和超顺磁性粒子。几家诊断公司(Roche、Bayer、Johnson&Johnson、Abbott、BioMerieux等)制造并且销售具有诸如用于免疫测定、核酸提取以及样品提纯的可磁化粒子的试剂。
[0093] 能够通过本领域中所描述的方法执行分析物特异性分子或者分析物到可磁化粒子表面的附着。例如，粒子可以携带诸如羟基、羧基，醛基或氨基的官能团。这些一般可以通过诸如处理未经涂覆的单分散、超顺磁性粒子提供，从而提供涂覆有携带这些官能团之一的聚合物的表面，例如，聚氨酯以及聚乙二醇提供羟基、或者纤维素衍生物提供羟基、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或者共聚物提供羧基、或者氨基烷基化聚合物提供氨基。美国专利4654267描述了许多这种表面涂层的介绍。可以根据美国专利4336173、4459378和4654267，通过修改粒子准备其它被涂覆的粒子。在特定类型粒子的情况下，表面携带经(CH2CH2O)8-10键合连接到聚合体主干的-OH基。其它特定粒子携带经甲基丙烯酸的聚合获得的-COOH基。例如，如在美国专利4654267中所描述的最初出现在粒子中的NH2基可以与双环氧化合物起作用，其后与甲基丙烯酸反应，以提供最终的乙烯基群。与甲基丙烯酸的溶液共聚作用产生涂覆有携带最终羧基的聚合体。类似地，能够通过使二元胺与上述与双环氧化合物反应的产物起反应引入氨基，而与诸如氨基甘油的羟胺反应引入了羟基。生物活性分子到粒子的耦合能够是不可逆的，但是通过使用用于在粒子和生物活性分子之间交联的联接分子，其也可以是可逆的。该联接的例子包括具有一定蛋白水解识别部位的缩氨酸、对某一限制性内切酶具有识别部位的寡核苷酸序列、或者那些包括可还原二硫基的化学可逆交联基。能够从Pierce Biotechnology公司(美国，IL，Rockford)获得多种可逆交联基。备选地，不通过共价耦合而是通过物理吸附实现分子的固定，例如，能够轻易地将许多蛋白质固定在具有憎水性的表面上。这应用于两个粒子表面，并且用于将分子固定在肉眼可见的表面(例如，生物传感器表面)上。
[0094] 市场上可买到的可磁化粒子有从纳米到微米的各种尺寸。设想具有不同尺寸的可磁化粒子(诸如，但不限于10nm到5μm的尺寸，典型地在50nm和1μm之间)适合于在本发明的上下文中使用，只要它们能够被磁场移动并且(可选地)能够被灵敏的检测。类似地，粒子的形状(球体、球状体、棒条体)并不重要。设想能够在一个反应室内同时使用诸如具有不同磁性和/或光学属性的不同类型的可磁化粒子(磁性粒子复用)。当需要检测多于一种分析物时，情况可能是这样的。
[0095] 在本发明中提供的方法、设备和工具的特定实施例设想基于可磁化粒子的磁性/可磁化属性或者光学属性在检测区域中检测可磁化粒子。另外或者备选地，设想能够基于直接附着到可磁化粒子或者通过分析物间接结合到粒子的标记的存在对可磁化粒子进行检测。在上文描述了用于结合到可磁化粒子的合适标记。因此，在特定实施例中，对在这里所描述的方法和设备中使用的可磁化粒子进行标记。能够将标记经无机或者经有机成分附着到可磁化粒子，或者能够将其合并到粒子中。
[0096] 在另一些特定实施例中，使用包括可磁化粒子作为标记以及非磁性标记的分子(例如，分析物特异性化合物或者分析物)。
[0097] 由于设想了不同类型的检测，所以取决于设备和如何执行检测，检测区域可以采用不同的物理形态，并且可以是诸如二维或者三维的。生物传感器表面可以是多孔的，使得样品可以流经它，或者可以是无孔的，其允许样品在其上移动。
[0098] 典型地，通过检测器确保检测区域的性质，即检测工具能够在诸如生物传感器表面的检测区域中检测分析物的存在。在特定实施例中，检测是基于信号的，该信号诸如但不限于磁信号、磁阻、霍尔效应、光信号(反射、吸收、散射、荧光、化学发光、RAMAN、FTIR等)、声音信号(石英晶体微天平(QCM)、表面声波(SAW)、体声波(BAW)等)。在大多数特定实施例中，信号是能够无专用装备就可以检测的诸如颜色变化的光信号。信号的产生可以是直接的，即结合到表面的标记的直接效应；或者可以是增加反应药剂的结果，例如确保颜色变化的酶衬底。
[0099] 本发明的特定方面涉及包括一个或多个预处理区域以及检测区域的设备，其允许一种或多种分析物的检测，其中，该一个或多个预处理区域用于特异性或者非特异性移除唾液样品干扰一种或多种分析物的检测的组分的至少一部分。
[0100] 根据特定实施例，(最后的或者唯一的)预处理区域和检测区域彼此紧邻。备选地，通过惰性区域、通道或室来分离预处理区域和检测区域。该惰性区域的典型例子包括但不限于微流体设备中的微流体通道(见图1)、侧流设备中的固体衬底(可能具有毛细管作用)等。
[0101] 能够以不同方式确保从一个预处理区域到(可选地经过惰性区域)另一个预处理区域的移动。在特定实施例中，样品垂直流经包括一个或多个预处理区域和一检测区域的设备。其能够基于重力或者毛细引力。另外或者备选地，构想设备诸如通过毛细力或者在设备中生成流体流(例如，通过机械流体流或声学或超声流体激励)的力确保侧流。在特定实施例中，设备的物理属性确保粒子朝向预处理和/或检测区域移动，例如，朝向结合表面的漏斗形。
[0102] 在特定实施例中，提供了使用在磁场中移动的磁性粒子的设备。更具体地，设想在检测区域中使用磁性/可磁化粒子。另外或者备选地，设想在一个或多个预处理区域中使用可磁化粒子。通过磁场的梯度以及粒子的磁性磁化率给出通过该场施加在磁性(或者可磁化)粒子上的力。能够计算磁力(例如，见J.D.Jackson、Classical Electrodynamics、John Wiley&Sons,Inc.,1999)。结果，磁性粒子上的力与磁场梯度有关。换言之，磁性粒子具有从具有较低磁场幅度的区域移动到具有较高磁场幅度的区域的趋势。
[0103] 在设想于预处理和检测区域中都进行磁激励的情况下，不同时在不同区域执行磁激励，但是随着样品从一个区域移动到另一个区域，一个接一个顺序执行。
[0104] 因此，提供了这样的系统，其中，能够通过一个或多个磁场发生工具产生一个或多个磁场。在本发明的上下文中设想不同类型的磁场发生工具，例如永久磁体、电磁体、线圈和/或导线。在粒子上磁力的强度使得所引发的行进距离大于无磁场时行进的距离，即磁力应该是比平移布朗运动占优势的。
[0105] 根据本发明，由一个或多个磁场发生工具所产生的磁场能够是恒定的、脉动的，或者能够在强度上变化。此外，在产生了多于一个磁场的情况下，它们的准确方向可以是固定的或者可以变化。
[0106] 根据特定实施例，磁场发生工具包括电磁体或者一条或多条电导线。这使避免设备中零件的机械移动变成可能。根据特定实施例，将磁场发生工具放置在预处理区域(一个或多个)和/或检测区域之下。
[0107] 在这里所描述的方法和设备的特定实施例中，至少一个磁场确保朝向检测区域内的区域的移动，该区域是检测发生的生物传感器表面。设想了这样的设备，其是能够与用于生成磁场的工具结合使用的料盒。另外地或者备选地，将用于产生磁场的工具合并到设备中。
[0108] 根据特定实施例，提供了不依赖于外部物理力的施加(例如，通过活塞施加压力)的设备。
[0109] 在特定实施例中，根据本发明的设备是侧流设备。在另一些特定实施例中，设备是微流体设备或者用于在微流体设备中使用的(一次性的)料盒。如这里所使用的微流体设备是指具有这样的特征(诸如通道)的设备，其中其在一维中的尺寸至少是在0.05到5000μm的范围内，更具体地，在10和500μm之间的范围内。
[0110] 根据特定实施例，本发明的设备包括一个或多个包括羟基磷灰石的预处理区域。
[0111] 本发明的设备还包括检测区域。在特定实施例中，检测区域包括生物传感器表面。典型地，这是特异衍生的、分子特别是探针能够结合的表面。合适表面的例子包括玻璃、金属、塑料、有机晶体或者无机晶体(例如，硅)、非晶质有机或者非晶质无机材料(例如，氮化硅、氧化硅、氮氧化硅、氧化铝)。对于本领域的技术人员，合适的表面材料和联接化学过程是已知的，并且例如，在A.M.Usmani和N.Akmal的1994年在美国华盛顿特区的美国化学协会
1994论坛丛书556的“Diagnostic Biosensor Polymers”中、在Y.Lvov和H.Mhwald(Marcel Dekker，纽约，2000)编辑的“Protein Architecture,Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization Biotechnology”中、在David Wild的“The Immunoassay Handbook”(自然出版集团，伦敦，2001，ISBN 1-56159-270-6)中、或者Kress-Rogers的“Handbook of Biosensors and Electronic Noses.Medicine,Food and the Environment”(ISBN 0-
8493-8905-4)中对其进行了描述。在Angenendt等(2002，Anal Biochem.309，253-260)中公开了用于将蛋白质结合到已涂覆的和未涂覆的塑料和玻璃支撑的支撑。Dufva(2005，Biomol Eng 22，173-184)回顾了附着寡核苷酸的方法以及影响该过程的因素。
1994论坛丛书556的“Diagnostic Biosensor Polymers”中、在Y.Lvov和H.Mhwald(Marcel Dekker，纽约，2000)编辑的“Protein Architecture,Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization Biotechnology”中、在David Wild的“The Immunoassay Handbook”(自然出版集团，伦敦，2001，ISBN 1-56159-270-6)中、或者Kress-Rogers的“Handbook of Biosensors and Electronic Noses.Medicine,Food and the Environment”(ISBN 0-
8493-8905-4)中对其进行了描述。在Angenendt等(2002，Anal Biochem.309，253-260)中公开了用于将蛋白质结合到已涂覆的和未涂覆的塑料和玻璃支撑的支撑。Dufva(2005，Biomol Eng 22，173-184)回顾了附着寡核苷酸的方法以及影响该过程的因素。
[0112] 在特定实施例中，提供了这样的系统和设备，其中，给生物传感器表面涂覆分析物、分析物类似物或者分析物特异性探针。
[0113] 可以提供根据本发明的设备作为用于结合检测工具使用的料盒，其确保了在检测区域中分析物的检测。另外地或者备选地，可以将合适的检测工具合并到用于执行这里所描述的方法的系统和设备中。合适的检测工具包括能够检测相关信号的工具，该相关信号诸如但不限于磁信号、磁阻、霍尔效应、光信号(反射、吸收、散射、荧光、化学发光、RAMAN、FTIR等)、声音信号(石英晶体微天平(QCM)、表面声波(SAW)、体声波(BAW)等)。在特定实施例中，提供了是磁阻元件的检测工具。
[0114] 这样，根据特定实施例，将用于检测生物传感器表面中或者表面上的磁性粒子的传感器集成到检测区域(例如，集成了磁阻传感器)。备选地，检测工具或者传感器(例如，光学单元)不是设备的集成部分。在这些实施例中，可选地，检测区域包括检测窗口，其允许对检测区域中(特别是生物传感器表面上)的标记的检测。由生物传感器表面在检测区域内的位置确定检测窗口的位置。更具体地，检测窗口作为斑点位于生物传感器表面中心或者生物传感器表面上或下的纵向区域，与生物传感器表面对应。
[0115] 在特定实施例中，由检测区域中生物传感器表面下的传感器确保检测。可选地，在支撑生物传感器表面的材料中提供检测窗口。
[0116] 在检测是基于磁场或者光学方法的情况下，例如，在全部或者部分检测区域和/或生物传感器表面材料对于将要检测的信号是透明的的情况下，提供专用检测窗口可能是多余的。
[0117] 除了上述部件之外，这里所描述的系统和设备的另一些特定实施例包括一个或多个下列部件。本发明的系统将通常包括一个或多个用于将样品、可磁化粒子和/或试剂引入反应室内的入口工具。能够将这些可选地耦合到包括每种试剂的源。可选地，根据本发明的设备包括用于从生物传感器表面和/或检测区域移除试剂、反应废料和/或可选地可磁化粒子的出口工具。
[0118] 本发明的特定实施例提供了(可选地，一次性的)集成了这里所描述的预处理和检测区域的料盒。一次性的料盒还能够包括集成在其中的可磁化粒子，或者这些能够单独提供。在特定实施例中，料盒的材料是使得能够在其中产生磁场的材料。例如，料盒由玻璃或者诸如树脂玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)或清洁PVC(聚氯乙烯)或PC(聚碳酸酯)或COP(例如，Zeonex)或PS(聚苯乙烯)的合成材料制造。
[0119] 可选地，在本发明的上下文中所设想的料盒还包括用于产生磁场梯度的至少一个物理载体。
[0120] 本发明中所描述的设备对于小样品体积能够快速、鲁棒并且简单地使用即时护理的生物传感器。如上详述的，设备或者料盒能够是将要与紧凑读取器一起使用的一次性的物品，其可选地包括一个或多个磁场生成工具和/或一个或多个检测工具。可选地，仅设备的一个或者多个部分是一次性的(例如，预处理区域、检测区域或者仅仅生物传感器表面)。
[0121] 根据另一个方面，本发明提供了这样的方法，通过该方法本发明的设备和/或料盒用于唾液样品中分析物的检测和/或量化。
[0122] 将要检测的分析物的性质对本发明是必不可少的。在本发明的上下文中所设想的方法包括分析物检测，该分析物是不同类型的分子，更具体地，是诸如DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、脂类和有机抗体或代谢物的生物分子。然而，根据特定实施例，提供了检测药物在唾液样品中的存在的方法。
[0123] 在本领域中，检测流体样品中药物的方法是众所周知的，并且在诸如WO 02/082040中进行了描述。能够使用本发明的方法测试的药物包括但不限于迷幻剂、精神兴奋剂、镇静剂、抑制剂、滥用的吸入剂、安眠药和酒精。根据特定实施例，将要检测的一种或多种分析物是从下面的组中选择的一种或多种药物：酒精、鸦片剂(OPI)、可卡因(COC)、诸如大麻或者特别是四氢大麻酚(THC)的大麻类、安非他命/甲基安非他命(AMP)、吗啡(MOR)、苯二氮类(BZO)、1-(1'-苯环己基(phenylcyclohexyl))哌啶(PCP)、巴比妥酸盐(BAR)、美沙酮(MET)和海洛因或者其它具有类吗啡作用的鸦片类药剂，诸如但不限于可待因、罂粟碱、那可丁、二氢可待因酮或芬太尼。也可以检测这些药物的衍生物或者代谢物。根据特定实施例，该方法特别适合于药物滥用测试。
[0124] 在本发明的检测方法中设想了不同的化验原理。
[0125] 在特定实施例中，检测基于通过结合到分析物特异性探针的分析物直接检测。
[0126] 这通过图2A和2B中的特定实施例说明。这里，提供了包括检测区域(4)的设备，检测区域(4)包括联接到生物传感器表面(5)的分析物特异性探针。在检测区域中，使样品与涂覆有能够特异性结合到唾液样品中将要检测的分析物的分子的可磁化粒子(7)接触。根据特定实施例，这些分子与生物传感器表面上的分子是不同的，以便确保两种分子能够同时结合感兴趣的分析物。在使用图2B中所说明的设备期间，唾液样品中的分析物(8)结合到可磁化粒子(7)上的分析物特异性分子。在通过施加磁场从生物传感器表面(5)移除未结合的磁性粒子之后，能够对已结合的磁性粒子进行检测。
[0127] 在特定实施例中，检测是基于分析物到分析物特异性探针的竞争结合。例如，设想了这样的方法，其中，给生物传感器表面涂覆以类分析物化合物或者分析物类似物。利用可磁化粒子标记的分析物特异性探针与生物传感器表面接触，并且其微弱地结合到类分析物化合物。一旦与包括分析物的样品接触，分析物就强有力地结合到分析物特异性探针，该分析物特异性探针被从生物传感器表面置换出来。检测区域中可磁化粒子的剩余部分(结合到分析物特异性探针)与样品中分析物的浓度成反比。
[0128] 在竞争化验的另一些可选实施例中，将分析物特异性探针结合到结合表面，并且在使样品与结合表面接触之前将磁性标记的分析物类似物或者分析物添加到样品。
[0129] 在这里所设想的方法的特定实施例中，分析物的检测需要将一种或多种诸如二级抗体、标记、衬底等的更多试剂添加到检测区域。
[0130] 对于本领域的技术人员来说，上述实施例不是要限制本发明，并且设想了对上述化验的其他变化。
[0131] 在这里所述方法的特定实施例中，使用未结合的可磁化粒子确定分析物的存在(以及数量)，而不是冲洗掉未结合的可磁化粒子。
[0132] 根据特定实施例，本发明的方法包括使样品与可磁化粒子(例如，磁性标记的分析物特异性探针或者磁性标记的分析物或分析物类似物)接触，以及使粒子在预处理区域内和/或在检测区域内的移动。可磁化粒子能够是干试剂或者流体试剂的部分。除了可磁化粒子之外，例如，试剂能够包含缓冲盐、去垢剂、协助生物交互作用的生物分子等。这些步骤能够在液体中执行，该液体是与所使用的试剂(例如，分析物、分析物特异性探针、标记)兼容的、诸如标准缓冲剂、或者经最低限度预处理或甚至纯样品(例如，血或者唾液)的任何液体。为了漂洗的目的，能够将液体引入到预处理和/或检测区域中。备选地，采用最小量的液体执行该方法，特别是在生物传感器表面上执行。
[0133] 根据特定实施例，本发明的方法还包括检测步骤，其允许定性或者定量确定检测区域中存在的标记的量，这是对样品中分析物的量的(直接或者间接)测量。使用如上所述的一种或多种检测工具确保检测步骤。
[0134] 本发明的另一个方面涉及使用羟基磷灰石用于分析物检测中唾液样品的预处理。采用羟基磷灰石对唾液样品进行一次或多次的预处理从样品中移除粘蛋白分子，防止粘蛋白分子影响样品移动性并且干扰分析物检测。
[0135] 因此，本发明提供了用于确定唾液中分析物的方法，该方法包括使唾液样品与羟基磷灰石至少接触一次。在特定实施例中，将羟基磷灰石预处理与过滤步骤组合。
[0136] 在本发明该方面的特定实施例中，将利用羟基磷灰石的预处理集成到检测设备或者料盒中。
[0137] 在本发明该方面的特定实施例中，提供了除了检测区域之外包括装载羟基磷灰石的过滤器的设备。
[0138] 在特定实施例中，在分析物检测中使用可磁化粒子。更具体地，使用可磁化粒子的磁属性来检测在检测区域中累积的可磁化粒子的存在和/或数量。另外地或者备选地，基于直接或间接附着于可磁化粒子(见上)的粒子或者标记的光学属性，在视觉上或者光学上执行可磁化粒子的检测。根据特定实施例，当使用可磁化粒子时，使用FTIR光谱学检测分析物。
[0139] 对于本领域的技术人员来说，用于具体化本发明的其它布置将是显而易见的。将理解，虽然已经在这里讨论了用于根据本发明的设备和方法的优选实施例、特有结构和配置以及材料，但是可以进行形式和细节上的各种变化或修改，而不脱离本发明的范围和精神。通过下面所提供的例子说明本发明，将这些例子视为说明性目的，并且本发明不限制于这里所描述的特定实施例。
[0140] 根据本发明的设备和方法特别适合于实现免疫测定，并且更具体地说，特别适合于作为竞争化验实施的免疫测定。
[0141] 例子
[0142] 例1：通过重复预处理步骤移除干扰粘蛋白
[0143] 超顺磁性珠被涂覆以能够特异性结合唾液的干扰化合物的分子，在该情况下，是粘蛋白抗体。在第一步骤中，使唾液样品与包括涂覆有抗粘蛋白抗体的顺磁性珠的第一预处理区域接触。通过施加磁场从流体中移除珠。随后，将样品移动到第二预处理区域。在与预处理区域接触期间，能够对使样品与顺磁性珠接触的效果(例如，由粘蛋白造成的超顺磁性珠的聚集或聚合状态)进行监控。这通过在显微镜下或者例如通过使用Nanosizer(Malvern仪器)研究样品、或者样品的等分试样来完成。当观测到聚合或者聚集时，重复预处理步骤(通过把样品施加到另一个预处理区域或者通过把样品重新施加到第一预处理区域，在该第一预处理区域已移除超顺磁性粒子并且用新涂覆的超顺磁性粒子代替)。可选地，重复预处理步骤直到不再观察到珠的聚集为止。
[0144] 然后，将唾液样品转移到检测区域，在检测区域中，发生分析物检测。在该例子中，分析物是吗啡。吗啡是仅具有一个抗原决定基的小分子，因此必须执行竞争化验以确定样品中吗啡的量。
[0145] 通过将1μl BSA-吗啡(在磷酸盐缓冲盐(PBS)中1mg/ml)均匀施加在孔中并且烘干它(在过量BSA中经其赖氨酸残留物耦合吗啡-3-葡糖苷酸)，将吗啡-BSA配合物涂覆在检测区域的聚苯乙烯表面上。在涂覆之后，在PBS中利用10mg/ml BSA+0.65％吐温-20来封闭表面1小时。随后，丢弃封闭溶液。
[0146] 使从(一个或多个)预处理区域获得的唾液样品与检测区域中涂覆有吗啡的表面接触。同时，添加涂覆有抗吗啡抗体(在PBS中具有10mg/ml BSA+0.65％吐温-20的溶液中经抗吗啡Ab涂覆的顺磁性粒子(200nm蛋白质G涂覆的磁性粒子)的1:10稀释液，溶液的总量是50μl)的顺磁性粒子。在唾液中不存在吗啡时，具有抗体的所有可磁化粒子结合到孔上所涂覆的吗啡上。为了确保有效结合，施加磁场将磁性珠吸引到传感器表面。当吗啡存在于唾液中时(或者在加标1至40ng/ml吗啡的控制样品中)，一部分抗体对于唾液的吗啡处于饱和状态，并且不结合到涂覆在表面上的分析物。
[0147] 一旦施加了背离表面取向的第二磁场，就能够从生物传感器表面移除未结合到所涂覆的分析物的可磁化粒子。通过测量结合到生物传感器表面的顺磁性粒子的量执行检测。
[0148] 例2：使用侧流化验的安非他命快速检测
[0149] 将唾液样品添加到包括样品垫(多孔结构)的预处理区域，使抗粘蛋白抗体固定在样品垫材料的表面上。唾液中存在的粘蛋白将结合到经固定的抗粘蛋白抗体。培养时间可能受样品垫的尺寸以及/或者样品垫的孔径尺寸影响。对与样品垫固定的抗体数目和培养时间进行调整，使得充分移除干扰基质成分，并且因此运动固相(mobile solid phase)的a特异性(a-specific)结合或者聚合/聚集不再是问题。
[0150] 在移动经过预处理地带之后，样品行经这样的地带，在该地带样品与用安非他命或者安非他命类似物标记的彩色粒子接触。随后，样品进一步移动到检测区域，检测区域包括所放置的抗安非他命抗体从而构成“检测线”。唾液样品中存在的(未标记的)安非他命将占据已标记的抗安非他命抗体的结合区域，从而防止以彩色粒子标记的安非他命在检测线中的结合和集中。在样品中不存在安非他命时，所有经标记的安非他命结合在检测地带中，这导致彩色带。这能够在视觉上被检测到。
[0151] 例3：使用HAP过滤的鸦片剂检测
[0152] 给超顺磁性粒子(Ademtech 500nm COOH涂覆的粒子)涂覆以单克隆抗鸦片剂抗体。通过提供涂覆有BSA-鸦片剂的表面准备检测区域。使用胶带组装生物传感器的顶部和底部部分，并且将传感器保持在室温的实验室条件下。使用4种不同的预处理条件：无预处理、Sponge Bob过滤材料(Filtrona，密度0.29g/cm3)，以及与50mg/mlHAP接触之后接以过滤器。接下来，粒子重新以0.2wt％分散在经预处理的缓冲剂或者唾液中。
[0153] 使包括化验缓冲剂或者化验缓冲剂中70％唾液(唾液供应者1-3)的样品经历不同的预处理区域，并且随后与可磁化粒子混合。
[0154] 在光学生物传感器系统中使用竞争化验执行从不同预处理条件获得的样品中鸦片剂的检测。不施加药物，以在竞争化验中获得最大信号。通过经过毛细通道的自动填充使样品与检测区域接触。施加磁场将磁性珠吸引到生物传感器表面。通过使用磁线圈系统施加磁吸引/激励。在料盒上施加另一个磁场，以将未结合的珠拉离衬底表面。总化验时间(填充、再分散和磁激励)是35秒(5秒料盒填充、30秒激励)。
[0155] 在图3中概括了化验结果。能够看出，当不使用羟基磷灰石过滤步骤时，结果是可变的。事实上，在样品2中，仅仅是样品稀释液就足够产生与没有鸦片剂的缓冲剂类似的结果。然而，在来自不同个体的样品1和3中，样品基质干扰检测。虽然对于一些样品(例如，见样品3)，过滤可以克服该问题，但是能够观察到，对于样品1，结合与羟基磷灰石接触的过滤最适合于得到正确结果。因此，羟基磷灰石增加了化验的灵敏度。
[0156] 当使用(例如，作为纳米粉末)固定在过滤器上的羟基磷灰石时，能够获得类似的结果。能够将该过滤器合并入微流体设备的料盒中，使得样品将在样品流入微流体通道并且流向测试室之前流经该过滤器。
[0157] 还能够利用干燥在料盒顶部上的可磁化珠获得类似的结果。随后，唾液首先经历包含可磁化粒子的预处理区域。接下来，通过经过毛细通道的自动填充使样品与检测区域接触。在检测区域中，磁性粒子重新分散，并且利用如上所述的磁激励执行化验(也见例4)。
[0158] 例4：使用HAP过滤和经干燥的珠的竞争鸦片剂化验用于检测
[0159] 给超顺磁性粒子(Ademtech 500nm COOH涂覆的粒子)涂覆以单克隆抗鸦片剂抗体。通过提供涂覆有BSA-鸦片剂(3个印制点)的表面准备检测区域。烘干缓冲剂(10mM Tris HCl、1wt％BSA、10wt％蔗糖，pH 7.5)中重新分散的磁性粒子。通过使用胶带组装生物传感器的顶部和底部部分，并且将传感器保持在室温的实验室条件下。使用2种不同的预处理条3
件：BNW过滤材料(Filtrona，密度0.3g/cm )，以及与每500μl唾液20mg/mlHAP接触之后接以BNW过滤器。包括100％唾液(唾液供应者1-5)的样品经历不同的预处理区域，并且随后被引导到检测室。
件：BNW过滤材料(Filtrona，密度0.3g/cm )，以及与每500μl唾液20mg/mlHAP接触之后接以BNW过滤器。包括100％唾液(唾液供应者1-5)的样品经历不同的预处理区域，并且随后被引导到检测室。
[0160] 使用光生物传感器系统执行从不同预处理条件获得的样品中的竞争化验。不施加药物，以在竞争化验中获得最大信号。通过经过毛细通道自动填充使样品与检测区域接触。施加磁场将磁性珠吸引到生物传感器表面。通过使用磁线圈系统施加磁吸引/激励。在料盒上施加另一个磁场，以将未结合的珠拉离衬底表面。总化验时间(填充、再分散和磁激励)是
35秒(5秒料盒填充、30秒激励)。
35秒(5秒料盒填充、30秒激励)。
[0161] 在图4中概括了化验结果。可以看出，当不使用羟基磷灰石过滤步骤时，结果总是较低(表示为在添加了超顺磁性珠之后的％信号变化)。在竞争检测化验中这些较低的信号可能被误解成阳性信号。能够观察到，结合与羟基磷灰石接触的过滤最适合于为唾液样品产生高信号。因此，羟基磷灰石增加了化验的灵敏度，并且降低了假阳性结果的风险。
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