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亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途

阅读：914发布：2021-11-26

专利汇可以提供亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了具有阳离子基团和亲脂性基团的模 块 化树枝状 聚合物 。在一些方面，本文提供的树枝状聚合物可以配制成含有核酸和一种或多种辅助赋形剂的组合物。在一些方面，这些组合物也可用于以 治疗 性核酸来治疗 疾病 或病症。，下面是亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途专利的具体信息内容。

1.一种下式的树枝状聚合物：
核-(重复单元)n-封端基团 (I)
其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
a是1、2、3、4、5或6；或者
所述核具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；并且
y是0、1,或2，条件是y与z的和是3；
R2是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；并且
z是1、2、3；条件是z与y的和是3；或者
所述核具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
其中：
e是1、2或3；
Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或者
所述核是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；并且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是氢、羧基、羟基，或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的树枝状聚合物，其中：
所述核具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
a是1、2、3、4、5或6；并且
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
封端基团，其中所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是氢、羧基、羟基，或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物具有式：
核-(重复单元)n-封端基团 (I)
其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)、或被取代的烷基(C≤18)；并且
y是0、1,或2，条件是y与z的和是3；
R2是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；并且
z是1、2、3；条件是z与y的和是3；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
封端基团，其中所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是氢、羧基、羟基，或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物具有式：
核-(重复单元)n-封端基团 (I)
其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
其中：
e是1、2或3；
Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；并且
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
封端基团，其中所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是氢、羧基、羟基，或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物具有式：
核-(重复单元)n-封端基团 (I)
其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
封端基团，其中所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是氢、羧基、羟基，或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述封端基团由下式进一步定义：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；并且R10是氢。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述封端基团由下式进一步定义：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)；并且
R10是氢。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的树枝状聚合物，其中Y4是烷烃二基(C4-18)。
9.根据权利要求1至5中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述封端基团由下式进一步定义：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)。
10.根据权利要求1至5中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述封端基团由下式进一步定义：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)或其中一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
R10是羟基。
11.根据权利要求1至2和6至10中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核由下式进一步定义：
其中：
X1是烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
a是1、2、3、4、5或6。
12.根据权利要求11所述的树枝状聚合物，其中X1是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。
13.根据权利要求11所述的树枝状聚合物，其中X1是杂环烷基(C≤12)或被取代的杂环烷基(C≤12)。
14.根据权利要求13所述的树枝状聚合物，其中X1是4-哌啶基、N-哌啶基、N-吗啉基、N-吡咯烷基、2-吡咯烷基、N-哌嗪基或N-4-甲基哌二嗪基。
15.根据权利要求11至14中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R1是氨基。
16.根据权利要求11至15中的任一项所述的树枝状聚合物，其中a是1、2、3或4。
17.根据权利要求11至16中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为下式化合物：
18.根据权利要求17所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
19.根据权利要求1、3和6至10中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核由下式进一步定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)、或被取代的烷基(C≤18)；并且
y是0、1或2，条件是y与z的和是3；
R2是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；并且
z是1、2、3；条件是z与y的和是3。
20.根据权利要求19所述的树枝状聚合物，其中X2是N。
21.根据权利要求19所述的树枝状聚合物，其中X2是NR5，其中R5是氢或烷基(C≤8)。
22.根据权利要求21所述的树枝状聚合物，其中R5是氢。
23.根据权利要求21所述的树枝状聚合物，其中R5是甲基。
24.根据权利要求19或权利要求20所述的树枝状聚合物，其中z是3。
25.根据权利要求19和21至23中的任一项所述的树枝状聚合物，其中z是2。
26.根据权利要求19至25中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R2是氨基。
27.根据权利要求19至25中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R2是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。
28.根据权利要求27所述的树枝状聚合物，其中R2是甲基氨基。
29.根据权利要求19至25中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R2是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。
30.根据权利要求29所述的树枝状聚合物，其中R2是二甲基氨基。
31.根据权利要求19至30中的任一项所述的树枝状聚合物，其中b是1、2、3或4。
32.根据权利要求19至31中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
33.根据权利要求32所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
34.根据权利要求1、4和6至10中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
其中：
e是1、2或3；
Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
35.根据权利要求34所述的树枝状聚合物，其中X3是烷基氨基二基(C≤8)或被取代的烷基氨基二基(C≤8)。
36.根据权利要求35所述的树枝状聚合物，其中X3是-NHCH2CH2NH-或-
NHCH2CH2NHCH2CH2NH-。
37.根据权利要求34所述的树枝状聚合物，其中X3是杂环烷烃二基(C≤8)或被取代的杂环烷烃二基(C≤8)。
38.根据权利要求37所述的树枝状聚合物，其中X3是N,N'-哌嗪二基。
39.根据权利要求34至38中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R3是氨基。
40.根据权利要求34至38中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R3是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。
41.根据权利要求40所述的树枝状聚合物，其中R3是甲基氨基。
42.根据权利要求34至41中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R4是氨基。
43.根据权利要求34至41中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R4是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。
44.根据权利要求43所述的树枝状聚合物，其中R4是甲基氨基。
45.根据权利要求34至41中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R4是-(CH2CH2N)e(Rc)Rd：
其中：
e是1、2或3；
Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)。
46.根据权利要求34至45中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
47.根据权利要求46所述的树枝状聚合物，其中所述核进一步定义为：
48.根据权利要求1和5至10中的任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核是烷基
胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式。
49.根据权利要求48所述的树枝状聚合物，其中所述核是辛基胺、癸基胺、十二烷基胺、十四烷基胺、十六烷基胺、十八烷基胺、N-甲基、N-十二烷基胺、二辛基胺、二癸基胺或4-N-甲基哌嗪基。
50.根据权利要求1至49中的任一项所述的树枝状聚合物，其中Y1是烷烃二基(C≤8)或被取代的烷烃二基(C≤8)。
51.根据权利要求50所述的树枝状聚合物，其中Y1是-CH2CH2-。
52.根据权利要求1至53中的任一项所述的树枝状聚合物，其中Y3是烷烃二基(C≤8)或被取代的烷烃二基(C≤8)。
53.根据权利要求52所述的树枝状聚合物，其中Y3是-CH2CH2-。
54.根据权利要求1至51中的任一项所述的树枝状聚合物，其中Y3是：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或者
Y3是：
其中：
X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式。
55.根据权利要求1至54中的任一项所述的树枝状聚合物，其中A1是-O-或-NH-。
56.根据权利要求1至55中的任一项所述的树枝状聚合物，其中A2是-O-或-NH-。
57.根据权利要求1至56中的任一项所述的树枝状聚合物，其中R9是烷基(C≤8)。
58.根据权利要求57所述的树枝状聚合物，其中R9是甲基。
59.根据权利要求1至58中的任一项所述的树枝状聚合物，其中n是1、2或3。
60.一种组合物，其包含：
(A)根据权利要求1至59中的任一项所述的树枝状聚合物；和
(B)核酸。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述核酸是siRNA、miRNA、pri-miRNA、信使RNA(mRNA)、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸、单向导RNA(sgRNA)、CRISPR-RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、转运RNA(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、向导RNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述核酸是siRNA、tRNA，或可用于CRISPR过程中的核酸。
63.根据权利要求60至62中的任一项所述的组合物，其中所述树枝状聚合物和所述核酸以约100:1至约1:5的重量比存在。
64.根据权利要求60至63中的任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种辅助脂质。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述辅助脂质选自类固醇、类固醇衍生物、PEG脂质或磷脂。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述辅助脂质是类固醇或类固醇衍生物。
67.根据权利要求65所述的组合物，其中所述类固醇是胆固醇。
68.根据权利要求66所述的组合物，其中所述类固醇或类固醇衍生物与所述树枝状聚合物以约10:1至约1:20的摩尔比存在。
69.根据权利要求65所述的组合物，其中所述辅助脂质是PEG脂质。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述PEG脂质是PEG化二酰基甘油。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述PEG脂质由下式进一步定义：
其中：
R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)，或这些基团中的任一个的取代形式；
Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；并且
x是1-250。
72.根据权利要求69所述的组合物，其中所述PEG脂质是二肉豆蔻酰基-sn-甘油或下式化合物：
其中：
n1是5-250；并且
n2和n3各自独立地是2-25。
73.根据权利要求69所述的组合物，其中所述PEG脂质和所述树枝状聚合物以约1:1至约1:250的摩尔比存在。
74.根据权利要求65所述的组合物，其中所述辅助脂质是磷脂。
75.根据权利要求65所述的组合物，其中所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
76.根据权利要求74所述的组合物，其中所述磷脂和所述树枝状聚合物以约10:1至约
1:20的摩尔比存在。
77.根据权利要求60至76中的任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上由所述树枝状聚合物、所述核酸和一种或多种辅助脂质组成。
78.一种药物组合物，其包含：
(A)根据权利要求60至77中的任一项所述的组合物；和
(B)药学上可接受的载体。
79.根据权利要求78所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是溶剂或溶液。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制以通过以下方式施用：口服，脂肪内，动脉内，关节内，颅内，皮内，病灶内，肌肉内，鼻内，眼内，心包内，腹膜内，胸膜内，前列腺内，直肠内，鞘内，气管内，瘤内，脐带内，阴道内，静脉内，囊内，玻璃体内，经脂质体，经局部，经粘膜，肠胃外，经直肠，结膜下，皮下，舌下，经表面，经颊，经皮，经阴道，呈膏状物，呈脂质组合物，通过导管，通过灌洗，通过连续输注，通过输注，通过吸入，通过注射，通过局部递送或通过局部灌注。
81.根据权利要求80所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于静脉内或动脉内注射。
82.根据权利要求78至81中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为单元剂量。
83.一种调节基因表达的方法，其包括将核酸递送到细胞，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求60至82中的任一项所述的组合物或药物组合物在足以引起所述核酸摄取到所述细胞中的条件下接触。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述细胞在体外或离体接触。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述细胞在体内接触。
86.根据权利要求83至85中的任一项所述的方法，其中所述基因表达的调节足以治疗疾病或病症。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
88.一种治疗患者中的疾病或病症的方法，其包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据权利要求60至82中的任一项所述的组合物或药物组合物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用一种或多种其它癌症疗法。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述癌症疗法是化学治疗化合物、手术、放射疗法或免疫疗法。
92.根据权利要求88至91中的任一项所述的方法，其中所述组合物或药物组合物被施用至所述患者一次。
93.根据权利要求88至91中的任一项所述的方法，其中所述组合物或药物组合物被施用至所述患者两次或更多次。
94.根据权利要求88至93中的任一项所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述患者是人类。
96.一种下式的树枝状聚合物：
核-(重复单元)n-封端基团 (I)
其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烯烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或者
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与所述接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；并且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷烃二基(C≤18)；并且
R10是氢；
其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。

说明书全文

亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2015年9月14日提交的美国临时申请序列号62/218,412的优先权，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

[0003] 本发明大体涉及树枝状聚合物领域。特别是，它涉及包含核酸的树枝状聚合物纳米颗粒组合物。更具体地说，它涉及用于递送核酸的树枝状聚合物纳米颗粒组合物。更具体地说，它涉及用于递送药物和其它赋形剂的树枝状聚合物纳米颗粒组合物。

背景技术

[0004] 自从发现RNAi或其它核酸剂并认识到其治疗潜力以来，一直在寻找有效的递送载体(Whitehead等,2009；Kanasty等,2013；Akinc等,2008；Davis等,2010；Love等,2010；
Siegwart等,2011；Jayaraman等,2012)。关于小RNA向健康肝脏的递送功效已经取得了进
展，但是现有的递送媒介物目前尚未满足临床上需要的对肿瘤的高效力和低正常细胞肝毒
性的组合。不幸的是，在过去四年中，用于肝细胞癌(HCC)治疗的小分子药物的所有五个III期人类临床试验都失败了，部分原因是衰弱的晚期肝功能障碍放大了药物毒性(Roberts,
L.R.,2008；Scudellari,M.,2014)。微小RNA(miRNA)代表了一种有前途的替代策略，因为它们可以通过同时靶向涉及细胞分化、增殖和存活的多种途径而起到肿瘤抑制剂的作用，但
是这些治疗剂需要载体有效(Ventura和Jacks,2009；Kasinski和Slack,2011；Ling等,
2013；Cheng等,2015)。药物载体的效力与毒性的平衡是一个有用的标准，特别是在肝癌的情况下，其中载体自身的毒性可以减弱小RNA疗法的治疗效果。
[0005] 为了实现低毒性和高效力的这种平衡，通过扩大递送载体的结构多样性和分子大小对化学结构的影响可用于实现治疗上的有效平衡。树枝状聚合物是单分散的大分子，由
从中心核径向发出的多个完全支化的单体组成。树枝状聚合物因此具有与小分子相同的高
度分子均匀性和化学调节为多分散聚合物的广泛理论空间(Bosman等,1999；Fréchet和
Tomalia,2002；Gillies和Frechet,2002；Grayson和Fréchet,2001)。这些固有特征使得树枝状聚合物对于各种生物医学应用(Stiriba等,2002；Lee等,2005；Wu等,2015)具有独特的性质(Murat和Grest,1996；Percec等,2010；Duncan和Izzo,2005)。在基因递送中，大多数研究已经使用有限数量的商业树枝状聚合物进行进一步的化学修饰。(Kang等,2005；
Taratula等,2009；Khan等,2014)。因此，树枝状聚合物应用的扩展取决于通过化学合成容易地调整尺寸、化学、拓扑结构以及最终树枝状聚合物的物理性质的能力。因此，可作为核酸和其它药物的载体的新型树枝状聚合物的开发在临床上是有用的。

发明内容

[0006] 在一些方面，本公开提供下式的树枝状聚合物：
[0007] 核-(重复单元)n-封端基团(I)
[0008] 其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
[0009] 所述核具有式：
[0010]
[0011] 其中：
[0012] X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
[0013] R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0014] a是1、2、3、4、5或6；或者
[0015] 所述核具有式：
[0016]
[0017] 其中：
[0018] X2是N(R5)y；
[0019] R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；并且
[0020] y是0、1或2，条件是y与z的和是3；
[0021] R2是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0022] b是1、2、3、4、5或6；并且
[0023] z是1、2、3；条件是z与y的和是3；或者
[0024] 所述核具有式：
[0025]
[0026] 其中：
[0027] X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)、或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0028] R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
[0029] 其中：
[0030] e是1、2或3；
[0031] Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0032] c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或者
[0033] 所述核是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0034] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0035] 所述可降解的二酰基具有式：
[0036]
[0037] 其中：
[0038] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0039] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0040] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
[0041]
[0042] 其中：
[0043] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0044] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0045] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0046] 所述接头基团具有式：
[0047]
[0048] 其中：
[0049] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0050] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；并且
[0051] 所述封端基团具有式：
[0052]
[0053] 其中：
[0054] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0055] R10是氢、羧基、羟基，或
[0056] 芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
[0057] R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0058] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0059] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0060] 或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述树枝状聚合物的结构被进一步定义：
[0061] 所述核具有式：
[0062]
[0063] 其中：
[0064] X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
[0065] R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；和
[0066] a是1、2、3、4、5或6；并且
[0067] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0068] 所述可降解的二酰基具有式：
[0069]
[0070] 其中：
[0071] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0072] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0073] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
[0074]
[0075] 其中：
[0076] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0077] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0078] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0079] 所述接头基团具有式：
[0080]
[0081] 其中：
[0082] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0083] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
[0084] 封端基团，其中所述封端基团具有式：
[0085]
[0086] 其中：
[0087] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0088] R10是氢、羧基、羟基，或
[0089] 芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
[0090] R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0091] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0092] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0093] 或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述树枝状聚合物具有式：
[0094] 核-(重复单元)n-封端基团(I)
[0095] 其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
[0096] 所述核具有式：
[0097]
[0098] 其中：
[0099] X2是N(R5)y；
[0100] R5是氢或烷基(C≤8)、或被取代的烷基(C≤18)；并且
[0101] y是0、1或2，条件是y与z的和是3；
[0102] R2是氨基、羟基或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0103] b是1、2、3、4、5或6；并且
[0104] z是1、2、3；条件是z与y的和是3；
[0105] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0106] 所述可降解的二酰基具有式：
[0107]
[0108] 其中：
[0109] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0110] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0111] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
[0112]
[0113] 其中：
[0114] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0115] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0116] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0117] 所述接头基团具有式：
[0118]
[0119] 其中：
[0120] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0121] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
[0122] 封端基团，其中所述封端基团具有式：
[0123]
[0124] 其中：
[0125] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0126] R10是氢、羧基、羟基，或
[0127] 芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
[0128] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0129] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0130] 或其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述树枝状聚合物具有式：
[0131] 核-(重复单元)n-封端基团(I)
[0132] 其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
[0133] 所述核具有式：
[0134]
[0135] 其中：
[0136] X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0137] R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
[0138] 其中：
[0139] e是1、2或3；
[0140] Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0141] c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；并且
[0142] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0143] 所述可降解的二酰基具有式：
[0144]
[0145] 其中：
[0146] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0147] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0148] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
[0149]
[0150] 其中：
[0151] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0152] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0153] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0154] 所述接头基团具有式：
[0155]
[0156] 其中：
[0157] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0158] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
[0159] 封端基团，其中所述封端基团具有式：
[0160]
[0161] 其中：
[0162] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0163] R10是氢、羧基、羟基，或
[0164] 芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
[0165] R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0166] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0167] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0168] 或其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述树枝状聚合物具有式：
[0169] 核-(重复单元)n-封端基团(I)
[0170] 其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
[0171] 所述核是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0172] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0173] 所述可降解的二酰基具有式：
[0174]
[0175] 其中：
[0176] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0177] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0178] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
[0179]
[0180] 其中：
[0181] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0182] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0183] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0184] 所述接头基团具有式：
[0185]
[0186] 其中：
[0187] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0188] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；和
[0189] 封端基团，其中所述封端基团具有式：
[0190]
[0191] 其中：
[0192] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中烷烃二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0193] R10是氢、羧基、羟基，或
[0194] 芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷烃二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
[0195] R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0196] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0197] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0198] 或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述封端基团由下式进一步定义：
[0199]
[0200] 其中：
[0201] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；并且
[0202] R10是氢。
[0203] 在其它实施方案中，所述封端基团由下式进一步定义：
[0204]
[0205] 其中：
[0206] Y4是烷烃二基(C≤18)；并且
[0207] R10是氢。
[0208] 在一些实施方案中，Y4是烷烃二基(C4-18)。在其它实施方案中，所述封端基团由下式进一步定义：
[0209]
[0210] 其中：
[0211] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0212] R10是烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)。
[0213] 在一些实施方案中，所述封端基团由下式进一步定义：
[0214]
[0215] 其中：
[0216] Y4是烷烃二基(C≤18)或其中一个或多个氢原子已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3代替的烷烃二基(C≤18)；
[0217] R10是羟基。
[0218] 在一些实施方案中，所述核由下式进一步定义：
[0219]
[0220] 其中：
[0221] X1是烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12),或其取代形式；
[0222] R1是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0223] a是1、2、3、4、5或6；
[0224] 在一些实施方案中，X1是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，X1是乙基氨基。在其它实施方案中，X1是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，X1是二甲基氨基。在其它实施方案中，X1是杂环烷基(C≤12)或被取代的杂环烷基(C≤12)。在一些实施方案中，X1是4-哌啶基、N-哌啶基、N-吗啉基、N-吡咯烷基、2-吡咯烷基、N-哌嗪基或N-4-甲基哌二嗪基。在其它实施方案中，X1是杂芳基(C≤12)或被取代的杂芳基(C≤12)。在一些实施方案中，X1是2-吡啶基或N-咪唑基。在一些实施方案中，R1是羟基。在其它实施方案中，R1是氨基。在其它实施方案中，R1是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R1是烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R1是甲基氨基或乙基氨基。在一些实施方案中，a是1、2、3或4。在一些实施方案中，a是2或3。在一些实施方案中，a是2。在其它实施方案中，a是3。在一些实施方案中，所述核进一步定义为下式化合物：
[0225]
[0226] 在一些实施方案中，所述核进一步定义为：
[0227]
[0228] 在其它实施方案中，所述核由下式进一步定义：
[0229]
[0230] 其中：
[0231] X2是N(R5)y；
[0232] R5是氢或烷基(C≤8)、或被取代的烷基(C≤18)；并且
[0233] y是0、1或2，条件是y与z的和是3；
[0234] R2是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0235] b是1、2、3、4、5或6；并且
[0236] z是1、2、3；条件是z与y的和是3。
[0237] 在一些实施方案中，X2是N。在其它实施方案中，X2是NR5，其中R5是氢或烷基(C≤8)。在一些实施方案中，R5是氢。在其它实施方案中，R5是甲基。在一些实施方案中，z是3。在其它实施方案中，z是2。在一些实施方案中，R2是羟基。在其它实施方案中，R2是氨基。在其它实施方案中，R2是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R2是烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R2是甲基氨基。在其它实施方案中，R2是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R2是二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R2是二甲基氨基。在一些实施方案中，b是1、2、3或4。在一些实施方案中，b是2或3。在一些实施方案中，b是2。在其它实施方案中，b是3。在一些实施方案中，所述核进一步定义为：
[0238]
[0239]
[0240] 在一些实施方案中，所述核进一步定义为：
[0241]
[0242] 在其它实施方案中，所述核进一步定义为：
[0243]
[0244] 其中：
[0245] X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-、或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0246] R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-(CH2CH2N)e(Rc)Rd；
[0247] 其中：
[0248] e是1、2或3；
[0249] Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0250] c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
[0251] 在一些实施方案中，X3是-O-。在其它实施方案中，X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)。在一些实施方案中，X3是-NH-或-NCH3-。在其它实施方案中，X3是烷基氨基二基(C≤8)或被取代的烷基氨基二基(C≤8)。在一些实施方案中，X3是-NHCH2CH2NH-或-NHCH2CH2NHCH2CH2NH-。在其它实施方案中，X3是烷氧基二基(C≤8)或被取代的烷氧基二基(C≤8)。在一些实施方案中，X3是-OCH2CH2O-。在其它实施方案中，X3是芳烃二基(C≤8)或被取代的芳烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，X3是苯二基。在其它实施方案中，X3是杂环烷烃二基(C≤8)或被取代的杂环烷烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，X3是N,N′-哌嗪二基。
[0252] 在一些实施方案中，R3是氨基。在其它实施方案中，R3是羟基。在其它实施方案中，R3是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R3是烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R3是甲基氨基。在其它实施方案中，R3是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R3是二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R3是二甲基氨基。
[0253] 在一些实施方案中，R4是氨基。在其它实施方案中，R4是羟基。在其它实施方案中，R4是烷基氨基(C≤12)或被取代的烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R4是烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R4是甲基氨基。在其它实施方案中，R4是二烷基氨基(C≤12)或被取代的二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R4是二烷基氨基(C≤12)。在一些实施方案中，R4是二甲基氨基。在其它实施方案中，R4是-(CH2CH2N)e(Rc)Rd：其中：e是1、2或3；并且Rc和Rd各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)。在一些实施方案中，e是1或2。在一些实施方案中，e是1。在一些实施方案中，Rc是氢。在一些实施方案中，Rd是氢。
[0254] 在一些实施方案中，c是1、2、3或4。在一些实施方案中，c是2或3。在一些实施方案中，c是2。在其它实施方案中，c是3。在一些实施方案中，d是1、2、3或4。在一些实施方案中，d是2或3。在一些实施方案中，d是2。在其它实施方案中，d是3。在一些实施方案中，所述核进一步定义为：
[0255]
[0256]
[0257] 在一些实施方案中，所述核进一步定义为：
[0258]
[0259] 在其它实施方案中，所述核是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式。在一些实施方案中，所述核是烷基胺(C≤18)或被取代的烷基胺(C≤18)。在一些实施方案中，所述核是辛基胺、癸基胺、十二烷基胺、十四烷基胺、十六烷基胺和十八烷基胺。在其它实施方案中，所述核是二烷基胺(C≤36)或被取代的二烷基胺(C≤36)。在一些实施方案中，所述核是N-甲基、N-十二烷基胺、二辛基胺或二癸基胺。在其它实施方案中，所述核是杂环烷烃(C≤12)或被取代的杂环烷烃(C≤12)。在一些实施方案中，所述核是4-N-甲基哌嗪基。在一些实施方案中，Y1是烷烃二基(C≤8)或被取代的烷烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，Y1是烷烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，Y1是-CH2CH2-。在一些实施方案中，Y3是烷烃二基(C≤8)或被取代的烷烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，Y3是烷烃二基(C≤8)。在一些实施方案中，Y3是-CH2CH2-。在其它实施方案中，Y3是：
[0260]
[0261] 其中：
[0262] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0263] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式。
[0264] 在一些实施方案中，X3是烷烃二基(C≤12)或被取代的烷烃二基(C≤12)。在一些实施方案中，X3是-CH2CH2-。在一些实施方案中，X4是烷烃二基(C≤12)或被取代的烷烃二基(C≤12)。在一些实施方案中，X4是-CH2CH2-。在一些实施方案中，Y5是共价键。在一些实施方案中，Y3是：
[0265]
[0266] 其中：
[0267] X3和X4是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0268] Y5是共价键、烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式。
[0269] 在一些实施方案中，X3是烷烃二基(C≤12)或被取代的烷烃二基(C≤12)。在一些实施方案中，X3是-CH2CH2-。在一些实施方案中，X4是烷烃二基(C≤12)或被取代的烷烃二基(C≤12)。在一些实施方案中，X4是-CH2CH2-。在一些实施方案中，Y5是共价键。在一些实施方案中，Y5是-CH2-或-C(CH3)2-。在一些实施方案中，A1是-O-。在其它实施方案中，A1是-NRa-。在一些实施方案中，Ra是氢。在一些实施方案中，A2是-O-。在其它实施方案中，A2是-NRa-。在一些实施方案中，Ra是氢。在一些实施方案中，R9是烷基(C≤8)。在一些实施方案中，R9是甲基。在一些实施方案中，n是0、1、2、3或4。在一些实施方案中，n是0、1、2或3。在一些实施方案中，n是0。在其它实施方案中，n是1。在其它实施方案中，n是2。在其它实施方案中，n是3。
[0270] 在另一方面，本公开提供组合物，其包含：
[0271] (a)本文所述的树枝状聚合物；和
[0272] (b)核酸。
[0273] 在一些实施方案中，所述核酸是短干扰RNA(例如小干扰RNA)(siRNA)、微RNA(miRNA)、pri-miRNA、信使RNA(mRNA)、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸、单向导RNA(sgRNA)、CRISPR-RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、转运RNA(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、向导RNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链RNA
(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述核酸是siRNA、tRNA或可用于CRISPR过程中的核酸。所述核酸可以是siRNA。在其它实施方案中，可用于CRISPR过程中的核酸如规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸、单向导RNA(sgRNA)、CRISPR-RNA(crRNA)或反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，所述核酸是针对因子VII的siRNA，其包含以下序列：
[0274] 5′-GGAucAucucAAGucuuAc[dT][dT]-3′(SEQ ID NO:1)；或
[0275] 3′-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT][dT]-5′(SEQ ID NO:2)。
[0276] 在其它实施方案中，所述核酸是miRNA。在其它实施方案中，所述核酸是mRNA。在其它实施方案中，所述核酸是tRNA。在其它实施方案中，所述核酸是向导RNA。在一些实施方案中，所述向导RNA被用于CRISPR过程中。在其它实施方案中，所述核酸是pDNA。
[0277] 在一些实施方案中，所述树枝状聚合物和所述核酸以约100:1至约1:5的重量比存在。在一些实施方案中，树枝状聚合物与核酸的重量比是约50:1至约2:1。在一些实施方案中，树枝状聚合物与核酸的重量比是25:1。在其它实施方案中，树枝状聚合物与核酸的重量比是7:1。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种辅助脂质。在一些实施方案中，所述辅助脂质选自类固醇、类固醇衍生物、PEG脂质或磷脂。在一些实施方案中，所述辅助脂质是类固醇或类固醇衍生物。在一些实施方案中，所述类固醇是胆固醇。在一些实施方案
中，所述类固醇或类固醇衍生物与所述树枝状聚合物以约10:1至约1:20的摩尔比存在。在
一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物与树枝状聚合物的摩尔比是约1:1至约1:10。在一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物与树枝状聚合物的摩尔比是约38:50。在一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物与树枝状聚合物的摩尔比是约1:5。
[0278] 在其它实施方案中，所述辅助脂质是PEG脂质。在一些实施方案中，所述PEG脂质是PEG化二酰基甘油，例如下式化合物：
[0279]
[0280] 其中：
[0281] R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0282] Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；并且
[0283] x是1-250。
[0284] 在一些实施方案中，所述PEG脂质是二肉豆蔻酰基-sn-甘油或下式化合物：
[0285]
[0286] 其中：
[0287] n1是5-250；并且
[0288] n2和n3各自独立地是2-25。
[0289] 在一些实施方案中，所述PEG脂质和所述树枝状聚合物以约1:1至约1:250的摩尔比存在。在一些实施方案中，PEG脂质与树枝状聚合物的摩尔比是约1:10至约1:125。在一些实施方案中，PEG脂质与树枝状聚合物的摩尔比是约1:20至约1:50。
[0290] 在其它实施方案中，所述辅助脂质是磷脂。在一些实施方案中，所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在其它实施方案中，所述磷脂是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，所述磷脂和所述树枝状聚合物以约10:1至约1:20的摩尔比存在。在一些实施方案中，磷脂与树枝状聚合物的摩尔比是约1:1至约1:10。在一些实施方案中，磷脂与树枝状聚合物的摩尔比是约4:5。在一些实施方案中，磷脂与树枝状聚合物的摩尔比是约1:5。在一些实施方案中，所述组合物基本上由树枝状聚合物、核酸和一种或多种辅助脂质组成。
[0291] 在另一方面，本公开提供药物组合物，其包含：
[0292] (a)本文所述的组合物或树枝状聚合物；和
[0293] (b)药学上可接受的载体。
[0294] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体是溶剂或溶液。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制通过以下方式施用：口服，脂肪内，动脉内，关节内，颅内，皮内，病灶内，肌肉内，鼻内，眼内，心包内，腹膜内，胸膜内，前列腺内，直肠内，鞘内，气管内，瘤内，脐带内，阴道内，静脉内，囊内，玻璃体内，经脂质体，经局部，经粘膜，肠胃外，经直肠，结膜下，皮下，舌下，经表面，经颊，经皮，经阴道，呈膏状物，呈脂质组合物，通过导管，通过灌洗，通过连续输注，通过输注，通过吸入，通过注射，通过局部递送或通过局部灌注。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于静脉内或动脉内注射。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为单位剂量。
[0295] 在另一方面，本公开提供了调节基因表达的方法，其包括将核酸递送至细胞，所述方法包括使所述细胞与本文所述的组合物或药物组合物在足以引起核酸摄取到细胞中的条件下接触。在一些实施方案中，使细胞在体外接触。在其它实施方案中，使细胞在体内接触。在其它实施方案中，使细胞离体接触。在一些实施方案中，基因表达的调节足以治疗疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肝癌。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肝细胞癌。
[0296] 在另一方面，本公开提供了治疗患者中的疾病或病症的方法，其包括向有需要的患者施用药学有效量的本文所述的组合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或
病症是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肝癌。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肝细胞癌。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用一种或多种额外的
癌症疗法。在一些实施方案中，所述癌症疗法是化学治疗化合物、手术、放射疗法或免疫疗法。在一些实施方案中，所述组合物或药物组合物对患者施用一次。在其它实施方案中，所述组合物或药物组合物对患者施用两次或更多次。在一些实施方案中，所述患者是哺乳动
物，例如人类。
[0297] 在另一方面，本公开提供提供下式的树枝状聚合物：
[0298] 核-(重复单元)n-封端基团(I)
[0299] 其中所述核通过从核中除去一个或多个氢原子并用所述重复单元代替所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
[0300] 所述核具有式：
[0301]
[0302] 其中：
[0303] X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烯烃二基(C≤8)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0304] R3和R4各自独立地是氨基、羟基、或巯基、或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；
[0305] c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或者
[0306] 其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
[0307] 所述可降解的二酰基具有式：
[0308]
[0309] 其中：
[0310] A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-，其中：
[0311] Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
[0312] Y3是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0313] R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
[0314] 所述接头基团具有式：
[0315]
[0316] 其中：
[0317] Y1是烷烃二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)，或这些基团中的任一个的取代形式；并且
[0318] 其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团与接头基团的氮原子和硫原子上的可降解的二酰基连接，其中所述重复单元中的第一个基团是可降解的二酰基，其
中对于每个接头基团，下一个基团包含两个连接到所述接头基团的氮原子上的可降解的二
酰基；并且其中n是所述重复单元中存在的接头基团的数量；并且
[0319] 所述封端基团具有式：
[0320]
[0321] 其中：
[0322] Y4是烷烃二基(C≤18)；并且
[0323] R10是氢；
[0324] 其中所述链中的最后的可降解二酰基连接到封端基团；
[0325] n是0、1、2、3、4、5或6；
[0326] 或其药学上可接受的盐。
[0327] 术语“包含”(以及包含的任何形式)、“具有”(以及具有的任何形式)、“含有”(以及含有的任何形式)和“包括”(以及包括的任何形式)都是开放式连系动词。因此，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或多个所列举的步骤或要素的方法、组合物、试剂盒或系统具有那些所列举的步骤或要素，但不限于仅具有那些步骤或要素；它可能具有(即涵盖)未列举的要素或步骤。同样，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或多个所列举特征的方法、组合物、试剂盒或系统的要素具有这些特征，但不限于仅具有那些特征；它可能具有未列举的特征。
[0328] 任何本发明方法、组合物、试剂盒和系统的任何实施方案可以由所描述的步骤和/或特征或基本上由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包含/包括/含有/具有所描述的步
骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由……组成”或“基本上由……组成”可以代替上面列举的任何开放式连系动词，以使得给定权利要求的范围相比于它本来使用开放式
连系动词的范围发生改变。
[0329] 在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，但本公开支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。
[0330] 根据以下详细描述，本公开的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅仅是以示例的方式给出的，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本
领域技术人员将变得显而易见。应注意，仅仅因为特定的化合物归属于一种特定的通式并
不意味着它不能也属于另一种通式。
附图说明
[0331] 以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地
理解本发明。
[0332] 图1A-1D显示在易感肝癌内的小RNA治疗需要对肿瘤细胞具有高效力和对正常细胞具有低毒性的组合。用于使生物相容性的基于酯的树枝状聚合物的化学官能团和尺寸多
样化的模块化策略允许发现平衡了低毒性和高的体内小RNA递送效力的树枝状聚合物。正
交反应加速了1,512种G1模块化可降解树枝状聚合物的合成，从而增加了分子结构的数量、大小和化学多样性。在每个步骤中包含可降解的酯键促进了低毒性。(图1A)小RNA过大并且呈阴离子性以致于自身不能进入细胞。为了有效利用RNAi机制，递送载体必须陪伴小RNA通过众多细胞外和细胞内屏障。设想了一种模块化设计，其将能够对树枝状聚合物结构中的
官能团身份和位置进行微调。(图1B)通过依序正交反应建立文库。首先，具有一系列初始分支中心(IBC)的胺与含有两个可降解酯基的AEMA的空间位阻较小的丙烯酸酯基团定量和选
择性地反应。然后产物经历DMPP催化的与各种硫醇的反应。(图1C)为了鉴定具有优化拓扑
结构以介导小RNA克服多种细胞外和细胞内递送屏障的可降解树枝状聚合物，文库分为四
个区：核结合-外周稳定化(I区)、核结合-外周结合(II区)、核稳定化-外周稳定化(III区)和核稳定化-外周结合(IV区)。(图1D)树枝状聚合物对于核和外周用化学多样的胺和硫醇
独立调节。选定的胺被分成两类：将产生1至6种支化物质的用于RNA结合的可电离胺被标记为1A-6A，而用于NP稳定化的疏水性胺被标记为1H-2H。预计这些胺增加更高代树枝状聚合
物的效力。基于烃长度，用于NP稳定化的疏水性烷基胺被标记为SC1-SC19。文库设计中包括醇和羧酸封端的硫醇(SO1-SO9)和胺官能化硫醇(SN1-SN11)以增加化学多样性。还使用代
扩增反应合成了具有多个分支的G2-G4更高代树枝状聚合物(参见图10B和图11)。
[0333] 图2显示了在50℃下，在5摩尔％丁基化羟基甲苯(BHT)的存在下，三(2-氨基乙基)胺6A3与甲基丙烯酸2-(丙烯酰氧基)乙酯(AEMA)的高氮杂迈克尔加成选择性。在未加入三
(2-氨基乙基)胺的情况下，在24小时后仅AEMA未反应并且其转化率是0％。加入三(2-氨基
乙基)胺后，AEMA转化率在2小时后为约82％并且在24小时后为约98％，生成了具有6个分支的第一代树枝状聚合物6A3-G1。应注意，添加过量的EAMA(6×0.05当量)旨在通过EAMA的1H NMR跟踪来容易地监测反应。如果EAMA转化完成，则应该仍有5％的Ha和Hb信号。
[0334] 图3显示了在50℃下，在5摩尔％丁基化羟基甲苯(BHT)的存在下，长烷基链十四烷基胺2H4与甲基丙烯酸2-(丙烯酰氧基)乙酯(AEMA)的高氮杂迈克尔加成选择性。在24小时
后仅AEMA未反应并且其转化率是0％。加入十四烷基胺后，AEMA转化率在24小时后为约
97％，生成具有长烷基链核的第一代树枝状聚合物2H4-G1。应注意，添加过量的EAMA(2×
0.05当量)旨在通过EAMA的1H NMR跟踪来容易地监测反应。如果EAMA转化完成，则应该仍有
5％的Ha和Hb信号。
[0335] 图4显示在60℃下，在400μL DMSO-D6中，6A3-G1(125mM)与2-(丁基氨基)乙硫醇(6×1.2当量)或1-十四烷硫醇(6×1.2当量)的硫杂迈克尔加成持续48小时。在未加入硫醇化合物的情况下，6A3-G1在60℃下在DMSO-D6中保持不变持续48小时。在加入(5摩尔％)二甲
基苯基膦(DMPP)作为催化剂的情况下，6A3-G1在48小时内在60℃下在DMSO-D6中以100％转
化率与1-十四烷硫醇反应，而在不存在DMPP的情况下6A3-G1的转化率为仅57％。在加入或
未加入DMPP的情况下，6A3-G1与2-(丁基氨基)乙硫醇的转化率几乎是定量的，这可能是因
为2-(丁基氨基)乙硫醇中的胺基可以充当催化剂。应注意，加入过量的硫醇(6×0.2当量)，这是因为6A3-G1含有(6×0.05当量)EAMA，它以其两个双键消耗硫醇反应物(6×0.1当量)。
[0336] 图5显示在60℃下，在DMSO-D6中，2H4-G1(125mM)与2-(丁基氨基)乙硫醇(2×1.2当量)或1-十四烷硫醇(2×1.2当量)的硫杂迈克尔加成持续48小时。在未加入硫醇化合物
的情况下，2H4-G1在60℃下在DMSO-D6中保持不变持续48小时。在加入(5摩尔％)二甲基苯
基膦(DMPP)作为催化剂的情况下，2H4-G1在48小时内在60℃下在DMSO-D6中以100％转化率
与1-十四烷硫醇反应，而在不存在DMPP的情况下2H4-G1的转化率为仅51％。在加入或未加
入DMPP的情况下，2H4-G1与2-(丁基氨基)乙硫醇的转化率是定量的，这可能是因为2-(丁基氨基)乙硫醇中的胺基可以充当催化剂。应注意，加入过量的硫醇(2×0.2当量)，这是因为
2H4-G1含有(2×0.05当量)EAMA，它以其两个双键消耗硫醇反应物(2×0.1当量)。
[0337] 图6A和图6B显示了高效率地建立1,512种第一代可降解树枝状聚合物的文库。(图6A)在50℃下，在5摩尔％的丁基化羟基甲苯(BHT)存在下，具有各种初始分支中心(IBC)的
不同胺C与甲基丙烯酸2-(丙烯酰氧基)乙酯(AEMA)在精确1:1进料当量下反应24小时。所有
1
42个反应的转化率根据H NMR都是几乎定量的。(图6B)42种C-L-G1中的每一种与36种硫醇
(P)中的每一种在66μL DMSO中在5％DMPP下以小规模(平均约20mg)进行反应。硫醇浓度是
750mM，并且1An&1Hn、2An&2Hn、3An、4An、5An和6An的浓度分别是750mM、275mM、250mM、
187.5mM、150mM和125mM。在未加入任何硫醇化合物的情况下，所有42种C-L-G1在60℃保持
1
稳定48小时。所有42种物质与SC4、SN8和SO9的每个反应都具有几乎定量的转化(通过 H 
NMR测量)。
[0338] 图7A-7C显示1,512种G1DD的体外siRNA递送筛选能够发现可以克服细胞内屏障并建立结构-活性关系的树枝状聚合物(图7A)。(图7B)用树枝状聚合物纳米颗粒(33nM 
siLuc，n＝3)处理后HeLa-Luc细胞中荧光素酶沉默的热图说明了区域活性关系。测量荧光
素酶活性和细胞活力以鉴定平衡了高递送效力与低毒性的树枝状聚合物(参见图8中的额
外数据)。(图7C)能够实现大于50％沉默的纳米颗粒群组的分析鉴定出具有优化的拓扑结
构以克服细胞内递送屏障的树枝状聚合物。根据一系列标准，如果子区的命中率高于其母
区的命中率，则对子区进行进一步分析。母区的命中率以橙色标记，而其子组的较高或较低的命中率分别以绿色或蓝色标记。整个文库的约6％能够实现>50％的基因沉默。核结合-外周稳定化I区具有10％的命中率。在I区内，具有SC分支的子区占15％，而具有SO分支的子区只有1％的命中率。在具有SC分支的子区中，具有三至六个分支即SC5-8分支或SC9-12分支
的树枝状聚合物具有高得多的有效介导siRNA递送的机会。
[0339] 图8显示了加入含有siLuc(33nM siRNA，值为n＝3的平均值)的1,512种第一代可降解树枝状聚合物(G1DD)NP后的细胞活力。将G1DD配制成含有重量比为12.5:1(G1DD:
siRNA)的萤火虫荧光素酶靶向siRNA(siLuc)和摩尔比为50:38:10:2(G1DD:胆固醇:DSPC:
脂质PEG)的辅助脂质胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和脂质PEG2000
的纳米颗粒。用ONE-Glo+Tox荧光素酶报告基因和细胞活力测定法(Promega)按照其方案测
量细胞活力。通过相对于未处理的细胞进行标准化来获得细胞活力。未处理的对照(n＝6)。
实验样品(n＝3)。
[0340] 图9A和图9B显示了1,512种第一代可降解树枝状聚合物(G1DD)的细胞内siRNA递送活性。将G1DD配制成含有重量比为12.5:1(G1DD:siRNA)的萤火虫荧光素酶靶向siRNA
(siLuc)和摩尔比为50:38:10:2(G1DD:胆固醇:DSPC:脂质PEG)的辅助脂质胆固醇、1,2-二
硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和脂质PEG2000的纳米颗粒。(图9A)将用33nM siRNA
处理G1DD纳米颗粒后稳定表达萤火虫荧光素酶的HeLa细胞中的荧光素酶活性降低的热图
分成多个区和区域以描述树枝状分析过程的分解(参见部分图9B)。利用ONE-Glo+Tox荧光
素酶报告基因和细胞活力测定法(Promega)按照其方案测量细胞活力和荧光素酶活性。通
过相对于未处理细胞的荧光素酶活性和活力对荧光素酶活性进行标准化来获得荧光素酶
降低。未处理的对照(n＝6)。实验样品(n＝3)。(图9B)利用树枝状聚合物启发的树分析过程来鉴定具有优化结构以介导siRNA克服细胞内递送屏障的可降解树枝状聚合物，其通过分
析它们的命中率与荧光素酶活性降低超过50％。根据一系列标准，如果子区的命中率高于
其母区的命中率，则对子区进行进一步分析。母区的命中率是黑色条形图，而其子组的较高或低命中率是蓝色或红色字体。整个文库的约6％诱导>50％的基因沉默。核结合-外周稳定化区(I区)具有10％的命中率。在I区中，具有SC分支的子区具有15％，而具有SO分支的子区具有1％。在具有SC分支的子区中，具有3、4、5或6个分支即SC5-8分支或SC9-12分支的树枝状聚合物有效介导siRNA以克服细胞内递送屏障的机会要高得多。
[0341] 图10A-10C显示系统性体内siRNA递送筛选，其进一步鉴定也可以克服细胞外屏障的树枝状聚合物。分析提供了SAR以设计具有预测活性的额外树枝状聚合物。(图10A)在
1mg/kg的siRNA剂量下评估26种具有多样化结构的第一代可降解树枝状聚合物在小鼠中的
因子VII敲低(n＝3)。PBS对照(n＝3)。数据以平均值±s.d.显示。(图10B)具有多个分支的
可降解树枝状聚合物的合理设计通过(I)选择具有多个IBC的多胺和(II)通过代扩增增加
分支来实现。利用天然多胺亚精胺5A5和精胺6A4。选择1A2(一个IBC)、2A2和2A11(两个
IBC)、3A3和3A5(三个IBC)以及4A1和4A3(四个IBC)通过代扩增合成具有多个分支的可降解
树枝状聚合物(也参见图11)。(图10C)以1mg/kg的siRNA剂量评估24种通过策略I和II合理
设计的可降解树枝状聚合物在小鼠中的因子VII敲低(n＝3)。PBS对照(n＝3)。数据以平均
值±s.d.显示。合理设计的树枝状聚合物在高命中率下具活性。
[0342] 图11显示了通过代扩增策略制备具有多个分支的可降解树枝状聚合物的2A2和2A11(两个IBC)、3A3和3A5(三个IBC)以及4A1和4A3(四个IBC)的合成路线。
[0343] 图12A-12E显示了一些可降解的树枝状聚合物(>95％体内FVII敲低)的体内毒性评估，其进一步鉴定可平衡高递送功效与低毒性的树枝状聚合物。一些可降解的树枝状聚
合物NP在结合对照siRNA(siCTR)后具有(图12A)相似的尺寸和(图12B)净表面电荷(纳米颗
粒在图中从左至右描述，基于图12B的图例)。C12-200类脂质LNP提供了具有挑战性的比较，因为它们代表了具有类似的体内功效的不可水解系统的最佳实例。(图12C)以4mg siCTR/
kg向野生型小鼠(p26)静脉内注射一些NP(100mg树枝状聚合物/kg或28mg对照C12-200/kg)
(n＝3)。根据树枝状聚合物的身份，体重变化在不同制剂之间有变化，但是所有NP在正常的WT小鼠中基本上是无毒的。(图12D)携带侵袭性MYC驱动肿瘤的转基因小鼠(p32)在注射3mg siCTR/kg(75mg/kg 5A2-SC8和6A3-SC12或21mg/kg C12-200)后的体重变化(n＝5)。(图
12E)在第32、36、40和44天时用3mg siCTR/kg剂量(75mg树枝状聚合物/kg)的5A2-SC8和
6A3-SC12纳米颗粒注射的转基因小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝5)。在荷瘤小鼠(易感
宿主)中，载体的毒性被放大，并且只有5A2-SC8能够被充分耐受并且不影响存活。数据以平均值±s.d.显示。用(e)Mantel-Cox检验进行统计分析；n.s.P>0.05；*P<0.05。
[0344] 图13A和图13B显示选择侵袭性转基因MYC驱动的肝脏肿瘤模型以评估模块化可降解树枝状聚合物递送miRNA用于抑制肿瘤生长的毒性和效力(Nguyen等,2014)。(图13A)示
意性示出LAP-tTa；TRE-MYC转基因小鼠模型。当呈现LAP-tTA转基因时，在不存在或存在多西环素(Dox)的情况下，通过肝脏特异性LAP启动子开启或关闭TRE-MYC。(图13B)在未经任
何治疗的情况下，在大约p20-26时可见肝脏肿瘤，然后至p32时肝脏布满小肿瘤，并且最终肿瘤长大并且肝脏大小在p42至p60急剧增大。
[0345] 图14A-14C显示荧光成像证实了siRNA递送到肝脏内部的肿瘤细胞中。(图14A)携带侵袭性肝脏肿瘤的转基因小鼠在41日龄时的大体解剖学和荧光成像。荧光成像显示，用
Cy5.5标记的siRNA配制的5A2-SC8纳米颗粒在整个癌变肝脏中介导大量的siRNA积累，其中
在1mg Cy5.5-siRNA/kg静脉内注射24小时后在脾脏和肾脏中有少量积累。为了进一步确认
5A2-SC8NP是否可以将siRNA体内递送到肿瘤细胞中，收集肝脏的肿瘤组织，包埋在OTC中并在静脉内注射24小时后切片进行H&E染色和共焦成像。(图14B)H&E染色证实肝脏含有肿瘤。
使用共焦成像扫描相同的肿瘤组织切片，并且在三种通道下捕获：DAPI用于核(蓝色)，FITC用于鬼笔环肽染色的肌动蛋白(绿色)，和Cy5.5用于siRNA(红色)。(图14C)相同区域的共焦成像显示5A2-SC8可以将siRNA有效地递送到肝脏内部的肿瘤细胞中。
[0346] 图15A和图15B显示了用Cy5.5标记的siRNA配制的5A2-SC8NP在正常的野生型小鼠和携带肝脏肿瘤的小鼠中的生物分布(图15A)和来自荷瘤小鼠的肝脏的H&E染色图像(图
15B)。5A2-SC8NP在1mg siRNA/kg静脉内注射24小时后在正常小鼠和携带肝脏肿瘤的小鼠
的全肝中介导Cy5.5标记的siRNA积累。H&E染色图像显示荷瘤小鼠的肝脏布满肿瘤并且用
于共焦成像的载玻片含有肿瘤细胞。应注意，肝脏的大小随着肿瘤生长而增加(参见图15A
中的等比例的方框)。
[0347] 图16A-16H显示模块化可降解树枝状聚合物可以将治疗性Let-7g miRNA模拟物递送到临床上相关且侵袭性的MYC驱动的遗传肿瘤模型，导致显著的存活益处。5A2-SC8NP使
得携带MYC驱动的肝脏肿瘤的转基因小鼠中的FVII蛋白沉默，如在血液中(图16A)和在采集
的肝脏组织中(图16B)所测量(单次注射，1mg/kg，p26小鼠，注射后48小时)(左侧为siCTR并且右侧为siFVII)。(图16C)5A2-SC8NP使得能够将Let-7g递送到携带MYC驱动的肝脏肿瘤的
转基因小鼠的肝脏组织中(单次注射，1mg/kg，p26小鼠，注射后48小时)。Let-7g表达显著增加，而其它Let-7家族成员未受影响(左侧为siCTR并且右侧为siFVII)。(图16D)每周一次向携带MYC驱动的肝脏肿瘤的转基因小鼠给予1mg/kg Let-7g的静脉内注射，从第26天开始
(在肿瘤发展开始后)直到第61天。接受Let-7g的小鼠具有明显更小的腹部。(图16E)与对照组相比，治疗小鼠的腹围更小。(图16F)来自Let-7g模拟物和对照模拟注射小鼠的肝脏的代表性图像显示降低的肿瘤负荷。(图16G)每周一次递送5A2-SC8NP内的miRNA模拟物并不影
响正常体重增加，而递送C12-200LNP内的miRNA模拟物造成体重减轻和死亡。n＝5。(图16H)从第26天至第61天每周一次递送Let-7g延长了存活期。未接受治疗的所有对照小鼠(n＝9)
和接受含有对照未靶向模拟物的5A2-SC8NP的小鼠(n＝5)在出生后60天左右死亡。注射
C12-200LNP的小鼠过早死亡(n＝7)。#C12-200+CTR模拟物实验停止，因为接受C12-200+
Let-7g模拟物注射的所有小鼠都已经死亡(n＝7)。5A2-SC8NP内的Let-7g的递送提供了明
显的存活益处。数据以平均值±s.d.显示。用(a,b,c,e)双尾Student t检验或(h)Mantel-
Cox检验进行统计分析；n.s.P>0.05；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
[0348] 图17A-17C显示了使用利用胆固醇、磷脂和PEG脂质在HeLa-Luc(图17A)、A549-Luc(图17B)和MDA-MB231-Luc(图17C)中的不同组合配制的树枝状聚合物纳米颗粒递送siLuc
的递送。
[0349] 图18A和图18B显示(图18A)具有DSPC脂质相比DOPE脂质与PEG-DMG的不同组合物制剂在将siLuc递送至HeLa-Luc时的比较。图18B显示了具有DSPC脂质相比DOPE脂质与PEG-
DHD的不同组合物制剂在将siLuc递送至HeLa-Luc时的比较。
[0350] 图19显示使用含有树枝状聚合物或Z120的纳米颗粒组合物递送sgRNA的递送，并且在所述纳米颗粒制剂中存在和不存在磷脂DSPC。
[0351] 图20A和图20B显示sgRNA(图20A)的囊封百分比和在HeLa-Luc-Cas9细胞中的递送(图20B)。
[0352] 图21A和图21B显示24小时温育(图21A)和48小时温育(图21B)后已经递送有Luc mRNA的IGROV细胞的活力。
[0353] 图22显示用mCherry mRNA处理后细胞的荧光显微镜照片，其显示mRNA向所述细胞的递送。

具体实施方式

[0354] 在一些方面，本公开提供了可用作核酸载体的亲脂阳离子树枝状聚合物。在一些实施方案中，所述树枝状聚合物含有一个或多个在生理条件下发生降解的基团。在一些实
施方案中，所述树枝状聚合物被配制成包含树枝状聚合物和一种或多种核酸的组合物。这
些组合物还可进一步包含一种或多种辅助脂质如胆固醇和/或磷脂。最后，在一些方面，本公开还提供了使用所述树枝状聚合物组合物来治疗一种或多种可用核酸治疗剂治疗的疾
病的方法。
[0355] A.化学定义
[0356] 当在化学基团的情形下使用时：“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代基”是指＝O；“羰基”是指-C(＝O)-；“羧基”是指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤基”独立地是指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2；“羟基氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH；“氰基”是指-CN；“异氰酸酯基”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在单价情形下“磷酸酯基”是指-OP(O)(OH)2或其脱质子化形式；在二价情形下“磷酸酯基”是指-OP(O)(OH)O-或其脱质子化形式；“巯基”是指-SH；并且“硫基”是指＝S；“磺酰基”是指-S(O)2-；“羟基磺酰基”是指-S(O)2OH；“磺酰胺”是指-S(O)2NH2；并且“亚磺酰基”是指-S(O)-。
[0357] 在化学式的情形下，符号“-”是指单键，“＝”是指双键，并且“≡”是指三键。符号表示任选的键，其在存在时是单键或双键。符号 表示单键或双键。因此，例如，式 包括 并且应理解，没有一个这样的环原
子构成多于一个双键的一部分。此外，应注意，共价键符号“-”当连接一个或两个立体原子时，不指示任何优选的立体化学。相反，它涵盖了所有的立体异构体以及其混合物。符号
当垂直穿过键(例如，甲基的 )绘制时指示基团的连接点。应注意，连接点通
常仅以这种方式针对较大基团确定，以辅助读者明确地确定连接点。符号 是指其中
连接到楔形粗端的基团是“在页面外”的单键。符号 是指其中连接到楔形粗端的基
团是“在页面内”的单键。符号 是指其中围绕双键的几何结构(例如E或Z)不确定的
单键。因此预期两种选择以及其组合。本申请中所示结构的原子上的任何未定义化合价隐
含地表示与该原子键合的氢原子。碳原子上的黑点指示连接到所述碳的氢从纸面向外定
向。
[0358] 当基团“R”被描述为环系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：
[0359]
[0360] 则R可以代替连接到任何环原子的任何氢原子，包括所描绘的、暗示的或明确定义的氢，只要形成稳定的结构即可。当基团“R”描绘为稠合环系上的“浮动基团”时，如例如在下式中：
[0361]
[0362] 则除非另外指明，否则R可以代替任何与任一稠环的任何环原子连接的氢。可代替的氢包括所描绘的氢(例如，上式中与氮连接的氢)，隐含的氢(例如，上式没有示出但理解为存在的氢)，明确定义的氢，以及任选的氢，其存在取决于环原子的身份(例如，当X等于-CH-时，连接到基团X的氢)，只要形成稳定的结构即可。在所描绘的实例中，R可位于稠环体系的5元或6元环上。在上式中，紧接在括号内括起来的基团“R”后的下标字母“y”代表数字变量。除非另有说明，否则该变量可以是0、1、2，或大于2的任何整数，仅受环或环系的最大可代替原子数限制。
[0363] 对于化学基团和化合物类别，基团或类别中的碳原子数目如下所示：“Cn”限定基团/类别中的碳原子的确切数目(n)。“C≤n”限定基团/类别中可能的碳原子的确切数目(n)，其中最小数目小至所讨论的基团/类别的可能数目，例如，应理解，基团“烯基(C≤8)”或类别“烯烃(C≤8)”中的最小碳原子数目是2。相比于“烷氧基(C≤10)”，其指示具有1至10个碳原子的烷氧基。“Cn-n'”限定基团中的碳原子的最小(n)和最大数目(n')。因此，“烷基(C2-10)”指示具有2至10个碳原子的那些烷基基团。这些碳数指标可以在其修饰的化学基团或类别
之前或之后，并且可能或可能没有括在括号中，而不表示任何含义改变。因此，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”、“烯烃(C5)”和“烯烃C5”都是同义词。
[0364] 当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和的”是指化合物或化学基团不具有碳碳双键且不具有碳碳三键，除非如下所示。当该术语用于修饰原子时，其是指原子不是任何双键或三键的一部分。在饱和基团的被取代形式的情况下，可能存在一个或多个碳氧双键或碳氮双键。并且当存在这样的键时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互
变异构的一部分出现的碳碳双键。当术语“饱和”用于修饰物质的溶液时，这意味着没有更多的该物质可以溶解在该溶液中。。
[0365] 术语“脂族”当在没有修饰词“被取代的”下使用时表示这样修饰的化合物或化学基团是无环或环状的但非芳族的烃化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以直链、支链或非芳族环(脂环)连接在一起。脂族化合物/基团可以是饱和的，即通过碳碳单键(烷烃/烷基)连接，或不饱和的，即具有一个或多个碳碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多
个碳碳三键(炔烃/炔基)。
[0366] 术语“芳族”当用于修饰化合物或化学基团原子时是指所述化合物或化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定化的原子的平面不饱和环。
[0367] 术语“烷基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，并且无除碳和氢以外的原子的单价饱和脂族基团。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr、iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基的非限制性实例。术语“烷烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有一个或两个饱和碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，无碳碳
双键或三键并且无除碳和氢以外的原子的二价饱和脂族基团。基团-CH2-(亚甲基)、-
CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷烃二基的非限制性实例。“烷烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。以下基团是被取代的烷基的非限制性实例：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是被取代烷基的子集，其中氢原子取代不限于卤基(即-F、-Cl、-Br或-I)，因此不存在除碳、氢和卤素以外的其它原子。基团-CH2Cl是卤代烷基的非限制性实例。术语“氟烷基”是被取代烷基的子集，其中氢原子取代不限于氟基，因此不存在除碳、氢和氟以外的其它原子。
基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟烷基的非限制性实例。
[0368] 术语“环烷基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有碳原子作为连接点，所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，无碳碳双键或三键并且无除碳和氢以外的原子的单价饱和脂族基团。非限制性实例包括：-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。术语“环烷烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有两个碳原子作为连接点，无碳碳双键或三键并且无除碳和氢以外的原子的二价饱和脂族基团。基团
是环烷烃二基的非限制性实例。“环烷烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R
是环烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0369] 术语“烯基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有碳原子作为连接点，具有直链或支链的无环结构，具有至少一个非芳族碳碳双键，无碳碳三键并且无除碳和氢以外的原子的单价不饱和脂族基团。非限制性实例包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。术语“烯烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有两个碳原子作为连接点，具有直链或支链、直链或支链无环结构，具有至少一个非芳族碳碳双键，无碳碳三键，并且无除碳和氢以外的原子的二价不饱和脂族基团。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯烃二基的非限制性实例。应注意，虽然烯烃二基是脂族的，但一旦在两端连接，则不排除该基团形成芳族结构的一部分。术语“链烯烃”和“烯烃”是同义词并且是指具有式H-R的化合物类别，其中R是烯基，该术语如上文所定义。类似地，术语“末端烯烃”和“α-烯烃”是同义词并且是指仅具有一个碳碳双键的烯烃，其中所述键是在分子末端的乙烯基的一部分。当
这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-
OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是被取代的烯基的非限制性实例。
[0370] 术语“炔基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有碳原子作为连接点，具有直链或支链的无环结构，具有至少一个碳碳三键并且无除碳和氢以外的原子的单价不饱和脂族基团。如本文所用，术语炔基不排除一个或多个非芳族碳碳双键的存在。基团-C≡
CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性实例。“炔烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是炔基。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0371] 术语“芳基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有芳族碳原子作为连接点并且所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分的单价不饱和芳族基团，其中环原子都是碳，并且其中所述基团不由除碳和氢以外的原子组成。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。如本文所用，该术语不排除连接到第一芳族环或存在的
任何额外芳族环的一个或多个烷基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。芳基的非限制性实例
包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和衍生自联苯的单价基团。术语“芳烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有两个芳族碳原子作为连接点并且所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分的二价芳族基团，其中
环原子都是碳，并且其中所述单价基团不由除碳和氢以外的原子组成。如本文所用，该术语不排除连接到第一芳族环或存在的任何额外芳族环的一个或多个烷基、芳基或芳烷基(碳
数限制允许)的存在。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。未稠合的环可通过以下中的一个或多个连接：共价键、烷烃二基或烯烃二基(碳数限制允许)。芳烃二基的非限制性实例包括：
[0372]
[0373] “芳烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，该术语如本文所定义。苯和甲苯是芳烃的非限制性实例。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0374] 术语“芳烷基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指单价基团-烷烃二基-芳基，其中所述术语烷烃二基和芳基各自以与上文所提供定义一致的方式使用。非限制性实例是：苯基甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与修饰词“被取代的”一起使用时，来自烷烃二基和/或芳基的一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。被取代的芳烷基的非限制性实例是：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。
[0375] 术语“杂芳基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有芳族碳原子或氮原子作为连接点并且所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分的单价芳族基团，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述杂芳基不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。杂芳基环可含有1、2、3或4个选自氮、氧和硫的环原子。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。如本文所用，所述术语不排除连接到芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(pyridinyl/pyridyl)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”是指具有氮原子作为连接点的杂芳基。术语“杂芳烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有两个芳族碳原子、两个芳族氮原子、或一个芳族碳原子和一个芳族氮原子作为两个连接点的二价芳族基
团，所述原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述二价基团不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。未稠合的环可通过以下中的一个或多个连
接：共价键、烷烃二基或烯烃二基(碳数限制允许)。如本文所用，所述术语不排除连接到芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳烃二基的非限制性实例包括：
[0376]
[0377] “杂芳烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性实例。当这些术语与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0378] 术语“杂环烷基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有碳原子或氮原子作为连接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述杂环烷基不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。杂环烷基环可含有1、2、3或4个选自氮、氧或硫的环原子。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。如本文所用，所述术语不排除连接到环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。此外，所述术语不排除环或环系中一个或多个双键
的存在，条件是所得的基团仍是非芳族的即可。杂环烷基的非限制性实例包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、吡喃基、环氧乙烷基和氧杂环丁烷基。术语“N-杂环烷基”是指具有氮原子作为连接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这种基团的一个实例。术语“杂环烷烃二基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指具有两个碳原子、两个氮原子、或一个碳原子和一个氮原子作为两个连接点的二价环状基团，所述原子形成一个或多个环结构的一部分，其中至
少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述二价基团不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在多于一个的环，则所述环可以是稠合或未稠合的。未稠合的环可以通过以下中的一个或多个连接：共价键、烷烃二基或烯烃二基(碳数限制允许)。如本文所用，所述术语不排除连接到环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。此外，所述术语不排除
环或环系中一个或多个双键的存在，条件是所得的基团仍是非芳族的即可。杂环烷烃二基
的非限制性实例包括：
[0379]
[0380] 当这些术语与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0381] 术语“酰基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基，这些术语如上文所定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基的非限制性实例。“硫代酰基”以类似方式定义，不同之处在于基团-C(O)R的氧原子已被硫原子代替，即-C(S)R。术语“醛”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被-CHO基团代替。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子(包括可能存在的直接连接到羰基或硫羰基的碳原子的氢原子)已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨甲酰基)和-CON(CH3)2是被取代的酰基的非限制性实例。
[0382] 术语“烷氧基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-OR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。非限制性实例包括：-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2(异丙氧基)、-OC(CH3)3(叔丁氧基)、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。术语“环烷氧基”、“烯氧基”、“炔氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指定义为-OR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷氧基二基”是指二价基团-O-烷烃二基-、-O-烷烃二基-O-或-烷烃二基-O-烷烃二基-。术语“烷硫基”和“酰硫基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-SR，其中R分别是烷基和酰基。术语“醇”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被羟基代替。术语“醚”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被烷氧基代替。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。
[0383] 术语“烷基氨基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。非限制性实例包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。术语“二烷基氨基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-NRR'，其中R和R'可以是相同或不同的烷基，或者R和R'可以连在一起表示烷烃二基。二烷基氨基的非限制性实例包括：-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。术语“环烷基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷基氨基”、“烷氧基氨基”和“烷基磺酰基氨基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指定义为-NHR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基的非限制性实例是-NHC6H5。术语“烷基氨基二基”是指二价基团-NH-烷烃二基-、-NH-烷烃二基-NH-或-烷烃二基-NH-烷烃二基-。术语“酰氨基”(酰基氨基)当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上文所定义。酰氨基的非限制性实例是-NHC(O)CH3。术语“烷基亚氨基”当在没有修饰词“被取代的”下使用时是指二价基团＝NR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任一个与修饰词“被取代的”一起使用时，连接到碳原子的一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2代替。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是被取代的酰氨基的非限制性实例。
[0384] 当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，词语“一”或“一个”的使用可以表示“一个”，但是它也符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义。
[0385] 在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的装置、方法的固有误差变化，或研究对象之间存在的变化。
[0386] 如本申请中所用，术语“平均分子量”是指每种聚合物物质的摩尔数与该物质的摩尔质量之间的关系。具体来说，每种聚合物分子可具有不同的聚合水平以及因此不同的摩尔质量。平均分子量可以用来表示多个聚合物分子的分子量。平均分子量通常与平均摩尔
质量同义。具体来说，有三种主要类型的平均分子量：数均摩尔质量，重量(质量)平均摩尔质量和Z-平均摩尔质量。在本申请的上下文中，除非另有说明，否则平均分子量代表该式的数均摩尔质量或重均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量是数均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量可用于描述存在于脂质中的PEG组分。
[0387] 术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那些一个或多个步骤，并且还涵盖其它未列出的步骤。
[0388] 术语“有效”在本说明书和/或权利要求中使用时，意味着足以实现所需、预期或期望的结果。“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”当在用化合物治疗患者或受试者的情形下使用时是指当施用于受试者或患者以治疗疾病时，足以实现这种疾病的治疗的化合物量。
[0389] 如本文所用，术语“IC50”是指获得最大反应的50％的抑制剂量。这种定量测量表明需要多少特定的药物或其它物质(抑制剂)才能将给定的生物、生物化学或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。
[0390] 第一化合物的“异构体”是其中每个分子含有与第一化合物相同的组分原子，但是其中这些原子的三维构型不同的单独化合物，。
[0391] 如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类动物。人类受试者的非限制性实例是成人、青少年、婴儿和胎儿。
[0392] 如本文通常所用，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者与合理的益处/风险比相称的其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0393] “药学上可接受的盐”是指如上文所定义的药学上可接受的并且具有所需药理学活性的本发明化合物的盐。这类盐包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸例如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘基磺酸、3-苯基丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂族单羧酸和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括碱加成盐，其可在存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时形成。可接
受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等。应该认识到，构成本发明任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子并不重要，只要所述盐总体上在药理学上是可接受的即
可。药学上可接受的盐的其它实例及其制备和使用方法呈现于《药用盐手册：性质和用途
(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use)》(P.H.Stahl和C.G.Wermuth
编,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)中。
[0394] 如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指涉及运载或转运化学药剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。
[0395] “预防”包括：(1)在可能处于疾病风险中和/或易患上疾病但尚未经历或显示疾病的任何或全部病理或症状的受试者或患者中抑制疾病发作，和/或(2)在可能处于疾病风险中和/或易患上疾病但尚未经历或显示疾病的任何或全部病理或症状的受试者或患者中减
缓疾病的病理或症状的发作。
[0396] “重复单元”是特定材料的最简单的结构实体，例如骨架和/或聚合物，无论是有机的、无机的还是金属有机的。在聚合物链的情况下，重复单元沿着链依次连接在一起，就像项链的珠子一样。例如，在聚乙烯-[-CH2CH2-]n-中，重复单元是-CH2CH2-。下标“n”表示聚合度，即连接在一起的重复单元的数量。当“n”的值未定义或其中“n”不存在时，它只是指示括号内该式的重复以及材料的聚合性质。重复单元的概念同样适用于重复单元之间的连接性三维延伸的地方，例如在金属有机骨架、改性聚合物、热固性聚合物等中。在树枝状聚合物的情形中，重复单元也可以被描述为分支单元、内层或代。类似地，封端基团也可以被描述为表面基团。
[0397] “立体异构体”或“光学异构体”是给定化合物的异构体，其中相同的原子键合到相同的其它原子，但是其中这些原子的三维构型不同。“对映异构体”是彼此呈镜像(如左手和右手)的给定化合物的立体异构体。“非对映异构体”是并非对映异构体的给定化合物的立体异构体。手性分子含有手性中心，也被称为立构中心或立体中心，其是带有基团的分子中的任意点，但不一定是原子，使得任何两个基团的交换导致立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，但其它原子也可能是有机和无机化合物中的立构中心。一个分子可以有多个立构中心，使其具有许多立体异构体。在其立体异构性归因于四面体立n
体中心(例如四面体碳)的化合物中，假设可能的立体异构体的总数不会超过2 ，其中n是四面体立构中心的数目。具有对称性的分子经常具有少于可能的最大数量的立体异构体。对
映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物。可选地，对映异构体的混合物可以是对映异构体富集的，使得一种对映异构体以大于50％的量存在。通常，可以使用本领域已知的技术来拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于尚未定义立体化学的任何立构中
心或手性轴，立构中心或手性轴可以其R形式、S形式或以R和S形式的混合物(包括外消旋和非外消旋混合物)形式存在。如本文所用，短语“基本上不含其它立体异构体”意指该组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％或最优选≤1％的另一种立体异构体。
[0398] “治疗”包括(1)在经历或显示疾病的病理或症状的受试者或患者中抑制疾病(例如，阻止病理和/或症状的进一步发展)，(2)在经历或显示疾病的病理或症状的受试者或患者中改善疾病(例如逆转病理和/或症状)，和/或(3)在经历或显示疾病的病理或症状的受
试者或患者中实现疾病的任何可测量的降低。
[0399] 上述定义优先于任何通过引用并入本文的参考文献中的任何冲突定义。但是，某些术语被定义的事实不应被视为指示任何未定义的术语都是不确定的。相反，所使用的所
有术语都被认为是以本领域普通技术人员能够理解本发明的范围和实践的方式来描述本
发明。
[0400] B.树枝状聚合物和树枝状结构
[0401] 在本公开的一些方面，提供了含有亲脂性和阳离子组分的树枝状聚合物。树枝状聚合物是展现规则树枝状分支的聚合物，其通过向核中或从核中依次或按代添加分支层而
形成，并且以一个核、至少一个内部分支层和一个表面分支层为特征。(参见Petar 
R.Dvornic和Donald A.Tomalia in Chem.英国,641-645,1994年8月。)在其它实施方案中，如本文所用的术语“树枝状聚合物”旨在包括但不限于具有内核、规律连接到该起始核的重复单元的内层(或“代”)以及连接到最外代的末端基团的外表面的分子结构。“树枝状物”是具有从焦点发出的分支的树枝状聚合物物质，所述焦点直接地或通过连接部分连接到或可
以连接到核，以形成更大的树枝状聚合物。在一些实施方案中，树枝状聚合物结构具有从中心核辐射的重复基团，其对于每个分支用每个重复单元加倍。在一些实施方案中，本文所述的树枝状聚合物可以被描述为小分子、中型分子、脂质或脂质样物质。这些术语可用于描述本文所述的具有树枝状物外观的化合物(例如从单个焦点辐射的分子)。
[0402] 虽然树枝状聚合物是聚合物，但由于它们具有可控的结构、单一分子量、众多且可控的表面官能团，并且在达到特定代数后在传统上采用球状构象，因此树枝状聚合物优于传统聚合物。树枝状聚合物可以通过每个重复单元的依次反应以产生单分散、树状和/或代结构聚合物结构来制备。单个树枝状聚合物由一个中心核分子组成，其中树枝状楔形物连
接到该中心核上的一个或多个功能位点。根据制备过程中使用的组装单体，树枝状聚合物
表面层可具有设置在其上的多种官能团，包括阴离子、阳离子、亲水性或亲脂性基团。
[0403] 改变核、重复单元和表面或封端基团的官能团和/或化学性质，可以调节它们的物理性质。可以改变的一些性质包括但不限于溶解性、毒性、免疫原性和生物附着能力。树枝状聚合物常常通过其代数或分支中的重复单元数量来描述。仅由核分子组成的树枝状聚合
物被称为第0代，而沿着所有分支的每个连续重复单元是第1代、第2代等，直到封端或表面基团。在一些实施方案中，半代可能仅由与胺的第一缩合反应而不是与硫醇的第二缩合反
应产生。
[0404] 树枝状聚合物的制备需要通过一系列逐步反应实现的合成控制水平，包括通过每个连续的基团建立树枝状聚合物。树枝状聚合物合成可以是收敛或发散型的。在发散型树
枝状聚合物合成期间，分子以逐步过程从核到外周组装，包括将一代连接到前一代，然后改变下一阶段反应的官能团。官能团转化对于防止不受控制的聚合是必要的。这种聚合反应
将导致并非单分散的高度支化分子，并且另外被称为超支化聚合物。由于空间效应，树枝状聚合物重复单元继续反应产生球形或球状分子，直到空间过度拥挤阻止了特定代的完全反
应并破坏了分子的单分散性。因此，在一些实施方案中，具体考虑了G1-G10代的树枝状聚合物。在一些实施方案中，树枝状聚合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复单元，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，本文使用的树枝状聚合物是G0、G1、G2或G3。然而，通过减少分支聚合物中的间隔单元可以增加可能的代数(例如11、12、13、14、15、20或25)。
[0405] 此外，树枝状聚合物具有两种主要的化学环境：由封端代上的特定表面基团产生的环境，和由于更高级结构而可能被屏蔽本体介质和表面基团的树枝状结构的内部。由于
这些不同的化学环境，树枝状聚合物已经发现了许多不同的潜在用途，包括在治疗应用中。
[0406] 在一些方面，使用丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团与胺和硫醇的差异反应性来组装本公开的树枝状聚合物。可以在此使用的树枝状聚合物包括由丙烯酸酯基团与伯或仲胺和
甲基丙烯酸酯与巯基的反应形成的仲或叔胺和硫醚。此外，本文所述的树枝状聚合物的重
复单元可含有在生理条件下可降解的基团。在一些实施方案中，这些重复单元可含有一个
或多个生发的二醚、酯、酰胺或二硫化物基团。在一些实施方案中，核分子是只允许在一个方向上发生树枝状聚合的单胺。在其它实施方案中，核分子是具有多个不同树枝状分支的
多胺，每个分支可以包含一个或多个重复单元。树枝状聚合物可通过从该核中除去一个或
多个氢原子而形成。在一些实施方案中，这些氢原子位于杂原子如氮原子上。在一些实施方案中，封端基团是亲脂性基团如长链烷基或烯基。在其它实施方案中，封端基团是长链卤代烷基或卤代烯基。在其它实施方案中，封端基团是含有可电离基团如胺(-NH2)或羧酸(-
CO2H)的脂族或芳族基团。在其它实施方案中，封端基团是含有一个或多个氢键供体如氢氧根基团、酰胺基团或酯的脂族或芳族基团。
[0407] 本公开提供的树枝状聚合物例如在上文发明内容部分和下文权利要求书中示出。它们可以使用实施例部分中概述的方法制得。这些方法可以使用本领域技术人员所应用的
有机化学原理和技术进一步修改和优化。例如在《马奇高等有机化学：反应、机理和结构
(March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)》
(2007)中教导了这样的原理和技术，该文献通过引用并入本文。
[0408] 本公开的树枝状聚合物可含有一个或多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以光学活性或外消旋形式分离。因此，除非明确指出具体的立体化学或异构体形式，否则所有的手性、非对映异构、外消旋形式、差向异构形式以及化学式的所有几何异构体形式都是预期的。树枝状聚合物可以外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单个非对映异构体形式存在。在一些实施方案中，获得单一的非对映异构体。本公开的树枝状聚合物的手性中心可以具有S或R构型。此外，预期可以存在一种或多种树枝状聚合物作
为构成异构体。在一些实施方案中，所述化合物具有相同的化学式但与核的氮原子的连接
性不同。不希望受任何理论束缚，据认为存在这种树枝状聚合物是因为起始单体首先与伯
胺反应，然后在统计学上与存在的任何仲胺反应。因此，构成异构体可以呈现完全反应的伯胺，然后呈现反应的仲胺的混合物。
[0409] 用于表示本公开的树枝状聚合物的化学式通常将仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基团与相应的烯醇基团平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基团与烯胺基团平衡存在。无论对于给定化学式描绘哪种互变异构体，并且不管
哪种互变异构体是最普遍的，给定化学式的所有互变异构体都是预期的。
[0410] 本公开的树枝状聚合物还可以具有这样的优点：相比于现有技术中已知的化合物，它们可以更有效，毒性更低，作用时间更长，效力更高，产生更少的副作用，更容易被吸收，和/或具有更好的药代动力学特征(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有其它有用的药理学、物理或化学性质，无论是否用于本文所述的适应症或其它方面。
[0411] 另外，构成本公开的树枝状聚合物的原子旨在包括这些原子的所有同位素形式。如本文所用，同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。作为一般实例而非
限制，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括13C和14C。
[0412] 应该认识到，形成本文所提供的树枝状聚合物的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子并不重要，只要该盐整体上在药理学上是可接受的即可。药学上可接受的盐的
其它实例及其制备和使用方法呈现于《药用盐手册：性质和用途(Handbook  of 
Pharmaceutical Salts:Properties,and Use)》(2002)中，所述文献通过引用并入本文。
[0413] C.辅助脂质
[0414] 在本公开的一些方面，将一种或多种辅助脂质与本公开的聚合物混合以产生组合物。在一些实施方案中，将聚合物与1、2、3、4或5种不同类型的辅助脂质混合。预期聚合物可以与单一类型的多种不同的脂质混合。在一些实施方案中，脂质可以是类固醇或类固醇衍
生物。在其它实施方案中，脂质是PEG脂质。在其它实施方案中，脂质是磷脂。在其它实施方案中，树枝状聚合物组合物包含类固醇或类固醇衍生物、PEG脂质和磷脂。
[0415] 1.类固醇和类固醇衍生物
[0416] 在本公开的一些方面，将聚合物与一种或多种类固醇或类固醇衍生物混合以产生树枝状聚合物组合物。在一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物包括任何类固醇或类固
醇衍生物。如本文所用，在一些实施方案中，术语“类固醇”是一类具有四环17碳环状结构的化合物，其可以进一步包含一个或多个取代，所述取代包括烷基、烷氧基、羟基、氧代基、酰基，或两个或更多个碳原子之间的双键。在一个方面，类固醇的环结构包含三个稠合的环己基环和稠合的环戊基环，如下式所示：
[0417]
[0418] 在一些实施方案中，类固醇衍生物包含具有一个或多个非烷基取代的上述环结构。在一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物是甾醇，其中该式进一步定义为：
[0419]
[0420] 在本公开的一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物是胆甾烷或胆甾烷衍生物。在胆甾烷中，环结构由下式进一步定义：
[0421]
[0422] 如上所述，胆甾烷衍生物包括一个或多个上述环系统的非烷基取代。在一些实施方案中，胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯或胆甾烯衍生物或者甾醇或甾醇衍生物。在其它
实施方案中，胆甾烷或胆甾烷衍生物胆甾烯和甾醇或其衍生物。
[0423] 在一些实施方案中，所述组合物还可包含类固醇与树枝状聚合物的摩尔比为约1:10至约1:20。在一些实施方案中，所述摩尔比为约1:20、1:18、1:16、1:14、1:12、1:10、1:8、
1:6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1至约10:1或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，所述摩尔比为约38:50或约1:5。
[0424] 2.PEG或PEG化脂质
[0425] 在本公开的一些方面，将聚合物与一种或多种PEG化脂质(或PEG脂质)混合以产生树枝状聚合物组合物。在一些实施方案中，本公开包括使用已连接有PEG基团的任何脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质是甘油二酯，其也包含与甘油基团连接的PEG链。在其它实施方案中，PEG脂质是含有一个或多个与接头基团连接的C6-C24长链烷基或烯基或C6-C24脂肪
酸基团与PEG链的化合物。PEG脂质的一些非限制性实例包括PEG改性的磷脂酰乙醇胺和磷
脂酸，PEG结合的神经酰胺，PEG改性的二烷基胺和PEG改性的1,2-二酰氧基丙-3-胺，PEG改性的二酰基甘油和二烷基甘油。在一些实施方案中，PEG改性的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或
PEG改性的二肉豆蔻酰基-sn-甘油。在一些实施方案中，通过脂质的PEG组分的分子量来测
量PEG修饰。在一些实施方案中，PEG修饰具有约100至约15,000的分子量。在一些实施方案中，分子量为约200至约500、约400至约5,000、约500至约3,000、或约1,200至约3,000。PEG修饰的分子量为约100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、
2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,
500至约15,000。美国专利5,820,873、WO 2010/141069或美国专利8,450,298教导了可用于本发明的脂质的一些非限制性实例，所述文献通过引用并入本文。
[0426] 在另一个方面，PEG脂质具有式：
[0427]
[0428] 其中：R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)，或这些基团中的任一个的取代形式；Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；并且x是1-250。在一些实施方案中，Re是烷基(C≤8)，例如甲基。R12和R13各自独立地是烷基(C≤4-20)。在一些实施方案中，x是5-250。在一个实施方案中，x是5-125或x是100-250。在一些实施方案中，PEG脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇。
[0429] 在另一个方面，PEG脂质具有式：
[0430]
[0431] 其中：n1是1至100的整数并且n2和n3各自独立地选自1至29的整数。在一些实施方案中，n1是5、10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，n1是约30至约50。在一些实施方案中，n2是5至23。在一些实施方案中，n2是11至约17。
在一些实施方案中，n3是5至23。在一些实施方案中，n3是11至约17。
[0432] 在一些实施方案中，所述组合物还可包含PEG脂质与树枝状聚合物的摩尔比为约1:1至约1:250。在一些实施方案中，所述摩尔比为约1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:
60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:125、1:150、1:175、1:200、1:225至约1:250或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，所述摩尔比为约1:25或约3:100。
[0433] 3.磷脂
[0434] 在本公开的一些方面，将聚合物与一种或多种磷脂混合以产生树枝状聚合物组合物。在一些实施方案中，也包含磷酸酯基团的任何脂质。在一些实施方案中，磷脂是含有一个或两个长链C6-C24烷基或烯基、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和任选地小有机
分子的结构。在一些实施方案中，有机小分子是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基，例如胆碱或乙醇胺。在一些实施方案中，磷脂是磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂是二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二油酰基磷脂酰乙醇胺。
[0435] 在一些实施方案中，所述组合物还可包含磷脂与树枝状聚合物的摩尔比为约1:10至约1:20。在一些实施方案中，所述摩尔比为约1:20、1:18、1:16、1:14、1:12、1:10、1:8、1:
6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1至约10:1或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，所述摩尔比是约38:50或约1:5。
[0436] D.核酸和核酸基治疗剂
[0437] 1.核酸
[0438] 在本公开的一些方面，所述树枝状聚合物组合物包含一种或多种核酸。在一些实施方案中，所述树枝状聚合物组合物包含与树枝状聚合物以约5:1至约1:100的重量比存在
的一种或多种核酸。在一些实施方案中，核酸与树枝状聚合物的重量比为约5:1、2.5:1、1:
1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，重量比为约1:25或约1:7。另外，应该清楚，本公开不限于本文公开的具体核酸。本发明的范围不限于核酸的任何特定来源、序列或类
型，然而，如本领域普通技术人员可容易地鉴定各种其它来源的核酸中的相关同系物，包括来自非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴、长臂猿、黑猩猩、猿、狒狒、牛、猪、马、绵羊、猫和其它物种)的核酸。预期在本公开中使用的核酸可以包含基于天然存在序列的序列。考虑到遗传密码的简并性，具有至少约50％、通常至少约60％、更通常约70％、最通常约80％、优选至少约90％并且最优选约95％的核苷酸的序列是与天然存在序列的核苷酸序列相同。在
另一个实施方案中，核酸是与天然存在序列互补的序列，或以75％、80％、85％、90％、95％和100％互补。
[0439] 在一些方面，核酸是沉默、互补或取代体内存在的另一序列的序列。长度为17个碱基的序列在人类基因组中应该只出现一次，因此足以指定独特的靶序列。尽管更短的低聚物更容易制备并增加体内可及性，但是确定杂交的特异性涉及许多其它因素。寡核苷酸对
其互补靶标的结合亲和力和序列特异性随着长度的增加而增加。预期将使用具有8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100个或更多个碱基对的示例性寡核苷酸，但是也考虑其它。还考虑了编码250、500、1000、
1212、1500、2000、2500、3000或更长的较长多聚核苷酸
[0440] 本文使用的核酸可以源自基因组DNA，即直接从特定生物体的基因组克隆。然而，在优选的实施方案中，核酸将包含互补DNA(cDNA)。还考虑了cDNA加天然内含子或来自另一基因的内含子；此类工程化分子有时被称为“迷你基因(mini-genes)”。最低限度上，本发明的这些和其它核酸可用作例如凝胶电泳中的分子量标准。
[0441] 术语“cDNA”旨在表示使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或由基因组、非加工或部分加工的RNA模板聚合的DNA相比，使用cDNA的优点是，cDNA主要含有相应蛋白质的编码序列。可能有时候全部或部分基因组序列是优选的，例如当非编码区是最
佳表达所需时，或者当非编码区如内含子将在反义策略中被靶向时。
[0442] 在一些实施方案中，核酸包含一个或多个抑制基因或基因产物表达的反义区段。反义方法利用了核酸倾向于与“互补”序列配对的事实。互补意指多聚核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补性规则进行碱基配对的多聚核苷酸。也就是说，较大的嘌呤将与较小
的嘧啶碱基配对，在DNA情况下形成与胞嘧啶配对的鸟嘌呤(G:C)和与胸腺嘧啶配对的腺嘌
呤(A:T)的组合，或者在RNA情况下形成与尿嘧啶配对的腺嘌呤(A:U)。在杂交序列中包含较少见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等不会干扰配对。
[0443] 用多聚核苷酸靶向双链(ds)DNA导致三螺旋形成；靶向RNA将导致双螺旋形成。反义多聚核苷酸在引入靶细胞中时特异性结合其靶标多聚核苷酸并干扰转录、RNA加工、转
运、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这种反义RNA的DNA可用于在体外或体内(例如在宿主动物(包括人类受试者)内)抑制宿主细胞内的基因转录或翻译或两者。
[0444] 反义构建体可以设计成结合基因的启动子和其它控制区、外显子、内含子或甚至外显子-内含子边界。预期最有效的反义构建体将包括与内含子/外显子剪接点互补的区
域。因此，提出优选的实施方案包括与内含子-外显子剪接点的50-200个碱基内的区域具有互补性的反义构建体。已经观察到一些外显子序列可以被包括在构建体中而不会严重影响
其靶选择性。所包括的外显子物质的量将根据所用的特定外显子和内含子序列而变化。可
以容易地测试是否包括过多外显子DNA，只需通过在体外测试构建体以确定正常细胞功能
是否受到影响或者具有互补序列的相关基因的表达是否受到影响。
[0445] 如上所述，“互补”或“反义”是指在其整个长度上基本上互补并且具有非常少的碱基错配的多聚核苷酸序列。例如，当长度为15个碱基的序列在13或14个位置上具有互补核苷酸时，它们可以被称为互补的。自然地，完全互补的序列将是在其整个长度上完全互补并且没有碱基错配的序列。也考虑具有较低同源性的其它序列。例如，可以设计具有高度同源性的有限区域但也含有非同源区域(例如，核糖酶；参见下文)的反义构建体。这些分子虽然具有小于50％的同源性，但会在适当条件下与靶序列结合。
[0446] 将基因组DNA的部分与cDNA或合成序列组合以形成siRNA或产生特定构建体可能是有利的。例如，当最终构建体需要内含子时，将需要使用基因组克隆。cDNA、siRNA或合成的多聚核苷酸可为构建体的其余部分提供更方便的限制性位点，因此可用于该序列的其余
部分。其它实施方案包括dsRNA或ssRNA，其可用于靶向基因组序列或编码/非编码转录物。
[0447] 在其它实施方案中，所述树枝状聚合物组合物可以包含核酸，该核酸包含一种或多种表达载体，其被用于基因疗法。表达需要在载体中提供适当的信号，并且其包括各种调节元件，例如来自病毒和哺乳动物来源的驱动宿主细胞中感兴趣基因表达的增强子/启动
子。还限定了设计来优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用多种优势药物选择标记来建立表达产物的永久稳定的细胞克隆的条件，以及将药物选择标记的
表达与多肽的表达连接的元件。
[0448] 在整个本申请中，术语“表达构建体”意在包括任何类型的含有编码基因产物的核酸的遗传构建体，其中部分或全部的核酸编码序列能够被转录。转录物可以被翻译成蛋白质，但无需如此。在某些实施方案中，表达包括基因的转录和mRNA翻译成基因产物。在其它实施方案中，表达只包括编码感兴趣基因的核酸的转录。
[0449] 术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可以插入核酸序列以将其引入可以被复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”，这意味着它对于引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源，但是处于宿主细胞核酸内通常不存在该序列的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人造染色体(例如YAC)。本领域技术人员将能够通过标准重组技术来构建载体，这些技术在Sambrook等(1989)和Ausubel等(1994)
中描述，两者都通过引用并入本文。
[0450] 术语“表达载体”是指含有编码能够被转录的基因产物的至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子然后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况下，这些序列不被翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可以含有多种“控制序列”，其指代在特定宿主生物中转录和可能翻译操作性连接的编码序列所必需的核酸序列。除了控制转录
和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可以含有也起到其它功能的核酸序列，并在下
文中进行描述。
[0451] 2.siRNA
[0452] 如上所述，本发明考虑使用一种或多种抑制性核酸来降低基因或基因产物的表达和/或活化。抑制性核酸的实例包括但不限于靶向核酸序列的分子，例如siRNA(小干扰
RNA)、短发夹RNA(shRNA)、双链RNA、反义寡核苷酸、核酶和靶向基因或基因产物的分子如适体。
[0453] 抑制性核酸可抑制基因的转录或阻止基因转录物在细胞中的翻译。抑制性核酸长度可以是16至1000个核苷酸，并且在某些实施方案中长度可以是18至100个核苷酸。
[0454] 抑制性核酸在本领域是众所周知的。例如，在美国专利6,506,559和6,573,099以及美国专利公开2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/
0159161和2004/0064842中描述了siRNA、shRNA和双链RNA，所述文献都通过引用整体并入
本文。
[0455] 自从Fire及其同事在1998年发现RNAi以来，生物化学机制已得到迅速表征。双链RNA(dsRNA)由Dicer切割，所述Dicer是RNA酶III家族核糖核酸酶。该过程产生长度为约21
个核苷酸的siRNA。这些siRNA被并入到多蛋白RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物被引导至靶mRNA。RISC切割互补区域中间的靶mRNA。在哺乳动物细胞中，发现相关的微RNA
(miRNA)是短的RNA片段(约22个核苷酸)。在具有不完全发夹RNA结构的较长(约70个核苷
酸)前体的Dicer介导的切割后产生miRNA。所述miRNA被并入miRNA-蛋白质复合物(miRNP)，其导致靶mRNA的翻译抑制。
[0456] 在设计能够产生RNAi效应的核酸时，需要考虑几个因素，例如siRNA的性质、沉默效应的持久性以及递送系统的选择。为了产生RNAi效应，引入生物体中的siRNA通常将含有外显子序列。此外，RNAi过程具有同源性依赖性，因此必须仔细选择序列以使基因特异性最大化，同时最小化同源但非基因特异性序列之间交叉干扰的可能性。特别地，siRNA在siRNA序列和EphA核苷酸序列的一部分之间表现出大于80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％的同一性。与靶基因具有小于约80％同一性的序列基本上效力较差。因此，siRNA和待抑制基因之间的同一性越大，不相关基因的表达将受到影响的可能性越小。
[0457] 此外，siRNA的大小是重要的考虑因素。在一些实施方案中，本公开涉及包含至少约19-25个核苷酸并且能够调节基因表达的siRNA分子。在本公开的上下文中，siRNA的长度特别小于500、200、100、50、25或20个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度是约25个核苷酸至约35个核苷酸或者约19个核苷酸至约25个核苷酸。
[0458] 为了提高siRNA介导的基因沉默的有效性，针对mRNA上的靶位点选择的指南已经被开发用于siRNA的最佳设计(Soutschek等,2004；Wadhwa等,2004)。这些策略可以允许用
于选择siRNA序列以实现最大基因敲低的合理方法。为了促进siRNA进入细胞和组织，已经
使用了多种载体，包括质粒和病毒载体如腺病毒、慢病毒和逆转录病毒(Wadhwa等,2004)。
[0459] 在抑制性核酸内，核酸的组分不需要是相同类型或始终同质的(例如，抑制性核酸可包含核苷酸和核酸或核苷酸类似物)。通常，抑制性核酸形成双链结构；所述双链结构可由部分或完全互补的两个单独的核酸产生。在本发明的某些实施方案中，抑制性核酸可以
仅包含单个核酸(多聚核苷酸)或核酸类似物并通过与其自身互补(例如形成发夹环)而形
成双链结构。抑制性核酸的双链结构可包含16-500个或更多个连续的核碱基，包括可由其
导出的所有范围。抑制性核酸可包含17至35个连续核碱基，更特别是18至30个连续核碱基，更特别是19至25个核碱基，更特别是20至23个连续核碱基，或20至22个连续核碱基，或21个连续核碱基，其与互补核酸(其可以是同一核酸的另一部分或独立的互补核酸)杂交以形成
双链结构。
[0460] siRNA可以从商业来源、天然来源获得，或者可以使用本领域普通技术人员众所周知的许多技术中的任何一种来合成。例如，预先设计的siRNA的商业来源包括Invitrogen的StealthTMSelect技术(Carlsbad,CA)、 (Austin,TX)和 (Valencia,CA)。
可用于本发明的组合物和方法中的抑制性核酸可以是已经被任何来源发现为基因或基因
产物的有效下调剂的任何核酸序列。
[0461] 在一些实施方案中，本发明提供具有至少19个核苷酸的分离的siRNA分子，其具有至少一条基本上与编码基因的核酸的至少十个但不超过三十个连续核苷酸互补的链，并且
其降低基因或基因产物的表达。在本公开的一个实施方案中，siRNA分子具有至少一条基本上与编码基因或基因产物的mRNA的至少十个但不超过三十个连续核苷酸互补的链。
[0462] 在一个实施方案中，siRNA分子与任何编码靶治疗性蛋白的核酸序列的至少10个连续核苷酸具有至少75％、80％、85％或90％同源性，特别是至少95％、99％或100％相似性或同一性，或前述其间的任何百分比(例如，本发明涵盖75％以上、80％以上、85％以上等等，并且所述范围旨在包括其间的所有整数)。
[0463] siRNA也可以包含一个或多个核苷酸的改变。这种改变可以包括添加非核苷酸材料，例如添加至19至25个核苷酸的RNA的末端或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)。在某
些方面，RNA分子含有3'-羟基。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可含有修饰的骨架，例如硫代磷
酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它修饰的骨架，或者可含有非天然的核苷间键。
siRNA的其它修饰(例如2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键和倒置脱氧碱基残基并入)可见于美国公开2004/0019001和美国专利6,673,611(其各自通过引用整体并入本文)。总而
言之，上述所有这些改变的核酸或RNA都被称为修饰的siRNA。
[0464] 在一个实施方案中，siRNA能够将特定遗传产物的表达降低至少10％、至少20％、至少30％、或至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更多或上述其间的任何范围。
[0465] 3.CRISPR/CAS
[0466] CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)是含有碱基序列的短重复的DNA基因座。每次重复之后接着是以前接触病毒的“间隔DNA”的短区段。在约40％的测序真细菌基因组和90％的测序古细菌中存在CRISPR。CRISPR通常与编码与CRISPR相关蛋白的cas基因相关。
CRISPR/Cas系统是一种原核免疫系统，其赋予对外源遗传元件如质粒和噬菌体的抗性并提
供一种获得性免疫形式。CRISPR间隔序列在真核生物中识别并沉默这些外源遗传元件，如
RNAi。
[0467] 1987年首次描述了细菌大肠杆菌(Escherichia coli)的重复序列。在2000年，在另外的细菌和古细菌中鉴别出类似的成簇重复序列，并且称为短规律间隔重复序列
(SRSR)。SRSR在2002年被重新命名为CRISPR。一组基因(一些编码推定的核酸酶或解旋酶蛋白)被发现与CRISPR重复序列(cas，或CRISPR相关基因)相关。
[0468] 2005年，三位独立研究人员证明CRISPR间隔序列与几种噬菌体DNA和染色体外DNA如质粒具有同源性。这表明CRISPR/cas系统可在细菌的适应性免疫中发挥作用。Koonin及
其同事提出，间隔序列作为RNA分子的模板，类似于使用称为RNA干扰的系统的真核细胞。
[0469] 2007年，Barrangou、Horvath(Danisco的食品工业科学家)等人表明，他们可以通过间隔DNA改变嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)对噬菌体攻击的抗性。Doudna
和Charpentier已独立研究CRISPR相关蛋白，以了解细菌如何在其免疫防御中部署间隔序
列。他们共同研究了一种更简单的CRISPR系统，该系统依赖于称为Cas9的蛋白质。他们发现细菌通过将间隔序列和回文DNA转录为长RNA分子来响应入侵噬菌体，细胞随后使用
tracrRNA和Cas9将其切割成称为crRNA的片段。
[0470] CRISPR于2012年首次在人类细胞培养中作为基因组工程/编辑工具发挥作用。它已广泛用于各种生物体，包括面包酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))、斑马鱼、线虫(秀丽隐杆线虫(C.elegans))、植物、小鼠和其它几种生物体。此外，CRISPR已被修饰为可编程转录因子，使科学家能够靶向并激活或沉默特定基因。成千上万的向导RNA的文库现在可用。
[0471] 2014年3月，MIT研究人员治愈了小鼠的一种罕见的肝脏病症，证明了CRISPR可以逆转活体动物中的疾病症状的第一个证据。自2012年以来，CRISPR/Cas系统已被用于基因
编辑(沉默、增强或改变特定基因)，甚至在真核生物如小鼠和灵长类动物中起作用。通过插入含有cas基因和专门设计的CRISPR的质粒，可以在任何需要的位置切割生物体的基因组。
[0472] CRISPR重复序列的大小范围为24至48个碱基对。它们通常显示一些二元对称性，意味着形成诸如发夹的二级结构，但不是真正的回文。重复序列由相似长度的间隔序列隔
开。一些CRISPR间隔序列与来自质粒和噬菌体的序列完全匹配，但一些间隔序列与原核生
物的基因组(自靶向间隔序列)相匹配。可以响应于噬菌体感染而快速添加新的间隔序列。
[0473] CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复间隔序列阵列相关联。截至2013年，已经描述了四十种以上不同的Cas蛋白质家族。在这些蛋白质家族中，Cas1似乎在不同的
CRISPR/Cas系统中无处不在。cas基因和重复序列结构的特定组合已被用于定义8种CRISPR
亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与另一种编码与重复序列相关的神秘蛋白质(RAMP)的基因模块相关。单个基因组中可能出现一种以上的
CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的零星分布表明该系统在微生物进化期间受到水平基因转移
的影响。
[0474] 外源DNA显然是由Cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为约30个碱基对)，然后以某种方式插入到靠近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA被组成性
表达，并通过Cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单个外源衍生序列元件组成的小RNA。
RNA指导其它Cas蛋白在RNA或DNA水平沉默外源遗传元件。有证据表明CRISPR亚型之间的功
能多样性。Cse(Cas亚型大肠杆菌)蛋白(在大肠杆菌中称为CasA-E)形成功能复合物
Cascade，其将CRISPR RNA转录物加工成Cascade保留的间隔序列-重复序列单元。在其它原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。有趣的是，在大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体灭活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)和其它原
核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小CRISPR RNA形成功能性复合物，所述小
CRISPR RNA识别和切割互补的靶RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制酶。
[0475] 也参见美国专利公开2014/0068797，其全部内容通过引用并入。
[0476] i.Cas9
[0477] Cas9是一种核酸酶，是专门用于切割DNA的酶，具有两个活性切割位点，每个双螺旋链都有一个切割位点。已经证明，可以禁用一个或两个位点，同时保留Cas9的归巢能力以定位其靶DNA。Jinek将tracrRNA和间隔RNA组合成一个“单向导RNA”分子，其与Cas9混合后可以找到并切割正确的DNA靶标。Jinek等人提出这种合成的向导RNA可能能够用于基因编
辑。
[0478] Cas9蛋白高度富集致病性和共生细菌。CRISPR/Cas介导的基因调节可能有助于调节内源性细菌基因，特别是在细菌与真核宿主的相互作用期间。例如，新凶手弗朗西斯菌
(Francisella novicida)的Cas蛋白Cas9使用独特的小的CRISPR/Cas相关RNA(scaRNA)来
抑制内源性转录物，所述转录物编码对新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)至关重要的细菌脂
蛋白，以抑制宿主反应并促进毒力。
[0479] ii gRNA或sgRNA
[0480] 作为一种RNA引导蛋白，Cas9需要一种短RNA来指导DNA靶标的识别(Mali等,2013a)。尽管Cas9优先询问含有PAM序列NGG的DNA序列，但它可以在此没有原间隔序列靶标的情况下结合。然而，Cas9-gRNA复合物需要与gRNA紧密匹配以产生双链断裂(Cho等,2013；
Hsu等,2013)。细菌中的CRISPR序列在多种RNA中表达，然后进行加工以产生RNA的引导链
(Bikard等,2013)。因为真核系统缺乏加工CRISPR RNA所需的一些蛋白质，所以产生合成构建体gRNA以将用于Cas9靶向的RNA的基本片段组合成用RNA聚合酶III型启动子U6表达的单
个RNA(Mali等,2013a,b)。合成gRNA在最小长度上略超过100bp，并且含有紧接在PAM序列
NGG之前的靶向20个原间隔序列核苷酸的部分；gRNA不包含PAM序列。
[0481] 4.修饰核碱基
[0482] 在一些实施方案中，本公开的核酸包含一个或多个包含修饰的糖部分的修饰核苷。包含一个或多个糖修饰的核苷的此类化合物可具有所需的性质，例如相对于仅包含含
有天然存在糖部分的核苷的寡核苷酸，增强的核酸酶稳定性或增加的与靶核酸的结合亲和
力。在一些实施方案中，修饰的糖部分是被取代的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。这种糖替代物可包含一个或多个对应于取代糖部分的取代。
[0483] 在一些实施方案中，修饰的糖部分是包含一个或多个非桥连糖取代基的取代糖部分，包括但不限于在2'和/或5'位的取代基。适合于2'位的糖取代基的实例包括但不限于：
2'-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，2'位的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O--C1-C10烷基、O--C1-C10取代烷基；
OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)和O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H，或被取代或未被取代的C1-C10烷基。5'位上的糖取代基的实例包括但不限于：
5'-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5'-甲氧基。在一些实施方案中，取代糖包含多于一个的非桥连糖取代基，例如T-F-5'-甲基糖部分(关于另外的5',2'-双取代的糖部分和核苷，参见例
如PCT国际申请WO 2008/101157)。
[0484] 包含2'-取代的糖部分的核苷被称为2'-取代的核苷。在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S或N(Rm)-烷基；O、S或N(Rm)-烯基；O、S或N(Rm)-炔基；O-烷基烯基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)或O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H，氨基保护基或者被取代或未被取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可以进一步被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、硫醇、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
[0485] 在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2—CH＝CH2、O--CH2—CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代的乙酰胺(O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基或者被取代或未被取代的C1-C10烷基。
[0486] 在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有2'-取代基的糖部分，所述2'-取代基选自F、OCF3、O--CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(CH3)2、--O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O--CH2--C(＝O)--N(H)CH3。
[0487] 在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有2'-取代基的糖部分，所述2'-取代基选自F、O--CH3和OCH2CH2OCH3。
[0488] 某些修饰的糖部分包含形成导致双环糖部分的第二个环的桥连糖取代基。在一些这样的实施方案中，双环糖部分包含4'和2'呋喃糖环原子之间的桥。这种4'至2'糖取代基
的实例包括但不限于：--[C(Ra)(Rb)]n--、--[C(Ra)(Rb)]n--O--、--C(RaRb)--N(R)--O--或--C(RaRb)--O--N(R)--；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)--O-2'(LNA)；4'-(CH2)--S-2'；
4'-(CH2)2--O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)--O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)--O-2'及其类似物(参见例如美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)--O-2'及其类似物(参见例如WO2009/006478)；
4'-CH2--N(OCH3)-2'及其类似物(参见例如WO2008/150729)；4'-CH2--O--N(CH3)-2'(参见
例如US2004/0171570，公开于2004年9月2日)；4'-CH2--O--N(R)-2'和4'-CH2--N(R)--O-
2'-，其中每个R独立地是H、保护基或C1-C12烷基；4'-CH2--N(R)--O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(参见美国专利7,427,672)；4'-CH2--C(H)(CH3)-2'(参见例如Chattopadhyaya
等《, 有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,2009,74,118-134)；和4'-CH2--C(＝CH2)-2'及其类似物(参见PCT国际申请WO 2008/154401)。
[0489] 在一些实施方案中，这种4'至2'桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：--[C(Ra)(Rb)]n--、--C(Ra)＝C(Rb)--、--C(Ra)＝N--、--C(＝NRa)--、--C(＝O)--、--C(＝S)--、--O--、--Si(Ra)2--、--S(＝O)x--和--N(Ra)--；其中：
[0490] x是0、1或2；
[0491] n是1、2、3或4；
[0492] 每个Ra和Rb独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、杂环基、被取代的杂环基、杂芳基、被取代的杂芳基、C5-C7脂环基、被取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚砜基(S(＝O)-J1)；并且
[0493] 每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、杂环基、被取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、被取代的C1-C12氨基烷基、或保护基。
[0494] 包含双环糖部分的核苷被称为双环核苷或BNA。双环核苷包括但不限于：(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA(也称为锁核酸或LNA)、(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2--O-2')BNA、(D)氨基氧基(4'-CH2--O--N(R)-2')BNA、(E)氧基氨基(4'-CH2--N(R)--O-2')BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)--O-2')BNA(也称
为受限乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫基(4'-CH2--S-2')BNA、(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-
2')BNA、(I)甲基碳环基(4'-CH2--CH(CH3)-2')BNA、(J)亚丙基碳环基(4'-(CH2)3-2')BNA，和(K)甲氧基(亚乙基氧基)(4'-CH(CH2OMe)-O-2')BNA(也称为受限MOE或cMOE)。
[0495] 其它双环糖部分是本领域中已知的，例如：Singh等《, 化学通讯(Chem.Commun.)》,1998,4,455-456；Koshkin等《, 四面体(Tetrahedron)》,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,2000,97,5633-5638；Kumar等,《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》,1998,8,2219-2222；Singh等,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,1998,63,10035-10039；Srivastava等《, 美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》,129(26)8362-8379(2007年7月4日)；Elayadi等,《研究药物新见
(Curr.Opinion Invens.Drugs)》,2001,2,5561；Braasch等《,化学生物学(Chem.Biol.)》,
2001,8,1-7；Orum等《, 分子疗法新见(Curr.Opinion Mol.Ther.)》,2001,3,239-243；美国专利7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、6,670,461和7,
399,845；WO 2004/106356、WO 1994/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公开No.US 2004/0171570、US 2007/0287831和US 2008/0039618；美国序列号12/129,154、
60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,
844；以及PCT国际申请No.PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。
[0496] 在一些实施方案中，双环糖部分和并有这种双环糖部分的核苷进一步由异构构型限定。例如，包含4'-2'亚甲基-氧基桥的核苷可以呈α-L构型或呈β-D构型。先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')双环核苷已被并入显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等,
《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,2003,21,6365-6372)。
[0497] 在一些实施方案中，被取代的糖部分包含一个或多个非桥连糖取代基和一个或多个桥连糖取代基(例如5'-取代的和4'-2'桥连糖；PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
[0498] 在一些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。在一些这样的实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在一些这样的实施方案中，这种修饰的糖部分还包含如上所述的桥连和/或非桥连取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和在2'位(参见例如公开的美国专利申请US 2005/0130923)和/或5'位的取代。作为另外的实例，已
经描述了具有4'-2'桥的碳环双环核苷(参见例如Freier等《, 核酸研究(Nucleic Acids 
Research)》,1997,25(22),4429-4443；和Albaek等《, 有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,2006,
71,7731-7740)。
[0499] 在一些实施方案中，糖替代物包含具有并非5个原子的环。例如，在一些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。这样的四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含这种修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(HNA)、阿努醇(anitol)核酸(ANA)、甘露醇核
酸(MNA)(参见Leumann,C《生物有机化学与医药化学通讯(J.Bioorg.&Med.Chem)》.(2002)
10:841-854)和氟代HNA(F-HNA)。
[0500] 在一些实施方案中，提供式VII的修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在一些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是甲基。在一些实施方案中，提供式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个是F。在某些实施方案中，R1是氟和R2是H，R1是甲氧基和R2是H，以及R1是甲氧基乙氧基和R2是H。
[0501] 本领域还已知许多其它的双环和三环糖替代物环系统，其可用于修饰核苷以并入反义化合物中(参见例如综述文章：Leumann,J.C《,生物有机化学与医药化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry)》,2002,10,841-854)。
[0502] 也提供了修饰的组合，不限于例如2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其它公开的5',2'-双取代的核苷，参见PCT国际申请WO 2008/101157)和用S代替核糖基环氧原子和在2'位
进一步取代(参见美国专利公开US 2005/0130923)，或者可选地双环核酸的5'-取代(参见
PCT国际申请WO 2007/134181，其中4'-CH2--O-2'双环核苷在5'位被5'-甲基或5'-乙烯基
进一步取代)。也已经描述了碳环双环核苷的合成和制备以及其低聚和生物化学研究(参见
例如Srivastava等,2007)。
[0503] 在一些实施方案中，本发明提供了包含修饰核苷的寡核苷酸。那些修饰的核苷酸可包括修饰的糖、修饰的核碱基和/或修饰的键。选择特定修饰以使得所得寡核苷酸具有所需特征。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。
[0504] 在一些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个未修饰的核碱基。在某些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个修饰的核碱基。
[0505] 在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：如本文所定义的通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大碱基和氟化碱基。如本文所定义的5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟基甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞
嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍
生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤，通用碱基，疏水性碱基，混杂碱基，尺寸扩大碱基和氟化碱基。其它修饰的核碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷
(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G夹如被取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨
基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-13][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲
哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环代替的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟
苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核碱基包括在美国专利3,687,808中公开的那些；在《简明的高分子科学与工程百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And 
Engineering)》,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons,1990,858-859中公开的那些；由
Englisch等,1991公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.,1993公开的那些。
[0506] 教导某些上述修饰核碱基以及其它修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,
432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,
469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,
830,653和6,005,096，所述专利各自通过引用整体并入本文。
[0507] 在一些实施方案中，本发明提供了包含连接的核苷的寡核苷酸。在这些实施方案中，核苷可以使用任何核苷间键连接在一起。核苷间连接基团的两个主要类别由磷原子的
存在或不存在限定。代表性的含磷核苷间键包括但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限
于：亚甲基甲基亚氨基(--CH2--N(CH3)--O--CH2--)、硫代二酯(--O--C(O)--S--)、硫代氨基甲酸酯(--O--C(O)(NH)--S--)；硅氧烷(--O--Si(H)2--O--)；和N,N'-二甲基肼(--CH2--N
(CH3)--N(CH3)--)。与天然磷酸二酯键相比，修饰的键可以用于改变(通常增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在一些实施方案中，具有手性原子的核苷间键可以制备为外消旋混合物或单
独的对映异构体。代表性的手性键包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和不含磷
的核苷间键的制备方法是本领域技术人员熟知的。
[0508] 本文所述的寡核苷酸含有一个或多个不对称中心，因此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构构型，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)或(S)，α或β(例如对于糖端基异构体)，或者(D)或(L)(例如对于氨基酸等)。本文提供的反义化合物中包括所有这些可能的异构体，以及其外消旋和光学纯的形式。
[0509] 中性核苷间键包括但不限于磷酸三酯，甲基膦酸酯，MMI(3'-CH2--N(CH3)--O-5')，酰胺-3(3'-CH2--C(＝O)--N(H)-5')，酰胺-4(3'-CH2--N(H)--C(＝O)-5')，甲缩醛(3'-O--CH2--O-5')和硫代甲缩醛(3'-S--CH2--O-5')。其它中性核苷间键包括非离子键，其包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编《, ACS研讨会系列(ACS Symposium Series)》,580；第3和4章,40-65)。其它中性核苷间键包括包含混合的N、O、S和CH2组分部分的非离子键。
[0510] 还可以在寡核苷酸上的其它位置进行另外的修饰，特别是糖的3'末端核苷酸上的3'位和5'末端核苷酸的5'位。例如，本发明的配体结合的寡核苷酸的一种另外的修饰涉及
将寡核苷酸与一个或多个另外的非配体部分或结合物化学连接，其增强寡核苷酸的活性、
细胞分布或细胞摄取。这些部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等,
1989)，胆酸(Manoharan等,1994)，硫醚如己基-5-三苯甲基硫醇(Manoharan等,1992；
Manoharan等,1993)，硫代胆固醇(Oberhauser等,1992)，脂族链例如十二烷二醇或十一烷
基残基(Saison-Behmoaras等,1991；Kabanov等,1990；Svinarchuk等,1993)，磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵(Manoharan等,
1995；Shea等,1990)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等,1995)，或金刚烷乙酸(Manoharan
等,1995)，棕榈酰基部分(Mishra等,1995)，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等,1996)。
[0511] 教导这种寡核苷酸结合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,
717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,
486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,
779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,
112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,
506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,
451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,
481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，所述专利各自通过引用并入本文。
[0512] E.试剂盒
[0513] 本公开还提供了试剂盒。本文公开的任何组分可以试剂盒形式组合。在一些实施方案中，所述试剂盒包含如上文或权利要求书中所述的树枝状聚合物或组合物。
[0514] 所述试剂盒通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器，其中可以放置组分，并且优选合适地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，所述试剂盒通常还会含有第二、第三或其它额外的容器，其中可以单独放置额外的组分。然而，组分的各种组合可以包含在容器中。在一些实施方案中，所有核酸递送组分都组合在单个容器中。在其它实施方案中，一些或所有的树枝状聚合物递送组分与本聚合物在分开的容器中提
供。
[0515] 本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳各种容器的包装，其紧密密封以用于商业销售。这种包装可包括其中保持所需容器的纸板或注塑或吹塑塑料包装。试剂盒也可包括
使用试剂盒组分的说明书。说明书可包括可以实施的变化。
[0516] F.实施例
[0517] 包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表本发明人发现的技术在本发明的实践中发挥良好的作用，因
此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变并且仍然获得相似或类似的结果，而不背离本
发明的精神和范围。
[0518] 实施例1：材料和仪器
[0519] 1.用于化学合成的材料
[0520] 所有的胺、硫醇和其它未指定的化学品均购自Sigma-Aldrich。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)购自Avanti Lipids。如下所述化学合成脂质PEG2000。按照所
报道的程序(Love等,2010)合成C12-200。所有有机溶剂均购自Fisher Scientific，并用溶剂纯化系统(Innovative Technology)纯化。
[0521] 2.用于体外和体内实验的核酸和其它材料
[0522] 所有的siRNA均购自Sigma-Aldrich。Let-7g miRNA模拟物及其对照模拟物购自Life Technologies的Ambion。达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle 
Media，DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Sigma-Aldrich。OptiMEM、DAPI和Alexa Fluor 488鬼笔环肽购自Life Technologies。ONE-Glo+Tox购自Promega。Biophen FVII购自Aniara 
Corporation。
[0523] siRNA的正义链和反义链的序列如下：
[0524] siLuc(针对荧光素酶的siRNA)。dT是DNA碱基。所有其它都是RNA碱基。
[0525] 正义：5'-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3'(SEQ ID NO:3)
[0526] 反义：3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5'(SEQ ID NO:4)
[0527] siFVII(针对FVII的siRNA)。2'-氟修饰的核苷酸是小写字母。
[0528] 正义：5'-GGAucAucucAAGucuuAc[dT][dT]-3'(SEQ ID NO:1)
[0529] 反义：3'-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT][dT]-5'(SEQ ID NO:2)
[0530] siCTR(作为对照的siRNA)
[0531] 正义：5'-GCGCGAUAGCGCGAAUAUA[dT][dT]-3'(SEQ ID NO:5)
[0532] 反义：3'-UAUAUUCGCGCUAUCGCGC[dT][dT]-5'(SEQ ID NO:6)
[0533] 在对照实验中使用Sigma-Aldrich MISSION siRNA通用阴性对照#1(目录号：SIC001)作为非靶向的siRNA。2'OMe修饰的对照siRNA(Sigma-Aldrich，专有修饰)用于体内研究以减少免疫刺激。
[0534] Cy5.5标记的siRNA(用于成像的siRNA)
[0535] 正义：5'-Cy5.5-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3'(SEQ ID NO:3)
[0536] 反义：3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5'(SEQ ID NO:4)
[0537] Let-7g miRNA模拟物
[0538] Ambion(Life Technologies)mirVana miRNA模拟物(目录号：4464070，产品ID：MC11758，名称：has-let-7g)。确切的序列和修饰未被Ambion公开。模拟物成熟人类Let-7g。
[0539] 阴性对照(CTR)miRNA模拟物
[0540] Ambion(Life Technologies)mirVana miRNA模拟物，阴性对照#1(目录号：4464061)。确切的序列和修饰未被Ambion公开。
[0541] 3.机器人自动化
[0542] 纳米颗粒(NP)制剂和体外筛选在配备有8通道液体处理臂(LiHa)、具有96通道头的多通道臂(MCA)、机器人操纵臂(RoMa)和集成式InfiniTe F/M200Pro微板读取器(Tecan)
的Tecan Freedom EVO 200流体处理机器人上进行。两个集成的定制加热和搅拌化学反应
站(V&P Scientific 710E-3HM系列滚筒搅拌器)提供反应和混合支持。所有操作均在
EVOware Standard软件(Tecan)中编程。
[0543] 4.合成表征
[0544] 1H和13C NMR在Varian 500MHz光谱仪上进行。MS在Voyager DE-Pro MALDI TOF上进行。在配备有UV-vis和蒸发光散射检测器(ELSD)的Teledyne Isco CombiFlash Rf-200i
色谱系统上进行快速色谱法。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(He-Ne激光，λ＝632nm)通过动态光散射(DLS)测量粒度和ζ电位。
[0545] 5.用于体内研究的纳米颗粒制剂
[0546] 用于体内研究的配制的树枝状聚合物纳米颗粒是使用具有人字形快速混合特征的微流体混合仪器(Precision Nanosystems NanoAssemblr)来制备的。如下所述，将树枝
状聚合物、DSPC、胆固醇和脂质PEG2000的乙醇溶液与siRNA的酸性溶液迅速组合。水溶液:
EtOH的典型比率为3:1(体积)，并且典型流速为12mL/分钟。
[0547] 6.模块化可降解树枝状聚合物的自动化体外递送筛选
[0548] 纳米颗粒(NP)制剂和体外筛选在配备有8通道液体处理臂(LiHa)、具有96通道头的多通道臂(MCA)、机器人操纵臂(RoMa)和集成式InfiniTe F/M200Pro微板读取器(Tecan)
的Tecan Freedom EVO 200流体处理机器人上进行。
[0549] 通过使用慢病毒感染来稳定转染荧光素酶基因，随后进行克隆选择，从HeLa细胞(ATCC)得到稳定表达萤火虫荧光素酶的HeLa细胞(HeLa-Luc)。将HeLa-Luc细胞接种(10,
000个细胞/孔)到不透明的白色96孔板(Corning)的每个孔中，并使其在补充有5％FBS的不
含酚红的DMEM中附着过夜。在开始转染之前的第二天，培养基更换为新鲜的含有FBS的培养基。
[0550] G1DD-siLuc纳米颗粒是借助于自动化流体处理机器人以加速发现过程来配制的。所有操作均在EVOware Standard软件中编程。首先，在乙醇中将树枝状聚合物反应溶液从
原始反应浓度稀释至12.5mM。接下来，使用LiHa臂将树枝状聚合物溶液第二次在乙醇中从
12.5mM稀释至1mM。然后，将89.2μL的于乙醇中的脂质混合物加入到96孔透明板中。所述脂质混合物由DSPC(0.0690mM)、胆固醇(0.2622mM)和脂质PEG2000(0.0138mM)在乙醇中组成。
随后，通过LiHa将30.8μL各树枝状聚合物(1mM)加入到96孔板中的脂质混合物中，接着快速混合(15次；75μL混合体积；速度250μL/秒)。LiHa一次添加并混合8个针尖。向第二个透明的
96孔板中，通过LiHa加入50μL在柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.3)中的siLuc(20ng/μL)。然后将30μL乙醇混合物(树枝状聚合物、DSPC、胆固醇、脂质PEG2000)加入到50μL siLuc溶液中，接着快速混合(15次；75μL混合体积；速度250μL/秒)以形成树枝状聚合物纳米颗粒。接下来，加入120μL无菌PBS(1×)并使用LiHa混合以稀释NP并增大pH。随后，将平板重新格式化以允许容易转移至生长中的细胞。最后，使用无菌一次性针尖通过MCA96头将20μL的NP溶液加入到培养细胞中以避免污染。细胞最终接受100ng siLuc(33nM)。在该筛选阶段中，树枝状聚合物与siLuc的摩尔比为100:1。制剂的最终组合物是G1DD:胆固醇:DSPC:脂质PEG2000＝50:
38:10:2(以摩尔计)。将细胞在37℃、5％CO2下温育24小时，然后使用One Glo+Tox测定试剂盒(Promega)分析萤火虫荧光素酶活性和活力。
[0551] 7.用于体内研究的树枝状聚合物-小RNA制剂
[0552] 用于体内研究的配制的树枝状聚合物纳米颗粒是使用具有人字形快速混合特征的微流体混合仪器(Precision Nanosystems NanoAssemblr)制备的。将树枝状聚合物、
DSPC、胆固醇和脂质PEG2000(摩尔比为50:38:10:2)的乙醇溶液与小RNA的酸性溶液快速组
合，得到最终重量比25:1(树枝状聚合物:小RNA)。水溶液:EtOH的典型比率为3:1(体积)，并且典型流速为12mL/分钟。根据所报道的程序(Love等,2010)制备C12-200LNP。将C12-200、DSPC、胆固醇和脂质PEG2000(摩尔比为50:38.5:10:1.5)的乙醇溶液与小RNA的酸性溶液快
速组合，得到最终重量比7:1(C12-200:小RNA)。所有配制的NP通过在具有3.5kD截留值的无菌PBS中透析纯化，并且在体内研究之前通过动态光散射(DLS)测量尺寸。当适用时，通过取少量溶液并遵循其方案，用Ribogreen结合测定法(Invitrogen)测量小RNA的囊封。
[0553] 8.动物研究
[0554] 所有实验均得到德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会的批准，并符合适用的地方、州和联邦法规。雌性C57BL/6小鼠购自Harlan Laboratories
(Indianapolis,IN)。通过将TRE-MYC菌株与LAP-tTA菌株杂交来产生携带MYC驱动的肝脏肿
瘤的转基因小鼠。携带LAP-tTA和TRE-MYC基因型的小鼠用1mg/mL的dox饲养，并且通过撤回dox诱导MYC。进行功率分析以预测达到统计学显著性所需的动物数量。
[0555] 9.小鼠中的体内因子VII沉默
[0556] 对于体内递送筛选，雌性C57BL/6小鼠接受以下物质的尾静脉内注射：PBS(阴性对照，n＝3)或在PBS(总体积为200μL以下)中稀释的含有非靶向siRNA的树枝状聚合物NP
(siCTR，阴性对照，n＝3)或含有抗因子VII siRNA的树枝状聚合物NP(siFVII，n＝3)。48小时后，测量体重增加/减轻并且通过异氟烷吸入对小鼠进行麻醉以通过眼眶后流血采集血
样。用血清分离管(Becton Dickinson)分离血清，并通过显色测定法(Biophen FVII，
Aniara Corporation)分析因子VII蛋白质水平。使用来自PBS注射的小鼠的样品构建标准
曲线，并且通过比较处理组与未处理的PBS对照来确定相对因子VII表达。
[0557] 对于治疗性研究，用上述血液测定法和通过使用收集的肝脏组织的qPCR验证转基因小鼠中的FVII敲低。为了评估统计学显著性，进行双尾Student t检验，置信度为95％。
[0558] 10.生物分布
[0559] 携带肝脏肿瘤的雌性C57BL/6小鼠或转基因小鼠接受200μL的以1mg/kg siRNA含有Cy5.5-siRNA的树枝状聚合物NP的尾静脉内注射。在注射后24小时，使小鼠安乐死并除去器官。通过用具有Cy5.5过滤器设置的IVIS Lumina系统(Caliper Life Sciences)对整个
器官进行成像来评估生物分布。
[0560] 对于共焦成像，将组织冷冻切片(7μm)并使用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟。载玻片用PBS洗涤三次，并在含有1％白蛋白的PBS中封闭30分钟。然后将切片与含有1％白
蛋白的PBS中的Alexa Fluor 488鬼笔环肽(1:200稀释，Life Technologies)温育30分钟。
载玻片用0.1％Tween 20洗涤三次并使用ProLong Gold Antifade(Life Technologies)固
定。使用配备有25倍物镜的LSM 700点扫描共焦显微镜(Zeiss)对切片进行成像。
[0561] 11.体内毒性评估和Let-7g治疗研究
[0562] 将携带肝脏肿瘤的野生型小鼠或转基因小鼠随机分成不同的组。小鼠接受含有siCTR的树枝状聚合物NP的尾静脉内注射。每天监测它们的体重。对于携带肝脏肿瘤的转基因小鼠，进行多次尾静脉注射以模拟重复给药。
[0563] 对于Let-7g治疗研究，携带肝脏肿瘤的转基因小鼠每周一次接受具有Let-7g模拟物或CTR模拟物的树枝状聚合物NP的尾静脉内注射，剂量为1mg/kg，于200μL PBS中，从26日龄至61日龄。使用处理顺序随机化。未进行盲式研究。仔细监测它们的体重、腹部尺寸和存活期。为了评估统计学显著性，进行了具有95％置信度的双尾T检验或Mantel-Cox检验。
[0564] 实施例2：PEG脂质和树枝状聚合物的合成和表征
[0565] 1.含有1,512种第一代可降解树枝状聚合物(G1DD)的文库的合成
[0566] 通过两个依序正交反应合成G1DD。首先，具有不同初始分支中心(IBC)的胺分别与甲基丙烯酸2-(丙烯酰氧基)乙酯(AEMA)的丙烯酸酯基团反应，其中胺与AEMA的摩尔比等于
IBC数(例如，加入2A胺:两当量的AEMA；加入六当量的AEMA)。在50℃下加入5摩尔％丁基化羟基甲苯(BHT)下进行反应24小时。接下来，将每个第一步加合物分别与各硫醇反应，硫醇与加成物的摩尔比等于胺IBC数(例如2A胺第一步加合物：加入两当量的各硫醇；加入6A胺
第一步加合物:六当量的各硫醇)。在60℃下加入5摩尔％二甲基苯基膦(DMPP)催化剂下进
行反应48小时。通过在玻璃小瓶和铝反应块中进行反应，加速了1,512个成员的文库合成。
使用定制加热和搅拌化学反应站(V&P Scientific 710E-3HM系列滚筒搅拌器)。
[0567] 用粗制G1DD进行初始体外递送筛选实验。使用纯化的树枝状聚合物进行后续研究以验证活性。
[0568] 用纯化的G1DD进行所有体内动物实验。使用Teledyne Isco色谱系统，利用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱液，通过中性氧化铝柱上的快速柱色谱法来获得纯化的G1DD。
[0569]
[0570] 根据前面的方法制备更高代的可降解树枝状聚合物(Ma等,2009)。在1A2胺与1当量AEMA在5摩尔％BHT存在下于50℃反应24小时后直接制备1A2-G1。将1A2-G1(4.00g，11.7
毫摩尔)溶解在10mL DMSO中。向上述溶液中加入2-氨基乙硫醇(1.37g，17.5毫摩尔)后，将反应在室温下搅拌30分钟。然后立即将300mL二氯甲烷加入反应溶液中并用冷盐水(50mL×
3)洗涤以除去多余的2-氨基乙硫醇。有机相用硫酸镁干燥并通过旋转蒸发浓缩以直接用于
下一步。将AEMA(4.75g，25.8毫摩尔)和BHT(227mg，1.08毫摩尔)加入到上述溶液中。反应在
50℃下搅拌并通过1H NMR监测。反应完成后，用20mL己烷部分重复洗涤溶液直至通过TLC板分析发现不存在EAMA。将洗涤后的溶液真空干燥，得到粘稠液体1A3-G2直接用于下一步骤。
按照上述两步合成程序使1A3-G2反应，得到粘稠液体1A3-G3直接用于下一步骤。在1A2-G3
(0.5g，0.3毫摩尔)溶解在0.5mL DMSO中后，加入1-辛硫醇(216μL，1.22毫摩尔)和二甲基苯基膦(DMPP)(8.6μL，0.061毫摩尔)。将反应在60℃下搅拌48小时，然后通过用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱液操作中性氧化铝柱进行纯化。获得浅黄色粘稠液体1A2-G3-SC8。
[0571] 3.脂质PEG2000的合成
[0572]
[0573] 将PEG44-OH(80g，40毫摩尔)和吡啶(6.5mL，80毫摩尔)溶解在250mL无水DCM中并在0℃下冷却。在30分钟内加入含甲磺酰氯(15.5mL，200毫摩尔)的50mL DCM，并将混合物在室温下搅拌过夜。再加入100mL DCM，并且有机相用饱和NaHCO3溶液(50mL×3)洗涤，然后用盐水(50mL×3)洗涤。将所得溶液浓缩并且将残余物在异丙醇中重结晶并干燥，得到白色粉末
PEG2000-Ms(74g，93％)。
[0574] 将PEG2000-Ms(35.41g，17.7毫摩尔)溶解在250mL DMF中。然后，将NaN3(12.4g，19.0毫摩尔)加入到溶液中。在氮气下，将反应在50℃下搅拌2天。除去DMF后，将残余物溶解在300mL DCM中并用盐水(50mL×3)洗涤。除去溶剂后，将残余油状物溶解在50mL甲醇中，并且产物用300mL二乙醚沉淀三次，得到呈白色粉末PEG2000-N3的所需化合物(25.55g，
72％)。
[0575] 将炔丙胺(0.50g，9.1毫摩尔)、BHT(191mg，0.91毫摩尔)和EAMA(2.73g，18.2毫摩尔)加入到25mL反应小瓶中。将混合物在50℃下搅拌48小时。将反应物冷却，得到无色油状产物T3-G1，其未经纯化用于下一步反应。
[0576] 4.所选树枝状聚合物的表征
[0577]
[0578] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.38-4.19(br,28H,-OCH2CH2O-),2.90-2.80(br,7H,-C(O)CH(CH3)CH2S-),2.75-2.71(br,14H,-NCH2CH2C(O)-),2.70-2.49(br,28H,-C(O)CH(CH3)
CH2S-,-SCH2-),2.49-2.39(br,36H,-N(CH3)2,-NCH2CH2N(CH2CH2)2NCH2-,-CH2N(CH2-)2),
1.57-1.48(m,8H,-SCH2CH2CH2-),1.37-1.28(br,8H,SCH2CH2CH2-),1.28-1.16(br,53H,-
SCH2CH2(CH2)4CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.85(t,J＝7.1Hz,12H,-(CH2)4CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.92,172.03,62.22,62.17,62.13,62.07,49.06,40.23,40.14,35.36,32.68,
32.56,31.76,29.60,29.14,28.82,22.58,16.85,16.81,14.04。MS(MALDI-TOF,m/z)
C109H196N6O28S7的计算值：2261.21，实验值：2262.43。
[0579]
[0580] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.34-4.21(br,16H,-OCH2CH2O-),2.82-2.76(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),2.73(t,J＝7.1Hz,8H,-C(O)CH2CH2N-),2.70-2.64(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),
2.58-2.51(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),2.51-2.46(m,8H,-CH2CH2S-),2.45-2.40(m,18H,(-C(O)
CH2CH2)2NCH2CH2CH2N(CH2-)2),2.35-2.26(br,4H,-CH2CH2N(CH2-)2),1.65-1.58(br,4H,-
NCH2CH2CH2N-),1.57-1.49(m,8H,-SCH2CH2CH2-),1.37-1.28(br,8H,-SCH2CH2CH2-),1.28-
1.16(br,44H,-SCH2CH2(CH2)4CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.85(t,J＝7.0Hz,12H,-(CH2)4CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.90,172.18,62.18,62.05,49.05,40.14,35.37,32.68,32.40,
31.76,29.60,29.15,28.83,22.60,16.81,14.08。MS(MALDI-TOF,m/z)C78H144N4O16S4的计算值：1520.95，实验值：1521.32。
[0581]
[0582] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.32-4.21(br,16H,-OCH2CH2O-),2.82-2.76(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),2.73(t,J＝7.0Hz,8H,-C(O)CH2CH2N-),2.69-2.62(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),
2.58-2.50(m,4H,-SCH2CH(CH3)-),2.50-2.45(m,8H,-CH2CH2S-),2.45-2.38(m,12H,(-C(O)
CH2CH2)2NCH2-),2.34-2.24(br,4H,-CH2N(CH3)CH2-),2.24-2.00(br,3H,-CH2N(CH3)CH2-)
1.66-1.57(br,4H,-NCH2CH2CH2N-),1.57-1.48(m,8H,-SCH2CH2CH2-),1.37-1.28(br,8H,-
SCH2CH2CH2-),1.28-1.16(br,45H,-SCH2CH2(CH2)4CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.85(t,J＝7.0Hz,
12H,-(CH2)4CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.90,172.18,62.18,62.05,49.00,40.13,
35.36,32.68,32.35,31.76,29.60,29.15,28.83,22.60,16.81,14.04。MS(MALDI-TOF,m/z)
C75H139N3O16S4的计算值：1465.90，实验值：1465.65。
[0583]
[0584] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.34-4.20(br,20H,-OCH2CH2O-),2.82-2.76(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),2.75-2.70(br,10H,-C(O)CH2CH2N-),2.69-2.62(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),
2.60-2.52(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),2.52-2.49(m,10H,-CH2CH2S-),2.49-2.45(br,16H,-
NCH2CH2N-),2.45-2.40(br,10H,-CH2N-),1.57-1.48(br,10H,-SCH2CH2CH2-),1.37-1.28
(br,10H,-SCH2CH2CH2-),1.28-1.16(br,55H,-SCH2CH2(CH2)4CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.87-
0.79(br,15H,-(CH2)4CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.93,172.13,62.28,62.01,
49.04,40.13,35.36,32.68,32.35,31.76,29.60,29.15,28.83,22.59,16.82,14.05。MS
(MALDI-TOF,m/z)C93H173N5O20S5的计算值：1840.13，实验值：1841.37。5A2-SC8也已制备为具有6个臂(下文所示结构)。
[0585]
[0586]
[0587] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.32-4.21(br,20H,-OCH2CH2O-),2.82-2.76(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),2.76-2.70(br,10H,-C(O)CH2CH2N-),2.69-2.62(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),
2.58-2.50(m,5H,-SCH2CH(CH3)-),2.50-2.45(m,10H,-CH2CH2S-),2.45-2.20(br,20H,(-
(CH2)2NCH2-,-CH2NHCH2-),1.66-1.57(br,6H,-NCH2CH2CH2N-),1.57-1.48(br,10H,-
SCH2CH2CH2-),1.37-1.28(br,10H,-SCH2CH2CH2-),1.28-1.16(br,55H,-SCH2CH2(CH2)4CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.82-0.75(br,15H,-(CH2)4CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.98,
172.13,62.28,62.01,49.04,40.13,35.36,32.68,32.35,31.76,29.60,29.15,28.83,
22.61,16.85,14.14。MS(MALDI-TOF,m/z)C94H174N4O20S5的计算值：1839.13，实验值：
1838.97。
[0588]
[0589] 1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.33-4.20(br,24H,-OCH2CH2O-),2.82-2.77(m,6H,-SCH2CH(CH3)-),2.77-2.71(br,12H,-C(O)CH2CH2N-),2.68-2.62(m,6H,-SCH2CH(CH3)-),
2.60-2.52(m,6H,-SCH2CH(CH3)-),2.52-2.48(br,12H,-CH2CH2S-),2.48-2.46(br,12H,-
NCH2CH2N-),2.45-2.40(br,12H,(-CH2)2N-),1.57-1.47(br,12H,-SCH2CH2CH2-),1.37-1.28(br,12H,-SCH2CH2CH2-),1.28-1.16(br,108H,-SCH2CH2(CH2)8CH3,-CHC(CH3)CH2S-),0.87-
0.80(br,18H,-(CH2)8CH3)。13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):174.87,172.07,62.16,62.04,
49.48,40.47,40.11,35.34,32.69,32.42,31.86,29.61,29.58,29.57,29.50,29.29,
29.21,28.85,22.62,16.81,14.06。MS(MALDI-TOF,m/z)C132H246N4O24S6的计算值：2463.65，实验值：2464.52。
[0590] 实施例3：第一代可降解树枝状聚合物(G1DD)的文库设计与合成
[0591] 肝癌是具有挑战性的用于治疗干预的宿主，因为药物引起的肝毒性可能加剧潜在的肝脏疾病(Boyerinas等,2010)。为了实现有效的RNAi介导的治疗，因此必须维持载体的
高效力和低毒性的平衡。这需要一种通用的策略以在尺寸、化学结构和最终物理性质方面
轻松地调节递送载体(图1A)。在一些实施方案中，树枝状聚合物被设计成展现以下特征中
的一种或多种：用于化学和尺寸操纵的最佳单分散材料(Wu等,2004；Carlmark等,2009；
Killops等,2008；Ma等,2009；Franc和Kakkar,2010)。利用正交反应与甲基丙烯酸2-(丙烯酰氧基)乙酯(AEMA)进行依序反应，以通过以下各种参数使第一代可降解树枝状聚合物
(G1DD)多样化：核(C)、键或重复单元(L)，和外周或封端基团(P)(图1B)。在一些实施方案中，选择酯作为起始可降解键，因为聚酯在FDA批准的产品中使用，毒性最小。在每个生长步骤中，酯值增加，这为鉴定具有均衡效力和毒性的可降解树枝状聚合物提供了机会。
[0592] 以前的结果表明，这些正交反应可以构建具有一系列代数的聚酯树枝状聚合物(Ma等,2009)。然而，在利用该策略之前，已证实该方法能够在不经纯化的情况下使用多种化学上不同的胺和硫醇化合物来产生多样化的树枝状聚合物。为了研究这种化学的稳健
性，使用最困难的起始原料即具有六个N-H键作为初始分支中心(IBC)的三(2-氨基乙基)胺
和具有14-碳长度烷基链的十四烷基胺，来测试正交迈克尔加成反应的结构限制。在50℃
下，在5摩尔％丁基化羟基甲苯(BHT)(以抑制自由基形成)存在下24小时后，三(2-氨基乙
基)胺和十四烷基胺都与AEMA中的丙烯酸酯官能团定量和选择性地反应，而AEMA本身在这
些条件下仍未反应(图2和图3)。在第二次正交反应(硫杂迈克尔加成)中，需要二甲基苯基
膦作为催化剂以实现低浓度(最低为125mM)或小规模(平均约20mg)条件的最终产物以及实
现高转化率(根据1H NMR为100％)，以便该材料可以不经纯化用于随后的测试或代扩增(图
4和图5)。一些树枝状聚合物以较大规模重新合成并通过快速色谱法纯化，然后进行体内研究。
[0593] 由于多种递送屏障，小RNA载体通过纳米囊封的效力受多种因素影响，包括pKa、拓扑/结构和疏水性(Siegwart等,2011；Jayaraman等,2012；Schaffert等,2011；Whitehead等,2014)。为了便于鉴定具有高递送效力的可降解树枝状聚合物，通过化学多样化核形成
胺C和外周形成硫醇P，设计了G1DD文库，其具有四个区：核结合-外周稳定化(I区)、核结合-外周结合(II区)、核稳定化-外周稳定化(III区)和核稳定化-外周结合(IV区)(图1C和图
1D)。在I区和II区，RNA结合受到具有一个(1An)至六个(6An)初始分支中心(IBC)的胺调节。
因此，相应的树枝状聚合物含有一至六个分支。在III区和IV区中，RNA-树枝状聚合物NP的稳定化主要随不同长度的烷基链(1Hn和2Hn)而改变。在II区和IV区中，氨基硫醇(SNn)的结合能力主要由不同的胺调节，而在I区和III区中，稳定化随着烷基硫醇(SCn)长度以及羧
基-和羟基-烷基硫醇(SOn)而改变。测试了整个化合物文库的树枝状聚合物的功效(图6)。
[0594] 实施例4：siRNA细胞内递送的体外G1DD筛选
[0595] 递送载体必须克服一系列细胞外和细胞内屏障，以使得小RNA在肿瘤细胞内具有活性。鉴定了可通过筛选1,512个成员G1DD文库以将体外siRNA递送至稳定表达的荧光素酶
的HeLa细胞的能力来介导siRNA克服细胞内屏障的G1DD。将G1DD配制成含有荧光素酶靶向
siRNA(siLuc)和辅助脂质胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和脂质
PEG2000的纳米颗粒(NP)(Akinc等,2008；Semple等,2010)。通过定量荧光素酶减少和细胞
活力来评估细胞内递送潜力(图7-9)。
[0596] 为了从体外数据中提取SAR，我们利用树枝状聚合物启发的树分析过程(图7B和图9B)。在1,512种树枝状聚合物中，有88个介导的荧光素酶沉默>50％，并且整个文库的命中率为6％。当分析所有四个区(I-IV)的命中率时，I区的命中率为10％，而II、III和IV区的命中率分别为0％、2％和3％。这个结果表明，这些具有siRNA结合核和稳定化外周的树枝状聚合物(I区)具有高得多的细胞内siRNA递送潜力。在1区的分支类型中，SO外周的树枝状聚合物的命中率低至1％，而SC外周的树枝状聚合物的命中率高达15％。不希望受任何理论束
缚，据认为来自树枝状聚合物外周的疏水稳定化对于通过纳米囊封将siRNA有效递送到细
胞中是至关重要的。这可能会导致疏水包装增加，从而提供额外的NP稳定性(Leung等,
2012)。在进一步研究了具有结合核和SC外周的这些树枝状聚合物的分支数和分支长度之
后，具有结合核和三个、四个、五个或六个SC5-8分支或SC9-12分支的树枝状聚合物有>25％的机会将siLuc递送至HeLa细胞，其中荧光素酶敲低>50％。通过体外筛选完整的G1DD文库
和树枝状分析过程，鉴定了显示增加的细胞内siRNA递送的树枝状聚合物的群组：具有结合核/SC外周和结合核与3-6个SC5-8或SC9-12分支的群组。
[0597] 实施例5：用于有效体内siRNA递送的可降解树枝状聚合物的鉴定和G2-G4树枝状聚合物的设计
[0598] 已鉴定出能够克服细胞内屏障的树枝状聚合物，接着鉴定了能够克服细胞外屏障以有效地在体内递送siRNA的树枝状聚合物。通过分离这两个过程，可以鉴定克服屏障的化学功能，包括血液稳定性、肝脏(肿瘤)定位、细胞摄取和活性siRNA释放。评估了树枝状聚合物在肝细胞中使因子VII沉默的能力，因为这种凝血因子可以容易地从小血清样品中定量
(Akinc等,2008；Semple等,2010)。选择命中的可降解树枝状聚合物中的26种以最大化化学多样性：22种基于树枝状分析过程具有优化的化学结构，而另外4种(2A2-SC14、2A6-SC14、
2A9-SC14和6A1-SO9)是基于其高细胞内siRNA递送能力选择的。用抗因子VII siRNA
(siFVII)配制树枝状聚合物，并以1mg siFVII/kg的剂量静脉内注射到小鼠中。在注射后3
天定量FVII活性。尽管体外效力很高，但2A2-SC14、2A6-SC14、2A9-SC14、6A1-SO9和大多数三分支树枝状聚合物仅显示最小的体内FVII敲低(图3A)。包含结合核和四个、五个或六个
SC8或SC12分支的树枝状聚合物表现出较高的敲低。基于这些研究，SC8分支树枝状聚合物
通常比SC12分支化合物更有效。
[0599] 根据体外和体内高通量筛选结果，我们询问现在是否可以使用SAR信息来合理设计具有预测活性的树枝状聚合物，以验证我们的方法。使用以下两种策略制备了一系列可
降解的树枝状聚合物：(I)通过选择具有五个或六个IBC的多胺；和(II)通过树枝状聚合物
代扩增来增加分支(图10)。选择两种天然胺，亚精胺(5个IBC)和精胺(6个IBC)来实施策略
I。关于策略II，选择1A2(一个IBC)、2A2和2A11(两个IBC)、3A3和3A5(三个IBC)以及4A1和
4A3(四个IBC)以通过代扩增产生具有多个分支的可降解树枝状聚合物(图10C和图11)。对
另外24种可降解树枝状聚合物进行评估(图10C)以进一步研究体内SAR。代扩增后，1A2(一
个IBC)、2A2(两个IBC)和3A3和3A5(三个IBC)的具有四个或六个SC分支的更高代树枝状聚
合物具有良好的体内siRNA递送至肝细胞，而具有八个分支的树枝状聚合物活性较低。该过程转化了在体外筛选中无活性的胺核，然后合理设计出显示体内活性的更高代树枝状聚合
物。
[0600] 实施例6：可降解树枝状聚合物在携带MYC驱动的肝脏肿瘤的小鼠中的体内毒性评估
[0601] 为了鉴定具有肝癌治疗所需的低毒性和高效力的所需平衡的可降解树枝状聚合物，选择可降解树枝状聚合物来评估其体内毒性。并行地，我们分析了C12-200类脂质LNP，并选择作为以前在小鼠和非人类灵长类动物中表现出强效的非水解系统的最佳实例(Love
等,2010)。类脂质作为一类，是临床研究前沿的基准材料(Kanasty等,2013；Love等,2010；
Sahay等,2013)。非免疫原性对照siRNA用于最好地评估单个树枝状聚合物本身的毒性。树
枝状聚合物NP以25:1的重量比(树枝状聚合物:siCTR)配制，比为了更好地探测毒性所需的
量更高。使用与先前报道相同的制剂参数制备C12-200LNP(Love等,2010)。表征每种NP在
PBS缓冲液中的大小和ζ电位。它们都具有相似的尺寸，直径为64-80nm，并且它们的表面电荷接近中性(图12A和图12B)。每种配制的NP都是以4mg siCTR/kg剂量(100mg树枝状聚合
物/kg或28mg C12-200/kg)静脉内注射到野生型小鼠中。在评估体内毒性的许多不同方式
中，体重减轻可以用作简单的信息性参数。在正常小鼠中，所选NP(包括C12-200对照LNP)的体重变化最小。然而，在候选物中，被注射有5A2-SC8和6A3-SC12的小鼠经历更快的恢复并且在第一天后正常增重。
[0602] 基于这些结果，选择5A2-SC8和6A3-SC12以进一步评估其在具有单次和多次注射的携带侵袭性肝脏肿瘤的慢性病转基因小鼠中的体内毒性。选择了充分确定的Tet-On MYC
诱导型转基因肝癌模型(图13A)(Nguyen等,2014)。由于当MYC在早期发育时间点过表达时
肿瘤更具侵袭性，MYC在出生后(p0)立即被诱导，其导致迅速生长的肝脏肿瘤。在32日龄
(p32)时，这些携带侵袭性肝脏肿瘤的病态转基因小鼠被注射3mg siCTR/kg剂量(75mg树枝
状聚合物/kg或21mg C12-200/kg)的5A2-SC8或6A3-SC12NP。接受5A2-SC8注射的小鼠在第
一天失去约5％体重并且在第二天迅速恢复到起始体重，而接受6A3-SC12注射的那些小鼠
到第三天仍然失去10％体重并且不能恢复(图12D)。在多次注射后，由于6A3-SC12载体的毒性，与未接受治疗的小鼠相比，这些小鼠早7天死亡(图12E)。与WT小鼠的结果相比，尽管接受的脂质比5A2-SC8注射小鼠少约3倍，但注射C12-200LNP的携带侵袭性肿瘤的小鼠在一天
后体重减轻>20％(图12D)。这些数据表明，化学结构的小变化可以产生巨大的毒性变化。它还表明荷瘤小鼠比健康小鼠对干预更敏感。基于这些结果，5A2-SC8作为可降解树枝状聚合物出现，其具有低毒性(在荷瘤小鼠中耐受性高达75mg/kg)和有效的体内FVII敲低(在1mg 
siFVII/kg下>95％)的平衡。除了与基准化合物相比毒性更低以外，5A2-SC8NP更有效，因为这些树枝状聚合物降低了对剂量限制性毒性的临床关注并实现了更宽的治疗窗口。
[0603] 实施例7：通过系统施用Let-7g miRNA模拟物有效抑制肝脏肿瘤生长
[0604] 为了评估可降解树枝状聚合物NP递送治疗性miRNA模拟物而不引起额外毒性的能力，再次使用在p0诱导的侵袭性MYC转基因肝癌模型(Nguyen等,2014)。这些小鼠患上迅速
生长的癌症，类似于小儿肝母细胞瘤(HB)，这种肿瘤类型与HCC的许多分子特征相同。20天后，从肿块效应中明显可见腹部膨胀，并且肿瘤迅速生长。在没有干预的情况下，小鼠在出生后60天内死亡。鉴于该模型的速度和致命性，成功治疗的机会有限。
[0605] 由于5A2-SC8平衡了体内低毒性和使肝细胞靶FVII沉默的有效性，首先，研究了5A2-SC8NP是否可将siRNA递送至肿瘤细胞中。在41日龄(p41)时，这些转基因小鼠的肝脏布满肿瘤(图14A)。在p40时，以1mg siRNA/kg的剂量向小鼠静脉内注射具有Cy5.5标记的
siRNA的5A2-SC8NP。注射后24小时，荧光成像显示5A2-SC8介导的siRNA在癌性肝脏中积累，而在脾脏和肾脏中仅有少量积累(图14A-14B)。5A2-SC8NP将siRNA递送到正常和转基因肝
脏中，即使癌性肝脏大于正常肝脏(图15A)。
[0606] 为了进一步确认5A2-SC8NP是否可以将siRNA体内递送到肿瘤细胞中，收集肝脏的肿瘤组织并在静脉内注射后24小时进行成像。H&E染色显示肿瘤组织密布细胞核并表现出
癌性表型(图15B)。共焦成像证实5A2-SC8NP能够有效地将标记的siRNA递送到肿瘤细胞中
(图14C)。
[0607] 然后评估5A2-SC8介导的小RNA在这些慢性病转基因小鼠中递送的治疗益处。最重要的miRNA之一是Let-7，一种在许多肿瘤类型中下调的肿瘤抑制子家族(Boyerinas等,
2010；Roush和Slack,2008)。因为已知内源性Let-7g在肝脏HB中下调(Nguyen等,2014)，所以进行测试以确定在这种侵袭性的基因工程小鼠模型中递送Let-7g模拟物是否可以抑制
肝癌的发展。
[0608] 证实了5A2-SC8NP能够在该模型中实现siRNA递送。在收集的肝脏组织中，使用血液测定法(图16A)和通过qPCR，静脉内递送单剂量的siFVII显示FVII蛋白的有效沉默(图
16B)。这种沉默在肿瘤发展起始之后的p26时实现。接下来，将1mg/kg Let-7g以5A2-SC8NP静脉内递送到荷瘤小鼠(p26)。注射后48小时，肝脏组织中的Let-7g表达增加7倍(图16C)。
[0609] 然后，从p26开始治疗方案，其通过每周一次以1mg/kg施用含有Let-7g模拟物或对照模拟物的5A2-SC8NP。在p50，接受Let-7g模拟物的小鼠具有显著较小的腹部和减少的肿
瘤负荷(图16D-16F)。Let-7g造成腹围缩小，定量肿瘤生长(图16E)。通过离体肝脏成像证实了对肿瘤生长的影响(图16F)。最重要的是，从第26天到第61天每周一次递送Let-7g不会影响体重增加(图16G)并显著延长存活期(图16H)。未接受治疗的所有对照小鼠和接受具有
CTR模拟物的5A2-SC8NP的小鼠在60日龄左右死亡。C12-200LNP(Let-7g或对照模拟物)引起
过早死亡，并且需要停止实验。5A2-SC8NP内的Let-7g的递送提供了显著的存活益处，其中一只小鼠活到100天。这些结果表明5A2-SC8可以平衡高的递送功效与低毒性，通过有效抑
制肝脏肿瘤生长而对慢性病转基因小鼠提供显著的治疗益处。
[0610] 实施例8：用于siRNA递送的不同脂质组合物的评估
[0611] 为了评估树枝状聚合物纳米颗粒中的哪些脂质组合物导致改进的siRNA递送，对不同磷脂和PEG-脂质的身份和浓度作出改变。使用三种不同的细胞系(HeLa-Luc、A549-Luc和MDA-MB231-Luc)。细胞以每孔10K个细胞和24小时温育的形式存在。在转染后24小时确定读数。在纳米颗粒中，使用DSPC和DOPE作为磷脂，并且使用PEG-DSPE、PEG-DMG和PEG-DHD作为PEG-脂质。所述组合物含有摩尔比为50:38:10:2的脂质或树枝状聚合物:胆固醇:磷脂:
PEG-脂质。脂质/树枝状聚合物与siRNA的摩尔比为100:1，其中使用100ng剂量。使用
RiboGreen、Cell-titer Fluor和OneGlo测定法来确定这些组合物的有效性。结果显示
HeLa-Luc细胞(图17A)、A549-Luc(图17B)和MDA-MB231-Luc(图17C)中的相对荧光素酶活
性。研究中使用的六种制剂包括：树枝状聚合物(脂质)+胆固醇+DSPC+PEG-DSPE(制剂1)，树枝状聚合物(脂质)+胆固醇+DOPE+PEG-DSPE(制剂2)，树枝状聚合物(脂质)+胆固醇+DSPC+
PEG-DMG(制剂3)，树枝状聚合物(脂质)+胆固醇+DOPE+PEG-DMG(制剂4)，树脂状聚合物(脂
质)+胆固醇+DSPC+PEG-DSPE(制剂5)，和树枝状聚合物(脂质)+胆固醇+DOPE+PEG-DHD(制剂
6)。
[0612] 进行进一步的实验以确定哪些磷脂显示增加的siRNA分子递送。使用HeLa-Luc细胞系，每孔10K个细胞，温育24小时，并在转染后24小时读出。所述组合物含有DOPE或DOPC作为磷脂，以及PEG-DHD作为PEG-脂质。脂质(或树枝状聚合物):胆固醇:磷脂:PEG-脂质的摩
尔比为50:38:10:2，树脂状聚合物(或脂质)与siRNA的摩尔比为200:1。使用Cell-titer 
Fluor和OneGlo测定法对这些组合物进行50ng剂量的测试。这些结果示于图18A和图18B中。
[0613] 实施例9：用于递送sgRNA和其它CRISPR核酸的树枝状聚合物纳米颗粒的评估
[0614] 为了评估组合物递送核酸对于CRISPR/Cas基因编辑，测试了sgRNA和mRNA的递送。建立了可允许快速筛选树枝状聚合物NP和Z120以进行sgRNA递送的细胞系。例如，建立HeLa(宫颈癌)和A549(肺癌)细胞以共表达荧光素酶和Cas9。选择和质量控制得到验证。根据先
前报道的靶向期望的靶基因的第一外显子的方法设计向导RNA。使用确定方案将具有最高
评分的指示切割活性和序列特异性的靶标用于sgRNA制备。商业合成DNA寡核苷酸，退火，通过BsbI消化克隆并连接到含有Cas9的质粒骨架中。体外转录能够分离sgRNA，然后可以将其包装在树枝状聚合物NP中用于递送。针对荧光素酶设计了一系列5种不同的引导序列。通过使用商业试剂选择最佳sgRNA序列的sgLuc-Cas9pDNA转染验证这些引导序列。接下来，我们将sgLuc包装到树枝状聚合物NP中，并评估在HeLa-Luc-Cas9细胞中递送sgRNA的递送。在暴露确定的小时数之后，使用One Glo+Tox(Promega)测量与未处理的细胞相比的荧光素酶和
活力。在典型的实验中，每孔接种10K个细胞，接着温育24小时，加入含有sgLuc的树枝状聚合物纳米颗粒，并在转染后24-48小时读出。这些组合物含有树枝状聚合物、DSPC或DOPE、胆固醇和PEG-脂质的组合。另外，所述组合物含有不同浓度的MgCl2。脂质(或树枝状聚合物):
胆固醇:PEG-脂质的摩尔比为50:38.5:0.5，脂质与核酸(sgRNA)的摩尔比为200:1，剂量为
50ng。此外，使用Cell-titer Fluor和OneGlo测定法获得结果。无磷脂情况下的结果示于图
19中。用存在的磷脂进行类似的研究。在这些组合物中，将磷脂DSPC用于制剂中。使用与上述不含磷脂的组合物相同比率的含磷脂组合物，其摩尔比为50:38.5:10:0.5(脂质/树枝状
聚合物:胆固醇:磷脂:PEG-脂质)，使用相同的给药量。使用RiboGreen、Cell-titer Fluor和OneGlo在两个时间段(24小时和72小时)对这些组合物进行测试。在24小时获得的数据显
示在图20A中，并且在72小时获得的数据显示在图20B中。
[0615] 实施例10：用于mRNA递送的树枝状聚合物纳米颗粒的评估
[0616] 与关于siRNA进行的研究类似地，用本文所述的树枝状聚合物和Z120测试mRNA分子的递送。IGROV1细胞系以每孔4K个细胞的浓度使用，温育24小时，并在转染后24小时和48小时读出。这些组合物含有DSPC、DOPE或无磷脂和PEG-DHD作为PEG-脂质。脂质(或树枝状聚合物):胆固醇:磷脂:PEG-脂质的摩尔比为50:38.5:0(10):2，树枝状聚合物与核酸(mRNA)
的重量比为5:1、10:1、20:1、30:1或40:1，和两种不同的剂量：50ng剂量和100ng剂量。使用Cell-titer Fluor和OneGlo测定法获得结果。这些结果示于图21A(24小时)和图21B(48小
时)中。此外，使用具有20:1比率的N/P和DSPC作为磷脂并且PEG-DHD作为PEG-脂质的纳米颗粒组合物，在图22中显示mCherry mRNA的递送。
[0617] *********************
[0618] 根据本公开内容，在本文公开和要求保护的所有组合物和方法都可以在没有过度实验的情况下进行和执行。尽管本发明的组合物和方法已经根据某些实施方案进行了描
述，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下对组合物和方法以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序作出变化。更具体地说，
显而易见的是，某些化学上和生理学上相关的试剂可以代替本文所述的试剂，同时可实现
相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为是
在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。
[0619] 参考文献
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