相关申请

本申请要求2006年1月24号提交的美国临时申请NO.60/761,708 的权益，上述申请的全部教导都在本文中引作参考。

发明背景

白细胞介素-4(IL-4)是对B细胞、T细胞和包括单核细胞、内皮 细胞和成纤维细胞在内的许多非淋巴细胞有广谱生物效应的多效性细胞 因子。例如IL-4刺激几种IL-2和IL-3依赖细胞株的增殖，诱导主要组 织相容性复合物II类分子在静息B细胞上的表达，并增加人B细胞分 泌IgG4和IgE。IL-4与Th2型免疫应答相关，由Th2细胞生成并促进 Th2细胞的分化。IL-4已与多种疾病相关，如变态反应和哮喘。

白细胞介素-13(IL-13)是诱导免疫球蛋白同种型转换为IgG4和 IgE，CD23上调，VCAM-1表达，并直接激活例如嗜曙红细胞和肥大 细胞的多效性细胞因子。IL-13主要由Th2细胞生成，并抑制LPS刺激 的单核细胞生成炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF、IL-8)。IL-13与 IL-4紧密相关，IL-13与IL-4在氨基酸水平上有20-25％的序列相似性 (Minty et. al.，Nature，363(6417)：248-50(1993))。虽然IL-13的许多活 性与IL-4相似，但IL-13不象IL-4那样对活化的T细胞或T细胞克隆 有促生长作用(Zurawski et al.，EMBO J.12：2663(1993))。

所述细胞表面受体和受体复合物以不同的亲和力与IL-4和/或IL- 13结合。与IL-4和/或IL-13结合的受体和受体复合物的主成份是IL- 4Rα、IL-13Rα1和IL-13Rα2。这些链作为IL-4Rα/IL-13Rα1和IL- 4Rα/IL-13Rα2单体或异二聚体在细胞表面表达。IL-4rα单体与IL-4而 非IL-13结合。IL-13Rα1和IL-13Rα2单体与IL-13而非IL-4结合。IL- 4Rα/IL-13Rα1和IL-4Rα/IL-13Rα2异二聚体与IL-4和IL-13都结合。

Th2型免疫应答促进抗体生成和体液免疫，并被详细说明能排斥细 胞外病原。Th2细胞是Ig生成的介导物(体液免疫)，并生成IL-4、 IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13(Tanaka，et.al.，Cytokine Regulation of Humoral Immunity，251-272，Snapper，ed.，John Wiley and Sons，New York (1996))。Th2型免疫应答通过某些细胞因子(如IL-4、IL-13)和特定 类型的抗体(IgE、IgG4)的生成得以表征，典型的是变应性反应，这 可导致泪溢和哮喘症状的出现，如气道炎症和肺部气道肌细胞收缩。

IL-4和IL-13都是基于其生物功能的治疗上重要的蛋白。IL-4已证 实能抑制自身免疫性疾病，IL-4和IL-13都已证实有增强抗肿瘤免疫应 答的潜能。由于两种细胞因子都与变应性疾病的病因有关，因此这些细 胞因子的抑制可产生治疗效果。然而，使用常规药物仅抑制IL-4或IL- 13，可能不会产生所需的治疗结果，因为这些细胞因子的许多活性和功 能相似。因此，存在对抑制IL-4或IL-13的改进药物和抑制IL-4和IL- 13的单个药物的需求。

发明概述

本发明涉及对IL-4(如人IL-4)具结合特异性的配体，对IL-13 (如人IL-13)具结合特异性的配体，还涉及对IL-4和IL-13(如人IL- 4和人IL-13)具结合特异性的配体。例如，所述配体可包含具有对IL- 4具结合特异性的结合位点的多肽域，具有对IL-13具结合特异性的结 合位点的多肽域，或包含具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽 域和具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽域。

一方面，本发明涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的配体。这样 的配体包含具有对IL-4具结合特异性的结合位点的蛋白部分，以及具 有对IL-13具结合特异性的结合位点的蛋白部分。具有对IL-4具结合 特异性的结合位点的所述蛋白部分，以及具有对IL-13具结合特异性的 结合位点的所述蛋白部分可以是任何合适的结合部分。所述蛋白部分可 以是肽部分、多肽部分或蛋白部分。例如，所述蛋白部分可以由具有对 IL-4或IL-13具结合特异性的结合位点的抗体片段提供，例如对IL-4 或IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。

所述配体可包含蛋白部分，该蛋白部分具有对IL-4具结合特异性 并与IL-4Rα、IL-4Rα的IL-4-结合部分、或抗IL-4的域抗体(dAb)竞 争与IL-4结合的结合位点。在一些实施方案中，所述配体包含具有对 IL-4具结合特异性的蛋白部分(如免疫球蛋白单可变域)，该特异性结 合位点与选自本文公开的下述抗IL-4 dAb的抗IL-4 dAb竞争与IL-4 结合(即DOM9-15(SEQ ID NO：175)、DOM9-17(SEQ ID NO：176)、 DOM9-23(SEQ ID NO：177)、DOM9-24(SEQ ID NO：178)、DOM9-25 (SEQ ID NO：179)、DOM9-27(SEQ ID NO：180)、DOM9-28(SEQ ID NO：181)、DOM9-29(SEQ ID NO：182)、DOM9-30(SEQ ID NO：183)、 DOM91(SEQ ID NO：184)、DOM9-32(SEQ ID NO：185)、DOM9-33 (SEQ ID NO：186)、DOM9-50(SEQ ID NO：187)、DOM9-57(SEQ ID NO：188)、DOM9-59(SEQ ID NO：189)、DOM9-63(SEQ ID NO：190)、 DOM9-67(SEQ ID NO：191)、DOM9-68(SEQID NO：192)、DOM9-70 (SEQ ID NO：193)、DOM9-79(SEQ ID NO：194)、DOM9-82(SEQ ID NO：195)、DOM9-86(SEQ ID NO：196)、DOM9-94(SEQ ID NO：197)、 DOM9-108(SEQ ID NO：198)、DOM9-112(SEQ ID NO：199)、DOM9- 112-1(SEQ ID NO：200)、DOM9-112-2(SEQ ID NO：201)、DOM9-112-3 (SEQ ID NO：202)、DOM9-112-4(SEQ ID NO：203)、DOM9-112-5(SEQ ID NO：204)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：205)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：206)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：207)、DOM9-112-9(SEQ ID 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在进一步的实施方案中，所述配体包含具有对IL-4具结合特异性 的结合位点的蛋白部分(如免疫球蛋白单可变区)，该结合位点与选自 下述的抗IL-4 dAb竞争与IL-4结合：DOM9-15(SEQ ID NO：175)、 DOM9-17(SEQ ID NO：176)、DOM9-23(SEQ ID NO：177)、DOM9-24 (SEQ ID NO：178)、DOM9-25(SEQ ID NO：179)、DOM9-27(SEQ ID NO：180)、DOM9-28(SEQ ID NO：181)、DOM9-29(SEQ ID NO：182)、 DOM9-30(SEQ ID NO：183)、DOM9-31(SEQ ID NO：184)、DOM9-32 (SEQ ID NO：185)、DOM9-33(SEQ ID NO：186)、DOM9-50(SEQ ID NO：187)、DOM9-57(SEQ ID NO：188)、DOM9-59(SEQ ID NO：189)、 DOM9-63(SEQ ID NO：190)、DOM9-67(SEQ ID NO：191)、DOM9-68 (SEQ ID NO：192)、DOM9-70(SEQ ID NO：193)、DOM9-79(SEQ ID NO：194)、DOM9-82(SEQ ID NO：195)、DOM9-86(SEQ ID NO：196)、 DOM9-94(SEQ ID NO：197)、DOM9-108(SEQ ID NO：198)、DOM9-112 (SEQ ID NO：199)、DOM9-112-1(SEQ ID NO：200)、DOM9-112-2(SEQ ID NO：201)、DOM9-112-3(SEQ ID NO：202)、DOM9-112-4(SEQ ID NO：203)、DOM9-112-5(SEQ ID NO：204)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：205)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：206)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：207)、DOM9-112-9(SEQ ID NO：208)、DOM9-112-10(SEQ ID NO：209)、DOM9-112-11(SEQ ID NO：210)、DOM9-112-12(SEQ ID 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NO：247)、DOM9-112-105(SEQ ID NO：248)、DOM9-112-106(SEQ ID NO：249)、DOM9-112-107(SEQ ID NO：250)、DOM9-112-108(SEQ ID NO：251)、DOM9-112-109(SEQ ID NO：252)、DOM9-112-110(SEQ ID NO：253)、DOM9-112-111(SEQ ID NO：254)、DOM9-112-112(SEQ ID NO：255)、DOM9-112-113(SEQ ID NO：256)、DOM9-112-114(SEQ ID NO：257)、DOM9-112-115(SEQ ID NO：258)、DOM9-112-116(SEQ ID NO：259)、DOM9-112-117(SEQ ID NO：260)、DOM9-112-118(SEQ ID NO：261)、DOM9-112-119(SEQ ID NO：262)、DOM9-112-120(SEQ ID NO：263)、DOM9-112-121(SEQ ID NO：264)、DOM9-112-122(SEQ ID NO：265)、DOM9-112-123(SEQ ID NO：266)、DOM9-112-124(SEQ ID NO：267)、DOM9-112-125(SEQ ID NO：268)、DOM9-112-126(SEQ ID NO：269)、DOM9-112-127(SEQ ID NO：270)、DOM9-112-128(SEQ ID NO：271)、DOM9-112-134(SEQ ID NO：272)、DOM9-112-135(SEQ ID NO：273)、DOM9-112-136(SEQ ID NO：274)、DOM9-112-137(SEQ ID NO：275)、DOM9-112-138(SEQ ID NO：276)、DOM9-112-140(SEQ ID NO：277)、DOM9-112-141(SEQ ID NO：278)、DOM9-112-142(SEQ ID NO：279)、DOM9-112-143(SEQ ID NO：280)、DOM9-112-144(SEQ ID 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此外，或在其他实施方案中，所述配体可包含具有对IL-13具结合 特异性的结合位点的蛋白部分，该结合位点与IL-13Rα1、IL-13Rα1的 IL-13结合部分、IL-13Rα2、IL-13Rα2的IL-13结合部分或抗IL-13的 域抗体(dAb)竞争与IL-13结合。所述配体可包含具有对IL-13具结 合特异性的结合位点的蛋白部分(如免疫球蛋白单可变域)，该结合位 点与选自本文公开的下述抗IL-13dAbs的抗IL-13域抗体(dAb)竞争 与IL-13结合(即DOM10-53(SEQ ID NO：967)、DOM10-53-1(SEQ ID NO：968)、DOM10-53-2(SEQ ID NO：969)、DOM10-53-3(SEQ ID NO：970)、DOM10-53-4(SEQ ID NO：971)、DOM10-53-5(SEQ ID NO：972)、DOM10-53-6(SEQ ID NO：973)、DOM10-53-7(SEQ ID NO：974)、DOM10-53-8(SEQ ID NO：975)、DOM10-53-9(SEQ ID NO：976)、DOM10-53-10(SEQ ID NO：977)、DOM10-53-11(SEQ ID NO：978)、DOM10-53-12(SEQ ID NO：979)、DOM10-53-13(SEQ ID NO：980)、DOM10-53-14(SEQ ID NO：981)、DOM10-53-15(SEQ ID NO：982)、DOM10-53-16(SEQ ID NO：983)、DOM10-53-17(SEQ ID NO：984)、DOM10-53-18(SEQ ID NO：985)、DOM10-53-19(SEQ ID NO：986)、DOM10-53-20(SEQ ID NO：987)、DOM10-53-21(SEQ ID NO：988)、DOM10-53-122(SEQ ID NO：989)、DOM10-53-123(SEQ ID NO：990)、DOM10-53-24(SEQ ID NO：991)、DOM10-53-25(SEQ ID NO：992)、DOM10-53-26(SEQ ID NO：993)、DOM10-53-27(SEQ ID 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所述配体还可包含对IL-13具结合特异性的结合位点的蛋白部分 (如免疫球蛋白单可变域)，该结合位点与选自下述的抗IL-13域抗体 (dAb)竞争与IL-13结合：DOM10-236(SEQ ID NO：2129)、DOM10- 238(SEQ ID NO：2130)、DOM10-241(SEQ ID NO：2131)、DOM10-245 (SEQ ID NO：2132)、DOM10-249(SEQID NO：2133)、DOM10-250(SEQ ID NO：2134)、DOM10-251(SEQ ID NO：2135)、DOM10-254(SEQ ID NO：2136)、DOM10-256(SEQ ID NO：2137)、DOM10-259(SEQ ID NO：2138)、DOM10-260(SEQ ID NO：2139)、DOM10-261(SEQ ID NO：2140)、DOM10-263(SEQ ID NO：2141)、DOM10-264(SEQ ID NO：2142)、DOM10-273(SEQ ID NO：2143)、DOM10-278(SEQ ID NO：2144)、DOM10-279(SEQ ID NO：2145)、DOM10-281(SEQ ID NO：2146)、DOM10-282(SEQ ID NO：2147)、DOM10-283(SEQ ID NO：2148)、DOM10-400(SEQ ID NO：2149)、DOM10-401(SEQ ID NO：2150)、DOM10-402(SEQ ID NO：2151)、DOM10-404(SEQ ID NO：2152)、DOM10-406(SEQ ID NO：2153)、DOM10-407(SEQ ID NO：2154)、DOM10-409(SEQ ID NO：2155)、DOM10-410(SEQ ID NO：2156)、DOM10-414(SEQ ID NO：2157)、DOM10-415(SEQ ID NO：2158)、DOM10-416(SEQ ID NO：2159)、DOM10-418(SEQ ID NO：2160)、DOM10-420(SEQ ID NO：2161)、DOM10-422(SEQ ID 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ID NO：2374)、DOM10-53-549(SEQ ID NO：2375)、DOM10-53-547(SEQ ID NO：2376)、DOM10-53-550(SEQ ID NO：2377)、DOM10-53-551(SEQ ID NO：2378)、DOM10-53-560(SEQ ID NO：2379)、DOM10-53-565(SEQ ID NO：2380)、DOM10-53-559(SEQ ID NO：2381)、DOM10-53-561(SEQ ID NO：2382)、DOM10-53-562(SEQ ID NO：2383)、DOM10-53-563(SEQ ID NO：2384)、DOM10-53-564(SEQ ID NO：2385)、DOM10-53-566(SEQ ID NO：2386)、DOM10-53-554(SEQ ID NO：2387)、DOM10-53-552(SEQ ID NO：2388)、DOM10-53-553(SEQ ID NO：2389)、DOM10-53-558(SEQ ID NO：2390)、DOM10-53-556(SEQ ID NO：2391)和DOM10-53-557 (SEQ ID NO：2392)。

在具体实施方案中，所述对IL-4和IL-13具结合特异性的配体包 含具有对IL-4具结合特异性的结合位点的蛋白部分，该结合位点与选 自下述的抗IL-4的域抗体(dAb)竞争与IL-4的结合：DOM9-112-155 (SEQ ID NO：292)、DOM9-112-168(SEQ ID NO：305)、DOM9-112-174 (SEQ ID NO：311)、DOM9-112-199(SEQ ID NO：336)、DOM9-112-200 (SEQ ID NO：337)、DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)、DOM9-155-5(SEQ ID NO：606)、DOM9-155-25(SEQ ID NO：617)、DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-202(SEQ ID NO：339)、DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434)和DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)，并进一步包含具有对IL- 13具结合特异性的结合位点的蛋白部分，该结合位点与选自下述的抗 IL-13域抗体(dAb)竞争与IL-13的结合：DOM10-176-535(SEQ ID NO：1587)、DOM10-53-223(SEQ ID NO：1090)、DOM10-53-234(SEQ ID NO：1101)、DOM10-53-316(SEQ ID NO：1182)、DOM10-53-339(SEQ ID NO：1203)、DOM10-53-344(SEQ ID NO：1208)、DOM10-53-396(SEQ ID NO：1260)、DOM10-53-474(SEQ ID NO：2369)和DOM10-275-1(SEQ ID NO：2241)。

所述对IL-4和IL-13具结合特异性的配体能抑制IL-4与IL-4R的结合， 抑制IL-4的活性，和/或抑制IL-4的活性而基本上不抑制IL-4与IL-4R的结 合。

优选地，所述与IL-4结合的配体(如免疫球蛋白单可变域)抑制IL-4 和IL-4受体(如IL-4Rα)结合，半数抑制浓度(ID50)为≤10μM、≤1 μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤300pM、≤100pM或≤ 10pM。所述IC50优选地用体外受体结合检测确定，例如本文所述的检 测。

还优选的是与IL-4受体结合的配体(如免疫球蛋白单可变域)，其在 合适的体外检测中抑制IL-4诱导的功能，半数中和剂量(ND50)≤10 μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤300pM、≤ 100pM或≤10pM。例如与IL-4受体结合的所述配体可在体内检测，例 如本文所述的检测中抑制IL-4诱导的TF-1细胞(ATCC检索号CRL-2003) 的增殖。

还优选的是与IL-4受体结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域)， 在合适的体外检测，例如本文所述的检测中，以20-50ug/ml HDM刺激4x 106细胞/ml，并加入100nM抗IL-4dAb，该配体抑制尘螨(HDM)诱 导的外周血单核细胞(PBMC)增殖至少约20％，至少约30％，至少约 40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约 90％。

本文所述受体结合检测中，基本上不抑制IL-4和IL-4受体(如IL- 4Rα)结合的配体(如免疫球蛋白单可变域)并不明显抑制IL-4和IL-4受 体结合。例如在本文所述的受体结合检测中，这样的配体可抑制IL-4和 IL-4受体结合，IC50为约1mM或更高，或抑制结合不超过约20％，不超 过约15％，不超过约10％，或不超过约5％。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体可抑制IL-13与IL-13Rα1和/或 IL-13Rα2结合，抑制IL-13活性，和/或抑制IL-13活性而基本上不抑制 IL-13与IL-13Rα1和/或IL-13Rα2的结合。

优选地，与IL-13结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域)抑制IL- 13与IL-13受体(如IL-13Rα1、IL-13Rα2)结合，半数抑制浓度(IC50)≤ 10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤300pM、≤ 100pM或≤10pM。所述IC50优选地通过体外受体结合检测确定，如本 文所述的检测。

还优选的是与IL-13受体结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变 域)，该配体在适当的体内检测中抑制IL-13诱导的功能，半数中和剂量 (ND50)≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤ 300pM、≤100pM、≤10pM、≤1pM≤500fM、≤300fM、≤100fM、≤ 10fM。例如在体内检测，如本文所述的检测中，其中TF-1细胞与终浓度 5ng/ml的IL-13混合，与IL-13受体结合的配体可抑制IL-13诱导的TF-1细胞 (ATCC检索号CRL-2003)增殖。

还优选的是与IL-13受体结合的所述配体，在体外检测，例如本文所 述的检测中，其中1x 105B细胞与10或100nM抗IL-13的dAb共同孵育，该 配体抑制IL-13诱导的B细胞增殖至少约50％，至少约60％，至少约70％， 至少约80％或至少约90％。

基本上不抑制IL-13与IL-13受体(如IL-13Rα1、IL-13Rα2)结合的配 体(如免疫球蛋白单可变域)在本文所述的受体结合检测或夹心ELISA 法中，不明显抑制IL-13与IL-13的结合。例如在本文所述的受体结合检测 中，这样的配体可抑制IL-13与IL-13受体结合，IC50约为1mM或更高， 或抑制结合不超过约20％，不超过约15％，不超过约10％，或不超过约 5％。

在进一步具体实施方案中，对IL-4和IL-13具结合特异性的所述 配体包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域和对IL-13具结 合特异性的免疫球蛋白单可变域，其中对IL-4具结合特异性的免疫球 蛋白单可变域与选自本文所述的抗IL-4 dAb的抗IL-4的域抗体 (dAb)竞争与IL-4的结合。

在进一步具体实施方案中，对IL-4和IL-13具结合特异性的所述 配体包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域和对IL-13具结 合特异性的免疫球蛋白单可变域，其中对IL-13具结合特异性的免疫球 蛋白单可变域与选自本文所述的抗IL-4 dAb的抗IL-13域抗体(dAb) 竞争与IL-13结合。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体可含有对IL-4具结合特 异性的蛋白结合部分(如免疫球蛋白单可变域)，该蛋白结合部分与 IL-4结合的亲和力常数(KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振 子共振测定。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体可含有对IL-13具结合特 异性的蛋白结合部分(如免疫球蛋白单可变域)，该蛋白结合部分与 IL-13结合的亲和力常数(KD)为约100nM至约1pM，由表面等离 振子共振测定。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体能与IL-4结合，亲和力 常数(KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体能与IL-13结合，亲和力 常数(KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体可包含对IL-4具结合特 异性的免疫球蛋白单可变域和对IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可 变域，其中所述免疫球蛋白单可变域选自人VH和人VL。

在一些实施方案中，对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体可 以是IgG样形式，其包含两个对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可 变域，和两个对IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。

在一些实施方案中，对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体包 含抗体Fc区。

在一些实施方案中，对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体包 含IgG恒定区。

本发明还涉及对IL-4具结合特异性的配体，其包含对IL-4具结合 特异性的免疫球蛋白单可变域，其中对IL-4具结合特异性的免疫球蛋 白单可变域与选自本文所述抗IL-4的dAb竞争与IL-4的结合。

例如对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域可含有氨基酸序 列，该氨基酸序列与选自本文所述抗IL-4 dAb的dAb的氨基酸序列具 有至少约85％的氨基酸序列一致性。

对IL-4具结合特异性的所述配体可抑制IL-4与IL-4R的结合，抑 制IL-4的活性和/或抑制IL-4的活性而基本上不抑制IL-4与IL-4R的结 合。

优选地，与IL-4结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域)抑制IL-4 与IL-4受体结合(如IL-4Rα)，半数抑制浓度((IC50)≤10μM，≤1 μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤500pM，≤300pM，≤100pM或 ≤10pM。所述IC50优选用体外受体结合检测，如本文所述的检测确定。

还优选与IL-4结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域)，其在合适 的体外检测中抑制IL-4诱导的功能，半数中和剂量(ND50)≤10μM，≤ 1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤500pM，≤300pM，≤100pM或 ≤10pM。例如与IL-4受体结合的所述配体可在体外检测，如本文所述的 检测中抑制IL-4诱导的TF-1细胞((ATCC检索号CRL-2003)增殖。

还优选的是与IL-4结合的配体(如免疫球蛋白单可变域)，在合适的 体外检测，如本文所述的检测中，其中用20-50ug/ml HDM刺激4x 106细 胞/ml，并加入100nM抗IL-4的dAb，该配体抑制尘螨(HDM)诱导的 外周血单核细胞(PBMC)增殖至少约20％，至少约30％，至少约40％， 或至少约50％，至少约60％，至少约70％，或至少约80％，或至少约 90％。

基本上不抑制IL-4与IL-4受体(如IL-4Rα)结合的配体(如免疫球蛋 白单可变域)在本文所述受体结合检测中，不明显抑制IL-4与IL-4受体结 合。例如在本文所述的受体结合检测中，此种配体可抑制IL-4与IL-4受体 结合，IC50为约1mM或更高，或抑制结合不超过约20％，不超过约 15％，不超过约10％，不超过约5％。

对IL-4具结合特异性的所述配体可包含对IL-4具结合特异性的免 疫球蛋白单可变域，该免疫球蛋白单可变域与IL-4结合的亲和力常数 (KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-4具结合特异性的所述配体可与IL-4结合，亲和力常数 (KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-4具结合特异性的所述配体可包含选自人VH和人VL的对IL- 4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。

在一些实施方案中，对IL-4具结合特异性的所述配体为IgG样形 式，包含至少两个对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。

在一些实施方案中，对IL-4具结合特异性的所述配体包含抗体Fc 区。

在一些实施方案中，对IL-4具结合特异性的所述配体包含IgG恒 定区。

本发明还涉及对IL-13具结合特异性并包含对IL-13具结合特异性 的免疫球蛋白单可变域的配体，其中对IL-13具结合特异性的免疫球蛋 白单可变域与选自本发明所述抗IL-13 dAb的抗IL-13的域抗体 (dAb)竞争与IL-13结合。

例如，对IL-13具结合特异性的所述免疫球蛋白单可变域可包含氨 基酸序列，该氨基酸序列与选自本文所述的抗IL-13dAb的dAb的氨基 酸序列有85％的氨基酸序列一致性。

对IL-13具结合特异性的所述配体可抑制IL-13与IL-13Rα1和/或 IL-13Rα2结合，抑制IL-13的活性，和/或抑制IL-13活性而基本上不 抑制IL-13Rα1和/或IL-13Rα2与IL-13结合。

优选地，与IL-13结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域)抑制 IL-13与IL-13受体(如IL-13Rα1、IL-13Rα2)结合，半数抑制浓度 (IC50)≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤ 300pM、≤100pM或≤10pM。所述IC50优选用体外受体结合检测， 如本文所述的检测确定。

还优选的是与IL-13受体结合的所述配体(如免疫球蛋白单可变域) 在合适的体外检测中抑制IL-13诱导的功能，半数中和剂量(ND50)≤10 μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤300pM、≤ 100pM、≤10pM、≤1pM、≤500fM、≤300fM、≤100fM、≤10fM。 例如，与IL-13受体结合的所述配体在体外检测中可抑制IL-13诱导的TF- 1细胞(ATCC检索号CRL-2003)的增殖，所述体外检测如本文所述的检 测，其中TF-1细胞和终浓度5ng/ml的IL-13混合。

还优选的是与IL-13受体结合的所述配体，其在体外检测中抑制IL- 13诱导的B细胞增殖至少约70％，至少约80％，至少约90％，所述体外检 测如本文所述的检测，其中1x 105B细胞与10或100nM的抗IL-13dAb共 同孵育。

基本上不抑制IL-13与IL-13受体(如IL-13Rα1、IL-13Rα2)结合的配 体(如免疫球蛋白单可变域)在本文所述的受体结合检测或夹心ELISA 中，不明显抑制IL-13和IL-13受体的结合。例如，这样的配体在本文所述 受体结合检测中可抑制IL-13与IL-13受体的结合，IC50为约mM或更 高，或抑制结合不超过约20％，不超过约15％，不超过约10％，或不超过 约5％。

对IL-13具结合特异性的所述配体可含有对IL-13具结合特异性的 免疫球蛋白单可变域，该免疫球蛋白单可变域结合IL-13的亲和力常数 (KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-13具结合特异性的所述配体，结合IL-13的亲和力常数 (KD)为约100nM至约1pM，由表面等离振子共振测定。

对IL-13具结合特异性的所述配体可包含对IL-13具结合特异性的 免疫球蛋白单可变域，该免疫球蛋白单可变域选自人VH和人VL。

在一些实施方案中，对IL-13具结合特异性的所述配体是包含至少 两个对IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变域的IgG样形式。

在一些实施方案中，对IL-13具结合特异性的所述配体包含抗体Fc 区。

在一些实施方案中，对IL-13具结合特异性的所述配体包含IgG恒 定区。

本发明还涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的配体(如融合蛋 白)，该配体包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域，其中 对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域与选自本文所述的抗IL-4 dAb的抗IL-4域抗体(dAb)竞争与IL-4的结合，还包含对IL-13具 结合特异性的免疫球蛋白单可变域，其中对IL-13具结合特异性的免疫 球蛋白单可变域与选自本文所述的抗IL-13 dAb的抗IL-13域抗体 (dAb)竞争与IL-13结合。

例如包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域的所述配体 (如融合蛋白)可包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自本文所述抗- IL-4 dAb的dAb的氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列一致性。

在另一实施例中，包含对IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变 域的所述配体(如融合蛋白)可包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自 本文所述抗-IL-13 dAb的dAb的氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸 序列一致性。

在一些实施方案中，包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可 变域，以及对IL-3具结合特异性的免疫球蛋白单可变域的所述配体 (如融合蛋白)进一步包含接头部分。

本发明还涉及包含具有对IL-4具结合特异性的结合位点的蛋白部 分，其中所述蛋白部分包含氨基酸序列，该氨基酸序列与本文所述的抗 IL-4dAb的CDR3的氨基酸序列相同。

在一些实施方案中，所述配体包含具有对IL-4具结合特异性的结 合位点的蛋白部分，其中所述蛋白部分包含与本文所述的抗IL-4 dAb 的CDR3的氨基酸序列相同的氨基酸序列，还包含与本文所述的抗IL- 4dAb的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR1 序列，该CDR1序列有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR1 序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR2 序列，该CDR2序列有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR2序 列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR3 序列，该CDR3序列有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR3序 列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR1 序列和CDR2序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的 CDR1或CDR2序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR2 序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的 CDR2或CDR3序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR1 序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的 CDR1或CDR3序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，还具有CDR1 序列、CDR2序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗 IL-4 dAb的CDR1、CDR2或CDR3序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域具有CDR2 序列，该序列有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR2序列一 致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域具有CDR3 序列，该序列有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR3序列一 致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域具有CDR1 和CDR2序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR1和 CDR2序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域具有CDR2 和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4dAb的CDR2和 CDR3序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变区具有CDR1 和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-4 dAb的CDR1和 CDR3序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中与IL-4结合的所述免疫球蛋白单可变域具有 CDR1、CDR2和CDR3序列，分别有至少50％的序列与本文公开的抗 IL-4 dAb的CDR1、CDR2和CDR3序列一致。

在一些实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的结合位点的蛋白 部分，其中所述蛋白部分包含与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR3的 氨基酸序列相同的氨基酸序列。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的结合位点的蛋白 部分，其中所述蛋白部分包含与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR3的 氨基酸序列相同的氨基酸序列，该配体还具有与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR1和/或CDR3的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域的氨基酸序列与本 文公开的抗IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该 配体还具有CDR1序列，该序列有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb 的CDR1序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域的氨基酸序列与本 文公开的抗IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该 配体还具有CDR2序列，该序列有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb 的CDR2序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域的氨基酸序列与本 文公开的抗IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该 配体还具有CDR3序列，该序列有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb 的CDR3序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域的氨基酸序列与本 文公开的抗IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该 配体还具有CDR1序列和CDR2序列，分别有至少50％与本文公开的 抗IL-13 dAb的CDR1和CDR2序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该配体还具有 CDR2序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb 的CDR2和CDR3序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该配体还具有 CDR1序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb 的CDR1和CDR3序列一致。

在其他实施方案中，所述配体包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域，其中与IL-13结合的所述免疫球蛋白单可变域与本文公开的抗 IL-4 dAb的氨基酸序列的不同不超过25个氨基酸位置，该配体还具有 CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的 抗IL-13 dAb的CDR1、CDR2和CDR3序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR2序列，该CDR2 序列有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR2序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR3序列，该CDR3 序列有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR3序列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR1和CDR2序 列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR1和CDR2序 列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR2和CDR3序 列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR2和CDR3序 列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR1和CDR3序 列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR1和CDR3序 列一致。

在另一实施方案中，本发明是包含与IL-13结合的免疫球蛋白单可 变域的配体，其中所述免疫球蛋白单可变域包含CDR1、CDR2和 CDR3序列，分别有至少50％与本文公开的抗IL-13 dAb的CDR1、 CDR2和CDR3序列一致。

在其他实施方案中，本文所述的任何配体进一步包含半衰期延长部 分，如聚烷撑二醇部分、血清白蛋白或其片段，转铁蛋白受体或其转铁 蛋白结合部分，或包含增加体内半衰期的多肽结合位点的部分。在一些 实施方案中，所述半衰期延长部分是包含增加体内半衰期的多肽结合位 点的部分，选自亲和体、SpA域、LDL受体A类域、EGF域或 avimer。

在其他实施方案中，所述半衰期延长部分是聚乙二醇部分。

在其他实施方案中，所述半衰期延长部分是包含血清白蛋白或新生 儿Fc受体的亲和体或亲和体片段(如免疫球蛋白单可变域)。

本发明还涉及用于治疗或诊断的本发明的配体，以及本发明的配体 在制备治疗、预防或抑制本发明所述疾病(如变应性疾病、Th2介导的 疾病、哮喘、癌症)的药物中的应用。

本发明还涉及用于治疗、抑制或预防Th2型免疫应答的本发明的 配体。

本发明还涉及包含将治疗有效量的本发明配体施用于对其有需要的 受试者的治疗方法。在一个实施方案中，本发明涉及包含将治疗有效量 的本发明配体施用于对其有需要的受试者，从而抑制Th2型免疫应答 的方法。

在其他实施方案中，本发明涉及包含将治疗有效量的本发明配体施 用于对其有需要的受试者，从而治疗哮喘的方法。

在其他实施方案中，本发明涉及包含将治疗有效量的本发明配体施 用于对其有需要的受试者，从而治疗癌症的方法。

本发明还涉及本发明的任何配体在制备抗IL-4治疗和抗IL-13治 疗联合给药的药物中的用途。在其他实施方案中，本发明涉及将抗IL-4 治疗和抗IL-13治疗施用于受试者的方法，包含通过将治疗有效量的对 IL-4和IL-13具结合特异性的配体施用于受试者，从而实现抗IL-4治 疗和抗IL-13治疗的联合给药。

本发明还涉及包含本发明配体和生理上可接受载体的组合物(如药 物组合物)。在一些实施方案中，该组合物包含静脉、肌肉、腹腔、动 脉内、鞘内、关节内、皮下、肺部、鼻腔、阴道或直肠给药的溶剂。

本发明还涉及包含本发明组合物(如药物组合物)的给药装置。在 一些实施方案中，所述给药装置含有许多治疗有效量的配体。

在一些实施方案中，所述给药装置选自胃肠外给药装置、静脉给药 装置、肌肉内给药装置、腹腔内给药装置、透皮给药装置、肺部给药装 置、动脉内给药装置、鞘内给药装置、关节内给药装置、皮下给药装 置、鼻腔内给药装置、阴道给药装置、直肠给药装置、注射器、透皮给 药装置、胶囊、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、气雾器、弥雾器、干 粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量弥雾器、定量雾化器和导 管。

本发明还涉及编码本发明任何配体的分离的或重组的核酸。在其他 实施方案中，本发明涉及包含本发明所述重组核酸的载体。

本发明还涉及包含本发明所述重组核酸或本发明所述载体的宿主细 胞。

本发明还涉及制备配体的方法，包含将本发明宿主细胞保特在适合 本发明核酸或载体表达的条件下，从而制备配体。在其他实施方案中， 制备配体的方法进一步包含分离所述配体。

本发明还涉及抑制变应原致敏的受试者中外周血单核细胞 (PBMC)增殖的方法，包含将含有本发明配体的药物组合物施用于受 试者。在一些实施方案中，所述变应原选自尘螨、猫变应原、草变应 原、霉菌变应原和花粉变应原。

本发明还涉及抑制受试者B细胞增殖的方法，包含将含有本发明 配体的药物组合物施用于受试者。

本发明还涉及治疗、预防或抑制本文所述疾病(如Th2介导的疾 病、变应性疾病、哮喘、癌症)的药物组合物，包含本文所述的配体活 性成分。

本发明还涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的配体，该配体包含 对IL-4具结合特异性的结合位点的蛋白部分，还包含对IL-13具结合 特异性的结合位点的蛋白部分，其中所述对IL-4具结合特异性的蛋白 结合部分不与本文所述任何抗IL4 dAb竞争结合。

本发明还涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的配体，该配体包含 对IL-4具结合特异性的结合位点的蛋白部分，还包含对IL-13具结合 特异性的结合位点的蛋白部分，其中所述对IL-13具结合特异性的蛋白 结合部分不与本文所述任何抗IL-13 dAb竞争结合。

本发明还涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的配体，其中所述配 体为包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域，和对IL-13具 结合特异性的免疫球蛋白单可变域的融合蛋白，其中所述对IL-4具结 合特异性的免疫球蛋白单可变域与选自DOM9-112-210和DOM9-155- 78的抗IL-4域抗体(dAb)竞争与IL-4的结合，所述对IL-13具结合 特异性的免疫球蛋白单可变域与选自DOM10-208、DOM10-212、 DOM10-213、DOM10-215、DOM10-224、DOM10-270、DOM10- 416、DOM10-236、DOM10-273、DOM10-275、DOM10-276和 DOM10-277的抗IL-13域抗体(dAb)竞争与IL-13结合。

在一些实施方案中，本发明涉及对IL-4具结合特异性的配体，该 配体包含对人IL-4和非人IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。 在优选的实施方案中，所述非人IL-4选自恒河猴IL-4和食蟹猴IL-4。 还优选的是，结合非人IL-4的免疫球蛋白单可变域与结合人IL-4的免 疫球蛋白可变域的结合亲和力的差别不超过系数10、50、100、500或 1000。

在一些实施方案中，本发明涉及对IL-13具结合特异性的配体，该 配体包含对人IL-13和非人IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变 域。在优选的实施方案中，所述非人IL-13选自恒河猴IL-13和食蟹猴 IL-13。还优选的是，结合非人IL-13的免疫球蛋白单可变域与结合人 IL-4的免疫球蛋白可变域的结合亲和力的差别不超过系数10、50、 100、500或1000。

在其他实施方案中，本发明涉及对IL-4和IL-13具结合特异性的 配体，该配体包含对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域和对IL- 13具结合特异性的免疫球蛋白单可变域，其中所述对IL-4具结合特异 性免疫球蛋白单可变域与人IL-4和非人IL-4结合，所述对IL-13具结 合特异性的免疫球蛋白单可变域与人IL-13和非人IL-13结合。在优选 的实施方案中，所述非人IL-4选自恒河猴IL-4和食蟹猴IL-4，所述非 人IL-13选自恒河猴IL-13和食蟹猴IL-13。还优选的是，结合非人IL- 4的免疫球蛋白单可变域与结合人IL-4的免疫球蛋白可变域的结合亲和 力的差别不超过系数10、50、100、500或1000，并且结合非人IL-13 的免疫球蛋白单可变域与结合人IL-13的免疫球蛋白可变域的结合亲和 力的差别不超过系数10、50、100、500或1000。

附图简述

图1A-1U显示的是编码特异性结合人IL-4的人(人(Homo sapiens))VH域抗体(dAb)的几种核苷酸序列。所述核苷酸序列为 SEQ ID NOS：1-174。

图2A-2J显示的是图1A-1U所示核酸序列编码的所述dAb的氨基 酸序列。所述氨基酸序列是SEQ ID NOS：175-348。

图3A-3S显示的是编码特异性结合人IL-4的人(人)Vκ域抗体 (dAb)的几种核苷酸序列。所述核苷酸序列为SEQ ID NOS：349- 499。

图4A-4H显示的是图3A-3S所示核苷酸序列所编码的dAb的氨基 酸序列。所述氨基酸序列为SEQ ID NOS：500-650。

图5A-5Z，5AA-5MM显示的是编码特异性结合人IL-13的人 (人)VH域抗体(dAb)的几种核苷酸序列。所述核苷酸序列为SEQ ID NOS：651-966。

图6A-6Q显示的是图5A-5Z，5AA-5MM所示核酸序列所编码的 dAb的氨基酸序列。所述氨基酸序列为SEQ ID NOS：967-1282。

图7A-7Z，7AA-7BB显示的是编码特异性结合人IL-13的人 (人)Vκ域抗体(dAb)的几种核苷酸序列。所述核苷酸序列为 SEQ ID NOS：1283-1507。

图8A-8L显示的是图7A-7Z，7AA，7BB所示核酸序列编码的 dAb的氨基酸序列。所述氨基酸序列为SEQ ID NOS：1508-1732。

图9A是与大鼠血清白蛋白(RSA)结合的六种Vκs的氨基酸序列 的比对。所比对的氨基酸序列来自被称作DOM7r-1(SEQ ID NO：1736)、DOM7r-3(SEQ ID NO：1737)、DOM7r-4(SEQ ID NO：1738)、DOM7r-5(SEQ ID NO：1739)、DOM7r-7(SEQ ID NO：1740) 和DOM7r-8(SEQIDNO：1741)的Vκs。

图9B是与人血清白蛋白(HSA)结合的六种Vκs的氨基酸序列的 比对。所比对的氨基酸序列来自被称作(SEQ ID NO：1742)、DOM7h-3 (SEQ ID NO：1743)、DOM7h-4(SEQ ID NO：1744)、DOM7h-6(SEQ ID NO：1745)、DOM7h-1(SEQ ID NO：1746)和DOM7h-7(SEQ ID NO：1747) 的Vκs。

图9C是与人血清白蛋白和共有序列(SEQ ID NO：1755)结合的七 种VHs的氨基酸序列的比对。所比对的氨基酸序列来自被称作 DOM7h-22(SEQ ID NO：1748)、DOM7h-23(SEQ ID NO：1749)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：1750)、DOM7h-25(SEQ ID NO：1751)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：1752)、DOM7h-21(SEQ ID NO：1753)和 DOM7h-27(SEQ ID NO：1754)的VHs。

图9D是与人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白结合的三种Vκs的氨 基酸序列的比对。所比对的氨基酸序列来自被称作DOM7h-8(SEQ ID NO：1756)、DOM7r-13(SEQ ID NO：1757)和DOM7r-14(SEQ ID NO：1758)的Vκs。

图10图示了与大鼠血清白蛋白(RSA)结合的Vκs的氨基酸序 列。所示的序列来自被称作DOM7r-15(SEQ ID NO：1759)、DOM7r-16 (SEQ ID NO：1760)、DOM7r-17(SEQ ID NO：1761)、DOM7r-18(SEQ ID NO：1762)、DOM7r-19(SEQ ID NO：1763)的Vκs。

图11A-11B图示了与大鼠血清白蛋白(RSA)结合的VHs的氨基 酸序列。所示的序列来自被称作DOM7r-20(SEQ ID NO：1764)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：1765)、DOM7r-22(SEQ ID NO：1766)、DOM7r- 23(SEQ ID NO：1767)、DOM7r-24(SEQ ID NO：1768)、DOM7r-25(SEQ ID NO：1769)、DOM7r-26(SEQ ID NO：1770)、DOM7r-27(SEQ ID NO：1771)、DOM7r-28(SEQ ID NO：1772)、DOM7r-29(SEQ ID NO：1773)、DOM7r-30(SEQ ID NO：1774)、DOM7r-31(SEQ ID NO：1775)、DOM7r-32(SEQ ID NO：1776)和DOM7r-33(SEQ ID NO：1777)的VHs。

图12图示了WO 2004/041862中公开的与小鼠血清白蛋白结合的 几种驼类(camelid)VHHs的氨基酸序列。序列A(SEQ ID NO：1778)、 序列B(SEQ ID NO：1779)、序列C(SEQ ID NO：1780)、序列D(SEQ ID NO：1781)、序列E(SEQ ID NO：1782)、序列F(SEQ ID NO：1783)、 序列G(SEQ ID NO：1784)、序列H(SEQ ID NO：1785)、序列I(SEQ ID NO：1786)、序列J(SEQ ID NO：1787)、序列K(SEQ ID NO：1788)、 序列L(SEQ ID NO：1789)、序列M(SEQ ID NO：1790)、序列N(SEQ ID NO：1791)、序列O(SEQ ID NO：1792)、序列P(SEQ ID NO：1793)和 序列Q(SEQ ID NO：1794。

图13显示与IL-4(DOM9-112-22、DOM9-44和DOM9-155-1)结 合的一些dAb与IL-4上不同表位结合的传感图。IL-4被固定在表面等 离振子共振芯片上，第一抗IL-4 dAb流经该表面，随后第二dAb流经 该表面。该图显示DOM9-44被结合后DOM9-155-1不与IL-4结合。 类似地，DOM9-155-1被结合后DOM9-44不结合。然而，第三和第四 个峰显示DOM9-44被结合后，还有DOM9-155-1被结合后，DOM9- 112-22与IL-4结合，这表明这些dAb结合在IL-4抗原的不同表位上。

图14A显示了在体外检测中，100nM抗IL-4 dAb(DOM9-44-502) 对尘螨(HDM)诱导的十二个个体供体的外周血单核细胞(PBMC) 增殖的作用。细胞增殖通过测量3[H]-TdR掺入进行评估。加入的抗IL- 4dAb抑制变应原诱导的十二个供体中的十个提供的PBMC的增殖。平 均抑制率为38％。

图14B显示了在体外检测中，100nM抗IL-4 dAb(DOM9-155-11) 对尘螨(HDM)诱导的十二个个体供体的外周血单核细胞(PBMC) 增殖的作用。细胞增殖通过测量3[H]-TdR掺入进行评估。加入的抗IL- 4dAb抑制变应原诱导的十二个供体中的十个提供的PBMC的增殖。平 均抑制率为34％。

图15显示了抗IL-13 dAb DOM10-53-338和DOM10-176-535对 IL-13诱导的B细胞增殖的作用。细胞增殖通过测量3[H]-TdR掺入进 行评估。这两种dAb 10nM时平均抑制率为80％，100nM时平均抑制 率为100％

图16A显示了在IL-4受体结合检测中，与IL-4和IL-13结合的半 衰期延长形式双特异性配体(PEG化DOM9-112(AST) DOM10-53- 343)对IL-4结合的作用。所述双特异性配体(PEG化DOM9-112 (AST)DOM10-53-343)的抗IL-4臂的效价为13nM。dAb DOM9-112 单体的效价为3.5nM。该图表明与所述dAb相比，所述双特异性配体 (PEG化DOM9-112(AST)DOM10-53-343)的效价仅稍有降低。

图16B显示在IL-13受体结合检测中，与IL-4和IL-13结合的半 衰期延长形式双特异性配体(PEG化DOM9-112(AST)DOM10-53- 343)对IL-13结合的作用。所述双特异性配体抗IL-13臂的效价为310 pM，所述dAb DOM10-53-343单体的效价为230pM。该图表明所述 双特异性配体与所述dAb单体的效价大致相同。

图17A显示了在IL-4受体结合检测中，双特异性配体(DOM9- 112(ASTKGPS)DOM10-53-344)对IL-4结合的作用。所述双特异性配 体和dAb DOM9-112单体的抗IL-4臂的效价约为1nM。该图表明所述 双特异性配体和所述dAb单体的效价大致相同。

图17B显示了在IL-13受体结合检测中，双特异性配体(DOM9- 112(ASTKGPS)DOM10-53-344)对IL-13结合的作用。所述双特异性 配体的抗IL-13臂的效价为120pM。所述dAb DOM10-53-344单体效价 为40pM。该图表明所述双特异性配体的效价和所述dAb单体相比， 仅略有降低。

图18A显示了在IL-4受体结合检测中，与IL-4和IL-13结合的双 特异性IgG样形式(IgG：9-44-502x 10-176-535)对IL-4结合的作用。 所述dAb DOM9-44-502单体的效价为4nM，所述双特异性IgG样形 式的效价为13nM。该图表明所述抗IL-4 dAb DOM9-44-502单体形成 所述IgG样形式时，效价降低3-4倍。

图18B显示在所述IL-13夹心ELISA中，与IL-4和IL-13结合的 双特异性IgG样形式(IgG：9-44-502x 10-176-535)对IL-13结合的作 用。所述双特异性IgG样形式和dAb DOM10-176-535单体的效价都是 1nM。

图19A-19Z，19AA-19ZZ，19AAA-19HHH所示为编码特异性结 合人IL-13的人(人)域抗体(dAb)的几种核苷酸序列，以及几种引 物的核苷酸序列。所述核苷酸序列为SEQ ID NOS：1804-2128。

图20A-20，20AA-20CC所示为图19A-19Z，19AA-19ZZ， 19AAA-19HHH中所示的核酸序列编码的dAb的氨基酸序列。所述氨 基酸序列为SEQ ID NOS：2129-2392。

图21A-21E所示为编码特异性结合人IL-4的人(人)域抗体 (dAb)的几种核苷酸序列。所述核苷酸序列为SEQ ID NOS：2393- 2425。

图22A-22C所示为图21A-21E中所示核酸序列编码的dAb的氨基 酸序列。所述氨基酸序列为SEQ ID NOS：2426-2455和SEQ ID NOS：1733-1735。

发明详述

本说明书中以清楚和简捷的方式描述了本发明实施方案，但实施方 案可有不同的组合或拆分，并不偏离本发明，这是本文的意图所在并应 被理解。

本文所用的“配体”指包含具有对所需内源性靶化合物(如IL-4、 IL-13)具结合特异性的结合位点的至少一种肽、多肽或蛋白部分的化 合物。依据本发明的所述配体优选地包含具有不同结合特异性的免疫球 蛋白可变域，并且不含有共同形成靶化合物结合位点的可变域对(即不 包含共同形成IL-4或IL-13结合位点的免疫球蛋白重链可变域和免疫 球蛋白轻链可变域)。优选地，具有对靶标具结合特异性的结合位点的 每种域是对所需靶标(如IL-4、IL-13)具结合特异性的免疫球蛋白单 可变域(如免疫球蛋白单重链可变域(如VH、VHH)，免疫球蛋白单 轻链可变域(如VL))。具有对靶标(如IL-4、IL-13)具结合特异性 的结合位点的每种多肽域还可以包含合适形式的对所需靶标(如IL-4、 IL-13)具结合特异性的抗体或抗体片段(免疫球蛋白单可变域)的一 个或多个互补决定区(CDRs)，这样所述结合域具有对所述靶标的结 合特异性。例如，所述CDRs可移植到合适的蛋白支架或骨架上，如 亲和体、SpA支架、LPL受体A类域或EGF域。进一步地，所述配体 可以如本文所述为二价的(异型二价)或多价的(异型多价)。因此 “配体”包括含有两种dAb的多肽，其中每种dAb与不同的靶标(如 IL-4、IL-13)结合。配体还包括含有与合适形式的不同靶标(或dAb 的所述CDRs)结合的至少两种dAb，例如抗体形式(如IgG样形式、 scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2)或合适的蛋白支架或骨架，例如本文所述的 亲和体、SpA支架、LPL受体A类域、EGF域、avimer和多特异性配 体。

具有对靶标(如IL-4、IL-13)具结合特异性的结合位点的所述多 肽域还可以是含有所需靶标的结合位点的蛋白域，例如蛋白域选自亲和 体、SpA支架、LPL受体A类域、EGF域、avimer(参见如美国专利 申请公开号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)。如果需 要，“配体”可以进一步包含一种或多种其他部分，每种可以独立地是 肽、多肽或蛋白部分或非蛋白部分(如聚烷撑二醇、脂质、糖)。例如 所述配体可进一步包含本文所述的半衰期延长部分(如聚烷撑二醇部 分，含有白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的部分，含有转铁蛋白、转 铁蛋白片段或转铁蛋白变体的部分，与白蛋白结合的部分，与新生儿 Fc受体结合的部分)。

本文所用的“靶标”指具有结合位点的多肽域可与之结合的生物分 子(如肽、多肽、蛋白、脂质或糖)。所述靶标可以是，例如细胞内靶 标(如细胞内蛋白靶标)、可溶性靶标(例如被分泌的蛋白，如IL-4、 IL-13)，或细胞表面靶标(如膜蛋白、受体蛋白)。优选地，所述靶 标是IL-4或IL-13。

“免疫球蛋白单可变域”指独立于其他V域，特异性结合靶、抗 原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VL)；然而，本文所用的免疫球蛋 白单可变域可以与其他可变区或可变域一起的形式出现(如异型多聚 体)，其中所述其他区或域对于所述单免疫球蛋白可变域与抗原结合不 是必须的(即其中所述免疫球蛋白单可变域独立于所述其他可变域结合 抗原)。每种“免疫球蛋白单可变域”不仅包括分离的抗体单可变域多 肽，还包括更大量的含有抗体单可变域多肽序列的一种或多种单体的多 肽。“域抗体”或“dAb”与本文所用的“免疫球蛋白单可变域”多肽 是相同的。免疫球蛋白单可变区域多肽优选哺乳类免疫球蛋白单可变域 多肽，更优选人的，包括啮齿类免疫球蛋白单可变域(例如WO 00/29004中公开的，其内容在此全部引作参考)和驼类(camelid)VHH dAb。本文所用的驼类(camelid)dAb是来自于包括骆驼、大羊驼、羊 驼、单峰驼和原驼的种的免疫球蛋白单可变域多肽，包含天然缺失轻链 (VHH)的重链抗体。类似的dAb可从其他种如护士鲨的单链抗体获 得。优选的配体包含至少两种不同的免疫球蛋白单可变域多肽或至少两 种不同的dAb。

本文所述的免疫球蛋白单可变域(dAb)含有互补决定区(CDR1、 CDR2和CDR3)。Kabat et al.对这些CDR和框架区(FR)的位置以及编号 系统都已进行了定义(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Govemment Printing Office(1991))。基于公知的Kabat氨基酸编 号系统和对CDR的定义，本文公开的VH和VκdAb的CDRs(CDR1、 CDR2、CDR3)的氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。根据所 述的Kabat编号系统，VL(Vκ或Vλ)CDR1为位置24至34，VL CDR2为 位置50至56，VL CDR3为位置89至97，VH CDR1为位置31至35，VH CDR2为位置50至65，VH CDR3为位置95至102。重链CDR-H3具有可变的 长度，在残基H100和H101之间的插入以字母编号至K(即H100、 H100A......H100K、H101)。作为FR4开始的残基103差不多一直是W。

本文所用的“白细胞介素-4”(IL-4)指自然产生的或内源性哺乳 动物IL-4蛋白，以及与自然产生的或内源性的相应哺乳动物IL-4蛋白 (例如重组蛋白、合成蛋白(即采用合成有机化学方法得到的))具有 相同氨基酸序列的蛋白。因此，如本文所定义的，该术语包括成熟IL-4 蛋白、多态或等位基因变体，以及IL-4的其他亚型和前述的修饰的或 未修饰的形式。自然产生的或内源性IL-4包括野生型蛋白如成熟IL- 4、多态或等位基因变体，以及哺乳动物(如人、非人灵长类动物)自 然产生的其他异型和变体。例如可从自然生成IL-4的来源发现和分离 这样的蛋白。这些蛋白以及与自然产生的或内源性相应IL-4具有相同 氨基酸序列的蛋白是以相应哺乳动物命名的。例如，如果相应哺乳动物 是人，则所述蛋白被命名为人IL-4。几种突变IL-4蛋白已为本领域所 知，例如WO 03/038041中所公开的。

本文所用的“白细胞介素-13”(IL-13)指自然产生的或内源性哺 乳动物IL-13蛋白，以及与自然产生的或内源性的相应哺乳动物IL-13 蛋白(例如重组蛋白、合成蛋白(即采用合成有机化学方法得到的)) 具有相同氨基酸序列的蛋白。因此，如本文所定义的，该术语包括成熟 IL-13蛋白、多态或等位基因变体，和IL-13的其他异型(如通过选择 性剪切或其他细胞方法)，以及前述的修饰的或未修饰的形式(如脂基 化、糖基化)。自然产生的或内源性IL-13包括野生型蛋白如成熟IL- 4、多态或等位基因变体，以及哺乳动物(如人、非人灵长类动物)自 然产生的其他异型和变体。例如本文所用的IL-13包括人IL-13变体和 IL-13的其他变体，其中成熟人IL-13位置110处的Arg被Gln取代 (成熟IL-13的位置110对应前体蛋白的位置130)，这与哮喘(变应 性和非变应性哮喘)相关(Heinzmann et al.，Hum Mol Genet.9：549-559 (2000)。例如可从自然生成IL-13的来源发现和分离这样的蛋白。这些 蛋白以及与自然产生的或内源性相应IL-4具有相同氨基酸序列的蛋白 是以对应的哺乳动物命名的。例如，如果相应哺乳动物是人，则所述蛋 白被命名为人IL-13。几种突变IL-13蛋白已为本领域所知，例如WO 03/035847中所公开的。

“亲和力”和“亲合力”为本领域的术语，描述了结合相互作用 力。对于本发明的所述配体，亲合力指细胞上的靶标(如第一细胞表面 靶标和第二细胞表面靶标)和所述配体间的总结合力。亲合力高于所述 单个靶标的各自亲和力的总和。

本文所用的“毒素部分”指包含毒素的部分。毒素是对细胞生理 (如产生细胞坏死、凋亡或抑制细胞分裂)有有害作用或改变细胞生理 的物质。

本文所用的“剂量”指全部一次性(单位剂量)，或给定时间间隔 两次或多次施用于受试者的配体的量。例如，剂量可以指一天(24小 时)(每日剂量)，两天，一周，两周，三周或一个或多个月的过程施 用于受试者(如通过单次给药，或通过两次或多次给药)的配体(例如 包含与IL-4结合的免疫球蛋白单可变域和与IL-13结合的免疫球蛋白 单可变域的配体)的量。所述剂量间隔可以是任何所需的时间量。

本文所用的“互补”指两个免疫球蛋白域属于形成同源对或组的结 构家族，或来自于这样的家族并保持此特性时，即形成互补。例如抗体 的VH域和VL域互补，两个VH不互补，两个VL域不互补。互补域可 以在所述免疫球蛋白超家族的其他成员中发现，例如T细胞受体的Vα 和Vβ(或γ和δ)域。人工域，如基于除非通过基因工程否则不与表 位结合的蛋白支架的域，是非互补的。同样地，基于(例如)免疫球蛋 白域和纤维连接蛋白域的两个域不是互补的。

本文所用的“免疫球蛋白”指保留了含有两个β折叠片，并通常含 有保守二硫键的抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽家族。所述免疫 球蛋白超家族成员涉及体内细胞或非细胞间相互作用的多个方面，包括 在免疫系统内的广泛作用(如抗体、T细胞受体分子等等)，涉及细胞 粘附(如所述的ICAM分子)以及细胞内信号转导(例如受体分子， 如所述PDGF受体)。本发明适用于具有结合域的所有免疫球蛋白超 家族分子。优选地，本发明涉及抗体。

本文所用的“域”指独立于所述蛋白其余部分，保留了其三级结构 的折叠蛋白结构。通常，域是蛋白具有不连续功能性质的原因，在许多 情况下，域可增加、去除或转移到其他蛋白，而不丧失所述蛋白和/或 域的剩余部分的功能。单抗体可变域是包含抗体可变域序列特征的折叠 多肽域。因此它包括完整的抗体可变域和经修饰的可变域，例如其中一 种或多种环已被抗体可变域非特征序列所取代，或已被截断或包含N 或C端延伸的抗体可变域，以及至少部分保留全长域的结合活性和特 异性的可变域折叠片段。因此，每个配体包含至少两种不同的域。

“库”指不同变体的集合，例如多肽的变体，其一级结构有差异。 文库涵盖了优选包含至少1000种成员的多肽库。

“文库”指异质多肽或核酸的混合物。文库由成员细成，每个成员 都有单独的多肽或核酸序列。在这层意义上，“文库”与“库”意思是 相同的。文库成员间序列差异是造成库多样性的原因。文库可以采用多 肽或核酸的简单混合物的形式，也可以是用核酸文库进行转化的有机体 或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。优选地，每种个 体有机体或细胞包含仅一种或有限数量的文库成员。有利的是所述核酸 包含在表达载体中，以允许该核酸编码的多肽的表达。因此优选地文库 可采用宿主有机体种群的形式，每种有机体包含表达载体的一个或多个 拷贝，该表达载体含有核酸形式的文库单个成员，所述核酸能表达生成 其相应的多肽成员。因此宿主有机体的种群有可能编码基因多样性多肽 变体的大库。

本文所用的抗体指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(如Fab、 F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合式构象多特异性抗体、二硫 键连接的scFv、双抗体)，不管从任何物种自然产生，或由重组DNA 技术创造而来，还是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分 离得到都是可以的。

本文所述的“抗原”是与根据本发明的结合域结合的分子。典型 地，抗原与抗体配体结合，能提高抗体的体内应答。抗原可以是多肽、 蛋白、核酸或其他分子。一般来说，对根据本发明的双特异性配体进行 选择以得到特异性针对两个特定靶标(如抗原)的靶标。至于常规抗体 和其片段，由可变的环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)定义的所述抗 体结合位点能与抗原结合。

“表位”是与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位指抗 体的最小结合位置，因此表现为抗体的特异性靶标。至于单域抗体，表 位指与分离的可变域结合的结构单元。

“通用框架”是单抗体框架序列，与Kabat定义的抗体保守序列区 (“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，US Department of Health and Human Services)相对应，或与Chothia and Lesk，(1987)J. Mol.Biol.196：910-917定义的人种系免疫球蛋白库或结构相对应。本发 明提供了单个框架或一套这样的框架的用途，已经发现虽然变化仅发生 在高可变区，但所述框架允许衍生出几乎所有结合特异性。

“半衰期”指体内配体的血清浓度降低50％所需的时间，例如由于 自然机制的配体降解和/或双特异性配体的清除或多价螯合。本发明的 配体通过与抗降解和/或清除或多价螯合的分子结合，在体内稳定，半 衰期延长。典型地，此种分子是自然生成的蛋白，其本身在体内半衰期 长。与对半衰期增加的分子无特异性的类似配体相比，如果配体的功能 活性持续更长一段时间，则其半衰期增加。因此，把对HSA和两种靶 标分子有特异性的配体，和对HAS无特异性，不与HSA结合而与另 一分子结合的相同配体进行比较。例如配体可以与细胞表面的第三个靶 标分子结合。典型地，半衰期增加10％、20％、30％、40％、50％或更 多。增加范围为2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更多倍 的半衰期是可能的。或者或此外，半衰期增加范围最高达30x、40x、 50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x是可能的。

本文所指的“竞争”是指当第二靶标与其同源靶标结合域结合时， 第一靶标与其同源靶标结合域的结合受到抑制。例如结合可受到立体抑 制，比如通过结合域的物理阻断，或通过改变结合域的结构或环境，从 而使结合域对靶标的亲和力降低。

本文所用的“低严格”、“中等严格”、“高严格”或“非常高严 格条件”描述核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可在 Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)， 6.3.1-6.3.6中找到，其全部在此引作参考。含水和非水的方法在上述参 考中有描述，这两种方法皆可使用。具体的杂交条件如下所述：(1) 低严格杂交条件6X氯化钠/枸橼酸钠(SSC)，45℃，随后0.2X SSC，0.1％SDS，至少50℃洗涤两次(低严格条件洗涤温度可增加至 55℃)；(2)中等严格杂交条件6X SSC，约45℃，随后0.2X SSC， 0.1％SDS，60℃洗涤一次或多次；(3)高严格杂交条件6X SSC，约 45℃，随后0.2X SSC，0.1％SDS，65℃洗涤一次或多次；优选(4) 非常严格杂交条件0.5M磷酸钠，7％SDS，65℃，随后0.2X SSC， 1％SDS，65℃洗涤一次或多次。非常严格杂交条件(4)为优选的条 件，除非有其他明确说明，否则应采用非常严格杂交条件。

与本文公开的所述序列相似或同源(例如至少约70％的序列一致 性)的序列也是本发明的一部分。在一些实施方案中，氨基酸水平的序 列一致性可以为约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高。核酸水平的序列一致性可以为 约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或更高。或者，当在选择性杂化条件(如非常 高严格杂化条件)下所述核酸片段会杂化时，则对于所述链的互补存在 基本的一致性。所述核酸可在整个细胞、细胞裂解液或部分纯化或基本 纯化的形式中出现。

两个序列间的“同源性”、“序列一致性”或“相似性”(这些术 语在本发明中可交换使用)的计算如下进行。为最优比较目的对所述序 列进行比对(例如对于最优比对可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的 一个或两者中引入空位，为比较目的非同源性序列可不予考虑)。在优 选实施方案中，为比较之目的被比对的参考序列的长度是所述参考序列 长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少 60％，以及甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。随后对相应氨 基酸位置或核苷酸位置上的所述氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一 序列的位置被第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据 时，则所述分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源 性”等同于氨基酸或核酸“一致性”)。所述两个序列的最优比对必须 引入空位，考虑到空位的数量和每个空位的长度，两个序列间的一致性 百分比是两序列共有的共同位置的数量的函数。本文所述的氨基酸和核 苷酸序列比对和同源性、相似性或一致性优选使用BLAST 2序列算法 和预设参数(Tatusova，T.A.et al.，FEMS Microbiol Lett，174：187-188(1999)) 来处理和确认。Alternatively，the BLAST algorithm(version 2.0)is employed for sequence alignment，with parameters set to default values.或者 采用所述BLAST算法(版本2.0)进行序列比对，参数设为预设值。 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本的局部比对搜索工 具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx采用的渐进搜索算 法；这些程序的有效性归因于使用Karlin and Altschul，1990，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8的统计学方法得到的结果。

除非有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技 术人员通常所理解的具有相同意义(如在细胞培养、分子遗传学、核酸 化学、杂交技术和生物化学中)。分子、遗传和生物化学方法使用标准 技术(一般参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， 2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. 以及Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley & Sons，Inc.，都在此引作参考)，化学方法也使用标准技术。

本发明涉及对IL-4具结合特异性(如人IL-4)的配体，对IL-13 具结合特异性(如人IL-13)的配体以及对IL-4和IL-13具结合特异性 (如人IL-4和人IL-4)的配体。例如所述配体可含有具有对IL-4具结 合特异性的结合位点的多肽域，含有具有对IL-13具结合特异性的结合 位点的多肽域，或含有具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域 和具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽域。

本发明还涉及与人IL-4和非人IL-4(如恒河猴IL-4、食蟹猴IL- 4)具有交叉反应性的配体，与人IL-13和非人IL-13(如恒河猴IL- 13、食蟹猴IL-13)具有交叉反应的配体，与人IL-4、人IL-13、非人 IL-4和非人IL-13(如恒河猴IL-4、恒河猴IL-13、食蟹猴IL-4和食蟹 猴IL-13)具结合特异性的配体。

本发明的所述配体有几种优点。例如，如本文所述所述，配体可被 剪裁从而具有所需的体外血清半衰期。域抗体比常规抗体小很多，与常 规抗体相比给药能获得更好的组织渗透性。因此当给药以治疗疾病如 Th2介导的疾病、哮喘、变应性疾病、癌症(如肾细胞癌)时，dAb和 包含dAb的配体比常规抗体有优势。例如哮喘(变应性哮喘)可以是 IgE介导的或非IgE介导的，可施用对IL-4、IL-13或IL-4和IL-13具 结合特异性的配体以治疗IgE介导的或非IgE介导的哮喘。

类似地，由于IL-4和IL-13生物学活性的重叠和相似性，用结合 并抑制仅一个这些细胞因子的物质进行治疗可能不会在所有情况下产生 所需的效果。因此，可将对IL-4和IL-13具结合特异性的配体施用于 患者(如变应性疾病患者(如变应性哮喘))以提供较之施用单个治疗 药更好的治疗。

在一些实施方案中，所述配体对IL-4具结合特异性，并含有至少 一个对IL-4具结合特异性的免疫球蛋白单可变域。在其他实施方案 中，所述配体对IL-13具结合特异性，并含有至少一个对IL-13具结合 特异性的免疫球蛋白单可变域。在某些实施方案中，所述配体对IL-4 和IL-13具结合特异性，并含有至少一个对IL-4具结合特异性的免疫 球蛋白单可变域和至少一个对IL-13具结合特异性的免疫球蛋白单可变 域。

本发明所述的配体可以是如本文所述的形式。例如，本发明的所述 配体可以形成体内半衰期改变的形式。如果需要，则该配体可如本文所 述进一步包含毒素或毒素部分。在一些实施方案中，所述配体包含表面 活性毒素，例如自由基引发剂(如含硒毒素)或放射性核素。在其他实 施方案中，所述毒素或毒素部分是具有对细胞内靶标具结合特异性的结 合位点的多肽域(如dAb)。在具体实施方案中，所述配体是对IL-4 和IL-13具结合特异性(如人IL-4和人IL-13)的IgG样形式。

一方面，本发明涉及对白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13 (IL-13)具结合特异性的配体，该配体包含具有对IL-4具结合特异性 的结合位点的蛋白部分，以及具有对IL-13具结合特异性的结合位点的 蛋白部分。本发明该方面的对IL-4和IL-13具结合特异性的所述配体 可进一步通过下列的任何一项或任何组合来表征：(1)限制性条件： 具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述蛋白部分不是IL-4受体或 其IL-4结合部分，并且具有对IL-13具结合特异性的结合位点的所述 蛋白部分不是IL-13受体或其IL-13结合部分；(2)限制性条件：对 IL-4具结合特异性的所述结合部分和对IL-13具结合特异性的所述结合 部分每个都是由单个氨基酸链组成；(3)限制性条件：对IL-4具结合 特异性的所述结合部分和对IL-13具结合特异性的所述结合部分都不包 含免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域；(4)限制性条 件：具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述蛋白部分不是与IL-4 结合的抗体或其抗原结合片段，该抗原结合片段包含共同形成IL-4结 合位点的免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域，具有对IL- 13具结合特异性的结合位点的所述蛋白部分不是与IL-4结合的抗体或 其抗原结合片段，该抗原结合片段包含共同形成IL-13结合位点的免疫 球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域。

一方面，本发明涉及对IL-4具结合特异性的配体，包含对IL-4具 结合特异性的结合位点的蛋白部分。本发明该方面的对IL-4具结合特 异性的该配体可进一步通过以下的一项或任何组合来表征：(1)限制 性条件：具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述蛋白部分不是与 IL-4结合的抗体或其抗原结合部分，该抗原结合部分包含共同形成IL- 4结合位点的免疫球蛋白重链单可变域和免疫球蛋白轻链单可变域； (2)限制性条件：具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述蛋白部 分不是IL-4受体或其IL-4结合部分；(3)限制性条件：对IL-4具结 合特异性的所述结合位点由单个氨基酸链组成；(4)限制性条件：对 IL-4具结合特异性的所述结合位点不是由免疫球蛋白重链可变域和免疫 球蛋白轻链可变域组成。

一方面，本发明涉及对IL-13具结合特异性的配体，包含对IL-13 具结合特异性的结合位点的蛋白部分。本发明该方面对IL-13具结合特 异性的所述配体可进一步由下列任何一项或任何组合表征：(1)限制 性条件：具有对IL-13具结合特异性的结合位点的所述蛋白部分不是与 IL-13结合的抗体或其抗原结合部分，该抗原结合部分含有共同形成 IL-13结合位点的免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域； (2)限制性条件：具有对IL-13具结合特异性的结合位点的所述蛋白 部分不是IL-13受体或其IL-13结合部分；(3)限制性条件：对IL-13 具结合特异性的所述结合位点由单个氨基酸链组成；(4)限制性条 件：具有对IL-13具结合特异性的所述结合位点不是由免疫球蛋白重链 可变域和免疫球蛋白轻链可变域组成。

配体形式

本发明的配体如本文所述可形成单特异性、双特异性或多特异性配 体。关于配体形成，也参见WO 03/002609，其全部教导都在此引作参 考。此种双特异性配体包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白单可变 域。此种双特异性配体可包含重和轻链域的组合。例如所述双特异性配 体可包含VH域和VL域，此二者可以以scFv的形式连接在一起(如使 用如Gly4Ser的合适接头)，或形成其双特异性抗体或抗原结合片段 (如F(ab’)2、Fab’、Fab片段)。所述双特异性配体不包含互补VH/VL 对，该互补对形成与抗原或表位都常规结合的双链抗体抗原结合位点。 相反地，所述双形式配体可包含VH/VL互补对，其中所述V域具有不 同的结合特异性。

如果需要则所述配体(如单特异性、双特异性配体)可包含一个或 多个CH或CL域。如果需要还可包括铰链区域。域的这样的组合可以 例如模拟天然配体，如IgG或IgM，或其片段如Fv、scFv、Fab或 F(ab’)2分子。设想如含有VH、VL、CH1和CL域的IgG分子的单臂的 其他结构。所述配体可包含免疫球蛋白(如IgG(如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4)，IgM，IgA，IgD或IgE)或其部分(如Fc部分)的重链 恒定区和/或轻链恒定区(如Cλ，Cκ)。例如所述配体可包含IgG1(如 人IgG1)的CH1，IgG1(如人IgG1)的CH1和CH2，IgG1(如人 IgG1)的CH1、CH2和CH3，IgG1(如人IgG1)的CH2和CH3， IgG1(如人IgG1)的CH1和CH3。

在一个实施例中，本发明的双特异性配体包含仅两个可变域，虽然 一些这样的配体可共同包含在IgG或多体免疫球蛋白，如IgM中。或 者在另一实施方案中，许多双特异性配体可共同形成多聚体。例如两个 不同的双特异性配体共同形成四特异性分子。本领域技术人员应理解本 发明双特异性配体的所述轻链和重链可变区可以在相同的多肽链上，或 者在不同的多肽链上。在所述可变区在不同的多肽链的情况下，它们可 通过接头，通常是柔性接头(如多肽链)、化学连接基团，或本领域所 知的任何其他方法相连接。

配体可形成双或多特异性配体或抗体片段或形成双或多特异性非抗 体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中可包括抗体可变域 或一个或多个其CDR，这样所述结构上的抗原就具有了结合特异性。 本领域已知的各种合适的抗体形式，如双特异性IgG样形式(如嵌合 抗体，人源抗体，人抗体，单链抗体，抗体重链和/或轻链的异二聚 体，任何前述的抗原结合片段(如Fv片段(如单链Fv(scFv)，二硫 键连接的Fv)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段)，单可变域(如 VH、VL、VHH)，dAb，以及任何前述的修饰形式(如通过聚烷撑二醇 (如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合适的聚合物共价连接的 修饰)。参见2003年6月提交的指定美国的PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)，是关于PEG化的单可变域和dAb，制备相同的体内半 衰期增加的PEG化单可变域、dAb单体和多聚物的合适方法，合适的 PEG，优选流体动力学大小的PEG，优选流体动力学大小的PEG化的 单可变域和dAb单体以及多聚物。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部教导，包括上述所指的部分，都在此引作参考。

使用合适的接头如(Gly4Ser)n，n＝从1至8(1、2、3、4、5、6或 7)，可形成所述配体。如果需要，包括dAb单体、二聚体和三聚体的 配体，可连接至抗体Fc区，包含CH2和CH3域其中之一或两者，以及 任选的铰链区。例如编码作为单核苷酸序列连接到Fc区的配体的载体 可用于制备这样的多肽。

配体和dAb单体还可结合和/或形成非抗体多配体结构，从而形成 以相同抗原与靶分子结合的多价复合体，因而有很好的亲和力。例如天 然的细菌受体如SpA可用作CDRs移植的支架，以生成特异性结合一 种或多种表位的配体。该方法的细节在US 5,831,012中有描述。其他合 适的支架包括基于纤维连接蛋白和亲和体的那些。合适方法的细节在 WO 98/58965中有描述。其他合适的支架包括在van den Beuken et al.，J. Mol.Biol.310：591-601(2001)中描述的脂笼蛋白和CTLA4，以及如在 WO 00/69907(Medical Research Council)中所描述的那些支架，这些 支架是基于例如细菌GroEL的环结构或其他分子伴侣多肽。蛋白支架 可以相结合；例如CDRs可移植到CTLA4支架上，与免疫球蛋白VH 或VL域合用以形成配体。同样地，纤维连接蛋白、脂笼蛋白和其他支 架可以相结合。

制备任何所需形式的各种合适方法为本领域所知。例如抗体链和形 式(例如单特异性、双特异性、三特异性或四特异性IgG样形式、嵌 合抗体、人源抗体、人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的同型二 聚体和异型二聚体)可通过合适的表达构建体的表达和/或合适细胞的 培养(例如杂交瘤、异种杂交瘤、含有编码所述形式的重组构建物的重 组宿主细胞)而制备。进一步地，如抗体或抗体链的抗原结合片段的形 式(如Fv片段(如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片 段、Fab’片段、F(ab’)2片段)可通过合适的表达构建物的表达，或例 如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶对抗体进行酶消化而制备。

所述配体可以形成如WO 03/002609中所述的多特异性配体，其所 有的教导都在此引作参考。这样的多特异性配体具有超过一个表位的结 合特异性。一般来说，所述多特异性配体包含两个或多个表位结合域， 这样的dAb或包含表位结合位点的非抗体蛋白域，如亲和体、SpA 域、LDL受体A类域、EGF域、avimer。可如本文所述进一步形成多 特异性配体。

在一些实施方案中，所述配体是IgG样的形式。这样的形式具有 IgG分子的常规四条链结构(两条重链和两条轻链)，其中一个或多个 单可变域(VH和或VL)已被具有所需特异性的dAb或免疫球蛋白单 可变域取代。优选地每个可变区(两个VH区和两个VL区)被dAb或 免疫球蛋白单可变域取代。包括在IgG样形式中的所述dAb或免疫球 蛋白单可变域可以具有相同的或不同的特异性。在一些实施方案中，所 述IgG样形式是四价的，可以有一种、两种、三种或四种特异性。所 述IgG样形式可以是双特异性的，包含例如具有相同特异性的第一和 第二dAb，具有不同特异性的第三dAb和具有不同于第一、第二和第 三dAb特异性的第四dAb；或四特异性的，包含四种dAb，每种都有 不同的特异性。

所述IgG样形式可以是单特异性的，包含对IL-4或IL-13具结合 特异性的四种dAb。所述Ig-G样形式可以是双特异性的，包含例如对 IL-4具结合特异性的三种dAb以及对IL-13具结合特异性的另一dAb， 或双特异性的，包含例如对IL-4具结合特异性的两种dAb以及对IL- 13具结合特异性的两种dAb。所述IgG样形式可以是双特异性的，包 含例如对IL-13具结合特异性的三种dAb，和对IL-14具结合特异性的 另一dAb。当所述IgG样形式含有两种或多种与IL-4结合的dAb时， 所述dAb可与相同或不同表位结合。例如所述IgG样形式可包含两 种、三种、或四种对IL-4具结合特异性的dAb，所述dAb可与相同或 不同的表位结合。类似地，当所述IgG样形式含有两种或多种与IL-13 结合的dAb时，所述dAb可与相同或不同表位结合。例如所述IgG样 形式可包含两种、三种、或四种对IL-13具结合特异性的dAb，所述 dAb可与相同或不同的表位结合。

在一个实施例中，所述IgG样形式是对IL-4或IL-13具结合特异 性的四价IgG样配体，该IgG样配体包含两条重链和两条轻链，其中 所述重链包含免疫球蛋白重链恒定区和对IL-4或IL-13具结合特异性 的单免疫球蛋白可变域；所述轻链包含免疫球蛋白恒定区和对IL-4或 IL-13具结合特异性的单免疫球蛋白可变域。该实施例的所述IgG样形 式可进一步通过所述限制性条件来表征，所述限制性条件为当所述重链 包含对IL-4具结合特异性的单免疫球蛋白可变域时，所述轻链包含对 IL-13具结合特异性的单免疫球蛋白可变域；并且当所述重链包含对 IL-13具结合特异性的单免疫球蛋白可变域时，所述轻链包含对IL-4具 结合特异性的单免疫球蛋白可变域。

可制备IgG样形式的抗原结合片段(如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、 scFV)。此外，可对特定的恒定区或Fc部分(如IgG的恒定区或Fc部 分，如IgG1(CH1、CH2和CH3；CH2和CH3))，其变体或部分进 行筛选以改变效应功能。例如如果需要补体活化和或抗体依赖性细胞毒 性(ADCC)功能，则所述配体可是是IgG1样形式。如果需要，所述 IgG样形式可包含突变的恒定区(可变IgG重链恒定区)，使与Fc受 体的结合和/或固定补体的能力最小化(参见例如Winter et al.，GB 2,209,757B；Morrison et al.，WO 89/07142；Morgan et al.，WO 94/29351，1994 年12月22号)。

本发明的所述配体可形成含有第一免疫球蛋白单可变域的融合蛋 白，所述第一免疫球蛋白单可变域直接融合(如通过肽键)或通过合适 的接头(氨基酸、肽或多肽)连接到第二免疫球蛋白单可变域。如果需 要，则此种形式可进一步包含例如本文所述的一个或多个免疫球蛋白域 (如恒定区、Fc部分)和/或半衰期延长部分。例如所述配体可包含直 接融合到第二免疫球蛋白单可变域的第一免疫球蛋白单可变域，所述第 二免疫球蛋白单可变域直接融合到与血清白蛋白结合的免疫球蛋白单可 变域。

在一个实施例中，所述配体包含第一免疫球蛋白单可变域，第二免 疫球蛋白单可变域和Fc部分或免疫球蛋白恒定区。所述第一和第二免 疫球蛋白单可变域每个都可以对IL-4或IL-13具结合特异性。因此这 种类型的配体可含有两个结合位点(二价的)，其中每个结合位点都与 IL-4结合，每个结合位点都与IL-13结合，或其中一个结合位点与IL-4 结合，一个与IL-13结合。例如，所述配体具有结构V域-V域-IgG恒 定区或V域-V域-IgGFc部分。

通常具有对靶标具结合特异性的结合位点的所述多肽域的取向，以 及所述配体是否包含接头，是设计选择的问题。然而一些取向，无论有 或没有接头，可能都比其他的取向有更好的结合特性。所有的取向(如 dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)都在本发明的范围内，包含具有 理想的结合特性的取向的配体可以容易地通过筛选确定。

半衰期延长形式

本文公开的所述配体和dAb单体，可形成其体内血清半衰期延长 的形式。体内半衰期增加对免疫球蛋白的体内应用是有用的，尤其是抗 体，最尤其的是如dAb小抗体片段。这样的片段(Fvs、二硫键连接的 Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)从体内被迅速清除，可限制其临床应用。

配体可形成抗体的更大抗原结合片段或具有更大流体动力学大小的 抗体(如形成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。配体还可形 成具有更大流体动力学大小的形式，例如通过连接聚烷撑二醇基团(如 聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、转铁蛋 白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与 抗体域缀合。在一些实施方案中，所述配体(如dAb单体)是PEG 化的。优选地，所述PEG化的配体(如dAb单体)与IL-4和/或IL- 13结合，亲和力或亲合力与非PEG化的相同配体基本相同。例如所述 配体可以是包含与IL-4或IL-13结合的dAb的PEG化配体，该配体 与IL-4或IL-13结合的亲合力，与非PEG化形式的配体的亲和力差异 不超过约1000的系数，优选不超过约100的系数，更优选不超过约10 的系数，或相对于非PEG形式亲和力基本没有改变。参见2003年6月 30日提交的指定美国的PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)，是 关于PEG化的单可变域和dAb，制备相同的体内半衰期增加的PEG化 单可变域、dAb单体和多聚物的合适方法，合适的PEG，优选流体动 力学大小的PEG，优选流体动力学大小的PEG化单可变域、dAb单体 和多聚物。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部教导，包括 上述所指的部分，在此引作参考。

本发明所述配体(如dAb单体和多聚体)的流体动力学大小可使 用本领域公知的方法测定。例如凝胶过滤层析法可用于测定所述配体流 体动力学大小。测定所述配体流体动力学大小的合适凝胶过滤基质如交 联琼脂糖基质，是公知的并且容易得到。

配体形式的大小(如连接在dAb单体的PEG部分的大小)可随所 需应用而变化。例如如果希望配体离开循环系统进入外周组织，理想的 是保特配体的流体动力学大小小到利于从血流外渗。或者如果需要配体 在体循环中保留更长的时间，则可增加配体的大小，例如通过形成IgG 样蛋白或通过加上30至60kDa的PEG部分(如线性或支链的30kDa 至40kDa的PEG，比如加上两个20kDa的PEG部分)。可改变所述 配体形式的大小从而得到所需的体内血清半衰期。例如，可改变所述配 体形式的大小以控制在毒素中的暴露和/或减少毒性物质的副作用。

如本文所述，配体(如dAb单体)的流体动力学大小及其血清半 衰期还可通过使所述配体与结合域(如抗体或抗体片段)缀合或相连接 而增加，所述结合域与增加体内半衰期的抗原或表位相结合。例如所述 配体(如dAb单体)可以与抗血清白蛋白或抗新生儿Fc受体抗体或 抗体片段(如抗SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)，或 抗SA亲和体或抗新生儿Fc受体亲和体缀合或连接。

用于根据本发明的配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的 例子在WO 2005/077042A2中有描述，其全部在此引作参考。尤其地， 下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可用于本发明：

·SEQ ID NO：1(如在WO 2005/077042A2所公开的，该序列明确 地在本公开中引作参考)；

·包含或由WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸1-387组 成的白蛋白片段或变体；

·白蛋白，或其片段或变体，包含选自下述氨基酸序列：(a) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸54至61；(b) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸76至89；(c) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸92至100；(d) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸170至176；(e) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸247至252；(f) WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸266至277； (g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸280至 288；(h))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸362 至368；(i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸439 至447；(j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸462 至475；(k))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸 478至486；和(l))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨 基酸560至566。

用于根据本发明的配体的合适白蛋白、片段或类似物的进一步的例 子在WO 2005/077042 A2中有描述，其全部在此引作参考。尤其地，下 述白蛋白、片段或变体可用于本发明：

·如在WO 03/076567 A2中描述的人血清白蛋白，(如图3) (该序列信息明确地在本公开中引作参考)；

·人血清白蛋白(HA)由585个氨基酸的单非糖基化的多肽链组 成，分子量为66,500(参见Meloun，et al.，FEBS Letters 58：136 (1975)；Behrens，et al.，Fed.Proc.34：591(1975)；Lawn，et al.，Nucleic Acids Research 9：6102-6114(1981)；Minghetti，et al.，J.Biol.Chem. 261：6747(1986))；

·如Weitkamp，et al.，Ann.Hum.Genet.37：219(1973)中所描述的白 蛋白的多态变体或类似物或片段；

·如EP 322094中描述的白蛋白片段或变体，(如HA(1-373)、 HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1- 419之间的片段)；

·如EP 399666中描述的白蛋白片段或变体，如HA(1-177)和 HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段，其中X是178至199的任 何数。

如果一种或多种半衰期延长部分(如白蛋白、转铁蛋白以及其片段 以及类似物)被用于本发明的配体，则可以使用任何合适的方法使其缀 合，如通过与靶标结合部分(如dAb或抗体片段)直接融合，例如通 过使用编码融合蛋白的单核苷酸构建物，其中所述融合蛋白被编码为带 有位于所述细胞表面靶标结合部分N端或C端的半衰期延长部分的单 多肽链。或者可通过在各部分间使用肽接头以实现缀合，(如WO 03/076567 A2或WO 2004/003019中描述的肽接头)(这些接头的公开 在本公开中引作参考，提供用于本发明的例子)。

典型地，增加体内血清半衰期的多肽是体内自然生成并抗降解或抗 内源性机制去除的多肽，所述内源性机制是从有机体(如人)去除不需 要的物质。例如增加体内血清半衰期的多肽可选自：细胞外基质蛋白， 血液中的蛋白，血脑屏障或神经组织中的蛋白，集中在肾、肝、肺、心 脏、皮肤或骨骼的蛋白、应激蛋白、疾病特异性蛋白，或涉及Fc转运 的蛋白。

增加体内血清半衰期的合适多肽，例如转铁蛋白受体特异性配体- 神经药物融合蛋白(参见美国专利No.5,977,307，其教导在此引作参 考)，脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(如可溶转 铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素 样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白 酶和HNF 1α。增加血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类 粘蛋白；AAG)、α-1抗糜蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白 HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂 蛋白B(Apo B)、铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成 分C4(C4)、C1酯酶抑制剂(C1 INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁 蛋白(FER)、血色素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露 糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(甲状腺素运载 蛋白；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。

合适的细胞外基质蛋白包括，例如胶原、层粘连蛋白、整合素和 纤维连接蛋白。胶原是细胞外基质的主要蛋白。最近已知约有15种胶 原分子在身体的不同部分被发现，如I型胶原(占身体胶原的90％)在 骨骼、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏器官中被发现，或II型胶原在软 骨、椎间盘、脊索和眼玻璃体液中被发现。

来自血液的合适蛋白包括，例如血浆蛋白(如纤维蛋白、α-2巨球 蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原(如纤维蛋白原A、纤维蛋白原 B)、血清淀粉样蛋白A、结合珠蛋白、抑制蛋白、泛素、子宫球蛋白 和β-2-巨球蛋白)、酶和酶抑制剂(如纤溶酶原、溶菌酶、胱抑素C、 α-1-抗胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂)、免疫系统的蛋白、如免疫球蛋白 (如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))、转运蛋白 (如视黄醇结合蛋白、α-1巨球蛋白)、防御素(如β-防御素1、中性 粒细胞防御素1、中性粒细胞防御素2和中性粒细胞防御素3)等等。

血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白包括，例如黑素皮质素受 体、髓鞘、抗坏血酸转运体等等。

增加体内血清半衰期的合适多肽还包括集中在肾的蛋白(如多囊蛋 白、IV型胶原、有机阴离子转运体K1、Heymann抗原)、集中在肝脏 的蛋白(如乙醇脱氢酶、G250)、集中在肺的蛋白(如与IgA结合的 分泌片)、集中在心脏的蛋白(如与扩张性心肌病相关的HSP 27)、 集中在皮肤的蛋白(如角蛋白)、骨特异性蛋白，如形态发生蛋白 (BMPs)，其为表现出成骨活性的转化生长因子β超家族蛋白的亚群 (例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)，肿瘤 特异性蛋白(如滋养层抗原、赫赛汀受体、雌激素受体、组织蛋白酶 (如组织蛋白酶B，其可在肝脏及脾脏中发现))。

合适的疾病特异性蛋白包括，例如仅在活化的T细胞上表达的抗 原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、骨保护素配体(OPGL；参见 Nature 402，304-309(1999))；OX40(TNF受体家族成员，在活化的T 细胞上表达，并在嗜人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)生成细胞中 被特异性上调；参见Immunol.165(1)：263-70(2000))。合适的疾病特 异性蛋白还包括，例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括果蝇 CG6512、人paraplegin、人FtsH、人AFG3L2、小鼠ftsH；以及血管生 长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生 长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF)、 转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成 素、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板源性内皮 生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中期因子血小板 源性生长因子-BB(PDGF)，以及趋化因子。

增加体内血清半衰期的合适多肽还包括如热休克蛋白(HSPs)的 应激蛋白。HSPs正常是在细胞内发现的。当其在细胞间被发现时则表 明细胞已经死亡，细胞内容物溢出。这种非程序性细胞死亡(坏死)作 为创伤、疾病或损伤的结果而发生，细胞外HSPs引发免疫系统的反 应。与细胞外HSP结合可导致本发明的组合物集中在疾病部位。

涉及Fc转运的合适蛋白包括，例如Brambell受体(还被称为 FcRB)。该Fc受体有两种功能，都对传递有潜在用处。所述功能是 (1)通过胎盘从母亲向孩子转运IgG(2)保护IgG免受降解从而延 长其血清半衰期。人们认为受体循环利用来自核内体的IgG。(参见 Holliger et al，Nat Biotechnol 15(7)：632-6(1997).)。

配体半衰期的药代动力学分析和测定方法为本领域技术人员所熟 悉。详情在Kenneth，A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters et al，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)中可找到。供参考的还有“Pharmacokinetics”， M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)， 描述了药代动力学参数如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。

含有毒素部分或毒素的配体

本发明还涉及含有毒素部分或毒素的配体。合适的毒素部分包含毒 素(如表面活性毒素、细胞毒素)。所述毒素部分或毒素通过任何合适 的方法可与所述配体连接或缀合。例如所述毒素部分或毒素可直接或通 过合适的接头共价连接到所述配体上。合适的接头可包含非可切割的或 可切割的接头，例如pH可切割接头包含细胞酶(如细胞酯酶，细胞蛋白 酶如组织蛋白酶B)的切割位点。这样的可切割接头可用于制备配体，该 配体被内化后可释放毒素部分或毒素的配体。

将毒素部分或毒素与配体连接或缀合的多种方法都可采用。选定的 具体方法取决域毒素部分或毒素，以及被链接或缀合的配体。如果需 要，则含有末端功能基团的接头可用于连接所述配体和毒素部分或毒 素。通常缀合是通过使含有活性功能基团(或经修饰含有)的毒素部分 或毒素与接头或直接与配体反应而实现的。通过使含有(或经修饰含 有)化学部分或功能基团的毒素部分或毒素发生化学反应形成共价键， 所述化学部分或功能基团能在适当条件下与第二个化学基团反应从而形 成共价键。如果需要，可采用合适的方法将合适的反应性化学基团加到 配体或接头上(参见，如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques， Academic Press：San Diego，CA(1996).)。许多合适的反应性化学基团组 合物为本领域所知，例如氨基基团可与如甲萃磺酰氧基、甲磺酰氧基、 卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟琥珀酰亚胺酯(NHS)等的亲电基团 反应。硫醇可与马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶 二硫化物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等等。醛类功能基 团可与含有氨基或酰肼的分子偶联，叠氮基团可与三价磷基团反应形成 磷酰胺酯或磷酰胺连接。分子内引入活化基团的合适方法为本领域所知 (参见如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。

合适的毒素部分和毒素包括例如美登素(例如美登醇，如DM1、 DM4)，紫杉烷，加里刹霉素，duocarmycin或其衍生物。所述美登素可以 是例如美登醇或美登醇类似物。美登醇类似物的例子包括那些具有修饰 的芳环(例如C-19-脱氯，C-20-去甲氧基和C-20-酰氧基)以及那些其它 位置修饰的类似物(例如，C-9-CH，C-14-烷氧甲基，C-14-羟甲基或酰氧 甲基，C-15-羟基/酰氧基，C-15-甲氧基，C-18-N-去甲基，4，5-脱氧)。美 登醇和美登醇类似物在例如美国专利号5,208,020和6,333,410中有描述， 其内容在此引作参考。美登醇可以使用如N-琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫) 丙酸酯(也称为4-(-2-吡啶二巯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(或SPP)，4-琥珀 酰亚胺-氧羰基-a-(2-吡啶二巯基)-甲苯(SMTP)，N-琥珀酰亚胺-3-(2- 吡啶二巯基)丁酸酯(SDPB)，2-亚氨基硫烷，或S-乙酰琥珀酸酐与抗体或 抗体片段偶联。紫杉烷可以是例如紫杉醇、紫杉特尔或新型紫杉烷(参 见例如WO0138318)。加里刹霉素可以是例如溴代的加里刹霉素(例如 α、β或γ溴代物)，碘代加里刹霉素(例如，α，β或γ碘代物)，或其类似 物以及拟似物。溴代加里刹霉素包含I1-Br、I2-Br、I3-Br、I4-Br、J1-Br、 J2-Br以及K1-Br。碘代的加里刹霉素包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、 L1-I以及K1-I。加里刹霉素及其突变体、类似物和拟似物如在美国专利 4,970,198；5,264,586；5,550,246；5,712,374和5,714,586中有描述，每项专 利的内容都在此引做参考。Duocarmycin类似物，如KW-2189、DC88、 DC89 CBI-TMI，和其类似物在例如美国专利No.5,070,092，美国专利No. 5,187,186，美国专利No.5,641,780，美国专利No.5,641,780，美国专利No. 4,923,990和美国专利No.5,101,038中有描述，每项专利的内容都在此引作 参考。

其它毒素的例子包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌 呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)，烷化剂(例如 二氯甲二乙胺，噻替哌(thiotepa)苯丁酸氮芥，CC-1065(参见美国专 利号5,475,092、5,585,499、5,846,545)，苯丙氨酸氮芥，亚硝脲氮芥 (BSNU)与(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌 素，自力霉素C，和顺铂(DDP)，蒽环类(例如道诺红菌素(之前的柔 毛霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素(之前的放线菌素)，争 光霉素，光神霉素，丝裂霉素，嘌呤霉素氨茴霉素(AMC))， duocarmycin及其类似物或衍生物，以及抗有丝分裂剂(例如长春新 碱，长春花碱，紫杉醇，auristatins(例如auristatin E)和美登素，及其 类似物或同系物。

所述毒素还可以是表面活性毒素，比如自由基生成剂(例如含硒的 毒素片段)，或含有放射性核的部分。合适的分子片段含有放射性核， 包括例如含放射性碘(131I或125I)，钇(90Y)，镥(177Lu)，锕 (225Ac)，镨，砹(211At)，铼(186Re)，铋(212Bi或213Bi)，铟 (111In)，锝(99mTc)，磷(32P)，铑(188Rh)，硫(35S)，碳 (14C)，氚(3H)，铬(51Cr)，氯(36Cl)，钴(57Co或58Co)，铁 (59Fe)，硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。

所述毒素可以是蛋白、多肽或肽，来自细菌的如白喉毒素，假单胞 菌属外毒素(PE)和植物蛋白，例如蓖麻毒素A链(RTA)，核糖体灭 活蛋白(RIPs)白树毒素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素和dodecandron 都用作毒素。

设计用于结合、阻止、促进降解或防止导致产生特定靶蛋白的 mRNA的生成的核酸反义化合物可用作毒素。反义化合物包括反义 RNA或DNA，单链或双链寡核苷酸，或其类似物，可特异性地与单个 mRNA种杂交，防止所述mRNA种的转录和/或RNA加工，和/或所 述被编码多肽的翻译，并因此影响相应被编码多肽量的减少。Ching，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder，et al.，Ann. Int.Med.113：604-618(1990)；Loreau，et al.，FEBS Letters 274：53-56 (1990)；有用的反义治疗法包括例如VeglinTM(VasGene)和OGX-011 (Oncogenix)。

毒素还可以是光敏剂。合适的光敏剂包括基于卟啉的物质，例如卟 吩姆钠、绿色卟啉、二氢卟酚E6、血卟啉自身衍生物、酞菁、 etiopurpurins、texaphrin等等。

所述毒素可以是与细胞内靶标结合的抗体或抗体片段，例如与细胞 内靶标(胞内抗体)结合的dAb。可将这样的抗体或抗体片段 (dAbs)导向确定的亚细胞区室或靶标。例如所述抗体或抗体片段 (dAbs)可与选自erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、Caspase3、 Caspase7、Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、 HP1、TypeIV胶原酶、组织蛋白酶L以及Kontermann，R.E.，Methods， 34：163-170(2004)中所述其他物质的细胞内靶标结合，Kontermann，R.E.， Methods，34：163-170(2004)在此全部引作参考。

与IL-4结合的多肽域

本发明提供具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域(如免 疫球蛋白单可变域，dAb单体)。在优选的实施方案中，所述多肽域 (如dAb)与IL-4结合的亲和力常数(KD；KD＝Koff(kd)/Kon(ka))为 300nM至1pM(即3x 10-7至5x 10-12M)，优选50nM至1pM，更 优选5nM至1pM，最优选1nM至1pM，例如KD为1x10-7M或 更少，优选1x 10-8M或更少，更优选1x 10-9M或更少，有利的是1 x 10-10M或更少，最有利的是1x 10-11 M或更少；和/或Koff速率常数 5x 10-1s-1至1x 10-7s-1，优选1x 10-2s-1至1x 10-6s-1，更优选5x 10-3 s-1至1x 10-5 s-1，例如5x 10-1s-1或更少，优选1x 10-2s-1或更少，有 利的是1x 10-3s-1或更少，更优选1x 10-4s-1或更少，还优选1x 10-5s- 1或更少，最优选1x 10-6s-1或更少，以上由表面等离振子共振测定。

在一些实施方案中，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的 多肽域和选自下述的dAb竞争与IL-4的结合：DOM9-15(SEQ ID NO：175)、DOM9-17(SEQ ID NO：176)、DOM9-23(SEQ ID NO：177)、 DOM9-24(SEQ ID NO：178)、DOM9-25(SEQ ID NO：179)、DOM9-27 (SEQ ID NO：180)、DOM9-28(SEQ ID NO：181)、DOM9-29(SEQ ID NO：182)、DOM9-30(SEQ ID NO：183)、DOM9-31(SEQ ID NO：184)、 DOM9-32(SEQ ID NO：185)、DOM9-33(SEQ ID NO：186)、DOM9-50 (SEQ ID NO：187)、DOM9-57(SEQ ID NO：188)、DOM9-59(SEQ ID NO：189)、DOM9-63(SEQ ID NO：190)、DOM9-67(SEQ ID NO：191)、 DOM9-68(SEQ ID NO：192)、DOM9-70(SEQ ID NO：193)、DOM9-79 (SEQ ID NO：194)、DOM9-82(SEQ ID NO：195)、DOM9-86(SEQ ID NO：196)、DOM9-94(SEQ ID NO：197)、DOM9-108(SEQ ID NO：198)、 DOM9-112(SEQ ID NO：199)、DOM9-112-1(SEQ ID NO：200)、DOM9- 112-2(SEQ ID NO：201)、DOM9-112-3(SEQ ID NO：202)、DOM9-112-4 (SEQ ID NO：203)、DOM9-112-5(SEQ ID NO：204)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：205)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：206)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：207)、DOM9-112-9(SEQ ID NO：208)、DOM9-112-10(SEQ ID NO：209)、DOM9-112-11(SEQ ID NO：210)、DOM9-112-12(SEQ ID NO：211)、DOM9-112-13(SEQ ID NO：212)、DOM9-112-14(SEQ ID 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在一些实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述 多肽域与选自下述的dAb竞争与IL-4的结合：DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-204(SEQ ID NO：2428)、DOM9-112-205(SEQ ID NO：2429)、DOM9-112-206(SEQ ID NO：2430)、DOM9-112-207(SEQ ID NO：2431)、DOM9-112-208(SEQ ID NO：2432)、DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434)、DOM9-112-211(SEQ ID NO：2435)、DOM9-112-212(SEQ ID NO：2436)、DOM9-112-213(SEQ ID NO：2437)、DOM9-112-214(SEQ ID NO：2438)、DOM9-112-215(SEQ ID NO：2439)、DOM9-112-216(SEQ ID NO：2440)、DOM9-112-217(SEQ ID NO：2441)、DOM9-112-218(SEQ ID NO：2442)、DOM9-112-219(SEQ ID NO：2443)、DOM9-112-220(SEQ ID NO：2444)、DOM9-112-221(SEQ ID NO：2445)、DOM9-112-222(SEQ ID NO：2446)、DOM9-112-223(SEQ ID NO：2447)、DOM9-112-224(SEQ ID NO：2448)、DOM9-112-225(SEQ ID NO：2449)、DOM9-112-226(SEQ ID NO：2450)、DOM9-112-227(SEQ ID NO：2451)、DOM9-112-228(SEQ ID NO：2452)、DOM9-112-229(SEQ ID NO：2453)、DOM9-112-230(SEQ ID NO：2454)、DOM9-112-231(SEQ ID NO：2455)、DOM9-112-233(SEQ ID NO：1734)、DOM9-112-232(SEQ ID NO：1733)和DOM9-112-234(SEQ ID NO：1735)。

在一些实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述 多肽域(如dAb)包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的 氨基酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约 91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致 性：DOM9-15(SEQ ID NO：175)、DOM9-17(SEQ ID NO：176)、DOM9- 23(SEQ ID NO：177)、DOM9-24(SEQ ID NO：178)、DOM9-25(SEQ ID NO：179)、DOM9-27(SEQ ID NO：180)、DOM9-28(SEQ ID NO：181)、 DOM9-29(SEQ ID NO：182)、DOM9-30(SEQ ID NO：183)、DOM9-31 (SEQ ID NO：184)、DOM9-32(SEQ ID NO：185)、DOM9-33(SEQ ID NO：186)、DOM9-50(SEQ ID NO：187)、DOM9-57(SEQ ID NO：188)、 DOM9-59(SEQ ID NO：189)、DOM9-63(SEQ ID NO：190)、DOM9-67 (SEQ ID NO：191)、DOM9-68(SEQ ID NO：192)、DOM9-70(SEQ ID NO：193)、DOM9-79(SEQ ID NO：194)、DOM9-82(SEQ ID NO：195)、 DOM9-86(SEQ ID NO：196)、DOM9-94(SEQ ID NO：197)、DOM9-108 (SEQ ID NO：198)、DOM9-112(SEQ ID NO：199)、DOM9-112-1(SEQ ID NO：200)、DOM9-112-2(SEQ ID NO：201)、DOM9-112-3(SEQ ID NO：202)、DOM9-112-4(SEQ ID NO：203)、DOM9-112-5(SEQ ID NO：204)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：205)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：206)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：207)、DOM9-112-9(SEQ ID 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在一些实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述 多肽域(如dAb)包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的 氨基酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约 91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致 性：DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-204(SEQ ID NO：2428)、DOM9-112-205(SEQ ID NO：2429)、DOM9-112-206(SEQ ID NO：2430)、DOM9-112-207(SEQ ID NO：2431)、DOM9-112-208(SEQ ID NO：2432)、DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434)、DOM9-112-211(SEQ ID NO：2435)、DOM9-112-212(SEQ ID NO：2436)、DOM9-112-213(SEQ ID NO：2437)、DOM9-112-214(SEQ ID NO：2438)、DOM9-112-215(SEQ ID NO：2439)、DOM9-112-216(SEQ ID NO：2440)、DOM9-112-217(SEQ ID NO：2441)、DOM9-112-218(SEQ ID NO：2442)、DOM9-112-219(SEQ ID NO：2443)、DOM9-112-220(SEQ ID NO：2444)、DOM9-112-221(SEQ ID NO：2445)、DOM9-112-222(SEQ ID NO：2446)、DOM9-112-223(SEQ ID NO：2447)、DOM9-112-224(SEQ ID NO：2448)、DOM9-112-225(SEQ ID NO：2449)、DOM9-112-226(SEQ ID NO：2450)、DOM9-112-227(SEQ ID NO：2451)、DOM9-112-228(SEQ ID NO：2452)、DOM9-112-229(SEQ ID NO：2453)、DOM9-112-230(SEQ ID NO：2454)、DOM9-112-231(SEQ ID NO：2455)、DOM9-112-233(SEQ ID NO：1734)、DOM9-112-232(SEQ ID NO：1733)和DOM9-112-234(SEQ ID NO：1735)。

在优选的实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所 述多肽域包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的氨基酸序 列具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约 94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少 约99％的氨基酸序列一致性：DOM9-112-155(SEQ ID NO：292)、 DOM9-112-168(SEQ ID NO：305)、DOM9-112-174(SEQ ID NO：311)、 DOM9-112-199(SEQ ID NO：336)、DOM9-112-200(SEQ ID NO：337)、 DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)、DOM9-155-5(SEQ ID NO：605)、 DOM9-155-25(SEQ ID NO：617)、DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、 DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-202(SEQ ID NO：339)、 DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434) 和DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)。例如，具有对IL-4具结合特异性 的结合位点的所述多肽域可包含DOM9-112-155(SEQ ID NO：292)、 DOM9-112-168(SEQ ID NO：305)、DOM9-112-174(SEQ ID NO：311)、 DOM9-112-199(SEQ ID NO：336)、DOM9-112-200(SEQ ID NO：337)、 DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)、DOM9-155-5(SEQ ID NO：605、 DOM9-155-25(SEQ ID NO：617)、DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、 DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-202(SEQ ID NO：339)、 DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434) 和DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)。

在一些实施方案中，所述具有对II-4具结合特异性的结合位点的 多肽域与本文公开的任何dAb竞争与IL-4的结合。

优选地，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域是免 疫球蛋白单可变域。所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽 域可含有任何合适的免疫球蛋白可变域，优选地包含人可变域或含有人 框架区的可变域。在某些实施方案中，所述具有对IL-4具结合特异性 的结合位点的多肽域包含本文所述的通用框架。

所述通用框架可以是VL框架(Vλ或Vκ)，例如含有由人种系 DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、 DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、 DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、 DPK26或DPK 28免疫球蛋白基因片段编码的所述框架氨基酸序列。 如果需要，所述VL框架可进一步包含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或 Jκ5免疫基因片段编码的框架氨基酸序列。

在其他实施方案中，所述通用框架可以是VH框架，例如含有由人 种系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、 DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、 DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因片段编码的所述框架氨基酸序 列。如果需要，所述VH框架可进一步包含由人种系JH1、JH2、JH3、 JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因片段编码的所述框架氨基酸序 列。

在某些实施方案中，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的 多肽域包含一个或多个含有与由人种系抗体基因片段编码的相应框架区 的氨基酸序列相同的氨基酸序列的框架区，或相对于由人种系抗体基因 片段编码的所述相应框架区的氨基酸序列，一个或多个所述框架区的所 述氨基酸序列总共包含最高达5个氨基酸的不同。

在其他实施方案中，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的 多肽域的FW1、FW2、FW3和FW4的所述氨基酸序列与由人种系抗 体基因片段编码的相应框架区的所述氨基酸序列相同，或相对于由人种 系抗体基因片段编码的相应框架区的所述氨基酸序列，FW1、FW2、 FW3和FW4的所述氨基酸序列总共含有最高达10个氨基酸的不同。

在其他实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽 域包含FW1、FW2和FW3区，所述FW1、FW2和FW3区的所述氨 基酸序列与由人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相 同。

在具体实施方案中，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的 多肽域包含选自DP47、DP45和DP38的DPK9VL框架或VH框架。 所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域包含可包含通用性 配体的结合位点，如蛋白A、蛋白L和蛋白G。

本发明的所述配体(例如对IL-4和IL-13具结合特异性的配体， 对IL-4具结合特异性的配体)可包含对IL-4具结合特异性的非免疫球 蛋白单可变域，优选抑制IL-4功能的(如与受体结合)，其中所述非 免疫球蛋白单可变域包含一个、两个或三个与IL-4结合的VH、VL或 VHH的所述CDRs，以及合适的支架。在某些实施方案中，所述非免疫 球蛋白结合部分包含与IL-4结合的VH、VL或VHH的CDR3而非 CDR1或CDR2，以及合适的支架。在其他实施方案中，所述非免疫球 蛋白结合部分包含与IL-4结合的VH、VL或VHH的CDR1和CDR2 而非CDR3，以及合适的支架。在其他实施方案中，所述非免疫球蛋白 结合部分包含与IL-4结合的VH、VL或VHH的CDR1、CDR2和 CDR3，以及合适的支架。优选地，这些实施方案的所述配体的CDR 是本文所述的抗IL-4 dAb的CDR。优选地，所述非免疫球蛋白结合部 分包含一个、两个或三个本文公开的抗IL-4 dAb的所述CDR。在其他 实施方案中，所述配体(例如对IL-4和IL-13具结合特异性的配体， 对IL-4具结合特异性的配体)仅包含与IL-4结合的VH、VL或VHH的 CDR3。所述非免疫球蛋白域可包含氨基酸序列，该氨基酸序列含有一 个或多个与本文所述的抗IL-4 dAb的一个、两个或三个CDR具有序 列一致性的区。例如，所述非免疫球蛋白域可具有氨基酸序列，该氨基 酸序列与本文所公开的抗IL-4 dAb的CDR1、CDR2和/或CDR3具有 至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％ 的序列一致性。甚至更优选地，所述非免疫球蛋白结合部分包含一个、 两个或三个下述的CDRs：DOM9-44-502(SEQ ID NO：512)、DOM9- 155-5(SEQ ID NO：605)、DOM9-155-25(SEQ ID NO：617)、DOM9-112- 155(SEQ ID NO：292)、DOM9-112-168(SEQ ID NO：305)、DOM9-112- 174(SEQ ID NO：311)、DOM9-112-199(SEQ ID NO：336)和DOM9-112- 200(SEQ ID NO：337)。

在某些实施方案中，具有对IL-4具结合特异性的结合位点的所述 多肽域大体上抗聚集。例如在一些实施方案中，当在常规用于药物制剂 的溶剂如盐水、缓冲液、柠檬酸缓冲液、水、乳液，以及含有如FDA 批准的赋形剂的任何这些溶剂中的1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20 mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml 的配体或dAb溶液，在约22℃，22-25℃，25-30℃，30-37℃，37- 40℃，40-50℃，50-60℃，60-70℃，70-80℃，15-20℃，10-15℃，5- 10℃，2-5℃，0-2℃，-10℃至0℃，-20℃至-10℃，-40℃至-20℃，- 60℃至-40℃，或-80℃至-60℃下，维持约一段时间如10分钟、1小 时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2 个月、3个月、4个月、6个月、1年或2年时，少于约10％，少于约 9％，少于约8％，少于约7％，少于约6％，少于约5％，少于约4％， 少于约3％，少于约2％或少于约1％的所述具有对IL-4具结合特异性 的结合位点的多肽域聚集。

可以使用任何合适的方法评定聚集，如通过显微镜检查，肉眼观察 或光谱法或任何其他合适的方法评估浊度。优选地，通过动态光散射评 定聚集。具有对IL-4具结合特异性的结合位点的抗聚集的多肽域有几 处优点。例如具有对IL-4具结合特异性的结合位点的这样的多肽域作 为通过使用合适的如大肠杆菌的生物制备体系表达的可溶性蛋白，可容 易地大量制得，与常规的多肽相比还可以在更高浓度下制成制剂和/或 存储，聚集现象和活性损失都更少。

此外，比起其他的抗原或表位结合多肽(如常规抗体)，具有对 IL-4具结合特异性的结合位点的抗聚集的多肽域制备更经济。例如，一 般来说打算用于体内的抗原或表位结合多肽的制备包括去除聚集多肽的 方法(如凝胶过滤法)。无法去除此种聚集体可导致出现不适合体内应 用的制品，因为例如打算用作拮抗剂的抗原结合多肽的聚集体可通过诱 导靶抗原的交联或聚集成簇而表现出激动剂的作用。蛋白聚集体还可以 通过诱导受试者对其被施用物质的免疫应答，降低治疗多肽的疗效。

相比之下，可以制备本发明的抗聚集的具有对Il-4具结合特异性 的结合位点的多肽域进行体内应用，无需包括去除聚集体的方法步骤， 还可体外使用，而没有多肽聚集体造成的上述不利之处。

在一些实施方案中，当加热到温度(Ts)并冷却到温度(Tc)时， 具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域可逆地解折叠，其中Ts 高于所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的熔点 (Tm)，Tc低于所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的 熔点。例如当温度加热到80℃并冷却到约室温时，具有对IL-4具结合 特异性的结合位点的多肽域可以可逆地解拆叠。可逆地解折叠的多肽， 解折叠时丧失功能，但重折叠后重获功能。这种多肽与解折叠时聚集的 多肽或非正确重折叠的多肽(错误折叠的多肽)不同，即解折叠时聚集 的多肽或非正确重折叠的多肽无法重获功能。

可对多肽解折叠或重折叠进行评定，例如采用任何合适的方法直接 或间接地检测多肽结构。例如，检测多肽结构可通过圆二色性(CD) (即远紫外CD，近紫外CD)，荧光(如色氨酸侧链的荧光)，对蛋 白水解的易感性，核磁共振(NMR)，或通过检测或测量依赖于正确 折叠的多肽的功能(例如与靶配体结合，与通用性配体结合)。在一个 实施例中，多肽解折叠是采用功能分析来评定的，在所述功能分析中结 合功能的丧失(即结合通用型和/或靶配体，结合底物)表明多肽是解 折叠的。

具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域解折叠和重折叠的 程度可采用解折叠或变性曲线来确定。以温度为纵坐标，折叠多肽的相 对浓度为横坐标作图可得解折叠曲线。具有对IL-4具结合特异性的结 合位点的折叠多肽域的相对浓度可使用任何合适的方法(例如CD、荧 光、结合分析)直接或间接地确定。例如可制备具有对IL-4具结合特 异性的结合位点的多肽域溶液，用CD确定溶液的椭圆度。得到的椭圆 度值代表折叠配体或dAb单体的百分比相对浓度。溶液中具有对IL-4 具结合特异性的结合位点的多肽域随后通过逐渐升高溶液温度而解折 叠，在合适的增量处可确定椭圆度(例如每次升高一度后)。然后溶液 中所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域通过逐渐降低溶 液温度而重折叠，在合适的增量处确定椭圆度。用数据可绘制出解折叠 曲线和重折叠曲线。解折叠和重折叠曲线是典型的S型，包含其中具有 对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域折叠的部分，其中具有对IL- 4具结合特异性分子的结合位点的多肽域不同程度解折叠的解折叠/重 折叠转变，以及其中具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的 解折叠部分。重折叠曲线在Y轴的截距是复性的重折叠的具有对IL-4 具结合特异性的结合位点的多肽域的相对量。复性率至少约50％，或 至少约60％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少 约85％，或至少约90％，或至少约95％，表明该配体或dAb单体可逆 地解折叠。

在优选实施例中，所述具有对Il-4具结合特异性的结合位点的多 肽域解折叠的可逆性通过制备具有对IL-4具结合特异性的结合位点的 多肽域溶液并绘制热解折叠和重折叠曲线来确定。所述具有对IL-4具 结合特异性的结合位点的多肽域溶液可在任何合适的溶剂中制备，如其 pH适合具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域溶解的含水缓冲 液(如高于或低于等电点(pI)三个单位的pH值)。所述具有对Il-4 具结合特异性的结合位点的多肽域溶液要浓到足以检测解折叠/折叠。 例如，所述配体或dAb单体溶液可以是约0.1μM至约100μM，或优选 约1μM至约10μM。

如果所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的熔点 (Tm)已知，则溶液可加热至约低于Tm 10度(Tm-10)，通过椭圆 度或荧光评定折叠(如200nm-250nm远紫外CD扫描，CD波长固定 在235nm或225nm；色氨酸的荧光发射光谱在300至450nm，激发波 长298nm)，以提供折叠的配体或dAb单体的相对百分比。溶液随后 以预定增量被加热到至少高出Tm10度(Tm+10)(如增加约0.1至约 1度)，在每个增量处测定椭圆度或荧光。然后所述具有对IL-4具结合 特异性的结合位点的多肽域按预定增量冷却到至少Tm-10进行重折 叠，在每个增量处测定椭圆度或荧光。如果所述具有对IL-4具结合特 异性的结合位点的多肽域的熔点未知，溶液可通过从约25℃逐渐加热 至约100C而解折叠，然后逐渐冷却至至少约25℃而重折叠，在每次 加热或冷却的增量处测定椭圆度或荧光。获得的数据可绘制解折叠曲线 和重折叠曲线，其中重折叠曲线在Y轴上的截距是复性的重折叠蛋白 的相对量。在一些实施方案中，所述具有对VEGF具结合特异性的结 合位点的多肽域不包含驼类(Camelid)免疫球蛋白可变域，或一种或 多种驼类(Camelid)种系抗体基因片段编码的免疫球蛋白可变域独有 的框架氨基酸。

优选地，当在大肠杆菌或毕赤酵母(Pichia)菌种(如巴斯德毕赤酵 母)中表达时，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的 分泌量至少约0.5mg/L。在其他优选实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤 酵母菌种(如巴斯德毕赤酵母)中表达时，所述具有对IL-4具结合特 异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约0.75mg/L，至少约1 mg/L，至少约4mg/L，至少约5mg/L，至少约10mg/L，至少约15 mg/L，至少约20mg/L，至少约25mg/L，至少约30mg/L，至少约35 mg/L，至少约40mg/L，至少约45mg/L，或至少约50mg/L，或至少 约100mg/L，或至少约200mg/L，或至少约300mg/L，或至少约400 mg/L，或至少约500m/L，或至少约600mg/L，或至少约700m/L， 或至少约800mg/L，至少约900mg/L，或至少约1g/L。在其他优选实 施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母菌种(如巴斯德毕赤酵母)中表达 时，所述具有对IL-4具结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量至少 约1mg/L到至少约1g/L，至少约1mg/L到至少约750mg/L，至少约 100mg/L到至少约1g/L，至少约200mg/L到至少约1g/L，至少约 300mg/L到至少约1g/L，至少约400mg/L到至少约1g/L，至少约 500mg/L到至少约1g/L，至少约600mg/L到至少约1g/L，至少约 700mg/L到至少约1g/L，至少约800mg/L到至少约1g/L，或至少约 900mg/L到至少约1g/L。虽然当在大肠杆菌或毕赤酵母菌种(如巴斯 德毕赤酵母)中表达时，本文所述的具有对IL-4具结合特异性的结合 位点的多肽域是可被分泌的，但它们还可使用任何合适的方法制备，如 化学合成方法或不采用大肠杆菌或毕赤酵母菌种的生物制备方法。

结合IL-13的多肽域

本发明提供具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽域(如 dAb)。在优选的实施方案中，所述多肽域(如dAb)与IL-13结合的 亲和力常数(KD；KD＝Koff(kd)/Kon(ka))为300nM至1pM(即3x 10-7 至5x 10-12M)，优选100nM至1pM，或50nM至10pM，更优选 10nM至100pM，最优选约1nM，例如KD为1x 10-7 M或更少， 优选1x 10-8M或更少，更优选约1x 10-9M或更少，1x 10-10M或更 少或1x 10-11M或更少；和/或Koff速率常数为5x 10-1s-1至1x 10-7s- 1，优选1x 10-2s-1至1x 1-6s-1，更优选5x 10-3s-1to 1x 10-5s-1，例如 5x 10-1s-1或更少，优选1x10-2s-1或更少，有利的是1x 10-3s-1或更 少，更优选1x 10-4s-1或更少，还更优选1x 10-5s-1或更少，最优选1x 10-6s-1或更少，以上由表面等离振子共振测定。

在一些实施方案中，具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽 域与选自下述的dAb竞争与IL-13的结合：DOM10-53(SEQ ID NO：967)、DOM10-53-1(SEQ ID NO：968)、DOM10-53-2(SEQ ID NO：969)、DOM10-53-3(SEQ ID NO：970)、DOM10-53-4(SEQ ID NO：971)、DOM10-53-5(SEQ ID NO：972)、DOM10-53-6(SEQ ID NO：973)、DOM10-53-7(SEQ ID NO：974)、DOM10-53-8(SEQ ID NO：975)、DOM10-53-9(SEQ ID NO：976)、DOM10-53-10(SEQ ID NO：977)、DOM10-53-11(SEQ ID NO：978)、DOM10-53-12(SEQ ID NO：979)、DOM10-53-13(SEQ ID NO：980)、DOM10-53-14(SEQ ID NO：981)、DOM10-53-15(SEQ ID NO：982)、DOM10-53-16(SEQ ID NO：983)、DOM10-53-17(SEQ ID NO：984)、DOM10-53-18(SEQ ID NO：985)、DOM10-53-19(SEQ ID NO：986)、DOM10-53-20(SEQ ID NO：987)、DOM10-53-21(SEQ ID NO：988)、DOM10-53-122(SEQ ID NO：989)、DOM10-53-123(SEQ ID NO：990)、DOM10-53-24(SEQ ID NO：991)、DOM10-53-25(SEQ ID NO：992)、DOM10-53-26(SEQ ID NO：993)、DOM10-53-27(SEQ ID NO：994)、DOM10-53-28(SEQ ID NO：995)、DOM10-53-29(SEQ ID NO：996)、DOM10-53-30(SEQ ID N0：997)、DOM10-53-31(SEQ ID NO：998)、DOM10-53-32(SEQ ID NO：1999)、DOM10-53-43(SEQ ID NO：1000)、DOM10-53-44(SEQ ID 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在一些实施方案中，具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽 域与选自下述的dAb竞争与IL-13的结合：DOM10-236(SEQ ID NO：2129)、DOM10-238(SEQ ID NO：2130)、DOM10-241(SEQ ID NO：2131)、DOM10-245(SEQ ID NO：2132)、DOM10-249(SEQ ID NO：2133)、DOM10-250(SEQ ID NO：2134)、DOM10-251(SEQ ID NO：2135)、DOM10-254(SEQ ID NO：2136)、DOM10-256(SEQ ID NO：2137)、DOM10-259(SEQ ID NO：2138)、DOM10-260(SEQ ID NO：2139)、DOM10-261(SEQ ID NO：2140)、DOM10-263(SEQ ID NO：2141)、DOM10-264(SEQ ID NO：2142)、DOM10-273(SEQ ID NO：2143)、DOM10-278(SEQ ID NO：2144)、DOM10-279(SEQ ID NO：2145)、DOM10-281(SEQ ID NO：2146)、DOM10-282(SEQ ID NO：2147)、DOM10-283(SEQ ID NO：2148)、DOM10-400(SEQ ID NO：2149)、DOM10-401(SEQ ID NO：2150)、DOM10-402(SEQ ID NO：2151)、DOM10-404(SEQ ID NO：2152)、DOM10-406(SEQ ID NO：2153)、DOM10-407(SEQ ID NO：2154)、DOM10-409(SEQ ID NO：2155)、DOM10-410(SEQ ID NO：2156)、DOM10-414(SEQ ID NO：2157)、DOM10-415(SEQ ID NO：2158)、DOM10-416(SEQ ID NO：2159)、DOM10-418(SEQ ID NO：2160)、DOM10-420(SEQ ID NO：2161)、DOM10-422(SEQ ID NO：2162)、DOM10-423(SEQ ID 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在一些实施方案中，具有对IL-13具结合特异性的结合位点的所述 多肽域(如dAb)包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的 氨基酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约 91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致 性：DOM10-53(SEQ ID NO：967)、DOM10-53-1(SEQ ID NO：968)、 DOM10-53-2(SEQ ID NO：969)、DOM10-53-3(SEQ ID NO：970)、 DOM10-53-4(SEQ ID NO：971)、DOM10-53-5(SEQ ID NO：972)、 DOM10-53-6(SEQ ID NO：973)、DOM10-53-7(SEQ ID NO：974)、 DOM10-53-8(SEQ ID NO：975)、DOM10-53-9(SEQ ID NO：976)、 DOM10-53-10(SEQ ID NO：977)、DOM10-53-11(SEQ ID NO：978)、 DOM10-53-12(SEQ ID NO：979)、DOM10-53-13(SEQ ID NO：980)、 DOM10-53-14(SEQ ID NO：981)、DOM10-53-15(SEQ ID NO：982)、 DOM10-53-16(SEQ ID NO：983)、DOM10-53-17(SEQ ID NO：984)、 DOM10-53-18(SEQ ID NO：985)、DOM10-53-19(SEQ ID NO：986)、 DOM10-53-20(SEQ ID NO：987)、DOM10-53-21(SEQ ID NO：988)、 DOM10-53-122(SEQ ID NO：989)、DOM10-53-123(SEQ ID NO：990)、 DOM10-53-24(SEQ ID NO：991)、DOM10-53-25(SEQ ID NO：992)、 DOM10-53-26(SEQ ID NO：993)、DOM10-53-27(SEQ ID NO：994)、 DOM10-53-28(SEQ ID NO：995)、DOM10-53-29(SEQ ID NO：996)、 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(SEQ ID NO：1714)、DOM10-176-664(SEQ ID NO：1715)、DOM10-176- 665(SEQ ID NO：1716)、DOM10-176-666(SEQ ID NO：1717)、DOM10- 176-667(SEQ ID NO：1718)、DOM10-176-668(SEQ ID NO：1719)、 DOM10-176-669(SEQ ID NO：1720)、DOM10-176-670(SEQ ID NO：1721)、DOM10-176-671(SEQ ID NO：1722)、DOM10-176-672(SEQ ID NO：1723)、DOM10-176-673(SEQ ID NO：1724)、DOM10-176-674 (SEQ ID NO：1725)、DOM10-176-675(SEQ ID NO：1726)、DOM10-253 (SEQ ID NO：1727)、DOM10-255(SEQ ID NO：1728)、DOM10-272(SEQ ID NO：1729)、DOM10-307(SEQ ID NO：1730)、DOM10-319(SEQ ID NO：1731)和DOM10-319-1(SEQ ID NO：1732)。

在一些实施方案中，具有对IL-13具结合特异性(如dAb)的结合 位点的所述多肽域包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的 氨基酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约 91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致 性：DOM10-236(SEQ ID NO：2129)、DOM10-238(SEQ ID NO：2130)、 DOM10-241(SEQ ID NO：2131)、DOM10-245(SEQ ID NO：2132)、 DOM10-249(SEQ ID NO：2133)、DOM10-250(SEQ ID NO：2134)、 DOM10-251(SEQ ID NO：2135)、DOM10-254(SEQ ID NO：2136)、 DOM10-256(SEQ ID NO：2137)、DOM10-259(SEQ ID NO：2138)、 DOM10-260(SEQ ID NO：2139)、DOM10-261(SEQ ID NO：2140)、 DOM10-263(SEQ ID NO：2141)、DOM10-264(SEQ ID NO：2142)、 DOM10-273(SEQ ID NO：2143)、DOM10-278(SEQ ID NO：2144)、 DOM10-279(SEQ ID NO：2145)、DOM10-281(SEQ ID NO：2146)、 DOM10-282(SEQ ID NO：2147)、DOM10-283(SEQ ID NO：2148)、 DOM10-400(SEQ ID NO：2149)、DOM10-401(SEQ ID NO：2150)、 DOM10-402(SEQ ID NO：2151)、DOM10-404(SEQ ID NO：2152)、 DOM10-406(SEQ ID NO：2153)、DOM10-407(SEQ ID NO：2154)、 DOM10-409(SEQ ID NO：2155)、DOM10-410(SEQ ID NO：2156)、 DOM10-414(SEQ ID NO：2157)、DOM10-415(SEQ ID NO：2158)、 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在优选的实施方案中，具有对IL-13具结合特异性(如dAb)的结 合位点的所述多肽域包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自DOM-10- 53(SEQ ID NO：967)或DOM10-176-535(SEQ ID NO：1587)的氨基酸序 列具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约 94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少 约99％的氨基酸序列一致性。例如，具有对IL-13具结合特异性的结合 位点的所述多肽域可包含DOM10-176-535(SEQ ID NO：1587)、 DOM10-53-223(SEQ ID NO：1090)、DOM10-53-234(SEQ ID NO：1101)、DOM10-53-316(SEQ ID NO：1182)、DOM10-53-339(SEQ ID NO：1203)、DOM10-53-344(SEQ ID NO：1208)、DOM10-53-396(SEQ ID NO：1260)、DOM10-53-474(SEQ ID NO：2369)和DOM10-275-1(SEQ ID NO：2241)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述具有对IL-13具结合特异性的结合位点的 多肽域与本文公开的任何dAb竞争与IL-13结合。

优选地，所述具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽域是免 疫球蛋白单可变域。所述具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽 域可含有任何合适的免疫球蛋白可变域，优选地包含人可变域或含有人 框架区的可变域。在某些实施方案中，所述具有对IL-13具结合特异性 的结合位点的多肽域包含本文所述的通用框架。

本发明的所述配体(例如对IL-4和IL-13具结合特异性的配体， 对IL-13具结合特异性的配体)可包含对IL-13具结合特异性，并抑制 IL-13功能(如与受体结合)的非免疫球蛋白可变域，其中所述非免疫 球蛋白单可变域包含一个、两个或三个与IL-13结合的VH、VL或 VHH的所述CDRs，以及合适的支架。在某些实施方案中，所述非免疫 球蛋白结合部分包含与IL-13结合的VH、VL或VHH的CDR3而非 CDR1或CDR2，以及合适的支架。在其他实施方案中，所述非免疫球 蛋白结合部分包含与IL-13结合的VH、VL或VHH的CDR1和CDR2而 非CDR3，以及合适的支架。在其他实施方案中，所述非免疫球蛋白结 合部分包含与IL-13结合的VH、VL或VHH的CDR1、CDR2和 CDR3，以及合适的支架。优选地，这些实施方案的所述配体的CDR 是本文所述的抗IL-13dAb的CDR。优选地，所述非免疫球蛋白结合 部分包含一个、两个或三个本文公开的抗IL-4dAb之一的所述CDR。 在其他实施方案中，所述配体(例如对IL-4和IL-13具结合特异性的 配体，对IL-13具结合特异性的配体)仅包含与IL-13结合的VH、VL 或VHH的CDR3。所述非免疫球蛋白域可包含氨基酸序列，该氨基酸序 列含有一个或多个与本文所述的抗IL-4dAb的CDR具有序列一致性 的区。例如，所述非免疫球蛋白域可具有氨基酸序列，该氨基酸序列与 本文所公开的抗IL-13dAb的CDR1、CDR2和/或CDR3具有至少约 50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％的序列 一致性。甚至更优选地，所述非免疫球蛋白结合部分包含一个、两个或 三个下述的CDRs：DOM10-176-535(SEQ ID NO：1587)、DOM10-53- 223(SEQ ID NO：1090)、DOM10-53-234(SEQ ID NO：1101)、DOM10- 53-316(SEQ ID NO：1182)、DOM10-53-339(SEQ ID NO：1203)、 DOM10-53-344(SEQ ID NO：1208)和DOM10-53-396(SEQ ID NO：1260)。

在某些实施方案中，具有对IL-13具结合特异性的结合位点的多肽 域抗聚集，可逆地解折叠，包含框架区和/或以如上文所述具有对IL-4 具结合特异性的结合位点的多肽域的方式被分泌。

与血清白蛋白结合的dAb单体

本发明的所述配体可进一步包含以Kd为1nM至500μM(即x 10-9至5x10-4)，优选100nM至10μM与血清白蛋白结合的dAb 单体。优选地，对于含有抗SA dAb的配体，所述配体与其靶标的结合 (如表面等离振子共振测定的Kd和/或Koff，(如使用BiaCore))) 相比于SA要强1至100000倍(优选100至100000，更优选1000至 100000，或10000至100000倍)。优选地，所述血清白蛋白是人血清 白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与 SA(即HSA)结合的Kd大约为50，优选70，更优选100、150或 200nM。

在某些实施方案中，所述与SA结合的dAb单体抗聚集，可逆性 解折叠和/或包含如本文所述的与IL-4结合的dAb单体的框架区。

在具体实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段是与 人血清白蛋白结合的dAb。在一些实施方案中，所述dAb与人血清白 蛋白结合，并与选自下述的dAb竞争与白蛋白结合：DOM7m-16(SEQ ID NO：1733)、DOM7m-12(SEQ ID NO：1734)、DOM7m-26(SEQ ID NO：1735)、DOM7r-1(SEQ ID NO：1736)、DOM7r-3(SEQ ID NO：1737)、DOM7r-4(SEQ ID NO：1738)、DOM7r-5(SEQ ID NO：1739)、DOM7r-7(SEQ ID NO：1740)、DOM7r-8(SEQ ID NO：1741)、DOM7h-2(SEQ ID NO：1742)、DOM7h-3(SEQ ID NO：1743)、DOM7h-4(SEQ ID NO：1744)、DOM7h-6(SEQ ID NO：1745)、DOM7h-1(SEQ ID  NO：1746)、DOM7h-7(SEQ ID NO：1747)、DOM7h-22(SEQ ID NO：1748)、DOM7h-23(SEQ ID NO：1749)、DOM7h-24(SEQ ID NO：1750)、DOM7h-25(SEQ ID NO：1751)、DOM7h-26(SEQ ID NO：1752)、DOM7h-21(SEQ ID NO：1753)、DOM7h-27(SEQ ID NO：1754)、DOM7h-8(SEQ ID NO：1756)、DOM7r-13(SEQ ID NO：1757)、DOM7r-14(SEQ ID NO：1758)、DOM7r-15(SEQ ID NO：1759)、DOM7r-16(SEQ ID NO：1760)、DOM7r-17(SEQ ID NO：1761)、DOM7r-18(SEQ ID NO：1762)、DOM7r-19(SEQ ID NO：1763)、DOM7r-20(SEQ ID NO：1764)、DOM7r-21(SEQ ID NO：1765)、DOM7r-22(SEQ ID NO：1766)、DOM7r-23(SEQ ID NO：1767)、DOM7r-24(SEQ ID NO：1768)、DOM7r-25(SEQ ID NO：1769)、DOM7r-26(SEQ ID NO：1770)、DOM7r-27(SEQ ID NO：1771)、DOM7r-28(SEQ ID NO：1772)、DOM7r-9(SEQ ID NO：1773)、DOM7r-30(SEQ ID NO：1774)、DOM7r-31(SEQ ID NO：1775)、DOM7r-32(SEQ ID NO：1776) 和DOM7r-33(SEQ ID NO：1777)。

在一些实施方案中，所述dAb与人血清白蛋白结合，并包含氨基 酸序列，该序列与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约80％，至 少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约 97％，或至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM7r-1 (SEQ ID NO：1736)、DOM7r-3(SEQ ID NO：1737)、DOM7r-4(SEQ ID NO：1738)、DOM7r-5(SEQ  ID NO：1739)、DOM7r-7(SEQ ID NO：1740)、DOM7r-8(SEQ ID  NO：1741)、DOM7h-2(SEQ ID NO：1742)、DOM7h-3(SEQ ID NO：1743)、DOM7h-4(SEQ ID NO：1744)、DOM7h-6(SEQ ID NO：1745)、DOM7h-1(SEQ ID NO：1746)、DOM7h-7(SEQ ID NO：1747)、DOM7h-22(SEQ ID NO：1748)、DOM7h-23(SEQ ID NO：1749)、DOM7h-24(SEQ ID NO：1750)、DOM7h-25(SEQ ID NO：1751)、DOM7h-26(SEQ ID NO：1752)、DOM7h-21(SEQ ID NO：1753)、DOM7h-27(SEQ ID NO：1754)、DOM7h-8(SEQ ID NO：1756)、DOM7r-13(SEQ ID NO：1757)、DOM7r-14(SEQ ID NO：1758)、DOM7r-15(SEQ ID NO：1759)、DOM7r-16(SEQ ID NO：1760)、DOM7r-17(SEQ ID NO：1761)、DOM7r-18(SEQ ID NO：1762)、DOM7r-19(SEQ ID NO：1763)、DOM7r-20(SEQ ID NO：1764)、DOM7r-21(SEQ ID NO：1765)、DOM7r-22(SEQ ID NO：1766)、DOM7r-23(SEQ ID NO：1767)、DOM7r-24(SEQ ID NO：1768)、DOM7r-25(SEQ ID NO：1769)、DOM7r-26(SEQ ID NO：1770)、DOM7r-27(SEQ ID NO：1771)、DOM7r-28(SEQ ID NO：1772)、DOM7r-29(SEQ ID NO：1773)、DOM7r-30(SEQ ID NO：1774)、DOM7r-31(SEQ ID NO：1775)、DOM7r-32(SEQ ID NO：1776)和DOM7r-3(SEQ ID NO：1777)。

例如，与人血清白蛋白结合的所述dAb可包含氨基酸序列，该序 列与DOM7h-2(SEQ ID NO：1742)、DOM7h-3(SEQ ID NO：1743)、 DOM7h-4(SEQ ID NO：1744)、DOM7h-6(SEQ ID NO：1745)、DOM7h-1 (SEQ ID NO：1746)、DOM7h-7(SEQ ID NO：1747)、DOM7h-8(SEQ ID NO：1756)、DOM7r-13(SEQ ID NO：1757)、DOM7r-14(SEQ ID NO：1758)、DOM7h-22(SEQ ID NO：1748)、DOM7h-23(SEQ ID NO：1749)、DOM7h-24(SEQ ID NO：1750)、DOM7h-25(SEQ ID NO：1751)、DOM7h-26(SEQ ID NO：1752)、DOM7h-21(SEQ ID NO：1753)和DOM7h-27(SEQ ID NO：1754)具有至少约90％，或至少约 95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％ 的氨基酸序列一致性。

氨基酸序列的一致性优选采用合适的序列比对算法和预设参数进行 测定，例如BLAST P(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-2268(1990))。

在更具体实施方案中，所述dAb是与人血清白蛋白结合，并包含 选自下述的氨基酸序列的VκdAb：DOM7h-2(SEQ ID NO：1742)、 DOM7h-3(SEQ ID NO：1743)、DOM7h-4(SEQ ID NO：1744)、DOM7h-6 (SEQ ID NO：1745)、DOM7h-1(SEQ ID NO：1746)、DOM7h-7(SEQ ID NO：1747)、DOM7h-8(SEQ ID NO：1756)、DOM7r-13(SEQ ID NO：1757) 和DOM7r-14(SEQ ID NO：1758)，或是具有选自下述的氨基酸序列的 VH dAb：DOM7h-22(SEQ ID NO：1748)、DOM7h-23(SEQ ID NO：1749)、DOM7h-24(SEQ ID NO：1750)、DOM7h-25(SEQ ID NO：1751)、DOM7h-26(SEQ ID NO：1752)、DOM7h-21(SEQ ID NO：1753)、DOM7h-27(SEQ ID NO：1754)。在其他实施方案中，与血清 白蛋白结合的抗体的所述抗原结合片段是与人血清白蛋白结合并包含任 何前述氨基酸序列的CDR的dAb。

合适的与血清白蛋白结合的驼类(Camelid)VHH包括在WO 2004/041862(Ablynx N.V.)和本文公开的那些，例如序列A(SEQ ID NO：1778)，序列B(SEQ ID NO：1779)，序列C(SEQ ID NO：1780)，序 列D(SEQ ID NO：1781)，序列E(SEQ ID NO：1782)，序列F(SEQ ID NO：1783)，序列G(SEQ ID NO：1784)，序列H(SEQ ID NO：1785)，序 列I(SEQ ID NO：1786)，序列J(SEQ ID NO：1787)，序列K(SEQ ID NO：1788)，序列L(SEQ ID NO：1789)，序列M(SEQ ID NO：1790)，序 列N(SEQ ID NO：1791)，序列O(SEQ ID NO：1792)，序列P(SEQ ID NO：1793)，序列Q(SEQ ID NO：1794)。在某些实施方案中，驼类 (Camelid)VHH与人血清白蛋白结合，并包含氨基酸序列，该氨基酸 序列与SEQ ID NOS：1778-1794中任一项具有至少约80％，或至少约 85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约 97％，或至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性。

氨基酸序列一致性优选采用合适的序列比对算法和预设参数进行测 定，例如BLAST P(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-2268(1990))。

在一些实施方案中，所述配体包含抗血清白蛋白dAb，该dAb与 本文公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争与血清白蛋白(例如人血清白 蛋白)结合。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明还提供编码本文所述配体(双特异性配体和多特异性配体) 的分离的和/或重组核酸分子。

本文提及的“分离的”核酸是从其原始来源(例如存在于细胞 中或核酸混合物如文库中)的基因组DNA或细胞RNA的所述核酸 分离的核酸，并包括通过本文所述的方法或其他合适的方法得到的核 酸，包括基本上纯的核酸，通过化学合成，生物和化学方法的组合制 备的核酸，以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.et al.， Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；Lewis，AP.and J.S.Crowe， Gene，101：297-302(1991))。

本文提及的“重组的”核酸是通过重组DNA方法制备的核酸，包括通 过依赖于人工重组方法的方法产生的那些核酸，例如所述聚合酶链式反应 (PCR)和/或使用限制酶克隆到载体里。

在某些实施方案中，所述分离的和/或重组的核酸包含编码配体的 核苷酸序列，如本文所述，其中所述配体包含氨基酸序列，该序列与本 文公开的与IL-4结合的dAb，或本文公开的与IL-13结合的dAb的氨 基酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％， 至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致 性。

例如，在一些实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包含编码对 IL-4具结合特异性的配体的核苷酸序列，如本文所述，其中所述配体包 含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至 少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至 少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％， 至少约98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM9-15(SEQ ID NO：175)、DOM9-17(SEQ ID NO：176)、DOM9-23(SEQ ID NO：177)、 DOM9-24(SEQ ID NO：178)、DOM9-25(SEQ ID NO：179)、DOM9-27 (SEQ ID NO：180)、DOM9-28(SEQ ID NO：181)、DOM9-29(SEQ ID NO：182)、DOM9-30(SEQ ID NO：183)、DOM9-31(SEQ ID NO：184)、 DOM9-32(SEQ ID NO：185)、DOM9-33(SEQ ID NO：186)、DOM9-50 (SEQ ID NO：187)、DOM9-57(SEQ ID NO：188)、DOM9-59(SEQ ID NO：189)、DOM9-63(SEQ ID NO：190)、DOM9-67(SEQ ID NO：191)、 DOM9-68(SEQ ID NO：192)、DOM9-70(SEQ ID NO：193)、DOM9-79 (SEQ ID NO：194)、DOM9-82(SEQ ID NO：195)、DOM9-86(SEQ ID NO：196)、DOM9-94(SEQ ID NO：197)、DOM9-108(SEQ ID NO：198)、 DOM9-112(SEQ ID NO：199)、DOM9-112-1(SEQ ID NO：200)、DOM9- 112-2(SEQ ID NO：201)、DOM9-112-3(SEQ ID NO：202)、DOM9-112-4 (SEQ ID NO：203)、DOM9-112-5(SEQ ID NO：204)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：205)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：206)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：207)、DOM9-112-9(SEQ ID NO：208)、DOM9-112-10(SEQ ID NO：209)、DOM9-112-11(SEQ ID NO：210)、DOM9-112-12(SEQ ID NO：211)、DOM9-112-13(SEQ ID NO：212)、DOM9-112-14(SEQ ID NO：213)、DOM9-112-15(SEQ ID NO：214)、DOM9-112-16(SEQ ID NO：215)、DOM9-112-17(SEQ ID NO：216)、DOM9-112-18(SEQ ID NO：217)、DOM9-112-19(SEQ ID NO：218)、DOM9-112-20(SEQ ID NO：219)、DOM9-112-21(SEQ ID NO：220)、DOM9-112-22(SEQ ID NO：221)、DOM9-112-23(SEQ ID NO：222)、DOM9-112-25(SEQ ID NO：223)、DOM9-112-81(SEQ ID NO：224)、DOM9-112-82(SEQ ID NO：225)、DOM9-112-83(SEQ ID NO：226)、DOM9-112-84(SEQ ID NO：227)、DOM9-112-85(SEQ ID NO：228)、DOM9-112-86(SEQ ID NO：229)、DOM9-112-87(SEQ ID NO：230)、DOM9-112-88(SEQ ID NO：231)、DOM9-112-89(SEQ ID NO：232)、DOM9-112-90(SEQ ID NO：233)、DOM9-112-91(SEQ ID NO：234)、DOM9-112-92(SEQ ID NO：235)、DOM9-112-93(SEQ ID NO：236)、DOM9-112-94(SEQ ID NO：237)、DOM9-112-95(SEQ ID NO：238)、DOM9-112-96(SEQ ID NO：239)、DOM9-112-97(SEQ ID NO：240)、DOM9-112-98(SEQ ID NO：241)、DOM9-112-99(SEQ ID NO：242)、DOM9-112-100(SEQ ID NO：243)、DOM9-112-101(SEQ ID NO：244)、DOM9-1132-102(SEQ ID NO：245)、DOM9-112-103(SEQ ID NO：246)、DOM9-112-104(SEQ ID NO：247)、DOM9-112-105(SEQ ID NO：248)、DOM9-112-106(SEQ ID NO：249)、DOM9-112-107(SEQ ID NO：250)、DOM9-112-108(SEQ ID NO：251)、DOM9-112-109(SEQ ID NO：252)、DOM9-112-110(SEQ ID NO：253)、DOM9-112-111(SEQ ID NO：254)、DOM9-112-112(SEQ ID NO：255)、DOM9-112-113(SEQ ID NO：256)、DOM9-112-114(SEQ ID NO：257)、DOM9-112-115(SEQ ID NO：258)、DOM9-112-116(SEQ ID NO：259)、DOM9-112-117(SEQ ID NO：260)、DOM9-112-118(SEQ ID NO：261)、DOM9-112-119(SEQ ID NO：262)、DOM9-112-120(SEQ ID NO：263)、DOM9-112-121(SEQ ID NO：264)、DOM9-112-122(SEQ ID NO：265)、DOM9-112-123(SEQ ID NO：266)、DOM9-112-124(SEQ ID NO：267)、DOM9-112-125(SEQ ID NO：268)、DOM9-112-126(SEQ ID NO：269)、DOM9-112-127(SEQ ID NO：270)、DOM9-112-128(SEQ ID NO：271)、DOM9-112-134(SEQ ID NO：272)、DOM9-112-135(SEQ ID NO：273)、DOM9-112-136(SEQ ID NO：274)、DOM9-112-137(SEQ ID NO：275)、DOM9-112-138(SEQ ID NO：276)、DOM9-112-140(SEQ ID NO：277)、DOM9-112-141(SEQ ID NO：278)、DOM9-112-142(SEQ ID NO：279)、DOM9-112-143(SEQ ID NO：280)、DOM9-112-144(SEQ ID NO：281)、DOM9-112-145(SEQ ID NO：282)、DOM9-112-146(SEQ ID NO：283)、DOM9-112-147(SEQ ID NO：284)、DOM9-112-148(SEQ ID NO：285)、DOM9-112-149(SEQ ID NO：286)、DOM9-112-150(SEQ ID NO：287)、DOM9-112-151(SEQ ID NO：288)、DOM9-112-152(SEQ ID NO：289)、DOM9-112-153(SEQ ID NO：290)、DOM9-112-154(SEQ ID NO：291)、DOM9-112-155(SEQ ID NO：292)、DOM9-112-156(SEQ ID NO：293)、DOM9-112-157(SEQ ID NO：294)、DOM9-112-158(SEQ ID NO：295)、DOM9-112-159(SEQ ID NO：296)、DOM9-112-160(SEQ ID NO：297)、DOM9-112-161(SEQ ID NO：298)、DOM9-112-162(SEQ ID NO：299)、DOM9-112-163(SEQ ID NO：300)、DOM9-112-164(SEQ ID NO：301)、DOM9-112-165(SEQ ID NO：302)、DOM9-112-166(SEQ ID NO：303)、DOM9-112-167(SEQ ID NO：304)、DOM9-112-168(SEQ ID NO：305)、DOM9-112-169(SEQ ID NO：306)、DOM9-112-170(SEQ ID NO：307)、DOM9-112-171(SEQ ID NO：308)、DOM9-112-172(SEQ ID NO：309)、DOM9-112-173(SEQ ID NO：310)、DOM9-112-174(SEQ ID 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NO：645)、DOM9-160(SEQ ID NO：646)、DOM9-161(SEQ ID NO：647)、DOM9-162(SEQ ID NO：648)、DOM9-163(SEQ ID NO：649) 和DOM9-164(SEQ ID NO：650)。

在一些实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包含编码对IL-4具 结合特异性的配体的核苷酸序列，如本文所述，其中所述配体包含氨基 酸序列，该氨基酸序列与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM9-155-77(SEQ ID NO：2426)、DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)、DOM9-112-204(SEQ ID NO：2428)、DOM9-112-205(SEQ ID NO：2429)、DOM9-112-206(SEQ ID NO：2430)、DOM9-112-207(SEQ ID NO：2431)、DOM9-112-208(SEQ ID NO：2432)、DOM9-112-209(SEQ ID NO：2433)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2434)、DOM9-112-211(SEQ ID NO：2435)、DOM9-112-212(SEQ ID NO：2436)、DOM9-112-213(SEQ ID NO：2437)、DOM9-112-214(SEQ ID NO：2438)、DOM9-112-215(SEQ ID NO：2439)、DOM9-112-216(SEQ ID NO：2440)、DOM9-112-217(SEQ ID NO：2441)、DOM9-112-218(SEQ ID NO：2442)、DOM9-112-219(SEQ ID NO：2443)、DOM9-112-220(SEQ ID NO：2444)、DOM9-112-221(SEQ ID NO：2445)、DOM9-112-222(SEQ ID NO：2446)、DOM9-112-223(SEQ ID NO：2447)、DOM9-112-224(SEQ ID NO：2448)、DOM9-112-225(SEQ ID NO：2449)、DOM9-112-226(SEQ ID NO：2450)、DOM9-112-227(SEQ ID NO：2451)、DOM9-112-228(SEQ ID NO：2452)、DOM9-112-229(SEQ ID NO：2453)、DOM9-112-230(SEQ ID NO：2454)、DOM9-112-231(SEQ ID NO：2455)、DOM9-112-233(SEQ ID NO：1734)、DOM9-112-232(SEQ ID NO：1733)和DOM9-112-234(SEQ ID NO：1735)。

在其他实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包含编码对IL-13 具结合特异性的配体的核苷酸序列，如本文所述，其中所述配体包含氨 基酸序列，该氨基酸序列与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM10-53(SEQ ID NO：967)、DOM10-53-1(SEQ ID NO：968)、DOM10-53-2(SEQ ID NO：969)、DOM10-53-3(SEQ ID NO：970)、DOM10-53-4(SEQ ID NO：971)、DOM10-53-5(SEQ ID NO：972)、DOM10-53-6(SEQ ID NO：973)、DOM10-53-7(SEQ ID NO：974)、DOM10-53-8(SEQ ID NO：975)、DOM10-53-9(SEQ ID NO：976)、DOM10-53-10(SEQ ID NO：977)、DOM10-53-11(SEQ ID NO：978)、DOM10-53-12(SEQ ID NO：979)、DOM10-53-13(SEQ ID NO：980)、DOM10-53-14(SEQ ID NO：981)、DOM10-53-15(SEQ ID NO：982)、DOM10-53-16(SEQ ID NO：983)、DOM10-53-17(SEQ ID NO：984)、DOM10-53-18(SEQ ID NO：985)、DOM10-53-19(SEQ ID NO：986)、DOM10-53-20(SEQ ID NO：987)、DOM10-53-21(SEQ ID NO：988)、DOM10-53-122(SEQ ID NO：989)、DOM10-53-123(SEQ ID NO：990)、DOM10-53-24(SEQ ID NO：991)、DOM10-53-25(SEQ ID NO：992)、DOM10-53-26(SEQ ID NO：993)、DOM10-53-27(SEQ ID NO：994)、DOM10-53-28(SEQ ID 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在其他实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包含编码对IL-13 具结合特异性的配体的核苷酸序列，如本文所述，其中所述配体包含氨 基酸序列，该氨基酸序列与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM10-236(SEQ ID NO：2129)、DOM10-238(SEQ ID NO：2130)、DOM10-241(SEQ ID NO：2131)、DOM10-245(SEQ ID NO：2132)、DOM10-249(SEQ ID NO：2133)、DOM10-250(SEQ ID NO：2134)、DOM10-251(SEQ ID NO：2135)、DOM10-254(SEQ ID NO：2136)、DOM10-256(SEQ ID NO：2137)、DOM10-259(SEQ ID NO：2138)、DOM10-260(SEQ ID NO：2139)、DOM10-261(SEQ ID NO：2140)、DOM10-263(SEQ ID NO：2141)、DOM10-264(SEQ ID NO：2142)、DOM10-273(SEQ ID NO：2143)、DOM10-278(SEQ ID NO：2144)、DOM10-279(SEQ ID NO：2145)、DOM10-281(SEQ ID NO：2146)、DOM10-282(SEQ ID NO：2147)、DOM10-283(SEQ ID NO：2148)、DOM10-400(SEQ ID NO：2149)、DOM10-401(SEQ ID NO：2150)、DOM10-402(SEQ ID NO：2151)、DOM10-404(SEQ ID NO：2152)、DOM10-406(SEQ ID NO：2153)、DOM10-407(SEQ ID NO：2154)、DOM10-409(SEQ ID NO：2155)、DOM10-410(SEQ ID NO：2156)、DOM10-414(SEQ ID NO：2157)、DOM10-415(SEQ ID NO：2158)、DOM10-416(SEQ ID 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在其他实施方案中，所述编码对IL-4具结合特异性的配体的分离 的和/或重组核酸，如本文所述，其中所述核酸包含核苷酸序列，该核 苷酸序列与编码选自下述的抗IL-4dAb的核苷酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的核苷酸序列一致性：DOM9-15(SEQ ID NO：1)、 DOM9-17(SEQ ID NO：2)、DOM9-23(SEQ ID NO：3)、DOM9-24(SEQ ID NO：4)、DOM9-25(SEQ ID NO：5)、DOM9-27(SEQ ID NO：6)、 DOM9-28(SEQ ID NO：7)、DOM9-29(SEQ ID NO：8)、DOM9-30(SEQ ID NO：9)、DOM9-31(SEQ ID NO：10)、DOM9-32(SEQ ID NO：11)、 DOM9-33(SEQ ID NO：12)、DOM9-50(SEQ ID NO：13)、DOM9-57 (SEQ ID NO：14)、DOM9-59(SEQ ID NO：15)、DOM9-63(SEQ ID NO：16)、DOM9-67(SEQ ID NO：17)、DOM9-68(SEQ ID NO：18)、 DOM9-70(SEQ ID NO：19)、DOM9-79(SEQ ID NO：20)、DOM9-82 (SEQ ID NO：21)、DOM9-86(SEQ ID NO：22)、DOM9-94(SEQ ID NO：23)、DOM9-108(SEQ ID NO：24)、DOM9-112(SEQ ID NO：25)、 DOM9-112-1(SEQ ID NO：26)、DOM9-112-2(SEQ ID NO：27)、DOM9- 112-3(SEQ ID NO：28)、DOM9-112-4(SEQ ID NO：29)、DOM9-112-5 (SEQ ID NO：30)、DOM9-112-6(SEQ ID NO：31)、DOM9-112-7(SEQ ID NO：32)、DOM9-112-8(SEQ ID NO：33)、DOM9-112-9(SEQ ID 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(SEQ ID NO：390)、DOM9-44-533(SEQ ID NO：391)、DOM9-44-534 (SEQ ID NO：392)、DOM9-44-535(SEQ ID NO：393)、DOM9-44-536 (SEQ ID NO：394)、DOM9-44-537(SEQ ID NO：395)、DOM9-44-538 (SEQ ID NO：396)、DOM9-44-539(SEQ ID NO：397)、DOM9-44-540 (SEQ ID NO：398)、DOM9-44-541(SEQ ID NO：399)、DOM9-44-542 (SEQ ID NO：400)、DOM9-44-543(SEQ ID NO：401)、DOM9-44-544 (SEQ ID NO：402)、DOM9-44-545(SEQ ID NO：403)、DOM9-44-546 (SEQ ID NO：404)、DOM9-44-547(SEQ ID NO：405)、DOM9-44-548 (SEQ ID NO：406)、DOM9-44-549(SEQ ID NO：407)、DOM9-44-550 (SEQ ID NO：408)、DOM9-44-551(SEQ ID NO：409)、DOM9-44-552 (SEQ ID NO：410)、DOM9-44-553(SEQ ID NO：411)、DOM9-44-554 (SEQ ID NO：412)、DOM9-44-555(SEQ ID NO：413)、DOM9-44-556 (SEQ ID NO：414)、DOM9-44-557(SEQ ID NO：415)、DOM9-44-558 (SEQ ID NO：416)、DOM9-44-559(SEQ ID NO：417)、DOM9-44-560 (SEQ ID NO：418)、DOM9-44-561(SEQ ID NO：419)、DOM9-44-562 (SEQ ID NO：420)、DOM9-44-563(SEQ ID NO：421)、DOM9-44-564 (SEQ ID NO：422)、DOM9-44-565(SEQ ID NO：423)、DOM9-44-566 (SEQ ID NO：424)、DOM9-44-625(SEQ ID NO：425)、DOM9-44-626 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序列全长进行测定的。

在其他实施方案中，所述编码对IL-4具结合特异性的配体的分离 的和/或重组核酸，如本文所述，其中所述核酸包含核苷酸序列，该核 苷酸序列与编码选自下述的抗IL-4dAb的核苷酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的核苷酸序列一致性：DOM9-155-77(SEQ ID NO：2393)、DOM9-155-78(SEQ ID NO：2394)、DOM9-112-204(SEQ ID NO：2395)、DOM9-112-205(SEQ ID NO：2396)、DOM9-112-206(SEQ ID NO：2397)、DOM9-112-207(SEQ ID NO：2398)、DOM9-112-208(SEQ ID NO：2399)、DOM9-112-209(SEQ ID NO：2400)、DOM9-112-210(SEQ ID NO：2401)、DOM9-112-211(SEQ ID NO：2402)、DOM9-112-212(SEQ ID NO：2403)、DOM9-112-213(SEQ ID NO：2404)、DOM9-112-214(SEQ ID NO：2405)、DOM9-112-215(SEQ ID NO：2406)、DOM9-112-216(SEQ ID NO：2407)、DOM9-112-217(SEQ ID NO：2408)、DOM9-112-218(SEQ ID NO：2409)、DOM9-112-219(SEQ ID NO：2410)、DOM9-112-220(SEQ ID NO：2411)、DOM9-112-221(SEQ ID NO：2412)、DOM9-112-222(SEQ ID NO：2413)、DOM9-112-223(SEQ ID NO：2414)、DOM9-112-224(SEQ ID NO：2415)、DOM9-112-225(SEQ ID NO：2416)、DOM9-112-226(SEQ ID NO：2417)、DOM9-112-227(SEQ ID NO：2418)、DOM9-112-228(SEQ ID NO：2419)、DOM9-112-229(SEQ ID NO：2420)、DOM9-112-230(SEQ ID NO：2421)、DOM9-112-231(SEQ ID NO：2422)、DOM9-112-233(SEQ ID NO：2423)、DOM9-112-232(SEQ ID NO：2424)和DOM9-112-234(SEQ ID NO：2425)。

在其他实施方案中，所述编码对IL-13具结合特异性的配体的分离 的和/或重组核酸，如本文所述，其中所述核酸包含核苷酸序列，该核 苷酸序列与编码选自下述的抗IL-13dAb的核苷酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的核苷酸序列一致性：DOM10-53(SEQ ID NO：651)、DOM10-53-1(SEQ ID NO：652)、DOM10-53-2(SEQ ID NO：653)、DOM10-53-3(SEQ ID NO：654)、DOM10-53-4(SEQ ID NO：655)、DOM10-53-5(SEQ ID NO：656)、DOM10-53-6(SEQ ID NO：657)、DOM10-53-7(SEQ ID NO：658)、DOM10-53-8(SEQ ID NO：659)、DOM10-53-9(SEQ ID NO：660)、DOM10-53-10(SEQ ID NO：661)、DOM10-53-11(SEQ ID NO：662)、DOM10-53-12(SEQ ID NO：663)、DOM10-53-13(SEQ ID NO：664)、DOM10-53-14(SEQ ID NO：665)、DOM10-53-15(SEQ ID NO：666)、DOM10-53-16(SEQ ID NO：667)、DOM10-53-17(SEQ ID NO：668)、DOM10-53-18(SEQ ID NO：669)、DOM10-53-19(SEQ ID NO：670)、DOM10-53-20(SEQ ID NO：671)、DOM10-53-21(SEQ ID NO：672)、DOM10-53-122(SEQ ID NO：673)、DOM10-53-123(SEQ ID NO：674)、DOM10-53-24(SEQ ID NO：675)、DOM10-53-25(SEQ ID NO：676)、DOM10-53-26(SEQ ID NO：677)、DOM10-53-27(SEQ ID NO：678)、DOM10-53-28(SEQ ID 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在其他实施方案中，所述编码对IL-13具结合特异性的配体的分离 的和/或重组核酸，如本文所述，其中所述核酸包含核苷酸序列，该核 苷酸序列与编码选自下述的抗IL-13dAb的核苷酸序列具有至少约 80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％的核苷酸序列一致性：DOM10-236(SEQ ID NO：1804)、DOM10-238(SEQ ID NO：1805)、DOM10-241(SEQ ID NO：1806)、DOM10-245(SEQ ID NO：1807)、DOM10-249(SEQ ID NO：1808)、DOM10-250(SEQ ID NO：1809)、DOM10-251(SEQ ID NO：1810)、DOM10-254(SEQ ID NO：1811)、DOM10-256(SEQ ID NO：1812)、DOM10-259(SEQ ID NO：1813)、DOM10-260(SEQ ID NO：1814)、DOM10-261(SEQ ID NO：1815)、DOM10-263(SEQ ID NO：1816)、DOM10-264(SEQ ID NO：1817)、DOM10-273(SEQ ID NO：1818)、DOM10-278(SEQ ID NO：1819)、DOM10-279(SEQ ID NO：1820)、DOM10-281(SEQ ID NO：1821)、DOM10-282(SEQ ID NO：1822)、DOM10-283(SEQ ID NO：1823)、DOM10-400(SEQ ID NO：1824)、DOM10-401(SEQ ID NO：1825)、DOM10-402(SEQ ID NO：1826)、DOM10-404(SEQ ID NO：1827)、DOM10-406(SEQ ID NO：1828)、DOM10-407(SEQ ID NO：1829)、DOM10-409(SEQ ID NO：1830)、DOM10-410(SEQ ID NO：1831)、DOM10-414(SEQ ID NO：1832)、DOM10-415(SEQ ID NO：1833)、DOM10-416(SEQ ID 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本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案 中，该载体是包含一种或多种可操作地连接到本发明重组核酸的表达调 控元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子或 载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌体展示载体)、表 达调控元件、宿主细胞和制备本发明重组宿主细胞的方法在本领域是公 知的，本文的实施例会进一步说明。

合适的表达载体可含有若干构件，例如复制起点、选择标记基因、 一种或多种表达调控元件如转录调控元件(如启动子、增强子、终止 子)和/或一种或多种翻译信号、信号序列或前导序列等等。表达调控 元件和信号序列如果存在，则由载体或其他来源提供。例如编码抗体链 的克隆核酸的转录和/或翻译调控序列可用于直接表达。

可提供启动子用于所需宿主细胞内的表达。启动子可以是组成型的 或诱导型的。例如，启动子可以是可操作地连接到编码抗体、抗体链或 其部分的核酸上，从而引导所述核酸转录。可获得各种原核细胞(如大 肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和真核细胞(如猴病毒40早期或 晚期启动子，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列、巨细胞病毒启动子、腺病 毒晚期启动子)宿主的合适启动子。

此外，表达载体通常包含筛选携带所述载体的宿主细胞的选择性标 记，对于复制表达载体来说，还包含复制起点。编码具有抗菌或耐药性 的产物的基因是常用选择性标记，可用于原核细胞(如内酰胺酶基因 (耐氨苄西林)、四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(如新霉素 (G418或遗传霉素)、谷丙转氨酶(霉酚酸)、氨苄西林或潮霉素抗 性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因在多种宿主细胞中允许用甲氨蝶呤 进行筛选。编码宿主营养缺陷型标记的基因产物的基因(如LEU2、 URA3、HIS3)常用作酵母中的选择性标记。使用病毒(例如杆状病 毒)或噬菌体载体，以及能整合到宿主细胞基因组的载体如逆转录病毒 载体，也在考虑范围中。在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌(E. coli))、昆虫细胞(果蝇(Drosophila Schnieder)S2细胞、Sf9)和酵母 (甲醇毕赤酵母(P.Methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)、酿酒酵 母(S.cerevisiae))中表达的合适的表达载体为本领域所公知。

合适的宿主细胞可以是原核的，包括细菌细胞如大肠杆菌、枯草芽 孢杆菌(B.subtilis)和/或其他合适的细菌；真核细胞，如真菌或酵母细胞 (如巴斯德毕赤酵母、曲霉(Aspergillus sp.)、酿酒酵母、稷酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其他 更低等的真核细胞，以及更高等的真核细胞如昆虫细胞(如果蝇 (Drosophila Schnieder)S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087 (O’Connor))，哺乳动物细胞(例如COS细胞，如COS-1(ATCC检索 号No.CRL-1650)和COS-7(ATCC检索号No.CRL-1651)、CHO(如 ATCC检索号No.CRL-9096、CHO DG44(Urlaub，G.and Chasin，LA.， Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7)：4216-4220(1980)))、293(ATCC检索号 No.CRL-1573)、HeLa(ATCC检索号No.CCL-2)、CV1(ATCC检索号 No.CCL-70)、WOP(Dailey，L.，et al.，J.Virol.，54：739-749(1985)、3T3、 293T(Pear，W.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993)) NS0细胞、SP2/0、HuT 78细胞等等，或植物细胞(如烟草)。(参 见例如Ausubel，F.M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates and John Wiley &Sons Inc.(1993))。在一些 实施方案中，所述宿主细胞是分离的宿主细胞，不是多细胞有机体(如 植物或动物)的一部分。在优选的实施方案中，宿主细胞是非人的宿主 细胞。

本发明还提供制备本发明的配体(如双特异性配体、多特异性配 体)的方法，包含将包含本发明的重组核酸的重组宿主细胞保持在适合 重组核酸表达的条件下，从而使重组核酸得以表达并且生成配体。在一 些实施方案中，所述方法进一步包含分离所述配体。

基于免疫球蛋白的配体的制备

根据本发明的配体(如双特异性配体、多特异性)可根据以往确立 的用于抗体工程领域的技术制备，用于scFv、“噬菌体”抗体和其他人工 改造抗体分子的制备。用于制备抗体的技术如下列综述和其引用文献中 所描述的：Winter &Milstein，(1991)Nature 349：293-299；Pluckthun (1992)Immunological Reviews 130：151-188；Wright et al.，(1992)Crti.Rev. Immunol.12：125-168；Holliger，P.&Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4， 446-449；Carter，et al.(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.& Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom，H.R. (1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol. 15，618-619；Plückthun，A.&Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83- 105；Carter，P.&Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449- 454；Holliger，P.&Winter，G.(1997)Cancer Immunol.Immunother.45，128- 130。

筛选具有所需特异性的抗体可变域所采用的合适技术使用的是本领 域已知的库和筛选方法。使用从人B细胞采集到的重排V基因的天然 库(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan et al.(1996)Nature Biotech.，14：309)为本领域技术人员所公知。合成库((Hoogenboom& Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad. Sci USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al. (1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)通 常采用PCR技术由克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR方法中的错误可 导致高度随机性。VH和/或VL文库可针对靶抗原或表位分别进行筛 选，在这种情况下直接选择单域结合，或者可一起进行筛选。

文库载体系统

本领域已知的各种筛选系统都适用于本发明。这种系统的例子描述 如下。

可直接检测噬菌体λ表达系统的噬菌体噬菌斑或溶源性细菌菌落， 此二者如前所述(Huse et al.(1989)Science，246：1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax et al.(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，88：2432)，并在本发明中使用。虽然此种表达系统可用于筛 选文库的最多达106种不同成员，但的确不适合筛选更大的数量(大于 106种成员)。文库构建中特别使用的是能使核酸连接到其表达的多肽 上的筛选展示系统。正如本文所使用的，筛选展示系统是借由合适的展 示手段，通过与通用的和/或靶配体结合从而对库的各个成员进行筛选 的系统。

分离所需大库成员的筛选过程为本领域所知，代表性的如噬菌体展 示技术。这种各种肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott and Smith (1990)Science，249：386)，已被证实可用于建立抗体片段(以及编码它 们的核苷酸序列)库，这种库用于体外筛选和扩增与靶抗原结合的特异 性抗体片段(McCafferty et al.，WO 92/01047)。编码可变区的核苷酸序列 被连接到编码引导其进入大肠杆菌周质空间的前导信号的基因片段上， 结果得到的抗体片段展示在噬菌体表面，典型的是与噬菌体外壳蛋白 (如pIII或pVIII)相融合。或者抗体片段展示在λ噬菌体衣壳 (phagebodies)外表面。基于噬菌体的展示系统的优点是，由于其为生 物系统，所以选定的库成员可仅通过使含有选定文库成员的噬菌体在细 菌细胞中生长而得以扩增。此外由于编码多肽库成员的所述核苷酸序列 包含在噬菌体或噬菌粒载体中，因而序列测定、表达和后续遗传操作相 对简单。

噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法为本领域所公 知(McCafferty et al.(1990)Nature，348：552；Kang et al.(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991)Nature，352：624； Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Burton et al.(1991)Proc. Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al. (1991)Gene，104：147；Marks et al.(1991)supra；Barbas et al.(1992) supra；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks et al.，1992， J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313在此引作 参考。

一种特别有利的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston et al.，1988， Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，85：5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc. Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty et al.(1990)supra； Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222： 581；Chiswell et al.(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks et al.(1992)J. Biol.Chem.，267)。已描述了展示在噬菌体外壳蛋白的scFv文库的各种 实施方案。噬菌体展示方法的改进也为公众所知，例如在WO96/06213 和WO92/01047(Medical Research Council et al.)以及WO97/08320 (Morphosys)中所述，其在此都引作参考。

其他产生多肽文库的系统涉及为体外合成文库成员使用无细胞酶促 装置。在一种方法中，通过多轮针对靶配体的筛选和PCR扩增的交替 操作，筛选RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249：505；Ellington and Szostak(1990)Nature，346：818)。类似的技术可用于鉴别与预先确定 的人转录因子结合的DNA序列(Thiesen and Bach(1990)Nucleic Acids Res.，18：3203；Beaudry and Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258 and WO92/14843)。类似地，体外翻译可作为生成大的文库的方法用 于合成多肽。这些一般包含稳定的多核糖体复合物的方法在 WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、 WO91/05058和WO92/02536中有进一步描述。如在WO95/22625和 WO95/11922(Affymax公司)中公开的非基于噬菌体的可供选择的展 示系统，使用多核糖体展示用于筛选的多肽。

还进一步的技术分类涉及人工小室里库的筛选，该人工小室允许基 因与其基因产物相连接。例如在WO99/02671、WO00/40712和Tawfik &Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6中描述的油包水乳剂形成 的微囊中，可筛选其中核酸编码所需基因产物的筛选系统。编码具有所 需活性基因产物的遗传因子被分隔进入微囊中，而后在微囊内转录和/ 或翻译生成其相应的基因产物(RNA或蛋白)。随后对生成具有所需 活性基因产物的遗传因子进行分类。该方法通过各种方法检测所需活性 以筛选感兴趣的基因产物。

文库构建

用于筛选的文库可使用本领域已知的技术构建，例如如上所述或可 商业渠道购买。用于本发明的文库在如WO99/20749中有描述。一旦选 定载体系统，并且一种或多种编码感兴趣的多肽的核酸序列被克隆到所 述文库载体，则可通过表达前的突变在被克隆的分子内产生多样性；或 者如上所述，在突变和额外的几轮筛选前，可表达并筛选被编码的蛋 白。通过标准分子方法对编码结构经优化的多肽的核酸序列进行突变。 特别使用的是聚合酶链反应，或PCR(Mullis and Faloona(1987) Methods Enzymol.，155：335，本文在此引作参考)。PCR采用由热稳定 的，依赖DNA的DNA聚合酶催化若干次循环的DNA复制，扩增感 兴趣的靶序列，这在本领域是公知的。各种抗体库的构建已在Winter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的文献里进行了讨 论。

使用模板DNA(至少1fg，更多地使用1-1000ng)以及至少 25pmol的寡核苷酸引物进行PCR；由于每个序列只需库分子的一小部 分即可表示，并且在之后的扩增循环中数量受到限制，所以当引物库大 部分是异质的时候，使用更大量的引物是有利的。典型的反应混合物包 括：2μl DNA、25pmol寡聚核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1 (Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或 2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)，去离子水 加至总体积25μl。以矿物油覆盖，使用程序热循环仪进行PCR反应。 PCR循环每一步的长度和温度以及循环次数，依据实际的严格性要求 进行调整。退火温度和时间都是由引物预期与模板对合的效率以及可接 受的错配程度来决定的；显然地，当核酸分子同时被扩增和突变时，至 少在第一轮合成中的错配是需要的。本领域一般技术人员都具备很好的 对严格的引物退火条件进行优化的能力。采用的退火温度为30℃至 72℃。模板分子最初变性正常发生在92℃-99℃之间，4分钟，随后是 20-40个循环，由变性(94-99℃，15秒-1分钟)，退火(温度如上述 讨论确定；1-2分钟)，和延伸(72℃，1-5分钟，取决于所述扩增产 物的长度)组成。最后的延伸一般是72℃，4分钟，可能后续还有4℃ 下不确定(0-24小时)的步骤。

单可变域结合

本发明中有用的免疫球蛋白可变域一旦选定，即可由本领域所知的 各种方法结合，包括共价和非共价的方法。优选的方法包括使用多肽接 头，如所述的例如与scFv分子连接(Bird et al.，(1988)Science 242：423- 426)。有关合适接头的讨论在Bird et al.Science 242，423-426；Hudson et al，Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson et al，Proc Nat Acad Sci USA 85，5879-5883中。接头优选柔性的，允许所述的两个单域 相互作用。一种接头的例子是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1至8，例如 2、3、4、5、或7。还可采用双价抗体中使用的柔性较低的接头 (Holliger et al.，(1993)Proc Nat Acad Sci(USA)90：6444-6448)。在一个 实施方案中，所采用的接头不是免疫球蛋白铰链区。

可变域可使用非接头的方法结合。例如通过自然生成或人为改造的 半胱氨酸残基得到的二硫桥可用于稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体 (Reiter et al.，(1994)Protein Eng.7：697-704)，或通过重塑可变域间的 界面以改善“适配性”从而改善相互作用的稳定性(Ridgeway et al.， (1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu et al.，(1997)Protein Science 6：781- 788)。可酌情采用其他连接或稳定免疫球蛋白可变域，特别是抗体VH 域的技术。

配体的表征

双特异性配体与细胞结合，或每个结合域与每个特异性靶标结合， 可通过本领域技术人员熟知的方法包括ELISA进行检测。在本发明优 选实施方案中，使用单克隆噬菌体ELISA对结合进行检测。噬菌体 ELISA可依据任何合适的方法进行：示例性方案如下所述。

每轮筛选制得的噬菌体群体可通过ELISA筛选其与选定抗原或表 位的结合，从而鉴定“多克隆”噬菌体抗体。来自这些群体的单个被感 染的细菌克隆的噬菌体可随后通过ELISA筛选以鉴定“单克隆”噬菌体 抗体。筛选与抗原或表位结合的可溶抗体片段也是理想的，这也可以通 过ELISA，使用例如针对C端或N端标签的试剂进行(参见如Winter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的文献)。

选定的噬菌体单克隆抗体的多样化还可以通过PCR产物的凝胶电 泳(Marks et al.1991，supra；Nissim et al.1994supra)、探针(Tomlinson et al.，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA的序列分析来评 定。

配体的结构

如果每个可变域是从V基因库筛选的，例如使用本文所述的噬菌 体展示技术，则这些可变域包含通用框架区(universal framework region)，这样就可以通过本文所述的通用型配体对其进行识别。通用框 架区、通用性配体等等的用途在WO99/20749有描述。

如果使用V基因库，则多肽序列的变化优选位于可变域的环结 构。两者中每个可变域的多肽序列可以或者用DNA改组技术或者突变 来改变，以增强各可变域与其互补对间的相互作用。DNA改组技术是 本领域所知的，并且在例如本文所引用的Stemmer，1994，Nature 370：389-391以及美国专利6,297,053中有教导，都在此引作参考。突变 的其他方法为本领域技术人员所熟知。

一般来说，筛选、制备以及形成双特异性配体所需的核酸分子和载 体构建物可用如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA.之类的标准实验手册中所述的方法来 构建和操作。

典型地用于本发明的核酸的操作是在重组载体上进行的。本文所用 的载体指用于将外源DNA引入细胞进行其表达和/或复制的非连续的元 件。这样的载体的筛选、构建，及随后的使用方法已为本领域普通技术 人员所熟知。大量载体可以公开获得，包括细菌质粒，噬菌体，人工染 色体以及附着体载体。此类载体可用于简单克隆及突变；或者还可以用 基因表达型载体。可筛选根据本发明所使用的载体，使其与编码所希望 大小的多肽编码序列相适应，典型的长度是0.25千碱基(kb)至40kb 或更长。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。每个载体含有 多种功能构件，一般包括克隆(或“多聚接头”)位点、复制起点，以 及至少一个选择标记基因。如果给定的载体为表达载体，其额外有一个 或多个下述构件：增强子元件、启动子、转录终止及信号序列，各自定 位于克隆位点的毗连区域，从而可操作地连接到编码根据本发明的双特 异性配体的基因上。

通常克隆与表达载体都含有使所述载体在一个或多个经筛选的宿主 细胞内复制的核酸序列。典型地在克隆载体中，该序列使载体不依赖于 宿主染色体DNA而自主复制，并含有复制起点或自主复制序列。各种 细菌，真菌以及病毒的此类序列已众所周知。所述质粒pBR322的复制 起点适合大多数革兰氏-阴性菌，该2微米的质粒起点适用于酵母，多 种病毒起点(如SV40，腺病毒)对哺乳动物细胞中的克隆载体是有用 的。总的来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点，除非这些用于哺乳 动物细胞的复制起点能复制高水平的DNA，比如COS细胞。

有利的是，克隆或表达载体可包含筛选基因，也称为选择性标记 物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养介质中存活或生长所必需 的蛋白。没有被含有筛选基因的载体转化的宿主细胞将因此无法在培养 介质中存活。典型的筛选基因编码赋予抗抗生素和其它毒素(如氨苄西 林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的性质，补充营养缺陷或提供生长介 质中没有的关键营养成分。

因为编码根据本发明的双特异性配体的载体在大肠杆菌中复制最便 利，所以大肠杆菌-选择性标记如赋予抗抗生素氨苄西林性质的β-内酰 胺酶基因是有用的。这些可从大肠杆菌质粒获得，如pBR322或如 pUC18或pUC19的pUC质粒。

表达载体通常含有启动子，其被宿主有机体识别并可操作地连接到 感兴趣的编码序列上。这样的启动子可以是是诱导型的或组成型的。 “可操作地连接”指并列连接，其中所述各构件间的关系使其以预期方式 发挥功能。调控序列“可操作地连接”到编码序列，该连接方式是指在适 宜于调控序列的条件下实现所述编码序列的表达。

适用于原核宿主的启动子包括如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱 性磷酸酯酶、色氨酸(trp)启动子系统，以及如tac启动子的杂合启动 子。在细菌系统中应用的启动子通常还含有可操作地连接到所述编码序 列的Shine-Delgarno序列。

优选的载体为表达载体，其使得对应于多肽库成员的核苷酸序列的 表达成为可能。因此用第一和/或第二抗原或表位的筛选可通过分离增 殖，表达多肽文库成员的单克隆的表达，或利用任何筛选展示系统进 行。如前所述，优选的筛选展示系统为噬菌体展示系统。因此可 利用噬菌体或噬菌粒载体(如pIT1或pIT2)。本发明中有用的前 导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA.。一个例子是 噬菌粒载体，其具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)，还有噬菌体 复制起点(用于单链DNA的生成)。此类载体的操作及表达在本领域 众所周知(Hoogenboom and Winter(1992)supra；Nissim et al.(1994) supra)。简而言之，所述载体含有使噬菌粒具有选择性的β-内酰胺酶基 因，以及表达盒上游的lac启动子，该表达盒(N端至C端)由pelB 前导序列(其引导表达的多肽进入周质空间)，多克隆位点(用于克隆 所述文库成员的核苷酸序列)，任选的一个或多个肽标签(检测用)， 任选的一个或多个TAG终止密码子以及噬菌体蛋白pIII组成。因此， 使用多种抑制型和非抑制型大肠杆菌株，加入葡萄糖，异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体如VCS M13，所述载体能象质粒那 样无表达地复制，仅产生大量的多肽库成员或产生噬菌体，其中有些含 有至少一个拷贝的融合在其表面的多肽-pIII。

采用常规连接技术构建编码根据本发明的双特异性配体的载体。被 分离的载体或DNA片段被切割、剪裁，以所需形式再连接，从而生成 所需载体。如果需要，可用已知的方式进行分析，以确认正确的序列出 现在所构建的载体中。构建表达载体，体外制备转录产物，将DNA导 入到宿主细胞，进行分析以评价表达和功能的合适方法为本领域技术人 员所知。用如Southern或Northern分析法，Western印迹，DNA、 RNA或蛋白的斑点杂交技术，原位杂交技术，免疫细胞化学，或核酸 或蛋白分子的序列分析的常规方法来检测样品中基因序列的出现，或对 其扩增和/或表达进行定量分析。本领域技术人员容易想象，如果需要 则可如何调整这些方法。

骨架

如上所述，骨架可基于免疫球蛋白分子或可以是非免疫球蛋白起 源。配体(如双特异性配体)的每个域可以是不同的骨架。优选的免疫 球蛋白骨架，如本文所定义，包括任何一种或多种选自下述的骨架：免 疫球蛋白分子，其包含至少(i)抗体的CL区(κ或λ亚类)；或(ii) 抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1与CH2区的免疫球蛋白分 子；包含抗体重链CH1、CH2和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何与 抗体CL(κ或λ亚类)区相关联的亚类(ii)。还可以包括铰链区。例 如，所述配体可包含免疫球蛋白(例如IgG(如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4)，IgM，IgA，IgD或IgE)的重链恒定区或其部分(如 Fc部分)和/或轻链恒定区(如Cλ、Cκ)。例如，所述配体可包含 IgG1(如人IgG1)的CH1，IgG1(如人IgG1)的CH1和CH2，IgG1 (如人IgG1)的CH1、CH2和CH3，IgG1(如人IgG1)的CH2和 CH3，IgG1(如人IgG1)的CH1和CH3。域的这样的组合可如模拟天 然抗体，比如IgG或IgM，或其片段，如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分 子。本领域所属的技术人员应知道，该列举并非穷举。

蛋白支架

每个表位结合域都含有蛋白支架以及一个或多个CDRs(如本文公 开的dAb的)，所述CDR涉及该域与一个或多个表位间的特异性相 互作用。有利的是根据本发明的表位结合域含有三个CDRs。合适的蛋 白支架包括任何选自下列的蛋白支架：基于免疫球蛋白域的，基于纤连 蛋白的，基于亲和体的，基于CTLA4的，基于如GroEL的分子伴侣 的，基于脂笼蛋白，以及基于细菌Fc受体SpA与SpD的蛋白支架。 本领域所述的技术人员应该明白，该列举并非穷举。所述结合域还可包 含具有对靶标(如IL-4、IL-13)具结合特异性的结合位点的蛋白支 架，但不含有一个或多个CDRs(如本文公开的dAbs)。例如所述结 合域可以是具有对靶标具结合特异性的结合位点的蛋白支架，所述靶标 选自亲和体、SpA域，基于CTLA4的，基于如GroEL的分子伴侣 的，基于脂笼蛋白，以及基于细菌Fc受体SpA与SpD的，LPL受体 A类域，avimer(参见例如美国专利申请公开号2005/0053973、 2005/0089932、2005/0164301)。

构建配体中使用的支架

主链构象的选择

免疫球蛋白超家族成员的多肽链都具有相似的折叠。例如尽管就其 一级序列而言抗体是高度多样的，但序列比较和晶体结构已揭示，与预 期相反，抗体的6个抗原结合环中的5个(H1、H2、L1、L2、L3)采 取了有限数量的主链构象，或典型结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol. Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。因此对环长度与 关键残基的分析已能预测在大部分人抗体中发现的H1、H2、L1、L2 与L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.，264： 220)。尽管就序列，长度和结构而言，所述H3区更多样化(因为D 片段的使用)，但对于短环长度，它还是形成了有限数量的主链构象， 这取决于所述环和抗体框架中关键位置特定残基的长度、出现或残基类 型(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters，399：1)。

可以设计配体和/或域的文库，其中某些环的长度和关键残基已经 过筛选，以确保成员的主链构象是已知的。有利的是，如前所述这些是 自然界中发现的免疫球蛋白超家族分子的真正构象，以使其处于非功能 状态的机会最小化。种系V基因片段用作构建抗体或T-细胞受体文库 的合适的基本框架；其它序列也有用处。可能会发生低频率的变化，这 样少量功能性成员可具有不影响其功能的改变了的主链构象。

经典结构理论也可用于估计配体编码的不同主链构象的数量，以预 测基于双特异性配体序列的主链构象，并选择不影响典型结构的多样化 的残基。众所周知，在人Vκ区中，所述L1环可采用四个典型结构之 一，所述L2环具有单一的典型结构，对L3环而言，有90％人Vκ区 采用了四个或五个典型结构之一(Tomlinson et al.(1995)supra)；因 此，仅在Vκ区，不同的典型结构能结合产生一系列不同的主链构象。 鉴于Vλ区编码不同系列的L1，L2和L3环典型结构，Vκ与Vλ域能与 编码H1和H2环几种典型结构的任何VH域配对，观察到的这五个环 的典型结构组合的数量是非常巨大的。这意味着，主链构象中多样性的 产生对广泛的结合特异性的产生可能是必须的。然而，通过构建基于单 一已知主链构象的抗体文库已发现，与预期相反，对于产生实质上以所 有抗原为靶向的足够多的多样性而言，主链构象的多样性并不是必需 的。更让人惊讶的是，所述的单一主链构象不必是共有结构——单一的 自然产生的构象可用作为整个文库的基础。因此，在优选的方面，本发 明的所述双特异性配体具有单一已知的主链构象。

选定的所述单一主链构象优选所讨论的所述免疫球蛋白超家族类型 分子中的普通构象。观测到的大量自然产生的分子所采取的构象是普通 构象。因此，在本发明优选的方面中，对于免疫球蛋白的每个结合环而 言，所述自然产生的不同主链构象可分别考虑，然后选定具有不同环的 主链构象所需组合的自然产生的可变域。如果没有自然产生的可变域， 则可选择最接近的等价物。优选的是，不同环主链构象的所需组合是通 过选择编码所需主链构象的种系基因片段创建的。更优选的是，所述选 定的种系基因片段在自然界上被频繁表达。最优选的是，它们是所有天 然种系基因片段的被最频繁表达的那些。

在设计的配体(如ds-dAbs)或其文库中，对于所述六个抗原结合 环区的每个而言，可分别考虑不同主链构象的发生率。对H1、H2、 L1、L2和L3而言，选择20％到100％的自然产生分子的抗原结合环区 所采用的特定构象。典型地，选定构象的观测到的发生率大于35％ (即35％到100％)，理想的是50％以上或甚至65％以上。因为绝大部 分的H3环区不具有典型结构，所以优选显示出典型结构的那些环中常 见的主链构象。所以对于各个所述的环而言，选择天然库中最常观测到 的构象。在人的抗体中，每个环最常见的典型结构(CS)如下：H1- CS 1(表达库的79％)，H2-CS 3(46％)，Vκ的L1-CS 2 (39％)，L2-CS 1(100％)，Vκ的L3-CS 1(36％)(计算时假定 κ∶λ比为70∶30，Hood et al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.， 48：133)。对于有典型结构的H3环，从残基94至101有盐桥的7个残 基的CDR3长度(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest，U.S.Department of Health and Human Services)看 来是最常见的。EMBL数据库中有至少16个人抗体序列有所需H3长 度和关键残基，以形成该构象，蛋白质数据库中有至少两种晶体结构可 用作抗体模建的基础(2cgr与1tet)。具有这种经典结构组合的最频繁 表达的种系基因片段为VH片段3-23(DP-47)、JH片段JH4b、Vκ片段 O2/O12(DPK9)和Jκ片段Jκ1。VH片段DP45与DP38也是合适的。这 些片段因此可在组合中使用，作为构建具有所需单一主链构象的文库的 基础。

或者对于每个所述结合环而言，不是以自然产生的不同主链构象为 基础分别选择所述单一主链构象，而是以自然产生的主链构象的组合作 为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如可以确定任何两个、三 个、四个、五个或全部六个抗原结合环的天然产生的典型结构组合。此 处优选的是所述选定的构象在自然产生的抗体中是常见的，最优选的是 所述选定的构象是天然库中最频繁观察到的。因此，在人抗体中，例如 当考虑到五个抗体结合环H1、H2、L1、L2与L3的自然结合时，可确 定典型结构的最经常的组合，然后与H3环的最常见构象相组合，作为 选择所述单一主链构象的基础。

典型序列的多样化

已选定几种已知的主链构象，或优选单一已知的主链构象，为了生 成具有结构和/或功能多样性的库，本发明的配体(如dAbs)或库可通 过变化所述分子的结合位点进行构建。这意味着生成了具有足够的结构 和/或功能多样性的变体，这样所述变体能提供一系列活性。

所述的所需多样性典型地通过在一个或多个位置改变所选定的分子 而产生。将要变化的位置可以以随机或优选的方式选择。所述改变可随 后完成，方法是：或者通过随机化过程，其中所述特定位置的氨基酸被 任何氨基酸或其天然的或合成的类似物取代，从而产生非常大量的突 变；或者所述特定位置的氨基酸被限定的氨基酸子集中的一个或多个取 代，从而产生数量上更为有限的变体。

已经报导了多种方法引入此种多样性。易错PCR法(Hawkins et al. (1992)J.Mol.Biol.，226：889)，化学诱变(Deng et al.(1994)J.Biol. Chem.，269：9533)或细菌突变株(Low et al.(1996)J.Mol.Biol.，260： 359)可用于将随机突变引入编码所述分子的基因中。选定位置突变的 方法已经为本领域所公知，包括错配寡核苷酸或简并寡核苷酸的应用， 使用或是不使用PCR。例如通过针对所述抗原结合环进行靶突变已建 立了几个合成的抗体库。人破伤风类毒素结合Fab的H3区已经随机突 变，形成一系列新结合特异性(Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA，89：4457)。随机或半随机突变H3与L3区已连接到种系V基因片 段以制备具有未突变框架区的大文库(Hoogenboom &Winter(1992)J. Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457； Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13： 3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。此种多样化已扩展到包 括一些或所有的其它抗原结合环(Crameri et al.(1996)Nature Med.，2： 100；Riechmann et al.(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys， WO97/08320，supra)。

因为环随机突变可能仅对H3就创建大约超过1015个结构，对其它 五个环创建类似的大量突变体，所以用当前的转化技术或甚至用无细胞 系统以产生代表所有可能组合的文库是不可行的。例如在迄今为止构建 的最大的库之一中，生成了6x1010个不同的抗体，对该设计得到的库 而言，这只是可能的多样性的一部分(Griffiths et al.(1994)supra)。

优选地，仅直接涉及创建或修饰所述双特异性配体分子的每个域的 所需功能的所述残基被多样化。对许多分子而言，每个域的所述功能是 与靶结合，因此多样性应集中于该靶结合位点，同时避免改变对所述分 子整体装配或维持选定的主链构象关键的残基。

用于抗体域时典型序列的多样化

就基于抗体的配体(如dAbs)而言，所述靶标结合位点最经常是 抗原结合位点。因此优选只有抗原结合位点中的那些残基发生变化。这 些残基在所述人抗体库中是非常多样化的，并且已知与高溶解性的抗体 /抗原复合体相接触。例如在L2中，已知位置50和53在自然产生的抗 体中是多样化的，观测到其与抗原相接触。相比之下，常规方法已使 Kabat et al.(1991，supra)定义的相应互补决定区(CDR1)中所有残基多 样化，与所述的两个相比，根据本发明使用的所述库中大约7个残基多 样化。这表明就为产生一系列抗原结合特异性所需的功能多样性而言， 有显著的进步。

自然界中抗体多样性是两个过程的结果：种系V、D、J基因片段 的体细胞重组，以创建初始的原始文库(所谓的种系与连接多样性)， 以及所述得到的重排V基因的体细胞超变异。人抗体序列的分析已表 明，原始文库的多样性集中于抗原结合位点的中心，而体细胞的超变异 将多样性扩展至原代库中高度保守的抗原结合位点的外围(参见 Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。该互补性或许已经发展 成有效的序列空间搜索策略，虽然显然为抗体独有，但其可容易地应用 于其它多肽库。所述经变化的残基是那些形成与靶的结合位点的子集。 如果需要，靶结合位点中残基的不同(包括重叠部分)子集是在筛选过 程的不同阶段被多样化的。

关于抗体库，可以建立最初的“初始”库，其中抗原结合位点中的 一些而非全部的残基被多样化。此处上下文使用的“初始”指没有预先 确定的靶标的抗体分子。这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体的 免疫球蛋白基因编码的分子，就如同胎儿或新生个体一样，其体内免疫 系统尚未受到各种各样抗原刺激物的刺激。该库可随后针对一系列抗原 或表位进行筛选。如果需要，则所述初始库中经多样化的区域的外围可 引入进一步的多样性。可对该成熟的库筛选修饰过的功能，特异性或亲 和力。

用于双特异性配体构建的结合域的初始库，其中所述抗原结合位点 中的一些或所有残基发生变化，该初始库为本领域所知。(参见 WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609)。该“原始”文库 模拟天然的原始库，具有的多样性局限于抗原结合位点中心的残基，所 述抗原结合位点在所述种系V基因片段中多样化(种系多样性)，或 在所述重组过程中被多样化(连接多样性)。被多样化的那些残基包括 但不限于：H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在所述“体细 胞”文库中，多样性局限于重组过程中被多样化的(连接多样性)或高 度体细胞突变的残基。那些被多样化的残基包括但不限于：H31、 H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。 以上所列的适于在这些文库中多样化的所有残基已知与一个或多个抗体 抗原复合物相接触。因为在这两个文库中，并非所有的抗原结合位点中 的残基被改变，所以如果需要，可在筛选过程中通过改变其余的残基获 得额外的多样性。任何这些残基的任何子集(或包含所述抗原结合位点 的额外的残基)可用于所述抗原结合位点的初始的和/或随后的多样 化，这对本领域技术人员应该是显而易见的。

在本发明所用的文库的构建中，选定位置的多样化典型地在核酸水 平实现，通过改变详细说明多肽序列的编码序列，从而在该位置包含大 量的可能氨基酸(全部20个或其子集)。用IUPAC命名法，用途最多 的密码子为NNK，其编码所有的氨基酸残基以及TAG终止密码子。 该NNK密码子优选地为引入所需多样性而使用。能获得同样目的其它 密码子也是有用的，包括所述NNN密码子，其导致额外的终止密码子 TGA与TAA的产生。

人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特点，是偏好某些氨基酸残 基的明显倾向性。如果对在各个所述VH、Vκ和Vλ区中十个最多样化 位置的氨基酸组成进行总计，则超过76％的侧链多样性来自仅7个不同 的氨基酸残基，这些是：丝氨酸(24％)，酷氨酸(14％)，天冬酰胺 (11％)，甘氨酸(9％)，丙氨酸(7％)，天冬氨酸(6％)和苏氨 酸(6％)。对亲水残基和可提供主链柔性的小体积残基的这种偏好可 能反应了倾向于和广泛的抗原或表位结合的表面的演变，并可有助于解 释在初始库中抗体的所需多样性。

因为优选的是模拟氨酸的这种分布，所以待改变位置的氨基酸分 布优选模拟在抗体的抗原结合位点中看到的氨基酸。氨基酸取代中的此 种偏好使得针对一系列靶抗原的对某些多肽(不是仅抗体多肽)的筛选 更容易应用到任何多肽库。形成待改变位置的氨基酸分布倾向性有多种 方法(包括使用三核苷酸突变，参见WO97/08320)，由于易于合成， 所以优选的方法是使用常规的简并密码子。通过将由简并密码子(每个 位置单重、双重、三重和四重简并的比率相同)的所有组合编码的氨基 酸特征与所用的天然氨基酸比较，可能计算出最具代表性的密码子。密 码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C与(AGT)(AGC)(CT)——分别用 IUPAC命名法即DVT、DVC与DVY——是最接近于所需氨基酸特征 的密码子：它们编码22％丝氨酸与11％的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨 酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此优选地，用DVT、 DVC或DVY密码子之一在每个多样化的位置构建文库。

治疗和诊断组合物及用途

本发明提供包含本发明的配体和药学上可接受的载体、稀释剂或辅 料的组合物，以及采用本发明的所述配体或组合物进行治疗与诊断的方 法。根据本发明的方法的配体可用于体内治疗或预防应用、体内诊断应 用等等。

本发明的配体的治疗和预防用途包括将根据本发明的配体施用于受 试哺乳动物，如人类。所述配体以很强的亲和力与多聚抗原结合。在一 些实施方案中，如IgG样配体的所述配体可允许募集细胞毒T细胞以 介导杀伤肿瘤细胞系，例如通过抗体依赖的细胞毒性。

优选至少90％-95％均质性的大体上纯的配体施用于哺乳动物，最 优选均质性98％-99％或更高的作为药用，尤其所述哺乳动物为人时。 一旦如所需地部分纯化或纯化至均质性，则该配体可用于诊断或治疗 (包括体外应用)或用于开发和进行检验方法，免疫荧光染色法等等 (Lefkovite and Pernis，(1979and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press，NY)。

在本申请中，“预防”涉及在疾病诱发前施用所述保护性的组合 物。“抑制”指在诱导事件后，但疾病临床出现前施用该组合物。“治 疗”涉及疾病症状变得明显后施用该保护性组合物。治疗包括疾病伴随 症状的改善，还包括疾病发病的预防和延迟，还包括疾病症状的严重程 度降低或频率减弱。

例如本发明的配体典型地在预防、抑制或治疗疾病状态中有用处。 例如可施用所述配体，以治疗、抑制或预防慢性炎症性疾病，变应性超 敏反应，癌症，细菌或病毒感染，自身免疫性疾病(其包括但不仅限于 I型糖尿病，哮喘，多发性硬化症，类风湿关节炎，幼年类风湿关节 炎，银屑病关节炎，脊柱关节病(例如强直性脊柱炎)，系统性红斑狼 疮，炎症性肠病(例如Crohn病、溃疡性结肠炎)，重症肌无力和 Behcet综合征，银屑病，子宫内膜异位症，和腹腔粘连(例如腹部手术 后)。

本发明的配体可用于治疗、抑制或预防疾病，例如变应性疾病、 Th2介导的疾病、IL-13介导的疾病、IL-4介导的疾病、和/或IL-4/IL- 13介导的疾病。这样的疾病的例子包括Hodgkin病，哮喘，变应性哮 喘，特应性皮炎，特应性变态反应，溃疡性结肠炎，硬皮病，变应性鼻 炎，COPD，特发性肺纤维化，慢性排斥反应，博莱霉素致肺纤维化， 辐射诱发肺纤维化，肺肉芽肿，进行性系统性硬化症，血吸虫病，肝纤 维化，肾癌，Burkitt淋巴瘤，Hodgkins病，非Hodgkin病，sezary综 合征，哮喘，化脓性关节炎，疱疹样皮炎，慢性特发性荨麻疹，溃疡性 结肠炎，硬皮病，增生性瘢痕，Whipple′s病，良性前列腺增生，其中 白细胞介素-4受体起作用的肺部疾病，其中白细胞介素-4受体介导的 上皮屏障的破坏起作用的疾病，其中白细胞介素-4受体起作用的消化 系统紊乱，药物变应性反应，川崎病，镰状细胞疾病，Churg-Strauss 综合征，Graves病，先兆子痫，Sjogren综合征，自身免疫性淋巴组织 增生综合征，自身免疫性溶血性贫血，Barrett食管，自身免疫性葡萄膜 炎，肺结核，囊性纤维化，变应性支气管肺真菌感染，慢性阻塞性肺疾 病，博莱霉素致肺病及纤维化，肺泡蛋白沉积症，成人呼吸窘迫综合 征，结节病，高IgE综合征，特发性嗜酸性粒细胞增多综合征，自身免 疫性疱病，寻常性天疱疮，大疱性类天疱疮，重症肌无力，慢性疲劳综 合征，肾病。

“变应性疾病”指其中患者对正常非免疫原性的物质超敏，并产生 免疫反应的病理性疾病。变应性疾病通常通过IgE活化肥大细胞引起可 导致良性的流鼻水到危及生命的变应性休克和死亡的免疫应答(如局部 应答、系统应答)而得以表征。变应性疾病的例子包括但不限于变应性 鼻炎(如花粉症)，哮喘(如变应性哮喘)，变应性皮炎(如湿疹)， 接触性皮炎，食物变态反应和荨麻疹(hives)。

本文所用的“Th2介导的疾病”指其中由特征性生成IL-4、IL-5、 IL-10和IL-13的CD4+Th2T淋巴细胞调节的免疫应答(Th2型免疫应 答)所产生的(全部或部分)病理的疾病。Th2型免疫应答与特定细胞 因子(如IL-4、IL-13)的生成，特定类别的抗体(如IgE)，以及体液 免疫相关。Th2介导的疾病型免疫应答通过Th2细胞因子(如IL-4、 IL-13)水平升高和/或特定类型抗体(如IgE)的出现得以表征，并包 括例如变应性疾病(如变应性鼻炎、特应性皮炎、哮喘(如支气管哮 喘)，变应性气道病(AAD)，变应性休克，结膜炎)与IL-4和/或 IL-13水平升高相关的自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎，宿主抗移 植物反应，肾病(如肾病综合征、狼疮性肾炎))，以及与IL-4和/或 IL-13水平上调相关的感染(如病毒性、寄生性、真菌性(如白色念珠 菌(C.albicans))感染)。

某些癌症与IL-4和/或IL-13水平上调相关或与IL-4诱导和/或IL- 13诱导的癌症细胞增殖相关(B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性 骨髓瘤、头颈部癌、乳腺癌和卵巢癌)。这些癌症可用本发明的所述配 体治疗、抑制或预防。

总的来说，所述配体以纯化的形式与药理学上合适的载体一起使 用。典型地，这些载体包括：水性或醇性/水性溶液，乳液或混悬液， 包括盐水和/或缓冲介质。肠道外赋形剂包括：氯化钠溶液，Ringer葡 萄糖，葡萄糖与氯化钠以及乳酸Ringer。如果需要保持多肽复合物处于 混悬态，合适的生理上可接受的赋型剂可以选用如羧甲基纤维素、聚乙 烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐的增稠剂。

静脉注射赋型剂包括如那些基于Ringer葡萄糖的流体和营养补充 剂以及电解质补充剂。还可以有如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气 体的防腐剂和其他添加剂(Mack(1982)Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition.)。各种合适的处方均可使用，包括缓释处方。

本发明所述的配体可作为单独给药的组合物或与其他物质一起使 用。所述配体可与现有的IL-13疗法(如现有的IL-13药物(如抗IL- 13Rα1，IL-4/13阱(Trap)，抗IL-13)和IL-4dAb，现有的IL-4药物 (如抗IL-4R、IL-4突变蛋白，IL-4/13阱)和IL-13dAb)以及IL-13 和IL-4抗体(例如WO05/0076990(CAT)，WO03/092610 (Regeneron)，WO00/64944(Genetic Inst.)和WO2005/062967(Tanox))。 所述配体可与一个或多个额外治疗剂或活性物质一起施用和/或配制。 当配体与其它治疗剂一起施用时，该配体可以在其它治疗剂施用之前、 同时或之后施用。总的来说，该配体和其它物质以提供治疗效果重合的 方式施用。可与本发明配体一起施用或配制的其它成分包括，例如各种 免疫治疗药，如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂，抗生素，抗真菌 药，抗病毒药和免疫毒素。例如，当施用拮抗剂以预防、抑制或治疗肺 部炎症或呼吸系统疾病(如哮喘)时，可以与磷酸二酯酶抑制剂(如磷 酸二酯酶4抑制剂)，支气管扩张剂(如β2-受体激动剂、抗胆碱能药 物、茶碱)，短效β-受体激动剂(如沙丁胺醇、沙丁胺醇、班布特 罗、非诺特罗、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、间 羟异丙基肾上腺素、吡布特罗、特布他林和比托特罗)，长效β-受体 激动剂(如福莫特罗和沙美特罗)，短效抗胆碱能药物(如异丙托溴铵 和氧托溴铵)，长效抗胆碱能药物(如噻托溴铵)，茶碱(如短效制 剂、长效制剂)，吸入性类固醇(如倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、 氟替卡松丙酸酯和曲安奈德)，口服类固醇(如甲基强的松龙，强的松 龙，氢化泼尼松和泼尼松)，短效β-受体激动剂与抗胆碱能药物合用 (如沙丁胺醇/舒喘宁/异丙阿托品，和非诺特罗/异丙阿托品)，长效 β-受体激动剂与吸入性类固醇合用(如沙美特罗/氟替卡松，和福莫特 罗/布地奈德)和溶黏液剂(如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新、羧 甲司坦、愈创木酚甘油醚和碘化甘油)。

其他合适的或共同治疗药可与本发明的配体一起施用以预防、抑制 或治疗哮喘(变应性敏性哮喘)，包括糖皮质激素(如倍氯米松、布地 奈德、氟替卡松)，色甘酸盐，尼多考米，β-激动剂(如沙丁胺醇、特 布他林、班布特罗、非诺特罗、瑞普特罗、妥布特罗(tolubuterol)、沙美 特罗、福莫特罗(fornoterol))，扎鲁司特，沙美特罗，泼尼松，强的 松龙，茶碱，齐留通(zileutron)，孟鲁司特(montelukast)和白三烯修饰 物)

本发明的所述配体可与多种适于治疗疾病(如Th-2介导的疾病， IL-4介导的疾病，IL-13介导的疾病，IL-4和IL-13介导的疾病，癌 症)的共同治疗药一起施用，包括细胞因子，镇痛剂/解热剂，止吐药 和化疗药物。

细胞因子包括但不限于淋巴因子，肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子样 细胞因子，淋巴毒素，干扰素，巨噬细胞炎性蛋白，粒细胞单核细胞集 落刺激因子，白细胞介素(包括但不限于白细胞介素-1、白细胞介素- 2、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素- 18)，生长因子，其中包括但不限于(例如生长激素，胰岛素样生长 因子1和2(IGF-1和IGF-2)，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，血小 板源生长因子(PGDF)，表皮生长因子(EGF)，以及刺激红细胞生 成的物质，如重组人红细胞生成素(Epoetin alfa)，EPO，激素激动 剂，激素拮抗剂(如氟他胺，他莫昔芬，醋酸亮丙瑞林 (LUPRON))，及类固醇(例如地塞米松、类维生素A、倍他米 松、皮质醇、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、 雌激素、睾酮、孕激素)。

镇痛剂/解热剂可包括但不限于(如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布 洛芬、萘普生钠、盐酸丁丙诺啡、盐酸右丙氧芬、萘磺酸右丙氧芬、盐 酸度冷丁、盐酸氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、酒石 酸双氢可待因、盐酸喷他佐辛、酒石酸氢可酮、酒石酸羟甲左吗喃、二 氟尼柳、水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、酒石酸布托非诺、 水杨酸胆碱、、布他比妥、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、甲氧异 丁嗪、盐酸桂麻磺碱、甲丙胺酯等等)。

止吐药也可共同施用以预防或治疗恶心呕吐，例如合适的止吐药包 括盐酸氯苯甲嗪、奈比隆(nabilone)、甲哌氯丙嗪、茶苯海明、盐酸异 丙嗪、硫乙哌丙嗪、东莨菪碱等等。

本文所用的化疗药物包含但不限于例如抗微管类药物(如紫杉醇 (paclitaxel))，泰索帝(多西紫杉醇)；烷化剂(如环磷酰胺、卡莫 司汀、洛莫司汀、苯丁酸氮芥)；细胞毒抗生素(如更生霉素、阿霉 素、丝裂霉素C、博莱霉素)；抗代谢药(如阿糖胞苷、吉西他滨 (gemcitatine)、甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶)；抗有丝分裂药物 (antimitotics)(如长春花生物碱类药物(vincristine vinca alkaloids) (如依托泊苷、长春碱和长春新碱))；和其他如顺铂、达卡巴嗪、甲 基苄肼和羟基脲；及其组合物。

药物组合物可包括各种细胞毒或其它物质与本发明配体合用的混合 物，或甚至是根据本发明的具有不同特异性的配体的合用，如用不同的 靶抗原或表位筛得的配体，无论它们在施用前是否混合。

依据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域所属普通技术人 员通常所知的任何给药途径。出于治疗目的，包括但不限于免疫治疗， 本发明选定的配体可以根据标准技术施用于任何患者。可以以任何合适 的方式给药，包括胃肠外，静脉注射，肌肉注射，腹腔内，透皮，鞘内 注射，关节内，经肺给药，或者还可以，恰当地通过直接灌注(如用导 管)。给药剂量与频率取决于年龄，性别和患者状态，其它药物的共同 给药情况，禁忌症和临床医生需考虑的其他参数。按指导给药可以是局 部的(如通过肺部给药局部传送到肺(如鼻腔内给药)，或局部直接注 入肿瘤)或全身给药。

本发明的配体可以冻干存储，使用前在合适的载体中重建。该技术 已证明对常规免疫球蛋白是有效的，可采用本领域已知的冻干与重建技 术。本领域技术人员应该理解，冻干和重建可导致不同程度的抗体活性 损失(例如用常规免疫球蛋白，IgM抗体易于产生比IgG更大的活性 损失)，并且可能要上调使用水平以补偿该损失。

可以施用含有所述配体的组合物进行预防性和/或治疗性治疗。在 某些治疗应用中，实现选定细胞群落被至少部分抑制、抑制、调节、杀 伤的足够量，或一些其它可测量参数，被定义为“治疗有效量”。达到该 剂量所需的量取决于疾病的严重程度和患者的一般状态，通常情况下， 所述数量范围为每千克体重0.005至5.0mg配体，更常用的剂量为0.05 至2.0mg/kg/剂量。就预防应用而言，含有本发明配体或其混合物的组 合物还可以以相似或略低的剂量施用，以预防、抑制或延迟疾病的发生 (如持续缓解或保持稳定，或预防急性期)。熟练的医师能确定合适的 剂量间隔以治疗、抑制或预防疾病。当施用配体以治疗、抑制或预防疾 病时，可最多达每天4次，每周2次，每周1次，每隔两个星期1次， 每月1次，或每隔两个月1次，给药剂量如大约10μg/kg至大约80 mg/kg、大约100μg/kg至大约80mg/kg、大约1mg/kg至大约80 mg/kg、大约1mg/kg至大约70mg/kg、大约1mg/kg至大约60 mg/kg、大约1mg/kg至大约50mg/kg、大约1mg/kg至大约40 mg/kg、大约1mg/kg至大约30mg/kg、大约1mg/kg至大约20 mg/kg、大约1mg/kg至大约10mg/kg、大约10μg/kg至大约10 mg/kg、大约10μg/kg至大约5mg/kg、大约10μg/kg至大约2.5 mg/kg、大约1mg/kg、大约2mg/kg、大约3mg/kg、大约4mg/kg、大 约5mg/kg、大约6mg/kg、大约7mg/kg、大约8mg/kg、大约9mg/kg 或大约10mg/kg。在具体实施方案中，施用所述配体以治疗、抑制或 预防慢性炎症疾病，每隔两周一次或每月一次，剂量大约10μg/kg至大 约10mg/kg(如大约10μg/kg，大约100μg/kg，大约1mg/kg，大约2 mg/kg，大约3mg/kg，大约4mg/kg，大约5mg/kg，大约6mg/kg，大 约7mg/kg，大约8mg/kg，大约9mg/kg或大约10mg/kg)。

在具体实施方案中，施用所述配体以治疗、抑制或预防哮喘，每 天，每两天，一周一次，两周一次或每月一次，剂量大约10μg/kg至大 约10mg/kg(如大约10μg/kg，大约100μg/kg，大约1mg/kg，大约2 mg/kg，大约3mg/kg，大约4mg/kg，大约5mg/kg，大约6mg/kg，大 约7mg/kg，大约8mg/kg，大约9mg/kg或大约10mg/kg)。所述配体 还可以以每日剂量或单位剂量为约10mg，约9mg，约8mg，约7 mg，约6mg，约5mg，约4mg，约3mg，约2mg或约1mg施用 (如治疗、抑制或预防哮喘)。

在具体实施方案中，本发明的所述配体的施用剂量提供饱和的IL-4 和/或IL-13或体内所需血清浓度。熟练的医师可确定实现饱和的恰当 剂量，例如通过滴定配体，并检测IL-4和/或IL-13自由结合位点的量 或配体血清浓度。涉及施用治疗药物以实现靶标饱和或药物所需血清浓 度的治疗方案在本领域是常见的。

如果相对于治疗前出现的此类症状，或相对于没有用该组合物治疗 的个体(人或模型动物)或其它合适对照中的此类症状，减少了一个或 多个症状(如减少至少10％或临床评价表上至少一个点)，则用本文描 述的组合物进行治疗被视为“有效”。虽然针对的疾病不同症状会明显 不同，但普通熟练的临床医师或技术人员能判断出来。对此类症状的判 断可以例如通过检测疾病的一个或多个生化指标水平(如与所述疾病相 关的酶或代谢物水平，受影响的细胞数等)，通过检测身体表现(如炎 症、肿瘤大小等)，或者通过被接受的临床评分，例如Juniper哮喘生 命质量问卷(美国胸腔学会以32项评价对关于活动受限，症状，情感 功能，以及受外界刺激作用的生活质量进行评估；Juniper，et.al.， “Health-related Quality of Life in Moderate Asthma，”Chest，116：1297-1303 (1999).)，扩展病残状态评分(用于多发性硬化)，Irvine炎症性肠病 问卷(以32分评价对关于肠功能，全身症状，社会功能和情绪状况的 生活质量进行评估——分值范围从32到224，分值越高表明生活质量 越好)，类风湿性关节炎生活质量量表，美国风湿病学会核心设置指 标，或其它本领域已知的可接受的临床评估。疾病症状的持续(如一天 或多天，优选更长时间)减少至少10％或给定的临床量表上减少一分 或多分意味着“有效”治疗。类似地，如果相对于没有用所述化合物治 疗的类似个体(人或动物模型)中的此种症状而言，一个或多个症状的 出现或严重程度被延迟、减少或消除，则用本发明所述的组合物进行预 防是有效的。

含有根据本发明的配体的组合物，可用在预防以及治疗设置上，以 辅助改变、灭活、杀死或移除哺乳动物中选定的靶细胞群落。此外，本 文所述的配体和选定的多肽库可在体外使用或体外有选择的杀死、消耗 或从异源细胞集合中有效除去靶细胞群落。按照标准技术，哺乳动物的 血液可在体外与配体，如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白结合，从而 杀死不需要的细胞或将其从血液中移除，再使血液回到哺乳动物。

实施例

实施例1：通用方法

对于针对人IL-13的初筛，VHdAbs和VkdAbs的文库用生物素化 的人IL-13蛋白(R&D systems，Minneapolis，US)进行淘选。所述IL-13 用5倍摩尔过量的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂(Pierce，Rockford， USA)生物素化。第1轮用链霉亲和素包被的磁珠(Dynal，Norway) 以及或100nM或20nM抗原进行；第2轮用中性链亲和素包被的磁珠 以及20nM或4nM抗原(Henderikx et al.，2002，Selection of antibodies against biotinylated antigens.Antibody Phage Display：Methods and protocols， Ed.O′Brien and Atkin，Humana Press)。

第二次初筛中，保持抗原浓度为100nM，在含有2％Marvel，终体 积为1ml PBS中，淘选相同的VH和Vk dAb噬菌体展示库。第一轮和 第三轮中，用4mg的M280Streptavidin Dynabeads(Dynal，Norway)捕 获抗原-噬菌体复合物。第二轮中，用4mg的中性链亲和素包被的 M270Carboxy Dynabeads(Dynal，Norway)替代。

通过如下标准碳二亚胺化学(carbodiimine chemistry)用中性链亲 和素包被M270Carboxy Dynabeads(Dynal，Norway)。1ml的Carboxy M-270Dynabeads(30mg/ml，2x106磁珠/μl)用1ml 0.01M NaOH洗涤 两次，两次洗涤中间允许4分钟的捕获。用水洗涤两次除去氢氧化钠， 接着用1ml 40mg/ml 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC)(Sigma，U.K)室温下旋转混合活化羧基30分钟。经EDC活化的 磁珠用水洗涤两次，将1ml的1mg/ml中性链亲和素(Pierce，U.S.A) 的pH5的10mM 2-吗啉乙磺酸(MES，Sigma，U.K.)缓冲液加入活化的 磁珠中。室温下旋转30分钟进行偶联。偶联后，捕获磁珠，去除未反 应的中性链亲和素，与1ml 0.05M三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液 pH7.4室温下孵育15分钟，猝灭磁珠上未反应的胺类活性基团。所述 包被和猝灭的磁珠用含有0.1％BSA的PBS洗涤四次，在1ml含有 0.1％BSA的PBS中重悬。叠氮钠(Sigma，U.K.)加至0.02％进行保 存，使用前磁珠4℃下保存。

下表(表1和2)描述VH和Vk dAb噬菌体文库的筛选方法

表1

表2

所述筛得的VH(DOM10-236(SEQ ID NO：1804)、DOM10-238(SEQ ID NO：1805)、DOM10-241(SEQ ID NO：1806)、DOM10-245(SEQ ID NO：1807)、DOM10-249(SEQ ID NO：1808)、DOM10-250(SEQ ID NO：1809)、DOM10-251(SEQ ID NO：1810)、DOM10-254(SEQ ID NO：1811)、DOM10-256(SEQ ID NO：1812)、DOM10-259(SEQ ID NO：1813)、DOM10-260(SEQ ID NO：1814)、DOM10-261(SEQ ID NO：1815)、DOM10-263(SEQ ID NO：1816)、DOM10-264(SEQ ID NO：1817)、DOM10-273(SEQ ID NO：1818)、DOM10-278(SEQ ID NO：1819)、DOM10-279(SEQ ID NO：1820)、DOM10-281(SEQ ID NO：1821)、DOM10-282(SEQ ID NO：1822)、DOM10-283(SEQ ID NO：1823)、DOM10-400(SEQ ID NO：1824)、DOM10-401(SEQ ID NO：1825)、DOM10-402(SEQ ID NO：1826)、DOM10-404(SEQ ID NO：1827)、DOM10-406(SEQ ID NO：1828)、DOM10-407(SEQ ID NO：1829)、DOM10-409(SEQ ID NO：1830)、DOM10-410(SEQ ID NO：1831)、DOM10-414(SEQ ID NO：1832)、DOM10-415(SEQ ID NO：1833)、DOM10-416(SEQ ID NO：1834)、DOM10-418(SEQ ID NO：1835)、DOM10-420(SEQ ID NO：1836)、DOM10-422(SEQ ID NO：1837)、DOM10-423(SEQ ID NO：1838)、DOM10-424(SEQ ID NO：1839)、DOM10-425(SEQ ID NO：1840)、DOM10-426(SEQ ID NO：1841)、DOM10-427(SEQ ID NO：1842)、DOM10-428(SEQ ID NO：1843)、DOM10-429(SEQ ID NO：1844)、DOM10-430(SEQ ID NO：1845)、DOM10-431(SEQ ID NO：1846)、DOM10-432(SEQ ID NO：1847)、DOM10-433(SEQ ID NO：1848)、DOM10-467(SEQ ID NO：1849)、DOM10-468(SEQ ID NO：1850)、DOM10-469(SEQ ID NO：1851)、DOM10-470(SEQ ID NO：1852)、DOM10-234(SEQ ID NO：1853)、DOM10-235(SEQ ID NO：1854)、DOM10-237(SEQ ID NO：1855)、DOM10-239(SEQ ID NO：1856)、DOM10-240(SEQ ID NO：1857)、DOM10-242(SEQ ID NO：1858)、DOM10-243(SEQ ID NO：1859)、DOM10-244(SEQ ID NO：1860)、DOM10-246(SEQ ID NO：1861)、DOM10-247(SEQ ID NO：1862)、DOM10-248(SEQ ID NO：1863)、DOM10-252(SEQ ID NO：1864)、DOM10-257(SEQ ID NO：1865)、DOM10-258(SEQ ID NO：1866)、DOM10-262(SEQ ID NO：1867)、DOM10-265(SEQ ID NO：1868)、DOM10-266(SEQ ID NO：1869)、DOM10-274(SEQ ID NO：1870)、DOM10-275(SEQ ID NO：1871)、DOM10-276(SEQ ID NO：1872)、DOM10-277(SEQ ID NO：1873)、DOM10-280(SEQ ID NO：1874)、DOM10-403(SEQ ID NO：1875)、DOM10-405(SEQ ID NO：1876)、DOM10-408(SEQ ID NO：1877)、DOM10-411(SEQ ID NO：1878)、DOM10-412(SEQ ID NO：1879)、DOM10-413(SEQ ID NO：1880)、DOM10-417(SEQ ID NO：1881)、DOM10-419(SEQ ID NO：1882)、DOM10-472(SEQ ID NO：1883))和Vk(DOM10-203(SEQ ID NO：1884)、DOM10-205(SEQ ID NO：1885)、DOM10-208(SEQ ID NO：1886)、DOM10-218(SEQ ID NO：1887)、DOM10-219(SEQ ID NO：1888)、DOM10-220(SEQ ID NO：1889)、DOM10-225(SEQ ID NO：1890)、DOM10-228(SEQ ID NO：1891)、DOM10-229(SEQ ID NO：1892)、DOM10-230(SEQ ID NO：1893)、DOM10-231(SEQ ID NO：1894)、DOM10-268(SEQ ID NO：1895)、DOM10-201(SEQ ID NO：1896)、DOM10-202(SEQ ID NO：1897)、DOM10-204(SEQ ID NO：1898)、DOM10-206(SEQ ID NO：1899)、DOM10-207(SEQ ID NO：1900)、DOM10-209(SEQ ID NO：1901)、DOM10-210(SEQ ID NO：1902)、DOM10-211(SEQ ID NO：1903)、DOM10-213(SEQ ID NO：1904)、DOM10-214(SEQ ID NO：1905)、DOM10-215(SEQ ID NO：1906)、DOM10-216(SEQ ID NO：1907)、DOM10-217(SEQ ID NO：1908)、DOM10-221(SEQ ID NO：1909)、DOM10-223(SEQ ID NO：1910)、DOM10-224(SEQ ID NO：1911)、DOM10-227(SEQ ID NO：1912)、DOM10-232(SEQ ID NO：1913)、DOM10-53-425(SEQ ID NO：2018))域抗体克隆到pDOM5 表达载体进行ELISA筛选或BIAcore解离速率分析。

对于针对人IL-4的初筛，VH dAbs的文库和Vk dAbs的文库用生 物素化的人IL-4蛋白(Peprotech，Rocky Hill，USA)进行淘选。所述IL- 4的生物素化如上所述。第1轮用中性链亲和素包被的磁珠(Dynal， Norway)以及或100nM抗原进行；第2轮用链霉亲和素包被的磁珠以 及20nM抗原。中性链亲和素包被的磁珠通过对甲苯磺酰基活化的 Dyna珠(Dynal，Norway)在5mg/ml免疫纯中性链亲和素-生物素结合 蛋白/0.1M硼酸盐缓冲液pH9.537℃下孵育16小时，接着在0.1％ (w/v)BSA/PBS中4℃下孵育5分钟，然后在0.1％(w/v)BSA/0.2M Tris pH 8.54℃下孵育16小时而制得。每阶段的洗脱使用1mg/ml胰 蛋白酶-PBS。

对于亲和力成熟筛选，使用有下述修改的上述方法：使用链霉亲和 素包被的磁珠和浓度降低的抗原(浓度范围1nM至50pM)进行2 至4轮筛选。来自筛选洗脱(第2和3轮)的噬菌体载体用质粒 prep(Qiagen)分离，dAb插入物用Sal I和Not I限制性内切释放。该插 入物连接至Sal I/Not I切割的pDOM5，用于转化大肠杆菌(E.coli)菌株 HB2151进行dAb的可溶性表达和筛选。

pDOM5是LacZ启动子控制下的基于pUC119的表达载体。dAb 在上清液中的表达通过在N末端融合于通用GAS前导信号肽确定。此 外，myc标签加在AdAb的C端。大肠杆菌HB2151细胞转化后，菌 落接种至50至500ml添加了羧苄青霉素(100μg/mL)的Terrific Broth 培养基。根据制造商的使用说明，用OVERNIGHT EXPRESSTM SYSTEM 1(高水平蛋白表达体系，Novagen)进行诱导。培养物250 rpm振摇，30℃培养24-48小时。离心(4,000rpm 20min)使细胞沉 淀后，上清液用0.45μm滤膜过滤，对于VH dAb，4℃下与Streamline- 蛋白A磁珠(Amersham Biosciences，结合容量：每ml磁珠5mg dAb)培养过夜，对于VL dAb，4℃下与蛋白L-琼脂糖磁珠 (Affitech，结合容量：每ml磁珠2mg dAb)培养过夜。然后将磁珠 装填入淋洗柱，以10倍柱体积的PBS洗涤，对于VH和VL dAb，分别 用0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.0或3.0洗脱结合的dAb。用1M Tris- HCl，pH 8.0中和后，蛋白样品在PBS中透析，用Vivaspin 5-kDa浓缩 器(Vivascience)浓缩，4℃保存。12％丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝胶 (Invitrogen)进行SDS-PAGE后，肉眼估测蛋白纯度。使用从氨基酸 组成计算得到的消光系数，在280nm处测蛋白浓度和收率(以mg/L细 菌培养物计)。

使用噬菌体文库的亲和力成熟

使用易错突变，多残基和单个残基的定点突变筛选技术进行成熟。 对于易错成熟文库，编码待成熟dAb的质粒DNA使用 IIRANDOM MUTAGENESIS KIT(随机、唯一突变试 剂盒，Stratagene)进行PCR扩增。产物用Sal I和Not I酶切，并用于 连接反应中与被切割噬菌体载体pDOM4连接。对于定点突变和单个残 基文库，用含NNK或NNS密码子的简并寡核苷酸进行PCR反应，使 亲和力待成熟的dAb中所需位置多样化。然后通过组装PCR生成全长 多样化插入片段。插入片段用Sal I与Not I酶切，对多残基突变，酶 切产物用于连接反应中与pDOM4连接；对单个残基突变，酶切产物用 于连接反应中与pDOM5连接。然后每种方法产生的连接物用通过电穿 孔转化大肠杆菌菌株TB1，被转化的细胞置于含15μg/ml四环素的 2xTY琼脂平板上，生成＞1×107克隆规模的文库。

pDOM4是Fd噬菌体载体衍生物，其中基因III信号肽序列被酵 母糖脂锚定表面蛋白(GAS)信号肽取代。它还含有前导序列和基因 III之间的c-myc标签，该标签使基因III重回框架。该前导序列不仅 在噬菌体展示载体，而且还在其他原核表达载体中起很好的作用，可普 遍使用。

用乳化作用的亲和力成熟

文库构建

1pg的DOM10-176(SEQ ID NO：1285)，DOM9-155(SEQ ID NO：451)，或DOM9-44(SEQ ID NO：358)Vk dAb的模板DNA，使用 GENEMORPH II，引物对OA16 (ATACCATGGGGTCGACGGACATCCAG；SEQ ID NO：1797)和OA17n (TTCTTTTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACC；SEQ ID NO：1798)， 进行35个循环的PCR扩增，然后用SalI和NotI进行限制性酶切。所 述纯化的DOM10-176(SEQ ID NO：1285)，DOM9-155(SEQ ID NO：451) 和DOM9-44(SEQ ID NO：358)片段用20μl体积的T4DNA连接酶与载 体pIE2aA或pIE7t3T连接。所有载体均来自Roche的pIVEX2.2b Nde 载体。0.5μl小份的连接产物在竞争子DNA存在下扩增，或在BioRad Mini-Opticon热循环仪上进行实时PCR，以确立每次反应的连接数量超 过109。文库从使用或者SuperTaq以及引物AS11 (TTCGCTATTACGCCAGCTGG；SEQ ID NO：1799)和AS17 (CAGTCAGGCACCGTGTATG；SEQ ID NO：1800)(scArc文库)，或 Platinum pfx以及引物AS12(AAAGGGGGATGTGCTGCAAG；SEQ ID NO：1801)和AS18(AACAATGCGCTCATCGTCATC；SEQ ID NO：1802) (Tus文库)的连接反应进行PCR扩增。对于靶向多样化文库，使用所 示位置含有NNS密码子的寡核苷酸，dAb通过重叠PCR进行组装。 该组装反应使用PfuUltra DNA聚合酶和克隆的SalI/NotI，用 OA16/17n寡核苷酸在scArc或Tus体外翻译(IVT)载体中进行PCR 扩增。

10pg DOM10-416(SEQ ID NO：1834)，DOM10-273(SEQ ID NO：1818)，DOM10-275(SEQ ID NO：1871)或DOM10-276(1872)VH dAb的模板DNA使用GenemorphII，以引物对AS9(SEQ ID NO：1916) 和AS65(SEQ ID NO：1917)进行35个循环的PCR扩增，随后用SalI和 NotI进行限制性酶切。纯化的DOM10-416(SEQ ID NO：1834)， DOM10-273(DOM10-273)，DOM10-275(SEQ ID NO：1871)或DOM10- 276(SEQ ID NO：1872)片段使用20μl体积的T4 DNA连接酶，连接入 pIE2a2A载体(SEQ ID：2015)，该载体是每个基因有两个Arc操纵子，有 潜在的四价展示能力的pIE2aA衍生物。0.5μl小份的连接产物在 BioRad Mini-Opticon热循环仪上进行实时PCR，以确立每次反应的连 接数量超过109。

体外表达和乳化

下述反应混合物用于PCR片段文库的体外转录/翻译：1.5μl 100 mM氧化谷胱甘肽，2μl 5mM甲硫氨酸，0.5μl DNA(5.0x108个分 子)，10μl H2O，0.25μl 50mg/ml抗HA mAb 3F10(仅与scArc使 用)，不同浓度生物素化的抗原，35μl EcoPro T7偶联的转录/翻译提 取物。混合后，立即将提取物加入0.7ml含有4.5％(v/v)Span-80和 0.5％(v/v)Triton X-100的轻质液体石蜡中。在5ml玻璃瓶中，2000rpm 旋转磁力搅拌子5分钟进行乳化。液滴形成的显微分析确证液滴直径为 ～2μm。乳化物25℃下孵育60分钟(Tus)至180分钟(seArc)，使 蛋白-DNA复合物表达并形成。加入0.25ml PBS/1％BSA/生物素化的 抗原和0.5ml己烷/20％(v/v)矿物油破坏乳剂，然后13,000rpm短时 涡旋并离心1分钟。去除油相后，加入1ml己烷/矿物油，重复该步骤 三次。仅用己烷进行最后的提取。

筛选与扩增

将提取的水相和50-5nM生物素化的抗原孵育筛选粘合剂(参见 以下每轮使用的提取条件)。如果进行解离速率筛选，则该孵育后加入 过量的非生物素化的抗原或1μM浓度的亲本VH dAb，并在5-100分 钟范围内孵育。随后每次乳化反应产物被分到链霉亲和素包被的PCR 板的5个孔(50μl/孔)，25℃孵育15分钟，用PBS/BSA洗涤4次。 将50μl含有或者OA16/17n引物，PfuUltra缓冲液，dNTPs，2.5u PfuUltra DNA聚合酶(Tus)，或者连续的嵌套引物对，dNTPs，KOD聚 合酶缓冲液和2.5u KOD聚合酶(scArc)的PCR混合物加到每个孔里。 进行25个(scArc)或30个(Tus)PCR循环。对于Tus筛选，所述 PCR产物纯化并用SalI/NotI酶解。片段随后被连接至pIE7t3T载体， 并如文库构建中所述进行扩增。对于scArc，所述PCR产物经凝胶纯 化，直接用于下一轮的筛选。

使用醛类和NHS活化的PEG进行PEG化

在合适的条件下，蛋白可用PEG-醛类(PEG-ALD)在N端特定 地PEG化。其优点在于当使用PEG-马来酰亚胺时，对于如半胱氨酸的 修饰，所述蛋白无需任何进一步的基因工程以引入特异性氨基酸。在非 优化的缓冲液条件下，当使用PEG-ALD时，一些蛋白赖氨酸残基的修 饰仍是可能的。或者可使用与表面赖氨酸残基特异性反应的NHS或 SPA活化的PEG。

实施例2：与IL-4结合的配体

IL-4受体结合分析(RBA)

MAXISORPTM板(高蛋白结合ELISA板，Nunc，Denmark)用 0.5μg/ml重组人IL-4R/Fc(R&D Systems，Minneapolis，USA)包被过 夜。用含0.1％(v/v)Tween 20的PBS洗涤各孔三次，然后用PBS洗涤 三次，再用含2％(w/v)BSA的PBS封闭。加入与抗IL-4 dAb或IL-4 系列稀释液混合的10ng/ml生物素化的-IL-4(R&D Systems)后再次洗 涤该板。用过氧化物酶标记的抗生物素抗体(Stratech，Soham，UK)检 测与IL-4的结合。然后用TBM底物(KPL，Gaithersburg，USA)显色。 加入HCl终止反应，在450nm读取吸光值。抗IL-4dAb的活性使IL-4 与所述受体结合减少，因此与仅IL-4的对照相比，吸收值降低。

IL-4细胞分析

检测经分离的dAbs抑制IL-4诱导的经培养TF-1细胞(ATCC目 录号：CRL-2003)增殖的能力。简而言之，无酚红RPMI培养基 (Gibco，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)中40000个TF-1细胞置于组织培 养微孔板，用终浓度1ng/ml的IL-4(R&D Systems，Minneapolis， USA)和待检测的dAb稀释液混合。混合物37℃，5％CO2孵育72小 时。然后加入CELLTITER试剂(检测活力的比色分析试剂， Promega，Madison，USA)，每孔内的细胞量通过测定490nm的吸光值 进行定量。抗IL-4 dAb的活性导致细胞增殖减少，与仅IL-4相比， A490相应降低。

用抗IL-4dAb的竞争

这些试验在3000仪上进行，使用链霉亲和素包被的， 偶联有～400RU生物素化IL-4(R&D Systems)的SA芯片(表面等离 振子共振系统，Biacore)。分析物流经抗原包被的流动池，以空白流 动池为内置参比(in-line referencing)，在HBS-EP运行缓冲液 (Biacore)中流速为30μl/min。注入第一dAb，随后立即用Biacore的 共注射功能注入第二dAb。此试验中使用dAbs DOM9-44(SEQ ID NO：358)，DOM9-155-1(SEQ ID NO：452)和DOM9-112-22(SEQ ID NO：47)。该竞争流程可通常可用于评估测试抗体或片段和已知dAb竞 争与IL-4的结合。

变应原诱导的细胞增殖

从对尘螨(HDM)过敏的供体采集血液。然后用Ficoll梯度离心 分离外周血单核细胞(PBMC)。细胞置于96孔板，浓度4x106/ml， 以20-50ug/ml HDM刺激。培养初始加入100nM的抗IL-3 dAb (1.4ug/ml)。细胞孵育5天，最后18小时加入3[H]胸腺嘧啶脱氧核 苷。然后收集细胞，通过测定掺入细胞DNA的3H的量对增殖进行评 估。

抗IL-4dAb的初筛和筛选

用VH和Vk dAb文库进行初次噬菌体筛选，筛得物亚克隆至所述 可溶表达载体pDOM5。抑制IL-4和IL-4R结合的dAb克隆通过上清 受体结合分析(RBA)进行鉴别。然后表达克隆，用蛋白A或蛋白L 纯化，以RBA中剂量反应进行检测，从而评估所述克隆抑制IL-4与 IL-4R的结合的效价。表3所示为在这样的RBA分析中抗IL-4 dAb DOM9-44(SEQ ID NO：358)，DOM9-112(SEQ ID NO：25)和DOM9-155 (SEQ ID NO：451)的结果。

表3

  IL-4受体结合分析   dAb   IC50(nM)   DOM9-44   122   DOM9-155   100   DOM9-112   3

抗IL-4 dAb的亲和力成熟

DOM9-44谱系

所述DOM9-44谱系使用体外表达和乳化实现亲和力成熟。构建 CDR2和CDR3残基多样化的文库，用于针对生物素化IL-4的筛选。 表达、纯化所得克隆，并在IL-4受体结合分析(RBA)中进行筛选。 来自该谱系的最有效的dAb为DOM9-44-502(SEQ ID NO：361)，其效 价在IL-4RBA(表4)中为5.5nM，在IL-4细胞分析(表5)中为 4.5nM。

表4

  IL-4受体结合分析   dAb IC50(nM)   DOM9-155-25   试验1 0.73   试验2 1   平均值 0.86   DOM9-44-502   试验1 4.1   试验2 3.6   试验3 5.5   试验4 8.6   平均值 5.5   DOM9-112-168   试验1 1.22   试验2 0.64   平均值   DOM9-112-210   试验n＝8 0.9 144pM

表5

  IL-4诱导的TF-1细胞增   殖   dAb   ND50(nM)   DOM9-155-25   试验1   0.55   试验2   1.1   平均值   0.83   DOM9-44-502   试验1   DOM9-112-210   试验n＝8   4.5   270pM

DOM9-155谱系

所述DOM9-155谱系使用体外表达和乳化实现亲和力成熟。所述 DOM9-155 dAb(SEQ ID NO：451)在易错条件下进行PCR扩增，并连接 入Tus载体，然后进行第二次PCR，扩增IVT盒。随后针对生物素化 的IL-4，对所述文库进行连续几轮筛选。10轮筛选后克隆入表达载 体，上清表达过夜。改进的克隆通过在所述Biacore上的筛选鉴别，随 后用作通过NNS突变使CDR1的残基多样化的文库的模板。表达、纯 化所得克隆，并在IL-4受体结合分析和IL-4细胞分析中检测。使用这 些方法鉴别的来自所述DOM9-155谱系的最有效dAb是在RBA中 IC50为0.86nM(Table 4)，且在细胞分析中IC50为0.83nM(Table 5)的DOM9-155-25(SEQ ID NO：466)。此鉴别所得物进一步筛选鉴别 得两个额外的具有亚纳摩级效价的dAbDOM9-155-77(SEQ ID NO： 2393)和DOM9-155-78(SEQ ID NO：2394)。

DOM9-112谱系

使用易错成熟文库，CDR1和2的多残基多样化的文库以及CDR1 和2的单残基多样化的文库，通过噬菌体展示，使所述DOM9-112谱 系亲和力成熟。用所得噬菌体文库针对生物素化的IL-4进行筛选。所 得物克隆入pDOM5，对表达上清进行筛选，以得到与亲本相比改善的 解离速率。具有改善的解离速率的dAb被表达，纯化，并在IL-4受体 结合分析(RBA)和细胞分析中检测。使用这些方法鉴别的最有效 dAb为如在IL-4RBA(表4)中测得的IC50值在0.9-3nM的DOM9- 112-155(SEQ ID NO：118)，DOM9-112-168(SEQ ID NO：131)，DOM9- 112-174(SEQ ID NO：137)，DOM9-112-199(SEQ ID NO：162)，DOM9- 112-200(SEQ ID NO：163)，DOM9-112-202(SEQ ID NO：165)和DOM9- 112-210(SEQ ID NO：2401)。

抗IL-4dAb的表位作图

为测定所述抗IL-4dAb的表位特异性，进行(表面等 离振子共振，)竞争试验。DOM9-44(SEQ ID NO：358) dAb被注入流经IL-4偶联的芯片，随后注入被DOM9-44(SEQ ID NO：358)结合后不与IL-4结合的DOM9-155-1(SEQ ID NO：452)dAb (图13)。类似地，DOM9-155-1(SEQ ID NO：452)被结合后，DOM9- 44(SEQ ID NO：358)不能结合。但是dAb DOM9-44(SEQ ID NO：358) 或dAb 9-155-1(SEQ ID NO：452)结合后，dAb DOM9-112-22(SEQ ID NO：47)仍能结合。结果表明dAbs DOM9-44(SEQ ID NO：358)和DOM9- 155-1(SEQ ID NO：452)与相同表位结合，DOM9-112-22(SEQ ID NO：47) 结合的表位与DOM9-44(SEQ ID NO：358)和DOM9-155-1(SEQ ID NO：452)不同。该竞争流程通常可用于评估待测抗体或片段和已知dAb (或其它抗体多肽)竞争与IL-4的结合(和表位作图)。

变应原诱导的细胞增殖

来自所有变应性供体的PBMC与HDM(尘螨)孵育时，表现出 剂量依赖性增殖。抗IL-4 dAb的添加导致多数供体中变应原诱导的增 殖受抑制。dAb DOM9-44-502(SEQ ID NO：361)抑制来自12个供体中 10个的PBMC增殖(图14A)，DOM9-155-11(SEQ ID NO：457)抑制 来自12个供体中10个的PBMC增殖(图14B)，DOM9-112-22(SEQ ID NO：47)抑制来自12个供体中的2个的PBMC的增殖。对于dAb DOM9-44-502(SEQ ID NO：361)，DOM9-155-11(SEQ ID NO：457)和 DOM9-112-22(SEQ ID NO：47)，所有相应供体的平均抑制分别为 38％、34％和23％。观测到的仅30-40％的最大应答最有可能是因为该 变应原诱导的应答不仅依赖于IL-4，还取决于其他白细胞介素如IL- 2。

IL-4诱导的B细胞增殖

从正常血液供体采集血液。Ficoll梯度离心分离PBMC。然后用阴 性B细胞分离试剂盒(EasySep Negative isolation kit，Stem Cell Technologies Inc)分离B细胞。用流式细胞仪以及CD3、CD4、CD8、 CD14、CD19和CD23染色，测定纯度超过98％。然后将B细胞置于 有IL-4(10ng/ml)的经照射CD40L+L细胞包被的板内，1x105细胞 孔。培养物孵育5天，最后18小时加入3[H]胸苷。培养开始时加入 10nM或100nM的抗IL-4dAb。

与恒河猴和食蟹猴IL-4的交叉反应性

这些dAb的预期要求为具有与恒河猴和食蟹猴IL-4的交叉反应 性。为此目的，在TF-1细胞增殖分析(参见上述更多详情)中检测 DOM9-112-210(SEQ ID NO：2401)，DOM9-155-5(SEQ ID NO：454)， DOM9-155-25(SEQ ID NO：466)，DOM9-155-77(SEQ ID NO：2393)和 DOM9-155-78(SEQ ID NO：2394)，其中用人IL-4(0.5ng/ml， Peprotech)，恒河猴IL-4(0.5ng/ml，R&D systems)或食蟹猴IL-4(含 有室内表达的食蟹猴IL-4的上清的1∶25000稀释液)刺激细胞。所述 dAb的剂量反应将确定该方式中的ND50。所得值总汇于下表(表 6)，证明有交叉反应性。

表6

  dAb   人IL-4(nM) 恒河猴IL-4(nM)   食蟹猴IL-4(nM)   DOM9-155-5   0.3-0.5   18-2.7   DOM9-155-77   1.1-1.7   3.6-5.4   DOM9-155-78   0.5-0.7   1.3-2.0   DOM9-155-25   0.75-1.1   2.7-4.1   2.6-3.8   DOM9-112-210   0.27   0.4   0.6

实施例3：与IL-13结合的配体

夹心ELISA

MAXISORPTM板(高蛋白结合ELISA板，Nunc，Denmark)用 2.5μg/ml包被抗体(Module Set，Bender MedSystems，Vienna， Austria)包被过夜，然后用含0.05％(v/v)Tween 20的PBS洗涤一次， 随后用含PBS的0.5％(w/v)BSA0.05％(v/v)Tween20的PBS封闭。再 次洗涤该板，然后加入25pg/ml混合有DOM10dAb(即抗IL-13 dAb)系列稀释液的IL-13或IL-13(Bender MedSystems)。再次洗涤 该板，然后用生物素缀合的检测抗体(Module Set，Bender Medsystems)，然后用过氧化物酶标记的链霉亲和素(Module Set， Bender MedSystems)检测IL-13与捕捉抗体结合。之后板与TMB底物 (KPL，Gaithersburg，USA)孵育，加入HCl终止反应，450nm读取吸收 值。抗IL-13dAb活性导致IL-13结合减少，因此与仅IL-13的对照相 比，吸收值降低。

使用8200细胞检测系统(8200 cellular detection system)进行IL-13 受体结合分析(RBA)

SPHEROTM山羊抗人IgG(H&L)聚苯乙烯微粒(山羊抗人微 粒，Spherotech，Libertyville，USA)用20μg IL-13Rα1/Fc嵌合体或 IL-13Rα2/Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis，USA)包被过夜。下 列试剂随后在384孔，边侧黑色底部透明的FMAT板(Applied Biosystems，Foster City，USA)中结合：DOM-10dAb的PBS系列稀释 液或含0.1％(w/v)BSA的PBS；0.5μg/ml生物素化抗IL-13抗体 (R&D Systems)；0.25μg/ml STREPTAVIDIN ALEXA647 缀合物(荧光探针，分子探针，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)；10 ng/ml重组人IL-13(R&D Systems)；以及IL-13R2/Fc包被微粒的 1∶10稀释液。该板培养7小时，然后在8200细胞检测系统(Applied Biosystems)中读取。IL-13与受体包被微粒结合形成了复合物，该复 合物由所述8200系统检测荧光现象。抗IL-13dAb活性使IL-13结合减 少，因此与仅IL-13的对照相比荧光现象减弱。

IL-13细胞分析

检测经分离的dAbs抑制IL-13诱导的经培养TF-1细胞(ATCC目 录号：CRL-2003)增殖的能力。简而言之，无酚红的RPMI培养基 (Gibco，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)中40000个TF-1细胞置于组织培养微 孔板的孔中，用终浓度5ng/ml的IL-13(R&D Systems，Minneapolis， USA)和待检测的dAb稀释液混合。混合物37℃，5％CO2孵育72小 时。然后加入CELLTITER试剂(检测活力的比色分析试剂， Promega，Madison，USA)，每孔内的细胞量通过测定490nm的吸光值 进行定量。抗IL-13dAb的活性导致细胞增殖减少，与仅IL-13相比， A490相应降低。

解离速率筛选

链霉亲和素包被的SA芯片(Biacore)用大约500RU的生物素化的 IL-13(R&D Systems，Minneapolis，USA)包被。含有可溶性dAb的上 清用运行缓冲液以1∶5稀释。50至100ul被稀释的上清以50ul/min 流速注入(kininject)，然后在解离相中解离5分钟。与亲本克隆相比 解离速率改善的克隆用肉眼鉴别或用BIAevaluation软件v4.1测定 (Biacore)。

用抗IL-13dAb的竞争

这些试验在3000仪(表面等离振子共振仪，Biacore) 上进行，使用链霉亲和素包被的，偶联有～400RU生物素化IL-13 (R&D Systems)的SA芯片(Biacore)。分析物流经抗原包被的流动 池，以空白流动池为内置参比(in-line referencing)，在HBS-EP运行 缓冲液(Biacore)中流速为30μl/min。注入第一dAb DOM10-176-535 (SEQ ID NO：1362)，随后立即用Biacore的共注射功能注入dAb DOM 10-53-99(SEQ ID NO：738)。该竞争流程可通常可用于评估测试抗体或 片段和已知dAb(或其他抗体多肽)竞争与IL-13结合。

竞争和表位作图

抗IL-13dAb的表位作图

为测定所述抗IL-13dAb的表位特异性，进行Biacore竞争试验。 注入dAb DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)，随后立即注入dAb DOM10-53-99(SEQ ID NO：738)。dAb DOM10-53-99(SEQ ID NO：738) 不与已和dAb DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)结合的IL-13结合。 这表明这些dAb与相同表位结合。该竞争流程通常可用于评估待测抗 体或片段与已知dAb(或其他抗体多肽)竞争与IL 13结合(和表位作 图)。第二组dAb的表位用稍作改变的IBIAcore流程确定，其中第一 组dAb被注入流经IL-13表面，随后注入高亲和力结合的，高浓度 (5μM)dAb(DOM10-53-386(SEQ ID NO：934))，使IL-13表面饱和， 最后再次注入所述dAb。如果用DOM10-53-386(SEQ ID NO：934)饱和 之前和之后的结合间存在不同，则表位至少部分重叠。使用此试验方 式，确定了Vk dAbs DOM10-212(SEQ ID NO：2016)，DOM10-270 (SEQ ID NO：1915)，DOM10-213(SEQ ID NO：1904)和DOM10-215 (SEQ ID NO：1906)与DOM10-53-386(SEQ ID NO：934)的表位相同，而 DOM10-208(SEQ ID NO1886)和DOM10-224(SEQ ID NO：1911)有不同 的表位。相同的BIAcore方式用于Vh dAbs DOM10-416(SEQ ID NO：1834)，DOM10-236(SEQ ID NO：1804)，DOM10-273(SEQ ID NO：1818)，DOM10-275(SEQ ID NO：1871)，DOM10-276(SEQ ID NO：1872)和DOM10-277(SEQ ID NO：1873)的注射。所有这些dAb已证 实与DOM10-53-386(SEQ ID NO：934)具有至少部分重叠的表位。这表 明一旦注入DOM10-53-386(SEQ ID NO：934)，则dAb结合更少。

IL-13诱导的B细胞增殖

从正常血液供体采集血液。Ficoll梯度离心分离PBMC。然后用阴 性B细胞分离试剂盒(EasySep Negative isolation kit，Stem Cell Technologies Inc)分离B细胞。用流式细胞仪以及CD3、CD4、CD8、 CD14、CD19和CD23染色，测定纯度超过98％。然后将B细胞置于 有IL-13(10ng/ml)的经照射CD40L+L细胞包被的板内，1x105细胞/ 孔。培养物孵育5天，最后18小时加入3[H]胸苷。培养开始时加入 10或100nM的抗IL-13dAb。

形成

使用PEG-马来酰亚胺使DOM10-53-343位点特异性PEG化

所述抗IL13 dAb DOM10-53-343(SEQ ID NO：891)经人工改造在所 述蛋白C端连接有半胱氨酸。所述dAb的表达和纯化如上述操作。所 述经人工改造具半胱氨酸的dAb用支链40K PEG2-MAL特异性修 饰，得到单体修饰蛋白。其他PEG形式如线性PEG-MAL也可得到， 线性PEG-MAL也可用于生成PEG化的单体，如30K或40K的线性 PEG。

mPEG-MAL    mPEG2-MAL

mPEG-MAL形式可用于PEG化单体dAb。所述PEG的MW大小为 500至60,000(例如2,000至40,000)，其性质或是线性的或是支链 的。

用5mM二硫苏糖醇还原1ml的160μM DOM10-53-343cys，室温 放置20分钟。样品用PD-10柱(Amersham Pharmacia)交换缓冲液，去 除所述还原剂。柱子已用5mM EDTA，20mM BIS-TRIS pH 6.5，10％ 甘油预平衡，按照制造商的指导上样并洗脱。所述样品(3.5ml of～50 μM dAb)随后直接与三倍摩尔过量的40K PEG-MAL(～20mg)直接混 合。反应在室温下进行3小时。

阴离子交换纯化PEG化的DOM10-53-343cys单体

所述样品用阴离子交换色谱(1ml Resource Q column)进一步纯 化，以去除任何未反应的PEG和蛋白。样品用平衡缓冲液(50mM TRIS pH 8.0)三倍稀释，上样到已用相同缓冲液平衡好的柱子上。以 0-500mM线性氯化钠梯度的50mM TRIS缓冲液，跑20个柱体积以 上，把PEG化的物质与修饰的dAb分离，仅含有PEG化dAb的级 分用SDS-PAGE鉴别，然后合并。

使用30KPEG-ALD使N端PEG化

使用30K PEG-ALD使所述抗IL13 dAb DOM10-53-338(SEQ ID NO：886)N端(α氨基基团)PEG化。所述dAb缓冲交换至20mM、 pH6.0的磷酸缓冲液中，终蛋白浓度2mg/ml(～166μM)。5倍摩尔过量 的PEG-ALD(830μM聚合体)直接加入所述dAb溶液，然后加入 2mM氰基硼氢化钠以减少与对水解稳定的胺的瞬时亚胺连接。然后室 温继续反应过夜。样品用如上所述的阴离子交换色谱进一步纯化。

使用40K PEG2-NHS使表面赖氨酸残基PEG化

使用40K PEG2-NHS使所述抗IL13 dAb DOM10-53-338(SEQ ID NO：886)表面赖氨酸残基PEG化。所述dAb缓冲交换至20mM、 pH8.0的磷酸缓冲液中，终蛋白浓度2mg/ml(～166μM)。5倍摩尔过 量的PEG-NHS(830μM聚合体)直接加入所述dAb溶液，室温下继 续反应过夜。样品用如上所述的阴离子交换色谱进一步纯化。

抗IL-13dAb的初筛和筛选

用VH和Vk dAb文库进行初次噬菌体筛选，筛得物亚克隆至所述 可溶表达载体pDOM5。抑制IL-13和IL-13R1结合的dAb克隆通过上 清RBA进行鉴别。然后表达克隆，用蛋白A或蛋白L纯化，以RBA 中剂量反应进行检测，从而确定所述克隆抑制IL-13与IL-13R1结合的 效价。表7为在这样的RBA分析中抗IL-13dAbs DOM10-53(SEQ ID NO：651)和DOM10-176(SEQ ID NO：1285)的结果，IC50值分别为150 和100nM，而其他的IC50值在微摩尔范围内。

表7

  IL-13受体I结合分析   dAb   IC50(nM)   DOM10-53   150   DOM10-176   100   DOM10-416   6000   DOM10-273   600   DOM10-275   1000   DOM10-276   3000

抗IL-13dAb的亲和力成熟

DOM10-176谱系

所述编码dAb DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)的核酸在易错条 件下行PCR扩增，并连接入scArc载体，然后进行第二次PCR，扩 增IVT盒。随后对所述文库进行连续多轮筛选，抗原浓度逐渐从50降 至5nM。

构建DOM10-176(SEQ ID NO：1285)的CDR2中多样化位置52-54 的分离文库，并用于进一步筛选。所得克隆在上清中表达，筛选得到与 亲本相比改善的解离速率。具有改善的解离速率的dAb被表达，纯 化，并在IL-13夹心ELISA和细胞分析中检测。来自这两轮筛选所鉴 别的最好dAb的突变相结合，生成DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)。这是所述DOM10-176谱系的最有效的dAb，在RBA中 IC50值在0.5nM的范围内，在IL-13细胞分析中为0.77nM(表8和 9)。

表8

  IL-13分析   IL-13受体I结合分析   DOM10-176-535   IC50(nM)   试验1   0.56   试验2   0.76   试验3   0.63   试验4   0.41   平均值   0.59   IL-13夹心ELISA   IC50(pM)   DOM10-53-234   试验1   87   试验2   81   试验3   87   试验4   40   平均值   73   DOM10-53-396   试验1   55   试验2   30   平均值   42

表9

  IL-13诱导的TF-1细胞增   殖   ND50(nM)   DOM10-176-535   0.77   DOM10-53谱系  ND50(pM)   10-53-234  43   10-53-344  100(n＝2)

DOM10-53谱系

使用易错成熟文库，CDR1、2和3的多残基多样化文库，以及 CDR1、2和3的单残基多样化文库，通过噬菌体展示，使所述 DOM10-53谱系亲和力成熟。所得噬菌体文库用于针对生物素化IL-13 的筛选。所得物克隆入载体pDOM5，对表达上清进行筛选，以得到与 亲本相比具有改善的解离速率。具有改善的解离速率的dAb被表达， 纯化，并在IL-13夹心ELISA和细胞分析中检测。使用这些方法鉴别 的最有效dAb为DOM10-53-223(SEQ ID NO：774)，DOM10-53-234 (SEQ ID NO：785)，DOM10-53-316(SEQ ID NO：866)，DOM10-53-339 (SEQ ID NO：887)，DOM10-53-344(SEQ ID NO：892)和DOM10-53-396 (SEQ ID NO：944)，在IL-13夹心ELISA和IL-13细胞分析中效价值为 100pM至40pM(表8和9)。

抑制IL-13和IL-13Rα2结合

在竞争分析中检测抗IL-13dAb抑制IL-13和IL13Rα2结合的能 力。表10表明DOM10-53-316(SEQ ID NO：866)和DOM10-176-535 (SEQ ID NO：1362)都能抑制IL-13和IL13Rα2结合，IC50值分别为 2nM和8nM。

表10

IL-13受体α2结合分析 dAb   IC50(nM) DOM10-53-316   1.2 DOM10-176-535   7.9

与变体IL-13(R130Q)结合

IL-13的基因变体已与哮喘(Heinzmann et al.Hum Mol Genet.(2000) 9549-59)和气道高反应性(Howard et al.，Am.J.Resp.Cell Molec.Biol. (2001)377-384)风险增加有关。因此已确定，无论所述抗IL-13能否与 变体IL-13(R130Q)结合，TF-1增殖分析都用变体IL-13(R130Q)和数 量增加的dAb进行。表11表明DOM10-53-316(SEQ ID NO：866)和 DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)都能抑制变体IL-13诱导的TF-1增 殖，ND50值分别为大约0.5nM和8nM。

表11

  变体和人IL-13   IC50(nM)   DOM10-53-316   1   人IL-13   0.39   变体IL-13   0.52   DOM10-176-535   人IL-13   6   变体IL-13   7.8

与恒河猴和食蟹猴IL-13的交叉反应性

这些dAb的预期要求为具有与恒河猴和食蟹猴IL-13的交叉反应 性。为此目的，在TF-1细胞增殖分析(参见上述更多详情)中检测 DOM10-53-344(SEQ ID NO：892)和DOM10-53-434(SEQ ID NO：2053)， 其中用人IL-13(5ng/ml，Peprotech)，恒河猴IL-13(5ng/ml，R&D systems)或食蟹猴IL-13(含有室内表达的食蟹猴IL-13的上清的 1∶4000稀释液)刺激细胞。所述dAb的剂量反应将确定该方式中的 ND50。所得值总汇于下表(表12)，证明有交叉反应性。

表12

  dAb   人IL-4   恒河猴IL-4   食蟹猴IL-4   DOM10-53-344   100pM   n.d.   980pM

  DOM10-53-434   600pM   2.8nM   5.6nM

DOM10-416，DOM10-273DOM10-275和DOM10-276谱系

如上所述制备并定量VH dAbs DOM10-416(SEQ ID NO：1834)， DOM10-236(SEQ ID NO：1804)，DOM10-273(SEQ ID NO：1818)， DOM10-275(SEQ ID NO：1871)，DOM10-276(SEQ ID NO：1872)和 DOM10-277(SEQ ID NO：1873)的易错PCR文库。所述连接混合物的剩 余部分用作第二次，常规Taq聚合酶(SuperTaq，HT Biotechnology Ltd， Cambridge，UK)催化的PCR反应的模板，以引物AS11和AS17扩增 IVT盒。亲和力成熟反应过程中，使DOM10-275(SEQ ID NO：1871)和 DOM10-276(SEQ ID NO：1872)分离，合并DOM 10-273(SEQ ID NO：1818)和DOM10-416(SEQ ID NO：1834)。然后文库进行十轮筛选。 第一个四轮筛选中抗原浓度为75nM，接下来的两轮筛选为60mM，随 后两轮为45nM，最后两轮为30nM。

所述筛得物克隆到pDOM5表达载体中，培养物上清通过表面等离 振子共振在BIAcore1000上筛选。鉴别了许多具有改善的性质的克隆。 令人惊讶地，所述改进的克隆不是通过易错PCR的点突变，而是通过 克隆间的重组得以最大化表征。DOM10-275-1(SEQ ID NO：1918)包含 DOM10-275(SEQ ID NO：1871)的CDR1和CDR2，以及DOM10-273 (SEQ ID NO：1818)的CDR3。DOM10-276-2(SEQ ID NO：1919)包含 DOM10-276(SEQ ID NO：1872)的CDR1和CDR3，以及DOM10-416 (SEQ ID NO：1834)的CDR2。DOM10-276-2(SEQ ID NO：1919)包含 DOM10-416(SEQ ID NO：1834)的CDR1和CDR2，以及DOM10-276 (SEQ ID NO：1872)的CDR3。从所述易错PCR文库筛选的克隆如下所 列：DOM10-275-1(SEQ ID NO：1918)，DOM10-276-2(SEQ ID NO：1919)，DOM10-276-3(SEQ ID NO：1920)，DOM10-275-3(SEQ ID NO：1979)，DOM10-277-2(SEQ ID NO：1980)，DOM10-277-3(SEQ ID NO：1981)，DOM10-273-1(SEQ ID NO：1982)，DOM10-273-2(SEQ ID NO：1983)，DOM10-275-2(SEQ ID NO：1984)，DOM10-275-4(SEQ ID NO：1985)，DOM10-276-1(SEQ ID NO：1986)，DOM10-276-4(SEQ ID NO：1987)和DOM10-277-1(SEQ ID NO：1988)。

表13

  IL-13分析   IL-13 BIAcore结合分析   DOM10-275-1   Kd(nM)   试验1   25   试验2   28   平均值   27   IL-13受体结合分析   DOM10-275-1   IC50(nM)   试验1   13   试验2   128   平均值   70   IL-13夹心ELISA   IC50(nM)   DOM10-275-1   试验1   38   IL-13细胞结合分析   IC50(nM)   试验1   37

DOM10-273，DOM10-275和DOM10-276VHdAb的靶向多样化文库

VH域抗体DOM10-273(SEQ ID NO：1818)，DOM10-275(SEQ ID NO：1871)或DOM10-276(1872)也通过CDR2的位置52、54、55、57 和59，以及CDR3的位置101、102和104多样化实现亲和力成熟。两 种CDR的两个靶向位置以所有可能的组合同时随机化。靶向各自亲本 克隆中相同CDR的文库被混合，通过SOE PCR在框架3中重组，在 围绕其相应CDR1区的所有可能组合中(在核苷水平3x107个不同克 隆所计算的多样性)，生成每个基因有四个随机化残基的重组文库，两 个在CDR2里，两个在CDR3里，即总共三个文库。通过在所述SOE PCR步骤前混合所有亲本克隆的5’和3’PCR片段重复相同操作，产生 约108理论多样性的文库。最后，编码CDR1和CDR2的文库的 DOM10-275组的5’片段与DOM10-273的CDR3文库的3’组重组。

靶向多样化文库1

pDOM5载体中TOM10-273VH dAb(SEQ ID NO：1818)中的CDR2 区使用10pg模板和SuperTaq DNA聚合酶，在十轮PCR反应中被多样 化。下述正向引物AS818(SEQ ID NO：1921)，AS819(SEQ ID NO：1922)，AS820(SEQ ID NO：1923)，AS821(SEQ ID NO：1924)， AS822(SEQ ID NO：1925)，AS823(SEQ ID NO：1926)，AS824(SEQ ID NO：1927)，AS825(SEQ ID NO：1928)，AS826(SEQ ID NO：1929)， AS827(SEQ ID NO：1930)AS828(SEQ ID NO：1931)都被用于进行以 AS339(SEQ ID NO：1951)为反向引物的PCR扩增反应。合并反应产 物，用2％E-Gel(Invitrogen，USA)进行凝胶纯化，形成片段组1。其后 片段组1用PCR反应产物经SOE PCR延长，所述PCR反应产物是从 带有AS9正向引物(SEQ ID NO：1916)和AS829反向引物(SEQ ID NO：1932)的相同载体构建物扩增形成的。所述SOE PCR包括使用 SuperTaq DNA聚合酶于50℃退火步骤的15个循环的扩增。SOE产 物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl小份用引物AS639(SEQ ID NO：1952)和AS65(TTGTAAAACGACGGCCAGTG；SEQ ID NO：1917) 进一步扩增。pDOM5载体中DOM10-273VH dAb的CDR3区使用10 pg模板和SuperTaq DNA聚合酶，在三个PCR反应中被多样化。下列 正向引物AS830(SEQ ID NO：1933)，AS831(SEQ ID NO：1934)和AS832 (SEQ ID NO：1935)每个都与AS339(CAGGAAACAGCTATGACCATG； SEQ ID NO：1951)结合。合并反应产物，用2％E-Gel(Invitrogen，USA) 凝胶纯化，形成片段组2。其后片段组2用PCR反应产物经SOE PCR 延长，所述PCR反应产物是从带有AS9正向引物(SEQ ID NO：1916) 和AS833反向引物(SEQ ID NO：1936)的相同载体构建物扩增形成的。 所述SOE PCR包括使用SuperTaq DNA聚合酶于50℃退火步骤的15 个循环的扩增。SOE产物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl小份用 引物AS339(SEQ ID NO：1951)和AS65(SEQ ID NO：1917)进一步扩增。

基于片段组1和2，DOM10-273(SEQ ID NO：1818)的CDR2和 CDR3集中库的重组反应在框架3区进行。带有片段的CDR2文库用引 物AS639(SEQ ID NO：1952)和AS660(SEQ ID NO：1976)，通过片段组1 的PCR扩增产生。带有片段的CDR3文库用引物AS659(SEQ ID NO：1975)和AS65(SEQ ID NO：1917)，通过片段组2的PCR扩增产 生。所述SOE反应如前述进行，除了被延长的产物用引物AS297(SEQ ID NO：1977)和AS298(SEQ ID NO：1978)再次扩增。所述扩增反应产物 经凝胶纯化，Sal I和Not I酶切，用2％E-Gels再次纯化，然后连接至 Sal I/Not I酶切的pIE2a2A载体。

靶向多样化文库2

pDOM5载体中DOM10-275VH dAb的CDR2区使用10pg模板和 SuperTaq DNA聚合酶，在10轮PCR反应中被多样化。下述正向引物 AS836(SEQ ID NO：1939)、AS837(SEQ ID NO：1940)、AS838(SEQ ID NO：1941)、AS839(SEQ ID NO：1942)、AS840(SEQ ID NO：1943)、 AS841(SEQ ID NO：1944)、AS842(SEQ ID NO：1945)、AS843(SEQ ID NO：1946)、AS844(SEQ ID NO：1947)、AS845(SEQ ID NO：1948)AS846 (SEQ ID NO：1949)都被用于进行以AS339(SEQ ID NO：1951)为反向引 物的PCR扩增反应。合并反应产物，用2％E-Gel(Invitrogen，USA)进 行凝胶纯化，形成片段组3。其后片段组3如上所述，用PCR反应产 物经SOE PCR延长，所述PCR反应产物是从带有AS9正向引物 (SEQ ID NO：1916)和AS847反向引物(SEQ ID NO：1950)的相同载体构建 物扩增形成的。SOE产物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl小份用 引物AS65(SEQ ID NO：1917)和AS639(SEQ ID NO：1952)进一步扩增。 pDOM5载体中DOM10-273 VH dAb的CDR3区使用10pg模板和 SuperTaq DNA聚合酶在三个PCR反应中被多样化。下列正向引物 AS848(SEQ ID NO：1953)，AS849(SEQ ID NO：1954)和AS850(SEQ ID NO：1955)每个都与AS339(SEQ ID NO：1951)结合。合并反应产物，用 2％E-Gel(Invitrogen，USA)凝胶纯化，形成片段组4。其后片段组4用 PCR反应产物经SOE PCR延长，所述PCR反应产物是从带有AS9正 向引物(SEQ ID NO：1916)和AS851反向引物 (ATAAGCTTTCGCACAGTAATATAC；SEQ ID NO：1956)的相同载体构 建物扩增形成的。SOE产物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl小份 用引物AS339(SEQ ID NO：1951)和AS65(SEQ ID NO：1917)进一步扩 增。

基于片段组3和4，DOM10-275的CDR2和CDR3集中库的重组 反应在所述dAb分子的框架3进行。带有片段的CDR2文库用引物 AS639(SEQ ID NO：1952)和AS660(SEQ ID NO：1976)，通过片段组3的 PCR扩增产生。带有片段的CDR3文库用引物AS659(SEQ ID NO：1975)和AS65(SEQ ID NO：1917)，通过片段组4的PCR扩增产 生。所述SOE反应如前述进行，除了被延长的产物用引物AS297(SEQ ID NO：1977)和AS298(SEQ ID NO：1978)再次扩增。所述扩增反应产物 经凝胶纯化，Sal I和Not I酶切，用2％E-Gels再次纯化，然后连接至 Sal I/Not I酶切的pIE2a2A载体。

靶向多样化文库3

pDOM5载体中DOM10-276VH dAb的CDR2区使用10pg模板和 SuperTaq DNA聚合酶，在10轮PCR反应中被多样化。下述正向引物 AS854(SEQ ID NO：1959)、AS855(SEQ ID NO：1960)、AS856(SEQ ID NO：1961)、AS857(SEQ ID NO：1962)、AS858(SEQ ID NO：1963)、 AS859(SEQ ID NO：1964)、AS860(SEQ ID NO：1965)、AS861(SEQ ID NO：1966)、AS862(SEQ ID NO：1967)、AS863(SEQ ID NO：1968)、 AS864(SEQ ID NO：1969)都被用于进行以AS339(SEQ ID NO：1951)为 反向引物的PCR扩增反应。合并反应产物，用2％E-Gel(Invitrogen， USA)进行凝胶纯化，形成片段组5。其后片段组5如上所述，用PCR 反应产物经SOE PCR延长，所述PCR反应产物是从带有AS9正向引 物(SEQ ID NO：1916)和AS865反向引物(SEQ ID NO：1970).的相同载 体构建物扩增形成的。SOE产物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl 小份用引物AS65(SEQ ID NO：1917)和AS639(SEQ ID NO：1952)进一步 扩增。pDOM5载体中DOM10-273VH dAb的CDR3区使用10pg模 板和SuperTaq DNA聚合酶在三个PCR反应中被多样化。下列正向引 物AS866(SEQ ID NO：1971)，AS867(SEQ ID NO：1972)和AS868(SEQ ID NO：1973)每个都与AS339(SEQ ID NO：1951)结合。合并反应产物， 用2％E-Gel(Invitrogen，USA)凝胶纯化，形成片段组6。其后片段组6 用PCR反应产物经SOE PCR延长，所述PCR反应产物是从带有AS9 正向引物(SEQ ID NO：1916)和AS869反向引物 (ATAAGCTTTCGCACAGTAATATAC；SEQ ID NO：1974)的相同载体构 建物扩增形成的。SOE产物的形成经凝胶电泳证实，反应的5μl小份 用引物AS339(SEQ ID NO：1951)和AS65(SEQ ID NO：1917)进一步扩 增。

基于片段组5和6，DOM10-276的CDR2和CDR3集中库的重组 反应在所述dAb分子的框架3进行。带有片段的CDR2文库用引物 AS639(SEQ ID NO：1952)和AS660(SEQ ID NO：1976)，通过片段组3的 PCR扩增产生。带有片段的CDR3文库用引物AS659(SEQ ID NO：1975)和AS65(SEQ ID NO：1917)，通过片段组4的PCR扩增产 生。所述SOE反应如前述进行，除了被延长的产物用引物AS297(SEQ ID NO：1977)和AS298(SEQ ID NO：1978)再次扩增。所述扩增反应产物 经凝胶纯化，Sal I和Not I酶切，用2％E-Gels再次纯化，然后连接至 Sal I/Not I酶切的pIE2a2A载体。

靶向多样化文库4

所有三种VH dAbs DOM10-273(SEQ ID NO：1818)，DOM10-275 (SEQ ID NO：1871)和DOM10-276(SEQ ID NO：1872)的所有CDR2和 CDR3集中库的重组反应在所述dAb分子的框架3进行。带有片段的 CDR2文库用引物AS639(SEQ ID NO：1952)和AS660(SEQ ID NO：1976)，通过片段组1，3和5制得的文库的PCR扩增产生。带有片 段的CDR3文库用引物AS659(SEQ ID NO：1975)和AS65(SEQ ID NO：1917)，通过片段组2，4和6制得的文库的PCR扩增产生。所述 SOE反应如前述进行，除了被延长的产物用引物AS297(SEQ ID NO：1977)和AS298(SEQ ID NO：1978)再次扩增。所述扩增反应产物经 凝胶纯化，Sal I和Not I酶切，用2％E-Gels再次纯化，然后连接至 Sal I/Not I酶切的pIE2a2A载体。

靶标多样化文库5

DOM10-273(SEQ ID NO：1818)的CDR2集中库和DOM10-273的 CDR3集中库的重组反应在所述dAb分子的框架3进行。带有片段的 CDR2文库用引物AS639(SEQ ID NO：1952)和AS660(SEQ ID NO：1976)，通过片段组3制得的文库的PCR扩增产生。带有片段的 CDR3文库用引物AS659(SEQ ID NO：1975)和AS65(SEQ ID NO：1917)，通过片段组2制得的文库的PCR扩增产生。所述SOE反应 如前述进行，除了被延长的产物用引物AS297(SEQ ID NO：1977)和 AS298(SEQ ID NO：1978)再次扩增。所述扩增反应产物经凝胶纯化， Sal I和Not I酶切，用2％E-Gels再次纯化，然后连接至Sal I/Not I酶 切的pIE2a2A载体。

来自DOM10-273，DOM10-275和DOM10-276谱系的靶向多样化文库 的筛选

对于易错PCR文库，DOM10-273(SEQ ID NO：1818)，DOM10-275 (SEQ ID NO：1871)和DOM10-276(SEQ ID NO：1872)谱系的靶向多样化 文库如上所述被连接和定量。所述文库随后经十轮筛选。第一轮筛选 中，所述抗原浓度为40nM，第二轮为20nM，后八轮为10nM。用抗 原平衡15分钟后，从第四轮筛选开始使用浓度1μM的竞争dAb DOM10-275-1(SEQ ID NO：1918)10、20、20、30、50，90和90分钟。 筛得物克隆入pDOM5表达载体，培养物上清通过BIAcore 1000的表 面等离振子共振进行筛选。鉴别了许多克隆(例如DOM10-275-13 (SEQ ID NO：1989)，DOM10-275-15(SEQ ID NO：1990)，DOM10-275-20 (SEQ ID NO：1991)，DOM10-275-8(SEQ ID NO：1992)，DOM10-276-13 (SEQ ID NO：1993)，DOM10-276-14(SEQ ID NO：1994)，DOM10-276-15 (SEQ ID NO：1995)，DOM10-276-17(SEQ ID NO：1996)，DOM10-276-7 (SEQ ID NO：1997)，DOM10-276-8(SEQ ID NO：1998)，DOM10-275-11 (SEQ ID NO：1999)，DOM10-275-12(SEQ ID NO：2000)，DOM10-275-14 (SEQ ID NO：2001)，DOM10-275-16(SEQ ID NO：2002)，DOM10-275-17 (SEQ ID NO：2003)，DOM10-275-5(SEQ ID NO：2004)，DOM10-275-6 (SEQ ID NO：2005)，DOM10-275-7(SEQ ID NO：2006)，DOM10-275-9 (SEQ ID NO：2007)，DOM10-276-10(SEQ ID NO：2008)，DOM10-276-11 (SEQ ID NO：2009)，DOM10-276-12(SEQ ID NO：2010)，DOM10-276-16 (SEQ ID NO：2011)，DOM10-276-5(SEQ ID NO：2012)，DOM10-276-6 (SEQ ID NO：2013)，DOM10-276-9(SEQ ID NO：2014))。

表14

  IL-13分析   IL-13BIAcore结合分析   DOM10-276-15   Kd(nM)   试验1   1.5   IL-13夹心ELISA

  IC50(nM)   DOM10-276-15   试验1   100   IL-13细胞结合分析   IC50(nM)   试验1   90

抗IL-13dAb的表位作图

为确定抗IL-13dAb的表位特异性，进行Biacore竞争试验。注入 dAb DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)，随后立即注入dAb DOM10- 53-99(SEQ ID NO：738)。dAb DOM10-53-99(SEQ ID NO：738)不与已和 dAb DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)结合的IL-13结合。这表明这 些dAb与相同表位结合。该竞争流程通常可用于评估待测抗体或片段 与已知dAb(或其他抗体多肽)竞争与IL-13结合(和表位作图)。

B细胞增殖分析

之前已证实CD40L能活化细胞，使其对IL-13有应答。该研究中 受测试的所有供体的B细胞与受辐射的CD40L+L细胞和浓度增加的 IL-13共同孵育时，所有供体确实都表现出剂量依赖性增殖。使用仅B 细胞或仅CD40L转染L细胞做阴性对照。加入抗IL-13dAb DOM10- 53-338(SEQ ID NO：886)和DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)使IL-13 诱导的所有供体B细胞的增殖受抑制(图15)。dAb DOM10-53-338 (SEQ ID NO：886)和DOM10-176-535(SEQ ID NO：1362)浓度都为10nM 时平均抑制率为80％，浓度都为100nM时平均抑制率为100％。阳性 对照为3μg/ml抗IL-13mAb(R&D)时，也观测到所述B细胞增殖的 全部抑制。不与IL-13结合的对照dAb不能抑制此B细胞增殖。

PEG化单体

使用30K醛类PEG部分通过N端或使用40K PEG2-NHS活化部 分通过表面赖氨酸使所述抗IL13 dAb DOM10-53-338(SEQ ID NO：886) PEG化。所述抗IL-13 dAb DOM10-53-343(SEQ ID NO：891)也经克隆所 述蛋白C端带有半胱氨酸。该分子使用带支链40K PEG2-MAL部分的 PEG-马来酰亚胺在C端PEG化。为确定PEG化的效果，检测PEG化 DOM10-53-338dAb在IL-13受体结合分析中抑制IL-13结合，以及抑 制IL-13诱导的TF-1细胞增殖的能力。在IL-13受体结合分析中(表 15)以及IL-13诱导的IF-1细胞增殖分析中(表15)中，维持30K PEG化DOM10-53-338dAb和40K PEG化DOM10-53-338dAb的效 价。为确定C端PEG化的效果，在IL-13受体结合分析中(表15)， 测试PEG化(40K PEG2-MAL)DOM10-53-343dAb抑制IL-13结合的能 力。在IL-13受体结合分析中，与天然DOM10-53-343dAb相比，C端 PEG化DOM10-53-343dAb的效价略有改善。

表15

  PEG化抗IL-13dAbs   IC50(pM)   IL-13受体结合分析   DOM10-53-338   387   DOM10-53-33830K PEGALD   169   DOM10-53-33840K PEG2NHS   226   IL-13诱导的TF-1增殖   DOM10-53-338   423   DOM10-53-33830KPEGALD   181   DOM10-53-33840K PEG2NHS   231   IL-13受体I结合分析   DOM10-53-343   136   DOM10-53-34340K PEG2MAL   33

抗IL-13dAb的生物物理学性质

为了研发肺部给药的产品，理想的是所述分子具有良好的生物物理 学性质。化学和物理稳定性差可能会降低生物学活性。肺部给药的蛋白 可能承受额外的应力如剪切力以及雾化装置中增加的温度。肺部能代谢 一些给药剂量，在一些疾病适应症中存在能影响生物学活性的高水平蛋 白酶。为此目的，我们通过多角度光散射(MALS)研究了溶液状态， 以及由DOM10-53谱系分子的差示扫描量热法(DSC)确定的熔化温 度。

SEC-MALLS(多角度激光散射)

dAb蛋白的溶液内性质通过最初的SEC(大小排阻层析；TSK胶 G2000/3000SWXL，Tosoh Biosciences，Germany；BioSep-SEC-S2000/3000， Phenomenex，CA，USA)分离，随后通过UV(280nm吸收)，RI(折 射率)和光散射(685nm激光)在线检测洗脱的蛋白性质的物质。 280nm处测定吸收值，确定蛋白初始浓度为0.5-1mg/mL，SDS-PAGE 目测杂质。待注射样品的均质性通常＞90％。注射100uL到SEC柱上。 SEC上0.5mL/min分离蛋白45分钟。用PBS(磷酸缓冲盐水±10％ EtOH)做流动相。ASTRA软件(Wyatt Inc；CA；USA)综合了所有三 个检测器的信号，根据“第一物理学原理(first physical principle)”确 定蛋白摩尔质量(kDa)。对于一些特征dAb，如正交方法(即 AUC)所示能可靠地确定蛋白的自结合。可通过将已知溶液内状态的 阳性对照和每个样品批次一起进行试验，来评估批间变异和数据质量。 对于某些DOM10-53克隆，没有可靠的溶液状态，因为所述分子非特 异性(aspecifically)结合到柱基质或无法用大小排阻层析解离。对于所述 溶液状态是可靠的那些情况(即DOM10-53(SEQ ID NO：651)， DOM10-53-531(SEQ ID NO：2097)和DOM10-53-612(SEQ ID NO：2044))，已证实DOM10-53(SEQ ID NO：651)分子在溶液中主要 是单体。

DSC(差示扫描量热法)

蛋白在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)中透析过夜，稀释并过滤， 280nm测吸光值得到PBS中浓度0.5mg/ml的溶液。PBS缓冲液用作所有样 品的参比。用毛细管池微量热计VP-DSC(Microcal，MA，USA)进行 DSC，加热速率180℃/小时。对于参比缓冲液和所述蛋白样品而言，典型 的扫描通常是25-90℃。每个参比缓冲液和样品配对后，用1％Decon的水 溶液和随后的PBS溶液清洗所述毛细管池。使用Origin 7Microcal软件分 析得到的数据曲线。从样品曲线减去从参比缓冲液获得的所述DSC曲 线。样品的精确摩尔浓度被输入常规用于得到appTm、焓(ΔH)和van’t Hoff焓(ΔHv)值的所述数据分析。数据通常适于非两态模型。所述DSC 试验表明，当保持其效价时，与其他DOM10-53分子(如10-53-344和 10-53-434)相比，一些DOM10-53分子(如10-53-472(SEQ ID NO：2103) 和10-53-474(SEQ ID NO：2105))的熔化温度更高。这样的性质表明稳定 性增加，能用于肺部给药。

表16

  分子   Tm(℃)   Mw  SECMALLS   效价IC50(pM)   10-53-344   52.6/54.2   -  n.d.   100   10-53-434   53.4   17kDa/27kDa  单体/二聚体   290   10-53-531   62.7   15,5kDa  单体   340   10-53   62.7  单体   100nM   10-53-612   63.6  单体   20nM   10-53-472   57.4  n.d.   54   10-53-474   57.5  n.d.   n.d.   10-53-475   55.3  n.d.   46

肺部给药的抗IL-13dAb的药代动力学测定

测试物质

DOM10-53-613(SEQ ID NO：2022)与人IL-13结合，但不与鼠IL- 13结合。带有用于检测的HA标签的DOM10-53-613(1.2mg/ml)用含 100mM NaCl的pH6.0，20mM柠檬酸稀释。施用前所述稀释溶液的温 度从贮存温度升至37℃。DOM10-53-613(1.2mg/ml)施用于老年雄性 BALB/c小鼠，给药时间8周。动物轻微麻醉，将50μl所述有关dAb 溶液或溶剂轻轻滴到鼻孔。当所述动物在溶液中自主呼吸时，其取直立 位几秒钟，而后可恢复自然状态，回到原笼中。其后在下列时间点：10 分钟，1小时，2小时，4小时，8小时和16小时，杀死小鼠。在每个 时间点采集每个小鼠的血清、肺管饲法(gavage)和肺匀浆。在每个时间 点对三只小鼠取样。

ELISA检测HA标记的dAb

96孔Maxisorp(Nunc)分析板于4℃用2μg/ml山羊多克隆抗HA 标记抗体(Abcam)的碳酸盐缓冲液，每孔100μl包被过夜。用0.05％ tween/PBS洗涤各孔三次，用PBS洗涤各孔三次。每孔加入200μl含 2％BSA的PBS封闭板。洗涤板，然后加入100μl HA标记的dAb标准 或样品。洗涤板，然后每孔加入100μl蛋白A-HRP(1∶5000稀释； Amersham)。每孔加入100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase(KPL，Gaithersburg，USA)溶液显色，室温放置直至合适的信 号显色。加入HCl终止反应，450nm读取吸收值。在GraphPad里绘制 数据，然后使用房室模型使数据在WinNonLin中拟合。

结果

BAL中DOM10-53-613(SEQ ID NO：2022)水平显示所述dAb有效 地进入了肺腔。1小时时BAL中可检测到19μg/ml(0.4ml中有～7μg) 的最高水平。这意味着给药剂量的至少12％(给药总量60μg中的7 μg)进入肺腔。可能使用灌洗法不能回收全部物质，该值可能被低 估。BAL中水平1小时时达最大值，dAb清除的t1/2为4.4小时，导致 16小时时高于10倍减少浓度。

肺中DOM10-53-613(SEQ ID NO：2022)水平显示2小时时最高水 平为3.4μg/ml。这意味着给药剂量的约5-6％出现在肺组织中。至于所 述BAL，肺中水平的下降表现出相似的模式。10分钟时水平最高，随 后清除率t1/2约为4.7小时，导致16小时时高于10倍减少浓度。

检测了DOM10-53-613(SEQ ID NO：2022)的血清水平。血清水平4 小时时达最大值。4小时时血清中测得的最高水平为0.73μg/ml。这意 味着可在血清中检测到给药物质的～1％(给药60μg中的0.7μg)。

表17

  BAL   肺   血清 T1/2(hr)   4.4   4.7   3.5 AUC0-∞(μg*hr/mL)   103.2   29.7   6.6 清除率(mL/hr/kg)   29.1   101.1   455.5 浓度最大值(CMax，μg/mL)   19.0   3.4   0.7 时间最大值(TMax，hr)   1   0.167   4

实施例4：与IL-4和IL-13结合的配体

融合蛋白

抗IL-4和抗IL-13双特异性二聚体的克隆和制备

编码抗IL-4dAb DOM9-112和抗IL-13dAb DOM10-53-343(SEQ ID NO：891)的核酸克隆到编码带有C端半胱氨酸的线内(in-line)融合 蛋白的构建物中。所述氨基酸序列AST出现在所述两个dAb之间，此 序列是天然抗体中出现的天然CH序列。所述构建物克隆到巴斯德毕赤 酵母载体pPICZα(Invitrogen)中。用所述构建物转化电感受态细胞(X- 33或KM71H)，100μg/ml零霉素筛选转化物。500ml培养物30℃、 250rpm在BMGY培养基中生长24小时至OD600达到～15-20。快速 旋转细胞使其沉淀，用BMMY培养基(含0.5％(v/v)甲醇)重悬，诱 导蛋白表达。培养物保持在30℃，250rpm振摇。每隔24小时往培养 物中加50％的甲醇溶液，如下使甲醇浓度逐渐增加为：1％、1.5％和 2％(v/v)。然后离心收集所述培养物，含有被表达蛋白的上清于4℃保 存直至使用。用标准纯化流程，使用PrA流线纯化上清中的蛋白。

发现所述PrA纯化的蛋白含有二聚体和单体种类。因此使用层析 聚焦分离所述两种蛋白。用Mono P 5/20柱(GE Healthcare)进行分 离，pH梯度为6至4。使用的多缓冲(polybuffer)如制造商所述使pH 范围为6至4。pH6时上样，使用100％缓冲液A跑35个柱体积产生 所述pH梯度，流速1ml/min。含有二聚体的级分用SDS-PAGE鉴别， 并混合进行PEG化。

然后使用以上略述的方法，用40K PEG2-MAL使所述蛋白PEG 化。此物质用阴离子交换层析纯化至纯度＞95％。在IL-4 RBA(图16A) 和IL-13RBA(图16B)中，测定得到的双特异性配体(PEG化 DOM9-112(AST)DOM10-53-344))的效价。与所述dAb DOM9-112单 体(3.5nM)的效价相比，所述双特异性配体(13nM)的抗IL-4臂的 效价略有降低，而所述抗IL-13臂的效价没有改变(所述双特异性配体 为310pM，所述dAb单体为230pM)。

所述抗IL-4和抗IL-13dAb DOM9-112(SEQ ID NO：25)和DOM10- 53-344(SEQ ID NO：892)，作为与所述出现在两个dAb间的氨基酸序列 ASTKGPS(SEQ ID NO：1803)的线内融合物也被克隆，此序列是天然抗 体中所述CH序列的起始。得到的经纯化双特异性配体(DOM9-112 (ASTKGPS)DOM10-53-344)的效价在IL-4RBA(图17A)和IL-13 夹心ELISA(图17B)中测定。所述抗IL-4臂的效价没有变化(～1 nM)，而与所述dAb单体相比，所述抗IL-13臂的效价仅略有下降 (dAb单体为40pM，所述双特异性配体为120pM)。

IL-4和IL-13的额外双靶向线内融合物

为一步理解IL-4和IL-13结合dAb的双靶向线内融合物的性 质，构建了一系列新的线内融合物和线内融合物文库。使用FR1、 CDR1、CDR2和CDR3三联体残基多样化文库，用噬菌体展示使所述 DOM10-53谱系亲和力成熟。所述文库克隆到噬菌体载体中，作为与 (dAb1接头dAb2)线内融合物基因3蛋白的融合蛋白展示，dAb1 为DOM9-112-210(SEQ ID NO：2401)，所述接头为氨基酸残基 ASTKGPS(SEQ ID NO：1803)，dAb2为DOM10-53文库。所述选择方 法、亚克隆并在大肠杆菌中表达，以及筛选方法本质上如上述操作，除 了用线内融合构建物替代单个dAb。所得物克隆到载体pDOM5，通过 结合到蛋白A包被的Biacore芯片，筛选表达上清液中改进的表达。

表达水平改善的线内融合物被表达，纯化，在IL-13夹心ELISA 和细胞分析中检测。筛选大量变体(包括DOM9-112-210-ASTKGPS- DOM10-53-566)。最有效的克隆是DOM10-53-531(SEQ ID NO：2097) 和DOM10-53-546(SEQ ID NO：2110)(参见表18)。从这些克隆制备 不同的蛋白，这些如上所述在IL-4RBA和IL-13夹心分析中检测。

表18

  克隆名称   表达水平   (mg/l)   IL-13夹心ELISA   (EC50nM)   IL-4RBA   (IC50nM)   DOM9-112-210-DOM10-53-   531   制备1   9.3   1.1/1.9   3.5/4.8   制备2   11.5   4.9   n.d.   制备3   4.5   2/2.8   13.9   制备4   10   1   5.4   DOM9-112-210-DOM10-53-   546   制备1   2.2   0.62/0.77   4.3   制备2   7.7   1   6

通过编码dAb接头的所述DNA片段的SOE PCR构建进一步的线 内融合物，如果所述第一dAb是Vh，则所述dAb接头是ASTKGPS (SEQ ID NO：1803)，如果所述第一dAb是Vk，则所述dAb接头是 TVAAPS(SEQ ID NO：2459)。此PCR产物用SalI/NotI酶切，连接到大 肠杆菌表达载体pDOM5。转化到MACH1(Invitrogen)细胞后，所进克 隆经序列检验，表达所述线内融合物。大肠杆菌在补充Onex培养基 (Novagen)的2TY中30℃生长2晚进行表达，细胞离心，上清与蛋白- L或蛋白-A树脂孵育。从树脂上洗脱后，制得的线内融合产物的质量 和数量用SDS-PAGE检验。所形成产物的相当大部分具有仅有有限自 由单体的线内融合物的分子量。因此无需额外的纯化步骤，可直接检测 所述物质。

使用上述方法表达、纯化和表征下述IL-4/IL-13线内融合物：

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-208

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-212

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-213

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-215

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-224

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-270

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-416

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-236

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-273

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-275

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-276

DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-277

DOM10-208-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-212-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-213-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-215-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-224-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-270-TVAAPS-DOM9-155-78

DOM10-416-ASTKGPS-DOM9-155-78

DOM10-236-ASTKGPS-DOM9-155-78

DOM10-273-ASTKGPS-DOM9-155-78

DOM10-275-ASTKGPS-DOM9-155-78

DOM10-276-ASTKGPS-DOM9-155-78

DOM10-277-ASTKGPS-DOM9-155-78

一旦纯化，即测定所述表达水平(mg/l)，在RBA中检测IL-4结 合活性，在夹心ELISA中检测IL-13结合活性。下表(表19)总结了 这些线内融合物的数据：

表19

此外，特异性筛选亲和力成熟变体DOM10-275(SEQ ID NO：2196)，即DOM10-275-1(SEQ ID NO：2241)，使其与DOM9-112- 210(SEQ ID NO：2434)和DOM9-155-78(SEQ ID NO：2427)都配对。这 些线内融蛤物如上述进行构建和表达。除了所述IL-4RBA和IL-13夹 心ELISA中的检测，还在TF-1细胞增殖分析中检测这些线内融合物的 功能。在这些分析中，所述dAb与固定数量的IL-4或IL-13预孵育， 此混合物加到TF-1细胞中，细胞孵育72小时。孵育后，测定细胞增殖 水平。此分析的结果总结如下(表20)，表明在所述细胞分析中所述 线内融合物的双臂是有活性的。

表20

  样品 DOM9RBA IC50(nM)   DOM10RBA   IC50(nM)   Il-4细胞分析   IC50(nM)  IL-13细胞分析  IC50(nM)   DOM9-112-210   0.391   -   DOM9-155-78   0.456   -   DOM10-275-1-   DOM9-155-78   6.238   39.17   5.1-7.6   31-46   DOM9-112-210-   DOM10-275-1   4.189   44.88   6.8-10.2   27-40   DOM10-275-1   -   31.30

B.IgG样形式

双特异性IgG克隆、表达

用所述载体pDOM30表达与IL-4和IL-13结合的IgG样形式。此 载体是基于所述Invitrogen pBudCE4.1骨架的，已经修饰包含CMV启 动子控制的密码子优化的重链盒，以及EF1-α启动子控制的密码子优化 的轻链盒。用BamHI和XhoI限制酶切位点将dAb克隆到所述重链 盒，用SalI和BsiWI限制酶切位点将dAb克隆到所述轻链盒。此策略 产生天然重和轻链N端与下述可变-恒定域接头。IgG表达构建物被转 化入在补充有250μg/L零霉素的低盐LB琼脂上生长的化学感受态 MachI细胞(Invitrogen)。对于每个构建物，从3或4个随机挑取的克隆 制备质粒DNA，用引物CMV-F(CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG) (SEQ ID NO：1795)和pIG(EF1-α)(TGAGTGGGTGGAGACTG)(SEQ ID NO：1796)验证dAb序列。使用用于经验证克隆的Qiagen无内毒素超大 量制备试剂盒(Qiagen endo-free Megaprep kit)，从500mL过夜培养 物制备无内毒素的质粒DNA。

在IL-4受体RBA和IL-13夹心ELISA中评估所述抗IL-4和抗IL- 13特异性IgG样形式的特异性。图18表明当形成所述IgG样形式时， 所述抗IL-4dAb单体DOM9-44-502(SEQ ID NO：361)的效价降低3-4倍 (所述dAb单体为4nM，所述IgG样形式为13nM)，而对于所述 dAb单体和所述IgG样形式，所述抗IL-13dAb DOM10-176-535(SEQ IDNO：1362)的效价为1nM。

[3H]-PEG化抗IL-13dAb以及抗IL-4和抗IL-13线内融合物的药代动力 学测定

PEG化抗IL-13dAb以及抗IL-4和抗IL-13线内融合物的放射性标记

如上所述，抗IL-13dAb以及抗IL-4和抗IL-13线内融合物被表 达，并使用40K支链PEG使所述N端(α氨基)或C端PEG化。使 用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)中的N-琥珀酰亚胺[2，3-3H]丙烯酸酯 (NSP)，用氚放射性标记所述蛋白。400μL NSP分散在瓶中，≤30℃ 下慢慢通氮气去除溶剂。之后所述残基重悬于100μL DMSO中。2.5mL DOM0910 40K支链PEG随后加入NSP/DMSO中，混合物室温孵育 60分钟。孵育后溶液上样到用25mL磷酸盐缓冲液(PBS)预平衡的 PD10柱上，丢弃洗脱液。用3.5mL PBS把放射性标记蛋白从PD10柱 洗脱下来，收集洗脱液。测定所述物质的特异性活性(假设100％标 记，蛋白从所述PD10柱上100％回收)，立即使用所述溶液或约4℃ 保存至使用。

动物工作

每个分子都用3只雌性Spargue-Dawley大鼠，单次静脉给药剂量 1mg/kg。然后在2分钟、2小时、8小时、24小时、48小时、72小时 和96小时后尾静脉采系列血样。麻醉状态下心脏穿刺处死前，给药 120小时后立即采最后血样。

收集血样，凝血得到血清。一旦凝血，样品3000rpm离心10分 钟。然后收集血清，-20℃保存至分析。

放射活性测定

用自动猝灭校正，通过液体闪烁计数测定每个样品的放射性含量。 加入闪烁液前用PBS混合血清样品。从样品衰变率中减去合适空白样 品瓶的衰变率，得到每个样品的净每分钟衰变率(dpm)。两次背景水 平下的总放射性被认为是在可信检测限下。

给药后2分钟，48小时和120小时得到的额外称重等份的血清， 冻干后测定放射性浓度，以确定没有氚时对放射性总量的任何贡献。

使用Winonlin拟合软件拟合数据。测定末端半衰期值，在表21中 有描述。带有N端40K支链PEG的DOM9-112-210 ASTKGPS DOM10-53-612的末端半衰期为41小时，而带有C端40K支链PEG 的DOM9-112-210 ASTKGPS DOM10-53-612半衰期为32小时。

表21

  分子   动物#1   动物#2   动物#3   平均值   (hrs)   DOM9-112-210ASTKGPS DOM10-53-612C-   端40K支链PEG   32.25   32.51   32.01   32.26   DOM9-112-210ASTKGPSDOM10-53-612N-   端40K支链PEG   38.37   44.32   41.38   41.36   DOM10-53-612N-端40K支链PEG   46.06   31.39   54.35   43.93   DOM10-53-612C-端40K支链PEG   46.58   46.57   41.45   44.87

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