具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法
专利汇可以提供具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了具有血管内皮生长因子(VEGF)结合特异性的配体、具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体或同时具有VEGF和EGFR结合特异性的配体。也公开了使用这些配体的方法。具体地讲，描述了这些配体在 癌症 治疗 中的用途。，下面是具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性结合位点的蛋白质部分和至少一个具有EGFR结合特异性结合位 点的蛋白质部分。
2.权利要求1的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性结合 位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合 EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
3.权利要求1的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性结合 位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合 EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
4.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结 合位点的蛋白质部分与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合 VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和 TAR15-26(SEQ ID NO：123)；而且其中每个所述具有EGFR结合特异 性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性 结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
5.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结 合位点的蛋白质部分与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合 VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和 TAR15-26(SEQ ID NO：123)；而且其中每个所述具有EGFR结合特异 性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性 结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
6.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结 合位点的蛋白质部分与贝伐单抗竞争性结合VEGF。
7.权利要求1或4的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性 结合位点的蛋白质部分与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
8.权利要求1-7中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合 特异性结合位点的蛋白质部分与贝伐单抗竞争性结合VEGF；而且其 中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与西妥昔单 抗竞争性结合EGFR。
9.权利要求1-8中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合 特异性结合位点的蛋白质部分和每个所述具有EGFR结合特异性结合 位点的蛋白质部分是由抗体片段提供的。
10.权利要求9的配体，其中所述抗体片段是免疫球蛋白单可变 区。
11.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白 单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
12.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白 单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR： DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
13.权利要求11或12的配体，其中每个所述具有EGFR结合特 异性的免疫球蛋白单可变区与抗体Fc区融合。
14.权利要求11或12的配体，其中每个所述具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区与抗体Fc区融合。
15.权利要求11的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的 免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少约85％氨基酸序列同一性：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、 DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
16.权利要求12的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的 免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少约85％氨基酸序列同一性：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
17.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自 以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)； 和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
18.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自 以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)； 和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
19.权利要求17的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性 的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸 序列具有至少约85％氨基酸序列同一性：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
20.权利要求18的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性 的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸 序列具有至少约85％氨基酸序列同一性：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
21.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制表皮生长 因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
22.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的 活性。
23.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的 活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α (TGFα)与EGFR结合。
24.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF与 血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)结合。
25.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的 活性。
26.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的 活性，而基本上不抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1) 和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
27.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与VEGF 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
28.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
29.权利要求28的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述 具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力 (KD)介于约10nM至约100pM之间。
30.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，所述配体与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之 间。
31.权利要求10-26和30中任一项的配体，其中经表面等离子共 振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM 之间。
32.权利要求31的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体 与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
33.权利要求10-32中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH 的具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和/或作为VHH的具 有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
34.权利要求10-32中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF 结合特异性的免疫球蛋白单可变区和每个所述具有EGFR结合特异性 的免疫球蛋白单可变区独立选自人VH和人VL。
35.权利要求1-34中任一项的配体，其中所述配体是包含两个具 有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和两个具有EGFR结合特 异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
36.权利要求1-35中任一项的配体，其中所述配体包含抗体Fc 区。
37.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自 以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)； 和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与西妥昔 单抗竞争性结合EGFR。
38.权利要求37的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性 的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸 序列具有至少约85％氨基酸序列同一性：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)。
39.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐 单抗竞争性结合VEGF；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
40.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐 单抗竞争性结合VEGF；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以 下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
41.权利要求39的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的 免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少约85％氨基酸序列同一性：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、 DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
42.权利要求40的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的 免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少约85％氨基酸序列同一性：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
43.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含具有VEGF结合特异性的第 一免疫球蛋白单可变区和具有EGFR结合特异性的第二免疫球蛋白单 可变区，其中
所述第一免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗竞争性结合VEGF；和
所述第二免疫球蛋白单可变区与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
44.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制表皮生 长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
45.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR 的活性。
46.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR 的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α (TGFα)与EGFR结合。
47.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF 与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)结合。
48.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF 的活性。
49.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF 的活性，而基本上不抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1) 和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
50.权利要求37-49中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与VEGF 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
51.权利要求37-50中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
52.权利要求51的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述 具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力 (KD)介于约10nM至约100pM之间。
53.权利要求37-49中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，所述配体与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之 间。
54.权利要求37-49和53中任一项的配体，其中经表面等离子共 振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM 之间。
55.权利要求54的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体 与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
56.权利要求37-55中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH 的具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和/或作为VHH的具 有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
57.权利要求37-55中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF 结合特异性的免疫球蛋白单可变区和每个所述具有EGFR结合特异性 的免疫球蛋白单可变区选自人VH和人VL。
58.权利要求37-57中任一项的配体，其中所述配体是包含两个 具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和两个具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
59.权利要求37-58中任一项的配体，其中所述配体包含抗体Fc 区。
60.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述 配体包含至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其 中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下 的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
61.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述 配体包含至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其 中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下 的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
62.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制表皮生长因子 (EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
63.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性。
64.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性， 而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与 EGFR结合。
65.权利要求60-64中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
66.权利要求65的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述 具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力 (KD)介于约10nM至约100pM之间。
67.权利要求60-64中任一项的配体，其中经表面等离子共振测 定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之 间。
68.权利要求67的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体 与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
69.权利要求60-68中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH 的具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
70.权利要求60-68中任一项的配体，其中每个所述具有EGFR 结合特异性的免疫球蛋白单可变区独立选自人VH和人VL。
71.权利要求1-70中任一项的配体，其中所述配体还包含毒素。
72.权利要求71的配体，其中所述毒素是表面活性毒素。
73.权利要求72的配体，其中所述表面活性毒素包括自由基产生 物或放射性核素。
74.权利要求73的配体，其中所述毒素是细胞毒素、自由基产生 物、抗代谢药、蛋白质、多肽、肽、光敏剂、反义化合物、化疗药、 放射性核素或胞内抗体。
75.权利要求1-74中任一项的配体，其中所述配体还包含半衰期 延长部分。
76.权利要求75的配体，其中所述半衰期延长部分是聚亚烷基二 醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分 或包含能延长体内半衰期的多肽结合位点的部分。
77.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是包含延长体 内半衰期的多肽结合位点的部分，选自：亲和体、SpA区、LDL受体 A类区、EGF区和高亲和性多聚体。
78.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇部 分。
79.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是包含血清白 蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段。
80.权利要求79的配体，其中所述包含血清白蛋白或新生动物 Fc受体结合位点的抗体或抗体片段是抗体片段，而且所述抗体片段是 包含血清白蛋白结合位点的免疫球蛋白单可变区。
81.权利要求80的配体，其中所述包含血清白蛋白结合位点的 免疫球蛋白单可变区与选自以下的dAb竞争性结合人血清白蛋白： DOM7m-16(SEQ ID NO：473)、DOM7m-12(SEQ ID NO：474)、 DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、 DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4(SEQ ID NO：478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO：480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、DOM7h-3(SEQ ID NO： 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、 DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、 DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、 DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、 DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、 DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
82.权利要求80的配体，其中所述包含血清白蛋白结合位点的 免疫球蛋白单可变区含有的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少85％氨基酸序列同一性：DOM7m-16(SEQ ID NO：473)、 DOM7m-12(SEQ ID NO：474)、DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、 DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO：478)、DOM7r-5(SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO：480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO： 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、 DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、 DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、 DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、 DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、 DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、 DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、 DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、 DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、 DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、 DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、 DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、 DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、 DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、 DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、 DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
83.用于治疗或诊断的权利要求1-70中任一项的配体。
84.用于治疗癌症的权利要求1-70中任一项的配体。
85.用于治疗过量表达EGFR和/或VEGF的癌细胞的权利要求 1-70中任一项的配体。
86.权利要求1-70中任一项的配体在制备用于治疗癌症的药物 中的用途。
87.权利要求1-70中任一项的配体在制备用于治疗过量表达 EGFR和/或VEGF的癌细胞的药物中的用途。
88.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗 有效量的权利要求1-70中任一项的配体。
89.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗 有效量的权利要求1-70中任一项的配体和化疗药。
90.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗 有效量的权利要求1-70中任一项的配体和抗肿瘤组合物，其中所述抗 肿瘤组合物包含至少一种化疗药，选自：烷化剂、抗代谢药、叶酸类 似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花属生物碱、表 鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂 配位络合物、蒽二酮取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾 上腺皮质类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药、雄激素、抗雄激素药 和促性腺激素释放激素类似物。
91.权利要求90的方法，其中所述化疗药选自顺铂、地卡巴嗪、 放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡培他滨、卡莫司汀、洛莫 司汀、多柔比星、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托 泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉 醇、多西他赛、doxetaxe、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、 克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干 扰素α、伊立替康、亮丙立德、亚叶酸、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌 呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、 普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替 派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、泰素、另外的生长因子受 体拮抗剂和任何上述药物的组合。
92.权利要求88-91中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌、 卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈 部癌、肾癌和胆囊癌。
93.权利要求88-91中任一项的方法，其中所述癌症是非小细胞 肺癌或结肠直肠癌。
94.一种给予患者抗VEGF治疗和抗EGFR治疗的方法，所述方 法包括通过给予所述患者治疗有效量的权利要求1-59中任一项的配 体而同时给予抗VEGF治疗和抗EGFR治疗。
95.一种包含权利要求1-70中任一项的配体和生理上可接受的 载体的组合物。
96.权利要求95的组合物，其中所述组合物包括用于静脉内、肌 内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内或皮下给药的溶媒。
97.权利要求95的组合物，其中所述组合物包括用于肺部、鼻内、 阴道或直肠给药的溶媒。
98.一种递药装置，所述装置包含权利要求95的组合物。
99.一种用于同时给予患者抗VEGF治疗和抗EGFR治疗的递药 装置，所述装置包含权利要求1-59中任一项的配体。
100.权利要求98或99的递药装置，所述装置包含多个治疗有效 量的配体。
权利要求98-100中任一项的递药装置，其中所述递药装置 选自胃肠外递药装置、静脉内递药装置、肌内递药装置、腹膜内递药 装置、经皮递药装置、肺部递药装置、动脉内递药装置、鞘内递药装 置、关节内递药装置、皮下递药装置、鼻内递药装置、阴道递药装置 和直肠递药装置。
权利要求101的递药装置，其中所述装置选自注射器、经皮 递药装置、胶囊剂、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、气雾 器、干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量气雾器、计量雾化 器、导管。
权利要求1-70中任一项的配体在制备用于选择性杀伤癌细 胞、而不是正常细胞的药物中的用途。
权利要求1-70中任一项的配体在制备用于杀伤细胞的药物 中的用途。
权利要求104的用途，其中所述配体包含抗体Fc区。
一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求1-70中任一 项的配体。
一种载体，所述载体包含权利要求106的重组核酸。
一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求106的重组核酸或权 利要求107的载体。
一种生产配体的方法，所述方法包括将权利要求108的宿主 细胞在适合表达所述核酸或载体的条件下进行培养，从而产生配体。
110.权利要求109的方法，所述方法还包括分离出所述配体。
111.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含的CDR3序列与选自 以下dAb的CDR3序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、 DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
112.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含的CDR3序列与选自 以下dAb的CDR3序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
113.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少85％同 一性的序列。
114.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
115.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少85％同 一性的序列。
116.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
117.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少92％同 一性的序列。
118.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少92％同一性的序列。
119.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少94％同 一性的序列。
120.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少94％同一性的序列。
121.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少96％同 一性的序列。
122.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少96％同一性的序列。
123.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少98％同 一性的序列。
124.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少98％同一性的序列。
125.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)和与上述任一序列具有至少99％同 一性的序列。
126.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR 与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序 列：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)、DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)和与上述任一序列具有至少99％同一性的序列。
127.权利要求111-125中任一项的组合物，其中所述单域抗体多 肽构建体包含四价、双特异性抗体多肽构建体，其包含：
a)第一拷贝的第一融合蛋白，含有能结合第一表位的单域抗体多 肽，与IgG重链恒定区融合；
b)第二拷贝的所述第一融合蛋白；
c)第一拷贝的第二融合蛋白，含有能结合第二表位的单域抗体多 肽，与轻链恒定区融合；
d)第二拷贝的所述第二融合蛋白；
其中所述第一和所述第二拷贝的所述第一融合蛋白是通过其各 自IgG重链恒定区以二硫键彼此结合，和
其中所述第一拷贝的所述第二融合蛋白的所述轻链恒定区与所 述第一拷贝的所述第一融合蛋白的IgG重链恒定区以二硫键结合，和
其中所述第二拷贝的第二融合蛋白的所述轻链恒定区与所述第 二拷贝的所述第一融合蛋白的IgG重链恒定区以二硫键结合，和
其中所述多肽构建体与所述第一和所述第二表位结合。
128.权利要求111的组合物，其中所述第一和/或所述第二表位 是EGFR表位。
129.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR1序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性。
130.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR1序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR1序列具有至少50％同一性。
131.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR2序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
132.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR2序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR2序列具有至少50％同一性。
133.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR3序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
134.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR3序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR3序列具有至少50％同一性。
135.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR1序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列 与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一 性。
136.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR1序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具 有至少50％同一性。
137.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR2序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列 与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
138.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR2序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具 有至少50％同一性。
139.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR1序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列 与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
140.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR1序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具 有至少50％同一性。
141.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同： DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)，并且其CDR1序列与DOM16-39 (SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100 (SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109 (SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200 (SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列 与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一 性，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少 50％同一性。
142.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多 肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，或者与以下的氨基酸序 列在不超过25个氨基酸位置上不同：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)，并且其CDR1序列与 DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622) 的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具 有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具有至少 50％同一性。
143.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性。
144.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR1序列具有至少 50％同一性。
145.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
146.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具有至少 50％同一性。
147.一种EGFR拮抗剂，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
148.一种EGFR拮抗剂，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具有至少 50％同一性。
149.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR2序列与 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一 性。
150.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR1序列具有至少 50％同一性，并且其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具有至少50％同一 性。
151.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
152.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具有至少 50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
153.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
154.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR1序列具有至少 50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
155.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438) 和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一 性，并且其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87 (SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107 (SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115 (SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具 有至少50％同一性。
156.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR1序列具有至少 50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR2序列具有至少50％同一 性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)的CDR3序列具有至少50％同一 性。
157.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性结合位点的蛋白质部分、至少一个具有EGFR结合特异性结合位 点的蛋白质部分和抗体Fc区。
158.权利要求157的配体，其中所述具有VEGF结合特异性结 合位点的蛋白质部分是能结合VEGF的域抗体(dAb)。
159.权利要求158的配体，其中所述能结合VEGF的dAb与选 自以下的抗VEGF dAb竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)。
160.权利要求158的配体，其中所述能结合VEGF的dAb与 TAR15-26-555(SEQ ID NO：704)竞争性结合VEGF。
161.权利要求157-160中任一项的配体，其中所述具有EGFR结 合特异性结合位点的蛋白质部分是能结合EGFR的域抗体(dAb)。
162.权利要求161的配体，其中所述能结合EGFR的dAb与选 自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
163.权利要求161的配体，其中所述能结合EGFR的dAb与选 自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
164.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)结合特异性的配体，所 述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和 抗体Fc区。
165.权利要求164的配体，其中所述具有VEGF结合特异性结 合位点的蛋白质部分是域抗体(dAb)。
166.权利要求165的配体，其中所述dAb与选自以下的抗VEGF dAb竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)。
167.权利要求165的配体，其中所述dAb与TAR15-26-555(SEQ ID NO：704)竞争性结合VEGF。
168.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所 述配体包含至少一个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和 抗体Fc区。
169.权利要求168的配体，其中所述具有EGFR结合特异性结合 位点的蛋白质部分是域抗体(dAb)。
170.权利要求169的配体，其中所述dAb与选自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87 (SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107 (SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115 (SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
171.权利要求169的配体，其中所述dAb与选自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFR：DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、 DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、 DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
172.权利要求168的配体，其中所述配体包含至少两个具有 EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
173.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区、至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区和接头，其中所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋 白单可变区通过所述接头与所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白 单可变区键合。
174.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区、至少一个具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区，其中所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可 变区与所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区直接融合。
175.权利要求173的配体，其中所述接头选自SEQ ID NO：706、 SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、 SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、 SEQ ID NO：723和SEQ ID NO：724。
176.权利要求173或175的配体，其中所述配体还包含抗体Fc 区。
177.权利要求176的配体，其中所述配体还包含第二接头，并且 其中一个所述免疫球蛋白单可变区通过所述第二接头与所述Fc区键 合。
178.权利要求177的配体，其中所述第二接头选自SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：723和SEQ ID NO：724。
179.权利要求174的配体，其中所述配体还包含接头和抗体Fc 区，并且其中一个所述免疫球蛋白单可变区通过所述接头与所述抗体 Fc区键合。
180.权利要求179的配体，其中所述接头选自SEQ ID NO：706、 SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、 SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、 SEQ ID NO：723和SEQ ID NO：724。
181.权利要求173-180中任一项的配体，其中
a.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可 变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可 变区；
b.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可 变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可 变区；
c.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可 变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可 变区；或者
d.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可 变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可 变区。
182.权利要求181的配体，其中所述重链可变区是VH或VHH。
183.权利要求181的配体，其中所述重链可变区是人VH。
184.权利要求181的配体，其中所述轻链可变区是VK。
185.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和/或表皮生长因子受体 (EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含第一免疫球蛋白单可变区、 第二免疫球蛋白单可变区和抗体Fc区。
186.权利要求185的配体，其中所述配体从氨基端到羧基端的通 式是dAb1-dAb2-Fc，其中dAb1是所述第一免疫球蛋白单可变区，dAb2 是所述第二免疫球蛋白单可变区，Fc是所述抗体Fc区，其中dAb1 与dAb2直接键合或通过第一接头键合，而dAb2与Fc直接键合或通 过第二接头键合。
187.权利要求186的配体，其中dAb1和dAb2相同。
188.权利要求186或187的配体，其中dAb1和dAb2各自为轻 链单可变区。
189.权利要求188的配体，其中dAb1和dAb2各自为Vk。
190.权利要求186或187的配体，其中dAb1和dAb2各自为重 链单可变区。
191.权利要求185-190中任一项的配体，其中所述第一免疫球蛋 白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区各自具有EGFR结合特异 性。
192.权利要求185-190中任一项的配体，其中所述第一免疫球蛋 白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区各自具有VEGF结合特异 性。
193.权利要求186和188-190中任一项的配体，其中dAb1具有 EGFR结合特异性，dAb2具有VEGF结合特异性。
194.权利要求186和188-190中任一项的配体，其中dAb1具有 VEGF结合特异性，dAb2具有EGFR结合特异性。
195.一种配体，其中所述配体是包含第一配体和第二配体的二聚 体，其中所述第一配体和所述第二配体各自如权利要求185-194中任 一项所定义。
196.权利要求195的配体，其中所述二聚体在所述第一配体和所 述第二配体之间包含二硫键。
发明背景
癌症是致死和发病的主要原因。癌症治疗方法包括用来切除肿瘤 的手术干预和化学治疗。这些方法可成功治愈一些患者。然而，即使 是看来已治愈的患者也常会复发癌症，需要进一步治疗。化疗药通常 是非选择性药物，对增殖细胞等细胞具有毒性。因此，这类药物能有 效杀伤癌细胞，但也杀伤健康细胞，而产生严重不良副作用。
某些癌细胞表达或过量表达某些细胞组分(例如细胞表面蛋白)， 或表达不同于正常细胞的细胞组分。针对癌症治疗的手术及化疗方法 和诊断的缺点的一种方法涉及靶向癌细胞，例如使用能结合癌细胞上 表达或过量表达的蛋白质的抗体或抗体片段。已经鉴定出大量的这类 靶蛋白。这类蛋白质中的一种就是表皮生长因子受体(EGFR)。
EGFR是ErbB1家族成员，能转导信号，导致细胞增殖和存活， 而且一旦结合表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)后能导 致建立生长因子和血管生成因子。因此，已经知道EGFR参与肿瘤生 长、转移和血管生成。此外，许多癌症都表达EGFR，例如膀胱癌、 卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺 癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。ERBITUX(西妥昔单抗； Imclone Systems Inc)是能结合人EGFR的嵌合小鼠/人抗体，该抗体已 经获准与伊立替康联合用于治疗某些表达EGFR的癌症。
有利于肿瘤形成、转移和复发的一个重要的病理生理过程是肿瘤 血管生成。该过程由肿瘤建立的血管生成因子(例如血管内皮生长因子 (VEGF))介导的，该因子诱导可向肿瘤供给营养的血管形成。因此， 治疗某些癌症的另一方法是抑制由VEGF介导的肿瘤血管生成，因而 使肿瘤挨饿。AVASTIN(贝伐单抗；Genetech，Inc.)是能结合人VEGF 的人源化抗体，该抗体已经获准用于治疗结肠直肠癌。据报道，一种 称为抗体2C3的抗体(ATCC保藏号PTA 1595)能结合VEGF并抑制 VEGF与表皮生长因子受体2的结合。
目前可用的靶向EGFR或VEGF的治疗药，并不是对所有患者或 对所有癌症(例如表达EGFR的癌症)都有效。因此，仍然需要改进的 药物，用于治疗癌症和其它病理症状。
发明概述
本发明涉及具有VEGF(例如人VEGF)结合特异性的配体，具有 EGFR(例如人EGFR)结合特异性的配体，以及具有VEGF和EGFR(例 如人VEGF和人EGFR)结合特异性的配体。例如，配体可包含具有 VEGF结合特异性结合位点的多肽域，具有EGFR结合特异性结合位 点的多肽域，或者包含具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域和具 有EGFR结合特异性结合位点的多肽域。
一方面，本发明涉及具有VEGF和EGFR结合特异性的配体。 这类配体包含至少一个具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分 和至少一个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分。具有 VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和具有EGFR结合特异性结 合位点的蛋白质部分可以各自为任何合适的结合部分。蛋白质部分可 以是肽部分、多肽部分或蛋白质部分。例如，蛋白质部分可由具有 VEGF或EGFR结合特异性的结合位点的抗体片段来提供，所述片段 例如具有VEGF或EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
配体可包含具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分，该部 分与AVASTIN(贝伐单抗；Genentech，Inc.)和/或抗体2C3(ATCC保 藏号PTA1595)竞争性结合VEGF。配体可包含具有EGFR结合特异 性结合位点的蛋白质部分，该部分与ERBITUX(西妥昔单抗；Imclone Systems，Inc.)和/或VECTIBIX(帕尼单抗(panitumumab)；Amgen，Inc.) 竞争性结合EGFR。在某些实施方案中，配体包含具有VEGF结合特 异性结合位点的蛋白质部分(该部分与贝伐单抗和/或抗体2C3(ATCC 保藏号PTA 1595)竞争性结合VEGF)，并且还包含具有EGFR结合特 异性结合位点的蛋白质部分(该部分与西妥昔单抗竞争性结合EGFR)。
在某些实施方案中，配体包含具有VEGF结合特异性结合位点的 蛋白质部分(例如免疫球蛋白单可变区)，该部分与选自以下的抗VEGF 域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3 (SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、 TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14 (SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、 TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22 (SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、 TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25 (SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
在某些实施方案中，配体包含具有VEGF结合特异性结合位点的 蛋白质部分(例如免疫球蛋白单可变区)，该部分与TAR15-26-555(SEQ ID NO：704)竞争性结合VEGF。
另外，在其它实施方案中，配体还可包含具有EGFR结合特异 性结合位点的蛋白质部分(例如免疫球蛋白单可变区)，该部分与选自 以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、 DOM16-20(SEQ ID NO：328)、DOM16-21(SEQ ID NO：329)、 DOM16-22(SEQ ID NO：330)、DOM16-23(SEQ ID NO：331)、 DOM16-24(SEQ ID NO：332)、DOM16-25(SEQ ID NO：333)、 DOM16-26(SEQ ID NO：334)、DOM16-27(SEQ ID NO：335)、 DOM16-28(SEQ ID NO：336)、DOM16-29(SEQ ID NO：337)、 DOM16-30(SEQ ID NO：338)、DOM16-31(SEQ ID NO：339)、 DOM16-32(SEQ ID NO：340)、DOM16-33(SEQ ID NO：341)、 DOM16-35(SEQ ID NO：342)、DOM16-37(SEQ ID NO：343)、 DOM16-38(SEQ ID NO：344)、DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-40(SEQ ID NO：346)、DOM16-41(SEQ ID NO：347)、 DOM16-42(SEQ ID NO：348)、DOM16-43(SEQ ID NO：349)、 DOM16-44(SEQ ID NO：350)、DOM16-45(SEQ ID NO：351)、 DOM16-46(SEQ ID NO：352)、DOM16-47(SEQ ID NO：353)、 DOM16-48(SEQ ID NO：354)、DOM16-49(SEQ ID NO：355)、 DOM16-50(SEQ ID NO：356)、DOM16-59(SEQ ID NO：357)、 DOM16-60(SEQ ID NO：358)、DOM16-61(SEQ ID NO：359)、 DOM16-62(SEQ ID NO：360)、DOM16-63(SEQ ID NO：361)、 DOM16-64(SEQ ID NO：362)、DOM16-65(SEQ ID NO：363)、 DOM16-66(SEQ ID NO：364)、DOM16-67(SEQ ID NO：365)、 DOM16-68(SEQ ID NO：366)、DOM16-69(SEQ ID NO：367)、 DOM16-70(SEQ ID NO：368)、DOM16-71(SEQ ID NO：369)、 DOM16-72(SEQ ID NO：370)、DOM16-73(SEQ ID NO：371)、 DOM16-74(SEQ ID NO：372)、DOM16-75(SEQ ID NO：373)、 DOM16-76(SEQ ID NO：374)、DOM16-77(SEQ ID NO：375)、 DOM16-78(SEQ ID NO：376)、DOM16-79(SEQ ID NO：377)、 DOM16-80(SEQ ID NO：378)、DOM16-81(SEQ ID NO：379)、 DOM16-82(SEQ ID NO：380)、DOM16-83(SEQ ID NO：381)、 DOM16-84(SEQ ID NO：382)、DOM16-85(SEQ ID NO：383)、 DOM16-87(SEQ ID NO：384)、DOM16-88(SEQ ID NO：385)、 DOM16-89(SEQ ID NO：386)、DOM16-90(SEQ ID NO：387)、 DOM16-91(SEQ ID NO：388)、DOM16-92(SEQ ID NO：389)、 DOM16-94(SEQ ID NO：390)、DOM16-95(SEQ ID NO：391)、 DOM16-96(SEQ ID NO：392)、DOM16-97(SEQ ID NO：393)、 DOM16-98(SEQ ID NO：394)、DOM16-99(SEQ ID NO：395)、 DOM16-100(SEQ ID NO：396)、DOM16-101(SEQ ID NO：397)、 DOM16-102(SEQ ID NO：398)、DOM16-103(SEQ ID NO：399)、 DOM16-104(SEQ ID NO：400)、DOM16-105(SEQ ID NO：401)、 DOM16-106(SEQ ID NO：402)、DOM16-107(SEQ ID NO：403)、 DOM16-108(SEQ ID NO：404)、DOM16-109(SEQ ID NO：405)、 DOM16-110(SEQ ID NO：406)、DOM16-111(SEQ ID NO：407)、 DOM16-112(SEQ ID NO：408)、DOM16-113(SEQ ID NO：409)、 DOM16-114(SEQ ID NO：410)、DOM16-115(SEQ ID NO：411)、 DOM16-116(SEQ ID NO：412)、DOM16-117(SEQ ID NO：413)、 DOM16-118(SEQ ID NO：414)、DOM16-119(SEQ ID NO：415)、 DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、 DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、 DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、 DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、 DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、 DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、 DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、 DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、 DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、 DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、 DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、 DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、 DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、 DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、 DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、 DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、 DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1(SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14 (SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、 NB17(SEQ ID NO：467)、NB18(SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、NB21(SEQ ID NO：471)和NB22 (SEQ ID NO：472)。
在具体实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分(该部分与选自以 下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123))， 并且还包含具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分，该部分与 选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
在具体实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分(该部分与选自以 下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123))， 并且还包含具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分，该部分与 选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在更具体的实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性， 并且包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至 少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有 VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗 体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
例如，具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、 TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10 (SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、 TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17 (SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、 TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7 (SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、 TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、TAR15-29 (SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
在其它具体的实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性， 并且包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至 少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗 体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18 (SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
在其它具体的实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性， 并且包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至 少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗 体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、 DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、 DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、 DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、 DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、 DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、 DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、 DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、 DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、 DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、 DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、 DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、 DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、 DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、 DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、 DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、 DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、 DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、 DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、 DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、 DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、 DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、 DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、 DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、 DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、 DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、 DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、 DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、 DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、 DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、 DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、 DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、 DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、 DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、 DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、 DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、 DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、 DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ IDN O：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在某些实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有VEGF结 合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb) 竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID 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NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)； 并且其中具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的 抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、 DOM16-20(SEQ ID NO：328)、DOM16-21(SEQ ID NO：329)、 DOM16-22(SEQ ID NO：330)、DOM16-23(SEQ ID NO：331)、 DOM16-24(SEQ ID NO：332)、DOM16-25(SEQ ID NO：333)、 DOM16-26(SEQ ID NO：334)、DOM16-27(SEQ ID NO：335)、 DOM16-28(SEQ ID NO：336)、DOM16-29(SEQ ID NO：337)、 DOM16-30(SEQ ID NO：338)、DOM16-31(SEQ ID NO：339)、 DOM16-32(SEQ ID NO：340)、DOM16-33(SEQ ID NO：341)、 DOM16-35(SEQ ID NO：342)、DOM16-37(SEQ ID NO：343)、 DOM16-38(SEQ ID NO：344)、DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-40(SEQ ID NO：346)、DOM16-41(SEQ ID NO：347)、 DOM16-42(SEQ ID NO：348)、DOM16-43(SEQ ID NO：349)、 DOM16-44(SEQ ID NO：350)、DOM16-45(SEQ ID NO：351)、 DOM16-46(SEQ ID NO：352)、DOM16-47(SEQ ID NO：353)、 DOM16-48(SEQ ID NO：354)、DOM16-49(SEQ ID NO：355)、 DOM16-50(SEQ ID NO：356)、DOM16-59(SEQ ID NO：357)、 DOM16-60(SEQ ID NO：358)、DOM16-61(SEQ ID NO：359)、 DOM16-62(SEQ ID NO：360)、DOM16-63(SEQ ID NO：361)、 DOM16-64(SEQ ID NO：362)、DOM16-65(SEQ ID NO：363)、 DOM16-66(SEQ ID NO：364)、DOM16-67(SEQ ID NO：365)、 DOM16-68(SEQ ID NO：366)、DOM16-69(SEQ 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在另外的实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并 且包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少 一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有VEGF 结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb) 竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)； 并且其中具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的 抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFR：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID 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NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
例如，配体可包含具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变 区，该区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约 85％氨基酸序列同一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)； 并且还包含具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，该区包含 的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序 列同一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 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例如，配体可包含具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变 区，该区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约 85％氨基酸序列同一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID 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NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512(SEQ ID 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NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在某些实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有VEGF结 合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb) 竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)； 并且具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与西妥昔单抗竞争 性结合EGFR。
例如，具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、 TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10 (SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、 TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17 (SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、 TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7 (SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、 TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ IDNO：124)、TAR15-29 (SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
在其它实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有VEGF结 合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗和/或抗体2C3(ATCC保 藏号PTA1595)竞争性结合VEGF：而具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合 EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、 DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
在其它实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有VEGF结 合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗和/或抗体2C3(ATCC保 藏号PTA1595)竞争性结合VEGF：而具有EGFR结合特异性的免疫 球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合 EGFR：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、 DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在其它实施方案中，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体包含 具有VEGF结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区和具有EGFR结合 特异性的第二免疫球蛋白单可变区，其中所述第一免疫球蛋白单可变 区与贝伐单抗和/或抗体2C3(ATCC保藏号PTA1595)竞争性结合 VEGF；而所述第二免疫球蛋白单可变区与西妥昔单抗竞争性结合 EGFR。
在具体实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中配体包含具有 VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区并且还包含具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区，所述具有VEGF结合特异性的免疫球 蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下抗VEGF dAb的氨基酸序 列具有至少90％氨基酸序列同一性：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)；而具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以 下的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性：DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)或DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)。
在具体实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且 包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中配体包含具有 VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区并且还包含具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区，所述具有VEGF结合特异性的免疫球 蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下抗VEGF dAb的氨基酸序 列具有至少90％氨基酸序列同一性：TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26(SEQ ID NO：123)，而具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以 下的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性：DOM16-39-521 (SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-618 (SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可抑制表皮生长因子 (EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合，抑制EGFR的活性 和/或抑制EGFR的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转 化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。另外，或者另一方面，具有VEGF 和EGFR结合特异性的配体可抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，抑制VEGF 的活性和/或抑制VEGF的活性，而基本上不抑制VEGF与VEGFR1 和/或VEGFR2结合。
具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可含有具有VEGF结合特 异性的蛋白结合部分(例如免疫球蛋白单可变区)，经表面等离子共振 (surface plasmon resonance)测定，该部分与VEGF结合的亲和力(KD) 介于约100nM至约1pM之间。
具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可含有具有EGFR结合特 异性的蛋白结合部分(例如免疫球蛋白单可变区)，经表面等离子共振 测定，该部分与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之 间或约10nM至约100pM之间。
经表面等离子共振测定，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体 与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
经表面等离子共振测定，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体 与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间或约10nM 至约100pM之间。
具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可包含作为VHH的具有 VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和/或作为VHH的具有EGFR 结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可包含具有VEGF结合特 异性的免疫球蛋白单可变区和具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单 可变区，其中免疫球蛋白单可变区选自人VH和人VL。
在某些实施方案中，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可以 是包含两个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和两个具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
在某些实施方案中，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体可包 含抗体Fc区。
本发明也涉及具有VEGF结合特异性的配体，所述配体包含至少 一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中至少一个具 有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选择以下的抗VEGF域 抗体(dAb)竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3 (SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、 TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14 (SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、 TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22 (SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、 TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25 (SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
例如，具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、 TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10 (SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、 TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17 (SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、 TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7 (SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、 TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、TAR15-29 (SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)和TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
具有VEGF结合特异性的配体可抑制VEGF与血管内皮生长因子 受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，抑制 VEGF的活性和/或抑制VEGF的活性，而基本上不抑制VEGF与 VEGFR1和/或VEGFR2结合。
具有VEGF结合特异性的配体可含有具有VEGF结合特异性的免 疫球蛋白单可变区，经表面等离子共振测定，该区与VEGF结合的亲 和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
经表面等离子共振测定，具有VEGF结合特异性的配体与VEGF 结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
具有VEGF结合特异性的配体可包含作为VHH的具有VEGF结合 特异性的免疫球蛋白单可变区。
具有VEGF结合特异性的配体可包含具有VEGF结合特异性的免 疫球蛋白单可变区，该区选自人VH和人VL。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的配体是包含至少两 个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的配体包含抗体Fc 区。
本发明也涉及具有EGFR结合特异性的配体，所述配体包含至少 一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有EGFR 结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb) 竞争性结合EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
本发明也涉及具有EGFR结合特异性的配体，所述配体包含至少 一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有EGFR 结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb) 竞争性结合EGFR：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211 (SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213 (SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215 (SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217 (SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219 (SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221 (SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223 (SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225 (SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227 (SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229 (SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231 (SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233 (SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235 (SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502 (SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504 (SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506 (SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508 (SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510 (SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512 (SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-522 (SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、DOM16-39-524 (SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、DOM16-39-525 (SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、DOM16-39-540 (SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542 (SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、DOM16-39-544 (SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、DOM16-39-550 (SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-552 (SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、DOM16-39-554 (SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、DOM16-39-561 (SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、DOM16-39-563 (SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、DOM16-39-571 (SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、DOM16-39-573 (SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、DOM16-39-580 (SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、DOM16-39-592 (SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、DOM16-39-601 (SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、DOM16-39-603 (SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605 (SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611 (SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613 (SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615 (SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617 (SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619 (SEQ ID NO：622)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、 DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ IDNO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
例如，具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少约85％氨基酸序列同 一性：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
具有EGFR结合特异性的配体可抑制表皮生长因子(EGF)和/或转 化生长因子α(TGFα)与EGFR结合，抑制EGFR的活性和/或抑制 EGFR的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因 子α(TGFα)与EGFR结合。
具有EGFR结合特异性的配体可含有具有EGFR结合特异性的免 疫球蛋白单可变区，经表面等离子共振测定，该区与EGFR结合的亲 和力(KD)介于约100nM至约1pM之间或约10nM至约100pM之间。
经表面等离子共振测定，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体 与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM或约10nM至约 100pM之间。
具有EGFR结合特异性的配体可包含作为VHH的具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区。
具有EGFR结合特异性的配体可包含具有EGFR结合特异性的免 疫球蛋白单可变区，该区选自人VH和人VL。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性的配体是包含至少两 个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性的配体包含抗体Fc 区。
在某些实施方案中，配体包含拮抗(抑制)人EGFR与受体结合的 免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述免疫球蛋白单可变区多肽包含的 CDR3序列与本文所公开的抗EGFR dAb的CDR3序列相同。
在其它实施方案中，配体包含可结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗EGFR dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与抗EGFR dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR3序列与抗EGFR dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗EGFR dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与抗EGFR dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与抗EGFR dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗EGFR dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗EGFR dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗EGFR dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合EGFR的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗EGFR dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗EGFR dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与抗EGFR dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗EGFR dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR2序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR3序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR2序列与抗EGFR dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR2序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR2序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗EGFR dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗EGFR dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是EGFR拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗EGFR dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR2序列与抗EGFR dAb的CDR2序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗EGFR dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在某些实施方案中，配体包含免疫球蛋白单可变区多肽，所述多 肽拮抗(抑制)人VEGF与受体结合，其中免疫球蛋白单可变区多肽包 含的CDR3序列与本文所公开的抗VEGF dAb的CDR3序列相同。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗VEGF dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与抗VEGF dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR3序列与抗VEGF dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗VEGF dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与抗VEGF dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与抗VEGF dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗VEGF dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗VEGF dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗VEGF dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变 区多肽，其中多肽的氨基酸序列与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基 酸序列相同，或者与本文所公开的抗VEGF dAb的氨基酸序列在不超 过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与抗VEGF dAb的 CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与抗VEGF dAb的 CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与抗VEGF dAb的 CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR2序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR3序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR2序列与抗VEGF dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR2序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR2序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗VEGF dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗VEGF dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是VEGF拮抗剂，其CDR1序列与 本文所公开的抗VEGF dAb的CDR1序列具有至少50％同一性，其 CDR2序列与抗VEGF dAb的CDR2序列具有至少50％同一性，其 CDR3序列与抗VEGF dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另外的实施方案中，任何本文所述的配体还包含毒素(例如细 胞毒素)、自由基产生物、抗代谢药、蛋白质、多肽、肽、光敏剂、反 义化合物、化疗药、放射性核素或胞内抗体。在具体实施方案中，毒 素是表面活性毒素(例如自由基产生物、放射性核素)。
在其它实施方案中，配体还包含半衰期延长部分，例如聚亚烷基 二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部 分、或包含延长体内半衰期的多肽结合位点的部分。在某些实施方案 中，半衰期延长部分是选自以下的包含延长体内半衰期的多肽结合位 点的部分：亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF-区和高亲和性 多聚体(avimer)。
在其它实施方案中，半衰期延长部分是包含血清白蛋白或新生动 物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段(例如免疫球蛋白单可变区)。
在具体实施方案中，半衰期延长部分是包含血清白蛋白结合位 点的免疫球蛋白单可变区，该区与选自以下的dAb竞争性结合人血清 白蛋白：DOM7m-16(SEQ ID NO：473)、DOM7m-12(SEQ ID NO： 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、 DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4(SEQ ID NO：478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO：480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、DOM7h-3(SEQ ID NO： 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、 DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、 DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、 DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、 DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、 DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
例如，包含血清白蛋白结合位点的免疫球蛋白单可变区包含的 氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列可具有至少85％氨基酸序列 同一性：DOM7m-16(SEQ ID NO：473)、DOM7m-12(SEQ ID NO： 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、 DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4(SEQ ID NO：478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO：480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、DOM7h-3(SEQ ID NO： 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、 DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、 DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、 DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、 DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、 DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
本发明也涉及编码本文所述配体的分离或重组核酸，涉及包含重 组核酸的载体(例如重组载体)。本发明也涉及包含本发明重组核酸或 载体的宿主细胞(例如重组宿主细胞、分离的宿主细胞)。本发明也涉 及用于生产配体的方法，该方法包括将本发明的宿主细胞在适合表达 所述核酸或载体的条件下进行培养，从而产生配体。在某些实施方案 中，该方法还包括分离出配体。
本发明也涉及用于治疗或诊断的本发明的配体，涉及本发明的配 体在制备用于治疗、预防或抑制本文所述疾病(例如癌症)的药物中的 用途。
本发明也涉及用于治疗、预防或抑制本文所述疾病(例如癌症)的 药物组合物，该组合物包含本发明配体作为活性成分。
在某些实施方案中，本发明涉及用于治疗过量表达EGFR和/或 VEGF的癌症或癌细胞的配体。
在其它实施方案中，本发明涉及配体在制备用于杀伤细胞(例如 选择性杀伤癌细胞、而不是正常细胞)的药物中的用途。
在其它实施方案中，本发明涉及配体在制备用于治疗过量表达 EGFR和/或VEGF的癌症或癌细胞的药物中的用途。
本发明也涉及治疗方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效 量的本发明配体。在一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法， 该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明配体。在某些实施 方案中，该方法还包括给予患者化疗药(例如用低剂量)。
在其它实施方案中，治疗癌症的方法包括给予有需要的患者治疗 有效量的本发明配体和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至 少一种化疗药。化疗药可选自烷化剂、抗代谢药、叶酸类似物、嘧啶 类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花属生物碱、表鬼臼毒素、 抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、 蒽二酮取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固 醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药、雄激素、抗雄激素药和促性腺激素 释放激素类似物。在某些实施方案中，化疗药选自顺铂、地卡巴嗪 (dicarbazine)、放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡培他滨、卡 莫司汀、洛莫司汀、多柔比星、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿 糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱(vinbiastine)、长 春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、doxetaxe、阿地白介素、天 冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、 羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙立德、亚叶酸、甲 地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬 酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、 睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、 泰素、另外的生长因子受体拮抗剂和任何上述药物的组合。
在某些实施方案中，该方法是治疗选自以下癌症的方法：膀胱癌、 卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、 前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。
本发明也涉及给予患者抗VEGF治疗和抗EGFR治疗的方法，该 方法包括通过给予所述患者治疗有效量的具有VEGF和EGFR结合特 异性的配体而同时给予抗VEGF治疗和抗EGFR治疗。
本发明也涉及包含本发明配体和生理上或药学上可接受的载体 的组合物(例如药物组合物)。在某些实施方案中，组合物包含用于静 脉内、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内皮下给药、肺部、鼻内、 阴道或直肠给药的溶媒。
本发明也涉及包含本发明组合物(例如药物组合物)或本发明配体 的递药装置。在一个实施方案中，递药装置用于同时给予患者抗VEGF 治疗和抗EGFR治疗，所述装置包含具有VEGF和EGFR结合特异性 的配体。在某些实施方案中，药物装置包含多个治疗有效量的配体。
在其它实施方案中，递药装置选自胃肠外递药装置、静脉内递药 装置、肌内递药装置、腹膜内递药装置、经皮递药装置、肺部递药装 置、动脉内递药装置、鞘内递药装置、关节内递药装置、皮下递药装 置、鼻内递药装置、阴道递药装置、直肠递药装置、注射器、经皮递 药装置、胶囊剂、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、气雾器、 干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量气雾器、计量雾化器、 导管。
本发明也涉及具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受 体(EGFR)结合特异性的配体，该配体包含至少一个具有VEGF结合特 异性结合位点的蛋白质部分、至少一个具有EGFR结合特异性结合位 点的蛋白质部分和抗体Fc区。这样的配体可由单一多肽组成。在其 它实施方案中，含有Fc区的两个配体结合在一起形成二聚体，例如 通过二硫键(例如在铰链区)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的配体可包含具有 VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。在某些实施方 案中，具有VEGF结合特异性的蛋白质部分与抗体Fc区融合。
在其它实施方案中，具有EGFR结合特异性的配体可包含具有 EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。在某些实施方 案中，具有EGFR结合特异性的蛋白质部分与抗体Fc区融合。例如， 配体可包含两个具有EGFR结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
另外，或者在其它实施方案中，具有VEGF和EGFR结合特异性 的配体包含具有VEGF结合特异性的单可变区、具有EGFR结合特异 性的单可变区和任选的接头。在这样的实施方案中，具有EGFR结合 特异性的单可变区可通过接头与具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白 单可变区键合。合适的接头包括SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、 SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、 SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：723 和SEQ ID NO：724。如有必要，配体也可包含抗体Fc区。当配体还包 含抗体Fc区时，接头可将免疫球蛋白可变区与Fc区连接起来。在其 它实施方案中，含有Fc区的两个配体结合在一起形成二聚体，例如 通过二硫键(例如在铰链区)。
另外，或者在其它实施方案中，具有VEGF和EGFR结合特异性 的配体包含具有VEGF结合特异性的单可变区及与其直接融合的具有 EGFR结合特异性的单可变区。
在配体包含具有VEGF结合特异性的单可变区和具有EGFR结合 特异性的单可变区和任选一个或多个接头的实施方案中，单可变区可 以独立地为轻链可变区或重链可变区。例如，配体可包含a)作为重链 可变区的具有VEGF结合特异性的单可变区，和作为轻链可变区的具 有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区；b)作为轻链可变区的具 有VEGF结合特异性的单可变区，和作为重链可变区的具有EGFR结 合特异性的单可变区；c)作为重链可变区的具有VEGF结合特异性的 单可变区，和作为重链可变区的具有EGFR结合特异性的单可变区； 或d)作为轻链可变区的具有VEGF结合特异性的单可变区和作为轻链 可变区的具有EGFR结合特异性的单可变区。在具体实施方案中，重 链可变区是VH或VHH。在另外的实施方案中，VH是人VH。在其它实 施方案中，轻链可变区是VK。
在本发明的另一方面，具有VEGF和EGFR结合特异性的配体包 含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个 具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区通过二硫键与具有VEGF结合特异性的 免疫球蛋白单可变区结合。或者，具有VEGF和EGFR结合特异性的 配体可包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和 至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中具有 EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与具有VEGF结合特异性的 免疫球蛋白单可变区直接融合(即包含两个dAb的单一多肽)。
在其它具体的实施方案中，配体是dAb与抗血清白蛋白dAb的 融合体(DOM7 dAb)。例如，从氨基端到羧基端，配体的结构为 DOM15-10—DOM16-39—抗血清白蛋白dAb、 DOM16-39—DOM15-10—抗血清白蛋白dAb、 DOM15-26-501—DOM16-39—抗血清白蛋白dAb或 DOM16-39—DOM15-26-501—抗血清白蛋白dAb。在另外的实施方案 中，具有EGFR结合特异性结合位点的配体可与西妥昔单抗和/或帕尼 单抗(panitumumab)竞争性结合EGFR，并能融合抗血清白蛋白dAb。 另外，或者在其它实施方案中，配体可包含与抗血清白蛋白dAb融合 的两个或更多dAb(例如抗EGFR dAb)。
附图简述
图1A-1E列出编码能特异性结合人VEGF的人(Homo sapiens)域 抗体(dAb)的27个核苷酸序列。所示核苷酸序列是SEQ ID NO：1-27、 535和536。
图2A-2C是编码能结合人VEGF的人dAb的12个核苷酸序列比 对。所示核苷酸序列是SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：28-38。
图3A-3D是编码能结合人VEGF的人dAb的12个核苷酸序列比 对。所示核苷酸序列是SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：39-49。
图4A-4J是编码能结合人VEGF的人dAb的53个核苷酸序列比 对。所示核苷酸序列是SEQ ID NO：24、50-99、537和538。
图5A-5C列出由图1A-1E所示的一些核酸序列编码的dAb的氨 基酸序列。所示氨基酸序列是SEQ ID NO：100-126。
图6是由图2A-2C所示核酸序列编码的dAb的氨基酸序列比对。 所示氨基酸序列是SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：127-137。
图7A-7B是由图3A-2D所示核酸序列编码的dAb的氨基酸序列 比对。已将符号～插入到TAR15-8-500序列内以便进行比对。所示氨 基酸序列是SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：138-148。
图8A-8D是由图4A-4J所示核酸序列编码的dAb的氨基酸序列 比对。所示氨基酸序列是SEQ ID NO：123、149-198、539和540。
图9A-9O列出一些编码能特异性结合人EGFR的人(Homo sapiens)域抗体(dAb)的核苷酸序列。所示核苷酸序列是SEQ ID NO：199-324。
图10A-10I列出由图9A-9O所示核酸序列编码的dAb的氨基酸 序列。所示氨基酸序列是SEQ ID NO：325-450。
图11A-11B列出能结合WO 2005/044858中公开的EGFR的一些 骆驼科动物VHH的氨基酸序列。NB1(SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14 (SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、 NB17(SEQ ID NO：467)、NB18(SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、NB21(SEQ ID NO：471)、NB22(SEQ ID NO：472)。
图12A是能结合小鼠血清白蛋白(MSA)的3种Vκ的氨基酸序列 比对。所比对的氨基酸序列来自被称为MSA16(也称为DOM7m-16 (SEQ ID NO：473)、MSA12(也称为DOM7m-12(SEQ ID NO：474)和 MSA26(也称为DOM7m-26(SEQ ID NO：475)的Vκ。
图12B是能结合大鼠血清白蛋白(RSA)的6种Vκ的氨基酸序列比 对。所比对的氨基酸序列来自被称为DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、 DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4(SEQ ID NO：478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO：480)和DOM7r-8(SEQ ID NO：481)的Vκ。
图12C是能结合人血清白蛋白(HSA)的6种Vκ的氨基酸序列比 对。所比对的氨基酸序列来自被称为DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、 DOM7h-3(SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)和DOM7h-7(SEQ ID NO：487)的Vκ。
图12D是能结合人血清白蛋白(HSA)和共有序列(SEQ ID NO： 488)的7种VH的氨基酸序列比对。所比对的序列来自被称为 DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)和 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)的VH。
图12E是能结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的3种Vκ的氨 基酸序列比对。所比对的氨基酸序列来自被称为DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、DOM7r-13(SEQ ID NO：497)和DOM7r-14(SEQ ID NO：498) 的Vκ。
图13是能结合大鼠血清白蛋白(RSA)的Vκ的氨基酸序列图。所 示序列来自被称为DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)的Vκ。
图14A-14B是能结合大鼠血清白蛋白(RSA)的VH的氨基酸序列 图。所示序列来自被称DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、DOM7r-25(SEQ ID NO： 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、 DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、 DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、 DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和DOM7r-33(SEQ ID NO：517)的VH。
图15列出能结合WO2004/041862中公开的小鼠血清白蛋白的一 些骆驼科动物VHH的氨基酸序列。序列A(SEQ ID NO：518)、序列B (SEQ ID NO：519)、序列C(SEQ ID NO：520)、序列D(SEQ ID NO： 521)、序列E(SEQ ID NO：522)、序列F(SEQ ID NO：523)、序列G(SEQ ID NO：524)、序列H(SEQ ID NO：525)、序列I(SEQ ID NO：526)、序 列J(SEQ ID NO：527)、序列K(SEQ ID NO：528)、序列L(SEQ ID NO：529)、序列M(SEQ ID NO：530)、序列N(SEQ ID NO：531)、序列 O(SEQID NO：532)、序列P(SEQ ID NO：533)、序列Q(SEQ ID NO：534)。
图16是用于制备IgG样形式的载体图谱。
图17A-17F列出能结合人EGFR的人dAb的氨基酸序列。所示 氨基酸序列是SEQ ID NO：541-622、725和726。序列是连续的，没有 空位，插入的符号～、～～和～～～表示CDR的位置。CDR1的两侧是～， CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
图18A-18L列出编码图17A-17F所示的dAb的核苷酸序列。所 示核苷酸序列是SEQ ID NO：623-703、727和728。
图19列出能结合VEGF的人dAb的氨基酸序列(SEQ ID NO：704)，以及编码dAb的核苷酸序列(SEQ ID NO：705)。序列是连续 的，没有空位，插入的符号～、～～和～～～表示CDR的位置。CDR1的 两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
发明详述
在本说明书中描述了许多实施方案，撰写方式使得本说明书能够 既清楚又简明，但是应当理解，在不偏离本发明的情况下，可以对这 些实施方案进行各种组合或分开。
本文所用的术语“配体”是指包含至少一个具有所需内源靶化合 物结合特异性结合位点的肽、多肽或蛋白质部分的化合物。本发明的 配体优选包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白可变区，而不含具有 相同特异性的可变区对。优选具有细胞表面靶结合特异性结合位点的 各区是具有所需细胞表面靶(例如膜蛋白，例如受体蛋白)结合特异性 的免疫球蛋白单可变区(例如免疫球蛋白重链单可变区(例如VH、VHH)、 免疫球蛋白轻链单可变区(例如VL))。具有细胞表面靶结合特异性结合 位点的各多肽域也包含具有所需细胞表面靶结合特异性的抗体或抗 体片段(例如免疫球蛋白单可变区)的一个或多个合适形式的互补决定 区(CDR)，致使结合域对细胞表面靶具有结合特异性。例如，可将CDR 移植到合适蛋白质支架或骨架上，例如亲和体(affibody)、SpA支架、 LDL受体A类区或EGF区。此外，配体可以是本文所述的双价(异型 双价)或多价(异型多价)。第一和第二结构域缺乏共享相同特异性的结 构域。因此，“配体”包括含有两个dAb的多肽，其中每个dAb与不 同细胞表面靶结合。配体也包含至少两个能结合不同细胞表面靶的合 适形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽，所述形式例如抗体形式(例如 IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2))或合适的蛋白支架或骨架(例 如本文所述的亲和体、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区、高亲 和性多聚体和多特异性配体)。具有细胞表面靶结合特异性结合位点的 (即第一或第二细胞表面靶)的多肽域也可以是包含针对目标靶结合位 点的蛋白结构域，例如蛋白结构域选自亲和体、SpA区、LDL受体A 类区、高亲和性多聚体(参见例如美国专利申请公布号2005/0053973、 2005/0089932、2005/0164301)。如有必要，“配体”还可包含一个或 多个额外部分，其可各自独立地为肽、多肽或蛋白质部分或非肽部分 (例如聚亚烷基二醇、脂质、碳水化合物)。例如，配体还可包含本文 所述的半衰期延长部分(例如聚亚烷基二醇部分，包含血清白蛋白、血 清白蛋白片段或血清白蛋白变异体的部分，包含转铁蛋白、转铁蛋白 片段或转铁蛋白变异体的部分，能结合血清白蛋白的部分，能结合新 生动物Fc受体的部分)。
本文所用的术语“靶”是指具有结合位点的多肽域能与其结合的 生物分子(例如肽、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物)。靶可以是例 如胞内靶(例如胞内蛋白靶)或细胞表面靶(例如膜蛋白、受体蛋白)。优 选的靶是VEGF或EGFR。
术语“免疫球蛋白单可变区”，是指能独立于其它V区(V region、 V domain)而特异性结合靶、抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、VL)； 然而，本文所用的术语免疫球蛋白单可变区可以与其它可变区 (variable region、variable domain)呈现例如异型多聚体的形式，其中其 它区(region、domain)不是免疫球蛋白单可变区的抗原结合所必需的 (即其中免疫球蛋白单可变区与抗原的结合独立于另外的可变区)。各 “免疫球蛋白单可变区”不仅包括分离的抗体单可变区多肽，而且包 括含有抗体单可变区多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。本文所 用的术语“域抗体(domain antibody)”或“dAb”与本文所用的术语“免 疫球蛋白单可变区”多肽同义。本文所用的免疫球蛋白单可变区多肽 是指哺乳动物免疫球蛋白单可变区多肽，优选人、但也包括啮齿动物 (例如公开于WO00/29004，所述文献的内容通过引用全部结合到本文 中)或骆驼科动物(camelid)VHH dAb。本文所用的骆驼科动物dAb是免 疫球蛋白单可变区多肽，它来自骆驼(camel)、美洲驼(llama)、羊驼 (alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和栗色骆马(guanaco)等物种，并且包含 天然缺乏轻链的重链抗体(VHH)。类似的dAb可得自其它物种(例如鲨 鱼(nurse shark))的单链抗体。优选的配体包含至少两种不同的免疫球 蛋白单可变区多肽或者至少两种不同dAb。
“人”免疫球蛋白单可变区(例如dAb、VH、VL、Vκ、Vλ)可来自 人源抗体或来自用人抗体可变区基因制备的文库。例如，如本文所述， 人免疫球蛋白单可变区具有由人种系抗体基因区段编码的一个或多 个构架区，或者与由人种系抗体基因区段编码的氨基酸序列相比具有 总共至多5个氨基酸的差异。优选的FW1、FW2、FW3和FW4的氨 基酸序列各自由人种系抗体基因区段编码，或者与由人种系抗体基因 区段编码的相应构架区氨基酸序列相比具有总共至多10个氨基酸的 差异。
本文所用的“血管内皮生长因子”(VEGF)是指天然存在的或内源 哺乳动物VEGF-A蛋白和与天然存在的或内源相应哺乳动物VEGF-A 蛋白具有相同氨基酸序列的蛋白质(例如重组蛋白、合成蛋白(即用合 成有机化学方法而制备))。因此，本文所述的术语包括成熟VEGF-A 蛋白、多态变体或等位变体，以及其它VEGF-A同种型(例如通过可 变剪接或其它细胞加工而产生)，以及上述的修饰或未修饰形式(例如 脂化、糖基化)。编码人(Homo sapiens)VEGF-A的RNA可变剪接， 产生人VEGF-A的一些同种型，其在蛋白质序列的氨基酸数量上有差 异。例如，称为VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189和VEGF-206的 同种型是在人体内产生的(参见例如Ferrara，N.，Endocrine Reviews， 25(4)：581-611(2004))。这些同种型和其它天然存在的同种型都涵盖在 术语“VEGF”之内。天然存在的或内源VEGF-A包括野生型蛋白质 例如成熟VEGF-A、多态变体或等位变体和哺乳动物(例如人、非人类 灵长类)体内天然存在的其它同种型。可从例如天然产生VEGF-A的 来源回收或分离这样的蛋白质。这些与天然存在的或内源相应VEGF 具有相同氨基酸序列的蛋白质可用相应的哺乳动物名称来命名。例 如，当相应的哺乳动物是人时，该蛋白质就称为人VEGF。
在本文所述的VEGFR1结合测定或VEGFR2测定中，在配体浓 度为约1nM、约10nM、约50nM、约100nM、约1μM、约10μM或 约100μM时进行测定，抑制VEGF与VEGFR1或VEGFR2结合的配 体(例如免疫球蛋白单可变区)抑制结合达至少约40％、至少约50％、 至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％ 或至少约95％。在VEGFR1结合测定或VEGFR2测定中，抑制VEGF 与VEGFR1或VEGFR2结合的配体抑制结合的IC50为约1μM以下、 约500nM以下、约100nM以下、约75nM以下、约50nM以下、约 10nM以下或约1nM以下。
在本文所述的VEGF生物测定中，抑制VEGF活性的配体(例如 免疫球蛋白单可变区)抑制活力达至少约20％、至少约30％、至少约 40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％或至少约95％。
在本文所述的VEGFR1结合测定或VEGFR2测定中，基本上不 抑制VEGF与VEGFR1或VEGFR2结合的配体(例如免疫球蛋白单可 变区)不会显著抑制结合。例如，在本文所述的VEGFR1结合测定或 VEGFR2测定中，这样的配体可抑制VEGF结合的IC50为约1mM以 上，或抑制结合不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％或不超 过约5％。
本文所用的“表皮生长因子受体”(EGFR、ErbB1、HER1)是指 天然存在的或内源哺乳动物EGFR蛋白和与天然存在的或内源相应哺 乳动物EGFR蛋白具有相同氨基酸序列的蛋白质(例如重组蛋白、合成 蛋白(即用合成有机化学方法而制备))。因此，本文所述的术语包括成 熟EGFR蛋白、多态变体或等位变体，以及其它EGFR同种型(例如通 过可变剪接或其它细胞加工而产生)，以及上述的修饰或未修饰形式 (例如脂化、糖基化)。天然存在的或内源EGFR包括野生型蛋白质例 如成熟EGFR、多态变体或等位变体和哺乳动物(例如人、非人类灵长 类)体内天然存在的其它同种型。可从例如天然产生EGFR的来源回收 或分离这样的蛋白质。这些与天然存在的或内源相应EGFR具有相同 氨基酸序列的蛋白质可用相应的哺乳动物名称来命名。例如，当相应 的哺乳动物是人时，该蛋白质就称为人EGFR。
在本文所述的EGFR结合测定或EGFR激酶测定中，抑制EGF 和/或TGFα与EGFR结合的配体(例如免疫球蛋白单可变区)抑制结合 的IC50为约1μM以下、约500nM以下、约100nM以下、约75nM 以下、约50nM以下、约10nM以下或约1nM以下。
在本文所述的EGFR激酶测定中，抑制EGFR活性的配体(例如 免疫球蛋白单可变区)抑制EGFR激酶活性的IC50为约1μM以下、约 500nM以下、约100nM以下、约75nM以下、约50nM以下、约10nM 以下或约1nM以下。
在本文所述的受体结合测定或激酶测定中，基本上不抑制EGF 或TGFα与EGFR结合的配体(例如免疫球蛋白单可变区)不会显著抑 制EGF和/或TGFα与EGFR结合。例如，在本文所述的受体结合测 定或激酶测定中，这样的配体可抑制EGF或TGFα与EGFR结合的 IC50为约1mM以上。
“亲和力”和“亲合力”在本领域是用于描述结合作用强度的术 语。对于本发明的配体，亲合力是指细胞上的靶(例如第一细胞表面靶 和第二细胞表面靶)与配体之间的总结合强度。亲合力大于单个靶的各 亲和力之和。
本文所用的“毒素部分”是指包含毒素的部分。毒素是对细胞生 理具有有害作用或改变细胞生理(例如引起细胞坏死、细胞凋亡或抑制 细胞分裂)的物质。
本文所用的术语“剂量”是指一次性全部给予(单位剂量)、或者 在限定的时间间隔内分两次或更多次给予患者的配体的量。例如，剂 量可以指在1天(24小时)(日用量)、2天、1周、2周、3周或1个月 或数月的疗程中给予(例如通过单次给予，或通过两次或更多次给予) 患者的配体(例如包含能结合VEGF的免疫球蛋白单可变区和能结合 EGFR的免疫球蛋白单可变区的配体)的量。给药之间的间隔可以是任 何所需时间。
本文所用的“互补”是指当两个免疫球蛋白结构域属于能构成关 联对或关联组的结构家族时，或者它们来源于这样的家族并保留该特 征时，那么它们是“互补”的。例如，抗体的VH区和VL区就是互补 的；两个VH区则不互补，两个VL区也不互补。在免疫球蛋白超家族 其它成员中也可发现互补区，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)区。 人工结构域，例如基于蛋白质支架的结构域(它们不结合表位，除非经 改造才可结合表位)，是非互补的。同样，基于(例如)免疫球蛋白结构 域和纤连蛋白结构域的两个结构域也不互补。
本文所用的“免疫球蛋白”，是指这样的多肽家族：其保留抗体 分子的免疫球蛋白折叠特征，含有两个β折叠，一般还含有保守二硫 键。免疫球蛋白超家族成员在体内参与细胞和非细胞相互作用的许多 方面，包括在免疫系统(例如抗体、T细胞受体分子等)中具有广泛作 用，参与细胞粘附(例如ICAM分子)和胞内信号转导(例如受体分子， 例如PDGF受体)。本发明可用于具有结合域的所有免疫球蛋白超家族 分子。优选本发明涉及抗体。
本文所用的“domain(域，结构域，区)”，是经过折叠的蛋白质 结构，它保留了蛋白质三级结构，但独立于蛋白质的其余部分。通常， 各结构域负责蛋白质的分离的功能性，并且在许多情况下可以添加、 去除或转移给其它蛋白质，而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其余部 分的功能。单抗体可变区(single antibody variable domain)是指经过折 叠的多肽域，包含特征为抗体可变区的序列。因此，它包含完整抗体 可变区和修饰可变区(例如其中一个或多个环已经被不具有抗体可变 区特征的序列所置换)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体 可变区，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变区 的折叠片段。因此，每个配体包含至少两个不同区。
“库(repertoire)”，一级序列不同的多样化变异体(例如多肽变异 体)的集合。本发明所用的文库可包括含有至少1000个成员的多肽库。
“文库(library)”，术语文库是指异源多肽或核酸的混合物。文库 由成员组成，每个成员都具有一个多肽或核酸序列。就这一方面而言， 文库(library)和库(repertoire)同义。文库成员间的序列差异造成文库的 多样性。文库可以呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以呈用 核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动植物细胞 等。优选各个生物体或细胞仅含有一个文库成员或数目有限的文库成 员。最好将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所编码的多肽。因 此，在一个优选的方面，文库可以呈宿主生物体群体的形式，每个生 物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有呈核酸形式的文 库的一个成员，所述核酸可以表达而产生其相应多肽成员。因此，宿 主生物体群体具有编码很大的具有遗传多样性的多肽变异体库的潜 力。
本文所用的抗体是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如 Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、 二硫键连接的scFv、双链抗体)，无论是来自任何物种的天然产生的 抗体，还是由重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样品中 分离的：血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。
本文所用的“抗原”是能与本发明的结合结构域结合的分子。通 常，抗原与抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。抗原可以是多肽、 蛋白质、核酸或其它分子。一般而言，针对两个特定靶(例如抗原)的 靶特异性而选择本发明双特异性配体。就常规抗体及其片段而言，由 可变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)所限定的抗体结合位点能够结合 抗原。
“表位”是与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位限 定针对抗体的最小结合部位，因此代表了抗体特异性的靶。就单域抗 体而言，表位代表了与分离的可变区结合的结构单元。
“通用构架(universal framework)”是指单抗体构架序列，对应于 序列中的保守抗体区，根据Kabat(＂Sequences of Proteins of Immunological Interest＂，US Department of Health and Human Services (美国健康和人类服务部))所定义；或者对应于人种系免疫球蛋白库或 结构，根据Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定义。 本发明提供单构架或一组这样的构架的用途，已经发现它们允许事实 上任何结合特异性的衍生，尽管变异仅在超变区内。
术语“半衰期”是指配体的血清浓度在体内降低50％所需要的时 间，例如因为通过天然机制所致的双特异性配体降解和/或清除或螯 合。本发明的配体在体内是稳定的，其半衰期因结合抵抗降解和/或清 除或螯合的分子而延长。通常，这类分子是天然存在的蛋白质，它们 本身在体内的半衰期较长。如果一种配体的功能活性在体内的持续时 间比对延长半衰期的分子不具有特异性的另一种类似配体更长的话， 则该配体的半衰期延长。因此，将对HSA和两个靶分子具有特异性 的配体，与对HAS无特异性且不结合HAS、而结合别的分子的相同 配体进行比较。例如，它能结合细胞上的第三靶。通常，半衰期延长 10％、20％、30％、40％、50％以上。半衰期延长范围在2x、3x、4x、 5x、10x、20x、30x、40x、50x以上是可能的。或者，另外，半衰期 延长范围高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也 是可能的。
本文所用的术语“竞争”是指当第二靶与其关联靶结合域结合时， 第一靶与其关联靶结合域的结合受到抑制。例如，结合可以是空间上 受到抑制，例如通过结合域的物理阻断或通过改变结合域的结构或环 境，使其对靶的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)降低。在竞争性结合 测定(例如竞争性ELISA或其它合适的结合测定)中，蛋白质部分与另 一试剂竞争性结合靶(例如EGFR、VEGF、血清白蛋白)，当蛋白质部 分抑制其它试剂与靶结合时。例如，在竞争性结合测定中，蛋白质部 分可抑制能结合靶(例如EGFR、VEGF、血清白蛋白)的另一试剂的结 合达至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约 60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。
本文所用的术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性” 或“极高严格性条件”描述了核酸杂交和洗涤条件。进行杂交反应的 指南可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons， N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，所述文献通过引用全部结合到本文中。该参 考文献中描述了含水方法和无水方法，都可以采用。本文所用的具体 杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中， 在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，在至少50℃(对于低严格 性条件，洗涤温度可升高至55℃)洗涤两次；(2)中等严格性杂交条件 在6X SSC中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％ SDS中，在60℃洗 涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在6X SSC中，在约45℃，再在 0.2X SSC、0.1％ SDS中，在65℃洗涤一次或多次；和优选(4)极高严 格性杂交条件是0.5M磷酸钠、7％ SDS中，在65℃，再在0.2X SSC、 1％ SDS中，在65℃洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条 件，除非另有说明，否则应采用该条件。
与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的 序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序 列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％以上。或者，当核酸区段在所选杂交条件(例如极高 严格性杂交条件)下与互补链杂交时，则存在基本的同一性。核酸可以 存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或者呈部分纯化或基本纯 化的形式。
两序列间“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(这些术语 在本文可互换使用)的计算如下进行。为了优化比较目的，将序列比对 (例如为了比较目的，对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸 序列中引入空位，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实施方案 中，为了比较目的，所比对的参考序列长度占参考序列总长度的至少 30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至 更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，对相应氨基酸位置或核 苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的某个位置 被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子 在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基 酸或核酸“同一性”)。两序列间的％同一性是考虑到空位数和各空位 长度后的两序列共享的相同位置数的函数，需要引入这些空位以进行 两序列的最佳比对。
优选采用BLAST 2 Sequences算法，使用默认参数，准备和测定 本文所定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性 (Tatusova，T.A.等，FEMS Microbiol Lett，174：187-188(1999))。或者， 最好采用BLAST算法(2.0版)进行序列比对，参数设定到默认值。 BLAST(基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)) 是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的启发式检索 算法；这些程序都主要归功于采用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8的统计学方法的发现。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例 如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术 人员公知的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见 Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和 Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley & Sons，Inc.，所述文献通过引用结合到本文中)和化学方法。
本发明涉及具有VEGF(例如人VEGF)结合特异性的配体，具有 EGFR(例如人EGFR)结合特异性的配体以及具有VEGF和EGFR(例 如人VEGF和人EGFR)结合特异性的配体。例如，配体可包含具有 VEGF结合特异性结合位点的多肽域，具有EGFR结合特异性结合位 点的多肽域，或者包含具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域和具 有EGFR结合特异性结合位点的多肽域。
本发明的配体提供一些优势，例如如本文所述，可修饰配体使之 具有所需体内血清半衰期。因此，配体可用于控制、降低或消除治疗 药(例如用于治疗癌症的毒素)的一般毒性。此外，dAb比常规抗体小 很多，给予dAb比给予常规抗体的组织渗透性更好。因此，当用于治 疗癌症(例如通过靶向实体瘤)时，dAb和包含dAb的配体比常规抗体 更具优势。此外，许多癌症过量表达EGFR，可以给予具有EGFR和 VEGF结合特异性的配体，将VEGF-抑制活性靶向肿瘤或癌细胞的环 境。该方法直接给予肿瘤或癌症部位两个有利活性，即通过结合EGFR 并抑制配体(例如EGF、TGFα)与受体结合，以及抑制支持肿瘤形成和 发育的血管生成，而导致抗癌活性。因此，可将具有VEGF和EGFR 结合特异性的配体给予癌症(例如表达EGFR的癌症)患者，以便用单 一治疗药达到良好治疗。
此外，通过EGFR转导的信号可导致血管生成因子(例如VEGF) 的产生。表达或过量表达EGFR的癌细胞(例如在肿瘤中)可产生高水 平VEGF，其在局部起到减少肿瘤血管生成的作用。因此，可将具有 VEGF和EGFR结合特异性的本发明配体给予患者，以便将配体的 VEGF抑制活性定向给予过量表达EGFR的细胞。因此，可将抗血管 生成治疗特异性给予产生VEGF的部位(例如给予过量表达EGFR的 细胞)。
在某些实施方案中，配体具有VEGF结合特异性并且包含(至少 一个)具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区。在其它实施方案 中，配体具有EGFR结合特异性并且包含(至少一个)具有EGFR结合 特异性的免疫球蛋白单可变区。在某些实施方案中，配体具有VEGF 和EGFR结合特异性，并且包含(至少一个)具有VEGF结合特异性的 免疫球蛋白单可变区和(至少一个)具有EGFR结合特异性的免疫球蛋 白单可变区。
如本文所述，可以精制本发明的配体。例如，可以精制本发明的 配体以改变其体内血清半衰期。如有必要，配体还可包含本文所述的 毒素或毒素部分。在某些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如 自由基产生物(例如含硒毒素)或放射性核素。在其它实施方案中，毒 素或毒素部分是具有胞内靶结合特异性结合位点的多肽域(例如 dAb)。在具体实施方案中，配体是具有VEGF和EGFR(例如人VEGF 和人EGFR)结合特异性的IgG样形式。
配体形式
如本文所述，本发明的配体可精制成单特异性、双特异性或多特 异性配体。另见WO 03/002609中关于配体精制，其全部内容通过引 用结合到本文中。所述双特异性配体包含具有不同结合特异性的免疫 球蛋白单可变区。所述双特异性配体可包含重链区和轻链区的组合。 例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，其可以scFv形式连接在 一起(例如使用合适的接头，例如Gly4Ser)，或者精制成双特异性抗体 或其抗原结合片段(例如F(ab’)2片段)。双特异性配体并不包括互补 VH/VL对，其形成能协同结合抗原或表位的常规两条链的抗体抗原结 合位点。而双形式的配体却包含VH/VL互补对，其中V区具有不同的 结合特异性。
另外，如有必要，双特异性配体可包含一个或多个CH区或CL区。 如有必要，也可包含铰链区。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体， 例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。也考 虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂。 优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体 也能掺入同一蛋白质，例如两个这样的配体可以掺入IgG或多聚体形 式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一个实施方案中，多个双特 异性配体结合在一起形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合 在一起，产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法 所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区，可以在同一多肽 链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以 通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或 者通过本领域已知的任何其它方法而连接。
在某些实施方案中，接头可以是含有抗体可变区羧基端氨基酸和 抗体恒定区氨基端氨基酸的“天然接头”。例如，天然接头可含有 Vκ的羧基端氨基酸和Cκ的氨基端氨基酸(例如KVEIKRTVAAPS (SEQ ID NO：706))。在其它实施方案中，接头可含比天然接头更少的 Lys和Arg残基(例如LVTVSSAST(SEQ ID NO：707)或 (LVTVSSGGGGSGGGS(SEQ ID NO：708))。如有必要，可使接头突变， 以取代一些或全部带正电荷的残基(例如在天然接头中)，例如用在生 理pH下不带正电荷的残基取代Lys和/或Arg。例如，Lys和/或Arg 残基可以用Asn、Leu、Gln或Ser取代。这类接头具有降低蛋白酶敏 感性的优势(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、 胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、组织蛋 白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶3)。这些接头的实例包括 GQGTNVEINRTVAAPS(SEQ ID NO：710)、GQGTNVEINQTVAAPS (SEQ ID NO：711)、GQGTNVEIQRTVAAPS(SEQ ID NO：712)或 GQGTLVTVSSTVAAPS(SEQ ID NO：713)。
蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、 胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、组织蛋 白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶3)在蛋白质的正常更新和代谢中起 作用。然而，在某些生理状态(例如炎症状态(例如COPD)和癌症)下， 组织、器官或动物体内(例如肺部、肿瘤内或其附近)存在的蛋白酶的 数量会增加。这样的蛋白酶的增加可导致内源蛋白质加速降解或失 活，以及所给予的治疗或诊断用肽、多肽和蛋白质的加速降解或失活。 事实上，某些具有体内用途(例如用于治疗、诊断活预防疾病)的药物 只有有限功效，因为它们被蛋白酶快速降解而失活。
本发明涉及包含能耐受蛋白酶降解的接头的配体。本发明的蛋白 酶耐受性配体具有一些优势。例如，可将蛋白酶耐受性配体给予患者， 比起蛋白酶敏感性药物而言，其活性在体内保留时间更长。因此，蛋 白酶耐受性配体可在足够产生生物效应的时间周期内保持功能。
在适于蛋白酶活性的条件下，将耐受蛋白酶降解的配体或接头与 蛋白酶一起孵育至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少 约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9 小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约24 小时、至少约36小时或至少约48小时，耐受蛋白酶降解的配体或接 头基本上不被蛋白酶降解。将配体或接头与蛋白酶一起孵育至少约2 小时之后，当不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过 约14％、不超过约13％、不超过约12％、不超过约11％、不超过约 10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不 超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约 1％或基本上没有配体或接头被蛋白酶降解时，则配体或接头基本上不 被降解。可采用SDS-PAGE等合适方法评价蛋白质降解。
可用任何合适方法评价蛋白酶耐受性。例如，可将蛋白酶添加到 配体或接头的合适缓冲液(例如PBS)的溶液中，得到配体或接头/蛋白 酶溶液，例如至少约0.01％(w/w)蛋白酶、约0.01％至约5％(w/w)蛋 白酶、约0.05％至约5％(w/w)蛋白酶、约0.1％至约5％(w/w)蛋白酶、 约0.5％至约5％(w/w)蛋白酶、约1％至约5％(w/w)蛋白酶、至少约 0.01％(w/w)蛋白酶、至少约0.02％(w/w)蛋白酶、至少约0.03％(w/w) 蛋白酶、至少约0.04％(w/w)蛋白酶、至少约0.05％(w/w)蛋白酶、至 少约0.06％(w/w)蛋白酶、至少约0.07％(w/w)蛋白酶、至少约0.08％ (w/w)蛋白酶、至少约0.09％(w/w)蛋白酶、至少约0.1％(w/w)蛋白酶、 至少约0.2％(w/w)蛋白酶、至少约0.3％(w/w)蛋白酶、至少约0.4％ (w/w)蛋白酶、至少约0.5％(w/w)蛋白酶、至少约0.6％(w/w)蛋白酶、 至少约0.7％(w/w)蛋白酶、至少约0.8％(w/w)蛋白酶、至少约0.9％ (w/w)蛋白酶、至少约1％(w/w)蛋白酶、至少约2％(w/w)蛋白酶、至 少约3％(w/w)蛋白酶、至少约4％(w/w)蛋白酶或约5％(w/w)蛋白酶 的溶液。在适于蛋白酶活性的温度(例如在37℃)中，孵育配体或接头/ 蛋白酶混合物，定时取样(例如在1小时、2小时、3小时等)并终止蛋 白酶反应。然后用SDS-PAGE分析等合适方法分析样品中的蛋白质降 解。结果用于绘制降解的时间曲线。
配体可精制成双特异性或多特异性抗体或抗体片段或双特异性 或多特异性非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中 可以掺入抗体可变区或其一个或多个CDR，以便在结构上赋予对抗原 的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如双特异性 IgG样形式(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、抗体重 链和/或轻链的异型二聚体、任何前述抗原结合片段(例如Fv片段(例 如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2 片段)、单可变区(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述的修饰形式(例 如通过共价连接聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇) 或其它合适的聚合物)而修饰)。参见PCT/GB03/002804(2003年6月 30日申请，指定国为美国(WO 2004/081026)有关PEG化单可变区和 dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延 长的体内半衰期、合适的PEG、优选的PEG流体动力学尺寸和优选 的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的流体动力学尺寸。 PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及 的部分，全都通过引用结合到本文中。
可以精制配体，例如使用合适接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-8， 例如2、3、4、5、6或7。如有必要，配体(包括dAb单体、二聚体和 三聚体)可以与抗体Fc区(包含CH2区和CH3区中的一个或两者都包含) 和任选铰链区连接。例如，将编码配体的载体与Fc区连接成为一个 核苷酸序列，用于制备所述多肽。在某些实施方案中，配体包含具有 相同或不同结合特异性的一个、两个或更多个dAb，以及CH2、CH3、 CH2-CH3、铰链-CH2、铰链-CH3、铰链-CH2-CH3、铰链-CH2的部分、 铰链-CH3的部分、或铰链-CH2-CH3的部分。在这样的实施方案中， CH2、CH3、CH2-CH3、铰链-CH2、铰链-CH3、铰链-CH2-CH3、铰链-CH2 的部分、铰链-CH3的部分和铰链-CH2-CH3的部分可来自所需抗体，例 如人IgG、例如人IgG1或人IgG4。
在某些实施方案中，本发明的配体包含与抗体Fc区融合(例如直 接或通过接头)的抗EGFR dAb或抗VEGF dAb。在某些实施方案中， 配体是包含以二硫键结合抗EGFR dAb的抗VEGF dAb的Fc融合体。 在具体实例中，配体包含两个或更多个dAb(例如两个能结合EGFR 的dAb、两个能结合VEGF的dAb、一个能结合EGFR的dAb和一个 能结合VEGF的dAb)和Fc区，而且从氨基端到羧基端，配体的结构 为VH-VH-Fc、VL-VL-Fc、VH-VL-Fc、VL-VH-Fc。例如，配体的结构为 VH-VK-铰链-CH2-CH3、VK-VH-铰链-CH2-CH3、VK-VK-铰链-CH2-CH3 或VH-VH-铰链-CH2-CH3。如有必要，任何上述通式所表示的VH都可 以是VHH。含有Fc区的两个配体可以结合在一起形成二聚体，例如通 过二硫键(例如在铰链区内)。
通常，具有靶(例如dAb)结合特异性结合位点的多肽域的方向， 以及配体是否包含接头，都是设计选择的问题。然而，与其它方向相 比，某些方向(有或无接头)可提供优选结合特性。所有方向(例如 dAb1-dAb2-Fc；dAb2-dAb1-Fc)都涵盖在本发明之内，可通过常规筛 选，容易地鉴定出含有能提供所需结合特异性的方向的配体。
配体和dAb单体也可以结合到和/或精制到非抗体多配体结构中， 形成多价复合物，其可结合具有相同抗原的靶分子，因而提供优越亲 合力。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以产 生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US 5,831,012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适 方法的细节参见WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和 CTLA4(参见van den Beuken等，J.Mol.Biol.310，591-601(2001))以及 例如描述于WO00/69907(Medical Research Council)的支架，所述支架 是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它多肽陪伴分子。蛋白质支架 可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球 蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样，纤连蛋白、脂质运 载蛋白和其它支架也可以进行组合。
制备任何所需形式的各种合适方法是本领域已知的，例如可以通 过表达合适的表达构建体和/或培养合适细胞(例如杂交瘤、异源杂交 瘤、含有编码所述形式的重组构建体的重组宿主细胞)，来制备抗体链 和抗体形式(例如双特异性IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗 体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体)。此 外，可以通过表达合适的表达构建体或通过抗体的酶促消化(例如用木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制备抗体或抗体链的抗原结合片段(例如双特 异性结合片段，例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、 Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)等形式。
配体可以精制成多特异性配体，例如按照WO 03/002609所述， 该文献所公开的内容通过引用全部结合到本文中。这样的双特异性配 体具有不止一个表位结合特异性。通常，多特异性配体包含两个或更 多个表位结合域，例如包含表位结合位点的dAb或非抗体蛋白结构 域，例如亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多 聚体。多特异性配体可按本文所述进一步精制。
在某些实施方案中，配体是IgG样形式。这类形式具有常规IgG 分子的4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH 和/或VL)已经被具有所需特异性的dAb即单可变区置换。优选各可变 区(2个VH区和2个VL区)被dAb即单可变区置换。包括在IgG样形 式中的dAb即单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施 方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。 例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性 的dAb；可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和 另一具有不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含2个具有 相同特异性的dAb和2个具有相同特异性但该特异性与上述的不同的 dAb；可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二 dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb 的特异性的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具 有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、 F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv)。另外，可以选择Fc部分(例如IgG，例如 IgG1)的具体恒定区、变异体或其部分，以改变效应器功能。例如，如 果需要补体激活和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的话，配体可 以是IgG1样形式。如有必要，IgG样形式可包含突变的恒定区(变异IgG 重链恒定区)，以尽可能降低与Fc受体结合和/或结合补体的能力。(参见 例如Winter等，GB 2,209,757B；Morrison等，WO 89/07142；Morgan等， WO 94/29351，1994年12月22日)。
在某些实施方案中，IgG样形式可包含抗EGFR dAb(例如 DOM16-39-542、DOM16-39-618或DOM16-39-619)、抗VEGF dAb(例 如DOM15-26-501)或抗EGFR dAb和抗VEGF dAb。
本发明的配体可精制成含有第一免疫球蛋白单可变区直接与第 二免疫球蛋白单可变区融合的融合蛋白。如有必要，这样的形式还可 包含半衰期延长部分。例如，配体可包含第一免疫球蛋白单可变区、 第二免疫球蛋白单可变区和能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变 区，其中第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融 合，而第二免疫球蛋白单可变区又直接与能结合血清白蛋白的免疫球 蛋白单可变区融合。例如，配体可以是两个或更多个具有EGFR结合 特异性结合位点的蛋白质部分的线状融合体(in line fusion)，所述蛋白 质部分可与抗EGFR域抗体(例如本文所公开的任何DOM16 dAb)竞争 性结合EGFR，并且与抗血清白蛋白dAb(例如本文所公开的任何 DOM7 dAb)融合。在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位 点的蛋白质部分(例如抗EGFR dAb)具有不同表位特异性。在其它实例 中，配体是线状融合蛋白，所述蛋白包含具有EGFR结合特异性结合 位点的蛋白质部分(例如抗EGFR dAb)、具有VEGF结合特异性结合 位点的蛋白质部分和抗血清白蛋白dAb。
在具体实施方案中，这样的线状融合体包含DOM16-39-618dAb 和/或DOM16-39-619和抗血清白蛋白dAb(例如 DOM16-39-618—DOM7h-14、DOM7h-14—DOM16-39-618、 DOM16-39-619—DOM7h-14、DOM7h-14—DOM16-39-619)。在其它 实施方案中，线状融合体包含与DOM16-39-618氨基酸序列具有至少 约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分(例如dAb)，包含与 DOM16-39-619氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性 的蛋白质部分，和/或包含与本文所公开的抗血清白蛋白dAb(例如 DOM7h-14)氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白 质部分(例如dAb)。
在其它具体的实施方案中，配体包含抗VEGF dAb、抗EGFR dAb 和抗血清白蛋白dAb(例如DOM15-10—DOM16-39—抗血清白蛋白 dAb、DOM16-39—DOM15-10—抗血清白蛋白dAb、 DOM15-26-501—DOM16-39—抗血清白蛋白dAb、 DOM16-39—DOM15-26-501—抗血清白蛋白dAb)。在其它实施方案 中，线状融合体包含与本文所公开的抗VEGF dAb(例如DOM15-10 或DOM15-25-501)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列 同一性的蛋白质部分(例如dAb)，和/或与本文所公开的抗EGFR dAb (例如DOM16-39)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列 同一性的蛋白质部分，和/或与本文所公开的抗血清白蛋白dAb(例如 DOM7h-14)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性 的蛋白质部分(例如dAb)。
通常，具有靶结合特异性结合位点的多肽域的方向，以及配体是 否包含接头，都是设计选择的问题。然而，与其它方向相比，某些方 向(有或无接头)可提供更好的结合特性。所有方向(例如dAb1-接头 -dAb2；dAb2-接头-dAb1)都涵盖在本发明之内，可通过筛选，容易地 鉴定出含有能提供所需结合特异性的方向的配体。
延长半衰期的形式
可以精制配体和dAb单体以延长其体内血清半衰期。延长体内半 衰期可用于免疫球蛋白(尤其是抗体、最尤其是小尺寸的抗体片段，例 如dAb)的体内应用。这样的片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、 dAb)被快速地从体内清除掉，这极大地限制了临床应用。
可将配体精制成为抗体的较大抗原结合片段或具有较大流体动 力学尺寸的抗体(例如精制成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。 配体也可精制成为具有较大流体动力学尺寸，例如通过连接聚亚烷基 二醇基团(例如聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋 白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc 区，或者通过与抗体区缀合。在某些实施方案中，将配体(例如dAb 单体)PEG化。优选PEG化配体(例如dAb单体)与非PEG化的同样配 体对VEGF和/或EGFR都具有基本相同的结合亲和力或亲合力。例如， 配体可以是包含能结合VEGF或EGFR的dAb的PEG化配体，其亲 和力或亲合力与未PEG化形式的配体的亲和力差异不超过约1000倍、 优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲和力或 亲合力相对于未PEG化形式的亲和力或亲合力来说基本不变。参见 PCT/GB03/002804(2003年6月30日申请，指定国为美国(WO 2004/081026)有关PEG化单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG 化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、 优选的PEG流体动力学尺寸和优选的PEG化单可变区和dAb单体和 多聚体的流体动力学尺寸。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全 部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。
可用本领域众所周知的方法，测定本发明配体(例如dAb单体和 多聚体)的流体动力学尺寸。例如，可采用凝胶过滤色谱来测定配体的 流体动力学尺寸。用于测定配体流体动力学尺寸的合适凝胶过滤基质 (例如交联琼脂糖基质)是众所周知的，容易获得。
配体形式的尺寸(例如与dAb单体连接的PEG部分的尺寸)因所需 用途而异。例如，当需要配体离开循环而进入外周组织时，最好保持 配体的流体动力学尺寸较小，以便从血流中外渗。或者，当需要配体 在体循环中保留长时间时，可增加配体尺寸，例如通过精制成Ig样蛋 白或通过添加30-60kDa PEG部分(例如直链或支链PEG30-40kDa PEG，例如添加两个20kDa PEG部分)。可改变配体形式的尺寸，从 而达到所需体内血清半衰期，例如为了控制与毒素的接触和/或降低毒 性试剂的副作用。
也可通过将配体与本文所述的结合域(例如抗体或抗体片段)缀合 或连接，而增加配体(例如dAb单体)的流体动力学尺寸及其血清半衰 期，所述结合域能结合能增加体内半衰期的抗原或表位。例如，配体 (例如dAb单体)可以与抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体 片段(例如抗SA或抗新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)或与抗 SA亲和体或抗新生动物Fc受体亲和体缀合或连接。
用于本发明配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实 例参见WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。 具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明：
●SEQ ID NO：1(公开于WO 2005/077042A2，该序列通过引用明 确地结合到本说明书中)；
●白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸1-387或由其组成；
●白蛋白或其片段或变异体，其包含选自以下的氨基酸序列：
(a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸54-61；
(b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸76-89；
(c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸92-100；
(d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸170-176；
(e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸247-252；
(f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸266-277；
(g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸280-288；
(h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸362-368；
(i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸439-447；
(j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸462-475；
(k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸478-486；
和
(l)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸560-566。
用于本发明配体的合适白蛋白、片段和类似物的其它实例参见 WO 03/076567 A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲， 下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明：
●人血清白蛋白，参见WO 03/076567A2，例如在图3中(该序列 信息通过引用明确地结合到本说明书中)；
●人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽 链组成，分子量为66,500(参见Meloun等，FEBS Letters 58：136 (1975)；Behrens等，Fed.Proc.34：591(1975)；Lawn等，Nucleic Acids Research 9：6102-6114(1981)；Minghetti等，J.Biol.Chem. 261：6747(1986))；
●白蛋白多态变体或其类似物或片段，参见Weitkamp等，Ann. Hum.Genet.37：219(1973)；
●白蛋白片段或变异体，参见EP322094，例如HA(1-373)、 HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和 1-419间的片段；
●白蛋白片段或变异体，参见EP 399666，例如HA(1-177)和 HA(1-200)和HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间的任 意数字。
当(一个或多个)延长半衰期的部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片 段和类似物)用于本发明配体时，可以用任何合适方法将其与配体缀 合，例如通过与靶结合部分(例如dAb或抗体片段)直接融合，例如通 过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白编码成为单 一多肽链，具有延长半衰期的部分(位于细胞表面靶结合部分的N端 或C端)。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO 03/076567 A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的全部公开内容通过 引用结合到本说明书中，以提供用于本发明的实例))，来完成缀合反 应。通常，能延长体内血清半衰期的多肽是这样的多肽：其在体内天 然存在，能抵抗通过内源机制所致的降解或清除，所述机制能够从生 物体(例如人体)内除去不想要的物质。例如，可从以下蛋白质中选出 延长体内血清半衰期的多肽：来自胞外基质的蛋白质，血液中的蛋白 质，血脑屏障或神经组织中的蛋白质，局限于肾、肝、肺、心、皮肤 或骨骼中的蛋白质，应激蛋白，疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋 白质。
能延长体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异 性配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利 号5,977,307，其公开内容通过引用结合到本文中)、脑毛细血管内皮 细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受体)、胰 岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2) 受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF1α。能延长 血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白 (orosomucoid)；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋 白HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂 蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4 (C4)、Cl酯酶抑制剂(Cl INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血 红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)[Lp(a)]、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌 红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白(transthyretin))(PAL)、视黄 醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。
来自胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整 联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知 道约15种胶原蛋白分子，在身体的不同部位发现，例如I型胶原蛋白 (占身体总胶原蛋白的90％)在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发 现，而II型胶原蛋白在软骨、椎间盘(vertebral disc)、脊索、眼睛的玻 璃体中发现。
来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白(例如血纤蛋白、α-2巨 球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如血纤蛋白原A、血纤蛋白原 B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白 和β-2-微球蛋白)；酶和酶抑制剂(例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半 胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)；免 疫系统蛋白质，例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免 疫球蛋白轻链(κ/λ))；转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)； 防卫素(例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫 素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。
血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受 体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白等。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括局限于肾脏中的蛋白 质(例如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann 抗原)、局限于肝脏中的蛋白质(例如醇脱氢酶、G250)、局限于肺部的 蛋白质(例如分泌成分，其可结合IgA)、局限于心脏中的蛋白质(例如 HSP27，其与扩张型心肌病相关)、局限于皮肤的蛋白质(例如角蛋白)、 骨特异性蛋白(例如骨形态发生蛋白(BMP)，它们是表现出成骨活性 (osteogenic activity)的转化生长因子β超家族亚类(例如BMP-2、 BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8))、肿瘤特异性蛋白(例如 滋养层抗原、herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如组织蛋白 酶B，其在肝和脾中发现))。
合适的疾病特异性蛋白包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原， 包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体 (OPGL；参见Nature 402，304-309(1999))、OX40(TNF受体家族成员， 在活化T细胞上表达并在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)产生细胞 中被特异性上调；参见Immunol.165(1)：263-70(2000))。合适的疾病 特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括 CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH； 以及血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性 成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子 (VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、 血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长 因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍 生生长因子-BB(PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热激蛋 白(HSP)。HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞 已经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅当作为 创伤、疾病或损伤、胞外HSP触发免疫系统反应的结果时才发生。与 胞外HSP的结合可使本发明组合物局限于疾病部位。
参与Fc转运的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为 FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两者可潜在用于递送。其功能是 (1)跨越胎盘将IgG从母亲转运给孩子，(2)保护IgG免遭降解，因而延 长其血清半衰期。认为受体从核内体中再循环IgG。(参见Holliger等， Nat Biotechnol 15(7)：632-6(1997))。
药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人 员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和载于Peters等， Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。参考文献也可参 见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ半 衰期和曲线下面积(AUC)。
含有毒素部分或毒素的配体
本发明也涉及包含毒素部分或毒素的配体。合适的毒素部分包括 毒素(例如表面活性毒素、细胞毒素)。采用任何合适方法，可将毒素 部分或毒素与配体连接或缀合。例如，毒素部分或毒素可以直接或通 过合适接头与配体共价键合。合适的接头可包括不可裂解或可裂解接 头(例如pH可裂解接头)，可裂解接头包含细胞酶(例如细胞酯酶、细 胞蛋白酶例如组织蛋白酶B)的裂解位点。这样的可裂解接头可用于制 备配体，当这样的配体内在化后，可释放出毒素部分或毒素。
各种用于将毒素部分或毒素与配体连接或缀合的方法都可使用。 所选具体方法取决于毒素部分或毒素以及有待连接或缀合的配体。如 有必要，可使用含有末端官能团的接头来连接配体和毒素部分或毒 素。通常，通过将含有活性官能团(或经修饰而含有活性官能团)的毒 素部分或毒素与接头或直接与配体反应，完成缀合。使含有(或经修饰 后含有)在合适条件下能与第二化学基团反应而形成共价键的化学部 分或官能团的毒素部分或毒素发生反应，形成共价键。如有必要，可 采用任何合适方法，将合适活性化学基团添加到配体或接头上(参见例 如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。许多合适的活性化学基团组合是本领域已知的， 例如胺基可与亲电子基团反应，所述亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲 磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。硫醇 可以与马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、 5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可以与含胺或 酰肼的分子偶联，而叠氮基可以与三价磷基团反应而形成氨基磷酸酯 或磷酰亚胺键(phosphorimide linkage)。将活化基团引入分子的合适方 法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。
合适的毒素部分和毒素包括例如美登木素生物碱(例如美登木 醇，例如DM1、DM4)、紫杉烷、加利车霉素、倍癌霉素或其衍生物。 美登木素生物碱可以是例如美登木醇或美登木醇类似物。美登木醇类 似物的实例包括具有修饰芳环的那些类似物(例如C-19-脱氯(decloro)、 C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基)以及在其它位置上修饰的那些类似物(例 如C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基 (aceloxymethyl)、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-脱甲基、 4，5-脱氧)。美登木醇和美登木醇类似物可参见例如美国专利号 5,208,020和6,333,410，所述文献的内容通过引用结合到本文中。美 登木醇可以与抗体和抗体片段偶联，使用例如3-(2-吡啶基二硫基)丙 酸N-琥珀酰亚胺基酯(也称为4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺 基酯或SPP)、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯 (SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SDPB)、2-亚氨 基硫杂环戊烷(2 iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐。紫杉烷可以是例 如泰素、泰索帝或新的紫杉烷(参见例如WO 01/38318)。加利车霉素 可以是例如溴-加利车霉素络合物(例如α、β或γ溴络合物)、碘-加利车 霉素络合物(例如α、β或γ碘络合物)或其类似物和模拟物。溴-加利车 霉素络合物包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR和K1-BR。 碘-加利车霉素络合物包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。 加利车霉素及其突变体、类似物和模拟物可参见例如美国专利号 4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374和5,714,586，所述文献 的内容通过引用结合到本文中。倍癌霉素类似物(例如KW-2189、 DC88、DC89CBI-TMI及其衍生物)可参见例如美国专利号5,070,092、 美国专利号5,187,186、美国专利号5,641,780、美国专利号5,641,780、 美国专利号4,923,990和美国专利号5,101,038，所述文献的内容通过 引用结合到本文中。
其它毒素的实例包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌 呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、烷 化剂(例如氮芥、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专利 号5,475,092、5,585,499、5,846,545)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛 莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星 (streptozotocin)、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类 (例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌 素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、丝裂霉素、嘌罗霉 素、安曲霉素(AMC))、倍癌霉素及其类似物或衍生物和抗有丝分裂药 (例如长春新碱、长春碱、泰素、auristatins(例如auristatin E)和美登木 素生物碱及其类似物或同系物。
毒素也可以是表面活性毒素，例如作为自由基产生物(例如含硒 毒素部分)的毒素或含有放射性核素的部分的毒素。合适的含有放射性 核素的部分包括例如含有放射性碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、 锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝 (99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯 (36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。
毒素可以是蛋白质、多肽或肽，来源于细菌蛋白质(例如白喉毒 素、假单胞菌外毒素(PE))和植物蛋白质(例如蓖麻毒蛋白A链(RTA))， 而多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒蛋白和商 陆毒蛋白(dodecandron)等核糖体失活蛋白(RIP)，也可考虑用作毒素。
可以结合、废止、促进降解或阻止负责特定靶蛋白产生的 mRNA的产生的反义核酸化合物，也可用作毒素。反义化合物包括反 义RNA或DNA，单链或双链，寡核苷酸或其类似物，其可与单独的 mRNA特异性杂交并阻止转录和/或mRNA的RNA加工和/或所编码 多肽的翻译，并因而导致相应的所编码多肽数量下降。Ching等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder等，Ann.Int.Med. 113：604-618(1990)；Loreau等，FEBS Letters 274：53-56(1990)；有用 的反义治疗药包括例如VeglinTM(VasGene)和OGX-011(Oncogenix)。
毒素也可以是光敏剂。合适的光敏剂包括基于卟啉的物质，例如 卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、其血卟啉衍生物、酞菁、初红紫素 (etiopurpurin)、德卟啉(texaphrin)等。
毒素可以是能结合胞内靶(例如胞内抗体)的抗体或抗体片段，例 如能结合胞内靶的dAb。这样的抗体或抗体片段(dAb)可靶向指定亚细 胞区室或靶。例如，抗体或抗体片段(dAb)可结合选自以下的胞内靶： erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、胱冬蛋白酶3、胱冬蛋白酶7、 Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV 型胶原酶、组织蛋白酶L以及以下文献所描述的其它胞内靶： Kontermann，R.E.，Methods，34：163-170(2004)，所述文献通过引用全部 结合到本文中。
能结合VEGF的多肽域
本发明提供具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域(例如免疫 球蛋白单可变区、dAb单体)。在优选的实施方案中，经表面等离子共 振测定，多肽域(例如dAb)与VEGF结合的亲和力(KD；KD＝K解离(kd)/K结合 (ka))为300nM至1pM(即3 x 10-7M至5 x 10-12M)、优选50nM至 1pM、更优选5nM至1pM、最优选1nM至1pM，例如KD为1 x 10-7M 以下、优选1 x 10-8M以下、更优选1 x 10-9M以下、有利的是1 x 10-10 M以下、最优选1 x 10-11M以下；和/或K解离速率常数为5 x 10-1s-1 至1 x 10-7s-1、优选1 x 10-2s-1至1 x 10-6s-1、更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5 s-1、例如5 x 10-1s-1以下、优选1 x 10-2s-1以下、有利的是1 x 10-3s-1 以下、更优选1 x 10-4s-1以下、还更优选1 x 10-5s-1以下、最优选1 x 10-6 s-1以下。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与 选自以下的dAb竞争性结合VEGF：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、 TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9 (SEQ ID NO：103)、TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、 TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16 (SEQ ID NO：110)、TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、 TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6 (SEQ ID NO：117)、TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、 TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27 (SEQ ID NO：124)、TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与 TAR15-26-555(SEQ ID NO：704)竞争性结合VEGF。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包 含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少 约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至 少约99％氨基酸序列同一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3 (SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、 TAR15-12(SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14 (SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、 TAR15-19(SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22 (SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、 TAR15-23(SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25 (SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包 含的氨基酸序列与TAR15-26-555(SEQ ID NO：704)的氨基酸序列具有 至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、 至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、 至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在优选的实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域 包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％、至 少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至 少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性： TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)和TAR15-26 (SEQ ID NO：123)。例如，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域可 包含TAR15-6(SEQ ID NO：117)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)或 TAR15-26(SEQ ID NO：123)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与 本文公开的任何dAb竞争性结合VEGF。
优选具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域是免疫球蛋白单 可变区。具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域可包含任何合适免 疫球蛋白可变区，并且优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。 在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含本 文所述的通用构架。
通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、 DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、 DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、 DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基 因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VL构架还可包含 由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码的构 架氨基酸序列。
在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种 系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、 DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、 DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。 如有必要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5 和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包 含一个或多个构架区，其氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的 相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸 序列与由人种系抗体基因区段编码的所述相应构架区氨基酸序列相 比具有总共至多5个氨基酸的差异。
在其它实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的 FW1、FW2、FW3和FW4氨基酸序列，与人种系抗体基因区段所编 码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4 的氨基酸序列与由所述人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨 基酸序列相比具有总共至多10个氨基酸的差异
在其它实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包 含FW1、FW2和FW3区，而且所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸 序列与由人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨基酸序列相同。
在具体实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包 含DPK9 VL构架或选自DP47、DP45和DP38的VH构架。具有VEGF 结合特异性结合位点的多肽域可包含普通配体(例如蛋白A、蛋白L 和蛋白G)的结合位点。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域 基本上能抵抗聚集。例如，在某些实施方案中，当将1-5mg/ml、5-10 mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或 200-500mg/ml配体或dAb于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐水、 柠檬酸缓冲盐水、水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的溶剂， 所述赋形剂例如为由FDA批准的赋形剂)中的溶液在约22℃、 22-25℃、25-30℃、30-37℃、37-40℃、40-50℃、50-60℃、60-70℃、 70-80℃、15-20℃、10-15℃、5-10℃、2-5℃、0-2℃、-10℃至0℃、-20℃ 至-10℃、-40℃至-20℃、-60℃至-40℃或-80℃至-60℃的温度下保持一 段时间(例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1 周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年或2 年)时，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域有小于约10％、 小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于 约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％聚集。
可采用诸如显微镜检、通过目测或分光镜或任何其它合适的方法 评价溶液浊度的任何合适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散 射来评价聚集。抗聚集的、具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域 具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生产系统(例如大肠杆菌) 进行表达，容易高收率产生可溶性蛋白质的形式的这类具有VEGF结 合特异性结合位点的多肽域，并可以比常规多肽更高的浓度来配制和 /或贮存，几乎没有聚集和活性损失。
另外，可以比其它抗原或表位结合多肽(例如常规抗体)更经济地 产生抗聚集的、具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域。例如，一 般而言，预期用于体内用途的抗原或表位结合多肽的配制包括除去聚 集多肽的过程(例如凝胶过滤)。如果不能去除这样的聚集物，制备物 就不适用于体内应用，因为例如预期起到拮抗剂作用的抗原结合多肽 聚集物，可通过诱导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。蛋白 聚集还会通过在它们所给予的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性 多肽的功效。
相比之下，可以制备本发明的抗聚集的、具有VEGF结合特异 性结合位点的多肽域，用于体内应用，而无需包括去除聚集物的加工 步骤，并且可用于体内应用而没有由多肽聚集而引起的前述缺点。
在某些实施方案中，当加热到温度(Ts)并冷却至温度(Tc)时，具 有VEGF结合特异性结合位点的多肽域能可逆地解折叠，其中Ts高 于具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的解链温度(Tm)，而Tc 低于具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的解链温度。例如，当 加热到80℃并冷却至约室温时，具有VEGF结合特异性结合位点的多 肽域能可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽在解折叠时会丧失功能， 而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多肽不同于在解折叠时聚集的多 肽或不适当重折叠(即不能恢复功能)的多肽(错误折叠的多肽)。
可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价多 肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UV CD、 近UV CD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、核 磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于正确折叠的多肽功能(例如 与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个实例 中，采用功能测定评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合通用配体 和/或靶配体、结合底物)的丧失表明该多肽是解折叠的。
可以采用解折叠或变性曲线，测定具有VEGF结合特异性结合位 点的多肽域的解折叠和重折叠的程度。可通过纵坐标为温度与横坐标 为折叠多肽相对浓度作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何合适的方 法(例如CD、荧光、结合测定)，直接或间接测定具有VEGF结合特异 性的结合位点的折叠多肽域的相对浓度。例如，可以制备具有VEGF 结合特异性的结合位点的多肽域溶液，并通过CD测定溶液的椭圆率。 所得椭圆率值表示折叠配体(例如dAb单体)的相对浓度为100％。再 通过逐渐升高溶液温度，使溶液中具有VEGF结合特异性的结合位点 的多肽域解折叠，然后以合适增量(例如温度每升高一度后)测定椭圆 率。然后通过逐渐降低溶液温度，使溶液中具有VEGF结合特异性的 结合位点的多肽域重折叠，再以合适增量测定椭圆率。可以对数据作 图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折叠曲线和重折叠曲线具有特 征性的S形曲线，它包括其中具有VEGF结合特异性的结合位点的多 肽域分子折叠的部分，其中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽 域分子解折叠到不同程度的解折叠/重折叠转换部分，以及其中具有 VEGF结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的部分。重折叠曲线的 Y轴截距是恢复的重折叠的具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽 域的相对数量。至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少 约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约 95％的恢复，表明配体或dAb单体可逆地解折叠。
在一个优选实施方案中，通过制备具有VEGF结合特异性的结合 位点的多肽域溶液并绘制加热解折叠和重折叠曲线，测定具有VEGF 结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的可逆性。可以在任何合适溶 剂中制备具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶液，所述溶剂 例如为含水缓冲液，其pH适于让具有VEGF结合特异性的结合位点 的多肽域溶解(例如pH比等电点(pI)高或低约3个单位)。具有VEGF 结合特异性的结合位点的多肽域溶液足够浓，以便可检测出解折叠/ 折叠。例如，配体或dAb单体溶液可以为约0.1μM至约100μM、或 优选约1μM至约10μM。
如果具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度(Tm) 是已知的，则可将溶液加热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后通过椭 圆率或荧光(例如从200nm至250nm的远UV CD扫描，于235nm或 225nm的固定波长CD；于300-450nm的色氨酸荧光发射光谱和298nm 的激发)评价折叠，以提供100％的相对折叠配体或dAb单体。再按预 定增量(例如约0.1度至约1度的增加)，将溶液加热至比Tm高至少 10度(Tm+10)，以每个增量测定椭圆率或荧光。然后，以预定增量通 过冷却到至少Tm-10使具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域重 折叠，并以每个增量测定椭圆率或荧光。如果不知道具有VEGF结合 特异性的结合位点的多肽域的解链温度，则可以通过从约25℃至约 100℃递增加热，使溶液解折叠，再递增冷却到至少约25℃使其重折 叠，以每个加热和冷却增量测定椭圆率或荧光。可以对所得数据作图， 绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折叠曲线的Y轴截距是恢复的 重折叠蛋白质的相对数量。在某些实施方案中，具有VEGF结合特异 性的结合位点的多肽域不含骆驼科动物免疫球蛋白可变区，或者不含 骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可变区所特有的 一个或多个构架氨基酸。
优选地，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域当在大肠杆 菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中 表达时，其分泌量为至少约0.5mg/L。在其它优选的实施方案中，当 在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有VEGF 结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约0.75mg/L、至少约 1mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约10mg/L、至少约15mg/L、 至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、 至少约40mg/L、至少约45mg/L、或至少约50mg/L、或至少约100mg/L、 或至少约200mg/L、或至少约300mg/L、或至少约400mg/L、或至少 约500mg/L、或至少约600mg/L、或至少约700mg/L、或至少约 800mg/L、至少约900mg/L、或至少约1g/L。在其它优选的实施方案 中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有 VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约1mg/L到至 少约1g/L、至少约1mg/L到至少约750mg/L、至少约100mg/L到至少 约1g/L、至少约200mg/L到至少约1g/L、至少约300mg/L到至少约 1g/L、至少约400mg/L到至少约1g/L、至少约500mg/L到至少约1g/L、 至少约600mg/L到至少约1g/L、至少约700mg/L到至少约1g/L、至 少约800mg/L到至少约1g/L、或至少约900mg/L到至少约1g/L。尽 管在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述 的具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域可为可分泌的，但是它 们也可以采用任何合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕赤酵 母的合成化学方法或生物学制备方法。
能结合EGFR的多肽域
本发明提供具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域(例如dAb)。 在优选的实施方案中，经表面等离子共振测定，多肽域(例如dAb)与 EGFR结合的亲和力(KD；KD＝K解离(kd)/K结合(ka))为300nM至1pM(即 3 x 10-7M至5 x 10-12M)、优选100nM至1pM、或50nM至10pM、更 优选10nM至100pM、最优选约1nM，例如KD为1 x 10-7M以下、优 选1 x 10-8M以下、更优选约1 x 10-9M以下、1 x 10-10M以下或1 x 10-11 M以下；和/或K解离速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1、优选1 x 10-2s-1 至1 x 10-6s-1、更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5s-1、例如5 x 10-1s-1以下、 优选1 x 10-2s-1以下、有利的是1 x 10-3s-1以下、更优选1 x 10-4s-1以 下、还更优选1 x 10-5s-1以下、最优选1 x 10-6s-1以下。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与 选自以下的dAb竞争性结合EGFR：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、 DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、 DOM16-20(SEQ ID NO：328)、DOM16-21(SEQ ID NO：329)、 DOM16-22(SEQ ID NO：330)、DOM16-23(SEQ ID NO：331)、 DOM16-24(SEQ ID NO：332)、DOM16-25(SEQ ID NO：333)、 DOM16-26(SEQ ID NO：334)、DOM16-27(SEQ ID NO：335)、 DOM16-28(SEQ ID NO：336)、DOM16-29(SEQ ID NO：337)、 DOM16-30(SEQ ID NO：338)、DOM16-31(SEQ ID NO：339)、 DOM16-32(SEQ ID NO：340)、DOM16-33(SEQ ID NO：341)、 DOM16-35(SEQ ID NO：342)、DOM16-37(SEQ ID NO：343)、 DOM16-38(SEQ ID NO：344)、DOM16-39(SEQ ID NO：345)、 DOM16-40(SEQ ID NO：346)、DOM16-41(SEQ ID NO：347)、 DOM16-42(SEQ ID NO：348)、DOM16-43(SEQ ID NO：349)、 DOM16-44(SEQ ID NO：350)、DOM16-45(SEQ ID NO：351)、 DOM16-46(SEQ ID NO：352)、DOM16-47(SEQ ID NO：353)、 DOM16-48(SEQ ID NO：354)、DOM16-49(SEQ ID NO：355)、 DOM16-50(SEQ ID NO：356)、DOM16-59(SEQ ID NO：357)、 DOM16-60(SEQ ID NO：358)、DOM16-61(SEQ ID NO：359)、 DOM16-62(SEQ ID NO：360)、DOM16-63(SEQ ID NO：361)、 DOM16-64(SEQ ID NO：362)、DOM16-65(SEQ ID NO：363)、 DOM16-66(SEQ ID NO：364)、DOM16-67(SEQ ID NO：365)、 DOM16-68(SEQ ID NO：366)、DOM16-69(SEQ ID NO：367)、 DOM16-70(SEQ ID NO：368)、DOM16-71(SEQ ID NO：369)、 DOM16-72(SEQ ID NO：370)、DOM16-73(SEQ ID NO：371)、 DOM16-74(SEQ ID NO：372)、DOM16-75(SEQ ID NO：373)、 DOM16-76(SEQ ID NO：374)、DOM16-77(SEQ ID NO：375)、 DOM16-78(SEQ ID NO：376)、DOM16-79(SEQ ID NO：377)、 DOM16-80(SEQ ID NO：378)、DOM16-81(SEQ ID NO：379)、 DOM16-82(SEQ ID NO：380)、DOM16-83(SEQ ID NO：381)、 DOM16-84(SEQ ID NO：382)、DOM16-85(SEQ ID NO：383)、 DOM16-87(SEQ ID NO：384)、DOM16-88(SEQ ID NO：385)、 DOM16-89(SEQ ID NO：386)、DOM16-90(SEQ ID NO：387)、 DOM16-91(SEQ ID NO：388)、DOM16-92(SEQ ID NO：389)、 DOM16-94(SEQ ID NO：390)、DOM16-95(SEQ ID NO：391)、 DOM16-96(SEQ ID NO：392)、DOM16-97(SEQ ID NO：393)、 DOM16-98(SEQ ID NO：394)、DOM16-99(SEQ ID NO：395)、 DOM16-100(SEQ ID NO：396)、DOM16-101(SEQ ID NO：397)、 DOM16-102(SEQ ID NO：398)、DOM16-103(SEQ ID NO：399)、 DOM16-104(SEQ ID NO：400)、DOM16-105(SEQ ID NO：401)、 DOM16-106(SEQ ID NO：402)、DOM16-107(SEQ ID NO：403)、 DOM16-108(SEQ ID NO：404)、DOM16-109(SEQ ID NO：405)、 DOM16-110(SEQ ID NO：406)、DOM16-111(SEQ ID NO：407)、 DOM16-112(SEQ ID NO：408)、DOM16-113(SEQ ID NO：409)、 DOM16-114(SEQ ID NO：410)、DOM16-115(SEQ ID NO：411)、 DOM16-116(SEQ ID NO：412)、DOM16-117(SEQ ID NO：413)、 DOM16-118(SEQ ID NO：414)、DOM16-119(SEQ ID NO：415)、 DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、 DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、 DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、 DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、 DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、 DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、 DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、 DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、 DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、 DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、 DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、 DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、 DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、 DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、 DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、 DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、 DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、 DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1(SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14 (SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、 NB17(SEQ ID NO：467)、NB18(SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、NB21(SEQ ID NO：471)和NB22 (SEQ ID NO：472)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与 选自以下的dAb竞争性结合EGFR：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、 DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、 DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、 DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、 DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、 DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、 DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、 DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、 DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、 DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、 DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、 DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、 DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、 DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、 DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、 DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、 DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、 DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、 DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、 DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、 DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、 DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、 DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、 DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、 DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、 DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、 DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、 DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、 DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、 DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、 DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、 DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、 DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、 DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、 DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、 DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、 DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包 含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少 约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少 约99％氨基酸序列同一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18 (SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包 含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少 约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少 约99％氨基酸序列同一性：DOM16-39-210(SEQ ID NO：541)、 DOM16-39-211(SEQ ID NO：542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO：543)、 DOM16-39-213(SEQ ID NO：544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO：545)、 DOM16-39-215(SEQ ID NO：546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO：547)、 DOM16-39-217(SEQ ID NO：548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO：549)、 DOM16-39-219(SEQ ID NO：550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO：551)、 DOM16-39-221(SEQ ID NO：552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO：553)、 DOM16-39-223(SEQ ID NO：554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO：555)、 DOM16-39-225(SEQ ID NO：556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO：557)、 DOM16-39-227(SEQ ID NO：558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO：559)、 DOM16-39-229(SEQ ID NO：560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO：561)、 DOM16-39-231(SEQ ID NO：562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO：563)、 DOM16-39-233(SEQ ID NO：564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO：565)、 DOM16-39-235(SEQ ID NO：566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO：725)、 DOM16-39-502(SEQ ID NO：726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO：567)、 DOM16-39-504(SEQ ID NO：568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO：569)、 DOM16-39-506(SEQ ID NO：570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO：571)、 DOM16-39-508(SEQ ID NO：572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO：573)、 DOM16-39-510(SEQ ID NO：574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO：575)、 DOM16-39-512(SEQ ID NO：576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、 DOM16-39-522(SEQ ID NO：578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO：579)、 DOM16-39-524(SEQ ID NO：580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO：581)、 DOM16-39-525(SEQ ID NO：582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO：583)、 DOM16-39-540(SEQ ID NO：584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO：587)、 DOM16-39-544(SEQ ID NO：588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO：589)、 DOM16-39-550(SEQ ID NO：590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-552(SEQ ID NO：592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO：593)、 DOM16-39-554(SEQ ID NO：594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO：595)、 DOM16-39-561(SEQ ID NO：596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO：597)、 DOM16-39-563(SEQ ID NO：598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO：599)、 DOM16-39-571(SEQ ID NO：600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO：601)、 DOM16-39-573(SEQ ID NO：602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO：603)、 DOM16-39-580(SEQ ID NO：604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO：605)、 DOM16-39-592(SEQ ID NO：606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO：607)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO：609)、 DOM16-39-603(SEQ ID NO：610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-605(SEQ ID NO：612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO：613)、 DOM16-39-611(SEQ ID NO：614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO：615)、 DOM16-39-613(SEQ ID NO：616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO：617)、 DOM16-39-615(SEQ ID NO：618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO：619)、 DOM16-39-617(SEQ ID NO：620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO：621) 和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在优选的实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域 包含的氨基酸序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)的氨基酸序列具有 至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、 至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％ 氨基酸序列同一性。例如，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域 可包含DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)或DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的氨基酸序列。
在其它优选的实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与以下的氨基酸序列具有至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性： DOM16-39-521(SEQ ID NO：577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO：585)、 DOM16-39-542(SEQ ID NO：586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO：591)、 DOM16-39-601(SEQ ID NO：608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO：611)、 DOM16-39-618(SEQ ID NO：621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO：622)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与 本文公开的任何dAb竞争性结合EGFR。
优选具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域是免疫球蛋白单可 变区。具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域可包含任何合适的免 疫球蛋白可变区，并且优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。 在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含本 文所述的通用构架。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域能 抵抗聚集，可逆地解折叠，并且包含构架区和/或如上所述地分泌具有 VEGF结合特异性结合位点的多肽域。
能结合血清白蛋白的dAb单体
本发明的配体还可包含dAb单体，其结合血清白蛋白(SA)的Kd 为1nM至500μM(即x 10-9至5 x 10-4)、优选100nM至10μM。优 选地，对于含有抗SA dAb的配体来说，配体与其靶标的结合(例如通 过表面等离子共振(例如使用BiaCore)测定的Kd和/或K解离)比SA强 1-100000倍(优选100-100000倍、更优选1000-100000倍、或 10000-100000倍)。优选地，血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。在一 个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd 约为50nM、优选70nM、更优选100nM、150nM或200nM。
在某些实施方案中，如以上对结合CD38的dAb单体的描述，结 合SA的dAb单体能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或包含构架区。
在具体的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是 结合人血清白蛋白的dAb。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋 白，并与选自以下的dAb竞争性结合白蛋白：DOM7m-16(SEQ ID NO： 473)、DOM7m-12(SEQ ID NO：474)、DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、 DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO：478)、DOM7r-5(SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO： 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、 DOM7h-3(SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO： 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、 DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、 DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、 DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，其含有的氨基酸序 列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或 至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性：DOM7m-16(SEQ ID NO： 473)、DOM7m-12(SEQ ID NO：474)、DOM7m-26(SEQ ID NO：475)、 DOM7r-1(SEQ ID NO：476)、DOM7r-3(SEQ ID NO：477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO：478)、DOM7r-5(SEQ ID NO：479)、DOM7r-7(SEQ ID NO： 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO：481)、DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、 DOM7h-3(SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO： 490)、DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、 DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、 DOM7r-15(SEQ ID NO：499)、DOM7r-16(SEQ ID NO：500)、 DOM7r-17(SEQ ID NO：501)、DOM7r-18(SEQ ID NO：502)、 DOM7r-19(SEQ ID NO：503)、DOM7r-20(SEQ ID NO：504)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：505)、DOM7r-22(SEQ ID NO：506)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：507)、DOM7r-24(SEQ ID NO：508)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：509)、DOM7r-26(SEQ ID NO：510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：511)、DOM7r-28(SEQ ID NO：512)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：513)、DOM7r-30(SEQ ID NO：514)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：515)、DOM7r-32(SEQ ID NO：516)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：517)。
例如，结合人血清白蛋白的dAb含有的氨基酸序列与以下序列具 有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至 少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性：DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、DOM7h-3(SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、 DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO：487)、DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、DOM7r-13(SEQ ID NO：497)、DOM7r-14(SEQ ID NO：498)、DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、 DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、 DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、 DOM7h-21(SEQ ID NO：494)和DOM7h-27(SEQ ID NO：495)。
氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进 行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-2268(1990))。
在更具体的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白并具有选自以 下的氨基酸序列的Vκ dAb：DOM7h-2(SEQ ID NO：482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO：483)、DOM7h-4(SEQ ID NO：484)、DOM7h-6(SEQ ID NO：485)、DOM7h-1(SEQ ID NO：486)、DOM7h-7(SEQ ID NO：487)、 DOM7h-8(SEQ ID NO：496)、DOM7r-13(SEQ ID NO：497)和DOM7r-14 (SEQ ID NO：498)，或者具有选自以下的氨基酸序列的VH dAb： DOM7h-22(SEQ ID NO：489)、DOM7h-23(SEQ ID NO：490)、 DOM7h-24(SEQ ID NO：491)、DOM7h-25(SEQ ID NO：492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO：493)、DOM7h-21(SEQ ID NO：494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO：495)。在其它实施方案中，结合血清白蛋白的 抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白并含有任一种前述氨基酸 序列的CDR的dAb。
结合血清白蛋白的合适的骆驼科动物VHH包括公开于WO 2004/041862(Ablynx N.V.)的那些和本文的序列A(SEQ ID NO：518)、 序列B(SEQ ID NO：519)、序列C(SEQ ID NO：520)、序列D(SEQ ID NO：521)、序列E(SEQ ID NO：522)、序列F(SEQ ID NO：523)、序列G (SEQ ID NO：524)、序列H(SEQ ID NO：525)、序列I(SEQ ID NO：526)、 序列J(SEQ ID NO：527)、序列K(SEQ ID NO：528)、序列L(SEQ ID NO：529)、序列M(SEQ ID NO：530)、序列N(SEQ ID NO：531)、序列 O(SEQ ID NO：532)、序列P(SEQ ID NO：533)、序列Q(SEQ ID NO：534)。在某些实施方案中，骆驼科动物VHH结合人血清白蛋白， 并含有与SEQ ID NO：518-534中的任一种具有至少约80％、或至少约 85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进 行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-2268(1990))。
在某些实施方案中，配体含有的抗血清白蛋白dAb与本文所公开 的任何抗血清白蛋白dAb竞争性结合血清白蛋白(例如人血清白蛋 白)。
核酸分子、载体和宿主细胞
本发明还提供编码本文所述的配体(双特异性配体和多特异性配 体)的分离和/或重组核酸分子。
本文中“分离的”核酸是已从其来源的基因组DNA或细胞RNA 的核酸(例如当它存在于细胞中或核酸混合物(例如文库)中)分离出来 的核酸，并且包括通过本文所述的方法或其它合适方法而得到的核酸， 包括基本纯的核酸，通过化学合成、通过生物和化学方法组合而产生的核 酸，以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101： 297-302(1991))。
本文中“重组的”核酸是通过重组DNA方法产生的核酸，包括 通过依靠人工重组方法产生的核酸，所述方法例如聚合酶链式反应 (PCR)和/或用限制酶克隆到载体中。
在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的配体 的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与本文所公开的结合 VEGF的dAb或本文所公开的结合EGFR的dAb的氨基酸序列相比， 具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约 92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约 97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
例如，在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述 的具有VEGF结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的 氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约 94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约 99％氨基酸序列同一性：TAR15-1(SEQ ID NO：100)、TAR15-3(SEQ ID NO：101)、TAR15-4(SEQ ID NO：102)、TAR15-9(SEQ ID NO：103)、 TAR15-10(SEQ ID NO：104)、TAR15-11(SEQ ID NO：105)、TAR15-12 (SEQ ID NO：106)、TAR15-13(SEQ ID NO：107)、TAR15-14(SEQ ID NO：108)、TAR15-15(SEQ ID NO：109)、TAR15-16(SEQ ID NO：110)、 TAR15-17(SEQ ID NO：111)、TAR15-18(SEQ ID NO：112)、TAR15-19 (SEQ ID NO：113)、TAR15-20(SEQ ID NO：114)、TAR15-22(SEQ ID NO：115)、TAR15-5(SEQ ID NO：116)、TAR15-6(SEQ ID NO：117)、 TAR15-7(SEQ ID NO：118)、TAR15-8(SEQ ID NO：119)、TAR15-23 (SEQ ID NO：120)、TAR15-24(SEQ ID NO：121)、TAR15-25(SEQ ID NO：122)、TAR15-26(SEQ ID NO：123)、TAR15-27(SEQ ID NO：124)、 TAR15-29(SEQ ID NO：125)、TAR15-30(SEQ ID NO：126)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：128)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：130)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：132)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：134)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：136)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：138)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：140)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：142)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：144)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：146)、 TAR15-8-510(SEQ ID NO：147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：148)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：150)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：152)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：154)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：156)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：158)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：160)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：162)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：164)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：166)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：168)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：170)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：172)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：174)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：176)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：178)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：180)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：182)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：184)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：186)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：188)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：190)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：192)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：194)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：196)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：198)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：540)。
例如，在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述 的具有VEGF结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的 氨基酸序列与SEQ ID NO：705(TAR15-26-555)的氨基酸序列具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在其它实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有 EGFR结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸 序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至 少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至 少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基 酸序列同一性：DOM16-17(SEQ ID NO：325)、DOM16-18(SEQ ID NO：326)、DOM16-19(SEQ ID NO：327)、DOM16-20(SEQ ID NO：328)、 DOM16-21(SEQ ID NO：329)、DOM16-22(SEQ ID NO：330)、 DOM16-23(SEQ ID NO：331)、DOM16-24(SEQ ID NO：332)、 DOM16-25(SEQ ID NO：333)、DOM16-26(SEQ ID NO：334)、 DOM16-27(SEQ ID NO：335)、DOM16-28(SEQ ID NO：336)、 DOM16-29(SEQ ID NO：337)、DOM16-30(SEQ ID NO：338)、 DOM16-31(SEQ ID NO：339)、DOM16-32(SEQ ID NO：340)、 DOM16-33(SEQ ID NO：341)、DOM16-35(SEQ ID NO：342)、 DOM16-37(SEQ ID NO：343)、DOM16-38(SEQ ID NO：344)、 DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-40(SEQ ID NO：346)、 DOM16-41(SEQ ID NO：347)、DOM16-42(SEQ ID NO：348)、 DOM16-43(SEQ ID NO：349)、DOM16-44(SEQ ID NO：350)、 DOM16-45(SEQ ID NO：351)、DOM16-46(SEQ ID NO：352)、 DOM16-47(SEQ ID NO：353)、DOM16-48(SEQ ID NO：354)、 DOM16-49(SEQ ID NO：355)、DOM16-50(SEQ ID NO：356)、 DOM16-59(SEQ ID NO：357)、DOM16-60(SEQ ID NO：358)、 DOM16-61(SEQ ID NO：359)、DOM16-62(SEQ ID NO：360)、 DOM16-63(SEQ ID NO：361)、DOM16-64(SEQ ID NO：362)、 DOM16-65(SEQ ID NO：363)、DOM16-66(SEQ ID NO：364)、 DOM16-67(SEQ ID NO：365)、DOM16-68(SEQ ID NO：366)、 DOM16-69(SEQ ID NO：367)、DOM16-70(SEQ ID NO：368)、 DOM16-71(SEQ ID NO：369)、DOM16-72(SEQ ID NO：370)、 DOM16-73(SEQ ID NO：371)、DOM16-74(SEQ ID NO：372)、 DOM16-75(SEQ ID NO：373)、DOM16-76(SEQ ID NO：374)、 DOM16-77(SEQ ID NO：375)、DOM16-78(SEQ ID NO：376)、 DOM16-79(SEQ ID NO：377)、DOM16-80(SEQ ID NO：378)、 DOM16-81(SEQ ID NO：379)、DOM16-82(SEQ ID NO：380)、 DOM16-83(SEQ ID NO：381)、DOM16-84(SEQ ID NO：382)、 DOM16-85(SEQ ID NO：383)、DOM16-87(SEQ ID NO：384)、 DOM16-88(SEQ ID NO：385)、DOM16-89(SEQ ID NO：386)、 DOM16-90(SEQ ID NO：387)、DOM16-91(SEQ ID NO：388)、 DOM16-92(SEQ ID NO：389)、DOM16-94(SEQ ID NO：390)、 DOM16-95(SEQ ID NO：391)、DOM16-96(SEQ ID NO：392)、 DOM16-97(SEQ ID NO：393)、DOM16-98(SEQ ID NO：394)、 DOM16-99(SEQ ID NO：395)、DOM16-100(SEQ ID NO：396)、 DOM16-101(SEQ ID NO：397)、DOM16-102(SEQ ID NO：398)、 DOM16-103(SEQ ID NO：399)、DOM16-104(SEQ ID NO：400)、 DOM16-105(SEQ ID NO：401)、DOM16-106(SEQ ID NO：402)、 DOM16-107(SEQ ID NO：403)、DOM16-108(SEQ ID NO：404)、 DOM16-109(SEQ ID NO：405)、DOM16-110(SEQ ID NO：406)、 DOM16-111(SEQ ID NO：407)、DOM16-112(SEQ ID NO：408)、 DOM16-113(SEQ ID NO：409)、DOM16-114(SEQ ID NO：410)、 DOM16-115(SEQ ID NO：411)、DOM16-116(SEQ ID NO：412)、 DOM16-117(SEQ ID NO：413)、DOM16-118(SEQ ID NO：414)、 DOM16-119(SEQ ID NO：415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：416)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：418)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：422)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：424)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：426)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：428)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：434)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：436)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：440)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：442)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：444)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：446)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：448)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：449)、DOM16-52(SEQ ID NO：450)、NB1 (SEQ ID NO：451)、NB2(SEQ ID NO：452)、NB3(SEQ ID NO：453)、 NB4(SEQ ID NO：454)、NB5(SEQ ID NO：455)、NB6(SEQ ID NO：456)、 NB7(SEQ ID NO：457)、NB8(SEQ ID NO：458)、NB9(SEQ ID NO：459)、 NB10(SEQ ID NO：460)、NB11(SEQ ID NO：461)、NB12(SEQ ID NO：462)、NB13(SEQ ID NO：463)、NB14(SEQ ID NO：464)、NB15(SEQ ID NO：465)、NB16(SEQ ID NO：466)、NB17(SEQ ID NO：467)、NB18 (SEQ ID NO：468)、NB19(SEQ ID NO：469)、NB20(SEQ ID NO：470)、 NB21(SEQ ID NO：471)和NB22(SEQ ID NO：472)。
在其它实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有 EGFR结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸 序列与选自SEQ ID NO：623-703、727和728的氨基酸序列具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配 体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下抗VEGF dAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性： TAR15-1(SEQ ID NO：1)、TAR15-3(SEQ ID NO：2)、TAR15-4(SEQ ID NO：3)、TAR15-9(SEQ ID NO：4)、TAR15-10(SEQ ID NO：5)、TAR15-11 (SEQ ID NO：6)、TAR15-12(SEQ ID NO：7)、TAR15-13(SEQ ID NO：8)、 TAR15-14(SEQ ID NO：9)、TAR15-15(SEQ ID NO：10)、TAR15-16 (SEQ ID NO：11)、TAR15-17(SEQ ID NO：12)、TAR15-18(SEQ ID NO：13)、TAR15-19(SEQ ID NO：14)、TAR15-20(SEQ ID NO：15)、TAR 15-22(SEQ ID NO：16)、TAR15-5(SEQ ID NO：17)、TAR15-6(SEQ ID NO：18)、TAR15-7(SEQ ID NO：19)、TAR15-8(SEQ ID NO：20)、 TAR15-23(SEQ ID NO：21)、TAR15-24(SEQ ID NO：22)、TAR15-25 (SEQ ID NO：23)、TAR15-26(SEQ ID NO：24)、TAR15-27(SEQ ID NO：25)、TAR15-29(SEQ ID NO：26)、TAR15-30(SEQ ID NO：27)、 TAR15-6-500(SEQ ID NO：28)、TAR15-6-501(SEQ ID NO：29)、 TAR15-6-502(SEQ ID NO：30)、TAR15-6-503(SEQ ID NO：31)、 TAR15-6-504(SEQ ID NO：32)、TAR15-6-505(SEQ ID NO：33)、 TAR15-6-506(SEQ ID NO：34)、TAR15-6-507(SEQ ID NO：35)、 TAR15-6-508(SEQ ID NO：36)、TAR15-6-509(SEQ ID NO：37)、 TAR15-6-510(SEQ ID NO：38)、TAR15-8-500(SEQ ID NO：39)、 TAR15-8-501(SEQ ID NO：40)、TAR15-8-502(SEQ ID NO：41)、 TAR15-8-503(SEQ ID NO：42)、TAR15-8-505(SEQ ID NO：43)、 TAR15-8-506(SEQ ID NO：44)、TAR15-8-507(SEQ ID NO：45)、 TAR15-8-508(SEQ ID NO：46)、TAR15-8-509(SEQ ID NO：47)、 R15-8-510(SEQ ID NO：48)、TAR15-8-511(SEQ ID NO：49)、 TAR15-26-500(SEQ ID NO：50)、TAR15-26-501(SEQ ID NO：51)、 TAR15-26-502(SEQ ID NO：52)、TAR15-26-503(SEQ ID NO：53)、 TAR15-26-504(SEQ ID NO：54)、TAR15-26-505(SEQ ID NO：55)、 TAR15-26-506(SEQ ID NO：56)、TAR15-26-507(SEQ ID NO：57)、 TAR15-26-508(SEQ ID NO：58)、TAR15-26-509(SEQ ID NO：59)、 TAR15-26-510(SEQ ID NO：60)、TAR15-26-511(SEQ ID NO：61)、 TAR15-26-512(SEQ ID NO：62)、TAR15-26-513(SEQ ID NO：63)、 TAR15-26-514(SEQ ID NO：64)、TAR15-26-515(SEQ ID NO：65)、 TAR15-26-516(SEQ ID NO：66)、TAR15-26-517(SEQ ID NO：67)、 TAR15-26-518(SEQ ID NO：68)、TAR15-26-519(SEQ ID NO：69)、 TAR15-26-520(SEQ ID NO：70)、TAR15-26-521(SEQ ID NO：71)、 TAR15-26-522(SEQ ID NO：72)、TAR15-26-523(SEQ ID NO：73)、 TAR15-26-524(SEQ ID NO：74)、TAR15-26-525(SEQ ID NO：75)、 TAR15-26-526(SEQ ID NO：76)、TAR15-26-527(SEQ ID NO：77)、 TAR15-26-528(SEQ ID NO：78)、TAR15-26-529(SEQ ID NO：79)、 TAR15-26-530(SEQ ID NO：80)、TAR15-26-531(SEQ ID NO：81)、 TAR15-26-532(SEQ ID NO：82)、TAR15-26-533(SEQ ID NO：83)、 TAR15-26-534(SEQ ID NO：84)、TAR15-26-535(SEQ ID NO：85)、 TAR15-26-536(SEQ ID NO：86)、TAR15-26-537(SEQ ID NO：87)、 TAR15-26-538(SEQ ID NO：88)、TAR15-26-539(SEQ ID NO：89)、 TAR15-26-540(SEQ ID NO：90)、TAR15-26-541(SEQ ID NO：91)、 TAR15-26-542(SEQ ID NO：92)、TAR15-26-543(SEQ ID NO：93)、 TAR15-26-544(SEQ ID NO：94)、TAR15-26-545(SEQ ID NO：95)、 TAR15-26-546(SEQ ID NO：96)、TAR15-26-547(SEQ ID NO：97)、 TAR15-26-548(SEQ ID NO：98)、TAR15-26-549(SEQ ID NO：99)、 TAR15-21(SEQ ID NO：535)、TAR15-2(SEQ ID NO：536)、 TAR15-26-550(SEQ ID NO：537)和TAR15-26-551(SEQ ID NO：538)。 优选核苷酸序列同一性是在编码所选抗VEGF dAb的全长核苷酸序列 上进行测定的。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配 体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码TAR15-26-555 (SEQ ID NO：705)的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少 约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少 约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸 序列同一性。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配 体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下的抗 VEGF dAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、 至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、 至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一 性：DOM16-17(SEQ ID NO：199)、DOM16-18(SEQ ID NO：200)、 DOM16-19(SEQ ID NO：201)、DOM16-20(SEQ ID NO：202)、 DOM16-21(SEQ ID NO：203)、DOM16-22(SEQ ID NO：204)、 DOM16-23(SEQ ID NO：205)、DOM16-24(SEQ ID NO：206)、 DOM16-25(SEQ ID NO：207)、DOM16-26(SEQ ID NO：208)、 DOM16-27(SEQ ID NO：209)、DOM16-28(SEQ ID NO：210)、 DOM16-29(SEQ ID NO：211)、DOM16-30(SEQ ID NO：212)、 DOM16-31(SEQ ID NO：213)、DOM16-32(SEQ ID NO：214)、 DOM16-33(SEQ ID NO：215)、DOM16-35(SEQ ID NO：216)、 DOM16-37(SEQ ID NO：217)、DOM16-38(SEQ ID NO：218)、 DOM16-39(SEQ ID NO：219)、DOM16-40(SEQ ID NO：220)、 DOM16-41(SEQ ID NO：221)、DOM16-42(SEQ ID NO：222)、 DOM16-43(SEQ ID NO：223)、DOM16-44(SEQ ID NO：224)、 DOM16-45(SEQ ID NO：225)、DOM16-46(SEQ ID NO：226)、 DOM16-47(SEQ ID NO：227)、DOM16-48(SEQ ID NO：228)、 DOM16-49(SEQ ID NO：229)、DOM16-50(SEQ ID NO：230)、 DOM16-59(SEQ ID NO：231)、DOM16-60(SEQ ID NO：232)、 DOM16-61(SEQ ID NO：233)、DOM16-62(SEQ ID NO：234)、 DOM16-63(SEQ ID NO：235)、DOM16-64(SEQ ID NO：236)、 DOM16-65(SEQ ID NO：237)、DOM16-66(SEQ ID NO：238)、 DOM16-67(SEQ ID NO：239)、DOM16-68(SEQ ID NO：240)、 DOM16-69(SEQ ID NO：241)、DOM16-70(SEQ ID NO：242)、 DOM16-71(SEQ ID NO：243)、DOM16-72(SEQ ID NO：244)、 DOM16-73(SEQ ID NO：245)、DOM16-74(SEQ ID NO：246)、 DOM16-75(SEQ ID NO：247)、DOM16-76(SEQ ID NO：248)、 DOM16-77(SEQ ID NO：249)、DOM16-78(SEQ ID NO：250)、 DOM16-79(SEQ ID NO：251)、DOM16-80(SEQ ID NO：252)、 DOM16-81(SEQ ID NO：253)、DOM16-82(SEQ ID NO：254)、 DOM16-83(SEQ ID NO：255)、DOM16-84(SEQ ID NO：256)、 DOM16-85(SEQ ID NO：257)、DOM16-87(SEQ ID NO：258)、 DOM16-88(SEQ ID NO：259)、DOM16-89(SEQ ID NO：260)、 DOM16-90(SEQ ID NO：261)、DOM16-91(SEQ ID NO：262)、 DOM16-92(SEQ ID NO：263)、DOM16-94(SEQ ID NO：264)、 DOM16-95(SEQ ID NO：265)、DOM16-96(SEQ ID NO：266)、 DOM16-97(SEQ ID NO：267)、DOM16-98(SEQ ID NO：268)、 DOM16-99(SEQ ID NO：269)、DOM16-100(SEQ ID NO：270)、 DOM16-101(SEQ ID NO：271)、DOM16-102(SEQ ID NO：272)、 DOM16-103(SEQ ID NO：273)、DOM16-104(SEQ ID NO：274)、 DOM16-105(SEQ ID NO：275)、DOM16-106(SEQ ID NO：276)、 DOM16-107(SEQ ID NO：277)、DOM16-108(SEQ ID NO：278)、 DOM16-109(SEQ ID NO：279)、DOM16-110(SEQ ID NO：280)、 DOM16-111(SEQ ID NO：281)、DOM16-112(SEQ ID NO：282)、 DOM16-113(SEQ ID NO：283)、DOM16-114(SEQ ID NO：284)、 DOM16-115(SEQ ID NO：285)、DOM16-116(SEQ ID NO：286)、 DOM16-117(SEQ ID NO：287)、DOM16-118(SEQ ID NO：288)、 DOM16-119(SEQ ID NO：289)、DOM16-39-6(SEQ ID NO：290)、 DOM16-39-8(SEQ ID NO：291)、DOM16-39-34(SEQ ID NO：292)、 DOM16-39-48(SEQ ID NO：293)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：294)、 DOM16-39-90(SEQ ID NO：295)、DOM16-39-96(SEQ ID NO：296)、 DOM16-39-100(SEQ ID NO：297)、DOM16-39-101(SEQ ID NO：298)、 DOM16-39-102(SEQ ID NO：299)、DOM16-39-103(SEQ ID NO：300)、 DOM16-39-104(SEQ ID NO：301)、DOM16-39-105(SEQ ID NO：302)、 DOM16-39-106(SEQ ID NO：303)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：304)、 DOM16-39-108(SEQ ID NO：305)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：306)、 DOM16-39-110(SEQ ID NO：307)、DOM16-39-111(SEQ ID NO：308)、 DOM16-39-112(SEQ ID NO：309)、DOM16-39-113(SEQ ID NO：310)、 DOM16-39-114(SEQ ID NO：311)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：312)、 DOM16-39-116(SEQ ID NO：313)、DOM16-39-117(SEQ ID NO：314)、 DOM16-39-200(SEQ ID NO：315)、DOM16-39-201(SEQ ID NO：316)、 DOM16-39-202(SEQ ID NO：317)、DOM16-39-203(SEQ ID NO：318)、 DOM16-39-204(SEQ ID NO：319)、DOM16-39-205(SEQ ID NO：320)、 DOM16-39-206(SEQ ID NO：321)、DOM16-39-207(SEQ ID NO：322)、 DOM16-39-209(SEQ ID NO：323)和DOM16-52(SEQ ID NO：324)。优 选核苷酸序列同一性是在编码所选抗EGFR dAb的全长核苷酸序列上 进行测定的。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配 体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下的抗EGFR dAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性： SEQ ID NO：623-703、727和728。
本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方 案中，载体是含有一个或多个与本发明的重组核酸有效连接的表达控 制元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子 或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达控制 元件、宿主细胞和生产本发明的重组宿主细胞的方法在本领域众所周 知，本文进一步描述了实例。
合适的表达载体可包含许多元件，例如复制起点、选择标记基因、 一个或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、 终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控 制元件和信号序列如果存在的话，则可由载体或其它来源提供。例如， 编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于指导表达。
可提供用于在所需宿主细胞中表达的启动子。启动子可为组成型 的或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸 有效连接，使得其指导核酸的转录。可获得多种适于原核宿主的启动 子(例如大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和适于真核宿主的启动 子(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序 列启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标 记，就复制型表达载体而言，还包含复制起点。赋予抗生素或药物抗 性的基因编码产物是常用的选择标记，可用于原核细胞(例如内酰胺酶 基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如 新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基 因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨蝶呤在多种宿主中进行选 择。编码宿主的营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、 HIS3)经常在酵母中用作选择标记。还考虑了病毒(例如杆状病毒)或噬 菌体载体以及能够整合入宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒 载体)的应用。适于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞 (果蝇Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、 巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的表达载 体在本领域众所周知。
合适的宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，例 如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉 (Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其它 低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞，例如昆虫细胞(例如 果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O′Connor))、哺 乳动物细胞(例如COS细胞，例如COS-1(ATCC保藏号CRL-1650) 和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO(例如ATCC保藏号 CRL-9096，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci. USA，77(7)：4216-4220(1980)))、293(ATCC保藏号CRL-1573)、HeLa (ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号CCL-70)、WOP(Dailey，L. 等，J.Virol，54：739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993))、NS0细胞、SP2/0、HuT 78细 胞等，或植物细胞(例如烟草细胞)。(参见例如Ausubel，F.M.等编辑， Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.(1993))。在某些实施方案中，宿主细胞为 分离的宿主细胞，不是多细胞生物(例如植物或动物)的组成部分。在 优选的实施方案中，宿主细胞为非人宿主细胞。
本发明还提供生产本发明配体(例如双特异性配体、多特异性配 体)的方法，该方法包括将包含本发明重组核酸的重组宿主细胞在适于 表达重组核酸的条件下进行培养，由此表达重组核酸并产生配体。在 某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。
基于免疫球蛋白的配体的制备
本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)可按照抗体工 程领域中用于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它的工程抗体分子的先 前建立的技术来制备。抗体的制备技术例如描述于以下综述及其中所 引用的参考文献：Winter & Milstein，(1991)Nature 349：293-299； Pluckthun(1992)Immunologica lReviews 130：151-188；Wright等，(1992) Crit.Rev.Immunol.12：125-168；Holliger，P.& Winter，G.(1993)Curr. Opin.Biotechnol.4，446-449；Carter等(1995)J.Hematother.4，463-470； Chester，K.A.& Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechnol.13，294-300； Hoogenboom，H.R.(1997)Nat.Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997) Nat.Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.& Pack，P.(1997) Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.& Merchant，A.M.(1997)Curr. Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.& Winter，G.(1997)Cancer Imm unol.Immunother.45，128-130。
适用于选择具有所需特异性的抗体可变区的技术采用本领域已 知的文库和选择程序。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库 (Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan等(1996)Nature Biotech.，14：309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库 (Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13： 692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif等(1995)J.Mol. Biol.，248：97)通常采用PCR通过克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR 过程中的错误可导致高度随机化。可单独地(在此情况下直接选择单域 结合)或一起选择针对靶抗原或表位的VH和/或VL文库。
文库载体系统
适用于本发明的各种选择系统是本领域已知的。这些系统的实例 如下所述。
可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两 者先前都有描述(Huse等(1989)Science，246：1275；Caton和Koprowski (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，88：2432)，可用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选 多达106个不同文库成员，但是它们确实不适合筛选更大数量(大于106 个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使所连接 的核酸能够表达为多肽。本文所用的选择展示系统是允许通过合适展 示方法选择结合通用配体和/或靶配体的各个文库成员的系统。
从大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌 体展示技术为代表。这些将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系 统(Scott和Smith(1990)Science，249：386)，已经证明可用于产生抗体 片段(及编码它们的核苷酸序列)的文库，用于体外选择和扩增结合靶 抗原的特异性抗体片段(McCafferty等，WO 92/01047)。编码可变区的 核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，所述前导信号可指导 它们到达大肠杆菌的壁膜间隙，结果所得抗体片段展示在噬菌体表 面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片 段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的优势 在于：因为它们是生物系统，所以可以仅通过将含有所选文库成员的 噬菌体在细菌细胞中培养来扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽 文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表 达和其后的遗传操作相对直接。
噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法在本领域众 所周知(McCafferty等(1990)Nature，348：552；Kang等(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等(1991)Nature，352：624； Lowman等(1991)Biochemistry，30：10832；Burton等(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.， 19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling等(1991) Gene，104：147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同 上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks等，1992，J. Biol.Chem.，267：16007；Lerner等(1992)Science，258：1313，所述文献 通过引用结合到本文中)。
一个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston等， 1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary等(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty等(1990)，出处 同上；Clackson等(1991)Nature，352：624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.， 222：581；Chiswell等(1992)Trends Biotechnol.，10：80；Marks等(1992) J.Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施 方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见 WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)以及 WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。
产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外合 成文库成员。在一个方法中，通过交替多轮的针对靶的选择和PCR扩 增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249：505；Ellington 和Szostak(1990)Nature，346：818)。一项类似技术可用于鉴定结合预 定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.， 18：3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和 WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生 大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步描 述于WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、 WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统，例如 那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多核 糖体来展示多肽，用于选择。
还有一类技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其 基因产物联系起来。例如，其中可在由油包水乳剂形成的微囊中选择 编码所需基因产物的核酸的选择系统描述于WO99/02671、 WO00/40712以及Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)， 652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微囊中区室化， 然后在微囊内转录和/或翻译，以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋 白质)。随后分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通 过多种手段检测所需活性而选择目标基因产物。
文库构建
用于选择的文库可以采用例如以上提出的本领域已知技术构建， 或者可以从商业来源购买。可用于本发明的文库描述于例如 WO99/20749。一旦选定载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸 序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子 内产生多样性；或者，可以在诱变和另外的多轮选择进行之前如上所 述表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化 多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR (Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol，155：335，所述文献通过引 用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它采用由热稳定的DNA 依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，来扩增目标靶序列。各种 抗体文库的构建已论述于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12， 433-55及其中引用的参考文献。
用模板DNA(至少1fg；更有用的为1-1000ng)和至少25pmol 寡核苷酸引物进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好 采用较大量引物，因为各序列仅由少量引物库分子作为代表，而且数 量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括：2μl DNA、 25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶 (Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水，至总体积为25μl。覆盖矿 物油，用可编程热循环仪进行PCR。PCR循环中各步骤的长度和温度 以及循环次数，按照实际所需的严格性来调整。退火温度和时间由预 计引物与模板退火的效率和可耐受的错配程度这二者而定；显然，当 核酸分子同时扩增和诱变时，错配是必需的，至少在合成的第一轮。 优化引物退火条件的严格性的能力完全属于本领域中等技术人员的 知识范围。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始变性 通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循环由变 性(94-99℃15秒至1分钟)、退火(如上所述确定的温度；1-2分钟)和 延伸(72℃1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72℃4 分钟，可后接于4℃的不确定(0-24小时)步骤。
组合单可变区
本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方 法组合，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多 肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)Science 242：423-426)。有 关合适接头的讨论参见Bird等，Science 242，423-426；Hudson等， Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat. Acad.Sci.USA，85，5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互 作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、 5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993) Proc Nat Acad Sci USA 90：6444-6448)。在一个实施方案中，所用的接 头不是免疫球蛋白铰链区。
可变区可采用不用接头的方法而组合。例如，可以开发二硫桥的 用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供 的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)Protein Eng.，7：697-704)，或者通过可变区之间界面的重构以改善“适合性 (fit)”，因而改善相互作用的稳定性(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7： 617-621；Zhu等(1997)Protein Science 6：781-788)。如果适当的话，可 以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体VH区的其它 技术。
配体特征
双特异性配体与细胞的结合或者每个结合域与每个特异性靶的 结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。 在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定 结合。可以按照任何合适方法进行噬菌体ELISA：示例性方案如下。
可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结 合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA 筛选来自这些群体中单个受感染细菌菌落的噬菌体，以鉴定“单克隆” 噬菌体抗体。还需要筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可 通过ELISA、采用例如针对C-端或N-端标记的试剂来进行(参见例如 Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的参考文 献。
可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim 等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776) 或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。
配体结构
在例如采用本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出每个 可变区的情况下，这些可变区包含通用构架区，使得它们可以被本文 定义的特异性通用双特异性配体所识别。通用构架、通用配体等的用 途描述于WO 99/20749。
当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环 内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以 便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的， 参见例如Stemmer，1994，Nature 370：389-391和美国专利号6,297,053， 所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法也是本领域技术人 员众所周知的。
一般而言，可以按照标准实验室手册(例如Sambrook等(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)的 陈述，构建并操作用于选择、制备和形成双特异性配体所需的核酸分 子和载体构建体。
本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。本文所用的载 体是指这样的分离元件：所述元件用于将异源DNA引入用于其表达 和/或复制的细胞中。选择或构建以及随后使用所述载体的方法是本领 域普通技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、 噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单的克隆和诱 变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所 需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更 大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同 的功能性组件，通常包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少 一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或 多个以下元件：增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列，每 个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明的双特异性配体的基 因有效连接。
克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主 细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于 宿主染色体DNA而复制，并且包含复制起点或自主复制序列。这类 序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的 复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而 各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载 体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些 起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。
最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该 基因编码在选择培养基中培养的转化宿主细胞存活或生长所必需的 蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在 培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质赋予抗生素抗性和其它 毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性，补充 营养缺陷，或提供生长培养基中所没有的关键营养物。
因为编码本发明的双特异性配体的载体的复制在大肠杆菌中最 便利进行，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素 抗性的β-内酰胺酶基因。这些选择标记可以得自大肠杆菌质粒，例如 pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。
表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目 标编码序列有效连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语 “有效连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起 作用。控制序列与编码序列“有效连接”是指连接方式使得在与控制 序列相容的条件下可实现编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系 统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动 子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列有效连接的SD序 列(Shine-Delgarno sequence)。
优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达 载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表 达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行 选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使 用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列 包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆 菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA) 的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的 (Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同 上)。简而言之，该载体含有β-内酰胺酶基因(以便赋予噬菌粒选择性) 和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端至C端)：pelB 前导序列(将表达多肽引导到壁膜间隙)、多克隆位点(用于克隆核苷酸 形式的文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多 个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑 制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进行复制， 但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些 在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
编码本发明的双特异性配体的载体的构建采用常规连接技术。分 离的载体或DNA片段被切割、修饰并重新连接成产生所需载体需要 的形式。如有需要，可以用已知方式进行分析，以证实所构建的载体 中存在正确序列。适于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引 入宿主细胞以及进行评价表达和功能的分析的方法是本领域技术人 员已知的。通过常规方法，例如DNA或RNA印迹分析、蛋白质印迹、 DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核 酸或蛋白质分子的测序分析，检测样品中存在的基因序列，或定量其 扩增和/或表达。如有需要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这 些方法。
骨架
骨架可以基于免疫球蛋白分子，或者可以是如上所述来源的非免 疫球蛋白。双特异性配体的每个区都可以为不同骨架。如本文定义的 优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架：至少包含 以下部分的免疫球蛋白分子：(i)抗体的CL(κ或λ亚类)区；或(ii)抗体 重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子； 包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何 (ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的 各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如 Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是 详尽而无遗漏的。
蛋白质支架
各结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与 一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3 个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架：基于免疫球蛋 白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于 CTLA4的支架、基于伴侣分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋 白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可 以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的
用于构建配体的支架
主链构象的选择
免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管 抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体学结构已 揭示，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、 L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J. Mol.Biol.，196：901；Chothia等(1989)Nature，342：877)。因此，分析 环长度和关键残基能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、 L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227：799； Tomlinson等(1995)EMBO J.，14：4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.， 264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D 区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及 抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否或残基种类 (Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai等(1996)FEBS Letters， 399：1)。
可设计配体和/或结构域文库，其中已选择出某些环长度和关键残 基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然 存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机 会降至最低。种系V基因区段用作一个合适的基本构架，用于构建抗 体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使 得少量功能性成员可具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功 能。
正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以 预测基于双特异性配体序列的主链构象并选择不影响正则结构的用 于多样化的残基。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结 构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用4 或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在Vκ 区，不同正则结构就可组合产生一系列不同的主链构象。假定Vλ区 为L1、L2和L3环编码不同系列的正则结构，且Vκ区和Vλ区可与任 何VH区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所 观察到的正则结构组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的 产生对产生广泛范围的结合特异性来说可能是必不可少的。然而，通 过构建基于一种已知主链构象的抗体文库，已经发现，与预期相反， 主链构象的多样性并非是产生足以靶向几乎所有抗原的多样性所必 需的。甚至更令人吃惊的是，该单一主链构象不一定是共有结构，共 有结构是可以用作整个文库基础的一种天然构象。因此，在优选方面， 本发明的配体具有一种已知主链构象。
所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子 中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用某种构象时，该构象 是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域 的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环的主 链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，则可选择最 接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因 区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然 界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达 的。
在设计配体(例如ds-dAb)或其文库时，可以单独考虑6个抗原结 合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和 L3，选择被20％至100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。 通常观察到发生率在35％以上(即介于35％和100％之间)、理想地在 50％以上乃至65％以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优 先选择在确实展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个 环来说，选择天然库中最常观察到的构象。在人抗体中，各环最常见 的正则结构(CS)如下：H1-CS 1(表达库的79％)、H2-CS 3(46％)、 L1-Vκ的CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、L3-Vκ的CS 1(36％)(计算 假定κ:λ的比例为70:30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.，48：133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基 94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991) Sequences of proteins of immunological interest，美国健康和人类服务 部)看来是最常见的。EMBL数据文库中至少有16个人类抗体序列具 有构成该构象所需的H3长度和关键残基，并且在蛋白质数据库中至 少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和1tet)。最常表达的种 系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、 Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合 适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象 的文库的基础。
或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来 选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单 一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5 或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所 选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中最常观察 到的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2和L3五个 抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合 最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。
正则序列的多样化
如果具有所选几种已知的主链构象或者优选单一已知主链构象， 可以通过改变分子的每个结合位点，构建本发明的双特异性配体(例如 ds-dAb)或本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能多样性的 库。这表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的 多样性，使得它们能够提供一系列活性。
所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产 生的。可以随机或优选选择要改变的位置。然后，可以如下达到变异： 通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的) 所取代)，产生数量非常大的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的 限定亚类来取代残余氨基酸，产生数目更有限的变异体。
已经报道了多种用于引入这样的多样性的方法。易错PCR (Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226：889)、化学诱变(Deng等(1994)J. Biol.Chem.，269：9533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260： 359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变 的方法也是本领域众所周知的，包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷 酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产 生了一些合成抗体文库。使结合人破伤风类毒素的Fab的H3区随机 化，以便产生一系列新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，89：4457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基 因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter (1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，89：4457；Nissim等(1994)EMBOJ.，13：692；Griffiths等(1994) EMBO J.，13：3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。这样的多 样化已延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996) Nature Med.，2：100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13：475； Morphosys，WO97/08320，出处同上)。
因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而 对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过 使用现有的转化技术乃至使用无细胞系统来产生代表所有可能组合 的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6 x 1010 个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等 (1994)，出处同上)。
优选地，只有直接参与产生或修饰双特异性配体分子的每个结构 域所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，每个结构域的 功能是要结合靶标的，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避 免改变对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。 正则序列在用于抗体域时的多样化
就基于抗体的配体(例如ds-dAb)而言，每个靶的结合位点都是最 常见的抗原结合位点。因此，优选只有在抗原结合位点的那些残基才 改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率 抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的 抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法 应当已经使相应互补决定区(CDR1)(如Kabat等(1991，出处同上)定义) 中的所有残基多样化，与本发明所用的文库中多样化的两个相比有约 七个残基。这显示了产生一系列抗原结合特异性所需的功能多样性的 显著改善。
在自然界，抗体多样性是两个过程的结果：种系V、D和J基因 区段的体细胞重组，产生幼稚(naive)初级库(所谓的种系和连接多样 性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。人类抗体序列的分析已表 明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则 将多样性扩散到抗原结合位点周围的区域，而这些区域在初级库中是 高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。此互补性 可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特 有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结 合位点的残基的亚类。如有需要，在选择期间的不同时期，改变靶结 合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。
就抗体库而言，可产生起始“幼稚”库(initial“naive”repertoire)， 其中抗原结合位点的某些而不是全部的残基出现多样化。在这种情况 下，本文所用的术语“幼稚(naive)”是指没有预定靶标的抗体分子。 这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(胎儿和新生儿个体就是 这种情况)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统 尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对一系列抗原或表位来选 择该库。如有必要，还可在起始库中被多样化的区域之外引入其它多 样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。
用于构建其中抗原结合位点中的某些或所有残基都已改变的双 特异性配体的结合域幼稚库是本领域已知的。(参见WO 2004/058821、 WO 2004/003019和WO 03/002609)。“初级”文库模拟天然初级库， 其多样性限于抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具 有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样 性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、 H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、 L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于重组过程中多样化 的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的。这些多样化的残基包 括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、 L32、L34和L96。已知适于这些文库多样性的以上列出的所有残基都 接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位 点中并非所有残基都改变，在选择当中，通过改变剩余残基而掺入另 外的多样性，如果需要这样做的话。对本领域技术人员显而易见的是， 任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以 用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。
在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水 平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨 基酸(所有20种或其亚类)可以在该位置掺入。采用IUPAC命名法， 最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。 优选使用NNK密码子，以便引入所需多样性。也可以使用达到相同 末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生另外的终 止密码子TGA和TAA。
人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸 残基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置 的氨基酸组成，则超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们 是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨 酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种针对可提供主链柔性的亲 水性残基和小残基的偏倚可能反映了倾向于结合广泛范围的抗原或 表位的表面进化，并且可能有助于解释初级库中所需的抗体混杂。
因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基 酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对 一系列靶抗原选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏 倚，易于用于任何多肽库。有多种方法用于在有待改变的位置上使氨 基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，其中 优选的方法因易于合成而采用常规简并密码子。通过比较由简并密码 子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、 三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码 子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，即使 用IUPAC命名法分别为DVT、DVC和DVY，就是最接近所需氨基 酸分布型的密码子：它们编码22％的丝氨酸以及11％的酪氨酸、天冬 酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选 的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。
治疗和诊断组合物及其用途
本发明提供包含本发明的配体和药学上可接受的载体、稀释剂或 赋形剂的组合物，以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法。 本发明方法的配体可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。
本发明配体的治疗和预防用途包括将本发明配体给予受体哺乳 动物，例如人。这样的配体以高亲和力和/或亲合力结合靶。在某些实 施方案中，例如IgG样配体，配体可通过例如抗体依赖性细胞毒性， 允许细胞毒性细胞募集以介导对肿瘤细胞系的杀伤。
优选将至少90-95％同质性(homogeneity)的大致纯的配体给予哺 乳动物，最优选98-99％以上同质性供药用，尤其是当哺乳动物是人时。 一旦部分纯化或纯化至所需同质性，配体就可用于诊断或治疗(包括离 体)或用于开发和实施测定方法、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis， (1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press， NY)。
例如，本发明的配体通常可用于预防、抑制或治疗疾病状态。例 如，可以给予配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病、变应性超敏 反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括但不限于I 型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关 节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy)(例如强直性 脊柱炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn’s disease)、 溃疡性结肠炎)、重症肌无力和贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome))、 银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。
配体可用于治疗这样的感染性疾病：其中被感染因子感染的细胞 包含的细胞表面EGFR水平要比未感染细胞的高，或者包含的一个或 多个细胞表面靶标在未感染细胞上并不存在，例如由感染因子(例如细 菌、病毒)编码的蛋白质。
能够结合EGFR的本发明配体可被表达EGFR的细胞内化(例如 胞吞)，并可在胞内递送治疗剂(例如毒素)(例如递送结合胞内靶的 dAb)。另外，配体提供了每个能够特异性结合胞内靶的结合域(例如 dAb单体)可递送到胞内环境的手段。该策略需要例如具有能使其保留 在细胞内的功能的物理性质的结合域。或者，如果最终目的地胞内区 室正在氧化，则良好折叠的配体可能不一定是无二硫化物的。
在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病之前给予保护性组合 物。“抑制”指在诱发事件后但在疾病有临床表现前给予组合物。“治 疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。治疗包括改善与疾病 相关的症状，还预防或延迟疾病的发作，以及减轻疾病症状的严重性 或减少频率。
术语“癌症”是指哺乳动物中通常以不受调节的细胞增殖或存活 为特征的病理状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、 肉瘤和白血病以及淋巴系统恶性肿瘤。更具体地说，癌症的实例包括 鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞 肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠 癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胆 囊癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、多发性骨髓 瘤、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、子宫内膜癌或子宫 癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、 阴茎癌、头颈部癌等。以在癌细胞表面表达EGFR为特征的癌症(表达 EGFR的癌症)包括例如膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(例 如非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊 癌。
可用于评价本发明配体预防、治疗或抑制疾病(例如癌症)的功效 的动物模型系统是可获得的。合适的癌症模型包括例如人类癌症在动 物模型中的异种移植和原位移植模型，例如SCID-hu骨髓瘤模型 (Epstein J.和Yaccoby，S.，Methods Mol.Med.113：183-90(2005)， Tassone P等，Clin Cancer Res.11(11)：4251-8(2005))、人肺癌的小鼠模 型(例如Meuwissen R和Berns A，Genes Dev.19(6)：643-64(2005))，以 及转移癌的小鼠模型(例如Kubota T.，J Cell Biochem.56(1)：4-8 (1994))。
通常，纯化形式的本发明配体可与药理上合适的载体一起使用。 通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和 /或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和 氯化钠以及乳酸化林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的 话，则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，这些增稠剂 例如为羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林 格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。
可以单独给予的组合物形式或者与其它药物一起使用本发明的 配体。配体可与一种或多种其它治疗药或活性剂一起给予和/或配制。 当配体与其它治疗药一起给予时，配体可以在给予其它药物之前、同 时或之后给予。通常，配体和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。 可给予本发明配体或与本发明配体一起配制的其它药物包括例如各 种免疫治疗药物，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、抗生素、 抗真菌药、抗病毒药和免疫毒素。例如，当给予拮抗剂以预防、抑制 或治疗肺部炎症或呼吸疾病时，其可协同给予磷酸二酯酶抑制剂(例如 磷酸二酯酶4抑制剂)、支气管扩张药(例如β2-激动剂、抗胆碱能药、 茶碱)、短效β-激动剂(例如舒喘灵(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、 班布特罗、非诺特罗、异他林(isoetherine)、异丙肾上腺素、左沙丁胺 醇、奥西那林、吡布特罗、特布他林和甲磺酸比托特罗吸入剂 (tornlate))、长效β-激动剂(例如福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能 药(例如异丙托溴铵和氧托溴铵)、长效抗胆碱能药(例如噻托品)、茶碱 (例如短效剂型、长效剂型)、吸入类固醇(例如倍可松(beclomethasone)、 倍氯米松(beclometasone)、布地奈德、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和曲 安西龙)、口服类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松龙、强的松龙(prednisolon) 和泼尼松)、短效β-激动剂和抗胆碱能药的组合(例如舒喘灵/沙丁胺醇/ 异丙阿托品(ipratopium)和非诺特罗/异丙阿托品)、长效β-激动剂和吸 入类固醇的组合(例如沙美特罗/氟替卡松和福莫特罗/布地奈德)以及 粘液溶解药(例如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新(bromheksin)、羧 甲司坦、愈创甘油醚(guiafenesin)和碘化甘油)一起给予。
本发明的配体可与各种各样合适的共治疗剂一起给予(例如治疗 癌症、炎性疾病或其它疾病)，所述共治疗剂包括细胞因子、止痛药/ 退热药、止吐药和化疗药。其它合适的共治疗药包括免疫抑制药，选 自环孢菌素、硫唑嘌呤、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、皮质类固醇、 甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立 宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司 (FK-506)、OKT3和抗胸腺细胞球蛋白；抗炎药，选自阿司匹林、其 它水杨酸盐、甾体类药物、NSAID(非甾体类抗炎药)、Cox-2抑制剂 和DMARD(疾病缓解抗风湿药)；抗银屑病药，选自煤焦油、维生素 A、地蒽酚、卡泊三烯(calcipotrien)、tarazotene、皮质类固醇、甲氨蝶 呤、类视色素、环孢菌素、依那西普、阿来西普、依法珠单抗 (efaluzimab)、6-硫鸟嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、他克莫司(FK-506)和羟 基脲。
细胞因子包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子 样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细 胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素 -6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、生长因子(包括但不限于例 如生长激素、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、粒细胞集落 刺激因子(GCSF)、血小板衍生生长因子(PGDF)、表皮生长因子(EGF)) 和用于刺激红细胞生成的药物，例如重组人促红细胞生成素(Epoetin alfa)、EPO、激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺、他莫昔芬、醋酸 亮丙瑞林(LUPRON))和类固醇药(例如地塞米松、类视色素、倍他米松、 氢化可的松、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、 雌激素、睾酮、孕酮)。
镇痛药/退热药可包括但不限于阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、 萘普生钠、盐酸丁丙诺啡、盐酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬、盐酸度冷丁、 氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、双氢可待因酒石酸 氢盐、盐酸喷他佐辛、氢可酮酒石酸氢盐、酒石酸左啡诺、二氟尼柳、 水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、酒石酸布托啡诺、水杨酸 胆碱、布他比妥、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、左美丙嗪、盐 酸桂美君、甲丙氨酯等。
还可以共给予止吐药，以预防或治疗恶心和呕吐，例如合适的止 吐药包括盐酸美克洛嗪、大麻隆、丙氯拉嗪、茶苯海明、盐酸异丙嗪、 硫乙拉嗪、东莨菪碱等。
化疗药在本文中作为术语使用时包括但不限于例如抗微管药物， 例如泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)；烷化剂，例如环磷酰胺、卡莫 司汀、洛莫司汀和苯丁酸氮芥；细胞毒性类抗生素，例如放线菌素D、 多柔比星、丝裂霉素C和博来霉素；抗代谢药，例如阿糖胞苷、吉西 他滨、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶；抗有丝分裂药，例如长春花属生物碱， 例如依托泊苷、长春碱和长春新碱；以及其它化疗药，例如顺铂、达 卡巴嗪、丙卡巴肼和羟基脲，以及它们的组合。
本发明的配体可连同其它治疗剂一起用于治疗癌症。例如，本发 明的配体可连同化疗药或包含(至少一种)化疗药的抗肿瘤组合物一起 给予。在这样的治疗方案中，最好可以减少为达到有效而必需给予的 化疗药的量。因此，本发明提供治疗癌症的方法，包括给予有需要的 患者治疗有效量的本发明配体和化疗药，其中化疗药以低剂量给予。 一般来说，与本发明配体合用的化疗药的量是正常给予患者的化疗药 单用剂量的约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或 约30％、或约20％、或约10％以下。因此，在化疗药引起有害的或不 需要的副作用(在较低剂量时可被降低或消除)时联合疗法尤其有用。
药物组合物可包括多种细胞毒性剂或其它药物连同本发明配体 乃至具有不同特异性的本发明配体组合(例如使用不同靶抗原或表位 选择的配体)的“合剂”，无论它们是否在给予前混合。
本发明药物组合物的给药途径可以为任何合适途径，例如本领域 普通技术人员公知的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来 说，可以采用标准技术，将本发明配体给予任何患者。可通过任何合 适方式给予，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、鞘内、关 节内、通过肺部途径，或者还合适地直接输注(例如用导管)。给药剂 量和频次将取决于患者年龄、性别和状况、同时给予的其它药物、禁 忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如通过 肺部给药(例如鼻内给药)局部给予至肺部，或者局部直接注射入肿瘤 中)或系统给药。
可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。已 表明该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知的 冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致不同 程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比IgG抗 体活性损失更高)，可能需要调高使用水平以便补偿。
可以给予含有配体的组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在某 些治疗应用中，足以达到至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或某些其 它可检测参数的所选细胞群体的用量，定义为“治疗有效量”。尽管 达到该剂量所需的用量将取决于疾病严重程度和患者的一般健康状 况，但是通常范围为0.005-5.0mg配体/kg体重，更常用的剂量为 0.05-2.0mg/kg/剂。对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含 有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如 维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合 适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防疾病。当给予配体治疗、抑制 或预防疾病时，可以例如约10μg/kg至约80mg/kg、约100μg/kg至约 80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、约1mg/kg 至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、 约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约 10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg 至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约 5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg 的剂量最多给予每天4次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月 一次或每两月一次。在具体的实施方案中，以约10μg/kg至约 10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约 3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、 约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量每两周一次或每月一次给予双特异性 配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病。
在具体的实施方案中，本发明的配体以提供体内饱和EGFR或所 需血清浓度的剂量给药。熟练医师可确定达到饱和的合适给药，例如 通过滴定配体和监测表达EGFR的细胞上的自由结合位点的数量或配 体的血清浓度。包括给予治疗剂以实现目标饱和或所需的药物血清浓 度的治疗方案是本领域常见的，尤其是在肿瘤学领域。
用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是：一种 或多种症状相对于治疗前存在的所述症状或者相对于未用所述组合 物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)中的所述症状被减轻 (例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点)。尽管症状随所 针对的疾病或障碍而明显不同，但是可以由一般熟练的临床医生或技 术人员进行测定。这些症状例如可如下测定：监测疾病或障碍的一种 或多种生化指标水平(例如与疾病相关的酶或代谢物水平，受累细胞数 量等)、监测身体表现(例如炎症、肿瘤大小等)或者可接受的临床评价 量表，例如扩展残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale)(用于 多发性硬化)、Irvine炎性肠病问卷调查表(32点评价表，评价有关肠 功能、全身症状、社交功能和情感状态的生活质量—评分范围为 32-224，评分越高表明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表 或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例 如一天以上，优选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下 降达一个点或多个点，就表明是“有效”治疗。同样，如果一种或多 种症状的发作或严重程度相对于未经本文所述的组合物治疗的类似 个体(人或动物模型)的所述症状被延迟、减少或消除，则用所述组合 物进行预防就是“有效”的。
含有本发明配体的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、 失活、杀伤或去除哺乳动物体内的所选靶细胞群体。另外，本文所述 的配体和所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽靶细胞群体 或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来 自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结 合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳 动物体内。
在一个实施方案中，本发明涉及将抗血管生成治疗(抗VEGF治 疗)递送到含有表达或过量表达EGFR细胞的部位的方法，该方法包括 给予需要的患者有效量的具有VEGF和EGFR结合特异性的配体。
本发明也涉及具有VEGF和EGFR结合特异性的配体在将抗血管 生成治疗(抗VEGF治疗)递送到含有表达或过量表达EGFR细胞的部 位的用途。本发明也涉及具有VEGF和EGFR结合特异性的配体在制 备用于将抗血管生成治疗(抗VEGF治疗)递送到含有表达或过量表达 EGFR细胞的部位的药物中的用途，或者制备在含有过量表达EGFR 的细胞的部位抑制血管生成的药物中的用途。
在具体实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给 予有需要的患者治疗有效量的本文所述的配体，其具有VEGF和 EGFR结合特异性。在具体实施方案中，患者患有表达EGFR的癌症， 例如膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、 胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。
在其它实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给 予有需要的患者治疗有效量的本文所述的配体(例如具有VEGF结合 特异性的配体、具有EGFR结合特异性的配体、具有VEGF和EGFR 结合特异性的配体)和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少 一种选自以下的化疗药：烷化剂、抗代谢药、叶酸类似物、嘧啶类似 物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生 素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽 二酮取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、 孕酮、雌激素、抗雌激素药、雄激素、抗雄激素药和促性腺激素释放 激素类似物。在某些实施方案中，化疗药选自顺铂、地卡巴嗪 (dicarbazine)、放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡培他滨、卡 莫司汀、洛莫司汀、多柔比星、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿 糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱(vinbiastine)、长 春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、doxetaxe、阿地白介素、天 冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、 羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙立德、亚叶酸、甲 地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬 酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、 睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、 泰素、其它生长因子受体拮抗剂和任何上述药物的组合。
用于评价配体的测定
可使用任何合适的体外或体内测定，对本发明的配体进行测定。 例如，使用本文所述的受体结合测定或生物测定。
VEGF活性的生物测定：
该生物测定是检测配体(例如dAb)中和VEGF诱导的HUVE(人 血管内皮)细胞增殖的能力。将接种在96孔板中的HUVE细胞与预先 平衡的VEGF和dAb蛋白一起孵育72小时。然后用细胞活力染料测 定细胞数目。
该测定进行如下。从亚汇合的175cm2瓶上将HUVE细胞用胰蛋 白酶水解。吸出培养基，细胞用5ml胰蛋白酶洗涤，再在室温下与2ml 胰蛋白酶一起孵育5分钟。用手叩瓶，让细胞从瓶底轻轻脱落。将8ml 诱导培养基加入到瓶内，吸打细胞以分散任何团块。活细胞用锥虫蓝 染色计数。
离心细胞，在诱导培养基中洗涤2次，离心细胞，每次洗涤后都 吸出原培养基。最后一次吸出后，将细胞稀释至105细胞/ml(在诱导 培养基中)并以100μl/孔接种到96孔板中(10,000细胞/孔)。将该板在 37℃孵育>2小时，让细胞贴壁。
将含有40ng/ml VEGF165(终浓度为10ng/ml)的60μl dAb蛋白和 60μl诱导培养基加入到V形底96孔板中，用膜封口。然后dAb/VEGF 混合物在37℃孵育0.5-1小时。
从培养箱中取出dAb/VEGF板，将100μl溶液加入到含有HUVEC 板的各孔(终体积为200μl)。该板再放回37℃培养箱达至少72小时。
对照孔包括以下：含细胞、但没有VEGF的孔；含细胞、阳性对 照中和抗VEGF抗体和VEGF的孔；和只含细胞和VEGF的对照孔。
细胞活力测定如下：加入20μl/孔Celltiter96试剂，将该板在37℃ 孵育2-4小时，直到显现褐色。加入20μl/孔10％(w/v)SDS，终止反 应。用Wallac微量板读数器在490nm处读取吸光度。
所有其它值减去无VEGF对照孔的值得出吸光度。吸光度与细胞 数目成比例。含对照抗VEGF抗体的对照孔也应当表现出最少细胞增 殖。仅含VEGF的孔应当表现出最大细胞增殖。
实施例1.VEGF受体结合测定
VEGF是内皮细胞在体外的特异性促分裂原和体内强效血管生成 因子，在各类肿瘤中高水平表达的蛋白质。它是45kDa糖蛋白，其同 型二聚体具有活性。已经描述了若干同种型，其通过mRNA可变剪接 而发生。在这些同种型中，看来VEGF-121和VEGF-165是最丰富的。
VEGF对内皮细胞的特异性作用主要受到两类受体酪氨酸激酶 (RTK)即VEGF R1(Flt-1)和VEGF R2(KDR/Flk-1)的调节。然而，看 来VEGF活性(例如促分裂原活性、趋化性和对形态变化的诱导)是由 VEGF R2介导，虽然这两类受体一旦结合VEGF都会经历磷酸化。
VEGF受体2结合测定
该方法介绍了VEGF受体结合测定，用于测定配体(例如dAb)阻 止VEGF-165与VEGF受体2结合的能力。重组人VEGF R2/Fc嵌合 体用于该项测定，其包括与人IgG1Fc区融合的人VEGF R2胞外结构 域。简而言之，受体捕获到ELISA板上，将该板封闭以防非特异性结 合。加入VEGF-165和配体的混合物，洗板后，用生物素化抗VEGF 抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗生物素抗体，测定结合受体的 VEGF-165。用发色底物让该板显色，在450nm处读取OD。如果dAb 阻止VEGF与受体结合，则检测不到颜色。
测定进行如下。96孔Nunc Maxisorp测定板的各孔用浓度为 0.5μg/ml的100μl重组人VEGF R2/Fc(R&D Systems，目录号： 357-KD-050)的碳酸盐缓冲液在4℃包被过夜。各孔用0.05％吐温/PBS 洗涤3次，再用PBS洗涤3次。加入200μl/孔2％ BSA的PBS，封 闭该板，将该板在室温下孵育至少1小时。
洗涤各孔(同上)，将50μl/孔的配体加入各孔中。将浓度为6ng/ml 的50μl VEGF的稀释液(终浓度为3ng/ml)加入各孔中，将板子在室温 下孵育2小时(对于上清液的测定；80μl上清液加入各孔中，然后是浓 度为15ng/ml的20μl VEGF)。
以下对照包括：0ng/ml VEGF(仅有稀释液)；3ng/ml VEGF(R&D Systems，目录号：293-VE-050)；3ng/ml VEGF和0.1μg/ml抗VEGF 中和抗体(R&D Systems cat#MAB293)。
洗涤该板(同上)，加入0.5μg/ml100μl生物素化抗VEGF抗体 (R&D Systems，目录号：BAF293)的稀释液，在室温下孵育2小时。
洗涤各孔(同上)，加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(1:5000在 稀释液中稀释；Stratech，目录号：200-032-096)。将该板在室温下孵 育1小时。
洗涤该板(同上)，确保任何痕量吐温20都被除去，以限制后续过 氧化物酶测定的背景并有助于防止测定板各孔中的气泡(这会造成不 正确的OD读数)。
将100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell过氧化物酶溶液 加入到各孔中，让该板在室温下放置至多20分钟。当结合HRP标记 的缀合物与底物反应时，显现深蓝色可溶性产物。加入100μl 1M盐 酸终止反应(蓝色变为黄色)。在96孔板读数器中，在加酸30分钟之 内，读取该板在450nm处的OD。OD450nm与结合的链霉抗生物素 -HRP缀合物成比例。
对于某些测定，加入蛋白L。蛋白L交联两个dAb单体。
对照的预期结果如下：0ng/ml VEGF应当得到<0.15 OD的低信 号；3ng/ml VEGF应当得到>0.5 OD的信号；而3ng/ml VEGF与 0.1μg/ml中和抗体预孵育应当得到<0.2 OD的信号。
VEGF受体1结合测定
该测定检测了VEGF-165与VEGF R1的结合以及配体封闭该相 互作用的能力。重组人VEGF R1/Fc嵌合体用于该项测定，其包括与 人IgG1Fc区融合的人VEGF R1胞外结构域。受体捕获到ELISA板上， 将该板封闭以防非特异性结合。加入VEGF-165和配体的混合物，洗 板后，用生物素化抗VEGF抗体和HRP缀合的抗生物素抗体，测定 结合受体的VEGF-165。用发色底物让该板显色，在450nm处读取OD。
测定进行如下。96孔Nunc Maxisorp测定板的各孔用浓度为 0.1μg/ml的100μl重组人VEGF R1/Fc(R&D Systems，目录号： 321-FL-050)的碳酸盐缓冲液在4℃包被过夜。各孔用0.05％吐温/PBS 洗涤3次，再用PBS洗涤3次。
加入200μl/孔的2％ BSA的PBS，封闭该板，将该板在室温下最 少孵育1小时。
洗涤各孔(同上)，将50μl/孔的纯化dAb蛋白加入各孔中。将浓度 为1ng/ml的50μl VEGF的稀释液(终浓度为500pg/ml)加入各孔中，将 该板在室温下孵育1小时(对于上清液的测定；80μl上清液加入各孔 中，然后是20μl VEGF@2.5ng/ml)。
以下对照包括：0ng/ml VEGF(仅有稀释液)；500pg/ml VEGF；和 500pg/mlVEGF和0.1μg/ml抗VEGF的抗体(R&D Systems cat#MAB293)。
洗涤各孔(同上)，加入50ng/ml 100μl生物素化抗VEGF抗体的稀 释液，在室温下孵育1小时。
洗涤各孔(同上)，加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(1:5000在 稀释液中稀释)。将该板在室温下孵育1小时。
洗涤该板(同上)，确保任何痕量吐温20都被除去，以限制后续过 氧化物酶测定的背景并有助于防止测定板各孔中的气泡(这会造成不 正确的OD读数)。
向各孔中加入100μl SureBlue 1-Component TMB Micro Well过氧 化物酶溶液，让该板在室温下最多放置20分钟。当结合HRP标记的 缀合物与底物反应时，呈现深蓝色可溶性产物。加入100μl 1M盐酸 终止反应。在96孔板读数器中，在加酸30分钟之内，读取该板在450nm 处的OD。OD450nm与结合的链霉抗生物素-HRP缀合物成比例。
对照的预期结果如下：0ng/ml VEGF应当得到<0.15 OD的低信 号；500pg/ml VEGF应当得到>0.8OD的信号；而500pg/ml VEGF与 0.1μg/ml中和抗体预孵育应当得到<0.3OD的信号。
表1
dAb RBA(VEGFR2) IC50 -蛋白L (nM) RBA(VEGFR2) IC50 +蛋白L (nM) TAR15-1 VK 171 7.4 TAR15-10 VK 12.2 0.3 TAR15-16 VK 31 1.7 TAR15-17 VK 38 0.5 TAR15-18 VK 174 0.4 TAR15-20 VK 28 0.3
当用不同浓度在低密度BIAcore芯片上测定时，TAR15-1的Kd 为50-80nM。在一个浓度(50nM)时，其它VK dAb在低密度芯片上被 忽略。不同dAb表现出不同的结合动力学。
表2
dAb 在上清液RBA(VEGFR2)中， 下降超过50％* TAR15-5 VH + TAR15-6 VH + TAR15-7 VH + TAR15-8 VH + TAR15-23 VH + TAR15-24 VH + TAR15-25 VH + TAR15-26 VH + TAR15-27 VH + TAR15-29 VH + TAR15-30 VH +
*dAb是在50nM时测定的
在一个浓度(50nM)时，VH dAb在低密度VEGF芯片上被忽略。 不同dAb表现出不同的结合动力学。
实施例2.EGFR结合
EGFR结合测定
将25ul配体(例如dAb)接种到96孔板上，然后加入25ul链霉抗 生物素-Alexa Fluor(lug/ml)(Molecular Probes)和25ul A431细胞 (ATCC No.CRL-1555)(8 x 105/ml)。所有试剂都用PBS/1％ BSA配制。 该板在室温下孵育30分钟。
不要扰动细胞，将40ng/ml 25ul生物素化EGF(Invitrogen)加入到 各孔，将该板在室温下孵育3小时。用AB8200 Cellular Detection Systems(Applied Biosystems)检测荧光。
抑制生物素化EGF与A431细胞上表达的EGFR的结合的配体(例 如dAb)，导致较低的荧光计数。没有配体的各孔提供最大荧光的参考 值(即生物素化EGF结合)，而没有配体或生物素化EGF的各孔提供背 景荧光水平的参考值。这些对照包括在所有测定中。
用某些抗EGFR dAb，在该测定中得到的结果见下表3。
EGFR激酶测定
在96孔板中，将5 x 104 A431细胞(ATCC No.CRL-1555)接种到 补充了10％胎牛血清的RPMI-1640各孔中。将该板在37℃/5％ CO2 孵育过夜，让细胞贴壁，然后原培养基更换为RPMI-1640。该板在37℃ /5％ CO2孵育4小时。将配体(在RPMI-1640中制备)加入到各孔中， 该板在37℃/5％ CO2孵育45分钟。将EGF(Invitrogen)加入到各孔中， 终浓度为100ng/ml，再将该板在室温下孵育10分钟。用冰冷PBS洗 涤各孔2次。加入冷的裂解缓冲液(1％ NP-40、20mM Tris、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM原钒酸钠、10ug/ml抑肽酶、10ug/ml 亮肽素)，将该板在冰上孵育10分钟。
将上清液转移至ELISA板上，该板已经用浓度为1ug/ml的抗 EGFR抗体(R&D Systems)的碳酸缓冲液包被过夜。ELISA板在室温下 孵育2小时。该板用PBS/0.05％吐温20洗涤3次。加入1ug/ml与辣 根过氧化物酶(Upstate Biotechnology)缀合的抗磷酸酪氨酸抗体，将该 板在室温下孵育1小时。用PBS/吐温洗板3次，再用PBS洗板3次。 反应物用SureBlue TMB 1-Component Micro Well过氧化物酶底物 (KPL)显色，25分钟后用1M HCl终止反应。用Wallac读板器读取吸 光度。
用某些抗EGFR dAb，在该项测定中得到的结果见下表3。
表3
dAb KD(nM) 受体结合测定 IC50(nM)* 激酶测定 IC50(nM)* DOM16-39 27.3 28.68-112.6(56.84) 31.16-100.9(56.07) DOM16-200 15.3 12.47-37.88(21.74) 30.29-111.9(58.21) DOM16-39-87 6.81 4.471-10.39(6.8) 11.95-252.4(54.92) DOM16-39-100 1.24 1.007-2.757(1.67) 9.142-17.56(12.67) DOM16-39-107 7.09 1.472-4.208(2.49) 12.00-34.99(20.49) DOM16-39-109 1.01 0.746-1.472(1.05) 6.817-11.08(8.69) DOM16-39-115 6.90 1.085-6.886(2.73) 21.52-83.34(42.35) ERBITUX (西妥昔单抗，Imclone Systems，Inc.) - 1.422-5.388(2.77) 3.875-7.689(5.46)
*所示数据是所得到的最小值到最大值和(平均值)。
实施例3.具有VEGF和EGFR结合特异性的IgG样形式
载体
pBudCE4.1骨架(Invitrogen)用于克隆免疫球蛋白恒定区，例如 IgG1重链恒定区和轻链κ恒定区(有关概述参见图16)。采用Ig κ链前 导序列，有利于所表达蛋白质的分泌。Ig恒定区(人IgG1和CK)由 GeneArt(Germany)生产。
将重链恒定区和信号肽作为Hind III/BglII片段克隆到pBudCE4.1 的HindIII/BamH I限制位点上。
将轻链恒定区和信号肽作为NotI/MluI片段克隆到pBudCE4.1上。 dAb克隆到IgG载体上并产生IgG样形式
将VK dAb(对VEGF或EGFR具有特异性)作为SalI/BsiWI片段 克隆到IgG载体上。将VH dAb(对VEGF或EGFR具有特异性)作为 BamHI/XhoI片段克隆到IgG载体上。
再将质粒转染HEK293T细胞(ATCC CRL-11268)，IgG瞬时表达 5天。用层流(Streamline)蛋白A纯化所产生的IgG。
在还原性和非还原性SDS凝胶上检查纯化IgG，观察预期大小的 条带。
将结合VEGF或EGFR的若干dAb精制成具有VEGF和EGFR 结合特异性的IgG样形式。通过产生编码IgG重链(其中VH是dAb) 和κ轻链(其中VK是dAb)的构建体，制备IgG样形式。所制备的IgG 样形式见下表4，测定中得到的某些IgG样形式的结果见下表5。 (Dummy VH和Dummy VK是不能结合VEGF或EGFR的种系序列)。
表5
IgG CH CK VEGF (生物 测定) ND50 (nM) VEGF (RBA) IC50 (nM) EGFR (细胞 RBA) EC50 (nM) EGFR (激酶 测定) ND50 (nM) 1 DOM16-39VK DOM16-39VK 17 22 3 DOM16-39VK DOM15-10VK 1.5 4 DOM16-72VK DOM15-10VK 6 DOM15-26VH DOM16-39VK 1 126 22 10 DOM15-26VH DOM16-52VH 0.2 0.05 11 DOM15-10VK DOM15-26VH 0.03 18 DOM15-26VH DOM16-200VK 0.4 5 19 DOM15-26VH Dummy VK 4.8 20 DOM15-26VH dCDR1/DOM16-200VK 4.1 21 DOM15-26VH dCDR2/DOM16-200VK 0.1 23 DOM15-26-501VH DOM16-200VK 0.16 0.16 23 24 DOM15-6-506VH DOM16-200VK 12 26 25 DOM15-8-505VH DOM16-200VK 34 27 DOM15-26-534VH DOM16-200VK 0.5 137 28 DOM15-26-501VH DOM16-39-500VK 0.8 43 30 DOM15-26-501VH DOM16-39-502VK 0.2 17
实施例4.双特异性流线状(Inline)形式
将能结合VEGF或EGFR的域抗体掺入到融合多肽中，其中，在 一条多肽链内含有抗VEGFR dAb和抗EGFR dAb。一些融合多肽也 包含抗体Fc区(人IgG1的-CH2-CH3)。克隆并表达的融合多肽的具体 实例包括与DOM16-39-206和与Fc融合的TAR15-10(SEQ ID NO：715)；与TAR15-10和与Fc融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO：716)；与TAR15-26-501和与Fc融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO：717)；与DOM16-39-206和与Fc融合的TAR15-26-501(SEQ ID NO：718)；与DOM16-39-206融合的TAR15-10(SEQ ID NO：719)；与 TAR15-10融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO：720)；与TAR15-26-501 融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO：721)；和与DOM16-39-206融合的 TAR15-26-501(SEQ ID NO：722)。按照它们在融合蛋白中从氨基端到 羧基端的排列，列出上述融合体的位置。
用标准方法，将编码dAb的DNA经PCR扩增并克隆到表达载体 上。通过在毕赤酵母中表达表达载体(不含Fc区的融合体)或在HEK 293T细胞中表达表达载体(含Fc区的融合体)，产生线状融合多肽。 分别对于HEK 293T细胞表达的构建体(Fc-标记)和毕赤酵母表达的构 建体而言，将线状融合体分批结合，并在层流蛋白A和层流蛋白L树 脂上进行亲和纯化。
下表6列出一些含Fc的融合体部分，按其在融合蛋白中从氨基 端到羧基端的排列。因此，可以通过从左到右阅读该表，来评价融合 蛋白的结构。表6所示的第一融合蛋白的结构，从氨基端到羧基端为 DOM15-10—接头1—DOM16-39-206—接头2—Fc。用实施例2所述 的EGFR结合测定和实施例1所述的VEGF受体2结合测定，评价融 合体的结合活性。
让线状融合体经历胰蛋白酶水解，测定其对降解的一般稳定性和 抵抗力。制备双特异性配体和胰蛋白酶(1/25(w/w)胰蛋白酶对配体)溶 液，在30℃孵育。在0分钟(即加入胰蛋白酶之前)、60分钟、180分 钟和24小时取样。在给定时间点，通过加入2X终浓度的完全蛋白酶 抑制剂混合物(Roche code：11 836 145 001)和PAGE上样染料，再在液 氮中快速冷冻样品，终止反应。样品经SDS-PAGE分析，目测蛋白质 条带，揭示了融合体经蛋白酶降解的时间进程。
这些实验表明，含有Vk的羧基端氨基酸和Ck的氨基端氨基酸 的具有“天然”接头(KVEIKRTVAAPS(SEQ ID NO：706)的线状融合 体，对快速蛋白酶解敏感，降解明显在10分钟时间点。SDS-PAGE 分析表明，降解发生在dAb间的接头上以及dAb与Fc间的接头上。
设计了新接头，其含有更少Lys和Arg残基，这是胰蛋白酶的切 割点，并且在天然接头中很丰富。含有工程接头(LVTVSSAST(SEQ ID NO：707))或(LVTVSSGGGGSGGGS(SEQ ID NO：708))的融合体显示 出对胰蛋白酶水解的抗性提高很多。
进行了另外的结合测定，评价含工程接头的线状融合体的效力。 结果表明，工程接头在效力上没有任何实质上的副反应。
表6.含Fc的融合多肽
dAb1 接头1 dAb2 接头2 测定 dAb1 (nM) 测定 dAb2 (nM) DOM15-10 (VK) KVEIKRTVAAPS DOM16-39-206 (VK) KVEIKRTVAAPS 0.45 23.8 DOM16-39- 206(VK) KVEIKRTVAAPS DOM15-10(VK) KVEIKRTVAAPS 3.7 0.88 DOM16-39- 206(VK) KVEIKRTVAAPS DOM15-26-501 (VH) LVTVSSASTKGPS 20.7 21.3 DOM15-26- 501(VH) LVTVSSASTKGPS DOM16-39-206 (VK) KVEIKRTVAAPS 5.7 7.7 DOM16-39- 601(VK) LVTVSSAST DOM15-10(VK) LVTVSSAST 0.68 10.8 DOM16-39- 601(VK) KVEIKRTVAAPS DOM15-10(VK) KVEIKRTVAAPS 0.77 2.9 DOM15-10 (VK) LVTVSSAST DOM16-39-601 (VK) LVTVSSAST 1.2 4.2 DOM16-39- 601(VK) LVTVSSGGGGSGG GS DOM15-10(VK) LVTVSSGGGGSGGGS 5.7 0.2 DOM15-10 (VK) LVTVSSGGGGSGG GS DOM16-39-601 (VK) LVTVSSGGGGSGGGS 0.8 3.1 DOM15-10 (VK) KVEIKRTVAAPS DOM16-39-601 (VK) KVEIKRTVAAPS 0.2 2.9
实施例5.另外的工程接头
将一些设计的突变引入在IgG样形式的轻链上表达的Vk dAb的 C-端区，以降低蛋白酶敏感性。“天然接头”是GQGTKVEIKRTVAAPS (SEQ ID NO：709，其含有Vk的羧基端氨基酸和Ck的氨基端氨基酸)。 设计具有氨基酸取代的变异接头1-3，其采用在生理pH下不带正电荷 的最保守取代，取代了天然接头上的一些或全部带正电荷的残基。可 能天然接头中的精氨酸残基较少地经历改变，因为CL区内形成的离 子相互作用。
变异接头1(GQGTNVEINRTVAAPS(SEQ ID NO：710))用天冬酰 胺取代了天然接头中的两个赖氨酸。将变异接头1和变异接头2 (GQGTNVEINQTVAAPS(SEQ ID NO：711)，其另外地将天然接头中的 精氨酸变为谷氨酰胺)，引入接头的N-糖基化位点(NxT)。对含变异接 头1或变异接头2的IgG样形式进行SDS-PAGE分析表明，轻链具有 更高分子量，与N-糖基化事件一致。变异接头3 (GQGTNVEIQRTVAAPS(SEQ ID NO：712)除去N-糖基化位点，而天 然接头内的精氨酸仍保留在原位。变异接头4 (GQGTLVTVSSTVAAPS(SEQ ID NO：713))用来自VH区的相应残基 取代了Vk区的6个C-端氨基酸，并且也缺乏正电荷。
含变异接头1-4的IgG样形式的蛋白酶抗性(按照实施例4评价的 胰蛋白酶抗性)表明，含有工程变异接头的IgG样形式比含天然接头的 IgG样形式具有更强的蛋白酶抗性。
实施例6.DOM16 dAb-抗血清白蛋白dAb融合体
设计了DOM16 dAb-抗血清白蛋白dAb融合体，其表达为抗 EGFR dAb与抗血清白蛋白dAb(一种DOM7 dAb)的融合体。按其在 融合蛋白中从氨基端到羧基端的排列，将融合体部分列于下表7。因 此，可以通过从左到右阅读该表，来评价融合蛋白的结构。表7所示 的第一融合蛋白的结构，从氨基端到羧基端为DOM16-39-618(S12P)— 接头—DOM7h-14。
DOM16-39-618在位置12上含有从丝氨酸到脯氨酸的突变，其终 止与蛋白L的结合并阻止轻链聚集。iDOM7 dAb是突变的，使其不能 结合白蛋白，因而是失活的。
表7
N端dAb 接头 C端dAb DOM16-39-618(S12P) TVAAPS DOM7h-14 DOM16-39-618(S12P) TVAAPS iDOM7h-14 DOM7h-14 TVAAPS DOM16-39-618(S12P) DOM7h-14 TVAAPS DOM16-39-618(S12P) DOM16-39-618(S12P) TVAAPS DOM7r-16 DOM16-39-618(S12P) TVAAPS iDOM7r-16 DOM7r-16 TVAAPS DOM16-39-618(S12P) DOM7r-16 TVAAPS DOM16-39-618(S12P)
实施例7.EGFR表位作图
在竞争性结合测定中，采用抗EGFR dAb、EGF和ERBITUX(西 妥昔单抗；Imclone Systems)，来进行表位作图。用BIAcore生物传感 器进行结合研究。在该项研究中，DOM16-39-200用作参考。 DOM16-39-200和称为DOM-16-39-x的其它dAb，是DOM16-39的亲 和力成熟变异体。因此，DOM-16-39系列中的所有dAb将会具有基 本相同的表位特异性，因为亲和力成熟产生具有更高结合亲和力的 dAb，但不改变dAb的特异性。
上述结果表明，DOM16-72、DOM16-79和DOM16-112与 DOM16-39-200竞争性结合EGFR，表明这些dAb结合重叠表位。然 而，DOM16-32、DOM16-52和DOM16-80表现出与不同表位的结合。 已知ERBITUX(西妥昔单抗；Imclone Systems)能抑制EGF与EGFR 结合(西妥昔单抗和EGF结合EGFR上的重叠表位)。该项研究结果也 表明，DOM16-39-200和西妥昔单抗竞争性结合EGFR，这表明 DOM16-39-200表位与西妥昔单抗表位重叠，并且具有EGF的结合位 点。
相关申请
本申请要求于2005年12月6日申请的美国临时申请号 60/742,992的权益以及2006年1月11日申请的美国临时申请号 60/758,355的权益。上述申请的全部内容都通过引用结合到本文中。
尽管参考本发明的优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是 本领域技术人员应该理解，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围 的情况下，可以对本发明在形式上和细节上实施各种修改。
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