发明背景

眼科疾病，干眼病是眼疾患者的常见疾病。未解决的干眼病症状 能够导致角膜上皮细胞表面的腐蚀和磨损，提高了对传染病的易感 性。疾病的发展可能导致角膜溃疡，甚至失明。

各种刺激物、损伤和医疗设备使人们的泪腺分泌物开始减少，导 致保护和滋养眼表面的泪水处于缺乏水平。还有一些环境因素能够引 起和/或促使眼泪产生数量和质量的降低，所述因素例如为高纬度、干 旱和多风的气候、空气污染、来自中央暖气和中央空调的干燥空气， 以及暴露于香烟中。甚至于计算机的广泛使用也是一个起作用的因 素，因为研究显示其使注意力集中于计算机屏幕上的使用者的眨眼率 明显降低。一些眼护理方面的进步也促使最近干眼病患者数量增加， 其开始于采用隐形眼镜，而目前流行LASIK法校正视力。使用隐形 眼镜导致眼镜吸收了泪膜，引起眼睑中结膜的生理疼痛。LASIK可能 具有因眼损伤而引起的继发副作用，因为在激光折射手术过程中神经 通常被切断或融化，其会导致至少暂时的几个月的干眼病症状。

疾病和一些身体不适可能使人易于患干眼病，这些疾病包括过敏 症、糖尿病、泪腺缺陷、狼疮、帕金森病、金格伦综合症、类风湿性 关节炎、红斑痤疮和其它疾病。针对其它疾病的药物治疗可能导致干 眼病或使其恶化，包括利尿剂、抗抑郁剂、抗过敏药物、避孕药丸、 减充血剂和其它药剂。

与年龄有关的变化也可能诱使干眼病或使其恶化。更年期后的妇 女经历激素水平的变化，其会产生干眼病或使其恶化，而且甲状腺不 平衡也可能导致类似的变化。最后，变老现象本身也会导致油脂分泌 减少，从而导致干眼病。

直至最近，治疗性措施仍只限于用以提高眼的水分水平的缓解措 施。这种干预方法最通常是借助于作为人工眼泪的滴眼液来实现。这 些液体通常为溶液，每天滴一次或多次。对于更严重的干眼病情况而 言，结合了增稠剂或眼凝胶的人工泪液可以增加保留在眼部的膜层的 量。或者，可以使用几种夜用药膏来治疗。增稠溶液、凝胶和药膏的 局限性在于施用后会显著损害视力，因此其很少被用于需要在觉醒、 活动时刻大量施用的一般患者中。另一个缓解措施是建立暂时性泪道 阻塞，或者甚至是通过外科手术关闭眼泪进入与眼相邻的鼻腔的正常 排泪途径。

但是，这些措施都不能有效治疗这种疾病。因此，希望研制出能 够有效治疗干眼病，优选以最小的副作用治疗的药剂。

发明概述

一方面，本发明提供治疗由LFA-1介导的炎症性疾病的方法，该 方法通过向患者施用有效量的单独的LFA-1拮抗剂或者与其它治疗 药剂相结合的LFA-1拮抗剂来进行。在本发明的一些实施方案中，本 发明的LFA-1化合物所要治疗的疾病为抗LFA-1抗体，Raptiva已显 示出治疗效果或者已显示出对于疾病组织中的炎症细胞具有作用的 疾病。可以用本发明的化合物治疗患有免疫介导的过敏性疾病，包括 鼻炎的病人，用以减轻与LFA-1介导的免疫和/或过敏反应相关的炎 症。在一些实施方案中，经口或鼻输送喷雾溶液或分散粉末的局部给 药方式可以用于治疗哮喘或其它由LFA-1介导的肺部炎症性疾病。在 一些实施方案中，本发明的乳膏制剂可以用于将LFA-1拮抗剂局部 施用于患有由LFA-1介导的皮肤病，例如湿疹和牛皮癣的皮肤上。在 一些实施方案中，在动物试验中通过口服途径给药LFA-1拮抗剂的 口服制剂，已知该LFA-1拮抗剂口服制剂在系统水平下的吸收性很 差，其可用于在胃肠道(GI)炎症疾病的治疗中局部输送LFA-1拮抗剂， 所述胃肠道炎症疾病包括克罗恩氏病和过敏性肠综合征，或由LFA-1 或其它白细胞整联蛋白，包括VLA4和Mac-1介导的其它GI疾病。

在一些实施方案中，由LFA-1介导的疾病为眼疾病。在一些实 施方案中，由LFA-1介导的炎症性疾病为干眼病。尤其，本发明的 方法可以用于治疗干眼综合症。该综合症包括由下述原因引起的症 状：角膜结膜干燥、金格伦综合症、角膜受伤、与年龄相关的干眼病、 史蒂文斯-约翰逊综合症、先天性无泪症、药物副作用、感染、赖利- 戴综合症、结膜纤维化、眼压、腺体和组织的损坏、眼部瘢痕类天疱 疮、睑炎、自体免疫和其它免疫缺陷疾病、过敏、糖尿病、泪腺缺乏、 狼疮、帕金森病、金格伦综合症、类风湿性关节炎、红斑狼疮，在干 燥空气、空气传播的颗粒、烟和烟雾环境中的过度暴露，以及不能眨 眼，以及其它疾病。许多患有干眼病的病人还可能有潜在的自体免疫 疾病，金格伦综合症。目前公认的确定病人的诊断标准包括临床征兆 和口干症状。本发明化合物的漱口液或锭剂可以用于治疗该症状。将 皮肤乳膏施用于眼睑外表面就会使LFA-1拮抗剂通过眼睑到达眼睑 内衬和中间的结膜组织和副泪腺，人们就是希望将这种皮肤乳膏用于 治疗由LFA-1介导的眼睑和眼的炎症，尤其是治疗干眼病。

本发明的另一个方面提供药物组合物，其包括在治疗由LFA-1介 导的炎症性疾病的方法中施用的LFA-1拮抗剂。在一些实施方案中， 由LFA-1介导的炎症性疾病为眼疾病，为了治疗该疾病而提供包括 LFA-1拮抗剂的药物组合物。在一些实施方案中，由LFA-1介导的 炎症性疾病为干眼病，为了治疗该疾病而提供包括LFA-1拮抗剂的药 物组合物。还提供，该组合物可以进一步包括另一种治疗药剂，其在 同一制剂中或者分别地共施用。在一些实施方案中，药物组合物经口 服、注射、鼻内、吸入、直肠、局部、滴至眼表面或经皮肤给药。

在另一个方面中，本发明提供组合物制剂，其在治疗由LFA-1. 介导的炎症性疾病的方法中给药。在一些实施方案中，提供组合物的 胃滞留制剂，用于在治疗由LFA-1介导的炎症性疾病中给药。在一 些实施方案中，提供组合物的胃滞留制剂，用于在眼疾的治疗中给药， 该眼疾为由LFA-1介导的炎症性疾病。在一些实施方案中，提供组合 物的眼用制剂，用于在眼疾的治疗中给药，该眼疾为由LFA-1介导的 炎症性疾病。在一些实施方案中，提供眼用组合物制剂，用于在治疗 由LFA-1介导的炎症性疾病中给药，其为溶液、乳膏、粉末、悬浮液、 喷雾、凝胶、固体，等等。本发明的一些实施方案还提供了受控的释 放剂型。在本发明的一些实施方案中，将本发明的化合物制成前药。

在另一个方面中，提供了用在本发明的方法中的化合物。可用于 本发明的方法中的化合物包括抗体、抗体片段、多肽、肽、聚合物和 有机小分子。在本发明的方法的另一个实施方案中，将Raptiva用在 治疗干眼病的眼用制剂中。

本发明的一个方面将诊断过程与用LFA-1拮抗剂进行治疗的方 法相结合。在一个实施方案中，对金格伦综合症进行诊断试验，并在 对疾病进行诊断之后，向病人施用本文中所述的LFA-1拮抗剂。在另 一个实施方案中，进行干眼病诊断试验，并在对干眼病进行诊断之后， 向病人施用本文中所述的LFA-1拮抗剂。

将本申请中提供化合物施用于患有由LFA-1介导的炎症性疾病 的患者，用以提高泪水或粘液素的产生。优选，所治疗的炎症性疾病 为干眼病。

在另一个方面中，提供一种鉴定LFA-1抑制剂与ICAM-I之间的 相互作用的方法。在一些实施方案中，经鉴定该抑制剂与ICAM-I针 对在LFA-1αL亚基内的LFA-1上的结合进行直接竞争。在一些实施 方案中，该方法采用竞争性结合试验来确定LFA-1拮抗剂：ICAM-I 之间的相互作用。在一些实施方案中使用标记探针分子，已知该分子 在金属离子依赖型黏着位上结合，所述黏着位为LFA-1：ICAM-1在 LFA-1αL亚基上的相互作用位置。

在另一个方面中，描述了一种对用于人类疾病的可用药物试剂进 行鉴定的方法，该方法使用siRNA(小的干扰RNA序列)的细胞生长抑 制特性曲线，据此在一组培养的细胞系中鉴定出具有类似的细胞生长 抑制特性曲线的化合物，其中所述的siRNA指向参与细胞生长和人类 疾病的细胞靶标。本发明的方法还可以用于鉴定可用的LFA-1抑制 剂、B-细胞受体BR3、Grb2(在信号级联反应中位于生长因子受体的 下游的蛋白)和其他细胞内和细胞外的蛋白靶标。在本发明的另一个 实施方案中，经鉴定与siRNA抑制细胞生长的活性特性曲线相反的化 合物可以作为细胞生长的刺激剂，该刺激剂可用于治疗细胞生长减缓 的疾病和病症。提高的细胞生长率可以用于伤口愈合和其它临床情况 下。在本发明的另一个实施方案中，该方法使用siRNA细胞活性数据 采用下述方式进行靶向或者选择靶标：通过对公用和/或私人化合物细 胞活性数据库进行搜索来找寻对化合物或化合物集合产生响应的类 似的细胞活性特性曲线，用以作为对可用于鉴定人类药物的化合物进 行鉴定的方法。

参考文献的结合

本说明书中提及的所有公开物和专利申请都据此结合进来作为 参考，每个单独的公开物或专利申请都按照具体和单独指定的程度结 合进来作为参考。

附图简述

所附权利要求对本发明的新颖性进行了特殊阐释。参考下列阐述 了说明性实施方案的详细描述可以对本发明的特征和优越性具有更 好的理解，所述详细描述中采用本发明的原则和下述附图：

图1描述了由LFA-1：ICAM-1相互作用产生的滚动、白细胞黏 着和穿过内皮的迁移。

图2描述了LFA-1：ICAM-1相互作用的抗原活化。

图3描述了LFA-1：ICAM-1相互作用的共刺激功能。

图4描述了用于鉴定方法中的小分子拮抗剂。

图5为表1，其显示了LFA-1的小分子拮抗剂的阳离子依赖性。

图6描述了化合物5交联的LFA-1的SDS-PAGE分析。

图7描述了化合物2B和ICAM-I-Ig与293细胞的结合，所述293 细胞表达野生型LFA-1或缺失结构域I的LFA-1。

图8描述了化合物2A、3、A-286982和sICAM-1在LFA-1/ICAM-1 和LFA-1/小分子ELISA中的拮抗剂竞争作用。

图9描述了LFA-1/ICAM-1与LFA-1/小分子ELISA进行拮抗剂竞 争作用而得到的IC50值的相互关系。

图10描述了拮抗剂对结合在LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子 ELISA上的配体的作用效果。

图11描述了sICAM-1的Schild回归和化合物3的拮抗作用。

图12描述了用于治疗人类癌症和炎症的有效细胞生长抑制剂的 发现流程图。

发明详述

I.白整联蛋白与黏着受体之间的相互作用：生物学和疾病

本发明的第一方面为治疗免疫和其它病症的炎症部分的方法。尤 其，本申请中描述的方法可以用于治疗白细胞介导的炎症。该部分用 于在所选疾病中引发和促进炎症，所述疾病例如为银屑病、湿疹、哮 喘、皮炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、与 炎症性肠炎有关的响应、Raynaud综合症、金格伦病、幼年发病的糖 尿病、糖尿病、肉芽肿病、CNS炎性病症、多器官损伤疾病、所有类 型的移植，包括移植物对抗宿主或宿主对抗移植物的疾病、HIV和鼻 病毒感染和动脉粥样硬化，以及其它疾病。

本发明的优选实施方案用于治疗眼病。尤其，本发明的方法用于 治疗干眼综合症。该综合症包括由下述原因引起的症状：干燥性角膜 结膜炎、金格伦综合症、角膜损伤、与年龄有关的干眼症、史蒂文斯 -约翰逊综合症、先天性无泪症、药物副作用、感染、赖利-戴综合症、 结膜纤维化、眼压、腺体和组织破坏、眼部瘢痕类天疱疮、目疡、自 体免疫和其它免疫缺陷病症、过敏、糖尿病、泪腺缺陷、狼疮、帕金 森病、金格伦综合症、风湿性关节炎、环境暴露：暴露于过量的干燥 空气、空气传播的颗粒、烟和物和不能眨眼，以及其它疾病。

并非意图限制作用机理，本发明的方法包括通过抑制LFA-1和 ICAM-I之间的相互作用来抑制与炎症有关的疾病的开始和发展。 LFA-1和ICAM-I为带有胞外受体域的分子，其参与淋巴细胞/白细胞 的迁移和增殖过程，导致炎症级联反应。在优选实施方案中，这种方 法提供体外和体内的抗-炎作用，例如如下面所作的详细描述，而且 其可以用于治疗炎症介导的疾病，尤其是干眼病。

人类血液中含有白血球(白细胞)，其进一步分类为嗜中性粒细 胞、淋巴细胞(分为B-和T-亚型)、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱 性粒细胞。这些类白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒 细胞和淋巴细胞中的若干细胞参与炎性病症。LFA-1是表达于大部分 白细胞上的白整联蛋白组中的一种，而且其被认为是与许多作为配体 的ICAM发生相互作用的淋巴整联蛋白。干扰这些相互作用，并因此 干扰免疫/炎症响应就可以使炎症，尤其是眼的炎症减弱。

例如，ICAM-1(CD54)是免疫球蛋白超家族中的ICAM家族黏着 受体(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4)中的一员，而且其表达 于被激活的白细胞、皮肤成纤维细胞和内皮细胞上。参见，Krensky， A.M.；Sanchez-Madrid，F.；Robbins，E.；Nagy，J.A.；Springer，T.A. Burakoff，SJ.“The functional significance，distribution，and structure of LFA-1，LFA-2，and LFA-3：cell surface antigens associated with CTL- target interactions.”1983 J.Immunol.131，611-616。其正常情况下在 沿着脉管细胞的内皮细胞上进行表达，而且在免疫/炎症开始时经暴露 于细胞因子，例如IL-I、LPS和TNF下而得到正调节。

近十年来所作的研究有助于说明参与免疫系统分子运动和活化 作用的分子事件，其集中级联反应中的细胞-细胞间引发性相互作用。 参见Springer，T.A.“Adhesion receptors of the immune system.”Nature， 1990，346，425-434。细胞间黏着分子(ICAMs)和白整联蛋白之间的 相互作用在免疫系统的功能中起到一定作用。人们相信免疫过程，例 如抗原呈递、T-细胞介导的细胞毒和白细胞跨内皮迁移(血细胞渗出) 需要由ICAMs与白整联蛋白相互作用而介导的细胞黏着。参见 Kishimoto，T.K.；Rothlein；R.R.“Integrins，ICAMs，and selectins： role and regulation of adhesion molecules in neutrophil recruitment to inflammatory sites.”AdV.Pharmacol.1994，25，117-138和Diamond， M.；Springer，T.A.“The dynamic regulation of integrin adhesiveness.” Current Biology，1994，4，506-532。

已经显示，ICAM-I和LFA-1(还称作αLβ2和CDlla/CD18)的相互 作用参与黏着过程，如图1所示，白细胞跨内皮进行迁移、迁移至伤 口位置，淋巴细胞在激活的靶标位置增殖。例如，目前认为在白细胞 跨内皮迁移之前，炎症反应成分，细胞因子/趋化因子的存在将在白细 胞上组成性表达的整联蛋白激活。血管内皮细胞也响应该细胞因子/ 趋化因子的存在而正调节ICAM-I。当滚动的白细胞接近被激活的内 皮细胞时，其前进首先被这些正调节的ICAM-I受体延缓。之后被表 达在血管内皮细胞表面上的LFA-1和ICAM-I之间的配体/受体相互作 用延缓，其阻止淋巴细胞的进一步滚动。然后淋巴细胞变平，从而发 生渗透作用(transvasation)。该过程对于淋巴细胞穿过血管内皮的迁 移以及淋巴细胞由外部血液行至淋巴结而言都是很重要的。

LFA-1在产生和维持免疫突触中具有作用，如图2所示，其可以 被定义为T细胞与抗原呈递细胞(APCs)的相互作用表面的物理结构。 LFA-1使T-细胞与APC的作用稳定化，从而激活T细胞。如图3所 示，LFA-1与ICAM-I的相互作用还表现为向停滞的T细胞提供共- 刺激信号。CD4+T-细胞的增殖和细胞因子的合成由作为炎症反应一 部分的该相互作用来介导。

假设ICAM-I与LFA-1的相互作用在免疫/炎性反应中具有作用， 则希望对这些相互作用进行调节，以获得希望的治疗结果(例如，在 过度活化的炎症反应情况下对该相互作用进行抑制)。而且，由于 LFA-1具有多个属于ICAM族(ICAM-I、ICAM-2和ICAM-3)并涉及多 个信号通道的配体对(ligand partners)，因此在一些实施方案中，希 望选择性调节这些相互作用。还指出可以借助指向ICAMs和白整联 蛋白中任何一个成分的试剂来实现对ICAMs和白整联蛋白之间的相 互作用的拮抗作用。

本文中描述的方法和组合物可以调节一种或多种本文中描述的 通道中的成分。除了抑制LFA-1和ICAM-I之间的相互作用之外，本 发明的方法和组合物还可以干预发炎过程中的早期和晚期部分。例 如，可以在粘连和跨内皮迁移之前，通过本文中描述的方法和组合物 来调节对ICAM-I或LFA-1的内皮细胞或白细胞的正调节(活化)。本 发明可以用于调节在白细胞通行过程中激活ICAM-I和LFA-1的细胞 因子或趋化因子的表达、调节细胞因子或趋化因子的运输，防止停滞 白细胞的渗透作用、调节参与白细胞在受伤或炎症部位进行增殖的其 它机理的信号传输等。

II.治疗方法

如本文中所用的，术语“患者”包括动物，尤其是人以及其它哺 乳动物。该方法通常包括施用一种或多种用于治疗一种或多种疾病的 药物。组合试剂可以用于治疗一种疾病或多种疾病，或者用于调节组 合中的一种或多种试剂的副作用。本文中描述的化合物可以与其它干 眼症治疗试剂结合使用。而且，本发明的化合物还可以与引起作为副 作用的干眼症的药物组合使用。

如本文中所用的，术语“治疗”及其等效措辞包括实现治疗性有 益效果和/或预防性有益效果。治疗性有益效果意指根除或改善被治疗 的主要病症。

而且，通过根除或改善一种或多种与主要病症有关的生理症状来 实现治疗性有益效果，从而在患者身上观察到改善情况，尽管患者可 能仍旧经受主要病症的折磨。对于预防性有益效果而言，即使还未给 出疾病的诊断结论，也可以将组合物施用于患者，但有产生特殊疾病 的危险，或者施用于记录具有一种或多种疾病生理症状的患者。可以 将组合物施用于患者，以预防生理症状或主要病症的发展。

在一些实施方案中，治疗试剂以足以产生治疗效果的量存在，即 该量足以除去平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、 80、90、大于90％或基本上除去疾病或其至少一个主要症状。优选该 治疗作用为针对炎症的治疗作用。

在一些实施方案中，治疗试剂以足以产生治疗效果的量存在，即 该量减少平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、 90、大于90％的干眼症症状或基本上除去干眼症症状。

在一些实施方案中，治疗试剂的有效量为日剂量1×10-11、1×10-10、 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、 1×101、1×102g。

可以以任何适当的方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过 口服给药方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过皮肤施用方式 施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过注射方式施用治疗试剂。在 一些实施方案中，局部施用治疗试剂。如果将组合试剂作为独立的组 合物给药，则其可以以相同途径或不同途径给药。如果组合试剂在单 一组合物中给药，则其可以以任何适当的途径给药。在一些实施方案 中，将组合试剂作为单一组合物经口服给药方式给药。在一些实施方 案中，将组合试剂作为单一组合物以皮肤给药方式施用。在一些实施 方案中，将组合试剂作为单一组合物经注射方式给药。在一些实施方 案中，将组合试剂作为单一组合物局部给药。

本文中描述的本发明方法为一种将LFA-1拮抗剂施用于患者以 治疗其干眼症的方法。尤其，该拮抗剂可以调节由白细胞介导的炎症。 本发明的优选实施方案通过施用LFA-1拮抗剂来调节与眼部炎症有 关的炎症，从而治疗患者。本发明的另一个优选实施方案是通过施用 LFA-1拮抗剂来治疗患有与干眼综合症有关的炎症的患者。本发明的 一个实施方案治疗具有因过敏引起的干眼病症状的患者。本发明的一 个实施方案治疗具有因糖尿病引起的干眼病症状的患者。本发明的一 个实施方案治疗具有因泪腺缺陷引起的干眼病症状的患者。本发明的 实施方案治疗具有由狼疮引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实 施方案治疗具有由帕金森病引起的干眼病症状的患者。本发明的一 个实施方案治疗具有由干燥病引起的干眼病(Sjoren’s)症状的患者。 本发明的一个实施方案治疗具有由类风湿性关节炎引起的干眼病症 状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由红斑狼疮引起的干眼病 症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由视力校正的LASIK 治疗引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因使 用隐形眼镜而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗 具有因暴露于干燥气候而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实 施方案治疗具有因暴露于空气污染而引起的干眼病症状的患者。本发 明的一个实施方案治疗具有因多风气候而引起的干眼病症状的患者。 本发明的一个实施方案治疗具有因暴露于香烟而引起的干眼病症状 的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因干燥性角膜结膜炎而引起 的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因角膜损伤而 引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因结膜纤 维化而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有与 年龄-有关的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因 史蒂文斯-约翰逊综合症而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个 实施方案治疗具有因先天性无泪症而引起的干眼病症状的患者。本发 明的一个实施方案治疗具有因病人服用的其它药物的副作用而引起 的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因感染而引起 的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因赖利-戴综 合症而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因 眼压，包括因使用计算机而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个 实施方案治疗具有因腺体和组织缺陷而引起的干眼病症状的患者。本 发明的一个实施方案治疗具有因眼瘢痕类天疱疮而引起的干眼病症 状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因目疡而引起的干眼病症 状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因自体免疫和其它免疫缺 陷病症引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因 不能眨眼而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方 法的LFA-1拮抗剂治疗具有银屑病症状的患者。本发明的一个实施方 案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有湿疹症状的患者。本发明的一个 实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有狼疮症状的患者。本发明 的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有Reynaud综合症症 状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有 肉芽肿病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗 剂治疗具有CNS炎性病症症状的患者。本发明的一个实施方案用该 方法的LFA-1拮抗剂治疗具有多个器官疾病症状的患者。本发明的一 个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有过敏性鼻炎症状的患 者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有肉芽肿 病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗 具有动脉粥样硬化症症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的 LFA-1拮抗剂治疗具有移植物对抗宿主的疾病症状的患者。本发明的 一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有与移植有关的炎症 反应症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治 疗具有炎症性肠病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的 LFA-1拮抗剂治疗具有幼年发病的糖尿病症状的患者。本发明的一个 实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有糖尿病症状的患者。本发 明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有多发性硬化症 状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有 哮喘症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治 疗具有皮炎症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮 抗剂治疗具有系统性红斑狼疮症状的患者。本发明的一个实施方案用 该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有HIV和鼻病毒感染症状的患者。

在本发明的一些实施方案中，使用诊断步骤来确定需要使用本发 明的方法进行治疗的患者。使用荧光素染色的角膜来诊断干眼病症 状。使用孟加拉玫瑰红染色的角膜来诊断干眼病症状。使用眼泪中断 时间(BUT)来诊断干眼病症状。使用Schirmer麻醉试验诊断干眼病症 状。使用Schirmer试验分析法诊断干眼病症状。使用压迹细胞学来诊 断干眼病症状。使用主观干眼症状来诊断干眼病症状。使用泪流分析 法诊断干眼病症状。使用免疫组织化学方法，包括但不限于人类白细 胞抗原II(HLA-DR)来诊断干眼病症状。使用抗核抗体试验(ANA)或荧 光抗核抗体试验(FANA)诊断干眼病症状。使用眼部蒸发来诊断干眼 病症状。使用红外睑板图(meibography)来诊断干眼病症状。使用连 续扫描共焦显微术(TSCM)诊断干眼病症状。这是可用于诊断干眼病 症状的示例方法的目录，其绝对不是用来进行限制的。

本发明方法的拮抗剂可以为抗体、抗体片断、肽或小分子。在优 选的实施方案中，所用的LFA-1拮抗剂为非抗体的肽。本发明的拮抗 剂为治疗试剂。

针对LFA-1拮抗剂的许多治疗指示都要求慢性疗法；因此， LFA-1/ICAM-1相互作用的小分子抑制剂是本发明的一组优选实施方 案，因为其具有口服给药以及降低材料成本的潜力。

进一步优选的实施方案为使用治疗试剂治疗干眼病的方法，所述 治疗试剂适于制剂和作为眼部疗法来给药。

此处和下文中描述了本发明的另一个方面，一种对ICAM-I和拮 抗剂的结合进行比较的方法，其中所述拮抗剂可用于确定抗体、抗体 片断、肽和作为LFA-1：ICAM-I相互作用的拮抗剂的小分子。参见 Gadek等，2002。就小分子拮抗剂来描述该方法。但是，不应该将其 解释为以排除其用于确定较大分子类型的LFA-1抑制剂的任何方式 来限制该方法，其中所述LFA-1抑制剂例如为抗体、抗体片段或肽。

该方法包括选择一个或多个下列步骤作为确定拮抗剂的方法的 一部分，其中所述拮抗剂作为LFA-1的直接竞争抑制剂：(a)使用全长 野生型LFA-1进行竞争试验，对有潜力的拮抗试剂与sICAM-1(LFA-1 的天然配体和竞争性LFA-1/ICAM-1抑制剂的胞外域)和A-286982(已 知结合在结构域I(插入)变构位(IDAS)上的变构LFA-1/ICAM-1抑制剂) 的结合作用进行比较。参见Liu，G.；Huth，J.R.；Olejniczak，E.T.； Mendoza，R.；DeVries，P.；Leitza，S.；Reilly；E.B.，Okasinski；G. F.；Fesik，S.W.和von Geldern，T.W.2001.“Novel p-arylthio cinnamides as antagonists of leukocyte function-associated antigen-1/intracellular adhesion molecule-1 interaction.2.Mechanism of inhibition and structure-based improvement of pharmaceutical properties.”J.Med. Cherα，44，1202-1210))，(b)对潜在的拮抗试剂和ICAM-I与LFA-1 突变体的结合进行研究，和(c)化学交联研究。之前已经将靶向于此的 ICAM-I结合位局限在包括位于LFA-1α亚基内结构域I内并依赖于金 属离子的黏着位点(MIDAS)基序上。参见Shimaoka，M.，Xiao，T.， Liu，J.-H.，Yang，Y.，Dong，Y.，Jun，C-D.，McCormack，A.Zhang， R.，Joachimiak，A.，Takagi，J.，Wang，J.-H.和Springer，T.A.2003 “Structures of the alpha L I domain and its complex with ICAM-I reveal a shape-shifting pathway for integrin regulation”，Cell 2003，99-111。 可以使用该方法的一个或多个步骤来确定具有下述作用方式的拮抗 剂：通过直接竞争一个位于LFA-1上的普通高亲合力结合位而抑制 ICAM-I的结合。

A.作为治疗试剂的抗体

本领域已知若干种适当的抗体。用指向其中之一或两个这些分子 的抗体阻断CAM例如ICAM-I，或白整联蛋白例如LFA-1，则可以抑 制炎症反应。之前的研究对于抗-CD11a Mab对体外许多T-细胞-依赖 型免疫功能的影响和对体内许多免疫响应的影响作了考察。在体外， 抗-CD11a Mab抑制T-细胞的活化(参见Kuypers T.W.，Roos D.1989 “Leukocyte membrane adhesion proteins LFA-1，CR3 and p150，95：a review of functional and regulatory aspects”Res.Immunol.， 140：461-465；Fischer A，Durandy A，Sterkers G，Griscelli C.1986， “Role of the LFA-1 molecule in cellular interactions required for antibody production in humans”，J.Immunol.，136，3198；target cell lysis by cytotoxic T-lymphocytes(Rrensky等，如前所述)，formation of immune conjugates(Sanders VM，Snyder JM，Uhr JW，Vitetta ES.， “Characterization of the physical interaction between antigen-specific B and T cells”.J.Immunol.，137：2395(1986)；Mentzer SJ，GromkoWski SH，Krensky AM，Burakoff SJ，Martz E.1985，“LFA-1 membrane molecule in the regulation of homptypic adhesions of human B lymphocytesn”，J.Immunol.，135：9)，和T-细胞对血管内皮的黏着(Lo SK，Van S eventer GA，Levin SM，Wright SD.，Two leukocyte receptors (CD1 1a/CD18 and CD1 1b/CD18)  mediate transient adhesion to endothelium by binding to different ligands.，J.Immunol.，143：3325 (1989))。两种抗-CDlla MAbs、HI111和G43-25B可购自Pharmingen/BD Biosciences。此外，包括F8.8、CBR LFA 1/9、BL5、May.035、TS1/11、 TS1/12、TS1/22、TS2/14、25-3-1、MHM2和依法丽珠单抗(efalizumab) 的研究工作评价了这些抗体占据的位于LFA-1上的结合位的范围。参 见Lu，C；Shimaoka，M.；Salas，A.；Springer，T.A.2004，“The Binding Sites  for Competitive  Antagonistic，Allosteric Antagonistic，and Agonistic Antibodies to the I Domain of integrin LFA-1”，J.Immun. 173：3972-3978，及其中的参考文献。

下述观察结果是试验这些分子的Mabs对人体内移植排斥现象的 预防作用的基础：LFA-1：ICAM-1的相互作用是优化T-细胞在体内 的功能所必需的，而且抗-CD1Ia Mabs诱发对于蛋白质抗原的耐受性 (Beniamin RJ，Qin SX，Wise MP，Cobbold SP，Waldmann H.1988， “Mechanisms of monoclonal antibody-facilitated tolerance induction：a possible role for the CD4(L3T4)and CD1Ia(LFA-1)molecules in self-non-self discriminaTIon”，Eur，J.Immunol.，18：1079)，并且延 长肿瘤移植物在小鼠体内的存活时间(Heagy W，Walterbangh C，Martz E.1984，“Potent ability of anti-LFA-1 monoclonal antibody to prolong allograft survival”，Transplantation，37：520-523)。还在灵长类动物 动物体内作了试验。例如，基于在猴子体内所作的试验，人们得出结 论指向ICAM-I的Mab可以预防或逆转肾移植排斥作用(Cosimi等， “Immunosuppression of Cynomolgus Recipients of Renal Allografts by R6.5，a Monoclonal Antibody to Intercellular Adhesion Molecule-1，” Springer等(eds.)，Leukocyte Adhesion Molecules New York：Springer， (1988)，274页；Cosimi等，J.Immunology，144：4604-4612(1990))。 向猕猴体内施用抗-CD11a Mab延长了皮肤同种异体移植存物活时 间。参见Berlin等，Transplantation，53：840-849(1992)。

B.小分子

对肽用于降低LFA-1与ICAM-I之间的相互作用的用途进行了研 究。美国专利No.5,747,035中对不含有IgG的Fc区域的多肽进行了 描述，该多肽可以用于治疗LFA-1介导的病症，尤其是干眼症。美国 专利No.5,843,885中描述了使用二肽来降低LFA-1和ICAM-I的相互 作用，其中所述二肽中第一个是ICAM-I调节剂，第二是具有从LFA-1 获得的序列的阻断肽。美国专利No.6,630,447中对环肽进行了描述， 所述环肽作为LFA-1：ICAM-I相互作用的抑制剂。

小分子拮抗剂包括结合在LFA-1 CD11结构域上的抑制素。参见 Kallen，J.，Welzenbach，K.，Ramage，P.Geyl，D.Kriwacki，R.， Legge，G.，Cottens，S.，Weitz-Schmidt，G.，和Hommel，U.1999. “Structural basis for LFA-1 inhibition upon lovastatin binding to the CD1 Ia I-domain”，J.MoI.Biol.，292：1-9；和Weitz-Schmidt，G.， Welzenbach，K.，Brinkmann，V.，Kamata，T.，Kallen，J.，Bruns， C，Cottens，S.，Takada，Y.和Hommel，U.2001.Statins selectively inhibit leukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrin site，Nature Med.，7：687-692；和Frenette，P.S.2001.“Locking a leukocyte integrin with statins”，N.Engl.J.Med.，345：1419-1421。衍生自美维 诺林(mevinolin)/美伐他汀(compactin)基序的分子也显示抗LFA-1 活性。参见Welzenbach，K.，Hommel，U.和Weitz-Schmidt，G.2002. “Small molecule inhibitors induce conformational changes in the I domain and the I-like domain of Lymphocyte Function-Associated Antigen-1”，J.Biol.Chem.，277：10590-10598，和美国专利No. 6,630,492。

基于乙内酰脲的抑制剂家族也可以用作拮抗剂。参见Kelly，T. A.，Jeanfavre，D.D.，McNeil，D.W.，Woska，J.R.Jr.，Reilly，P.L.， Mainolfi，E.A.，Kishimoto，K.M.，Nabozny，G.H.，Zinter，R.， Bormann，B.-J.和Rothlein，R.1999.“Cutting edge：a mall molecule antagonist of LFA-1-mediated cell adhesion”，J.Immunol.，163： 5173-5177。相信这些化合物是LFA-1的变构抑制剂。

新的对芳基硫代肉桂酰胺族可以用作LFA-1拮抗剂。参见Liu， G.；Link，J.T.；Pei，Z.；Reilly，E.B.；Nguyen，B.；Marsh，K.C.； Okasins ki，G.F.；von Geldern，T.W.；Ormes，M.；Fowler，K.；Gallatin， M.2000.“Discovery of novel p-arylthio cinnamides as antagonists of leukocyte function-associated antigen-1/intracellular adhesion molecule-1 interaction.1.Identification of an additional binding pocket based on an anilino diaryl sulfide lead.”J.Med.Chem.43，4015-4030。

其它小分子抑制剂族在出版物(参见Gadek，T.R.，Burdick，D. J.，McDowell，R.S.，Stanley，M.S.，Marsters，J.C.Jr.，Paris，K.J.， Oare，D.A.，Reynolds，M.E.，Ladner，C，Zioncheck，K.A.，Lee， W.P.，Gribling，P.，Dennis，M.S.，Skelton，N.J.，Tumas，D.B.， Clark，K.R.，Keating，S.M.，Beresini，M.H.，Tilley，J.W.，Presta， L.G.，和Bodary，S.C.2002.“Generation of an LFA-lantagonist by the transfer of the ICAM-I immunoregulatory epitope to a small molecule”， Science，295：1086-1089和在线补充资料)和专利，包括美国专利No. 6,872,735、美国专利No.6,667,318、美国专利No.6803384、美国专 利No.6,515,124、美国专利No.6331640，和美国申请，包括U.S. 20020119994、U.S.20040058968、U.S.20050080119、WO99/49856、 WO00/21920、WO01/58853、WO02/59114、WO05/044817，以及其它 文献中进行了公开。所有引用文献的全部内容结合进来作为参考。

在一些实施方案中，本文中描述的化合物与丽眼达(restasis)(环 孢霉素A)结合使用。本发明的化合物还可以用于提高T粘蛋白的产 生和/或泪液的产生。因此，本发明的化合物除了降低炎症外还可以通 过提高补偿一部分泪膜的粘蛋白的产生来提供附加的缓解。

已知LFA-1与ICAMs的相互作用参与各种自体免疫和炎症疾病， 尤其是那些涉及淋巴细胞(T-或B-细胞)、树突状单环细胞的疾病，其 中所述单环细胞将LFA-1表达在其表面上，它们是疾病的一部分炎症 成分。LFA-1拮抗剂可以特别用于治疗这些疾病，因为治疗靶标在疾 病组织内的表达被限制在免疫系统的浸润细胞内。LFA-1可以通过免 疫系统的细胞而将炎症信号的黏着、迁移、增殖和释放阻断在周边组 织内。对疾病组织内的炎症细胞具有效力的抗-LFA-1抗体，Raptiva 可以用于治疗干眼症。

许多患有干眼症的病人可能也患有潜在的自体免疫疾病，金格伦 综合症。目前认可的诊断标准包括临床病症和口干症状。本发明的化 合物可以以漱口制剂或锭剂形式用于治疗该症状。结合了本发明化合 物并混于固体或蜡状物质中的锭剂可以刺激唾液分泌，同时以持续释 放的形式释放出化合物。

可以用本发明的化合物治疗患有免疫介导的过敏疾病，包括鼻炎 的病人。例如，可将LFA-1拮抗剂局部输送至鼻、鼻管和/或鼻腔， 以减少与免疫和/或过敏响应有关的炎症。

当对本发明化合物进行局部施用，经口或鼻输送作为雾状溶液或 分散粉末的化合物时，其可以用于治疗哮喘或其它LFA-1介导的肺炎 疾病。

本发明化合物的乳膏制剂可以用于将LFA-1拮抗剂局部输送至 患有由LFA-1介导的皮肤病的皮肤处，所述皮肤病例如为湿疹和银屑 病。可用于该问题的化合物包括LFA-1拮抗剂及其前药，所述前-药 在用于炎性皮肤时转化为活性药物。将皮肤乳膏施用于眼睑外表面从 而将LFA-1拮抗剂输送过眼睑而到达眼睑内衬和中间的结膜组织以 及附属的泪腺处，人们希望使用这种乳膏来治疗LFA-1介导的眼睑和 眼部炎症，尤其是治疗干眼症。

已知在动物研究中，LFA-1拮抗剂的口服制剂在系统水平下经口 服途径施用时吸收性很差，则该制剂可以用以局部输送LFA-1拮抗 剂，以用于治疗胃肠(GI)道的炎症疾病，包括克罗恩氏病和肠综合症， 或者用于治疗由LFA-1或其它白细胞整联蛋白包括VLA4和Mac-1 介导的其它GI疾病。

II.用于该方法中的化合物

A.定义

如本文中所用的，术语“脂肪族的”包括饱和和不饱和的、直链 (非支链)或支链脂肪族烃，其任选被一个或多个官能团取代。本领 域普通技术人员应该理解，本文中的“脂肪族的”意图包括但不限于 烷基、链烯基、炔基部分。因此，如本文中所用的，术语“烷基”包 括直链和支链烷基。类似的规则适用于其他同类的术语，例如“链烯 基”、“炔基”等。

此外，如本文中所用的，术语“烷基”、“链烯基”、“炔基”等包 括取代和未取代的基团。如本文中所用的，在某些实施方案中，“低 级烷基”用于指示具有约1-6个碳原子的那些烷基(取代的、未取 代的、支链的或非支链的)。

在某些实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约 1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，本发明中所用的 烷基、链烯基和炔基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实 施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-8个碳原 子。在进一步的其它实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔 基含有约1-6个碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用 的烷基、链烯基和炔基含有约1-4个碳原子。因此，说明性脂肪族 基团包括但不限于，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、正 丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、 正己基、仲己基部分等，其同样可以含有一个或多个取代基。

链烯基包括但不限于，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基等。代表性 的炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基等。

如本文中所用的，术语“低级亚烷基”指与两个其它基团相连， 即在两端分别与另一个基团键合的烃链，例如亚甲基、亚乙基、亚丁 基等。这种取代基优选具有1-10个碳原子，更优选具有1-5个碳 原子。这种基团可以被取代，优选被氨基、乙酰基氨基(通过氮原子 键合的低级烷基羰基)取代，或者为环状低级烷基。后者意指饱和烃 环，优选总计具有3-10个亚甲基(包括连接的碳)，更优选3-6个 亚甲基。

如本文中所用的，术语“脂环的”指结合了脂肪族和环族化合物 的性质的化合物，其包括但不限于单环或多环脂肪族烃和桥接环烷基 化合物，其任选被一个或多个官能团取代。

本领域普通技术人员应该理解，本文中的“脂环的”意图包括但 不限于环烷基、环链烯基和环炔基部分，其任选被一个或多个官能团 取代。

因此，说明性的脂环族基团包括但不限于，例如环丙基、-CH2- 环丙基、环丁基、-CH2-环丁基、环戊基、-CH2-环戊基、环己基、-CH2- 环己基、环己烯基乙基、环己烷基乙基、降莰烷基部分等，其同样可 以含有一个或多个取代基。

如本文中所用的，术语“烷氧基”或“烷基氧基”指贯穿氧原子 的饱和或不饱和母体分子部分。在某些实施方案中，烷基含有约1- 20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，烷基含有约1-10 个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基含 有约1-8个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有 约1-6个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1 -4个脂肪族碳原子。

烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、 异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基、正己氧基等。

如本文中所用的，术语“低级烷氧基”指通过氧与另一个基团连 接的如上定义的低级烷基(即，烷基醚)，同样如上面的定义该烷基 可以为支链或非支链的。

如本文中所用的，术语“硫烷基”指通过硫原子与母体分子部分 相连的饱和或不饱和(即，S-链烯基和S-炔基)基团。在某些实施方 案中，烷基含有约1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中， 烷基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发 明中所用的烷基含有约1-8个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施 方案中，烷基含有约1-6个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案 中，烷基含有约1-4个脂肪族碳原子。硫烷基的例子包括但不限于 甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基等。

如本文中所用的，术语“低级烷硫基“指通过二价硫原子键合的 低级烷基，例如甲基巯基或异丙基巯基。低级亚烷基硫基意指在每个 端基处键合的这种基团。

如本文中所定义的，术语“烷基氨基”指具有-NHR′结构的基团， 其中R′为烷基。术语“氨基烷基”指具有NH2R′-结构的基团，其中 R′如此处的定义。在某些实施方案中，烷基含有约1-20个脂肪族碳 原子。在另外的某些实施方案中，烷基含有约1-10个脂肪族碳原子。 在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基含有约1-8个脂肪 族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1-6个脂肪族 碳原子。在另外的其它实施方案中，烷基含有约1-4个脂肪族碳原 子。烷基氨基的例子包括但不限于甲基氨基等。

本发明化合物的上述脂肪族(以及其它)部分的一些取代基的例 子包括但不限于脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳 香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基 杂芳基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基； 杂烷硫基；Rx独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂 环族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基 杂芳基部分，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、 杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链 或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述和此处描述的任何 芳基或杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。常用取代基的其它 例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中进行了说明。

通常，如本文中所用的，术语“芳香族部分”指具有优选3-14 个碳原子的稳定的单-或多环不饱和部分，每个环可以为取代或未取 代的环。在某些实施方案中，术语“芳香族部分”指在每个环原子上 具有垂直于环平面的p-轨道并且满足Huckel规则：其中环中的π电 子数为(4n+2)(其中n为整数)的平面环。本文中将不满足一个或多 个这些芳香性规则的单-或多环、不饱和部分定义为“非-芳香族的”， 并且包括在术语“脂环族”中。

通常，如本文中所用的，术语“杂芳族部分”指具有优选3-14 个碳原子的稳定的单-或多环不饱和部分，每个环可以为取代或未取 代的环而且在环内的环碳原子位置处包括至少一个选自O、S和N的 杂原子。在某些实施方案中，术语“杂芳香族部分”指包括至少一个 杂原子、在每个环原子上具有垂直于环平面的p-轨道并且满足Huckel 规则：其中环中的π电子数为(4n+2)(其中n为整数)的平面环。

应该理解，如本文中所定义的，芳香族和杂芳族部分可以通过烷 基或杂烷基部分进行连接，因此其还包括-(烷基)芳香族、-(杂烷基) 芳香族、-(杂烷基)杂芳族和-(杂烷基)杂芳族部分。因此，如本文中所 用的，措辞“芳香族或杂芳族部分”和“芳香族、(杂烷基)芳香族、 -(杂烷基)杂芳族和(杂烷基)杂芳族”是可以互换的。取代基包括但不 限于之前提及的任何取代基，即针对脂肪族部分或本文中公开的其它 部分所阐述的取代基，而且得到稳定的化合物。

如本文中所用的，术语“芳基”与该术语在本领域中的一般含义 并没有显著差别，其指包括至少一个芳香族环的不饱和环部分。在某 些实施方案中，“芳基”指具有一个或两个芳香族环的单-或双环碳环 体系，其中所述芳香族环包括但不限于苯基苯基、萘基、四氢萘基、 茚满基、茚基等。

如本文中所用的，术语“杂芳基”与该术语在本领域中的一般含 义并没有显著差别，其指具有5-10个环原子的环芳族基团，其中环 原子中的一个环原子选自S和N；0、1或2个环原子为另外的独立选 自S和N的杂原子；剩余的环原子为为碳，该基团通过任何环原子连 接在剩余分子上，例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、 咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、硫苯基、 呋喃基、喹啉基、异喹啉基等。

应该理解，芳基和杂芳基(包括双环芳基)可以为未取代或取代的 基团，其中的取代包括独立地以任意一个或多个下列部分代替基团上 的一个或多个氢原子，所述部分包括但不限于：脂肪族；脂环族；杂 脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂 烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基； 杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I； -OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH； -CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-C(O)N(Rx)2；-OC(＝O)Rx；-OCO2Rx； -OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx 独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、 杂芳族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷 基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、 杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代和未取代、支链或 非支链、饱和或不饱和基团，而且其中上述和此处描述的任何芳香族、 杂芳香族、芳基、杂芳基、-(烷基)芳基或-(烷基)杂芳基取代基可以为 取代或未取代的基团。此外，应该理解，任何两个相邻的基团连接在 一起可以代表4、5、6或7-元取代或未取代的脂环族-或杂环族部分。 常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中 进行了说明。

如本文中所用的，术语“环烷基”具体指具有3-7，优选3-10 个碳原子的基团。适当的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊 基、环己基、环庚基等，其在脂肪族、脂环族、杂脂肪族或杂环族部 分的情况下可以任选被取代基取代，所述取代基包括但不限于脂肪 族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基； 烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳基 氧；杂烷氧基；杂芳基氧；烷基硫；杂芳基硫；F；Cl；Br；I；-OH； -NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2； -CH2SO2CH3；-C(＝O)Rx；-C(O)N(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx； -OC(O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx 独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、 杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂 烷基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、 杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链 或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述和此处描述的任何 芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。 常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中 进行了说明。

如本文中所用的，术语“杂脂肪族”指主链上的一个或多个碳原 子已被杂原子取代的脂肪族部分。因此，杂脂肪族基团指含有一个或 多个代替碳原子的氧、硫、氮、磷或硅原子的脂肪族链。杂脂肪族部 分可以为直链或支链，饱和或不饱和部分。在某些实施方案中，杂脂 肪族部分上的一个或多个氢原子独立地被一个或多个包括但不限于 下述基团的部分取代：脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族； 杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；烷基杂芳基；烷氧基；芳基氧； 杂烷氧基；杂芳基氧；烷硫基；芳硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I； -OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH； -CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(＝O)Rx；-C(C＝O)N(Rx)2；-OC(＝O)Rx； -OCO2Rx；-OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中 Rx在每次出现时独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、 杂环族、芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、 杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂 环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代 或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且上述和此 处描述的任何芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基取代基可以为取代或 未取代的基团。常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具 体实施方案中进行了说明。

如本文中所用的，术语“杂环烷基”、“杂环”或“杂环的”指结 合了杂脂肪族和环化合物的性质的化合物，其包括但不限于具有5- 16个原子的饱和和不饱和单-或多环环系，而且其中至少一个环原子 为选自S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可以任选被氧化)，其中环 系任选被一个或多个本文中定义的官能团取代。在某些实施方案中， 术语“杂环烷基”、“杂环”或“杂环的”指其中至少一个环杂原子选 自S和N(其中氮和硫杂原子可以任选被氧化)的非-芳香族5-、6-或7- 元环或多环基团，其包括但不限于二-或三-基团，包括具有1-3个独 立地选自氧、硫和氮的杂原子的稠合六元环，其中(i)每个5元环具有 0-2个双键，每个6元环具有0-2个双键，每个7元环具有0-3 个双键，(ii)氮和硫杂原子可以任选被氧化，(iii)氮杂原子可以任选被 季铵化，和(iv)上面的任何杂环可以与芳环或杂芳环稠合。代表性的 杂环包括但不限于杂环，例如呋喃基、吡喃基、吡咯基、噻吩基、吡 咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶子基、哌 嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、二噁唑基、噻二 唑基、噁二唑基、四唑基、三唑基、噻三唑基、噻二唑基、噁二唑基、 吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、二噻唑基、二 噻唑烷基、四氢呋喃基，及其苯并稠合的衍生物。在某些实施方案中， 使用“取代的杂环，或杂环烷基或杂环”基团，且如本文中所用的， 其指上述定义的杂环，或杂环烷基或杂环基，环上的一个、两个或三 个氢原子独立地被下述但并不限于此的基团取代：脂肪族；脂环族； 杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基； 杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳基氧；杂烷氧 基；杂芳基氧；烷硫；芳基硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br； I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH； -CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(C＝O)Rx；-CC＝O)N(Rx)2；-OC(O)Rx； -OCO2Rx；-OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中 Rx在每次出现时独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂 环族、芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、 杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处所述的任何脂肪族、脂 环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代 或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述 和此处所述的任何芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基可以为取代或未 取代的。此外，应该理解，上述和此处所述的任何脂环族或杂环族部 分可以包括稠合在其上的芳基或杂芳基部分。

本文中所用的术语“卤代”和“卤素”选自氟、氯、溴和碘的原 子。

术语“卤代烷基”意指连接有一个、两个或三个卤素原子的上述 定义的烷基，其例如为这种基团：氯甲基、溴甲基、三氟甲基等。

如本文中所用的，术语“氨基”指伯(-NH2)、仲(-NHRx)、叔(-NRxRy) 或季胺(-N+RxRyR2)，其中Ry和Rz独立地为本文中定义的脂肪族、脂 环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族或杂芳香族部分。氨基的例子包括 但不限于甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、二乙基氨 基羰基、异丙基氨基、哌啶子基、三甲基氨基和丙基氨基。

如本文中所用的，术语“酰基”指具有通式-C(＝O)R的基团，其 中R为本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族或 杂芳香族部分。

如本文中所用的，术语“磺酰氨基”指通式-SO2NRxRy的基团， 其中Rx和Ry独立地为氢，或本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪 族、杂环族、芳香族、杂芳香族或酰基部分。

如本文中所用的，术语“苯甲酰氨基”指通式PhNRx的基团，其 中Rx为氢，或本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、 芳香族、杂芳族或酰基部分。

如本文中所用的，术语“C1-6亚烷基”指具有1-6个碳原子、在 基团的两端都具有自由价“-”、仅由碳和氢原子组成的取代或未取代 的、直链或支链的饱和二价基团。

如本文中所用的，术语“C2-6亚链烯基”指具有2-6个碳原子、 在基团的两端都具有自由价“-”、仅由碳和氢原子组成的取代或未取 代的、直链或支链的不饱和二价基团，而且其中的不饱和状态仅以双 键形式存在，且双键可以存在于链的第一个碳原子和剩余分子之间。

如本文中所用的，术语“脂肪族”、“杂脂肪族”、“烷基”、“链烯 基”、“炔基”、“杂烷基”、“杂链烯基”、“杂炔基”等包括取代和未取 代的、饱和和不饱和的和直链和支链基团。类似地，术语“脂环族”、 “杂环族”、“杂环烷基”、“杂环”等包括取代和未取代的和饱和和不 饱和的基团。此外，术语“环烷基”、“环链烯基”、“环炔基”、“杂环 烷基”、“杂环链烯基”、“杂环炔基”、“芳香族”、“杂芳香族”、“芳 基”、“杂芳基”等包括被取代和未被取代基团。

如本文中所用的，术语“天然氨基酸”指在天然产生的蛋白质中 发现的任何一种常见、天然产生的L-氨基酸：甘氨酸(GIy)、丙氨酸 (Ala)、缬氨酸(VaI)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(He)、赖氨酸(Lys)、精 氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、 苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸 (GIu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(GIn)、半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸 (Met)。

如本文中所用的，术语“非天然氨基酸”指非天然氨基酸的所有 氨基酸。其包括，例如α-、β-、D-、L-氨基酸残基，和下列通式的化 合物：

其中，侧链R不同于天然产生的氨基酸的侧链。

更通常，如本文中所用的，术语“氨基酸”包括天然氨基酸和非 天然氨基酸。

如本文中所用的，术语“生物电子等排体”通常指拥有类似的分 子形状和/或体积的两个或多个化合物或部分。在某些实施方案中，生 物电子等排体具有大约相同的电子分布。在另外的某些实施方案中， 生物电子等排体显示类似的生物学性质。在优选的实施方案中，生物 电子等排体拥有类似的分子形状和体积；具有大约相同的电子分布； 并且显示类似的生物学性质。

如本文中所用的，术语“药物可接受的衍生物”意指任何药物可 接受的盐、酯或这种酯的盐、该化合物的盐，或施用于病人后能够提 供(直接或间接)如本文中另外描述的化合物的任何其它加合物或衍 生物，或其代谢物或剩余物。因此，除了其它物质之外，药物可接受 的衍生物还包括前药。前药是通常能够显著降低药物活性的化合物衍 生物，其含有在体内易于除去而产生作为药物活性物质的母体分子的 另外部分。前药的例子是酯，其在体内裂解产生目标化合物。各种化 合物和物质的前药以及衍生母体化合物产生前药的方法是已知的，而 且可以用于本发明。下文中将详细讨论某些示例性药物组合物和药物 可接受的衍生物。

如本文中所用的，术语“药物可接受的盐”指适于药物用途，优 选适用于人和低级动物身体组织且没有不适当的疼痛、过敏反应等的 那些盐。胺、羧酸和其它类型化合物的药物可接受的盐是本领域已知 的。例如，S.M.Berge等在J Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977) 中详细描述了药物可接受的盐，其在此结合进来作为参考。该盐可以 在本发明化合物的最后分离和纯化过程中就地制备，或者如下文中总 述的，通过使游离碱或游离酸的官能团与适当的试剂反应而单独制 备。例如，游离碱官能团可以与适当的酸反应。此外，当本发明的化 合物带有酸性部分时，其适当的药物可接受的盐可以包括金属盐，例 如碱金属盐，如钠或钾盐；和碱土金属盐，如钙或镁盐。药物可接受 的无毒酸加合盐的例子为氨基与无机酸形成的盐，所述无机酸例如为 盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或与有机酸形成的盐，所述有 机酸例如为醋酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、丙二酸， 或利用本领域采用的其它方法，例如离子交换法制备的盐。其它药物 可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲 酸盐、硫氢酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸 盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸 盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸 盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸、乳酸盐、月桂酸盐、月桂 基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝 酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、栉酸盐(pectinate)、过硫酸盐、 3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸 盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一 烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、 钙、镁盐等。其它药物可接受的包括，如果适当，无毒铵盐、季铵盐， 和使用抗衡离子形成的胺阳离子，所述抗衡离子例如为卤化物离子、 氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根。

如本文中所用的，术语“药物可接受的酯”指在体内发生水解的 酯，其包括那些在人体内容易分解释放出母体化合物或其盐的酯。适 当的酯包括例如衍生自药物可接受的脂肪族醇化合物，尤其是烷醇、 链烯醇、乙二醇、环烷醇等，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有 不大于6个的碳原子。这些物质只是示范，并不以任何方式限制本领 域已知的酯的使用可能性。

如本文中所用的，术语“药物可接受的前药”指适于药物用途的 本发明化合物的那些前药，优选用于人和低级动物的身体组织并且没 有不当的毒性、疼痛、过敏反应等，而且对于意图的用途而言是有效 的，以及如果可能的话指本发明化合物的两性离子形式。术语“前药” 指在体内迅速转化得到上式的母体化合物的化合物，例如通过在血液 中水解进行转化。T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems，A.C.S.专题论文集系列14卷，和Edward B.Roche，ed.， Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中提供了透彻的论述，该两篇 文献据此结合进来作为参考。

B.该方法的示例化合物

在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的化合物包括式I化 合物：

式I

其中，R1和R2彼此独立地为氢、氨基酸侧链、-(CH2)mOH、 -(CH2)m芳基、-(CH2)m杂芳基，其中m为0-6、-CH(R1A)(OR1B)、 -CH(R1A)(NHR1B)、U-T-Q，或任选被U-T-Q取代的脂肪族、脂环族、 杂脂肪族或杂脂环族部分；其中U可以为不存在或下列之一：-O-、 -S(O)0-2-、-SO2N(R1A)、-N(R1A)-、-N(R1A)C(＝O)-、-N(R1A)C(＝O)-O-、 -N(R1A)C(＝O)-N(R1B)-、-N(R1A)-SO2-、-C(＝O)-、-C(O)-O-、-O-C(＝O)-、 芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、-C(＝O)-N(R1A)-、 -OC(＝O)N(R1A)、-C(＝N-R1E)-、-C(＝N-R1E)-O-、-C(＝N-R1E)-N(R1A)-、 -O-C(＝N-R1E)-N(R1A)-、-N(R1A)C(＝N-R1E)-、-N(R1A)C(＝N-R1E)-O-、 -N(R1A)C(＝N-R1E)-N(R1B)-、-P(＝O)(OR1A)-O-或-P(O)(R1A)-O-；其中T 为不存在，或脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂 芳基部分；Q为氢、卤素、氰基、异氰酸酯、-OR1B；-SR1B；-N(R1B)2、 -NHC(＝O)OR1B、-NHC(＝O)N(R1B)2、-NHC(＝O)R1B、-NHS O2R1B、 NHSO2N(R1B)2、-NHSO2NHC(＝O)OR1B、-NHC(＝O)NHSO2R1B、 -C(＝O)NHC(＝O)OR1B、C(＝O)NHC(＝O)R1B、-C(＝O)NHC(＝O)N(R1B)2、 -C(＝O)NHSO2R1B、-C(＝O)NHSO2N(R1B)2、C(＝S)N(R1B)2、-SO2R1B、 -SO2OR1B、-SO2N(R1B)2、-SO2-NHC(＝O)OR1B、-OC(＝O)-N(R1B)2、 -OC(＝O)R1B、-OC(＝O)NHC(＝O)R1B、-OC(＝O)NHSO2R1B、-OSO2R1B， 或脂肪族杂脂肪族、芳基或杂芳基部分，或其中R1和R2连接在一 起为脂环族或杂环族部分，或一起为

其中，R1A和R1B每次出现时独立地为氢、脂肪族、脂环族、杂 脂肪族、杂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分、 -C(＝O)R1C，或-C(＝O)NRICR1D；其中R1C和R1D每次出现时独立地 为氢、羟基或脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂 芳基部分；和R1E为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳基、 杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分、-CN、-OR1C、-NR1CR1D或 -SO2R1C；

其中R3为-C(＝O)OR3A、-C(＝O)H、-CH2OR3A、-CH2OC(＝O)-烷基、 -C(＝O)NH(R3A)、-CH2X0；其中R3A每次出现时独立地为氢、保护基 团、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳 基、烷基杂芳基、杂烷基芳基、杂烷基杂芳基部分，或药物可接受的 盐或酯，或者R3A与R1和R2连接在一起形成杂环族部分；其中X0 为选自F、Br或I的卤素；

R4每次出现时独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、脂肪族、脂环族、 杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分， 或为GRG，其中G为-O-、-S-、NRG2-、-CO-、-SO-、-SO2-、C(＝O)O-、 -C(＝O)NRG2-、C(＝O)-、-NRG2C(＝O)-或-SO2NRG2-，和RG1和RG2独 立地为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、 烷基芳基或烷基杂芳基部分；

n为0-4的整数；

AR1为单环或多环芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、脂环 族或杂环族部分；

按照价态允许的情况，A、B、D和E通过单键或双键连接；其 中A、D和E每次出现时独立地为C＝O、CRiRii、NRi、CRi、N、O、 S、-S(＝O)或SO2；其中Ri每次出现时独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、 脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或 烷基杂芳基部分，或者为-GRG1，其中，G为-O-、-S-、-NRG2、-CO-、 -SO-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRG2-、-OC(＝O)-、-NRG2C(＝O)-或-SO2NRG2-， 和RG1和RG2独立地为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、 芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分，或任意两个相邻基团连 接在一起代表脂环族、杂脂环族、芳基、或杂芳基部分；

p为0-4的整数；和

L为不存在或V-W-X-Y-Z，其中V、W、X、Y和Z每次出现时 独立地为不存在、C＝O、NRL1、-O-、-C(RL1)＝、＝C(RL1)-、-C(RL1)(RL2)、 C(＝N-ORL1)、C(＝NRL1)、-N＝、S(O)0-2；取代或未取代的C1-6亚链烯 基(alkenylidene)或C2-6亚链烯基(alkenylidine)链，其中最多两个 不相邻亚甲基单元独立地任选被下述基团代替：-C(＝O)-、-CO2-、 -C(＝O)C(＝O)-、-C(C＝O)NRL3-、-OC(＝O)、-OC(＝O)NRL3-、-NRL3NRL4-、 -NRL3NRL4C(＝O)-、-NRL3C(＝O)-、NRL3CO2-、NRL3C(＝O)NRL4-、 -S(＝O)-、-SO2-、-NRL3SO2-、-SO2NRL3、-NRL3SO2NRL4、-O-、-S-， 或-NRL3-；其中RL3和RL4每次出现时独立地为氢、烷基、杂烷基、 芳基、杂芳基或酰基；或脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳 基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分；RL1和RL2每次出现时独 立地为氢、羟基、被保护的羟基、氨基、被保护的氨基、硫代、被保 护的硫代基团、卤素、氰基、异氰酸酯、羧基、羧烷基、甲酰基、甲 酰氧基、叠氮基、硝基、脲基、硫脲基、硫氰基、烷氧基、芳氧基、 巯基、亚磺酰氨基、苯甲酰氨基、甲苯磺酰基，或脂肪族、脂环族、 杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分， 或其中的一个或多个RL1和RL2连接在一起，或者与V、W、X、Y 或Z之一连接在一起形成脂环族或杂环族部分或形成芳基或杂芳基 部分。

本发明方法的一些优选实施方案为式II化合物：

其中，R28为下列基团之一：

或

且R27为下列基团之一：

或

式II

且R29为氢、药物可接受的盐或酯。

本发明的一些优选实施方案为II′化合物

式II′

其中的取代情况如式II中所示。

本发明方法的化合物的一些特别优选的实施方案为式IIA、IIB和 IIC的化合物：

式IIA

其中各自的R17可以各自选自氢、药物可接受的盐和酯。

本发明方法的化合物的另一组优选实施方案为式III化合物：

式III

其中，Cy为任选被下述基团取代的芳香族碳环、芳香族杂环或 非-芳香族碳环或杂环：羟基(-OH)、巯基(-SH)、硫烷基、卤素(例如， F、Cl、Br、I)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、氨基烷基、脒基(-C(NH)-NH2)、 胍基(-NH2-C(NH)-NH2)、硝基、烷基或烷氧基。在特殊的实施方案中， Cy为3-5元环。在优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤 素(优选F或Cl)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、脒基、胍基、硝基、 烷基或烷氧基取代的5或6元非芳香族杂环。在更优选的实施方案中， Cy为任选被羟基、氧代、硫代、Cl、C1-4烷基(优选甲基)或C1-4烷酰 基(优选乙酰基、丙酰基或丁酰基)取代的5元非芳香族杂环。更优选， 该非芳香族杂环包括一个或多个杂原子(N、O或S)，并且任选被羟基、 氧代、巯基、硫代、甲基、乙酰基、丙酰基或丁基取代。在特殊的实 施方案中，该非芳香族杂环包括至少一个任选被甲基或乙酰基取代的 氮原子。在特别优选的实施方案中，该非-芳香族杂环选自下组：哌 啶、哌嗪、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑烷、噻唑烷，其任选被 羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基取代。在最优选的实施方案 中，Cy为选自下组的非-芳香族杂环：四氢呋喃-2-基、噻唑烷-5-基、 噻唑烷-2-酮-5-基和噻唑烷-2-硫酮-5-基和环丙烷吡咯烷。在优选的实 施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤素(优选F或Cl)、氧代(＝O)、 硫代(＝S)、氨基、脒基、胍基、硝基、烷基或烷氧基取代的5或6元 芳香族碳环或杂环。在更优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、氧 代、硫代、Cl、C1-4烷基(优选甲基)或C1-4烷酰基(优选乙酰基、丙酰 基或丁酰基)取代的5元芳香族碳环或杂环。更优选，芳香族或杂环 包括一个或多个杂原子(N、O或S)，并且任选被羟基、氧代、巯基、 硫代、甲基、乙酰基、丙酰基或丁基取代。

在另一个优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤素、 氧代、硫代、氨基、脒基、胍基、烷基、烷氧基或酰基取代的3-6元 碳环。在一个具体的实施方案中，碳环为饱和或部分不饱和环。在一 个具体的实施方案中，Cy为选自下组的碳环：环丙基、环丙烯基、 环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基。

X2为任选具有一个或多个被N、O、S、SO或SO2代替的碳原子 并且任选被羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代 取代的C1-5二价烃连接基团。在优选的实施方案中，X2具有至少一个 碳原子。经代替和取代可以在烃链内或在各端或两端处形成酰胺部分 (-NRC(＝O)-或-C(＝O)NR-)。其它部分包括氨磺酰基(-NRSO2-或 -SO2NR)、酰基、醚、硫醚和胺。在特别优选的实施方案中，X2为基 团-CH2-NR10-C(O)-，其羰基-C(O)-部分与Cy相邻(即，共价键合)，且 R10为烷基，即甲基，更优选为H。

K为任选被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤素-取代的 烃、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或酰基取代的碳环或杂 环。在具体的实施方案中，K为任选被卤素、羟基取代的芳基或杂芳 基。在特别优选的实施方案中，K为被卤素(优选Cl)或羟基取代的苯 基、呋喃-2-基、噻吩-2-基、苯基，优选在间位取代。

L2为具有一个或多个被N、O、S、SO或SO2代替的碳原子并且 任选被羟基、卤素、氧代、或硫代取代的二价烃；或者该烃的三个碳 原子被氨基酸残基代替。优选L2的长度为小于10个原子，更优选为 5或更小，最优选长度为5或3个原子。在特别优选的实施方案中， L2选自下组：-CH＝CH-C(O)-NR-CH2-、-CH2-NR10-C(O)-、 -C(O)-NR10-CH2-、-CH(OH)-(CH2)2-、-(CH2)2-CH(OH)-、-(CH2)3-、 -C(O)-NR10-CH(R7)-C(O)-NR10-、-NR10-C(O)-CH(R16)-NR10-C(O)-、 -CH(OH)-CH2-O-和-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每个R10独立地为H或 烷基，R16为氨基酸侧链。优选的氨基酸侧链包括非天然形成的侧链， 例如苯基，或者天然形成的侧链。优选的侧链为选自Phe、Tyr、Ala、 GIn和Asn的侧链。在优选的实施方案中，L2为 -CH＝CH-C(O)-NR10-CH2-，其中，其-CH＝CH-部分与K相邻(即，共 价键合)。在另一个优选的实施方案中，L2为-CH2-NR10-C(O)-，其中， 其亚甲基部分(-CH2-)与K相邻。

R5为H、OH、氨基、O-碳环或任选被氨基、碳环、杂环取代的 烷氧基，或药物可接受的盐或酯。在优选的实施方案中，R5为H、苯 基或任选被碳环，例如苯基取代的C1-4烷氧基。在特别优选的实施方 案中，R5为H。在另一个特别优选的实施方案中，R5为甲氧基、乙 氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、苯氧基或 苄氧基。在又一个特别优选的实施方案中，R5为NH2。在特别优选的 实施方案中，R5为乙氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R5为 异丁氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R5为被氨基取代的烷氧 基，所述氨基例如为2-氨基乙氧基、N-吗啉代乙氧基、N，N-二烷基氨 基乙氧基、季铵羟基烷氧基(例如，三甲基铵羟基乙氧基)。

R6-9独立地为H、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒基、胍基、 硝基或烷氧基；或R7和R8在一起形成任选被羟基、卤素、氧代、 硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基取代的稠合碳环或杂环。在一个特 殊的实施方案中，R6和R7独立地为H、F、Cl、Br或I。在另一个 特殊的实施方案中，R8和R9均为H。在另一个特殊的实施方案中， R6和R7之一为卤素，而另一个为氢或卤素。在特别优选的实施方案 中，R7为Cl而R6、R8和R9各自为H。在另一个特别优选的实施方 案中，R6和R7均为Cl而R8和R9均为H。

R10为H或任选被碳环或杂环取代的烃链。在优选的实施方案中， R10为H或烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔 丁基。在具体的实施方案中，R10为H。

本发明方法的进一步优选的实施方案为式IV的化合物：

式IV

其中，R11为下式基团

其中，A为氢、羟基、氨基或卤素，B为氨基、羧基、氢、羟基、 氰基、三氟甲基、卤素、低级烷基，或低级烷氧基；

R12为下式基团：

其中，R13为氢、羧基或低级烷基；n为0或1；U2、V2和W2 独立地为氢、卤素或低级烷基，条件是U2和V2不都为氢；X3为羰 基、苯基-取代的低级亚烷基、亚氨基、取代的亚氨基或磺酰基；Y2 为低级亚烷基，其可以被一个或多个氨基、取代的氨基、低级烷基或 环低级烷基取代，或Y2为低级亚链烯基或低级亚烷基硫基；

k为0或1；当k为1时，Z2为氢、低级烷硫基、-COOH、-CONH2、 氨基；当k为0或1时，Z2为1-金刚烷基、二苯基甲基、3-[[(5-氯代 吡啶-2-基)氨基]羰基]吡嗪-2-基、羟基、苯基甲乙÷氧基、2-氯-4-[[[(3- 羟基苯基)甲基]氨基]羰基]苯基、[2，6-二氯苯基)甲氧基]苯基；此外， 当k为0或1时，Z2可以为含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷 基或芳基，或者为含有2或3个环的稠合环系，该环可以独立地为含 有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，任何一个环可以为 未取代的，或被至少下列之一取代：卤素、氰基、氨基、取代的氨基、 氨基磺酰基、硝基、氧代、羟基、芳基、芳氧基、未取代的低级烷基、 卤素取代的低级烷基、低级烷氧基取代的低级烷基、低级烷氧基、低 级烷磺酰基、低级烷硫基、乙酰基、氨基羰基、肼基、羧基、烷氧基 羰基、乙酰氧基、或者还可以被氨基低级烷基取代；R20为氢、药物 可接受的盐或酯。

式IV化合物的优选实施方案具有式指示的立体化学结构：

式IV’

本发明方法的化合物的另一组优选实施方案为式V化合物：

式V

其中，R14为下式基团：

或

其中，R15为氢、羧基或低级烷基；U3、V3和W3独立地为氢、 卤素；或U3、V3和W3为低级烷基，条件是U3和V3不都为氢；X4 为羰基、苯基取代的低级亚烷基、亚氨基，包括氰基，或磺酰基的取 代的亚氨基；Y3为低级亚链烯基、低级亚烷基硫基，或为低级亚烷基， 其可以被氨基、乙酰基氨基、或环低级烷基取代；

k2为0或1；当k2为1时，Z为氢、低级烷基硫基、-COOH、 -T-CONH2-或氨基；当k2为0或1时，Z3为1-金刚烷基、二苯基甲基、 3-[[(5-氯吡啶-2-基)氨基]羰基]吡嗪-2-基；当k2为0或1时，Z可以为 含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，或者为含有2或3 个环的稠合环系，其中该环独立地为含有0-3个相同或不同的杂原 子的环烷基或芳基，其中任何一个环都可以为未取代的，或者被至少 下列之一取代：卤素、氰基、氨基、取代的氨基、氨基磺酰基、硝基、 氧代、羟基、芳基、芳氧基、未取代的低级烷基、卤素-取代的低级 烷基、低级烷氧基-取代的低级烷基、低级烷氧基、羧基、烷氧基羰 基或乙酰氧基；和，

R21为氢、其药物可接受的盐或酯。

式V化合物的优选实施方案中具有式V所指示的立体化学：

式V’

该方法的另一类优选化合物由式VI代表

式VI

其中，D4为单-、二-或三环饱和、不饱和，或芳香族环，每个环 的环中具有5-、6-或7个原子，其中环内的原子为碳或为1-4个选 自氮、氧和硫的杂原子，其中，任何碳或硫原子可以任选被氧化，每 个环被0-3个R31取代；L3为选自下列基团的二价连接基团

-L3-L2-L1-，

-L4-L3-L2-L1-，和

-L5-L4-L3-L2-L1-，

其中，L1选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、CR32、R32、CR32 het、 NR30和N，

L2选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、CR34R34′、CR34、 het NR30和N，

L3选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、CR35R35′、CR35、 het NR30和N，

L4为不存在，或选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、 CR36R36′、CR36、NR30和N，

L5为不存在，或选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、CR37R37′、CR37、 NR30和N，条件是L1-L3中只有一个可以为het，而且当L1-L3之一为 het时，L1-L5中的另一个可以为不存在，

其中，

R32、R32′、R34、R3 4′、R35、R35′、R36、R36′、R37和R37′各自独 立地选自R38、R39和U-Q-V-W，

任选地，R24和R34′独立地或者一起可以通过位于B上的取代基 RP而与B3形成饱和、不饱和或芳香族稠合环，该稠环在环中含有5、 6或7个原子，并且任选含有1-3个选自O、S和N的杂原子，其中， 任何S或N可以任选被氧化；任选地，R35和R35独立地或者一起， R36和R36′独立地或者一起可以通过位于D3上的取代基R31而与D3 形成饱和、不饱和或芳香族稠环，该稠环的环中含有5、6或7个原 子，并且任选含有1-3个选自O、S和N的杂原子，其中，任何S或 N可以任选被氧化，同样任选地，每个R32-R37、NR30或L1-L5中的N 与任何其它的R32-R37、NR30或L1-L5中的N一起可以形成5、6或7 元饱和、不饱和的同素-或杂环或芳香族，其任选含有1-3个另外的， 选自N、O和S的杂原子，其中，任何碳或硫原子可以任选被氧化， 每个环被0-3个R31取代；其中，s为0-2；B选自下列基团

和其中

其为含有5、6或7个原子的稠合杂或同素环，该环为不饱和、 部分饱和或芳香族环，杂原子选自1-3个O、S和N，

Y3选自CH和NR30；n为0-3；

G3选自氢和C1-C6烷基，任选G与T一起可以形成任选被-V-W 取代的C3-C6环烷基；

T3选自天然形成的α-氨基酸侧链，和U4-Q4-V4-W4；

U4为选自下列的任选被取代的二价基团：

C1-C6烷基、C0-C6烷基-Q、C2-C6链烯基-Q，和C2-C6炔基-Q：

其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38；

Q4为不存在或选自下列基团：

-O-、-S(O)s-、-SO2-N(R30)-、-N(R30)-、-N(R30)-C(＝O)-、-N(R30)- C(＝O)-N(R30)-、-N(R30)-C(＝O)-O-、-N(R30)-SO2-、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、 -het-、-C(＝O)-N(R30)-、-O-C(＝O)-N(R30)-、-PO(OR30)O-和-P(O)O-；

其中，

s为0-2，且

het为单-或双环的5、6、7、9或10元杂环，每个环含有1-4个 选自N、O和S的杂原子，其中杂环可以为饱和、部分饱和或芳香族 环，而且任何N或S任选被氧化，该杂环被0-3个R41取代；

V4为不存在，或为选自C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C0-C6烷基 -C6-C10芳基和C0-C6烷基-het的任选取代的二价基团；

其中，任何烷基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基或het 上的取代基为1-3个R31；

W4选自下列基团：

氢、OR33、SR42、NR30R30、NH-C(＝O)-O R43、NH-C(＝O)-NRnRn， NH-C(＝O)-R43、NH-SO2-R37、NH-SO2-NR30R30、 NH-SO2-NH-C(＝O)-R43、NH-C(＝O)-NH-SO2-R37、 C(＝O)-NH-C(＝O)-O-R43、C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、 C(＝O)-NH-C(＝O)-NR30R30′、C(＝O)-NH-SO2-R37、 C(＝O)-NH-SO2-NR30R30′、C(＝S)-NR30R30′、SO2-R37、SO2-O-R37、 SO2-NR37R37′、SO2-NH-C(＝O)-O-R43、SO2-NH-C(＝O)-NR30R30′、 SO2-NH-C(＝O)-R43、O-C(＝O)-NR30R30′、O-C(＝O)-R43、 O-C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、O-C(＝O)-NH-SO2R46和O-SO2-R37；

R44选自C(＝O)-R45、C(＝O)-H、CH2(OH)和CH2O-C(＝O)-C1-C6烷 基；

R38为被1-3个R38′取代的R38’或R38″；其中，

R38′选自下列基团：

氢、卤代(F、Cl、Br、I)、氰基、异氰酸酯、羧基、羧基-C1-C11 烷基、氨基、氨基-C1-C8烷基、氨基羰基、羧酰胺基、氨基甲酰基、 氨基甲酰氧基、甲酰基、甲酰氧基、叠氮基、硝基、咪唑基、脲基、 硫脲基、硫氰基、羟基、C1-C6烷氧基、巯基、亚磺酰氨基、het、苯 氧基、苯基、苯甲酰氨基、甲苯磺酰基、吗啉代、吗啉基、哌嗪基、 哌啶基，吡咯啉基、咪唑基和吲哚基；

R38″选自下列基团

C0-C10烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C10链烯基-Q-C0-C6烷基、C0-C10 炔基-Q-C0-C6烷基、C3-C11环烷基-Q-C0-C6烷基、C3-C10环链烯基 -Q-C0-C6烷基、C1-C6烷基-C6-C12芳基-Q-C0-C6烷基、C6-C10芳基-C1-C6 烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基-het-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基 -Q-het-C0-C6烷基、het-C0-C6烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基-Q-C6-C12 芳基和-Q-C1-C6烷基；

R43选自氢和取代或未取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10 炔基、C3-C11环烷基、C3-C10环链烯基、C1-C6烷基-C6-C12芳基、C6-C10 芳基-C1-C6烷基、C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷基、C6-C12芳基和het，

其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，任何 芳基或het上的取代基为1-3个R31；

R31选自R40和R41；

R41选自下列基团：

OH、OCF3、OR43、SR42、卤代(F、Cl、Br、I)、CN、异氰酸酯、 NO2、CF3、C0-C6烷基-NR30 R30′、C0-C6烷基-C(＝O)-NR30R30′、C0-C6 烷基-C(＝O)-R38、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C2-C8链烯基、C2-C8炔 基、C3-C6环烷基、C3-C6环链烯基、C1-C6烷基苯基、苯基C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基羰基、苯基C0-C6烷氧基、C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷 基、SO2-het、-O-C6-C12芳基、-SO2-C6-C12芳基、-SO2-C1-C6烷基和 het，其中任何烷基、链烯基或炔基可以任选被1-3个选自OH、卤代 (F、Cl、Br、I)、硝基、氨基和氨基羰基的基团取代，而且任何芳基 或het上的取代基为1-2个羟基、卤代(F、Cl、Br、I)、CF3、C1-C6 烷基、C1-C6烷氧基、硝基和氨基；

R42选自S-C1-C6烷基、C(＝O)-C1-C6烷基、C(＝O)-NR30R30′、C1-C6 烷基、卤代(F、Cl、Br、I)-C1-C6烷基、苄基和苯基；

R30选自下列基团：R43、NH-C(＝O)-O-R43、NH-C(＝O)-R43、 NH-C(＝O)-NHR43、NH-SO2-R46、NH-SO2-NH-C(＝O)-R43、 NH-C(＝O)-NH-SO2-R37、C(＝O)-O-R43、C(＝O)-R43、C(＝O)-NHR43、 C(＝O)-NH-C(＝O)-O-R43、C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、C(＝O)-NH-SO2-R46、 C(＝O)-NH-SO2-NHR37、SO2-R37、SO2-O-R37、SO2-N(R43)2、 SO2-NH-C(＝O)-O-R43、SO2-NH-C(＝O)-O-R43和SO2-NH-C(＝O)-R43；

R30′选自氢、羟基和取代或未取代的C1-C11烷基、C1-C11烷氧基、 C2-C10链烯基、C2-C10炔基、C3-C11环烷基、C3-C10环链烯基、C1-C6 烷基-C6-C12芳基、C6-C10芳基-C1-C-6烷基、C6-C10芳基-C0-C6烷氧基、 C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷基、C6-C12芳基、het、C1-C6烷基羰基、 C1-C8烷氧基羰基、C3-C8环烷基羰基、C3-C8环烷氧基羰基、C6-C11 芳氧基羰基、C7-C11芳基烷氧基羰基、杂芳基烷氧基羰基、杂芳基烷 基羰基、杂芳基羰基、杂芳基烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、C1-C6烷 基磺酰基、和C6-C10芳基磺酰基，其中任何烷基、链烯基或炔基上的 取代基为1-3个R38，而且任何芳基、het或杂芳基上的取代基为1-3 个R31；

R30和R30′与相连的氮一起可以形成任选取代的杂环，所述杂环选 自吗啉基、哌嗪基、硫吗啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、二氢吲哚基、 异二氢吲哚基、1，2，3，4-四氢-喹啉基、1，2，3，4-四氢异喹啉基、噻唑烷 基和氮杂二环壬基，其中的取代基为1-3个R38；R33选自氢和取代或 未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、 C3-C8环烷基和苯甲酰基，其中任何烷基上的取代基为1-3个R38，而 且任何芳基上的取代基为1-3个R40；

R40选自下列基团：OH、卤代(F、Cl、Br、I)、CN、异氰酸酯、 OR43、SR42、SOR43、NO2、CF3、R43、NR30R30′、NR30C(＝O)-O-R43、 NRC(＝O)-R43、C0-C6烷基-SO2-R43、C0-C6烷基-SO2-NR30R30′、 C(＝O)-R43、O-C(＝O)-R43、C(＝O)-O-R43和C(＝O)-NR30R30′，其中任何 烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基上的取 代基为1-3个R31；

R46为取代或未取代的、选自下列的基团：

C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C6环 链烯基、C0-C6烷基苯基、苯基-C0-C6烷基、C0-C6烷基-het和het-C0-C6 烷基，

其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且 任何芳基或het上的取代基为1-3个R31；

R45为取代或未取代的、选自下列的基团：羟基、C1-C11烷氧基、 C3-C12环烷氧基、C8-C12芳烷氧基、C8-C12芳环烷氧基、C6-C10芳氧 基、C3-C10烷基羰氧基烷氧基、C3-C10烷氧基羰氧基烷氧基、C3-C10 烷氧基羰基烷氧基、C5-C10环烷基羰氧基烷氧基、C5-C10环烷氧基羰 氧基烷氧基、C5-C10环烷氧基羰基烷氧基，C8-C12芳氧基羰基烷氧基、 C8-C12芳氧基羰氧基烷氧基、C8-C12芳基羰氧基烷氧基、C5-C10烷氧 基烷基羰氧基烷氧基、(R30)(R30)N(C1-C10烷氧基)-，

和

其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且 任何芳基或het上的取代基为1-3个R31，及其药物可接受的盐。

式I-VI的化合物还包括药物可接受的盐，和包括式I-VI的前药 化合物的酯，其中，R3A、R5R10、R17、R18、R19、R20、R21、R29和 R44上的羧酸酯可以为低级烷基或-CH2CH2-R22，其中R22为下列基团 之一：

或

其中，R23为氢或甲基，R24为低级烷基或低级环烷基。

式VI化合物的优选实施方案具有式VI′所指示的立体化学。

式VI’

本文中描述的一些化合物可以包括一个或多个不对称中心，因此 其可以包括单独的立体异构体、单独的非对映体及其任意的混合物。 此外，本发明的化合物可以含有双键的几何异构体，包括Z和E异 构体，而且可以作为纯的几何异构体或其混合物存在。

在一些优选实施方案中，本发明的方法采用下列化合物或其药物 可接受的盐或酯来实施：

本发明的化合物包括下列化合物或其药物可接受的盐或酯：

本发明的化合物可以通过本领域熟练技术人员公知的方法制备， 并且可以以多种方式纯化，包括在不同条件下结晶或沉积得到一种或 多种多晶型物。因此，本发明包括上述发明的化合物、其多晶型物、 其药物可接受的盐、其药物可接受的溶剂化物，及含有这些物质的药 物可接受的组合物。

本发明的化合物可以通过本领域熟练技术人员公知的方法制备， 并且可以以多种方式纯化，包括在不同条件下经结晶或沉积而得到一 种或多种多晶型物。因此，本发明包括上述发明的化合物、其多晶型 物、其药物可接受的盐、其药物可接受的溶剂化物，及含有这些物质 的药物可接受的组合物。

上述优选实施方案的例子意图说明一些潜在的治疗试剂，并不意 图以任何方式限制发明。本发明的方法可以采用抗体、抗体片断、肽 和其它合成分子来实施，从而用来治疗干眼病，其中所述其它合成分 子为采用上述的确定治疗试剂的方法可以确定的分子，其中上述确定 方法确定的治疗试剂为针对LFA-1和ICAM-I相互作用的选择性的、 有效的和直接的竞争性抑制剂。

本发明还提供了使用本发明中描述的化合物和诊断及治疗方法 的商业方法。一种商业方法包括确定肽或小分子的LFA-1拮抗性质， 和研发治疗由LFA-1介导的疾病的方法，优选通过局部输送的方式进 行治疗。由于未对该化合物进行系统给药，因此这些药物的系统药物 代谢动力学特征通常并未确定，因而针对可用于研发的药物的试验对 象群是庞大的。在一个实施方案中，将LFA-1拮抗剂研制成眼用制剂， 之后再改进并销售出去以用于治疗眼病，例如干眼症。Hut78试验通 常用于确定LFA-1的拮抗性质。除了LFA-1的拮抗性质之外，还可以 确定白细胞的拮抗性质。

III.给药

本发明的方法可以采用许多适当的给药方式，用以输送本文中描 述的方法的LFA-1拮抗剂。可以通过局部或系统给药来实现药物至受 影响的身体区域的输送。适当的制剂和附加载体在Remington“The Science and Practice of Pharmacy”(20版，Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore MD)中进行了描述，其全部教导据此结合进来作 为参考。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于施用于患者的药物组合 物，其含有：(i)有效量的治疗试剂；和(ii)适于口服给药的药物赋形剂。 在一些实施方案中，该组合物进一步含有：(iii)有效量的第二治疗试 剂。

为了减少眼病的炎症，优选将本发明的药物组合物输送至眼表 面、连通的神经分布、结膜、泪腺或睑板腺。预计的有效治疗可包括 通过下述途径施用本发明的治疗试剂：口服给药、局部给药、注射、 鼻内、直肠、经皮肤、经浸渍或涂覆装置，例如眼注入或移植，或者 经离子电渗，以及其它给药途径。

对于注射给药，可以经肌内、动脉内、皮下或静脉内注射药物组 合物。可以利用泵机理在预定时间内施用药物组合物。对于本发明的 一些实施方案，希望局部输送药物，因此可以在眼周、眼内、结膜下 (subconjunctively)、眼球后或眼房内进行注射。对于本发明的一些 实施方案，优选采用系统输送方式。

对于系统给药，可以将本发明的化合物制成口服药剂并口服给 药。对于可以将治疗试剂局部或系统分布的给药方式，可以经鼻内、 皮肤，或经一些口服给药形式施用本发明的组合物，例如使用漱口液 或锭剂，其中结合了根据G.I.而言吸收率很差的本发明化合物。对于 可以经部位或局部输送本发明组合物的给药方式，可以使用离子电渗 或局部给药。

此外，可以经泵-导液管体系将本发明的药物组合物施用至眼表 面，或者从连续或选择性释放装置内释放出来，所述装置例如为膜， 例如但不限于用作OcusertTM系统(Alza Corp，Palo Alto，CA)中的那 些装置。可以将药物组合物结合至隐形眼镜内、由隐形眼镜运载或者 附着在隐形眼镜上，然后该隐形眼镜被患者用废。可以将药物组合物 喷在眼表面上。

本发明的药物组合物可以与用于治疗病症或潜在疾病的其它疗 法结合给药。例如，在患者接受免疫抑制力疗法治疗的过程中，将本 发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药，其中所述免疫抑制疗法例如为 咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、甲氨蝶呤、抗疟药、麦考酚酸酯(mycophenolan mofetile)、达可如美(daclizumab)、静脉内免疫球蛋白疗法等。在另 一个例子中，在患者接受其它抗-炎治疗的治疗期间，将本发明的 LFA-1拮抗剂同时或分别给药，所述抗-炎治疗例如为环孢霉素A、皮 质甾类、NSAIDS、阿司匹林、脱氧土霉素。在进一步的例子中，在 患者接受激素疗法等的治疗期间，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分 别给药。在更进一步的例子中，在患者接受抗-过敏疗法、干眼症缓 解护理的治疗期间，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药，所述 干眼症缓解护理包括人工泪液或人工唾液、毒蕈碱M3受体拮抗剂以 提高含水分泌物、自体同源血清、透明质酸钠滴液等。这些实施例仅 用于说明并不意图限制本发明。在一些实施方案中，以单一剂量给药 LFA-1拮抗剂。当与另一种物质(例如，止痛药)共施用以治疗急性病 症时，也可以使用单一剂量的LFA-1拮抗剂。在一些实施方案中，分 多个剂量给药LFA-1拮抗剂(其本身或与其它药物结合)。剂量给药可 以为每日约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、 10次或多于10次。剂量给药还可以为约每月1次、每两周1次、每 周1次，或每隔一天1次。在一个实施方案中，该药物为止痛药。在 另一个实施方案中，LFA-1拮抗剂和另一种物质一起给药，每日施用 约1次-约10次。在另一个实施方案中，LFA-1拮抗剂和另一种治 疗物质持续给药小于约7天。在又一个实施方案中，共施用持续进 行大于约6、10、14、28天、2个月、6个月或1年。在一些情况下， 共施用的给药方式维持尽量长的时间，例如在针对慢性炎症进行剂量 给药时。本发明组合物的给药可以持续尽可能长的时间。在一些实施 方案中，将本发明的组合物给药大于1、2、3、4、5、6、7、14或28 天。在一些实施方案中，将本发明的组合物给药小于28、14、7、6、 5、4、3、2或1天。在一些实施方案中，基于病情进展状态而长期给 药本发明的化合物，例如用于治疗慢性疼痛。

在本发明的方法中，通过常规试验可以找到LFA-1拮抗剂的给药 剂量。每日剂量可以为约1×10-7g-5000mg。每日剂量范围可以取 决于LFA-1拮抗剂的形式，例如所用的酯或盐，和/或给药途径。例 如，对于系统给药，常用的每日剂量范围为例如，约1-5000mg，或 约1-3000mg，或约1-2000mg，或约1-1000mg，或约1-500mg，或 约1-100mg，或约10-5000mg，或约10-3000mg，或约10-2000mg， 或约10-1000mg，或约10-500mg，或约10-200mg，或约10-100mg， 或约20-2000mg，或约20-1500mg，或约20-1000mg，或约20-500mg， 或约20-100mg，或约50-5000mg，或约50-4000mg，或约50-3000mg， 或约50-2000mg，或约50-1000mg，或约50-500mg，或约50-100mg， 约100-5000mg，或约100-4000mg，或约100-3000mg，或约100-2000 mg，或约100-1000mg，或约100-500mg。在一些实施方案中，LFA-1 拮抗剂的每日剂量为约100、200、300、400、500、600、700、800、 900或1000mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为10mg。 在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为100mg。在一些实施方 案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为500mg。在一些实施方案中，LFA-1 拮抗剂的日剂量为1000mg。

对于局部输送至眼表面的情况而言，常用的日剂量范围为例如， 约1×10-7g-5.0g，或约1×10-7g-2.5g，或约1×10-7g-1.00g，或 约1×10-7g-0.5g，或约1×10-7g-0.25g，或约1×10-7g-0.1g，或约 1×10-7g-0.05g，或约1×10-7g-0.025g，或约1×10-7g-1×10-2g，或 约1×10-7g-5×10-3g，或约1×10-7g-2.5×10-3g，或约1×10-7g- 1×10-3g，或约1×10-7g-5×10-3g，或约1×10-6g-5.0g，或约1×10-6g -2.5g，或约1×10-6g-1g，或约1×10-6g-0.5g，或约1×10-6g-0.25g， 或约1×10-6g-0.1g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-5×10-2g， 或约1×10-6g-2.5×10-2g，或约1×10-6g-1×10-2g，或约1×10-6g-5×10-3 g，或约1×10-6g-2.5×10-3g，或约1×10-6g-1×10-3g，或约1×10-6g- 5×10-4g，或约1×10-5g-5g，或约1×10-5g-2.5g，或约1×10-5g-1g， 或约1×10-5g-0.5g，或约1×10-5g-0.25g，或约1×10-5g-0.1g，或约 1×10-5g-0.05g，或约1×10-5g-2.5×10-2g，或约1×10-5g-1×10-2g， 或约1×10-5g-5×10-3g，或约1×10-5g-2.5×10-3g，或约1×10-5g- 1×10-3g，或约1×10-5g-5×10-4g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂 的日剂量为约1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3g、1×10-2g、1×10-1g 或1g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-7g。在一 些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-5g。在一些实施方案 中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-3g。在一些实施方案中，LFA-1 拮抗剂的日剂量为1×10-2g。在一些实施方案中，单独的剂量范围为 约1×10-7g-5.0g，或约1×10-7g-2.5g，或约1×10-7g-1.00g，或约1×10-7 g-0.5g，或约1×10-7g-0.25g，或约1×10-7g-0.1g，或约1×10-7g- 0.05g，或约1×10-7g-0.025g，或约1×10-7g-1×10-2g，或约1×10-7g -5×10-3g，或约1×10-7g-2.5×10-3g，或约1×10-7g-1×10-3g，或约 1×10-7g-5×10-4g，或约1×10-6g-5.0g，或约1×10-6g-2.5g，或约1×10-5 g-1g，或约1×10-6g-0.5g，或约1×10-6g-0.25g，或约1×10-6g-0.1g， 或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-2.5×10-2 g，或约1×10-6g-1×10-2g，或约1×10-6g-5×10-3g，或约1×10-6g- 2.5×10-3g，或约1×10-6g-1×10-3g，或约1×10-6g-5×10-4g，或约1×10-5 g-5g，或约1×10-5g-2.5g，或约1×10-5g-1g，或约1×10-5g-0.5g， 或约1×10-5g-0.25g，或约1×10-5g-0.1g，或约1×10-5g-0.05g，或约 1×10-5g-2.5×10-2g，或约1×10-5g-1×10-2g，或约1×10-5g-5×10-3g， 或约1×10-5g-2.5×10-3g，或约1×10-5g-1×10-3g，或约1×10-5g-5 ×10-4g。在一些实施方案中，将如上所述的单一剂量每日重复1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10次。

对于其它给药形式，日剂量可以为约所述的用于系统给药的范 围，或者可以为约所述的用于局部给药的范围。

IV制剂

可以将本发明的化合物制成本领域公知的混在适当载体中的无 菌溶液或悬浮液。适当的制剂和附加载体在Remington″The Science and Practice of Pharmacy″(20版，Lippincott Williams & Wilkins， Baltimore MD)中进行了描述，其全部教导据此结合进来作为参考。

对于可注射制剂，载体可以选自本领域公知的适当载体，包括水 溶液或油悬浮液，或乳液和芝麻油、玉米油、棉籽油和花生油，以及 酏剂、甘露糖醇、葡萄糖或无菌水溶液，以及类似的药物载体。

可以对药物浓度进行调节，如本领域公知的，可以将缓冲液pH 值和等渗性调节至与静脉注射相容。

口服制剂可以为片剂、胶囊、药片、药丸、干胶片(wafers)、口 胶、锭剂、水溶液或悬浮液、油状悬浮液、糖浆、酏剂或可分散的粉 末或颗粒等，而且可以按照本领域已知的任何方式制备。口服制剂还 可以含有甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。

用于片剂形式的药物可接受的赋形剂可以包括无毒成分，例如惰 性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠等。

在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀 粉，而且通常加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药， 可用的载体包括乳糖和玉米淀粉。载体和赋形剂的其它非限制性例子 包括牛乳、糖、某些类型的粘土、凝胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸钙、 滑石、植物脂肪或油、口胶和乙二醇。

可用于形成药物组合物和本发明的剂型的表面活性剂包括但不 限于亲水性表面活性剂、亲油性表面活性剂及其混合物。也就是说， 可以使用亲水性表面活性剂的混合物，可以使用亲油性表面活性剂的 混合物，或者可以使用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲油性 表面活性剂的混合物。

适当的亲水性表面活性剂通常具有至少10的HLB值，而适当的 亲油性表面活性剂通常具有小于约10的HLB值。用于表征非离子型 两性化合物的亲水性和亲油性的经典参数是亲水-亲油平衡(“HLB” 值)。具有较低HLB值的表面活性剂亲油性或疏水性更强，并且在油 中的溶解性更大，而具有较高的HLB值的表面活性剂亲水性更强， 并且在水溶液中的溶解性更大。通常认为亲水性表面活性剂为HLB 值大于约10的那些化合物，以及HLB范围通常不适用的阴离子、阳 离子或两性离子化合物。类似地，亲油性(即，疏水性)表面活性剂为 HLB值等于或小于约10的化合物。但是，表面活性剂的HLB值仅是 常用于进行工业、药物和化妆品乳液判断的粗略的指导。

亲水性表面活性剂可以为离子型或非离子型。适当的离子型表面 活性剂包括但不限于烷基铵盐；梭链孢酸盐；氨基酸、低聚肽和多肽 的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和 氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血 磷脂及其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多 库酯钠；酰基乳酸酯；单和二甘油酯的单和二乙酰基化酒石酸酯；琥 珀酰化的单和二甘油酯；单和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

在前面提及的组中，优选的离子型表面活性剂包括例如：卵磷脂、 溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基 硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单和二甘油酯的单和二 乙酰基化酒石酸酯；琥珀酰化的单和二甘油酯；单和二甘油酯的柠檬 酸酯；及其混合物。

离子型表面活性剂可以为卵磷脂、溶血卵磷脂、卵磷脂、脑磷酯、 磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰 乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG- 磷脂酰乙醇胺、聚乙烯吡咯烷酮-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸乳酸盐、硬 脂酰-2-乳酸盐、硬脂酰乳酸盐、琥珀酸单甘油酯、单/二甘油酯的单/ 二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、肌氨胆酸盐、已酸盐、 辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、十四烷酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、蓖麻 醇酸盐、亚油酸盐、亚麻酸盐、硬脂酸盐、月桂烷硫酸盐、四乙酰基 硫酸盐、多库酸盐、月桂酰肉毒碱、棕榈酰肉碱、十四酰肉毒碱，及 其盐和混合物。

亲水性非离子型表面活性剂可以包括但不限于烷基糖苷；烷基麦 芽糖苷；烷基硫糖苷；月桂酰聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚，例 如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚，例如聚乙二醇烷基酚；聚氧化 烯烷基酚脂肪酸酯，例如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二 酯；聚乙二醇脂肪酸甘油酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯山梨聚糖脂 肪酸酯，例如聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯；多元醇与至少一个下组物 质的亲水性酯交换产物：甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾 醇；聚氧乙烯甾醇，其衍生物和类似物；聚氧乙烯化维生素及其衍生 物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇山梨聚 糖脂肪酸酯，和多元醇与至少一个下组物质的亲油性酯交换产物：甘 油三酸酯、植物油和氢化植物油。多元醇可以为甘油、乙二醇、聚乙 二醇、山梨糖醇、丙二醇、季戊四醇或糖类。

其它亲水性-非-离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸 酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32 二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20 二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15 硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸 酯、PEG-20二月桂酸酯，PEG-25甘油基三油酸酯、PEG-32二油酸 酯、PEG-20甘油基月桂酸酯，PEG-30甘油基月桂酸酯，PEG-20甘 油基硬脂酸酯、PEG-20甘油基油酸酯、PEG-30甘油基油酸酯、PEG-30 甘油基月桂酸酯、PEG-40甘油基月桂酸酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50 氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40 氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸酯/ 辛酸酯甘油酯、PEG-8癸酸酯/辛酸酯甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯， PEG-30胆甾醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-20三油 酸酯、PEG-40山梨聚糖油酸酯、PEG-80山梨聚糖月桂酸酯、多山醇 酯20、多山醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10 油烯基醚、POE-20油烯基醚、POE-20硬脂酰基醚、儿茶酚基PEG-100 琥珀酸酯、PEG-24胆甾醇、聚甘油基-10油酸酯、Tween 40、Tween 60、 蔗糖单硬脂酸酯、乳糖单月桂酸酯、乳糖单棕榈酸酯、PEG 10-100 壬基酚同系物、PEG 15-100辛基酚同系物，和泊洛沙母。

仅作为举例的形式，适当的亲油性表面活性剂包括：脂肪醇；脂 肪酸甘油酯；乙酰基化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪 酸酯；山梨聚糖脂肪酸酯；聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯；甾醇和甾醇 衍生物；聚氧乙烯化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖 醚；单和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与至少一个下组物质的疏水 性酯交换产物：甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇；油溶 性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在该组中，优选的亲油性表面 活性剂包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸丙二醇酯及其混合物，或者为多元 醇与至少一个下组物质的疏水性酯交换产物：植物油、氢化植物油和 三甘油酯。

表面活性剂可以用在本发明的任何制剂中，只要其使用不会产生 矛盾。在本发明的一些实施方案中，优选不使用或使用有限种类的表 面活性剂。

当本发明的化合物制成口服给药形式时，可能希望采用胃滞留制 剂，用以提高胃肠(GI)道的吸收。在胃中停留若干小时的制剂可以缓 慢释放出本发明的化合物并且可以提供持续的释放，这在本发明的一 些实施方案中可能是优选的。这种胃滞留制剂的公开内容可以在下 述文献中找到：Klausner，E.A.；Lavy，E.；Barta，M.；Cserepes， E.；Friedman，M.；Hoffman，A.2003“Novel gastroretentive dosage forms： evaluation of gastroretentivity and its effect on levodopa in humans.” Pharm.Res.20，1466-73，Hoffman，A.；Stepensky，D.；Lavy，E.； Eyal，S.Klausner，E.；Friedman，M.2004“Pharmacokinetic and pharmacodynamic aspects of gastroretentive dosage forms”Int.-J.Pharm. 11，141-53，Streubel，A.；Siepmann，J.；Bodmeier，R.；2006 “Gastroretentive drug delivery systems”Expert Opin.Drug Deliver.3， 217-3，和Chavanpatil，M.D.；Jain，P.；Chaudhari，S.；Shear，R.； Vavia，P.R.“Novel sustained release，swellable and bioadhesive gastroretentive drug delivery system for olfo×acin”Int.J.Pharm.2006 epub 3月24。可以采用扩展、浮动和生物黏着技术来使本发明化合物 的吸收率最大化。

鼻内给药可以采用由本发明化合物组成的可呼吸的颗粒的气溶 胶悬浮液，其被患者吸入。经肺部吸收或经由鼻泪管而与泪囊组织接 触从而将药物有效量的本发明化合物吸收到血液流中，随后将其输送 到泪囊组织中。可呼吸的颗粒可以为具有适当粒度的固体或液体，如 本领域已知的吸收有效的情况。吸入或吹入组合物包括药物可接受 的、水或有机溶剂的溶液和悬浮液或其混合物，和粉末。液体或固体 组合物可以含有适当的如前所述的药物可接受的赋形剂。优选，该组 合物通过口服或鼻内呼吸途径进行局部或系统给药。可以使用惰性气 体对溶于优选的药物可接受的溶剂中的组合物进行喷雾。可以从喷雾 装置直接吸入喷雾溶液，或者可以将喷雾装置连接在面罩或间歇式正 压呼吸机上。可以从以适当形式输送制剂的装置中施用溶液、悬浮液 或粉末组合物，优选通过口或鼻内形式。

对于经皮肤给药，可以采用本领域已知的任何适当制剂，所述制 剂为溶液、悬浮液、凝胶、粉末、乳膏、油、固体、二甲基亚砜(DMSO)- 基溶液或用于贴剂的脂质体制剂或本领域已知的其它输送体系。药物 组合物还可以包括适当的固体和凝胶相载体或赋形剂，其为具有下述 作用的化合物：能够提高治疗分子的透过性或者有助于治疗分子的输 送，即透过皮肤角质层渗透障碍的透过性和输送。对于局部制剂领域 的熟练技术人员而言，有许多已知的渗透性-增强分子。这种载体和 赋形剂的例子包括但不限于湿润剂(例如，尿素)、乙二醇类(例如，丙 二醇)、醇类(例如，乙醇)、脂肪酸(例如，油酸)、表面活性剂(例如， 十四酸异丙酯和月桂基硫酸钠)，吡咯烷酮、单月桂酸甘油酯，亚砜， 萜烯(例如，薄荷醇)、胺类、酰胺类、链烷烃、烷醇、水、碳酸钙、 磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、凝胶和聚合物，例如聚乙 二醇。用于输送药物试剂的皮肤贴剂的组成和用途是本领域已知的。 参见，例如，美国专利No.5,023,252、4,992,445和5,001,139。这种 贴剂可以制成连续、脉动或按需输送药物试剂的形式。

对于局部给药，如本领域中已知的，可以使用眼科领域使用的用 于眼局部给药的所有制剂(例如，滴眼液、插入物、眼罩(eye pack)、 浸渍的隐形眼镜、泵送体系、二甲基亚砜(DMSO)-基溶液悬浮液、脂 质体和眼膏)，和皮肤科和耳鼻喉科领域使用的用于外部使用的所有 制剂(例如，药膏、乳膏、凝胶、粉末、油膏、洗液、晶体形式、泡 沫和喷雾)。此外，可以使用用于局部给药于皮肤和鼻部通道的黏液 薄膜的所有适当制剂来输送本发明的化合物。本发明的药物组合物可 以为用于局部或口服给药的脂质体制剂，适合于本发明目的的任何一 种形式都是本领域已知的。

可以用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限 于硬脂酸酯钙、硬脂酸酯镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨糖醇、 甘露糖醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢 化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉 米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂，或其混 合物。其它润滑剂包括，例如硅酸盐硅胶、合成硅的凝结气雾剂，或 其混合物。任选以小于药物组合物的约1重量％的量加入润滑剂。

此外，预计可以将本发明的化合物可释放地连接在用于持续释放 制剂的生物相容聚合物中，其中所述持续释放型制剂位于用于局部或 系统给药的插入物上、内部或与其连接。可以采用水溶性聚合物从生 物相容的聚合物中受控释放，用以同样形成可点滴的制剂。

可以将活性成分溶解在无菌水溶液，例如生理盐水、缓冲溶液等 中，或者在使用之前将粉末组合物结合进来并使其溶解而制得滴眼 液。如本领域中已知的，还可以选择其它载体，包括但不限于：平衡 盐溶液、食盐溶液、水溶性聚醚，例如聚乙二醇、聚乙烯，例如聚乙 烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素衍生物，例如甲基纤维素和羟丙基 甲基纤维素、石油衍生物，例如矿物油和白矿脂、动物脂肪，例如羊 毛脂，丙烯酸聚合物，例如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪，例如花生 油和多糖，例如右旋糖苷和葡糖胺聚糖基，例如透明质酸钠。如果希 望，还可以加入常用于滴眼液中的添加剂。这种添加剂包括等渗试剂 (例如，氯化钠等)，缓冲试剂(例如，硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠 等)，防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇等)，增稠剂(例 如糖，如乳糖、甘露糖醇、麦芽糖等；例如透明质酸或其盐，如透明 质酸钠、透明质酸钾等；例如粘多糖，如硫酸软骨素等；例如聚丙烯 酸钠、羧基乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡 咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤 维素、羟丙基纤维素，或本领域熟练技术人员已知的其它试剂)。

通过在组合物中使用表面活性剂或其它适当的共溶剂可以提高 本发明组合物的组分溶解性。这种共溶剂包括多山醇酯20、60和80、 Pluronic F68、F-84和P-103、环糊精或本领域熟练技术人员已知的其 它试剂。所用的这种共溶剂的水平可以为约0.01％-2％重量。

可以将本发明的组合物制成不含防腐剂的无菌单元剂型。可以将 本发明的组合物包装为多剂量形式。优选在使用过程中采用防腐剂来 防止微生物污染。适当的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫汞撒、三氯叔丁 醇、甲基帕拉贝、丙基帕拉贝、苯乙醇、依地酸钙钠、山梨酸、Onamer M，或本领域熟练技术人员已知的其它试剂。在现有技术的眼用产品 中，这种防腐剂的使用水平为0.004％-0.02％。在本申请的组合物中， 防腐剂，优选苯扎氯铵的使用水平为0.001％-小于0.01％，例如 0.001％-0.008％，优选约0.005％重量。已经发现，0.005％的苯扎氯 铵浓度足以使本发明的化合物防止微生物的侵袭。

用于本发明中的活性成分的给药量和给药次数根据病人的性别、 年龄和体重、治疗症状、希望的治疗效果、给药途径和治疗周期而变 化。对于成人用滴眼液来说，含有本发明化合物的制剂的浓度可以为 约0.0001-10.0 W/V％、约0.005-10.0 W/V％、约0.01-10.0 W/V％、 约0.05-10.0 W/V％、约0.1-10.0 W/V％、约0.5-10.0 W/V％、约 1.0-10.0 W/V％、约20-10.0 W/V％、约3.0-10.0 W/V％、约4.0- 10.0 W/V％，或约5.0-10.0 W/V％。本发明一个实施方案的制剂具有 约1.0-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂具有 约0.01-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂具 有约5.0-10.0 W/V％的本发明化合物。给药方式可以为每日每只眼施 用若干次，优选1-10次，更优选1-4次，最优选每日1次。给药 的液滴大小可以为约10-100μl、约10-90μl、约10-80μl、约10-70μl、 约10-60μl、约10-50μl、约10-40μl、约10-30μl、约20-100μl、约20-90μl、 约20-80μl、约20-70μl、约20-60μl、约20-50μl、约20-40μl或约20-30μl。 本发明的一个实施方案给药10-30μl的滴眼液。本发明的一个实施方 案给药10-100μl的滴眼液。本发明的一个实施方案给药20-50μl的滴 眼液。本发明的一个实施方案给药10-60μl的滴眼液。

本发明的制剂可以每次给药若干滴，1-4滴，优选1-3滴，更 优选1-2滴，最优选每日1滴。

在软膏、乳膏、洗液或喷雾制剂中，制剂中的本发明化合物的浓 度可以为约0.0001-10.0 W/V％、约0.005-10.0 W/V％、约0.01-10.0 W/V％、约0.05-10.0 W/V％、约0.1-10.0 W/V％、约0.5-10.0 W/V％、 约1.0-10.0 W/V％、约20-10.0 W/V％、约3.0-10.0 W/V％、约4.0 -10.0 W/V％，或约5.0-10.0 W/V％。本发明一个实施方案的制剂具 有约1.0-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂 中含有约0.01-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的 制剂中含有约5.0-10.0 W/V％的本发明化合物。这些制剂可以每日 施用或喷雾若干次，优选1-6次，更优选1-4次，最优选每日1次。 可以根据炎症或感染的程度适当提高和降低每种成分的化合比例。

本发明的制剂可以进一步包括其它药物活性成分，只要其不与本 发明的目的相矛盾。在多种活性成分相结合的情况下，考虑到其效果 和安全性可以适当提高或降低其各自的含量。

V.试剂盒

本发明还提供试剂盒。试剂盒包括适当包装的本发明的化合物， 和可以包括使用说明、临床研究讨论、副作用列表等的书写材料。试 剂盒还可以进一步含有与本发明的LFA-1共施用的另一种治疗试剂。 在一些实施方案中，将该治疗试剂和本发明的LFA-1拮抗剂作为在试 剂盒的分隔容器内的分开组合物来提供。在一些实施方案中，将该治 疗试剂和本发明的LFA-1拮抗剂作为试剂盒容器内的单一组合物来 提供。适当的包装和其它使用物件(例如，用于液体制剂的量杯、使 在空气中的暴露最小化的铝箔包装、配药器等)是本领域已知的，其 也可以包括在试剂盒中。

VI.可用于本发明治疗方法中的新化合物的确定方法

A.试验方式背景

1.配体亲合力对二价阳离子的依赖性

二价阳离子在整联蛋白/配体的结合中起至关重要的作用，而且其 存在对于这些相互作用的试验研究是必需的。参见Hynes，R.O.1992. Integrins：Versatility，modulation，and signaling in cell adhesion，Cell， 69：11-25；Humphries，M.J.1996.Integrin activation：the link between ligand binding and signal transduction，Curr.Op.Cell Biol.，8：632-640. 在两组常用的二价阳离子条件下，使用荧光偏振测量ICAM-I-Ig和化 合物1、3和4对LFA-1(结构如表4所示)的亲合力。首先在直接结 合试验中测量化合物1对LFA-1的亲合力，然后在与亲合LFA-1的化 合物1进行竞争的条件下测量ICAM-I-Ig和化合物3和4对LFA-1的 亲合力(图4和图5中的表1)。未对结合在IDAS上的A-286982的亲 合力进行测量，因为其不与结合在LFA-1上的化合物发生竞争(参见 下文)。在对于ICAM-I-Ig而言的不同的阳离子条件下测量化合物1、 3和4对LFA-1的亲合力的类似变化。在MnCl2存在下测得的小分子 亲合力是在CaCl2和MgCl2存在下测得的亲合力的至少10倍。不存 在二价阳离子时这些小分子不与LFA-1结合(数据未给出)。类似地， 在MnCl2存在下以同样方法测量在溶液中可溶性蛋白，ICAM-I-Ig对 LFA-1的结合亲合力，其比在CaCl2和MgCl2存在下的亲合力至少好 4倍。因此，与包括A-286982的LFA-1拮抗剂类型不同，A-286982 已知与结构域I的IDAS区域结合(Liu，G.，Huth，J.R.，Olejniczak， E.T.，Mendoza，R.，DeVries，P.，Leitza，S.，Reilly，E.B.，Okasinski， G.F.，Fesik，S.W.，和von Geldern，T.W.2001.Novel p-arylthio cinnamides as antagonists of leukocyte function-associated antigen-1/intracellular adhesion molecule-1 interaction.2.Mechanism of inhibition and structure-based improvement of pharmaceutical properties，J.Med.Chem.，44：1202-1210.，Huth，J.R.，Olejniczak， E.T.，Mendoza，R.，Liang，H.，Harris，E.A.S.，Lupher，M.L.Ir.， Wilson，A.E.，Fesik，S.W.，和Staunton，D.E.2000.NMR and mutagenesis evidence for an I domain allosteric site that regulates lymphocyte function-associated antigen 1 ligand binding，Proc.Natl. Acad.ScL U.S.A.，97：5231-5236.)，而且据报导其以非阳离子-依赖型 方式与LFA-1结合(Welzenbach，K.，Hommel，U.，和Weitz-Schmidt，G. 2002.Small molecule inhibitors induce conformational changes in the I domain and the I-like domain of lymphocyte Function-Associated Antigen-1，J.Biol.Chem.，277：10590-10598)，ICAM-I-Ig和由化合物 1-4代表的LFA-1类拮抗剂共享一个对LFA-1结合敏感的二价阳离 子(表1)。因此，为了确定以类似方式与ICAM-I-Ig和化合物1-4结 合的LFA-1/ICAM-I拮抗剂，在MnCl2存在下，在类似条件下进行本 文中报道的所有结合试验，已知其可以使ICAM-I和这些阳离子-敏感 拮抗剂的结合都达到最大化。

2.化合物5对LFA-1αL亚基的交联

为了确定小分子拮抗剂的结合点，将化合物5、化合物3的氚- 标记的光激活类似物结合在LFA-1上，之后进行光致交联。为了使特 定的、高亲合力交联作用最大化，必须用凝胶过滤样品，用以在辐射 之前除去未结合或弱结合的化合物5(图6，通道e对f，和g对h)。 不进行凝胶过滤则化合物5对LFA-1α亚基、β亚基和杂二聚物具有 显著的交联作用(约200,000的带)，而在凝胶过滤试样中不会观察到 非特定的交联作用(数据未示出)。在凝胶过滤条件下，化合物5具体 地只与αL亚基发生交联(图6，泳道c和g)。而且，在温育过程中化 合物3的存在会充分降低氚对αL亚基的结合(图6，道e对g)。类似 地，在不进行凝胶过滤的条件下，化合物3的存在会使氚结合入αL 亚基、β2亚基和杂二聚体的情况下稍微减少(图6，泳道fVs.h)。当使 用分离出来的、结构完好的αL或β2亚基的凝胶过滤试样时，没有 发生化合物5的交联(数据未示出)。因此，借助LFA-1杂二聚体提供 了在凝胶过滤之后所必需的高亲合力结合位。在分离出来的αL亚基 中高亲合力位的缺少与之前的、表明xVA143与分离出来的结构域I 之间缺少相互作用的研究(Welzenbach等，2002)相一致。

通过下述方式进一步定义交联位：用羟胺打碎亲合标记的αL亚 基，用电泳法分离该片段，然后在放射性同位素标记的片段上进行 N-末端排序，用以确定其在蛋白质序列中的位置。确定两个序列，第 一个从残基1开始(实际序列：YNLDVRGARSFS)，第二个从残基30 开始(实际序列：GVIVGAPGEGNST)(Larson，R.S.，Corbi，A.L.， Berman，L.，和Springer，T.1989.Primary structure of the leukocyte function-associated molecule-1 alpha subunit：an integrin with an embedded domain defining a protein superfamily，J.Cell Biol，.108： 703-712)。在SDS-PAGE(50-60 kDa)上对其大小进行确定，两种肽均 为约500个氨基酸长；该片段大小与接下来的两个预测的羟胺裂解位 (N-G)，N507和N530相一致(Larson等，1989，Bornstein，P.1969.The nature of a hydroxyamine-sensitive bond in collagen，Biochem.Biophys. Res.Comm.，36：957-964)。未将标记结合在亚基一半处的C-末端上。 试图对交联位作进一步改进，但是并未成功。用溴化氰或Lys-C对标 记的αL亚基进行有限地消化之后，不能重新获得可定义的肽。

3.化合物2B与缺少结构域I的LFA-1的结合

通过制备缺少结构域I的αL构建体来说明结构域I在化合物2B 和相关的类似物与LFA-1的结合中的作用。将单独的β2构建体(模拟 物)或与缺少结构域I的构建体或野生型αL结合在一起的β2构建体 转染到293细胞中，并且考察化合物2B对转染细胞的结合(图7)。化 合物2B显示出对野生型αL转染细胞的充分的结合力，但是也说明与 对于模拟(B2)转染细胞的结合力相比，其对于被缺少结构域I的αL 转染的细胞没有显著的结合力。还对转染物对于ICAM-I-Ig的黏着能 力进行了试验，正如所预计的，缺少结构域I的LFA-1转染细胞和模 拟转染物显示出没有区别的背景结合水平，而野生型αL转染细胞显 示出很强的黏着力(图7B)(Yalamanchili，P.，Lu，C，Oxvig，C和 Springer T.A.2000.Folding and function of I domain-deleted Mac-1 and lymphocyte function-associated antigen-1，J.Bio1.Chem.，275： 21877-21882)。对一组LFA-1抗体对转染细胞的结合力的评价显示， 除了对应于结构域I的抗体的结合损失之外，在缺少αL结构域I的 转染细胞中的LFA-1杂二聚体看起来是不受影响的(数据未示出)。

数据支持下述结论：化合物3和相关分子结合至LFA-1上的高 亲合力位上，该位置与ICAM-I结合位重叠，且之前已经显示ICAM-I 结合位包括在LFA-1αL亚基内的结构域I上的MIDAS基序 (Shimaoka，M.，xiao，T.，Liu，J.-H.，Yang，Y.，Dong，Y.，Jun， C-D.，McCormack，A.Zhang，R.，Joachimiak，A.，Takagi，J.，Wang， J.-H.，和Springer，T.A.2003a.Structures of the alpha L I domain and its comple×with ICAM-I reveal a shape-shifting pathway for integrin regulation，Cell，112：99-111.)。

从删除ICAM-I-Ig与化合物2B结合处的结构域I的一般效果中 可以看出，有确凿证据表明ICAM-I和小分子拮抗剂在LFA-1上的结 合位极其相近。化合物2B和ICAM-I都不能结合至缺少结构域I的 LFA-1上，而ICAM-I的结合位就位于该结构域中。而且，A-286982 对于ICAM-I-Ig与化合物2B的结合的变构改进能力与下述情况一致： 其结合位与LFA-1α亚基I域内的IDAS基序内的A-286982结合位 极其相近(Liu，G.2001b.Small molecule antagonists of the LFA-1 /ICAMrI interaction as potential therapeutic agents，E×pert Opin.Ther. Patents，11：13 83-1393，Liu等，2001)。化合物5与LFA-1α链的选 择性光化学结合作用使其结合位局限在该亚基的残基30-507中。上 面提到的所有发现都与位于LFA-1α链的结构域I内的单一的高亲合 力小分子相一致。

利用较高浓度的化合物5(4.1μM，图6)进行光化学交联研究的密 切考察，其提供直接证据表明在LFA-1上具有另外的低亲合力小分子 结合位。在存在和不存在凝胶过滤的情况下观察到大大不同的蛋白质 和交联特性曲线。当在辐射之前对样品进行凝胶过滤以除去未结合或 弱结合的分子时，只观察到高亲合力标记的α亚基。但是，在不存在 凝胶过滤步骤的情况下，对化合物5与LFA-1的复合物进行辐射后导 致其以高强度交联至α亚基上，并以较低强度交联至β亚基中的低亲 合力结合位上，该亚基与化合物5的复合情况太弱以致于不能经历凝 胶过滤。在两种情况下，观察到的交联都部分受到大量过量的(290μM) 化合物3的抑制(图6，道e和g，f和h)，其说明了与两个位置的结 合的特殊性质。试图将化合物5结合至分离出来的α或β亚基上， 但是未能提供能够经过凝胶过滤过程的高亲合力复合物。因此，可以 看出化合物3代表的化合物类型的高亲合力竞争性结合需要存在完整 全长的LFA-1杂二聚体。试图获得在LFA-1亚基或分离出来的结构 域I构造内的该结合位，结果导致LFA-1对于ICAM-I和化合物3 的小分子类似物(例如，xVA143)的亲合力减小(Shimaoka，M.，Lu，C， Palframan，R.T.，von Andrian，U.H.，McCormack，A.，Takagi，J.， 和Springer，T.A.200 1.Reversibly locking a protein fold in an active conformation with a disulfide bond：integrin alphaL I domains with high affinity and antagonist activity in vivo，Proc.Natl.Acad.Sci，美国，98： 6009-6014.，Welzenbach等，2002)。尤其有趣的是可以看到少量LFA-1 杂二聚体的存在，其通常出现在不存在凝胶过滤的情况下(图6，＞ 200,000道尔顿的带)。根据考马斯蓝染色和放射自显影术的判断， LFA-1带的强度与在使杂二聚体稳定化的β链上的第二位具有的低亲 合力相一致。

公开的凝胶稳定化研究显示(Shimaoka，M.，Salas，A.，Yang， W.，Weitz-Schmidt，G.和Springer，T.2003b.Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in another，Immunity，19：391-402， Salas，A.，Shimaoka，M.，Kogan，A.N.，Harwood，C，von Andrian， U.H.，和Springer，T.A.，2004.Rolling adhesion through an extended conformation of integrin αLβ2 and relation to α I and β I-like domain interaction，Immunity，20：393-406，Yang，W.，Shimaoka，M.，Salas， A.，Takagi，J.，和Springer，T.A.2004.Intersubunit signal transmission in integrins by a receptor-like interaction with a pull spring.PNAS，101： 2906-2911)，对LFA-1至SDS-PAGE的稳定化负责的结合位位于β 亚基的类似结构域I区域中。本文中提供的数据显示该β亚基结合位 与α亚基内的高亲合力结合位没有关联，而α亚基内的高亲合力结合 位对直接的竞争性抑制ICAM-I结合负责。但是，通过化合物3而对 LFA-1稳定化作用负责的β亚基结合位可以与我们观察到的低亲合力 β亚基交联位相同。

总而言之，本文中提供的交联和结合试验的结果指出，本文中所 用的LFA-1类小分子拮抗剂探针具有两个不同的结合位。第一个是位 于LFA-1 αL亚基内的高亲合力结合位，通过该结合位小分子与LFA-1 形成足够稳定以经历凝胶过滤过程的复合物(例如，Kd＜25 nM)。此 处报导的结合试验对这个小分子结合位进行了表征，表明其与 ICAM-I结合位重叠并且与下述作用相关：通过化合物3和4有效抑 制LFA-1/ICAM-I的结合(化合物4的IC50＝1.4 nM)；其在体外对LFA-1 的有效抑制作用诱使淋巴细胞增殖(化合物4的IC50＝3 nM)；而且其 在体内抑制免疫系统的响应(Gadek等，2002)。第二个位点是β亚基 内的低亲合力结合位(例如，Kd＞1μM)，其在SDS-PAGE作用下参与 LFA-1杂二聚体的稳定化。该位点的性质更加活跃(即，更快的解离速 率)，而且不能经历凝胶过滤/光解过程。该第二低亲合力位的特征与 最近描述的在β亚基的I-类域内的α/β I-类变构拮抗剂结合位相一致 (Welzenbach等，2002，Shimaoka等，2003b，等，2004，Yang等， 2004)。本文中描述的ICAM-I模拟物在LFA-1β亚基(假设为类似结 构域I的结构域)上的低亲合力结合很可能是由于I和结构域I类似 结构域之间的序列同源性，尤其是在下述情况时：MIDAS基序与其 对于这类拮抗剂中常有的羧酸部分的亲合力具有类似性。假设包括 MAC-I的β2族整联蛋白共用该亚基，则为了选择特定用于LFA-1的 拮抗剂，化合物对于β2亚基的类似结构域I的结构域的亲合力必须 衰减(Keating，S.，Marsters，J.，Beresini，M.，Ladner，C，Zioncheck， K.，Clark，K.，Arellano，F.，和Bodary，S.2000.Putting the pieces together： Contribution of fluorescence polarization assays to small molecule lead optimization，SPIE Proceedings，3913：128-137)。

上述试验证实了化合物3和4对于LFA-1具有高亲合力，结合方 式与ICAM-I相似，结合位与包括LFA-1亚基结构域I内的MIDAS 基序的ICAM-I结合位重叠(Shimaoka，M.，xiao，T.，Liu，J.-H.， Yang，Y，Dong，Y.，Jun，C-D.，McCormack，A.Zhang，R.，Joachimiak， A.，Takagi，J.，Wang，J.-H.，和Springer，T.A.2003a.Structures of the alDha L I domain and its complex with ICAM-I reveal a shape-shifting pathway for integrin regulation，Cell，112：99-111)。该现象与提出的 对其ICAM-I表位的模拟相一致(Gadek等，2002)，而且与具有下述 内容的任何结论都不一致：其功能是作为LFA-1/ICAM-I的α/β类 I变构拮抗剂(Shimaoka等，2003b，Shimaoka，M.，和Springer，TA.2004. Therapeutic antagonists and the conformational regulation of the β2 integrins，Curr.Topics Med.Chem.，4：1485-1495)。这些ICAM-I模拟 物对β2整联蛋白亚基的结合虽然只有较低的亲合力，但是其提出了 如下问题：作为反馈机理的一部分，ICAM-I本身是否结合至类I结 构域内的第二位点上(Welzenbach等，2002，Shimaoka等，2003b，Salas 等，2004，Yang等，2004，Shimaoka和Springer 2004)。本发明中所 用的试验细节为：为了确保形成LFA-1的活性构象而对二价阳离子提 出的要求，和对于探针分子1-5、已知的LFA-1调节剂与ICAM-I直 接进行竞争所进行的物理证实，通过这些试验细节形成了确定新的拮 抗剂的方法，所述新拮抗剂为直接竞争性LFA-1拮抗剂。该方法可用 于确定新的LFA-1拮抗剂，该方法将被用在本发明的治疗干眼病的方 法中。

之前已经显示，小分子可以以高亲合力结合至α-L亚基上，这相 对于LFA-1而言是独一无二的。因此，这些化合物可以选择性用于 LFA-1(αLβ2)而非Mac-1(αMβ2)。本发明的一个优选实施方案是确定 和使用选择性的LFA-1抑制剂，其可以带来治疗安全性方面的优越 性。

B.试验方法：竞争性结合试验

1.拮抗剂在LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISA中的竞争

使用化合物2A和3、A-286982和sICAM-1来说明该方法。为了 说明对于ICAM-I-Ig与LFA-1的结合的抑制作用，将这些拮抗剂滴定 至LFA-1/ICAM-1 ELISA中。通过加入1/5系列稀释的化合物3(-●-)、 化合物2A(-▲-)、A-286982(-◆-)和sICAM-1(--)来进行试验，在含 有捕获的LFA-1的板上用CAM-1-Ig(A)或化合物2B(B)对其进行培 养。显示的数据是来自单个试验的两个板的平均值，其是若干个独立 测量的代表结果。实线是数据的拟合值。在图例中提供了IC50值(nM)。

图8A中显示了针对ELISA中的这些抑制剂的典型竞争曲线。化 合物3有效抑制ICAM-I-Ig与LFA-1的结合，其IC50为2nM。化合 物2A、化合物3的类似物也抑制结合，但是其IC50值约高出10倍。 A-2869S2和sICAM-1抑制ICAM-I-Ig与LFA-1的结合，但是IC50 值比化合物3高出100倍。

还说明了这些相同化合物对于FITC标记的小分子拮抗剂、化合 物2B与LFA-1的结合的抑制能力(图8B)。化合物2A和3以及可溶 的ICAM-I作为化合物2B的结合抑制剂的效力与其作为ICAM-I-Ig 的结合抑制剂的效力类似。化合物3、化合物2A和sICAM-1抑制化 合物2B与LFA-1的结合，其IC50值分别为3，56和1200 nM。吸收 值经历短暂提高-在约4μM处达到最大值，之后降低，这说明 A-286982不能抑制而是提高化合物2B对LFA-1的结合。

将对于LFA-1/小分子和LFA-1/ICAM-1 ELISAs中的IC50值的评 价扩展到更大的化合物组中，所述化合物组包括蝮蛇毒素衍生的肽和 代表该LFA-1小分子拮抗剂类的小分子(Gadek等，2002)。如图9所 示(由LFA-1：ICAM-I和LFA-1：小分子ELISAs中的拮抗剂竞争而 得的IC50值关系)，将与化合物2B竞争的多组化合物的IC50值(4种肽， 5个小分子和sICAM-1)相对于与ICAM-I-Ig和LFA-1的结合进行竞争 而确定的IC50值进行作图。图的斜率为0.964，y-截距为0.237且 R＝0.940。每个数据点为来自两个板的IC50值平均值，在该多组化合 物的两个配体结合试验中，每个配体的竞争IC50值之间具有良好的关 联(R＝0.94)，该关联特性曲线经历5个效力对数单位，其中所述多组 化合物包括sICAM-1、化合物2A和3。相竞争的两个拮抗剂ELISAs 和ICAM-I-Ig与作为配体的化合物2B之间的一般效力趋势说明每个 化合物都按照类似的机械方式中断ICAM-I和小分子配体的结合。该 类似的抑制效力说明ICAM-I-Ig和化合物2B都结合在LFA-1上的相 同位点上(Wong，A.，Hwang，S.M.，Johanson，K.，Samanen，J.， Bennett，D.，Landvatter，S.W.，Chen，W.，Heys，J.R.，AIi，F.E.， Ku，T.W.，Bondinell，W.，Nichols，A.J.，Powers，D.A.，和Stadel， J.M.1998.Binding of[3H]-SK&F 107260 and[3H]-SB 214857 to purified integrin alphallbbeta3：evidence for a common binding site for cyclic arginyl-glycinyl-aspartic acid peptides and nonpeptides，J. Pharmacol.Exp.Therapeutics，285：228-235)。

2.结合在LFA-1/ICAM-I和LFA-1/小分子ELISAs上的配体的拮 抗剂调节

通过与目标配体直接竞争而产生抑制作用的拮抗剂显示出如下 性质：当拮抗剂浓度增大时，其在配体结合曲线中经不可饱和的向右 迁移而移到较高的表观EC50值处，而且不使配体的最大结合值减小 (Lutz，M.，和Kenakin，T.1999.Quantitative Molecular Pharmacology and Informatics in Drug Discovery，John Wiley & Sons，Ltd.，New York， Pratt，W.B.，和Taylor，P.1990.Principles of Drug Action；The Basis of Pharmacology，Churchill Livingstone，New York Matthews，J.C.1993. Fundamentals of Receptor，Enzyme，and Transport Kinetics，CRC Press， Boca Raton，Kenakin，T.1997.Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction，Lippincott-Raven，Philadelphia)。可以克服这种抑制作用， 但是需要在提高直接竞争的抑制剂浓度的条件下提高配体的量 (Gaddum，I.H.，Hameed，K.A.，Hathway，D.E.，和Stephens，F.F.1955. Quantitative studies of antagonists for 5-hydroxytryptamine，Q.J.Exp. Physiol.，40：49-74)。图10显示了直接竞争的化合物3、A-286982和 sICAM-1对于ICAM-I-Ig和化合物2B与LFA-1相结合所得的曲线的 影响，其为显示直接竞争作用的拮抗剂的例子。在不存在(-◇-)或存在 拮抗剂的条件下将ICAM-I-Ig(A，C，E)或化合物2B(B、D、F)滴定 至LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISAs中。加入稀释了2倍的拮 抗剂，起始浓度为2.4(A)和2.7(B)μM的sICAM-1，0.040(C)和0.10 (D)μM的化合物3和20(E)和50(F)μM的A-286982。拮抗剂浓度 的数量级为，-□-(加入的最低拮抗剂浓度)，-△-，-○-，-◆-，-■-，-▲- 至-●-(最高的拮抗剂浓度)。该组数据如实线所示。所示数据都来自一 个板，并且代表两个试验的最小值。(注意：A-286982(F)导致化合物 2B对LFA-1的结合力增大)。相反，变构抑制剂可以通过减小最大结 合力或使曲线的向右饱和位移减小来改变配体的结合曲线。(Lutz和 Kenakin 1999，Matthews 2993)。如图10A所示，增大的sICAM-1浓 度明显使ICAM-I-Ig结合曲线向右移至较高的EC50值处。此外，正 如预期的，当相同的天然配体的两种分子形式直接竞争于结合在受体 的一个位置上时，在存在和不存在sICAM-1的条件下观察到相同的 ICAM-I-Ig至LFA-1的最大结合程度(Lutz和Kenakin 1999，Pratt， W.B.，和Taylor，P.1990.Principles of Drug Action：The Basis of Pharmacology，Churchill Livingstone，New York，Matthews 1993， Kenakin，T.1997.Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction， Lippincott-Raven，Philadelphia)。类似地，化合物3浓度的增大还会 使ICAM-I-Ig的结合迁移至较高的EC50值，并使ICAM-I-Ig的最大结 合发生最小的变化(图10C)。虽然在竞争性拮抗剂存在下，在配体结 合曲线中的向右迁移通常是平行的，但情况并非总是如此(Coultrap， S.J.，Sun，H.，Tenner，T.E.Jr.，和Machu，T.K.1999.Competitive antagonism of the mouse 5-hydroxytryptamine3 receptor by bisindolylmaleimide I，a″selective″protein kinase C inhibitor，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.290：76-82)。在存在或不 存在化合物3的条件下，LFA-1/ICAM-I-Ig结合曲线的非平行斜率 可能是因为在异种配体结合的ELISA条件下其不能实现与该化合物 的完全平衡。在LFA-1/化合物2B形式的配体结合的ELISA中，化合 物3浓度的增大明显地使化合物2B的结合曲线向右迁移至较高的 EC50值处，并且不使最大结合力减小(图10D)。sICAM-1浓度的增大 也显示出类似的作用(图10B)，虽然在曲线中的迁移程度受到在2.7 μM处可获得的最大sICAM-1浓度的限制。因此，sICAM-1和化合 物3对ICAM-I-Ig和化合物2B至LFA-1的结合的影响就是如上所述 的直接竞争的特征。

A-286982对ICAM-I-Ig和化合物2B至受体的结合的影响则明显 不同(图10E和10F)。在LFA-1/ICAM-1 ELISA中，ICAM-I-Ig曲线 向右迁移至较高的EC50值处；但是，随着A-286982浓度增大， ICAM-I-Ig至LFA-1的最大结合显著降低。随着A-286982浓度的增 大，最大结合力和配体结合曲线的向右迁移也减小，该减小即是如上 所述的变构抑制作用的反映。A-286982使配体亲合力和结合能力都 减小(Lutz，M.，and Kenakin，T.1999.Quantitative Molecular Pharmacology and Informatics in Drug Discovery，John Wiley & Sons， Ltd.，New York，Matthews 1993)；这说明A-286982是一种不能克服 的ICAM-I-Ig结合拮抗剂。相反，在LFA/小分子ELISA中，微摩尔 浓度的A-286982的存在使化合物2B的结合曲线迁移至较低的EC50 值处，并且显示可以增强化合物2B至LFA-1的结合(图10F)。A-286982 对化合物2B和ICAM-I-Ig的结合的作用差异可能是由于已知的结合 至LFA-1 IDAS位上的化合物的变构作用引起的。在阐述该方法的结 合试验中，A-286982结合数据用以说明对于小分子和结合至LFA-1 上的蛋白配体的变构抑制作用。

Schild分析法还可以用于研究化合物是否通过竞争一个结合位而 抑制配体的结合(Lutz and Kenakin 1999，Pratt和Taylor 1990，Matthews 1993，Kenakin 1997，Coultrap 1999)。该模型基于下述假设：在试验 中同等活性的反应是配体占据等量受体的结果，而且拮抗剂的存在并 不改变最大结合。在Schild分析法中，剂量比为存在或不存在拮抗剂 时的EC50值的比，而且其是产生等活性响应的配体浓度的量度。针 对各个拮抗剂的浓度确定该剂量比，并且如图11所示，对Schild回 归进行作图。在Schild回归中，斜率为1的线性响应表示拮抗剂的抑 制作用是直接竞争和不可逆的(Lutz和Kenakin 1999，Kenakiα 1997)。 在不会使最大结合减小的变构抑制剂的情况下，Schild分析法会产生 非线性关系和/或显著偏离1的斜率(Lutz和Kenakin 1999，Kenakin 1997)。图11中显示了sICAM-1和化合物3的Schild回归，其可比的 斜率分别为1.26和1.24。根据图5(A)和(C)的数据，分别对 s-ICAM-1 (-▲-)和化合物3(-●-)在LFA-1/ICAM-1配体结合的ELISA 中的拮抗作用进行Schild回归作图。化合物3的斜率为1.24，y-截距 为10.9且R＝0.99832。sICAM-1图的斜率为1.26，y-截距为8.51且 R＝0.99131。虽然Schild分析法需要斜率接近1的线性回归，用以说 明直接的竞争抑制作用，但是大量文献中并没有指出何种范围是可以 接受的Schild值。斜率1.24和1.26落入了许多公开的用于支持竞争 性结合结论的Schild值内，因此，这些斜率值并不被认为是显著不同 于1。回归图的线性和斜率关系的类似性与配体(ICAM-I-Ig)的结合相 一致，而且两种拮抗剂(sICAM-1和化合物3)以相同方式结合至同一 位置上。

上述结合试验和所讨论的分析法用于形成确定直接竞争性LFA-1 抑制剂的方法。使用一种或多种本文中描述的试验类型可以对潜在的 直接竞争性治疗试剂进行研究，用以确定该有益试剂是否确实与已知 的天然和合成配体形成竞争，从而在ICAM-1进行结合的相同的LFA-1 位上结合。因此，直接竞争性拮抗治疗剂被确定为可用于本发明的方 法中，用以治疗需要对由LFA-1及其与ICAM-I的相互作用介导的炎 性病症进行治疗的病人。

VII.确定可用于治疗人类疾病的化合物的方法

本文中描述了一种精细的研究方法，其使用细胞增长的siRNA(小 分子干扰RNA序列)抑制特性曲线来确定在一组培养的细胞系中具有 类似的细胞增长特性曲线的化合物，其中所述siRNA指向参与细胞增 长和人类疾病的细胞靶标。人们希望使用siRNA数据，因为siRNA 使靶标基因静止并且直接与由该靶标产生的细胞增长抑制作用相联 系。因此，siRNA数据可用于将对靶标功能的抑制与对细胞增长的抑 制关联起来。以此方式确定的化合物可以用于治疗人类疾病。

图12为用于鉴定用以治疗人类疾病的化合物的流程图，所述鉴 定过程使用siRNA生长抑制数据。

该方法包括选择参与细胞生长并含有所述靶标的细胞靶标(例 如，蛋白质或其它二元共聚物，而且其形成受到基因转录和/或转译的 控制)，所述靶标的抑制作用可用于控制细胞生长。可以从包括科学 文献的公开物中的这种靶标列表中进行选择，其包括酶、受体和参与 蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质。一种该可用的靶标是β-连环蛋白 与TCF族蛋白，例如TCF-4的缔合。这些蛋白质位于Wnt路径中并 且参与多种人体肿瘤包括常见癌的生长和增殖。与β-连环蛋白结合并 阻挡其与TCF-4结合的化合物可用于阻止所选基因的转录和人体癌， 尤其是结肠癌内的肿瘤的生长。靶标独有的小的干扰RNA(siRNA)序 列可购自商业供应商，例如Dharmacon，Boulder CO。从National Cancer Institute获得60个与癌(例如，衍生自结肠和乳腺的NCI细胞 系)和/或炎症(例如，NCI白血病细胞系)有关的细胞系，在增大量的、 指向靶标的siRNA存在下使这些细胞系生长，直到细胞生长受到抑制 为止。可选地，单一浓度的siRNA可以用于拮抗所有细胞系，而且可 以测量对细胞生长的相对抑制。生长依赖于靶标的存在的细胞系将受 到抑制，而其它细胞系的依赖性可能较小，因此其生长会受到较小的 抑制。因此，对NCI的60细胞系组的抑制会产生对于各个siRNA和 试验靶标的一种生长抑制。预计使用不普遍存在于NCI-60细胞系组 的细胞系也是该方法的一部分。此外还预计诸如LipofectinTM， LipofectamineTM等的试剂可以调节siRNA至细胞的输送。可以使用 NCI的COMPARE程序搜索所得的剂量滴定化合物对于该60个细胞 系的生长的NCI影响数据，或者用以确定具有类似活性特性曲线的化 合物(例如，与未抑制的生长相比，以50％比例抑制细胞生长的化合 物的浓度，化合物的GI50值)。可以通过统计或其它方法对该类似性 进行定量，所述其它方法包括用在NCI COMPARE程序中的Pearson 相关性。可以将不同于NCI COMPARE的其它检索算法用于定义化合 物与siRNA的类似性。可以通过互联网在线分析从NCI获得数据， 或者可以将其下载到计算机或计算机网络上并进行离线分析。其它数 据库包括将化合物结构与其细胞生长抑制性结合起来的公用和私人 数据库，这些数据库也可以用于本发明的目的中。对于每个靶标而言， 当某化合物的生长活性模式与由siRNA试验产生的生长抑制的模式 类似时，该化合物应具有常见的亚结构特征(例如，苯基、羧基、氢 键供体基团等)，该特征可以定义结构活性关系(SAR)。药物研发领域 的熟练药剂师通常使用这种SAR关系，用以将拮抗靶标的化合物的 活性与常见的结构图连接起来。对SAR的研发和改进可用于确定和 设计可能显示类似或改善的细胞活性的结构类似的化合物。通过对结 构相关的化合物进行比较来研发和改进SAR。在NCI数据库或其它 数据库中进行计算机检索以查找可商购获得的化合物，或在计算机图 书馆内检索目标和不同结构特性和计算性质(例如‘药物类似性’)的 化合物，从而合成或确定可用的化合物。可以在细胞生长试验中检验 商购或合成的化合物，以改善其细胞生长抑制效力，而且该试验数据 (用于效力的改善和降低)可以用于改善SAR对于由靶标介导的细胞 生长的抑制性能。重复循环性的数据采集、SAR的改善、化合物的 获取、化合物的试验/数据采集可以确定在10微摩尔以下就具有细胞 生长抑制作用的化合物。这种化合物可以用于药物研发中，因为其在 用作人类疾病模型的动物中通常可以实现大于10微摩尔的循环水平 (例如，人类癌症的小鼠异种移植模型，作为非限制性例子)。为了改 善效力、效能和作用时间而在动物模型中进行的其它试验可以确定用 于临床治疗人类疾病的候选分子，所述疾病包括由异常细胞生长引起 的癌症和炎症疾病。可选地，经确定与siRNA抑制细胞生长的活性特 性曲线相反的化合物可以作为细胞生长的刺激剂，该刺激剂可用于治 疗细胞生长减缓的疾病和病症。提高的细胞生长速度可以用于伤口愈 合和其它临床情况下。本文中描述的方法还可以利用已知蛋白质调节 剂的基因转染来帮助确定区别性足够大的抑制特性曲线，其中要求该 区别足以用来确定具有类似活性特性曲线的分子。

该方法可用于确定有效的化合物，该化合物在10微摩尔以下就 具有显著的抑制细胞生长的能力。这些化合物可以用于患有人类癌症 和炎症的动物模型中。更优选的是在1微摩尔以下就能抑制细胞生长 (GI50)的化合物。再更优选的是生长抑制(GI50)小于100nM的化合 物。最优选的是GI50值小于10nM的化合物。本发明的方法还可以 用于确定可用的LFA-1、B-cel受体BR3、Grb2(在串联信号中的生长 因子受体的下游蛋白质)和在细胞内和外的其它蛋白质靶标的抑制 剂。其尤其可用于抵抗位于Wnt路径的靶标，所述靶标包括用于治疗 人类结肠癌的β-连环蛋白。还可以用于抵抗与疾病有关的其它靶标， 所述靶标位于淋巴瘤、白血病、结肠癌、黑素瘤、乳腺癌、脑瘤、肺 癌、肾癌和其它人类癌症。该方法还可用于确定可用于治疗由炎症细 胞的生长和增殖介导的人类炎症疾病的化合物。这些包括但不限于银 屑病、湿疹、哮喘、风湿性关节炎和干眼症。以上述方式确定并且在 人类疾病的动物模型中具有活性的化合物可用于治疗包括癌症和炎 症疾病的人类疾病。涉及非癌症和炎症疾病的靶标也可以用于该方法 中，而所述癌症和炎症疾病涉及异常细胞的增殖。

此外，预计的方法是使用siRNA细胞活性数据按照下述方式进行 靶向或者选择靶标：通过对共用和/或私人化合物细胞活性数据库进行 搜索来找寻对化合物或化合物集合产生响应的类似的细胞活性特性 曲线，用以作为对可用于确定人类药物的化合物进行确定的方法。

VIII.实施例

A.材料

在人体293细胞中制备全长的重组人类膜结合的LFA-1和重组人 类结构域5ICAM-I-Ig融合体(ICAM-I-Ig)，并按照所述方式进行纯化 (Fisher等，1997，Keating等，2000)。sICAM-1(为了方便用在体外试 验中，其为不具有跨膜和胞浆结构域的天然ICAM-I的截短形式，但 是具有完整的LFA-1结合表位)和MEM-48得自R&D系统 (Minneapolis，MN)。使用标准步骤产生小鼠单细胞系抗人类β2整联 蛋白(克隆PLM2)(Fisher等，1997)。按照描述的方式合成小分子和肽 拮抗剂(Gadek等，2002，Burdick 1999，Liu等，2000)。化合物1-5 和A-286982如图4所示。化合物1、2A和2B与化合物3类似，但 是加入连接物而使其与荧光素(化合物1和2B；2A未与荧光素结合) 结合。通过使胺官能团与荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)偶合来制备荧光 素缀合物(Keating等，2000)。其它被分析的分子包括化合物6和 7(Gadek等，2002)、蝮蛇毒素(Dennis等，1990)、蝮蛇毒素七肽H2N-C GFDMPC-CO2H和H2N-CGY(m)DMPC-CO2H、环蝮蛇毒素肽CR IPRGDMPDDRC和四肽H2N-CN(F)PC-CO2H，其中Y(m)为β- 酪氨酸和N(F)为N′-3-苯基丙基天冬酰胺。

化合物6  化合物7

将所有小分子拮抗剂制成50％DMSO中的10mM溶液，贮存于 -20℃下。化合物5为Hoffman-La Roche Inc.(Nutley，NJ)赠送的赠品。

B.试验

实施例1：亲合力的测量

按照之前的描述，使用与小分子拮抗剂、化合物1(图2)呈竞争形 式的荧光偏振(FP)(Lakowicz 1999，Panvera 1995)测量小分子对LFA-1 的亲合力(Keating等，2000)。在含有50mM Hepes，pH 7.2，150mM NaCl，0.05％正辛基糖苷和0.05％牛γ球蛋白(BGG)以及1mM MnCl2，或1mM CaCl2和1mM MgCl2的缓冲溶液中进行所有的测量。 首先按照下述方式测量化合物1对LFA-1的亲合力：将2nM化合物 1加入到LFA-1的系列稀释液中，最初为在含有MnCl2或CaCl2和 MgCl2的缓冲液中的1μM溶液。通过将拮抗剂的系列稀释液加入到2 nM化合物1(使用3nM的LFA-1(溶于MnCl2)或40nM的LFA-1(溶 于CaCl2和MgCl2))中来进行竞争试验。在ICAM-I-Ig竞争试验中， 将LFA-1浓度降低至溶于二价阳离子缓冲液中的2和20nM LFA-1， 用以使ICAM-I-Ig的抑制作用最大化。试验中使用的不同LFA-1浓度 要考虑在亲合力的计算中(参见下文)。在37℃下，在96-孔黑色HE96 板(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上培养溶液2小时。在分析读 板器上485nm的激发态光、530nm的发射光和505nm的二向色过 滤器测量荧光偏振(FP)。测定不含化合物1的适当试样的强度，通过 减去该试样强度来校正除去所有粗略强度数据的背景发射。用 KaleidaGraph软件(Synergy Software，Reading，PA)，使用非线性最小 二乘方拟合的4参数方程式分析LFA-1结合和拮抗剂竞争数据，用以 获得LFA-1滴定的EC50值和拮抗剂的IC50值。用于拟合数据的方程 式为Y＝((A-D)/(1+(×/C)λB))+D，其中Y为试验响应，A为Y-在最 上端渐近线处的值，B为斜率因子，C为IC50或EC50，且D为Y-在 最下端渐近线处的值。通常，在下述的同类FP和异种ELISA形式中 测量的数据含有较大的信号-背景比例，而且在拟合的数据中偏差估 计值通常小于拟合参数终值的10％。使用Klotz和Hill分析法计算存 在和不存在A-286982时LFA-1对化合物1的平衡离解常数 (Kd)(Panvera，1995)。使用IC50值、化合物1/LFA-1的Kd和化合物1 和LFA-1在竞争试验中的浓度计算拮抗剂对于LFA-1的亲合力 (Kj)(Keating等，2000，Jacobs等，1975)。

实施例2：LFA-1/ICAM-I和LFA-1/小分子酶-结合的免疫吸收试 验(ELISAs)。

(A)拮抗剂竞争：在竞争形式下评价小分子和sICAM-1对 ICAM-I-Ig或荧光素-标记的小分子拮抗剂、化合物2B至LFA-1的结 合的破坏能力(Gadek等，2002，Burdick 1999，Quan等，1998)。化 合物2B与化合物1类似，但是其在小分子和荧光素之间具有更长的 连接，用以使抗-荧光检测抗体的结合最大化。4℃下，在96-孔板上 涂覆5μg/ml(33.3nM)溶于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的小鼠抗-人类 B2整联蛋白(非官能阻断抗体)并经历整夜。室温下用试验缓冲液(20 mM Hepes，pH7.2，140mM NaCl，1mM MnCl2，0.5％牛血清白蛋 白(BSA)和0.05％Tween-20)封闭该板1小时。在缓冲液中洗涤(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，1mM MnCl2和0.05％Tween-20) 之后，加入8nM LFA-l(LFA-1/ICAM-1 ELISA)或2nM LFA-1(LFA-1/ 小分子ELISA)，之后在37℃下培养1小时。洗涤该板，且对于 LFA-1/ICAM-A ELISA而言，将小分子拮抗剂或sICAM-1的系列稀释 液加入到板中并保持30分钟，之后在37℃下加入0.89nM的 ICAM-I-Ig(终浓度)并保持2小时。再次洗涤之后，加入山羊抗-huIgG (特定的Fc)-HRP并在37℃下培养1小时。在LFA-1/小分子ELISA中， 将稀释的拮抗剂和25nM化合物2B同时加入到板中，之后在37℃下 培养2小时。洗涤之后加入绵羊抗荧光素-HRP，并在37℃下再培养1 小时。对于两次试验而言，在洗涤之后通过下述方式检测结合的HRP- 缀合抗体：加入四甲基联苯胺(TMB)，之后在加入1M H3PO4使反应 停止之后测量产物在450nm处的吸收率。使用KaleidaGraph软件拟 合出上述的4参数方程式，从而确定每个曲线的IC50值。 LFA-1/ICAM-1试验的形式和结果与之前报道的情况类似(Gadek等， 2002，Burdick 1999)；但是，由于抗体是捕获LFA-1而非直接被涂覆 在ELISA板上，因此该形式更加稳固。

(B)配体结合：按照上述方式进行LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子 ELISAs，只是在存在或不存在拮抗剂的情况下将ICAM-I-Ig或化合物 2B的系列稀释液加入到板中。在所有情况下配体都与拮抗剂同时加 入。在加入拮抗剂和配体之后，进行洗涤和加入检测抗体之前，在37 ℃下将板培养6小时以达到平衡状态。通过拟合如上所述的4参数模 型来确定每个曲线的EC50值。通过Schild回归来分析存在和不存在 拮抗剂的情况下所产生的EC50值(Arunlakshana和Schild 1959，Lutz 和Kenakin 1999，Pratt和Taylor 1990，Matthews 1993，Kenakin，1997)。 按照下述方式计算Log(浓度比-1)对拮抗剂浓度的Schild图：(浓度比 -1)＝((带有拮抗剂的配体EC50)/(没有拮抗剂的配体EC50))-1。通过将 线拟合到线性方程式Y＝A+BX中来计算Log(浓度比-1)对拮抗剂浓 度的图的斜率。

实施例3：放射性同位素标记的、可光激活的化合物3的类似物 对LFA-1的交联

在存在或不存在290μM化合物3的情况下，在37℃下用4.1μM 化合物5、氚标记的可光激活的化合物3的类似物(Kauer等，1986) 将全长的人体膜结合的LFA-1或BSA(0.35mg/mL[分别为1.4和5.3 μM]，溶于20mM Hepes、150mM NaCl、5mM CaCl2、5mM MgCl2、 1mM MnCl2和1％正辛基糖苷中，pH7.2)培养过夜。化合物5与LFA-1 的摩尔比为3∶1。使用预涂了1％BSA的96孔板进行培养。在即将 进行交联之前通过凝胶过滤迅速除去过量的化合物5，所述凝胶过滤 采用与同一缓冲液达到平衡的96孔形式的G-25微旋柱。通过暴露 在高压汞蒸汽灯下(450瓦，一级玻璃，Vineland，NJ)而使LFA-1/化 合物5复合物发生交联。在照射过程中，在冰上冷却试样并用5mm 厚的硼硅玻璃进行保护，以使蛋白质的降解最小化。按照上述方式用 凝胶过滤法(G-25)除去剩余的未连接的化合物5。然后在8M胍基盐 酸盐(GuHCl)中使交联复合物变性并还原和烷基化。使经处理的蛋白 质经历SDS-PAGE，之后进行考马斯蓝染色。用自身放射线照相法观 察放射性同位素标记的蛋白质。

为了确定化合物5的结合位，在6M GuHCl，20mM Hepes，10mM EDTA，pH6.8存在下，用粒度排除色谱分离经处理的αL和B2亚基， 然后在75℃下用具有7M GuHCl且溶于10％醋酸的2.6 M羟胺进行 化学裂解。用SDS-PAGE分离放射性同位素标记的蛋白质，并且用声 放射线照相法观察或将其转移至聚偏二氟乙烯膜上，用考马斯蓝染 色，之后用N末端蛋白质序列进行确定。

实施例4：缺少结构I的αL构建体的产生

所用的构建体，pLFA.huID.Δp，含有从结构域I的Narl限制性 位点5′至结构域I的第二PfIM1限制位3′的αL基因序列，其中删除了 结构域I的第一PfIM1限制性位点3′(Edwards等，1995)。为了产生缺 少结构域I的突变体，制备了下列引物：正向引物

CACTGTGGCGCCCTGGTTTTCAGGAAGGTAGTGGATCAGGC ACAAGCAAACAGGACCTGACTTC，含有从Narl位点至结构域I开 始处的序列、编码GSGSG的DNA序列和在结构域I结束之后的αL 序列的2bp，以及反向引物 TCTGAGCCATGTGCTGGTATCGAGGGGC，其在结构域I之后的第 二PfIM1限制性位点上引发聚合反应。使用这些引物和经BgI II线性 化的pLFA.huID.Δp进行PCR，其在结构域I内的位置内剪切。该 DNA片段被扩增，所述片段含有从Nar 1位点至第二PfIM1位点的序 列，而且其中整个结构域I，从C125至G311均被编码为GSGSG的 DNA序列代替。纯化该段DNA，用Nar1和PfIM1对其进行消化并将 其插入到人的αL质粒的(pRKLFAαm)相应的Nar1和PfIM1位点上。 通过序列分析对编码为GSGSG的DNA序列的插入进行确认。

实施例5：缺少结构域I的LFA-1与ICAM-I或化合物2B的结合

用单独的β2构建体(模拟物)或用野生型αL构建体(wt)或缺少 结构域I(I-less)的αL构造转染293细胞，并使其恢复3天。分离细 胞并将其重新悬浮在黏着缓冲液(0.02M HEPES，pH7.2，0.14M NaCl，0.2％葡萄糖)中。按照所述方式与结合在板上的ICAM-I-Ig相 结合(Edwards等，1998)。为了使化合物2B进行结合，将2×105个 细胞加入到圆底96孔板的每个孔中，所述板位于含有0.5％BGG，0.1 mM MnCl2，1μg/ml抗B2活化抗体MEM-48和1μM化合物2B的 黏着缓冲液中。在37℃下将细胞培养1小时，用冷PBS洗涤并用1％ 的甲醛/PBS固定。然后在室温下用1∶500的绵羊抗荧光素-HRP稀 释液培养细胞1小时，用PBS洗涤并用TMB培养15分钟。用1M H3PO4终止反应并在450nm下读数。平行地对转染物进行试验，用 以试验表面表达的αL/B2复合物的结构完整性，并通过FACS分析法， 使用一组具有已知的结合表位的抗体来试验结构域I的存在或不存在 (Edwards等，1998)。

实施例6：人类T细胞黏着试验(细胞粘接试验)

使用人类T淋巴细胞系HuT 78进行T-细胞黏着试验。在PBS中 将山羊抗-HuigG(Fc)稀释至2mg/ml，并在37℃下将96孔板的每个孔 涂覆50ml而且保持1小时。用PBS洗涤盘并在室温下用溶于PBS的 1％BSA封闭1小时。在PBS中将结构域5ICAM-Ig稀释至100ng/ml， 并在4℃下以50ml/孔的量将其加入到板O/N中。对100g HuT 78细 胞进行离心，并在37℃下于5％CO2培养箱中用5mM EDTA处理细 胞团5分钟。在0.14 M NaCl，0.02M Hepes，0.2％葡萄糖和0.1mM MnCl2(试验缓冲液)中洗涤细胞并离心。将细胞重新悬浮在试验缓冲 液中，使浓度达到3.0×106c.ml。在试验缓冲液中将抑制剂稀释至2× 终浓度，并在室温下用HuT78细胞预培养30分钟。将100μl/孔的细 胞和抑制剂加入到板中并在室温下培养1小时。加入100μl/孔的PBS 并将板密封，在将100g物质离心转化5分钟。将未粘接的细胞从板 中轻轻弹出，并将过量的PBS印迹在纸巾上。将60μl/孔的对硝基苯 基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(0.257g，成为100ml柠檬酸盐缓冲液) 加入到盘中，并在37℃下培养1.5小时。用90μl/孔的50mM glycione/5mM EDTA终止酶反应，并在读板器上读取405 nM处的读 数。使用Langegren对硝基苯基法测量黏着在5dICAM-Ig上的HUT 78 细胞，U.(1984).J.Immunol.Methods 57，379-388。

实施例7：T细胞增殖试验

该试验为由激活作用产生的淋巴细胞增殖的体外模型，其由T细 胞受体和LFA-1的参与而被诱发，对与抗原呈递细胞之间的相互作用 产生影响(Springer等，1990，Nature)。在4℃下经整夜时间用溶于无 菌PBS中的50μl的2μg/ml山羊抗人Fc(Caltag H1 0700)和50μl的 0.07μg/ml单克隆抗体至CD3(免疫技术0178)预包被微滴定盘(经认证 的Nunc 96孔ELISA)。

第二天吸入包被溶液。然后用PBS洗涤板2次，在37℃下加入 100μl的17ng/ml 5d-ICAM-Ig并保持4小时。在加入CD4+T细胞 之前用PBS洗涤板2次。从取自健康献血者的肝素化全血中分离末梢 血的淋巴细胞。一种可选方法是通过增白细胞防病法(leukophoresis) 从健康的献血者体内获得全血。用盐水将血液稀释为1∶1、分层并在 LSM上离心分离2500×g物质30分钟(每100ml中含有6.2g Ficoll 和9.4g泛影葡胺钠)(Organon Technica，NJ)。使用骨髓样细胞消耗试 剂法消耗单核细胞(Myeloclear，Labs，Hornby，Ontario，Canada)。 将PBL重新悬浮在90％的热减活胎牛血清和10％的DMSO中，等分 试样并贮存在液氮中。融解后，将细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基 中(Gibco，Grand Island，NY)，所述培养基中补充了10％的热减活胎 牛血清(Intergen，Purchase，NY)、1mM丙酮酸钠、3mM L-谷氨酰 胺、1mM非必需氨基酸、500μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml 庆大霉素(Gibco)。

通过负选择法对CD4+T细胞进行纯化(人CD4细胞回收柱Kit # CLl10-5精确的)。37℃下在100ml含有5％CO2的培养培养基(RPMI 1640(Gibco)，其中补充了10％的热减活FBS(Intergen)、0.1mM非必 需氨基酸、1nM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、 50μg/ml庆大霉素、10mM Hepes和2mM谷氨酰胺)中对100,000个 纯化的CD4+T细胞(90％纯度)/微滴定板孔进行72小时培养。在培养 开始时将抑制剂加入到板中。在收集细胞之前的最后6小时内滴定加 入1μCi/孔的胸腺嘧啶，用以测量这些培养物的增殖响应。通过液体 闪烁计数来测量放射性标记的结合(Packard 96孔收集器和计数器)。 结果用计数/分钟(cpm)表达。

实施例8：体外混合淋巴细胞培养模型

混合淋巴细胞培养模型为体外移植模型(A.J.Cunningham， ″Understanding Immunology，Transplantation Immunology″157-159页 (1978))，用其考察各种LFA-1拮抗剂在人类混合淋巴细胞响应的增殖 和效应臂中的影响。

细胞的分离：从取自健康献血者的肝素化全血中分离出末梢血 (PBMC)的单核细胞。用盐水将血液稀释至1∶1、分层并在LSM上对 ×2500g物质离心分离30分钟(每100ml中含有6.2g Ficoll和9.4g泛 影葡胺钠)(Organon Technica，NJ)。一种可选方法是通过增白细胞防 病法从健康的献血者体内获得全血。按照上述方式分离PBMC，将其 重新悬浮在90％的热减活胎牛血清和10％的DMSO中，等分试样并 贮存在液氮中。融解后，将细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基中 (Gibco，Grand Island，NY)，所述培养基中补充了10％的热减活胎牛 血清(Intergen，购得，NY)、1mM的丙酮酸钠、3mM的L-谷氨酰胺、 1mM的非必需氨基酸、500μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml 庆大霉素(Gibco)。

混合淋巴细胞的反应(MLR)：在96孔平底微滴定板内建立单向 人体混合淋巴细胞的培养。在200μl的完全培养基中，对1.5×105 个响应子(responder)PBMC和等数量的异基因辐射(3000拉得，3分钟， 52秒)刺激子PBMS进行共培养。在培养开始时加入LFA-1拮抗剂。

在37℃下，在5％的CO2中将培养物培养6天，然后用3H-胸腺 嘧啶核苷(6.7 Ci/mmol，NEN，Boston，MA)脉冲6小时。在Packard 细胞收集器中收集细胞(Packard，Canberra，加拿大)。用液体闪烁计 数法测量[3H]TdR的结合。结果表示为每分钟的计数(cpm)。

实施例9：用以逆转干眼症发病的兔子模型

通过手术闭合泪腺排泄管而使兔子患上干眼症，并使兔子在不治 疗的情况下维持至少4周。参见Gilbard，J.P，1996“Dry Eye： phramcological approaches，effects，and progress”CLAO J.22，141-145。 经Schirmer试验确定了干眼症和眼表面的染色之后，滴入本发明的 LFA-1拮抗剂，其为溶于中性、等渗缓冲水溶液中的浓度为0.01、0.1 和1.0％的溶液。给药方式为向眼表面滴入一滴50微升的液滴，每日 5次，持续4周每天滴入。每天对干眼症的症状进行一次监测，监测 4周，Schirmer分数的升高和/或眼表面染色量的降低表明了LFA-1拮 抗剂在治疗干眼病中的作用。

实施例10：I期人体研究

多达56个健康个体参加了试验。进行了单次和多次给药LFA-1 拮抗剂的随机、受控、逐步提高剂量的试验。在6-8个LFA-1拮抗剂 剂量水平中的各水平下对同龄的7个患者(5个治疗，2个对照)各自进 行治疗，其中所述拮抗剂制成无菌、中性、等渗的缓冲水溶液。患者 每天接受单一的眼内给药。在随后的一周内获得是试样的药物代谢 动力学和药效评价。第8天开始，患者每天接受同样剂量的LFA-1拮 抗剂，总共持续14天。评价了PK/PD评价、安全性试验室研究、 Schirmer试验、角膜染色和结膜活组织检查。

实施例11：II期人体研究

150个患有干眼病的成年患者参加了试验，所述干眼症如主要的 包含/排除标准所作的定义。患者可以患有或不患有干燥综合症或干燥 病。对LFA-1拮抗剂进行随机、受控的剂量测定试验。三组患者接受 标记剂量的丽眼达或者两个LFA-1拮抗剂剂量水平中的一个剂量，所 述拮抗剂被制成中性、缓冲、等渗的水溶液，每日给药，持续12周。 随后在接下来的三个月时间内，在Schirmer′s试验、角膜染色和整个 疾病严重性中对病人进行安全性和改进性的证明试验。在一小组病人 中获得了结膜活组织检查。

虽然本文中描述和显示了本发明的优选实施方案，但是对本领域 熟练技术人员而言显而易见这种实施方案只是提供作为实施例。在不 偏离本发明的情况下，本领域熟练技术人员现可以进行各种变型、改 变和替换。应该理解，在本发明的实施中可以采用本文中描述的本发 明实施方案的各种替换形式。意图利用下列权利要求定义本发明的范 围，以及在这些权利要求及其覆盖的等效范围内的方法和结构。

交叉参考

本申请要求下列申请的权益：2005年5月17日申请的美国临时 申请No.60/681,684；2005年5月17日申请的美国临时申请No. 60/681,722；2005年5月17日申请的美国临时申请No.60/681,772， 和2005年5月17申请的美国临时申请No.60/681,723，每个申请的 全文在此结合进来作为参考。