用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物
阅读：1003发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了小分子配体-药物轭合物和使用该小分子配体-药物轭合物在需要的患者中靶向 治疗 癌症的方法。此外还描述了在癌症组织中杀灭循环性 肿瘤 细胞和确定药物浓度的方法。，下面是用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物专利的具体信息内容。
1.一种小分子轭合化合物，包含：靶向配体、治疗剂、和将靶向配体连接到治疗剂上的连接子，其中靶向配体来自下列化合物，包含：(a)吲哚部分,具有结构
(b)多烯部分，具有结构
和(c)侧链部分，具有结构
其中治疗剂是抗癌药，所述连接子是琥珀酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚、酰胺或氨基酸。
2.根据权利要求1的小分子轭合化合物，包含靶向配体、治疗剂、和将靶向配体连接到治疗剂上的连接子，其中靶向配体来自：
其中治疗剂是抗癌药，所述连接子是琥珀酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚、酰胺或氨基酸。
3.根据权利要求1的小分子轭合化合物，其中所述抗癌药选自：氨鲁米特、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、顺铂(顺-DDP)、环磷酰胺、盐酸阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP-16)、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲、羟基酰胺、异环磷酰胺、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤(MTX)、丝裂霉素、米托坦(o.p’-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸甲基苄肼、链脲霉素、柠檬酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、噻替哌、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷，六甲蜜胺(HMM)、米托胍腙(甲基-GAG，甲基乙二醛双-丙咪腙(MGBG)、喷司他丁、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)、紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉烷、长春地辛。
4.根据权利要求1-3任一项的小分子轭合化合物，还包含能在肿瘤微环境中识别肿瘤间质、肿瘤细胞和/或基质的配体。
5.权利要求4的化合物，其中能在肿瘤微环境中识别肿瘤间质、肿瘤细胞和/或基质的配体选自识别细胞表面整联蛋白受体的RGD肽、识别细胞表面生长因子受体的生长因子、能识别功能性细胞表面的肽和能识别功能性细胞表面的小分子底物。
6.小分子轭合化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述小分子轭合化合物包含：靶向配体、治疗剂、和将靶向配体连接到治疗剂上的连接子，其中靶向配体来自下列化合物，包含：
(a)吲哚部分(I),具有结构
(b)多烯部分，具有结构
(c)侧链部分，具有结构
其中治疗剂是抗癌药，所述连接子是琥珀酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚、酰胺或氨基酸。
7.根据权利要求6的小分子轭合化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述小分子轭合化合物包含：靶向配体、治疗剂、和将靶向配体连接到治疗剂上的连接子，其中靶向配体来自：
其中治疗剂是抗癌药，所述连接子是琥珀酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚酰胺或氨基酸。
8.根据权利要求6或7的用途，其中所述抗癌药选自：氨鲁米特、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、顺铂(顺-DDP)、环磷酰胺、盐酸阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP-16)、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲、羟基酰胺、异环磷酰胺、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤(MTX)、丝裂霉素、米托坦(o.p’-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸甲基苄肼、链脲霉素、柠檬酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、噻替哌、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷，六甲蜜胺(HMM)、米托胍腙(甲基-GAG，甲基乙二醛双-丙咪腙(MGBG)、喷司他丁、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)、紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉烷、长春地辛。
9.根据权利要求6-8任一项的用途,其中所述小分子轭合化合物还包含能在肿瘤微环境中识别肿瘤间质、肿瘤细胞和/或基质的配体。
10.权利要求9的用途,其中能在肿瘤微环境中识别肿瘤间质、肿瘤细胞和/或基质的配体选自识别细胞表面整联蛋白受体的RGD肽、识别细胞表面生长因子受体的生长因子、能识别功能性细胞表面的肽和能识别功能性细胞表面的小分子底物。
11.根据权利要求1-5任一项的小分子轭合化合物在制备用于消灭循环肿瘤细胞的药物中的用途。
12.根据权利要求1-5任一项的小分子轭合化合物在制备用于在癌组织中确定药物浓度的试剂中的用途。
用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物
[0001] 本申请是 申请日为2009年6 月12日、申请号 为200980126216.X(PCT/US2009/047216)、发明名称为“用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物”的中国专利申请的分案申请。
[0003] 本发明是在国家科学基金颁发的授权号0748834和国立癌症研究所的授权号CA-119338下得到政府支持完成。政府对本发明具有一些权利。
技术领域
[0004] 本发明涉及用于癌症靶向治疗的小分子配体-药物轭合物。
背景技术
[0005] 癌症是美国人死亡的第二首要原因。大多数死于癌症的人是由没有有效治疗方法的转移导致的。改善药物向癌细胞的递送对于研究患者的有效化学治疗是关键性的。一种途径是合成有希望的药物与靶向配体的化学轭合物，其中所述靶向配体识别癌细胞表面上独特的生物标记。不幸的是，由于癌细胞表面生物标记的不均一性和进化性以及靶向配体较大的化学结构，尽管有希望，但从技术和转译(translation)的观点来看，这种类型的靶向途径仍然是一种挑战。
[0006] 需要对癌症具有特异性的改善的药物递送系统，它具有负载药物的时间依赖性释放，所释放的药物能诱导对癌细胞的最大化杀灭，但对正常宿主细胞几乎不或不会产生损害。
发明内容
[0007] 本发明提供小分子轭合化合物，包含：靶向配体；治疗剂和/或显像剂；和将配体连接到治疗剂和/或显像剂上的连接子。
[0008] 在一些实施方案中，所述靶向配体包含吸电子基团或给电子基团。
[0009] 在其他实施方案中，所述靶向配体包含：吲哚部分；多烯(polyen)部分；和侧链部分。
[0010] 在一些实施方案中，所述吲哚部分、多烯部分和/或侧链部分包含轭合顺应性的官能团。在各种实施方案中，所述轭合顺应性的官能团可以选自OH、NH2、SH和COOH。
[0011] 在一些实施方案中，所述吲哚部分和多烯部分如下式所示：
[0012]
[0013] 其中E表示多烯部分，R1、R2和R3各自独立地选自：OH；NH2；SH；COOH；H；C1-C15烷基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；烷氧基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；芳基，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；非芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；氧基(oxy)；羰基；烯基；硝基；和氨基。
[0014] 在一些实施方案中，所述多烯部分可以是被选自OH、NH2、SH和COOH的取代基取代的多烯。
[0015] 在一些实施方案中，所述多烯部分可以是二烯、三烯或四烯，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；任选包含芳基，所述芳基任选被一个或多个杂原子或取代基取代；任选包含芳香环，所述芳香环任选被一个或多个杂原子或取代基取代；或任选包含非-芳香环，所述非-芳香环任选被一个或多个杂原子或取代基取代，其中一个或多个取代基选自OH、NH2、SH和COOH。
[0016] 在一些实施方案中，所述侧链部分和吲哚部分如下式所示：
[0017]
[0018] 其中I表示吲哚部分，R6可以选自：OH；NH2；SH；COOH；H；C1-C15烷基，并可以任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；烷氧基，并可以任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；芳基，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；芳香环，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；非-芳香环，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；氧基；羰基；烯基；硝基；和氨基。
[0019] 在一些实施方案中，所述吲哚部分可以选自：
[0020] 及其组合。
[0021] 在一些实施方案中，所述多烯部分和吲哚部分选自：
[0022]
[0023] 其中I表示化合物的吲哚部分。
[0024] 在一些实施方案中，所述侧链部分和吲哚部分选自：
[0025]
[0026] 及其组合，其中I表示吲哚部分。
[0027] 在一些实施方案中，所述靶向配体是连接两个脂肪族吲哚的多烯。
[0028] 在一些实施方案中，所述多烯可以包含2-4个共轭双键。
[0029] 在一些实施方案中，所述靶向配体可以是花青染料。在各种实施方案中，所述花青染料可以如下式所示：
[0030]
[0031] 其中R1和R2各自独立地选自：H；C1-C15烷基，并可以任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；烷氧基，并可以任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；芳基，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；芳香环，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；非-芳香环，并可以任选被一个或多个杂原子或取代基取代；氧基；羰基；烯基；硝基；和氨基。
[0032] 在其他实施方案中，所述花青染料可以选自：
[0033]
[0034]
[0035] 在一些实施方案中，所述靶向配体可以是IR-783或其衍生物。在各种实施方案中，所述IR-783衍生物可以选自：S2-I3-E2、S4c-I1-E4cCl、S1-I2-E3、S1-I4-E3Cl、S1-I1-E3、S5c-I1-E4cCl、S5-I1-E4cCl、S3-I1-E4cCl、S4s-I1-E4cba、S3p-I1-E4cCl、S4ac-I1-E4cCl、S3-I1-E3和S2-I1-E4cCl。
[0037] 在一些实施方案中，所述连接子可以选自：琥珀酸酯、氨基酸、肽、二酸、二胺、二醇、酐、CN、能点击反应的炔基、环氧、肼、叠氮、醛、酮、磺酸、磷酸、phosphoamidite、胍、短(C1-C6)烷基、芳香基、酯、酰胺、脲、硫脲、咪唑、咪唑衍生物、硫酯、丙烯酸酯、硫醚、二硫代酸酯(dithioate)、硒化物和苯基硒化物、二烯、二酮、嘧啶、嘌呤、杂环结构、冠醚、酚二氮烯、硝基苯、硝基苯衍生物、碘或溴、单糖、寡糖、azirine、二苯甲酮、联吡啶、联苯酚、氨基苯酚、能作为电化学交联剂的吲哚衍生物、放射性原子、放射性原子的螯合剂及其组合。
[0038] 在一些实施方案中，所述治疗剂可以选自：能靶向于细胞生长、存活、血管发生、粘连、迁移、侵入、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的抗癌药；能靶向于细胞生长、存活、血管发生、粘连、迁移、侵入、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的小分子药物；用于转移性骨癌治疗的二碳磷酸盐药物；肽治疗剂及其组合。
[0039] 在一些实施方案中，所述组合还可以包含能在肿瘤微环境中识别肿瘤间质、肿瘤细胞和/或基质的配体。在各种实施方案中，这些配体可以是识别细胞表面整联蛋白受体的精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(“RGD”)肽；识别细胞表面生长因子受体的生长因子例如EGF、PDGF、VEGF；能识别功能性细胞表面纤溶酶原活化因子、蛙皮素、缓激肽或前列腺特异性膜抗原受体的肽或小分子底物。
[0040] 在一些实施方案中，所述抗癌药可以选自：氨鲁米特、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、顺铂(顺-DDP)、环磷酰胺、盐酸阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP-16)、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(hydroxyurea)、羟基脲(hydroxycarbamide)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、干扰素α-2b、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤(MTX)、丝裂霉素、米托坦(o.p’-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸甲基苄肼、链脲霉素、柠檬酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、噻替哌、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷，六甲蜜胺(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(甲基-GAG，甲基乙二醛双-丙咪腙(MGBG)、喷司他丁、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)、紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉烷、长春地辛和硫酸盐。
[0041] 在特定的实施方案中，所述治疗剂可以是紫杉醇或多西紫杉醇。
[0042] 在一些实施方案中，所述小分子药物可以选自抗体、反义核苷酸、小干扰RNA和微RNA。在一些实施方案中，二碳磷酸盐药物可以是zolendrate或palmedranate。在一些实施方案中，所述肽治疗剂可以是环孢素或生长抑素(samatostatin)。
[0043] 在一些实施方案中，所述化合物可以是S4s-I1-E4cCl-Suc-多西紫杉醇或S4s-I1-E4cCl-Suc-紫杉醇。
[0045] 在一些实施方案中，所述显像剂可以是正电子发射体层摄影术(PET)显像剂或核磁共振显像(MRI)造影剂。在各种实施方案中，所述PET显像剂可以是氟-18(F-18)、碳-11(C-11)、氮-13(N-13)或氧-15(O-15)。在一个特别的实施方案中，所述MRI造影剂可以是钆。
[0046] 本发明也提供一种在需要的患者中治疗癌症的方法，包括：提供本发明的小分子轭合化合物；和给该患者施用有效量的该化合物。
[0048] 本发明也提供一种在癌组织中确定药物浓度的方法，包括：提供本发明的小分子轭合化合物；给需要的患者或组织施用有效量的化合物；使患者或组织显像；和将显像的强度与该组织中药物的量建立关系。
[0049] 本发明也提供一种使癌细胞或癌组织显像的方法，包括：提供本发明的小分子轭合化合物；给需要的患者或组织施用有效量的化合物，其中显像剂是核磁共振显像(MRI)造影剂或正电子发射体层摄影术(PET)显像剂；和使患者或组织显像。附图说明
[0050] 图1a描述了根据本发明的一个实施方案，研发用于癌症靶向治疗的花青染料轭合物的一个代表。
[0051] 图1b显示的是根据本发明的一个实施方案，S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的化学结构。
[0052] 图2显 示 的 是 根 据 本 发 明 的 一 个 实 施 方 案，S4s-I1-E4cCl-Suc 和S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的质谱。
[0053] 图3显示的是根据本发明的一个实施方案，在SN12C细胞中S4s-I1-E4cCl和S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的吸收。(a)在37℃下，用SN12C细胞(一种人肾癌细胞株)培养S4s-I1-E4cCl(20uM)30分钟，洗涤并进行共焦显像。在配有703nm激光(λex＝800nm和λem＝850nm)的荧光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)上记录荧光显像；(b)在(a)中显像的细胞的明视野；重叠(a)和(b)。类似地进行(d-e)的S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的吸收实验。(d)在37℃下，用SN12C细胞培养IR-783-Suc-多西紫杉醇30分钟。在λex＝800nm和λem＝850nm处获得荧光显像；(e)在(d)中显像的细胞的明视野；重叠(d)和(e)。
[0054] 图4显示的是根据本发明的一个实施方案，S4s-I1E4cCl-Suc-Dtxl的体内靶向。(a)在静脉注射S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl 48小时后皮下植入人膀胱癌T24细胞的无胸腺
6
裸小鼠的全身NIR光学成像和X-射线。实验条件：将1x10个人膀胱癌T24细胞皮下植入
3
到无胸腺裸小鼠的双侧腹。在肿瘤大小达到直径为约7-8mm时，以每只小鼠10nmol的剂量将S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl静脉注射到小鼠的尾静脉。在配有800nm滤波器组(激发/发射，800/850nm)的Kodak体内动物成像站(New Haven，CT)上进行全身NIR视像和X-射线。用Kodak ID3.6.3network version imaging来分析图像。荧光密度可以达到500任意单位以上；(b)相同小鼠的明视野显像；(c)(a)和(b)的重叠。
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裸小鼠的全身NIR光学成像和X-射线。实验条件：将1x10个人膀胱癌T24细胞皮下植入
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到无胸腺裸小鼠的双侧腹。在肿瘤大小达到直径为约7-8mm时，以每只小鼠10nmol的剂量将S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl静脉注射到小鼠的尾静脉。在配有800nm滤波器组(激发/发射，800/850nm)的Kodak体内动物成像站(New Haven，CT)上进行全身NIR视像和X-射线。用Kodak ID3.6.3network version imaging来分析图像。荧光密度可以达到500任意单位以上；(b)相同小鼠的明视野显像；(c)(a)和(b)的重叠。
[0055] 图5显示的是根据本发明的一个实施方案，S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的体内癌靶向性和保留的时程研究。
[0056] 图6显示的是根据本发明的一个实施方案，当在第2天评价时IR-MUT1是毒性的而且能杀死癌细胞，但是毒性比游离的非轭合药物低。
[0057] 图7显示的是根据本发明的一个实施方案，对小鼠肿瘤组织凋亡的研究。(A)用IR-MUT1治疗的具有T24人膀胱肿瘤异种植入物的裸小鼠。应当注意，在IR-MUT1-治疗的样本中可以观察到肿瘤凋亡。(B)没有治疗的对照组具有T24人膀胱肿瘤异种植入物的小鼠。
[0058] 图8显示的是根据本发明的一个实施方案，描述本发明的染料分子的定名。IR783(MUT)系列染料的建议名称是S4h-I1-E4cCl。S：侧链；4：4CH2；h(小写字母)：羟基(胺(a)，COOH(c)，乙酸根(ac)，SO3-(s)，ph(p))；I：吲哚；E：多烯；4：4烯；c(小写字母)：
环；Cl：氯(Cl)。
环；Cl：氯(Cl)。
[0059] 图9显示的是根据本发明的一个实施方案，具有单-、二-和三-个功能性染料分子的药物轭合物。
[0060] 图10显示的是根据本发明的一个实施方案，体外研究表明，在培养基中人肾癌细4
胞有效吸收IR-MUT1，但正常人胎儿肾细胞则不会吸收。将肾癌细胞(1x10/孔)和正常细胞植入涂有玻连蛋白的四孔小室的载玻片上。以20μM的浓度加入IR-MUT 1。在37℃下将载玻片培养30分钟，然后在4℃下用10％甲醛固定。通过配有633nm激光器和650nm荧光滤光器的共聚焦激光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)记录显像。观察到肾癌细胞(SN12C，ACHN和Caki-1)显著吸收IR-MUT1。相反，正常人胎儿肾细胞(HEK293)对IR-MUT1的吸收很少，以至于检测不到。
胞有效吸收IR-MUT1，但正常人胎儿肾细胞则不会吸收。将肾癌细胞(1x10/孔)和正常细胞植入涂有玻连蛋白的四孔小室的载玻片上。以20μM的浓度加入IR-MUT 1。在37℃下将载玻片培养30分钟，然后在4℃下用10％甲醛固定。通过配有633nm激光器和650nm荧光滤光器的共聚焦激光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)记录显像。观察到肾癌细胞(SN12C，ACHN和Caki-1)显著吸收IR-MUT1。相反，正常人胎儿肾细胞(HEK293)对IR-MUT1的吸收很少，以至于检测不到。
[0061] 图11显示的是根据本发明的一个实施方案，另一项体外研究表明，在培养基中人前列腺癌有效吸收IR-MUT1，但正常人前列腺上皮细胞则不会吸收。将前列腺癌细胞4 4
(1x10/孔的C4-2，PC3，ARCaP-M和ARCaP-E)和正常前列腺上皮细胞(1x10/孔的P-69)植入涂有玻连蛋白的四孔小室的载玻片上。以20μM的浓度加入IR-MUT1。在37℃下将载玻片培养30分钟，然后在4℃下用10％甲醛固定。通过配有633nm激光器和650nm荧光滤光器的共聚焦激光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)记录显像。观察到前列腺癌细胞(C4-2，PC3，ARCaP-M，ARCaP-E)显著吸收IR-MUT1。而人前列腺上皮细胞(P69)对IR-MUT1的吸收很少，以至于检测不到。
(1x10/孔的C4-2，PC3，ARCaP-M和ARCaP-E)和正常前列腺上皮细胞(1x10/孔的P-69)植入涂有玻连蛋白的四孔小室的载玻片上。以20μM的浓度加入IR-MUT1。在37℃下将载玻片培养30分钟，然后在4℃下用10％甲醛固定。通过配有633nm激光器和650nm荧光滤光器的共聚焦激光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)记录显像。观察到前列腺癌细胞(C4-2，PC3，ARCaP-M，ARCaP-E)显著吸收IR-MUT1。而人前列腺上皮细胞(P69)对IR-MUT1的吸收很少，以至于检测不到。
[0062] 图12显示的是根据本发明的一个实施方案，另一项体外研究表明，在培养基中人和小鼠胰腺癌细胞有效吸收IR-MUT1。将胰腺癌细胞
[0063] (1x104/孔)植入涂有玻连蛋白的四孔小室的载玻片上。以20μM的浓度加入IR-MUT1。在37℃下将载玻片培养30分钟，然后在4℃下用10％甲醛固定。通过配有633nm激光器和650nm荧光滤光器的共聚焦激光显微镜(Zeiss LSM 510META，德国)记录显像。观察到人胰腺癌细胞(MIA PACA2，BXPC3)和小鼠胰腺癌细胞(PDAC2.3)显著吸收IR-MUT1。
[0064] 图13显示的是根据本发明的一个实施方案，另一项体外研究表明，在体外IR-MUT1对人前列腺癌细胞(C4-2)生长的抑制要大于对正常人前列腺上皮(P-69)细胞的抑制。将C4-2(A)和P69(B)细胞置入96孔板(3，000/孔)中。在附着过夜后，用IR-MUT1培养这些细胞48小时。用MTT分析来确定和比较IR-MUT1在C4-2和P69细胞体外生长中的细胞毒性。该图显示了在培养基中IR-MUT1抑制人前列腺癌细胞生长，与泰索帝(taxotere)的IC50相同，都是10nM。相反，IR-MUT1对P69细胞的细胞毒性显著低于泰索帝对P－69细胞的细胞毒性。(C)将SN12C和(D)HEK293细胞置入96孔板(3，000/孔)中。在附着过夜后，用IR-MUT1培养这些细胞48小时。用MTT分析来确定IR-MUT1在SN12C和HEK293细胞体外生长中的细胞毒性。该图显示了在培养基中IR-MUT1抑制人肾癌细胞生长，与泰索帝的IC50相同，都是12nM。相反，IR-MUT1对HEK293细胞的细胞毒性(IC50为1，000nM)显著高于对SN12C细胞的细胞毒性；泰索帝抑制HEK293的生长，经评价IC50为600nM。
[0065] 图14显示的是根据本发明的一个实施方案，描述IR-MUT1减轻SQ肿瘤的体内研究：与IR783和泰索帝治疗的比较。将1百万的C4-2人前列腺癌细胞皮下植入到4-6周龄的无胸腺裸小鼠的背部。本发明人比较了在小鼠中，IR-MUT1与单用染料(IR783)或药物(泰索帝)对皮下人前列腺肿瘤生长的作用。用IR783、IR-MUT1和泰索帝i.p注射到3组雄性小鼠中(每组5只小鼠)；在植入肿瘤后，以每只小鼠每天5mg/kg的剂量(或累积剂量为每周30mg/kg，根据6天治疗、1天停用药物或染料来计算)来注射IR783和IR-MUT1，而以15mg/kg，每周2次的剂量(以避免全身毒性)注射泰索帝。用IR-MUT1治疗的小鼠的肿瘤要比用染料治疗的小鼠小得多。用测径器测量肿瘤直径，通过下式计算肿瘤体积，单位2
mm3：体积＝(宽度)x长度/2。IR-783组中肿瘤形成的发生率(9/20)也高于IR-MUT1治疗的小鼠(2/20)；在泰索帝-治疗的组中没有形成肿瘤。
mm3：体积＝(宽度)x长度/2。IR-783组中肿瘤形成的发生率(9/20)也高于IR-MUT1治疗的小鼠(2/20)；在泰索帝-治疗的组中没有形成肿瘤。
[0066] 图15显示的是根据本发明的一个实施方案，表明体重减轻差异的体内研究：IR-MUT1、泰索帝和IR783的比较。在治疗期间，每日获取体重。除了指定为泰索帝组的小鼠减轻了约50％的体重外，用IR783或IR-MUT1治疗的小鼠都没有减轻体重。
[0067] 图16显示的是根据本发明的一个实施方案，体内研究表明，用IR-MUT1或泰索帝治疗的具有人前列腺C4-2肿瘤的小鼠血清PSA降低。血清PSA水平用于在C4-2SQ肿瘤模型中监测肿瘤生长。在植入前和肿瘤细胞植入后第35，45天检测小鼠的血清PSA水平。在IR-MUT1和泰索帝组中，小鼠的血清PSA水平显著低于IR-783(对照)组。
[0068] 图17显示的是体内研究表明，IR-MUT1导致在小鼠中生长的SQ C4-2肿瘤凋亡。需要注意，根据本发明的一个实施方案，IR-MUT1导致C4-2肿瘤死亡的证据是当与IR-783对照的染料治疗样本(B道)相比，核形态被破坏(A道)。(A)通过组织病理学(H/E染色，
100x)证明了IR-MUT1组的SQ C4-2肿瘤细胞中存在凋亡。(B)由组织病理学分析可知，在IR783组中C4-2肿瘤细胞没有受到该染料的影响。
100x)证明了IR-MUT1组的SQ C4-2肿瘤细胞中存在凋亡。(B)由组织病理学分析可知，在IR783组中C4-2肿瘤细胞没有受到该染料的影响。
[0069] 图18显示的是根据本发明的一个实施方案，另一项体内研究表明，通过注射IR-MUT1和泰索帝减少了胫骨内(intratibial)肿瘤。将1百万的C4-2人前列腺癌细胞骨内植入到4-6周龄的无胸腺裸小鼠的胫骨。为评价IR-MUT1对肿瘤生长的抑制，在肿瘤细胞胫骨内植入30天后开始，以上述剂量将IR783、IR-MUT1或泰索帝i.p注射到3组雄性小鼠中(每组5只小鼠)中。每日观察小鼠并每日测量体重。用测径器测量肿瘤直径，通3 2
过下式计算肿瘤体积，单位mm：体积＝(宽度) x长度x 0.5236。A：在注射IR-783的组中，有4只从胫骨中生长出肿瘤(4/5)，与之相比，在IR-MUT1组中仅有1只(1/5)生长出肿瘤。肿瘤的平均体积也比IR-MUT1组大得多。在泰索帝治疗组中没有形成肿瘤(0/5)。B：
从骨x-射线扫描可知，肿瘤显然包括混合型成骨细胞病变和溶骨性病变。特别是与泰索帝组(c)和IR-MUT1组(a)相比，在IR783治疗组(b)中出现严重的溶骨性病变。与IR783治疗组(b)相比，IR-MUT1抑制了由注射C4-2肿瘤细胞导致的骨的溶骨性病变，减轻了成骨细胞病变(a)。
过下式计算肿瘤体积，单位mm：体积＝(宽度) x长度x 0.5236。A：在注射IR-783的组中，有4只从胫骨中生长出肿瘤(4/5)，与之相比，在IR-MUT1组中仅有1只(1/5)生长出肿瘤。肿瘤的平均体积也比IR-MUT1组大得多。在泰索帝治疗组中没有形成肿瘤(0/5)。B：
从骨x-射线扫描可知，肿瘤显然包括混合型成骨细胞病变和溶骨性病变。特别是与泰索帝组(c)和IR-MUT1组(a)相比，在IR783治疗组(b)中出现严重的溶骨性病变。与IR783治疗组(b)相比，IR-MUT1抑制了由注射C4-2肿瘤细胞导致的骨的溶骨性病变，减轻了成骨细胞病变(a)。
[0070] 图19显示的是根据本发明的一个实施方案，通过RT-PCT确定的在mRNA水平下，人前列腺癌细胞株ARCaP-M和正常人前列腺上皮细胞株P-69之间OATPs(1B3，2B1和5A1)表达的显著差异。这些差异与染料，IR-783和染料-药物轭合物，IR-MUT1相符，通过肿瘤细胞中存在而正常细胞中不存在的OATPs，IR-MUT1潜在地介导了优先吸收和蓄积。
[0071] 发明详述
[0072] 下面非限制性的描述提供了对本发明一些实施方案的其他详述。
[0073] 如表1所示，与抗体、适体或肽介导的癌症治疗相比，小分子癌症-靶向药物具有独特的特征。
[0074] 表1.抗体、适体和小分子介导的癌症靶向和药物递送的比较
[0075]
[0076]
[0077] 使用小分子用于癌症靶向和药物递送的益处是显而易见的(见表1)。与大分子靶向配体例如抗体和适体相比，小分子要容易制备得多，并且没有免疫原性。可量测性、操作性、灭菌性和储藏稳定性都对治疗方式的临床转译有显著的影响。由于操作简单，它们易于大规模化、灭菌和储藏，小分子是最有希望用于临床环境的。
[0078] 本发明提供了用于癌症靶向治疗的配体-药物轭合物。该配体靶向于癌细胞，并能将药物地送到希望的位置。这里提供的轭合物具有3个组分：靶向配体、治疗剂(药物)和将配体连接到药物上的连接子。图1(a)显示了本发明的轭合物的一般结构，图1(b)显示了一个具体的例子。词语“配体”和“染料”在本说明书的全文中可互换使用。
[0079] 本发明也提供用于癌症靶向治疗的配体。如本文所述，该配体用于配体-药物轭合物。
[0080] 用于本发明的轭合物的药物可以是能连接到靶向配体上的任何治疗剂。有用的药物的例子包括：FDA批准的用语治疗癌症的药物；氨鲁米特；门冬酰胺酶；博来霉素；白消安；卡铂；卡莫司汀(BCNU)；苯丁酸氮芥；顺铂(顺-DDP)；环磷酰胺；盐酸阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；盐酸多柔比星；雌氮芥磷酸钠；依托泊苷(VP-16)；氟尿苷；氟尿嘧啶(5-FU)；氟他胺；羟基脲；羟基脲；异环磷酰胺；干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)；洛莫司汀(CCNU)；盐酸氮芥(氮芥)；美法仑；巯嘌呤；美司钠；甲氨蝶呤(MTX)；丝裂霉素；米托坦(o.p’-DDD)；盐酸米托蒽醌；奥曲肽；普卡霉素；盐酸甲基苄肼；链脲霉素；柠檬酸他莫昔芬；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；安吖啶(m-AMSA)；阿扎胞苷，六甲蜜胺(HMM)；白细胞介素2；米托胍腙(甲基-GAG，甲基乙二醛双-丙咪腙(MGBG))；喷司他丁；司莫司汀(甲基-CCNU)；替尼泊苷(VM-26)；紫杉醇、多西紫杉醇和其他紫杉烷；硫酸长春地辛及涉及靶向于细胞生长和存活、血管发生、热激蛋白、微管、细胞粘连、运动和迁移的其他小分子药物和生物制品(例如抗体、反义核苷酸、小干扰RNA或微RNAs)，用于转移性骨癌治疗的二碳磷酸盐药物例如zolendrate和palmedranate，肽治疗剂例如环孢素和生长抑素，核酸例如siRNA和寡核苷酸药物。
[0081] 靶向配体是通过任何适当的连接子连接到药物上的。一般而言，所述连接子具有下列结构：x---y，其中x和y都可以与配体和药物上的基团反应，以把这些结构连接到一起。配体和药物上的这些基团包括基团例如卤素原子、COOH、NH2、OH和SH。连接子的一些例子包括琥珀酸酯、氨基酸、肽、二酸、二胺、二醇、其它酐、CN或用于点击反应(click reation)的炔基、环氧、肼、叠氮、醛、酮、磺酸、磷酸、phosphoamidite、胍、短(C1-C6)烷基、芳香基、酯、酰胺、脲、硫脲、咪唑及其衍生物、硫酯、丙烯酸酯(盐)、硫醚、二硫代酸酯、硒化物和苯基硒化物、二烯、二酮、嘧啶、嘌呤和其他杂环结构、冠醚(用于与金属螯合)、酚二氮烯(光致变色的探针)、硝基苯及其衍生物(光猝灭剂或作为束光探针(photocaged probe))、碘或溴(用于放射性标记和重原子相)、单糖和寡糖(例如环糊精)、azirine和二苯甲酮(用于光致交联)、联吡啶(金属螯合)、二苯酚和氨基苯酚(氧化还原电子或基团的电子阱)、其他吲哚衍生物(作为电化学交联剂)和任意的放射性原子或用于这些原子的螯合剂(用于MRI或PET显像用途)。本领域已知如何用适当的基团制备适当的连接子和将连接子与要连接的基团反应，也已知如何将连接子和要连接的基团官能化以发生期望的连接。
[0082] 该靶向配体一般包含在多烯两个末端连接两个脂肪族吲哚的多烯(在一个实施方案中为二烯至四烯)。在一个实施方案中，所述靶向配体是花青染料或其衍生物。在一个实施方案中，所述花青染料衍生物是IR783或其衍生物。在一个实施方案中，所述靶向配体是红外或近红外吸收型染料。在一个实施方案中，所述靶向配体具有大于650nm的最大荧光发射波长。在一个实施方案中，所述靶向配体包含2-4个共轭双键和2个脂肪族吲哚结构。本文使用的“衍生物”是指所述分子的相关结构一个或多个原子或部分改变。
[0083] 本发明的配体-药物轭合物在癌症治疗中具有治疗效果。本文使用的“治疗效果”是指减轻疾病的征象、症状或病因，或生物学方面其他期望的改变例如通过预防或消除血液中的循环性癌细胞或促进淋巴结、骨髓和/或软组织中的癌细胞死亡来延迟疾病进程。本文使用的“癌症”是指特征在于细胞异常生长的疾病，所述细胞异常生长不是由宿主微环境中正常生物化学、生理学和身体方面的影响调节的。能对本文所述的化合物、组合物和方法应答的癌症包括，例如在Isselbacher等人(1994)，Harrison Principles of Internal Medicine，1814-1877中所列的那些。本文所述的化合物、组合物和方法用于治疗多囊性肾病和癌症，例如癌、淋巴瘤、白血病、神经内分泌性肿瘤和肉瘤。癌症的代表性但非限制性例举是淋巴瘤、何杰金病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、头和颈癌、肾癌、肺癌例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、骨髓瘤、成神经细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、甲状腺和肾上腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑素瘤、结肠癌、子宫颈癌、乳腺癌及其他原因不明的上皮和间质癌。特别地，可以通过本发明的配体-药物轭合物治疗前列腺癌、胰腺癌和肾癌。本文所述的化合物、组合物和方法不仅可以通过通过对局部和弥散性癌的直接细胞毒性作用来治疗癌症，还可以对循环性癌细胞发挥细胞毒性，因此可以防止弥散的癌细胞到达转移位点。本文所述的化合物、组合物和方法也可以用于治疗炎性疾病例如骨关节炎、类风湿性关节炎、Crohn's病、弥漫间质性肺纤维化、炎性肠病以及良性/非-转移性肿瘤例如良性前列腺增生和其他良性肿瘤或癌变前疾病例如颈和肛门发育异常、其他发育异常、重度发育异常、增生、非典型增生和瘤形成。
[0084] 也提供治疗方法，其包括：提供本发明的小分子轭合化合物，给需要的患者施用有效量的该小分子轭合化合物。也提供组合物，其包含本发明的小分子轭合化合物和药学可接受的盐或载体。本文使用的治疗量是指能产生治疗效果的量。治疗有效量的确定是本领域公知的。例如，该方法可以用于治疗癌症。特别地，该治疗方法可以用于治疗前列腺癌、胰腺癌和肾癌。
[0085] 本发明的配体-药物轭合物在癌症的治疗和诊断中有很多用途，这可以通过回顾本发明的内容来认识到。例如，所述配体-药物轭合物可以用于在患者中“消灭”循环性肿瘤细胞，以防止或减少癌细胞后续粘连和外渗以形成转移性沉积物。所述配体-药物轭合物可以直接在肿瘤中显像。显像的强度与癌组织中的药物浓度相关。这种信息为医生和治疗学家提供了工具来调节药物的剂量、追踪观察和预测患者的靶癌细胞的临床应答性。由于所述配体-药物轭合物极有可能通过有机阴离子载体OATs和OATPs进入癌细胞，这提示正常和癌细胞在它们的OATs和OATPs性质方面存在差异。因此，所述配体-药物轭合物在癌细胞中的蓄积反映了OAT和OATP的异质性，这可以预测癌症的临床行为。(见图19。)[0086] 如本文所述，可以使用所述配体-药物轭合物检测癌细胞。在一个实施方案中，可以收集患者的血液，并在治疗后分析，以确定：a.患者的血液中是否有循环性癌细胞；b.该细胞是否蓄积了丰富的配体-药物轭合物，或c.在施用配体-药物轭合物后该细胞是否被染色。这种信息可以用于诊断、预测和患者随访的个性化治疗。
[0087] 甚至在福尔马林中固定后IR783染料都是稳定的。因此，存在合并的组织病理学，它整合了癌细胞对配体-药物轭合物的应答(例如细胞死亡分析)和组织切片的组织病理学(例如，分化或恶性肿瘤的情况，例如人前列腺癌的Gleason评分)，这些参数的相互关系可以用在作用位点的组织和细胞中所存在和蓄积的配体-药物轭合物的浓度来确定。
[0088] NIR染料-药物轭合物具有荧光发射，在>700nm处有λmax，这不会收到生物物质的自身荧光的显著干扰。因此，无需预先精制配体-药物轭合物，即可方便地在组织或细胞中确定本发明的配体-药物轭合物的浓度，条件是，只有不显著量的所关注化合物已经代谢。
[0089] 本发明的配体-药物轭合物长时间保留在细胞或组织中表明所述配体-药物轭合物和细胞化学组分之间有十分重要的相互作用，这提供了有价值的预测和诊断信息。
[0090] 在其他实施方案中，本发明的配体-药物轭合物可以用于其他癌症治疗方式例如激素去势、激素拮抗剂、放疗和化疗。例如，本发明的配体-药物轭合物可以在其他癌症治疗方式之前、相互结合或之后施用于需要的患者。
[0091] 本文使用的“药学可接受的盐”是与酸形成的有机酸加成盐，所述酸形成了生理可接受的阴离子，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可以形成适当的无机的药学可接受的盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。可以用本领域公知的标准方法得到药学可接受的盐，例如，通过碱性足够强的化合物例如胺与适当的酸反应，得到生理学可接受的阴离子。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
[0092] 配体结构
[0093] 可以改变配体的结构来为配体-药物轭合物提供性质的微调。例如，可以将吸电子基团或给电子基团加入到配体中。
[0094] 合成路线1显示了具有优良的靶向性和较差的靶向性的几种染料的例子。
[0095] 合成路线1
[0096]
[0097] 在一个实施方案中，所述靶向配体(染料分子)包含吲哚部分(I)、多烯部分(E)和侧链部分(S)(见例如，图8)。
[0098] 可以在特定位置使用被轭合顺应性的官能团控制的染料类似物来控制药物-染料轭合物的组成和结构(见例如，图9)。例如，可以容易地将轭合顺应性的基团(-OH、-NH2、-SH、-COOH)引入到I，E和S部分。
[0099] 因此，在一些实施方案中，所述吲哚部分、多烯部分和/或侧链部分包含轭合顺应性的官能团；例如，-OH、-NH2、-SH、-COOH。
[0100] 在一些实施方案中，所述吲哚部分和多烯部分如下式所示：
[0101]
[0102] 其中E表示多烯部分，R1、R2和R3各自独立地选自：OH；NH2；SH；COOH；H；C1-C15烷基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；烷氧基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；芳基，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；非-芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；氧基；羰基；烯基；硝基；和氨基。
[0103] 在各种实施方案中，所述多烯部分是被选自OH、NH2、SH和COOH的取代基取代的多烯。
[0104] 在其他实施方案中，所述多烯部分是任选被取代基取代的二烯、三烯或四烯；任选包含芳基，所述芳基任选被一个或多个杂原子或取代基取代；任选包含芳香环，所述芳香环任选被一个或多个杂原子或取代基取代；或任选包含非-芳香环，所述非-芳香环任选被一个或多个杂原子或取代基取代；其中取代基选自OH、NH2、SH和COOH。
[0105] 在各种实施方案中，所述侧链部分和吲哚部分如下式所示：
[0106]
[0107] 其中I表示吲哚部分，R6选自：OH；NH2；SH；COOH；H；C1-C15烷基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；烷氧基，并任选被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子取代；芳基，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；非-芳香环，并任选被一个或多个杂原子或取代基取代；氧基；羰基；烯基；硝基；和氨基。
[0108] 如图8所示，根据染料分子的定名合成路线，IR783(MUT)系列染料的名称是S4h-I1-E4cCl。
[0109]
[0110] 下文所示的是该分子的吲哚(I)部分的示例性结构：
[0111]
[0112] 下文所示的是该分子的多烯(E)部分的示例性结构，其中“I”表示吲哚部分。
[0113]
[0114]
[0115] 下文所示的是该分子的侧链(S)部分的示例性结构，其中“I”表示吲哚部分：
[0116]
[0117]
[0118] 染料分子的各个部分的任何组合和亚组合都意欲以与它们被绘为分开的单独化合物相同的程度包括在本发明中。例如，多烯(E)的任何例子都可以与吲哚(I)结构和一个或多个任选的侧链(S)结构组合，形成本发明使用的染料分子。在一个实施方案中，一个E结构与吲哚结构的两个例子和侧链结构的两个例子组合。在一个实施方案中，这两个侧链结构是相同的。在一个实施方案中，这两个侧链结构是不同的。在一个实施方案中，这两个吲哚结构是相同的。在一个实施方案中，这两个吲哚结构是不同的。在一个实施方案中，两个不同的吲哚结构连接到多烯结构上，不同的侧链结构连接到各吲哚结构上。在一个实施方案中，两个相同的吲哚结构连接到多烯结构上，两个相同的侧链结构连接到各吲哚结构上。
[0119] 合成
[0120] 配体的合成
[0121] 可以根据如合成路线3所示的一般反应合成路线来合成花青染料。
[0122]
[0123] R1和R2各自独立地选自H；C1-C15烷基或烷氧基，其可以被一个或多个含氮基团、含氧基团、含硫或卤素原子(例如SO3、OC(＝O)、NCS、NH2、COOH)取代；芳基或其他环系统例如6-或5-元芳香或非-芳香环，其可以被一个或多个本文所述的杂原子或取代基取代；氧基；羰基；烯基；硝基；氨基；和其他基团，例如本文所述和所示的那些，其中这些基团可以分别任选被一个或多个卤素原子或杂原子取代。
[0124] 下文所示的是合成和不同取代基的例子，这些取代基可以分别与其他基团联合以形成本发明的其他分子。
[0125] 实施例1
[0126]
[0127] 实施例2
[0128]
[0129] 实施例3
[0130]
[0131] 实施例4
[0132]
[0133] 如合成路线3所示，通过改变R1和R2基团可以容易地获得染料库。此外，也可以改变多烯的长度和结构以及多烯上的取代基来优化配体的癌靶向性。
[0134] 配体-药物轭合物的合成
[0135] 合成路线4显示了本发明的轭合物的合成方法的一般步骤。
[0136] 合成路线4
[0137] 步骤1：在染料产生活性胺基团(create an active amine group on dye)[0138]
[0139] 步骤2：在多西紫杉醇上引入-COOH组
[0140]
[0141] 步骤3：染料和多西紫杉醇的轭合物
[0142]
[0143] 在一个具体的例子中，将S4s-I1-E4cCl的-Cl(合成路线3)转化为反应性更强的胺官能团，以与治疗剂例如多西紫杉醇轭合(合成路线5)。将S4s-I1-E4cCl的-Cl基转化为芳香族胺基。然后多西紫杉醇(Dtxl)与琥珀酸酐(Suc)反应，形成COOH-末端的Dtxl。用常规的偶合化学来轭合修饰的S4s-I1-E4cCl和Suc-Dtxl(合成路线5)。如合成路线5所示，通过改变R1和R2基团可以容易地制备染料库。此外，也可以改变多烯的长度和结构以及多烯上的取代基来优化配体的癌靶向性。
[0144] 合成路线5.IR783-Suc-多西紫杉醇的合成
[0145]
[0146] 用质谱来确认S4s-I1-E4cCl-Suc和S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的结构(图2)。
[0147] 应当理解的事，期望的药物可以与期望的配体连接，并用于本发明的方法。例如，IR-783可以与各期望的药物轭合。IR-783已经轭合到多西紫杉醇(IR-MUT1)和紫杉醇(IR-MUT2)上。这些轭合物在培养基中抑制人前列腺和膀胱癌细胞生长(数据未标示)。
[0148] S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl(IR-MUT1)的体外和体内评价
[0149] 在体外和具有肿瘤的小鼠中评价S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的靶向效力。
[0150] 在不同的癌细胞中进一步评价IR-MUT1(S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl)的细胞内摄作用。用IR-MUT1(20μM)分别处理前列腺癌细胞(C4-2，PC3，ARCaP-M，ARCaP-E)，肾癌细胞(SN12C，ACHN，Caki-1)和胰腺癌细胞(MIAPACA2，BXPC3，PDAC2.3)30分钟(见图10-12)。用共焦荧光显微镜观察到IR-MUT1显著内摄到上述所有细胞中。相反，正常人前列腺上皮细胞(P69，见图10-12)、人中肾细胞(HEK-293，见图10)对IR-MUT1的吸收很少，以至于检测不到。
[0151] 也测定了不同细胞株中IR-MUT1的体外细胞毒性。对于SN12C(人肾癌细胞株)和C4-2(人前列腺癌细胞株)，IR-MUT1的48小时IC50值分别为12nM和10nM。值得注意的是，IR-MUT1的IC50值与泰索帝(多西紫杉醇)相似，证明了IR-MUT1在靶向癌细胞中的有效性。但是在平行研究中，对于HEK293(人中肾细胞株)和P69(正常人前列腺上皮细胞株)，IR-MUT1的48小时IC50值超过1000nM和100nM；相反，泰索帝对于这两种细胞的IC50值为约600nM和10nM(见图13)。
[0152] 评价了S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的体内靶向(图14-18)。S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl对小鼠中人前列腺肿瘤皮下生长(图14-17)和人前列腺肿瘤胫骨内生长(图18)显示出高度有效的靶向效力。在这两种情况下，不仅肿瘤的大小，就连肿瘤形成的发生率的％都显著下降(见图14和18)。与未轭合的泰索帝治疗组相比，IR-MUT-1是安全的，不会影响所治疗小鼠的体重，而泰索帝甚至仅用一半的剂量和比IR-MUT-1更少的次数治疗，也会减轻近50％的体重(见图15)。在组织形态学水平上，本发明人观察到，IR-MUT1通过从肿瘤细胞除去核碎片而杀死前列腺肿瘤细胞(图17)。进一步通过血清PSA数据证明小鼠中IR-MUT1对前列腺肿瘤生长的细胞毒性效果，本发明人观察到，与仅用染料治疗的小鼠相比，泰索帝和IR-MUT1治疗的小鼠的血清PSA受到极大地抑制(通过很多先前的研究证明了这与前列腺肿瘤的大小有关)(图16)。
[0153] 所治疗动物的全身显像表明，S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl优先集中于肿瘤组织。与其中大量施用物质集中于肝或脾的抗体或适体介导的癌症靶向不同，与肿瘤组织相比驻留在肝和脾中的S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl很低(图4和5)。此外，令人惊奇地S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl显示出可以长时间驻留在肿瘤组织中。与在第一天相同肿瘤组织的荧光强度相比，甚至在注射后第5天肿瘤组织中的荧光强度(S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的量)也仅降低了25％。
[0154] 在前列腺C4-2肿瘤模型中评价IR-MUT1的体内效力。将C4-2前列腺癌细胞皮下植入到4-6周龄的无胸腺裸小鼠背部。为评价IR-MUT1减小肿瘤的效力，将雄性小鼠分为3组(每组5只小鼠)，并注射(i.p.)(1)IR-783、(2)IR-MUT1和(3)泰索帝，IR-783和IR-MUT1的剂量为每日1次，5mg/kg(每7天停药1天)，但是由于系统毒性，泰索帝的暴露减少为以15mg/kg的剂量每周注射2次。本发明人观察到，IR-783治疗组中肿瘤的发生率是9/2，而IR-MUT1治疗组显著降低至2/20，而且在IR-MUT1治疗组中肿瘤的体积也显著减小。尽管在泰索帝组中没有肿瘤生长，但该组中小鼠的体重明显低于IR-MUT1和IR-MUT组的小鼠体重(图14和15)。在肿瘤减小研究过程中监测血清前列腺特异性抗原(PSA)的水平，PSA指示前列腺癌的存在。对于IR-MUT1和泰索帝组，在第35和45天时血清PSA水平显著低于IR783组，并达到在植入肿瘤前的PSA水平。该结果证明，IR-MUT1或泰索帝治疗减少了前列腺肿瘤(图16)。IR-MUT1组的肿瘤组织的免疫-组织病理学分析表明C4-2前列腺癌细胞凋亡，而这种凋亡在IR-783组的组织中可忽略不计(图17)。
[0155] 在另一个肿瘤模型中，将C4-2癌细胞骨内施用于4-6周龄无胸腺裸小鼠的胫骨中。小鼠分为3组(每组5只小鼠)，并从肿瘤细胞植入后30天开始以上述剂量(见上一段)注射(i.p.)IR-783、IR-MUT1和泰索帝。对于IR-783组，有4个从胫骨生长出肿瘤(4/5)，与之相比IR-MUT1组仅有1个生长出肿瘤(1/5)。IR-783治疗的小鼠中，肿瘤的平均体积显著大于IR-MUT1治疗组。从胫骨区域的X-射线显像研究中可以看出，IR-783治疗组中明显观察到溶骨性和成骨细胞性病变(图18(b))；而IR-MUT1和泰索帝组则没有观察到病变。这表明，IR-MUT1可以有效抑制由于小鼠骨骼中存在肿瘤细胞而导致的骨溶解和成骨细胞形成。
[0156] 图5显示的是S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的体内癌靶向性和保留的时程研究。在第1-5天静脉注射S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl 48小时后皮下植入人膀胱癌T24细胞的无胸腺
6
裸小鼠的全身NIR光学成像和X-射线。实验条件：将1x10个人膀胱癌T24细胞皮下植入
3
到无胸腺裸小鼠的双侧腹。在肿瘤大小达到直径为约7-8mm时，以每只小鼠10nmol的剂量将S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl静脉注射到小鼠的尾静脉。在配有800nm滤波器组(激发/发射，800/850nm)的Kodak体内动物成像站(New Haven，CT)上进行全身NIR光学成像和X-射线。在第1，2，3，4和5天用Kodak ID3.6.3network vers ion imaging来分析图像。
每天测定左和右侧腹肿瘤中S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的荧光密度。
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裸小鼠的全身NIR光学成像和X-射线。实验条件：将1x10个人膀胱癌T24细胞皮下植入
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到无胸腺裸小鼠的双侧腹。在肿瘤大小达到直径为约7-8mm时，以每只小鼠10nmol的剂量将S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl静脉注射到小鼠的尾静脉。在配有800nm滤波器组(激发/发射，800/850nm)的Kodak体内动物成像站(New Haven，CT)上进行全身NIR光学成像和X-射线。在第1，2，3，4和5天用Kodak ID3.6.3network vers ion imaging来分析图像。
每天测定左和右侧腹肿瘤中S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl的荧光密度。
[0157] 花青染料的合成及结构-功能关系的评价
[0158] 在使用IR-MUT1(S4s-I1-E4cCl-Suc-Dtxl)证明体内癌靶向性后，通过改变吲哚环、脂肪族侧链和多烯结构来评价IR783的结构-功能关系(表2)。
[0159] Table 2.IR783衍生物在体内和体外癌靶向性
[0160]
[0161] IR-783(仅为染料分子)是无毒的。图6表明，在第2天评价时，IR-MUT1有毒性而且能杀死癌细胞，但是毒性比游离的非轭合药物泰索帝低。这正是人们期望的，因为蓄积于细胞中的与多西紫杉醇或紫杉醇轭合的IR783需要酶活化，从而在细胞中释放活化的泰索帝或紫杉酚组分，以显示对癌细胞生长的细胞毒性。这表明，可以用本文所述的配体-药物轭合物实施靶向的、持久的癌症治疗。
[0162] 凋亡
[0163] 本发明的配体-药物轭合物显示能使肿瘤细胞凋亡。图7是对小鼠肿瘤组织凋亡的评价。(A)用IR-MUT1治疗的具有T24人膀胱肿瘤异种植入物的裸小鼠，(B)没有治疗的对照组具有T24人膀胱肿瘤异种植入物的小鼠。用M30抗体染色的细胞死亡表明了IR-MUT1治疗的无胸腺裸小鼠的肿瘤中明显的细胞凋亡。显示的是T24肿瘤的冷冻切片的10X，插入物为20X的放大率。注意：黑色沉积物代表凋亡的细胞。在对照小鼠中，在组织切片中没有M30细胞死亡抗体染色所显示的凋亡证据(10X的图片，20X的插入物)。
[0164] 在本申请全文中所有的参考文献，例如专利文献包括出版或授权的专利或等价物；专利申请公开；以及非专利文献或其他来源的物质；都以其整体通过参考引入本文，就像是分别通过参考引入的一样，对各文献的引用程度为至少部分不与本申请的内容矛盾(例如，通过参考引入部分矛盾的参考文献，排除该参考文献中部分矛盾的部分)。
[0165] 本说明书中提到的任何专利和出版物对于本发明所述属领域的技术人员的水平都是指导性的。本文所引用的参考文献都以其整体引入本文以表明技术状态，在一些情况下为它们提交日的技术状态，可以预期，如果需要，本文可以使用这种信息，以排除(例如，放弃)现有技术中的具体实施方案。例如，当要求保护一种化合物时，应当理解为现有技术已知的化合物，包括在本文所述的参考文献(特别是参考的专利文献)中披露的某些化合物并不意欲包括在权利要求中。
[0166] 当本文公开取代基的基团时，应当理解为分别公开了这些基团的所有个体成员和所有亚基团，包括该基团成员的任何异构体和对映体，以及用这些取代基可以形成的化合物种类。当要求保护一种化合物时，应当理解为本领域已知的化合物包括在本文所述的参考文献中披露的化合物都不包括在内。当本文使用马库什基团或其他基团时，该基团的所有所有个体成员、该基团和所存在的其他基团可能的任何组合和亚组合都分别包括在公开内容中。
[0167] 除非另有说明，所述或例举的任何制剂或组分的组合都可以用于实施本发明。化合物的具体名称是示例性的，这是由于已知本领域普通技术人员可以给相同的化合物以不同的命名。例如当在结构式或化学名称中本文描述了一种化合物而未具体指定该化合物的异构体或对映体时，该描述意欲包括所述化合物的个体或任意组合的各异构体和对映体。本领域技术人员将会意识到，除了具体例举的那些以外的方法、药物化合物、原料、合成方法和轭合组分可以用于实施本发明，而无须过多的实验。任何这样的方法、药物化合物、原料、合成方法和轭合组分的任何本领域已知的功能等价物都意欲包括在本发明中。当在说明书中给出一个范围，例如组合物范围时，任何中间范围和亚范围，以及所有包括在该给定范围内的个值都意欲包括在公开内容中。
[0168] 本文使用的“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是指包括或两端开放的，不排除其他未描述的组分或方法步骤。本文使用的“由……组成”排除了所要求组分以外未指定的任何组分、步骤或成分。本文使用的“基本上由……组成”不排除不实质上影响所要求的基本和新性质的物质或步骤。本文对术语“包含”的任何描述，特别是对组合物的组分的描述或对装置的元件的描述都应当理解为包括那些基本上由所述组分或元件组成或者由所述组分或元件组成的组合物和方法。本文说明性地描述的本发明可以适当地在缺少本文未具体描述的任意一种或多种元件、一种或多种限制的情况下实施。
[0169] 已使用的术语和表达都用作说明书的术语，而非限制，我们无意用这些术语和表达排除所示和所述特征及其部分的任何等价物，但是应当认识到，在本发明所要求保护的范围内可以做出很多改变。因此，应当理解，尽管通过优选实施方案和任选的特征具体描述了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所述的概念进行改变和变更，应当认为这些改变和变更也在所附权利要求限定的本发明的范围内。
[0170] 一般而言，本文使用的术语和短语具有它们在技术方面公认的含义，这可以通过参考标准文件、杂志参考和本领域技术人员已知的背景来获得。提供下列定义以阐明它们在本发明的全文中的具体应用。
[0171] 本领域技术人员很容易即可意识到，本发明非常适合在物质上实施，并获得所述以及本发明内在的结果和优点。本文所述的方法、组分、物质和量度作为优选实施方案的一般性代表，仅是作为实例提供的，而不是意欲限制本发明的范围。本领域技术人员可以对其作出在本发明的精神内的改变和其他应用，这也包括在权利要求的范围内。
[0172] 尽管本文的描述包含了一些具体信息和实施例，这些不应当解释为限制本发明的范围，而仅是对本发明的一些实施方案提供说明。因此，其他实施方案也在本发明的范围内。
[0173] 确切的制剂、施用途径和剂量可以由医生个人根据患者的情况来选择(见例如Fingl等人，The Pharmacological Basis of Therapeutics，1975，Ch.1p.1)。本领域已知的施用途径和剂量可以参见Comprehensive Medicinal Chemistry，Volume 5，Hansch，C.Pergamon Press，1990。
[0174] 应当注意的是，主治医师知道如何以及何时由于不希望有的毒性、器官异常或其他不良作用而停止、中断或调节给药。反之，主治医师也知道如果临床应答不足(排除毒性)要调节治疗至更高水平。在治疗所关注的疾病中，施用剂量的大小由于要治疗疾病的严重度和施用途径而不同。疾病的严重度可以，例如部分通过标准预后评价法来评价。此外，根据患者个体的年龄、体重和应答，剂量和可能的给药频率也不同。与上述讨论相当的方案也可以用于兽医学。
[0175] 根据要治疗的具体情况和所选择的靶向方法，可以配制这些药物并全身或局部施用。制剂和施用的技术可以参见Alfonso和Gennaro(1995)。适当的途径可以包括，例如口服、直肠、经皮、阴道、跨粘膜或肠内施用；胃肠外递送，包括肌内、皮下或髓内注射，以及鞘内、静脉或腹腔内注射。
[0176] 为了注射，本发明的药物可以配制到水溶液中，优选生理学相容的缓冲液例如Hanks'溶液、Ringer's溶液或生理盐水缓冲液中。为了跨粘膜施用，在制剂中使用适合透过屏障的渗透剂。这些渗透剂一般是本领域已知的。
[0177] 为实施本发明，使用药学可接受的载体将本文所述的化合物配制成适合全身施用的剂型在本发明的范围内。适当选择载体和适当的制备方法，本发明的组合物，特别是配制成溶液的那些可以胃肠外施用，例如通过静脉注射。用本领域公知的药学可接受的载体可以容易地将适当的化合物配制成适合口服的剂型。这些载体能将本发明的化合物配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、膏剂、混悬液等，用于要治疗患者口服。
[0178] 可以用本领域普通技术人员公知的技术施用欲细胞内施用的药物。例如，可以将这些药物包封在脂质体中，然后如上所述施用。脂质体是具有水性内部的球形脂双层。在脂质体形成时水溶液中存在的所有分子都混入到水性内部中。脂质体的各组分受到保护，免受外部微环境的影响，由于脂质体与细胞膜融合，因此脂质体的各组分可以有效递送到细胞质中。此外，由于它们的疏水性，可以直接细胞内施用有机小分子。
[0179] 适合在本发明中使用的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以达到预定目的的组合物。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细内容更是如此。
[0180] 除了活性成分，这些药物组合物可以包含适当的药学可接受的载体，包括促进将活性化合物处理成药学可以使用的制剂的赋形剂和佐剂。配制成用于口服的制剂可以是片剂、药丸、胶囊或溶液的形式，包括配制成用于延迟释放或仅在药物到达小或大肠时释放的那些制剂。
[0181] 可以以本身已知的方式制备本发明的药物组合物，例如，通过常规混合、溶解、制粒、制药丸、漂浮、乳化、包封、封闭或冻干方法。
[0182] 胃肠外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可以将活性化合物的混悬液制备成适当的油性注射混悬液。适当的亲脂溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或者合成型脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬液可以包含增强混悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖苷。任选地，该混悬液也可以包含适当的稳定剂或增强化合物溶解性的试剂，以制备高浓度的溶液。
[0183] 得到口服使用的药物制剂，可以包括混合活性化合物和固体赋形剂，并任选粉碎所得混合物并在需要时加入适当的佐剂后处理颗粒的混合，得到片剂或药丸芯。特别地，适当的赋形剂是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
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