抗体及用于治疗与雌激素受体相关疾病的方法
阅读：813发布：2020-11-13
专利汇可以提供抗体及用于治疗与雌激素受体相关疾病的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 在一些实施方式中提供了的 抗体 、抗体 片段 、药物组合物，用于调节雌 激素 受体α36功能的方法和用于 预防 和/或 治疗 通过雌激素受体α36调节的 疾病 。，下面是抗体及用于治疗与雌激素受体相关疾病的方法专利的具体信息内容。
1.一种抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：
5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的CDR。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO：8。
3.一种抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的一员。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区选自：
a)包括SEQ ID NO：9的轻链可变区；
b)包括SEQ ID NO：11的轻链可变区；
c)包括SEQ ID NO：12的轻链可变区；和
d)包括SEQ ID NO：13的轻链可变区。
6.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的一员。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区选自：
a)包括SEQ ID NO：10的重链可变区；
b)包括SEQ ID NO：14的重链可变区；和
c)包括SEQ ID NO：15的重链可变区。
9.如权利要求6-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的LCDR。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区选自：
a)包括SEQ ID NO：9的轻链可变区；
b)包括SEQ ID NO：11的轻链可变区；
c)包括SEQ ID NO：12的轻链可变区；和
d)包括SEQ ID NO：13的轻链可变区。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：16和所述重链包括SEQ ID NO：18。
13.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：20和所述重链包括SEQ ID NO：22。
14.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28的轻链和选自SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32的重链。
15.前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包括一种或多种非-天然氨基酸(NNAA)取代基。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述NNAA能够偶联。
17.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述NNAA包括叠氮基、炔基、酮基、醛基和/或硫醚基。
18.如权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述的NNAA能够通过铜催化的点击化学进行偶联。
19.前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包括一种或多种保守替换。
20.一种抗体或其抗原结合片段，其结合与权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合的表位基本相同的表位。
21.如权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包括SEQ ID NO：2的G20、N21、K22、W23和/或F24。
22.如权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包括SEQ ID NO：2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23和/或F24。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、人抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。
24.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是骆驼源化的单域抗体、双价抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双价抗体、纳米抗体、域抗体或者二价域抗体。
25.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包括免疫球蛋白恒定区。
26.如权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白恒定区是λ轻链、κ轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链或γ4重链恒定区。
27.一种复合物，其包括结合到如SEQ ID NO：1描述的hER-α36或者包括SEQ ID NO：
2的hER-α36片段的如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
28.一种分离的多肽，其包括一种或多种如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的一种或多种氨基酸序列。
29.一种编码如权利要求28所述的多肽的分离多核苷酸。
30.一种包括包括如权利要求29所述的多核苷酸的分离载体。
31.一种包括如权利要求30所述的载体的分离宿主细胞。
32.一种表达如权利要求28所述的包括一种或多种氨基酸序列的多肽的方法，其包括在表达如权利要求28所述的多肽的条件下培养如权利要求31所述的分离宿主细胞。
33.一种药物组合物，其包括如权利要求1-26任一项所述的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述的一种或多种药学上可接受的载体选自药学上可接受的液体、胶体、固相载体、含水载体、无水载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合或络合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂和无毒助剂。
35.一种药物组合物，其包括与一种或多种化疗剂相连或者相结合的如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段一种或多种。
36.如权利要求35所述的包括抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中一种或多种化疗剂选自氨柔比星、阿曲生坦、巴特布林(batabulin)、骨化三醇、西仑吉肽、达沙替尼、迪卡它尼(decatanib)、艾朵特卡莱(edotecarin)、恩杂朵瑞(enzastaurin)、厄洛替尼、依维莫司、吉美特卡(gimatecan)、棉籽酚易普利姆玛、洛那法尼、硫蒽酮、努阿迪布(neuradiab)、诺拉曲塞、奥布里森(oblimersen)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞构单抗(oregovomab)、帕尼单抗、帕唑帕布卡(pazopanibrubitecan)、他仑帕奈、西罗莫司、替米利芬、汉防己甲素、替斯利姆单抗(ticilimumab)、曲贝替定、凡德他尼、维特斯盘(vitespan)、赞利姆单抗(zanolimumab)、唑仑二膦酸盐(zolendronate)、组氨瑞林(histrelin)、阿扎胞苷、右丙亚胺、阿仑单抗(alemtuzumab)、来那度胺、吉姆单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、艾迪托特(editronate)、环孢霉素、艾德温那-天门冬酰胺酶和锶89。
37.一种组合物，其包括与一种或多种标记物相连接的如权利要求1-26中任一项所述抗体或其抗原结合片段一种或多种。
123 124 125 131 35 3
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述标记物选自包括 I、I、 I、I、S、H、
111 112 14 64 67 86 88 90 177 211 186 188 153 212 32
In、 In、C、Cu、Cu、Y、Y、Y、Lu、 At、Re、 Re、Sm、 Bi和 P的放射性同位素、镧系元素、发光标记、选自荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红的荧光标记，和选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶的酶底物标记。
39.一种抗体-药物偶联物，其包括与一种或多种药物分子部分或其药学上可接受的盐或溶剂化物相连接的抗体，其中所述偶联物具有式(I)
Ab(-L-D)n (I)，
其中，Ab是如权利要求1-26所述的抗体或者抗原结合片段，L是将药物与抗体偶联的连接子，D是药物，n是1-60之间的整数。
40.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述L选自马来酰亚胺基己酰、马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基、N-琥珀酰亚胺-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯、N-琥珀酰亚胺-4-(2－吡啶二硫代)丁酸酯和MB-vc。
41.如权利要求40所述的抗体-药物偶联物，其中所述马来酰亚胺羧酸酯的结构如式(II)所示：
42.如权利要求40所述的抗体-药物偶联物，其中所述马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基如式(Ⅲ)所示：
43.根据权利要求40所述的抗体-药物偶联物，其中所述MBvc结构如式(IV)所示：
44.如权利要求40所述的抗体-药物偶联物，其中所述N-琥珀酰亚胺-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯如式(V)所示：
45.如权利要求40所述的抗体-药物偶联物，其中所述N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯如式(VI)所示：
46.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述药物选自甲基阿里他汀E、单甲基阿里他汀F、倍癌霉素和美登素。
2’
47.如权利要求46所述的抗体-药物偶联物，其中所述美登素包括N -去乙
2’ 2’ 2’
酰-N -(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N -去乙酰基-N -(4-巯基-4-甲基-1-氧代丙基)美登素。
48.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体-药物偶联物化合物的结构包括Ab-mc-vc-PAB-MMAE，如式(VII)：
其中，s是1-20之间的整数。
49.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体-药物偶联物化合物的结构包括Ab-mc-MMAF，如式(VIII)
其中，t是1-20之间的整数。
50.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体-药物偶联物化合物结构包括Ab-SMCC-DM1，如式(IX)
其中，v是1-60之间的整数。
51.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体-药物偶联物化合物的结构包括Ab-SPDB-DM4，如式(X)：
其中，u是1-60之间的整数。
52.如权利要求39所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体-药物偶联物化合物结构包括Ab-MB-vc-倍癌霉素，如式(XI)
Ab-MB-vc-倍癌霉素
其中，y是1-20之间的整数。
53.一种调整细胞内ER-α36活性的方法，其包括将表达ER-α36的细胞暴露于如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
54.一种检测样品中存在ER-α36的方法，其包括将样品暴露于如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段并且确定N-琥珀酰亚胺-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯的存在。
55.一种用于检测表达ER-α36的样品的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求
1-26所述的抗体或其抗原结合片段。
56.一种治疗或预防受试体内与ER-α36相关病况的方法，其包括向受试体施予治疗有效量的包括如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
57.一种治疗或预防受试体内与ER-α36相关病况的方法，其包括向受试体施予治疗有效量的包括如权利要求39-52中任一项所述的抗体-药物偶联物的药物组合物。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述病况选自骨流失、骨折、骨质疏松、转移性骨疾病、佩吉特氏病(Paget's disease)、牙周组织疾病、软骨退变、子宫内膜异位症、子宫肌瘤病、潮热、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、认知功能损伤、大脑退行性疾病、(心瓣手术后)再狭窄、男子乳腺发育症、血管平滑肌细胞增殖、肥胖症、大小便失禁、焦虑症、源自雌激素缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、经前期综合症、躁郁症、焦虑症、痴呆、强迫行为、注意力缺乏症、睡眠障碍、易怒、冲动、免疫缺陷、自身免疫疾病、情绪管理、多发性硬化和帕金森疾病、炎症、炎性病症、炎症性肠病、呼吸系统疾病、性功能障碍、高血压、视网膜变性、哮喘和癌症。
59.如权利要求56-58所述的方法，其中所述病况包括骨流失、骨折、骨质疏松、绝经、经前综合症、子宫内膜异位症、子宫疾病、阳痿、性功能障碍、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、动脉粥样硬化、血管平滑肌细胞增殖、源自雌激素缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、免疫缺陷、自身免疫疾病、炎症、炎性病症、哮喘和癌症。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述炎性病症选自类风湿性关节炎、硬皮病、牛皮癣、慢性阻塞性肺疾病和哮喘。
61.如权利要求58或59所述的方法，其中所述癌症选自鳞状细胞癌、肺癌(例如：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、或者肺鳞状细胞癌)，腹膜癌、肝癌(例如，肝细胞癌/肝癌)、胃或腹部癌(例如消化道癌)、胰腺癌、脑肿瘤(例如：胶质母细胞瘤/多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非恶性胶质瘤或者脑膜瘤)、神经胶质瘤(例如，室管膜瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或混合性胶质瘤如少突星形细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(例如，肝母细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤或者肝癌)、膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌(例如：肾脏的横纹肌样肉瘤)、前列腺癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌(例如肛门鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈癌(例如：鼻咽癌)、皮肤癌(例如，黑色素瘤或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤(例如：横纹肌肉瘤，纤维肉瘤，卡波济肉瘤(Kaposi's sarcoma))、类癌肿瘤、眼癌(例如，视网膜母细胞瘤)、间皮瘤，淋巴细胞/淋巴细胞白血病(例如：T细胞系和前体B细胞谱系的急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞、淋巴细胞(CLL)、急性粒细胞/粒细胞白血病(AML)包括肥大细胞白血病、慢性粒细胞/粒细胞/粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿，色杂瑞综合症(Sezary syndrome)，皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、髓母细胞瘤，肾母细胞瘤，孤立性浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征，慢性与非慢性骨髓增殖性疾病、中枢神经系统肿瘤，垂体瘤，听神经瘤、原始神经外胚层肿瘤，室管膜瘤，脉络丛乳头状瘤，真性红细胞增多症，原发性血小板增多症，特发性骨髓纤维变性和儿科肿瘤例如：
小儿肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)。
62.如权利要求56或57所述的方法，其中所述药物组合物通过胃肠外途径包括皮下、腹腔、静脉注射、肌内或皮内注射；或非胃肠外途径包括透皮、口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部给药。
63.如权利要求56或57所述的方法，其中所述治疗有效量大约是0.01mg/kg到大约
100mg/kg。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述治疗有效量选自大约0.01mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约2mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg、大约15mg/kg、大约20mg/kg、大约25mg/kg、大约30mg/kg、大约35mg/kg、大约40mg/kg、大约45mg/kg、大约50mg/kg、大约55mg/kg、大约60mg/kg、大约65mg/kg、大约70mg/kg、大约75mg/kg、大约80mg/kg、大约
85mg/kg、大约90mg/kg、大约95mg/kg和大约100mg/kg。
65.一种确定受检体内与ER-α36相关病况状态的方法，其包括使用如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段检测ER-α36的水平。
抗体及用于治疗与雌激素受体相关疾病的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0003] 本发明涉及抗体、其药学组合物和用于预防、治疗和/或诊断雌激素受体相关疾病的方法。
背景技术
[0004] 雌激素是参与人体内的很多生理功能的一类激素。雌激素的功能包括发育女性的性器官，为怀孕提供乳房和子宫的准备以及在生育后提供人乳喂养。雌激素还在维持适当的心血管功能和骨质密度方面发挥重要的作用。还公认雌激素促进细胞增殖并且会增加女性形成癌症，特别是乳腺癌和子宫癌的风险。
[0005] 雌激素结合到靶细胞内/或细胞上的雌激素受体从而调节细胞功能。在人体细胞(hERs)中发现了两种类型的雌激素受体，hER-α和hER-β。它们分享共同的蛋白结构，每个拥有三个独立但是相互作用的功能域：N-末端域(A/B域)、中心DNA-结合域(C域)和C-末端配体结合域(D/E/F域)。N-末端域具有一个配体独立的激活功能(AF-1)，该域参与共激活因子相互作用以及配体缺失时靶基因的转录作用。所述的DNA结合域在受体二聚作用和结合特异性DNA序列发挥着重要的作用。所述的C-末端配体结合域调节配体的结合并且具有配体依赖的转活功能(AF-2)，在配体存在下激活基因转录。
[0006] hER-α的全长确定为66kDa蛋白并被称为hER-α66。hER-α66包括全部三个功能域。后来发现了hER-α66的剪变体并且被称为hER-α46。hER-α46的分子量大约为46KDa并且缺少hER-α66的AF-1域的N-末端。近来，一种新的36kDa的hER-α的剪变体，hER-α36得到了证实。hER-α36缺少AF-1域的N-末端和hER-α66的AF-2域的C-末端。(王等，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)336，
1023-1027(2005))。
1023-1027(2005))。
[0007] hER-α66被认定通过其靶基因的转录激活调节雌激素促进细胞的增殖。雌激素结合到hER-α66激活了hER-α66的转录激活域并且因此促进了下游靶基因的表达，并最终引起了细胞增殖。已发现hER-α46调节膜启动和雌激素促进的快速NO合成(Li等，美国科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100：4807-4812(2003))。也表明了缺少AF-1域的hER-α46抑制了hER-α66的AF-1活性(Flouriot,G.,EMBO,19,4688-4700，(2000))。因为hER-α36缺少AF-1和AF-2转录激活域，它对hER-α66和hER-β起着主要负抑制剂的作用从而抑制了hER-α和hER-β的AF-1和AF-2的功能。另外，hER-α36主要位于细胞质膜并且调节促进细胞的增殖的膜启动的有丝分裂雌激素信号。(王等，《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》336，1023-1027(2005)，王等，《美国科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》103：9063-9068(2006)。
[0008] 广泛的研究已经表明雌激素信号通过经典的细胞核转录激活通路和非经典的细胞膜启动信号通路进行调节。看起来hER-α66和hER-α46主要在细胞核其作用，然而，hER-α36主要通过细胞核外部其作用。
[0009] 也表明hER-α36缺少原始hER-α66配体结合域的螺旋结构8-12，这完全改变了hER-α36的配体结合特异性。因此，hER-α36可以结合到与hER-α66和hER-β不同的配体。
[0010] 因为雌激素和雌激素受体相关的疾病持续影响着许多个体，所以存在发现如新抗体和用于预防、治疗和/或诊断这些疾病的方法的迫切需要。
[0011] 通常的抗体药物偶联物(ADC)已经研究并发展了很长时间。与自身单独的抗体和的毒素相比，抗体药物偶联物提高了药物和其他制剂向靶细胞、组织和肿瘤的输送，从而得到了较高的疗效和较低的毒性。US2012148610中公开了mc-vc-PAB-MMAE和mc-MMAF偶联物，WO2007038658中公开了MB-vc-倍癌霉素偶联物，US2005169933中公开了SMCC-DM1和SPDB-DM4偶联物。以上所有的专利引入本文作为参考。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供了抗体、抗原结合片段及其修饰物，并且提供了用于治疗/预防/诊断与雌激素受体ER-α36(SEQ ID NO：1，Gene Accession Number BX640939)相关病况的药物组合物和方法。
[0014] 在一些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段特异性结合到ER-α36而不结合到ER-α66(图1(a)表示ER-α66的氨基酸序列)或ER-α46(图1(b)表示ER-α46的氨基酸序列)。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合到SEQ ID NO：1从N末端起的284至310位氨基酸残基，或者SEQ ID NO：2从1至27位氨基酸残基。
[0015] 在一些实施方式中提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的互补决定区(CDR)。.
[0016] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO：6和所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5。
[0017] 在一些实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的一员。
[0018] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
[0019] 在一些实施方式中，所述的轻链可变区选自：
[0020] a)包括SEQ ID NO：9的轻链可变区；
[0021] b)包括SEQ ID NO：11的轻链可变区；
[0022] c)包括SEQ ID NO：12的轻链可变区和
[0023] d)包括SEQ ID NO：13的轻链可变区。
[0024] 在一些实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的一员。
[0025] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
[0026] 在一些实施方式中，所述的重链可变区选自：
[0027] a)包括SEQ ID NO：10的轻链可变区；
[0028] b)包括SEQ ID NO：14的轻链可变区；和
[0029] c)包括SEQ ID NO：15的轻链可变区。
[0030] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的LCDR。
[0031] 在一些实施方式中，所述的轻链可变区包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
[0032] 在一些实施方式中，所述的轻链可变区选自包括：
[0033] a)包括SEQ ID NO：9的轻链可变区；
[0034] b)包括SEQ ID NO：11的轻链可变区；
[0035] c)包括SEQ ID NO：12的轻链可变区；和
[0036] d)包括SEQ ID NO：13的轻链可变区。
[0037] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，所述轻链包括SEQ ID NO：16和所述重链包括SEQ ID NO：18。
[0038] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，所述轻链包括SEQ ID NO：20和所述重链包括SEQ ID NO：22。
[0039] 在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括选自包括SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28的轻链和选自包括SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32的重链。
[0040] 在一些实施方式中，提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合与含有包括SEQ ID NO：16的轻链和包括SEQ ID NO：18的重链或者含有包括SEQ ID NO：20的轻链和包括SEQ ID NO：22的重链的抗体或其抗原结合片段特异性结合的表位基本相同的表位。
[0041] 在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23和/或F24。
[0042] 在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的G20、N21、K22、W23和/或F24。
[0043] 在上述一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、人抗体、鼠抗体、标记抗体、双价抗体或抗独特型抗体。
[0044] 在上述一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段是骆驼源化单域抗体、双特异抗体、单链抗体(scFv)、scFv二聚体、双价抗体(BsFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双二硫键稳定性抗体(dsFv)2、双特异性二硫键稳定性抗体(dsFv-dsFv')、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、二硫键稳定性双特异抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
[0045] 在上述一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段还包括免疫球蛋白恒定区。
[0046] 在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白恒定区是λ轻链、Κ轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链或者γ4重链恒定区。
[0047] 在一些实施方式中，提供了复合物，其包括结合到如SEQ ID NO：1描述的hER-α36或者包括SEQ ID NO：2的hER-α36的片段的抗体或其抗原结合片段的复合物。
[0048] 在一些实施方式中，提供了与ER-α36特异性结合和/或调节ER-α36活性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段治疗、抑制、降低或预防与ER-α36相关的疾病。例如，本文公开的抗体或其抗原结合片段发挥抑制肿瘤生长的功能从而抑制肿瘤生长、减小肿瘤尺寸或延迟肿瘤生长到特定的尺寸。
[0049] 在一些实施方式中，所述的抗体或抗原片段以解离常数KD≤1000pM与ER-α36相结合。在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段以解离常数KD≤500pM与ER-α36相结合，在其他实施例中，解离常数≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤20pM、≤10pM或者≤1pM。
[0050] 在一些实施方式中，提供了用于抑制、治疗、降低或预防受试体内与ER-α36相关疾病的方法，通过向所述受试体施用治疗有效量的一种或多种本文公开的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段以每次施用大约0.01mg/kg到大约100mg/kg(如，大约10mg/kg或大约5mg/kg或更少)的剂量进行施用。在这些一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段以每次大约1mg/kg或更少的剂量施用。在其他实施方式中，以每次大约0.5mg/kg或更少，并且还在其他实施方式中，以大约0.1mg/kg或更少的剂量施用。
[0051] 在一些实施方式中，提供了用于确定ER-α36蛋白存在或者与ER-α36相关的疾病进展/恶化的诊断方法，通过将样品暴露于本文提供的抗体或其抗原结合片段，并且确定抗体或其抗原结合片段与样品的结合情况。例如，提供了包括本文公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段的试剂盒。在一些实施方式中，所述的试剂盒还包括使用抗体或其抗原结合片段和/或使用该试剂盒内其它元件的指导书。
[0052] 在一些实施方式中，提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的多核苷酸。在其他一些实施方式中，提供了包括这些多核苷酸的载体，并且在其他一些实施方式中，提供了包括这些载体的宿主细胞。在一些实施方式中，提供了用于表达本文公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段的方法，通过将这些宿主细胞在由多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段从载体表达出来的条件下进行培养。在一些实施方式中，本文提供的多核苷酸可操作地与载体内的启动子如CMV启动子相结合。在一些实施方式中，包括本文提供载体的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0053] 在一些实施方式中，提供了包括一种或多种本文公开的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方式中，所述的组合物还包括一种或多种药物载体。在这些一些实施方式中，所述的一种或多种药物载体可以是一种或多种药学上可接受的载体包括例如，稀释液、抗氧化剂、佐剂、赋形剂或者非毒性辅助剂。
[0054] 在一些实施方式中，本文提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段用于制备治疗与ER-α36相关疾病的药物的用途。
[0055] 在一些实施方式中，提供了一种确定个体与ER-α36相关病况的方法，包括使用抗体或其抗原结合片段检测ER-α36的水平。
[0057] 图1显示人ER的氨基酸序列。图1(a)显示人ER-α66的氨基酸序列。图1(b)显示人ER-α46的氨基酸序列。
[0058] 图2显示纯化的SNGmB1抗体的质量控制(QC)结果。使用带有重组ER-α36蛋白作为免疫原的杂交瘤技术生成了SNGmB1(mlgG2b)的单克隆抗体。所述的杂交瘤在其基因克隆之前亚克隆了三次。
[0059] 图3显示SNGmB1的结合特异性。“Fc-LBD”表示Fc和包括C-末端27个氨基酸的ER-α36配体结合域的融合蛋白；“Fc-LBD-D27”表示删除C-末端27个氨基酸的Fc-LBD。“Fc-ER66”表示Fc和ER-α66配体结合域的融合蛋白。“多肽”表示源自ER-α36的F域C-末端的27个氨基酸。“人lgG”表示对照人lgG蛋白，净浓度＝10μg/ml。
[0060] 图4通过免疫印迹法显示SNGmB1的结合特异性。使用以下裂解物：1)亲本HEK293细胞(“P”)；2)用pcDNA3.1_ER-α36带有Myc-标签(“E”)全长蛋白转染的HEK293细胞；3)MDA-MB-231(“231”)；4)MCF-7；5)Hec-1A；6)K562。
[0061] 图5显示如流式细胞分析(FACS)检测到的SNGmB1与表达在K562(图5A)细胞表面、MCF7(图5B)细胞表面、SKBR3(图5C)细胞表面、MHCC97H(图5D)细胞表面、3T3诱导的细胞系(图5E)细胞表面的ER-α36的结合。在FACS的分析，SNGmB1抗体表现出了与K-562的结合呈剂量依赖性。鼠IgG2b用于同型对照。
[0062] 图6显示SNGmB1结合MCF7衍生的成球细胞及其对MCF7成球细胞形成的免疫荧光分析。图6A显示SNGmB1能够检测MCF7上的膜结合ER-α36，如荧光信号所示。图6B显示图6A的量化荧光强度。图6C显示SNGmB1抗体能够抑制MCF7成球细胞的形成和生长。图6D显示SNGmB1抗体能够以不同的浓度抑制MCF7成球细胞的形成和增长。
[0063] 图7显示SNGmB1在K-562细胞内的时间依赖内化。％内化＝(Qn-Qo)/(Nn-Qo)；Qn＝淬火后，样品在特定时间点的MFI(平均荧光强度)；Nn＝未经淬火，在特定时间点取样的MFI；Qo＝淬火后，样品仅在冰上培养0小时的MFI。
[0064] 图8显示生物大分子相互作用分析(biacore assay)模式。芯片表面覆盖捕获受检抗体的抗鼠FC IgG，并且GV27多肽(即：SEQ ID NO：2)注入其表面使受检抗体竞争结合。覆盖有IgG而没有受检抗体的芯片作为对照。
[0065] 图9显示通过丙氨酸扫描的表位图谱。检测了SNGmB1与包括C-末端27个氨基酸的ER-α36衍生的一系列突变肽的结合。
[0066] 图10显示抗-ERa-36抗体与ER-α36的结合。图10A显示人源化的抗体SNGHZD(C1L+C6H)与ER-α36的结合，并且图10B显示人源化的抗体SNGHZD(C2L+C5H)的结合。“Fc-LBD”、“Fc-LBD-D27”、“Fc-ER66”、“肽”和“人lgG”表示如说明书对图3定义的相同制剂。图10C到图10D显示如酶联免疫吸附法(ELISA)检测的杂交瘤衍生的鼠SNGmB1(C)抗体、嵌合SNGhB1(D)和人源化SNGHZD分别与SNGmB1抗体竞争结合ER-α36。平板分别覆盖SNGmB1、SNGhB1和SNGHZD，接着添加生物素化的GV27肽和竞争抗体(即，抗体104c3F8，其是结合不同表位的抗-ERα-36的抗体、抗体SNGmB1或者对照IgG)。图10F显示SNGmB1不同的人源化变异体，与SNGmB1抗体竞争结合ER-α36。HZD-B1表示SNGmB1的人源化变异体，HBD-F8表示人源化的104c3F8,HBD-B1表示产生SNGmB1的杂交瘤，鼠lgG表示阴性对照抗体。
[0067] 图11显示通过使用免疫组织化学方法用SNGmB1抗体检测的人组织样品中在浸润前沿(A)和淋巴结转移(B)中的ER-α36的表达。
[0068] 图12显示SNGmB1在BCAP37异种移植小鼠模型体内以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞的增长。
[0069] 图13显示如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE和SNGmB1的疏水作用色谱-高效液相(HIC-HPLC)色谱图。
[0070] 图14a显示SNGmB1的分子筛-高效液相(SEC-HPLC)色谱图。
[0071] 图14b显示如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE的SEC-HPLC色谱图。
[0072] 图15显示如式(VII)所示的Ab-mc-MMAF和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
[0073] 图16显示如式(VII)所示Ab-mc-MMAF的SEC-HPLC色谱图。
[0074] 图17显示如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
[0075] 图18显示如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1和SNGmB1的SEC-HPLC色谱图。
[0076] 图19显示如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
[0077] 图20显示如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4的SEC-HPLC色谱图。
[0078] 图21显示如式(XI)所示的MB-vc-倍癌霉素(duocarmycin)和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
[0079] 图22显示如式(XI)所示的MB-vc-倍癌霉素(duocarmycin)和SNGmB1的SEC-HPLC色谱图。
[0080] 图23显示分别用不同浓度的不同ADC治疗的癌症细胞系PLC的活力检测结果。
[0081] 图24显示分别用不同浓度不同ADC治疗的癌症细胞系SUM159的活力检测结果。
[0083] 图26a显示在对照lgG治疗后，向荷瘤裸鼠施予它莫昔芬的肺转移灶的ALDH1免疫组化图。
[0084] 图26b显示在SNGmB1治疗后，向荷瘤裸鼠施予它莫昔芬的肺转移灶的ALDH1的免疫组化图。
[0085] 发明详述
[0086] 本发明以下描述仅仅用于说明本发明的各种实施方式。例如，所讨论的特定的修改不能解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言显而易见的是，可以做出的多种等同、变化和修改而不偏离本发明的保护范围，并且可以理解这些等同的实施方式将包括于本文之中。本文引用的所有参考文献，包括公开文件、专利和专利申请都以全部参考的方式引入本文。
[0087] 本文所用的术语“抗体”包括任意单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、结合特异抗原的双特异性抗体(二价)抗体。完整的抗体包括两条重链和两条轻链，每条重链包括可变区和第一、第二和第三恒定区，而每条轻链包括可变区和恒定区。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，并且哺乳动物轻链分类为λ或κ。所述的抗体具有"Y"形状，Y的茎部由通过二硫键结合到一起的两条重链的第二和第三恒定区构成。Y的每个臂部包括单条重链的可变区和第一恒定区，其与单条轻链的可变区和恒定区相结合。所述的轻链和重链的可变区负责与抗体相结合。两条链的可变区通常包括称为互补决定区(CDR)的三个高变环区(轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR界限可以通过Kabat，Chothia或者Al-Lazikani公约(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat
1991)定义或者确定。三个CDR通过侧翼向的已知骨架区(FR)截断，骨架区比CDR更保守并且形成了支持高变环区的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，而是呈现了多种效应功能。抗体基于它们重链保守区氨基酸的序列进行分类。五种主要的类别或同型抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要抗体类别分配于亚类中，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或者IgA2(α2重链)。
1991)定义或者确定。三个CDR通过侧翼向的已知骨架区(FR)截断，骨架区比CDR更保守并且形成了支持高变环区的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，而是呈现了多种效应功能。抗体基于它们重链保守区氨基酸的序列进行分类。五种主要的类别或同型抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要抗体类别分配于亚类中，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或者IgA2(α2重链)。
[0088] “二价”抗体或其抗原结合片段包括两个抗原结合位置。所述的两个抗原结合位置可以结合相同的抗原，或者它们各自可以结合到不同抗原，其中所述的抗体或其抗原结合片段描述为“双特异性”。
[0089] 本文使用的术语“抗原结合片段”指的是例如双价抗体的抗体片段、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双价抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双价抗体)、通过包括一个或多个CDR的抗体部分形成多特异性抗体、骆驼源化的单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或能结合抗原但并不包括完整抗体结构的其他抗体片段。抗原结合片段能够结合到与母抗体或母抗体片段(如，母scFV)结合的相同抗原。在一些实施方式中，抗原结合片段可以包括源自特定人抗体的一种或多种CDR移植到来自于一种或多种不同人抗体的骨架区。
[0090] 关于抗体的“Fab”指的是由通过二硫键结合到单条重链可变区和第一恒定区的单条轻链(可变区和恒定区)构成的抗体部分。
[0091] “Fabˊ”指的是包括铰链区部分的Fab片段。
[0092] “F(abˊ)2”指的是Fab’的二聚体。
[0093] 关于抗体“Fc”指的是由通过二硫键结合到第二重链第二和第三恒定区的第一重链第二和第三恒定区构成的抗体部分。抗体的Fc部分承担了多种效应功能，例如ADCC和CDC，而不起到与抗原结合的功能。
[0094] 关于抗体“Fv”指的是承担完整抗原结合位置的抗体最小片段。Fv片段由与单条重链可变区相结合的单条轻链可变区构成。
[0095] “单链Fv抗体”或“scFv”指的是由相互直接相连或者通过肽连接子序列相连的轻链可变区和重链可变区构成的基因工程抗体。(Houston1988)
[0096] “单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”指的是由连接到抗体Fc区的scFv构成的基因工程抗体。
[0097] “骆驼源化单域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”指的是包括两个VH域且并不包括轻链的抗体(Riechmann 1999；Muyldermans 2001；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初源自骆驼科(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然缺少轻链，骆驼源化抗体有真正的抗原-结合完整功能(Hamers-Casterman 1993；Nguyen 2002；Nguyen2003)。重链抗体可变域(VHH域)表示通过适应性免疫应答产生的最小的已知抗原结合单位。(Koch-Nolte 2007)
[0098] “纳米抗体”指的是由源自重链抗体的VHH和两个恒定区CH2和CH3构成的抗体片段。
[0099] “双价抗体”包括具有两个抗原结合位置的小抗体片段，其中所述的片段包括连接到相同肽链(VH-VL或VH-VL)VL域的VH域(参见，如Holliger 1993；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短难以在相同链的两个域之间进行配对的连接子，所述的域被迫与另一链的互补域相配对，因此创造两个抗原结合位置，所述的抗原结合位置可以靶向不同抗原(或表位)的相同位置。
[0100] “域抗体”指的是仅包括重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在一些实施方式中，两个或更多的VH域共价地与肽连接子相结合从而形成二价或多价域抗体。所述的二价域抗体的二VH域可以靶向相同或不同的抗原。
[0101] 在一些实施方式中，"(dsFv)2"包括三个肽链：两个VH部分通过肽连接子相连并且通过二硫键桥接到两个VL分子。
[0102] 在一些实施方式中，“双特异性抗体”和“双价抗体”包括VH1-VL2(通过肽连接子相连)通过在VH1和VL1之间的二硫键接结合到VL1-VH2(也通过肽连接子相连)。
[0103] 在一些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”包括三个肽链：VH1-VH2部分，其中重链通过肽连接子连接(如，长的柔性连接子)并通过二硫键分别结合到VL1和VL2部分，其中每个二硫键配对的重链和轻链有不同的抗原特异性。
[0104] 在一些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双价抗体或包括VH-VL(通过肽连接子相连)与另一VH-VL部分形成二聚体的二价ScFv(BsFv)，从而一个部分的VH'与另一个部分的VL'相配合并形成能够靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位置。在另一实施方式中，“scFv二聚体”是包括VH1-VL2(通过肽连接子连接)与VL1-VH2(也通过肽连接子连接)相连的双特异性双价抗体，从而VH1和VL1相配合并且VH2和VL2相配合，并且每个配对具有不同的抗原特异性。
[0105] 本文使用的术语“表位”指的是与抗体相结合的抗原上特定的原子组或氨基酸组。如果两个抗体对抗原呈现竞争性，它们可以结合抗原上的相同的表位。例如，如本文公开的抗体或其抗原结合片段与SNGmB1对ER-α36的结合产生竞争性，所述的抗体可以而不是必然地认为结合如SNGmB1相同的表位。
[0106] 本文使用的"ER"指的是几种已知的雌激素受体中的一种，ER-α66、ER-α46或者ER-α36。人ER-α全长确定为具有595氨基酸的66kDa蛋白被称为hER-α66(图1(a))。hER-α66由三个独立的并不影响的功能域构成：N-末端A/B域、C或DNA-结合域和D/E/F或者配体结合域(参见美国申请号10/591,199，其引入本文作为参考)。所述ER-α66的N-末端域编码配体-独立激活功能(AF-1)，编码参于与共激活因子作用和靶基因的转录活动区。所述的DNA-结合域或C域包括两个锌指状结构，其在与受体二聚化并且结合特定的DNA序列起着重要的作用。所述D/E/F域的C末端是调节配体结合、受体二聚化、核转运和配体依赖转录激活功能(AF-2)的配体结合域。AF-1和AF-2在转录控制发挥的相关贡献随着细胞-特异性和DNA启动子-特异性方面进行变化。(Berry等,EMBO J.,9:2811(1990)和Tzukerman等,Mol.Endocrin.,8:21(1994))。人ER-α46(hER-α46，图1(b)是hER-α66的剪接变异体，具有分子量46KDa包括412氨基酸，并且缺少hER-α66的N-末端AF-1域。人ER-α36(如SEQ ID NO：1列出的hER-α36)是缺少hER-α66的N-末端AF-1域和C-末端AF-2域的36kDa的hER-α变异体。(Wang等.,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)336,1023-1027(2005)》，美国申请号10/591,199,WO2005/087811)。
然而，hER-α36相较于hER-α66或hER-α46具有其C末端独特添加的27个氨基酸残基。
所述的27个氨基酸残基是SEQ ID NO.1的从284到310位的氨基酸残基或SEQ ID NO.2的从1到27位的氨基酸残基。
然而，hER-α36相较于hER-α66或hER-α46具有其C末端独特添加的27个氨基酸残基。
所述的27个氨基酸残基是SEQ ID NO.1的从284到310位的氨基酸残基或SEQ ID NO.2的从1到27位的氨基酸残基。
[0107] 本文使用的"ER活性"包括通过ER(例如：hER-α36)诱导的细胞内事件，例如受体磷酸化(如酪氨酸磷酸化)，细胞内信号分子与受体或者其他细胞内信号分子结合，启动信号级联和/或启动生物学应答(例如：诱导具有ER细胞(如，hER-α36)的基因表达和生理学的改变或发展(如，增殖))。
[0108] 本文使用的“癌症”或者“癌症病况”指的是通过肿瘤或者恶性细胞生长、增殖或转移调节的任何医学病况并且包括实体癌和非实体癌，例如白血病。本文使用的“肿瘤”指的是癌症和/或恶性细胞的固体肿块。
[0109] 本文使用的病况的“进行治疗”或“治疗”，包括预防或缓解病况，降低病况的发生或发展率，减少病况的发展风险，预防或推迟与病况相关的症状发展，降低或结束与病况相关的症状，产生病况完全或部分衰退，治愈一个病况或其多个病况的组合。关于癌症，“进行治疗”或“治疗”包括根除全部或部分肿瘤，抑制或降低肿瘤生长和转移、预防或推迟肿瘤的发展及其结合。
[0110] 本文使用的术语“特异性结合”指的是两分子之间的非任意结合反应，例如在抗体和抗原之间。在一些实施方式中，特异性结合抗原的抗体或抗原结合片段以亲和-6 -7 -7 -7 -8 -8 -8力(KD)≤10 M(例如，≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、-9 -9 -9 -10
≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、10 M)结合抗原。本文使用的KD指的是离解率和结合率的比率(koff/kon)，可以使用本领域已知的方法确定。(例如，使用生物大分子相互作用分析(Biacore)或者高感度测量技术(Kinexa)技术)
≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、10 M)结合抗原。本文使用的KD指的是离解率和结合率的比率(koff/kon)，可以使用本领域已知的方法确定。(例如，使用生物大分子相互作用分析(Biacore)或者高感度测量技术(Kinexa)技术)
[0111] “分离”物质已经用人类手工从天然状态进行了改变。如果“分离”的组合物或者物质在自然界发生，它已经从其原始环境中进行了改变和/或去除。例如，天然存在于活体动物的多核苷酸或多肽不是“分离”的，然而如果相同的多核苷酸或多肽已经从其天然状态中的共存物质中得到了充分的分离，从而以实质上纯粹的状态存在，那么它是“分离”的。
[0112] 本文使用的术语“载体”指的是多核苷酸编码的蛋白可操作插入的媒介，从而引起蛋白的表达。载体可以用来转换、转导或者转染宿主细胞从而引起宿主细胞内遗传因素的表达。载体的实例包括质粒、噬粒、粘粒、例如酵母人工染色体(YAC)的人工染色体、细菌人工染色体(BAC)或者P1衍生的人工染色体(PAC)，λ噬菌体或者M13噬菌体的细菌噬菌体和动物病毒。用于载体的动物病毒类型包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒(例如SV40)。载体可以包括多种用来控制表达的因素，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择因素和报告基因。另外，载体可以包括复制源。载体也可以包括辅助进入细胞的材料，包括不限于病毒颗粒、脂质体或者蛋白涂层。
[0113] 本文使用的短语“宿主细胞”指的是引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。可以从多种细胞类型选择宿主细胞，包括例如E.coli或者B.subtilis细胞的细菌细胞、如酵母菌细胞或者曲霉细胞的真菌细胞、如Drosophila S2或者Spodoptera Sf9细胞的昆虫细胞、或者如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、EK 293细胞的动物细胞或人细胞。
[0114] 本文使用的“与ER或者ER-α36相关或者相联系的疾病”指的是由ER活性(例如：ER-α36)增加或者降低引起的、加重的或者与之相关联的任何病况。这些病况包括通过依赖于ER(如：ER-α36)细胞调解生长、增殖或转移的癌症，骨疾病例如：骨流失、骨折或骨质疏松，以及例如类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病或者哮喘的炎性病症。
[0115] 本文使用的“阻止结合”或者“竞争结合”能力指的是抗体或者抗原结合片段抑制两分子结合相互作用的能力到可以检测程度。在一些实施方式中，阻断两分子之间结合的抗体或抗原结合片段抑制了两分子间结合的相互作用至少50％。在一些实施方式中，这个抑制可以超过60％，在一些实施方式中超过70％，在一些实施方式中超过80％，并且在一些实施方式中超过90％。在一些实施方式中，受到抑制的结合相互作用可以是SNGmB1与hER-α36的结合。
[0116] 本文使用的术语“治疗有效量”或者“有效剂量”指的是用于治疗与hER-α36相关的疾病或病况的药物有效剂量或浓度。例如，关于本文公开的治疗癌症的抗体或者抗原结合片段的用途，治疗有效量是能够根除全部或者部分肿瘤、抑制或者降低肿瘤增长、抑制调解癌症病况细胞的生长或者增殖、抑制肿瘤细胞转移、减轻任何与肿瘤或者癌症病况相关的任何症状或标志、阻止或者推迟肿瘤或癌症病况发展或者以上结合的抗体或抗原结合片段的剂量或浓度。
[0118] 抗hER-α36抗体
[0119] 一方面，本发明提供了特异性结合SEQ ID NO：1的284-310个氨基酸残基，即如SEQ ID NO：2所示27个氨基酸片段的抗-hER-α36的抗体和其抗原结合片段。
[0120] SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列如下列出。
[0121] SEQ ID NO：1的氨基酸序列：
[0122] Met Ala Met Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn[0123] Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys[0124] Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys[0125] Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys[0126] Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly[0127] Gly Ile Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg[0128] Gln Arg Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp[0129] Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser[0130] Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser[0131] Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro[0132] Thr Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu[0133] Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro[0134] Gly Phe Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys[0135] Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu[0136] His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn[0137] Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu[0138] Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe[0139] Val Cys Leu Lys Ser Ile Leu Leu Leu Asn Ser Gly Ile Ser His Val[0140] Glu Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asn Leu His Pro Lys Ile Phe Gly Asn[0141] Lys Trp Phe Pro Arg Val
[0142] SEQ ID NO：2的氨基酸序列
[0143] Gly Ile Ser His Val Glu Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asn Leu His Pro[0144] Lys Ile Phe Gly Asn Lys Trp Phe Pro Arg Val
[0145] 本文使用的“抗-hER-α36”抗体指的是阻断hER-α36受体与其配体相结合或者与配体竞争结合hER-α36受体的抗体。
[0146] 在一些实施方式中，抗-hER-α36抗体和其抗原结合片段特异性结合hER-α36(即：SEQ ID NO：1)或包括SEQ ID NO：2的hER-α36片段，具有结合亲和力-6 -7 -7 -7 -8 -8 -8 -9
(KD)≤10 M(如.≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、-9 -9 -10 -10 -11 -11 -11
≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、≤2x10 M、≤5x 10 M、≤5x 10 M或者≤10 M)。在一-11 -8 -11 -9 -11 -8
些实施方式中，结合亲和力的范围从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从-11 -7 -11 -6 -10 -8 -10 -9 -10 -8
10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从
-10 -7 -10 -6
10 M到10 M或者从10 M到10 M。
(KD)≤10 M(如.≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、-9 -9 -10 -10 -11 -11 -11
≤2x10 M、≤10 M、≤5x10 M、≤2x10 M、≤5x 10 M、≤5x 10 M或者≤10 M)。在一-11 -8 -11 -9 -11 -8
些实施方式中，结合亲和力的范围从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从-11 -7 -11 -6 -10 -8 -10 -9 -10 -8
10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从10 M到10 M、从
-10 -7 -10 -6
10 M到10 M或者从10 M到10 M。
[0147] 所述的结合亲和力可以通过KD值表示，当抗原和抗体分子达到平衡时，该值通过离解率与结合率的比率(koff/kon)计算出来。当难以得到kon测定值时，例如：由于抗原聚集，也可以使用结合平衡时测定离解率(koff)。所述的抗原-结合亲和力(例如：KD或koff)可以使用本领域已知的适合方法适当确定出，包括例如生物大分子相互作用分析(Biacore)(参见,例如,Murphy,M.等,蛋白质科学当前手册(Currentprotocols in protein science),19卷19.14单元，2006)和高感度测量技术(Kinexa techniques)(参见，例如Darling,R.J.,等,药物检测发展技术(Assay Drug Dev.
Technol.,2(6):647-657(2004))。
Technol.,2(6):647-657(2004))。
[0148] 在一些实施方式中，本文提供的抗体或其片段拮抗一种或多种hER-α36的ER活性。这种抗体及其片段与hERα36相结合时，不促进一种或多种ER活性，和/或它们能够与ER配体或激动剂竞争受体结合，从而通过ER配体或激动剂促进的ER活性可以得到抑制或拮抗。所述的抗体及其片段对ER的活性可以使用本领域已知的检测测定，例如，通过检测受体磷酸化、检测ER配体或激动剂结合的抑制、检测hER-α36受体的一种或多种生物学效应。实例方法或检测在WO05/087811描述，其全部引入本文。
[0149] 在一些实施方式中，所述的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段可以被表达hER-α36的细胞内化。抗体的内化可以通过例如在一定时间孵化表达标记抗-hER-α36抗体的hER-α36的细胞，并检测细胞内标记抗体存在进行测定。(例如，通过荧光显微镜，或流式细胞分析(FACS))
[0150] 在一些实施方式中，所述的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段拥有体外和/或体内的抗肿瘤活性。所述的抗体及其片段能够抑制肿瘤细胞的增长和/或诱导肿瘤细胞凋亡。所述的抗肿瘤活性通过使用体外肿瘤细胞培养或者体内动物模型得以检测。
[0151] 源自SNGmB1的抗体
[0152] 本文提供的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段，包括SNGmB1抗体的至少一个(例如，至少2、3、4、5或所有6个)CDR。
[0153] 本文使用的“SNGmB1抗体”指的是包括具有SEQ ID NO：16氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：18氨基酸序列的重链的鼠单克隆抗体。如下提供了编码SNGmB1抗体轻链和重链的核苷酸序列，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19。轻链和重链的氨基酸序列如下列出，其中CDR区是黑体并且下划线标记，并且恒定区是黑体和斜体标记。
[0154] 所述的SNGmB1的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：16):
[0155] ETTVTQSPASLSMTIGEKVTIRC WYRKKPGQPPKLLIS
[0156] LCDR1
[0157] GVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYC FGAGTKLELK
[0158] LCDR2 LCDR3
[0159]
[0160] SNGmB1(SEQ ID NO：18)重链的氨基酸序列:
[0161] QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFT WIKQTPRQGLEWIG
[0162] HCDR1
[0163] KATLTVDKSSSTAYLQLSSLTSEESAVYFCARWGQGTTLTVSS
[0164] HCDR2 HCDR3[0165]
[0166] 编码鼠抗SNGmB1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)：
[0167] 5‘-GAGACCACAGTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTCAGCATGACAATCGGCGAGAAGGTGACCATCAGGTGCATCACATCCACCGACATCGACGACGACATGAACTGGTACAGGAAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAACTCCTCATCAGCGAGGGCAACACACTCAGGCCTGGCGTCCCCTCCAGATTCTCCAGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCGTCTTCACCATCGAGAACATGCTGTCCGAGGACGTGGCCGACTACTACTGCCTGCAGTCCGATAACCTGCCCCTGACATTCGGCGCCGGCACCAAGCTCGAGCTGAAAAGGGCCGACGCCGCCCCTACCGTCAGCATTTTCCCCCCTTCCAGCGAGCAACTGACAAGCGGAGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTCAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAAAACGGAGTGCTGAACAGCTGGACCGATCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCATGAGCTCCACCCTCACACTGACCAAGGACGAATACGAGAGGCACAACTCCTACACCTGCGAGGCCACACACAAGACAAGCACCTCCCCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAACGAGTGCTGA-3’
[0168] 编码鼠抗SNGmB1重链的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)：
[0169] 5’-CAGGCCTACCTGCAACAAAGCGGCGCTGAGCTCGTCAGGCCTGGAGCTAGCGTGAAGATGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCCACAACATGCACTGGATCAAGCAGACCCCTAGGCAGGGACTGGAATGGATCGGAGCCATTCACCCCGTGAACGGAGATACCGCTTATAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCCTGACCGTCGACAAGTCCTCCTCCACAGCCTATCTGCAGCTCAGCTCCCTGACCAGCGAAGAGAGCGCCGTCTACTTTTGCGCCAGAGAAGGCTACGGCAGCGTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCACCCTCACCGTGAGCTCGGCCAAGACCACCCCTCCTAGCGTCTACCCTCTGGCTCCCGGCTGTGGAGACACCACCGGAAGCTCCGTCACCCTGGGATGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGTCCGTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCCCTGAGCAGCTCCGTGCACACCTTCCCCGCTCTGCTGCAGTCCGGCCTGTACACCATGAGCTCCAGCGTCACAGTGCCCTCCAGCACCTGGCCTTCCCAGACAGTGACCTGCAGCGTGGCCCACCCTGCTTCCAGCACCACAGTCGACAAAAAGCTGGAGCCTAGCGGCCCTATTTCCACCATCAACCCCTGCCCCCCCTGCAAGGAGTGCCATAAGTGTCCTGCCCCTAATCTCGAGGGCGGACCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAACATCAAAGACGTCCTGATGATCTCCCTGACACCCAAGGTGACATGCGTCGTCGTCGACGTGAGCGAAGACGACCCCGACGTGCAAATCTCCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACAGCCCAGACCCAAACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCATTAGGGTGGTCAGCACACTCCCCATCCAACACCAGGACTGGATGTCCGGCAAGGAGTTTAAGTGCAAGGTCAACAACAAGGACCTGCCCAGCCCCATCGAGAGGACCATCTCCAAGATTAAGGGCCTGGTGAGGGCTCCTCAGGTGTATATCCTCCCCCCCCCTGCTGAACAGCTGTCCAGAAAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCGTCGGATTCAATCCCGGAGACATCTCCGTCGAATGGACCAGCAACGGACACACAGAGGAGAACTACAAGGACACAGCCCCTGTCCTGGACTCCGACGGCTCCTACTTCATCTACTCCAAGCTGAATATGAAGACCAGCAAGTGGGAGAAGACCGACTCCTTCAGCTGTAACGTGAGGCACGAGGGCCTCAAGAACTACTATCTGAAGAAGACAATCTCCAGGAGCCCCGGCAAGTGA-3’
[0170] SNGmB1抗体CDR序列如下表1列出
[0171] 表1
[0172]CDR 序列 序列号
LCDR1 ITSTDIDDDMN SEQ ID NO：3
LCDR2 EGNTLRP SEQ ID NO：4
LCDR3 LQSDNLPLT SEQ ID NO：5
HCDR1 SHNMH SEQ ID NO：6
HCDR2 AIHPVNGDTAYNQKFKG SEQ ID NO：7
HCDR3 EGYGSVDY SEQ ID NO：8
LCDR1 ITSTDIDDDMN SEQ ID NO：3
LCDR2 EGNTLRP SEQ ID NO：4
LCDR3 LQSDNLPLT SEQ ID NO：5
HCDR1 SHNMH SEQ ID NO：6
HCDR2 AIHPVNGDTAYNQKFKG SEQ ID NO：7
HCDR3 EGYGSVDY SEQ ID NO：8
[0173] 在一些实施方式中，本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括选自SEQ ID NO：3-8的至少一个CDR(或至少两个、三个、四个、五个或六个)。已知的CDR用于与抗原结合。然而，已经发现不是所有的6个CDR对于抗原结合都是不可或缺的。换言之，可能替换SNGmB1抗体的一个或多个CDR而实质保持着与hER-α36的亲和力。
[0174] 在一些实施方式中，本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括SEQ ID NO：8(即：SNGmB1抗体重链CDR3序列)。重链CDR3区位于抗原结合位置的中心，并且因此据信与抗原进行最大接触并且提供了抗原抗体亲和力的最大自由能。据信，就长度、氨基酸组成和多元化机制的构造而言(Tonegawa S.抗体多样体细胞的生成(Somatic generation of antibody diversity)自然.302:575-81)，重链CDR3是抗原结合位置最多样的CDR。重链CDR3多样化足以提供最多的抗体特异性(Xu JL,Davis MM.V(H)CDR3区多样化足以提供最多的抗体特异性《免疫学(Immunity)》13:37-45)和想要的抗原结合亲和力。(Schier R,等.通过抗体结合区中心互补决定区分子的进化分离皮摩尔亲和力抗-c-erbB-2单链，分子生物杂志(J Mol Biol.)263:551-67)。
[0175] 在一些实施方式，本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括含有SNGmB1抗体的3个HCDR中任意一个，即：包括SEQ ID NO：6-8中任意一个的重链可变区，和/或包括含有SNGmB1抗体3个LCDR中任意一个，即：包括SEQ ID NO：3-5中任意一个的轻链可变区。
[0176] 在一些实施方式中，本文提供的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO：6、7和8的重链可变区；和/或含有SEQ ID NO：3、4和5的轻链可变区。
[0177] 在一些实施方式中，本文提供的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段包括SNGmB1抗体的重链可变区，即，SEQ ID NO：10；和/或包括SNGmB1抗体的轻链可变区，即SEQ ID NO：9。在一些实施方式中，所述的抗-hER-α36的抗体是SNGmB1抗体，包括SEQ ID NO：16的轻链和SEQ ID NO：18的重链。
[0178] CDR区、SNGmB1抗体的轻链可变区和重链可变区可以按照本领域已知的方法移植到其他框架区或者恒定区从而产生骆驼源化的单域抗体、双价抗体、BsFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双价抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或全抗体。本文公开的抗体可以是单克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体或全人抗体。
[0179] 嵌合和/或人源化抗体
[0180] 在一些实施方式中，所述的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段是嵌合的。本文使用的“嵌合”指的是包括源自不同物种的至少两部分的一个分子。例如，嵌合抗体可以具有至少一个非人序列和一个人序列。在一些实施方式中，所述的嵌合抗体及其抗原结合片段包括源自鼠的至少一个CDR，以及源自非鼠物种(例如人)的至少一个恒定区和/或框架区。
[0181] 所述的嵌合抗体和抗原结合片段保持着对hER-α36的结合特异性，并且优选地，保持着与hER-α36的结合亲和力(例如，不少于SNGmB1抗体亲和力的60％、70％、80％、90％或95％)和/或保持着hER-α36上的生物活性(例如，拮抗活性)。
[0182] 在一些实施方式中，所述的嵌合抗体及其抗原-结合片段包括SEQ ID NO：3-8中至少一个和人源抗体骨架。在一些实施方式中，所述的嵌合抗体及其抗原结合片段包括移植于人源抗体骨架的含有SEQ ID NO：6-8全部序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO：3-5全部序列的轻链可变区。
[0183] 在一些实施方式中，所述的嵌合抗体合其抗原结合片段包括移植于人源抗体骨架的SEQ ID NO：10的重链可变区和/或SEQ ID NO：9轻链可变区。
[0184] 在一些实施方式中，所述的嵌合抗体包括具有SEQ ID NO：20氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：22氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，所述的嵌合抗体包括通过SEQ ID NO：21多核苷酸序列编码的轻链和通过SEQ ID NO：23多核苷酸序列编码的重链。
[0185] 嵌合抗体和抗原结合片段可以使用重组方法进行制备，例如如Morrison等在美国专利5,807,715、Cabilly等在美国专利4,816,567；Boss等在美国专利4,816,397；Morrison,《科学(Science)》229(4719):1202-1207(1985)；Morrison,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》81:6851-6855(1984)中的描述，以上全部引入本文作为参考。通常，编码一个物种可变区的DNA分子是与编码其他物种恒定区的另一DNA分子框架相连，并且导致了DNA编码的嵌合抗体链转染进入细胞使其表达，并且轻链和重链任意地插入细胞产生嵌合抗体或其抗原结合片段。
[0186] 嵌合抗-hER-α36抗体和其抗原结合片段可以进行人源化。通过“人源化”意味着改造非人抗体以增加相对于人抗体的同源序列，从而保留抗原结合性质然而减少对于人的免疫原性。
[0187] 在一些实施方式中，所述的人源化抗体及其抗原结合片段包括移植于人源性抗体骨架的源自SNGmB1抗体的一种或多种抗原结合序列。本文使用的“人源性”指的是抗体骨架是全人的，或者除了少量的突变或者修饰相当多地源自人，例如引入这些突变或者修饰以提供提高结合亲和力，提供结合位置，形成额外的二硫键或者为了其他适当的目的。在一些实施方式中，人源化抗体骨架已经减少相对于非人源抗体，例如鼠抗体的免疫源性或者在人体无免疫源性。
[0188] SNGmB1的一个或多个CDR和/或可变区可以移植于人源抗体或其片段。例如：SNGmB1抗体的CDR可以移植于人源抗体的人骨架区，从而SNGmB1的CDR置于替换人源抗体相应的CDR。另外的实施例，SNGmB1抗体的可变区可以移植于人源抗体相应的恒定区。
[0189] 在一些实施方式中，SNGmB1抗体的CDR移植于人骨架区，人骨架区特定的氨基酸残基可以用SNGmB1抗体相应的残基取代，从而人源化抗体的抗原结合区更接近于鼠抗体结构。这种氨基酸残基的实例包括而不限于人源化抗体可变区轻链的V4、P44、L46、S49和/或S64，以及重链的T28、L81。(见表2)
[0190] 在一些实施方式中，人源化嵌合抗体及其抗原结合片段包括移植到人源恒定区的选自SEQ ID NO：14和15的重链可变区和/或包括选自SEQ ID NO：11、12和13的轻链可变区。下表2提供了人源化的可变区序列，其中人骨架区的取代氨基酸残基以较大的字符表示。
[0191] 在一些实施方式中，人源化嵌合抗体包括具有选自SEQ ID NO：24、26和28氨基酸序列的轻链，和具有选自SEQ ID NO：30和32氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，嵌合抗体包括通过选自SEQ ID NO：25、27和29的核苷酸序列编码的轻链和通过选自SEQ ID NO：31和33核苷选序列编码的重链。
[0192] 表2人源化抗体可变区
[0193]
[0194] 可以使用本领域已知的多种方法用于非人抗体的人源化。例如，描述于Lo.B,《Antibody Engineering(抗体工程)》的方法：Springer,2004,135-159页公开的方法和实验报告；Padlan《分子免疫学(Mol.Immunol.)》28:489-498(1991)；Sato等.《分子免疫学(Mol.Immunol.)》31(5):371-381(1994)；Kettleborough等，《蛋白质工程(Protein Eng)》.4(7):773-783(1991)；和Presta,L.,《先进药物传递评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》,58(2006)640-656。
[0195] 亲和变异体
[0196] 本发明还提供了具有提高性质的抗体和抗原-结合片段(例如，提高亲和性、提高半衰期、提高偶联相容性等)，其包括在SNGmB1抗体的一个或多个CDR序列或者重链或轻链可变区、或在重链或者轻链恒定区取代、增加或减少一个或多个氨基酸。
[0197] 在一些实施方式中，具有这种氨基酸取代的抗体或其抗原结合片段保持着与hER-α36的结合特异性和结合亲和力，并且优选地，提高了对hER-α36的结合亲和力。这可以通过氨基酸序列随机或靶向的突变和随后的结合以及功能检测实现。以这种方式生成的抗体和抗原结合片段可以通过结合ER-α36进行筛选，从而确定与ER-α36结合性质的抗体。具有良好结合性质的抗体可以通过一种或多种功能检测以确定它们例如：抑制体外癌细胞生长或增殖或者体内肿瘤生长的能力。
[0198] NNAA变异体
[0199] 在一些实施方式中，抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段因此包括一种或多种非天然氨基酸(NNAA)取代。本文使用的“非天然氨基酸”或“NNAA”指的是任意氨基酸，包括修饰的氨基酸和/或不是二十种标准氨基酸(即：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)中一种的氨基酸类似物。
[0200] NNAA可以包括多种官能基团或者活性基团，这能提供额外的功能和/或者活性。例如，适于并入抗体和抗原结合片段的NNAA可以是光固化的(photocaged)和/或光敏异构化氨基酸(例如p-苯偶氮基-苯丙氨酸)、糖基化氨基酸(例如：N-乙酰-L-葡萄糖氨基-L-丝氨酸)、同位素标记氨基酸、含酮氨基酸(例如：吡咯赖氨酸)、含醛氨基酸，例如：
TM
甲酰甘氨酸(伍特生物科学(Redwood Bioscience’s)的SMARTAG )，重原子取代的氨基酸(例如：p-碘代苯丙氨酸)。化学裂解和/或光裂解氨基酸、氧化还原-活性氨基酸(3-氨基-L-酪氨酸)，或光激活氨基酸(例如：p-叠氮-L-苯丙氨酸和p-苯甲酰-L-苯丙氨酸)。
NNAA的总述可见如Xie,J.等《化学生物学研究的现状(Current Opinion in Chemical Biology)》2005，9:548–554；Hohsaka,T.等，《化学生物学研究的现状(Current Opinion in Chemical Biology)》2002,6:809–815,它们均全部引入本文。
TM
甲酰甘氨酸(伍特生物科学(Redwood Bioscience’s)的SMARTAG )，重原子取代的氨基酸(例如：p-碘代苯丙氨酸)。化学裂解和/或光裂解氨基酸、氧化还原-活性氨基酸(3-氨基-L-酪氨酸)，或光激活氨基酸(例如：p-叠氮-L-苯丙氨酸和p-苯甲酰-L-苯丙氨酸)。
NNAA的总述可见如Xie,J.等《化学生物学研究的现状(Current Opinion in Chemical Biology)》2005，9:548–554；Hohsaka,T.等，《化学生物学研究的现状(Current Opinion in Chemical Biology)》2002,6:809–815,它们均全部引入本文。
[0201] NNAA可以提供多种优点，例如，抗体偶联、标记、糖基化、光交联等等。
[0202] 在一些实施方式中，本文提供的抗体和抗原结合片段包括能够偶联的NNAA。具有官能团的偶联分子能够与NNAA相应的活性基团反应，从而在抗体的NNAA和偶联物之间能够形成稳定的连接，由此将偶联物连接到抗体。例如，包括酮基或醛或β-二酮分子的NNAA可以与含有酰肼-或O-烷基羟胺-或羟胺-制剂反应从而形成腙或O-烷基化肟连接。对于其他实例，NNAA含有能够与炔烃衍生物反应的叠氮基团从而通过铜(I)催化[3+2]的环加成形成稳定的三唑连接(并且反之亦然)。对于其他实例，含有叠氮基团的NNAA能够与适合的水溶性含膦-制剂相配合通过施陶丁格连接(Staudinger ligatio)形成酰胺键。此外，NNAA的硫酯基团可以与含胺制剂反应从而形成酰胺键。引入NNAA的抗体和抗原结合片段可以通过环加成反应与制剂相偶联。例如，二烯烃和二烯亲和物之间的(4+2)环加成反应(狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction))，通过1，3-偶极胡伊斯根环加成(Huisgen cycloaddition)的(3+2)环加成反应，和通过硝酮-烯烃环加成的(3+2)环加成反应。适于抗体偶联的环加成方法已经在例如WO05003294、US20120004183、WO06009901、WO07130453和美国专利6,737,236中进行了描述。这些方法在抗体和多种偶联物例如：荧光团、亲和分子(例如生物素)、糖类似物、聚合物(如，PEGs)以及化学化合物(例如：细胞毒素和抗肿瘤制剂)偶联时都非常有用。
[0203] 在一些实施方式中，抗体和引入NNAA的抗原结合片段包括叠氮基或炔基。这种NNAA能够通过铜催化的“点击”化学偶联，例如，具有叠氮的NNAA能够与带有末端炔烃的偶联物在铜离子(I)存在下反应，从而形成三唑连接。带有炔基的NNAA也可以与带有叠氮基团的制剂通过铜催化进行“点击”化学反应。该反应的更多细节已经描述在例如：美国专利7,009,059、WO2004055160,美国专利7,375,234和美国专利7,763,736内。
[0204] 可以使用任何本领域已知的适合的NNAA，包括不限于在PCT公开的WO05038002、WO04035743、WO04035605、WO06001832、WO06068802和WO06110182以及美国专利申请US20130030160,US20130028906和US20120301490。在一些实施方式中，NNAA是任何20种标准氨基酸的类似物。实例的NNAA包括而不限定于：
[0205] 赖氨酸类似物如吡咯赖氨酸；
[0206] 苯丙氨酸类似物如p-硝基苯丙氨酸、p-氨基苯丙氨酸、p-(2-氨基-3-羟基乙基)苯丙氨酸、p-苯甲酰苯丙氨酸、p-苯基偶氮苯丙氨酸、p-叠氮苯丙氨酸、p-碘代苯丙氨酸、p-乙酰苯丙氨酸、p-甲氧苯丙氨酸、p-(3-氧丁酰)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫羰基-苯丙氨酸、p-乙基硫羰基苯丙氨酸和p-炔丙氧基苯丙氨酸、p-羧甲基苯丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸；
[0207] 丙氨酸类似物例如L-3-(2-萘基)丙氨酸；
[0208] 酪氨酸类似物如O-甲基-酪氨酸、O-(2硝基苄基)酪氨酸、O-(三甲基氨烷基)酪氨酸、3-碘代酪氨酸、3-氨基-酪氨酸；
[0209] 半胱氨酸类似物例如S-(2-硝基苄基)-半胱氨酸、硒代半胱氨酸；
[0210] 苯丙氨酸类似物例如p-苯甲酰-L-苯丙氨酸)；
[0211] 色氨酸类似物例如5-羟基色氨酸；
[0212] 甘氨酸类似物例如7-羟基香豆素-甘氨酸和丹磺酰基-甘氨酸；
[0213] 丝氨酸类似物例如β-GlcNAc-丝氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-天冬酰胺酸和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸；
[0214] 苏氨酸类似物例如α-GalNAc-苏氨酸；和
[0215] 谷氨酰胺类似物例如L-人谷氨酰胺。
[0216] NNAA能够通过引入编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸中所希望的位点的指定遗传密码进行编码。NNAA可以通过不同于任何编码20个标准氨基酸天然密码的独特遗传密码进行编码。用于NNAA的遗传密码可以是终止密码子(例如琥珀密码子(UAG)、赭石密码子(UAA)和蛋白石密码子(UGA)密码子)，四联密码子(例如：AGGA、AGGU、CGGU、CGCU、CGAU、CCCU、CUCU、CUAU和GGGU)，五联密码字、六联密码子等等。
[0217] NNAA可以通过包括正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶对翻译系统引入抗体及其抗原结合片段。通常，包括用于NNAA密码子的抗体编码的核苷酸序列可以引入翻译系统，其中NNAA的密码子可以特异性得到识别并且通过tRNA和tRNA氨酰基合成酶的正交对翻译为NNAA，从而将核苷酸翻译为引入NNAA的抗体和抗原结合片段。
[0218] 正交对之内的合成酶特异地将带有NNAA的tRNA氨基酰化，并且tRNA能特异性识别NNAA的遗传密码子。该对可以人工引入系统(即：tRNA和合成酶的外源对)或者天然存在于系统(即tRNA的天然对和微生物的合成酶的原生对)。用于制备这类翻译系统的方法是本领域公知的。例如，参见PCT公开的WO02085923、WO02086075、WO03033521、WO04094593、WO05007624、WO05007870和WO05019415。
[0219] 保守变异体
[0220] 在一些实施方式中，抗-hER36抗体及其抗原结合片段因此包括来自SNGmB1抗体的保守替换。本文使用的“保守替换”指的是一个氨基酸残基用另一个侧链与被替换的残基有类似理化性质(例如：侧链的疏水性和分子体积)的氨基酸残基替换。例如，保守替换可以在具有疏水侧链氨基酸之间(例如：Met、Ala、Val、Leu和Ile)，在具有中性疏水侧链氨基酸之间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)，在具有酸性侧链(例如Asp、Glu)氨基酸，在具有碱性侧链(His、Lys和Arg)的氨基酸或者具有芳香侧链(例如Trp,Tyr和Phe)的氨基酸之间完成。如本领域公知的保守替换并不引起蛋白构想结构的重要变化，并且因此不降低或损害蛋白的生物活性。在一些实施方式中，保守替换可以引入SNGmB1抗体可变区的一个或多个位置，例如对于抗原结合不重要的位置。
[0221] pH依赖变异体
[0222] 在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括给予依赖pH结合到ER-α36的一个或多个氨基酸替代。在一些实施方式中，相对中性pH条件，这种抗体和抗原结合片段在酸性pH条件下与ER-α36的结合已经减少。结合到受体表面的抗体可以内化为细胞溶质并且接着当pH酸性时在溶酶体内降解。这是考虑到酸性pH下，降低的亲和力能够将抗体从溶酶体内的受体离解，并且使得抗体逃脱而免于降解，并回收到细胞表面用于继续与其他受体分子结合。
[0223] 具有pH依赖性的与ER-α36结合的抗体和抗原结合片段可以使用本领域已知的方法进行基因改变。例如Igawa T.等《自然生物技术(Nature
biotechnology)》,28(11):2010；美国专利申请20110076275,美国专利申请20110111406。
例如，抗体或其抗原片段的表面残基可以使用组氨酸扫描得以突变，并且最终的突变可以通过在酸性pH和中性pH与受体的结合亲和性得以筛选。已经公开了在可变区适合组氨酸突变的特定残基，例如美国专利申请20110076275和美国专利申请20110111406。
biotechnology)》,28(11):2010；美国专利申请20110076275,美国专利申请20110111406。
例如，抗体或其抗原片段的表面残基可以使用组氨酸扫描得以突变，并且最终的突变可以通过在酸性pH和中性pH与受体的结合亲和性得以筛选。已经公开了在可变区适合组氨酸突变的特定残基，例如美国专利申请20110076275和美国专利申请20110111406。
[0224] 在一些实施方式中，所述的抗体或者抗原结合片段包括一种或多种提高与Fc受体(FcRn)pH依赖性结合的氨基酸替代。已知Ig G在酸性pH下结合FcRn并且在中性pH下离解。内化lgG能在内体与FcRn相复合，并且当内体转胞吞作用向细胞基底外侧时，可以从细胞释放出。这种与FcRn的结合使得lgG逃脱免于在溶酶体内降解，并且因此能够延长抗体的药代动力半衰期。改变抗体和其抗原结合片段的基因工程方法从而提高与FcRn的结合亲和力是本领域公知的。参见,例如：Vaughn,D.等,《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等,《抗体工程(Antibody Engineering)》,卷1,第27章:改变Fc区基因工程以提高PK(Engineering of the Fc region for improved PK),Springer公开,2010；
Yeung,Y.等,《癌症研究(Cancer Research)》,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等,《免疫学(Immunology)》,176:346-356(2006)。可以筛选出突变的抗体从而确认具有改善FcRn结合亲和力的候选物。
Yeung,Y.等,《癌症研究(Cancer Research)》,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等,《免疫学(Immunology)》,176:346-356(2006)。可以筛选出突变的抗体从而确认具有改善FcRn结合亲和力的候选物。
[0225] 具有改变ADCC活性的变异体
[0226] 在一些实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可以通过基因工程方法改变Fc区从而改变抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)。Fc区在效应细胞例如：天然杀伤细胞和巨噬细胞表面上结合Fc受体，并且引导这些效应细胞到如ER-α36表达细胞的靶向细胞。在一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段包括提高ADCC活性的修饰或者突变。可以提供在Fc区的CH2域特定的氨基酸残基的取代从而提高ADCC活性。任选地或额外地，可以改变抗体上的碳水化合物结构以改善ADCC活性。通过抗体基因工程提高ADCC活性的方法已经在本领域进行了描述，参见例如Shields RL.等.,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2001.276(9)：6591-604；Idusogie EE.等,《免疫学(J Immunol)》.2000.164(8):4178-84；
Steurer W. 等 ,《免 疫 学 (J Immunol)》.1995,155(3):1165-74；Idusogie
EE. 等《免 疫 学 (J Immunol)》.2001,166(4):2571-5；Lazar GA. 等《美 国 科 学院 院 报(PNAS)》,2006,103(11):4005–4010；Ryan MC.等《癌 症 分 子 治 疗 (Mol.Cancer Ther.)》2007,6:3009–3018；Richards JO,. 等《癌 症 分 子 治 疗 (Mol.Cancer Ther.)》2008,7(8):2517-27；Shields R.L. 等《生 物 化 学 杂 志 (J Biol Chem.)》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.et al,,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》
2003,278:3466-3473。
Steurer W. 等 ,《免 疫 学 (J Immunol)》.1995,155(3):1165-74；Idusogie
EE. 等《免 疫 学 (J Immunol)》.2001,166(4):2571-5；Lazar GA. 等《美 国 科 学院 院 报(PNAS)》,2006,103(11):4005–4010；Ryan MC.等《癌 症 分 子 治 疗 (Mol.Cancer Ther.)》2007,6:3009–3018；Richards JO,. 等《癌 症 分 子 治 疗 (Mol.Cancer Ther.)》2008,7(8):2517-27；Shields R.L. 等《生 物 化 学 杂 志 (J Biol Chem.)》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.et al,,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》
2003,278:3466-3473。
[0227] 表位
[0228] 本发明还提供了与SNGmB1抗体特异性结合的表位基本相同的表位相结合的抗体及其抗原结合片段。
[0229] 用于识别抗体表位的方法是本领域公知的，例如，通过丙氨酸扫描。通常，引入单个的丙氨酸突变到感兴趣的残基从而产生突变的抗原，并检测突变抗原和抗体的结合亲和力，例如，使用竞争ELISA或者放射性配体免疫结合检测。如果通过这种丙氨酸取代抗体结合活性显著降低或者削弱，组成表位的残基将得到识别，如通过Cunningham等描述，《科学(Science)》244(4908):1081-1085(1989)。在例如Westwood,O.等,表位图谱可以得到更多的方法：《实用方法(a practical approach)》，牛津大学出版社2001年公开。
[0230] 在一些实施方式中，本申请所述的抗体可以结合包括选自SEQ ID NO：2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23的一个或多个。在一些实施方式中，所述的表位包括选自SEQ ID NO：2的G20、N21、K22、W23和/或F24的一个或多个。
[0231] 在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的G20、N21、K22、W23和/或F24的残基。在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23的残基。
[0232] 在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的G20、N21、K22、W23和/或F24的残基，在一些实施方式中，所述的表位包括SEQ ID NO：2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23。
[0233] 结合相同表位的抗体倾向于相互竞争结合，或者阻止其他抗体与抗原的结合。因此，也可以使用竞争结合分析识别与SNGmB1特异性结合相同表位的抗体。
[0234] 使用抗体和抗原结合片段的方法
[0235] 已经发现本文提供的所述的抗体和抗原结合片段抑制体内肿瘤生长。因此，可以使用抗体和抗原结合片段治疗与ER-α36相关的多种状况或疾病。
[0236] 在一些实施方式中，预防和/或治疗受试者与ER-α36相关疾病的方法包括向受试者施予治疗有效量的包括本文提供的抗体或抗原结合片段的药物组合物。与ER-α36相关的疾病实例包括不限于骨流失、骨折、骨质疏松、转移性骨疾病、佩吉特氏病(Paget's disease)、牙周组织疾病、软骨退变、子宫内膜异位症、子宫肌瘤病、潮热、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、认知功能损伤、大脑退行性疾病、(心瓣手术后)再狭窄、男子乳腺发育症、血管平滑肌细胞增殖、肥胖症、大小便失禁、焦虑症、源自雌激素缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、经前期综合症、躁郁症、焦虑症、痴呆、强迫行为、注意力缺乏症、睡眠障碍、易怒、冲动、免疫缺陷、自身免疫疾病、情绪管理、多发性硬化和帕金森疾病、炎症、炎性病症、炎症性肠病、呼吸系统疾病、性功能障碍、高血压、视网膜变性、哮喘和癌症。优选地，与ER-α36相关-的疾病包括骨流失、骨折、骨质疏松、绝经、经前综合症、子宫内膜异位症、子宫疾病、阳痿、性功能障碍、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、血管平滑肌细胞增殖、源自雌激素缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、免疫缺陷、自身免疫疾病、炎症、炎性病症、哮喘和癌症。更优选地，与ER-α36相关的疾病包括骨流失、骨质疏松、阳痿、心血管疾病、动脉粥样硬化、免疫缺陷、炎症、炎性病症、哮喘和癌症。本文使用的炎性病症包括类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。受试者可以是哺乳动物例如狗、猫、牛、羊、马或者人，优选人。该方法要求的治疗有效量将根据特异性疾病变化并且对于知晓当前公开技术的本领域普通技术人员来说是容易确定的。
[0237] 在一些实施方式中，预防和/或治疗个体中癌症病况的方法包括向个体施予包括本文提供的抗体或者抗原片段的药物组合物。使用本文公开的抗体或者抗原片段可以治疗的癌症状况和肿瘤类型包括而不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、生殖细胞瘤或血液或淋巴恶性肿瘤，例如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。更优选地，使用本文公开的抗体可以治疗的癌症状况和肿瘤类型包括而不限制于鳞状细胞癌、肺癌(例如：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌或者肺鳞状细胞癌)，腹膜癌、肝癌(例如，肝细胞癌/肝癌)、胃或腹部癌(例如消化道癌)、胰腺癌、脑肿瘤(例如：胶质母细胞瘤/多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非恶性胶质瘤或者脑膜瘤)、神经胶质瘤(例如，室管膜瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或混合性胶质瘤如少突星形细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(例如，肝母细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤或者肝癌)、膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌(例如：肾脏的横纹肌样肉瘤)、前列腺癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌(例如肛门鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈癌(例如：鼻咽癌)、皮肤癌(例如，黑色素瘤或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤(例如：横纹肌肉瘤，纤维肉瘤，卡波济肉瘤(Kaposi's sarcoma))、类癌肿瘤、眼癌(例如，视网膜母细胞瘤)、间皮瘤、淋巴细胞/淋巴细胞白血病(例如：T细胞系和前体B细胞谱系的急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞/淋巴细胞白血病(CLL)、急性粒细胞/粒细胞白血病(AML)包括肥大细胞白血病、慢性粒细胞/粒细胞/粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿、色杂瑞综合症(Sezary syndrome)、皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、孤立性浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、慢性与非慢性骨髓增殖性疾病、中枢神经系统肿瘤，垂体瘤、听神经瘤、原始神经外胚层肿瘤，室管膜瘤，脉络丛乳头状瘤，真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、特发性骨髓纤维变性和儿科肿瘤例如:小儿肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)。另外，肿瘤可以是恶性的(例如：癌症)或者良性的(例如：增生、囊肿、假性囊肿、错构瘤和良性肿瘤)。
[0238] 在一些实施方式中，在受试体中抑制与ER-α36相关的肿瘤转移的方法，该方法包括向受试者施予治疗有效剂量的包括本文提供的抗体或抗原片段的药物组合物。
[0239] 在一些实施方式中，本文提供的抗体和抗原结合片段是ER-α36的调节剂并且用于调节体内和体外细胞ER-α36的活性。在一些实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段可以引起细胞死亡和/或者抑制细胞增殖。
[0240] 在一些实施方式中，调节细胞内ER-α36的方法包括将表达ER-α36的细胞暴露于本文公开的抗体和抗原结合片段。所述的细胞可以内源性表达ER-α36或者通过基因工程外源性表达ER-α36。在一个实施方式中，所述的细胞内源性表达ER-α36。在优选的实施方式中，所述的细胞是外源性表达ER-α36的癌症细胞。表达ER-α36癌症细胞的实例是乳腺癌细胞、白血病细胞、肺癌细胞、骨髓瘤细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞和胃癌细胞。在另外优选的实施方式中，表达ER-α36的细胞是内源性表达ER-α36的乳腺癌细胞。表达ER-α36乳腺癌细胞的实例是MCF7和MDA-MB-231细胞。内源性ER-α36的表达可以通过一种或多种制剂治疗得到增加或减少。这些制剂的实例是血清、E2β(17β-雌二醇)、它莫昔芬和ICI 182,780。
[0241] 在其他实施例中，细胞通过基因工程得到改变以表达外源ER-α36。表达外源ER-α36的细胞可以通过本领域普通技术人员已知的基因工程方法制备(参见Sambrook等，《分 子克隆(Molecular Cloning)》，《实验 室手 册(A Laboratory Manual)》(2d Ed.1989)冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)。简而言之，制备外源ER-α36基因并且插入表达载体转染进入宿主细胞，宿主细胞接着在适合表达外源ER-α36的培养溶液中培养。人ER-α36的基因序列的实例由王等(Wang et al)在《生化、生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》336,1023-1027(2005)中进行了公开，基因银行登陆号(GenBank Accession No.BX640939)。表达外源ER-α36的细胞可以或者不可以表达外源ER-α36。细胞内的内源或外源ER-α36的表达水平可以通过一种或多种制剂治疗得到增加或降低。这种制剂的实例是血清、E2β(17β-雌二醇)、它莫昔芬和ICI 182,780。表达ER-α36的细胞可以或者不可以表达其他雌激素受体例如ER-α66、ER-α46和ER-β。
[0242] 本文公开的抗体或抗原结合片段可以单独或者与一种或多种额外的治疗方法或者制剂联合施用。例如，本文公开的抗体或者抗原结合片段可以与化疗、放疗、癌症治疗手术(例如：肿瘤切除术)、化疗引发并发症的一种或多种止吐剂或其他治疗、或者其它用于治疗由ER-α36调节的癌症或者任何内科疾病的治疗制剂共同施用。在这些一些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段与一种或多种额外治疗制剂联合施用，可以同时与一种或多种额外的治疗制剂施用，并且在这些一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段和额外的治疗制剂可以作为同一药物组合物的一部份进行施用。然而，抗体或者抗原结合片段与其它治疗制剂“联合”施用，不必要同时或者作为相同组合物内的制剂进行施用。在其他制剂之前或者之后施用的抗体或者抗原结合片段认为如本文使用的短语所述，与制剂“联合”进行施用，即便所述的抗体或抗原结合片段和第二种制剂通过不同的途径进行施用。其中可能的是，与本文公开的抗体或者抗原结合片段联合施用的额外治疗制剂是按照额外治疗制剂产品信息单的列出的进度表进行施用，或者按照内科医生案头参考资料(Physicians'Desk Reference)2003(内科医生案头参考资料，(Physicians'Desk Reference)第57版；医疗经济公司(Medical Economics Company)；ISBN:1563634457；第57th版(2002年11月)或者本领域公知的方案进行施用。治疗制剂的实施例包括而不限制于阿可拉定、它莫昔芬、17β-雌二醇、ICI 182,780,在2007年10月23日提交的美国专利申请11/877,575公开的化合物，其引入本文作为参考。在2008年4月8日提交的美国专利申请60/046,255公开的引入本文作为参考的化合物，细胞因子、抗-VEGF抗体(例如，贝伐单抗或阿瓦斯汀)、抗-HER2抗体(例如赫赛汀或曲妥单抗)、抗EGFR抗体(尼妥珠单抗或爱必妥)和细胞因子受体抑制剂例如格帕替尼(Gapatinib)和拉帕替尼(Lapatinib)。
[0243] 细胞因子的实例包括不限于淋巴因子、单核因子、人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛肽、原松弛肽、促卵胞成熟激素、促甲状腺激素、促黄体激素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、泌乳雌激素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子、副中肾管抑制物质、鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、整联蛋白、促血小板生成素、神经生长因子类如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II、促红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素类如干扰素-α、-β和–γ，集落刺激因子如巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞-CSF，白细胞介素如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12，肿瘤坏死因子类如TNF-α和TNF-β，以及其他多肽类因子。
[0244] 在一些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段通过连接、偶联或者联合一种或多种化疗制剂使用。化疗制剂的实例包括而不限定于氨柔比星、阿曲生坦、巴特布林(batabulin)、骨化三醇、西仑吉肽、达沙替尼、迪卡它尼(decatanib)、艾朵特卡莱(edotecarin)、恩杂朵瑞(enzastaurin)、厄洛替尼、依维莫司、吉美特卡(gimatecan)、棉籽酚易普利姆玛、洛那法尼、硫蒽酮、努阿迪布(neuradiab)、诺拉曲塞、奥布里森(oblimersen)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞构单抗(oregovomab)、帕尼单抗、帕唑帕布卡(pazopanibrubitecan)、他仑帕奈、西罗莫司、替米利芬、汉防己甲素、替斯利姆单抗(ticilimumab)、曲贝替定、凡德他尼、维特斯盘(vitespan)、赞利姆单抗(zanolimumab)、唑仑二膦酸盐(zolendronate)、组氨瑞林(histrelin)、阿扎胞苷、右丙亚胺、阿仑单抗(alemtuzumab)、来那度胺、吉姆单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、艾迪托特(editronate)、环孢霉素、艾德温那-天门冬酰胺酶和锶89。
[0245] 多种偶联物可以连接到本文提供的抗体或者抗原片段，这是可以预计的(参见，例如，“偶联疫苗(Conjugate Vaccines)”微生物学和免疫学贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(eds.)，卡格出版社(Carger Press)，纽约(1989)。这些偶联物可以通过其它方法中的共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合、络合、联合、共混或者加成的方法连接到抗体或者抗原结合片段。如果需要的话，在表位结合区外的特定位置可以改变基因结构，从而提供用于偶联位置。例如，所述的抗体或其抗原结合片段的基因结构可以改变为包括一个或多个活性氨基酸残基，例如半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸或蛋氨酸残基或如上描述的NNAA以促进与偶联物的共价结合。
[0246] 在一些实施方式中，所述的抗体可以间接连接到偶联物，或者通过其它偶联物或者通过连接子。例如，所述的抗体或抗原结合片段可以结合于生物素、然后间接连接于结合到抗生物素蛋白的第二个偶联物。可以使用多种连接子将偶联物连接到抗体的残基上，例如，用于连接到半胱氨酸的(6-马来酰亚胺己酰基)腙连接子、用于连接到赖氨酸的4-(4′-乙酰苯氧基)丁酸、用于连接到赖氨酸的4-巯基戊酸和连接到半胱氨酸的缬氨酸-瓜氨酸连接子。(参见，例如，Ducry,L等，生物偶联物化学，第21卷NO.1,2010)为了制备半胱氨酸连接子抗体药物偶联物，所述的抗体或其片段可以通过例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)或者氨基乙硫醇的还原剂部分还原以提供自由的硫醇基，该硫醇接着通过连接到连接子的偶联物烷基化，例如缬氨酸-瓜氨酸连接单乙基阿里他汀E(MMAE)。然而，在任选的实施例中，抗体或抗原结合片段可以不经过还原使用从而得到缬氨酸-连接子抗体偶联物，例如，在抗体或者抗原结合片段序列插入游离的半胱氨酸，或者插入游离的S-甲基化的半胱氨酸接着对插入的S-甲基化的半胱氨酸脱甲基化。类似地，蛋氨酸脱甲基化提供能与其他分子例如连接子或者小分子(例如药物)进一步偶联的巯基或者硫氢基(-SH)。制备而成的抗体偶联物可以进一步得到纯化和检测。
[0247] 在一些实施方式中，偶联物和连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的连接子可以包括一种或多种制剂或者官能团用来改变一种或多种药物代谢动力学(PK)性质(例如：增加半衰期)或者减少抗体或抗原结合片段的免疫原性。这种制剂或者基团可以包括而不限于例如：聚乙二醇(PEG)、葡萄糖醛酸或者其他糖基连接子，极性的、能够提高琥珀酰亚胺环水解率的阳性或者阴性电荷基团和减少或者弱化迈克尔逆反应速率，因此减少或者弱化药物和从抗体或抗原结合片段到其他含巯基蛋白的连接子和小分子的损失率。
[0248] 在一些实施方式中，本发明提供了抗体药物偶联物。所述的抗体药物偶联物包括共价结合到一种或多种药物分子的本发明的抗体或者抗原结合片段。在一些实施方式中，所述的抗体药物偶联物具有分子式Ab(-L-D)n，其中所述的Ab是本发明的抗体或者抗原结合片段，D是药物，L是将药物结合到抗体或者抗原结合片段的连接子。并且所述的连接子在靶细胞或组织存在下是可断裂的或者不可断裂的。n是1-60之间的一个整数。
[0249] 可以使用任何类型的连接子。适合连接子的实例包括而不限定于马来酰亚胺基己酰(MC)、马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基(mc-vc-PAB)、SMCC、SPDB和MB-vc。在一些实施方式中，所述的连接子选自包括马来酰亚胺基己酰(参见，例如式(II))、马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基(参见，例如式(III))、N-琥珀酰亚胺-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(参见，例如式(V))、N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(参见例如式(VI)和MB-vc(参见，例如式(Ⅳ))。这些实例连接子的结构如下所示：
[0250]
[0251]
[0252] 本文使用的术语“药物”指的是治疗制剂或者优选地细胞毒素剂、药物的实例包括但不限定于单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)、倍癌霉素和例如N2’-去乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
[0253] 本文还提供了优选抗体偶联物的结构，例如：如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE，其中“s”是从1到20变化的整数；如式(VIII)所示的Ab-mc-MMAF，其中“t”是从1-20变化的整数；如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1，其中“v”是从1-60变化的整数；如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4，其中“u”是从1-60变化的整数。式(XI)所示的Ab-MB-vc-倍癌霉素，其中“y”是从1-20变化的整数。
[0254]
[0255] Ab-mc-vc-PAB-MMAE
[0256]
[0257] Ab-mc-MMAF
[0258]
[0259] Ab-SMCC-DM1
[0260]
[0261] Ab-SPDB-DM4(X)
[0262]
[0263] Ab-MB-VC-倍癌霉素(XI)
[0264] 其中，“s”是从1-20变化的一个整数，“t”是从1-20变化的一个整数,“u”是从1-60变化的一个整数，“v”是从1-60变化的一个整数，“y”是从1-20变化的一个整数并且“Ab”是本发明的抗体或抗原结合片段。
[0265] 在抗体药物偶联物中，特别地，具有式Ab(-L-D)n的抗体药物偶联物，所述的连接子可以在一端与抗体或抗原结合片段的活性基团反应，并且还能够在另一端与药物部分的其他反应基团反应，因此，将抗体和药物相连，形成抗体药物偶联物。
[0266] 在一些实施方式中，所述的连接子能够与抗体或其抗原结合片段半胱氨酸巯基反应。可以使用任何适当的抗体或者抗原结合片段的半胱氨酸残基用于连接子反应。在一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段具有有限数量的半胱氨酸巯基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)适合与连接子反应。例如，在抗体或者抗原结合片段的一些存在的二硫键可以使用例如二硫苏糖醇(DTT)得到还原，从而释放一个或多个用于连接子反应的巯基。适用于与抗体中巯基反应的连接子可以包括而不限定于mc-vc-PAB、mc和MB-vc。连接子与半胱氨酸巯基反应抗体-药物偶联物的实例是Ab-mc-vc-PAB-MMAE和Ab-mc-MMAF和Ab-MB-vc-倍癌霉素。
[0267] 在一些实施方式中，所述的连接子能够抗体或其抗原结合片段赖氨酸残基上的氨基酸反应，在一个实施例中，所述的连接子将抗体或抗原结合片段通过抗体赖氨酸残基和也含有硫醚分子或二硫键的活性酯之间形成的共价氨键连接到例如美登素的药物。优选的美登素是DM1和DM4，DM1和DM4的结构分别如式(XI)和式(XII)所表示:
[0268]
[0269]
[0270] 在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段分子可以与超过一分子药物部分偶联。例如，所述的抗体或抗原结合片段可以包括超过一个用于连接子反应的活性基团。因此，导致了超过一个连接子或药物分子偶联。在这种情况下，所述的抗体药物偶联物可以是在特定分布范围的带有变化数目的偶联连接子或药物分子的偶联物的混合物。每个抗体的药物分子平均值可以按照重量均值计算得出。∑i*(Ab-(LD)i％)，其中i是抗体或抗原结合片段药物分子的数值，这如Ab-(LD)i所示，并且能够从0到60变化。每个特定种类Ab-(LD)i的百分率如(Ab-(LD)i)％所示。ADC混合物的负载率(药物/抗体比例，或者DAR)可以以不同的方式进行控制，包括以下的一种或所有：(i)限定药物连接子中间体或者连接子制剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限定偶联反应时间或者温度，(iii)半胱氨酸巯基修饰的部分或者限定还原条件和控制游离半胱氨酸的数目，引入抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的蛋氨酸或NNAA数目。
[0271] 在优选的实施例中，所述的连接子包括聚乙二醇部分，例如Ab-MB-vc-倍癌霉素。连接子的PEG部分可以在1到50单位长度，在优选的实施例中，所述的PEG部分具有1-12个重复单位，更优选地，2-6个重复单位。所述的PEG部分降低了药物偶联到抗体时可能发生的聚合度。
[0272] 在另外优选地实施例中，所述的连接子包括肽序列。具有肽连接子的抗体药物偶联物的实例包括而不限定于，mc-vc-PAB-MMAE和MB-vc-倍癌霉素。在一些实施方式中，可以基于多肽序列的氨基酸对酶裂解适应情况进行选择。例如：与蛋白酶相关的肿瘤，在优选的实施例中，肽连接子包括两个氨基酸连接子val-cit。然而，具有两个或超过两个氨基酸残基的其他氨基酸组合物可以类似方式工作，这也是公知的。
[0273] 在一个实施方式中，偶联物的连接子包括非裂解连接子和可裂解的连接子。非裂解的连接子是以稳定、共价情况下，能够将药物连接到抗体或抗原结合片段的化学分子。连接连接子上的药物通过抗体序列的断裂释放出来，并且连接到连接子上的氨基酸(例如赖氨酸或半胱氨酸)游离而出。非裂解连接子基本上耐受酸引发的裂解、光引发的裂解、肽酶引发的裂解、酯酶引发的裂解和二硫键裂解。非裂解连接子的实例包括涉及氨键和硫醚的连接子，例如：SMCC和mc。可裂解的连接子能够通过蛋白酶、肽酶、酯酶、光、酸或二硫键断裂例如裂解，马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧羰基和MB-vc进行裂解。从抗体的可裂解的连接子释放药物并保持抗体完整性，这是可能的。
[0274] 在一些实施方式中，连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的偶联物可以包括一123 124 125
种或多种可检测的标记物。这些标记物包括但不限定于放射性同位素例如：I、I、 I、
131 35 3 111 112 14 64 67 86 88 90 177 211 186 188 153 212 32
I、S、H、In、 In、C、Cu、Cu、Y、Y、Y、Lu、 At、Re、 Re、Sm、 Bi和 P。其他镧系元素、发光标记物、例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红和例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶的酶底物标记物。
种或多种可检测的标记物。这些标记物包括但不限定于放射性同位素例如：I、I、 I、
131 35 3 111 112 14 64 67 86 88 90 177 211 186 188 153 212 32
I、S、H、In、 In、C、Cu、Cu、Y、Y、Y、Lu、 At、Re、 Re、Sm、 Bi和 P。其他镧系元素、发光标记物、例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红和例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶的酶底物标记物。
[0275] 在一些实施方式中，连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的偶联物可以包括一种或多种毒素。该毒素可以相同或不同。不同的毒素表示具有相同或不同行为机制的(MOA)的不同分子负载在相同单抗或单抗片段。这些毒素可以靶向表达ER-α36的细胞并且因此在靶向细胞上发挥细胞毒性。适合的毒素包括而不限定于通过例如vc或mc连接子的例如MMAE和MMAF的阿里他汀(西雅图基因)、例如DM1、DM3和DM4(免疫基因)的美登素、卡奇霉素(辉瑞)、倍癌霉素(欣欣(Synthon))、PBD二聚体(斯毕瑞根(Spirogen),西雅图基因和罗氏，参见US8426402)和作为RNA聚合酶抑制剂(海德堡制药(Heidelberg Pharma))的毒伞毒素(例如阿玛尼汀(Amanitin))。
[0276] 本文还提供了连接到偶联物的抗体及其抗原结合片段使用的方法。在特定的实施方式，偶联的抗体和抗原结合片段可以以治疗有效剂量施予受试体，从而治疗、预防或缓解与ER-α36相关的疾病，抑制ER-α36表达细胞的增殖，减少ER-α36表达细胞，和/或杀死ER-α36表达细胞。所述的抗体和抗原结合片段特异性靶向ER-α36表达细胞，因此使得偶联物(例如，毒素、化疗药物)特异性靶向所述的偶联物可以发挥治疗效果的ER-α36表达细胞。通过偶联制剂的这种靶向给药，偶联物的功效可以得到明显提高，并且由非特异性活性引起的毒性可以得到极大地降低。在一些实施方式中，当作为偶联抗体或抗原结合片段给药时，偶联物的治疗有效摩尔量可以比没有偶联到本文提供的抗体或抗原结合片段时要求的有所降低(例如：至少10％、20％、30％、40％、50％或更高)。
[0277] 在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以作为包括一种或多种药学上可接受载体的药物组合物的一部分进行给药。本文公开的在药物组合物中使用的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性载体、非水载体、抗菌制剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂或络合剂、稀释剂、佐剂、辅料或非毒性辅料，本领域已知的其他成分或其多种组合。
[0278] 适合的成分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、染色剂、乳化剂或例如糖和环胡精的稳定剂。适当的抗氧化剂可以包括例如：蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、抗氧化酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨醇糖、丁基茴香醚、丁基苯甲醇和/或没食子酸丙酯。如本文公开，一种或多种抗氧化剂包括例如在含有抗体或抗原结合片段和本文提供的偶联物的组合物中的蛋氨酸降低了所述抗体或抗原结合片段的氧化。该氧化还原阻止或减少了结合亲合力的损失，因此提高了抗体稳定性并且延长了保存期。因此，在一些实施方式中，所提供的组合物包括本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段以及如蛋氨酸的一种或多种抗氧化剂。还提供了用于阻止本文提供的抗体或抗原结合片段氧化、延长本文提供的抗体或抗原结合片段保护期和/或提高本文提供的抗体或抗原结合片段的效力的方法，通过将所述的抗体或抗原结合片段与一种或多种例如蛋氨酸的抗氧化剂混合。
[0279] 为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如氯化钠注射剂的含水载体，林格液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸格林注射液、无水载体例如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，以抗菌或抑菌浓度的的抗菌剂，如氯化钠或葡萄糖的等渗制剂、如磷酸盐或柠檬酸缓冲液的缓冲液，例如硫酸氢钠的抗氧化剂、例如盐酸普鲁卡因的局部麻醉剂、例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮的悬浮剂和分散剂，例如聚山梨醇酯80的乳化剂(吐温-80)、例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸的螯合剂或络合剂。作为载体使用的抗菌剂可以添加到包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基P-羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量包装的药物组合物中。适当的辅料可以包括例如水、盐溶液、葡萄糖、乙二醇或乙醇。适当的非毒性辅助物质可以包括例如：润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂或例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙胺或环糊精的制剂。
[0280] 本文提供抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量将依赖本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、既往病史、当前药物、受试体的健康状况和关于交叉反应、过敏、敏感性和副作用以及给药途径和肿瘤发展程度的潜在可能性。剂量可以由本领域普通技术人员(例如，医师或兽医)通过这些或者其他情况或要求的指示按比例地减少或增加。
[0281] 在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以以大约0.01mg/kg到大约100mg/kg(例如，大约0.01mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约2mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg、大约15mg/kg、大约20mg/kg、大约25mg/kg、大约30mg/kg、大约35mg/kg、大约40mg/kg、大约45mg/kg、大约50mg/kg、大约55mg/kg、大约60mg/kg、大约65mg/kg、大约70mg/kg、大约75mg/kg、大约80mg/kg、大约85mg/kg、大约90mg/kg、大约95mg/kg或大约100mg/kg)的治疗有效剂量进行施用。在这些一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段以大约50mg/kg或更少的剂量给药，并且在这些一些实施方式中，所述的剂量是10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.1mg/kg或更少。在一些实施方式中，所述的给药剂量可以在整个治疗过程中变化。例如，在一些实施方式中，起始的给药剂量可以高于接下来的给药剂量，在一些实施方式中，所述的给药剂量在治疗过程中依赖受试体的反应进行改变。
[0282] 可以调整剂量方案从而提供最好的想要的反应(例如，治疗反应)。例如，可以随着时间单一剂量或者分剂量给药。
[0283] 本文公开的抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的路径给药，例如胃肠外(例如，皮下、腹腔、静脉注射包括静脉输液、肌内或皮内注射)或非注射(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)路径。在所述的抗体或抗原结合片段通过注射给药的实施例中，可注射的药物组合物可以以任何常规的形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳化液或适合生成液体溶液、悬浮液或乳化液的固体形式。注射液的制备可以包括准备注射的无菌和/或非引起发热的溶液。无菌干燥的可溶性产品，例如冻干粉，在使用前准备与溶剂相结合，包括皮下注射片，准备注射的无菌悬浮液，使用前准备与载体相结合的无菌干燥不可溶产品和无菌和/或非引起发热的乳化剂。所述的溶液可以是含水的或者不含水。
[0284] 在一些实施方式中，单位剂量的胃肠外制剂以安瓿、小瓶或带针头的注射器形式包装。胃肠外给药的所有制剂应该是无菌的和非引起发热的，正如本领域公知和公用的一样。
[0285] 在特定的实施中，无菌、冻干粉通过将本文公开的抗体或抗原结合片段溶解于适合的溶剂中制备而成。所述的溶液可以包括提高稳定性的赋形剂，或者粉末或由粉末制成的重组溶液中的药理成分。可以使用的赋形剂包括而不限定于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他可溶制剂。所述的溶剂可以包括缓冲剂，例如柠檬酸、磷酸钠或磷酸钾，或者本领域人员公知的其他这类缓冲剂。在一个实施例中，大约中性pH。溶液随后灭菌过滤，接下来在本领域技术人员已知标准条件下冷冻干燥提供了想要的剂型。在一个实施例中，最终的溶液将分配到小瓶中用于冷冻干燥。每个小瓶能够容纳单一剂量或多剂量的抗-hER抗体或其抗原结合片段或者其组合物。少量超过需要的一个剂量或一组剂量(例如，大约10％)的过量瓶是可接受的从而便于准确的样品取出和准确的剂量。所述的冻干粉末可以在适当的条件下储藏，例如大约4℃到室温。
[0286] 用水复建用来注射的冻干粉提供了一种用于胃肠外给药的剂型。在一个实施例中，用于复建无菌和/或非引起发热的水或其他液体可溶性载体添加到冻干粉末。精确量依赖于给定的选定的治疗并且能够凭经验决定。
[0287] 本文提供的抗体和抗原结合片段可以以多种非治疗用途使用。在一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段可以作为亲和纯化制剂使用以纯化ER-α36或其片段。在这些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段可以使用本领域已知方法固定于例如树脂或滤纸的固定相。可以使用所述的抗体或抗原结合片段从溶液中沉淀ER-α36及其片段。在其他非治疗性实施方式中，可以在多种体外或体内诊断或检测应用中使用所述的抗体或抗原结合片段。在这些一些实施方式中，所述的抗体或抗原结合片段可以结合到检测标记物。所述的抗体或抗原结合片段可以结合到检测标记物。在其他实施例中，所述的抗体或抗原结合片段不能结合到检测标记物，却可以使用结合到抗体的标记第二抗体得以检测。在一些实施方式中，可以使用本文公开的抗体或抗原结合片段以检测ER-α36的表达。在这些一些实施方式中，可以使用所述的抗体或抗原结合片段诊断与ER-α36表达相关的升高或降低状况。例如，所述的抗体或抗原结合片段可以与来自受检者的生物样品相接触，从而诊断受检者ER-α36表达升高或降低相关的状况。特别地，与ER-α36相关的进展或衰退状况。类似地，所述的抗体或抗原结合片段可以直接施用于受检者，使用本领域公知的方法通过与受检的ER-α36相结合。
[0288] 在一些实施方式中，提供了编码本文抗体或抗原结合片段的分离的核苷酸，包括核苷酸的载体和宿主细胞以及用于制备抗体的重组技术。
[0289] 对于抗体的重组制备，编码它的核苷酸可以得到分离并且插入到可复制的载体用于进一步的克隆(DNA的扩大)或者表达。在其他实施例中，所述的抗体可以通过本领域的已知的同源重组制备，DNA编码的单克隆抗体使用常规程序容易分离和测序。(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)很多载体是可以得到的。所述的载体成分通常包括但不限定于以下列举的一种或多种：信号序列、复制源、标记基因的一种或多种、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0290] 用于克隆或在本文的载体中表达DNA的合适的宿主细胞是如上描述的原核生物细胞、酵母菌或高等真核细胞。用于该目的的适当原核生物细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌、肠杆菌、欧文氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌的肠杆菌科；沙门氏菌如鼠伤寒沙门氏菌；沙雷氏菌例如粘质沙雷氏菌和志贺菌；以及杆菌，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；假单胞菌，例如铜绿假单胞菌和链霉菌。
[0291] 除了原核生物，真核微生物例如丝状真菌或酵母菌适合作为克隆或作为抗-ER抗体编码载体的表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是在低等真核宿主微生物中最广泛使用的。然而，通常可以得到并使用本文的大量其他属、种和品系，例如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母宿主例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC12，424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerants)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、耶罗维亚酵母(yarrowia)(EP 402，226)、毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)、念珠菌、里氏木霉(EP 244,234)、链孢霉；例如许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)的许旺酵母菌属(Schwanniomyces)和例如脉孢霉(Neurospora)、青霉菌、真菌和黄曲霉(Aspergillus hosts)例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)的丝状真菌。
[0292] 用于表达提供的糖基化抗体和抗原结合片段的适当的宿主细胞衍生于多细胞生物。无脊椎动物的细胞的实例包括植物和昆虫细胞。许多病毒株和变异体以及来源寄主相应允许的昆虫宿主细胞，例如：草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和桑蚕已经得到了证实。用来转染的多种病毒株是公众可以得到的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且这种病毒可以按照本发明，特别用于草地夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以作为宿主使用。
[0293] 然而，对无脊椎动物细胞的兴趣已经很大，并且培养(组织培养)中的无脊椎动物细胞的繁殖已经变成常规的程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCC CRL1651)转变的猴肾CV1细胞；人胚肾(在悬浮培养中生长的293细胞或亚克隆的293细胞Graham等,《普通病毒学(J.Gen Virol.)》36:59(1977))，幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,《美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》美国77:4216(1980)小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,《纽约科学年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC5细胞；；FS4细胞；和人肝肿瘤细胞株(Hep G2)。
[0294] 宿主细胞用以上描述的表达或者用于抗-ER抗体制备的克隆载体进行转化，并且宿主细胞在按照适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码想要序列基因改良的传统的营养培养基中进行培养。
[0295] 制备本文提供的抗体或抗原结合片段使用的宿主细胞可以在多种培养基中培养。商业上可以获得的培养基例如汉斯(Ham's)F10(西格玛)、最小必要培养基(MEM)(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),西格玛)是适合于培养宿主细胞的。另外，在Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,《生物化学年报(Anal.Biochem.)102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或者美国专利参见30,985可以用于宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种在需要时可以补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN.TM药)、微量元素(如无机化合物定义通常以最终浓度为微摩尔范围出现)以及葡萄糖或者等效能量源。也可以以本领域人员公知合适的浓度包括任何其他必要的补充物。所述的培养条件例如温度、pH等是那些以前和选择用于表达的宿主细胞一起使用的，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
[0296] 当使用重组技术时，所述的抗体能在细胞内、壁膜间隙制备或直接分泌于培养基内。如果所述的抗体在细胞内制备，第一步，去除颗粒物或者宿主细胞或裂解碎片，例如，通过离心或者超滤。Carter等，生物/技术10：163-167(1992)描述了一种分离分泌到大肠杆菌壁膜间隙的抗体的程序。简言之，细胞体在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟存在下解冻大约30分钟。细胞碎片能够通过离心去除。当抗体分泌到培养基上，这种表达体系的上清液通常首先使用商业上可得到的蛋白离心过滤器例如，超滤或微孔超滤单元进行离心。例如PMSF的蛋白酶抑制剂可以包括于前述的任何一种步骤以抑制蛋白水解并且可以增加抗生素以阻止外来污染物的生长。
[0297] 通过细胞制备的抗体可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性依赖于抗体存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人的抗体重链的γ1、γ2、γ3或γ4(Lindmark等,《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62:1-13(1983)。蛋白G是用于所有鼠同种型和是人的γ3的重组(Guss等,EMBO J.5:1567 1575(1986))。亲和配体结合的基质最普遍的是琼脂糖，然而也可以使用其他基质。物理上稳定的基质例如受控的孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯能比琼脂糖达到更快的流速和更短的操作时间。其中在所述的抗体包括C.亚.H3域，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。其他用于蛋白纯化的技术，例如在离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱层析、在肝素SEPHAROSE.TM色谱层析、阴阳离子交换树脂(例如聚天门冬氨酸色谱柱)色谱层析、聚焦层析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和硫酸铵沉淀也可以根据待回收的抗体进行使用。
[0298] 在任何最初的纯化步骤之后，包括感兴趣的抗体和污染物的混合物可以经过使用pH在大约2.5－4.5之间的洗脱液，优选在低盐浓度(例如从大约0-0.25M盐)下用低pH疏水作用色谱进行处理。
[0299] 在一些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以提供在试剂盒中，即，预先确定量的制剂和实施诊断检测说明书的包装组合。其中所述的抗体用酶进行标记，试剂盒将包括底物和酶要求的辅酶因子(例如，提供检测生色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其他添加物例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲或裂解缓冲)等等。多种制剂的相对量可以大范围变化以提供制剂的溶液浓度，基本上优化了检测的敏感度。特别地，可以以干燥粉末形式提供制剂，通常为冻干，还包括赋形剂，从而在溶解时将提供制剂溶液具有适当浓度的赋形剂。
[0300] 在一些实施方式中，提供了包括用于治疗以上描述状况材料的制品。该制片包括容器和标签。适合的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。所述的容器可以由例如玻璃或塑料的多种材料制成。该容器容纳本文提供的对所述状况有效的药学组合物(包括本文公开的抗体或抗原结合片段)并且可以有消毒入口(例如，该容器可以是静脉溶液袋或可以通过皮下注射针可刺破的带塞子小瓶)。容器上或与容器相关的标签表明组合物用来治疗供选择的状况。所述制品还可以包括含有药物可接受缓冲液的第二个容器，例如磷酸盐缓冲液、林格液溶液和葡萄糖溶液。它还包括其他从商业和用户观点想要的材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器和指导使用的包装说明书。
[0301] 提供以下的实施例更好地说明要求的发明而不应解释为限制发明的范围。所有以下的描述的特定组合物、材料和方法，在总体上或部分落入本发明的范围内。特定的组合物、材料和方法不用来限制本发明，而是仅仅解释落入本发明范围的一些实施方式。本领域技术人员无需创造能力并且不偏离本发明范围即可开发等同的组合物、材料和方法。可以理解在本文公开的流程进行多种改变同时依然在本发明的范围内。发明人的目的是这些变化包括在本发明的范围内。实施例
[0302] 实施例1 重组蛋白的制备和ER-α36表达细胞的建立
[0303] 通过以下方法制备重组用来免疫的ER-α36蛋白
[0304] ER-α36的配体结合域和Fc(LBD-ER-α36_Fc)的配体结合域的蛋白融合
[0305] 通过重组方法将Fc融合到ER-α36配体结合域的C末端。构建表达LBD-ER-α36_Fc的载体，ER-α36的配体结合域从SEQ ID NO：1的第166个氨基酸延伸到第310个氨基酸。使用以下的方法构建pET30a-ER-α36 LBD-Fc质粒。人ER-α36全长基因克隆到pcDNA3.1(+)载体(英杰公司(Invitrogen))的BamH I/Not I位置并且使用T7正向和BGH反相引物确定的DNA序列证实了插入的序列。带有N-末端myc标记的人ER-α36和科扎克序列(kozak sequence)也得到克隆并且插入到pcDNA3.1(+)载体的NheI/XbaI位置。插入序列通过使用CMV正向和BGH反相引物确定的DNA序列得以证实。质粒DNA转化进入BL21(DE3)(新英格兰生物试验公司(New England Biolabs Inc.))已经挑选出新鲜的转化株并且在37℃30L LB培养基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl,10g/L)中培养。
当培养液OD600达到0.6时，通过将IPTG(西格玛)添加到0.5mM终浓度，诱导了蛋白的表达。在诱导4小时后，通过在4℃离心7000g细胞30分钟，收获细胞。30克表达重组ER-α36 LBD-Fc的细菌细胞在300ml蛋白提取缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，2.0M尿素，1％聚乙二醇辛基苯基醚100,pH 8.0)通过超声处理(350W，3*45爆发(burst))溶解。
在4℃离心20,000克(Beckman hAvanti J-26XP)30分钟后从上清液中收集可溶蛋白，并且放置于20ml CaptivA PriMAB色谱柱上(吉诺泰公司(RepliGen Corporation))。色谱柱得到平衡并且用CaptivA PriMAB缓冲液A(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，pH8.0)洗涤，直到A280值达到基线。重组的ER-α36 LBD-Fc蛋白接着通过CaptivA PriMAB缓冲液B(100mM甘氨酸，pH2.5)从CaptivA PriMAB色谱柱洗脱。蛋白洗脱液馏分汇集到一起，并且最终通过透析与储存缓冲液交换。透析最终的纯化蛋白并于-80℃在储存缓冲液(PBS pH7.3)储存。
当培养液OD600达到0.6时，通过将IPTG(西格玛)添加到0.5mM终浓度，诱导了蛋白的表达。在诱导4小时后，通过在4℃离心7000g细胞30分钟，收获细胞。30克表达重组ER-α36 LBD-Fc的细菌细胞在300ml蛋白提取缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，2.0M尿素，1％聚乙二醇辛基苯基醚100,pH 8.0)通过超声处理(350W，3*45爆发(burst))溶解。
在4℃离心20,000克(Beckman hAvanti J-26XP)30分钟后从上清液中收集可溶蛋白，并且放置于20ml CaptivA PriMAB色谱柱上(吉诺泰公司(RepliGen Corporation))。色谱柱得到平衡并且用CaptivA PriMAB缓冲液A(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，pH8.0)洗涤，直到A280值达到基线。重组的ER-α36 LBD-Fc蛋白接着通过CaptivA PriMAB缓冲液B(100mM甘氨酸，pH2.5)从CaptivA PriMAB色谱柱洗脱。蛋白洗脱液馏分汇集到一起，并且最终通过透析与储存缓冲液交换。透析最终的纯化蛋白并于-80℃在储存缓冲液(PBS pH7.3)储存。
[0306] FC_LBD-ER-α36
[0307] Fc通过重组方法融合到ER-α36配体结合域的N末端。使用以下的方法构建pET30a-Fc-ER-α36 LBD质粒：质粒DNA转化进入BL21(DE3)。已经挑选出新鲜的转化株并且在37℃在30L的LB培养基中培养。当培养液OD600达到0.6，通过将IPTG添加到最终浓度0.5mM诱导蛋白的表达。在诱导后4小时，通过在4℃离心7000g细胞30分钟，收获细胞。30克表达重组Fc-ER-α36 LBD的细菌细胞在300ml蛋白提取缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，2.0M尿素，1％聚乙二醇辛基苯基醚100，pH 8.0)通过超声处理(350W，3*45爆发)溶解。在4℃离心20,000克(Beckman hAvanti J-26XP)30分钟之后从上清液中收集可溶蛋白并且放置于20ml CaptivA PriMAB色谱柱上。色谱柱得到平衡并且用CaptivA PriMAB缓冲液A(50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM NaCl，pH8.0)洗涤，直到A280值达到基线。重组的Fc-ER-α36 LBD蛋白接着通过CaptivA PriMAB缓冲液B(100mM甘氨酸，pH2.5)从CaptivA PriMAB色谱柱洗脱。蛋白洗脱液馏分汇集到一起并且最终通过透析与储存缓冲液交换并且于-80℃在储存缓冲液(PBS pH7.3)储存。
[0308] ER-α36重组细胞制备
[0309] 人ER-α36全长基因克隆到pcDNA3.1(+)载体的BamH I/Not I位置并且使用T7正向和BGH反相引物(英杰公司((Invitrogen))确定DNA序列证实了插入的序列。带有N-末端myc标记的人ER-α36和科扎克序列(kozak sequence)也得到克隆并且插入到pcDNA3.1(+)载体的NheI/XbaI位置。插入序列通过使用CMV正向和BGH反相引物确定的DNA序列得以证实。
[0310] CHOK1、NIH3T3或HEK293细胞(ATCC)培养到大约75％融合或者1x106细胞/ml，并且接着细胞用ER-α36 DNA质粒通过用于CHOK1和NIH3T3的脂质体2000(Lipofectamine2000)(英杰公司)或者用于HEK293的PEI(Polyscience)转染。
[0311] 为了细胞系的稳定发展，所述的细胞通过24小时的后转染并且转向带有800μg/ml G418(Gibco)的新鲜选择培养基。选择培养基每三天进行更新并且选择程序持续2-3周，接着转染子通过以1细胞/孔的方式在96孔板以有限稀释得到亚克隆。亚克隆从单菌落生长孔扩大到6孔板并且通过流氏细胞仪筛选，4-5个阳性克隆进一步得到扩大，冷藏保存并且为了稳定的检测进行保持。
[0312] 为了瞬时转染，转染细胞在完整的培养基内额外培养48小时。收获部分细胞并且为了转染率和表达水平使用ER-α36特异性抗体或者cmyc融合标签抗体(Abcam)蛋白印记法检测准备细胞裂解液。72-96小时后，收获用于动物免疫的细胞、细胞为基础的结合检测或者用于细胞裂解液的制备。
[0313] 实施例2 抗体的制备和筛选
[0314] 抗原和免疫原的制备
[0315] 为了扩大针对ER-α36制备的抗体的多样性，使用三种不同类型的抗原用于ER-α36抗体的制备，包括：1)ER-α36衍生的C-末端肽、2)包括配体结合域和C-末端27个氨基酸的重组ER-α36蛋白和3)使用瞬时或者稳定转染建立的表达ER-α36全长蛋白的细胞系，或在膜上表达高水平的ER-α36蛋白的自然发生的细胞系。
[0316] 具 有 以 下 的 序 列 1)GISHVEAKKRILNLHPKIFGNKWFPRVC 和 2)GISHVEAKKRILNLHPKIFGC的ER-α36衍生的C-末端肽使用固体化学方法合成并且与匙孔血蓝蛋白(KLH)(西格玛(Sigma))偶联。通过质谱检测(Waters)合成的肽具有超过95％的纯度。C-末端27个氨基酸的合成肽接着通过异双官能团的连接子偶联KLH载体蛋白。
未结合的肽和连接子通过针对PBS，pH 7.2透析偶联物去除。纯化的ER-α36蛋白的包含LBD-使用实施例1显示的方法进行制备。
未结合的肽和连接子通过针对PBS，pH 7.2透析偶联物去除。纯化的ER-α36蛋白的包含LBD-使用实施例1显示的方法进行制备。
[0317] 动物免疫：
[0318] 使用重组蛋白和合成的KLH偶联肽接着用作免疫原免疫C57BL/6、Balb/c和SJL鼠(Slac试验动物公司，上海)。简言之，使用完全或不完全的弗氏佐剂(Fraund’s adjuvant)(西格玛(Sigma))乳化到相同的体积，接着以100μl/注射和50-100μg/动物/注射剂量免疫动物皮下注射或腹腔注射。每2-3周进行免疫，并且在每次增强免疫(boost immization)后7天进行血液和酶联免疫吸附检测。
[0319] 对于以细胞为基础的免疫，NIH3T3或CHOK1细胞系用全长人ER-α36瞬时转染。在两天转染后，收获部分细胞并使用ER-α36的抗体用于蛋白印记法检测以确定ER-α36的表达。在转染后三天，收获细胞并且使用RPMI1640基础培养基(Gibo)洗涤两次。以(5-10)x106细胞/动物/注射腹腔的方式至少2-3周对选定的小鼠品系C57BL/6,Balb/c和SJL小鼠(Slac试验动物公司，上海)免疫一次并且在每次增强免疫之后进行血液检测和流氏细胞(BD生物科学公司)或高内涵细胞分析(Acumen assay)(TTP试验室技术)。在每次列入计划的免疫或者检测血液分析之前恰好进行准备好新鲜的ER-α36转染子。
[0320] 融合：
[0321] 在融合前四天，每只小鼠使用ER-α36蛋白或者27氨基酸肽-KLH偶联物或者在磷酸盐缓冲液内的重组ER-α36蛋白进行腹膜内增强免疫。在融合当天，无菌去除脾脏并且把器官处理到单独的细胞悬浮液中。在洗涤后，所有的细胞在DMEM基础培养基(Gibco)内悬浮细胞并且以5：1比例和SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)混合，用基础培养液洗涤一次混合液并且接着经过聚乙二醇(PEG)介导的融合。当完全融合时，使用DMEM基础培养液洗涤6
细胞一次并且在补充1×HAT(西格玛)和杂交瘤生长因子到0.5*10细胞/ml的后融合细胞生长培养基中再次悬浮细胞。200μl每孔的细胞悬浮液置于96孔细胞培养平板并且在
37℃用5％CO2恒温箱培养。在7天培养之后，加入含有1×HAT(西格玛)5μl/孔的新鲜生长培养液。通过酶联免疫吸附试验或者Acumen酶标仪在细胞融合后10-14天进行融合筛选。
细胞一次并且在补充1×HAT(西格玛)和杂交瘤生长因子到0.5*10细胞/ml的后融合细胞生长培养基中再次悬浮细胞。200μl每孔的细胞悬浮液置于96孔细胞培养平板并且在
37℃用5％CO2恒温箱培养。在7天培养之后，加入含有1×HAT(西格玛)5μl/孔的新鲜生长培养液。通过酶联免疫吸附试验或者Acumen酶标仪在细胞融合后10-14天进行融合筛选。
[0322] 杂交瘤筛选
[0323] 1.酶联免疫吸附试验筛选
[0324] 高结合的洁净聚苯乙烯96孔平板(Nunc)用10μl/孔的纯化ER-α36LBD融合蛋白、阴性对照蛋白或者其他在pH 7.2的磷酸缓冲液中稀释到1μg/ml的反筛选抗原(包括的FC-ER-α66配体结合域融合蛋白，人lgG)覆盖。带有覆盖溶液的平板在2-8℃过夜孵育，接着使用磷酸缓冲液+0.05％吐温20(PBST)，西格玛)在平板垫圈上洗涤一次。向每个孔添加200μl/孔的封闭液(pH7.4磷酸缓冲液+1％的牛血清蛋白(西格玛))并且在室温下孵育1-2小时。清空平板并且添加50-100μl/孔的杂交瘤培养上清液。在37℃孵育1.0小时后，接着用PBST洗涤平板3次，并且接着添加100μl/孔的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠lgG抗体(ZSBO生物公司)。该反应在37℃持续1.0小时接着用PBST洗涤3次，并且添加100μg/孔的二甲基苯底物(CW生物公司)。在室温下孵育15分钟之后，添加100μl/孔的1.0N的盐酸作为中止液并且通过酶联免疫平板阅读器(分子仪器公司(Molecular Device))在450nm下阅读平板。确定了生成了在酶联免疫筛选高读出的抗体的杂交瘤克隆。
[0325] 2.Acumen酶标仪筛选
[0326] 人ER-α36转染的筛选细胞放置于黑色/洁净的底部的384孔平板(Nunc)并且在37℃,5％CO2条件下过夜培养。第二天，去除培养基并且添加20μl/孔的杂交瘤上清液样品。在37℃，孵育两个小时后，用磷酸缓冲液pH 7.2洗涤平板两次，并且接着添加15μl/孔的Alexa488偶联的羊抗鼠IgG(F(ab’)2片段，英杰公司)，接着在37℃进行1小时孵育。
接着用磷酸缓冲液洗涤平板3-4次，并且接着用4％的多聚甲醛(西格玛)固定细胞并且用碘化丙啶(DOJINDO)在37℃再次染色1小时。检测平板用Acumen微量板计数器(Acumen eX3，TTP莱伯泰科科技)阅读。确定了制备出在Acumen微量板计数器筛选高读出的抗体的杂交瘤克隆。
接着用磷酸缓冲液洗涤平板3-4次，并且接着用4％的多聚甲醛(西格玛)固定细胞并且用碘化丙啶(DOJINDO)在37℃再次染色1小时。检测平板用Acumen微量板计数器(Acumen eX3，TTP莱伯泰科科技)阅读。确定了制备出在Acumen微量板计数器筛选高读出的抗体的杂交瘤克隆。
[0327] 亚克隆：
[0328] 来自酶联免疫吸附和/或Acumen筛选的选定阳性杂交瘤克隆通过在96孔培养平板的限定稀释进行亚克隆。在7-10天的培养之后，通过酶联免疫吸附或Acumen检测筛选亚克隆平板。用于母本克隆的带有单菌落生长的两种阳性克隆扩增到24孔平板用于额外的确认检测，分型并且接着进一步扩增到培养瓶用于冷冻保存。
[0329] 制备和纯化：
[0330] 用于选定杂交瘤细胞系的抗体制备通过使用带有杂交瘤培养基(SFM Gibco)的滚瓶(康宁)细胞培养。2-3周培养之后，收培养基并且通过超滤去除细胞和细胞碎片。通过超滤接着浓缩澄清的上清液并且放置于制备的蛋白A-琼脂糖色谱柱(GE健康生命科学公司)。在用平衡缓冲液洗涤到通过紫外光检测器监测到基线时，色谱柱接着用0.1M柠檬酸pH3.5洗脱，并且洗脱的抗体立刻用1.0M的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0中和，并且用pH 7.2的磷酸缓冲液(英杰公司)透析，在2-8℃过夜，更换两次缓冲液。纯化的抗体通过0.22μm消毒的注射器式过滤器过滤并且在-80℃或者更低温度下储存。纯化的抗体命名为SNGmB1。抗体产品的样品提交到质量控制部门检测包括纯化、浓度、与蛋白的结合能力和基于抗原的细胞结合能力、体外效力等。图2显示质量控制的分析结果。
[0331] 实施例3 SNGmB1与ER-α36的结合性质
[0332] 抗-ER-α36抗体SNGmB1与ER-α36的结合性质在本实施例中以下面列出的不同方面描述。
[0333] a)使用酶联免疫分析SNGmB1的结合特异性
[0334] 使用酶联免疫分析评估SNGmB1的结合特异性。使用五种不同的蛋白以1μg/ml覆盖检测平板。在广泛封闭之后，不同浓度的SNGmB1(10、2、0.4、0.08和0.016、0.004μg/ml)抗体添加到检测平板上并且孵育1.5小时，接着使用HRP(辣根过氧化酶)标记的抗鼠lgGFc(英杰公司)检测复合物的形成。下图3显示了数据的实施例。SNGmB1显示结合源于ER-α36(图3的“肽”)F域的27个氨基酸肽并且还结合Fc-LBD蛋白(图3的“Fc-LBD-D27”)，然而不结合删除了27个氨基酸的Fc-LBD(图3的“Fc-LBD-D27”)或者Fc-ER-α66蛋白(图3的“Fc-ER66”)。因此，SNGmB1特异性结合到ER-α36的F域C末端的27个氨基酸肽。ER-36F域用于与SNGmB1结合的关键的表位残基通过使用肽扫描和丙氨酸扫描已经进行了描图。(见例5)
[0335] b)免疫印迹分析
[0336] 抗体SNGmB1的结合特异性通过使用免疫印迹法分析来自于一组人癌细胞系的全部细胞裂解液得到了进一步的评估。使用以下的裂解液：1)亲本的HEK293细胞；2)带有Myc-标记的pcDNA3.1_ER-α36全长蛋白转染的HEK293细胞；3)MDA-MB-231(ATCC)；4)MCF-7(ATCC)；5)Hec-1A(ATCC)；6)K562(ATCC)。
[0337] 通过吸入培养基制备来自不同细胞系的细胞裂解液，并且用磷酸缓冲液洗涤细胞，接着将细胞放置于裂解缓冲液(磷酸缓冲液+1％乙基苯基聚乙二醇40和0.7mM乙二胺四乙酸+1％蛋白酶抑制剂混合物)(罗氏)于冰上达到30分钟。通过以14000rpm在艾本德离心机在4℃离心旋转10分钟，澄清裂解液，收集上清液。在蛋白定量后，将50-100μg蛋白裂解液与5x十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的凝胶加样缓冲液(Bio-rad)混合，并且放置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳接着转移到PVDF膜。所述的PVDF膜接着用TBS缓冲液+0.1％的吐温20(PBST)洗涤并且用含有磷酸缓冲液+0.1％吐温20+5％脱脂牛奶的缓冲液在4℃过夜阻断非特异性结合。最初的SNGmB1接着添加到带有1％脱脂牛奶的TBST中达到1-2ug/ml的浓度并且用膜孵育，在4℃过夜2小时。膜接着洗涤三次，每次在TBST中轻轻摇动10分钟，并且接着将辣根过氧化酶结合的羊抗鼠人Fc的二抗(ZSGB生物)添加到带有5％脱脂牛奶的TBST内并且在室温孵育2小时，在用ELC底物(Millipore)孵育前每次轻轻摇动用TBST洗涤三次，每次5分钟用于检测。
[0338] 如图4所示，带有myc-标记的转染ER-α36蛋白用抗Myc(Abcam)检测为大约37KD。所有细胞检测到的内源ER-α36带是36KD。仅有的检测到的其他带是在55-72KD之间。该带可能是ER-α66与来自ER-α36或其他具有类似表位蛋白F域的嵌合蛋白，并且它的身份将进一步进行定义。
[0339] c)ER-α36表达的流式细胞分析
[0340] 还检测了SNGmB1与一系列包括来自于慢性粒细胞白血病病人的K562细胞；表达ER-α66和ER-α36的乳腺癌细胞系MCF7，表达高水平的HER2的乳腺癌细胞系
SKBR3(ATCC)，和高度转移性肝癌的MHCC97H(ATCC)细胞系人癌细胞系的结合。可以通过免疫印迹法发现这些细胞系表达ER-α36蛋白。
SKBR3(ATCC)，和高度转移性肝癌的MHCC97H(ATCC)细胞系人癌细胞系的结合。可以通过免疫印迹法发现这些细胞系表达ER-α36蛋白。
[0341] 这些细胞系(K562、MCF7、SKBR3、MHCC97H)在各自的培养基中培养到90％的汇合度并且接着使用磷酸缓冲液洗涤细胞，接着用0.5mM乙二胺二乙酸(粘壁细胞系)预处理以便于去除底物。接着收集细胞并且在2500rpm在4℃离心5分钟。数细胞数量之后，接6
着在封闭缓冲液(10％正常山羊血清(英杰公司))再次悬浮到最终的5-10 x 10细胞/
5
ml浓度，并且100μl细胞(5x 10)转移到1.5ml的及压管用于染色。所有的那些管(封闭缓冲液内的细胞)接着在4℃放置于旋转装置(Grant)30分钟。之后，在4℃以2500rpm的速度离心细胞5分钟，弃去上清液，接着添加100μl一抗(1-30μg/ml终浓度，SNGmB1或鼠lgG2b同型对照)并在4℃在旋转装置孵育1小时。接着通过在2500rpm在4℃离心收集细胞，并且用磷酸缓冲溶液洗涤细胞两次。羊抗鼠lgG(H+L)异硫氰酸荧光素标记的二抗(英杰公司)接着以1：400-800稀释范围添加，接下来在旋转装置在4℃孵育1小时并且在暗处保存。在孵育后，通过用磷酸缓冲液洗涤细胞两次去除游离的抗体并且接着在1％多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，并且在再次悬浮200-400μl的磷酸缓冲液内的细胞前，添加5μl 7-氨基放线素D(BD Biosciences)用于最终的流式细胞分析。
着在封闭缓冲液(10％正常山羊血清(英杰公司))再次悬浮到最终的5-10 x 10细胞/
5
ml浓度，并且100μl细胞(5x 10)转移到1.5ml的及压管用于染色。所有的那些管(封闭缓冲液内的细胞)接着在4℃放置于旋转装置(Grant)30分钟。之后，在4℃以2500rpm的速度离心细胞5分钟，弃去上清液，接着添加100μl一抗(1-30μg/ml终浓度，SNGmB1或鼠lgG2b同型对照)并在4℃在旋转装置孵育1小时。接着通过在2500rpm在4℃离心收集细胞，并且用磷酸缓冲溶液洗涤细胞两次。羊抗鼠lgG(H+L)异硫氰酸荧光素标记的二抗(英杰公司)接着以1：400-800稀释范围添加，接下来在旋转装置在4℃孵育1小时并且在暗处保存。在孵育后，通过用磷酸缓冲液洗涤细胞两次去除游离的抗体并且接着在1％多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，并且在再次悬浮200-400μl的磷酸缓冲液内的细胞前，添加5μl 7-氨基放线素D(BD Biosciences)用于最终的流式细胞分析。
[0342] 检测一系列浓度(100、20、4、0.8、0.16、0.032μg/ml)的SNGmB1抗体并且在流式细胞分析中显示了与K562细胞的浓度依赖性结合(见图5A)。在图5A，“几何平均”指的是几何平均荧光强度。SNGmB1抗体与其他受检的人乳腺癌细胞系的特异性结合也得到了证实。参见图5B(MCF7)、5C(SKBR3)和5D(MHCC97H)。为了更好地描述抗体的特异性结合，我们建立了能够诱导表达人ER-α36蛋白的稳定的3T3细胞系。使用SNGmB1抗体孵育细胞系并且检测结合性，根据以上描述的类似程序，使用鼠lgG2b作为异性对照。结果表明SNGmB1抗体也特异性结合到细胞系。(参见图5E)
[0343] d)免疫荧光分析
[0344] 使用免疫染色法评估SNGmB1检测MCF-7细胞的膜结合ER-36蛋白的能力。形成了MCF-7微球并且通过以下步骤进行免疫染色。
[0345] 1.在无酚红的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养MCF-7细胞2天，并且用7-氨基放线素D(7-AAD)染色，接着用流式细胞分析分类。在无酚红的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)/F12(Gibo)带有B27(英杰公司，EGF(BD Biosciences)and bFGF(BD Biosciences)培养分类的细胞6天，并且形成MCF-7微球。
[0346] 2.在1000rpm转速下离心MCF-7微球4分钟，并且去除上清液。
[0347] 3.用500μl的磷酸缓冲液洗涤成球细胞，并且在以1000rpm转速离心4分钟之前转移到1.5ml的及压管(EP tube)，并且去除上清液。
[0348] 4.用500μl的多聚甲醛(4％)固定沉淀20分钟(或者过夜)，并且以1000rpm转速离心4分钟去除上清液。
[0349] 5.用500μl磷酸缓冲液洗涤沉淀并且以1000rpm速度离心4分钟，弃去上清液，使用磷酸缓冲液洗涤三次。
[0350] 6.去除上清液并且用50μl山羊血清封闭溶液在37℃孵育沉淀30分钟，在以1000rpm离心4分钟之后，弃去上清液。
[0351] 7.用SNGmB1(工作浓度：10μg/mL)在4℃过夜孵育微球。
[0352] 8.在第二天，以1000rpm离心微球4分钟，并且用500μl磷酸缓冲液洗涤三次。
[0353] 9.添加山羊抗-鼠IgG(H+L)异硫氰酸荧光素标记的二抗(英杰公司)(5μg/ml)，并且在37℃孵育20分钟。
[0354] 10.在1000rpm离心4分钟之后，将20μl的烟酸己可碱逐滴加入到沉淀，并且在室温下放置20分钟。
[0355] 11.用500μl的磷酸缓冲溶液洗涤微球三次。
[0356] 12.将微球转移到小的观察盘，并且在4℃储存用于检测。
[0357] 如图6A所示，在大部分细胞中观察到清晰的膜染色。SNGmB1染色的MCF-7成球细胞呈浓度依赖关系(参见图6B)。
[0358] e)内吞分析
[0359] 正如抗体药物偶联物的发展依赖于内吞的载体抗体携带化疗药物进入肿瘤细胞，也评估SNGmB1通过K-562的内吞能力。
[0360] 首先将K562细胞在正常的伊思柯夫改良培养基(IMDM)中培养24小时，在第二天，通过离心收集细胞并且用温暖的磷酸缓冲溶液洗涤细胞一次。接着用补充有2.5％无酚红的活性炭处理的胎牛血清(Gibo)的无酚红的IMDM(Gibco)中再悬浮。在培养48小时后，收集细胞并且在1000rpm转速离心5分钟。接着用AlexaFluro488标记的抗-ER-α36抗体SNGmB1在37℃不同时间(1、2、4、6、24小时)孵育细胞使得内吞发生。通过将细胞置于冰上结束内吞。K562细胞进行抗体SNGmB1的内吞分析通过表面荧光淬灭进行，并且通过流式细胞分析的平均荧光强度进行测定。使用抗-抗-AlexaFluro488抗体淬灭结合域K562细胞表面的AlexaFluro488-标记的SNGmB1抗体。结果如图7所示，其表明了内吞抗体百分率呈时间依赖性增长并且在24小时结合抗体峰值达到～75％。
[0361] 实施例4 使用雌二醇刺激的MCF7微球形成分析对中和抗－ER-α36抗体进行功能检测
[0362] 通过雌二醇刺激的MCF7微球形成分析评估了抗体对细胞形成和生长的影响[0363] MCF7(ATCC)保存在含有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基在检测前已经传代2-3次并且是60％的汇合度。
[0364] 用温的无酚红DMEM洗涤MCF-7细胞两次并且在含有2.5％活性炭处理的胎牛血清(CFBS)的无酚红的DMEM中培养48小时。接着胰酶消化细胞并且通过40-μm过滤器去除细胞团，接着用7-氨基放线菌D染色并且将800细胞放置于含有无血清DMEM-F12(Gibco)，补充有5μg/ml胰岛素、0.4％牛血清白蛋白(西格玛)B27(英杰公司)20ng/ml表皮生长因子和重组人碱性成纤维细胞生长因子bFGF(BD Biosciences)的800μl微球培养基超低吸附24孔板(康宁公司)的每个孔。为了评估抗体的活性，二甲基亚砜的1nM雌二醇添加到每个孔诱导添加抗体后的微球形成。
[0365] MCF7细胞在1nM的雌二醇和磷酸缓冲液、人lgG、鼠lgG2b、重组ER-α36配体结合域Fc融合蛋白或者SNGmB1中培养，使用二甲基亚砜作为阴性对照。在72小时处理后，计数培养中的微球数量。SNGmB1和重组ER-α36配体结合域Fc融合蛋白相对于人lgG和鼠lgG2b明显地抑制了雌二醇刺激的MCF7微球的形成。(图6C)
[0366] 还通过以下方法评估了在7天的较长时间里的抗体活性：使用上述相同的方法制备了MCF7微球。为了评估抗体的活性，微球培养基中的100μl的10x浓缩抗体原液接着添加到各个孔并且使其孵育2小时，之后，100μl的10x浓缩雌二醇原液(最终浓度在100pM或在0.02％二甲基亚砜中的3nM)接着添加到每个孔以刺激微球的形成。在微球培养基中的100μl的10x新鲜抗体原液在第4天添加到每个孔。7天后使用显微镜人工数微球的数量。SNGmB1相对于mlgG表现出了较好的抑制微球形成的能力。(图6D)
[0367] 实施例5 Biacore结合分析
[0368] 通过Biacore技术检测SNGmB1与靶蛋白的亲和力。图8表示了Biacore分析的形式。抗体捕捉于抗-鼠/人FC lgG包被的表面上，并且在表面上注射肽。使用空FC1作为参考的通道，重新生成碎片表面和Gly1.5。
[0369] 向捕获的抗体滴定GV27
[0370] 一系列S CM5感应碎片(9000RU)(BIACORE)在FC2、FC3和FC4碎片通过7分钟注射(10μl/分钟)新鲜制备的混合物和同体积的50mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)得到激活。接着1：25稀释的Biacore抗-鼠Fc抗体(在pH5.0的乙酸钠缓冲液中以25μg/ml浓度存在)以10μl/分钟注射于激活碎片FC2、FC3和FC4细胞上直到信号达到9000Ru。激活的配对位点通过7分钟以10μl/min注射1M乙醇胺得到阻断。每个抗体分别捕获到的碎片表面(FC2、FC3和FC4、FC1作为参考细胞)并且捕获的信号大约500RU，GV27(ER-α36c-末端的27个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示)以0nM、1.5625nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM和25nM浓度以30μl/分钟于结合相180s并且于分离相900s。通过注射再生缓冲液(10mM pH 1.5的苷氨酸缓冲液)90秒再生出感应器表面。作为对照，GV27也以不同浓度注射于未捕获抗体的FC表面。
从对照步骤减去步骤2得到的信号并且结果适合于使用1对1结合形式。
从对照步骤减去步骤2得到的信号并且结果适合于使用1对1结合形式。
[0371] 如表3所示，SNGmB1的Kd结合27个氨基酸肽(F域)大约是100pM(n＝7)
[0372] 表3 SNGmB1的Biacore亲和力数据
[0373]
[0374] 实施例6 表位图谱
[0375] 使用丙氨酸扫描的方法进一步分析SNGmB1的表位结合。合成一系列氨基酸依序替换为丙氨酸的肽，并且将所述的肽覆盖在高结合力的平板上并且确定抗体结合肽的能力。列出的肽和它们的序列列于表4中。
[0376] 表4带有系列丙氨酸突变的肽系列和它们的序列
[0377]
[0378]
[0379] 基于肽的表位图谱：丙氨酸扫描
[0380] 使用以下的方法研究SNGmB1结合以上将氨基酸依序替代为丙基酸的肽：用含有列出的33种肽中的一种肽的5μg/ml肽的磷酸缓冲液覆盖洁净的聚丙乙烯平板(Nunc)(50μl/孔)。平板用覆盖的溶液在4℃过夜孵育。接着将平板用磷酸缓冲液+0.05％吐温20(西格玛)在自动平板洗涤器中洗涤一次。将含有磷酸缓冲液+1％牛血清蛋白+0.5％吐温20(西格玛)的200μl封闭溶液加入到每个孔并且在37℃孵育1小时。50μl受
检的SNGmB1以封闭溶液中10μg/ml的浓度添加到平板上并且在37℃孵育1小时，接着用含有0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤平板三次。接着，向每个孔添加100μl的山羊抗-鼠-lgG-Fab-HRP(ZSGB Bio)并且在37℃孵育平板1小时。用带有0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤平板三次，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物以100μl/孔添加到每个孔，并且在室温下孵育15分钟。将50μl/孔的中止液加入到平板并且在平板阅读器上读数。图9显示结果。
检的SNGmB1以封闭溶液中10μg/ml的浓度添加到平板上并且在37℃孵育1小时，接着用含有0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤平板三次。接着，向每个孔添加100μl的山羊抗-鼠-lgG-Fab-HRP(ZSGB Bio)并且在37℃孵育平板1小时。用带有0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤平板三次，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物以100μl/孔添加到每个孔，并且在室温下孵育15分钟。将50μl/孔的中止液加入到平板并且在平板阅读器上读数。图9显示结果。
[0381] 实施例7 抗体基因克隆和序列
[0382] SNGmB1的轻链和重链可变区序列通过聚合酶联链式反应(PCR)已知如5’快速扩增cDNA末端(RACE)(cDNA末端的快速扩增)扩增技术得到。SNGmB1抗体的全部RNA产生的杂交瘤细胞使用Trizol(英杰公司)得到分离，并且使用带有低聚(dT)12-18引物的Superscript第一链合成系统(英杰公司)合成cDNA。鼠IgG基因的可变区通过带有MuIgG VH3’-2的聚合酶联链式反应得到克隆并且MuIg-5’引导引物用于轻链可变区(NOVAGEN)。最终的波段克隆到TOPOTA克隆宿主并且来自超过10个克隆的DNAs提交用于淬灭并且使用ABI DNA淬灭仪(生命技术公司)确定。使用Vector NTI Advance 10软件(英杰公司)确定共有序列。在淬灭分析和确定之后，SNGmB1基因的可变区克隆到重组表达的载体(VL进入pCP-mCK；VH进入pCP-mCg2a)用于抗体的制备和纯化。
[0383] 重链和轻链序列如SEQ ID NO：16-19列出。抗体同种型如鼠lgG2b。为了促进抗体的分泌，信号肽(MGWSCIILFLVATGVHS)融合于抗体的N-末端。
[0384] 实施例8 重组抗体蛋白在293E6细胞的表达和纯化
[0385] 通过以下方法进行重组抗体蛋白的表达和纯化：在带有10％Pluronic F-68的6
Freestyle293表达培养基培养(Gibco)以1x10细胞//ml培养的HEK293细胞和等量的重链载体和轻链载体DNA以最终浓度0.5μg/ml以及1.0μg/ml聚醚酰亚胺(线性聚乙烯亚胺Polyscience)进行转染。DNA和聚醚酰亚胺的比例为1：2。DNA和聚醚酰亚胺复合物与带有最佳的MEM形成期应该为室温下15分钟。转染的细胞可以在带有5％CO2的烧瓶中在37℃，125rpm摇速下培养。在转染后22到26小时加入蛋白胨培养基。在第6天收条件培养基并且上清液在3000rpm下离心30分钟。澄清的条件培养基接着放置于n蛋白A色谱柱(G.E.Healthcare)，用磷酸盐缓冲液加0.1曲通-X100(triton-X100)洗涤，并且最终的结合抗体IgG用含有pH 3.5的0.1M甘氨酸洗脱。洗脱的抗体蛋白透析到磷酸盐缓冲液中并且在-80℃储存。为了去除内毒素，通过Hitrap DEAE Sepharose F.F.色谱柱进一步制备纯化的蛋白，并且分析最终的抗体使用尺寸排阻色谱柱(Superdex 200 5/150GL,G.E.Healthcare)确定纯度水平。
Freestyle293表达培养基培养(Gibco)以1x10细胞//ml培养的HEK293细胞和等量的重链载体和轻链载体DNA以最终浓度0.5μg/ml以及1.0μg/ml聚醚酰亚胺(线性聚乙烯亚胺Polyscience)进行转染。DNA和聚醚酰亚胺的比例为1：2。DNA和聚醚酰亚胺复合物与带有最佳的MEM形成期应该为室温下15分钟。转染的细胞可以在带有5％CO2的烧瓶中在37℃，125rpm摇速下培养。在转染后22到26小时加入蛋白胨培养基。在第6天收条件培养基并且上清液在3000rpm下离心30分钟。澄清的条件培养基接着放置于n蛋白A色谱柱(G.E.Healthcare)，用磷酸盐缓冲液加0.1曲通-X100(triton-X100)洗涤，并且最终的结合抗体IgG用含有pH 3.5的0.1M甘氨酸洗脱。洗脱的抗体蛋白透析到磷酸盐缓冲液中并且在-80℃储存。为了去除内毒素，通过Hitrap DEAE Sepharose F.F.色谱柱进一步制备纯化的蛋白，并且分析最终的抗体使用尺寸排阻色谱柱(Superdex 200 5/150GL,G.E.Healthcare)确定纯度水平。
[0386] 实施例9 人源化和序列分析，抗体活性描述
[0387] 人源化和序列分析
[0388] 使用鼠源SNGmB1抗体的可变区序列确定与鼠源结构具有高度同源性种系序列并且使用计算机模拟设计人源化变异体。使用其中带有直线CDR移植进入带有V4、P44、L46、S49、S64回复突变的VK1|5-2受体框架的轻链V1(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25,氨基酸和核苷酸)对SNGmB1进行人源化。还使用带有4、L46、S49、S64回复突变的轻链V2(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，氨基酸和核苷酸)对SNGmB1进行人源化。还使用带有V4、P44、L46、S49回复突变的轻链V3(SEQ ID NO：28和SEQID NO：29)对SNGmB1进行人源化。使用用小鼠残基在T28A移植到VH1|1-46受体框架的重链V1(SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33)对SNGmB1进行人源化。还使用用额外的L81M突变V1的重链V2(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31)对SNGmB1进行人源化。合成了设计的变异体并且克隆到具有人lgG 1Fc恒定区的pTT5表达载体内并且在293E6细胞中表达。
[0389] 抗体活性的特征
[0390] 纯化人源化抗体，并且使用酶联免疫吸附检测(ELSA)进行表征并且Biacore用于结合分析。人源化抗体的序列成分如表5所示。
[0391] 表5抗体列表：
[0392]
[0393]
[0394] 检测人源化抗体与ER-α36的结合亲和力。检测结果显示在图10A-B和表6。
[0395] 表6嵌合抗体和人源化抗体与人ER-α36的结合亲和力
[0396]样品(抗体) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
SNGmB1-20110709(IgG2b) 2.12e6 1.29e-4 6.06e-11
SNGmB1-20111117(IgG2b) 1.76e6 3.19e-4 1.82e-10
SNGhB1(20111118) 1.74e6 2.83e-4 1.63e-10
SNGHZD(C1L+C5H) 7.44e5 1.22e-4 1.64e-10
SNGHZD(C2L+C6H) 1.28e6 3.98e-4 3.1e-10
SNGHZD(C3L+C6H) 1.33e6 3.6e-4 2.71e-10
SNGHZD(C3L+C5H) 3.54e6 3.56e-4 1e-10
SNGHZD(C1L+C6H) 2.89e6 3.02e-4 1.05e-10
SNGHZD(C2L+C5H) 3.46e6 4.88-4 1.3e-10
SNGmB1-20110709(IgG2b) 2.12e6 1.29e-4 6.06e-11
SNGmB1-20111117(IgG2b) 1.76e6 3.19e-4 1.82e-10
SNGhB1(20111118) 1.74e6 2.83e-4 1.63e-10
SNGHZD(C1L+C5H) 7.44e5 1.22e-4 1.64e-10
SNGHZD(C2L+C6H) 1.28e6 3.98e-4 3.1e-10
SNGHZD(C3L+C6H) 1.33e6 3.6e-4 2.71e-10
SNGHZD(C3L+C5H) 3.54e6 3.56e-4 1e-10
SNGHZD(C1L+C6H) 2.89e6 3.02e-4 1.05e-10
SNGHZD(C2L+C5H) 3.46e6 4.88-4 1.3e-10
[0397] 酶联免疫吸附法(ELISA)竞争
[0398] 使用酶联免疫吸附竞争分析，检测杂交瘤得到的SNGmB1、嵌合SNGmB1和人源化SNGmB1与杂交瘤得到的SNGmB1或104c3F8抗体(具有与SNGmB1不同序列的ERα36抗体)与ER-α36相结合的竞争能力。
[0399] 用1μg/ml杂交瘤得到的SNGmB1、嵌合SNGmB1或磷酸盐缓冲液内的人源化SNGmB1覆盖洁净的聚苯乙烯平板(Nunc)，并且在4℃过夜孵育平板，接着将平板在自动平板洗涤器上洗涤一次。添加抗原(生物素化的GV27肽)和不同量的竞争鼠抗体，接着在洗板前使得酶联免疫吸附平板孵育到均衡。添加辣根过氧化酶标记的链霉亲和素(西格玛，S2438，1：5000)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物(Biopanda,中国)并且在平板阅读器上检测OD450。检测lgG作为平行对照抗体。
[0400] 结果表示在图10C-10E，所有的三种与SNGmB1竞争GV27肽结合的检测抗体呈现出剂量依赖关系，然而，没有一种与抗体104c3F8相比，表现出了明显的对GV27肽的结合。基于一套完整的数据，在GV27肽上的有不同的结合位点，并且源自SNGmB1的抗体结合到与
104c3F8抗体不同的位点。
104c3F8抗体不同的位点。
[0401] 使用描述的酶联免疫吸附竞争分析检测了不同的人源化抗体，简言之，1μg/ml的SNGmB1覆盖在平板上，并且添加抗原(生物素化的GV27肽)和不同量的竞争抗体(即，表6表示的不同人源化抗体)。平行检测鼠IgG和HBD-F8(即：人源化的104C3F8)作为阴性对照，并且平行检测HBD-B1作为阳性平行对照(杂交瘤制备的SNGmB1)。结果表示在图10F，所有人源化的变异体相对于SNGmB1表现出剂量依赖型竞争。
[0402] 实施例10 诊断用途：人样品的免疫组化分析(IHC)
[0403] 使用免疫组化分析评估使用如SNGmB1特异性抗体的能力，更好检测人组织样品ER-α36的存在。4μm厚的乳腺癌病人的石蜡组织块通过在二甲苯中浸泡二十分钟脱石蜡，接着逐个在99％、90％、85％、75％、50％乙醇中复水5分钟。接着用磷酸盐缓冲液洗涤组织切片三次。接着通过在95℃柠檬酸(pH 6.0)缓冲液中在微波炉中加热，进行抗原修复。一旦冷却到室温，接着用磷酸盐缓冲液洗涤切片，并且用3％过氧化氢在室温下孵育，接着用磷酸盐缓冲液洗涤。通过用10％正常的山羊血清孵育30分钟，阻断了抗体的非特异性结合，接着用一抗在潮湿房间里4℃过夜孵育。当用磷酸盐缓冲液洗涤五次，添加预先稀释的二抗(ZSGB-Bio,Cat#PV-6000)并且在室温下孵育20分钟。接着用磷酸盐缓冲液洗涤切片并且用二氨基联苯胺(DAB)溶液孵育2-5分钟，接着在蒸馏水中冲洗5-10分钟。切片接着在苏木精(ZSGB-BIO,Cat#ZLI-9609)中复染色，接着依次在50％、75％、85％、90％和99％的乙醇中冲洗脱水。切片接着在二甲苯中擦干并且在用显微镜评估前用中性的香脂密封。
[0404] 如图11所示，SNGmB1抗体检测的膜结合和在人肿瘤组织中蛋白细胞质表达的ER-α36(Figure 11)。
[0405] 实施例11 抗-ER-α36抗体抑制肿瘤细胞生长的能力
[0406] 使用BCAP37乳腺癌模型评估抗-ER-α36抗体在异种移植模型中抑制人肿瘤细胞生长。乳腺浸润性导管癌病人的BCAP37进展并且通过蛋白印记法表现出表达ER-α36和3
HER2。细胞移植到NOD-SCID小鼠。当肿瘤长到80-120mm尺寸时，10只小鼠进行随机分组，并且或者通过鼠lgG2b或者SNGmB1抗体或者赫赛汀进行治疗，以1.25、5和20mg/kg给予SNGmB1，或者3mg/kg给予赫赛汀。在17天治疗之后，对肿瘤进行切除，并检测了肿瘤的重量和体积，如图12所示，发现了SNGmB1类似于赫赛汀能够呈剂量依赖关系抑制肿瘤的增长。对照组lgG2b治疗组和SNGmB1抗体治疗组的肿瘤体积有显著的区别。
HER2。细胞移植到NOD-SCID小鼠。当肿瘤长到80-120mm尺寸时，10只小鼠进行随机分组，并且或者通过鼠lgG2b或者SNGmB1抗体或者赫赛汀进行治疗，以1.25、5和20mg/kg给予SNGmB1，或者3mg/kg给予赫赛汀。在17天治疗之后，对肿瘤进行切除，并检测了肿瘤的重量和体积，如图12所示，发现了SNGmB1类似于赫赛汀能够呈剂量依赖关系抑制肿瘤的增长。对照组lgG2b治疗组和SNGmB1抗体治疗组的肿瘤体积有显著的区别。
[0407] 实施例12 b-mc-vc-PAB-MMAE式(VII)的抗体药物偶联物(ADC)的合成
[0408] 1.Ab-mc-vc-PAB-MMAE式(VII)的抗体药物偶联物的合成
[0409] 取140mg抗体SNGmB1(Ab)并且溶解于磷酸盐缓冲液中(康宁)，调整溶液浓度到10mg/ml。以摩尔比例添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(赛默飞世尔科技)到抗体溶液中TCEP/抗体＝3。一管上述溶液在37℃保持2小时，小分子(例如TCEP和TCEP的氧化物)通过磷酸盐缓冲液内平衡的PD-10色谱柱(GE)去除。监控抗体和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)内的游离巯基的浓度，并且当游离的巯基/抗体>4时，向抗体溶液中添加1/10(v/v)的二甲基乙酰胺(DMA)(霍尼韦尔)。DMA中的10mM(即：药物)以摩尔比例添加到抗体溶液中，并且药物与抗体的比例达到4.5。将溶液在室温下保持4小时并且通过疏水作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)(安捷伦)监控反应。在反应结束后，用Amicon离心过滤装置纯化抗体药物偶联物产品，并且通过0.2μm的过滤器，在10体积磷酸盐缓冲液中洗涤6次，得到最终的产品。在4℃储存抗体药物偶联物。
[0410] 2.ADC的分析
[0411] 2.1 HIC-HPLC流程
[0412] 色谱柱：#14947，TSK凝胶Butyl-NPR,4.6mm内径x 3.5cm，2.5μm(Tosoh生物科学)，柱温：30℃
[0413] 流速：1ml/分钟
[0414] 检测：紫外280和紫外252。缓冲液A：1.5M磺酸铵；
[0415] 缓冲液B：25mM磷酸钠，pH7.0，25％异丙醇，20分钟，0％---90％；1分钟，90％---95％；4分钟，95％；1分钟，95％---0％。20μl依赖抗体药物偶联物浓度的分析样品
[0416] 2.2分子筛-高效液相色谱(SEC-HPLC)流程
[0417] 色谱柱：#08541,G3000SWxl,7.8mm内径x 30cm，5μm(Tosoh生物科学)，柱温：室温。
[0418] 流速：0.4ml/min
[0419] 检测：紫外280
[0420] 缓冲液：100mM磷酸钠，pH 7.0，100mM氯化钠，15％异丙醇，60分钟。
[0421] 依赖抗体药物偶联物浓度的20μl分析样品，分光光度计程序和药物抗体比例(DAR)计算
[0422] μl体积用于检测，1x PBS作为空白；在280nm吸收记录
[0423] 3.结果
[0424] 3.1 HIC-HPLC
[0425] 从图13可见，带有小峰的色谱说明了本发明未偶联的抗体。带有较多峰的色谱说明了Ab-mc-vc-PAB-MMAE。在相同的HIC-HPLC条件下分析了两个样品，Ab-mc-vc-PAB-MMAE表现了在标准HPLC条件下的主要峰，其表示了抗体本身的异质性群体。
[0426] 基于峰的分布，平均值DAR＝3.97，带有7.89％的未偶联抗体。
[0427] 3.2 SEC-HPLC
[0428] 参见图14a，说明了本发明的未偶联的抗体，即本发明的SNGmB1。参见图14b，说明了Ab-mc-vc-PAB-MMAE的抗体药物偶联物。结果说明了在偶联过程中，形成了较低分子量的物质，这说明抗体减少了，并且取代形成完整的lgG形成了较低分子量的物质，还通过lgG之间的二硫键形成了一些高分子量的物质。
[0429] 实施例13 Ab-mc-MMAF式(VIII)抗体药物偶联物(ADC)的合成
[0430] 1.抗体药物偶联物Ab-mc-MMAF式(VIII)的合成
[0431] 取140mg抗体溶解于磷酸盐缓冲液中(康宁)，调整溶液浓度到10mg/ml。以摩尔比例添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(赛默飞世尔科技)到抗体溶液中，TCEP/抗体＝3。一管上述溶液在37℃保持2小时，小分子通过磷酸缓冲液内平衡的PD-10色谱柱(GE)去除。监控抗体和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸内的游离巯基的浓度，并且当游离的巯基/抗体>4时，向抗体溶液中添加1/10(v/v)的二甲基乙酰胺(DMA)(霍尼韦尔)。DMA中的10mM的MMAF(即：药物)以摩尔比例添加到抗体溶液中，并且药物与抗体的比例达到4.5。将溶液在室温下保持4小时，并且通过HIC-HPLC(安捷伦)监控反应。在反应结束后，用Amicon离心过滤装置纯化抗体药物偶联物产品，并且在10体积磷酸盐缓冲液中洗涤6次，得到最终的产品。在通过0.2μm过滤器后，在4℃储存抗体药物偶联物产品。
[0432] 2.偶联物的分析
[0433] 2.1 HIC-HPLC流程
[0434] 色谱柱：#14947，TSK凝胶Butyl-NPR,4.6mm内径x 3.5cm，2.5μm(Tosoh生物科学)，柱温：30℃
[0435] 流速：1ml/分钟
[0436] 检测：紫外280和紫外252
[0437] 缓冲液A：1.5M磺酸铵；
[0438] 缓冲液B：25mM磷酸钠，pH7.0，25％异丙醇，
[0439] 20分钟，0％---90％；1分钟，90％---95％；4分钟，95％；1分钟，95％---0％。20μl依赖抗体药物偶联物浓度的分析样品
[0440] 2.2分子筛-高效液相色谱(SEC-HPLC)流程
[0441] 色谱柱：#08541，G3000SWxl，7.8mm内径x 30cm，5μm(Tosoh生物科学)，柱温：室温。
[0442] 流速：0.4ml/min
[0443] 检测：紫外280
[0444] 缓冲液：100mM磷酸钠，pH 7.0，100mM氯化钠，15％异丙醇，60分钟。
[0445] 依赖抗体药物偶联物浓度的20μl分析样品，分光光度计程序和药物抗体比例(DAR)计算
[0446] 2.5μl体积用于检测，1x磷酸盐缓冲液作为空白；
[0447] 在280nm吸收记录。
[0448] 3.结果
[0449] 3.1 HIC-HPLC
[0450] 从图15可见，带有小峰的色谱说明了未偶联的抗体，即本发明的SNGmB1。带有较多峰的色谱说明了Ab-mc-MMAF。在相同的HIC-HPLC条件下分析了两个样品，Ab-mc--MMAF表现了在标准HPLC条件下的主要峰，其表示了抗体本身的异质性群体。
[0451] 基于峰的分布，平均值DAR＝3.97，带有7.89％的未偶联抗体。
[0452] 3.2 SEC-HPLC
[0453] 参见图16，说明了Ab-mc-MMAF的抗体药物偶联物。结果说明了在偶联过程中，形成了较低分子量的物质，这说明抗体减少了并且取代形成完整的lgG形成了较低分子量的物质，这里还有大量的高分子量物质(HMC)。
[0454] 因此，制备了Ab-mc-vc-PAB-MMAE和Ab-mc-MMAF的抗体药物偶联物。抗体药物偶联物Ab-mc-vc-PAB-MMAE的纯度超过98.0％，抗体药物偶联物Ab-mc-MMAF的纯度超过98.0％，可以通过HPLC监控整个反应。
[0455] 实施例14 Ab-SMCC-DM1式(Ⅸ)的抗体药物偶联物(ADC)的合成
[0456] 1.Ab-SMCC-DM1的合成
[0457] 取100mg抗体溶解于磷酸盐缓冲液中(康宁)，调整溶液浓度到10mg/ml。磷酸盐缓冲液与偶联缓冲液(50mM磷酸钠，pH＝6.5)相交换。二甲基乙酰胺以1/10(v/v)添加到溶液中，并且DM1即：药物与抗体的摩尔比等于7.5。将反应在室温下保持2小时，并且通过疏水作用色谱-高效液相色谱(HIC-HPLC)监控反应。在反应结束后，用Amicon离心过滤装置纯化抗体药物偶联物产品，并且在10体积磷酸盐缓冲液中洗涤6次，得到最终的产品。在通过0.2μm过滤器过滤后，4℃储存抗体药物偶联物。
[0458] 分析方法流程
[0459] 2.1 HIC-HPLC流程
[0460] 色谱柱：#14947，TSK凝胶Butyl-NPR，4.6mm内径x 3.5cm，2.5μm(Tosoh生物科学)
[0461] 柱温：30℃
[0462] 流速：1ml/分钟
[0463] 检测：紫外280和紫外252
[0464] 缓冲液A：1.5M磺酸铵；缓冲液B：25mM磷酸钠，pH7.0，25％异丙醇，20分钟，0％---90％；1分钟，90％---95％；4分钟，95％；1分钟，95％---0％。μl依赖抗体药物偶联物浓度的分析样品。
[0465] 2.2分子筛-高效液相色谱(SEC-HPLC)流程
[0466] 色谱柱：#08541，G3000SWxl，7.8mm内径x 30cm，5μm(Tosoh生物科学)，柱温：室温
[0467] 流速：0.4ml/min
[0468] 检测：紫外280
[0469] 缓冲液：100mM磷酸钠，pH 7.0，100mM氯化钠，15％异丙醇，60分钟。
[0470] 2-100μl样品用于依赖抗体药物偶联物浓度的分析
[0471] 依赖抗体药物偶联物浓度的20μl分析样品；μl体积用于检测；1x磷酸盐缓冲液作为空白；在280nm吸收记录。
[0472] 2.3分光光度计程序和药物抗体比例(DAR)计算
[0473] 2.5μl体积用于检测，1x PBS作为空白；
[0474] 在280nm吸收记录。
[0475] 2.4内毒素检测流程
[0476] 用无内毒素的水稀释样品到想要的检测范围(50-100倍)，接着按照Endosafe便携式检测系统(PTS)指导，将样品添加到暗盒，打印内毒素读数。
[0477] 结论
[0478] 3.1 HIC-HPLC:
[0479] 从图17可见，少量峰的色谱图表示了本发明未偶联的抗体。较多峰的色谱图表示了Ab-SMCC-DM1。两种样品在相同的HIC-HPLC条件下分析，Ab-SMCC-DM1表示在标准HPLC条件下的主要峰，其表示了抗体本身的异质性群体。
[0480] 基于紫外吸收，药物抗体的平均比例2.86，11.05％未偶联抗体，未偶联抗体的比例低于10％，在4℃储存期该比例升高。
[0481] 3.2 SEC-HPLC
[0482] 从图18可见，较多峰的色谱是抗体药物偶联物，较少峰的色谱是未偶联的抗体，与Ab-MB-vc-PAB-MMAE相比，Ab-SMCC-DM1包含了较少的低分子量物质，其确定了在MMAE偶联物中较低分子量的物质从还原的步骤中产生出来。
[0483] 实施例15 Ab-SPDB-DM4式(X)抗体药物偶联物(ADC)的合成
[0484] 1.抗体药物偶联物的合成
[0485] 取100mg抗体并溶解于磷酸缓冲液中(康宁)，调整溶液浓度到10mg/ml。磷酸盐缓冲液与偶联物缓冲液交换(50mM磷酸钠，pH＝6.5)。向溶液中添加1/10(v/v)的二甲基乙酰胺(DMA)，并且抗体与DM4即：药物的摩尔比等于7.5。将反应在室温下保持2小时。通过HIC-HPLC监控反应。在反应结束后，用Amicon离心过滤装置纯化抗体药物偶联物产品，并且在10体积磷酸盐缓冲液中洗涤6次，得到最终的产品。通过0.2μm过滤器过滤后，在4℃储存抗体药物偶联物产品。
[0486] 2.分析方法流程
[0487] 2.1 HIC-HPLC流程
[0488] 色谱柱：#14947，TSK凝胶Butyl-NPR,4.6mm内径x 3.5cm，2.5μm(Tosoh生物科学)，柱温：30℃
[0489] 流速：1ml/分钟
[0490] 检测：紫外280和紫外252
[0491] 缓冲液A：1.5M磺酸铵；缓冲液B：25mM磷酸钠，pH7.0，25％异丙醇，20分钟，0％---90％；1分钟，90％---95％；4分钟,95％；1分钟，95％---0％。
[0492] 20μl依赖抗体药物偶联物浓度的分析样品
[0493] 2.2分子筛-高效液相色谱(SEC-HPLC)流程
[0494] 色谱柱：#08541，G3000SWxl，7.8mm内径x 30cm，5μm(Tosoh生物科学)。柱温：室温
[0495] 流速：0.4ml/min
[0496] 检测：紫外280
[0497] 缓冲液：100mM磷酸钠，pH 7.0，100mM氯化钠，15％异丙醇，60分钟。
[0498] 依赖抗体药物偶联物浓度的20μl分析样品
[0499] 2.3分光光度计程序和药物抗体比例(DAR)计算
[0500] 2.5μl体积用于检测，1x磷酸盐缓冲液作为空白；
[0501] 在280nm吸收记录。
[0502] 3.结论
[0503] 3.1 HIC-HPLC
[0504] 从图19可见，带有小峰的色谱图说明了本发明未偶联的抗体。带有较多峰的色谱表示了Ab-SPDB-DM4。在相同的HIC-HPLC条件下分析了两个样品，Ab-SPDB-DM4表现了在标准HPLC条件下的主要峰，其表示了抗体本身的异质性群体。
[0505] 基于紫外吸收，药物和抗体的平均摩尔比达到3.28，9.01％的未偶联抗体。未偶联抗体少于10％，在4℃储存时出现增加。
[0506] 3.2 SEC-HPLC
[0507] 参见图20，较多峰的色谱图是抗体药物偶联物，并且较少峰的色谱图是未偶联的抗体。
[0508] 实施例16 Ab-MB-vc-倍癌霉素式(Ⅺ)的抗体药物偶联物(ADC)的合成
[0509] 1.抗体药物偶联物的合成
[0510] 取140mg抗体即：SNGmB1并溶解于磷酸盐缓冲液中(康宁)，调整溶液浓度到10mg/ml。以摩尔比例添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(赛默飞世尔科技)到抗体溶液中TCEP/抗体＝3。一管上述溶液在37℃保持2小时，过量的TCEP通过磷酸盐缓冲液内平衡的PD-10色谱柱去除。监控抗体和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)内的游离巯基的浓度，并且当游离的巯基/抗体>4时，向抗体溶液中添加1/10(v/v)的二甲基乙酰胺(DMA霍尼韦尔)。DMA中的10mM的倍癌霉素(即：药物)以摩尔比例添加到抗体溶液中，并且药物与抗体的比例达到4.5。将溶液在室温下保持4小时，并且通过HIC-HPLC(安捷伦)监控反应。在反应结束后，用Amicon离心过滤装置纯化抗体药物偶联物产品，并且在10体积磷酸盐缓冲液中洗涤6次，得到最终的产品。在通过0.2μm过滤器过滤后，在4℃储存抗体药物偶联物产品。
[0511] 2.分析方法流程
[0512] 2.1 HIC-HPLC流程
[0513] 色谱柱：#14947，TSK凝胶Butyl-NPR，4.6mm内径x 3.5cm，2.5μm(Tosoh生物科学)
[0514] 柱温：30℃
[0515] 流速：1ml/分钟
[0516] 检测：紫外280和紫外252
[0517] 缓冲液A：1.5M磺酸铵；缓冲液B：25mM磷酸钠，pH7.0,25％异丙醇
[0518] 20分钟，0％---90％；1分钟，90％---95％；4分钟，95％；1分钟，95％---0％。
[0519] 20μl依赖抗体药物偶联物浓度的分析样品
[0520] 2.2分子筛-高效液相色谱(SEC-HPLC)流程
[0521] 色谱柱：#08541，G3000SWxl，7.8mm内径x 30cm，5μm(Tosoh生物科学)，柱温：室温
[0522] 流速：0.4ml/min
[0523] 检测：紫外280
[0524] 缓冲液：100mM磷酸钠，pH 7.0，100mM氯化钠，15％异丙醇，60分钟
[0525] 依赖抗体药物偶联物浓度的20μl分析样品
[0526] 2.3分光光度计程序和药物抗体比例(DAR)计算
[0527] 2.5μl体积用于检测
[0528] 1x磷酸缓冲盐溶液作为空白；
[0529] 在280nm吸收记录。
[0530] 3.结果
[0531] 从图21可见，带有较多峰的色谱图是抗体药物偶联物，并且带有小峰的色谱说明了未偶联的抗体。在相同的HIC-HPLC条件下分析了两个样品，抗体药物偶联物在标准HPLC条件下的主要峰，其表示了抗体本身的异质性群体。
[0532] 基于峰的分布，平均值药物抗体比率＝3.04，带有17.6％的未偶联抗体。
[0533] 从图22可见，有较多峰的色谱图是抗体药物偶联物，并且有较少峰的色谱图是未偶联的抗体。结果表示了在偶联过程中，形成了较低分子量的物质，其表示抗体得到了还原并且取代形成完整的lgG，形成了较低分子量的物质。
[0534] 实施例17 偶联物治疗细胞的活力检测
[0535] 本实验使用的细胞列在下表1
[0536] 表1
[0537]MHCC97H 肝细胞癌 ER-α36
PLC 肝细胞癌 ER-α36+
SUM159 乳腺癌 ER-α36+
PLC 肝细胞癌 ER-α36+
SUM159 乳腺癌 ER-α36+
[0538] 实验方法
[0539] 第1天
[0540] 分别取表1的90％汇合度的细胞并且去除培养基。将2mL的磷酸盐缓冲液添加到60mm的培养皿，并去除。0.5mL的胰蛋白酶添加到培养皿中，并且在37℃保持2～3分钟。
当大约80％的细胞通过显微镜悬浮时，添加1mL的培养基终止反应。将细胞悬浮液转移到
2mL的及压管，并且在900rpm室温下离心5钟。吸收上清液并且添加1mL的磷酸盐缓冲液以重新悬浮细胞(去除酚红和血清激素)。在室温900rpm离心溶液5分钟，并且细胞通过
2.5％的小牛血清－胎牛血清无酚红培养基并且计数。按照细胞体积和生长速度在96孔平板培养细胞，保持2000-3000细胞/孔和90μL/孔。在三孔中去除每个抗体药物偶联物并且在孔的周围添加磷酸盐缓冲液。将平板放置于5％CO2的恒温箱并且在37℃保持24小时。
当大约80％的细胞通过显微镜悬浮时，添加1mL的培养基终止反应。将细胞悬浮液转移到
2mL的及压管，并且在900rpm室温下离心5钟。吸收上清液并且添加1mL的磷酸盐缓冲液以重新悬浮细胞(去除酚红和血清激素)。在室温900rpm离心溶液5分钟，并且细胞通过
2.5％的小牛血清－胎牛血清无酚红培养基并且计数。按照细胞体积和生长速度在96孔平板培养细胞，保持2000-3000细胞/孔和90μL/孔。在三孔中去除每个抗体药物偶联物并且在孔的周围添加磷酸盐缓冲液。将平板放置于5％CO2的恒温箱并且在37℃保持24小时。
[0541] 第2天
[0542] 每 种 抗 体 药 物 偶 联 物 (Ab-mc-vc-PAB-MMAE、Ab-mc-MMAF、Ab-SPDB-DM4、Ab-SMCC-DM1和Ab-MB-vc-多癌霉素)的检测浓度分别为300nM、100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM和0.1nM。将以上每种溶液保持72小时用来检测。
[0543] 第5天
[0544] 将10μL的CCK-8添加到每个孔，将温度提高到37℃，2-4小时。基于细胞的颜色，选择最佳的时间检测OD450并且计算IC50。给予不同浓度每种制剂(SNGmB1、Ab-mc-vc-PAB-MMAE、Ab-mc-MMAF、Ab-SMCC-DM1、Ab-SPDB-DM4和Ab-MB-vc-多癌霉素)PCL的OD450在图23中进行表示。给予不同浓度每种制剂(SNGmB1、Ab-mc-vc-PAB-MMAE、Ab-mc-MMAF、Ab-SMCC-DM1、Ab-SPDB-DM4和Ab-MB-vc-多癌霉素)的SUM159的OD450如图24所示。
[0545] 总而言之，当抗体或抗原结合片段与药物偶联时，它的效果例如对特定细胞系的细胞毒性改变了。在一些实施例中，这种抗体药物偶联物的细胞毒性比裸抗或者抗原结合片段更有效。
[0546] 实施例18
[0547] 通过SNGmB1靶向ER-α36用于去除肿瘤的转移
[0548] SNGmB1抑制肺肿瘤的转移4
[0549] 流式细胞仪-分类的4T1-ER-α36阳性细胞(ATCC)(5*10)通过尾部静脉注射于裸鼠。平均20mg/kg体重SNG mB1或者阳性lgG(20mg/kg体重)通过尾静脉每3或4天注射，共施予18天，并且同时在胃内施予它莫昔芬(1mg/kg体重)。肺肿瘤细胞的转移表示在图25中。它说明了SNGmB1阻止了肺肿瘤的转移。
[0550] 代表性的免疫组化图表示了通过给予它莫昔芬的荷瘤裸鼠分别在对照lgG和SNGmB1抗体治疗后，肺转移灶的乙醛脱氢酶(ALDH1)。使用苏木精进行计数染色。参见图26a和图26b，说明在SNGmB1注射标准为50μm时的ALDH1减少了。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种治疗经前胃脘胀满、心烦、身潮热的中药制剂 | 2020-05-14 | 236 |
| 一种用于控制滚筒类烟丝干燥过程氧含量的方法及装置 | 2020-05-17 | 515 |
| 核受体结合剂 | 2020-05-18 | 628 |
| 用GABA类似物的前药治疗或预防潮热 | 2020-05-12 | 572 |
| 使用开孔表面层的吸收性物品 | 2020-05-20 | 858 |
| 一种治疗骨蒸潮热的中药 | 2020-05-11 | 962 |
| 一种治阴虚骨蒸潮热的配方 | 2020-05-11 | 492 |
| 一种提高CEM-1覆铜箔层压板耐潮热性的方法 | 2020-05-14 | 726 |
| 半支架式民用耐潮热引风机 | 2020-05-15 | 831 |
| 民用耐潮热引风机 | 2020-05-13 | 453 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
潮热热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈