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嵌合抗原受体及使用方法

阅读:286发布:2021-03-08

专利汇可以提供嵌合抗原受体及使用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 申请 公开了包含Centyrin的嵌合 抗原 受体(CAR)(即CARTyrin),编码本公开内容的CAR和CARTyrin的转座子,经修饰以表达本公开内容的CAR和CARTyrin的细胞,以及其制备方法和用于过继性 细胞疗法 的使用方法。,下面是嵌合抗原受体及使用方法专利的具体信息内容。

1.一种嵌合抗原受体(CAR),其包含:
(a) 包含抗原识别区的胞外结构域,其中抗原识别区包含至少一个Centyrin;
(b) 跨膜结构域,和
(c) 包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。
2.权利要求1的CAR,其中(a)的胞外结构域还包含信号肽。
3.权利要求1或2的CAR,其中(a)的胞外结构域还包含抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链
4.权利要求2或3的CAR,其中信号肽包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。
5.权利要求2或3的CAR,其中信号肽包含编码人CD8α信号肽的序列。
6. 权利要求5的CAR,其中信号肽包含含有MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 3)的基酸序列。
7. 权利要求5或6的CAR,其中信号肽由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca (SEQ ID NO: 45)的核酸序列编码。
8.前述权利要求的任一项的CAR,其中跨膜结构域包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。
9.前述权利要求的任一项的CAR,其中跨膜结构域包含编码人CD8α跨膜结构域的序列。
10. 权利要求9的CAR,其中跨膜结构域包含含有IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列。
11. 权利要求9或10的CAR,其中跨膜结构域由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc (SEQ ID NO: 5)的核酸序列编码。
12.前述权利要求的任一项的CAR,其中胞内结构域包含人CD3ζ胞内结构域。
13.前述权利要求的任一项的CAR,其中至少一个共刺激结构域包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内段,或其任何组合。
14.前述权利要求的任一项的CAR,其中至少一个共刺激结构域包含人CD28和/或4-1BB共刺激结构域。
15. 权利要求13或14的CAR,其中CD28共刺激结构域包含含有rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列。
16. 权利要求15的CAR,其中CD28共刺激结构域由包含cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 7)的核酸序列编码。
17. 权利要求13或14的CAR,其中4-1BB共刺激结构域包含含有krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel (SEQ ID NO: 8)的氨基酸序列。
18. 权利要求17的CAR,其中4-1BB共刺激结构域由包含aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 9)的核酸序列编码。
19.权利要求14-18的任一项的CAR,其中4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
20.权利要求2-19的任一项的CAR,其中铰链包含源自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。
21.权利要求2-19的任一项的CAR,其中铰链包含源自人CD8α序列的序列。
22. 权利要求20或21的CAR,其中铰链包含含有tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd (SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列。
23. 权利要求22的CAR,其中铰链由包含actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac (SEQ ID NO: 11)的核酸序列编码。
24.前述权利要求的任一项的CAR,其中至少一个Centyrin包含蛋白支架,其中支架能够特异性地结合抗原。
25.前述权利要求的任一项的CAR,其中至少一个Centyrin包含含有至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列的蛋白支架,其中支架能够特异性地结合抗原。
26.权利要求25的CAR,其中至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域源自人蛋白。
27. 权利要求26的CAR,其中人蛋白是生蛋白-C。
28.权利要求25-27的任一项的CAR,其中共有序列包含
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 1)。
29.权利要求25-27的任一项的CAR,其中共有序列包含
MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 13)。
30. 权利要求29的CAR,其中共有序列由包含atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca (SEQ ID NO: 14)的核酸序列编码。
31.权利要求25-30的任一项的CAR,其中共有序列在以下环内的一个或多个位置被修饰:
(a) 包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基TEDS (SEQ ID NO: 15)或由它们组成的A-B环;
(b) 包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基TAPDAAF (SEQ ID NO: 16)或由它们组成的B-C环;
(c) 包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基SEKVGE (SEQ ID NO: 17)或由它们组成的C-D环;
(d) 包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基GSER (SEQ ID NO: 18)或由它们组成的D-E环;
(e) 包含在共有序列的位置60-64的氨基酸残基GLKPG (SEQ ID NO: 19)或由它们组成的E-F环;
(f) 包含在共有序列的位置75-81的氨基酸残基KGGHRSN (SEQ ID NO: 20)或由它们组成的F-G环;或
(g) (a)-(f)的任何组合。
32.权利要求25-31的任一项的CAR,其包含至少5个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
33.权利要求25-31的任一项的CAR,其包含至少10个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
34.权利要求25-31的任一项的CAR,其包含至少15个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
35.权利要求24-34的任一项的CAR,其中支架以至少一个选自以下KD的亲和结合抗
9 10 11 12
原,所述KD小于或等于10-M,小于或等于10- M,小于或等于10- M,小于或等于10- M,小于或等于10-13M,小于或等于10-14M,和小于或等于10-15M。
36.权利要求35的CAR,其中KD由表面等离子体共振测定。
37.一种组合物,其包含前述权利要求的任一项的CAR和至少一种药学上可接受的载体。
38.一种转座子,其包含前述权利要求的任一项的CAR。
39.权利要求38的转座子,其中转座子进一步包含选择基因。
40.权利要求39的转座子,其中选择基因编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。
41.权利要求39的转座子,其中当受到选择性细胞培养条件的挑战时,选择基因编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。
42.权利要求41的转座子,其中选择性细胞培养条件包含对细胞存活或生存有害的化合物,且其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。
43. 权利要求39的转座子,其中选择基因包含neo、DHFR (二氢叶酸还原酶)、TYMS (胸苷酸合成酶)、MGMT (O(6)-甲基嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (脱氢酶1家族,成员A1)、FRANCF、RAD51C (RAD51 Paralog C)、GCS (葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (NK2同源异型框2)或其任何组合。
44.权利要求38-43的任一项的转座子,其中转座子包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含
(a) 配体结合区,
(b) 接头,和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽,
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
45.权利要求44的转座子,其中非-人序列是限切酶位点。
46. 权利要求44或45的转座子,其中诱导型半胱天冬酶多肽的配体结合区包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。
47. 权利要求46的转座子,其中FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的氨基酸序列包含在序列的位置36的修饰。
48. 权利要求47的转座子,其中修饰是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。
49. 权利要求46-48的任一项的转座子,其中FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。
50.权利要求49的转座子,其中FKBP12多肽由包含
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 24)的核酸序列编码。
51. 权利要求44-50的任一项的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸编码。
52. 权利要求51的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的接头区由包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列编码。
53.权利要求44-52的任一项的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。
54.权利要求44-53的任一项的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。
55. 权利要求44-54的任一项的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 
27)的氨基酸编码。
56.权利要求55的转座子,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 28)的核酸序列编码。
57.权利要求44-56的任一项的转座子,其中诱导型前凋亡多肽由包含
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 29)的氨基酸序列编码。
58.权利要求57的转座子,其中诱导型前凋亡多肽由包含
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 30)的核酸序列编码。
59.权利要求38-58的任一项的转座子,其中转座子包含至少一个自切肽。
60.权利要求39-58的任一项的转座子,其中转座子包含至少一个自切肽且其中自切肽位于CAR和选择基因之间。
61.权利要求44-60的任一项的转座子,其中转座子包含至少一个自切肽和其中自切肽位于CAR和诱导型前凋亡多肽之间。
62.权利要求44-61的任一项的转座子,其中转座子包含至少两个自切肽,且其中第一个自切肽位于诱导型前凋亡多肽的上游和第二个自切肽位于诱导型前凋亡多肽的下游。
63.权利要求38-62的任一项的转座子,其中转座子包含至少一个自切肽和其中第一个自切肽位于CAR的上游,而第二个自切肽位于CAR的下游。
64.权利要求59-63的任一项的转座子,其中至少一个自切肽包含T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。
65. 权利要求64的转座子,其中T2A肽包含含有egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 
31)的氨基酸序列。
66. 权利要求64的转座子,其中GSG-T2A肽包含含有GSGegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列。
67. 权利要求64的转座子,其中E2A肽包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 
34)的氨基酸序列。
68. 权利要求64的转座子,其中GSG-E2A肽包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列。
69. 权利要求64的转座子,其中F2A肽包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列。
70. 权利要求64的转座子,其中GSG-F2A肽包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列。
71. 权利要求64的转座子,其中P2A肽包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 
38)的氨基酸序列。
72. 权利要求64的转座子,其中GSG-P2A肽包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列。
73.权利要求38-72的任一项的转座子,其中转座子是piggyBac转座子。
74.一种组合物,其包含权利要求38-73的任一项的转座子。
75.权利要求74的组合物,其进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。
76.权利要求75的组合物,其中编码转座酶的序列是mRNA序列。
77.权利要求74-76的任一项的组合物,其中转座酶是piggyBac转座酶。
78. 权利要求77的组合物,其中piggyBac转座酶包含含有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
79. 权利要求77或78的组合物,其中piggyBac转座酶是超活性变异体和其中超活性变异体包含在SEQ ID NO: 12的位置30、165、282和538的一个或多个处的氨基酸取代。
80. 权利要求79的组合物,其中SEQ ID NO: 12的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I) (I30V)。
81. 权利要求79的组合物,其中SEQ ID NO: 12的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G) (G165S)。
82. 权利要求79的组合物,其中SEQ ID NO: 12的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M) (M282V)。
83. 权利要求79的组合物,其中SEQ ID NO: 12的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N) (N538K)。
84. 权利要求77-83的任一项的组合物,其中转座酶是超级piggyBac (sPBo)转座酶。
85. 权利要求84的组合物,其中超级piggyBac (sPBo)转座酶包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
86.一种载体,其包含权利要求1-36的任一项的CAR。
87.权利要求86的载体,其中载体是病毒性载体。
88.权利要求87的载体,其中病毒性载体包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。
89.权利要求87或88的载体,其中病毒性载体包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列。
90.权利要求87-89的任一项的载体,其中病毒性载体是重组载体。
91.权利要求86的载体,其中载体是纳米粒子载体。
92.权利要求91的载体,其中纳米粒子载体包含核酸、氨基酸、聚合物、胶束、脂质、有机分子、无机分子或其任何组合。
93.权利要求86-92的任一项的载体,其中载体进一步包含选择基因。
94.权利要求93的载体,其中选择基因编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。
95.权利要求93的载体,其中当受到选择性细胞培养条件的挑战时,选择基因编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。
96.权利要求95的载体,其中选择性细胞培养条件包括对细胞存活或生存有害的化合物和其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。
97. 权利要求93-96的任一项的载体,其中选择基因包含neo、DHFR (二氢叶酸还原酶)、TYMS (胸苷酸合成酶)、MGMT (O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (醛脱氢酶1家族,成员A1)、FRANCF、RAD51C (RAD51 Paralog C)、GCS (葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (NK2同源异型框2)或其任何组合。
98.权利要求86-97的任一项的载体,其中载体包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a) 配体结合区,
(b) 接头,和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽,
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
99.权利要求98的载体,其中非-人序列是限切酶位点。
100. 权利要求98或99的载体,其中诱导型半胱天冬酶多肽的配体结合区包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。
101. 权利要求100的载体,其中FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的氨基酸序列包含在序列的位置36的修饰。
102. 权利要求101的载体,其中修饰是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。
103. 权利要求100-102的任一项的载体,其中FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。
104. 权利要求103的载体,其中FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 
24)的核酸序列编码。
105. 权利要求98-104的任一项的载体,其中诱导型前凋亡多肽的接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸编码。
106. 权利要求105的载体,其中诱导型前凋亡多肽的接头区由包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列编码。
107.权利要求98-106的任一项的载体,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。
108.权利要求98-107的任一项的载体,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。
109. 权利要求98-108的任一项的载体,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 
27)的氨基酸编码。
110. 权利要求109的载体,其中诱导型前凋亡多肽的截短的半胱天冬酶9多肽由包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 28)的核酸序列编码。
111. 权利要求98-110的任一项的载体,其中诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 29)的氨基酸序列编码。
112. 权利要求111的载体,其中诱导型前凋亡多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 30)的核酸序列编码。
113.权利要求86-112的任一项的载体,其中载体包含至少一个自切肽。
114.权利要求86-112的任一项的载体,其中载体包含至少一个自切肽和其中自切肽位于CAR和选择基因之间。
115.权利要求98-114的任一项的载体,其中转座子包含至少一个自切肽和其中自切肽位于CAR和诱导型前凋亡多肽之间。
116.权利要求98-115的任一项的载体,其中转座子包含至少两个自切肽,其中第一个自切肽位于诱导型前凋亡多肽的上游和第二个自切肽位于诱导型前凋亡多肽的下游。
117.权利要求86-116的任一项的载体,其中载体包含至少一个自切肽,其中第一个自切肽位于CAR的上游和第二个自切肽位于CAR的下游。
118.权利要求113-117的任一项的载体,其中至少一个自切肽包含aT2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽,或GSG-P2A肽。
119. 权利要求118的载体,其中T2A肽包含含有egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 
31)的氨基酸序列。
120. 权利要求118的载体,其中GSG-T2A肽包含含有GSGegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列。
121. 权利要求118的载体,其中E2A肽包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 
34)的氨基酸序列。
122. 权利要求118的载体,其中GSG-E2A肽包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列。
123. 权利要求118的载体,其中F2A肽包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列。
124. 权利要求118的载体,其中GSG-F2A肽包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列。
125. 权利要求118的载体,其中P2A肽包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 
38)的氨基酸序列。
126. 权利要求118的载体,其中GSG-P2A肽包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列。
127.一种组合物,其包含权利要求86-126的任一项的载体。
128.一种细胞,其包含权利要求1-36的任一项的CAR。
129.一种细胞,其包含权利要求38-85的任一项的转座子或转座酶。
130.一种细胞,其包含权利要求86-126的任一项的载体。
131.权利要求128-130的任一项的细胞,其中所述细胞在细胞表面上表达CAR。
132.权利要求128-131的任一项的细胞,其中所述细胞是免疫细胞。
133.权利要求132的细胞,其中免疫细胞是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。
134.权利要求132的细胞,其中免疫细胞是T-细胞。
135.权利要求128-131的任一项的细胞,其中所述细胞是人工抗原呈递细胞。
136.权利要求128-131的任一项的细胞,其中所述细胞是肿瘤细胞。
137.权利要求118-136的任一项的细胞,其中细胞是自体的。
138.权利要求118-136的任一项的细胞,其中细胞是同种异体的。
139.一种组合物,其包含权利要求128-138的任一项的细胞。
140.一种在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)的方法,其包括:
(a) 获得细胞群;
(b) 在足以使CAR转移穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件下,使细胞群与包含依据权利要求1-36的任一项的CAR或编码CAR的序列的组合物接触,从而产生修饰的细胞群;
(c) 在适合CAR整合的条件下,培养修饰的细胞群;
(d) 从修饰的细胞群扩增和/或选择至少一个在细胞表面上表达CAR的细胞。
141.权利要求140的方法,其中细胞群包含白细胞。
142.权利要求141的方法,其中细胞群包含优化比例的CD4+和CD8+白细胞。
143.权利要求142的方法,其中CD4+与CD8+白细胞的优化比例不在体内自然发生。
144.权利要求140的方法,其中转座子或载体包含CAR或编码CAR的序列。
145.权利要求140的方法,其中权利要求38-73的任一项的转座子包含CAR或编码CAR的序列。
146.权利要求144或145的方法,其中转座子包含piggyBac转座子。
147.权利要求146的方法,进一步包含组合物,所述组合物包含含有编码转座酶的序列的质粒。
148.权利要求147的方法,其中编码转座酶的序列是mRNA序列。
149.权利要求147或148的任一项的方法,其中转座酶是piggyBac转座酶。
150. 权利要求149的方法,其中piggyBac转座酶包含含有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
151. 权利要求149或150的方法,其中piggyBac转座酶是超活性变异体,且其中超活性变异体包含在SEQ ID NO: 12的位置30、165、282和538的一个或多个处的氨基酸取代。
152. 权利要求151的方法,其中SEQ ID NO: 12的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I) (I30V)。
153. 权利要求151的方法,其中SEQ ID NO: 12的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G) (G165S)。
154. 权利要求151的方法,其中SEQ ID NO: 12的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M) (M282V)。
155. 权利要求151的方法,其中SEQ ID NO: 12的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N) (N538K)。
156. 权利要求149-155的任一项的方法,其中转座酶是超级piggyBac (sPBo)转座酶。
157. 权利要求156的方法,其中超级piggyBac (sPBo)转座酶包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
158.权利要求140的方法,其中权利要求76-116的任一项的载体包含CAR或编码CAR的序列。
159.权利要求140、144、145或158的任一项的方法,其中足以转移编码CAR的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括核转染
160.权利要求140-158的任一项的方法,其中(b)的足以转移编码CAR的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括以下至少一种:在指定电压下一个或多个电流脉冲的施加、缓冲剂和一种或多种补充因子。
161. 权利要求160的方法,其中缓冲剂包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。
162.权利要求160或161的方法,其中一种或多种补充因子包含
(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合;
(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合;
(c) 细胞培养基;
(d) 细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂;和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂
163. 权利要求162的方法,其中重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-
24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。
164. 权利要求162的方法,其中盐、矿物质、代谢物或其任何组合包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5,或其任何组合。
165. 权利要求162的方法,其中细胞培养基包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。
166. 权利要求162的方法,其中细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包括TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂、TWS119、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。
167.权利要求162的方法,其中修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
168.权利要求140-158的任一项的方法,其中适合于CAR或编码CAR的序列的整合的条件包括以下至少一种:缓冲剂和一种或多种补充因子。
169. 权利要求168的方法,其中缓冲剂包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。
170.权利要求168或169的方法,其中一种或多种补充因子包含
(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合;
(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合;
(c) 细胞培养基;
(d) 细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂;和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。
171. 权利要求170的方法,其中重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-
24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。
172. 权利要求170的方法,其中盐、矿物质、代谢物或其任何组合包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5,或其任何组合。
173. 权利要求170的方法,其中细胞培养基包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。
174. 权利要求170的方法,其中细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包含TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、糖原合酶激酶-3β (GSK-3β)的抑制剂、TWS119、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。
175.权利要求170的方法,其中修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
176.权利要求140-175的任一项的方法,其中(d)的扩增和选择序贯发生。
177.权利要求176的方法,其中扩增在选择前发生。
178.权利要求176的方法,其中扩增在选择后发生。
179.权利要求178的方法,其中进一步的选择在扩增后发生。
180.权利要求140-175的任一项的方法,其中(d)的扩增和选择同时发生。
181.权利要求140-180的任一项的方法,其中扩增包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与抗原接触,以通过CAR刺激至少一个细胞。
182.权利要求181的方法,其中抗原在基质表面上呈递。
183.权利要求182的方法,其中基质是一个珠或多个珠。
184.权利要求183的方法,其中一个珠或多个珠在扩增后与修饰的细胞群分离。
185.权利要求181的方法,其中抗原在细胞表面上呈递。
186.权利要求185的方法,其中抗原在人工抗原呈递细胞表面上呈递。
187.权利要求140-186的任一项的方法,其中转座子或载体包含选择基因和其中选择步骤包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与选择基因赋予抗性的化合物接触,从而将表达选择基因的细胞识别为在选择中存活和将未能表达选择基因的细胞识别为未能在选择步骤中存活。
188.权利要求140-187的任一项的方法,其中扩增和选择步骤持续10-14天的时期,包括端点。
189.一种组合物,其包含权利要求140-188的任一项的扩增和选择的细胞群。
190.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法,其包括给予所述受试者权利要求37、
74-85、127、139或189的任一项的组合物,其中CAR特异性地结合肿瘤细胞上的抗原。
191.权利要求190的方法,其中肿瘤细胞是恶性肿瘤细胞。
192.权利要求190或191的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是自体的。
193.权利要求190或191的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是同种异体的。
194.一种在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法,其包括给予所述受试者权利要求37、74-85、127、139或189的任一项的组合物,其中CAR特异性地结合受试者的自身免疫细胞上的抗原。
195.权利要求194的方法,其中自身免疫细胞是特异性地结合受试者的靶细胞上的自体抗原的淋巴细胞。
196.权利要求194或195的方法,其中自身免疫细胞是B淋巴细胞。
197.权利要求194或195的方法,其中自身免疫细胞是T淋巴细胞。
198.权利要求194-197的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是自体的。
199.权利要求194-197的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是同种异体的。
200.一种在有需要的受试者中治疗或预防感染的方法,其包括给予所述受试者权利要求37、74-85、127、139或189的任一项的组合物,其中CAR特异性地结合包含感染因子的细胞、与感染因子联系的细胞或暴露于感染因子的细胞上的抗原。
201.权利要求200的方法,其中感染因子是细菌、病毒、酵母生物
202.权利要求200或201的方法,其中感染因子可诱导感染、免疫缺陷疾病、炎性疾病和增殖性疾病中的一种或多种。
203.权利要求202的方法,其中感染导致结核、脑小畸形、神经变性或疟疾。
204.权利要求202或203的方法,其中感染导致受试者的胎儿的脑小畸形。
205.权利要求204的方法,其中感染因子是病毒,且其中病毒是寨卡病毒。
206.权利要求202的方法,其中免疫缺陷疾病是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
207.权利要求202的方法,其中增殖性疾病是癌症。
208.权利要求207的方法,其中癌症是宫颈癌和其中感染因子是人乳头状瘤病毒
(HPV)。
209.权利要求200-208的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是自体的。
210.权利要求200-208的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是同种异体的。
211.一种在有需要的受试者中治疗肥大细胞疾病的方法,其包括给予所述受试者权利要求37、74-85、127、139或189的任一项的组合物,其中CAR特异性地结合肥大细胞上的抗原。
212.权利要求211的方法,其中肥大细胞疾病是与肥大细胞过度增殖有关的病症。
213.权利要求212的方法,其中肥大细胞疾病是肥大细胞增多症。
214.权利要求213的方法,其中肥大细胞疾病是一种与肥大细胞的异常活性有关的病症。
215.权利要求214的方法,其中肥大细胞疾病是肥大细胞激活综合征(MCAS)、过敏性疾病、哮喘或炎性疾病。
216.权利要求211-216的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是自体的。
217.权利要求211-216的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是同种异体的。
218.一种在有需要的受试者中治疗变性疾病的方法,其包括给予所述受试者权利要求
37、74-85、127、139或189的任一项的组合物,其中CAR特异性地结合有害细胞或衰老细胞上的抗原。
219.权利要求218的方法,其中变性疾病是神经变性病症、代谢病症、血管病症或衰老。
220.权利要求218或219的方法,其中变性疾病是神经变性病症,且其中有害细胞或衰老细胞是干细胞、免疫细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。
221.权利要求218或219的方法,其中变性疾病是代谢病症,且其中有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。
222.权利要求218或219的方法,其中变性疾病是血管病症,且其中有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。
223.权利要求218或219的方法,其中变性疾病是衰老,且其中有害细胞或衰老细胞是卵母细胞、精子、干细胞、体细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。
224.权利要求218-223的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是自体的。
225.权利要求218-223的任一项的方法,其包括给予所述受试者权利要求139或185的组合物,其中细胞或细胞群是同种异体的。
226.一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法,其包括给予所述受试者一种组合物,所述组合物包含含有权利要求38-73的任一项的转座子的细胞,其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。
227.一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法,其包括给予所述受试者一种组合物,所述组合物包含含有权利要求86-126的任一项的载体的细胞,其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。
228.权利要求226或227的方法,其中细胞是自体的。
229.权利要求226或227的方法,其中细胞是同种异体的。
230.权利要求226-229的任一项的方法,其中细胞疗法是过继性细胞疗法。
231.权利要求226-230的任一项的方法,其中改变是终止细胞疗法。
232.权利要求226-230的任一项的方法,其中改变是细胞疗法中提供的一部分细胞的耗竭。
233.权利要求226-232的任一项的方法,其还包括给予诱导剂的抑制剂以抑制细胞疗法的改变,从而恢复细胞疗法的功能和/或疗效的步骤。

说明书全文

嵌合抗原受体及使用方法

[0001] 相关申请本申请要求临时申请USSN 62/362,746 (2016年7月15日提交)、USSN 62/405,180 
(2016年10月6日提交)和USSN 62/503,127 (2017年5月8日提交)的权益,其各自的内容通
过引用以其整体并入本文。
[0002] 并入序列表命名为“POTH-008_001WO_SeqList”的文本文件的内容,其于2017年7月13日创建,文件
大小为55 KB,通过引用以其整体并入本文。
[0003] 本公开内容的领域本公开内容涉及分子生物学,且更特别地涉及嵌合抗原受体、含有一个或多个CAR的转
座子,以及制备和使用它们的方法。
[0004] 背景本领域对于不使用传统的抗体序列或其片段来指导免疫细胞特异性的方法,一直有长
期存在但尚未得到满足的需求。本公开内容提供一种优越的嵌合抗原受体。
[0005] 概述本公开内容提供一种嵌合抗原受体(CAR),其包含:(a) 包含抗原识别区的胞外结构
域,其中抗原识别区包含至少一个Centyrin;(b) 跨膜结构域,和(c) 包含至少一个共刺激
结构域的胞内结构域。如贯穿本公开内容所用的,包含Centyrin的CAR被称为CARTyrin。在
某些实施方案中,抗原识别区可包含两个Centyrin以产生一种双特异性或串联CAR。在某些
实施方案中,抗原识别区可包含3个Centyrin以产生一种三特异性CAR。在某些实施方案中,
胞外结构域可进一步包含信号肽。可供选择地,或者另外,在某些实施方案中,胞外结构域
可进一步包含抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链
[0006] 本公开内容提供一种嵌合抗原受体(CAR),其包含:(a) 包含抗原识别区的胞外结构域,其中抗原识别区包含至少一个蛋白支架或抗体模拟物;(b) 跨膜结构域,和(c) 包含
至少一个共刺激结构域的胞内结构域。在某些实施方案中,抗原识别区可包含两个支架蛋
白或抗体模拟物,以产生一种双特异性或串联CAR。在某些实施方案中,抗原识别区可包含3
个蛋白支架或抗体模拟物以产生一种三特异性CAR。在某些实施方案中,胞外结构域可进一
步包含信号肽。可供选择地,或者另外,在某些实施方案中,胞外结构域可进一步包含抗原
识别区和跨膜结构域之间的铰链。
[0007] 在本公开内容的CAR的某些实施方案中,信号肽可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中,信号肽可包含编码人CD8α信号肽的序列。人CD8α信号肽可包含含有MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 3)的基酸序列。人CD8α信号肽可包含含有
MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列或与含有MALPVTALLLPLALLLHAARP 
(SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。人CD8α信号肽可由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca 
(SEQ ID NO: 45)的核酸序列编码。
[0008] 在本公开内容的CAR的某些实施方案中,跨膜结构域可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中,跨膜结构域可包含编码人CD8α跨膜结构域的序列。CD8α跨膜结构域可包含含有IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列或与包含
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。CD8α跨膜结构域可由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagt
gctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc (SEQ ID NO: 5)的核酸序列编码。
[0009] 在本公开内容的CAR的某些实施方案中,胞内结构域可包含人CD3ζ胞内结构域。
[0010] 在本公开内容的CAR的某些实施方案中,至少一个共刺激结构域可包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内段,或其任何组合。在本公开内容的CAR的某些实施方案中,至少一个共刺激结构域可包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。CD28共刺激结构域可包
含含有rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaea
yseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列或与包含
rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigm
kgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列具有至少70%、
80%、90%、95%,或99%同一性的序列。CD28共刺激结构域可由包含cgcgtgaagtttagtcgatcag
cagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatga
cgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctg
tataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggca
aagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcact
gcctccaagg (SEQ ID NO: 7)的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可包含含有krgrkklly
ifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel (SEQ ID NO: 8)的氨基酸序列或与包含krgrkkll
yifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel (SEQ ID NO: 8)的氨基酸序列具有至少70%、80%、
90%、95%,或99%同一性的序列。4-1BB共刺激结构域可由包含aagagaggcaggaagaaactgctgt
atattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctga
ggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 9)的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可位
于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
[0011] 在本公开内容的CAR的某些实施方案中,铰链可包含源自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中,铰链可包含源自人CD8α序列的序列。铰
链可包含含有tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd (SEQ ID NO: 10)的人
CD8α氨基酸序列或与包含tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd (SEQ ID 
NO: 10)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。人CD8α铰链氨基酸序列可由包含actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtc
tgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac (SEQ 
ID NO: 11)的核酸序列编码。
[0012] 本公开内容的Centyrin可包含蛋白支架,其中支架能够特异性地结合抗原。本公开内容的Centyrin可包含含有至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列的蛋白支
架,其中支架能够特异性地结合抗原。至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域可源自人蛋白。
人蛋白可以是生蛋白-C (Tenascin-C)。共有序列可包含LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDA
AFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 
1)或MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSI
YGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 13)。共有序列可由包含atgctgcctgcaccaaagaacctgg
tggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcat
cgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctg
acagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgt
ccgcaatcttcaccaca (SEQ ID NO: 14)的核酸序列编码。共有序列可在以下环内的一个或
多个位置被修饰:(a) 包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基TEDS (SEQ ID NO: 15)
或由它们组成的A-B环;(b) 包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基TAPDAAF (SEQ ID 
NO: 16)或由它们组成的B-C环;(c) 包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基SEKVGE 
(SEQ ID NO: 17)或由它们组成的C-D环;(d) 包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基
GSER (SEQ ID NO: 18)或由它们组成的D-E环;(e) 包含在共有序列的位置60-64氨基酸残
基GLKPG (SEQ ID NO: 19)或由它们组成的E-F环;(f) 包含在共有序列的位置75-81的氨
基酸残基KGGHRSN (SEQ ID NO: 20)或由它们组成的F-G环;或(g) (a)-(f)的任何组合。本
公开内容的Centyrin可包含至少5个纤连蛋白III型(FN3)结构域、至少10个纤连蛋白III型
(FN3)结构域或至少15个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。所述支架可结合具有选
自小于或等于10-9M,小于或等于10-10M,小于或等于10-11M,小于或等于10-12M,小于或等于10-13M,小于或等于10-14M,和小于或等于10-15M的KD的至少一个亲和的抗原。KD可由
表面等离子体共振测定。
[0013] 本公开内容提供抗-BCMA CARTyrin (在此称为A08),其具有包含:MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGH
PGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNI
DCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVE
KIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPT
PSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFF
KTSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPMLPAPKNLVVSRITEDSARLSWTAPDAAFDS
FPIRYIETLIWGEAIWLDVPGSERSYDLTGLKPGTEYAVVITGVKGGRFSSPLVASFTTTTTPAPRPPTPAPTIAS
QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQE
EDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL
YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPM
VGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNESRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLS
RELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEID
LEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND (SEQ ID NO: 21,粗体序列包含A08 Centyrin的
氨基酸序列)的氨基酸序列。在某些实施方案中,本公开内容的A08 CARTyrin可由包含:at
gggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcat
tacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgg
gaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccat
tagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtg
gaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatg
ccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagaga
aagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcacttt
atggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatg
gagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagt
gtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctg
gggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagca
ccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctt
tgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggcttt
gtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccatt
cagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgg
gtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttccggatctggagagggaaggggaagcctgctgacc
tgtggagacgtggaggaaaacccaggaccaatggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgc
tgcacgcagctagaccaatgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgagccggatcacagaggactccgccagact
gtcttggaccgcccctgacgccgccttcgattcctttccaatccggtacatcgagacactgatctggggcgaggcc
atctggctggacgtgcccggctctgagaggagctacgatctgacaggcctgaagcctggcaccgagtatgcagtgg
tcatcacaggagtgaagggcggcaggttcagctcccctctggtggcctcttttaccacaaccacaacccctgcccc
cagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgca
ggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgacatctacatttgggcaccactggccgggacctgtg
gagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgcaagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaaca
gcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggc
gggtgtgagctgcgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtata
acgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggagg
caagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattct
gagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaa
aggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaaggggaagtggagaaggacgaggatcactgctgac
atgcggcgacgtggaggaaaaccctggcccaatggtcgggtctctgaattgtatcgtcgccgtgagtcagaacatg
ggcattgggaagaatggcgatttcccatggccacctctgcgcaacgagtcccgatactttcagcggatgacaacta
cctcctctgtggaagggaaacagaatctggtcatcatgggaaagaaaacttggttcagcattccagagaagaaccg
gcccctgaaaggcagaatcaatctggtgctgtcccgagaactgaaggagccaccacagggagctcactttctgagc
cggtccctggacgatgcactgaagctgacagaacagcctgagctggccaacaaagtcgatatggtgtggatcgtcg
ggggaagttcagtgtataaggaggccatgaatcaccccggccatctgaaactgttcgtcacacggatcatgcagga
ctttgagagcgatactttctttcctgaaattgacctggagaagtacaaactgctgcccgaatatcctggcgtgctg
tccgatgtccaggaagagaaaggcatcaaatacaagttcgaggtctatgagaagaatgac (SEQ ID NO: 22,
该序列在此也称为P-BMCA-101的开放阅读框(ORF))的核酸序列编码。
[0014] 本公开内容提供一种包含本公开内容的CAR和至少一种药学上可接受的载体的组合物。
[0015] 本公开内容提供一种包含本公开内容的CAR的转座子。
[0016] 本公开内容的转座子可包含用于表达转座子的细胞的鉴定、富集和/或分离的选择基因。示例性选择基因编码为细胞生存和存活所必需的任何基因产物(如转录子
(transcript)、蛋白、酶)。示例性选择基因编码对于赋予对药物挑战的抗药性至关重要的
任何基因产物(如转录子、蛋白、酶),在选择基因编码的基因产物的不存在下,细胞对于药
物挑战是敏感的(或者可能对细胞是致命的)。示例性选择基因在缺乏为细胞生存和/或存
活所必需的一种或多种营养素的细胞培养基中(在选择基因的不存在下),编码为生存和/
或存活所必需的任何基因产物(如转录子、蛋白、酶)。示例性选择基因包括,但不限于neo 
(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS 
(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因
(MDR1)、ALDH1 (编码脱氢酶1家族,成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶),和NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)。
[0017] 本公开内容的转座子可包含诱导型前凋亡多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 前凋亡多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,非-
人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中,配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开
内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中,本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半胱天冬酶
多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内容的转座子
可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半胱天冬酶多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内容的转座子可包含
诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 截短的半胱天冬酶9多
肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型
半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,配体结合区可包含FK506结
合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中,包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体
结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的
苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中,FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVV
HYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFD
VELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中,FKBP12多肽由包含GGG
GTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACA
CCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAA
GCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGC
CCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT 
GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 24)的核酸序列编码。在某些实施方案中,对配体结
合区特异性的诱导剂可包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)的FK506结
合蛋白12 (FKBP12)多肽,包括AP20187和/或AP1903两种合成药物。
[0018] 在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸或包含
GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列编码。在某些实施方案中,编码接头的核酸
序列不包含限切酶位点。
[0019] 在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地,或者另外,在本
公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些
实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序
列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9
多肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGH
CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHG
CQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEP
DATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANA
VSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 27)的氨基酸或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTG
GAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACA
ATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAG
GTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAG
CTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATC
TGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGG
CACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCAC
GGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCC
AGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTA
CAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATC
TTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCA
TCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 
28)的核酸序列编码。
[0020] 在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中,其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽,诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQE
VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADL
AYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGAL
DCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSP
EDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSED
LQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 29)的氨基酸序列或包含GGGGTC
CAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCG
GGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCA
GGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCT
GACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGC
TGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCT
GGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGA
CTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCG
AAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCT
GGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGA
ACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAA
AGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCC
TGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAG
CTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCAT
GGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGA
CCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTC
AATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 30)的核酸序列编码。
[0021] 本公开内容的转座子可包含至少一个自切肽,其位于,例如,本公开内容的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本公开内容的选择基因之间。本公开内容的转座
子可包含至少一个自切肽,其位于,例如,本公开内容的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的
一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的转座子可包含至少两个
自切肽,第一个自切肽位于,例如,本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上
游,而第二个自切肽位于,例如,本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。
[0022] 至少一个自切肽可包含,例如,T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽,或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列具有至少70%、
80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ 
ID NO: 32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序
列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 33)的核酸序列。
E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列或与包含
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基
酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列具有至少70%、
80%、90%、95%,或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID 
NO: 36)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列
具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP  (SEQ  ID  NO:  37)的氨基酸序列或与包含
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸
序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、
90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID 
NO: 39)的氨基酸或序列与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列
具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。
[0023] 本公开内容的转座子可包含第一个和第二个自切肽,第一个自切肽位于,例如,本公开内容的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的上游,第二个自切肽位于,例
如,本公开内容的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的下游。第一个和/或第二
个自切肽可包含,例如,T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽,或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列或与包
含egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 32)的氨基酸
序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、
90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctga
cctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 33)的核酸序列包。E2A肽可包含含有
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP 
(SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列或与包含
GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸
序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列具有至少70%、
80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP 
(SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)
的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有
ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP 
(SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP  (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列或与包含
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。
[0024] 本公开内容提供一种包含本公开内容的转座子的组合物。在某些实施方案中,组合物可进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。编码转座酶的序列可以是mRNA序列。
[0025] 本公开内容的转座子可包含piggyBac转座子。在这种方法的某些实施方案中,转座子是具有编码嵌合抗原受体的序列的质粒DNA转座子,所述受体侧面连接两个顺式调节
绝缘子元件。在某些实施方案中,转座子是piggyBac转座子。本公开内容的转座酶可包含
piggyBac转座酶或相容酶(compatible enzymes)。在某些实施方案中,且特别是在其中转
座子是piggyBac转座子的那些实施方案中,转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)
转座酶。在某些实施方案中,且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那
些实施方案中,编码转座酶的序列是mRNA序列。
[0026] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含与以下序列之间有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 12)。
[0027] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶,所述氨基酸序列具有在以下序列的位置30、165、282或
538的一个或多个处的氨基酸取代:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 12)。
[0028] 在某些实施方案中,转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶,所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 12序列的位置30、165、282或538的两个或
更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中,转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成
的piggyBac™ (PB)转座酶,所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 12序列的3个或多于3个位
置30、165、282或538的氨基酸取代。在某些实施方案中,转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶,所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 12序列的以下
位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12序列的
位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12序
列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 
12序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
[0029] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中,本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含SEQ ID NO: 
12序列的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 12序列的氨基酸序列组成,其中位置30的氨基酸取
代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I),位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G),位置
282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M),和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取
代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中,超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含与以下氨基酸
序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 2)。
[0030] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含
在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代:位置3、46、
82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、
311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,
piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在46、119、125、177、180、185、187、200、
207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、
485、503、552和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,
SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某
些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙
氨酸(A)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置82的氨基酸取代是色
氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置103
的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱
氨酸(C)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置177的氨基酸取代是赖
氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置177的
氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 
2的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 
12或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施
方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨
酸(F)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置185的氨基酸取代是亮氨
酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置187的
氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 
2的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 
12或SEQ ID NO: 2的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案
中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸
(V)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置226的氨基酸取代是苯丙氨
酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置235的
氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 
12的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 
12或SEQ ID NO: 2的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方
案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸
(P)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置258的氨基酸取代是丝氨酸
(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置296的氨
基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2
的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12
或SEQ ID NO: 2的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案
中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸
(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是丙氨酸
(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298的氨
基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 
2的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 
12或SEQ ID NO: 2的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中,
SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某
些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代
苏氨酸(T)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置327的氨基酸取代是
精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置328
的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬
氨酸(D)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置436的氨基酸取代是异
亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置456
的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施
方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨
酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置503的氨基酸取代是异亮
氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置552
的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨
酰胺(Q)。
[0031] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶
可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置103、194、372、375、450、509和
570的一个或多个位置的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转
座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™转座酶可包
含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置
103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,
piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ 
ID NO: 2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。
在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置194的氨基酸取代是缬氨酸
(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置372
的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2序列的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中,SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置509的氨基酸取代是甘氨酸
(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置570的氨基
酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中,piggyBac™转座酶可包含在SEQ 
ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中,包括其中
piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代
的那些实施方案,piggyBac™转座酶还可包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位
置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中,piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID 
NO: 12的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代,在SEQ ID NO: 12的位置372的丙氨
酸(A)对精氨酸(R)的取代,和在SEQ ID NO: 12的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取
代。在某些实施方案中,piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)
对甲硫氨酸(M)的取代,在SEQ ID NO: 12的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代,在
SEQ ID NO: 12的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO: 12的位置450
的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
[0032] 本公开内容提供包含本公开内容的CAR的载体。在某些实施方案中,载体是病毒性载体。载体可以是重组载体。
[0033] 本公开内容的病毒性载体可包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。病毒性载体可包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列
(AAV)。病毒性载体可包含重组AAV (rAAV)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺
病毒相关病毒包含两个或更多个反向末端重复(ITR)序列,其位于编码本公开内容的蛋白
支架、Centyrin或CARTyrin的序列的顺式(cis)紧邻处。本公开内容的示例性腺病毒相关病
毒和重组腺病毒相关病毒包括,但不限于所有血清型(如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、
AAV6、AAV7、AAV8,和AAV9)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括,但不限于自补AAV (scAAV)和含有一个血清型的基因组和另一个血清型的衣壳的AAV杂
种(如AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关
病毒包括,但不限于rAAV-LK03。
[0034] 本公开内容的病毒性载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时,选择基因可编码为细胞生存和存
活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物,且其
中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括,但不限于neo 
(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS 
(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因
(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族,成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。
[0035] 本公开内容的病毒性载体可包含诱导型前凋亡多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 前凋亡多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,
非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中,配体结合区可以是多聚体配体结合区。本
公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中,本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半
胱天冬酶多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内容
的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半
胱天冬酶多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内容
的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 截
短的半胱天冬酶9多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽的
某些实施方案中,本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽,配体结
合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中,包含FK506结合蛋白12 
(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨
酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中,FKBP12多肽由包含GVQVETI
SPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYG
ATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中,
FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAG
ACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCT
TCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCG
GGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACC
CTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 24)的核酸序列编码。在某些实施方
案中,对配体结合区特异性的诱导剂可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽,其具有位置
36的苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)取代(F36V),包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。
[0036] 在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸或包含
GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列编码。在某些实施方案中,编码接头的核酸
序列不包含限切酶位点。
[0037] 在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地,或者另外,在本
公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些
实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列
编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多
肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCL
IINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQ
ASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDA
TPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVS
VKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 27)的氨基酸或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGA
GTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAAT
GTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGT
TCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCT
GGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTG
CAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCA
CTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGG
CTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAG
GAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACA
GTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTT
TGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATC
TACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 28)
的核酸序列编码。
[0038] 在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中,其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽,诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQE
VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADL
AYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGAL
DCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSP
EDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSED
LQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 29)的氨基酸序列或包含GGGGTC
CAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCG
GGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCA
GGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCT
GACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGC
TGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCT
GGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGA
CTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCG
AAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCT
GGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGA
ACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAA
AGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCC
TGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAG
CTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCAT
GGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGA
CCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTC
AATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 30)的核酸序列编码。
[0039] 本公开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中,载体可包含至少一个自切肽,其中自切肽位于CAR和选择基因之间。在一些实施方案中,载体可包含
至少一个自切肽,其中第一个自切肽位于CAR的上游和第二个自切肽位于CAR的下游。本公
开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽,其位于例如本公开内容的蛋白支架、
Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的
病毒性载体可包含至少两个自切肽,第一个自切肽位于,例如本公开内容的诱导型前凋亡
多肽的上游或紧邻接的上游,而第二个自切肽位于,例如,本公开内容的诱导型前凋亡多肽
的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含,例如,T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽,或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 31)
的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列具有至少
70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP 
(SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨
基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 33)的核
酸序列。E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列或与包
含QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的
氨基酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列具有至少
70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸
序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP  (SEQ  ID  NO:  37)的氨基酸序列或与包含
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸
序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、
90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID 
NO: 39)的氨基酸序列或与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列
具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。
[0040] 本公开内容提供包含本公开内容的CAR的载体。在某些实施方案中,载体是纳米粒子。本公开内容的示例性纳米粒子载体包括,但不限于核酸(如RNA、DNA、合成核苷酸、修饰合成核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰氨基酸,或其任何组合)、聚合物(如多聚体)、胶束、脂质(如脂质体)、有机分子(如原子、片材、纤维、管)、无机分子(如磷酸或金)或其任何组合。纳米粒子载体可以被动地或主动地穿过细胞膜。
[0041] 本公开内容的纳米粒子载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时,选择基因可编码为细胞生存和
存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物和其
中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括,但不限于neo 
(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS 
(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因
(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族,成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。
[0042] 本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型前凋亡多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 前凋亡多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案
中,非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中,配体结合区可以是多聚体配体结合区。
本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中,本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半胱天冬酶多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内
容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 半胱天冬酶多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,本公开内
容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽,其包含(a)配体结合区,(b) 接头,和(c) 截短的半胱天冬酶9多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽
的某些实施方案中,本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽,配体
结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中,包含FK506结合蛋白12 
(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨
酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中,FKBP12多肽由包含GVQVETI
SPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYG
ATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中,
FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAG
ACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCT
TCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCG
GGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACC
CTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 24)的核酸序列编码。在某些实施方
案中,对可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽(具有取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸
(V) (F36V))的配体结合区有特异性的诱导剂包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。
[0043] 在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸或包含
GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列编码。在某些实施方案中,编码接头的核酸
序列不包含限切酶位点。
[0044] 在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地,或者另外,在本
公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些
实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序
列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9
多肽的某些实施方案中,截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGH
CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHG
CQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEP
DATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANA
VSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 27)的氨基酸或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTG
GAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACA
ATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAG
GTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAG
CTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATC
TGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGG
CACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCAC
GGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCC
AGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTA
CAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATC
TTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCA
TCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 
28)的核酸序列编码。
[0045] 在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中,其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽,诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQE
VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADL
AYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGAL
DCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSP
EDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSED
LQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 29)的氨基酸序列或包含GGGGTC
CAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCG
GGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCA
GGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCT
GACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGC
TGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCT
GGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGA
CTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCG
AAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCT
GGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGA
ACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAA
AGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCC
TGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAG
CTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCAT
GGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGA
CCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTC
AATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 30)的核酸序列编码。
[0046] 本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中,纳米粒子载体可包含至少一个自切肽,其中自切肽位于CAR和纳米粒子之间。在一些实施方案中,
纳米粒子载体可包含至少一个自切肽,其中第一个自切肽位于CAR的上游和第二个自切肽
位于CAR的下游。在一些实施方案中,纳米粒子载体可包含至少一个自切肽,其中第一个自
切肽位于CAR和纳米粒子之间,而第二个自切肽位于CAR的下游。在一些实施方案中,纳米粒
子载体可包含至少一个自切肽,其中第一个自切肽位于CAR和纳米粒子之间和第二个自切
肽位于CAR的下游,例如,CAR和选择基因之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个
自切肽,其位于,例如,本公开内容的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本公
开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少两个自切肽,第
一个自切肽位于例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游,而第二个自
切肽位于,例如,本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含,
例如,T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽,或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP  (SEQ  ID  NO: 31)的氨基酸序列或与包含
egrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序
列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、
90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctga
cctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 33)的核酸序列。E2A肽可包含含有
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP 
(SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列或与包含
GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸
序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列具有至少70%、
80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP 
(SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 37)
的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有
ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP 
(SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP  (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列或与包含
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%,或
99%同一性的序列。
[0047] 本公开内容提供一种包含本公开内容的载体的组合物。
[0048] 本公开内容提供包含本公开内容的CAR的细胞。本公开内容提供包含本公开内容的转座子的细胞。在某些实施方案中,包含本公开内容的CAR、转座子,或载体的细胞可在细胞表面上表达CAR。细胞可以是任何类型的细胞。优选地,细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、造
血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。优选地,免疫细胞是T-细
胞。细胞可以是人工抗原呈递细胞,其可以任选地用来刺激和扩增本公开内容的修饰免疫
细胞或T细胞。细胞可以是肿瘤细胞,其可以任选地用作人工或修饰的抗原呈递细胞。
[0049] 可用于过继治疗的本公开内容的修饰细胞可以是自体的或同种异体的。
[0050] 本公开内容提供一种在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)的方法,其包括:(a) 获得细胞群,(b) 使细胞群与包含本公开内容的CAR或编码CAR的序列的组合物,在足以使
CAR转移穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件下接触,从而产生修饰的细胞群;(c) 
在适合转座子的整合条件下培养修饰的细胞群;和(d) 从修饰的细胞群扩增和/或选择至
少一个在细胞表面上表达CAR的细胞。
[0051] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,细胞群可包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群可包含优化比例的CD4+和CD8+白细胞。优化比例的CD4+与CD8+白细胞并不
在体内自然发生。细胞群可包含肿瘤细胞。
[0052] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,转座子或载体包含CAR或编码CAR的序列。
[0053] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,足以转移编码CAR的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括核转染
[0054] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,其中足以转移编码CAR的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括以下至少一种:在指定电压下一个或多个电流脉冲
的施加、缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中,缓冲剂可包含PBS、HBSS、
OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实
施方案中,一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任
何组合;(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合;(c)细胞培养基;(d)细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂;和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸
试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-
17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆
181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5,或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS 
OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T
细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包含TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂,糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
[0055] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,适合于整合本公开内容的CAR或编码CAR的序列的条件包括以下至少一种:缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中,
本公开内容的转座子或载体包含本公开内容的CAR或编码CAR的序列。在某些实施方案中,
缓冲剂可包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中,一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化
因子、白细胞介素或其任何组合;(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合;(c)细胞培养基; (d)细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂;和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可
包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-
24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟
酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5,或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、
ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包括TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-
3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括pH调节剂、DNA-结
合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
[0056] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,扩增和选择步骤序贯发生。扩增可在选择之前发生。扩增可在选择之后发生,且任选地,进一步的(即第二)选择可在扩增之后发
生。
[0057] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,扩增和选择步骤可同时发生。
[0058] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,扩增可包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与抗原接触,以通过CAR刺激至少一个细胞,从而产生扩增细胞群。抗原可在基质表
面上呈递。基质可具有任何形式,包括,但不限于表面、孔、珠或其中的多个,和基质。基质可进一步包含顺磁性或磁性成分。在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,抗原可在基质表
面上呈递,其中基质是磁珠,和其中磁体可以用来从修饰和扩增的细胞群去除或分离磁珠。
抗原可在细胞或人工抗原呈递细胞表面上呈递。本公开内容的人工抗原呈递细胞可包括,
但不限于肿瘤细胞和干细胞。
[0059] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,其中转座子或载体包含选择基因,且其中选择步骤包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与选择基因赋予抗性的化合物接触,从而
将表达选择基因的细胞识别为在选择中存活和将未能表达选择基因的细胞识别为未能在
选择步骤中存活。
[0060] 在表达CAR的这种方法的某些实施方案中,扩增和/或选择步骤可持续10-14天的时期,包括端点。
[0061] 本公开内容提供一种包含用本公开内容的方法修饰、扩增和选择的细胞群的组合物。
[0062] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法,其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物,其中CAR特异性地结合肿瘤细胞上的抗原。在某些实施方案
中,肿瘤细胞可以是恶性肿瘤细胞。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者包含本公开
内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中,其包
括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是同
种异体的。
[0063] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法,其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物,其中CAR特异性地结合受试者的自身免疫细胞上
的抗原。在某些实施方案中,自身免疫细胞可以是特异性地结合受试者的靶细胞上自体抗
原的淋巴细胞。在某些实施方案中,自身免疫细胞可以是B淋巴细胞(即B细胞)。在某些实施
方案中,自身免疫细胞可以是T淋巴细胞(即T细胞)。在某些实施方案中,其包括给予所述受
试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是自体的。在某些
实施方案中,其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞
或细胞群可以是同种异体的。
[0064] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗感染的方法,其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物,其中CAR特异性地结合在包含感染因子的细胞、与感染因子联
系的细胞或暴露于感染因子的细胞上的抗原。在一些实施方案中,与感染因子联系的细胞
可以与感染因子在空气中联通(如感染因子是空气传播或吸入的)或液体联通(如感染因子
性液体或生物液体中携带)。引起宿主细胞感染的感染因子可以是细菌、病毒、酵母,或微生物。感染因子可诱导细胞或细胞的宿主生物体(受试者),示例性条件包括,但不限于病
毒性感染、免疫缺陷疾病、炎性疾病和增殖性疾病。在某些实施方案中,感染导致结核、脑小畸形、神经变性或疟疾。在某些实施方案中,感染导致受试者胎儿的脑小畸形。在某些实施
方案中,包括其中感染导致受试者胎儿的脑小畸形的那些,感染因子是病毒和其中病毒是
寨卡病毒。在某些实施方案中,免疫缺陷疾病是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。在某些实施
方案中,增殖性疾病是癌症。在某些实施方案中,癌症是宫颈癌和其中感染因子是人乳头
瘤病毒(HPV)。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细
胞群的组合物,细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者包
含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是同种异体的。
[0065] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗肥大细胞疾病的方法,其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物,其中CAR特异性地结合于肥大细胞上的抗原。在某些
实施方案中,CAR特异性地结合受试者的肥大细胞上的抗原。在某些实施方案中,肥大细胞
疾病可包括,但不限于,与肥大细胞过度增殖有关的疾病、与具有异常活性的肥大细胞有关
的疾病,和与异常的肥大细胞数量和异常的肥大细胞活性有关的疾病。示例性与肥大细胞
过度增殖有关的疾病包括,但不限于肥大细胞增多症、皮肤肥大细胞增多症(如,色样性荨
麻疹或斑丘疹皮肤肥大细胞增多症)、系统性肥大细胞增多症(包括肥大细胞白血病),和局
部化肥大细胞增殖。示例性与具有异常活性的肥大细胞有关的疾病,包括,但不限于肥大细
胞激活综合征(MCAS)或肥大细胞激活病症(MCAD)、过敏性疾病(包括过敏反应)、哮喘、炎性
疾病(包括例如,关节组织的自身免疫相关炎症、关节炎等),或其任何组合。在某些实施方
案中,其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞
群可以是自体的。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞
或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是同种异体的。
[0066] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗变性疾病的方法,其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物,其中CAR特异性地结合于有害细胞或衰老细胞上的抗原。
在某些实施方案中,CAR特异性地结合受试者的有害细胞或衰老细胞上的抗原。在某些实施
方案中,变性疾病可包括,但不限于,神经变性病症、代谢病症、血管病症和衰老。示例性神经变性病症包括,但不限于与一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的功能或功效丧
失有关的失调。示例性神经变性病症包括,但不限于与一个或多个信号传导分子、蛋白质
朊蛋白的积聚(其干扰一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的功能或降低其功效)有
关的失调。示例性代谢病症包括,但不限于与线粒体紊乱有关的障碍、电子传送链的中断、
细胞ATP生产的中断、一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的一个或多个线粒体功能
的丧失或效能的降低。示例性代谢病症包括,但不限于与流向神经元、胶质细胞或小胶质细
胞的循环血流损失或血流减少有关的障碍(如中);神经元、胶质细胞或小胶质细胞中短
暂或永久的缺状态(例如,足以释放细胞中的自由基);在受试者的睡眠状态下,流向神经
元、胶质细胞或小胶质细胞的循环CNS损失或CNS血流减少足以降低在睡眠状态下除去神经
元、胶质细胞或小胶质细胞的废物的功效。示例性衰老障碍包括,但不限于与神经元、胶质
细胞或小胶质细胞的一个或多个染色体上端粒的增加或缩短;神经元中端粒酶的功能的丧
失或效能的降低、胶质细胞或小胶质细胞;或神经元、胶质细胞或小胶质细胞中DNA修复机
制的功能的丧失或效能的降低有关的障碍。在某些实施方案中,有害细胞或衰老细胞在包
含有害细胞或衰老细胞的网络中干扰一种功能或降低另一种细胞的效能,而有针对性地移
除有害细胞或老化细胞可以改善或恢复功能或增加网络的功效。在某些实施方案中,有害
细胞或衰老细胞可能改变第二个细胞的功能或功效,而有针对性地移除有害细胞或衰老细
胞防止第二个细胞的转化。在某些实施方案中,变性疾病是神经变性病症和有害细胞或衰
老细胞是干细胞、免疫细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中,变性疾病是代谢病症和有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在
某些实施方案中,变性疾病是血管病症和有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、免疫细
胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中,变性疾病是衰老和有害细胞或衰老细胞是卵母细胞、精子、干细胞、体细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或
细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中,其包括给予所述受试者
包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物,细胞或细胞群可以是同种异体的。
[0067] 本公开内容提供一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法,其包括给予所述受试者一种包含含有转座子或载体的细胞的组合物,所述组合物包含诱导型前凋亡多肽,
其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。在某些实施方案中,细胞是自
体的。在某些实施方案中,细胞是同种异体的。在这种方法的某些实施方案中,细胞疗法是
过继性细胞疗法。在这种方法的某些实施方案中,改变细胞疗法包括终止细胞疗法。在这种
方法的某些实施方案中,改变细胞疗法包括细胞疗法中提供的一部分细胞的损耗。在某些
实施方案中,该方法进一步包括给予诱导剂的抑制剂的步骤,以抑制细胞疗法的改变,从而
恢复细胞疗法的功能和/或疗效。
[0068] 本公开内容的改变细胞疗法的方法可被用来终止或抑制对例如,康复迹象或减轻疾病严重程度/进展的迹象、疾病缓解/停止的迹象,和/或不利事件的发生有反应的疗法。
如果病情的体征或症状应再次出现或加重和/或不利事件得到解决,本公开内容的细胞疗
法可通过抑制诱导剂恢复。
[0069] 附图简述图1是描述本公开内容的7676个基对的piggyBac CARTyrin构建体的示意图,其包括
包含CARTyrin的转座子(包含CD8a信号肽、Centyrin、CD8a铰链序列,和跨膜序列,和CD3z共刺激结构域)。
[0070] 图2是本公开内容的P-BCMA-101构建体的氨基酸序列的示意图。
[0071] 图3A-B是本公开内容的P-BCMA-101构建体的核酸序列的示意图。
[0072] 图4是描述本公开内容的CARTyrin的构建的示意图和对比Centyrin和抗体的特征的表。
[0073] 图5A是描述用5 μg的CARTyrin mRNA电穿孔后,CARTyrin表达的一系列的细胞分选图。
[0074] 图5B,左小图,是描述用对照K562细胞系和表达BCMA的H929细胞系挑战后,CARTyrin功能的一系列的细胞分选图,以及右小图,显示左小图的曲线的量化的图(添加了
来自用表达BCMA的细胞系U266挑战的数据)。
[0075] 图5C是描述CARTyrin活性作为在T-细胞电穿孔期间所用的mRNA的量的函数的曲线图。
[0076] 图6是描述在小鼠中使用A08 CARTyrin的体内肿瘤挑战研究时间线的示意图。
[0077] 图7是显示A08 CARTyrin-处理的小鼠的完整(100%)生存的一对图。肿瘤负荷以M-蛋白的存在来评估。在保护的动物中没有可检测的M-蛋白。
[0078] 图8是描述本公开内容的示例性诱导型截短的半胱天冬酶9多肽的示意图。
[0079] 图9是一系列流式细胞术绘图,描绘了从活细胞区域(控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞的丰度,其作为在细胞中诱导剂(AP1903)的递增剂量的
函数,所述细胞经修饰以在核转染后第12天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽
(由通过piggyBac (PB)转座酶引入到细胞中的iC9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合
表达治疗剂(CARTyrin)。
[0080] 图10是一系列流式细胞术绘图,其描绘了从活细胞区域(门控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞丰度,其作为在细胞中诱导剂(AP1903)的递增剂量的
函数,所述细胞经修饰以在核转染后第19天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽
(由通过piggyBac (PB)转座酶引入到细胞中的iC9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合
表达治疗剂(CARTyrin)。
[0081] 图11是描述图9 (左图)或图10 (右图)所示的聚集结果的量化的一对图。特别地,这些图显示对于每个修饰的细胞类型在第12天(图9和左图)或第19天(图10和右图),iC9安
全开关对作为iC9开关的诱导剂(AP1903)的浓度的函数的细胞生存百分率的影响。
[0082] 详细描述本公开内容提供包含至少一个Centyrin的嵌合抗原受体。本公开内容的嵌合抗原受体
可包含一个以上的Centyrin。例如,双特异性CAR可包含特异性地结合两个不同的抗原的两
个Centyrin。
[0083] 本公开内容的Centyrin特异性地结合于抗原。本公开内容的包含一个或多个特异性地结合抗原的Centyrin的嵌合抗原受体可被用来引导细胞(如细胞毒性免疫细胞)的特
异性以趋向特定抗原。
[0084] 本公开内容的Centyrin可包含含有LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 1)的共有序列。
[0085] 本公开内容的嵌合抗原受体可包含人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR的信号肽。本公开内容的铰链/间隔域可包含人CD8α、IgG4和/或CD4的铰链/间隔物/茎。本公开内容的细胞内结构域或胞内域可包含人CD3ζ的细胞内信号域并可进一步包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内段,或其任何组合。示例性跨膜结构域包括,但不限于人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域。
[0086] 本公开内容通过将本公开内容的CAR和/或CARTyrin引入这些细胞,提供赋予对一个或多个抗原的特异性的基因修饰细胞,如T细胞、NK细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括来自G-CSF-动员的外周血的T细胞)、脐带血(UCB)衍生的T细胞。本公开内容的
细胞可通过编码本公开内容的CAR或CARTyrin的转座子和包含本公开内容的编码转座酶的
序列(优选地,本公开内容的编码转座酶的序列是mRNA序列)的质粒的电转移进行修饰。
[0087] 本公开内容的转座子以游离基因形式(episomally)维持或整合进重组体/修饰细胞的基因组中。转座子可以是利用转座子和转座酶以推动非-病毒性基因转移的两个组分
piggyBac系统的部分。在这种方法的某些实施方案中,转座子是具有编码嵌合抗原受体的
序列的质粒DNA转座子,所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中,
转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中,且特别是在其中转座子是piggyBac转座子
的那些实施方案中,转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。
[0088] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座子是具有编码抗原受体的序列的质粒DNA转座子,所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中,转座子是
piggyBac转座子。在某些实施方案中,且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实
施方案中,转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中,且特
别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中,编码转座酶的序列
是mRNA序列。
[0089] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含与以下氨基酸序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 12)。
[0090] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶,其包含具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列或由
它们组成:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 12)。
[0091] 在某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶,其包含具有在SEQ ID NO: 12序列的位置30、165、282或538的两个或更多个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组
成。在某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶,其包含具有在SEQ ID NO: 12序
列的位置30、165、282或538的3个或多于3个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在
某些实施方案中,转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶,其包含具有在以下SEQ ID NO: 12序
列的位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某
些实施方案中,SEQ ID NO: 12序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。
在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨
酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代
天冬酰胺(N)。
[0092] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中,本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含SEQ ID NO: 
12序列的氨基酸序列或由其组成,其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸
(I),位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G),位置282的氨基酸取代是缬氨酸
(V)取代甲硫氨酸(M),和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施
方案中,超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、
90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成:
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID 
NO: 2)。
[0093] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含
在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代:3、46、82、
103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、
315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™或
超级piggyBac™转座酶可进一步包含一个或多个以下位置的氨基酸取代:46、119、125、
177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、
340、421、436、456、470、485、503、552和570。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方
案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。
在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取
代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置103的氨基酸
取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的
位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12
或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案
中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸
(C)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置177的氨基酸取代是赖氨
酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置177的
氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中,在SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某
些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取
代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置185的氨基酸取
代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位
置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ 
ID NO: 2的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中,SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬
氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置226的氨基酸取代是苯
丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置
235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ 
ID NO: 12的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些
实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯
氨酸(P)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置258的氨基酸取代是丝
氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置296
的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫
氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是丙
氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置298
的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案
中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。
在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)
取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置327的氨基酸取
代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置
328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ 
ID NO: 2的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中,SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些
实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代
天冬氨酸(D)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置436的氨基酸取代
是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位
置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12
或SEQ ID NO: 2的位置706的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案
中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸
(S)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置503的氨基酸取代是亮氨酸
(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置503的氨
基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中,SEQ ID 
NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施
方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰
胺(Q)。在某些实施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是精氨
酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
[0094] 在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶
可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置103、194、372、375、450、509和
570的一个或多个的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中,包括其中转座酶
包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™转座酶可包含或
超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置103、
194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中,包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案,piggyBac™转座
酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的
位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中,
SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸
(M)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置372的氨基酸取代是丙氨
酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置375的
氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中,在SEQ ID NO: 12或SEQ ID 
NO: 2的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中,在SEQ 
ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实
施方案中,SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬
酰胺(N)。在某些实施方案中,piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 12的位置194的缬氨
酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中,包括其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ 
ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案,piggyBac™转座
酶可进一步包含在SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 2序列的位置372、375和450的氨基酸取
代。在某些实施方案中,piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)
对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO: 12的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代,和在
SEQ ID NO: 12的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中,piggyBac
™转座酶可包含在SEQ ID NO: 12的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID 
NO: 12的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代、在SEQ ID NO: 12的位置375的丙氨酸
(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO: 12的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取
代。
[0095] 支架蛋白本公开内容的蛋白支架可源自纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白、编码或互补核酸、载体、
宿主细胞、构成、组合、制剂、装置,以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施方案中,蛋白支架包含来自人生腱蛋白-C的多个FN3结构域的共有序列(此后为“生腱蛋白”)。在一
个更优选的实施方案中,本发明的蛋白支架是15 FN3结构域的共有序列。本公开内容的蛋
白支架可以被设计以结合各种分子,例如,细胞靶蛋白。在一个优选的实施方案中,本公开
内容的蛋白支架可以被设计以结合野生型和/或变异形式的抗原的表位。
[0096] 本公开内容的蛋白支架可包括另外的分子或部分,例如,抗体的Fc区,白蛋白结合结构域,或其它影响半衰期的部分。在进一步的实施方案中,本公开内容的蛋白支架可结合
于可编码蛋白支架的核酸分子。
[0097] 本公开内容提供至少一种在宿主细胞中表达基于多个FN3结构域的共有序列的至少一个蛋白支架的方法,该方法包括在其中至少一个蛋白支架以可检测和/或可回收的量
表达的条件下,如在此所述的培养宿主细胞。
[0098] 本公开内容提供至少一个组合物,其包含(a) 基于多个FN3结构域的共有序列和/或如在此描述的编码核酸的蛋白支架;和(b) 合适的和/或药学上可接受的载体或稀释剂。
[0099] 本公开内容提供生成基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白,优选地,多个FN3结构域的共有序列,且更优选地,来自人生腱蛋白的多个FN3结构域的共有序列的蛋白支架文库的
方法。通过在支架的部分,如环区中改变(通过突变)分子中特定位置的氨基酸或氨基酸的
数量,制备连续几代的支架来形成支架文库。通过改变单环或同时改变多个环或支架分子
的另外位置的氨基酸组成可生成支架文库。改变后的环可以相应地加长或缩短。这样的库
可以生成以在每个位置包含所有可能的氨基酸,或设计出的氨基酸的子集。库成员可被用
来通过展示进行筛选,如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。
[0100] 本公开内容的蛋白支架提供增强的生物物理特性,如还原条件下的稳定性和高浓度时的溶解性;它们可以在原核系统中表达和折叠,如大肠杆菌,在真核系统中,如酵母,和在体外转录/翻译系统中,如兔网织红细胞溶解系统。
[0101] 本公开内容提供通过用靶标淘选本发明的支架文库并检测粘合剂,生成结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关方面,本公开内容包括可被用来生成或结合成熟的具
有所需活性的蛋白支架的筛选方法,如,能够与具有某种亲和力的靶蛋白结合。亲和性成熟
可以通过迭代诱变和选择使用系统完成,如噬菌体展示或体外展示。在此过程中的诱变可
能是对特定支架残基的位点定向诱变,由于容易出错的PCR导致随机突变,DNA改组
(shuffling),和/或这些技术的组合的结果。
[0102] 本公开内容提供基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白的共有序列的分离、重组和/或合成的蛋白支架,包括但不限于,源自哺乳动物的支架,以及组成和编码包含至少一个基
于共有FN3序列的多核苷酸编码蛋白支架的核酸分子。本公开内容还包括,但不限于制备和
使用这样的核酸和蛋白支架的方法,包括诊断和治疗组合物、方法和装置。
[0103] 本公开内容的蛋白支架提供优于传统疗法的优势,如局部给予、口服,或越过血脑屏障的能力,在大肠杆菌中表达,使得蛋白的表达作为对比哺乳动物细胞表达能力(会被基
因改造成结合多个目标或相同目标的多个表位的双特异性或串联分子)的函数的资源增加
的能力,与药物、聚合物和探针结合的能力,可配制成高浓度的能力,和这样的分子有效穿
透病变组织和肿瘤的能力。
[0104] 而且,蛋白支架具有的许多抗体特性与它们模拟抗体的可变区的折叠有关。这种取向使FN3环能够与抗体相似地暴露于抗体互补决定区(CDR)。它们应该能够与细胞目标结
合,且环可以改变,例如,亲和性成熟,以改善某些结合或相关的特性。
[0105] 本公开内容的蛋白支架的6个环中的3个在拓扑上与抗体的互补决定区(CDR 1-3),即抗原-结合区相对应,而其余的三个环以类似于抗体CDR的方式暴露在表面。这些环跨
越SEQ ID NO: 13的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或在这些残基附近。优选地,为了结合特异性和亲和力而改变在残基22-28、51-54和75-81或它们附近的环区。这
些环区的一个或多个与其它环区和/或其它保持其作为主干部分的顺序的链任意排列以填
充库,而强效粘合剂可从对特定蛋白目标具有高度亲和力的库中选择。一个或多个环区可
与目标蛋白相互作用,类似于抗体CDR与蛋白质的相互作用。
[0106] 本公开内容的支架可包含抗体模拟物。
[0107] 术语“抗体模拟物”旨在描述一种特异性地结合目标序列并具有与天然存在的抗体不同结构的有机化合物。抗体模拟物可包含蛋白、核酸,或小分子。本公开内容的抗体模
拟物特异性地结合的目标序列可以是抗原。抗体模拟物可提供超过抗体的优越的特性,包
括但不限于优越的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性(如对酶降解的抗性),和较低的
生产成本。示例性抗体模拟物包括,但不限于,affibody、afflilin、affimer、affitin、
alphabody、anticalin,和avimer (也称为亲合多聚物)、DARPin (设计的锚定蛋白
(Ankyrin)重复蛋白)、Fynomer、Kunitz结构域肽,和单体
[0108] 本公开内容的affibody分子包含含有或由一个或多个无任何二硫键的α螺旋组成的蛋白支架。优选地,本公开内容的affibody分子包含或由3个α螺旋组成。例如,本公开内容的affibody分子可包含免疫球蛋白结合结构域。本公开内容的affibody分子可包含蛋白
A的Z结构域。
[0109] 本公开内容的Affilin分子包含通过修饰例如或者γ-B晶体蛋白或者泛素蛋白(ubiquitin)的暴露氨基酸产生的蛋白支架。Affilin分子在功能上模拟抗体与抗原的亲和
性,但不要在结构上模仿抗体。在用来制备affilin的任何蛋白支架中,在正确-折叠的蛋白
分子中的易接近溶剂或可能的结合配体(binding partners)的那些氨基酸被认为是暴露
的氨基酸。这些暴露的氨基酸的任何一个或多个可被修饰以特异性地结合目标序列或抗
原。
[0110] 本公开内容的Affimer分子包含含有高度稳定的蛋白的蛋白支架,所述蛋白经改造以展示对特定目标序列提供高亲和力结合位点的肽环。本公开内容的示例性Affimer分
子包含基于胱抑素蛋白或其三级结构的蛋白支架。本公开内容的示例性Affimer分子可能
共享一个包含平放在一个反并行的β-片上面的α-螺旋的共有三级结构。
[0111] 本公开内容的Affitin分子包含人工蛋白支架,例如,其结构可源自DNA结合蛋白(如DNA结合蛋白Sac7d)。本公开内容的Affitins选择性地结合目标序列,其可能是抗原的
全部或部分。本公开内容的示例性Affitins通过使一个或多个氨基酸序列在DNA结合蛋白
的结合表面上任意排列并将生成的蛋白置于核糖体的展示和选择中来制备。本公开内容的
Affitins的目标序列可例如在基因组中或在肽、蛋白、病毒或细菌的表面上发现。在本公开
内容的某些实施方案中,affitin分子可用作酶的特异性抑制剂。本公开内容的Affitin分
子可包括耐热蛋白或其衍生物。
[0112] 本公开内容的Alphabody分子也可被称为细胞穿透Alphabody (CPAB)。本公开内容的Alphabody分子包含结合各种目标序列(包括抗原)的小蛋白(一般少于10 kDa)。
Alphabody分子能够到达和结合细胞内目标序列。在结构上,本公开内容的Alphabody分子
包含形成单链α螺旋的人工序列(类似于天然存在的盘绕的线圈结构(coiled-coil 
structures))。本公开内容的Alphabody分子可包含含有被修饰以特异性地结合目标蛋白
的一个或多个氨基酸的蛋白支架。不管分子的结合特异性,本公开内容的Alphabody分子保
持正确的折叠和热稳定性
[0113] 本公开内容的Anticalin分子包含在或者蛋白或者小分子中结合目标序列或位点的人工蛋白。本公开内容的Anticalin分子可包含源自人脂钙蛋白(lipocalin)的人工蛋
白。本公开内容的Anticalin分子可用于代替,例如,单克隆抗体或其片段。Anticalin分子
可显示出优于单克隆抗体或其片段的组织穿透性和热稳定性。本公开内容的示例性
Anticalin分子可包含约180个氨基酸,具有大约20 kDa的质量。结构上,本公开内容的
Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的反平行β-链的桶状结构。在优选
的实施方案中,本公开内容的Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的8
条反平行β-链的桶状结构。
[0114] 本公开内容的Avimer分子包含特异性地结合于目标序列(其也可以是抗原)的人工蛋白。本公开内容的Avimer可识别相同目标内或不同目标内的多个结合位点。当本公开
内容的Avimer识别不止一个目标时,avimer模拟双特异性抗体的功能。人工蛋白avimer可
包含两个或更多个各自大约30-35个氨基酸的肽序列。这些肽可经由一个或多个接头肽连
接。Avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可源自膜受体的A结构域。Avimer具有可任选地包
含二硫键和/或钙的刚性结构。本公开内容的Avimer可显示出与抗体比较的更大的热稳定
性。
[0115] 本公开内容的DARPin (设计的锚定蛋白(Ankyrin)重复蛋白)包含基因工程改造的重组体,或对目标序列具有高特异性和高亲和力的嵌合蛋白。在某些实施方案中,本公开
内容的DARPin源自锚定蛋白(Ankyrin),且任选地包含锚定蛋白(Ankyrin)的至少3个重复
基序(也称为重复结构单元)。锚定蛋白(Ankyrin)介导高亲和力蛋白-蛋白相互作用。本公
开内容的DARPin包含一个大的目标相互作用面。
[0116] 本公开内容的Fynomer包含源自人Fyn SH3结构域,并经改造以结合具有同等亲和力和同等特异性的目标序列和分子作为抗体的小结合蛋白(约7 kDa)。
[0117] 本公开内容的Kunitz结构域肽包含含有Kunitz结构域的蛋白支架。Kunitz结构域包含抑制蛋白酶活性的活性位点。结构上,本公开内容的Kunitz结构域包含一个富含二硫
化物的α+β折叠。这种结构以胰腺胰蛋白酶抑制剂为例。Kunitz结构域肽识别特定蛋白结构并用作竞争性蛋白酶抑制剂。本公开内容的Kunitz结构域可包含卡拉肽
(Ecallantide) (源自人脂蛋白相关凝血抑制剂(LACI))。
[0118] 本公开内容的单体是大小与单链抗体相当的小蛋白(包含约94个氨基酸且具有约10 kDa的质量)。这些基因工程蛋白特别结合了包括抗原的目标序列。本公开内容的单体可
特异性地靶向一个或多个不同的蛋白或目标序列。在优选的实施方案中,本公开内容的单
体包含模拟人纤连蛋白的结构,和更优选地,模拟纤连蛋白的第十胞外III型结构域的结构
的蛋白支架。纤连蛋白的第十胞外III型结构域,及其单体模拟物,含有7个形成桶的β片和3个对应于抗体3个互补决定区(CDR)每一侧上的暴露的环。与抗体可变结构域的结构形成对
比,单体缺乏金属离子的结合位点以及中心的二硫键。多特异性单体可通过修改环BC和FG
来优化。本公开内容的单体可包含adnectin。
[0119] 这样一种方法可包括在需要症状、效果或机制的这样的调节、治疗、缓解、预防,或减少的细胞、组织、器官、动物或患者中给予有效量的包含至少一个支架蛋白的组合物或药物组合物。有效量可包含每次单独(如,大剂量)、多次或连续给予的约0.001-500 mg/kg,或每次单独、多次或连续给予达到0.01-5000 μg/ml血清浓度的血清浓度,或其中任何有效范
围或值的量,如使用已知的方法(如在此描述的或相关领域已知的)进行和测定的。
[0120] 支架蛋白的产生与生成本公开内容的至少一个支架蛋白可任选地通过本领域熟知的细胞系、混合的细胞系、
永生化细胞或永生化细胞的克隆群体生产。见例如,Ausubel, et al., ed., 分子生物学
中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons, 
Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., 分子克隆:实验室手册(Molecular 
Cloning: A Laboratory Manual), 第二版, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); 
Harlow和Lane, 抗体,实验室手册(Antibodies, a Laboratory Manual), Cold Spring 
Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., 免疫学的通用方案(Current 
Protocols in Immunology), John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan 
et al.,蛋白质科学的通用方案(Current Protocols in Protein Science), John Wiley 
& Sons, NY, N.Y., (1997-2001)。
[0121] 支架蛋白中的氨基酸可以被改变、添加和/或缺失以降低免疫原性或减少、增强或修改结合、亲和力、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、亲合力(avidity)、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或本领域已知的任何其它合适的特性。
[0122] 任选地,可对支架蛋白进行工程改造以保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。为达到这个目标,支架蛋白可任选地通过利用亲本和工程序列的三维模型对亲代
序列和各种概念工程产物的分析过程来制备。三维模型通常是可获得的且为本领域技术人
员所熟悉。计算机程序是可供利用的,其说明和显示选定候选序列的可能三维构象结构并
可测量可能的免疫原性(如,Xencor, Inc. of Monrovia, Calif.的Immunofilter程序)。
对这些展示的检查允许分析残基在候选序列功能中的可能作用,即分析影响候选支架蛋白
结合其抗原的能力的残基。这样,残基可以从亲代序列和参考序列中选择和组合,从而达到
预期的特性,例如对目标抗原的亲和力。做为选择,或除上述程序外,其它合适的工程方法
也可以使用。
[0123] 支架蛋白的筛选筛选与类似蛋白或片段特异结合的蛋白支架可以方便地使用核苷酸(DNA或RNA展示)
或肽展示库,例如体外展示来实现。这种方法包括对具有所需功能或结构的单个成员收集
的大量肽进行筛选。展示的核苷酸或肽序列的长度可以是3-5000或更多个合成核苷酸或氨
基酸,常见为5-100个氨基酸长,且常常为约8-25氨基酸长。除了生成肽库的直接化学合成
方法外,几种重组DNA方法已被描述。一种类型涉及肽序列在噬菌体或细胞表面上的展示。
每个噬菌体或细胞含有编码特定展示的肽序列的核苷酸序列。这样的方法被描述于PCT专
利公布号91/17271、91/18980, 91/19818和93/08278中。
[0124] 生成肽库的其它系统具有体外化学合成和重组两种方法的特点。见,PCT专利公布号92/05258, 92/14843,和96/19256。也见,美国专利号5,658,754;和5,643,768。肽展示
库、载体,和筛选试剂盒可从这样的供应商经市售获得,如Invitrogen (Carlsbad, 
Calif.),和Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)。见例如,授权于
Enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、
5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456;授权于Dyax的5,223,409、5,403,
484、5,571,698、5,837,500,授权于Affymax的5,427,908、5,580,717;授权于Cambridge 
Antibody Technologies的5,885,793;授权于Genentech的5,750,373,授权于Xoma的5,
618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417; Colligan, 同上;
Ausubel,同上;或Sambrook, 同上。
[0125] 本公开内容的蛋白支架可结合具有广泛范围的亲和力(KD)的人或其他哺乳动物蛋白。在一个优选的实施方案中,本发明的至少一个蛋白支架可任选地以高亲和力,例如,
以等于或少于约10-7 M,例如但不限于0.1-9.9 (或其中的任何范围或值) X 10-8、10-9、
10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值的KD结合于目标蛋白,如由本领域技术人员通过实施表面等离子体共振或Kinexa方法所测定的。
[0126] 蛋白支架对抗原的亲和性(affinity)或亲合力(avidity)可以用任何合适的方法经实验确定(见,例如,Berzofsky, et al., “抗体-抗原相互作用(Antibody-Antigen 
Interactions)”, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New 
York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New 
York, N.Y. (1992);和在此描述的方法)。如果在不同的条件(如,盐浓度、pH)下测量,特定的蛋白支架-抗原相互作用的测量的亲和力可能会有所不同。因此,亲和力和其它抗原-结
合参数(如,KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白支架和抗原的标准化溶液和标准化缓冲剂
(如在此描述的缓冲剂)进行。
[0127] 竞争性试验可以用本公开内容的蛋白支架执行,以确定哪些蛋白、抗体,和其他拮抗剂与本发明的蛋白支架竞争对目标蛋白的结合和/或共享表位区。这些对本领域普通技
术人员来说是很容易知道的试验可评价拮抗剂或配体之间对有限数量的蛋白上的结合位
点的竞争。蛋白和/或抗体在竞争前后是固定或不溶解的,且例如,通过倾斜(其中蛋白/抗
体已预先溶解)或通过离心(其中蛋白/抗体在竞争反应后沉淀),使与目标蛋白结合的样品
与未结合的样品分离。同样,竞争性结合可能由蛋白支架与目标蛋白的结合或缺乏结合的
功能是否改变而决定,例如,蛋白支架分子是否抑制或增强例如标记的酶促活性。ELISA和
其他功能分析可被使用,这是本领域熟知的。
[0128] 核酸分子本公开内容编码蛋白支架的核酸分子可呈现为RNA的形式,如mRNA、hnRNA、tRNA或任何
其他形式,或为DNA的形式,包括,但不限于CDNA和通过克隆获得的或合成产生的基因组
DNA,或其任何组合。DNA可以是三链、双链或单链的,或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链,也称为有义链,或者它可以是非-编码链,也称为反义链。
[0129] 本公开内容的分离的核酸分子可包含含有开放阅读框(ORF)的核酸分子,任选地具有一个或多个内含子,例如,但不限于至少一个蛋白支架的至少一个特定的部分;包含结
合目标蛋白的蛋白支架或环区的编码序列的核酸分子;和包含基本上不同于上述那些的核
苷酸序列,但由于遗传密码的简并性,仍然编码如在此描述的和/或如本领域已知的蛋白支
架的核酸分子。当然,遗传密码是本领域熟知的。因此,对于本领域技术人员来说,生产这样的简并核酸变体将是例行的事,所述核酸变体编码本发明的特定蛋白支架。见例如,
Ausubel, et al., 同上,这样的核酸变体被包括在本发明内。
[0130] 如在此指明的,本公开内容的包含核酸编码蛋白支架的核酸分子可包括,但不限于那些编码蛋白支架片段自身的氨基酸序列;完整蛋白支架或其部分的编码序列;蛋白支
架、片段或部分的编码序列,以及附加序列,如至少一个信号先导或融合肽的编码序列,有
或没有前面提到的附加编码序列,例如至少一个与附加的非-编码序列一起的内含子,包括
但不限于非-编码5′和3′序列,如在转录、mRNA加工,包括剪接和多腺苷化信号(例如,mRNA的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的,非翻译的序列;编码额外的氨基酸的附加编码
序列,例如提供额外功能的那些。因此,编码蛋白支架的序列可融合于标记序列,如编码促
进包含蛋白支架片段或部分的融合蛋白支架纯化的肽的序列。
[0131] 选择性地与如在此描述的多核苷酸杂交的多核苷酸本公开内容提供在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因
此,这个实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测,和/或定量包含这样的多核苷酸的核酸。
例如,本发明的多核苷酸可被用来在保藏的库中鉴定、分离,或扩增部分或全长克隆。在一
些实施方案中,多核苷酸是基因组的或分离的cDNA序列,或者相反,与来自人类或哺乳动物
核酸库的cDNA互补。
[0132] 优选地,cDNA库包含至少80%的全长序列,优选至少85%或90%的全长序列,且更优选至少95%的全长序列。cDNA库可以标准化以增加稀有序列的表示。低或中度严格性的杂交
条件通常但不排除地用于相对于互补序列具有减少序列同一性的序列。中和高严格性条件
可任选地用于具有更大同一性的序列。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的
选择性杂交并可被用来鉴定正向同源或共生同源序列。
[0133] 任选地,本发明的多核苷酸将编码至少一部分由在此描述的多核苷酸编码的蛋白支架。本发明的多核苷酸包含可被用于与编码本发明的蛋白支架的多核苷酸选择性杂交的
核酸序列。见例如,Ausubel, 同上;Colligan, 同上,各自通过引用全文并入本文。
[0134] 核酸的构建本公开内容的分离的核酸采用以下方法制备:(a) 重组方法,(b) 合成技术;(c) 纯化
技术,和/或(d) 其组合,如本领域熟知的。
[0135] 除了本发明的多核苷酸外,所述核酸可方便地还包含其他序列。例如,包含一个或多个限制性内切酶位点的多克隆位点可插入核酸中以帮助分离多核苷酸。同样,可以插入
可翻译的序列,以帮助分离本公开内容的翻译的多核苷酸。例如,六聚-组氨酸标记序列提
供了一种纯化本公开内容的蛋白的便利方法。本公开内容的核酸(不包括编码序列)可任选
地为用于本公开内容的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、适配体或接头。
[0136] 附加序列可被加入到这样的克隆和/或表达序列中,以优化它们在克隆和/或表达中的功能,以帮助分离多核苷酸,或改善多核苷酸在细胞中的导入。克隆载体、表达载体、适配体和接头是本领域熟知的(见例如,Ausubel, 同上;或Sambrook, 同上)。
[0137] 构建核酸的重组方法本公开内容的分离的核酸组合物,如RNA、CDNA、基因组DNA,或其任何组合,可以使用本
领域技术人员已知的任意数量的克隆方法从生物来源获得。在一些实施方案中,在严格的
条件下,与本发明的多核苷酸选择性地杂交的寡核苷酸探针被用来鉴定cDNA或基因组DNA
库中的期望的序列。RNA的分离,和cDNA和基因组库的构建是本领域普通技术人员熟知的
(见例如,Ausubel, 同上;或Sambrook, 同上)。
[0138] 核酸筛选和分离方法cDNA或基因组库可使用基于本公开内容多核苷酸的序列的探针进行筛选。探针可被用
来与基因组DNA或cDNA序列杂交,以分离同一或不同生物中的同源基因。本领域技术人员将
意识到,该方法可采用不同程度的杂交强度;和无论是杂交还是洗涤介质都可能是严格的。
因为杂交的条件越来越严格,探针和靶标之间必须有更大程度的互补性,才能形成双链。严
格程度可由温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一个或多个因素控制。
例如,通过改变反应物溶液的极性,可以例如通过控制甲酰胺的浓度在0%-50%的范围内,方
便地改变杂交的严格性。为可检测的结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交培养
基和/或洗涤介质的严格性而有所不同。互补性程度将最好为100%,或70-100%,或其中的任
何范围或值,然而,应该理解,探针和引物中的微小序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤
介质的严格性来补偿。
[0139] RNA或DNA的扩增方法是本领域熟知的并可依据本公开内容基于本文的讲述和指导采用,而无需不适当的实验。
[0140] DNA或RNA扩增的已知的方法包括,但不限于聚合酶链反应(PCR)和相关扩增过程(见例如,授予Mullis, et al.的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,
188;授予Tabor, et al的4,795,699和4,921,794;授予Innis的5,142,033;授予Wilson, 
et al.的5,122,464;授予Innis的5,091,310;授予Gyllensten, et al的5,066,584;授予
Gelfand, et al的4,889,818;授予Silver, et al的4,994,370;授予Biswas的4,766,067;
授予Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增(使用对作为双链DNA合成模板的目标序列的
反义RNA) (授予Malek, et al的美国专利号5,130,238,商品名NASBA),其参考文献的全部
内容通过引用并入本文(见例如,Ausubel, 同上;或Sambrook, 同上)。
[0141] 例如,聚合酶链反应(PCR)技术可被用来扩增本公开内容的多核苷酸的序列和直接来自基因组DNA或cDNA库的相关基因。PCR和其它体外扩增方法也可用于例如克隆编码要
表达的蛋白的核酸序列,制备用作检测期望的mRNA在样品中的存在,对核酸测序,或用于其
它目的的探针的核酸。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术的实例见于Berger, 同
上, Sambrook, 同上,和Ausubel, 同上,以及Mullis, et al., 美国专利号4,683,202 
(1987);和Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, 
Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的市售可
获得的试剂盒是本领域已知的。见例如,优等-GC基因组PCR试剂盒(Advantage-GC Genomic 
PCR Kit) (Clontech)。另外,例如,T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可被用来提高长
PCR产物的收率。
[0142] 构建核酸的合成方法本公开内容的分离的核酸也可以用已知的方法,通过直接化学合成来制备(见例如,
Ausubel, et al., 同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸,其可以通过与互补序列杂交,
或通过使用单链作为模板,用DNA聚合酶聚合而转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到,
虽然DNA的化学合成可能限制在大约100个或更多碱基的序列,更长的序列可以通过连接较
短的序列获得。
[0143] 重组表达盒本公开内容进一步提供包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序
列,例如,编码本公开内容的蛋白支架的cDNA或基因组序列,可被用来构建可引入至少一个
期望的宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常包含可操作地连接到转录起始调控序列
的本公开内容的多核苷酸,所述调控序列将指导预期宿主细胞中多核苷酸的转录。异源的
和非-异源的(即,内源的)启动子都可能被用来指导本公开内容的核酸的表达。
[0144] 在一些实施方案中,用作启动子, 增强子,或其它元素的分离的核酸可以在本公开内容的多核苷酸的非-异源形式的适当位置(上游、下游或在内含子中)引入,以便上调或
下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如,内源性启动子可以在体内或体外通过突变、缺失
和/或替代而改变。
[0145] 载体和宿主细胞本公开内容也涉及包含分离的本公开内容的核酸分子的载体、用重组载体进行基因工
程改造的宿主细胞,和用重组技术制备的至少一种蛋白支架,这是本领域熟知的。见例如,
Sambrook, et al., 同上;Ausubel, et al., 同上,各自通过引用全文并入本文。
[0146] 例如,可使用PB-EF1a载体。载体包含以下核苷酸序列:tgtacatagattaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgac
gcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacac
ttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaa
tttcttctataaagtaacaaaacttttatcgaatacctgcagcccgggggatgcagagggacagcccccccccaaa
gcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccgg
cgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttc
ctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaagttgactgtgcctttcg
atcgaaccatggacagttagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggacc
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tattggccattgcatacgttgtatctatatcataata (SEQ ID NO: 40)。
[0147] 多核苷酸可任选地连接到包含可选择标记的载体,以供在宿主中增殖。一般来说,在沉淀物中引入质粒载体,如磷酸钙沉淀,或在一个带电荷脂质的复合物中。如果载体是病
毒,它可以用合适的包装细胞系在体外包装,然后导入宿主细胞。
[0148] DNA插入应该可操作地连接到适当的启动子上。表达构建体还将包含转录起始、终止的位点,并在转录区包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录子的编
码部分将优选地包含从开头开始的翻译和适当定位在要翻译的mRNA末端的终止密码子
(如,UAA、UGA或UAG),UAA和UAG优先用于哺乳动物或真核细胞表达。
[0149] 表达载体将优选地(但任选地)包含至少一个可选择的标记。这样的标记包括,例如,但不限于氨苄西林、博来霉素(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基
因)、G418/遗传霉素(neo基因)、麦考酚酸,或谷氨酰胺合成酶(GS, 美国专利号5,122,464;
5,770,359;5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因),对真核细胞培养以及氨苄西林、博来霉素
(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/新霉素(neo基因)、卡那霉素、大观霉素、链霉素、羧苄西林、博莱霉素、红霉素、多粘菌素B,或四环素的耐药基因,对在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的耐药基因(以上专利通过引用全部并入本文)。对
于上述宿主细胞的适宜的培养基和条件是本领域已知的。对于技术人员而言,合适的载体
将是显而易见的。将载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转
染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知的方法进行。这样的方法在本领域有描述,如Sambrook, 同上, 章节1-4和16-18; Ausubel, 同上, 章节1、9、13、15、16。
[0150] 表达载体将优选地(但任选地)包含至少一个可选择的细胞表面标记,以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的细胞表面标记包含表面蛋
白、糖蛋白,或浆细胞的或细胞的子集与另一个定义的细胞子集区分开来的蛋白组。优选
地,可选择的细胞表面标记将由本公开内容的组合物和方法修饰的那些细胞与未由本公开
内容的组合物和方法修饰的那些细胞区分开来。这样的细胞表面标记包括,例如,但不限于
“指定簇”或“分类决定子”蛋白(通常缩写为“CD”),例如截短的或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52,或其任何组合。细胞表面标记还包括自杀基因标记RQR8 
(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)。
[0151] 表达载体将优选地(但任选地)包括至少一个可选择的耐药标记,以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的耐药标记可包含野生型或突变
体Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2,或其任何组合。
[0152] 至少一个本公开内容的蛋白支架可以以一种修饰的形式表达,例如融合蛋白,并且不仅可以包括分泌信号,还可以包括额外的异源功能区。例如,额外的氨基酸区,特别是
荷电的氨基酸,可被加入到蛋白支架的N-末端,以提高在纯化过程中,或在随后的处理和储
存过程中的稳定性和在宿主细胞中的持久性。同样,所述肽部分可加入到本公开内容的蛋
白支架以促进纯化。在最后制备蛋白支架或其至少一个片段之前,可以移除这样的区。这样
的方法被描述于许多标准实验室手册,如Sambrook, 同上, 章节17.29-17.42和18.1-
18.74; Ausubel, 同上, 章节16, 17和18。
[0153] 本领域普通技术人员对大量可用于表达编码本公开内容的蛋白的核酸表达系统非常了解。做为选择,通过在含有编码本公开内容的蛋白支架的内源性DNA的宿主细胞中打
开(通过操作),本公开内容的核酸可在宿主细胞中表达。这样的方法是本领域熟知的,例
如,如在美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述,通过引用全部
并入本文。
[0154] 可用于制备蛋白支架、其特定部分或变体的示例性细胞培养,是本领域已知的细菌、酵母,和表达细胞。表达细胞系统常常以单层细胞的形式存在,尽管哺乳动物细胞悬液
生物反应器也可以被使用。本领域已经开发出许多能够表达完整糖基化蛋白的合适的宿
主细胞系,并包括COS-1 (如,ATCC CRL 1650)、COS-7 (如,ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (如,ATCC CRL-10)、CHO (如,ATCC CRL 1610)和BSC-1 (如,ATCC CRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等,可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection), Manassas, Va. 
(www.atcc.org)容易地获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞,如骨髓瘤和淋巴瘤细
胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞
(ATCC登录号CRL-1851)。在特别优选的实施方案中,重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-
Ag14细胞。
[0155] 用于这些细胞的表达载体可包含一个或多个以下的表达控制序列,例如,但不限于复制起点;启动子(如,延迟或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062; 5,
385,839)、HSV tk启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,
491)、至少一个人启动子;增强子,和/或处理信息位点,如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如,SV40大T Ag聚A加成位点),和转录终止子序列。见例如,Ausubel et al., 同上;Sambrook, et al., 同上。可用于制备本发明的核酸或蛋白的其它细胞是已知
的和/或可从例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(American Type Culture 
Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas) (www.atcc.org)或其它已知的
或商业来源获得。
[0156] 当利用真核宿主细胞时,多腺苷酸化或转录终止子序列通常被结合到载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。转录本的准确剪接序列也可以
包括在内。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague, et al., J. Virol. 45:
773-781 (1983))。另外,控制宿主细胞复制的基因序列可以结合到载体中,如本领域已知
的。
[0157] 蛋白支架的纯化用众所周知的方法可以从重组细胞培养中回收和纯化蛋白支架,包括但不限于蛋白A
纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和层析、羟基磷灰石色谱和凝集素层析。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。
见例如,Colligan, 免疫学的通用方案(Current Protocols in Immunology),或蛋白质科
学的通用方案(Current Protocols in Protein Science), John Wiley & Sons, NY, 
N.Y., (1997-2001), 如,章节1、4、6、8、9、10,各自通过引用全文并入本文。
[0158] 本公开内容的蛋白支架包括天然纯化的产物、化学合成工艺的产物,和通过重组技术从原核或真核宿主,包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和表达细胞生产的产物。
取决于重组生产程序中所用的宿主,本公开内容的蛋白支架可以被糖基化或可以被非-糖
基化。这样的方法被描述于许多标准实验室手册,如Sambrook, 同上, Sections 17.37-
17.42; Ausubel, 同上, 章节10、12、13、16、18和20, Colligan, Protein Science, 同
上, 章节12-14,所有通过引用全部并入本文。
[0159] 氨基酸密码组成本公开内容的蛋白支架的氨基酸通常都是缩写的。氨基酸命名可以通过用其单字
母代码指定氨基酸、其三个字母代码,名称,或本领域普遍理解的三个核苷酸密码子来表示
(见Alberts, B., et al.,细胞的分子生物学(Molecular Biology of The Cell), 第3
版, Garland Publishing, Inc., New York, 1994)。本公开内容的蛋白支架可包含一个
或多个氨基酸取代、缺失或添加,无论是从自然突变或人为操纵,如本文所指定的。本公开
内容的蛋白支架中为功能所必需的氨基酸,可以通过本领域已知的方法来识别,如例如定
点诱变或丙氨酸扫描诱变(如,Ausubel, 同上, 章节8, 15; Cunningham和Wells, 
Science 244:1081-1085 (1989))。后一种程序在分子中的每一个残基上都引入了单一的
丙氨酸突变。然后对产生的突变分子进行生物活性测试,例如,但不限于至少一种中和活
性。蛋白支架结合的关键位点也可以通过结构分析来确定,如结晶、核磁共振或光亲和标记
(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)和de Vos, et al., Science 
255:306-312 (1992))。
[0160] 如技术人员所意识到的,本发明包括至少一个生物活性的本公开内容的蛋白支架。生物活性的蛋白支架具有天然的(非-合成)、内源的或相关和已知的蛋白支架的特异性
活性的至少20%、30%,或40%,和优选至少50%、60%,或70%,且最优选至少80%、90%,或95%-99%或更多的特异性活性。酶活性和底物特异性的测定和定量测量的方法是本领域技术人员熟
知的。
[0161] 在另一方面,本公开内容涉及如在此描述的蛋白支架和片段,其被有机分子的共价附着修饰。这样的修饰可产生一种具有改进的药代动力学特性的蛋白支架片段(如,增加
的体内血清半衰期)。有机部分可以是线性或支化的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪
酸酯基。在特定的实施方案中,亲水性聚合物基团可具有约800-约120,000道尔顿的分子量
并可以是聚链烷二醇(如,聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚
合物或聚乙烯吡咯烷酮,和脂肪酸或脂肪酸酯基可包含从约8至约40个碳原子。
[0162] 本公开内容的修饰蛋白支架和片段可包含一个或多个与抗体直接或间接地共价结合的有机部分。结合于本公开内容的蛋白支架或片段的每个有机部分可独立地为亲水性
聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。如本文所用的,术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧
酸。如本文所用的术语“亲水性聚合物基团”,指一种比在辛烷中更易溶于水的有机聚合物。
例如,聚赖氨酸比在辛烷中更易溶于水。因此,本公开内容涵盖通过聚赖氨酸的共价附着修
饰的蛋白支架。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物可以是线性或支化的并
包括,例如,聚链烷二醇(如,PEG,单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(如,葡聚糖、纤维素、低聚糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(如,聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷氧化物(如,聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地,修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物作为一个单独的分子实体时,具有约800-约150,000道
尔顿的分子量。例如,可以使用PEG5000和PEG 20,000,其中下标是聚合物的平均分子量(道
尔顿)。亲水性聚合物基团可用1-约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基取代。用脂肪酸或脂肪酸
酯基取代的亲水性聚合物可采用合适的方法制备。例如,包含胺基的聚合物可以偶联到脂
肪酸或脂肪酸酯的羧酸盐上,而脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸盐(如,用羰基二咪唑激
活)可以偶联到聚合物的羟基上。
[0163] 适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的,也可以包含一个或多个不饱和单位。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸包括,例如,正-十
二烷酸(C12,月桂酸)、正-十四烷酸(C14,豆蔻酸)、正-十八烷酸(C18、硬脂酸)、正-二十烷酸(C20、花生酸)、正-二十二烷酸(C22、山萮酸)、正-三十烷酸(C30)、正-四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18、油酸)、所有顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸(C20,花生四烯酸)、
辛二酸,十四碳二酸,十八碳二酸,二十二碳二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或支化
的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1-约12,优选1-约6个碳原子。
[0164] 修饰的蛋白支架和片段可使用合适的方法,例如通过与一个或多个修饰剂反应来制备。如本文所用的术语“修饰剂”,指包含活化基团的合适的有机基团(如,亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或功能团,其可在适当的条件下与第二个化学基团反应,从而在修饰剂和第二个化学基团之间形成共价键。例如,胺-反应性活化基团包
括亲电基团,如甲苯磺酸、甲磺酸、卤代(氯代、溴代、氟代、碘代)、N-羟基琥珀酰基酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括,例如,来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫醚(pyridyl disulfides)、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能团可
偶联至含有胺或酰肼的分子,而叠氮基可与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯
(phosphoramidate)或磷酰亚胺键(phosphorimide linkages)。将活化基团引入分子的合
适的方法是本领域已知的(见 例如,Hermanson, G. T., Bioconjugate Technoques;
Academic Press: San Diego, Calif. (1996))。活化基团可直接连接于有机基团(如,亲
水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯),或通过接头部分,例如,二价C1-C12基团,其中一个或多个碳原子可被杂原子,如氧、氮或硫替代。合适的接头部分包括,例如,四乙二醇
(tetraethylene glycol)、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-
CH2-CH2-O-CH-NH-。例如,通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下,
使单-Boc-烷基二胺(如,单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应,形成在游离
胺和脂肪酸羧酸盐之间的酰胺键,可制备包含接头部分的修饰剂。Boc保护基团可通过用三
氟乙酸(TFA)处理从产物除去,以暴露于可偶联至另一个所述的羧酸盐的伯胺,或可与马来
酸酐反应,并使生成的产物环化生成一种活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物(见,例如,
Thompson, et al., WO 92/16221,其中的全部讲述都通过引用并入本文)。
[0165] 本公开内容的修饰的蛋白支架可通过使蛋白支架或片段与修饰剂反应来制备。例如,通过使用胺-反应性修饰剂,例如PEG的NHS酯,可以非-位点特异性方式使有机部分结合
于蛋白支架。包含结合于本公开内容的蛋白支架的特定位点的有机部分的修饰蛋白支架和
片段可使用合适的方法,如反向蛋白水解(Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-
153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et 
al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 
59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)),和
在Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques;Academic Press: San Diego, Calif. 
(1996)中描述的方法制备。
[0166] 包含另外的治疗活性成分的蛋白支架组合物本公开内容的蛋白支架化合物、组合物或组合可进一步包含任何合适的辅助剂,例如
但不限于稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等的至少一种。药学上可接受的辅助剂是优选的。制备这样的无菌溶液及制备方法的非限制性实例是本领域
熟知的,例如,但不限于,Gennaro,  Ed., Remington's药物科学(Remington's 
Pharmaceutical Sciences), 第18版, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990。可常
规选择适合于本领域熟知的或如在此描述的蛋白支架、片段或变体组合物的给药方式、溶
解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
[0167] 可用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括,但不限于蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如,糖,包括单糖、二-、三-、四-,和低聚糖;衍生的糖,如醛糖、醛酸、酯化糖等;以及多糖或糖聚合物),其既可以单独存在,也可以组合存在,包含单独或组合量的
1-99.99%重量或体积。示例性蛋白赋形剂包括血清白蛋白,例如人血清白蛋白(HSA)、重组
人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸/蛋白组分,其也可具有缓冲功能,包括丙氨酸,甘氨酸,精氨酸,甜菜碱、组氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
[0168] 适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括,例如,单糖,如果糖,麦芽糖,半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖,山梨糖等;二糖,如乳糖,蔗糖,海藻糖,纤维二糖等;多糖,如子糖、木密三糖(melezitose)、麦芽糊精、葡聚精、淀粉等;和醛醇,如甘露醇,木糖醇,麦芽酚,丙交醇,木糖醇、山梨醇(花楸糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露醇,海藻糖,和棉子糖。
[0169] 蛋白支架组合物也可包含缓冲剂或pH-调节剂;通常地,缓冲剂是由从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐,例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐;Tris, 盐酸氨丁三醇,或磷酸盐缓冲液。用于本发明组合物
的优选的缓冲剂是有机酸盐,例如柠檬酸盐。
[0170] 此外,本发明的蛋白支架组合物可包括聚合物赋形剂/添加剂,如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(ficolls) (聚合糖)、葡萄糖结合剂(如,环糊精,如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂抗菌剂甜味剂,抗氧化剂,抗静电剂,表面活性剂(如,聚山梨醇酯,如“TWEEN 
20”和“TWEEN 80”)、脂质(如,磷脂、脂肪酸)、类固醇(如,胆固醇),和螯合剂(如,EDTA)。
[0171] 适合用于依据本发明的蛋白支架、部分或不同成分的这些和另外的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的,例如,如在“Remington:药物科学和实践(Remington: The Science & Practice of Pharmacy)”, 第19版, Williams & Williams, (1995),和在“临
床药师案头参考书(Physician's Desk Reference)”, 第52版, Medical Economics, 
Montvale, N.J. (1998)中列出的,其公开内容通过引用全部并入本文。优选的载体或赋形
剂原料是碳水化合物(如,糖和醛醇)和缓冲剂(如,柠檬酸盐)或聚合剂。示例性载体分子是
粘多醣、透明质酸,其可用于关节内递送。
[0172] 从白细胞去除术(Leukapheresis)产物分离T细胞使用封闭系统和标准方法(例如,血浆分离置换系统(COBE Spectra Apheresis 
System)),白细胞去除术产物或血液可临床场所从受试者收集。优选地,依据标准医院或机
构白细胞去除术程序,在标准白细胞去除术收集袋收集产物。例如,在本公开内容的方法的
优选实施方案中,无额外抗凝血剂或血液添加剂(肝素等)包括在白细胞采集过程中通常使
用的那些之外。
[0173] 做为选择,白细胞(WBC)/外周血单核细胞(PBMC) (使用Biosafe Sepax 2 (密闭的/自动化的))或T细胞(使用CliniMACS® Prodigy (密闭的/自动化的))可直接从全血
分离出来。然而,在某些受试者(如诊断和/或治疗癌症的那些)中,WBC/PBMC从全血中分离
的产率可能比用白细胞去除术分离时要低得多。
[0174] 或者,白细胞去除术程序和/或指导细胞分离的程序可用于本公开内容的任何受试者。
[0175] 白细胞去除术的产物、血液、WBC/PBMC组成和/或T-细胞组成应用绝缘容器包装,并应依据为用于临床方案批准的标准医院机构血液收集程序,保持在受控制的室温下(+19
℃至+25℃)。白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分不应冷藏。
[0176] 在运输过程中,细胞浓缩白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分不应超过0.2x109细胞每mL。应避免白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞
成分的强烈混合。
[0177] 如果白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分必须贮存例如过夜,它应该在受控制的室温下保持(与上文相同)。在贮存期间,白细胞去除术产物、血液、
WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分的浓度决不应超过0.2x109细胞每mL。
[0178] 优选地,白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分的细胞应贮存在自体血浆中。在某些实施方案中,如果白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分的细胞浓度高于0.2x109细胞每mL,产物应用自体血浆稀释。
[0179] 优选地,当开始标记和分离程序时,白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分不应超过24小时。白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分可
使用密闭和/或自动化系统(如,CliniMACS Prodigy)处理和/或准备细胞标记。
[0180] 自动化的系统可能是通过渗漉(ficolation)和/或清洗细胞产物来进行额外的白血球层(buffy coat)分离(例如,白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成
分)。
[0181] 一种密闭的和/或自动化的系统可被用来制备和标记细胞以供T-细胞分离(从例如白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC成分和/或T-细胞成分)。
[0182] 虽然WBC/PBMC可能被直接核转染(这更容易且保存其他步骤),本公开内容的方法可以包括在核转染之前首先分离T细胞。直接核转染PBMC的简单策略要求经由CAR信号传导
介导的CAR+细胞的选择性扩增,这本身就是一种劣质的扩增方法,其通过使T细胞功能衰
竭,直接降低产物的体内效率。产物可以是CAR+细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细
胞,或其任何组合的非均匀成分,这增加了从患者到患者的产物的可变性,增加了剂量和
CRS管理的更大的难度。因为T细胞被认为是抑制和杀伤肿瘤的主要效应物,T细胞分离用于
制造一种自体产物可能导致超过其他更不均匀的成分的显著的好处。
[0183] T细胞可以通过富集标记细胞或在单向标记程序中耗尽标记细胞来直接分离,或者在两步标记程序中间接地分离。根据本公开内容的某些富集策略,T细胞可以收集在细胞
收集袋,而未标记的细胞(非-靶细胞)在负分压袋中收集。本公开内容的富集策略相反,未
标记的细胞(靶细胞)在细胞收集袋中收集,而标记的细胞(非-靶细胞)分别在负分压袋或
非-靶细胞袋中收集。选择的试剂可包括,但不限于抗体包覆的珠。抗体包覆的珠可或者在
修饰和/或扩增步骤之前除去,或者在修饰和/或扩增步骤之前保留在细胞上。细胞标记的
一个或多个以下非-限制性实例可被用来分离 T-细胞:CD3、CD4、CD8、CD25, 抗-生物素、
CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β,和/或其任何组合。用于分离T-细胞的方法可包括一个或多个试剂,其特异性地结合和/或可检测地-标记可被用来分离T-细胞的细胞标记的一个或多个以下
非-限制性实例:CD3、CD4、CD8、CD25、抗-生物素、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β,和/或其任何组合。
这些试剂可能是或可能不是“良好操作规范” (“GMP”)级。试剂可包括,但不限于Thermo DynaBeads和Miltenyi CliniMACS产物。分离本公开内容的T-细胞的方法可能包括标记和/
或隔离步骤的多次迭代。在分离本公开内容的T-细胞的方法的任何点,不需要的细胞和/或
不需要的细胞类型可通过积极或消极地选择不需要的细胞和/或不想要的细胞类型,可以
从本公开内容的T细胞产物组成中耗尽。本公开内容的T细胞产物组合物可含有额外的可表
达CD4、CD8,和/或另一个T细胞标记的细胞类型。
[0184] 本公开内容的用于T细胞的核转染的方法可通过例如,在一个群体中或由WBC/PBMC组成的T细胞核转染过程中(在核转染后,包括分离步骤或经由TCR信号传导的选择性
扩增步骤)消除T细胞分离的步骤。
[0185] 某些细胞群可在T细胞富集和/或分选前后,通过积极或消极地选择来消除。可从细胞产物成分中耗尽的细胞成分的实例,可包括髓细胞、CD25+调节T细胞(T Regs)、树突细
胞、巨噬细胞、红细胞、肥大细胞、γ-δT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、诱导型天然杀伤(iNK) T细胞、NK T细胞、B细胞,或其任
何组合。
[0186] 本公开内容的T细胞产物组成可包括CD4+和CD8+ T-细胞。CD4+和CD8+ T-细胞可被分离到分开的收集袋中。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞可被进一步地分开处理,或经重组(组
合呈相同组成)以特定比例处理。
[0187] 可重组的特定比例的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞可取决于所用扩增技术的类型和功效、细胞培养基,和/或为扩增T-细胞产物成分所用的生长条件。可能的CD4+: CD8+比例
的实例包括,但不限于50%:50%、60%:40%、40%:60% 75%:25%和25%:75%。
[0188] CD8+ T细胞表现出强大的杀死肿瘤细胞的能力,而CD4+ T细胞提供许多支持CD8+ T细胞增殖能力和功能所需的细胞因子。因为从正常供体分离的T细胞主要是CD4+,T-细胞
产物成分在体外根据CD4+:CD8+比例进行人工调节,以提高CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比
值,否则在体内就会以别的比值出现。优化比值也可用于自体的T-细胞产物成分的离体扩
增。鉴于人工调节的T-细胞产物成分的CD4+:CD8+比例,重要的是要注意到,本公开内容的
产物的组成与任何天然存在的T-细胞群相比,可能存在显著差异,并提供了更大的优势。
[0189] 用于T细胞分离的优选的方法可包括一个负选择策略,以产生未接触的pan T细胞,这意味着生成的T-细胞组成包括未被操纵并且含有天然存在的种类/比例的T-细胞的
T-细胞。
[0190] 可用于正或负选择的试剂包括但不限于磁性细胞分离珠。在本公开内容的T-细胞分离方法的下一步骤之前,磁性细胞分离珠可能或不可能从选定的CD4+ T细胞、CD8+ T细
胞群,或CD4+和CD8+ T细胞二者的混合群体中移除或耗尽。
[0191] 可以准备T细胞成分和T细胞产物成分以供冷冻保存、标准T细胞培养基中保存和/或基因修饰。
[0192] T细胞组成、T细胞产物成分、未刺激的T细胞组合物、静息的T细胞成分或其任何部分可以用一种标准的冷冻保存方法进行冷冻保存,这种方法是为储存和恢复具有高恢复能
力、活力、表型和/或功能能力的人细胞而优化的。可采用市售可获得的冷冻保存介质和/或
方案。本公开内容的冷冻保存方法可包括无DMSO冷冻剂(如CryoSOfree™无DMSO冷冻保存
介质),以减少冷冻-相关毒性。
[0193] T细胞组成、T细胞产物成分、未刺激的T细胞组成、静息T细胞成分或其任何部分可保存在培养基中。本公开内容的T细胞培养基可被优化以供细胞储存、细胞基因修饰、细胞
表型和/或细胞扩增。本公开内容的T细胞培养基可包括一个或多个抗体。因为在细胞培养
基中包含抗生素可能会经由核转染降低基因修饰后的转染效率和/或细胞得量,特定抗生
素(或其组合)和它们各自的浓度可能会被改变,以在经由核转染的基因修饰后获得最佳的
转染效率和/或细胞产量。
[0194] 本公开内容的T细胞培养基可包括血清,而且,血清成分和浓度可能会改变,以获得最佳的细胞结果。人AB血清比FBS/FCS更适合于T细胞的培养,因为,虽然考虑在本公开内
容的T细胞培养基中使用,FBS/FCS可能会引入异种蛋白。血清可从打算给予受试者培养的
T-细胞成分的血液中分离出来,因此,本公开内容的T细胞培养基可包含自体的血清。无血
清培养基或血清-代用品也可用于本公开内容的T细胞培养基。在T-细胞培养基的某些实施
方案和本公开内容的方法中,无血清培养基或血清-代用品可提供超过用异种血清补充培
养基的优势,包括, 但不限于在核转染后表现出更高的活力,表现出更理想的细胞表型,
和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的更健康的细胞。
[0195] T细胞培养基可包括市售可获得的细胞生长培养基。示例性市售可获得的细胞生长培养基包括,但不限于PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、
ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基,或其任何组合。
[0196] 可准备T细胞成分、T细胞产物成分、未刺激的T细胞成分、静息T细胞成分或其任何部分以供基因修饰。为基因修饰而进行的T细胞成分、T细胞产物成分、未刺激的T细胞成分、静息T细胞成分或其任何部分的准备工作可包括细胞洗涤和/或再悬浮于期望的核转染缓
冲剂中。冷冻保藏的T-细胞成分可以解冻和制备由核转染修饰的基因。冷冻保藏的细胞可
依据标准或已知的方案解冻。冷冻保藏细胞的解冻和准备可被优化以产生具有更大活力、
更高效率的核转染,核转染后表现出更大的活力,表现出更理想的细胞表型,和/或在增加
扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。例如,Grifols Albutein (25%人白蛋白)可用于解冻
和/或准备过程。
[0197] 自体的T细胞产物成分的基因修饰T细胞成分、T细胞产物成分、未刺激的T细胞成分、静息T细胞成分或其任何部分可使用
例如核转染策略例如电穿孔进行基因修饰。要进行核转染的细胞总数,核转染反应的总体
积,和样品准备的精确时间可以优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染,核转染后表
现出更大的活力,表现出更理想的细胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的
细胞。
[0198] 核转染和/或电穿孔可使用,例如,Lonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、Harvard Apparatus BTX,和/或Invitrogen Neon实现。非-金属电极系统,包括但不限于塑料聚合物
电极,对于核转染可能是优选的。
[0199] 在通过核转染的基因修饰之前,T细胞成分、T细胞产物成分、未刺激的T细胞成分、静息T细胞成分或其任何部分可再悬浮于核转染缓冲液中。本公开内容的核转染缓冲液包
括市售可获得的核转染缓冲液。本公开内容的核转染缓冲液可被优化以产生具有更大活
力、更高效率的核转染,核转染后表现出更大的活力,表现出更理想的细胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。本公开内容的核转染缓冲液可包括,但不限于PBS、
HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂和其任何组合。本公开内容的核转染缓冲液可包含一种或多种补充因子,以产生具有更大活力、更高效率的核
转染,核转染后表现出更大的活力,表现出更理想的细胞表型,和/或在增加扩增技术后更
大/更快的扩增的细胞。示例性补充因子包括,但不限于重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素和其任何组合。示例性细胞因子、趋化因子,和白细胞介素包括,但不限于、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-
32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括,但不限于HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)
2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆
407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5,和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于培养基例如PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T
细胞扩增培养基和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括,但不限于TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂,糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于以增强细胞传递,增强核传递或转运,促进核酸进入细胞核,促进表染色体核酸的降解,
和/或降低DNA-介导的毒性的方式,修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或
多种核酸的示例性试剂包括,但不限于pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶,和其任何组合。
[0200] 转位试剂,包括转座子和转座酶,可在将细胞加入到核转染缓冲剂(任选地,包含在核转染反应小瓶或比色杯中)之前、于加入同时,或之后加入到本公开内容的核转染反应
中。本公开内容的转座子可包含质粒DNA、线性质粒DNA、PCR产物、DOGGYBONE™ DNA、mRNA模板、单链或双链DNA、蛋白-核酸组合或其任何组合。本公开内容的转座子可包含一个或多个
序列,其编码一个或多个TTAA位点、一个或多个反向末端重复(ITRs)、一个或多个长尾重复
(LTRs)、一个或多个绝缘子、一个或多个启动子、一个或多个全长或截短的基因、一个或多
个聚A信号、一个或多个自切2A肽裂解位点、一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)、一个
或多个增强子、一个或多个调节基因、一个或多个复制起点,和其任何组合。
[0201] 本公开内容的转座子可包含一个或多个序列,其编码一个或多个全长或截短的基因。由本公开内容的转座子引入的全长和/或截短的基因可编码一个或多个信号肽、
Centyrin、单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、一种嵌合抗原受体
(CAR)、嵌合T-细胞受体(CAR-T)、CARTyrin (包含Centyrin的CAR-T)、受体、配体、细胞因
子、耐药性基因、肿瘤抗原、同种异体抗原(allo antigen)或自体抗原(auto antigen)、酶、蛋白、肽、多肽、荧光蛋白、突变蛋白或其任何组合。
[0202] 本公开内容的转座子可在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本公开内容或其任何组合补充因子中制备。
[0203] 本公开内容的转座子可被设计以优化临床安全性和/或提高可制备性。作为一个非限制性实例,本公开内容的转座子可被设计以通过消除不必要的序列或区域和/或包括
一个非抗生素选择标记,优化临床安全性和/或提高可制备性。本公开内容的转座子可能是
或可能不是GMP级。
[0204] 本公开内容的转座酶可通过质粒DNA、mRNA、蛋白、蛋白-核酸组合或其任何组合的一个或多个序列编码。
[0205] 本公开内容的转座酶可在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本公开内容或其任何组合补充因子中制备。本公开内容的转座酶或编码或递送它们的序列/构建体可能是或可能不是GMP级。
[0206] 本公开内容的转座子和转座酶可通过任何方式递送到细胞。
[0207] 虽然本公开内容的组合物和方法包括通过质粒DNA (pDNA)将本公开内容的转座子和/或转座酶递送至细胞,使用质粒递送可允许转座子和/或转座酶被整合进细胞的染色
体DNA,这可导致连续的转座酶表达。因此,本公开内容的转座子和/或转座酶可作为mRNA或
者蛋白被递送到细胞,以除去任何染色体整合的可能性。
[0208] 本公开内容的转座子和转座酶可在转座子和/或转座酶引入核转染反应之前,可以单独或联合进行预孵育。每个转座子和转座酶的绝对量,以及相对量,例如,转座子与转
座酶的比例可以优化。
[0209] 在准备核转染反应后,任选地,在小瓶或比色杯中,根据制造商的协议,反应可能被加载到细胞核转染液装置中,并被激活以传送电流脉冲。递送本公开内容的转座子和/或
转座酶(或编码本公开内容的转座子和/或转座酶的序列)给细胞所用的电流脉冲条件可被
优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染,核转染后表现出更大的活力,更理想的细胞
表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。对于Amaxa 2B或4D细胞核转染液,每一个
不同的核转染程序都被考虑在内。
[0210] 在本公开内容的核转染反应后,细胞可以轻轻地添加到细胞培养基中。例如,当T细胞经历核转染反应,T细胞可加入到T细胞培养基中。本公开内容的核转染后细胞培养基
可包含任何一个或多个市售可获得的培养基。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本
公开内容的核转染后T细胞培养基)可被优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染,核
转染后表现出更大的活力,展示出更理想的细胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快
的扩增。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可
包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T
细胞扩增培养基和其任何组合。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核
转染后T细胞培养基)可包含本公开内容的一种或多种补充因子,以提高活力、核转染效率、
效率核转染后表现出更大的活力、细胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。示
例性补充因子包括,但不限于重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素和其任何组合。示例
性细胞因子、趋化因子,和白细胞介素包括,但不限于、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-
1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括,但不限于HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、
Pop313、Crown-5,和其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于培养基例如 PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基和
其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括,但不限于TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK及其任何组合。示例性补充因子包括,但不限于以增强细胞传
递,增强核传递或转运,促进核酸进入细胞核,促进表染色体核酸的降解,和/或降低 DNA-
介导的毒性的方式修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或多种核酸的示例
性试剂包括,但不限于pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶,和其任何组合。
[0211] 本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可在室温或预热至,例如32℃-37℃之间(包括端点)使用。本公开内容的核转染后细胞培养基
(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可预热至维持或提高细胞成活力和/或表达本
公开内容的转座子或其部分的任何温度。
[0212] 本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可包含在组织培养烧瓶或培养皿、G-Rex烧瓶、生物反应器或细胞收获培养袋,或任何其它标
准贮器中。本公开内容的核转染后细胞培养物(包括本公开内容的核转染后T细胞培养)可
保持不动,或者,做为选择,它们也可以被搅动(例如震动、旋转或摇动)。
[0213] 核转染后细胞培养物可包含基因-修饰细胞。核转染后T细胞培养物可包含基因-修饰的T细胞。本公开内容的基因修饰细胞可以静息一段特定的时间,也可以通过添加T细
胞Expander技术来刺激扩增。在某些实施方案中,本公开内容的基因修饰细胞可以或者静
息一段特定的时间。或者立即刺激扩增,例如,加入一种T细胞Expander技术。本公开内容的基因修饰细胞可以静息以允许它们有足够的时间适应,足够的时间发生易位,和/或积极或
消极选择的时间,导致细胞具有更高的存活率,更高的核转染效率,效率核转染后更大的活
力,理想的细胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。本公开内容的基因修饰细
胞可以静息,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24,或更多个小时。在某些实施方案中,本公开内容的基因修饰细胞可以静息,例如过夜。在某些方面,过夜是约12小时。本公开内容的基因修饰细胞可以静息,例如,1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14或更多天。
[0214] 本公开内容的基因修饰细胞可在加入Expander技术之前,在核反应后选择。为了基因-修饰细胞的最佳选择,细胞可允许在核转染后细胞培养基中静息至少2-14天,以便于
鉴定经修饰的细胞(如,修饰与非-修饰细胞的区别)。
[0215] 在早至核转染后24-小时,本公开内容的CAR/CARTyrin和选择标记的表达在本公开内容的转座子成功核转染后,可在修饰的T细胞中检测到。由于转座子在表染色体上的表
达,单个选择标记的表达可能无法将修饰的T细胞(其中转座子已经成功地整合的那些细
胞)与未修饰的T细胞(其中转座子未成功整合的那些细胞)区分开来。当转座子的表染色体
表达模糊时,通过选择标记检测修饰细胞,核转染细胞(修饰和未修饰的细胞二者)可以静
息一段时间(如2-14天),以使细胞停止表达或丧失所有表染色体转座子表达。在这个标准
静息期后,只有经修饰的T细胞才能保持选择标记的阳性表达。这个标准静息期的长度可针
对每种核转染反应和选择过程进行优化。当通过选择标记检测修饰细胞,转座子的表染色
体表达模糊时,选择可以在没有这个标准静息期的情况下执行,但是,可以在稍后的时间点
包含额外的选择步骤(如或者在扩增阶段期间或者在扩增阶段之后)。
[0216] 本公开内容的基因修饰细胞的选择可用任何方式执行。在本公开内容的方法的某些实施方案中,公开内容的基因修饰细胞的选择可通过分离细胞表达特定选择标记执行。
本公开内容的选择标记可通过一个或多个转座子中的序列编码。本公开内容的选择标记可
能是由于成功的易位(即转座子中的一个或多个序列未编码)而被修饰的细胞所表达的。在
某些实施方案中,本公开内容的基因修饰细胞含有一种选择标记,其赋予核转染后细胞培
养基对有害化合物的抗性。有害化合物可包含,例如,抗生素或药物,其在选择标记赋予修
饰细胞的抗性缺乏时,会导致细胞死亡。示例性选择标记包括,但不限于野生型(WT)或一个
或多个以下基因的突变形式:neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS,和NKX2.2。示例性选择标记包括,但不限于,表面-表达的选择标记或表面-表达的标签可分别
通过Ab-包覆磁珠技术或柱的选择来靶向目标。可裂解的标签例如用于蛋白纯化的那些可
加入到本公开内容的选择标记中,以便进行有效的柱选择、洗涤和洗脱。在某些实施方案
中,本公开内容的选择标记并不由天然修饰的细胞(包括修饰的T细胞)表达,因此,可用于
修饰细胞的物理分离(例如,通过细胞分选技术)。示例性本公开内容的选择标记并不由天
然修饰的细胞(包括修饰的T细胞)表达,包括,但不限于全长、突变的,或截短形式的CD271、CD19、CD52、CD34、RQR8、CD22、CD20、CD33和其任何组合。
[0217] 本公开内容的基因修饰细胞可在核转染反应后选择性扩增。在某些实施方案中,包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过CAR/CARTyrin刺激而选择性地扩增。包含CAR/
CARTyrin的修饰的T细胞可通过接触目标覆盖的试剂来刺激(如肿瘤细胞系或正常细胞系,
表达靶点或被靶点覆盖的扩张珠)。做为选择,包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过与
辐照的肿瘤细胞、辐照的同种异体正常细胞、辐照的自体的PBMC接触来刺激。为尽量减少用
于刺激的靶标-表达细胞对本公开内容的细胞产物成分的污染,例如,当细胞产物成分可以
直接给予受试者时,可以用涂有CAR/CARTyrin靶蛋白的扩张珠进行刺激。由CAR/CARTyrin
刺激的包含CAR/CARTyrin的修饰T细胞的选择性扩增可经优化,以避免在功能上耗尽修饰
的T-细胞。
[0218] 本公开内容的选择的基因修饰细胞可经冷冻保藏,静息一段特定的时间,或通过加入细胞Expander技术刺激扩增。本公开内容的选择的基因修饰细胞可经冷冻保藏,静息
一段特定的时间,或即刻通过加入细胞Expander技术刺激扩增。当选择的基因工程-修饰细
胞是T细胞时,T细胞可通过加入T-细胞Expander技术刺激扩增。选择的本公开内容的基因
修饰细胞可静息,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24,或更多个小时。在某些实施方案中,选择的本公开内容的基因修饰细胞可静息,例如过夜。在某些方面,过夜是约12小时,本公开内容的选择的基因修饰细胞可静息,例如1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。本公开内容的选择的基因修饰细胞可静息任何时间段,导致具有更大活力、更高效率的核转染,核转染后表现出更大的活力,更理想的细
胞表型,和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。
[0219] 选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的T细胞)可使用任何标准冷冻保存方法冷冻保藏,其可经优化以供贮存和/或以高回收率、活力、表型和/或功能
能力回收人细胞。本公开内容的冷冻保存方法可包括市售可获得的冷冻保存介质和/或方
案。
[0220] 选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的T细胞)的易位效率可用任何方法评价。例如,在应用Expander技术之前,由选择的基因-修饰细胞(包括本公开
内容的选择的基因-修饰的T细胞)表达的转座子可通过荧光-激活的细胞分选(FACS)测量。
选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的T细胞)的易位效率的测定可
包括测定选择的细胞表达转座子(如CAR)的百分率。做为选择,或者另外地,T细胞的纯度、
平均荧光强度(MFI)、CAR (转座子传递)介导表达CAR配体的靶细胞脱颗粒和/或杀伤的能
力,和/或选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的T细胞)的表型可用
任何方法评价。
[0221] 本公开内容的细胞产物成分可在符合某些释放标准的情况下被释放出来给予受试者。示例性释放标准可包括,但不限于,修饰、选择和/或扩增T细胞在细胞表面上表达CAR的可检测水平的特定百分率。
[0222] 自体T细胞产物成分的基因修饰本公开内容的基因-修饰细胞(包括基因-修饰的T细胞)可使用Expander技术扩增。本
公开内容Expander水平技术可包含市售可获得的Expander技术。本公开内容的示例性
Expander水平技术包括经由TCR刺激本公开内容的基因-修饰的T细胞。虽然刺激本公开内
容的基因-修饰T细胞的所有方式都是被考虑的,经由TCR刺激本公开内容的基因-修饰的T
细胞是优选的方法,产生具有较高杀伤力水平的产物。
[0223] 为经由TCR刺激本公开内容的基因-修饰的T细胞,Thermo Expander DynaBeads可以珠与T细胞3:1的比例使用。如果膨胀剂珠是不能生物降解的,则可将珠从膨胀剂组合物
中除去。例如,在约5天后,珠可从膨胀剂组合物中除去。为经由TCR刺激本公开内容的基因-修饰的T细胞,可以使用Miltenyi T细胞激活扩增试剂(Miltenyi T Cell Activation/
Expansion Reagent)。为经由TCR刺激本公开内容的基因-修饰的T细胞,可以使用肝细胞
平技术的免疫培养人CD3/CD28或CD3/CD28/CD2  T细胞激活剂试剂(StemCell 
Technologies’ ImmunoCult Human CD3/CD28或CD3/CD28/CD2 T Cell Activator 
Reagent)。这个技术可能是优选的,因为可溶性四聚体抗体复合物会在一段时间后降解,而
不需要将其从流程中移除。
[0224] 人工抗原呈递细胞(APCs)可经改造以共同表达目标抗原并可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内容的细胞或T-细胞。人工APCs可包含或可源自肿瘤细胞
系(包括,例如,永生化髓系白血病细胞系K562)并可经改造以 共同表达多个共刺激分子或
技术(例如 CD28、4-1BBL、CD64、mbIL-21、mbIL-15、CAR目标分子等)。当本公开内容的人工APCs与共刺激分子结合时,条件可经优化以防止发育或出现一种不理想的表型和功能能
力,即终末分化的效应子T细胞。
[0225] 辐照的PBMC (自体或同种异体)可表达一些目标抗原,如CD19,并可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内容的细胞或T-细胞。可供选择地,或者另外地,辐照
的肿瘤细胞可表达一些目标抗原并可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内
容的细胞或T-细胞。
[0226] 板结合和/或可溶性抗-CD3、抗-CD2和/或抗-CD28刺激可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
[0227] 抗原-涂布的珠可显示出目标蛋白并可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内容的细胞或T-细胞。可供选择地,或者另外地,用CAR/CARTyrin目标蛋白涂布的
膨胀剂珠可被用来通过本公开内容的TCR和/或CAR刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
[0228] 通过TCR或CAR/CARTyrin和经由表面-表达的CD2、CD3、CD28、4-1BB,和/或基因-修饰的T细胞上的其它标记刺激本公开内容的细胞或T-细胞的扩增方法。
[0229] 扩增技术可在核转染后即刻直至核转染后大约24小时应用于本公开内容的细胞。虽然各种细胞培养基可在扩增程序期间使用,本公开内容的理想的T细胞扩增培养基可得
到具有例如,更大活力、细胞表型、总扩增,或具有更大的体内持久性、植入性和/或CAR-介导的杀伤能力的细胞。本公开内容的细胞培养基可经优化以改进/提高本公开内容的基因-
修饰细胞的扩增、表型,和功能。扩增T细胞的优选的表型可包括T干细胞记忆、T中枢和T效
应记忆细胞的混合物。Expander Dynabeads可主要产生中枢记忆T细胞,其可导致优越的临
床表现。
[0230] 本公开内容的示例性T细胞扩增培养基可能包括部分或全部PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基(CellGro DC Medium)、CTS 
OpTimizer T细胞扩增(T Cell Expansion) SFM、TexMACS培养基(TexMACS Medium)、
PRIME-XV T细胞扩增培养基(PRIME-XV T Cell Expansion Medium)、ImmunoCult-XF T细
胞扩增培养基(ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium),或其任何组合。本公开内容的
T细胞扩增培养基可进一步包括一种或多种补充因子。可包括在本公开内容的T细胞扩增培
养基中的补充因子提高活力、细胞表型、总扩增,或增加体内持久性、植入性和/或CAR-介导的杀伤能力。可包括在本公开内容的T细胞扩增培养基中的补充因子包括,但不限于重组人
细胞因子、趋化因子,和/或白细胞介素 例如 IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L,或其任何组合。可包括在本公开内容的T细胞扩增培养基中的补充因子包括,但不限于盐、矿物质,和/或代谢物,例如
HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5或其任何组合。可包括在本公开内容的T细胞扩增培养基中的补充因子包括,但不限于细胞
DNA传感、代谢、分化、信号转导,和/或凋亡途径的抑制剂,例如TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂,糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK,或其任何组合。
[0231] 可包括在本公开内容的T细胞扩增培养基中的补充因子包括,但不限于以增强细胞传递,增强核传递或转运,促进核酸进入细胞核,促进表染色体核酸的降解,和/或降低 
DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定核酸的试剂,如pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、
CaPO4、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶,或其任何组合。
[0232] 本公开内容的基因-修饰细胞可在扩增过程期间通过采用可选择的药物或化合物来选择。例如,在某些实施方案中,当本公开内容的转座子可编码选择赋予基因-修饰细胞
对添加到培养基的药物的耐药性,选择可发生在扩增过程期间并可能需要大约1-14天的培
养才能进行选择。可用作由本公开内容的转座子编码的选择标记的耐药基因实例,包括,但
不限于野生型(WT)或突变形式的基因neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS、NKX2.2,或其任何组合。可添加到选择标记可赋予抗性的培养基中的相应的药物或化
合物实例包括,但不限于G418、嘌呤霉素、氨苄西林、卡那霉素、甲氨蝶呤、美法仑、替莫唑胺、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、苯达莫司汀、氟达拉滨、Aredia (帕米膦酸二钠)、
Becenum  (卡莫司汀)、BiCNU  (卡莫司汀)、替佐米(Bortezomib)、卡非佐米
(Carfilzomib)、Carmubris  (卡莫司汀), 卡莫司汀、Clafen  (环磷酰胺)、环磷酰胺、
Cytoxan (环磷酰胺)、达雷木单抗、Darzalex (达雷木单抗)、Doxil (盐酸多柔比星脂质
体)、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL (盐酸多柔比星脂质体)、lotuzumab、Empliciti (埃罗
妥珠单抗(Elotuzumab))、Evacet (盐酸多柔比星脂质体)、Farydak  (帕比司他
(Panobinostat))、伊沙佐米(Ixazomib)柠檬酸盐、Kyprolis  (卡非佐米)、来那度胺、
LipoDox (盐酸多柔比星脂质体)、Mozobil (普乐沙福(Plerixafor))、Neosar (环磷酰
胺)、Ninlaro (伊沙佐米柠檬酸盐)、帕米膦酸二钠、帕比司他(Panobinostat)、普乐沙福
(Plerixafor)、泊马度胺(Pomalidomide)/Pomalyst (泊马度胺)、Revlimid (来那度胺)、
Synovir (沙利度胺)、沙利度胺、Thalomid (沙利度胺)、Velcade (硼替佐米)、唑来膦酸
(Zoledronic Acid)、Zometa (唑来膦酸),或其任何组合。
[0233] 本公开内容的T-细胞扩增过程可发生在WAVE生物反应器、G-Rex烧瓶,或在任何其它合适的容器和/或反应器中的细胞培养袋中。
[0234] 本公开内容的细胞或T-细胞培养可保持稳定、摇动、旋转或震动。
[0235] 本公开内容的细胞或T-细胞扩增过程可优化某些条件,包括但不限于培养 持续时间、细胞浓度、T细胞培养基添加/除去的程序、细胞大小、总细胞数、细胞表型、细胞群的纯度、生长中的细胞群的基因-修饰细胞的百分率、补充剂的使用和组成、Expander水平技
术的添加/除去,或其任何组合。
[0236] 本公开内容的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至预先定义的端点,然后配制生成的扩增细胞群。例如,本公开内容的细胞或T-细胞扩增过程可继续预定量的时间:至少2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时;至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天;至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周;
至少1、2、3、4、5、6月,或至少1年。本公开内容的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至生成的培养达到预定的总细胞密度:1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010细胞每体积(μl、ml、L)或之间的任何密度。本公开内容的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至生成的培
养基因-修饰细胞显示出本公开内容的转座子的预定水平的表达:1%、10%、20%、30%、40%、
50%、60%、70%、80%、90%,或100%或之间的任何百分比的阈值水平的表达(最小、最大或平均水平的表达表明生成的基因-修饰细胞是临床上-有效的)。本公开内容的细胞或T-细胞扩
增过程可继续直至生成的培养物基因-修饰细胞的比例与未修饰的细胞的比例达到预定阈
值:至少1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、2:1、4:1、5:1、6:1  ,7:1、8:1、
9:1 10:1或之间的任何比例。
[0237] 基因-修饰的自体T细胞释放的分析基因-修饰细胞的百分率可在本公开内容的扩增过程期间或之后评价。本公开内容的
基因-修饰细胞的转座子细胞表达可通过荧光-激活的细胞分选(FACS)测量。例如,FACS可
被用来测定本公开内容的表达CAR的细胞或T细胞的百分率。做为选择,或者另外地,可评价
基因-修饰细胞或T细胞的纯度,由本公开内容的基因-修饰细胞或T细胞表达的CAR的平均
荧光强度(MFI),CAR介导表达CAR配体的靶细胞脱颗粒和/或杀伤的能力,和/或CAR+ T细胞
的表型。
[0238] 计划给予受试者的本公开内容的组合物可被要求满足一个或多个“释放标准”,这些标准表明对于配制为药品和/或给予受试者而言,所述组合物是安全和有效的。释放标准
可包括这样的要求,即一种本公开内容的组合物(如本公开内容的T-细胞产物)包含特定百
分率的在其细胞表面上表达可检测水平的、本公开内容的CAR的T细胞。
[0239] 扩增过程应继续直至特定标准已得到满足(如获得一定数量的细胞,实现特定数量的记忆细胞,达到特定规模的种群)。
[0240] 扩增过程应在某些标准信号点结束。例如,细胞一旦达到300fL (否则,超过这个阈值大小的细胞可能会开始死亡)的大小,就应该被配方、重新激活或冷冻保存细胞。当细
胞群达到300 fL以下的平均细胞大小时,立即冷冻保存,解冻和培养后可获得更好的细胞
回收,因为细胞在冷冻保存前还没有达到完全静止状态(完全静止的大小大约是180 fL)。
扩增前,本公开内容的T细胞可具有约180 fL的细胞大小,但在扩张后3天,它们的细胞大小
可能会翻两番,达到大约900 fL。在接下来的6至12天内,T细胞的数量将缓慢减少到180 fL
时的完全静止状态时的细胞大小。
[0241] 一种制备用于制剂的细胞群的方法可包括,但不限于浓集细胞群细胞,洗涤细胞,和/或经由针对特定表面-表达的标记的耐药或磁珠分选进一步选择细胞的步骤。一种制备
用于制剂的细胞群的方法还可以包括分选步骤,以确保最终产品的安全性和纯度。例如,如
果来自患者的肿瘤细胞已被用于刺激本公开内容的基因-修饰的T-细胞或已被基因改造,
以刺激正在准备配制的本公开内容的基因-修饰T-细胞,重要的是,患者的肿瘤细胞不包括
在最终产品中。
[0242] 细胞产物输注和/或冷冻保存以供输注本公开内容的药物制剂可分装成袋,用于输液、冷冻保存和/或储存。
[0243] 本公开内容的药物制剂可使用标准方案冷冻保藏,且任选地,用不熔的冷冻保存介质。例如,无DMSO的低温保存剂(如CryoSOfree™无DMSO冷冻保存介质)可被用来减少冷
冻-相关的毒性。冷冻保藏的本公开内容的药物制剂可能会在稍后的日期储存以供注入患
者。有效的治疗可需要多次给予本公开内容的药物制剂,因此,药物制剂可以用预先等分部
分的“剂量”包装,这些“剂量”可以被冷冻储存,但可以分开用于单个剂量的解冻。
[0244] 本公开内容的药物制剂可在室温下储存。有效的治疗可需要多次给予本公开内容的药物制剂,且因此,药物制剂可以用预先等分部分的“剂量”包装,这些“剂量”可以被储存在一起,但分开用于单个剂量的解冻。
[0245] 本公开内容的药物制剂可封存,以便随后重新扩增和/或选择以供在同种异体治疗的情况下为相同患者产生额外剂量,该患者可能需要在以后的某一天进行治疗,例如,病
情的缓解和复发。
[0246] 制剂如上所述,本公开内容提供稳定的制剂,其优选地包含含盐水或选择盐的磷酸盐缓冲
液,以及保存的溶液和含有防腐剂和多用途保藏制剂的制剂,其适用于医药或兽医用途,包
含在药学上可接受的制剂中的至少有一个蛋白支架。保存的制剂含有至少一个已知的防腐
剂或任选地选自在水性稀释剂中的苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如,六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的至少一种。
可如本领域已知的使用任何合适的浓度或混合物,如约0.0015%,或任何范围、值,或其中的部分。非-限制性实例包括,除防腐剂外,约0.1-2%间-甲酚(如,0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、
1.0%)、约0.1-3%苄醇(如,0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、约0.001-0.5%硫柳汞(如,
0.005、0.01)、约0.001-2.0%苯酚(如,0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基酯(如,0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、
0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)等。
[0247] 如上所述,本发明提供一种制造物品,包括包装材料和至少一个小瓶,小瓶包含含有规定的缓冲液和/或防腐剂的至少一个蛋白支架的溶液,任选在水性稀释剂中,其中所述
包装材料包含指示这样的溶液可保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、
66、72小时或更长的时期的标签。本发明进一步包含一种制造物品,其包含包装材料、包含
冻干的至少一个蛋白支架的第一个小瓶,和第二个小瓶包含规定的缓冲剂或防腐剂的水性
稀释剂,其中所述包装材料包含一个标签,该标签指示患者在水性稀释剂中重新构成至少
一个蛋白支架,以形成可在24小时或更长时间内保持的溶液。
[0248] 根据本发明所用的至少一个蛋白支架可通过重组方法,包括从哺乳动物细胞或转基因制剂产生,或可从其他生物源中提纯,如本文所述或本领域所知的。
[0249] 在本发明的产物中至少一个蛋白支架的范围包括在重新构成时产生的量,如果是在湿/干系统中,则浓度是从约1.0 μg/ml至约1000 mg/ml,尽管较低和更高的浓度是可操
作的,并且取决于预定的递送介质,例如溶液制剂将不同于透皮贴片,,经粘膜,或渗透或微方法。
[0250] 优选地,水性稀释剂任选地进一步包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括从苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物组成的一组选择的那
些。用于制剂的防腐剂的浓度是足以产生抗-微生物效应的浓度。这样的浓度取决于所选择
的防腐剂并很容易由熟练的技术人员决定。
[0251] 其它赋形剂,例如,等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂,和防腐增强剂可任选地和优选地添加到稀释剂中。等渗剂,如甘油,通常以已知的浓度使用。优选加入生理上耐受的缓冲液,以提供改进的pH控制。制剂可覆盖广泛范围的pHs,如从约pH 4-约pH 10,优选从约pH 5至约pH 9的范围,且最优选从约6.0-约8.0的范围。优选地,本发明的制剂具有在约6.8和约7.8
之间的pH。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂,最优选磷酸钠,特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
[0252] 其它添加剂,例如药学上可接受的增溶剂如Tween 20 (聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、Tween 40 (聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕酸酯), Tween 80 (聚氧乙烯(20)
脱水山梨糖醇单油酸酯)、普朗尼克F68 (聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物),和PEG (聚乙二
醇)或非-离子表面活性剂,如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188、普朗尼克®多元醇、
其它嵌段共聚物,和螯合剂,如EDTA和EGTA,可任选地添加到制剂或组合物中以减少聚集。
这些添加剂是特别有用的,如果使用泵或塑料容器给予制剂的话。药学上可接受的表面活
性剂的存在减轻蛋白聚集的倾向。
[0253] 本发明的制剂可通过这样的方法制备,其包括将至少一个蛋白支架与选自苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的防腐剂在水性稀释剂中混合。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架和防腐剂使用传统的溶解和混合程序进
行。为制备合适的制剂,例如,在缓冲溶液中至少有一个蛋白支架的测量的量与缓冲溶液中
足以提供所需浓度的蛋白和防腐剂的量合并在一起。这一过程的变化将为本领域普通技术
人员所认知。例如,组分加入的次序,是否使用额外的添加剂,制备制剂的温度和pH,都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。
[0254] 要求的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者,包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架,所述支架用第二瓶中含有的水、防腐剂和/或赋形剂(最好是磷酸盐缓冲液和/
或盐水以及选定的盐)在水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可
多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法,从而可以提供比目前获得的更方便
治疗方案
[0255] 目前要求的制造物品可用于在当即到24小时或更长的时间范围内给药。因此,目前要求的制造物品给患者提供显著的优点。本发明的制剂可任选地在从约2℃至约40℃的
温度下安全地储存并长时间保持蛋白的生物活性,因此,允许使用一个包装标签,该标签指
示该溶液可以在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的一段时间内持有和/或使用。如果使用保存的稀释剂,这样的标记可使用至多1-12个月、半年、1年半,和/或两年。
[0256] 本发明的至少一个蛋白支架的溶液可通过包括在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架的方法制备。混合使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的稀释剂,例如,至
少一个蛋白支架在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度蛋白和任选的防腐剂或缓
冲剂的量合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如,组分加入的次序,
是否使用额外的添加剂,制备制剂的温度和pH,都是可以优化使用的浓度和给药方式的因
素。
[0257] 要求的产物可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者,包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架,所述支架用第二瓶中含有的水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶
液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法,从而可以提供比目
前获得的更方便的治疗方案。
[0258] 要求的产物可通过向药房、诊所或其他此类机构和设施提供澄清的溶液或双瓶而间接提供给患者,所述双瓶包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架,其用第二瓶中含有的水
性稀释剂中重新构成。在这种情况下的澄清溶液可以达到一升或甚至更大的大小,提供一
个大储藏室,从中至少一个蛋白支架溶液的较小部分可被回收一次或多次以供转移到较小
的小瓶中并由药房或诊所提供给其顾客和/或患者。
[0259] 包含单瓶系统的识别装置包括用于输送溶液的笔式喷射器装置,如BD Pens、BD Autojector®、Humaject® 、NovoPen®、B-D® Pen、AutoPen® ,和OptiPen® 、
GenotropinPen®、Genotronorm Pen®、Humatro Pen®、Reco-Pen®、Roferon Pen®、
Biojector®、Iject®、J-tip Needle-Free Injector®、Intraject®、Medi-Ject®,例
如,如由Becton Dickinson (Franklin Lakes, N.J., www.bectondickenson.com), 
Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, 
Oreg. (www.bioject.com);National Medical Products, Weston  Medical 
(Peterborough, UK, www.weston-medical.com)、Medi-Ject Corp (Minneapolis, 
Minn., www.mediject.com) 制造或开发的,及类似的合适装置。包含双瓶系统的识别装置
包括那些用于在药盒中重新构成冻干药物以供递送已重构的溶液的笔式喷射器系统,如
HumatroPen®。其它合适的装置的实例包括预填充注射器、自动注射器、无针注射器和无针
静脉输液器。
[0260] 目前要求的产物包括包装材料。包装材料除提供监管机构要求的信息外,还提供产品使用的条件。本发明的包装材料提供给患者操作的指示,在水性稀释剂中重新构成至
少一个蛋白支架,以形成溶液并在2-24小时或更长的时间内使用该溶液,用于两瓶(湿/干)
产品。对于单瓶溶液产品,标签指明这种溶液可以在2-24小时或更长的时间内使用。目前要
求的产品对于人类药品的使用是有用的。
[0261] 本发明的制剂可通过这样的方法制备,其包括混合至少一个蛋白支架和选择的缓冲剂,优选地,磷酸盐缓冲剂含有盐水或选择的盐。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架
和缓冲剂使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的制剂,例如,使至少一个蛋白支架
在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的所需缓冲剂在水中的量
合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如,组分加入的次序,是否使用
额外的添加剂,制备制剂的温度和pH,都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。
[0262] 要求的稳定或保存的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者,包括一小瓶冻干的蛋白支架,所述支架用第二瓶中含有的防腐剂和赋形剂在水性稀释剂中重新构成。
需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者
疗法,从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。
[0263] 稳定蛋白支架的其它制剂或方法可导致包含蛋白支架的冻干粉末的澄清溶液以外的其他制剂。在非澄清的溶液中有含有微粒悬浮液的制剂,所述微粒是一种组合物,其含
有可变尺寸的结构和各种被称为微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体的蛋白支架。这样
的相对均一的,基本上是球形的含有活性物质的微粒制剂可通过使含有活化剂和聚合物的
水相和非水相接触,接着使非水相蒸发,导致水相中粒子的聚结而形成,如在美国专利号4,
589,330中讲述的。多孔微粒可使用含有活化剂的第一相和分散在连续溶剂中的聚合物并
冷冻干燥或稀释萃取沉淀从悬浮液中除去所述溶剂来制备,如在美国专利号4,818,542
中讲述的。用于此类制剂的优选的聚合物是选自以下的天然或合成共聚物或聚合物:明胶
琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚羟基乙酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸)、聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚酰胺、聚(氨基
酸)、聚(2-羟基乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-六亚甲基二异
氰酸酯)和聚(甲基甲基丙烯酸酯)。特别优选的聚合物是聚酯,如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交
酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸),和聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸。可用于溶解聚合物和/或活性剂的溶剂包括:水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、苯,或六氟丙酮倍半水合物。用第二相分散含活性剂相的过程可包括压力迫使所述的第一相通过
喷嘴中的孔来影响液滴的形成。
[0264] 干粉制剂可从冻干以外的过程产生,例如通过喷雾干燥或溶剂萃取,通过蒸发或沉淀结晶成分,然后采取一个或多个步骤去除水性或非水性溶剂。喷雾干燥蛋白支架制剂
的制备在美国专利号6,019,968中讲述。蛋白支架基干粉组合物可在提供一种可吸入的干
粉的条件下,通过喷雾干燥蛋白支架的溶液或浆液以及任选的在溶剂中的赋形剂来制备。
溶剂可包括极性化合物,如水和乙醇,它们可容易被干燥。蛋白支架稳定性可在没有氧气的
情况下(例如在氮气覆盖下)执行喷雾干燥程序或通过使用氮气作为干燥气体来增强。另一
个相对干燥的制剂是分散在通常包含氢氟烷烃推进剂的悬浮介质中的多个穿孔微结构的
分散体,如在WO 9916419中讲述的。使用计量吸入器,可将稳定的分散剂应用于患者的肺
部。可用于喷雾干燥药物工业生产的设备由Buchi Ltd.或Niro Corp.制造。
[0265] 至少一个蛋白支架在本文所述的稳定或保存的制剂或溶液中,可根据本发明,经由各种递送方法给予患者,包括SC或IM注射;透皮,肺,经粘膜,植入物,渗透泵,药盒,微型泵,或技术人员认可的其他方法。如本领域熟知的。
[0266] 治疗应用本发明也提供一种使用至少一个本发明的蛋白支架在细胞、组织、器官、动物,或患者
中调节或治疗疾病的方法,如本领域已知的或如在此描述的,例如用治疗有效量的蛋白支
架给予或接触细胞、组织、器官、动物,或患者。本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物,或患者中调节或治疗疾病(包括,但不限于恶性疾病)的方法。
[0267] 本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种恶性疾病的方法,包括,但不限于至少一种以下的疾病:白血病、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性淋巴细胞白血病、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、急性骨髓性白血病,慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病,骨髓增
生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤,卡波济氏肉瘤,结肠直肠癌,胰腺癌、鼻咽癌,恶性组织细胞增生症,副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈部癌、遗传性非息肉病癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌,非小细胞肺癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,肾细胞癌,睾丸癌、腺癌,肉瘤,恶性黑色素瘤,血管瘤,转移性疾病,癌症相关骨吸收,癌症相关骨痛等。
[0268] 本发明的任何方法可包括将包含至少一个蛋白支架的有效量的组合物或药物组合物给予需要这样的调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这样一种方法可任选地进一步包括共同给药或组合疗法以供治疗这样的疾病或障碍,其中所述至少一个蛋白
支架、特定的部分或其变体的给予,进一步包括之前、同时和/或之后给予至少一种选自烷
化剂、有丝分裂抑制剂,和放射性药物中的至少一种。合适的剂量是本领域熟知的。见例如,Wells et al., eds., 药物治疗手册(Pharmacotherapy Handbook), 第二版, Appleton
和Lange,  Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket 
Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. 
(2000); Nursing 2001 药物手册(Handbook of Drugs), 21st版, Springhouse Corp., 
Springhouse, Pa., 2001; 卫生专业药物指南(Health Professional’s Drug Guide) 
2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, 
N.J.,其中的各个参考文献通过引用全部并入本文。
[0269] 优选的剂量可任选地包括约0.1-99和/或100-500 mg/kg/给予,或任何范围、值或其分数,或达到约0.1-5000 μg/ml血清浓度每单次或多次给予的血清浓度,或任何范围、值或其分数。对于本发明的蛋白支架的优选剂量范围是从约1 mg/kg,至多约3、约6或约12 
mg/kg患者体重。
[0270] 做为选择,给予的剂量可能会有所不同,这取决于已知的因素,如特定药物的药效学特征及其给药方式和给药途径;的年龄、健康和体重;症状的性质和程度,合并治疗的种
类,治疗的频率和期望的效果。通常活性成分的剂量可以是约0.1-100毫克每千克体重。普
通地,0.1-50,和优选0.1-10毫克每千克每次给予或缓慢释放的形式对获得期望的结果是
有效的。
[0271] 作为一个非限制性实例,人或动物的治疗可作为至少一个本发明的蛋白支架的1次或定期剂量提供,每天约0.1-100 mg/kg或任何范围、值或其分数,在第1-40天中至少有
一天,或者,做为选择或此外,在第1-52周中至少有一天,或者做为选择或此外,1-20年中至少有一天,或其任何组合,使用单次、输注或重复剂量。
[0272] 适合于内部给予的剂型(组合物)通常每单位或容器含有从约0.001毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中,活性成分将普通地以基于组合物总重量约0.5-
99.999%重量的量存在。
[0273] 对于胃肠外给予,蛋白支架可配制为溶液、悬浮液、乳剂、颗粒、粉末或冻干粉,与药学上可接受的胃肠外媒介组合,或单独提供。这样的媒介的实例有水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液,和约1-10%人血清白蛋白。脂质体和非水媒介,如固定油,也可以使用。媒介或冻干粉末可含有保持等渗性(如,氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如,缓冲剂和防腐剂)的添加剂。制剂用已知的或合适的技术灭菌。
[0274] 合适的药物载体被描述于最新版本的Remington’s药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences), A. Osol,一本本领域的标准参考书。
[0275] 可供选择的给药依据本发明可采用许多已知的和已开发的模式给予药物有效量的至少一个依据本发
明的蛋白支架。虽然在下面的描述中使用了肺给药,根据本发明,可以使用其他给予方式,
并取得适当的效果。本发明的蛋白支架可在载体中递送,作为溶液、乳液、胶体或悬浮液,使用在此描述的或本领域已知的各种适合吸入或其他方式给药的装置和方法的任何一种。
[0276] 胃肠外制剂和给药对于胃肠外给予的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚烷二醇,如聚乙二
醇、植物油、氢化等。用于注射的水性或油性悬浮液可根据已知的方法,使用适当的乳化
剂或增湿剂和悬浮剂来制备。用于注射的试剂可以是无毒的、非口服的稀释剂,如水溶液、
无菌注射液或在溶剂中的悬浮液。作为合适的介质或溶剂,水、林格氏溶液、等渗盐水等是
允许的;作为普通溶剂或悬浮溶剂,可使用无菌的非挥发油。为了这些目的,可以使用任何
种类的非挥发油和脂肪酸,包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸;天然或合成或半合
成单-或二-或三-甘油酯。胃肠外给予是本领域已知的并包括,但不限于传统的注射方式,
一种如在美国专利号5,851,198中描述的气体加压无针注射装置,和如在美国专利号5,
839,446中描述的激光射孔器装置,通过引用全部并入本文。
[0277] 可供选择的递送本发明进一步涉及通过胃肠外、皮下、肌肉、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、
软骨内、腔内、体腔颈内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内,胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内,肾内、视网膜内、椎管内、滑膜腔内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、团状、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径给予至少一个蛋白支架。至少一个蛋白支架组合物可被制备用于胃肠外(皮下、肌肉或静脉)或任何其他给药方
式,特别是以液体溶液或悬浮液的形式;用于阴道或直肠给予方式,特别是以半固体的形
式,例如,但不限于乳膏和栓剂;用于口腔或舌下给药,例如,但不限于片剂或胶囊的形式;
或鼻内,例如,但不限于粉末、滴鼻剂、喷雾剂或某些制剂的形式;或经皮,如不限于凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或具有化学促进剂例如二甲亚砜以或者改变皮肤结构或者增加透皮贴剂
的药物浓度的贴剂递送系统(Junginger, et al. In “药物渗透增强(Drug Permeation 
Enhancement)”; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 
1994,通过引用全部并入本文),或使用氧化剂,其能使含有蛋白和肽的制剂应用在皮肤上
(WO 98/53847),或应用电场以建立瞬态传输路径,如电穿孔,或增加带电药物通过皮肤的
移动性,如离子导入,或声波的应用,如声纳电泳(美国专利号4,309,989和4,767,402) 
(以上出版物和通过引用全部并入本文)。
[0278] 肺/鼻给予对于肺给药,优选地,至少一个蛋白支架组合物以颗粒大小递送到达肺或鼻窦的下气
道是有效的。依据本发明,至少一个蛋白支架可由本领域已知的任何一种吸入或鼻腔装置
递送,用于吸入治疗剂。能够在患者的窦腔或肺泡内沉积雾化的制剂的这些装置包括计量
剂量吸入器,雾化器,干粉发生器,喷雾器等。其他适用于指引蛋白支架的肺或鼻给药的装
置也是本领域已知的。所有这样的装置可使用适用于给予在气溶胶中分布蛋白支架的制
剂。这样的气溶胶可包含或者溶液(水性和非水性两种溶液)或者固体颗粒。
[0279] 计量剂量吸入器如Ventolin计量剂量吸入器,通常使用推进剂气体,在吸气时需要驱动(见例如,WO 94/16970, WO 98/35888)。干粉吸入器像Turbuhaler™ (Astra)、
Rotahaler®  (Glaxo)、Diskus®  (Glaxo)、Spiros™ 吸入器  (Dura),由Inhale 
Therapeutics销售的装置,和Sp吸入器®粉末吸入器(Fisons),使用混合粉末的呼吸驱动
(美国专利号4,668,218 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo、WO 94/08552 
Dura、美国专利号5,458,135 Inhale、WO 94/06498 Fisons,通过引用全部并入本文)。喷雾器像AERx™ Aradigm,Ultravent®喷雾器(Mallinckrodt),和Acorn II®喷雾器
(Marquest Medical Products) (美国专利号5,404,871 Aradigm,WO 97/22376),以上参
考文献通过引用并入本文,从溶液产生气溶胶,而计量剂量吸入器、干粉吸入器等生成小颗
粒气溶胶。这些商业上可获得的吸入装置的具体例子旨在代表适合于本发明实践的特定装
置,且并不是为了限制本发明的范围。
[0280] 优选地,包含至少一个蛋白支架的组合物通过干粉吸入器或喷雾器递送。吸入装置有几个理想的特性,用于给予至少一个本发明的蛋白支架。例如,吸入装置的递药可靠,
重复性好,准确性高。为了良好的呼吸适合性,吸入装置可任选地递送小干燥颗粒,例如少
于约10 μm,优选约1-5 μm。
[0281] 给予作为喷雾剂的蛋白支架组合物包含蛋白支架组合物的喷雾剂可通过在压力下强制至少一种蛋白支架的悬浮液或溶
液通过喷嘴而产生。可以选择喷嘴的尺寸和结构、施加的压力和液体进给率来达到预期的
输出和粒度。例如,电喷雾可以通过与毛细管或喷嘴进料有关的电场产生。有利地,由喷雾
器递送的至少一个蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10 μm,优选在约1 μm至约5 μm,且最优选约2 μm至约3 μm的范围内的粒度。
[0282] 适用于喷雾器的至少一个蛋白支架组合物的制剂通常包括蛋白支架组合物的水溶液,其浓度为约0.1 mg至约100 mg的至少一个蛋白支架组合物每mL溶液或mg/gm,或其中
的任何范围、值,或分数。制剂可包括试剂,例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂,且优选锌。制剂也可包括赋形剂或用于稳定蛋白支架组合物的试剂,例如缓冲剂、还原
剂、大体积蛋白,或是碳水化合物。可用于配制蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精
蛋白等。可用于配制蛋白支架组合物的典型碳水化合物包括蔗糖,甘露醇,乳糖,海藻糖,葡萄糖等。蛋白支架组合物制剂也可包括表面活性剂,其可减少或防止在形成气溶胶中溶液
雾化引起的蛋白支架组合物表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂,如聚氧乙烯脂
肪酸酯和醇,和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和14%重量之间的
范围内。为了本发明目的,特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨
醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域已知的用于配制蛋白,如蛋白支架,或特定的部分或变体
的另外的试剂也可包括在制剂中。
[0283] 用喷雾器给予蛋白支架组合物本发明的蛋白支架组合物可通过喷雾器给予,如喷射雾化器或超声波雾化器。通常地,
在喷射雾化器中,压缩空气源被用来制造高速空气射流通过孔板。当气体在喷嘴外膨胀时,
产生低压区,这迫使蛋白支架组合物的溶液通过连接到贮液器的毛细管被抽出。从毛细管
流出的液体流被剪切成不稳定的细丝和液滴,当它离开管时,产生气溶胶。可以使用一系列
的配置、流速和挡板类型来实现给定的喷射雾化器所需的性能特性。在超声波雾化器中,高
电能被用来产生振动,机械能,典型使用压电换能器。这种能量被直接或通过耦合流体
递到蛋白支架组合物的制剂中,创建包含蛋白支架组合物的气溶胶。有利地,由雾化器递送
的蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10 μm,优选约1 μm至约5 μm,且最优选约2 μm至约3 μm的范围内的粒度。
[0284] 适用于雾化器,无论是喷射雾化器还是超声波雾化器的至少一个蛋白支架的制剂,通常包括浓度约0.1 mg至约100 mg的至少一个蛋白支架每mL溶液。制剂可包括试剂,例
如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂,且优选锌。制剂也可包含赋形剂或稳定至少一个蛋白支架组合物的试剂,例如缓冲剂、还原剂、散装蛋白,或碳水化合物。可用于配制至少一个蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精蛋白等。可用于配制至少一个蛋白支
架的典型的碳水化合物包含蔗糖,甘露醇,乳糖,海藻糖,葡萄糖等。至少一个蛋白支架制剂也可包括表面活性剂,其可减少或防止在形成气溶胶中溶液雾化引起的至少一个蛋白支架
表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂,如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇,和聚氧乙烯山梨
醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和4%重量之间的范围内。为了本发明目的,特别
优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领
域已知的用于配制蛋白,如蛋白支架的另外的试剂也可包括在制剂中。
[0285] 用计量剂量吸入器给予蛋白支架组合物在计量剂量吸入器(MDI)中,推进剂、至少一个蛋白支架,和任何赋形剂或其它添加剂
作为一种混合物包含在罐内,其中包含液化压缩气体。计量的驱动作用将混合物释放为
气溶胶,优选地含有在少于约10 μm,优选约1 μm至约5 μm,且最优选约2 μm至约3 μm的大小范围内的颗粒。所需的气溶胶粒度可通过使用蛋白支架组合物的制剂而获得,由本领域
技术人员已知的各种方法,包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点凝结等产生。优选的计量剂量
吸入器包括由3M或Glaxo制造的那些并使用氢氟碳化合物推进剂。用于计量剂量装置吸入
器的至少一种蛋白支架的制剂将一般包含细分散粉末,其含有至少一个蛋白支架作为在
非-水性培养基中的悬浮液,例如,在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是
用于此目的的任何常规材料,如氯氟烃、氢氯氟烃、氟烃,或烃,包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a (氢氟烷烃-134a)、HFA-227 (氢氟烷
烃-227)等。优选地,推进剂是氟烃。可选择表面活性剂以稳定至少一个蛋白支架作为在推
进剂中的悬浮液,保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包含脱水山梨醇三油酸
酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况下,溶液气溶胶优先使用溶剂,如乙醇。用于蛋白制剂的本领域已知的另外的试剂也可包括在制剂内。本领域普通技术人员将认识到,本发明的
方法可经由此处未描述的装置,将至少一个蛋白支架组合物经肺给予实现。
[0286] 口服制剂和给药用于口服给予的制剂依赖于共同给予辅助剂(如,间苯二酚和非离子表面活性剂,如聚
氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚),以人为地增加肠壁的通透性,以及酶抑制剂的共同
给予(如,胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶)以抑制酶降解。用于递送亲
水剂的制剂,包括蛋白和蛋白支架以及至少两种表面活性剂的组合,打算用于口腔、粘膜、
鼻腔肺、阴道跨膜,或直肠给予,讲述于美国专利号6,309,663中。口服用固体剂型的活性成分化合物可与至少一种添加剂混合,包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物,和甘油。这些剂型也可含有其它类型的添加剂,例
如,非活性稀释剂、润滑剂、如硬脂酸镁、对羟基本甲酸酯、保水剂,如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚,抗氧化剂,如半胱氨酸,崩解剂,粘合剂,增稠剂,缓冲剂,甜味剂,调味剂,香料。
[0287] 片剂和丸剂可被进一步加工成包肠衣的制剂。用于口服给予的液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和考虑到医学应用的溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于上述领
域的不活跃稀释剂,例如水。脂质体也被描述为胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号
4,239,754)。最近,混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物微球已被用于递送药物(美国专利号
4,925,673)。此外,在美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中描述的并用来口服
递送生物活性剂的载体化合物是本领域已知的。
[0288] 粘膜制剂和给药用于口服包封在一种或多种生物相容性聚合物或共聚物赋形剂(优选可生物降解的聚
合物或共聚物)中的生物活性剂,由于所合成的微胶囊的适当尺寸而提供的微胶囊,导致药
物到达并被毛囊淋巴聚集物吸收,也称为动物的“集合淋巴小结(Peyer's patch)”或
“GALT”,而不会因药物通过胃肠道而失效。类似的毛囊淋巴聚集物可在支气管(BALT)和大
肠中被发现。上述组织一般称为粘膜相关淋巴网组织(MALT)。为了通过粘膜表面吸收,给予
至少一个蛋白支架的组合物和方法包括由多个亚微米粒子、粘液粘附大分子、生物活性肽
和水连续相组成的乳液,其通过实现乳化液颗粒的粘结作用,促进通过粘膜表面的吸收(美
国专利号5,514,670)。适用于本发明的乳剂应用的粘液表面可包括膜、结膜、口、舌下、
鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给予的制剂,例如,栓剂,可含有赋形剂,例如聚烷二醇、凡士林、可可脂等。鼻内给予的制剂可以是固体并含有赋形剂,例如,乳糖或可以是水或含油的滴鼻液。对于粘膜给药,赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸、预凝胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。
[0289] 透皮制剂和给予对于透皮给药,至少一个蛋白支架被封装在递送装置中,如脂质体或聚合物纳米粒子、
微粒、微胶囊或微球(统称为微粒,除非另有说明)。许多合适的装置是已知的,包括由合成
聚合物组成的微粒,如聚羟基酸,如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物,聚原酸酯、多元酸酐、聚磷腈(polyphosphazenes)和天然聚合物,如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白、藻酸
盐和其它聚糖,及其组合(美国专利号5,814,599)。
[0290] 长期给药和制剂将本发明的化合物在延长的时间段递送至受试者可能是可取的,例如,为期一周至一
年的单次给药。可使用各种缓释剂、贮库或植入物剂型。例如,剂型可含有药学上可接受的
化合物的非-毒性盐,其在体液中的溶解度低,例如(a) 与多元酸,如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、扑酸、藻酸,聚谷氨酸,萘单或二磺酸,聚半乳糖醛酸等所成的酸加成盐;(b) 与多价金属阳离子,如锌、钙、铋、钡、镁、、钴、镍、镉等,或与从如,N,N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子所成的盐;或(c) (a)和(b)的组合,例如,单宁酸锌盐。此外,本发明的化合物,或者最好是一种相对不溶的盐,如刚才所述的盐,可在凝胶中配制,例如
单硬脂酸铝凝胶,配以芝麻油,适合注射用。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、扑酸盐等。
另一类用于注射的缓慢释放贮库制剂将含有分散在缓慢降解、无毒、无抗原聚合物中以供
包封的化合物或盐,例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物例如,如在美国专利号3,773,919中所述。
化合物或优选相对不溶的盐,例如上述的那些,也可以在胆固醇基质橡胶颗粒中配制,特
别是在动物中使用。另外的缓慢释放,贮库或植入制剂,例如气体或液体脂质体,是在文献
这已知的(美国专利号5,770,222和“缓释和控释给药系统(Sustained and Controlled 
Release Drug Delivery Systems)”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., 
N.Y., 1978)。
[0291] 作为过继性细胞疗法的修饰细胞的输注本公开内容提供表达一个或多个本公开内容的CAR和/或CARTyrin的修饰细胞,其已经
选择和/或扩增以供给予有需要的受试者。本公开内容的修饰细胞可被配制以供在任何温
度(包括室温和体温)下储存。本公开内容的修饰细胞可被配制以供冷冻保存和随后的解
冻。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中配制,以指导从无菌包装给予受试
者。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中与细胞成活力和/或CAR/CARTyrin
表达水平的指示剂一起配制,以确保最小水平的细胞功能和CAR/CARTyrin表达。本公开内
容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中以规定的密度与一个或多个试剂配制,以抑制剂
进一步扩增和/或防止细胞死亡。
[0292] 诱导型前凋亡多肽本公开内容的诱导型前凋亡多肽优于现有的诱导型多肽,因为本公开内容的诱导型前
凋亡多肽是免疫原性极其低的。虽然本公开内容的诱导型前凋亡多肽是重组体多肽,因此,
经重组产生本公开内容的诱导型前凋亡多肽的非-天然存在的序列不包含宿主人免疫系统
可识别为“非-自身”的非-人序列,从而在接受本公开内容的诱导型前凋亡多肽,包含诱导
型前凋亡多肽的细胞或包含诱导型前凋亡多肽的组合物或包含诱导型前凋亡多肽的细胞
的受试者中诱导免疫反应。
[0293] 本公开内容提供包含配体结合区、接头,和前凋亡肽的诱导型前凋亡多肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,非-人序列包含限切酶位点。在某些
实施方案中,前凋亡肽是半胱天冬酶多肽。在某些实施方案中,半胱天冬酶多肽是半胱天冬
酶9多肽。在某些实施方案中,半胱天冬酶9多肽是截短的半胱天冬酶9多肽。本公开内容的
诱导型前凋亡多肽可以是非-天然存在的。
[0294] 本公开内容的半胱天冬酶多肽包括,但不限于半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶
9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12,和半胱天冬酶14。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括,但不限于那些与细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽,包括半胱天冬酶2、半胱天
冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9,和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括,但不限于那些与初始细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽,包括半
胱天冬酶2、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9,和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括,但不限于那些执行凋亡的半胱天冬酶多肽,包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶6,和半胱天
冬酶7。
[0295] 本公开内容的半胱天冬酶多肽与野生型氨基酸或核酸序列相比,可由具有一个或多个修饰的氨基酸或核酸序列编码。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可以是
优化的密码子。对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一个或多个修
饰可增加相互作用、交联、交叉激活,或本公开内容的半胱天冬酶多肽的激活(与野生型氨
基酸或核酸序列比较)。做为选择,或者另外地,对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸
和/或核酸序列的一个或多个修饰可降低本公开内容的半胱天冬酶多肽与野生型氨基酸或
核酸序列相比的免疫原性。
[0296] 与野生型半胱天冬酶多肽比较,本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是截短的。例如,半胱天冬酶多肽可被截短以消除编码半胱天冬酶激活和招募结构域(CARD)的序列,以
除了在包含本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽的细胞中引发细胞凋亡外,还消除或尽量
减少激活局部炎症反应的可能性。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可剪接,
以形成本公开内容的半胱天冬酶多肽的变异氨基酸序列(与野生型半胱天冬酶多肽比较)。
本公开内容的半胱天冬酶多肽可由重组体和/或嵌合序列编码。本公开内容的重组和/或嵌
合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个不同的半胱天冬酶多肽的序列。可供选择地,或
者另外,本公开内容的重组和/或嵌合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个物种的序列
(如人序列和非-人序列)。本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是非-天然存在的。
[0297] 本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体结合区可包括任何多肽序列,其利于或促进第一个本公开内容的诱导型前凋亡多肽与第二个本公开内容的诱导型前凋亡多肽的二
聚,二聚作用激活或诱导前凋亡多肽的交联和诱导细胞凋亡。
[0298] 配体-结合(“二聚”)区可包含任何多肽或其功能结构域,其将允许使用天然或非天然配体(即和诱导剂)引入,例如,非天然合成配体。配体-结合区可能是细胞膜的内部或
外部,取决于诱导型前凋亡多肽的性质和配体(即诱导剂)的选择。广泛种类的配体-结合多
肽及其功能结构域,包括受体,是已知的。本公开内容的配体-结合区可包括来自受体的一
个或多个序列。特别令人感兴趣的是配体结合区,其中配体(例如,小的有机配体)是已知的
或可能容易产生。这些配体-结合区或受体可包括,但不限于,FKBPs和亲环蛋白受体、甾体
受体、四环素受体等,以及“非天然”受体,其可从抗体,特别是其重链或轻链亚单位、突变序列、经随机过程得到的随机氨基酸序列、组合合成等而获得。在某些实施方案中,配体-结合区选自FKBP配体-结合区、亲环蛋白受体配体-结合区、甾体受体配体-结合区、亲环蛋白受
体配体-结合区,和四环素受体配体-结合区。
[0299] 包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以有至少约50个氨基酸,和少于约350个氨基酸,通常少于200个氨基酸,或者作为天然结构域或其截短的活性部分。结合区可
以例如是小的(< 25 kDa,允许在病毒载体中有效转染)、单体的、非免疫的、具有易于合成
的、细胞可渗透的、无毒的配体,其可配置用于二聚。
[0300] 包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以在细胞内或细胞外,取决于 诱导型前凋亡多肽的设计和适宜的配体(即诱导剂)的可利用性。对于疏水性配体,结合区可以
是在膜的任一面上,但对于亲水性配体,特别是蛋白配体,结合区将通常是在细胞膜的外
面,除非有一种转运系统将配体以一种可供结合的形式内化。对于细胞内受体,包含诱导型
前凋亡多肽的诱导型前凋亡多肽或转座子或载体可编码信号肽和受体结构域序列的跨膜
结构域5′或3′或可具有受体结构域序列的脂质附着信号序列5′。当受体结构域是在信号肽和跨膜结构域之间,受体结构域将是在细胞外。
[0301] 抗体和抗体亚单位,例如重链或轻链,特别是片段,更特别是所有或部分的可变区,或重链和轻链的融合以建立高-亲和性结合,可用作本公开内容的配体结合区。设想中
的抗体包括为外生表达的人类产物的抗体,如胞外结构域,它不会引起免疫反应,通常不会
在周围(即,CNS/脑区外)表达。这样的实例包括,但不限于低亲和力神经生长因子受体
(LNGFR),和胚胎表面蛋白(即癌胚抗原)。此外,还可以制备抗触觉分子的抗体,其在生理上可以接受的,以及筛选出的个体抗体亚基的结合亲和力。cDNA编码亚单位可通过缺失恒定
区、可变区的部分、可变区的突变等分离和修饰,以获得对配体具有适当亲和力的结合蛋白
结构域。这样,几乎任何生理上可以接受的触觉化合物都可以用作配体或为配体提供一个
表位。可以用天然受体代替抗体单位,其中结合区或结构域是已知的,并且有一个有用的或
已知的配体来结合。
[0302] 为使受体多聚化,对于诱导型前凋亡多肽的配体-结合区/受体结构域的配体可能是多聚体,因为在这个意义上,配体可有至少两个结合位点,每个结合位点都能够结合于配
体受体区(即配体具有能够结合第一个诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第一个结合位
点和能够结合诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第二个结合位点,其中第一个和第二个
诱导型前凋亡多肽的配体-结合区是相同或不同的)。因此,如本文所用的,术语“多聚体配
体结合区”指结合于多聚体配体的本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体-结合区。本公开
内容的多聚体配体包括二聚配体。本公开内容的二聚配体可具有两个能够结合配体受体结
构域的结合位点。在某些实施方案中,本公开内容的多聚体配体是二聚体或高阶低聚物,通
常由小的合成有机分子组成的不大于约四聚的配体,单个分子通常是至少约150 Da和少于
约5 kDa,通常少于约3 kDa。可以使用多种合成配体和受体对。例如,在涉及天然受体的实
施方案中,二聚FK506可与FKBP12受体一起使用,二聚环孢菌素A可与亲环蛋白受体一起使
用,二聚雌激素与雌激素受体、二聚糖皮质激素与糖皮质激素受体、二聚四环素与四环素受
体、二聚维生素D与维生素D受体等。另外,也可以使用高阶配体,例如,三聚体。对于涉及非天然受体的实施方案,例如抗体亚单位、修饰的抗体亚单位、由重链和轻链可变区串联而成
的单链抗体,由柔性接头分开,或修饰受体,及其突变列等,可用于多种化合物中的任何一
种。包含本公开内容的多聚体配体的单元的一个显著特征是,各个结合位点能够以高亲和
力结合受体,且优选地,它们能够在化学上二聚化。同样,所述方法可用来平衡配体的疏水
性/亲水性,以便它们能够以功能水平溶解在血清中,而在大多数应用中则能扩散越过质
膜。
[0303] 本公开内容的诱导型前凋亡多肽的激活可通过例如,由诱导剂介导的化学诱导的二聚(CID)完成,以产生一种条件控制的蛋白或多肽。由于不稳定的二聚化剂的降解或单聚
竞争抑制剂的使用,本公开内容的前凋亡多肽不仅是诱导型的,而且这些多肽的诱导也是
可逆的。
[0304] 在某些实施方案中,配体结合区包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中,配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)的FKBP12多
肽。在某些实施方案中,其中配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) 
(F36V)的FKBP12多肽,诱导剂可包含AP1903、合成药物(CAS索引名:2-哌啶羧酸, 1-[(2S)-
1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-, 1,2-乙烷二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙烷二
基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*
[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登记号:195514-63-7;分子式:C78H98N4O20;分子量:
1411.65))。在某些实施方案中,其中配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨
酸(F) (F36V)的FKBP12多肽,诱导剂可包含AP20187 (CAS登记号:195514-80-8和分子式:
C82H107N5O20)。在某些实施方案中,诱导剂是AP20187同系物,例如,AP1510。如本文所用
的,诱导剂AP20187、AP1903和AP1510可互换使用。
[0305] AP1903 API由Alphora Research Inc.产生,而用于注射的AP1903药品由Formatech Inc制造。它被配制为AP1903在非-离子增溶剂Solutol HS 15 (250 mg/mL, 
BASF)的25%溶液中的5 mg/mL溶液。在室温,这个制剂是稍显黄色的澄清溶液。在制冷时,这个制剂经历了可逆的相变,形成了乳白色的溶液。这种相变在再加热到室温时被逆转。在3 
mL玻璃小瓶中装入2.33 mL (每小瓶注射总共大约10 mg AP1903)。在确定给予AP1903的需
要量时,患者可以例如,在2小时内,使用一种非-DEHP、非-环氧乙烷消毒输液器,经由IV输注注射(0.4 mg/kg)给予单次固定剂量的AP1903。对所有患者的AP1903的剂量分别计算,且
不再重新计算,除非体重波动≧10%。经计算的剂量在100 mL的0.9%正常盐水中稀释,然后
输注。在AP1903的先前的I期研究中,24名健康志愿者用注射单剂量的AP1903治疗,以0.01、
0.05、0.1、0.5和1.0 mg/kg的剂量水平经IV输注2小时。AP1903血浆水平与剂量成正比,平
均Cmax值在大约10-1275 ng/mL剂量范围内,约为0.01-1.0 mg/kg。初始输注期后,血液浓
度显示出快速的分布期,血浆水平在给药后0.5、2和10小时分别减少至大约18、7和1%最大
浓度。对于注射而言,AP1903显示在所有剂量水平都是安全和耐受性好的,并显示出良好的
药动学特征。Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001。
[0306] 供注射用的AP1903的固定剂量,例如,可以是0.4 mg/kg,静脉内输注2小时。细胞有效信号转导所需的体外AP1903的量是10-100 nM (1600 Da MW)。这等于16-160 μg/L或˜
0.016-1.6 μg/kg (1.6-160 μg/kg)。高达1 mg/kg的剂量在上述AP1903的I期研究中是良
好耐受的。因此,0.4 mg/kg可以是AP1903用于与治疗细胞组合的这个I期研究的安全有效
的剂量。
[0307] 与野生型氨基酸或核酸序列相比,本公开内容的编码配体结合的氨基酸和/或核酸序列可含有序列一个或多个修饰。例如,本公开内容的氨基酸和/或核酸序列编码配体结
合区可以是密码子-优化的序列。与野生型多肽比较,一个或多个修饰可增加配体(如诱导
剂)对本公开内容的配体结合区的结合亲和力。做为选择,或者另外地,与野生型多肽比较,一个或多个修饰可降低本公开内容的配体结合区的免疫原性。本公开内容的配体结合区
和/或本公开内容的诱导剂可以是非-天然存在的。
[0308] 本公开内容的诱导型前凋亡多肽包含配体结合区,接头和前凋亡肽,其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中,非-人序列包含限切酶位点。接头可包含
允许配体结合区二聚、相互作用、交联、交叉激活,或激活前凋亡多肽的任何有机或无机材
料,以致前凋亡多肽的相互作用或激活启动细胞凋亡。在某些实施方案中,接头是多肽。在
某些实施方案中,接头是包含G/S富含氨基酸序列(“GS”接头)的多肽。在某些实施方案中,接头是包含氨基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 25)的多肽。在优选的实施方案中,接头是多
肽,编码多肽的核酸不含限制性内切酶的限切酶位点。本公开内容的接头可以是非-天然存
在的。
[0309] 本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够引发和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在细胞中的表达的转录调节下,在细胞中表达。如本文所用的术语“启
动子”指用作启动对RNA聚合酶的结合位点以转录基因的启动子。例如,本公开内容的诱导
型前凋亡多肽可在能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在哺乳动物细胞中
的表达的任何启动子的转录调节下,在哺乳动物细胞中表达,包括,但不限于天然的、内源
的、外源的,和异源的启动子。优选的哺乳动物细胞包括人细胞。因此,本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在人细胞
中的表达的任何启动子的转录调节下,在人细胞中表达,包括,但不限于人启动子或病毒性
启动子。人细胞中表达的示例性启动子包括,但不限于,人巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因
启动子、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长端重复、β-肌动蛋白启动子、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶启动子,其中的每一个可被用来获得高水平表达的本公开内容
的诱导型前凋亡多肽。也考虑了使用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体
启动子,以达到本公开内容的诱导型前凋亡多肽的表达,只要表达水平足以引发细胞凋亡。
通过使用具有熟知的特性的启动子,可以优化转染或转化后感兴趣蛋白的表达水平和表达
模式。
[0310] 选择响应特定生理或合成信号而调节的启动子可允许本公开内容的诱导型前凋亡多肽的诱导型表达。蜕皮激素系统(ecdysone system) (Invitrogen, Carlsbad, 
Calif.)就是一个这样的系统。这种系统被设计以允许相关基因在哺乳动物细胞中的调节
表达。它由一种严格调控的表达机制组成,几乎不允许转基因的基础水平表达,但是超过
200倍的可诱导性。系统是建立在果蝇(Drosophila)异二聚体蜕皮激素受体的基础上的,且
当蜕皮激素或类似物例如muristerone A结合受体时,受体激活启动子,以启动mRNA转录子
的下游转基因高水平的表达。在该系统中,异二聚体受体的两个单体由一个载体构成表达,
而蜕皮激素-反应性启动子,其驱动感兴趣基因的表达,位于另一个质粒上。因此,将这种类型的系统设计成感兴趣的载体可能是有用的。另一个可能有用的诱导型系统是Tet-Off™
或Tet-On™系统(Clontech, Palo Alto, Calif.),最早由Gossen and Bujard (Gosse 
and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., 
Science, 268:1766-1769, 1995)开发。这种系统还允许对四环素或四环素衍生物如多西
环素的反应来调节高水平的基因表达。在Tet-On™系统中,基因表达在多西环素的存在下
开启,而在Tet-Off™系统中,基因表达在多西环素的不存在下开启。这些系统是基于从大
肠杆菌的四环素抗药性操纵子衍生出的两个调节元件:四环素算符序列(四环素抑制剂结
合的序列)和四环素抑制剂蛋白。感兴趣的基因被克隆到启动子后面的质粒中,启动子中含
有四环素反应元件。第二个质粒含有称为四环素-受控反式激活剂的调节元件,其在Tet-
Off™系统中由源自单纯疱疹病毒和野生型四环素抑制剂的VP16结构域组成。因此在多西
环素的存在下,转录是构成性的。在Tet-On™系统中,四环素抑制剂不是野生型的,且在多
西环素的存在下激活转录。对于基因疗法载体生产,可使用Tet-Off™系统,以使细胞可以
在四环素或多西环素存在下培养产生,并防止潜在毒性转基因的表达,但当载体引入患者
时,基因表达将是构成性的。
[0311] 在某些情况下,需要调节转基因在基因治疗载体中的表达。例如,采用具有不同活性强度的不同病毒性启动子,这取决于期望水平的表达。在哺乳动物细胞中,CMV即刻早期
启动子常常被用来提供强的转录激活。CMV启动子在Donnelly, J. J., et al., 1997. 
Annu. Rev. Immunol. 15:617-48中有评述。当期望转基因的表达水平减少时,效力较差的
CMV启动子的修饰版本也被使用。当转基因在造血细胞中的表达是期望的情况下,通常采用
逆病毒性启动子例如来自MLV或MMTV的LTRs。取决于所需效果而使用的其它病毒性启动子
包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2 LTR,腺病毒启动子例如E1A、E2A,或MLP区,AAV LTR、HSV-TK,和禽肉瘤病毒。
[0312] 在其它例子中,启动子的选择可能受到发育调控,并且在特定的分化细胞中是活跃的。因此,例如,启动子在多能干细胞中可能不活跃,但是,例如,多能干细胞分化成更成熟的细胞,然后启动子可能被激活。
[0313] 类似地,组织特定启动子被用来在特定组织或细胞中进行转录,以减少对非-靶标组织的潜在的毒性或不需要的效应。这些启动子可导致与较强启动子例如CMV启动子比较
的表达减少,但也可导致更有限的表达,和免疫原性(Bojak, A., et al., 2002. 
Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31)。例如,组织
特定启动子例如PSA相关启动子或前列腺特异性腺激肽释放酶,或肌肉肌酸激酶基因,可酌
情使用。
[0314] 组织特异性或分化特异性启动子的例子包括,但不限于以下:B29 (B细胞);CD14 (单核细胞);CD43 (白细胞和血小板);CD45 (造血细胞);CD68 (巨噬细胞);肌间线蛋白
(肌肉);弹性蛋白酶-1 (胰腺腺泡细胞);内皮蛋白(内皮细胞);纤连蛋白(分化细胞、愈合
组织);和Flt-1 (内皮细胞);GFAP (星形胶质细胞)。
[0315] 在某些适应症中,在给予基因治疗载体后的特定时间激活转录是可取的。这是用那些激素或细胞因子可以调节的此类启动子来完成的。可使用的细胞因子和炎症蛋白应答
启动子包括K和T激肽原(Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), 
c-fos、TNF-α、C-反应性蛋白(Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 
3195-3207), 触珠蛋白(Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912),血清淀粉
状蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6 (Poli和Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 
86, 8202-8206),补体C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell。Biol., 6181-6191)、IL-
8,α-1酸糖蛋白(Prowse和Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂肪酶(Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988),血管紧张素原
(Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895),纤维蛋白原、c-jun (被佛波醇
酯诱导、TNF-α、UV辐射、维甲酸和过氧化氢)、胶原酶(佛波醇酯和维甲酸诱导的)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导型)、基质溶素(佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗-糜蛋白酶。其它启动子包括,例如,SV40、MMTV、人免疫缺陷病毒(MV)、莫罗尼病毒、ALV、爱泼斯坦-巴尔病毒、劳氏肉瘤病毒、人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白和肌酸。
[0316] 已设想上述任何一种启动子单独或与另一种启动子结合使用可能是有用的。选择启动子和其它调节元件以使它们在期望的细胞或组织发挥功能。此外,启动子的这个列表
不应视为是穷举的或限制性的;其它启动子与本文公开的启动子和方法一起使用。
实施例
[0317] 实施例1:P-BCMA-101 (a/k/a抗-BCMA CARTyrin (A08))的特征鉴定在编码CARTyrin的序列的mRNA电穿孔进入T细胞后,评价本公开内容的CARTyrin的表
达。CARTyrin-表达T细胞的功能通过针对肿瘤细胞系的脱粒法测量。特征进一步分析与功
能的相关性。
[0318] 图4描述A08抗-BCMA CARTyrin的结构。
[0319] 图5-8显示出P-BCMA-101 (编码A08抗-BCMA CARTyrin)的体外和体内特征。
[0320] A08 CARTyrin的体外评价显示出人原代T细胞慢病毒转导后高水平的表面表达和对抗BCMA+肿瘤细胞的强细胞毒作用(如增殖) (见图5A-C)。基于这个强烈的体外表现,对
A08 CARTyrin在体内发挥功能的能力进行了评价。
[0321] 图6描述了使用A08 CARTyrin用于小鼠的体内研究的治疗方案。这个研究的结果显示,用P-BCMA-101 (编码A08 CARTyrin)治疗的小鼠在第21天100%存活(见图7)。在接受
治疗的动物在第21天完全存活的同时,肿瘤负荷显示为零(如通过M-蛋白丰度所评价的,其
在第21天,在这些动物中未检测出) (见图7)。图8提供进一步说明在对照动物以及用P-
BCMA-101治疗的那些动物中的肿瘤负荷的一系列照片。表达A08 CARTyrin的动物与对照组
比较显示出肿瘤负荷减少。
[0322] 实施例2:piggyBac整合的iC9安全开关在人pan T-细胞中的表达和功能使用具有4个piggyBac转座子之一的Amaxa 4D细胞核转染液,对人pan T-细胞进行核
转染。用空piggyBac转座子对接受“模拟”条件的修饰的T细胞进行核转染。修饰的T细胞接
受含有单独治疗剂(编码CARTyrin的序列)的piggyBac转座子或者含有整合的iC9序列和治
疗剂(编码CARTyrin的序列)的piggyBac转座子。
[0323] 图8提供iC9安全开关的示意图,所述开关含有配体结合区、接头,和截短的半胱天冬酶9多肽。特别地,iC9多肽含有包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽(包括缬氨酸(V)取
代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V))的配体结合区。iC9多肽的FKBP12多肽由包含GVQVETISP
GDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGAT
GHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 23)的氨基酸序列编码。iC9多肽的FKBP12多肽由
包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTG
CATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGC
TGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGAC
CATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT 
GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 24)的核酸序列编码。iC9多肽的接头区由包含
GGGGS (SEQ ID NO: 25)的氨基酸和包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 26)的核酸序列
编码。编码iC9多肽的接头区的核酸序列由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVN
FCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQF
PGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEG
LRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYK
QMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 27)的氨基酸编码。编码iC9多肽的接头区的核酸序列由
包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCC
TGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATA
TTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAA
GAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTG
TCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGG
AGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGC
CTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAAC
CCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCA
CTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTG
GTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTG
GCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCT
TTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 28)的核酸序列编码。
[0324] 为测试iC9安全开关,4个修饰的T细胞的每一个与0、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM或1000 nM AP1903 (AP1903的诱导剂)一起培养24小时。使用7-原放线菌素D (7-AAD)、荧
光嵌入剂(作为细胞经历凋亡的标记),通过流式细胞术评价活力。
[0325] 细胞成活力在第12天评价(见图9)。数据显示出细胞群从右下象限迁移到左上象限,诱导剂在含有iC9构建体的细胞中的浓度逐渐增加;然而,这个效应在缺乏iC9构建体的
细胞(仅接受CARTyrin的那些)中未观察到,其中细胞在这两个区域均匀地分布,而与诱导
剂的浓度无关。而且,细胞成活力在第19天评价(见图10)。数据显示如在图9 (核转染后第
12天)所示的相同趋势;然而,在这个较晚的时间点(核转染后第19天),细胞群向左上象限
的迁移更为明显。
[0326] 对聚集结果进行了量化,如图11所示,显示在第12天(图9和左图)或第19天(图10和右图),iC9安全开关对细胞成活力百分比的显著影响,所述细胞成活力百分比作为每个
修饰细胞类型的iC9开关诱导剂(AP1903)的浓度的函数。iC9安全开关的存在到第12天在绝
大多数细胞中诱导细胞凋亡,到第19天效果甚至更显著。
[0327] 这个研究结果显示,iC9安全开关在与诱导剂(如AP1903)接触时,极其有效地消除活性细胞,因为AP1903即使在研究的最低浓度(0.1 nM)下也诱导细胞凋亡。此外,iC9安全
开关可以在功能上作为三顺反子载体的一部分表达。
[0328] 通过引用并入本文引用的每份文件,包括任何交叉参照的或相关的专利或申请通过引用以其整体并
入本文,除非明确排除或另有限制。任何文件的引用并不是承认它是关于在此公开或要求
的任何本发明的现有技术,或它单独,或与任何其它一个或多个参考文献组合,讲述、建议
或公开任何这样的发明。此外,在本文件中某一术语的任何含义或定义与以引用方式合并
的文件中同一术语的任何含义或定义达到冲突的程度时,将以本文件中指定给该术语的含
义或定义为准。
[0329] 其它实施方案虽然本公开内容的特定实施方案已作了说明和描述,各种其它改变和修饰可在不背离
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