多价的合成纳米载体疫苗
阅读：102发布：2021-03-18
专利汇可以提供多价的合成纳米载体疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 至少一部分涉及包含含不同组 抗原 的合成纳米载体的群的组合物以及相关方法。，下面是多价的合成纳米载体疫苗专利的具体信息内容。
1.一种组合物，包含：
一个剂型，包含：
一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；
一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及
一种药物学上可接受的赋形剂；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种类型的抗原。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该第二组表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种类型的抗原。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性属获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性属获得或衍生的抗原。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该第一感染性属与该第二感染性属相同。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性种获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性种获得或衍生的抗原。
7.如权利要求6所述的组合物，其中该第一感染性种与该第二感染性种相同。
8.如权利要求1-7中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性病毒株获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性病毒株获得或衍生的抗原。
9.如权利要求8所述的组合物，其中该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株相同。
10.如权利要求1-9中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下科的病毒获得或衍生的抗原：腺病毒科、细小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、反转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科或细小病毒科。
11.如权利要求10所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下病毒获得或衍生的抗原：腺病毒、柯萨奇病毒、A型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃-巴二氏病毒、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西方尼耳病毒、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、人类偏肺病毒、人类乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人类博卡病毒或细小病毒B19。
12.如权利要求11所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：VI、VII、E1A、E3-19K、52K、VP1、表面抗原、3A蛋白质、衣壳蛋白、核衣壳、表面突出物、跨膜蛋白、UL6、UL18、UL35、UL38、UL19、早期抗原、衣壳抗原、Pp65、gB、p52、潜伏的核抗原-1、NS3、包膜蛋白、包膜蛋白E2结构域、gp120、p24、脂肽Gag(17-35)、Gag(253-284)、Nef(66-97)、Nef(116-145)、Pol(325-355)、神经氨酸酶、核衣壳蛋白、基质蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神经氨酸酶、糖蛋白、E6、E7、包膜脂蛋白或非结构蛋白质(NS)。
13.如权利要求1-9中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下属的细菌获得或衍生的抗原：博德特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属和披衣菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏杆菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次体属、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属弧菌属或耶尔森氏菌属。
14.如权利要求13所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳杆菌、伯氏疏螺旋菌、牛布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉披衣菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏杆菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团杆菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓假单胞菌、立氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌或鼠疫耶尔森氏菌。
15.如权利要求14所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳毒素(PT)、丝状血球凝集素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、菌毛(FIM 2/3)、VlsE；DbpA、OspA、Hia、PrpA、MltA、L7/L12、D15、0187、VirJ、Mdh、AfuA、L7/L12、外膜蛋白、LPS、A型抗原、B型抗原、C型抗原、D型抗原、E型抗原、FliC、FliD、Cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氢盐-醛缩酶(FBA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)、延伸因子-G(EF-G)、假定蛋白(HP)、T毒素、类毒素抗原、荚膜多糖、蛋白质D、Mip、核蛋白(NP)、RD1、PE35、PPE68、EsxA、EsxB、RD9、EsxV、Hsp70、脂多糖、表面抗原、Sp1、Sp2、Sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引导蛋白质、荚膜蛋白质(F1)或V蛋白质。
16.如权利要求1-9中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下真菌获得或衍生的抗原：念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺囊虫属或葡萄穗霉菌属。
17.如权利要求16所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：白色念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌、罗氏隐球菌、浅白隐球菌、加特隐球菌、荚膜组织胞浆菌、伊氏肺囊虫或黑葡萄穗霉。
18.如权利要求17所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：表面抗原、荚膜糖蛋白、Yps3P、Hsp60、主要表面蛋白质、MsgC1、MsgC3、MsgC8、MsgC9或SchS34。
19.如权利要求1-3中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含从一种滥用的或上瘾的物质获得或衍生的抗原。
20.如权利要求19所述的组合物，其中该滥用的或上瘾的物质是可卡因或烟碱。
21.如权利要求1-20中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含相同的表面抗原，并且其中该第一组表面抗原的至少一种抗原所呈现的定向与该第二组表面抗原中所呈现的不同。
22.如权利要求1-20中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含相同的表面抗原，并且其中该第一组表面抗原的至少一种抗原所呈现的构象与该第二组表面抗原中所呈现的不同。
23.如权利要求1-20中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原的分子结构与该第二组表面抗原的不同。
24.如权利要求1-23中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
25.如权利要求1-24中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含表面抗原，这些表面抗原包含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子。
26.如权利要求25所述的组合物，其中该第一组表面抗原的至少一种表面抗原和/或该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
27.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含肽的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
28.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含肽的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
29.如权利要求28所述的组合物，其中该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
30.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
31.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
32.如权利要求31所述的组合物，其中该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
33.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
34.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
35.如权利要求34所述的组合物，其中该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
36.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
37.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
38.如权利要求37所述的组合物，其中该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
39.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
40.如权利要求24-26中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
41.如权利要求40所述的组合物，其中该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
42.如权利要求1-41中任何一项所述的组合物，另外包含一种或多种佐剂。
43.如权利要求42所述的组合物，其中该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到这些合成纳米载体上的佐剂。
44.如权利要求42或43所述的组合物，其中该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到这些合成纳米载体上的佐剂并且该组合物包含一种或多种混合的佐剂。
45.如权利要求42-44中任何一项所述的组合物，其中该一种或多种佐剂各自包含矿物盐、明矾、与肠细菌的单磷酰脂质(MPL)A、 (AS04)组合的明矾、AS15、皂甙、TM TM
QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX 、MF59 、 ISA51、 ISA
720、AS02、脂质体或脂质体配制品、AS01、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体、淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的衍生自细菌的外膜泡、壳聚糖颗粒、贮存形成剂、 嵌段共聚物、特异性修饰或制备的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、RC529、细菌类毒素、毒素片段、Toll样受体2、3、4、5、7、8或9的激动剂、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性DNA、免疫刺激性RNA、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、针对DC表面分子CD40的激动剂、类型I干扰素、聚I:C、细菌性脂多糖(LPS)、VSV-G、HMGB-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含CpG的免疫刺激性DNA分子、从坏死细胞释放的促发炎刺激物、尿酸盐晶体、补体级联的活化组分、免疫复合物的活化组分、补体受体激动剂、细胞因子或细胞因子受体激动剂。
46.如权利要求43-45中任何一项所述的组合物，其中这些佐剂是不同的。
47.如权利要求43-46中任何一项所述的组合物，其中该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含TLR-2、-3、-4、-7、-8或-9激动剂。
48.如权利要求47所述的组合物，其中该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、MPL、咪喹莫特或瑞喹莫德。
49.如权利要求44-48中任何一项所述的组合物，其中该混合的佐剂是包含CpG的免疫刺激性核酸、AS01、AS02、AS04、AS15、QS-21、皂甙、明矾或MPL。
50.如权利要求1-49中任何一项所述的组合物，其中该第一和该第二群合成纳米载体的存在量有效在一位受试者中对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原产生一种免疫应答。
51.如权利要求50所述的组合物，其中该免疫应答是产生对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
52.如权利要求1-51中任何一项所述的组合物，另外包含一种或多种另外的群的合成纳米载体，其中各另外的群的合成纳米载体包含一组表面抗原，该组表面抗原在结构上与该组合物中的其他组表面抗原不同。
53.如权利要求52所述的组合物，其中该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个另外包含一种偶合到其上的佐剂。
54.如权利要求53所述的组合物，其中该偶合到该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个上的佐剂与该组合物中的其他佐剂不同。
55.如权利要求1-54中任何一项所述的组合物，其中各组表面抗原是单价或低价组的表面抗原。
56.如权利要求52-55中任何一项所述的组合物，其中这些群的合成纳米载体的存在量有效对各组表面抗原产生一种免疫应答。
57.如权利要求56所述的组合物，其中该免疫应答是产生对各组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
58.如权利要求1-57中任何一项所述的组合物，其中该第一和/或该第二群的合成纳米载体另外包含一种偶合到其上的通用的T细胞抗原。
59.如权利要求58所述的组合物，其中该通用的T细胞抗原包含一种T辅助细胞抗原。
60.如权利要求59所述的组合物，其中该T-辅助细胞抗原包含一种从卵白蛋白获得或衍生的肽。
61.如权利要求60所述的组合物，其中该从卵白蛋白获得或衍生的肽包含如SEQ ID NO：1中所阐明的序列。
62.如权利要求58-61中任何一项所述的组合物，其中该通用的T细胞抗原通过封装来偶合。
63.一种组合物，包含：
一个剂型，包含：
一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；
一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及
一种药物学上可接受的赋形剂；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
64.如权利要求63所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种类型的抗原。
65.如权利要求63或64所述的组合物，其中该第二组表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、
9、10种或更多种类型的抗原。
66.如权利要求63-65中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性属获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性属获得或衍生的抗原。
67.如权利要求66所述的组合物，其中该第一感染性属与该第二感染性属相同。
68.如权利要求63-67中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性种获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性种获得或衍生的抗原。
69.如权利要求68所述的组合物，其中该第一感染性种与该第二感染性种相同。
70.如权利要求63-69中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原包含从第一感染性病毒株获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性病毒株获得或衍生的抗原。
71.如权利要求70所述的组合物，其中该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株相同。
72.如权利要求63-71中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下科的病毒获得或衍生的抗原：腺病毒科、细小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、反转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科或细小病毒科。
73.如权利要求72所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下病毒获得或衍生的抗原：腺病毒、柯萨奇病毒、A型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃-巴二氏病毒、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西方尼耳病毒、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、人类偏肺病毒、人类乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人类博卡病毒或细小病毒B19。
74.如权利要求73所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：VI、VII、E1A、E3-19K、52K、VP1、表面抗原、3A蛋白质、衣壳蛋白、核衣壳、表面突出物、跨膜蛋白、UL6、UL18、UL35、UL38、UL19、早期抗原、衣壳抗原、Pp65、gB、p52、潜伏的核抗原-1、NS3、包膜蛋白、包膜蛋白E2结构域、gp120、p24、脂肽Gag(17-35)、Gag(253-284)、Nef(66-97)、Nef(116-145)、Pol(325-355)、神经氨酸酶、核衣壳蛋白、基质蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神经氨酸酶、糖蛋白、E6、E7、包膜脂蛋白或非结构蛋白质(NS)。
75.如权利要求63-71中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下属的细菌获得或衍生的抗原：博德特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属和披衣菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏杆菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次体属、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属弧菌属或耶尔森氏菌属。
76.如权利要求75所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳杆菌、伯氏疏螺旋菌、牛布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉披衣菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏杆菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团杆菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓假单胞菌、立氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌或鼠疫耶尔森氏菌。
77.如权利要求76所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳毒素(PT)、丝状血球凝集素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、菌毛(FIM 2/3)、VlsE；DbpA、OspA、Hia、PrpA、MltA、L7/L12、D15、0187、VirJ、Mdh、AfuA、L7/L12、外膜蛋白、LPS、A型抗原、B型抗原、C型抗原、D型抗原、E型抗原、FliC、FliD、Cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氢盐-醛缩酶(FBA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)、延伸因子-G(EF-G)、假定蛋白(HP)、T毒素、类毒素抗原、荚膜多糖、蛋白质D、Mip、核蛋白(NP)、RD1、PE35、PPE68、EsxA、EsxB、RD9、EsxV、Hsp70、脂多糖、表面抗原、Sp1、Sp2、Sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引导蛋白质、荚膜蛋白质(F1)或V蛋白质。
78.如权利要求63-71中任何一项所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下真菌获得或衍生的抗原：念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺囊虫属或葡萄穗霉菌属。
79.如权利要求78所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：白色念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌、罗氏隐球菌、浅白隐球菌、加特隐球菌、荚膜组织胞浆菌、伊氏肺囊虫或黑葡萄稳霉。
80.如权利要求79所述的组合物，其中该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：表面抗原、荚膜糖蛋白、Yps3P、Hsp60、主要表面蛋白质、MsgC1、MsgC3、MsgC8、MsgC9或SchS34。
81.如权利要求63-80中任何一项所述的组合物，另外包含一种或多种佐剂。
82.如权利要求81所述的组合物，其中该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到该合成纳米载体上的佐剂。
83.如权利要求81或82所述的组合物，其中该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到该合成纳米载体上的佐剂并且该组合物包含一种或多种混合的佐剂。
84.如权利要求81-83中任何一项所述的组合物，其中该一种或多种佐剂各自包含矿物盐、明矾、与肠细菌的单磷酰脂质(MPL)A、 (AS04)组合的明矾、AS15、皂甙、TM TM
QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX 、MF59 、 ISA51、 ISA
720、AS02、脂质体或脂质体配制品、AS01、合成的或具体制备的微粒和微载体、淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的衍生自细菌的外膜泡、壳聚糖颗粒、贮存形成剂、 嵌段共聚物、特异性修饰或制备的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、RC529、细菌类毒素、毒素片段、Toll样受体2、3、4、5、7、8或9的激动剂、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性DNA、免疫刺激性RNA、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、针对DC表面分子CD40的激动剂、类型I干扰素、聚I:C、细菌性脂多糖(LPS)、VSV-G、HMGB-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含CpG的免疫刺激性DNA分子、从坏死细胞释放的促发炎刺激物、尿酸盐晶体、补体级联的活化组分、免疫复合物的活化组分、补体受体激动剂、细胞因子或细胞因子受体激动剂。
85.如权利要求82-84中任何一项所述的组合物，其中这些佐剂是不同的。
86.如权利要求82-85中任何一项所述的组合物，其中该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含一种TLR-2、-3、-4、-7、-8或-9激动剂。
87.如权利要求86所述的组合物，其中该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、MPL、咪喹莫特或瑞喹莫德。
88.如权利要求83-87中任何一项所述的组合物，其中该混合的佐剂是包含CpG的免疫刺激性核酸、AS01、AS02、AS04、AS15、QS-21、皂甙、明矾或MPL。
89.如权利要求63-88中任何一项所述的组合物，其中该第一和该第二群合成纳米载体的存在量有效在一位受试者中对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原产生一种免疫应答。
90.如权利要求89所述的组合物，其中该免疫应答是产生对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
91.如权利要求63-90中任何一项所述的组合物，另外包含一种或多种另外的群的合成纳米载体，其中各另外的群的合成纳米载体包含一组表面抗原，该组表面抗原在免疫上与该组合物中的其他组表面抗原不同。
92.如权利要求91所述的组合物，其中该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个另外包含一种偶合到其上的佐剂。
93.如权利要求92所述的组合物，其中该偶合到该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个上的佐剂与该组合物中的其他佐剂不同。
94.如权利要求63-93中任何一项所述的组合物，其中各组表面抗原是单价或低价组的表面抗原。
95.如权利要求91-94中任何一项所述的组合物，其中这些群的合成纳米载体的存在量有效对各组表面抗原产生一种免疫应答。
96.如权利要求95所述的组合物，其中该免疫应答是产生对各组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
97.如权利要求63-96中任何一项所述的组合物，其中该第一和/或该第二群的合成纳米载体另外包含一种偶合到其上的通用的T细胞抗原。
98.如权利要求97所述的组合物，其中该通用的T细胞抗原包含一种T辅助细胞抗原。
99.如权利要求98所述的组合物，其中该T-辅助细胞抗原包含一种从卵白蛋白获得或衍生的肽。
100.如权利要求99所述的组合物，其中该从卵白蛋白获得或衍生的肽包含如SEQ ID NO：1中所阐明的序列。
101.如权利要求97-100中任何一项所述的组合物，其中该通用的T细胞抗原通过封装来偶合。
102.如权利要求1-101中任何一项所述的组合物，其中该药物学上可接受的赋形剂包含防腐剂、缓冲剂、盐水、磷酸盐缓冲盐水、着色剂或稳定剂。
103.如权利要求1-102中任何一项所述的组合物，其中各合成纳米载体的群的合成纳米载体包含基于脂质的纳米颗粒、聚合纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树状聚合物、巴克球(buckyball)、纳米线、病毒样颗粒、基于肽或蛋白质的颗粒、脂质-聚合物纳米颗粒、球状纳米颗粒、立方形纳米颗粒、金字塔形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒或环形纳米颗粒。
104.如权利要求103所述的组合物，其中各合成纳米载体的群包含一种或多种聚合物。
105.如权利要求104所述的组合物，其中该一种或多种聚合物包含一种聚酯。
106.如权利要求104或105所述的组合物，其中该一种或多种聚合物包含或另外包含一种偶合到亲水聚合物上的聚酯。
107.如权利要求105或106所述的组合物，其中该聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己内酯。
108.如权利要求106或107所述的组合物，其中该亲水聚合物包含一种聚醚。
109.如权利要求108所述的组合物，其中该聚醚包含聚乙二醇。
110.一种组合物，包含：
一个剂型，包含：
一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；
一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及
一种药物学上可接受的赋形剂；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
111.如权利要求110所述的组合物，其中：
该第一组表面抗原包含第一组单价或低价的表面抗原；以及
该第二组表面抗原包含第二组单价或低价的表面抗原。
112.一种组合物，包含：
一个剂型，包含：
一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；
一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及
一种药物学上可接受的赋形剂；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
113.如权利要求112所述的组合物，其中：
该第一组表面抗原包含第一组单价或低价的表面抗原；以及
该第二组表面抗原包含第二组单价或低价的表面抗原。
114.一种方法，包括：
给予一位受试者如权利要求1-113中任何一项所述的组合物。
115.如权利要求114所述的方法，其中该受试者罹患或有风险罹患一种感染或感染性疾病。
116.如权利要求114所述的方法，其中该受试者罹患或有风险罹患癌症。
117.如权利要求114所述的方法，其中该受试者罹患或有风险罹患一种成瘾。
118.如权利要求114-117中任何一项所述的方法，其中该组合物通过经口、皮下、经肺、鼻内、皮内或肌肉内给予来给药。
119.一种方法，包括：
制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；
制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及
将该第一和该第二群的合成纳米载体组合于一个剂型中；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
120.一种方法，包括：
制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；
制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及
将该第一和该第二群的合成纳米载体组合于一个剂型中；
其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
121.如权利要求119或120所述的方法，另外包括给予一位受试者该剂型。
122.如权利要求121所述的方法，另外包括确定是否对各组表面抗原产生一种免疫应答。
123.如权利要求122所述的方法，其中该免疫应答是产生对各组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
124.如权利要求121-123中任何一项所述的方法，另外包括确定有效对各组表面抗原产生该免疫应答的量。
125.一种用于制造组合物的剂型的方法，该方法包括如权利要求119-124中任何一项中所定义的方法步骤。
126.如权利要求1-113中任何一项所述的组合物，用于治疗或预防中。
127.如权利要求1-113中任何一项所述的组合物，用于如权利要求114-118和/或
121-124中任何一项中所定义的方法中。
128.如权利要求1-113中任何一项所述的组合物，用于治疗或预防感染或感染性疾病的方法中。
129.如权利要求1-113中任何一项所述的组合物，用于治疗或预防癌症的方法中。
130.如权利要求1-113中任何一项所述的组合物，用于治疗或预防成瘾的方法中。
131.如权利要求128-130中任何一项所述的组合物，其中该方法包括通过经口、皮下、经肺、鼻内、皮内或肌肉内给予来给予该组合物。
132.一种如权利要求1-113中任何一项所述的组合物的用途，用于制造供在如权利要求114-118、121-124或128-131中任何一项中所定义的方法中使用的药剂。
多价的合成纳米载体疫苗
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119要求了2010年5月26日提交的美国临时申请61/348713、2010年5月26日提交的61/348717、2010年5月26日提交的61/348728以及
2010年6月25日提交的61/358635的权益，各自的全文内容通过引用结合在此。
2010年6月25日提交的61/358635的权益，各自的全文内容通过引用结合在此。
[0003] 发明背景
[0004] 多价疫苗是一种对某些外来物质产生免疫应答的有用的方式，这些外来物质否则不会令人希望地强健。举例来说，与使用单价疫苗进行接种相比，针对一种病毒的多个病毒株的接种可以提供针对该病毒的多个病毒株的更强健的交互保护。
[0005] 然而，当前的多价疫苗和其制造方法需要改进。举例来说，当前的使抗原与蛋白质载体结合的方法是复杂的且提供低产率。另外，经常需要开发新技术来使新抗原与载体蛋白质结合，因为常规技术可能因常规载体蛋白质的相对易碎性而不成功。
[0006] 需要的是提供改进的多价疫苗的组合物和方法。
发明内容
[0007] 一个方面，提供一种组合物，包含一个剂型，该剂型包含一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及一种药物学上可接受的赋形剂，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0008] 另一个方面，还提供一种组合物，包含一个剂型，该剂型包含一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及一种药物学上可接受的赋形剂，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
[0009] 又另一个方面，还提供一种组合物，包含一个剂型，该剂型包含一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及一种药物学上可接受的赋形剂，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0010] 再另一个方面，提供一种组合物，包含一个剂型，该剂型包含一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及一种药物学上可接受的赋形剂，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
[0011] 在任何所提供的组合物的一个实施方案中，该第一组表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种类型的抗原。在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第二组表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种类型的抗原。
[0012] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含从第一感染性属获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性属获得或衍生的抗原。在一个实施方案中，该第一感染性属与该第二感染性属相同。在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含从第一感染性种获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性种获得或衍生的抗原。在一个实施方案中，该第一感染性种与该第二感染性种相同。在另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含从第一感染性病毒株获得或衍生的抗原，并且该第二组表面抗原包含从第二感染性病毒株获得或衍生的抗原。在一个实施方案中，该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株相同。
[0013] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下科的病毒获得或衍生的抗原：腺病毒科、细小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、反转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科或细小病毒科。在一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下病毒获得或衍生的抗原：腺病毒、柯萨奇病毒、A型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃-巴二氏病毒、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西方尼耳病毒、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、人类偏肺病毒、人类乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人类博卡病毒或细小病毒B19。在另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：VI、VII、E1A、E3-19K、52K、VP1、表面抗原、3A蛋白质、衣壳蛋白、核衣壳、表面突出物、跨膜蛋白、UL6、UL18、UL35、UL38、UL19、早期抗原、衣壳抗原、Pp65、gB、p52、潜伏的核抗原-1、NS3、包膜蛋白、包膜蛋白E2结构域、gp120、p24、脂肽Gag(17-35)、Gag(253-284)、Nef(66-97)、Nef(116-145)、Pol(325-355)、神经氨酸酶、核衣壳蛋白、基质蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神经氨酸酶、糖蛋白、E6、E7、包膜脂蛋白或非结构蛋白质(NS)。
[0014] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下细菌获得或衍生的抗原：博德特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属和披衣菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏杆菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次体、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属弧菌属或耶尔森氏菌属。在一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳杆菌、伯氏疏螺旋菌、牛布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉披衣菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏杆菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团杆菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓假单胞菌、立氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌或鼠疫耶尔森氏菌。在另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：百日咳毒素(PT)、丝状血球凝集素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、菌毛(FIM 2/3)、VlsE；DbpA、OspA、Hia、PrpA、MltA、L7/L12、D15、0187、VirJ、Mdh、AfuA、L7/L12、外膜蛋白、LPS、A型抗原、B型抗原、C型抗原、D型抗原、E型抗原、FliC、FliD、Cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氢盐-醛缩酶(FBA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)、延伸因子-G(EF-G)、假定蛋白(HP)、T毒素、类毒素抗原、荚膜多糖、蛋白质D、Mip、核蛋白(NP)、RD1、PE35、PPE68、EsxA、EsxB、RD9、EsxV、Hsp70、脂多糖、表面抗原、Sp1、Sp2、Sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引导蛋白质、荚膜蛋白质(F1)或V蛋白质。
[0015] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下属的真菌获得或衍生的抗原：念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺囊虫属或葡萄穗霉菌属。在一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：白色念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌、罗氏隐球菌、浅白隐球菌、加特隐球菌、荚膜组织胞浆菌、伊氏肺囊虫或黑葡萄穗霉。在另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从以下获得或衍生的抗原：表面抗原、荚膜糖蛋白、Yps3P、Hsp60、主要表面蛋白质、MsgC1、MsgC3、MsgC8、MsgC9或SchS34。
[0016] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含从在此提供的任何以下物质获得或衍生的抗原：感染物、病毒、细菌、蛋白质、肽、多肽、小分子、多糖或寡糖。
[0017] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含从一种滥用的或上瘾的物质获得或衍生的抗原。在一个实施方案中，该滥用的或上瘾的物质是可卡因或烟碱。
[0018] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含相同表面抗原，并且其中该第一组表面抗原的至少一种抗原所呈现的定向与该第二组表面抗原所呈现的不同。
[0019] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原和该第二组表面抗原包含相同表面抗原，并且其中该第一组表面抗原的至少一种抗原所呈现的构象与该第二组表面抗原所呈现的不同。
[0020] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原的分子结构与该第二组表面抗原不同。
[0021] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0022] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原和/或该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。
[0023] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原的至少一种表面抗原和/或该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0024] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含肽的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0025] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含肽的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一个实施方案中，该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0026] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0027] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一个实施方案中，该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0028] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0029] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一个实施方案中，该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0030] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0031] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一个实施方案中，该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0032] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含分子量小于10,000Da的表面抗原。
[0033] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且该第二组表面抗原包含含肽、蛋白质、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一个实施方案中，该第二组表面抗原的至少一种表面抗原的分子量小于10,000Da。
[0034] 在任何所提供的组合物的一个实施方案中，这些组合物另外包含一种或多种佐剂。在一个实施方案中，该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到该合成纳米载体上的佐剂。在另一个实施方案中，该第一群合成纳米载体和/或该第二群合成纳米载体另外包含一种偶合到该合成纳米载体上的佐剂并且该组合物包含一种或多种混合的佐剂。
[0035] 在一个实施方案中，任何所提供的组合物的一种或多种佐剂各自包含矿物盐、明矾、与肠细菌的单磷酰脂质(MPL)、 (AS04)组合的明矾、AS15、皂甙、QS-21、TM TMQuil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX 、MF59 、 ISA 51、 ISA 720、
AS02、脂质体或脂质体配制品、AS01、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体、淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的衍生自细菌的外膜泡、壳聚糖颗粒、贮存形成剂、 嵌段共聚物、特异性修饰或制备的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、RC529、细菌类毒素、毒素片段、Toll样受体2、3、4、5、7、8或9的激动剂、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性DNA、免疫刺激性RNA、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、针对DC表面分子CD40的激动剂、类型I干扰素、聚I:C、细菌性脂多糖(LPS)、VSV-G、HMGB-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含CpG的免疫刺激性DNA分子、从坏死细胞释放的促发炎刺激物、尿酸盐晶体、补体级联的活化组分、免疫复合物的活化组分、补体受体激动剂、细胞因子或细胞因子受体激动剂。在一个实施方案中，这些佐剂是不同的。在另一个实施方案中，该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含一种TLR-2、-3、-4、-7、-8或-9激动剂。在又另一个实施方案中，该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、MPL、咪喹莫特或瑞喹莫德。在一个实施方案中，该混合的佐剂是包含CpG的免疫刺激性核酸、AS01、AS02、AS04、AS15、QS-21、皂甙、明矾或MPL。
AS02、脂质体或脂质体配制品、AS01、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体、淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的衍生自细菌的外膜泡、壳聚糖颗粒、贮存形成剂、 嵌段共聚物、特异性修饰或制备的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、RC529、细菌类毒素、毒素片段、Toll样受体2、3、4、5、7、8或9的激动剂、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性DNA、免疫刺激性RNA、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、针对DC表面分子CD40的激动剂、类型I干扰素、聚I:C、细菌性脂多糖(LPS)、VSV-G、HMGB-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含CpG的免疫刺激性DNA分子、从坏死细胞释放的促发炎刺激物、尿酸盐晶体、补体级联的活化组分、免疫复合物的活化组分、补体受体激动剂、细胞因子或细胞因子受体激动剂。在一个实施方案中，这些佐剂是不同的。在另一个实施方案中，该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含一种TLR-2、-3、-4、-7、-8或-9激动剂。在又另一个实施方案中，该偶合到该第一群合成纳米载体上的佐剂和/或该偶合到该第二群合成纳米载体上的佐剂包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、MPL、咪喹莫特或瑞喹莫德。在一个实施方案中，该混合的佐剂是包含CpG的免疫刺激性核酸、AS01、AS02、AS04、AS15、QS-21、皂甙、明矾或MPL。
[0036] 在任何所提供的组合物的一个实施方案中，该第一和该第二群的合成纳米载体的存在量有效在一位受试者中对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原产生一种免疫应答。在一个实施方案中，该免疫应答是产生对该第一组表面抗原和该第二组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
[0037] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，这些组合物包含一种或多种另外的群的合成纳米载体，其中各另外的群的合成纳米载体包含一组表面抗原，该组表面抗原与该组合物中的其他组的表面抗原在结构上不同。在一个实施方案中，该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个另外包含一种偶合到其上的佐剂。在另一个实施方案中，该偶合到该一个或多个另外的群的合成纳米载体中的至少一个上的佐剂与该组合物中的其他佐剂不同。
[0038] 在任何所提供的组合物的又另一个实施方案中，该第一组表面抗原包含第一组单价或低价的表面抗原；并且该第二组表面抗原包含第二组单价或低价的表面抗原。
[0039] 在任何所提供的组合物的再另一个实施方案中，各组表面抗原是一个单价或低价组的表面抗原。
[0040] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，这些群的合成纳米载体的存在量有效对各组表面抗原产生一种免疫应答。在一个实施方案中，该免疫应答是产生对各组表面抗原具有特异性的抗体滴度。
[0041] 在任何所提供的组合物的一个实施方案中，该第一和/或该第二群的合成纳米载体另外包含一种偶合到其上的通用T细胞抗原。在另一个实施方案中，该通用的T细胞抗原包含一种T辅助细胞抗原。在又另一个实施方案中，该T-辅助细胞抗原包含一种从卵白蛋白获得或衍生的肽。在再另一个实施方案中，该从卵白蛋白获得或衍生的肽包含如SEQ IDNO：1中所阐明的序列。在另一个实施方案中，该通用的T细胞抗原通过封装偶合。
[0043] 在任何所提供的组合物的另一个实施方案中，各合成纳米载体的群的合成纳米载体包含基于脂质的纳米颗粒、聚合纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树状聚合物、巴克球(buckyball)、纳米线、病毒样颗粒、基于肽或蛋白质的颗粒、脂质-聚合物纳米颗粒、球状纳米颗粒、立方形纳米颗粒、金字塔形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒或环形纳米颗粒。在一个实施方案中，各合成纳米载体的群包含一种或多种聚合物。在另一个实施方案中，该一种或多种聚合物包含一种聚酯。在再另一个实施方案中，该一种或多种聚合物包含或另外包含一种偶合到亲水聚合物上的聚酯。在又另一个实施方案中，该聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己内酯。在另一个实施方案中，该亲水聚合物包含一种聚醚。在再另一个实施方案中，该聚醚包含聚乙二醇。
[0044] 另一个方面，提供一种方法，该方法包括给予一位受试者任何所提供的组合物。在一个实施方案中，该受试者罹患或有风险罹患一种感染或感染性疾病。在另一个实施方案中，该受试者罹患或有风险罹患癌症。在又另一个实施方案中，该受试者罹患或有风险罹患成瘾。在另一个实施方案中，该组合物通过经口、皮下、经肺、鼻内、皮内或肌肉内给予来给药。
[0045] 又另一个方面，提供一种方法，该方法包括制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；并且将该第一和该第二群合成纳米载体组合于一个剂型中，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0046] 另一个方面，提供一种方法，该方法包括制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；并且将该第一和该第二群合成纳米载体组合于一个剂型中，其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。在一个实施方案中，该方法另外包括给予一位受试者该剂型。在另一个实施方案中，该方法另外包括确定是否对各组表面抗原产生一种免疫应答。在一个实施方案中，该免疫应答是产生对各组表面抗原具有特异性的抗体滴度。在另一个实施方案中，该方法另外包括确定有效对各组表面抗原产生该免疫应答的量。
[0047] 再另一个方面，提供一种用于制造组合物的剂型的方法，该方法包括如在此提供的任何方法中所定义的方法步骤。
[0048] 在一个实施方案中，任何所提供的组合物用于治疗或预防中。在另一个实施方案中，任何所提供的组合物用于在此提供的任何方法中。在又另一个实施方案中，任何所提供的组合物用于治疗或预防感染或感染性疾病的方法中。在再另一个实施方案中，任何所提供的组合物用于治疗或预防癌症的方法中。在另一个实施方案中，任何所提供的组合物用于治疗或预防成瘾的方法中。
[0049] 在另一个实施方案中，任何这些方法包含通过经口、皮下、经肺、鼻内、皮内或肌肉内给予来给予任何这些组合物。
[0050] 又另一个方面，提供任何所提供的组合物的用途，用于制造供在任何所提供的方法中使用的药剂。
[0051] 图式简要说明
[0052] 图1示出了未免疫的小鼠和注射过NC-Nic和NC-OVA(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗烟碱(深灰色条)和抗卵白蛋白(浅灰色条)抗体滴度。
[0053] 图2示出了未免疫的小鼠和注射过NC-Nic-OVA和NC-L2(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗烟碱、抗卵白蛋白以及抗L2肽抗体滴度。
[0054] 图3示出了未免疫的小鼠和注射过NC-Nic-OVA和NC-M2e-L2(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗烟碱、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。
[0055] 图4示出了未免疫的小鼠和注射过NC-M2e和NC-L2(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗M2e肽和抗L2肽抗体滴度。
[0056] 图5示出了未免疫的小鼠和注射过NC-HA5和NC-OVA(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗HA5蛋白质和抗卵白蛋白蛋白质抗体滴度。
[0057] 图6示出了未免疫的小鼠和注射过NC-HA5、NC-OVA以及NC-M2e-L2(5只动物/组；s.c.，每次注射100μg各NC，以3-周为间隔进行2次)的小鼠的抗HA、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。
[0058] 图7示出了用NC-M2e、NC-L2肽以及NC-烟碱-卵白蛋白的组合免疫过的小鼠的抗体滴度。
[0059] 图8示出了用NC-3′-烟碱和NC-1′-烟碱的组合免疫过的小鼠的抗体滴度。
[0060] 发明的详细说明
[0061] 在详细地描述本发明之前，应理解本发明不受特别例证的材料或工艺参数限制，因为这些材料和工艺参数当然可以变化。还应理解，在此使用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，并且不打算对使用替代性术语描述本发明进行限制。
[0063] 除非发明内容另有明确规定，否则如本说明书和随附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“该”包括复数指示物。举例来说，提及“一种聚合物”包括两种或更多种此类分子的混合物，提及“一种溶剂”包括两种或更多种此类溶剂的混合物，提及“一种粘合剂”包括两种或更多种此类材料的混合物，等等。
[0064] 引言
[0065] 诸位发明人已出乎意料并且出人意料地发现上文指出的问题和限制可以通过实施在此披露的发明来克服。具体地说，诸位发明人已出乎意料地发现，有可能提供发明的组合物和相关方法，这些组合物和方法通过提供一种组合物来解决本领域的问题和限制，该组合物包含一个剂型，该剂型包含：一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及一种药物学上可接受的赋形剂；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0066] 另一个方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含：一个剂型，该剂型包含：一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及一种药物学上可接受的赋形剂；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
[0067] 一个方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含：一个剂型，该剂型包含：一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及一种药物学上可接受的赋形剂；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0068] 一个方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含：一个剂型，该剂型包含：一个用于呈现第一组表面抗原的第一合成纳米载体装置；一个用于呈现第二组表面抗原的第二合成纳米载体装置；以及一种药物学上可接受的赋形剂；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
[0069] 另一个方面，本发明提供一种方法，该方法包括：制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及将该第一和第二群合成纳米载体组合于一个剂型中；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上不同。
[0070] 又另一个方面，本发明提供一种方法，该方法包括：制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；以及将该第一和第二群合成纳米载体组合于一个剂型中；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在免疫上不同。
[0071] 已发现，有可能产生对应地包含第一和第二组表面抗原的第一和第二群合成纳米载体，这些纳米载体可以与一种药物学上可接受的赋形剂组合在一起产生一个剂型。在某些实施方案中，此剂型可以用作多价疫苗。诸位发明人另外指出了本发明剂型产生中的某些优点，特别是相对于常规的多价疫苗。这些优点包括但不限于使常规多价疫苗中的一个问题疫苗体积最小化，和使在常规的蛋白质载体-半抗原多价疫苗中存在的可以导致非特异性结合和沉淀的蛋白质-蛋白质相互作用最小化。
[0072] 本发明的另一个优点是包含多组表面抗原的不同群的合成纳米载体的组合允许使用不同的方法来使不同组的表面抗原偶合到不同群的合成纳米载体上。这可以是需要不相容的偶合方法来使多组表面抗原偶合到多群合成纳米载体上的实施方案的重要的优点。举例来说，针对链球菌肺炎的疫苗(艾伯塔科研委员会(Alberta Research Council)的美国专利6,132,723和惠氏(Wyeth)的WO 2008/143709)包含多个抗原。因为不是所有多糖抗原的连接化学条件都相同(WO 2008/143709)，所以在单个偶合环境中将所有表面抗原连接到单个群的合成纳米载体上的偶合方法将不是所希望的。实施不同群的合成纳米载体首先偶合到某些组的表面抗原并且然后组合的本发明的实施方案可以改善本领域中所提出的问题。
[0073] 可以受益于本发明的这一实施方案的多价疫苗的另一个实例包含基于多糖并且多价的针对脑膜炎奈瑟菌的疫苗。此类实施方案可以针对脑膜炎奈瑟菌A和C群(二价的)或A、C、W135以及Y群(四价的)。
[0074] 这些实例说明根据本发明的某些实施方案，其中肽、多糖、小分子等结合到第一群合成纳米载体和/或第二群合成纳米载体上。这些群然后结合形成一种根据本发明的组合物。
[0075] 现将更详细地描述本发明。
[0076] 定义
[0077] “滥用的物质”是受试者(例如人类)出于除物质指示的目的以外的目的或以除医师所指导的以外的方式或量而服用的任何物质。在一些实施方案中，滥用的物质是上瘾的物质。在一些实施方案中，用于包括在纳米载体中的滥用的物质是完全分子、类似物或其部分。“上瘾的物质”是引起痴迷、强迫或物理依赖或心理依赖的物质。在一些实施方案中，用于包括在纳米载体中的上瘾的的物质是完全分子、类似物或其部分。
[0078] “佐剂”意指一种不构成特异性抗原但增强所给予的抗原(例如伴随给予的抗原)的免疫应答的强度和寿命的试剂。这样的佐剂可以包括但不限于：模式识别受体(如Toll样受体、RIG-1和NOD样受体(NLR))的刺激剂、矿物盐(例如明矾，与肠道细菌(例如大肠埃希氏杆菌、明尼苏达沙门菌、鼠伤寒沙门菌、或弗氏志贺菌)的单磷酰脂质(monphosphoryl lipid，MPL)A组合的明矾或分别与 (AS04)、以上提到的细菌的MPLA特异性组合的TM TM明矾)、皂苷(如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX )、乳液(如MF59 、
ISA 51和ISA 720)、AS02 脂质体和脂质体配制品(如
AS01)、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体(如淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和其他细菌的衍生自细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(如 嵌段共聚物)、
特异性修饰或制备的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。
ISA 51和ISA 720)、AS02 脂质体和脂质体配制品(如
AS01)、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体(如淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和其他细菌的衍生自细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(如 嵌段共聚物)、
特异性修饰或制备的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。
[0079] 在实施方案中，佐剂包括针对模式识别受体(PRR)(包括但不限于Toll样受体(TLR)，特别是TLR 2、3、4、5、7、8、9和/或其组合)的激动剂。在其他实施方案中，佐剂包含针对Toll样受体3的激动剂、针对Toll样受体7和8的激动剂、或针对Toll样受体9的激动剂；所述佐剂优选地包括咪唑并喹啉(如R848)；腺嘌呤衍生物(如美国专利权
6,329,381(住友制药公司(Sumitomo Pharmaceutical Company))、比戛迪克(Biggadike)等人的US公布专利申请2010/0075995、或坎坡斯(Campos)等人的WO 2010/018132中所披露的那些)；免疫刺激性DNA；或免疫刺激性RNA。
6,329,381(住友制药公司(Sumitomo Pharmaceutical Company))、比戛迪克(Biggadike)等人的US公布专利申请2010/0075995、或坎坡斯(Campos)等人的WO 2010/018132中所披露的那些)；免疫刺激性DNA；或免疫刺激性RNA。
[0080] 在具体的实施方案中，合成的纳米载体合并了化合物作为佐剂，它们是针对toll样受体(TLR)7&8的激动剂(“TLR 7/8激动剂”)。它的效用是托马伊(Tomai)等人的美国专利6,696,076中披露的TLR 7/8激动剂化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-桥接咪唑并喹啉胺。优选的佐剂包括咪喹莫特和瑞喹莫德(也称为R848)。在具体的实施方案中，合成的纳米载体合并了一种针对toll样受体(TLR)-9的配体(如CpGs)，它诱导类型I干扰素产生并且刺激T和B细胞活化，产生增加的抗体产生和细胞毒性T细胞应答(克力克(Krieg)等人，细菌DNA中的CpG基元触发直接B细胞活化(CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation)，自然(Nature)1995.374：546-549；朱(Chu)等人，CpG寡脱氧核苷酸充当接通T辅助细胞1型(Th1)免疫性的佐剂(CpG oligodeoxynucleotidesact as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity)，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1997.186：1623-1631；利甫福德(Lipford)等人，含有CpG的合成寡核苷酸促进对蛋白质抗原产生的B细胞和细胞毒性T细胞应答：一种新型疫苗佐剂(CpG-containing synthetic oligonucleotidespromote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen：a new class ofvaccine adjuvants)，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)1997.27：2340-2344；罗曼(Roman)等人，免疫刺激性DNA序列充当促进T辅助细胞1型的佐剂(Immunostimulatory DNA sequences funetion as Thelper-1-promoting adjuvants)，自然医学(Nat.Med.)1997.3：849-854；
载维斯(Davis)等人，CpG DNA是用重组B型肝炎表面抗原免疫的小鼠中特异性免疫的有效增强剂(CpG DNA is a potent enhancer of specificimmunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surfaceantigen)，免疫学杂志(J.Immunol.)1998.160：
870-876；利甫福德(Lipford)等人，作为免疫细胞活化剂的细菌DNA(Bacterial DNA asimmune cell activator)，微生物趋势(Trends Microbiol)1998.6：496-500；克力克等人的美国专利6,207,646；塔克(Tuck)等人的美国专利7,223,398；范内斯特(Van Nest)等人的美国专利7,250,403；或克力克等人的美国专利7,566,703)。
载维斯(Davis)等人，CpG DNA是用重组B型肝炎表面抗原免疫的小鼠中特异性免疫的有效增强剂(CpG DNA is a potent enhancer of specificimmunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surfaceantigen)，免疫学杂志(J.Immunol.)1998.160：
870-876；利甫福德(Lipford)等人，作为免疫细胞活化剂的细菌DNA(Bacterial DNA asimmune cell activator)，微生物趋势(Trends Microbiol)1998.6：496-500；克力克等人的美国专利6,207,646；塔克(Tuck)等人的美国专利7,223,398；范内斯特(Van Nest)等人的美国专利7,250,403；或克力克等人的美国专利7,566,703)。
[0081] 在具体的实施方案中，佐剂可以是DC表面分子CD40的激动剂。在某些实施方案中，为了刺激免疫性而不是耐受性，合成的纳米载体合并了促进DC成熟(对于引发初始T细胞而言是需要的)以及细胞因子(例如类型I干扰素，它促进抗体免疫应答和抗病毒免疫性)的产生的佐剂。在实施方案中，佐剂还可以包括免疫刺激RNA分子(如但不限于dsRNA、ssRNA、聚I:C或聚I:聚C12U(以Ampligen 获得，聚I:C与聚I:聚C12U两者都称为TLR3刺激剂)、和/或在海尔(F.Heil)等人，“经由Toll样受体7和8种属特异性识别单链RNA(Species-Specific Recognitionof Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor7and 8)”科学(Science)303(5663)，1526-1529(2004)；福尔默(J.Vollmer)等人，“通过化学修饰的核糖核苷和寡核糖核苷酸进行的免疫调节(Immune modulation bychemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides)”WO2008033432A2；福尔斯巴赫(A.Forsbach)等人，“含有特异性序列基元并且靶向Toll样受体8通路的免疫刺激性寡核糖核苷酸(Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequencemotif(s)and targeting the Toll-like receptor 8pathway”WO 2007062107A2；
乌尔曼(E.Uhlmann)等人，“具有增强的免疫疫刺激性活性的修饰的寡核糖核苷酸类似 物 (Modified oligoribonucleotide analogs withenhanced immunostimulatory activity)”美国专利申请公布US2006241076；利甫福德(G.Lipford)等人，“免疫刺激性病毒性RNA寡核糖核苷酸和其用于治疗癌症和感染的用途(Immunostimulatory viralRNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections)”WO2005097993A2；
G.Lipford(利甫福德)等人，“免疫刺激性含G，U的寡核糖核苷酸、组合物以及筛选方法 (Immunostimulatory G，U-containingoligoribonucleotides，compositions，and screening methods)”WO2003086280A2中披露的那些。
乌尔曼(E.Uhlmann)等人，“具有增强的免疫疫刺激性活性的修饰的寡核糖核苷酸类似 物 (Modified oligoribonucleotide analogs withenhanced immunostimulatory activity)”美国专利申请公布US2006241076；利甫福德(G.Lipford)等人，“免疫刺激性病毒性RNA寡核糖核苷酸和其用于治疗癌症和感染的用途(Immunostimulatory viralRNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections)”WO2005097993A2；
G.Lipford(利甫福德)等人，“免疫刺激性含G，U的寡核糖核苷酸、组合物以及筛选方法 (Immunostimulatory G，U-containingoligoribonucleotides，compositions，and screening methods)”WO2003086280A2中披露的那些。
[0082] 在一些实施方案中，一种佐剂可以是TLR-4激动剂，如细菌性脂多糖(LPS)、VSV-G、和/或HMGB-1。在一些实施方案中，佐剂可以包括TLR-5激动剂(如鞭毛蛋白)或其部分或衍生物，包括但不限于美国专利6,130,082、6,585,980以及7,192,725中所披露的那些。
[0083] 在一些实施方案中，佐剂可以是从坏死细胞释放的促发炎刺激物(例如尿酸盐晶体)。在一些实施方案中，佐剂可以是补体级联的活化组分(例如CD21、CD35，等)。在一些实施方案中，佐剂可以是免疫复合物的活化组分。这些佐剂还包括补体受体激动剂(如结合到CD21或CD35上的分子)。在一些实施方案中，补体受体激动剂诱导合成纳米载体的内生补体调理作用。在一些实施方案中，佐剂是细胞因子，它是由细胞释放的小的蛋白质或生物因子(在5kD-20kD的范围内)，并且对细胞-细胞相互作用、联通以及其他细胞的行为具有特异性作用。在一些实施方案中，细胞因子受体激动剂是小分子、抗体、融合蛋白或适体。
[0084] 在实施方案中，至少一部分佐剂剂量可以偶合到合成纳米载体上，优选地所有佐剂剂量偶合到合成纳米载体上。在其他实施方案中，至少一部分佐剂剂量并不偶合到合成纳米载体上。在实施方案中，佐剂剂量包括两种或更多种类型的佐剂。例如，而没有限制，可以组合作用于不同TLR受体的佐剂。作为一个实例，在一个实施方案中，TLR 7/8激动剂可以与TLR 9激动剂组合。在另一个实施方案中，TLR 7/8激动剂可以与TLR 4激动剂组合。在又另一个实施方案中，TLR 9激动剂可以与TLR 3激动剂组合。
[0085] “给予”或“给药”意指以药物学上有用的方式提供物质给受试者。
[0086] “有效量”是组合物的产生一种或多种所希望的免疫应答的任何量。此量可以出于体外或体内目的。出于体内目的，该量可以是健康开业医师将认为可以对需要一种或多种抗原特异性抗体应答的受试者具有临床益处的量。“抗体应答”意指导致B细胞产生或刺激和/或抗体产生的任何免疫应答。在实施方案中，因此，有效量是健康开业医师将认为可以针对在此提供的本发明组合物的表面抗原产生抗体应答的量。有效量可以通过常规方法监测。有效产生一种或多种所希望的免疫应答的量还可以是在此提供的组合物产生所希望的治疗终点或所希望的治疗结果的量。因此，在其他实施方案中，有效量是临床医师将认为将向在此提供的受试者提供治疗益处(包括预防性益处)的量。此类受试者包括罹患或有风险罹患癌症、感染或感染性疾病的那些。
[0087] 在实施方案中，在此提供的任何本发明组合物的这种或这些抗原可以是有效量的。在一些实施方案中，有效量是健康开业医师将认为可以针对在此提供的组合物的多组表面抗原产生抗体滴度的量。“抗体滴度”意指产生可测量水平的抗体。抗体应答或抗体滴度的产生优选地是在人类中。在一些实施方案中，抗体是某种同种型的抗体，如IgG或其子类。本领域已知抗体滴度的测量方法并且这些方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。抗体应答的测量方法还在实例中略为详细地进行了描述。抗体应答或抗体滴度优选地对一组表面抗原具有特异性。在合成纳米载体除针对一种特异性免疫应答(如抗体应答或抗体滴度)的一组表面抗原以外还包括通用抗原的一些实施方案中，该免疫应答对该组表面抗原但不对通用抗原具有特异性。
[0088] 有效量当然将取决于所治疗的具体受试者；病状、疾病或病症的严重程度；个别患者的参数，包括年龄、身体状况、体型以及体重；治疗持续时间；并行治疗(如果有)的性质；具体的给药途径以及健康开业医师的知识和专业知识内的类似因素。这些因素为本领域普通技术人员所熟知，并且可以仅仅用常规实验方法解决。总体上优选的是使用“最大剂量”，即根据合理医药判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员应了解，出于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因，患者可以坚持较低剂量或耐受剂量。
[0089] “抗原”意指B细胞抗原或T细胞抗原。在实施方案中，抗原偶合到合成纳米载体上。在其他实施方案中，抗原并未偶合到合成纳米载体上。在实施方案中，抗原与合成纳米载体共给予。在其他实施方案中，抗原不与合成纳米载体共给予。“一种或多种类型的抗原”意指共享相同或实质上相同的抗原特征的分子。
[0090] “至少一部分剂量”意指剂量的至少某部分，范围高达包括所有剂量。
[0091] “有风险”受试者是健康开业医师认为有可能罹患在此提供的疾病或病状的受试者，该疾病或病状包括但不限于感染、感染性疾病、癌症或成瘾。
[0092] “B细胞抗原”意指B细胞中或B细胞所识别并且在B细胞中触发免疫应答的任何抗原(例如由B细胞上的B细胞受体所特异性识别的抗原)。在一些实施方案中，是T细胞抗原的抗原也是B细胞抗原。在其他实施方案中，T细胞抗原并不也是B细胞抗原。B细胞抗原包括但不限于：蛋白质、肽、小分子、碳水化合物、寡糖以及多糖。在一些实施方案中，B细胞抗原是非蛋白质抗原(即不是蛋白质或肽抗原)。在一些实施方案中，B细胞抗原包括与感染因子缔合的碳水化合物、寡糖或多糖。在一些实施方案中，B细胞抗原包括与感染因子缔合的糖蛋白或糖肽。感染因子可以是细菌、病毒、真菌、原生动物或寄生虫。在一些实施方案中，B细胞抗原包括免疫原性差的抗原。在一些实施方案中，B细胞抗原包括滥用的或上瘾的物质或其一部分或类似物。上瘾的物质包括但不限于烟碱、麻醉药、咳嗽抑制剂、安神剂、以及镇静剂。在一些实施方案中，B细胞抗原包括毒素，如来自化学武器或天然来源的毒素。B细胞抗原还可以包括危险的环境因素。在一些实施方案中，B细胞抗原包括一种自身抗原。在其他实施方案中，B细胞抗原包括异体抗原、变应原、接触性致敏原、退行性疾病抗原、半抗原、感染性疾病抗原、癌抗原、特应性疾病抗原、自身免疫疾病抗原、上瘾的物质、异种抗原、或代谢性疾病酶或其酶产物。
[0093] “偶合”或“偶合了”或“偶合了的”(等等)意指使一种实体(例如部分)与另一个在化学上缔合。在一些实施方案中，偶合是共价的，意指偶合在两个实体之间存在共价键的情况下发生。在非共价的实施方案中，通过非共价相互作用介导非共价偶合，这些非共价相互作用包括但不限于：电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或它们的组合。在实施方案中，封装是偶合的一种形式。
[0094] “衍生”意指从原始来源改编或修改。举例来说，作为一个非限制性实例，衍生自感染性病毒株的肽抗原可以具有数个非天然氨基酸残基，这些非天然氨基酸残基取代感染性病毒株中可见的原始抗原中可见的天然氨基酸残基。这些改编或修饰可以由于种种原因，包括但不限于增加的特异性、更容易的抗原加工、或改进的安全性。
[0095] 在实施方案中，具有与天然肽或核酸(优选天然共同肽或核酸)仅50％一致性的肽或核酸将被称为衍生自天然肽或核酸。在实施方案中，对物质实质上进行修饰。实质上经过修饰的物质意指经过修饰使得该修饰显著影响所讨论物质的化学或免疫学特性的物质。如果所述衍生的肽和核酸相比于天然肽或核酸具有改变的化学或免疫学特性，那么衍生的肽和核酸还可以包括具有与天然肽或核酸序列大于50％一致性的序列的那些。这些化学或免疫学特性包括亲水性、稳定性、亲和性、以及与载体(如合成纳米载体)偶合的能力。
[0096] “剂型”意指在培养基、载体、媒剂或器件中的适用于给予受试者的药理学和/或免疫学活性物质(如疫苗)。
[0097] “封装”或“封装的”意指密封在合成纳米载体内，优选完全密封在合成纳米载体内。被封装的大部分或所有物质不暴露于合成纳米载体外的局部环境。封装与吸收不同，吸收将大部分或所有物质放置在合成纳米载体的表面上，并且使物质暴露于合成纳米载体外的局部环境。
[0098] “在免疫上不同”是指在通过免疫产生的血清产生一个针对各表面抗原的独特的抗体应答谱图时可以指出的某些表面抗原之间的差异。表面抗原特异性抗体将仅识别一个特异性组的表面抗原，并且将以可区别的结合模式结合到其他组的表面抗原上。举例来说，如果用一组表面抗原A免疫，那么所产生的抗血清将结合到表面抗原A的组，但不结合到表面抗原B的组。如果两个或更多个表面抗原组合在单个合成纳米载体上，那么可以设计将相对于两组表面抗原区分血清的结合模式的淘选分析。在实施方案中，第一组表面抗原和第二组表面抗原在免疫上不同。在其他实施方案中，第一组表面抗原、第二组表面抗原以及第三组表面抗原全部在免疫上不同。
[0099] “感染”或“感染性疾病”是由微生物、病原体或其他因子(如细菌、真菌、朊病毒或病毒)引起的任何病状或疾病。在此提供的本发明组合物的表面抗原可以从任何感染因子获得或衍生，例如在此提供的可以引起感染或感染性疾病的那些。
[0100] “感染性属”意指包括能够感染受试者的有机体的属。在实施方案中，表面抗原可以从第一感染性属获得或衍生，或从第二感染性属获得或衍生。在实施方案中，该第一感染性属与该第二感染性属相同。在其他实施方案中，该第一感染性属与该第二感染性属不同。
[0101] “感染性种”意指包括能够感染受试者的有机体的种。在实施方案中，表面抗原可以从第一感染性种获得或衍生，或从第二感染性种获得或衍生。在实施方案中，该第一感染性种与该第二感染性种属于相同属。在其他实施方案中，该第一感染性种与该第二感染性种也相同。在一些实施方案中，该第一感染性种与该第二感染性种不同，但属于相同属。在其他实施方案中，这些不同的感染性种属于不同的属。
[0102] “感染性病毒株”意指包括能够感染受试者的有机体的病毒株。在实施方案中，表面抗原可以从第一感染性病毒株获得或衍生，或从第二感染性病毒株获得或衍生。在实施方案中，该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株属于相同种。在其他实施方案中，该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株也相同。在又其他实施方案中，他们属于相同种，但属于不同病毒株。在一些实施方案中，该第一感染性病毒株与该第二感染性病毒株属于不同种，但属于相同属。
[0103] “分离的核酸”意指从核酸的天然环境中分离并且以足以允许鉴别或使用的数量存在的核酸。分离的核酸可以是(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增；(ii)通过克隆重组生产；(iii)如通过切割和凝胶分离进行纯化；或(iv)通过例如化学合成而合成的核酸。分离的核酸是可以通过本领域中众所周知的重组DNA技术容易地操作的核酸。因此，认为已知5′和3′限制位点或已披露聚合酶链反应(PCR)引物序列的载体中包含的核苷酸序列是分离的，但以天然状态存在于天然宿主中的核酸序列不是。分离的核酸可以是实质上纯化的，但不必是。举例来说，在克隆或表达载体内分离的核酸是不纯的，因为它可能包含仅微小百分比的它所存在的细胞中的物质。但是，如同在此使用该术语，该核酸为分离的，因为它可以通过本领域的普通技术人员已知的标准技术容易地操作。在此提供的任何核酸可以是分离的。在一些实施方案中，在此提供的组合物中的抗原以分离的核酸的形式存在，如编码抗原肽、多肽或蛋白质的分离的核酸。
[0104] “分离的肽、多肽或蛋白质”意指肽、多肽或蛋白质从它的天然环境分离并且以足以允许其鉴别或使用的数量存在。这表示例如这些多肽可以被(i)通过表达克隆选择性地生产或(ii)如通过色谱法或电泳进行纯化。分离的肽、多肽或蛋白质可以是(但不必是)实质上纯的。因为分离的肽、多肽或蛋白质可以与药物制剂中的药物学上可接受的载体混合，所以肽、多肽或蛋白质可以仅占该制剂的小重量百分比。尽管如此，该肽、多肽或蛋白质是分离的，因为它已经与生物系统中它可能缔合的物质分开，即与其他肽、多肽或蛋白质分离。在此提供的任何肽、多肽或蛋白质可以是分离的。在一些实施方案中，在此提供的组合物中的抗原是肽、多肽或蛋白质。
[0105] “合成纳米载体的最大尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。举例来说，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大和最小尺寸应该是实质上一致的，并且应该是它的直径的大小。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸应该是它的高度、宽度或长度中最小的那个，而合成纳米载体的最大尺寸应该是它的高度、宽度或长度中最大的那个。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸是大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸等于或大于110nm，更优选等于或大于120nm，更优选等于或大于130nm，并且再更优选等于或大于150nm。本发明的合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以取决于实施方案而变化。举例来说，合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以从1∶1到1,000,000∶1、优选从1∶1到100,000∶1、更优选从1∶1到1000∶1、再优选从1∶1到100∶1、并且又更优选从1∶1到10∶1变化。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm、并且再更优选等于或小于500nm。在优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少
90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm、并且仍更优选等于或大于150nm。通过将这些合成纳米载体悬浮在一种液体(通常是水性)介质中，并且使用动态光散射(例如使用一台Brookhaven ZetaPALS仪器)获得合成纳米载体大小的测量值。
90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm、并且仍更优选等于或大于150nm。通过将这些合成纳米载体悬浮在一种液体(通常是水性)介质中，并且使用动态光散射(例如使用一台Brookhaven ZetaPALS仪器)获得合成纳米载体大小的测量值。
[0106] “分子量小于10,000”意指基于分子的分子结构计算的分子量小于10,000。
[0107] “获得”意指从一个来源获得不进行实质性修饰。实质性修饰是显著影响所讨论物质的化学或免疫学特性的修饰。举例来说，作为一个非限制性实例，序列与天然肽或核苷酸序列(优选天然共同肽或核苷酸序列)具有大于90％、优选大于95％、优选大于97％、优选大于98％、优选大于99％、优选100％的一致性，并且具有不显著不同于天然肽或核酸的化学和/或免疫学特性的肽或核酸将被称为是获自天然肽或核苷酸序列。这些化学或免疫学特性包括亲水性、稳定性、亲和性、以及与载体(如合成纳米载体)偶合的能力。在实施方案中，所获得的物质已取自原始来源并且未曾进行改编或修饰。举例来说，在实施方案中，获自一种来源的抗原可以包括可见于此来源中的原始氨基酸残基序列。在其他实施方案中，举例来说，获自一种来源的抗原可以包括可见于此来源中的原始分子结构。
[0108] “一种或多种寡糖”意指包含几个(典型地两个到二十个)通过糖苷键连接的糖单元的糖聚合物。在高数目糖单元下，寡糖可以包括多糖。
[0109] “一种或多种肽”意指包含主要通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键接合在一起的氨基酸残基并且具有100个或更少的氨基酸残基的化合物。出于不同的目的，如稳定或偶合，肽中的某些肽键可以由其他键类型替代。
[0110] “药物学上可接受的赋形剂(或载体)”意指与所述合成纳米载体一起用来配制本发明的组合物的药理学上无活性的物质。药理学上无活性的物质可以添加到本发明的剂型中以进一步促进组合物的给予。药物学上可接受的赋形剂包括本领域中已知的多种物质，包括但不限于糖(如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(如抗微生物剂)、复水助剂、着色剂、生理盐水(如磷酸盐缓冲的生理盐水)以及缓冲剂。药物学上可接受的赋形剂的实例(但不限于)包括碳酸钙、磷酸钙、不同的稀释剂、不同的糖以及各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇、防腐剂、不同的药物载体、无菌生理盐水、冻干稳定剂等。组合物可以使用常规的药物制造和配合技术获得有用剂型来制备。在一个实施方案中，本发明的合成纳米载体与防腐剂一起悬浮于供注射的无菌的生理盐水溶液中。
[0111] “一种或多种多糖”意指由许多通过糖苷键连接的糖单元构成的糖聚合物。在低数目糖单元下，多糖可以包括寡糖。
[0112] “群”意指共享一个或多个共同的物理或化学特征的合成纳米载体的一个定义组。共同的物理或化学特征可以包括具有一组共同的表面抗原、共同的偶合佐剂、构成大块纳米载体的共同的材料、共同的形状、共同的粒度，等等。可以鉴别多个群的合成纳米载体，例如第一群、第二群、第三群、第四群，等等。在一个实施方案中，可以呈现三个或更多个群的合成纳米载体，优选地其中各群合成纳米载体包括一组表面抗原；并且其中各组表面抗原在结构上或在免疫上彼此不同。
[0113] “一种或多种蛋白质”意指分子量典型地大于1000道尔顿的包含主要通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键接合在一起的氨基酸残基的化合物。蛋白质还可以包括其他键结结构，如二级结构、三级结构，等等。出于不同的目的，例如稳定或偶合，蛋白质中的某些肽键可以由其他键类型替代。
[0114] “单价表面抗原的组”意指一组表面抗原，其中表面抗原不是不同，优选地不是在结构上和/或在免疫上不同。在实施方案中，单价表面抗原的组包含多个复本的一种类型的不是在结构上或在免疫上不同的表面抗原(即多个复本的相同抗原)。在一些实施方案中，多个复本的此相同抗原可以串联(strung)在一起，如美国公布2003/0223938中说明的那样。包含多个复本的一种类型的不是在结构上或在免疫上不同的表面抗原的一组单价的表面抗原不是一组低价(或多价)的表面抗原。
[0115] “低价(或多价)的表面抗原的组”意指一组表面抗原，其中存在有限数目、即大于一个的不同类型的表面抗原，优选地其中差异包括结构差异和/或免疫学差异。在优选实施方案中，该组中的有限数目的表面抗原包括2到15种类型的表面抗原，优选地2到10种类型的表面抗原，更优选地2到8种类型的表面抗原，更优选地2到7种类型的表面抗原，更优选地2到6种类型的表面抗原，更优选地2到5种类型的表面抗原，更优选地2到4种类型的表面抗原，更优选地2到3种类型的表面抗原，并且甚至更优选地2种类型的表面抗原。在其他实施方案中，该低价(或多价的表面抗原)的组包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种或更多种类型的表面抗原。
[0116] “表面抗原的组”意指一组经过鉴别的表面抗原，优选地基于它们的特性、优选地它们的结构和/或它们的免疫学特性通过测量和/或预测来鉴别。一组表面抗原可以基于使用用于合成该组表面抗原和/或包括该组表面抗原的合成纳米载体的群的化学合成方法以及用于偶合它们的化学方法进行预测来部分地或完全地进行鉴别。可以鉴别多个组的表面抗原；例如第一组、第二组、第三组等。
[0117] “在结构上不同”或“结构差异”意指呈现不同的用于与B细胞受体相互作用的分子结构。在实施方案中，此差异可以通过比较一组表面抗原中所呈现的抗原的占有率(prevalence)和类型与不同组表面抗原中所呈现的抗原的占有率和类型来表示。如果这些组之间的所呈现的抗原的占有率和/或类型不同，那么可以认为这些组的表面抗原在结构上不同。在实施方案中，所呈现的抗原的占有率和/或类型的差异可以通过比较用于产生表面抗原和/或将表面抗原偶合到合成纳米载体的一个表面的化学合成策略与配制策略来确定。举例来说，在一个实施方案中，如果使用一种或多种特别的化合物产生一组表面抗原，并且使用一种或多种不同的化合物产生另一组表面抗原，那么可以确定这两组表面抗原是不同的。在一个不同的实施方案中，如果使用三种化合物产生表面抗原以形成一个具有三个表面抗原的组，并且使用两种化合物产生其他的表面抗原以形成一个具有两个表面抗原的组，那么可以确定这两组表面抗原是不同的。在又另一个实施方案中，如果使用非不同的化学合成策略和配制策略(包括使用非不同量的物质--在实验误差范围内--在策略中)产生两组表面抗原并且(适当时)将这两组表面抗原偶合到合成纳米载体的表面上，并且这两组表面抗原具有相同的构象和定向，那么这两组表面抗原很可能不会在结构上不同。在实施方案中，第一组表面抗原与第二组表面抗原之间的结构差异包括非不同组的分子，这些分子所呈现的定向在第一组与第二组表面抗原之间不同。在实施方案中，第一组表面抗原与第二组表面抗原之间的结构差异包括非不同组的分子，这些分子所呈现的构象在第一组与第二组表面抗原之间不同。在实施方案中，第一组表面抗原与第二组表面抗原之间的结构差异包括多组分子，它们的分子结构在第一组与第二组表面抗原之间不同。
[0118] “受试者”意指动物，包括温血哺乳动物，如人类和灵长类动物；禽类；家庭驯养动物或农用动物，如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马以及猪；实验动物，如小鼠、大鼠以及天竺鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物；等。
[0119] “一种或多种表面抗原”意指可见于合成纳米载体的一个表面上或表面周围的抗原。在优选实施方案中，表面抗原包括B细胞抗原。在实施方案中，表面抗原偶合到合成纳米载体的一个表面上。
[0120] “一种或多种合成纳米载体”意指未见于自然界中并且拥有至少一个小于或等于5微米大小的尺寸的离散物体。总体上，包括白蛋白纳米颗粒作为合成纳米载体，但是，在某些实施方案中，合成纳米载体不包含白蛋白纳米颗粒。在实施方案中，本发明的合成纳米载体不包含壳聚糖。
[0121] 合成纳米载体可以是但不限于一个或多个基于脂质的纳米颗粒(例如脂质体)(在此还称为脂质纳米颗粒，即构成其结构的大多数物质是脂质的纳米颗粒)、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴克球、纳米线、病毒样颗粒(即主要由病毒结构蛋白质构成但不具有感染性或具有低感染性的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(在此还称为蛋白质颗粒，即构成其结构的大多数物质是肽或蛋白质的颗粒)(如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料的组合产生的纳米颗粒(如脂质-聚合物纳米颗粒)。合成纳米载体可以具有多种不同的形状，包括但不限于球状、立方形、金字塔形、长方形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包括一个或多个表面。可以适用于本发明的惯例中的示例性合成纳米载体包括：(1)格里夫(Gref)等人的美国专利
5,543,158中披露的生物可降解纳米颗粒，(2)索尔兹曼(Saltzman)等人的已公布的美国专利申请20060002852的聚合纳米颗粒，(3)德西蒙(DeSimone)等人的已公布的美国专利申请20090028910的用平版印刷法建构的纳米颗粒，(4)冯安德里安(von Andrian)等人的WO 2009/051837的披露，(5)Penades(佩纳德斯)等人的已公布的美国专利申请
2008/0145441中披露的纳米颗粒，(6)德洛斯里奥斯(de los Rios)等人的已公布的美国专利申请20090226525中披露的蛋白质纳米颗粒，(7)西贝(Sebbel)等人的已公布的美国专利申请20060222652中披露的病毒样颗粒，(8)巴赫曼(Bachmann)等人的已公布的美国专利申请20060251677中披露的与核酸偶合的病毒样颗粒，(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中披露的病毒样颗粒，或(10)保利赛利(P.Paolicelli)等人，“可以有效缔合并且递送病毒样颗粒的经过表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can EfficientlyAssociate and Deliver Virus-like Particles)”，纳米医学(Nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中披露的纳米沉淀的纳米颗粒。在实施方案中，合成纳米载体可以拥有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、
1∶5、1∶7、或大于1∶10的长宽比。
5,543,158中披露的生物可降解纳米颗粒，(2)索尔兹曼(Saltzman)等人的已公布的美国专利申请20060002852的聚合纳米颗粒，(3)德西蒙(DeSimone)等人的已公布的美国专利申请20090028910的用平版印刷法建构的纳米颗粒，(4)冯安德里安(von Andrian)等人的WO 2009/051837的披露，(5)Penades(佩纳德斯)等人的已公布的美国专利申请
2008/0145441中披露的纳米颗粒，(6)德洛斯里奥斯(de los Rios)等人的已公布的美国专利申请20090226525中披露的蛋白质纳米颗粒，(7)西贝(Sebbel)等人的已公布的美国专利申请20060222652中披露的病毒样颗粒，(8)巴赫曼(Bachmann)等人的已公布的美国专利申请20060251677中披露的与核酸偶合的病毒样颗粒，(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中披露的病毒样颗粒，或(10)保利赛利(P.Paolicelli)等人，“可以有效缔合并且递送病毒样颗粒的经过表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can EfficientlyAssociate and Deliver Virus-like Particles)”，纳米医学(Nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中披露的纳米沉淀的纳米颗粒。在实施方案中，合成纳米载体可以拥有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、
1∶5、1∶7、或大于1∶10的长宽比。
[0122] 根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括具有使补体活化的羟基的表面，或者可替代地包括基本由不是使补体活化的羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中，根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括实质上使补体活化的表面，或者可替代地包括基本由不实质上活化补体的部分组成的表面。在更优选的实施方案中，根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选地等于或小于
100nm的最小尺寸，不包括使补体活化的表面，或者可替代地包括基本由不使补体活化的部分组成的表面。在实施方案中，合成纳米载体排除病毒样颗粒。在实施方案中，当合成纳米载体包括病毒样颗粒时，病毒样颗粒包括非天然佐剂(意指VLP包含除VLP制造期间所产生的天然存在的RNA以外的佐剂)。在实施方案中，合成纳米载体可以拥有大于1∶1、
1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的长宽比。
100nm的最小尺寸，不包括使补体活化的表面，或者可替代地包括基本由不使补体活化的部分组成的表面。在实施方案中，合成纳米载体排除病毒样颗粒。在实施方案中，当合成纳米载体包括病毒样颗粒时，病毒样颗粒包括非天然佐剂(意指VLP包含除VLP制造期间所产生的天然存在的RNA以外的佐剂)。在实施方案中，合成纳米载体可以拥有大于1∶1、
1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的长宽比。
[0123] “T细胞抗原”意指由T细胞识别并且触发T细胞中的免疫应答的任何抗原(例如，由T细胞或NKT细胞上的T细胞受体经由呈现结合到I类或II类主要组织相容性复合分子(MHC)上或结合到CD1复合物上的抗原或它的一部分特异性识别的抗原)。在一些实施方案中，是T细胞抗原的抗原也是B细胞抗原。在其他实施方案中，T细胞抗原并不也是B细胞抗原。T细胞抗原总体上是蛋白或多肽。T细胞抗原可以是刺激CD8+T细胞应答、CD4+T细胞应答或两者的抗原。因此，在一些实施方案中，纳米载体可以有效地刺激两种类型的应答。
[0124] 在一些实施方案中，T细胞抗原是‘通用’T细胞抗原或T细胞记忆抗原(即受试者具有原有记忆并且可以用于加强T细胞对不相关抗原(例如不相关的B细胞抗原)的辅助的T细胞抗原)。通用T细胞抗原包括破伤风类毒素以及一种或多种衍生自破伤风类毒素、埃-巴二氏病毒或流感病毒的肽。通用的T细胞抗原还包括流感病毒的组分，如血球凝集素、神经氨酸酶或核蛋白或一种或多种从它们衍生的肽。在一些实施方案中，通用T细胞抗原不是存在于与MHC分子的复合物中的抗原。在一些实施方案中，通用T细胞抗原不与用于呈现到T辅助细胞上的MHC分子复合。因此，在一些实施方案中，通用T细胞抗原不是T辅助细胞抗原。然而，在其他实施方案中，通用T细胞抗原是T辅助细胞抗原。
[0125] 在实施方案中，T辅助细胞抗原可以包含一种或多种获自或衍生自以下物质的肽：破伤风类毒素、埃-巴二氏病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒、白喉类毒素或PADRE肽(从赛特(Sette)等人的美国专利7,202,351的工作中知晓)。在其他实施方案中，T辅助细胞抗原可以包含卵白蛋白或从它获得或衍生的肽。优选地，卵白蛋白包含如寄存编号AAB59956、NP 990483.1、AAA48998或CAA2371中所述的氨基酸序列。在其他实施方案中，获自或衍生自卵白蛋白的肽包含以下氨基酸序列：H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Arg-OH(SEQ ID NO：1)。在其他实施方案中，T辅助细胞抗原可以包含一种或多种脂质或糖脂，包括但不限于：α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)、α-键联的鞘糖脂(来自鞘氨醇单胞菌属)、半乳糖苷二酰基甘油(来自伯氏疏螺旋体)、脂磷酸聚糖(来自杜氏利什曼虫)以及磷脂酰肌醇四甘露糖苷(PIM4)(来自麻风分枝杆菌)。对于用作T辅助细胞抗原的另外的脂质和/或糖脂，参看塞昂多罗(V.Cerundolo)等人，“开发疫苗接种策略中的不变NKT细胞(Harnessing invariant NKT cells in vaccinationstrategies)”，自然免疫学评论(Nature Rev Immun)，9：28-38(2009)。
[0126] 在实施方案中，CD4+T细胞抗原可以是获自一个来源(如天然来源)的CD4+T细胞抗原的衍生物。在此类实施方案中，CD4+T细胞抗原序列(如结合到MHC II上的那些肽)可以与获自该来源的抗原具有至少70％、80％、90％或95％的一致性。在实施方案中，T细胞抗原、优选通用T细胞抗原或T辅助细胞抗原可以偶合到合成纳米载体上或与合成纳米载体去偶合。在一些实施方案中，通用T细胞抗原或T辅助细胞抗原封装在本发明的组合物的合成纳米载体中。
[0127] “表面抗原的类型”、“表面抗原类型”等意指表面抗原共享一个或多个共同的化学和/或免疫学特征的一个定义组。
[0128] “疫苗”意指改良对特定病原体或疾病产生的免疫应答的物质组合物。疫苗典型地含有刺激受试者的免疫系统的因子以将特异性抗原识别为外来的并且将它从受试者的体内去除。疫苗还建立免疫学‘记忆’，使得在一个人再受到攻击时，抗原将被快速识别并且产生应答。疫苗可以是预防性的(例如预防未来感染任何病原体)或治疗性的(例如针对肿瘤特异性抗原以治疗癌症的疫苗)。在实施方案中，疫苗可以包含根据本发明的剂型。
[0129] 纳米载体群和表面抗原组
[0130] 在实施方案中，多群合成纳米载体共享共同的物理或化学特征。在实施方案中，此类共同的物理或化学特征可以包括一组共同的表面抗原、共同的偶合佐剂、构成大块纳米载体的共同的材料、共同的形状、共同的粒度、共同的表面电荷等等。佐剂、材料、形状以及粒度的类型在本申请中论述。
[0131] 在实施方案中，一个群可以共享一组共同的表面抗原。这些共同的表面抗原可以基于共同的物理或化学特征(如但不限于结构或免疫学特性)而集中在一起。在实施方案中，共同的特征可以包括共同的定向或构象、或多组共享共同的分子结构的分子、或所有前述事项。在实施方案中，共同的表面抗原可以包括分子量小于10,000的表面抗原。在其他实施方案中，共同的表面抗原可以包括肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子。在又其他实施方案中，共同的表面抗原可以包括分子量小于10,000的那些，并且包括肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子。在其他实施方案中，共同的表面抗原可以根据它们所获自或衍生自的感染性有机体而集中在一起；并且因共享共同的属、种和/或病毒株而分类。在表面抗原的分子量小于10,000的实施方案中，共同的表面抗原可以根据分子类别而集中在一起，如化学战剂、环境毒素、上瘾的或滥用的物质、以及生理学内生分子，包括但不限于激素、脂质以及神经递质。在实施方案中，多组共同的表面抗原可以由它们体内诱导抗体应答的能力的强度来定义。举例来说，一组表面抗原可能具有体内诱导高亲和力抗体产生的能力，而另一组共同的表面抗原可以体内诱导低亲和力抗体产生。
[0132] 在实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)可以包括从感染因子获得或衍生的抗原。在一些实施方案中，感染因子是细菌、真菌、病毒、原生动物或寄生虫。在其他实施方案中，病毒是痘病毒、天花病毒、埃博拉病毒、马伯格氏病毒、麻疹病毒(在实施方案中，抗原可以从血球凝集素蛋白质、血球凝集素套索表位、血球凝集素氨基酸106-114和/或519-550等获得或衍生)、登革热病毒、流感病毒、A型流感病毒(在实施方案中，抗原可以从HA蛋白质、M2e蛋白质等获得或衍生)、流感H5N1病毒、流感H1N1病毒、感染性鲑鱼贫血病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷性病毒、人类乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒、JC病毒、弹状病毒、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、乳头瘤病毒(在实施方案中，抗原可以从L1或L2蛋白质获得或衍生)、细小病毒、细小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、引起流行性腮腺炎的病毒、引起狂犬病的病毒、呼肠孤病毒、风疹病毒、披衣病毒、正粘病毒、反向病毒、嗜肝DNA病毒、柯萨奇病毒、马脑炎病毒、蜱媒脑炎、日本脑炎病毒、黄热病毒、立谷热病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒或E型肝炎病毒。
[0133] 在实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自下表1所示的病毒科的病毒。在另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表1中所提供的种的病毒。在再另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表1中所提供的抗原。
[0134] 表1：病毒性感染因子
[0135]
[0136]
[0137]
[0138] 在其他实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)可以包括从细菌性有机体获得或衍生的抗原，如疏螺旋体种(Borreliaspecies)、炭疽杆菌、伯氏疏螺旋体、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、空肠弯曲杆菌、衣原体种(Chlamydia species)、鹦鹉披衣菌、沙眼衣原体、梭菌种(Clostridium species)、破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、白喉杆菌、考克斯氏体种(Coxiella species)、肠球菌种(Enterococcusspecies)、埃里克体种(Erlichia species)、大肠埃希氏杆菌、土弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌种(Haemophilus species)、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、乳杆菌种(Lactobacillus species)、军团杆菌种(Legionella species)、嗜肺军团杆菌、问号钩端螺旋体、李斯特菌种(Listeria species)、单核细胞增多性李斯特菌、分枝杆菌种(Mycobacterium species)、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、支原体种(Mycoplasma species)、肺炎支原体、奈瑟菌种(Neisseria species)、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、肺炎球菌种(Pneumococcus species)(例如类型6A、6B、3、4、14、19F等)、假单胞菌种(Pseudomonas species)、绿脓假单胞菌、沙门氏菌种(Salmonellaspecies)、伤寒沙门菌、肠道沙门菌、立克次体种(Rickettsia species)、立氏立克次体、伤寒立克次体、志贺氏杆菌种(Shigella species)、葡萄球菌种(Staphylococcus species)、金黄色葡萄球菌、链球菌种(Streptococcusspecies)、肺炎链球菌、化脓性链球菌、变形链球菌、密螺旋体种(Treponema species)、苍白密螺旋体、弧菌种(Vibrio species)、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌，等等。
[0139] 在实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自下表2所示的细菌属的细菌。在另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表2中所提供的细菌种。在再另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表2中所提供的抗原。
[0140] 表2：细菌性感染因子
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] 在又其他实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)可以包括从真菌、原生动物和/或寄生有机体的抗原获得或衍生的抗原，如曲霉种、念珠菌种、白色念珠菌、热带假丝酵母、隐球菌种、新型隐球菌、溶组织内阿米巴、荚膜组织胞浆菌、利什曼虫种，星形诺卡菌、镰状疟原虫、刚地弓形虫、阴道毛滴虫、弓形虫种、布鲁斯锥虫、曼氏血吸虫，等等。
[0146] 在又其他实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)可以包括从毒素获得或衍生的抗原，如O-烷基(＜C10，包括环烷基)烷基(Me、Et、n-Pr或i-Pr)-氟膦酸酯(例如沙林：甲基氟膦酸O-异丙酯，梭曼：甲基氟膦酸O-叔己酯)、O-烷基(＜C10，包括环烷基)N，N-二烷基(Me、Et、n-Pr或i-Pr)磷酰胺基氰酸酯(phosphoramidocyanidates)(例如塔崩：N，N-二甲基磷酰胺基氰酸O-乙酯)、O-烷基(H或＜C10，包括环烷基)S-2-二烷基(Me、Et、n-Pr或i-Pr)-氨乙基烷基(Me、Et、n-Pr或i-Pr)硫代膦酸酯以及相对应的烷基化或质子化的盐(例如VX：O-乙基S-2-二异丙基氨基乙基甲基硫代膦酸酯)、硫芥子气：2-氯乙基氯甲基硫醚，芥子气：双(2-氯乙基)硫醚、双(2-氯乙基硫基)甲烷，倍半芥子气：1，2-双(2-氯乙基硫基)乙烷、1，3-双(2-氯乙基硫基)-正丙烷、1，4-双(2-氯乙基硫基)-正丁烷、1，5-双(2-氯乙基硫基)-正戊烷、双(2-氯乙基硫基甲基)醚，O-芥类：双(2-氯乙基硫基乙基)醚；路易氏气类，路易氏气
1：2-氯乙烯基二氯胂，路易士气2：双(2-氯乙烯基)氯胂，路易士气3：三(2-氯乙烯基)胂，氮芥类：HN1：双(2-氯乙基)乙胺，HN2：双(2-氯乙基)甲胺，HN3：三(2-氯乙基)胺，石房蛤毒素，篦麻毒素，胺吸磷：O，O-二乙基S-(2-(二乙基氨基)乙基)硫代膦酸酯和相对应的烷基化或质子化的盐，PFIB：1，1，3，3，3-五氟-2-(三氟甲基)-1-丙烯、二苯乙醇酸
3-奎宁环基酯(BZ)；光气：碳酰二氯、氯化氰、氰化氢；以及氯化苦：三氯硝基甲烷。
1：2-氯乙烯基二氯胂，路易士气2：双(2-氯乙烯基)氯胂，路易士气3：三(2-氯乙烯基)胂，氮芥类：HN1：双(2-氯乙基)乙胺，HN2：双(2-氯乙基)甲胺，HN3：三(2-氯乙基)胺，石房蛤毒素，篦麻毒素，胺吸磷：O，O-二乙基S-(2-(二乙基氨基)乙基)硫代膦酸酯和相对应的烷基化或质子化的盐，PFIB：1，1，3，3，3-五氟-2-(三氟甲基)-1-丙烯、二苯乙醇酸
3-奎宁环基酯(BZ)；光气：碳酰二氯、氯化氰、氰化氢；以及氯化苦：三氯硝基甲烷。
[0147] 在其他实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自下表3所示的真菌属的真菌。在另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表3中所提供的真菌种。在再另一个实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)包括或获自或衍生自表3中所提供的抗原。
[0148] 表3：真菌感染因子
[0149]
[0150]
[0151] 在再另外的实施方案中，一组表面抗原(例如第一和/或第二组表面抗原)可以包括从滥用的或上瘾的物质获得或衍生的抗原。在一些实施方案中，滥用的或上瘾的物质是一种药物，如非法药物、非处方药物或处方药物。在其他实施方案中，滥用的或上瘾的物质具有改变情绪的作用，且因此包括吸入剂和溶剂。在其他实施方案中，滥用的或上瘾的物质是没有改变情绪的作用或中毒性质的物质，且因此包括同化类固醇。滥用的或上瘾的物质包括但不限于大麻素(例如印度大麻、大麻)、镇静剂(例如巴比妥、苯二氮卓、氟硝西泮(Rohypnol)、GHB、安眠酮(quaaludes))、解离麻醉剂(例如开他敏、PCP)、迷幻剂(例如LSD、墨斯卡灵、裸头草碱)、类鸦片物质和吗啡衍生物(例如可待因、芬太尼、海洛因、吗啡、鸦片)、兴奋剂(安非他明、可卡因、迷幻药(Ecstacy)(MDMA)、脱氧麻黄碱、哌醋甲酯(利他林)、烟碱)、同化类固醇以及吸入剂。在实施方案中，抗原包括可卡因类似物，如去甲可卡因。在其他实施方案中，抗原包括可铁宁。
[0152] 在本发明的实施方案中，可以组合各自包含一组表面抗原的不同群的合成纳米载体。群之间的差异是基于多组表面抗原之间的差异。
[0153] 在某些实施方案中，这些差异可以包含物理或化学特征的差异，如但不限于结构或免疫学特性。在实施方案中，这些差异可以包含表面抗原定向或构象的差异或多组表面抗原之间的分子结构的差异。在又其他实施方案中，表面抗原的差异可以基于它们所获自或衍生自的感染性有机体；并且将因来自不同的属、种和/或病毒株而分类。在表面抗原的分子量小于10,000的实施方案中，表面抗原可以基于化学类别而不同，如化学战剂、上瘾的或滥用的物质、以及内生分子，包括但不限于激素、脂质以及神经递质。
[0154] 在实施方案中，这些差异可以包括表面抗原定向或构象的差异。举例来说，表面抗原连接到合成纳米载体上的不同连接点将引起该表面抗原的不同呈现。这些不同呈现可以产生识别表面抗原的不同表位的抗体。表面抗原可以用不同构象呈现，并且可以被合成或修饰以实现这些构象。举例来说，可以执行肽或蛋白质截断，其中在所关心的肽或蛋白质抗原中产生修饰的构象变化。可替代地，可以添加氨基酸或化学连接物以增加长度或使改变肽或蛋白质抗原暴露的特定定向稳定。类似地，如分子量小于10,000的抗原、或寡糖、或多糖可以通过添加化学连接物或化学修饰来改变。
[0155] 在其他实施方案中，合成纳米载体的群之间的差异可以基于表面抗原的组之间基于不同的分子结构和/或抗原占有率的差异。在一些实施方案中，差异可以包括这些组之间的表面抗原的一个或多个类型的占有率的差异。
[0156] 在一个群包含一组单价的表面抗原的实施方案中，这组表面抗原的分子结构、优选地抗原类型可以不同于另一群或其他群的一组单价的表面抗原的分子结构。在一个群包含一组单价的表面抗原的某些实施方案中，它的表面抗原的组包含的表面抗原占有率可以不同于另一群或其他群的一组单价的表面抗原所包含的表面抗原占有率。
[0157] 在一群合成纳米载体包含一组低价(或多价)的表面抗原的实施方案中，不同占有率的不同抗原类型可以在该组内组合以形成此类表面抗原类型的组合。因此，在至少一群合成纳米载体包含一组低价(或多价)的表面抗原的实施方案中，该组低价(或多价)的表面抗原的分子结构(可以用每一类型的抗原的分子结构随它们在该组内的占有率的变化来表示)可以不同于另一群或其他群的该组表面抗原的分子结构。在实施方案中，此可能是因为另一群包含一组单价的表面抗原(其中根据定义这些组的表面抗原将不同)或因为另一群包含一组低价(或多价)的表面抗原，其中这两组表面抗原的分子结构(以每一类型的抗原的分子结构和/或各抗原类型在该组内的占有率表示)是不同的。
[0158] 举例来说，这些组的表面抗原可以包含一组对映体，如(R)和(S)烟碱。对映体可以等量地存在于相同或不同的纳米载体上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上。在另一个实施方案中，一组表面抗原可以包含光学纯的或外消旋的两个在结构上不同但相关的分子，如可铁宁和烟碱。可铁宁和烟碱可以等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上。另外，多组表面抗原可以包含来自单个包含几种血清型的有机体的抗原，如来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F以及23F的荚膜抗原性多糖。不同的抗原可以等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上。在实施方案中，多组表面抗原可以包含来自单个有机体的一族不同的抗原，如人类乳头瘤病毒的衣壳蛋白L1和L2。这些组的表面抗原可以等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上。在实施方案中，这些组的表面抗原可以包含具有互异的结构的几种小分子，如毒气战剂VX、沙林以及梭曼。不同的化合物可以等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成纳米载体上。举例来说，在一个实施方案中，一组表面抗原可以包含50％VX和
50％沙林，而另一组表面抗原可以包含80％VX和20％沙林，其中表面抗原的百分比可以是重量百分比或摩尔百分比，并且基于表面抗原的总重量或总摩尔数。
50％沙林，而另一组表面抗原可以包含80％VX和20％沙林，其中表面抗原的百分比可以是重量百分比或摩尔百分比，并且基于表面抗原的总重量或总摩尔数。
[0159] 在实施方案中，表面抗原的组的差异可以包含提供包含一组来自一种类型或多种类型的表面抗原(例如分子量小于10,000和/或是肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子)的一群合成纳米载体；并且然后提供包含一个不同组的来自一种类型或多种类型的表面抗原(例如分子量小于10,000和/或是肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子)的另一群合成纳米颗粒。
[0160] 在实施方案中，当第一组表面抗原包含分子量小于10,000的表面抗原时，第二组表面抗原包含肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子(只要这些组在结构上或在免疫上不同)。在实施方案中，当第一组表面抗原包含含肽的表面抗原时，第二组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含蛋白质、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第一组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原时，第二组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第一组表面抗原包含含寡糖的表面抗原时，第二组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第一组表面抗原包含含多糖的表面抗原时，第二组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、寡糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第一组表面抗原包含含小分子的表面抗原时，第二组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、寡糖或多糖的表面抗原(只要这些组在结构上或在免疫上不同)。
[0161] 在实施方案中，当第二组表面抗原包含分子量小于10,000的表面抗原时，第一组表面抗原包含肽、蛋白质、寡糖、多糖或小分子(只要这些组在结构上或在免疫上不同)。在实施方案中，当第二组表面抗原包含含肽的表面抗原时，第一组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含蛋白质、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第二组表面抗原包含含蛋白质的表面抗原时，第一组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第二组表面抗原包含含寡糖的表面抗原时，第一组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、多糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第二组表面抗原包含含多糖的表面抗原时，第一组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、寡糖或小分子的表面抗原。在实施方案中，当第二组表面抗原包含含小分子的表面抗原时，第一组表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白质、寡糖或多糖的表面抗原(只要这些组在结构上或在免疫上不同)。
[0162] 合成纳米载体的群之间的其他差异可以基于表面抗原的组之间基于抗原的来源的差异。举例来说，在一个实施方案中，此类差异可以基于获得或衍生表面抗原的感染性属、种和/或病毒株的差异。举例来说，一群合成纳米载体可以包括一组从以下细菌性来源(如大肠埃希氏杆菌、结核分枝杆菌、破伤风梭菌或炭疽杆菌)获得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一组从病毒性来源(如流感病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒以及人类疱疹病毒)获得或衍生的表面抗原。在实施方案中，一群合成纳米载体可以包括一组从以下细菌性来源(如以上指出的那些)获得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一组从真菌(例如白色念珠菌或伊氏肺孢子虫)获得或衍生的表面抗原。在其他实施方案中，一群合成纳米载体可以包括一组从以下病毒性来源获得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一组从寄生虫(如镰状疟原虫)获得或衍生的表面抗原。按照以上说明的其他组合和子组合涵盖在本发明的范围内。
[0163] 在其他实施方案中，不同组的表面抗原可以从并非不同的感染性属、种或病毒株获得或衍生。在实施方案中，这些差异可以起因于对感染性属、种或病毒株内的不同抗原的选择。举例来说，一组表面抗原可以从一种病毒性外壳蛋白获得或衍生，而另一组表面抗原可以从来自同一病毒的相同或另一病毒性外壳蛋白的不同表位获得或衍生。在一个实施方案中，不同组的表面抗原可以从一种可以包括几个独特的表位的病毒蛋白质(例如巨细胞病毒(CMV)衣壳蛋白质或其他CMV蛋白质)获得或衍生。同样地，不同组的表面抗原可以从白喉或破伤风毒素的不同表位获得或衍生。
[0164] 在其他实施方案中，合成纳米载体的群之间的差异可以基于表面抗原的组之间基于不同化学类别的抗原的差异。举例来说，在分子的分子量小于10,000的情况下，此类差异可以基于化学骨架或整个分子结构或此类分子展现的活性的差异。举例来说，不同的表面抗原的组可以从结构不同但活性类似的表面抗原的组(如类鸦片类，如吗啡和海洛因)获得或衍生。在其他实施方案中，不同组的表面抗原可以包含结构类似但活性不同的分子，示例的是对映异构体，如(R)和(S)利他林或(R)和(S)烟碱。在实施方案中，表面抗原的组之间的差异可以包括化合物和它们的代谢产物，如特非那定和非索非那丁或阿斯特马唑(astemazole)和降阿斯特马唑(norastemazole)。表面抗原的组之间的差异还可以基于化合物结构的不相关性，如烟碱和脱氧麻黄碱。
[0165] 在其他实施方案中，合成纳米载体的群之间的差异可以基于表面抗原的组之间基于表面抗原的组之间的免疫学差异的差异。在实施方案中，表面抗原的组可以由它们体内诱导免疫应答的能力来定义。举例来说，一个表面抗原的组可能具有体内诱导高水平的高亲和力抗体产生所关心的抗原的能力，而第二组表面抗原可能不体内诱导高水平的高亲和力抗体产生该抗原。作为另一个实例，第一组表面抗原可以具有产生对第一组表面抗原的抗原具有特异性的抗体滴度的能力，而第二组表面抗原可以具有产生对第二组表面抗原的抗原具有特异性的抗体滴度的能力。在实施方案中，第二组表面抗原产生对第二组表面抗原的抗原而不是对第一组抗原具有特异性的抗体滴度。
[0166] 本发明组合物和相关方法
[0167] 合成纳米载体可以使用本领域已知的多种多样的方法来制备。举例来说，合成纳米载体可以由如以下的方法形成：纳米沉淀、使用射流通道的流动聚焦、喷雾干燥、单一和双重乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳液工序、微制造、纳米制造、牺牲层、简单和复杂的凝聚、以及本领域普通技术人员熟知的其他方法。可替代地或另外地，已经描述了单分散半导体、传导性、磁性、有机以及其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(普莱伊亚诺(Pellegrino)等人，2005，微小(Small)，1：48；默瑞(Murray)等人，2000，材料科学评论年报(Ann.Rev.Mat.Sci.)，30：545；以及特林达迪(Trindade)等人，2001，化学材料(Chem.Mat.)，13：3843)。文献中已经描述了另外的方法(参看例如达保罗(Doubrow)编，“医学和药学中的微胶囊和纳米粒子(Microcapsules and Nanoparticles inMedicine and Pharmacy)，”CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton)，1992；马西威兹(Mathiowitz)等人，1987，控释杂志(J.Control.Release)，5：13；马西威兹等人，1987，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6：275；以及马西威兹等人，1988，应用聚合物科学杂志(J.Appl.Polymer Sci.)，35：755，并且还参看美国专利5578325和6007845；保利赛利等人，“可以高效缔合并且递送病毒样颗粒的经过表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can EfficientlyAssociate and Deliver Virus-like Particles)”纳米医学(Nanomedicine)，5(6)：843-853(2010))。
[0168] 在实施方案中，本发明包括用于呈现多组表面抗原、优选地多组单价的或低价的表面抗原的合成纳米载体装置。一个特别的本发明实施方案包括一个用于呈现第一组表面抗原、优选地第一组单价的或低价的表面抗原的第一合成纳米载体装置；和一个用于呈现第二组表面抗原、优选地第二组单价的或低价的表面抗原的第二合成纳米载体装置。用于呈现表面抗原的此类合成纳米载体装置在本披露中披露，并且涵盖在此披露的实施方案。
[0169] 希望时，可以使用多种方法将不同的材料封装于合成纳米载体中，这些方法包括但不限于阿斯特提(C.Astete)等人，“PLGA纳米颗粒的合成和表征
(Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles)”生物材料杂志聚合物辑(J.Biomater.Sci.Polymer Edn)，第17卷，第3期，第247-289页(2006)；阿沟司达奇斯(K.Avgoustakis)“聚乙二醇化聚(丙交酯)与聚(丙交酯-共-乙交酯)
纳米颗粒：制备、特性以及在药物递送中的可能的应用(Pehylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in DrugDelivery)”当前药物递送(Current Drug Delivery)1：
321-333(2004)；瑞斯(C.Reis)等人，“纳米封装I.用于制备药物负载的聚合的纳米颗粒的方法(Nanoencapsulation I.Methods for preparation of drug-loadedpolymeric nanoparticles)”纳米医学2：8-21(2006)；保利赛利等人，“可以高效缔合并且递送病毒样颗粒的经过表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒”纳米医学，5(6)：843-853(2010)。可以使用适合用于将物质(例如寡核苷酸)封装在合成纳米载体中的其他方法，包括但不限于在安格(Unger)的美国专利6,632,671(2003年10月14日)中披露的方法。
(Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles)”生物材料杂志聚合物辑(J.Biomater.Sci.Polymer Edn)，第17卷，第3期，第247-289页(2006)；阿沟司达奇斯(K.Avgoustakis)“聚乙二醇化聚(丙交酯)与聚(丙交酯-共-乙交酯)
纳米颗粒：制备、特性以及在药物递送中的可能的应用(Pehylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in DrugDelivery)”当前药物递送(Current Drug Delivery)1：
321-333(2004)；瑞斯(C.Reis)等人，“纳米封装I.用于制备药物负载的聚合的纳米颗粒的方法(Nanoencapsulation I.Methods for preparation of drug-loadedpolymeric nanoparticles)”纳米医学2：8-21(2006)；保利赛利等人，“可以高效缔合并且递送病毒样颗粒的经过表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒”纳米医学，5(6)：843-853(2010)。可以使用适合用于将物质(例如寡核苷酸)封装在合成纳米载体中的其他方法，包括但不限于在安格(Unger)的美国专利6,632,671(2003年10月14日)中披露的方法。
[0170] 在某些实施方案中，合成纳米载体通过纳米沉淀方法或喷雾干燥来制备。可以改变在制备合成纳米载体中使用的条件以产生具有希望的大小或特性(例如疏水性、亲水性、外部形态学、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如溶剂、温度、浓度、空气流速等)可以取决于有待偶合到合成纳米载体上的物质和/或该聚合物基质的构成。
[0171] 如果通过任何上述方法制备的颗粒具有所希望范围以外的尺寸范围时，可例如使用筛网、差示离心或沉降来定颗粒尺寸。
[0172] 本发明的合成纳米载体的要素，如包含一个免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基质、抗原、佐剂等等，可以例如通过一个或多个共价键偶合到合成纳米载体上或可以借助一个或多个连接物偶合。使合成纳米载体官能化的另外的方法可以由以下文献改编而来：萨尔茨曼(Saltzman)等人的公布的美国专利申请2006/0002852、德西蒙(DeSimone)等人的公布的美国专利申请2009/0028910、或默蒂(Murthy)等人的公布的国际专利申请WO/2008/127532A1。
[0173] 可替代地或另外地，合成纳米载体可以直接地或间接地经由非共价相互作用偶合到包含一个免疫特征表面的部分、靶向部分、佐剂、抗原和/或其他要素上。在非共价的实施方案中，通过非共价相互作用介导非共价偶合，这些非共价相互作用包括但但不限于：电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或它们的组合。此类偶合可以安排在一种本发明合成纳米载体的一个外表面或一个内表面上。在实施方案中，封装和/或吸附是偶合的一种形式。
[0174] 根据本发明，可以使用多种多样的合成纳米载体。在一些实施方案中，合成纳米载体是球形或球状体。在一些实施方案中，合成纳米载体是平坦的或板状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是立方体或立方形。在一些实施方案中，合成纳米载体是卵形或椭圆。在一些实施方案中，合成纳米载体是圆筒、圆锥或金字塔。
[0175] 在一些实施方案中，希望使用一群在大小、形状、和/或构成方面相对一致的合成纳米载体，这样每一合成纳米载体具有类似特性。例如，基于合成纳米载体的总数，至少80％、至少90％、或至少95％的合成纳米载体可以具有落在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％之内的最小尺寸或最大尺寸。在一些实施方案中，一群合成纳米载体就大小、形状、和/或构成而论可以是不均匀的。
[0176] 合成纳米载体可以是实心的或空心的，并且可以包括一个或多个层。在一些实施方案中，每一层相对于另一或其他层都具有独特的构成和独特的特性。为了给出但是一个实例，合成纳米载体可以具有一个核/壳结构，其中核是一层(例如一个聚合物核)并且壳是一个第二层(例如一个脂质双层或单层)。合成纳米载体可以包括多个不同的层。
[0177] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以任选地包括一种或多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种胶束。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一个核心，该核心包括一个由一种脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)环绕的聚合物基质。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一个非聚合核心(例如金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒性颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等等)，该核心由一个脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)环绕。
[0178] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种或多种聚合物。在一些实施方案中，此类聚合物可以由一个涂层(例如脂质体、脂质单层、胶束等)环绕。在一些实施方案中，这些合成纳米载体的不同的要素可以与聚合物偶合。
[0179] 在一些实施方案中，一个免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐剂和/或低聚核苷酸可以与一个聚合物基质共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合通过连接物介导。在一些实施方案中，一个免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐剂和/或低聚核苷酸可以与一个聚合物基质非共价缔合。例如，在一些实施方案中，一个免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐剂和/或低聚核苷酸可以被封装在聚合物基质内、被聚合物基质环绕、和/或被分散遍及聚合物基质。可替代地或另外地，一个免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐剂、和/或寡核苷酸可以通过疏水性相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质缔合。
[0180] 多种多样的聚合物和用于从其形成聚合物基质的方法常规地是已知的。总体来说，一种聚合物基质包括一种或多种聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。在序列方面，共聚物可以是无规的、嵌段的，或包含无规的和嵌段的序列的组合。根据本发明的聚合物典型地是有机聚合物。
[0181] 适合用于本发明的聚合物的实例包括但不限于聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚富马酸丙酯、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚己内酯、聚羟基酸(例如聚(β-羟基烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物、聚(乙亚胺)、聚(乙亚胺)-PEG共聚物、以及聚磷嗪。
[0182] 在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包括根据21C.F.R.§177.2600已经由美国食品与药品管理局(FDA)批准用于人类的聚合物，包括但但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。
[0183] 在一些实施方案中，聚合物可以是亲水性的。举例来说，聚合物可以包含阴离子基团(例如磷酸酯基、硫酸酯基、羧酸酯基)；阳离子基团(例如季胺基)；或极性基团(例如羟基、硫醇基、胺基)。在一些实施方案中，包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水性环境。聚合物的亲水性或疏水性的选择可以对合并(例如偶合)在合成纳米载体内的物质的性质具有影响。
[0184] 在一些实施方案中，聚合物可以用一个或多个部分和/或官能团修饰。根据本发明，可以使用多种部分或官能团。在一些实施方案中，可以用聚乙二醇(PEG)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖类的非环状聚缩醛来修饰聚合物(巴比索夫(Papisov)，2001，ACS研讨会系列(ACSSymposium Series)，786：301)。可以使用格里夫等人的美国专利号5543158、或冯安德里安等人的WO公布WO2009/051837中的全部传授内容进行某些实施方案。
[0185] 在一些实施方案中，聚合物可以用脂质或脂肪酸基团修饰。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸或二十四烷酸中的一种或多种。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是棕榈烯酸、油酸、异油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一种或多种。
[0186] 在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，这些共聚物包括乳酸和乙醇酸单元，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在此统称为“PLGA”；和包含乙醇酸单元的均聚物，在此称为“PGA”；和包含乳酸单元的均聚物，如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯以及聚-D，L-丙交酯，在此统称为“PLA”。在一些实施方案中，示例性的聚酯包括例如多羟基酸；PEG共聚物和丙交酯与乙交酯的共聚物，例如PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物以及它们的衍生物。在一些实施方案中，聚酯包括例如聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]以及它们的衍生物。
[0187] 在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是一种生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多种形式的PLGA特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸、或D，L-乳酸。可以通过改变乳酸∶乙醇酸的比率调整PLGA的降解速率。在一些实施方案中，根据本发明，将使用的PLGA特征在于大约85∶15、大约75∶25、大约60∶40、大约50∶50、大约40∶60、大约25∶75、或者大约15∶85的乳酸∶乙醇酸比率。
[0188] 在一些实施方案中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯、以及包括一种或多种以上聚合物的组合。丙烯酸聚合物可以包含丙烯酸和甲基丙烯酸酯与低含量季铵基团的全聚合共聚物。
[0189] 在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子型聚合物。通常，阳离子型聚合物能够缩合和/或保护核酸(例如DNA、或它的衍生物)的带负电的链。包含胺的聚合物(如聚(赖氨酸)(泽纳(Zauner)等人，1998，先进药物递送评论(Adv.Drug Del.Rev.)，30：97；和卡巴诺夫(Kabanov)等人，1995，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)，6：7)、聚(亚乙基亚胺)(PEI；博塞夫(Boussif)等人，1995，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，美国，1995，92：7297)和聚(酰胺基胺)树枝状聚合物(库沃斯卡-拉塔罗(Kukowska-Latallo)等人，1996，美国国家科学院院刊，美国，93：4897；唐(Tang)等人，1996，生物共轭化学，7：
703；和汉斯勒(Haensler)等人，1993，生物共轭化学，4：372))在生理pH下带正电，与核酸形成离子对，并且在多种细胞系中介导转染。在实施方案中，本发明的合成纳米载体可以不包含(或可以排除)阳离子型聚合物。
703；和汉斯勒(Haensler)等人，1993，生物共轭化学，4：372))在生理pH下带正电，与核酸形成离子对，并且在多种细胞系中介导转染。在实施方案中，本发明的合成纳米载体可以不包含(或可以排除)阳离子型聚合物。
[0190] 在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(普特南(Putnam)等人，1999，大分子(Macromolecules)，32：3658；巴雷拉(Barrera)等人，1993，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，115：11010；权(Kwon)等人，1989，大分子，22：3250；林(Lim)等人，1999，美国化学会志，121：5633；以及周(Zhou)等人，1990，大分子，23：3399)。这些聚合物的实例包括聚(L-丙交酯L-赖氨酸共聚物)(巴雷拉等人，1993，美国化学会志，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(周等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(普特南等人，1999，大分子，32：3658；以及林等人，1999，美国化学会志，121：5633)、以及聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(普特南等人，1999，大分子，32：3658；以及林等人，1999，美国化学会志，121：5633)。
[0191] ，这些和其他聚合物的特性以及用于制备它们的方法在本领域中是熟知的(参看，例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；
5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；王(Wang)等人，2001，美国化学会志，123：9480；林等人，2001，美国化学会志，123：2460；朗格尔(Langer)，2000，化学研究评述，33：94；朗格尔，1999，控释杂志，62：7；以及乌利希(Uhrich)等人，1999，化学评论，99：3181)。更总体而言，聚合物科学以及聚合物胺和铵盐的简明百科全书(Concise Encyclopedia of Polymer Science and PolymericAmines and Ammonium Salts)，由戈萨尔斯(Goethals)编，培格曼出版社(Pergamon Press)，1980；聚合原理(Principles of Polymerization)，奥迪安(Odian)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，第四版，
2004；当代聚合物化学(Contemporary Polymer Chemistry)，奥科克(Allcock)等人，普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice-Hall)，1981；载明(Deming)等人，1997，自然(Nature)，390：
386；以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446以及6,818,732中描述用于合成某些适合聚合物的多种方法。
5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；王(Wang)等人，2001，美国化学会志，123：9480；林等人，2001，美国化学会志，123：2460；朗格尔(Langer)，2000，化学研究评述，33：94；朗格尔，1999，控释杂志，62：7；以及乌利希(Uhrich)等人，1999，化学评论，99：3181)。更总体而言，聚合物科学以及聚合物胺和铵盐的简明百科全书(Concise Encyclopedia of Polymer Science and PolymericAmines and Ammonium Salts)，由戈萨尔斯(Goethals)编，培格曼出版社(Pergamon Press)，1980；聚合原理(Principles of Polymerization)，奥迪安(Odian)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，第四版，
2004；当代聚合物化学(Contemporary Polymer Chemistry)，奥科克(Allcock)等人，普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice-Hall)，1981；载明(Deming)等人，1997，自然(Nature)，390：
386；以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446以及6,818,732中描述用于合成某些适合聚合物的多种方法。
[0192] 在一些实施方案中，聚合物可以是直链或分支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以彼此实质上交联。在一些实施方案中，聚合物可以实质上不交联。在一些实施方案中，聚合物可根据本发明使用而不进行交联步骤。进一步理解的是，本发明的合成纳米载体可以包括嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何以上及其他聚合物的加合物。本领域普通技术人员应认识到在此列出的聚合物代表可根据本发明使用的聚合物的示例性不详尽清单。
[0193] 在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或多种聚合物。因此，聚合的合成纳米载体还可以包括冯安德里安(Von Andrian)等人的Wo公布WO 2009/051837中描述的聚合的合成纳米载体，包括但不限于具有一种或多种亲水性组分的那些。优选地，一种或多种聚合物包含聚酯，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己内酯。更优选地，一种或多种聚合物包含或另外包含偶合到亲水性聚合物(如聚醚)上的聚酯。在实施方案中，该聚醚包含聚乙二醇。再更优选地，一种或多种聚合物包含聚酯和偶合到亲水性聚合物(如聚醚)上的聚酯。在其他实施方案中，一种或多种聚合物被偶合到一种或多种抗原和/或一种或多种佐剂上。在实施方案中，至少一些聚合物被偶合到这种或这些抗原上，和/或至少一些聚合物被偶合到这种或这些佐剂上。优选地，当存在大于一种类型的聚合物时，一种类型的聚合物被偶合到这种或这些抗原上。在实施方案中，一种其他类型的聚合物被偶合到这种或这些佐剂上。举例来说，在实施方案中，当纳米载体包含聚酯和偶合到亲水性聚合物(如聚醚)上的聚酯时，该聚酯被偶合到该佐剂上，而该偶合到亲水性聚合物(如聚醚)上的聚酯被偶合到这种或这些抗原上。在实施方案中，如果纳米载体包含通用T细胞抗原，如T辅助细胞抗原，那么通用T细胞抗原可以封装在纳米载体中。
[0194] 在一些实施方案中，合成纳米载体不包含一种聚合组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等等。在一些实施方案中，非聚合的合成纳米载体是非聚合组分的聚集体，如金属原子(例如金原子)的聚集体。
[0195] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以任选地包含一种或多种两亲实体。在一些实施方案中，两亲实体可以促进具有增加的稳定性、改良的均匀性或增加的粘性的合成纳米载体的制造。在一些实施方案中，两亲实体可以与脂质膜(例如脂质双层、脂质单层等)的内表面缔合。本领域中已知的多种两亲实体适用于制备根据本发明的合成纳米载体。这样的两亲实体包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；
二油烯基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)；二油烯基氧丙基三乙基铵(DOTMA)；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰基甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(PEG))；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性脂肪酸(例如棕榈酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油单酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯 甘氨胆酸酯；脱水山梨糖醇单月桂酸酯 聚山梨醇酯
20 聚山梨醇酯60 聚山梨醇酯65 聚山
梨醇酯80 聚山梨醇酯85 聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活
性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；双十六烷基磷酸酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；蓖麻油酸甘油酯；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；
聚(乙二醇)5000磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成的和/或天然的洗涤剂；脱氧胆酸酯；环糊精；离液序列高的盐；离子对试剂；
以及它们的组合。两亲实体组分可以是不同两亲实体的混合物。本领域普通技术人员应认识到这是具有表面活性剂活性的物质的示例性的非详尽清单。任何两亲实体都可以用于制造根据本发明使用的合成纳米载体中。
二油烯基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)；二油烯基氧丙基三乙基铵(DOTMA)；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰基甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(PEG))；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性脂肪酸(例如棕榈酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油单酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯 甘氨胆酸酯；脱水山梨糖醇单月桂酸酯 聚山梨醇酯
20 聚山梨醇酯60 聚山梨醇酯65 聚山
梨醇酯80 聚山梨醇酯85 聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活
性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；双十六烷基磷酸酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；蓖麻油酸甘油酯；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；
聚(乙二醇)5000磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成的和/或天然的洗涤剂；脱氧胆酸酯；环糊精；离液序列高的盐；离子对试剂；
以及它们的组合。两亲实体组分可以是不同两亲实体的混合物。本领域普通技术人员应认识到这是具有表面活性剂活性的物质的示例性的非详尽清单。任何两亲实体都可以用于制造根据本发明使用的合成纳米载体中。
[0196] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以任选地包含一种或多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包括单糖或二糖，包括但但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物是一种多糖，包括但但不限于：支链淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、右旋糖酐、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、卡拉胶、多聚糖(glycon)、直链淀粉、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、藻胶和海藻酸、淀粉、甲壳质、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明质酸、凝胶多糖、以及黄原胶。在实施方案中，本发明的合成纳米载体不包含(或特别排除)碳水化合物，如多糖。在某些实施方案中，碳水化合物可以包含碳水化合物衍生物，如糖醇，包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇以及乳糖醇。
[0197] 根据本发明的组合物包含本发明的合成纳米载体以及药物学上可接受的赋形剂，如防腐剂、缓冲剂、生理盐水或磷酸盐缓冲的生理盐水。组合物可以使用常规的药物制造和配合技术获得有用剂型来制备。在一个实施方案中，本发明的合成纳米载体与防腐剂一起悬浮在无菌的供注射生理盐水溶液中。
[0198] 在实施方案中，当制备合成纳米载体作为针对抗原和/或佐剂的载体以用于疫苗中时，用于将抗原和/或佐剂偶合到合成纳米载体上的方法可以是有用的。如果抗原和/或佐剂是小分子，那么在组装合成纳米载体之前将抗原和/或佐剂连接到聚合物上可能具有优势。在实施方案中，制备具有用于将抗原和/或佐剂偶合到合成纳米载体上的表面基团的合成纳米载体也可能是一个优势，该制备通过使用这些表面基团而不是将抗原和/或佐剂连接到聚合物上并且然后在建构合成纳米载体时使用此聚合物结合物来进行。
[0199] 表面抗原可以通过多种方法偶合到合成纳米载体上。在实施方案中，表面抗原共价地或非共价地偶合到合成纳米载体的一个外表面上。
[0200] 在某些实施方案中，偶合可以是经由共价连接物。在实施方案中，根据本发明的表面抗原和/或佐剂可以经由1，2，3-三唑连接物共价偶合到外表面上，该连接物通过纳米载体表面上的叠氮基与包含炔基的表面抗原或佐剂进行1，3-偶极环加成反应或通过纳米载体表面上的炔与包含叠氮基的表面抗原或佐剂进行1，3-偶极环加成反应形成。此类环加成反应优选在铜(I)催化剂以及适合的Cu(I)-配体和将Cu(II)化合物还原成催化活性的Cu(I)化合物的还原剂存在下执行。此类Cu(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)也可以称为点击反应。
[0201] 另外，共价偶合可以包含共价连接物，它包含酰胺连接物、二硫基连接物、硫醚连接物、腙连接物、酰肼连接物、亚胺或肟连接物、脲或硫脲连接物、脒连接物、胺连接物以及磺酰胺连接物。
[0202] 酰胺连接物经由一种组分(如肽)上的胺与第二组分(如纳米载体)的羧酸基团之间的酰胺键形成。连接物中的酰胺键可以用被适当保护的氨基酸或肽与被活化的羧酸(如被N-羟基丁二酰亚胺活化的酯)使用任何常规酰胺键形成反应制备。
[0203] 二硫基连接物经由在例如R1-S-S-R2的形式的两个硫原子之间形成二硫(S-S)键制备。二硫键可以通过包含硫醇基/巯基(-SH)的表面抗原和/或佐剂与聚合物或纳米载体上另一被活化的硫醇基或包含硫醇基/巯基的纳米载体与包含被活化的硫醇基的抗原和/或佐剂进行硫醇交换来形成。
[0204] 三唑连接物(特别是R1和R2可以是任何化学实体的 形式的1，2，3-三唑)通过连接于第一组分(如纳米载体)上的叠氮与连接于第二组分(如抗原和/或佐剂)上的末端炔的1，3-偶极环加成反应来制备。1，3-偶极环加成反应在有或无催化剂的情况下、优选在有经由1，2，3-三唑官能团连接两个组分的Cu(I)催化剂的情况下执行。这种化学方法详细地描述在夏普勒斯(Sharpless)等人，德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)，41(14)，2596，(2002)和梅尔达尔(Meldal)等人，化学评论(Chem.Rev.)，2008，108(8)，
2952-3015中，并且经常称为“点击”反应或CuAAC。
2952-3015中，并且经常称为“点击”反应或CuAAC。
[0205] 在实施方案中，制备一种聚合物，它在聚合物链末端包含叠氮基或炔基。然后使用这种聚合物制备合成纳米载体，以此方式使得多个炔或叠氮基安置在该纳米载体的表面上。可替代地，合成纳米载体可以通过另一种途径制备，并且随后用炔或叠氮基官能化。抗原和/或佐剂在炔基(如果聚合物包含叠氮基)或叠氮基(如果聚合物包含炔基)存在下制备。然后在有或无催化剂下允许抗原和/或佐剂与纳米载体经由1，3-偶极环加成反应进行反应，该催化剂将抗原和/或佐剂经由1，4-二取代的1，2，3-三唑连接物共价偶合到颗粒上。
[0206] 硫醚连接物通过以例如R1-S-R2的形式形成硫碳(硫醚)键制备。硫醚可以通过用第二组分(如纳米载体)上的烷基化基团(如卤基或环氧基)烷基化一种组分(如抗原和/或佐剂)上的硫醇基/巯基(-SH)制备。硫醚连接物还可以通过将一种组分(如抗原和/或佐剂)上的硫醇基/巯基与作为迈克尔受体的第二组分(如包含顺丁烯二酰亚胺基或乙烯砜基的聚合物)上的缺电子烯基进行迈克尔加成来形成。以另一种方式，硫醚连接物可以通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的硫醇基/巯基与第二组分(如聚合物或纳米载体)上的烯基进行自由基硫醇-烯反应来制备。
[0207] 腙连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的酰肼基与第二组分(如纳米载体)上的醛/酮基进行反应来制备。
[0208] 酰肼连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的肼基与第二组分(如纳米载体)上的羧酸基团进行反应来形成。此类反应总体上使用类似于形成酰胺键的化学方法(其中羧酸用活化试剂活化)执行。
[0209] 亚胺或肟连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺或N-烷氧基胺基(或氨氧基)与第二组分(如纳米载体)上的醛或酮基进行反应来形成。
[0210] 脲或硫脲连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺基与第二组分(如纳米载体)上的异氰酸酯或异硫氰酸酯基进行反应来制备。
[0211] 脒连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺基与第二组分(如纳米载体)上的酰亚胺酯基进行反应来制备。
[0212] 胺连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺基与第二组分(如纳米载体)上的烷基化基团(如卤基、环氧基或磺酸酯基)进行烷基化反应来制备。可替代地，胺连接物还可以通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺基与第二组分(如纳米载体)上的醛或酮基在适合的还原试剂(如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)存在下进行还原胺基化来制备。
[0213] 磺酰胺连接物通过一种组分(如抗原和/或佐剂)上的胺基与第二组分(如纳米载体)上的磺酰基卤化物(如磺酰氯或磺酰氟)基团进行反应来制备。砜连接物通过亲核试剂与乙烯砜进行迈克尔加成来制备。乙烯砜或亲核试剂可以位于纳米颗粒的表面上或连接到抗原或佐剂上。
[0214] 抗原或佐剂还可以与纳米载体经由非共价结合方法来结合。举例来说，带负电的抗原或佐剂可以与带正电的纳米载体通过静电吸附结合。包含金属配体的抗原或佐剂还可以与包含金属复合物的纳米载体经由金属-配体复合物结合。
[0215] 在实施方案中，抗原或佐剂可以在组装合成纳米载体之前连接到聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)上，或可以形成合成纳米载体而使得反应性或可活化基团在它的表面上。在后一情况下，可以制备抗原或佐剂以使其具有与由合成纳米载体的表面呈现的连接化学结构相容的基团。在其他实施方案中，可以使用适合的连接物将肽抗原连接到VLP或脂质体上。连接物是能够将两个分子偶合在一起的化合物或试剂。在一个实施方案中，连接物可以是同双官能或杂双官能试剂，如海尔曼森(Hermanson)2008中所述。举例来说，可以在EDC存在下用同双官能连接物己二酸二酰肼(ADH)处理表面上包含羧基的VLP或脂质体合成纳米载体，形成具有ADH连接物的相应合成纳米载体。然后使所得被ADH连接的合成纳米载体与包含酸基的肽抗原和/或佐剂经由NC上的ADH连接物的另一端结合，产生相应的VLP或脂质体肽结合物。
[0216] 对于可用的结合方法的详细描述，参看海尔曼森(Hermanson GT)，“生物结合技术”，第2版，由学术出版公司(Academic Press，Inc.)出版，2008。除共价连接以外，抗原和/或佐剂还可以通过吸附于预成型的合成纳米载体上来偶合，或它/它们可以通过在形成合成纳米载体期间进行封装来偶合。
[0217] 在实施方案中，表面抗原可以使用不同的非共价相互作用非共价偶合到合成纳米载体上，这些非共价相互作用包括但不限于：电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或它们的组合。在实施方案中，封装是偶合的一种形式。当偶合带电的表面抗原时，合成纳米载体可以在表面活性剂的存在下制造，这些表面活性剂吸附到合成纳米载体的表面上，并且这样之后，它们赋予合成纳米载体电荷。带电的表面抗原随后可以通过电荷-电荷相互作用非共价地连接到带电的合成纳米载体上(参看例如奥哈根(O’Hagen)WO2000006123A1)。
[0218] 在实施方案中，本发明的合成纳米载体可以与一种或多种佐剂通过混合在同一媒剂或递送系统中来组合。这样的佐剂可以包括但不限于在此提供的佐剂，如矿物盐(如明矾，与肠道细菌(例如大肠埃希氏杆菌、明尼苏达沙门菌、鼠伤寒沙门菌、或弗氏志贺菌)的单磷酰脂质(MPL)A组合的明矾或分别与 (AS04)、以上提到的细菌的TM
MPL A特异性组合的明矾)、皂苷(如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX )、乳液(如TM
MF59 、 ISA 51和ISA 720)、AS02 脂质
体和脂质体配制品(如AS01)、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体(如淋病奈瑟菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原体和其他细菌的源于细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(depot-forming agent)(如 嵌段共聚物)、特异性修饰或制备的肽(如
胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。此类其他佐剂的剂量可以使用常规剂量范围研究来确定。
MPL A特异性组合的明矾)、皂苷(如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX )、乳液(如TM
MF59 、 ISA 51和ISA 720)、AS02 脂质
体和脂质体配制品(如AS01)、AS15、合成的或特别制备的微粒和微载体(如淋病奈瑟菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原体和其他细菌的源于细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(depot-forming agent)(如 嵌段共聚物)、特异性修饰或制备的肽(如
胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。此类其他佐剂的剂量可以使用常规剂量范围研究来确定。
[0219] 在实施方案中，本发明的合成纳米载体可以与分别地在不同时间点和/或在不同身体部位和/或通过不同的免疫路径给予的与偶合到纳米载体上的那些不同、类似或相同的其他抗原(有或无佐剂，利用或不利用另一种递送媒剂)组合或与分别地在不同时间点和/或在不同身体部位和/或通过不同的免疫路径给予的另一种携带抗原和/或佐剂的合成纳米载体组合。
[0220] 合成纳米载体的群可以使用传统的药物混合方法组合以形成根据本发明的剂型。这些方法包括液体-液体混合，其中两种或更多种各自包含一个或多个纳米载体子组的悬浮液直接组合或经由一个或多个包含稀释剂的容器集合在一起。因为合成纳米载体还可以用粉末形式制造或储存，所以可以执行干燥的粉末-粉末混合，因为可以将两种或更多种粉末再悬浮于共同的介质中。取决于纳米载体的特性和它们的相互作用势，一种或另一种混合途径可能也有优势。
[0221] 包含合成纳米载体的典型的发明的组合物可以包括无机或有机缓冲剂(例如磷酸、碳酸、乙酸、或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸或乙酸的盐、氨基酸和它们的盐)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如聚山梨醇20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧胆酸钠)、溶液和/或低温/冻干稳定剂(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如盐类或糖类)、抗细菌剂(例如苯甲酸、苯酚、庆大霉素)、防沫剂(例如聚二甲基硅酮)、防腐剂(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和粘度调节剂(例如聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)、以及共溶剂(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。
[0222] 根据本发明的组合物包含与药物学上可接受的赋形剂或载体组合的本发明的合成纳米载体。组合物可以使用常规的药物制造和配合技术获得有用的剂型来制备。适合用于实施本发明的技术可以在工业混合手册：科学和惯例(Handbook of Industrial Mixing：Science and Practice)，由爱德华L.保罗(Edward L.Paul)，维克多A.阿蒂莫-奥本格(Victor A.Atiemo-Obeng)以及苏珊妮M.克里斯塔(Suzanne M.Kresta)编，2004约翰威利父子公司；和制药学：剂型设计科学(Pharmaceutics：The Scienceof Dosage Form Design)，第2版由奥顿(M.E.Auten)编，2001，邱吉尔利文斯通公司(Churchill Livingstone)中找到。在一个实施方案中，本发明的合成纳米载体与防腐剂一起悬浮在无菌的供注射生理盐水溶液中。
[0223] 剂型的剂量包含不同量的根据本发明的合成纳米载体的群。本发明的剂型中所存在的合成纳米载体的量可以随表面抗原的组的性质、欲实现的治疗益处以及其他此类参数而变化。在实施方案中，可以执行剂量范围研究以确立剂型中存在的合成纳米载体的最佳治疗量。在实施方案中，第一和第二群的存在量在给予受试者后有效对第一组表面抗原和第二组表面抗原产生免疫应答。有可能使用常规剂量范围研究和技术确定有效在受试者中产生免疫应答的第一、第二和/或后续群的量。本发明的剂型可以在多种频率下给予。在一个优选实施方案中，至少一次给予剂型足够产生药理学有关的应答。在更优选的实施方案中，利用剂型的至少两次给予、至少三次给予或至少四次给予来确保药理学有关的应答。
[0224] 应理解，本发明的组合物可以用任何适合的方式制备，并且本发明决不限于可以使用在此说明的方法制造的组合物。适当方法的选择可能要求注意相缔合的特别部分的特性。在实施方案中，制造方法包括制备一个第一群包含第一组表面抗原的合成纳米载体；制备一个第二群包含第二组表面抗原的合成纳米载体；并且将该第一和该第二群合成纳米载体组合于一个药物剂型中；其中该第一组表面抗原和该第二组表面抗原在结构上或在免疫上不同。
[0225] 在一些实施方案中，本发明的合成纳米载体在无菌条件下制造并且最后杀菌。此可以确保所得组合物是无菌的并且是非感染性的，因此当与非无菌的组合物相比时，提高安全性。这提供了有价值的安全措施，特别是当接受合成纳米载体的受试者具有免疫缺陷、正在遭受感染，和/或对感染敏感时。在一些实施方案中，取决于配制策略，本发明的合成纳米载体可以冻干并且储存在悬浮液中或呈冻干粉末形式历经较长时间而无活性损失。
[0226] 本发明的组合物可以通过多种给药途径来给予，包括但不限于肠胃外(如皮下、肌肉内、静脉内或皮内)；经口；经鼻、鼻内、经粘膜、舌下、直肠、眼用、透皮、经皮或通过这些途径的组合。
[0227] 在此说明的组合物和方法可以用于诱导、增强、调节、刺激、抑制、引导或重新引导免疫应答。在此说明的组合物和方法可以用于诊断、预防和/或治疗多种病症，如癌症、感染性疾病、代谢性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、免疫疾病、或其他失调和/或病症。在此说明的组合物和方法还可以用于预防或治疗成瘾，如烟碱或麻醉药成瘾。在此说明的组合物和方法还可以用于预防和/或治疗由于暴露于毒素、有害物质、环境毒素、或其他有害介质而导致的病症。
[0228] 在此提供的受试者可以罹患或有风险罹患对滥用的或上瘾的物质的成瘾。
[0229] 在此提供的受试者可以罹患或有风险罹患癌症。癌症包括但不限于乳癌；胆道癌；膀胱癌；脑癌，包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；子宫颈癌；绒膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液学赘瘤，包括急性淋巴细胞性和骨髓性白血病，例如B细胞CLL；T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤；
AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内赘瘤，包括博文氏病(Bowen′s disease)和佩吉特氏病(Paget′s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括何杰金氏病(Hodgkin′s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌瘤；
卵巢癌，包括从上皮细胞、基质细胞、生殖细胞以及间充质细胞产生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤以及骨肉瘤)；皮肤癌，包括黑色素瘤、梅克尔细胞癌、卡波济氏肉瘤、基底细胞癌以及鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒膜癌)、基质肿瘤以及生殖细胞肿瘤；
甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和维尔姆斯氏瘤。
AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内赘瘤，包括博文氏病(Bowen′s disease)和佩吉特氏病(Paget′s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括何杰金氏病(Hodgkin′s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌瘤；
卵巢癌，包括从上皮细胞、基质细胞、生殖细胞以及间充质细胞产生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤以及骨肉瘤)；皮肤癌，包括黑色素瘤、梅克尔细胞癌、卡波济氏肉瘤、基底细胞癌以及鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒膜癌)、基质肿瘤以及生殖细胞肿瘤；
甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和维尔姆斯氏瘤。
[0230] 在此提供的受试者可以罹患或有风险罹患感染或感染性疾病。感染或感染性疾病包括但不限于病毒性感染性疾病，如AIDS、禽痘(水痘)、普通感冒、细胞肥大病毒感染、科罗拉多蜱传热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯性疱疹、带状疱疹、HPV、流形性感冒(Flu)、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、感染性单核细胞增多症、腮腺炎、诺如病毒(Norovirus)、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、狂犬病、风疹、SARS、天痘(天花)、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病以及黄热病；细菌性感染性疾病，如炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病、军团病、麻疯病(汉森病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、风湿热、MRSA感染、诺卡氏菌病、百日咳(Pertussis/Whooping Cough)、瘟疫、肺炎球菌肺炎、鹦鹉热、Q热、落矶山斑疹热(RMSF)、沙门菌病、猩红热、志贺氏杆病、梅毒、破伤风、沙眼、肺结核、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒以及尿路感染；寄生虫感染性疾病，如非洲睡眠病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、恰加斯氏病、华支睾吸虫病、隐孢子虫病、囊虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、棘球蚴病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自由生活阿米巴感染、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病(Trichinellosis/Trichinosis)、鞭虫病、滴虫病以及锥虫病；真菌感染性疾病，如曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、香港脚(脚癣)以及股癣；朊病毒感染性疾病，如阿尔珀斯病、致死性家族性失眠、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(Gerstmann- -Scheinker syndrome)、库鲁症以及变异的克罗伊茨费尔特-雅各布病(Variant C reutzfeldt-Jakob disease)
[0231] 实例
[0232] 本发明参考以下实例将更容易理解，这些实例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的被包括且不作为限制。
[0233] 本领域的普通技术人员应理解，可对刚才描述过的实施方案的不同的改写和修改进行配置，而无须偏离本发明的范围和精神。本领域中已知的其他适合技术和方法可由本领域普通技术人员以众多特定模式并且根据在此所描述的本发明的描述而加以应用。
[0234] 因此，应理解，本发明可不同于在此确切描述的来实施。以上描述旨在为说明性的，并且没有限制性。在审阅以上描述后，多种其他实施方案对于本领域的技术人员将是清楚的。因此，本发明的范围应该参考所附权利要求以及此类权利要求所有权获得的等效物的全部范围来确定。
[0235] 实例1：配制第一群纳米载体(预示的)
[0236] 经由一种双重乳液方法制备合成纳米载体，这些合成纳米载体包含PLGA-R848结合物(佐剂)、PLA-PEG-N3结合物(到肽抗原的连接物)以及卵清蛋白肽(T细胞抗原)，其中卵清蛋白肽封装于合成纳米载体中。在轻缓搅拌下向合成纳米载体的悬浮液(10mg/mL于PBS(pH 7.4缓冲液)中，5mL，含有约12.5mg(MW：20,000；0.000625mmol)PLA-PEG-N3)中添加包含乙炔连接物的HPV L1-肽(33mg)。添加抗坏血酸钠的溶液(100mM于H2O中，0.3mL)，然后添加CuSO4溶液(10mM于水中，0.6mL)。在20C下搅拌所得淡黄色悬浮液15小时并且添加另外的CuSO4溶液(0.3mL)和抗坏血酸钠溶液(0.15mL)。在20C下搅拌悬浮液5小时，并且用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释到10mL并且进行离心以去除上清液。用PBS缓冲液洗涤残余纳米载体球粒两次。然后将洗涤过的NC再悬浮于5mL PBS缓冲液中并且进行冷冻储存。通过消化过的合成纳米载体的HPLC分析和通过生物分析来证实合成纳米载体表面上的L1肽的结合。
[0237] 实例2：配制第二群纳米载体(预示的)
[0238] 使用以上实例1中的通用程序概述，制备包含PLA-R848、PLA-PEG-N3以及封装的卵清蛋白肽的合成纳米载体，并且将这些合成纳米载体与HPV L2肽进行结合以提供经过L2肽结合的合成纳米载体。
[0239] 实例3：配制组合第一和第二群纳米载体(预示的)
[0240] 将来自以上实例1和2的合成纳米载体制剂解冻并且于PBS中稀释到每毫升5mg纳米载体的最终浓度。组合各制剂的相同等分试样(0.5mL)以提供含有HPV L1和L2肽两者的纳米载体群。
[0241] 实例4：制备纳米载体
[0242] 制备NC-Nic-OVA
[0243] 在普林斯顿全球合成中心(Princeton Global Synthesis)(乔治帕特森路300号206室(300 George Patterson Drive#206)，布里斯托尔(Bristol)，宾夕法尼亚州(PA)19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，
4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造具有约5,000Da的PEG嵌段和约21,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG-烟碱(S-642)，即聚-D/L丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羟基甲基烟碱醚。通过使dl-丙交酯与具有dl-丙交酯的HO-PEG-顺丁烯二酰亚胺进行开环聚合来产生PLA嵌段，从商业起始物质合成PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺，该PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺是由约
22000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2900Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由顺丁烯二酰亚胺官能团封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(EMDChemicals Inc.)(民主南路
480号(480South Democrat Road)吉布斯镇(Gibbstown)，新泽西州(NJ)08027，件号(Part Number)4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造具有约5,000Da的PEG嵌段和约21,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG-烟碱(S-642)，即聚-D/L丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羟基甲基烟碱醚。通过使dl-丙交酯与具有dl-丙交酯的HO-PEG-顺丁烯二酰亚胺进行开环聚合来产生PLA嵌段，从商业起始物质合成PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺，该PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺是由约
22000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2900Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由顺丁烯二酰亚胺官能团封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(EMDChemicals Inc.)(民主南路
480号(480South Democrat Road)吉布斯镇(Gibbstown)，新泽西州(NJ)08027，件号(Part Number)4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0244] 溶液如下制备：
[0245] 溶液1：0.13N HCl于纯化过的水中。
[0246] 溶液2：通过将每种聚合物分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后组合2份PLGA-R848溶液与1份每种PLA-PEG-烟碱溶液和PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺溶液，制备于二氯甲烷中的50mg/mLPLGA-R848、25mg/mL PLA-PEG-烟碱以及25mg/mL PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺。
[0247] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0248] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0249] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪(Branson Digital Sonifier)250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理40秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0250] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。将纳米载体悬浮液冷冻储存于-20C下直到再使用。
[0251] 表4：NC-Nic-OVA表征
[0252]
[0253] (1)在表面上具有PEG-烟碱和PEG-MAL的NC，如上制备；于PBS缓冲液中的6.5mg/mL悬浮液。
[0254] (2)OVA蛋白质(来自蛋白的卵白蛋白)：沃辛顿(Worthington)，批号POK12101，MW：46000。
[0255] (3)特劳特氏试剂(Traut′s reagent)(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)：MP生物医学(MP Biomedical)，批号8830KA，MW：137.6
[0256] (4)pH 8缓冲液(磷酸钠，20mM，具有0.5mM EDTA)。
[0257] (5)pH 71x PBS缓冲液。
[0258] 将OVA蛋白质(10mg)溶解于1mL pH 8缓冲液中。将新鲜制造的特劳特氏试剂于pH 8缓冲液中的溶液(0.25mL，2mg/mL)添加到OVA蛋白质溶液中。在暗处在氩气下搅拌所得溶液1.5小时。用MWCO3K透滤管对溶液进行透滤，并且用pH 8缓冲液洗涤两次。在氩气下将所得具有硫醇基的修饰过的OVA溶解于1mL pH 8缓冲液中。对NC悬浮液(3mL，6.5mg/mL)进行离心以去除上清液。然后将修饰过的OVA溶液与NC球粒混合。在暗处在氩气下在室温下搅拌所得悬浮液12小时。然后用pH 7PBS将NC悬浮液稀释到10mL，并且进行离心。用2×10mLpH 7PBS洗涤所得NC球粒。然后将NC-Nic-OVA结合物在储存于4℃下的pH 7PBS中(约6mg/mL，3mL)进行再悬浮。
[0259] 制备NC-OVA
[0260] 在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。通过使dl-丙交酯与HO-PEG-顺丁烯二酰亚胺进行开环聚合来产生PLA嵌段，从商业起始物质合成PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺，该PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺是由约22000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2900Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由顺丁烯二酰亚胺官能团封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(民主南路480号，吉布斯镇，新泽西州08027，件号
4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0261] 溶液如下制备：
[0262] 溶液1：0.13N HCl于纯化过的水中。
[0263] 溶液2：通过将每种聚合物分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后组合1份PLGA-R848溶液与1份PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺溶液，制备于二氯甲烷中的50mg/mL PLGA-R848和50mg/mL PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺。
[0264] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0265] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0266] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理40秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0267] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。将纳米载体悬浮液冷冻储存于-20℃下直到再使用。
[0268] 表5：NC-OVA表征
[0269]
[0270] (1)在表面上具有PEG-MAL的NC，如上制备；于PBS缓冲液中的6mg/mL悬浮液。
[0271] (2)OVA蛋白质(来自蛋白的卵白蛋白)：沃辛顿，批号POK12101，MW：46000。
[0272] (3)特劳特氏试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)：MP生物医学，批号8830KA，MW：137.6。
[0273] (4)pH 8缓冲液(磷酸钠，20mM，具有0.5mM EDTA)。
[0274] (5)pH 71x PBS缓冲液。
[0275] 将OVA蛋白质(20mg)溶解于1mL pH 8缓冲液中。将新鲜制造的特劳特氏试剂于pH 8缓冲液中的溶液(0.5mL，2mg/mL)添加到OVA蛋白质溶液中。在暗处在氩气下搅拌所得溶液1.5小时。用MWCO 3K透滤管对溶液进行透滤，并且用pH 8缓冲液洗涤两次。在氩气下将所得具有硫醇基的修饰过的OVA溶解于1mL pH 8缓冲液中。对NC悬浮液(4mL，6mg/mL)进行离心以去除上清液。然后将修饰过的OVA溶液与NC球粒混合。在暗处在氩气下在室温下搅拌所得悬浮液12小时。然后用pH 7PBS将NC悬浮液稀释到10mL，并且进行离心。用2×10mLpH 7PBS洗涤所得NC球粒。然后将NC-OVA结合物在储存于4℃下的pH
7PBS中(约6mg/mL，4mL)进行再悬浮。
7PBS中(约6mg/mL，4mL)进行再悬浮。
[0276] 制备NC-HA5
[0277] 从巴亨美洲公司(Bachem Americas Inc.)(柏市街3132号(3132KashiwaStreet)，托伦斯(Torrance)加利福尼亚州(CA)90505，产品代码4065609)购买卵白蛋白肽
323-339酰胺乙酸盐。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3：1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。通过使dl-丙交酯与HO-PEG-顺丁烯二酰亚胺进行开环聚合来产生PLA嵌段，从商业起始物质合成PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺，该PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺是由约
22000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2900Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由顺丁烯二酰亚胺官能团封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
323-339酰胺乙酸盐。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3：1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。通过使dl-丙交酯与HO-PEG-顺丁烯二酰亚胺进行开环聚合来产生PLA嵌段，从商业起始物质合成PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺，该PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺是由约
22000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2900Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由顺丁烯二酰亚胺官能团封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0278] 溶液如下制备：
[0279] 溶液1：在室温下在0.13N HCl中制备20mg/mL卵白蛋白肽323-339。
[0280] 溶液2：通过将每种聚合物分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后组合1份PLGA-R848溶液与1份PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺溶液，制备于二氯甲烷中的50mg/mL PLGA-R848和50mg/mL PLA-PEG-顺丁烯二酰亚胺。
[0281] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0282] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0283] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理40秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0284] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。将纳米载体悬浮液冷冻储存于-20℃下直到再使用。
[0285] 表6：NC-HA5表征
[0286]
[0287] (1)在表面上具有PEG-MAL的NC，如上制备；于PBS缓冲液中的6.7mg/mL悬浮液。
[0288] (2)HA5蛋白质：重组血球凝集素，A/越南(Vietnam)/1203/2004，MW：72000，以于pH 7PBS-吐温(tween)缓冲液中之溶液(0.55mg/mL)形式提供。
[0289] (3)特劳特氏试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)：MP生物医学，批号8830KA，MW：137.6。
[0290] (4)pH 8缓冲液(磷酸钠，20mM，具有0.5mM EDTA)。
[0291] (5)pH 71x PBS缓冲液。
[0292] 用pH 8缓冲液将HA5蛋白质(0.21g于0.38mL pH 7.1PBS-吐温缓冲液中)稀释到0.5mL。将新鲜制造的特劳特氏试剂于pH 8缓冲液中的溶液(0.02mL，2mg/mL)添加到HA5蛋白质溶液中。在暗处在氩气下搅拌所得溶液1.5小时。用MWCO 3K透滤管对溶液进行透滤，并且用pH 8缓冲液洗涤两次。在氩气下将所得具有硫醇基的修饰过的HA5蛋白质溶解于0.5mL pH 8缓冲液中。对NC悬浮液(3mL，6.7mg/mL)进行离心以去除上清液。然后将修饰过的HA5溶液与NC球粒混合。在暗处在氩气下在室温下搅拌所得悬浮液12小时。然后用pH 7PBS将NC悬浮液稀释到10mL，并且进行离心。用2×10mL pH 7PBS洗涤所得NC球粒。然后将NC-HA5结合物再悬浮于储存于4℃下的pH 7PBS中(约6mg/mL，3mL)。
[0293] 制备NC-L2、NC-M2e或NC-M2e-L2
[0294] 从巴亨美洲公司(柏市街3132号，托伦斯加利福尼亚州90505，产品代码4065609)购买卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸盐。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。通过使HO-PEG-COOH结合到氨基-C6H12-叠氮基上并且然后通过使所得HO-PEG-C6-N3与dl-丙交酯进行开环聚合来产生PLA嵌段，从而合成PLA-PEG-C6-N3，该PLA-PEG-C6-N3是由约23000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2000Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由连接到叠氮基上的结合酰胺的C6H12连接物封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(民主南路480号，吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。通过使HO-PEG-COOH结合到氨基-C6H12-叠氮基上并且然后通过使所得HO-PEG-C6-N3与dl-丙交酯进行开环聚合来产生PLA嵌段，从而合成PLA-PEG-C6-N3，该PLA-PEG-C6-N3是由约23000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2000Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且由连接到叠氮基上的结合酰胺的C6H12连接物封端的嵌段共聚物。从EMD化学公司(民主南路480号，吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0295] 溶液如下制备：
[0296] 溶液1：在室温下在0.13N HCl中制备20mg/mL卵白蛋白肽323-339。
[0297] 溶液2：通过各自分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后以相同体积份组合，制备于二氯甲烷中的50mg/mL PLGA-R848和50mg/mL PLA-PEG-C6-N3。
[0298] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0299] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0300] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理40秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0301] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。产生两个相同批次并且然后组合以形成单个均匀悬浮液，将它冷冻储存于-20℃下直到再使用。
[0302] 表7：NC-L2、NC-M2e或NC-M2e-L2表征
[0303]
[0304] (1)具有表面PEG-C6-N3并且含有PLGA-R848和卵清蛋白肽的纳米载体，如上制备，于PBS中的7mg/mL悬浮液。
[0305] (2)以连接于C端Lys氨基的炔连接物修饰的HPV16L2肽；巴亨美洲公司，批号B06055，MW 2595，TFA盐；序列：
[0306] H-Ala-Thr-Gln-Leu-Tyr-Lys-Thr-Cys-Lys-Gln-Ala-Gly-Thr-Cys-Pro-Pro-Asp-Ile-Ile-Pro-Lys-Val-Lys(5-己酰基)-NH2(具有Cys-Cys二硫键)。
[0307] (3)催化剂：CuSO4，100mM于去离子水中；THPTA配体，200mM于去离子水中；抗坏血酸钠，200mM于新鲜制备的去离子水中。
[0308] (4)pH 7.4PBS缓冲液。
[0309] 通过离心将NC悬浮液(7mg/mL，4mL)浓缩到约1mL体积。添加L2肽(20mg)于2mL PBS缓冲液中的溶液。添加0.2mL CuSO4(100mM)与0.2mL THPTA配体(200mM)的预混合的溶液，然后添加0.4mL抗坏血酸钠(200mM)。在暗处在环境室温下搅拌所得淡黄色悬浮液18小时。然后用PBS缓冲液将悬浮液稀释到10mL，并且进行离心以去除上清液。将NC-L2结合物进一步制粒，用10mL PBS缓冲液洗涤两次，并且将它们以约6mg/mL(约4mL)的最终浓度再悬浮于pH 7.4缓冲液中，并且储存于4℃下。
[0310] (1)具有表面PEG-C6-N3并且含有PLGA-R848和卵清蛋白肽的纳米载体，如上制备，于PBS中的7mg/mL悬浮液。
[0311] (2)以连接于C端Gly的炔连接物修饰的M2e肽；CS Bio公司(CSBio Co)，目录号CS4956，批号：H308，MW 2650，TFA盐；序列：
[0312] H-Met-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Thy-Arg-Asn-Glu-Trp-Glu-Cys-Arg-Cys-Ser-Asp-Gly-Gly-NHCH2CCH。
[0313] (3)催化剂：CuSO4，100mM于去离子水中；THPTA配体，200mM于去离子水中；抗坏血酸钠，200mM于新鲜制备的去离子水中。
[0314] (4)pH 7.4PBS缓冲液。
[0315] 通过离心将NC悬浮液(7mg/mL，4mL)浓缩到约1mL体积。添加M2e肽(20mg)于2mL PBS缓冲液中的溶液。添加0.2mL CuSO4(100mM)与0.2mL THPTA配体(200mM)的预混合的溶液，然后添加0.4mL抗坏血酸钠(200mM)。在暗处在环境室温下搅拌所得淡黄色悬浮液18小时。然后用PBS缓冲液将悬浮液稀释到10mL，并且进行离心以去除上清液。用
10mL PBS缓冲液进一步洗涤NC-M2e结合物球粒两次，并且将它们以约6mg/mL(约4mL)的最终浓度再悬浮于pH 7.4缓冲液中，并且储存于4℃下。
10mL PBS缓冲液进一步洗涤NC-M2e结合物球粒两次，并且将它们以约6mg/mL(约4mL)的最终浓度再悬浮于pH 7.4缓冲液中，并且储存于4℃下。
[0316] (1)具有表面PEG-C6-N3并且含有PLGA-R848和卵清蛋白肽的纳米载体，如上制备，于PBS中的7mg/mL悬浮液。
[0317] (2)以连接于C端Lys氨基的炔连接物修饰的HPV16L2肽；巴亨美洲公司，批号B06055，MW 2595，TFA盐；序列：
[0318] H-Ala-Thr-Gln-Leu-Tyr-Lys-Thr-Cys-Lys-Gln-Ala-Gly-Thr-Cys-Pro-Pro-Asp-Ile-Ile-Pro-Lys-Val-Lys(5-己酰基)-NH2(具有Cys-Cys二硫键)。
[0319] (3)以连接于C端Gly的炔连接物修饰的M2e肽；CS Bio公司，目录号CS4956，批号：H308，MW 2650，TFA盐；序列：
[0320] H-Met-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Thy-Arg-Asn-Glu-Trp-Glu-Cys-Arg-Cys-Ser-Asp-Gly-Gly-NHCH2CCH。
[0321] (4)催化剂：CuSO4，100mM于去离子水中；THPTA配体，200mM于去离子水中；抗坏血酸钠，200mM于新鲜制备的去离子水中。
[0322] (5)pH 7.4PBS缓冲液。
[0323] 通过离心将NC悬浮液(7mg/mL，2mL)浓缩到约0.5mL体积。添加L2肽(5mg)和M2e肽(5mg)于1mL PBS缓冲液中的混合物。添加0.2mL CuSO4(100mM)与0.2mL THPTA配体(200mM)的预混合的溶液，然后添加0.4mL抗坏血酸钠(200mM)。在暗处在环境室温下搅拌所得淡黄色悬浮液18小时。然后用PBS缓冲液将悬浮液稀释到10mL，并且进行离心以去除上清液。用10mL PBS缓冲液进一步洗涤NC-M2e-L2结合物球粒两次，并且将它们以约6mg/mL(约2mL)的最终浓度再悬浮于pH 7.4缓冲液中，并且储存于4℃下。
[0324] 实例5：用两种单价抗原纳米载体进行的免疫导致对这两种抗原的免疫应答[0325] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-Nic和NC-OVA(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗烟碱(深灰色柱状图)和抗卵白蛋白(浅灰色柱状图)抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图1中示出(针对聚赖氨酸-烟碱或卵白蛋白蛋白质的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-Nic和NC-OVA免疫过的)。
[0326] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-Nic(在外表面上展现烟碱并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)和100μg NC-OVA(在外表面上展现卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗烟碱和抗卵白蛋白抗体滴度。示出了如通过针对聚赖氨酸-烟碱或卵白蛋白蛋白质的ELISA所测量的抗烟碱和抗卵白蛋白抗体滴度(EC50)(图1)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。结果证实，用两种单价抗原纳米载体(NC-Nic和NC-OVA)的组合免疫过的小鼠针对这两种抗原产生抗体。
[0327] 实例6：用单价和二价抗原纳米载体进行的免疫导致对所有三种抗原的免疫应答[0328] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-Nic-OVA和NC-L2(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗烟碱、抗卵白蛋白以及抗L2肽抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图2中示出(针对聚赖氨酸-烟碱、卵白蛋白蛋白质或PLA-PEG-L2肽的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-Nic-OVA和NC-L2免疫过的)。
[0329] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-Nic-OVA(在外表面上展现烟碱和卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)和100μg NC-L2(在外表面上展现HPV L2肽(aa17-36)并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗烟碱、抗卵白蛋白以及抗L2肽抗体滴度。示出了如通过针对聚赖氨酸-烟碱、卵白蛋白蛋白质以及L2肽的ELISA所测量的抗烟碱、抗卵白蛋白以及抗L2肽抗体滴度(EC50)(图2)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。结果证实，用一种单价抗原纳米载体和一种二价抗原纳米载体(NC-Nic-OVA和NC-L2)的组合免疫过的小鼠针对所有三种抗原产生抗体。
[0330] 实例7：用两种二价抗原纳米载体进行的免疫导致对所有四种抗原的免疫应答[0331] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-Nic-OVA和NC-M2e-L2(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗烟碱、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图3中示出(针对聚赖氨酸-烟碱、卵白蛋白蛋白质、PLA-PEG-M2e肽或PLA-PEG-L2肽的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-Nic-OVA和NC-M2e-L2免疫过的)。
[0332] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-Nic-OVA(在外表面上展现烟碱和卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)和100μg NC-M2e-L2(在外表面上展现流感M2e肽(aa2-27)和HPV L2肽(aa17-36)并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗烟碱、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。示出了如通过针对聚赖氨酸-烟碱、卵白蛋白蛋白质、M2e肽以及L2肽的ELISA所测量的抗烟碱、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度(EC50)(图3)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。结果证实，用两种二价抗原纳米载体(NC-Nic-OVA和NC-M2e-L2)的组合免疫过的小鼠针对所有四种抗原产生抗体。
[0333] 实例8：用两种单价肽抗原纳米载体进行的免疫导致对这两种肽抗原的免疫应答[0334] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-M2e和NC-L2(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗M2e肽和抗L2肽抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图4中示出(针对PLA-PEG-M2e肽或PLA-PEG-L2肽的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-M2e和NC-L2免疫过的)。
[0335] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-M2e(在外表面上展现流感M2e肽(aa2-27)并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)和100μg NC-L2(在外表面上展现HPV L2肽(aa17-36)并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗M2e肽和抗L2肽抗体滴度。示出了如通过针对M2e肽和L2肽的ELISA所测量的抗M2e肽和抗L2肽抗体滴度(EC50)(图4)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。这些结果证实，用两种单价肽抗原纳米载体(NC-M2e和NC-L2)的组合免疫过的小鼠针对这两种肽抗原产生抗体。
[0336] 实例9：用两种单价蛋白质抗原纳米载体进行的免疫导致对这两种蛋白质抗原的免疫应答
[0337] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-HA5和NC-OVA(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗HA5蛋白质和抗卵白蛋白蛋白质抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图5中示出(针对H5N1HA蛋白质或卵白蛋白蛋白质的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-HA5和NC-OVA免疫的)。
[0338] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-HA5蛋白质(在外表面上展现流感H5N1HA蛋白质并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)和
100μg NC-OVA(在外表面上展现卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗HA5和抗卵白蛋白抗体滴度。示出了如通过针对H5N1HA蛋白质和卵白蛋白蛋白质的ELISA所测量的抗HA5和抗卵白蛋白抗体滴度(EC50)(图5)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。这些结果证实，用两种单价蛋白质抗原纳米载体(NC-HA5和NC-OVA)的组合免疫过的小鼠针对这两种蛋白质抗原产生抗体。
100μg NC-OVA(在外表面上展现卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗HA5和抗卵白蛋白抗体滴度。示出了如通过针对H5N1HA蛋白质和卵白蛋白蛋白质的ELISA所测量的抗HA5和抗卵白蛋白抗体滴度(EC50)(图5)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。这些结果证实，用两种单价蛋白质抗原纳米载体(NC-HA5和NC-OVA)的组合免疫过的小鼠针对这两种蛋白质抗原产生抗体。
[0339] 实例10：用两种单价抗原纳米载体和一种二价抗原纳米载体进行的免疫导致对所有四种抗原的免疫应答
[0340] 测量未免疫的小鼠和注射过NC-HA5、NC-OVA以及NC-M2e-L2(如实例4中所制备)的小鼠(5只动物/组；皮下，每次注射100μg每种NC，以3周为间隔进行2次)的抗HA、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。用NC进行免疫后第33天的滴度在图6中示出(针对HA蛋白质、卵白蛋白蛋白质、PLA-PEG-M2e肽或PLA-PEG-L2肽的ELISA)(组1：未免疫的；组2：用NC-HA5、NC-OVA以及NC-M2e-L2免疫过的)。
[0341] 以3周为间隔(第0天和第21天)给小鼠注射100μg NC-HA5蛋白质(在外表面上展现流感H5N1HA蛋白质并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)、100μg NC-OVA(在外表面上展现卵白蛋白并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)以及100μgNC-M2e-L2(在外表面上展现流感M2e肽(aa2-27)和HPV L2肽(aa17-36)并且在NC中含有OP-II辅助肽和R848佐剂的纳米载体)(皮下，后肢)。在用NC进行免疫后第33天测量血清抗HA、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度。示出了如通过针对HA蛋白质、卵白蛋白蛋白质、M2e肽以及L2肽的ELISA所测量的抗HA、抗卵白蛋白、抗M2e肽以及抗L2肽抗体滴度(EC50)(图6)。还示出了未免疫的对照小鼠的滴度。这些结果证实，用两种单价抗原纳米载体和一种二价抗原纳米载体(NC-HA5、NC-OVA以及NC-M2e-L2)的组合免疫过的小鼠针对所有四种抗原产生抗体。
[0342] 实例11：用两种单价抗原纳米载体和一种二价抗原纳米载体进行的免疫导致对所有四种抗原的免疫应答
[0343] 测量用NC-M2e、NC-L2肽以及NC-烟碱-卵白蛋白的组合(如实例4中所制备)免疫过的小鼠的抗体滴度。NC-M2e和NC-L2肽含有OP-HT辅助肽(对应地为2.0％和2.4％)和R848佐剂(对应地为3.6％和4.3％)；NC-烟碱-卵白蛋白含有R848佐剂(4.2％)。图7的每个柱状图表示针对抗原的滴度。通过每次注射120μg每种NC对每组五只动物进行皮下免疫，以3周为间隔进行2次。示出了第一次免疫后第33天的滴度(对应地针对PLA-PEG-M2e、PLA-PEG-L2、卵白蛋白以及聚赖氨酸-烟碱进行的ELISA)。
[0344] 这些结果证实，用各自携带一种不同肽抗原的两种NC与携带另外两种抗原的一种NC一起的组合进行的免疫导致针对所有四种NC携带的抗原产生抗体。当使用相同量的三种NC(第一种含有来自A型流感病毒的表面M2e肽(M2基质蛋白质的胞外域，氨基酸2-27)，第二种含有来自HPV病毒的表面L2肽(来自HPV-16的L2衣壳蛋白的氨基酸17-36)，并且第三种携带表面烟碱和卵白蛋白蛋白质)进行动物免疫时，在所有动物中都诱导了针对所有四种NC偶合的抗原的强体液应答(图7)。在预免疫小鼠的血清中没有检测到反应性。
[0345] 实例12：用在不同空间定向上具有抗原的两种单价纳米载体进行的免疫导致对这两种定向的免疫应答
[0346] 制备NC-3′-烟碱
[0347] 从巴亨美洲公司(柏市街3132号，托伦斯加利福尼亚州90505，产品代码4065609)购买卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸盐。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约
8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。在普林斯顿全球合成中心(300乔治帕特森路206号，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造具有约5,000Da的PEG嵌段和约21,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG-烟碱(S-642)，即聚-D/L丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羟基甲基烟碱醚。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约
8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。在普林斯顿全球合成中心(300乔治帕特森路206号，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造具有约5,000Da的PEG嵌段和约21,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG-烟碱(S-642)，即聚-D/L丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羟基甲基烟碱醚。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0348] 溶液如下制备：
[0349] 溶液1：在室温下在0.13N HCl中制备20mg/mL卵白蛋白肽323-339。
[0350] 溶液2：通过将每种聚合物分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后组合2份PLGA-R848溶液与1份每种PLA-PEG-烟碱溶液和PLA溶液，制备于二氯甲烷中的50mg/mL PLGA-R848、25mg/mL PLA-PEG-烟碱以及25mg/mL PLA。
[0351] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0352] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0353] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理40秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0354] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。将纳米载体悬浮液冷冻储存于-20℃下直到再使用。
[0355] 表8：NC-3′-烟碱表征
[0356]
[0357] 制备NC-1′-烟碱
[0358] 从巴亨美洲公司(柏市街3132号，托伦斯加利福尼亚州90505，产品代码4065609)购买卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸盐。在普林斯顿全球合成中心(乔治帕特森路
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约
8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。合成PLA-PEG-1′-Nic，即由约23000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2000Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且经由连到烟碱上的1′氨基的4-碳键与烟碱结合的嵌段共聚物。简言之，通过与环氧乙烷聚合而将在1′位置处具有丁醇连接物的烟碱制成HO-PEG-1′-Nic，并且然后通过使HO-PEG-1′-Nic与dl-丙交酯进行开环聚合而产生PLA加长部分。从塞莫迪克斯药物公司(SurModicsPharmaceuticals)(汤姆马丁路756号(756Tom Martin Drive)，伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州(AL)35211，产品代码100DL 2A)购买具有0.22dL/g的固有黏度的PLA。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
300号206室，布里斯托尔，宾夕法尼亚州19007)专门制造约7,000Da的PLGA-R848(聚-D/L-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，该PLGA-R848是由3∶1丙交酯与乙交酯比率的PLGA制造并且具有约
8.5％w/w的结合瑞喹莫德含量。合成PLA-PEG-1′-Nic，即由约23000Da的聚-D/L-丙交酯(PLA)嵌段和约2000Da的聚乙二醇(PEG)嵌段组成并且经由连到烟碱上的1′氨基的4-碳键与烟碱结合的嵌段共聚物。简言之，通过与环氧乙烷聚合而将在1′位置处具有丁醇连接物的烟碱制成HO-PEG-1′-Nic，并且然后通过使HO-PEG-1′-Nic与dl-丙交酯进行开环聚合而产生PLA加长部分。从塞莫迪克斯药物公司(SurModicsPharmaceuticals)(汤姆马丁路756号(756Tom Martin Drive)，伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州(AL)35211，产品代码100DL 2A)购买具有0.22dL/g的固有黏度的PLA。从EMD化学公司(民主南路480号吉布斯镇，新泽西州08027，件号4-88)购买聚乙烯醇PhEur，USP(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mPa.s)。
[0359] 溶液如下制备：
[0360] 溶液1：在室温下在0.13N HCl中制备20mg/mL卵白蛋白肽323-339。
[0361] 溶液2：通过将每种聚合物分别地以100mg/mL溶解于二氯甲烷中，然后组合2份PLGA-R848溶液与1份每种PLA-PEG-1′-Nic溶液和PLA溶液，制备于二氯甲烷中的50mg/mL PLGA-R848、25mg/mLPLA-PEG-1′-Nic以及25mg/mL PLA。
[0362] 溶液3：于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0363] 溶液4：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
[0364] 首先使用溶液1和溶液2产生一种初级(W1/O)乳液。将溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)组合于一个小玻璃压力管中，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。然后通过添加溶液3(2.0mL)到初级乳液中，涡旋以产生一种过程分散体，并且然后使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下进行声处理60秒，从而形成二级(W1/O/W2)乳液。
[0365] 添加二级乳液到含有70mM磷酸盐缓冲溶液(30mL)的一个50mL开口烧杯中，并且在室温下搅拌2小时以允许二氯甲烷蒸发并且纳米载体形成于悬浮液中。通过将纳米载体悬浮液转移到一个离心管中，以21,000rcf旋转45分钟，去除上清液，并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，借此洗涤一部分悬浮的纳米载体。重复此洗涤程序，并且然后将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中以获得具有以聚合物计10mg/mL的标称浓度的纳米载体悬浮液。将纳米载体悬浮液冷冻储存于-20℃下直到再使用。
[0366] 表9：NC-1′-烟碱表征
[0367]
[0368] 免疫和结果
[0369] 测量用NC-3′-烟碱与NC-1′-烟碱的组合免疫过的小鼠的抗体滴度。NC-3′-烟碱和NC-1′-烟碱含有OP-II T辅助肽(2.1％)和R848佐剂(4.2％)。图8
的每个柱状图表示针对抗原的滴度。通过每次注射120μg每种NC对每组五只动物进行皮下免疫，以3周为间隔进行2次。示出了第一次免疫后第33天的滴度(对应地针对聚赖氨酸-烟碱进行的ELISA)。
的每个柱状图表示针对抗原的滴度。通过每次注射120μg每种NC对每组五只动物进行皮下免疫，以3周为间隔进行2次。示出了第一次免疫后第33天的滴度(对应地针对聚赖氨酸-烟碱进行的ELISA)。
[0370] 这些结果显示，用各自携带相同抗原但处于不同空间定向上的两种NC的组合进行的免疫导致针对相同抗原的这些不同定向两者都产生抗体。使用相同量的两种NC(第一种含有在3′位置处连接于NC的表面烟碱，并且第二种在1′位置处连接于NC)进行动物免疫时，在所有动物中都诱导了针对烟碱的两种定向的强体液应答(图8)。在预免疫小鼠的血清中没有检测到反应性。
[0371] 实例13：制备聚合物和纳米载体
[0372] 制备PLGA-R848
[0373] 如下通过使含有酸端基的PLGA聚合物与R848在存在诸如HBTU的偶合剂的情况下反应来制备PLGA-R848。在氩气下在室温下搅拌PLGA(湖岸聚合物公司(Lakeshores Polymers)，MW约5000，7525DLG1A，酸值0.7mmol/g，10g，7.0mmol)和HBTU(5.3g，14mmol)于无水EtOAc(160mL)中的混合物50分钟。添加化合物R848(2.2g，7mmol)，然后添加二异丙基乙胺(DIPEA)(5mL，28mmol)。在室温下搅拌混合物6小时，并且随后在50℃至55℃下搅拌一整夜(约16小时)。在冷却之后，用EtOAc(200mL)稀释混合物，并且用饱和NH4Cl溶液(2×40mL)、水(40mL)以及盐水溶液(40mL)进行洗涤。经Na2SO4(20g)干燥溶液，并且将它浓缩为胶状残余物。然后添加异丙醇(IPA)(300mL)，并且聚合物结合物从溶液中沉淀析出。然后用IPA(4×50mL)洗涤聚合物以去除残余试剂，并且在35℃-40℃下在真空下干燥3天而成为白色粉末(10.26g，通过GPC测得MW是5200，通过HPLC测得R848负载是12％)。
[0374] 以类似方式，通过使PLA-CO2H(具有酸端基的聚丙交酯)与R848反应来制备PLA-R848。
[0375] 制备PLA-PEG-CO2H
[0376] 在60℃下在真空下干燥于一个100mL圆底烧瓶中的HO-PEG-CO2H(MW：2000，1.0g，0.5mmol)、dl-丙交酯(10.8g，75mmol)以及Na2SO4(15g)的混合物2天。添加无水甲苯(30ML)，并且在氩气下加热混合物到回流。添加Sn(Oct)2(0.162mL，0.5mmol)。在氩气下回流混合物一整夜并且冷却到环境室温。用CH2Cl2(200mL)稀释混合物，并且经由硅藻土(Celite.)垫进行过滤。将滤液浓缩为稠的粘性残余物。在剧烈搅拌下添加含10％MeOH的乙醚(200mL)以使聚合物沉淀析出。用含10％MeOH的乙醚(100mL)进一步洗涤聚合物并且在30℃下在真空下进行干燥，以得到呈灰白色泡沫固体状的PLA-PEG-CO2H共聚物(10.0g，CDCl3的H NMR显示聚合物具有21000的MW)。
[0377] 制备PLA-PEG-NH2
[0378] 在60℃下在真空下干燥于一个100mL圆底烧瓶中的HO-PEG-NH2.HCl(MW：3500，1.0g，0.28mmol)、dl-丙交酯(6.1g，42mmol)以及Na2SO4(10g)的混合物1天。添加无水甲苯(30ML)，并且在氩气下加热混合物到90℃。添加Sn(Oct)2(0.1mL，0.28mmol)。在氩气下回流混合物一整夜并且冷却到环境室温。用乙酸乙酯(200mL)稀释混合物，并且经由硅藻土垫进行过滤。将滤液浓缩为稠的粘性残余物。在剧烈搅拌下添加含10％MeOH的叔丁基甲基醚(MTBE)(200mL)以使聚合物沉淀析出。用含5％MeOH的MTBE(50mL)和MTBE(50mL)进一步洗涤聚合物并且在30℃下在真空下进行干燥，以得到呈灰白色泡沫固体状的PLA-PEG-NH2.HCl共聚物(5.0g，CDCl3的H NMR显示聚合物具有18000的MW)。
[0379] 制备PLA-PEG-PEG3-N3
[0380] 如下通过使HO-PEG-叠氮基与dl-丙交酯在存在例如Sn(Oct)2的催化剂的情况下进行开环聚合来制备PLA-PEG-N3聚合物。在存在于无水DCM(10mL)中的DCC(MW 206，0.117g，0.57mmol)和NHS(MW115，0.066g，0.57mmol)的情况下用NH2-PEG3-N3(MW 218.2，
0.1g，0.458mmol)处理HO-PEG-CO2H(MW 3500，1.33g，0.38mmol)一整夜。在进行过滤以去除不溶性副产物(DCC-脲)后，对溶液进行浓缩，并且然后用乙醚进行稀释以使聚合物HO-PEG-PEG3-N3(1.17g)沉淀析出。在干燥后，在一个100mL烧瓶中将HO-PEG-PEG3-N3(MW
3700，1.17g，0.32mmol)与dl-丙交酯(从EtOAc再结晶的，MW 144，6.83g，47.4mmol)和Na2SO4(10g)混合。在45℃下在真空下干燥固体混合物一整夜并且添加无水甲苯(30mL)。
在氩气下加热所得悬浮液到110℃并且添加Sn(Oct)2(MW 405，0.1mL，0.32mmol)。在回流下加热混合物18小时并且冷却到室温。用DCM(50mL)稀释混合物并且进行过滤。在浓缩为油状残余物之后，添加MTBE(200mL)以使聚合物沉淀析出，用100mL含10％MeOH的MTBE和50mL MTBE洗涤该聚合物一次。在干燥后，获得呈白色泡沫状的PLA-PEG-PEG3-N3(7.2g，通过H NMR测得平均MW：23,700)。
0.1g，0.458mmol)处理HO-PEG-CO2H(MW 3500，1.33g，0.38mmol)一整夜。在进行过滤以去除不溶性副产物(DCC-脲)后，对溶液进行浓缩，并且然后用乙醚进行稀释以使聚合物HO-PEG-PEG3-N3(1.17g)沉淀析出。在干燥后，在一个100mL烧瓶中将HO-PEG-PEG3-N3(MW
3700，1.17g，0.32mmol)与dl-丙交酯(从EtOAc再结晶的，MW 144，6.83g，47.4mmol)和Na2SO4(10g)混合。在45℃下在真空下干燥固体混合物一整夜并且添加无水甲苯(30mL)。
在氩气下加热所得悬浮液到110℃并且添加Sn(Oct)2(MW 405，0.1mL，0.32mmol)。在回流下加热混合物18小时并且冷却到室温。用DCM(50mL)稀释混合物并且进行过滤。在浓缩为油状残余物之后，添加MTBE(200mL)以使聚合物沉淀析出，用100mL含10％MeOH的MTBE和50mL MTBE洗涤该聚合物一次。在干燥后，获得呈白色泡沫状的PLA-PEG-PEG3-N3(7.2g，通过H NMR测得平均MW：23,700)。
[0381] 制备PLA-PEG-C6-N3
[0382] 在存在于无水DCM(10mL)中的DCC(MW 206，0.118g，0.57mmol)和NHS(MW 115，0.066g，0.57mmol)的 情 况 下 用6- 叠 氮 基-1-己 胺 (H2N-C6-N3)(MW 142，0.081g，
0.57mmol)处理HO-PEG-CO2H(MW 3500，1.00g，0.29mmol)一整夜。在进行过滤以去除不溶性副产物(DCC-脲)后，对溶液进行浓缩，并且然后用MTBE进行稀释以使聚合物沉淀析出，然后用MTBE洗涤该聚合物两次并且在30℃下在真空下干燥一整夜，以得到HO-PEG-C6-N3聚合物(1.1g)。将HO-PEG-C6-N3聚合物(1.1g，0.29mmol)和dl-丙交酯(6.5g，45mmol)混合于无水甲苯(60mL)中。加热混合物到回流，同时通过共沸物蒸馏来去除30mL甲苯。
冷却所得溶液到100℃并且添加Sn(Oct)2(0.095mL，0.29mmol)。在氩气下在回流下加热溶液一整夜并且冷却到室温。然后将溶液添加到150mL 2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用
2-丙醇(100mL)洗涤该聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到呈灰白色固体状的PLA-PEG-C6-N3共聚物(6.8g，通过GPC测得MW是27000，DPI是1.5)。
0.57mmol)处理HO-PEG-CO2H(MW 3500，1.00g，0.29mmol)一整夜。在进行过滤以去除不溶性副产物(DCC-脲)后，对溶液进行浓缩，并且然后用MTBE进行稀释以使聚合物沉淀析出，然后用MTBE洗涤该聚合物两次并且在30℃下在真空下干燥一整夜，以得到HO-PEG-C6-N3聚合物(1.1g)。将HO-PEG-C6-N3聚合物(1.1g，0.29mmol)和dl-丙交酯(6.5g，45mmol)混合于无水甲苯(60mL)中。加热混合物到回流，同时通过共沸物蒸馏来去除30mL甲苯。
冷却所得溶液到100℃并且添加Sn(Oct)2(0.095mL，0.29mmol)。在氩气下在回流下加热溶液一整夜并且冷却到室温。然后将溶液添加到150mL 2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用
2-丙醇(100mL)洗涤该聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到呈灰白色固体状的PLA-PEG-C6-N3共聚物(6.8g，通过GPC测得MW是27000，DPI是1.5)。
[0383] 制备PLA-PEG(5K)-CONH2NH2
[0384] 在室温下搅拌HO-PEG(5k)-CO2H(键凯技术(JenKemTechnology)，美国(USA))(MW：5000，1.0g，0.2mmol))、肼基甲酸叔丁酯(Boc-酰肼)(MW：132，0.053g，0.4mmol))、DCC(MW 206，0.083g，0.4mmol)以及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(MW 115，0.05g，0.4mmol)于无水DCM(15mL)中的混合物25小时。通过过滤去除不溶性DCC-脲并且浓缩滤液。将残余物添加到50mL MTBE中以使聚合物沉淀析出，用40mL MTBE洗涤该聚合物两次并且在真空下干燥2天，以得到呈白色粉末状的HO-PEG(5k)-CONHNHtBoc(1.07g)。将HO-PEG(5k)-CONHNHtBoc聚合物(1.07g，0.20mmol)和dl-丙交酯(4.32g，30mmol)混合于无水甲苯(70mL)中。加热混合物到回流，同时通过共沸物蒸馏来去除50mL甲苯。冷却所得溶液到100℃并且添加Sn(Oct)2(0.065mL，0.20mmol)。在氩气下在回流下加热溶液22小时并且冷却到室温。然后将溶液添加到150mL 2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用2-丙醇(60mL)洗涤该聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到呈白色固体块状的PLA-PEG(5k)-CONHNHtBoc共聚物。将聚合物溶解于50mL无水DCM中并且用冰水进行冷却。添加三氟乙酸(TFA)(15mL)并且在室温下搅拌所得溶液一整夜。将微黄色的溶液浓缩到干燥。将残余物添加到200mL 2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用
100mL 2-丙醇洗涤该聚合物。在真空下在30℃下干燥聚合物以得到所希望的聚合物，即PLA-PEG(5k)-CONHNH2(3.4g，通过NMR测得MW：24000)。
100mL 2-丙醇洗涤该聚合物。在真空下在30℃下干燥聚合物以得到所希望的聚合物，即PLA-PEG(5k)-CONHNH2(3.4g，通过NMR测得MW：24000)。
[0385] 制备PLA-PEG-MAL
[0386] 在一个100mL烧瓶中将HO-PEG(3K)-顺丁烯二酰亚胺(HO-PEG-MAL)(莱桑生物公司(Laysan Bio，Inc))(MW：3000，0.6g，0.2mmol)与dl-丙交酯(从EtOAc再结晶的，MW 144，4.32g，30mmol)和Na2SO4(4g)混合。在60℃下在真空下干燥固体混合物一整夜并且添加无水甲苯(20mL)。在氩气下加热所得悬浮液到110℃并且添加Sn(Oct)2(MW 405，0.065mL，0.2mmol)。在回流下加热混合物20小时并且冷却到室温。用DCM(50mL)稀释混合物并且进行过滤。在浓缩为油状残余物之后，添加含10％MeOH的乙醚(80mL)以使聚合物沉淀析出，用80mL含10％MeOH的乙醚和60mL乙醚洗涤该聚合物一次。在真空下在30℃下干燥一整夜后，获得呈白色泡沫状的PLA-PEG(3K)-MAL(3.26g，通过H NMR测得平均MW：
24,000)。
24,000)。
[0387] 制备PLA-PEG-SH(预示的)
[0388] 根据 文献(尼 莎C.卡拉 瑞卡尔(Nisha C.Kalarickal) 等人；巨分 子(Macromolecules)2007，40：1874-1880)制备PLA-PEG-SH共聚物。简言之，进行以下步骤。
[0389] 步骤-1.制备tBuS-PEG：将无水THF(22mL)、萘钾(potassiumnaphthalene)(于THF中的0.2M溶液，12mL)以及tBu-SH(0.54mL，4.8mmol)装到一个密封的100mL圆底烧瓶中。搅拌这些组分至少15分钟以确保形成硫醇盐，这时使用一个两头的针添加液体环氧乙烷(EO)(11.5mL，0.230mol)。进行聚合反应48小时，并且通过在冷乙醚中沉淀来回收产物。通过GPC测得聚合物的MW是约2100。
[0390] 步骤-2.制备(PEG-S)2：将来自步骤-1的tBu-S-PEG(1.0g)溶解于DMSO(19mL)中，然后添加TFA(106mL，15/85v/v)以达到8mg/mL的最终聚合物浓度。搅拌反应物20分钟，此后通过旋转蒸发来去除TFA。然后将残余物沉淀于冷乙醚中两次以回收粗PEG二硫化物。通过分步沉淀来进一步纯化粗(PEG-S)2。因此，将聚合物(1.0g)溶解于二氯甲烷(100mL)中，并且然后在搅拌下逐步添加冷乙醚直到出现沉淀。进一步搅拌溶液30分钟，并且通过过滤将沉淀的物质分离并且在真空中进行干燥。在两到三个分步沉淀结束时，PEG二硫化物(PEG-S)2的回收产率在55％-60％范围中。
[0391] 步骤-3.通过使dl-丙交酯进行开环聚合来制备(PLA-b-PEG-S)2：将(PEG-S)2(0.4g，0.10mmol)和dl-丙交酯(4.32g，30mmol)混合于无水甲苯(70mL)中。加热混合物到回流，同时通过共沸物蒸馏来去除50mL甲苯。冷却所得溶液到100℃并且添加Sn(Oct)2(0.065mL，0.20mmol)。在氩气下在回流下加热溶液18-20小时并且冷却到室温。然后将溶液添加到150mL 2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用2-丙醇(60mL)和乙醚(60mL)洗涤该聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到(PLA-PEG-S)2(约4.0g，MW：
46000)。
46000)。
[0392] 步骤-4.通过还原(PLA-PEG-S)2来制备PLA-PEG-SH：将来自步骤-3的(PLA-PEG-S)2(3.2g，0.07mmol)溶解于经过去氧的THF(25mL)中，并且添加Bu3P(1.7mL，
7.0mmol，就二硫化物单元而论是100当量)。在室温下在氩气下搅拌反应混合物一整夜。
通过在冷乙醚中进行沉淀然后在氩气氛下进行过滤来回收被还原的硫醇化的聚合物，并且在真空下进行进一步干燥，以得到呈灰白色块状固体状的PLA-PEG-SH(约3.0，MW：23000)。
7.0mmol，就二硫化物单元而论是100当量)。在室温下在氩气下搅拌反应混合物一整夜。
通过在冷乙醚中进行沉淀然后在氩气氛下进行过滤来回收被还原的硫醇化的聚合物，并且在真空下进行进一步干燥，以得到呈灰白色块状固体状的PLA-PEG-SH(约3.0，MW：23000)。
[0393] 制备具有表面PEG-X并且含有封装的卵清蛋白肽的纳米载体
[0394] 经由一种双重乳液方法制备纳米载体，这些纳米载体包含PLGA-R848、PLA-PEG-X(其中X＝羧酸(CO2H)、胺(NH2)、C6-叠氮基(C6-N3)或PEG3-叠氮基
(PEG3-N3)、酰肼(CONHNH2)、顺丁烯二酰亚胺(MAL)、硫醇(SH)以及次氮基三乙酸基团(NTA))并且含有卵清蛋白肽，其中卵清蛋白肽封装于纳米载体中。从JT贝克(JTBaker)购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％部分水解的)。在这个相同实例中，从巴亨美洲公司(柏市街3132号，托伦斯加利福尼亚州90505)获得卵白蛋白肽323-339(序列：H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Arg-NH2，乙酸盐，批号B06395)，从塞莫迪克斯药物公司(汤姆马丁路756号，伯明翰，阿拉巴马州35211)获得具有酸端基的PLA(100DL2A)；如上文所述制备PLGA-R848和PLA-PEG-X结合物。
(PEG3-N3)、酰肼(CONHNH2)、顺丁烯二酰亚胺(MAL)、硫醇(SH)以及次氮基三乙酸基团(NTA))并且含有卵清蛋白肽，其中卵清蛋白肽封装于纳米载体中。从JT贝克(JTBaker)购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％部分水解的)。在这个相同实例中，从巴亨美洲公司(柏市街3132号，托伦斯加利福尼亚州90505)获得卵白蛋白肽323-339(序列：H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Arg-NH2，乙酸盐，批号B06395)，从塞莫迪克斯药物公司(汤姆马丁路756号，伯明翰，阿拉巴马州35211)获得具有酸端基的PLA(100DL2A)；如上文所述制备PLGA-R848和PLA-PEG-X结合物。
[0395] 使用以上物质来制备以下溶液：
[0396] 1.于二氯甲烷中的100mg/mL PLA-R848结合物，
[0397] 2.于二氯甲烷中的100mg/mL PLA-PEG-X，
[0398] 3.于二氯甲烷中的100mg/mL PLA(100DL2A)，
[0399] 4.于0.13N HCl中的70mg/mL卵白蛋白肽323-339，以及
[0400] 5.于100mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中的50mg/mL聚乙烯醇。
[0401] 在一个小容器中组合1号溶液(0.50mL)、2号溶液(0.25mL)以及3号溶液(0.25mL)，并且添加于0.13N HCl中的4号溶液(0.1mL)，并且使用一个必能信数字式超声波仪250在50％振幅下进行声处理40秒。添加5号溶液(2.0mL)到此乳液中，并且使用必能信数字式超声波仪250在30％振幅下对第二种乳液进行声处理40秒。然后将这个乳液添加到一个含有70mM磷酸盐缓冲溶液(pH 8)(30mL)的搅拌烧杯中，并且在室温下搅拌此混合物2小时以形成纳米载体。
[0402] 为了洗涤纳米载体，将一部分纳米载体分散液(26.5mL)转移到一个50mL离心管中，并且在4℃下在9500rpm(13,800g)下旋转一小时。去除上清液，并且将球粒再悬浮于26.5mL磷酸盐缓冲生理盐水中。重复离心程序，并且将球粒再悬浮于8.3g磷酸盐缓冲生理盐水中，以获得约10mg/mL的含有封装的卵清蛋白肽的最终纳米载体分散液。
[0403] 制备具有表面PEG-X并且不具有封装的卵清蛋白肽的纳米载体
[0404] 以与上文刚描述过的程序类似的方式制备不具有卵清蛋白肽的纳米载体，其中在制备中删除4号溶液。
[0405] 实例14：具有获得的抗原相较于衍生的抗原的纳米载体(预示的)
[0406] 具有PTH的纳米载体：如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CONHNH2酰肼基团的纳米载体。在存在EDC的情况下用4-甲酰基-苯甲酸经由赖氨酸氨基对PTH(副甲状腺素)蛋白质进行酰化。使用HCl和NHS以产生含有苯甲醛基团的PTH。在经由用一个MWCO1K过滤器进行透滤而纯化后，使修饰过的PTH在PBS缓冲液(pH 8-9)中与在表面上含有酰肼的NC进行结合。在通过用PBS缓冲液洗涤球粒而纯化后，将所得NC-修饰过的PTH结合物悬浮于pH 7.4缓冲液中。
[0407] 具有修饰过的PTH的纳米载体：如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS。然后将溶解于同一PBS缓冲液中的修饰过的PTH添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-修饰过的PTH结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0408] 然后可以组合相等份的两种纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0409] 实例15：具有来自相同感染物的属的抗原的单价和二价纳米载体(预示的)[0410] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH 6.0缓冲液中的人类A型流感病毒HA蛋白质三聚体和HA M2e蛋白质添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-HA蛋白质三聚体/M2e蛋白质结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0411] 以相同方式使用单体人类A型流感病毒HA蛋白质来制备NC-HA单体蛋白质结合物。
[0412] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0413] 实例16：具有来自不同感染物的属的抗原的单价和二价纳米载体(预示的)[0414] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH 6.0缓冲液中的人类A型流感病毒HA蛋白质三聚体和HA M2e蛋白质添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-HA蛋白质三聚体/M2e蛋白质结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0415] 以相同方式使用失活的感染性鲑鱼贫血病毒来制备NC-感染性鲑鱼贫血病毒结合物。
[0416] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0417] 实例17：具有来自相同感染物的种的抗原的单价纳米载体(预示的)
[0418] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将麻疹血球凝集素抗原(含有麻疹血球凝集素免疫显性区的重组片段，氨基酸106-114和519-550)溶解于pH 6.0缓冲液中，并且然后添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-麻疹血球凝集素结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0419] 以相同方式使用麻疹融合蛋白的片段(对应于麻疹大融合蛋白的氨基酸399-525的重组片段)制备NC-麻疹融合抗原结合物。
[0420] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0421] 实例18：具有来自不同感染物的种的抗原的单价纳米载体(预示的)
[0422] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH 6.0缓冲液中的人类A型流感病毒HA蛋白质三聚体添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-HA蛋白质三聚体结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中以供进一步测试。
[0423] 选择链球菌肺炎多糖(PnPs)6B作为代表性PnPs血清型。将纯化过的天然(即没有纯化后减小尺寸)PnPs-6B溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs-6B溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文实例13中所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的NC中。震荡所得NC和PnPs-6B悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0424] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0425] 实例19：具有来自相同感染物的株的抗原的单价纳米载体(预示的)
[0426] 如下制备在表面上具有PEG-X的纳米载体。通过如文献((1)“单分散形状特定纳米生物材料的直接制造与收集(Direct Fabrication andHarvesting of Monodisperse，Shape Specific Nano-Biomaterials)”，罗兰，J.P.(Rolland J.P.)；梅诺，B.W.(Maynor，B.W.)；尤里斯；L.E.(Euliss，L.E.)；埃克斯纳；A.E.(Exner，A.E.)；丹尼森，G.M.(Denison，G.M.)；德西蒙，J.M(DeSimone，J.M)，美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)2005，127，10096；(2)“靶向转铁蛋白受体的纳米颗粒的多价在癌症疗法中的复合作用(The Complex Role of Multivalency in Nanop articlesTargeting the Transferrin Receptor for Cancer Therapies)”；王金(JinWang)，田少敏(Shaomin Tian)，罗比A.彼得斯(Robby A.Petros)，玛丽E.纳比尔(Mary E.Napier)以及约瑟夫M.德西蒙(Joseph M.DeSimone)；美国化学学会期刊，2010，132(32)，第11306-11313页)中所述的在不润湿模板中的颗粒复制(PRINT)方法来制备单分散PRINT纳米载体(PRINT NC)，这些纳米载体包含PLGA-R848、PLA-PEG-X(其中X＝羧酸(CO2H)、胺(NH2)、C6-叠氮基(C6-N3)或PEG3-叠氮基(PEG3-N3)、酰肼(CONHNH2)、顺丁烯二酰亚胺(MAL)以及硫醇(SH))并且含有卵清蛋白肽。在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将具有表面PEG-CO2H基团的PRINT-NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH 6.0缓冲液中的肺炎球菌表面蛋白质A(PspA)添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PsPA结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0427] 将纯化过的天然PnPs-6B溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs-6B溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的PRINT NC中。震荡所得NC和PnPs-6B悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0428] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0429] 实例20：具有来自不同感染物的株的抗原的单价纳米载体(预示的)
[0430] 将纯化过的天然PnPs-6B溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs-6B溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文实例13中所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的NC中。震荡所得NC和PnPs-6B悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0431] 将纯化过的天然PnPs14溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs14溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的PRINT NC中。震荡所得PRINT NC和PnPs14悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得PRINT NC-PnPs14结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0432] 如下制备具有表面PEG-X(其中X＝羧酸(CO2H)、胺(NH2)、叠氮基(N3)、酰肼(CONHNH2)以及醛(CHO))的金NC。
[0433] 步骤1.形成金NC(AuNC)：在配备有一个冷凝器的一个1L圆底烧瓶中在剧烈搅拌下加热500mL的1mM HAuCl4水溶液到回流，持续10分钟。然后向搅拌的溶液迅速添加50mL的40mM柠檬酸三钠溶液。保持所得深酒红色溶液处在回流下25-30分钟，并且撤消加热并且将溶液冷却到室温。然后经由一个0.8μm薄膜过滤器过滤该溶液，以得到AuNC溶液。使用可见光谱学和透射电子显微术来表征AuNC。AuNC具有约20nm直径，由柠檬酸盐封端，在520nm处具有峰值吸收。
[0434] 步骤-2.使用HS-PEG-X经过PEG-X官能化的AuNC：如下用HS-PEG-X(MW范围：1500-5000)(其中X＝羧酸(CO2H)、胺(NH2)、叠氮基(N3)、酰肼(CONHNH2)以及醛(CHO))对AuNC进行官能化。将150μl的HS-PEG-X(10μM于10mM碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中)的溶液添加到1mL的20nm直径的柠檬酸盐封端的金纳米载体(1.16nM)中以产生2500：1的硫醇与金的摩尔比率。在氩气下在室温下搅拌混合物1小时以允许硫醇与金纳米载体上的柠檬酸盐完全交换。然后通过在12,000g下离心30分钟来纯化在表面上具有PEG-X的AuNC。倾析出上清液并且将含有AuNC-PEG-X的球粒再悬浮于适当PBS缓冲液中以供与生物分子进行进一步生物结合。将纯化过的天然PnPs-19F溶解于2MNaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：
1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs-19F溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的AuNC中。震荡所得AuNC和PnPs-19F悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得AuNC-PnPs-19F结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的PnPs-19F溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的AuNC中。震荡所得AuNC和PnPs-19F悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得AuNC-PnPs-19F结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0435] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0436] 实例21：具有相同抗原但不同定向的单价纳米载体(预示的)
[0437] 如 上 文 所 述 从 衍 生 自 反-3 ′ -羟 基 甲 基 烟 碱(3-HO-MeNic) 的PLA-PEG-3-HO-MeNic共聚物、PLGA-R848以及卵清蛋白肽制备具有经由3′位置连接的表面烟碱类似物的PRINT NC。将所得的含有表面3′取代的烟碱类似物的PRINT NC悬浮于pH 7.4缓冲液中。
[0438] 以类似方式，如上文所述从衍生自1′-丁基烟碱(1-丁基-Nic)的PLA-PEG-1-丁基-Nic共聚物、PLGA-R848以及卵清蛋白肽制备具有经由1′位置连接的表面烟碱类似物的PRINT NC。将所得的含有表面1′取代的烟碱类似物的PRINT NC悬浮于pH 7.4缓冲液中。
[0439] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0440] 实例22：具有相同抗原但不同构象的单价纳米载体(预示的)
[0441] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH 6.0缓冲液中的麻疹病毒血球凝集素套索表位(HNE，H379-410，完整二硫化物)添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-HNE结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0442] 麻疹病毒的高度保守的血球凝集素套索表位(HNE，H379-410)含有三个半胱氨酸残基，这些残基中的两个(Cys386和Cys394)形成一个二硫桥键。使用含于PBS缓冲液中的二硫苏糖醇(DTT)将含有二硫桥键的HNE肽还原以得到被还原的HNE。如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的NC。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后在存在DTT的情况下在氩气下将溶解于pH 6.0缓冲液中的被还原的HNE添加到所得NC悬浮液中。在氩气下在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-被还原的HNE结合物悬浮于pH7.4PBS缓冲液中。
[0443] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0444] 实例23：具有具备不同结构的小分子抗原的单价和二价纳米载体(预示的)[0445] 如上文所述制备具有表面PEG-CO2H基团的AuNC。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将AuNC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将含于pH 6.0缓冲液中的从可商购的4-可铁宁羧酸(美国专利申请：US2007/0129551A1)制备的反-3′-氨基甲基烟碱添加到活化过的AuNC中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得AuNC-烟碱结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0446] 如文献(“通过使用叠氮基-炔点击化学的直接结合而对病毒样颗粒进行表面官能化(Surface Functionalization of Virus-Like Particles byDirect Conjugation Using Azide-Alkyne Click Chemistry)”，基达G.帕特尔(Kedar G.Patel)和詹姆斯R.斯瓦兹(James R.Swartz)；生物结合化学(Bioconjugate Chem.)，2011，22(3)，第376-387页)中所述来制备具有表面官能团(如用于CuAAC点击化学的叠氮基或炔)的VLP。根据文献程序来制备含有炔或叠氮基连接物的可卡因类似物以及含有炔或叠氮基连接物的脱氧麻黄碱类似物作为表面B细胞抗原表位。在标准CuAAC条件下用含有表面炔基团的VLP来处理具有叠氮基连接物的可卡因类似物与脱氧麻黄碱类似物的等摩尔混合物，以得到VLP-可卡因-脱氧麻黄碱结合物。
[0447] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0448] 实例24：具有具备不同结构的寡糖抗原的二价纳米载体(预示的)
[0449] 用稀酸或在声处理下对纯化过的PnPs-6B进行尺寸减小以得到寡聚PnPs-6B，将该寡聚PnPs-6B溶解于2M NaCl中。类似地，用稀酸或在声处理下对纯化过的PnPs-3进行尺寸减小以得到寡聚PnPs-3，将该寡聚PnPs-3溶解于2M NaCl中。从这些溶液制备寡聚PnPs-6B与PnPs-3的等摩尔混合溶液。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.5mg/mg)到混合的PnPs溶液中。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的寡聚PnPs-6B/PnPs-3溶液添加到含于pH 9缓冲液中的如上文所述制备的具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的AuNC中。震荡所得AuNC和活化过的PnPs-6B/PnPs-3悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得AuNC-PnPs-6B/3结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0450] 在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将在表面上含有羧酸(CO2H)基团的VLP活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的VLP球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将这些VLP悬浮于pH 6.0缓冲液中。用稀酸或在声处理下对纯化过的PnPs-4进行尺寸减小以得到寡聚PnPs-4，将该寡聚PnPs-4溶解于2M NaCl中。类似地，用稀酸或在声处理下对纯化过的PnPs-19F进行尺寸减小以得到寡聚PnPs-19F，将该寡聚PnPs-19F溶解于2M NaCl中。从这些溶液制备寡聚PnPs-4与PnPs-19F的等摩尔混合溶液。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.5mg/mg)到混合的PnPs溶液中。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的混合的PnPs-4/19F溶液中。混合所得溶液1小时，并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭，并且通过透析来进行纯化。然后将含于pH 6.0缓冲液中的具有ADH连接物的纯化过的寡聚PnPs-4/19F添加到含于pH 6.0缓冲液中的活化过的VLP中，并且在4℃下混合所得悬浮液一整夜，并且通过透析或球粒洗涤来进行纯化，以得到VLP-PnPs-4/19F结合物以供进一步测试。
[0451] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0452] 实例25：具有具备不同结构的多糖抗原的二价纳米载体(预示的)
[0453] 将纯化过的天然PnPs-6B溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的PnPs-6B溶液中。混合所得溶液1小时，并且通过透析来进行纯化。将具有ADH连接物的纯化过的PnPs-6B溶解于pH 6.0缓冲液中以用于NC结合。
[0454] 将纯化过的脑膜炎奈瑟菌脑膜炎球菌多糖血清群A(NmA)溶解于1M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/NmA的比率：1.5mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的NmA溶液中。混合所得溶液1-2小时，并且通过透析来进行纯化。将具有ADH连接物的纯化过的NmA溶解于pH 6.0缓冲液中以用于NC结合。
[0455] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的NC。然后在4℃下用含于pH6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将具有ADH连接物的PnPs-6B与具有ADH连接物的NmA于pH 6.0缓冲液中的等摩尔混合溶液添加到活化过的NC溶液中，并且在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs6B/NmA结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0456] 将纯化过的天然PnPs-19F溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.0mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的PnPs-19F溶液中。混合所得溶液1小时，并且通过透析来进行纯化。将具有ADH连接物的纯化过的PnPs-19F溶解于pH6.0缓冲液中以用于NC结合。
[0457] 将纯化过的脑膜炎奈瑟菌脑膜炎球菌多糖血清群C(NmC)溶解于1M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/NmC的比率：1.5mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的NmC溶液中。混合所得溶液1-2小时，并且通过透析来进行纯化。将具有ADH连接物的纯化过的NmC溶解于pH 6.0缓冲液中以用于NC结合。
[0458] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的NC。然后在4℃下用含于pH6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将具有ADH连接物的PnPs-19F与具有ADH连接物的NmC于pH 6.0缓冲液中的等摩尔混合溶液添加到活化过的NC溶液中，并且在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs-19F/NmC结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0459] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0460] 实例26：具有不同定向上的小分子抗原的二价和单价纳米载体(预示的)
[0461] 如上文实例13中所述制备具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)的纳米载体，并且在4℃下将这些纳米载体悬浮于pH 6.0缓冲液中。根据一种报道过的程序(“与分裂的腺病毒偶合的可卡因类似物：引起针对上瘾药物的高滴度免疫性的一种疫苗策略(Cocaine Ahalog Coupled toDisrupted Adenovirus：A Vaccine Strategy to Evoke High-titer ImmunityAgainst Addictive Drugs)”马丁J希克斯(Martin J Hicks)等人，分子疗法(Mol Ther)2011，19：612-619)来制备一种可卡因类似物GNC(6-(2R，3S)-3-(苯甲酰氧基)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-羰氧基-己酸)。用含于DMF中的EDC/NHS活化这种化合物，并且分离活化过的GNC-NHS酯并且进行纯化以用于NC结合。根据一种报道过的程序(“半抗原中的位置连接物对可卡因免疫药物疗法的作用(Positional linkereffects in haptens for cocaine immunopharmacotherapy)”，阿基拉伊诺(Akira Ino)，托宾J.迪克森(Tobin J.Dickerson)以及金姆D.简达(KimD.Janda)；生物有机化学与医药化学通讯(Bioorganic&MedicinalChemistry Letters)17(2007)4280-4283)来制备另一种可卡因类似物AI1，并且用如上EDC/NHS进行活化。将与NC表面PEG-酰肼相比过量的等摩尔部分的每一种活化过的可卡因类似物与含于pH 6.0缓冲液中的NC进行混合。
在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-GNC/AI1可卡因结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-GNC/AI1可卡因结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0462] 用丁二酸酐处理去甲可卡因(norcocaine)以得到含有丁二酸连接物的可卡因SNC，并且然后根据一种报道过的程序(福克斯BS(Fox BS)，坎塔克KM(Kantak KM)，爱德华MA(Edwards MA)等人，治疗性可卡因疫苗在啮齿动物模型中的功效(Efficacy of a therapeutic cocainevaccine in rodent models)，自然医学(Nat.Med.)2(10)，1129-1132(1996))用EDC/NHS进行活化。如上文实例13中所述制备具有表面
PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)的NC，并且在4℃下将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将过量的活化过的可卡因类似物SNC添加到NC中。在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-SNC可卡因结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)的NC，并且在4℃下将这些NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将过量的活化过的可卡因类似物SNC添加到NC中。在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-SNC可卡因结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0463] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0464] 实例27：具有具备不同附着物的肽抗原的二价和单价纳米载体(预示的)
[0465] 根据实例13制备具有表面PEG-叠氮基(PEG-N3)的纳米载体，并且将这些纳米载体悬浮于用氩气脱气过的pH 7缓冲液中。通过标准固相肽合成法来制备具有C端炔丙酰胺基(C-炔基团)的卵白蛋白(325-336)肽，并且在氩气下将所得纯化过的卵(325-336)-C-炔肽溶解于pH 7缓冲液中。通过标准固相肽合成法来制备具有用5-己炔酸进行酰化过的N端胺(N端炔基团)的卵白蛋白(325-336)肽，并且在氩气下将所得纯化过的卵(325-336)-N-炔肽溶解于pH 7缓冲液中。在氩气下将具有表面PEG-N3的NC与等摩尔量的每一种卵-C-炔和N-炔肽混合于pH 7缓冲液中，并且使所得悬浮液根据一种报道过的方案(“铜催化的叠氮基-炔环加成反应在生物结合中的分析与最佳化(Analysis and optimizationof copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition for bioconjugation)”，弘V(Hong V)，普瑞苏尔斯基SI(Presolski SI)，马C(Ma C)，芬恩MG.(Finn MG.)；德国应用化学(Angew Chem Int Ed Engl)，2009；48(52)：9879-83)来进行CuAAC点击反应。通过用pH 7缓冲液进行球粒洗涤来纯化所得NC-卵清蛋白肽-C-键联的/卵清蛋白肽-N-键联的结合物，并且悬浮于pH 7缓冲液中。
[0466] 根据一种标准程序制备重组病毒样颗粒(VLP)。具体地说，如马修皮西(Matthew Peacey)等人((1)皮西M(Peacey M)，威尔逊S(WilsonS)，贝尔德MA(Bajrd MA)，华德VK(Ward VK)，“通用RHDV病毒样颗粒：通过基因修饰和化学结合来合并抗原(Versatile RHDVvirus-like particles：incorporation of antigens by genetic modification andchemical conjugation)”生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)；2007；98：968-77；(2)皮西M，威尔逊S，佩雷特R(Perret R)，龙凯塞F(RoncheseF)，华德VK，杨V(Young V)，杨S(Young S)，贝尔德MA，“来自兔出血性疾病病毒的病毒样颗粒可以诱导抗肿瘤应答(Virus-likeparticles from rabbit hemorrhagic disease virus can induce ananti-tumorresponse)”疫苗(Vaccine)；2008；26：5334-5337)所述，制备来自兔出血性疾病病毒的VLP，并且经由如4-(N-顺丁烯二酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸磺基丁二酰亚胺基酯(磺基-SMCC)的异质双官能连接物将这些VLP与卵(323-339)肽进行结合。纯化所得VLP-卵清蛋白肽结合物并且悬浮于pH 7缓冲液中。
[0467] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0468] 实例28：具有在蛋白质上的不同附着点(活化的相较于蛋白质标签)处偶合的蛋白质抗原的单价纳米载体(预示的)
[0469] 如实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。然后将溶解于pH6.0缓冲液中的麻疹血球凝集素蛋白质(MHP)添加到所得NC悬浮液中。在4℃下允许结合进行一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-MHP结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0470] 如实例13中所述制备具有表面PEG-NTA基团的纳米载体用于Ni-His标签复合。然后用NiCl2于结合缓冲液(50mM磷酸盐缓冲系统，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)中的溶液处理NC以形成具有表面NTA-Ni复合物的NC。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，在氩气下将所得NC悬浮于结合缓冲液中。将加了His6标签的重组麻疹血球凝集素蛋白质于结合缓冲液中的溶液添加到NC悬浮液中，并且在氩气下在4℃下培育悬浮液一整夜。用pH 7缓冲液洗涤所得NC-NTA-His6-MHP结合物球粒，并且悬浮于PBS缓冲液中。
[0471] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0472] 实例29：具有在不同附着点(活化羟基相较于连接物)处偶合的寡糖抗原的单价纳米载体(预示的)
[0473] 如实例13中所述制备具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的纳米载体，并且在氩气下将这些纳米载体悬浮于pH 9缓冲液中。用稀酸或在声处理下对纯化过的PnPs-6B进行尺寸减小以得到寡聚PnPs-6B，将寡聚PnPs-6B溶解于2M NaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/PnPs的比率：1.5mg/mg)到PnPs-6B溶液中。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将所得活化过的寡聚PnPs-6B溶液添加到具有表面PEG-CONHNH2(PEG-酰肼)基团的NC中。震荡所得NC和活化过的PnPs-6B悬浮液1小时并且用2M甘氨酸溶液进行淬灭。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0474] 如实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的纳米载体。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。根据一种报道过的方法(“合成的6B二糖、三糖以及四糖-蛋白质结合物含有肺炎球菌6A和
6B型共同和6B特异性表位，在小鼠中引出保护性抗体(Synthetic 6B Di-，Tri-，and Tetrasaccharide-Protein Conjugates Contain Pneumococcal Type 6Aand 6B Common and 6B-Specific Epitopes That Elicit ProtectiveAntibodies in Mice)”，詹 森WTM(Jansen WTM)等人，感染与免疫(InfectImmun)，2001；69(2)：787-793)来制备具有
3-氨基丙基连接物的寡PnPs-6B。将含于pH 6缓冲液中的寡聚PnPs-6B-3-丙胺添加到活化过的NC中。在氩气下在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
6B型共同和6B特异性表位，在小鼠中引出保护性抗体(Synthetic 6B Di-，Tri-，and Tetrasaccharide-Protein Conjugates Contain Pneumococcal Type 6Aand 6B Common and 6B-Specific Epitopes That Elicit ProtectiveAntibodies in Mice)”，詹 森WTM(Jansen WTM)等人，感染与免疫(InfectImmun)，2001；69(2)：787-793)来制备具有
3-氨基丙基连接物的寡PnPs-6B。将含于pH 6缓冲液中的寡聚PnPs-6B-3-丙胺添加到活化过的NC中。在氩气下在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将NC-PnPs-6B结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0475] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
[0476] 实例30：具有在多糖上的不同附着点处偶合的多糖抗原的单价纳米载体(预示的)
[0477] 经由用CDAP活化过的羟基将NmA在多个附着点处连接到NC上。将纯化过的脑膜炎奈瑟菌脑膜炎球菌多糖血清群A(NmA)溶解于1MNaCl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)于CH3CN(100mg/mL)中的溶液(CDAP/NmA的比率：1.5mg/mg)。用0.2M Et3N水溶液或NaOH溶液稀释液将所得溶液的pH调节到9。在3-4分钟之后，将己二酸二酰肼(ADH)连接物于pH 9缓冲液中的溶液添加到活化过的NmA溶液中。混合所得溶液1-2小时，并且通过透析来进行纯化。将具有ADH连接物的纯化过的NmA溶解于pH 6.0缓冲液中以用于NC结合。
[0478] 如实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的NC。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。将具有ADH连接物的NmA于pH 6.0缓冲液中的溶液添加到活化过的NC溶液中，并且在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-NmA结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0479] 经由末端氨基将NmA连接到NC上。如实例13中所述制备具有表面PEG-CO2H基团的NC。然后在4℃下用含于pH 6PBS缓冲液中的过量EDC/NHS将NC活化1-2小时。然后用pH 6.0缓冲液洗涤活化过的NC球粒以去除未反应的EDC/NHS，并且将NC悬浮于pH 6.0缓冲液中。根据一种报道过的程序(“针对A和C型脑膜炎球菌的一种结合物疫苗的开发与1期临床测试(Development and phase 1clinical testing of aconjugate vaccine against meningococcus A and C)”，科斯坦蒂诺P(Costantino P)，维蒂S(Viti S)，迫达A(Podda A)，威尔蒙特MA(Velmonte MA)，能乔尼L(Nencioni L)，拉波利R(Rappuoli R)，疫苗(Vaccine)1992；10(10)：691-8)用含于pH 7缓冲液中的NH4Cl和氰基硼氢化钠(NaCNBH3)对纯化过的NmA进行还原胺化以得到氨基-NmA。然后将氨基-NmA添加到活化过的NC悬浮液中，并且在4℃下混合所得悬浮液一整夜。在用PBS缓冲液洗涤球粒后，将所得NC-NmA结合物悬浮于pH 7.4PBS缓冲液中。
[0480] 然后可以组合这些纳米载体以形成NC悬浮液以供进一步测试。
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