良性前列腺增生(BPH)是一种常见的、与日益增长的年龄相关 的前列腺紊乱。很高比例的年龄超过50岁的男性(68％)具有良性前 列腺增生的组织学证据，截至70岁，百分之四十三(43％)的男性具 有临床上明显的前列腺增大。该疾病的特征是前列腺的尿道周围与过 渡区域处的腺体及肌纤维组织逐渐增大，从而导致膀胱出口梗阻的症 状。仅仅在美国，每年为BPH要进行350,000至400,000例手术， 这使得它成为美国最常见的治疗，总花费达45亿美元。BPH的发病率 远高于前列腺癌，但对其病因几乎没有什么了解。不过，普遍认为高 龄男性中睾酮与雌激素之间平衡的细微变化可能会引发前列腺的生 长，从而导致BPH。良性(或恶性)疾病引起的前列腺肿大一般导致 前列腺部尿道顺应性降低并增加膀胱出口梗阻。结果经常在膀胱中发 生次级变化。这些变化包括膀胱壁肥大以及小梁与憩室的形成。逼肌 的次级变化主要是与前列腺梗阻、遗尿、尿频尿急相关的最为棘手的 症状相关。根本的机制仍然具有争论，但可能同梗阻膀胱中逼肌发育 不稳定有部分关联。
导致膀胱出口梗阻的BPH传统上通过经尿道前列腺切除术 (TURP)来治疗。尽管TURP被认为是BPH外科处理中的黄金标准， 但存在高频率的并发症。例如，70％的切除案例受到不同程度的逆行 性射精的困扰，1-2％导致尿失禁。作为选择，BPH可以通过施用诸如 α-受体阻滞剂这类药物或者通过使用非那雄胺(Proscar)阻滞睾酮对 前列腺的活性来进行治疗。后一种药物是通过抑制5-α还原酶的活性阻 止睾酮转变为前列腺中的活性形式DHT来发挥作用的。利用这种手 段，可以阻止前列腺受到男性激素的刺激，防止其进一步生长，这样 来预防临床BPH的发展。然而，在长至可检测的大小或者发展至需要 进行外科手术的症状之前，尚无可靠的标记来检测BPH。而到了可检 测的时候，在绝大多数情况下，膀胱逼肌已经被损害，其中相当数量 即便在TURP后也无法获得改善。现有的那些众所周知的标记——前 列腺酸性磷酸酶(PAP)及前列腺特异抗原(PSA)，尽管可用于检测 前列腺癌，但在BPH早期检测方面并不是非常有用。PSA是当前最好 的最有用处的用于检测前列腺癌的标记。不过，由于BPH与前列腺癌 在PSA水平上有很大重叠，在那些两可病例中尤为如此(PSA水平范 围为4-10ng/ml)，因此无法精确区分BPH与前列腺癌。已经尝试通 过测量游离PSA(PSA没有与蛋白酶抑制剂结合)与总PSA(游离PSA 加上与α-1-抗糜蛋白酶[ACT]结合的PSA)的比例，或者联合PSA与 hK2，来改善两可区域诊断的精确度。不过，相当数量的受试者仍然被 错误分类。
近来全世界几个实验室进行了一些尝试，其焦点是用于BPH的特 异性标记。Mikolajczyk与其同事已报道来自BPH病人前列腺组织过 渡区域的一种游离PSA修饰形式有所升高，他们称之为BPSA(BPH 相关PSA)。
他们进一步报道了在精浆中存在BPSA。BPSA用作BPH标记的 潜力正在积极探索中。目前对前列腺癌发生的研究证实通过皮下注射 睾酮(T)及苯甲雌二醇(E2)可轻易诱发前列腺癌。这与分泌蛋白谱 的并发变化、许多多肽生长因子的改变表达、间质平滑肌紊乱以及包 括在动物模型的前列腺癌及人前列腺癌的发育及发展过程中Id-1基因 过量表达在内的差异基因表达相关联。通过将Id-1基因转然已知的人 前列腺癌细胞系LNCaP中对该基因的功能进行了广泛研究，发现它通 过灭活p161NK4a/RB可在无血清培养基中刺激癌细胞增殖，其中包括激 活MAPK及NF-KB途径。通过使用激素诱发的前列腺癌Noble大鼠模 型，发现施用激素胶囊后2-3个月在前列腺中首先检测到发育异常。发 育异常/癌的发展与一种新的分泌蛋白，与人激肽释放酶2(hK2)同源 并且是前列腺特异抗原(PSA)基因家族成员的一种的激肽释放酶样蛋 白的出现同时发生。尽管PSA(hK3)在前列腺癌诊断方面有用，但它 并不是肿瘤特异性的。为了找到更好且更特异的用于前列腺癌的肿瘤 标记进行了全球范围的广泛检索，其中hK2是候选之一，因为它的水 平与前列腺癌更直接线性相关，表现出了更多的肿瘤特异性。目前的 研究表明在人BPH中，分泌蛋白谱有相类似的改变，其中可能会分泌 能够在前列腺分泌物和/或血清中可检测的特异蛋白。
发明概述
本发明提供了一种诊断受试者是否患有良性前列腺增生(BPH) 的方法，该方法包括从受试者获取前列腺液样品、以及分析该前列腺 液样品以检测BPH蛋白标记存在与否从而确定受试者是否患有 BPH。
本发明进一步提供了一种诊断受试者是否患有良性前列腺增生 (BPH)的方法，该方法包括从受试者获取血清样品、以及分析该血 清样品以检测BPH蛋白标记存在与否从而确定受试者是否患有 BPH。
最后，本发明提供一种含有BPH蛋白标记与使用说明书的用于检 测良性前列腺增生(BPH)标记的诊断试剂盒，以及含有针对PSP61、 lwPSA及αs1-酪蛋白的抗体与使用说明书的用于检测良性前列腺增生 (BPH)标记的诊断试剂盒。
附图的简要描述
图1是BPH及非BPH对照的人前列腺液(EPS)中分泌蛋白的双 向电泳分析。根据等电点(pI，pH3-10)及分子量分离200μg蛋白， 凝胶用银染来处理。所示的是来自年轻组(A)、同龄对照组(B)及 BPH患者(C)的具有代表性的凝胶。箭头指示仅在BPH样品中存在 的(斑点1-3)、在BPH中高表达的(斑点4)以及在BPH及正常对 照中均表达的(斑点或者斑痕5-8)蛋白斑。
图2所示的是经ESI-MS/MS后斑点1(PSP94的同种异型， [iPSP94]，即PSP61)的谱图。图表顶部所示的是MS/MS离子，图表 底部包含MasEnt43谱图。
图3是经ESI-MS/MS后斑点1(iPSP94，[即PSP61])的片段序 列，通过数据库检索后确认为PSP94，但其仅有61氨基酸，因此为 PSP61。
图4所示的是经ESI-MS/MS后斑点2(血清白蛋白)的谱图。图 表顶部所示的是MS/MS离子，图表底部包含MasEnt43谱图。
图5是经ESI-MS/MS后斑点2(血清白蛋白)的片段序列，图表 顶部所示的是MS/MS离子，图表底部包含MasEnt43谱图。
图6所示的是低分子量PSA(lwPSA)的片段序列。
图7是斑点3中αs1-酪蛋白的谱图。图表顶部所示的是MS/MS离 子，图表底部包含MasEnt43谱图。
图8为斑点3中αs1-酪蛋白的片段序列。
图9是经MALDI-MS后斑点5中多肽的谱图。谱图是在反射模式、 质量范围为600-3400Da的条件下获得的。所提取多肽的谱图经数据库 检索后鉴定为锌-α-2-糖蛋白。
图10是经MALDI-MS后斑点6中多肽的谱图。谱图是在反射模 式、质量范围为600-3400Da的条件下获得的。所提取多肽的谱图经数 据库检索后鉴定为微精浆蛋白(microseminoprotein)(PSP94)。
图11是经MALDI-MS后斑点8中多肽的谱图。谱图是在反射模 式、质量范围为600-3400Da的条件下获得的。所提取多肽的谱图经数 据库检索后鉴定为前列腺酸性磷酸酶(PAP)。
图12是经MALDI-MS后斑点4(乳铁传递蛋白)的谱图。图表顶 部所示的是MS/MS离子，图表底部包含MasEnt43谱图。
图13经ESI-MS/MS后斑点4(乳铁传递蛋白)的片段序列，通过 数据库检索后确认为乳铁传递蛋白。
图14所示的是在人正常前列腺、BPH及前列腺癌样品中αs1-酪蛋 白的免疫染色(A×100；B×200；C、D、E、F，×400)。
图15是在人正常前列腺、BPH及前列腺癌中αs1-酪蛋白的免疫反 应性。所有正常前列腺与70％的前列腺癌样品的αs1-酪蛋白反应为阴 性。仅30％的前列腺癌样品分别表现出轻度至中等的αs1-酪蛋白免疫 反应性。相反，91％的BPH样品表现出中等至强烈的αs1-酪蛋白免疫 反应性，其中36％为++并且55％为+++水平。
发明的详细描述
定义
在本申请的用法中，其中如果没有另外特别说明，下述每个术语 均为下文所阐述的意思。
在本文用法中，“受试者”可以是诸如灵长类、小鼠、大鼠、豚鼠 或者兔子等任何动物。在优选实施例中，受试者是人。
在本文用法中，“蛋白标记”指所发现的蛋白其水平与模式癌症相 关。“BPH蛋白标记”是其水平与BPH诊断相关的蛋白。
发明的实施例
本发明提供了一种诊断受试者是否患有良性前列腺增生(BPH) 的方法，该方法包括从受试者获取前列腺液样品、以及分析该前列腺 液样品以检测BPH蛋白标记存在与否从而确定受试者是否患有 BPH。在优选实施例中，受试者为人类男性。通过直肠途径手指挤压 病人的前列腺可获得分泌的前列腺液样品。在一个实施例中，使用双 向电泳法与质谱分析来检测标记蛋白。针对这些标记蛋白的特异的抗 血清增加了。可以使用针对蛋白标记的抗体来检测蛋白标记。在优选 实施例中，蛋白标记包括PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白。
本发明进一步提供了一种诊断受试者是否患有良性前列腺增生 (BPH)的方法，该方法包括从受试者获取血清样品、以及分析该血 清样品以检测BPH蛋白标记存在与否从而确定受试者是否患有 BPH。在优选实施例中，受试者为人类男性，蛋白标记包括PSP61、 lwPSA或者αs1-酪蛋白。在另一个实施例中，可以应用使用抗体的免 疫放射分析来检测蛋白标记。这些抗体可以是针对PSP61、lwPSA或 者αs1-酪蛋白的单克隆抗体。
本发明进一步提供一种用于检测良性前列腺增生(BPH)标记的 诊断试剂盒。在一个实施例中，该诊断试剂盒含有BPH蛋白标记与使 用说明书。在另一个实施例中，用于检测良性前列腺增生(BPH)的 诊断试剂盒包括针对PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白的抗体以及使用 说明书。在一个实施例中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施例中， 抗体吸附在某种基质上。
下述的实验细节用以说明如何实施本发明，其不应被视为以任何 形式限制了本发明。
实验细节
已经进行了广泛研究用以分析通过直肠指检(DRE)直接挤压前 列腺所获得的前列腺分泌物。已知通过以上过程收集的分泌物为前列 腺液(EPSs)。正常人前列腺(年轻组及同龄对照组)与BPH的EPS 样品分别与蛋白酶抑制剂混合，冷冻条件下储存备用。通过双向电泳 对正常前列腺及BPH的EPS进行的比较分析表明，在BPH分泌物中 有多种蛋白被差异表达。特别地，仅仅在BPH样品中发现了称为斑点 1、2和3的三个主要斑点，而在正常/同龄样品中则完全缺失或者以极 低以至无法检测的水平表达(图1)。尽管还有其它的差异表达的斑点 (即，斑点4等)，但目前关注的焦点仍然是这三个主要斑点(斑点 1-3)。利用质谱检测以及mass sequencing(在悉尼Macquarie大学澳 大利亚蛋白质组分析研究组[APAF]的协助下)对这些差异表达的斑点 进行分析，表明斑点1为PSP94的“同种异型物”(iPSP94；MW 14kDa， pI 4.5)或者是β-微精浆蛋白，即已知的类抑制素多肽(3-抑制素)。 我们进一步鉴定了该蛋白，发现该蛋白实际上含有61个氨基酸(而非 PSP94的94个氨基酸)(参见图2和3)，因此应该更确切的称之为 PSP61。斑点2(MW为9kDa，pI 5-5.5)被证实为血清白蛋白(图4、 5)，而斑点3(MW 10kDa，pI 8.5-9.3)含有两种蛋白：一种是低分 子量的PSA(lwPSA)(图6)，另一种为αs1-酪蛋白(图7、8)。
为了检验实验的有效性和可靠性，对在正常、同龄对照及BPH样 品中均存在的几个主要蛋白斑点进行了分析。例如，斑点5为锌-α-2- 糖蛋白(图9)，斑点6至8分别为PSP94(图10)、PSA[数据未列 出，由Western blotting证实]及前列腺酸性磷酸酶[PAP](图11)。进 一步注明斑点4实际上是乳铁传递蛋白(图12、13)。已经证实这些 蛋白可以同特异的抗血清作用，而且它们曾被报道为前列腺的分泌成 分。
在本研究中，使用了年轻成年男性(40岁以下)的EPS样品与同 龄未患有BPH的EPS。来自已确认患有前列腺癌的病人的EPSs没有 包括在内，原因是因为绝大多数患有前列腺癌的病人其BPH程度总是 变化的。因此，如果包括来自前列腺癌病人的EPSs只会多余地在初期 搞乱BPH信号。三个前列腺癌细胞系，LNCaP(PSA+)、PC3(PSA-) 及DU145(PSA-)的上清，经双向电泳分析后发现，LNCaP(连同其 它两个细胞系)对于lwPSA是阴性的，在所有三个细胞系中没有或者 仅仅是痕量PSP94被检出。在人体中，已报道PSP94在前列腺癌中被 下调。这有助于支持我们的假设——lwPSA与PSP94及PSP61在前列 腺癌细胞中不在任何重要途径中表达。
I BPH分泌物中特异性标记蛋白的鉴定及特征
A.收集前列腺分泌物
从10名年龄为40岁或以下(正常)的男性、50岁同龄对照及50 名年龄在60-70岁之间并确诊患有BPH的男性中收集前列腺液 (EPSs)。在着手进行任何治疗方案之前，从正常组、同龄对照组(未 患有BPH)与BPH病人(已确诊)中获得EPS样品(每份约1ml)， 分别与蛋白酶抑制剂混合，冷冻条件下(-80℃)储存备用。它们分别 称作非BPH(正常的与同龄对照)及BPH-EPS(BPH)。
B.双向凝胶电泳
采用根据Wilkins等编辑的书所述的方案(31)总结在下面几个段 落中，使用IPGphor Isoelectric Focusing System与垂直SDS-PAGE， 对来自正常组、同龄对照组及BPH病人的EPS进行双向凝胶电泳。
1.第一向——等电聚焦(IEF)
使用固定pH梯度(IPG)胶条(Amersham Pharmacia Biotech) 进行等电聚焦。将5μl EPS溶解或稀释在250μl再水化液(8M尿素， 2％CHAPS，0.5％IPG缓冲液)中，含有样品的水化液加入到IPG胶 条中，使其再水化14h。EPS样品在从100V(2h)、500V(1h)1000V (1h)至8000V(4h)逐渐增高的电压下进行电泳。在第一向IEF中， 蛋白根据其pH值进行分离。
2.第二向——SDS-PAGE
在平衡缓冲液(50mM Tris-Cl，6M尿素，30％甘油，2％SDS， DTT 10mg/ml或者碘乙酰胺25mg/ml，以及示踪染料)中平衡IPG胶 条30分钟。随后，将IPG胶条置于垂直SDS-PAGE体系(Hoefer SE 600)中，根据分子量通过电泳来分离蛋白。所获得的凝胶利用银染试 剂盒(Amersham)进行银染。在ImageMaster 2D Elite凝胶分析软件 (Amersham)的协助下对来自年轻组和同龄对照组及BPH组的EPS 的双向凝胶进行比较，以显示差异表达蛋白概况。
C.质谱分析
Young CYF，Seay T，Higen K，Charlesworth MC，RochePC， Klee GG，Tindall D，Prostate[Suppl]7：17-24(1996)中所述的实验 步骤如下。
1.衬质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)方法
为了进行质谱分析，电泳图可用银或考马斯亮蓝来染色。确定双 向凝胶上差异表达的蛋白斑点，切下用于质谱分析。在质谱分析中， 我们请求澳大利亚蛋白质组分析研究组(APAF)给予协助。使用的是 MALDI-MS方法。所分离的蛋白斑点首先于37C进行胶内胰蛋白酶 切。所获得的多肽使用10％乙腈、1％TFA溶液从胶中提取，用ZipTip 进行纯化。多肽从基质上洗脱，置于MALDI靶上并风干。然后使用 一台Micromass ToF Spec 2E飞行时间质谱学进行MALDI-MS。使用 氮激光器(337nm)照射样品，通过反射模式在600-3400Da的质量范 围获得谱图。利用近点校正，可以给出典型的～100ppm或者更低的质 量精度。然后可获得来自样品多肽的单一同位素峰列表(图10-12)。 用Peptldent对SWISS-PROT和TREMBL中智人(Homo sapiens)的 肽质指纹图谱进行检索。这可以基于肽指纹给出最相似的候选蛋白。
2.电喷雾离子化质谱/Mass Sequencing(ESI-MS/MS)
差异表达的蛋白斑点的性质进一步通过ESI-MS/MS来确认。经 16h胰蛋白酶消化后，所获得的多肽使用ZipTip纯化以浓缩并除去盐 分。利用配备纳米喷雾源(nanospray source)的Micromass Q-TOF MS 通过ESI-TOF MS/MS分析样品，使用硼硅酸毛细管手动获得数据。获 取m/z范围超过400-1800的数据，以选取用于MS/MS分析的多肽。 选定多肽后，将机器调节到质谱/Mass Sequence模式，在多种碰撞能量 设置下收集m/z范围50-2000的数据。生成多肽片段及片段离子(Y系 列离子用于所关注多肽的测序)的谱图。通过这些收集的数据，可以 确定所关注多肽的氨基酸序列。基于所选取多肽的氨基酸序列数据， 可以确定最可能的蛋白。
II特异标记蛋白的细胞来源
通过双向电泳和质谱对这些差异表达蛋白的性质进行了鉴定，使 用免疫组织化学和原位杂交方法对三个特异蛋白的细胞来源进行检 测，并评估这些蛋白标记在BPH中的特异性。
A.抗血清的生成
为了确定这些蛋白的细胞来源，生成了针对这些蛋白的抗血清。 为了实现这个步骤，采用了Alpha Diagnostic International，San Antonio，TX，USA的服务，在基于标记蛋白通过大量测序所确定的已 知氨基酸序列的基础上生成特异性针对这些蛋白的抗体。
B.免疫组织化学(IHC)
抗血清的特异性首先针对相应差异表达的蛋白斑点进行确认。然 后将这些抗血清用于正常人前列腺、同龄对照组、BPH组及前列腺癌 样品的IHC。结果表明BPH的前列腺上皮细胞对这些标记蛋白表现出 阳性反应，而基质组织则是阴性的(图14、15)。这表明特异性的标 记蛋白是由BPH上皮细胞分泌的。
III.蛋白标记的检测
最后阶段就是检测PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白是否存在于BPH 病人的血清中，以开发出一种通过检测血清中是否存在这些蛋白来诊 断BPH的方法，并特别在临界情形下评估新发现的标记与PSA水平的 相关性。
A.简介
由于血检是最便利的临床检测方法之一，因此本计划的最后一步 就是检测这三个蛋白能否在BPH病人的血液中检出，以及它们是否是 BPH病人所特有的。同时也将检验PSA水平，并研究PSA水平与这 三个蛋白水平之间的关联。我们预测结果对PSA与PSP94将会是阳性 的，因为已知它们是存在于血清中。预计这些分子的变体(即PSP61、 lwPSA及αs1-酪蛋白)也将会进入血液，因此能够在血清中检出。一 旦获得确认，这将被证明在临床症状尚未出现前的早期BPH诊断中是 非常有用的。然后可以考虑生产检验试剂盒。
B.收集用于化验的血液
从新近被诊断患有BPH的100个病人中按标准方式收集静脉血 (20ml)。为了进行比较，还收集了20个正常男子(年龄40岁以下) 与50个同龄对照的血液。此外，为了进行比较，从50个PSA水平范 围在4-10nm/ml的病人中收集血液样品。样品在室温下放置1小时， 然后在3500rpm离心10分钟，使血清与其它血液组分分离。之后将 样品保存在20℃备用。
C.确定PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白血清浓度
通过免疫反射分析(Tandem-R PSA，Hybritech，Inc.)或者Labrie 等描述的方法(34)对样品进行分析，用于不含PSA的常规血清及总 PSA的检验。对这些方法通过使用所生成的特异的单克隆抗体(即 lwPSA、PSP61及αs1-酪蛋白)来代替原始抗体进行了调整，用来检验 血清lwPSA、PSP61及αs1-酪蛋白。所获得的数据同常规PSA或PSP94 的数据进行比较。一旦确立了检验方法，便可进行大规模的血清检查 以确定这些蛋白作为BPH标记的特异性。
D.特异性BPH标记的水平与特别涉及PSA水平临界高度(即， 4-10ng/ml)的血清PSA水平的关系
评估所有确诊为BPH的病人(100)的PSA水平，并比较这些PSA 水平与本研究中确定的BPH标记。对PSA水平为临界高度的病人体内 的BPH特异标记，也通过确定其特异BPH标记(即PSP61、lwPSA 及αs1-酪蛋白)的血清水平来进行了评估。通过比较BPH病人中PSA 水平与特异BPH标记以及血清PSA为临界高度的患者中的这些标记， 可以确定后者是否患有前列腺癌。PSA(临界高度)与特异标记同时升 高的病人可能仅患有BPH。在另一方面，特异BPH标记降低或者为无 法检测水平的病人更可能患有前列腺癌。
本申请要求于2003年7月8日提交的美国临时申请No.60/485,653 以及于2003年8月27日提交的美国临时申请No.60/498,623的优先 权，它们的内容并入本申请作为参照。
在本申请中，通过在括号中标注作者及日期的方式引用了多个出 版物。所述出版物的完整引述列于说明书的最后、权利要求之前。这 些出版物的完整内容并入本申请作为参照，以期更完整地公开在此所 描述和请求保护的申请的申请日前本领域的现有技术。
下列参考文献在本说明书种引用。这些参考文献的全部内容作为 背景和现有技术引入本发明。
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