用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物
阅读：461发布：2020-05-17
专利汇可以提供用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于 治疗 和 预防 良性前列腺增生 的组合物，以及使用该组合物治疗和预防良性前列腺增生的方法。更具体地，本发明涉及一种用于有效治疗和预防良性前列腺增生的包含来源于端粒酶的肽的组合物和使用该组合物治疗和预防良性前列腺增生的方法。所述组合物包含根据本发明的肽，其在治疗和预防良性前列腺增生方面表现出卓越的有效性。，下面是用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物，其中所述组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、具有与所述肽具有80％以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨基酸序列的片段。
2.一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物，其中所述组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、具有与所述肽具有80％以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨基酸序列的片段。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种选自下组的添加剂：稀释剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味剂。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0.01mg至1mg的所述肽。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0.56mg的所述肽。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是食物组合物。
8.一种用于治疗和预防良性前列腺增生的方法，其中所述方法包含给需要治疗的受试者施用权利要求1至7中任一项所述的组合物的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述组合物以每次0.005mg/kg至0.05mg/kg施用。
10.如权利要求8所述的方法，其中，在总共12周时长的治疗中，将所述组合物每2周施用，其中所述施用在第0周、第2周、第4周、第6周、第8周、第10周和第12周的一天完成，并且每次施用的组合物为0.56mg，其相当于4nmol肽/kg体重。
用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物。更具体地，本发明涉及一种包含来源于端粒酶的肽的组合物并且所述组合物用于治疗和预防良性前列腺增生。
背景技术
[0002] 良性前列腺增生(BPH)是男性老年性疾病中最常见的疾病，其伴有下尿路症状。相关的症状从40岁开始出现，但大部分临床症状在50多岁后期出现。由于生活质量的下降，BPH可引起性功能障碍，对于BPH的治疗及手术可影响性功能。
[0003] 导致增生的BPH依赖于雄性激素。特别是雄性激素对前列腺的正常细胞增殖和正常凋亡的抑制是必需的。最众所周知的内因是衰老。前列腺由于衰老和正常睾丸功能而变大。作为前列腺依赖的雄性激素，睾酮在前列腺的生长和分化中发挥重要的作用，并且通过5α-还原酶代谢产生二氢睾酮(DHT)，其在前列腺生长和前列腺基因的表达中发挥重要作用。
[0004] 作为引起前列腺增长的外因，有雄性激素、雌激素、糖皮质激素和与内分泌酶有关的物质，其通过饮食和环境诱导。这些外因的生理学效应经由多种生长因子肽出现。
[0005] BPH发生在20多岁早期到40多岁晚期，其由组织学变化引起，此时，雄性激素和雌激素协同作用引起BPH。随着年龄增长，雌激素/DHT比例增加，然后BPH增加。
[0006] 同时，众所周知，前列腺生长直至20多岁早期，并且保持其大小直到50岁，其依赖于使前列腺保持其平衡的非常复杂的相互作用，如内源生长因子、信号通路、细胞周期调节、细胞分裂和凋亡。如果细胞周期调节因子发生转变，BPH可能被诱发。
[0007] 遗传因素是影响BPH的一个主要因素。据报道，具有BPH家族史的患者显示超过60％的BPH增加，同时也报道5α-还原酶抑制剂的治疗在具有BPH家族史的患者是不太有效的。其原因在于，在这种情况下，BPH依赖于非雄激素依赖性途径。
[0008] 对于治疗BPH，可以使用手术和药物治疗。对于药物治疗，药物施用根据患者的年龄和临床进程而调节。最近，大量的BPH患者在韩国和全球范围内显著增加并且年轻患者的患病率也在增加。大量的药物被用于治疗但是它们的使用因为副作用而受到限制。
[0009] 舒必利(sulpiride)是2型多巴胺受体拮抗剂，其常用作治疗抑郁症的药物。多巴胺是一种肾上腺素和去甲肾上腺素合成过程中产生的中间产物，是一种抑制性神经递质。舒必利抑制多巴胺与其受体结合，这抑制作为多巴胺能作用的催乳素分泌，并且提高血液内催乳素的浓度。通过舒必利的连续施用而增加的催乳素会引起高催乳素血症。
[0010] 据报道催乳素与前列腺的增生、前列腺癌和BPH的发展及调节有关。同时已知催乳素与雄激素协同提高前列腺的增殖。作为另一个机制，也已知催乳素作为应激激素提高5α-还原酶的表达并且诱发前列腺的增生。催乳素是一种非甾体类因子，其与前列腺的增生和BPH的诱发有关。随着年龄的增长，催乳素增加而睾酮水平下降。据报道催乳素在老年人中诱发BPH。对于大鼠和人类，报道催乳素与前列腺的增生和分化有关。根据此报道，认为催乳素通过信号传导通路由受体所诱导。
[0011] 现有技术文件
[0013] KR 2011-0062943 A
[0014] KR 2011-0057049 A
[0015] EP 1020190 A3
[0016] 非专利文件
[0017] MCCONNELL，John D.，等“The effect of finasteride on the risk of acute urinary retention and the need for surgical treatment among men with benign prostatic hyperplasia”，New England Journal of Medicine，1998，338卷，第9期，557-563页。
[0018] 发明详述
[0019] 技术问题
[0020] 于是，本发明人尝试开发一种用于治疗和预防BPH的组合物，其具有最小的副作用和优异的治疗效果，并且完成了本发明。
[0021] 本发明的发明人已经发现了来源于端粒酶的肽用于治疗和预防BPH可以具有卓越的效果并且完成了本发明。
[0022] 本发明的目的是提供一种在治疗和预防BPH方面有效的组合物。
[0023] 技术方案
[0024] 为了解决上述技术问题，根据本发明，提供一种用于治疗和预防BPH的包括肽或肽的片段的组合物，所述肽或肽的片段包含SEQ ID NO:1的序列(以下为“PEP1”、“GV1001”或“GV”)或与SEQ ID NO:1具有80％以上同源性的序列。
[0025] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所述片段可包含3个以上的氨基酸。
[0026] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所包含的肽的浓度可为0.01mg至1mg，优选0.56mg(4nmol肽/kg体重)。
[0027] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所述组合物可以是药物组合物。
[0028] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所述组合物可以是食物组合物。
[0029] 根据本发明的另一个实施方式，提供通过给需要的受试者施用治疗和预防BPH的组合物来治疗和预防BPH的方法。
[0030] 在根据本发明用于治疗和预防BPH的方法中，所述组合物的施用可一周进行3次。
[0031] 发明效果
[0032] 根据本发明的组合物，包含具有SEQ ID NO:1的序列的肽或者具有与SEQ ID NO:1具有80％以上同源性的序列的肽对于治疗和预防BPH具有卓越的效果和较少的副作用。
[0034] 图1示出移除靶标器官以测量其重量的过程的照片。
[0035] 图2示出在验证PEP1对BPH的治疗作用的实验中的电泳照片，通过使用RT-PCR，其显示每个实验组的腹侧前列腺中对5α-还原酶表达的影响的结果。
[0036] 图3示出在验证PEP1对BPH的治疗作用的实验中的显示在每个实验组中测量的精囊重量的结果的图。
[0037] 图4示出在验证PEP1对BPH的治疗作用的实验中的显示在每个实验组中测量的前列腺重量的结果的图。
[0038] 图5示出显示在BPH诱发动物模型的基质细胞系(WPMY-1)中用PEP1处理后细胞增殖量的图。
[0039] 图6示出显示在BPH诱发动物模型的上皮细胞系(RWPE-1)中用PEP1处理后细胞增殖量的图。
[0041] 图8示出显示在BPH诱发动物模型的表皮细胞系(RWPE-1)中通过使用PEP1-FITC(异硫氰酸荧光素)缀合物测量PEP1对雄激素受体的结合能力的图。
[0042] 图9示出显示PEP1对PCNA(增殖细胞核抗原)表达(其在BPH诱发模型中增加)影响的电泳照片。
[0043] 图10示出一幅显示PEP1对Ki67(MK67)表达影响的免疫染色照片，所述Ki67表达在BPH被诱发时在BPH诱发模型中增加。
[0044] 图11示出在BPH动物模型的实验中通过H&E染色方法显示出PEP1对BPH组织相关细胞的影响的结果的照片。
[0045] 图12示出在BPH动物模型的实验中通过Masson三色染色方法显示出PEP1对BPH组织相关细胞的影响的结果的照片。
[0046] 图13示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物体重的变化的图。
[0047] 图14示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物模型的前列腺重量的变化的图。
[0048] 图15示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物的精囊重量的变化的图。
[0049] 发明的最佳实施方式
[0050] 因为本发明可适用于多种应用领域和进行多种变化，接下来对本发明进行更详细的描述。然而，这并不意味着限定了实际应用的形式；应该理解，主旨在于包括所有的变化形式、等同形式或替代形式中的概念和技术程度。在本发明的描述中，如果任何关于现有技术的详细描述被认为会破坏本发明的基本原则，则忽略该描述。
[0051] 端粒已知是在染色体末端发现的遗传物质的重复序列，其防止染色体损伤或合并到其它的染色体。端粒的长度在每次细胞分裂时缩短，并且在一定次数的细胞分裂后，端粒长度极度缩短以致细胞停止分裂并且死亡。另一方面，已知端粒的延长会延长细胞寿命。例如，癌细胞制造一种称为端粒酶的酶，其阻止端粒的缩短，因此导致癌细胞的繁殖。本发明的发明人鉴定出一种来源于端粒酶的肽，其有效治疗和预防BPH并且完成了本发明。
[0052] 在本发明的一个实施方式中，SEQ ID NO:1氨基酸序列的肽、上述肽的肽片段或具有与上述肽的氨基酸序列的80％以上序列同源性的肽包括端粒酶，特别是来源于人类的端粒酶。本文公开的肽可包括包含与SEQ ID NO:1的肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同源性的氨基酸序列的肽或其片段。另外，本发明公开的肽可包括与SEQ ID NO:1或其片段在至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个转化氨基酸、至少6个转化氨基酸或至少7个氨基酸上存在差异的肽。
[0053] 在本发明的一个实施方式中，氨基酸的变化包括肽的物理和化学性质的修饰。例如，可以进行氨基酸修饰以提高肽的热稳定性，改变底物特异性，及改变最优pH。
[0054] 本文中的术语“氨基酸”不仅包括天然组成肽的22种标准氨基酸，也可以是D-异构体和修饰的氨基酸。因此，在本发明的具体的实施方式中，此处的肽包括具有D型氨基酸的肽。另一方面，肽可包括非标准氨基酸，诸如那些被翻译后修饰的氨基酸。翻译后修饰的实例包括磷酸化、糖基化、酰基化(包括乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化)、烷基化、羧基化、羟基化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质的修饰(例如β-消除脱酰胺化、脱酰胺化)和结构修饰(例如二硫键的形成)。同时，氨基酸的变化包括由于在用于形成肽缀合物的采用交联剂的结合过程中的化学反应而发生的氨基酸变化，如氨基、羧基和侧链的变化。
[0055] 本文公开的肽可为从天然来源被鉴定和分离出的野生型肽。另一方面，当与SEQ ID NO:1或其片段比较时，本文公开的肽可以为人工变体，其包含一个或多个氨基酸取代、删除和/或插入。野生型多肽(不仅人工变体)的氨基酸变换包括不会显著影响活性的蛋白的折叠和/或氨基酸的保守取代。保守取代的实例可在以下的组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常发生的变换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，及其反向变换。保守取代的其它实例显示在下表1中：
[0056] [表1]
[0057]原始氨基酸 残基取代的实例 优选残基取代
Ala(A) val；leu；ile Val
Arg(R) lys；gln；asn Lys
Asn(N) gln；his；asp，lys；arg Gln
Asp(D) glu；asn Glu
Cys(C) ser；ala Ser
Gln(Q) asn；glu Asn
Glu(E) asp；gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) asn；gln；lys；arg Arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) norleucine；ile；val；met；ala；phe Ile
Lys(K) arg；gln；asn Arg
Met(M) leu；phe；ile Leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) tyr；phe Tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser Phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 Leu
Ala(A) val；leu；ile Val
Arg(R) lys；gln；asn Lys
Asn(N) gln；his；asp，lys；arg Gln
Asp(D) glu；asn Glu
Cys(C) ser；ala Ser
Gln(Q) asn；glu Asn
Glu(E) asp；gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) asn；gln；lys；arg Arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) norleucine；ile；val；met；ala；phe Ile
Lys(K) arg；gln；asn Arg
Met(M) leu；phe；ile Leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) tyr；phe Tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser Phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 Leu
[0058] 通过在下述功效中选择进行显著不同的取代来进行肽的生物性质的显著转化：(a)在取代区域保持多肽骨架的结构(如片状或螺旋状的三维结构)的功效，(b)在靶标区域保持分子的电荷或疏水性的功效，或(c)保持侧链的体积的功效。天然残基通过一般侧链性质分为以下几组：
[0059] (1)疏水性:正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
[0060] (2)中性亲水性:cys，ser，thr；
[0061] (3)酸性:asp，glu；
[0062] (4)碱性:asn，gln，his，lys，arg；
[0063] (5)影响链取向的残基:gly，pro；及
[0064] (6)芳香族:trp，tyr，phe。
[0065] 非保守取代可以通过将上述类组的成员交换为不同类组的成员来进行。与保持合适的肽三维结构无关的任何半胱氨酸残基通常可以被取代为丝氨酸，以此增加分子的氧化稳定性和避免不合适的交联。相反，可以通过对肽添加半胱氨酸键获得稳定性的提高。
[0066] 另一种类型的肽的氨基酸变体为那些具有改变的肽糖基化模式的肽。本文的术语“改变”意味着删除在肽中存在的至少一个糖残基和/或添加至少一个在肽中不存在的糖基化残基。
[0067] 肽的糖基化通常为N连接或者O连接。本文的术语“N连接”指糖残基与天冬酰胺残基的侧链相连。作为三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除了脯氨酸的任何氨基酸)为用于以酶促方式将糖残基连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这样的三肽序列中之一时，创立了潜在的糖基化位点。“O连接糖基化”意味着将作为糖的N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个连接至羟基氨基酸。所述羟基氨基酸最典型为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0068] 通过改变氨基酸序列以包含上述的三肽序列(对N连接糖基化位点而言)，可方便地添加多肽的糖基化位点。所述变化可以通过将来自丝氨酸或苏氨酸的至少一个残基添加至第一抗体序列或通过用这些残基进行取代来进行(对O连接糖基化位点而言)。
[0069] 同时，根据本发明包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含与上述序列具有大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段在有生命物质中具有低毒性和高稳定性的优势。本文使用的SEQ ID No:1是源自端粒酶的由16个氨基酸组成的肽。
[0070] SEQ ID NO:1EARPALLTSRLRFIPK
[0071] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防BPH的组合物，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含具有与上述序列大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防BPH的药物组合物，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含具有与上述序列大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。在根据本发明的一个实施方式的药物组合物，其可通过口服、直肠、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、骨髓内、硬膜外或皮下途径施用。
[0074] 口服施用的形式可以为但不限于：片剂、丸剂、软胶囊或硬胶囊、颗粒、粉末、溶液或乳液。非口服施用的形式可以为但不限于：注射剂、滴剂、洗剂、软膏、凝胶、乳膏、悬浮液、乳剂、栓剂、贴剂或喷雾。
[0075] 在本发明的一个实施方式中，在必要时，所述药物组合物可包含添加剂，如稀释剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味剂。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可通过本领域的传统工业方法制造。
[0076] 在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物的活性成分的剂量可根据患者的年龄、性别、体重、病理学和状态、施用路径或处方者的判断而改变。根据所述因素的剂量可在本领域技术人员的水平内确定，且每日剂量例如可为但不限于：0.01μg/kg/天至10g/kg/天，特别是0.1μg/kg/天至1mg/kg/天，更特别是1μg/kg/天至0.1g/kg/天，更特别是1μg/kg/天至10mg/kg/天，优选是1μg/kg/天至1mg/kg/天，优选是0.005mg/kg/天至0.05mg/kg/天，最优选是0.01mg/kg/天，但是如果根据施用剂量的效果不同其可以进行调整。对于成人，优选施用剂量是0.1mg至1mg，优选是0.4mg至0.6mg，特别是最优选的剂量是0.56mg。
[0077] 在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可以但不限于每天施用1至3次。
[0078] 在本发明的一个实施方式中，所述组合物可包含0.01g/L至1kg/L、特别是0.1g/L至100g/L、更特别是1g/L至10g/L的肽，所述肽包含SEQ ID NO:1、包含具有与上述序列至少80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述序列的片段中的至少一种的氨基酸序列。当所述肽的含量在上述范围内时，组合物的安全性和稳定性均可被满足，且所述范围在成本效益方面是合适的。
[0079] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防BPH的食物组合物，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含具有与上述序列大于80％同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。
[0080] 在本发明的一个实施方式中，食物组合物不限于特别形式，但是例如可为片剂、颗粒、粉末、液体和固体形式。除活性成分外，每种形式可通过本领域技术人员选择合适的工业常用成分形成，并可与其它成分组合产生协同效应。
[0081] 本文使用的术语旨在用于描述实施方式，但不限制本发明。在术语前面没有数字并非限制数量，而是表明可以使用多于一个该术语的事物。术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”应该理解为开放式(即“包括但不限于”)。
[0083] 除非另外提出或语境中明显矛盾，本文提出的所有方法均以适当的顺序进行。除非其被包含在权利要求中，使用“任何一个实施方式”和“所有实施方式”或者示例性语言(例如，“诸如”、“如”)是用来更清楚地描述本发明，而不是限制本发明的范围。本文中除了权利要求以外的任何语言均不应该被解释为本发明的必要条件。除非另外限定，此处使用的科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
[0084] 本发明优选的实施方式包括发明人所知的本发明的最佳实施方式。优选实施方式的变化形式在本领域技术人员阅读上述说明后可变得显而易见。本发明发明人希望本领域技术人员可以充分利用所述变化形式，并且本发明可以以除了本文所列出以外的其它方式进行实施。因此，本发明在专利法允许的情况下包括权利要求中所陈述的本发明的关键点的等同形式、修改形式和变化形式。另外，在上述成分的任何组合内的所有可能的变化形式都包括在本发明之内，除非另有明确声明或与上下文相悖。虽然已通过示例性实施方式描述并展示了本发明，本领域技术人员可以清楚知晓，在不脱离本发明的主旨和后文权利要求所限定的范围的情况下，可以进行形式和细节方面的各种变化。
[0085] 用于建立本发明的实施方式
[0086] 在下文中，将通过实施例和测试例详细描述本公开。但是，下列的实施例和测试例仅以说明为目的，并且对于领域普通技术人员显而易见，本公开的范围不受所述实施例和测试例所限制。
[0087] 实施例1.肽的合成
[0088] SEQ ID NO:1的肽根据固相肽合成的传统已知方法合成。更具体地，利用ASP48S(Peptron，Inc.，Daejeon ROK)，通过Fmoc固相肽合成(SPPS)从C端偶联每个氨基酸来合成所述肽。如下使用其第一个氨基酸在C端连接到树脂的那些肽：
[0089] NH2-Lys(Boc)-2-氯三苯甲基树脂
[0090] NH2-Ala-2-氯三苯甲基树脂
[0091] NH2-Arg(Pbf)-2-氯三苯甲基树脂
[0092] 用以合成肽的所有氨基酸在N端通过Fmoc保护，所述氨基酸残基通过能溶解在酸中的Trt、Boc、t-Bu(t-丁酯)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)保护。实例包括以下：
[0093] Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ahx-OH、Trt-巯基乙酸。
[0094] 作为偶联试剂，使用了HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯]/HOBt[N-羟基苯并三唑]/NMM[4-甲基吗啉]。使用在20％DMF中的哌啶溶液以移除Fmoc。为了从残基上移除保护基或者将合成的肽从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA(三氟乙酸)/TIS(三异丙基硅烷)/H2O＝92.5/2.5/2.5]。
[0095] 肽的合成通过使用固相支架进行并重复下面过程：以氨基酸保护起始，每个氨基酸的分离反应，用溶剂冲洗和脱保护。每个肽的合成通过使用固相支架以结合至具有氨基酸保护基的起始氨基酸，分别使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。在从树脂释放之后，合成的肽通过HPLC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证合成，然后冻干。
[0096] 通过高效液相色谱法发现制备的肽的纯度在95％或更高。
[0097] PEP 1的具体合成过程可以如下：
[0098] 1)偶联
[0099] 用NH2-Lys(Boc)-2-氯三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)与融化于DMF中的偶联试剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室温(RT)温育2小时。温育后，反应混合物依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
[0100] 2)Fmoc去保护
[0101] 添加在20％DMF中的哌啶溶液并在RT温育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和DMF冲洗。
[0102] 3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肽的基本框架，NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯三苯甲基树脂。
[0103] 4)切割:向完成合成的肽添加切割混合物，以此从树脂上切下肽。
[0104] 5)将预冷的乙醚添加至获得的混合物中，然后离心以使收集的肽沉淀。
[0105] 6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干以制造成粉末形式。
[0106] 实施例2.通过使用BPH诱发动物模型的实验验证PEP1对BPH的作用
[0107] 制备BPH诱发动物模型
[0108] 1)作为雄激素，睾酮是最常使用的体内激素。但是与前列腺发育相关的雄激素中最有效的激素是5α-二氢睾酮(DHT)，其通过结合睾酮和5α-还原酶产生。在大鼠中，当以40mg/kg浓度施用舒必利30天，其在体内抑制2型多巴胺受体增加催乳素的浓度并且诱发高催乳素血症以激活5α-还原酶，并且其通过与睾酮反应表现出协同效应。据报道，通过高催乳素血症产生的DHT在前列腺的侧叶比背叶或腹叶产生更多的重量增加。基于这个事实，仅使用根据实施例1的PEP1或与其它的测试材料共同施用给BPH诱发动物模型的实验如下进行。成熟Sprague-Dawley雄性大鼠(6周龄)购自Jae-il实验动物中心并且抚养一周(7周龄，
49天)用于纯化，然后用于实验。为了诱发BPH，每天一次口服施用舒必利(40mg/kg)30天。每次实验都跟踪在在先实验的结果(Van Coppenolle等，2001)。每只动物每日早10点开始施用测试材料。在施用测试材料后，每天观察每只动物的一般状态和特殊症状。同时施用测试材料前，测量并记录每只动物的体重。
49天)用于纯化，然后用于实验。为了诱发BPH，每天一次口服施用舒必利(40mg/kg)30天。每次实验都跟踪在在先实验的结果(Van Coppenolle等，2001)。每只动物每日早10点开始施用测试材料。在施用测试材料后，每天观察每只动物的一般状态和特殊症状。同时施用测试材料前，测量并记录每只动物的体重。
[0109] 2)施用的测试材料和剂量
[0110] 作为测试材料的舒必利购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，美国)并且用于实验。本发明人通过每日一次连续腹膜内注射施用舒必利(40mg/kg)60天以通过高催乳素血症诱发BPH。每次施用所述测试材料前，舒必利首先溶解在0.1N HCl溶液中，然后通过使用0.1N NaOH溶液中和至pH 7.0。对于联合施用组，在施用舒必利后通过腹膜内注射施用根据实施例1的PEP1和非那司提。PEP1(0.01mg/kg，0.1mg/kg，1mg/kg和10mg/kg)在使用前新鲜配置，并且通过皮下注射施用。非那司提通过使用15％乙醇/玉米油(v/v)作为载体每天制备。施用的剂量基于0.5ml/kg的浓度计算，反应每天测量的体重。均遵循下表2完成对于7组的施用以验证PEP1对BPH的作用。
[0111] [表2]
[0112]
[0113] (i.p＝腹膜内，s.c＝皮下)
[0114] 1)对于BPH诱发模型，在施用PEP1和测试材料的实验之后，收集动物器官，保存所述器官并测量其重量
[0115] 在施用所述测试材料60天的24小时后，所有动物通过乙醚麻醉，然后从腹主动脉收集的血液分离为血清。分离的血清在-80℃保存以分析激素。
[0116] 对于所有动物，在测试包皮分离(PPS)的出口后，将诸如阴茎头型(Gp)、精囊和凝固腺(SV)、腹侧前列腺(VP)、尿道球腺(CpG)、肛提肌和球海绵体肌(levator aniplus bulbocavernosus muscle，LABC)的附属生殖腺从动物体依次分离。分离的详细过程遵循OECD规程。
[0117] 如图1中提及，对于分离Gp，通过使用镊子钳住Gp部分并且剪下包皮分离线。如图1中提及，对于肺，在从腹部肌层分离膀胱后，暴露被脂质层覆盖的肺左侧和右侧小叶，暴露膀胱至SV，通过使用镊子从肺左侧和右侧小叶分离脂质，通过使用微镊拨离，从尿道剪下肺左侧小叶，通过使用手术钳，在从尿道暴露后剪下肺右侧小叶。如图1中提及，对于包含凝固腺的SV，在SV下准备纸毛巾以给肌肉、脂质层和腺体分类。通过使用夹子固定包含与尿道相连的曲细精管的SV的底部，以防止在精囊移除过程中的渗漏。在移除脂质后，清理相关的附属器官，移除所述夹子并将精囊放置在盘上以测量其重量。
[0118] 2)在BPH诱发动物测试模型中，施用PEP1对5α-还原酶表达的影响
[0119] 在施用舒必利和测试材料60天并且收集腹侧前列腺后，通过RT-PCR测定其对5α-还原酶表达的影响。具体地，总RNA从腹侧前列腺(25mg)分离，并且通过添加DEPC处理的水重悬。其后通过使用分光光度计对RNA进行定量。通过使用Torres和Ortega(2004)的方法合成第一链cDNA。PCR程序为：94℃变性(30sec)，55℃退火(30sec)，72℃延伸(30sec)，进行30至35个循环。使用对照GAPDH，在电泳中定量，其表达水平不会因为使用其它药物而改变。作为结果，通过施用舒必利，5α-还原酶水平的增加在PEP1施用组中以剂量依赖方式被抑制，并且在高剂量PEP1施用组(GV10，10mg PEP1施用组)中所述抑制作用高于非那司提施用组(参见图2)。因此PEP1可以提供剂量依赖性的治疗并且通过抑制5α-还原酶提高其对BPH的作用。
[0120] 3)PEP1施用对BPH诱发测试动物模型器官的影响
[0121] 在下表3中，报道了肽PEP1在每组实验中影响精囊的重量、前列腺重量和前列腺指数。表3中描述的前列腺指数通过使用公式“体重/最终前列腺重量”计算。
[0122] [表3]
[0123]
[0124] 表3中描述的结果转化成图片，即，在BPH诱发动物模型中，在施用PEP1和非那司提(5mg/kg)并随后施用舒必利后，观察精囊的测量结果，图片显示在高剂量PEP1施用(10mg/kg)情况下，精囊重量显著减少(参见图3)。同时，在BPH诱发动物模型中，在舒必利和PEP1共施用的情况下，显示出前列腺重量的显著减少(参见图4)。如果P值小于0.05，表示其为显著性结果。
[0125] 因此，通过实施例2的结果，通过施用PEP1至舒必利诱发的BPH动物模型可以以剂量依赖方式有效地减少5α-还原酶的表达、减少精囊重量和减少前列腺重量。因此，施用PEP1可有效治疗和改善5α-还原酶的表达和生殖器官的重量所致的BPH相关疾病症状。
[0126] 实施例3：通过观察DHT对前列腺基质细胞和上皮细胞的改变来验证PEP1对BPH的作用
[0127] 1)测试细胞制备和实验过程
[0128] 睾酮在注射到身体内后被5α-还原酶转变为DHT，其诱导前列腺细胞增殖而引起BPH。基于此，通过使用根据实施例1中PEP1的施用进行实验以观察其对前列腺细胞系增殖的影响。作为细胞系，使用来自动物模型的WPMY-1(前列腺基质细胞系)和RWPE-1(前列腺上3 4
皮细胞系)。对于所述实验，将WPMY-1(2.5×10个细胞)和RWPE-1(1×10 个细胞)接种到具有如表4中的不同实验组的96孔板，以观察增殖变化。在吸出培养基后，所述增殖变化通过注入每10μL CCK-8溶液到培养基的每个孔中，然后在450nm波长测量光密度1至4小时。
皮细胞系)。对于所述实验，将WPMY-1(2.5×10个细胞)和RWPE-1(1×10 个细胞)接种到具有如表4中的不同实验组的96孔板，以观察增殖变化。在吸出培养基后，所述增殖变化通过注入每10μL CCK-8溶液到培养基的每个孔中，然后在450nm波长测量光密度1至4小时。
[0129] 2)确认观察结果和影响
[0130] 在非DHT处理组(1-3组)中，在WPMY-1和RWPE-1中未施用PEP1(1组)和施用PEP1(2和3组)之间均没有显著性差异。在DHT处理组(4-6组)，未施用PEP1(4组)和施用PEP1(5和6组)之间具有显著性差异，通过PEP1处理的组对增殖显示显著地抑制(参见表4和图5、6)。因此，PEP1可以有效抑制前列腺细胞的增殖，其影响DHT诱导的BPH。
[0131] [表4]
[0132] 每组细胞系的处理条件
[0133]
[0134] 实施例4：验证PEP1对雄激素受体的结合能力和抑制BPH的机制
[0135] 1)测试细胞的制备和实验过程
[0136] 通过5α-还原酶产生的DHT通过结合雄激素受体促进前列腺细胞的增殖并引起BPH。基于此，通过使用根据实施例1中PEP1的施用进行实验以观察其对前列腺细胞系增殖的影响。作为细胞系，使用来自动物模型的WPMY-1和RWPE-1。WPMY-1和RWPE-1分为抗雄激素受体组和同型对照组，通过放置PEP1-FITC(异硫氰酸荧光素)在其中，与每种抗体温育进行竞争测试，并且测量荧光值的结果。荧光值通过使用流式细胞术方法测量。
[0137] 2)确认观察结果和影响
[0138] 对于每个WPMY-1和RWPE-1，测定以下情形的荧光值：一种情形为首先与抗雄激素受体同型对照抗体反应(与抗体竞争，最右边的峰)，另一种情形为与抗雄激素受体抗体反应(与抗体竞争，中间的峰)，而再一种情形为不与均未结合FITC的两种抗体反应(最左边的峰)(参见图7和图8)。在与抗雄激素受体同型对照抗体竞争的情况下，PEP1结合抗雄激素受体，所以PEP1-FITC结合物的荧光值增加(图中峰值位移至直方图右侧)。与抗雄激素受体竞争的情况下，PEP1较弱地结合抗雄激素受体，所以荧光值减少(图中峰值位移至直方图左侧)。因此，考虑PEP1抑制了结合抗雄激素受体的DHT所诱导的BPH，PEP1可以通过直接结合抗雄激素受体而影响BPH。
[0139] 实施例5:通过使用BPH诱发动物模型验证PEP1在体内对BPH的有效性
[0140] 1)准备测试动物
[0141] 实验使用6至8周龄雄性C57BL/6(n＝10/组)小鼠，所述小鼠在首尔大学医学院实验动物实验室的SPF(无特定病原体)区域饲养。用于注射的50mg庚酸睾酮(TE，购自EVER Pharma Hena GmbH，德国)和0.5mg戊酸雌二醇(购自EVER Pharma Hena GmbH，德国)分别混合至70μl体积的微渗透泵(Alzet pump，购自DURECT Corporation，美国)，所述泵在麻醉下植入小鼠背部。所述泵经设计以每小时0.11μl的浓度在28天(2周)中通过利用渗透现象释放激素给小鼠。
[0142] 2)测试材料和施用剂量
[0143] 作为测试材料，使用睾酮和非那司提。制备动物模型，每一个受试者(25g小鼠模型)分别每天皮下(注射)施用250μg实施例1所述的PEP1和2500μg非那司提(在DMSO或环糊精中，购自Sigma Aldrich，美国)。注射测试材料2周后(植入所述泵至动物模型4周后)，从眶上静脉收集血液并在14000rpm于4℃离心30分钟以分离血清，并且提取前列腺并在-70℃液氮中冻存或固定在固定液中。实验测试组在下表5中描述。
[0144] [表5]
[0145]
[0146] 3)测量诱发BPH的因子的减少
[0147] 诱发BPH增加前列腺组织中的PCNA(增殖细胞核抗原，复制的必需蛋白)和Ki67(MK167，细胞增殖的必需蛋白)。基于此，在BPH诱发小鼠模型中进行测试测定PEP1抑制PCNA和Ki67表达的有效性。使用2D-凝胶电泳用从前列腺组织细胞提取的蛋白测定PCNA，通过免疫染色方法检测组织中的表达水平以测定Ki67。作为结果，PCNA和Ki67的表达在BPH诱发动物的前列腺组织中增加，在用PEP1处理的组中减少(参见图9和图10)。因此，PEP1抑制BPH诱发因子并且对于治疗和改善BPH是有效的。
[0148] 4)测量与诱发BPH相关的组织的变化
[0149] 已知BPH由组成前列腺腺体的基质细胞和上皮细胞的异常增殖所诱发。基于此，为了检测PEP1在BPH诱发动物模型的前列腺组织中引起的变化，对BPH诱发动物模型进行组织学分析。使用H&E染色方法检测一般组织中的变化，并且使用Masson三色染色方法测定炎性反应水平并更清晰检测细胞核的形状。作为结果，表明BPH诱发组的上皮层比对照组的上皮层要厚，但是在PEP1处理组，表明上皮层以与对照组类似的常规顺序排列，且上皮的厚度比BPH诱发组的薄(参见图11和12)。因此，PEP1可以有效恢复BPH诱发组织的变化并且将所述组织转化为不显示出BPH的正常组织。
[0150] 5)测量BPH相关器官的变化
[0151] BPH可以通过前列腺和精囊重量的变化检测。基于此，为了检测PEP1对前列腺和精囊重量的影响(其直接显示BPH相关症状)，在BPH诱发动物模型中测量体重、前列腺重量和精囊重量。测量结果作为图表通过分组显示在表5中(参见图13、14和15)。没有显示出整体体重的变化，但是与激素处理组相比，显示出PEP1处理组的前列腺重量显著性减少，且PEP1处理组的减少与施用非那司提组(已知为BPH的治疗药物)的结果相当，所以这证实PEP1处理组中的减少具有显著性。对于精囊，PEP1处理组的精囊重量比激素处理组的重量小。因此，PEP1可以有效地显著性减少具有BPH症状的器官重量。
[0152] 在上述所有的实施例中，通过BPH诱发动物模型的体外和体内实验，表明PEP1对BPH相关诱发因子、激素受体和实质生殖器官具有良好的治疗效果。因此，认为PEP1对于治疗、改善和预防BPH具有有效性，而将PEP1开发为用于BPH治疗的组合物和治疗BPH的方法有很大可能性。
[0153] 序列列表自由文本
[0154] 全端粒酶序列的1132个氨基酸
[0155]MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSTRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVEEAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRCFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRGHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLREIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
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