一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法
专利汇可以提供一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种重组 鸡球虫 甲病毒颗粒 疫苗 及制备方法，选用基于SFV的甲病毒复制子载体pSMART2b与柔嫩 艾 美 耳 球虫保护性 抗原 基因Repair_PSII连接，构建出重组质粒pSMART2b-Repair_PSII并用辅助质粒pSHCAR 包装 成含Repair_PSII基因的甲病毒颗粒疫苗，具有保护效果好、诱导免疫 水 平高、安全性高的优势。，下面是一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法专利的具体信息内容。
1.一种Repair_PSII基因，其序列如SEQ no.1所示。
2.一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备方法，包括以下步骤：
1）重组质粒pSMART2b-Repair_PSII的构建及表达
提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA并反转录为cDNA，通过PCR扩增出Repair_PSII基因；连接、转化及克隆成质粒pMD18-T-Repair_PSII，并通过限制性内切酶BamHI和ClaI以及生物测序鉴定连接情况，同法将粘性端Repair_PSII基因连接至甲病毒复制子载体pSMART2b上；
然后将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII转染进293细胞，Western blot鉴定Repair_PSII基因表达情况；
2）重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备
将鉴定和表达正确的重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR用脂质体法转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；向病毒原液中加入1/20体积的α-糜蛋白酶溶液（10 g/L），室温孵育40min将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白以活化病毒；加入1/15体积的抑肽酶aprotinin（10 g/L），室温孵育5 min；取适量激活后的病毒原液感染BHK-21细胞，48小时后收集重组鸡球虫甲病毒颗粒用于摄透射电镜观察和Western blot鉴定Repair_PSII基因的表达情况；
3）重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备方法优化
将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR按照摩尔比1:1.5的共2.5ug共转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；采用先取辅助质粒pSHCAR 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，24小时时再取重组质粒pSMART2b-Repair_PSII 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；将优化的病毒原液分别感染BHK-21细胞，即得重组鸡球虫甲病毒颗粒。
一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
然后连接、转化及克隆成质粒pMD18-T-Repair_PSII，并通过限制性内切酶BamHI和ClaI以及生物测序鉴定连接情况，同法将粘性端Repair_PSII基因连接至甲病毒复制子载体pSMART2b上；然后将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII转染进293细胞，Western blot鉴定Repair_PSII基因表达情况；
2、重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备
将鉴定和表达正确的重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR用脂质体法转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液。向病毒原液中加入1/20体积的α-糜蛋白酶溶液（10 g/L），室温孵育40min以激活病毒(将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白以活化病毒)，然后加入1/15体积的抑肽酶aprotinin（10 g/L），室温孵育5 min；取适量激活后的病毒原液感染BHK-21细胞，48小时后收集重组鸡球虫甲病毒颗粒用于摄透射电镜观察和Western blot鉴定Repair_PSII基因的表达情况；
3、重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗制备方法优化
参照Invitrogen公司的转染试剂LipofectamineTM3000说明书，将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR按照摩尔比1:1.5的(共2.5ug)共转染入293细胞，6小时换液，48小时收集病毒原液；同时，采用先取辅助质粒pSHCAR 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，24小时时再取重组质粒pSMART2b-Repair_PSII 2.5ug单转染入293细胞，6小时换液，
48小时收集病毒原液；最后将优化的病毒原液分别感染BHK-21细胞，取少量重组鸡球虫甲病毒颗粒拍摄透射电镜。
图3 限制性内切酶鉴定重组质粒pSMART2b-Repair_PSII电泳图；
图4 Western blot法鉴定重组质粒在293细胞表达图；
图5 Western blot法鉴定重组鸡球虫甲病毒颗粒图；
图6重组鸡球虫甲病毒颗粒透射电镜图；
图7重组甲病毒颗粒感染BHK-21细胞的X-gal分析图；
图8 双抗体夹心ELISA测定免疫后鸡血清中细胞因子变化情况图。
具体实施方式
1、Primer 5.0软件设计引物PCR法扩增鸡球虫Repair_PSII基因，序列如SEQ no.1所示；
上游：5’-CGCGGATCCGATGGACTGGCTTTCGAGCGAG-3’(BamH I)
下游：5’-CCCATCGATACGATACTTGGCAATCTCG-3’ (ClaI)
2、以鸡球虫cDNA为模板，PCR法扩增鸡球虫Repair_PSII基因，做纯化处理后连接至克隆载体pMD18-T，转化DH5α感受态细胞并克隆，并用限制性内切酶BamHI和ClaI切下含粘性末端的Repair_PSII基因片段，同法获得含BamHI和ClaI粘性末端切口的pSMART2b载体（参见图1-4）；
3、按照含无内毒素质粒pSMART2b-Repair_PSII 2.5ug，转染试剂
LipofectamineTM3000 7.5ul的条件制备转染复合物，转入培养至60%-80%汇合度的293细胞，转染6小时后换液，以浓度为2.0%胎牛血清和1.0%双抗的DMEM培养基继续培养48小时。
收集培养48小时后的293细胞，裂解细胞并获取全蛋白，用兔抗鸡球虫Repair_PSII蛋白的多抗血清做Western blot鉴定（参见图5）。
1、将鉴定和表达正确的重组质粒pSMART2b-Repair_PSII、辅助质粒pSHCAR和转染试剂LipofectamineTM3000按照1ug:1.5ug:7.5ul的比例制成转染复合物共转染入汇合度60-80%的293细胞，6小时换成含2.0%胎牛血清和1.0%双抗的DMEM培养基继续培养48小时，48小时后收集病毒原液。
X-gal原位染色后的阳性细胞呈蓝细胞，可初步估计rSFV-Repair_PSII颗粒滴度，400×(40×目镜+10×物镜)倍数下，随机找3个视野计算蓝细胞的平均数，然后确定滴度。每个视野蓝细胞数×平板面积/一个视野面积，所得结果×lml/实际所用病毒悬液体积(ml)，即得出病毒滴度(IU/ml)（参见图7）。
将160只13日龄的健康雏鸡随机分成4组，每组40只。免疫组按照14日龄一免、21日龄二免、28日龄三免的免疫程序每组肌注100μl重组甲病毒颗粒与100μl佐剂的混合液；佐剂对照组按照上述免疫程序只注射100μl佐剂；同时设立阴性对照组（白对照）和阳性对照组（红对照），白对照组不免疫不攻虫，红对照组不免疫攻虫。在免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行心脏采血和脾脏淋巴细胞分离，测定血清中抗体水平、IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平，MTT法测定鸡脾脏淋巴细胞增殖情况等指标。第三次免疫7天后口服接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×104个/只进行攻虫试验，并进行存活率、相对增重率、盲肠病变计分、OPG、ACI等指标的统计测定。最终以综合抗球虫指数（ACI）来评价甲病毒颗粒对鸡的免疫保护效果（参见图8）。
组别 存活率(%) 相对增重率(%) 病变值 卵囊值 抗球虫指数（ACI)
rSFV-Repair_PSII组 100 92.98 6 1 185.98
佐剂组 90 64.91 24 10 120.91
阳性对照 90 56.14 27 10 109.14
阴性对照 100 100 0 0 200
结论：参见表1所示，免疫rSFV-Repair_PSII组的综合抗球虫指数为185.98，与阳性对照组的抗球虫指数109.14相比，明显高于阳性对照组，显示了良好的保护效果。
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