包含LG12-进化枝蛋白酶变体的组合物和方法
阅读：816发布：2022-01-09
专利汇可以提供包含LG12-进化枝蛋白酶变体的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了由LG12-进化枝酶产生的丝 氨 酸蛋白酶。此外，本发明提供了包含这些蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含这些蛋白酶中的至少一者的清洁组合物。，下面是包含LG12-进化枝蛋白酶变体的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片段，所述LG12-进化枝变体枯草杆
菌蛋白酶或其活性片段包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰。
2.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，所述生产性位置选自第27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、
242、245和251位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ
ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
3.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，其中在所述生产性位置处测试的所述修饰的至少50％满足下列标准中的至少
一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述生产性位置选自第27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、
242、245和251位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ
ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
4.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，所述生产性位置选自第2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、118、
119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271和275位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示
出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
5.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，其中在所述生产性位置处测试的所述修饰的至少30％但少于50％满足下列标
准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述生产性位置选自第2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、
118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271和
275位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3
中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
6.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，所述生产性位置选自第1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、
57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、
113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、
183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、
252、255、265和272位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对
应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
7.一种包含对亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯
草杆菌蛋白酶或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶的
生产性位置，其中在所述生产性位置处测试的所述修饰的至少15％但少于30％满足下列标
准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述生产性位置选自第1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、
55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、
108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、
173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、
246、252、255、265和272位，其中所述LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通
过对应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列来编号
的。
8.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，所述生产性位置
选自第4、7、8、12、14、16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、
111、114、120、122、125、128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、
204、205、206、211、212、215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273和274位，其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸
序列来编号的。
9.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，其中在所述生产
性位置处测试的修饰的至少一个但少于15％满足下列标准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述生产性位置选自第4、7、8、12、14、16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、
81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、128、132、138、141、143、146、151、163、
165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、215、220、224、227、230、232、238、250、
260、262、268、273和274位，其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示
出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
10.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，其中在所述生产
性位置处测试的所述修饰的至少60％满足下列标准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述修饰选自：残基27(K，H，N，A，D，E，G，L，P，Q，R，S，T，M)，40(A，I，Q，L，T，W，D，E，H，K，M，N，R，V，Y)，43(N，V，I，A，F，G，H，K，L，M，Q，S，W，Y，D，E)，78(T，C，S，I，K，L，V，A，D，E，F，G，H，R，W)，98(A，Y，V，D，F，K，N，W，H，M，Q，S，T)，130(S，I，R，H，L，N，Q，T，W，E，F，V，Y)，131(G，I，K，L，T，H，N，A，P，R，S，D，E)，158(S，E，G，H，I，L，Q，K，A，D，M，T，V)，166(G，K，W，C，F，I，L，A，D，E，H，M，N，Q，S，T，Y)，182(S，C，Q，P，W，A，H，I，M，R，Y，D，E)，237(K，L，M，T，Y，F，S，D，G，H，R，A，N，Q)，239(P，Y，C，E，F，G，H，I，N，R，S，T，W，A，D，K，L，M，V)，242(T，G，H，L，I，K，N，V，W，A，E，P，Q，S)，245(Q，C，A，F，H，M，N，R，T，W，D，S，Y)，和251(K，C，G，H，Y，W，F，L，R，A，D，M，N，S，T，V)，
其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶
的氨基酸序列来编号的。
11.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，其中在所述生产
性位置处测试的所述修饰的至少30％但少于50％满足下列标准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述修饰选自：残基2(Q，E，F，K，P，R，S，W，Y)，9(P，Y，H，Q，A，G，I，M，R，S，T，V)，
15(K，M，Q，T，G，H，R，V，Y，A)，38(N，H，Y，A，Q，T，D，E，K，S)，45(K，L，D，E，F，Q，R，S，W，A)，48(A，W，D，E，G，H，K，N，Q)，52(S，E，T，V，D，H，L，M，N，Q，R，F)，59(Q，F，M，H，N，W，T，I，V)，62(N，F，I，V，A，F，K，L，P，W)，75(L，A，N，H，K，F，Q，R，W，G)，97(S，D，G，H，L，M，N，A，I)，99(S，A，D，N，Q，R，S，I，K，L，V)，103(T，E，A，Y，G，H，K，N，R，S，D)，117(N，M，Q，H，K，R，E，G，S，T，Y)，118(G，T，K，R，Y，D，E，H，Q，S)，119(M，N，V，A，F，H，I，L，Q，S，T)，123(N，I，S，A，D，E，G，H，Q)，129(S，E，I，R，Y，K，Q，A，G，H，D)，133(T，G，H，A，F，L，M，N，Q，V，D，I)，145(R，D，F，G，L，V，M，W，Y，N)，148(V，D，I，L，M，Q，N，G，S)，149(V，A，P，S，E，G，L，N，Q)，156(S，C，E，G，D，H，Q，A，M，K，N)，159(S，C，F，T，M，N，Y，D，E，K，Q)，161(N，F，K，W，M，S，D，E，R，Y)，181(S，T，D，E，Q，A，H，K，N)，209(T，I，K，M，V，F，H，W，Y)，236(A，V，F，G，N，C，D，E，Q，S)，240(S，H，Q，F，I，L，P，V，W，M)，248(E，Q，K，L，N，T，W，D，C，H，M，Y)，256(N，V，A，D，K，M，Q，W，E，P，R)，267(V，H，N，A，F，I，K，S，T，Y)，271(E，D，L，M，Q，H，K，A，F，W，Y)，和275(Q，L，T，Y，G，H，W，E，N，R)，
其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12sprC蛋白酶的
氨基酸序列来编号的。
12.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，其中在所述生产
性位置处测试的所述修饰的至少15％但少于30％满足下列标准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述修饰选自：残基1(A，L，H，K，G，R)，3(T，A，G，H，E，Y，I，V)，18(A，D，F，S，Q，N，R，T)，19(A，F，K，L，R，M，W)，20(G，H，Q，E，N)，22(T，D，S，E)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，26(V，E，R，N，S)，28(V，N，S，E，T)，30(I，T，A，E，V)，31(L，I，M，Q，T)，44(V，A，I，F)，50(F，R，S，A，K，Q，Y)，53(G，Y，H，A，D，N，R，E)，55(P，I，K，N，R)，57(A，G，W，P)，58(L，F，D，K)，58(L，F，D，K)，67(A，G，A，I，P)，72(V，M，A，G，S，T)，76(N，F，P，A，Q，S，Y，D)，77(N，Q，G，T)，79(T，E，M，A，K，Q，I，L)，80(G，C，P，F，H，M，Y)，85(A，T，V，S)，86(Y，A，P，F)，87(N，Q，M，H，L，S)，89(D，A，R，F)，90(L，D，S，G，Q，E，N，P)，91(Y，H，I，M，N，T，V，W)，93(V，G，I，L，T)，96(L，G，K，R，Y，I，E，H)，100(G，F，K，V，Y，A，E)，101(S，M，A，T，V，R)，102(G，V，F，E，Y)，106(G，A，I，E，N，S，T，V)，107(I，H，Q，V，T)，108(A，S，I，C)，113(W，Y，F，H)，116(S，E，F，M)，121(V，T，S，A，I)，124(M，R，S，Y，A)，126(L，H，W，I，Q，G，K)，127(G，E，H，N)，136(Q，L，H，W，F，R，D)，137(Q，M，V，I，H，T，E)，140(N，I，F，Y，D，Q)，144(N，D，F，H，M，V，W，Y)，147(I，R，K，S，A，H，M)，150(I，A，S，D，N，T，V)，152(A，G，P，V)，153(A，M，G，S)，160(G，N，H，M)，162(R，K，M，V)，170(R，P，K，L)，172(S，C，N，T，G，H)，173(S，A，T，D)，183(N，G，A，Q，D，E)，185(T，C，W，Q，R，M)，187(A，C，G，D，H，P，V，W)，188(S，C，L，N，T，H，Y)，194(S，M，T，F，K，P，R，D)，213(N，V，W，G，M，R，K，Q)，216(S，C，F，I，T，A)，217(F，C，H，K，L，E，R)，218(N，C，H，D)，222(M，C，A，H，L，Q)，225(P，A，G，V)，
228(A，C，R，S)，231(A，C，G，S)，234(I，M，Q，V)，235(K，I，N，S，G，D，E，F)，241(M，H，K，I，L，Q，S，W)，243(N，A，T，G)，244(V，A，E，Y)，246(I，N，V，A，T)，252(N，D，Q，F，E)，252(N，D，Q，F，E)，
265(K，R，D，S)，和272(S，P，V，M，F，N，Q，K)，
其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶
的氨基酸序列来编号的。
13.一种包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶
或其活性片段，其中所述修饰位于所述LG12-进化枝酶变体的生产性位置，其中在所述生产
性位置处测试的修饰的至少一个但少于15％满足下列标准中的至少一个：
a)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.9的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.0的PI；
b)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.8的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.2的PI；或者
c)在所述位置处，相对于所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面具有大于
或等于0.5的最低性能指数(PI)：1)选自pH9或pH10的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10
的EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和
4)选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测定中的任一者而
言，具有大于或等于1.5的PI；
并且其中所述修饰选自：残基4(V，C)，7(G，N)，8(I，L)，12(K，G，R)，14(D，L)，16(A，G，
V)，17(H，A)，29(A，T，S)，33(T，D)，42(L，D)，46(G，N)，51(V，I)，56(N，E)，65(G，T，V)，69(A，G，T)，73(A，G)，81(V，H，M)，83(G，S)，84(V，A)，88(A，C，G)，94(K，G)，104(L，Y，V)，109(Q，K)，
111(I，V)，114(S，T，G)，120(N，H，E)，122(I，M)，125(S，G)，128(G，E，N)，132(S，A)，138(A，E，S)，141(N，G)，143(Y，D，E)，146(G，N，R)，151(A，H)，163(N，S，D)，165(M，I，V)，167(Y，G)，167(Y，G)，167(Y，G)，195(E，Q)，203(V，C)，204(N，E)，205(I，V)，206(L，Y)，211(G，C)，211(G，C)，215(A，D，E)，220(T，A，G)，224(A，S)，224(A，S)，230(A，S)，232(A，S)，238(Y，W，F)，250(L，I，M)，260(P，Y)，260(P，Y)，268(I，F)，273(A，S)，和273(A，S)，
其中所述LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12 sprC蛋白酶
的氨基酸序列来编号的。
14.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中与所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶相比，所述LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋
白酶具有改善的污垢去除性能。
15.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是属于图8或图9的LG12进化枝的任何枯草
杆菌蛋白酶。
16.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含具有Ser221、His64和Asp32的催化三联
体，其中所述氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列
来编号的。
17.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含第55-58位的P,N/D,A,L基序，其中所述
氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12 sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
18.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Thr103-Leu104基序，其中所述氨基酸
位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
19.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Tyr86-Asn/Asp87基序，其中所述氨基
酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
20.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Ala16-His17基序，其中所述氨基酸位
置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
21.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Val21-Thr22基序，其中所述氨基酸位
置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
22.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含第267-275位的V,I,N/D,V/L,E,X,A,L,
Q基序，其中X表示任意氨基酸，并且其中所述氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的
LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
23.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Tyr86-Asn/Asp87基序和Val21-Thr22
基序，其中所述氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶的氨基酸序
列来编号的。
24.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含Tyr86-Asn/Asp87基序、和Ala16-His17
基序、Val21-Thr22基序，并且其中所述氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的
LG12sprC蛋白酶的氨基酸序列来编号的。
25.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是Bacillus_sp_LG12sprC_AAC43500或
Bacillus_sp_WP010192403。
26.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:3的Bacillus_sp_LG12sprC_
AAC43500。
27.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:7的芽孢杆菌属M3-13枯草杆
菌蛋白酶E(1)。
28.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:10的芽孢杆菌属DSM 8719枯
草杆菌蛋白酶Bhon03321。
29.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:13的堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM_9711。
30.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:16的堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM_9712。
31.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:19的堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM_6951。
32.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:20的芽孢杆菌属KSM-LD1,SB
(BAD21128.1)。
33.根据上述权利要求中任一项所述的LG12-进化枝变体枯草杆菌蛋白酶或其活性片
段，其中所述变体与所述亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少60％的同一性。
34.一种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:10具有至少70％的同一
性。
35.根据权利要求34所述的枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶具有SEQ ID NO:10
的序列。
36.一种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:13具有至少70％的同一
性。
37.根据权利要求36所述的枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶具有SEQ ID NO:13
的序列。
38.一种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:16具有至少70％的同一
性。
39.根据权利要求38所述的枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶具有SEQ ID NO:16
的序列。
40.一种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:19具有至少70％的同一
性。
41.根据权利要求40所述的枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶具有SEQ ID NO:19
的序列。
42.一种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:20具有至少70％的同一
性。
43.根据权利要求42所述的枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶具有SEQ ID NO:20
的序列。
44.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1至43中任一项所述的枯草杆
菌蛋白酶。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物软化
剂、盘碟洗涤剂、以及硬质表面清洁剂。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含表面活性剂。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离
子表面活性剂、两性离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们
的组合。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述表面活性剂是离子表面活性剂。
51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种稳
定剂。
53.根据权利要求44至51中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.001重量％
至约10重量％的所述多肽。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种漂白剂。
55.根据权利要求44至54中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物不含磷酸盐。
56.根据权利要求44至55中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物包含磷酸盐。
57.根据权利要求44至56中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种助剂成
分。
58.根据权利要求44至57中任一项所述的组合物，其中所述组合物为颗粒状、粉末、固
体、条、液体、片剂、凝胶、单位剂量或糊剂组合物。
59.根据权利要求44至58中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种选自
下列的附加的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷
酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素
酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖
酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧
合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、
酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、还原酶、鼠李糖半
乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰-酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖
酶、和木糖苷酶、附加的金属蛋白酶以及它们的组合。
60.根据权利要求44至59中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制在约5.0至约
12.0的pH。
61.一种清洁方法，所述方法包括使表面或物品与包含至少一种根据权利要求1至43中
任一项所述的枯草杆菌蛋白酶的清洁组合物接触。
62.一种清洁方法，所述方法包括使表面或物品与权利要求44至60中任一项所述的清
洁组合物接触。
63.根据权利要求61或62所述的方法，所述方法还包括在分别使所述表面或物品与所
述清洁组合物接触之后，冲洗所述表面或物品。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述物品为盘碟。
65.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述物品为织物。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，所述方法还包括在使所述表面或物品
与所述清洁组合物接触之后，冲洗所述表面或物品的步骤。
67.根据权利要求66所述的方法，所述方法还包括在所述表面或物品的所述冲洗之后，
干燥所述表面或物品的步骤。
68.一种清洁表面或物品的方法，所述方法包括：提供权利要求44至59中任一项所述的
清洁组合物、和需要清洁的表面或物品；以及在适宜清洁所述表面或物品的所述表面的条
件下，使所述清洁组合物与所述需要清洁的表面或物品接触，以得到经清洁的表面或物品。
69.根据权利要求68所述的方法，所述方法还包括冲洗所述经清洁的表面或物品以得
到冲洗过的表面或物品的步骤。
70.根据权利要求68或69所述的方法，所述方法还包括干燥所述冲洗过的表面或物品
的步骤。
71.一种纺织物加工组合物，所述纺织物加工组合物包含根据权利要求1至43中任一项
所述的枯草杆菌蛋白酶。
72.一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶。
73.一种皮革加工组合物，所述皮革加工组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶。
74.一种羽毛加工组合物，所述羽毛加工组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽。
75.一种谷物加工组合物，所述谷物加工组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶。
76.一种纤维素乙醇加工组合物，所述纤维素乙醇加工组合物包含根据权利要求1至43
中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶。
77.一种镜片清洁组合物，所述镜片清洁组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶。
78.一种组织清创组合物，所述组织清创组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述
的枯草杆菌蛋白酶。
79.一种组织细胞培养添加剂组合物，所述组织细胞培养添加剂组合物包含根据权利
要求1至43中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶。
包含LG12-进化枝蛋白酶变体的组合物和方法
[0002] 本专利申请要求提交于2013年9月12日的美国临时专利申请序列号61/877,087的优先权，该申请的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
[0003] 丝氨酸蛋白酶是一类能裂解蛋白质中的肽键的酶。丝氨酸蛋白酶包含位于活性位点的亲核丝氨酸残基。枯草杆菌蛋白酶是丝氨酸蛋白酶中的一个大家族，虽然它们早已为
工业酶领域所知，但仍然需要适用于特定条件和用途的工程化蛋白酶。
发明内容
工业酶领域所知，但仍然需要适用于特定条件和用途的工程化蛋白酶。
发明内容
[0004] 本公开特别提供了LG12-进化枝蛋白酶(包括LG12-进化枝蛋白酶变体)、编码此类酶的核酸、以及与其生产和使用有关的组合物和方法。
[0005] 在一些实施方案中，本发明是LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，
其中该修饰位于LG12-进化枝酶变体的生产性位置。在一些实施方案中，本发明是LG12-进
化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片
段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，其中该修饰位于LG12-进化枝酶变体的生产性
位置，其中在该生产性位置处测试的修饰中至少50％满足下列标准中的至少一个：
其中该修饰位于LG12-进化枝酶变体的生产性位置。在一些实施方案中，本发明是LG12-进
化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体或其活性片
段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，其中该修饰位于LG12-进化枝酶变体的生产性
位置，其中在该生产性位置处测试的修饰中至少50％满足下列标准中的至少一个：
[0006] a)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.9：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.0的PI；
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.0的PI；
[0007] b)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.8：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.2的PI；或者
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.2的PI；或者
[0008] c)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.5：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.5的PI；
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.5的PI；
[0009] 并且其中该生产性位置选自第27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245和251位，其中LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID
NO:3中示出的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)LG12sprC枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列来编号的。
NO:3中示出的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)LG12sprC枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0010] 在一些实施方案中，修饰选自：残基27(K,H，N，A，D，E，G，L，P，Q，R，S，T，M)，40(A，I，Q，L，T，W，D，E，H，K，M，N，R，V，Y)，43(N，V，I，A，F，G，H，K，L，M，Q，S，W，Y，D，E)，78(T，C，S，I，K，L，V，A，D，E，F，G，H，R，W)，98(A，Y，V，D，F，K，N，W，H，M，Q，S，T)，130(S，I，R，H，L，N，Q，T，W，E，F，V，Y)，131(G，I，K，L，T，H，N，A，P，R，S，D，E)，158(S，E，G，H，I，L，Q，K，A，D，M，T，V)，166(G，K，W，C，F，I，L，A，D，E，H，M，N，Q，S，T，Y)，182(S，C，Q，P，W，A，H，I，M，R，Y，D，E)，237(K，L，M，T，Y，F，S，D，G，H，R，A，N，Q)，239(P，Y，C，E，F，G，H，I，N，R，S，T，W，A，D，K，L，M，V)，242(T，G，H，L，I，K，N，V，W，A，E，P，Q，S)，245(Q,C,A,F,H,M,N,R,T,W,D,S,Y)和251(K,C,G,H,Y,W,F,L,R,A,D,M,N,S,T,V)，其中LG12-进化枝变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC
蛋白酶氨基酸序列来编号的。
蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0011] 在一些实施方案中，本发明是LG12-进化枝酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝酶变体或其活性片段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，其中该修饰位于LG12-进化
枝酶变体的生产性位置，其中在该生产性位置测试的修饰中至少30％但少于50％满足a、b
和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第2、9、15、38、45、48、
52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、
209、236、240、248、256、267、271和275位。
枝酶变体的生产性位置，其中在该生产性位置测试的修饰中至少30％但少于50％满足a、b
和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第2、9、15、38、45、48、
52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、
209、236、240、248、256、267、271和275位。
[0012] 在一些实施方案中，修饰选自：残基2(Q,E，F，K，P，R，S，W，Y)，9(P，Y，H，Q，A，G，I，M，R，S，T，V)，15(K，M，Q，T，G，H，R，V，Y，A)，38(N，H，Y，A，Q，T，D，E，K，S)，45(K，L，D，E，F，Q，R，S，W，A)，48(A，W，D，E，G，H，K，N，Q)，52(S，E，T，V，D，H，L，M，N，Q，R，F)，59(Q，F，M，H，N，W，T，I，V)，62(N，E，I，V，A，F，K，L，P，W)，75(L，A，N，H，K，F，Q，R，W，G)，97(S，D，G，H，L，M，N，A，I)，99(S，A，D，N，Q，R，S，I，K，L，V)，103(T，E，A，Y，G，H，K，N，R，S，D)，117(N，M，Q，H，K，R，E，G，ST，Y)，118(G，T，K，R，Y，D，E，H，Q，S)，119(M，N，V，A，F，H，I，L，Q，S，T)，123(N，I，S，A，D，E，G，H，Q)，129(S，E，I，R，Y，K，Q，A，G，H，D)，133(T，G，H，A，F，L，M，N，Q，V，D，I)，145(R，D，F，G，L，V，M，W，Y，N)，148(V，D，I，L，M，Q，N，G，S)，149(V，A，P，S，E，G，L，N，Q)，156(S，C，E，C，D，H，Q，A，M，K，N)，
159(S，C，F，T，M，N，Y，D，E，K，Q)，161(N，F，K，W，M，S，D，E，R，Y)，181(S，T，D，E，Q，A，H，K，N)，
209(T，I，K，M，V，F，H，W，Y)，２36(A，V，F，G，N，C，D，E，Q，S)，240(S，H，Q，F，I，L，P，V，W，M)，248(E，Q，K，L，N，T，W，D，C，H，M，Y)，256(N，V，A，D，K，M，Q，W，E，P，R)，267(V，H，N，A，F，I，K，S，T，Y)，271(E，D,L,M,Q,H,K,A,F,W,Y)和275(Q,L,T,Y,G,H,W,E,N,R)，其中LG12-进化枝变体的
氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
159(S，C，F，T，M，N，Y，D，E，K，Q)，161(N，F，K，W，M，S，D，E，R，Y)，181(S，T，D，E，Q，A，H，K，N)，
209(T，I，K，M，V，F，H，W，Y)，２36(A，V，F，G，N，C，D，E，Q，S)，240(S，H，Q，F，I，L，P，V，W，M)，248(E，Q，K，L，N，T，W，D，C，H，M，Y)，256(N，V，A，D，K，M，Q，W，E，P，R)，267(V，H，N，A，F，I，K，S，T，Y)，271(E，D,L,M,Q,H,K,A,F,W,Y)和275(Q,L,T,Y,G,H,W,E,N,R)，其中LG12-进化枝变体的
氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0013] 在一些实施方案中，本发明是LG12-进化枝酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝酶变体或其活性片段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，其中该修饰位于LG12-进化
枝酶变体的生产性位置，其中，在该生产性位置测试的修饰中至少15％但少于30％满足a、b
和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第1、3、18、19、20、22、
24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、
93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、
150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、
228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265和272位，其中LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋
白酶氨基酸序列来编号的。
枝酶变体的生产性位置，其中，在该生产性位置测试的修饰中至少15％但少于30％满足a、b
和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第1、3、18、19、20、22、
24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、
93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、
150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、
228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265和272位，其中LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆菌蛋
白酶氨基酸序列来编号的。
[0014] 在一些实施方案中，修饰选自：残基1(A,L，H，K，G，R)，3(T，A，G，H，E，Y，I，V)，18(A，D，F，S，Q，N，R，T)，19(A，F，K，L，R，M，W)，20(G，H，Q，E，N)，22(T，D，S，E)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，26(V，E，R，N，S)，28(V，N，S，E，T)，30(I，T，A，E，V)，31(L，I，M，Q，T)，44(V，A，I，F)，50(F，R，S，A，K，Q，Y)，53(G，Y，H，A，D，N，R，E)，55(P，I，K，N，R)，57(A，G，W，P)，58(L，F，D，K)，58(L，F，D，K)，67(A，G，A，I，P)，72(V，M，A，G，S，T)，76(N，F，P，A，Q，S，Y，D)，77(N，Q，G，T)，79(T，E，M，A，K，Q，I，L)，80(G，C，P，F，H，M，Y)，85(A，T，V，S)，86(Y，A，P，F)，87(N，Q，M，H，L，S)，89(D，A，R，F)，90(L，D，S，G，Q，E，N，P)，91(Y，H，I，M，N，T，V，W)，93(V，G，I，L，T)，96(L，G，K，R，Y，I，Ｅ，H)，100(G，F，K，V，Y，A，E)，101(S，M，A，T，V，R)，102(G，V，F，E，Y)，
106(G，A，I，E，N，S，T，V)，107(I，H，Q，V，T)，108(A，S，I，C)，113(W，Y，Ｆ，H)，116(S，E，F，M)，
121(V，T，S，A，I)，124(M，R，S，Y，A)，126（L，H，W，I，Q，G，K)，127(G，E，H，N)，136(Q，L，H，W，F，R，D)，137(Q，M，V，I，H，T，E)，140(N，I，F，Y，D，Q)，144(N，D，F，H，M，V，W，Y)，147(I，R，K，S，A，H，M)，150(I，A，S，D，N，T，V)，152(A，G，P，V)，153(A，M，G，S)，160(G，N，H，M)，162(R，K，M，V)，
170(R，P，K，L)，172(S，C，N，T，G，H)，173(S，A，T，D)，183(N，G，A，Q，D，E)，185(T，C，W，Q，R，M)，
187(A，C，G，D，H，P，V，W)，188(S，C，L，N，T，H，Y)，194(S，M，T，F，K，P，R，D)，213(N，V，W，G，M，R，K，Q)，216(S，C，F，I，T，A)，217(F，C，H，K，L，E，R)，218(N，C，H，D)，222(M，C，A，H，L，Q)，225(P，A，G，V)，228(A，C，R，S)，231(A，C，G，S)，234(I，M，Q，V)，235(K，I，N，S，G，D，E，F)，241(M，H，K，I，L，Q，S，W)，243(N，A，T，G)，244(V，A，E，Y)，246(I，N，V，A，T)，252(N，D，Q，F，E)，252(N，D，Q，F，E)，265(K，R，D，S)，和272(S,P,V,M,F,N,Q,K)，其中LG12-进化枝变体的氨基酸位置是通
过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
106(G，A，I，E，N，S，T，V)，107(I，H，Q，V，T)，108(A，S，I，C)，113(W，Y，Ｆ，H)，116(S，E，F，M)，
121(V，T，S，A，I)，124(M，R，S，Y，A)，126（L，H，W，I，Q，G，K)，127(G，E，H，N)，136(Q，L，H，W，F，R，D)，137(Q，M，V，I，H，T，E)，140(N，I，F，Y，D，Q)，144(N，D，F，H，M，V，W，Y)，147(I，R，K，S，A，H，M)，150(I，A，S，D，N，T，V)，152(A，G，P，V)，153(A，M，G，S)，160(G，N，H，M)，162(R，K，M，V)，
170(R，P，K，L)，172(S，C，N，T，G，H)，173(S，A，T，D)，183(N，G，A，Q，D，E)，185(T，C，W，Q，R，M)，
187(A，C，G，D，H，P，V，W)，188(S，C，L，N，T，H，Y)，194(S，M，T，F，K，P，R，D)，213(N，V，W，G，M，R，K，Q)，216(S，C，F，I，T，A)，217(F，C，H，K，L，E，R)，218(N，C，H，D)，222(M，C，A，H，L，Q)，225(P，A，G，V)，228(A，C，R，S)，231(A，C，G，S)，234(I，M，Q，V)，235(K，I，N，S，G，D，E，F)，241(M，H，K，I，L，Q，S，W)，243(N，A，T，G)，244(V，A，E，Y)，246(I，N，V，A，T)，252(N，D，Q，F，E)，252(N，D，Q，F，E)，265(K，R，D，S)，和272(S,P,V,M,F,N,Q,K)，其中LG12-进化枝变体的氨基酸位置是通
过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0015] 在一些实施方案中，本发明是LG12-进化枝酶变体或其活性片段，该LG12-进化枝酶变体或其活性片段包含对亲本LG12-进化枝酶的氨基酸修饰，其中该修饰位于LG12-进化
枝酶变体的生产性位置，其中在该生产性位置测试的修饰中至少一个但少于15％的修饰满
足a、b和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第4、7、8、12、14、
16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、
128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、
215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273和274位，其中LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆
菌蛋白酶氨基酸序列来编号的。
枝酶变体的生产性位置，其中在该生产性位置测试的修饰中至少一个但少于15％的修饰满
足a、b和c(同上)中所列的标准中的至少一个，并且其中该生产性位置选自第4、7、8、12、14、
16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、
128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、
215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273和274位，其中LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的芽孢杆菌属LG12sprC枯草杆
菌蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0016] 在一些实施方案中，修饰选自：残基4(V,C),7(G,N),8(I,L),12(K,G,R),14(D,L),16(A,G,V),17(H,A),29(A,T,S),33(T,D),42(L,D),46(G,N),51(V,I),56(N,E),65(G,T,
V),69(A,G,T),73(A,G),81(V,H,M),83(G,S),84(V,A),88(A,C,G),94(K,G),104(L,Y,V),
109(Q,K),111(I,V),114(S,T,G),120(N,H,E),122(I,M),125(S,G),128(G,E,N),132(S,
A),138(A,E,S),141(N,G),143(Y,D,E),146(G,N,R),151(A,H),163(N,S,D),165(M,I,V),
167(Y,G),167(Y,G),167(Y,G),195(E,Q),203(V,C),204(N,E),205(I,V),206(L,Y),211
(G,C),211(G,C),215(A,D,E),220(T,A,G),224(A,S),224(A,S),230(A,S),232(A,S),238
(Y,W,F),250(L,I,M),260(P,Y),260(P,Y),268(I,F),273(A,S),和273(A,S)，其中LG12-进
化枝变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编
号的。
V),69(A,G,T),73(A,G),81(V,H,M),83(G,S),84(V,A),88(A,C,G),94(K,G),104(L,Y,V),
109(Q,K),111(I,V),114(S,T,G),120(N,H,E),122(I,M),125(S,G),128(G,E,N),132(S,
A),138(A,E,S),141(N,G),143(Y,D,E),146(G,N,R),151(A,H),163(N,S,D),165(M,I,V),
167(Y,G),167(Y,G),167(Y,G),195(E,Q),203(V,C),204(N,E),205(I,V),206(L,Y),211
(G,C),211(G,C),215(A,D,E),220(T,A,G),224(A,S),224(A,S),230(A,S),232(A,S),238
(Y,W,F),250(L,I,M),260(P,Y),260(P,Y),268(I,F),273(A,S),和273(A,S)，其中LG12-进
化枝变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编
号的。
[0017] 在一些实施方案中，本发明是包含至少一种如上所列的变体的组合物。在一些实施方案中，本发明是使用如上所列的清洁组合物进行清洁的方法。
[0019] 图1提供了用于表达LG12sprC野生型蛋白酶和蛋白酶变体的pHYT-LG12的质粒图谱。
[0020] 图2提供了质粒pHYT-LG12中编码的LG12sprC蛋白的前体序列。
[0021] 图3提供了用于表达Bhon03321的pHYT-Bhon03321的质粒图谱。
[0022] 图4提供了OMO HDL洗涤剂中LG12同源物的清洁性能。
[0023] 图5提供了OMO HDD洗涤剂中LG12同源物的清洁性能。
[0024] 图6提供了GSM-B pH9洗涤剂中LG12同源物的清洁性能。
[0025] 图7提供了GSM-B pH10.5洗涤剂中LG12同源物的清洁性能。
[0026] 图8提供了与LG12sprC的序列同一性大于60％的多种枯草杆菌蛋白酶的系统发育树，包括方括号内示出的sprC的LG12-进化枝同源物。
[0027] 图9A至图9B提供了以下各种LG12-进化枝蛋白酶的比对：Bac sp LG12SprC、DSM_9711、DSM_9712、DSM_6951、Bhon03321、Bac sp BAD11988、Bac sp WP_010192403、Bac sp
LG12SprD、Bac sp WP_010192405、Bac sp BAD21128以及迟缓芽孢杆菌(B lentus)枯草杆
菌蛋白酶P29600。
LG12SprD、Bac sp WP_010192405、Bac sp BAD21128以及迟缓芽孢杆菌(B lentus)枯草杆
菌蛋白酶P29600。
[0028] 图10A至图10B提供了可用的洗涤剂蛋白酶与如下蛋白酶的基于结构的比对：LG12sprC蛋白酶以及其它已知的与LG12sprC具有接近的序列同一性的枯草杆菌蛋白酶。凸
显的区域表示LG12-进化枝成员共有的基序序列。
显的区域表示LG12-进化枝成员共有的基序序列。
[0029] 图11提供了基于来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶结构所建立的LG12sprC蛋白酶结构的同源模型的区域。在该图中，Tyr 86、Asn87、Thr 22和His 17
的侧链以棍形图示出。
的侧链以棍形图示出。
[0031] 发明详述
[0032] 本发明提供了新型丝氨酸蛋白酶，特别是LG12-进化枝丝氨酸蛋白酶的酶和变体，尤其是可用于洗涤剂组合物的酶。在一些实施方案中，本发明提供了与亲本丝氨酸蛋白酶
相比具有一个或多个修饰(如置换)的丝氨酸蛋白酶变体。在一些实施方案中，本发明提供
了属于LG12-进化枝丝氨酸蛋白酶的新型丝氨酸蛋白酶。对于上述每种情况，本发明的丝氨
酸蛋白酶可用于多个行业，包括污垢去除、谷物乙醇生产、动物饲料、食品加工及消化助剂、
皮革加工和个人护理。这可以通过如下方式对酶进行改进来实现：改善酶的清洁性能、在化
学试剂的存在下稳定性和/或酶的热稳定性，从而提高酶的效力。本发明提供了丝氨酸蛋白
酶变体，包括但不限于LG12sprC丝氨酸蛋白酶变体，该酶特别适于和可以用于各种清洁应
用。本发明包括具有本文所述的至少一种新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋白酶(如，
LG12sprC变体)的组合物。这样的一些组合物包括洗涤剂组合物。本发明提供了多种物种，
包括芽孢杆菌属物种的变体丝氨酸蛋白酶和包含一种或多种此类变体LG12进化枝丝氨酸
蛋白酶的组合物。本发明的丝氨酸蛋白酶变体可以与其它可用于洗涤剂组合物的酶相组
合。本发明还提供了使用本发明的新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋白酶的方法。
相比具有一个或多个修饰(如置换)的丝氨酸蛋白酶变体。在一些实施方案中，本发明提供
了属于LG12-进化枝丝氨酸蛋白酶的新型丝氨酸蛋白酶。对于上述每种情况，本发明的丝氨
酸蛋白酶可用于多个行业，包括污垢去除、谷物乙醇生产、动物饲料、食品加工及消化助剂、
皮革加工和个人护理。这可以通过如下方式对酶进行改进来实现：改善酶的清洁性能、在化
学试剂的存在下稳定性和/或酶的热稳定性，从而提高酶的效力。本发明提供了丝氨酸蛋白
酶变体，包括但不限于LG12sprC丝氨酸蛋白酶变体，该酶特别适于和可以用于各种清洁应
用。本发明包括具有本文所述的至少一种新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋白酶(如，
LG12sprC变体)的组合物。这样的一些组合物包括洗涤剂组合物。本发明提供了多种物种，
包括芽孢杆菌属物种的变体丝氨酸蛋白酶和包含一种或多种此类变体LG12进化枝丝氨酸
蛋白酶的组合物。本发明的丝氨酸蛋白酶变体可以与其它可用于洗涤剂组合物的酶相组
合。本发明还提供了使用本发明的新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋白酶的方法。
[0033] 本发明包括丝氨酸蛋白酶的酶变体，该酶变体与亲本丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个修饰。该酶变体通过在洗涤性能、洗涤剂组合物中的酶稳定性和酶热稳定性方面具
有最低性能指数，同时在这些特性的至少一个中与亲本丝氨酸蛋白酶相比具有改善，而可
以用于洗涤剂组合物中。
有最低性能指数，同时在这些特性的至少一个中与亲本丝氨酸蛋白酶相比具有改善，而可
以用于洗涤剂组合物中。
[0034] 另外，本发明提供在丝氨酸蛋白酶的一个或多个氨基酸位置处的修饰(例如置换)，其中该丝氨酸蛋白酶可用于洗涤剂组合物中，其中在所述位置的有利修饰导致该丝氨
酸蛋白酶在洗涤性能、洗涤剂组合物中的酶稳定性和酶热稳定性方面具有最低性能指数，
同时在这些特性的至少一个中与亲本丝氨酸蛋白酶相比具有改善。这些修饰被认为是本发
明的适宜修饰。这些氨基酸位置可被认为是对亲本丝氨酸蛋白酶进行组合修饰的有用位
置。被发现是有用位置的丝氨酸蛋白酶氨基酸位置可以进一步表征为：具有适用于洗涤剂
组合物的多个修饰。对于每个位置，可能的适宜修饰的数目越大表示特定位置的生产力越
高。
酸蛋白酶在洗涤性能、洗涤剂组合物中的酶稳定性和酶热稳定性方面具有最低性能指数，
同时在这些特性的至少一个中与亲本丝氨酸蛋白酶相比具有改善。这些修饰被认为是本发
明的适宜修饰。这些氨基酸位置可被认为是对亲本丝氨酸蛋白酶进行组合修饰的有用位
置。被发现是有用位置的丝氨酸蛋白酶氨基酸位置可以进一步表征为：具有适用于洗涤剂
组合物的多个修饰。对于每个位置，可能的适宜修饰的数目越大表示特定位置的生产力越
高。
[0035] 此外，本发明提供了包含本发明的新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含这些新型丝氨酸蛋白酶和/或变体丝氨酸蛋
白酶中的至少一者的清洁组合物。
白酶中的至少一者的清洁组合物。
[0036] 应当认识到，为清楚起见在上文和下文中于分开的实施方案的背景中描述的本发明某些特征，也可在单个实施方案中以组合的方式提供。反之，为简化起见在单个实施方案
的背景中描述的本发明的各个特征也可以分开地提供，或以任何子组合的方式提供。
的背景中描述的本发明的各个特征也可以分开地提供，或以任何子组合的方式提供。
[0037] 定义
[0038] 除非另外指明，否则本发明的实践涉及在分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA中通常使用的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术是本领域技术人员
已知的，并且在本领域的技术人员所熟知的许多教科书和参考文献中有描述。本文的上文
和下文中提及的所有专利、专利申请、文章和出版物在此明确以引用方式并入本文。
已知的，并且在本领域的技术人员所熟知的许多教科书和参考文献中有描述。本文的上文
和下文中提及的所有专利、专利申请、文章和出版物在此明确以引用方式并入本文。
[0039] 除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。许多技术词典是本领域的技术人员已知的。本文
描述了一些合适的方法和材料，但在本发明的实践中可使用任何与本文所述方法和材料类
似或等同的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书，可以更全面描述以下紧接定义的术
语。另外，如本文所用，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式的“一个”、“一种”和“所
述”包括复数涵义。数值范围包括限定范围的端值在内。除非另外指明，否则核酸以5'至3'
方向从左到右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。应当理解，本发明并不
限于所描述的具体方法、方案和试剂，这些方法、方案和试剂可以根据其所使用的情境由本
领域的技术人员进行变化。
描述了一些合适的方法和材料，但在本发明的实践中可使用任何与本文所述方法和材料类
似或等同的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书，可以更全面描述以下紧接定义的术
语。另外，如本文所用，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式的“一个”、“一种”和“所
述”包括复数涵义。数值范围包括限定范围的端值在内。除非另外指明，否则核酸以5'至3'
方向从左到右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。应当理解，本发明并不
限于所描述的具体方法、方案和试剂，这些方法、方案和试剂可以根据其所使用的情境由本
领域的技术人员进行变化。
[0040] 除非另外指明，否则本发明的实施采用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术，所有这些技术都在本领域的技术范围内。
[0041] 另外，本文提供的标题并非限制本发明的各个方面或实施方案，这些方面或实施方案可以通过整体参考本说明书而得出。因此，通过整体参考本说明书，可以更全面定义以
下紧接定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，下文定义了多个术语。
下紧接定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，下文定义了多个术语。
[0042] 在整个本说明书中给出的每一最大数值限都旨在包括每一更低数值限，就如同该更低数值限明确地写入本文一样。在整个本说明书中给出的每一最小数值限都包括每一更
高数值限，就如同此更高数值限明确地写入本文一样。在整个本说明书中给出的每一数值
范围将包括落在此较宽数值范围内的每一较窄数值范围，就如同这些较窄数值范围全部明
确地写入本文中一样。
高数值限，就如同此更高数值限明确地写入本文一样。在整个本说明书中给出的每一数值
范围将包括落在此较宽数值范围内的每一较窄数值范围，就如同这些较窄数值范围全部明
确地写入本文中一样。
[0043] 如本文所用，术语“蛋白酶”是指具有分解其它蛋白质的能力的酶蛋白。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，“蛋白水解”通过水解形成蛋白的肽或多肽链中将氨基酸连接在
一起的肽键来开始蛋白质的分解代谢。蛋白酶作为蛋白消化酶的这种活性被称为“蛋白水
解活性”。有许多熟知的方法用于测量蛋白水解活性(参见例如，Kalisz，“Microbial
Proteinases”，Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/
Biotechnology，(1988))。例如，蛋白水解活性可通过对比试验探知，其中分析相应的蛋白
酶水解商业底物的能力。在蛋白酶或蛋白水解活性分析中可用的示例性底物包括但不限于
二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)
和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。利用这些底物的比色测定试验是本领域所熟知的
(参见例如，WO 99/34011和美国专利6,376,450，这些均以引用方式并入本文)。pNA测定试
验(参见例如，Del Mar等人，Anal.Biochem.99:316-320[1979])也可用于测定在梯度洗脱
过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定试验测量对硝基苯胺的释放速率，其中酶水解可
溶性合成肽底物(诸如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-
pNA))，并且裂解发生在C端氨基酸(苯丙氨酸)和p-NA之间，从而导致从所述水解反应中产
生黄色，所述黄色在分光光度计上410nm处进行测量并且与活性酶浓度成正比。利用对所述
颜色变化的测量可计算反应速率。此外，可使用280纳米(nm)处的吸光度测量值来测定总蛋
白浓度。在使用参照标准时，通过活性酶/总蛋白比率可以得出酶纯度。
一起的肽键来开始蛋白质的分解代谢。蛋白酶作为蛋白消化酶的这种活性被称为“蛋白水
解活性”。有许多熟知的方法用于测量蛋白水解活性(参见例如，Kalisz，“Microbial
Proteinases”，Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/
Biotechnology，(1988))。例如，蛋白水解活性可通过对比试验探知，其中分析相应的蛋白
酶水解商业底物的能力。在蛋白酶或蛋白水解活性分析中可用的示例性底物包括但不限于
二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)
和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。利用这些底物的比色测定试验是本领域所熟知的
(参见例如，WO 99/34011和美国专利6,376,450，这些均以引用方式并入本文)。pNA测定试
验(参见例如，Del Mar等人，Anal.Biochem.99:316-320[1979])也可用于测定在梯度洗脱
过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定试验测量对硝基苯胺的释放速率，其中酶水解可
溶性合成肽底物(诸如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-
pNA))，并且裂解发生在C端氨基酸(苯丙氨酸)和p-NA之间，从而导致从所述水解反应中产
生黄色，所述黄色在分光光度计上410nm处进行测量并且与活性酶浓度成正比。利用对所述
颜色变化的测量可计算反应速率。此外，可使用280纳米(nm)处的吸光度测量值来测定总蛋
白浓度。在使用参照标准时，通过活性酶/总蛋白比率可以得出酶纯度。
[0044] 如本文所用，术语“变体多肽”是指包含与亲本或参考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列有至少一个氨基酸残基不同的氨基酸序列的多肽。
[0045] 如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽
孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、
嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆
菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、吉氏芽孢杆菌
(B.gibsonii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢
杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽
孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认芽孢杆菌属持续发生分类
学上的重组。因此，该属旨在包括已经被重分类的物种，包括但不限于生物体例如嗜热脂肪
芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其目前命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus
stearothermophilus)”。在存在氧气的情况下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定
义特性，但是这种特性也应用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、兼性
芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽抱杆菌
(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、纤细芽
孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属
(Paenibacillus)、中度嗜盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属
(Thermobacillus)、尿素芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、
嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆
菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、吉氏芽孢杆菌
(B.gibsonii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢
杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽
孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认芽孢杆菌属持续发生分类
学上的重组。因此，该属旨在包括已经被重分类的物种，包括但不限于生物体例如嗜热脂肪
芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其目前命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus
stearothermophilus)”。在存在氧气的情况下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定
义特性，但是这种特性也应用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、兼性
芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽抱杆菌
(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、纤细芽
孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属
(Paenibacillus)、中度嗜盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属
(Thermobacillus)、尿素芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
[0046] 本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指由共价键合在链中的核苷酸单体构成的任意长度的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸，其为包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)
和RNA(核糖核酸，其为核糖核苷酸的聚合物)是具有不同生物功能的多核苷酸或核酸的例
子。多核苷酸或核酸包括但不限于单链DNA、双链DNA或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-
RNA杂合体、或包含以下碱基的聚合物：嘌呤和嘧啶碱基、或其它天然的、经化学修饰的、经
生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。以下为多核苷酸的非限制性例子：基因、
基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA
(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载
体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷
酸包括经修饰的核苷酸(诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和
连接基团(诸如氟核糖和硫酯)以及核苷酸分支。在一个具体的实施方案中，核苷酸序列被
非核苷酸组分中断。
和RNA(核糖核酸，其为核糖核苷酸的聚合物)是具有不同生物功能的多核苷酸或核酸的例
子。多核苷酸或核酸包括但不限于单链DNA、双链DNA或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-
RNA杂合体、或包含以下碱基的聚合物：嘌呤和嘧啶碱基、或其它天然的、经化学修饰的、经
生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。以下为多核苷酸的非限制性例子：基因、
基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA
(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载
体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷
酸包括经修饰的核苷酸(诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和
连接基团(诸如氟核糖和硫酯)以及核苷酸分支。在一个具体的实施方案中，核苷酸序列被
非核苷酸组分中断。
[0047] 如本文所用，术语“突变”是指在起始氨基酸或核酸序列中进行的变化。该术语旨在涵盖置换、插入和缺失。
[0048] 如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸或多核苷酸引入或转移到靶细胞或靶组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。载体通常用于将外源DNA引入到另一个细胞或组织
中。载体通常包含作为转基因的DNA序列以及充当载体“骨架”的较大多核苷酸序列。载体通
常用于将遗传信息(诸如插入的转基因)转移至靶细胞或靶组织，从而在靶细胞或靶组织中
分离、倍增或表达插入物。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(如，病毒载体)、粘粒、表
达载体、穿梭载体、盒等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入
靶细胞的过程通常称为转染。使用病毒载体转染细胞通常称为转导。在一些实施方案中，本
发明包括载体，该载体包括编码变体蛋白酶(如，前体或成熟变体蛋白酶)的DNA序列，该DNA
序列有效连接至合适的、能够实现该DNA序列在合适宿主中表达的前序列(如，分泌、信号肽
序列等)。
中。载体通常包含作为转基因的DNA序列以及充当载体“骨架”的较大多核苷酸序列。载体通
常用于将遗传信息(诸如插入的转基因)转移至靶细胞或靶组织，从而在靶细胞或靶组织中
分离、倍增或表达插入物。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(如，病毒载体)、粘粒、表
达载体、穿梭载体、盒等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入
靶细胞的过程通常称为转染。使用病毒载体转染细胞通常称为转导。在一些实施方案中，本
发明包括载体，该载体包括编码变体蛋白酶(如，前体或成熟变体蛋白酶)的DNA序列，该DNA
序列有效连接至合适的、能够实现该DNA序列在合适宿主中表达的前序列(如，分泌、信号肽
序列等)。
[0049] 如本文所用，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指通过重组或合成而生成的用于在靶细胞中表达所关注核酸(如，外源核酸或转基因)的核酸构建体或载体。所关
注核酸通常表达所关注蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外源核酸表达的启
动子核苷酸序列。表达载体或表达盒通常还包含允许在靶细胞中转录特定核酸的任何其它
指定的核酸元件。重组表达盒可以被整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸
片段中。一些表达载体能够将异源DNA片段整合到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达该异源
DNA片段。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。选择合适的表达载体在本领域技术人
员的知识范围内。选择合适的表达载体以便由整合到表达载体中的核酸序列表达蛋白质在
本领域技术人员的知识范围内。
注核酸通常表达所关注蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外源核酸表达的启
动子核苷酸序列。表达载体或表达盒通常还包含允许在靶细胞中转录特定核酸的任何其它
指定的核酸元件。重组表达盒可以被整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸
片段中。一些表达载体能够将异源DNA片段整合到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达该异源
DNA片段。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。选择合适的表达载体在本领域技术人
员的知识范围内。选择合适的表达载体以便由整合到表达载体中的核酸序列表达蛋白质在
本领域技术人员的知识范围内。
[0050] DNA构建体是可被引入靶细胞或靶组织中的人工构建的核酸片段。DNA构建体通常包含已亚克隆到载体中的DNA插入物，该插入物包含编码所关注蛋白质的核苷酸序列。载体
可包含用于在细菌内生长的细菌抗性基因、以及用于在生物体内表达所关注蛋白质的启动
子。该DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适的技术在体外生成。在一些实
施方案中，DNA构建体包含所关注核酸序列。在一些实施方案中，该序列被有效连接至另外
的元件，诸如控制元件(如，启动子等)。DNA构建体可进一步包含选择性标记，并且可进一步
包含旁侧带有同源盒的引入序列(incoming sequence)。该构建体可包含添加在末端的其
它非同源序列(如，填充序列或侧翼)。在一些实施方案中，序列的末端是闭合的，使得DNA构
建体形成闭环。使用本领域所熟知的技术整合到DNA构建体中的所关注核酸序列可以是野
生型、突变型或经修饰的核酸。在一些实施方案中，DNA构建体包含一个或多个与宿主细胞
染色体同源的核酸序列。在其它实施方案中，DNA构建体包含一个或多个非同源核苷酸序
列。在体外将DNA构建体组装好后，可将该DNA构建体用于例如：1)将异源序列插入宿主细胞
的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)；3)
删除靶基因；和/或4)将复制质粒引入到宿主中。“DNA构建体”和“表达盒”在本文中可互换
使用。
可包含用于在细菌内生长的细菌抗性基因、以及用于在生物体内表达所关注蛋白质的启动
子。该DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适的技术在体外生成。在一些实
施方案中，DNA构建体包含所关注核酸序列。在一些实施方案中，该序列被有效连接至另外
的元件，诸如控制元件(如，启动子等)。DNA构建体可进一步包含选择性标记，并且可进一步
包含旁侧带有同源盒的引入序列(incoming sequence)。该构建体可包含添加在末端的其
它非同源序列(如，填充序列或侧翼)。在一些实施方案中，序列的末端是闭合的，使得DNA构
建体形成闭环。使用本领域所熟知的技术整合到DNA构建体中的所关注核酸序列可以是野
生型、突变型或经修饰的核酸。在一些实施方案中，DNA构建体包含一个或多个与宿主细胞
染色体同源的核酸序列。在其它实施方案中，DNA构建体包含一个或多个非同源核苷酸序
列。在体外将DNA构建体组装好后，可将该DNA构建体用于例如：1)将异源序列插入宿主细胞
的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)；3)
删除靶基因；和/或4)将复制质粒引入到宿主中。“DNA构建体”和“表达盒”在本文中可互换
使用。
[0051] 如本文所用，“质粒”是指能够独立于染色体DNA复制的染色体外DNA分子。质粒是双链的(ds)，并且可以是环形的，通常用作克隆载体。
[0052] 如本文所用，在将核酸序列引入细胞的上下文中，术语“引入”是指适用于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电
穿孔、接合和转导(参见例如，Ferrari等人，“Genetics”，Bacillus(Hardwood等人编辑)，
Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989])。
穿孔、接合和转导(参见例如，Ferrari等人，“Genetics”，Bacillus(Hardwood等人编辑)，
Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989])。
[0053] 转化是指由遗传物质(如，DNA)的摄取、基因组整合以及表达所引起的细胞的遗传改变。
[0054] 如本文所用，当核酸与另一个核酸序列在功能上相关时，该核酸与另一个核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子或增强子影响核苷酸编码序列的转录，则该启动子或增强
子有效连接至该编码序列。如果核糖体结合位点被置于有利于编码序列的翻译的位置，则
该核糖体结合位点有效连接至该编码序列。通常，“有效连接”的DNA序列是邻接的。但增强
子不必是邻接的。通过在便利的限制性位点通过连接反应来完成连接。如果不存在这样的
位点，则可根据常规做法来使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
子有效连接至该编码序列。如果核糖体结合位点被置于有利于编码序列的翻译的位置，则
该核糖体结合位点有效连接至该编码序列。通常，“有效连接”的DNA序列是邻接的。但增强
子不必是邻接的。通过在便利的限制性位点通过连接反应来完成连接。如果不存在这样的
位点，则可根据常规做法来使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0055] 如本文所用，术语“基因”是指编码多肽的多核苷酸(如，DNA片段)，包括编码区之前和之后的区域、以及各编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0056] 如本文所用，当结合细胞使用时，“重组”通常表示细胞已通过引入异源核酸序列而被修饰，或者该细胞来源于被这样修饰过的细胞。例如，重组细胞可包含形式与在天然
(非重组)形式细胞中所见有所不同的基因，或者重组细胞可包含天然基因(发现于天然形
式的细胞中)，但该基因已经过修饰并重新引入到细胞中。重组细胞可以包含该细胞内源性
的核酸，所述核酸在未从该细胞中移除的情况下已经过修饰；这样的修饰包括通过基因替
换、定点突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的修饰。重组DNA技术包括在体
外制备重组DNA并将重组DNA转移到细胞中的技术，其中重组DNA可以在该细胞中得到表达
或增殖从而产生重组多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”通常是指两个或更多个核
酸或多核苷酸链或片段组装或结合产生新的多核苷酸或核酸。重组多核苷酸或核酸有时称
为嵌合体。当核酸或多肽为人工制成的或工程化得到、或来源于人工或工程化的蛋白或核
酸时，它们是“重组的”
(非重组)形式细胞中所见有所不同的基因，或者重组细胞可包含天然基因(发现于天然形
式的细胞中)，但该基因已经过修饰并重新引入到细胞中。重组细胞可以包含该细胞内源性
的核酸，所述核酸在未从该细胞中移除的情况下已经过修饰；这样的修饰包括通过基因替
换、定点突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的修饰。重组DNA技术包括在体
外制备重组DNA并将重组DNA转移到细胞中的技术，其中重组DNA可以在该细胞中得到表达
或增殖从而产生重组多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”通常是指两个或更多个核
酸或多核苷酸链或片段组装或结合产生新的多核苷酸或核酸。重组多核苷酸或核酸有时称
为嵌合体。当核酸或多肽为人工制成的或工程化得到、或来源于人工或工程化的蛋白或核
酸时，它们是“重组的”
[0057] 如本文所用，术语核酸或基因“扩增”是指以下过程：特定DNA序列不成比例地复制，使得扩增的核酸或基因的拷贝数量比最初存在于基因组中的数量高。在一些实施方案
中，通过在药物(如，可抑制酶的抑制剂)存在的情况下生长来选择细胞，导致编码在该药物
存在的情况下细胞生长所需的基因产物的内源基因扩增，或者编码该核酸或基因产物的外
源(即，输入)序列扩增，或两者。
中，通过在药物(如，可抑制酶的抑制剂)存在的情况下生长来选择细胞，导致编码在该药物
存在的情况下细胞生长所需的基因产物的内源基因扩增，或者编码该核酸或基因产物的外
源(即，输入)序列扩增，或两者。
[0058] “扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特例。这与非特异性模板复制(即，该复制依赖于模板，但不依赖于特定模板)形成对比。模板特异性在此区别于复制保真度(即，正确
多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性常通
过“靶”特异性进行描述。靶序列就为了将该序列从其它核酸中分选出来这一意义上是
“靶”。扩增技术主要是为这种分选而设计的。
多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性常通
过“靶”特异性进行描述。靶序列就为了将该序列从其它核酸中分选出来这一意义上是
“靶”。扩增技术主要是为这种分选而设计的。
[0059] 如本文所用，术语“引物”是指天然存在的(以纯化的限制性消化物形式)或以合成方式产生的寡核苷酸(核苷酸残基的聚合物)，当将该寡核苷酸置于可以诱导与核酸链互补
的引物延伸产物合成的条件下时(即，存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶，并且在合适的温
度和pH)，该寡核苷酸能够充当合成起始点。引物优选为单链的，以达到最大扩增效率，但也
可以是双链的。如果引物是双链的，则首先会对引物进行处理，将其双链分开，再用于制备
延伸产物。在一些实施方案中，引物为寡聚脱氧核苷酸。引物必须足够长，以便在诱导剂存
在的情况下引发延伸产物的合成。引物的具体长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和
方法的用途。
的引物延伸产物合成的条件下时(即，存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶，并且在合适的温
度和pH)，该寡核苷酸能够充当合成起始点。引物优选为单链的，以达到最大扩增效率，但也
可以是双链的。如果引物是双链的，则首先会对引物进行处理，将其双链分开，再用于制备
延伸产物。在一些实施方案中，引物为寡聚脱氧核苷酸。引物必须足够长，以便在诱导剂存
在的情况下引发延伸产物的合成。引物的具体长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和
方法的用途。
[0060] 如本文所用，术语“探针”是指天然存在(以纯化的限制性消化物形式)的寡核苷酸、或通过合成、重组或PCR扩增产生的寡核苷酸，该寡核苷酸通常能够杂交到另一个所关
注寡核苷酸。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。
本发明中使用的任何探针都可以考虑用任何“报道分子”标记，以便该探针可以在任何检测
系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶系统(如，ELISA以及基于酶的组织化学测定试
验)、荧光系统、放射系统和发光系统。不旨在将本发明限制于任何特定检测系统或标记。
注寡核苷酸。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。
本发明中使用的任何探针都可以考虑用任何“报道分子”标记，以便该探针可以在任何检测
系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶系统(如，ELISA以及基于酶的组织化学测定试
验)、荧光系统、放射系统和发光系统。不旨在将本发明限制于任何特定检测系统或标记。
[0062] 如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188(这些专利据此以引用方式并入)中所述的方法，包括不采用克隆或纯化而增大基
因组DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。这种用于扩增靶序列的方法是本领域熟知的。
因组DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。这种用于扩增靶序列的方法是本领域熟知的。
[0064] 如本文所用，术语“限制性内切酶”或“限制性酶”是指能够在特定核苷酸序列(称为限制性位点)位置或附近切割双链或单链DNA的酶(如，细菌酶)。含有限制性位点的核苷
酸序列由给定限制性内切酶或限制性酶识别并剪切，并且常常是用于插入DNA片段的位点。
限制性位点可以被改造到表达载体或DNA构建体中。
酸序列由给定限制性内切酶或限制性酶识别并剪切，并且常常是用于插入DNA片段的位点。
限制性位点可以被改造到表达载体或DNA构建体中。
[0065] “同源重组”是指两个DNA分子或配对的染色体于相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的DNA片段交换。在一些实施方案中，染色体整合是同源重组。
[0066] 如果核酸或多核苷酸在其天然状态下或通过本领域技术人员已知的方法操作时可以被转录和/或翻译以生成多肽或其片段，则称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。也称此
类核酸的反义链编码该序列。
类核酸的反义链编码该序列。
[0067] 如本领域已知，DNA序列可由RNA聚合酶转录生成RNA序列，而RNA序列可通过逆转录酶逆转录生成DNA序列。
[0068] “宿主菌株”或“宿主细胞”是指包含所关注DNA序列的表达载体的合适宿主。所关注DNA序列可在宿主菌株或宿主细胞中表达所关注蛋白质。
[0069] “蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合物序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开中通篇使用了按照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(JCBN)的
要求所定义的氨基酸单字母代码和3字母代码。单字母X是指二十种氨基酸中的任何一种。
还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个的核苷酸序列编码。突变的命名方
式为：亲本氨基酸的单字母代码后接三位数或两位数的位置编号，然后是氨基酸变体的单
字母代码。例如，第87位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。在突变之
间插入“-”来指示多个突变。第87位和第90位的突变则表示为“G087S-A090Y”或“G87S-
A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的插入，单字母代码“Z”在位置编号的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”在位置编号的右
侧。对于插入，该位置编号为在所插入的(一个或多个)氨基酸之前的位置编号，针对每个氨
基酸再加上0.01。例如，在第87位与第88位之间插入三个氨基酸——丙氨酸(A)、丝氨酸(S)
和酪氨酸(Y)，表示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因此，将上述所有突变结合起来再
加上第100位的缺失，表示为：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。在描
述修饰时，位置编号后跟列于括号中的氨基酸表示该位置可由任一所列出的氨基酸进行置
换。例如，6(L,I)是指第6位可被亮氨酸或异亮氨酸置换。
要求所定义的氨基酸单字母代码和3字母代码。单字母X是指二十种氨基酸中的任何一种。
还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个的核苷酸序列编码。突变的命名方
式为：亲本氨基酸的单字母代码后接三位数或两位数的位置编号，然后是氨基酸变体的单
字母代码。例如，第87位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。在突变之
间插入“-”来指示多个突变。第87位和第90位的突变则表示为“G087S-A090Y”或“G87S-
A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的插入，单字母代码“Z”在位置编号的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”在位置编号的右
侧。对于插入，该位置编号为在所插入的(一个或多个)氨基酸之前的位置编号，针对每个氨
基酸再加上0.01。例如，在第87位与第88位之间插入三个氨基酸——丙氨酸(A)、丝氨酸(S)
和酪氨酸(Y)，表示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因此，将上述所有突变结合起来再
加上第100位的缺失，表示为：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。在描
述修饰时，位置编号后跟列于括号中的氨基酸表示该位置可由任一所列出的氨基酸进行置
换。例如，6(L,I)是指第6位可被亮氨酸或异亮氨酸置换。
[0070] “前序列”或“前肽序列”是指信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列，该氨基酸序列是正确折叠和分泌蛋白酶所必需的。前序列或前肽序列的剪切得到成熟的活性
蛋白酶。前序列可以是内源性的，或者可出现在高度相关的蛋白质，例如另一种枯草杆菌蛋
白酶中。
蛋白酶。前序列可以是内源性的，或者可出现在高度相关的蛋白质，例如另一种枯草杆菌蛋
白酶中。
[0071] 术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与成熟形式或前体形式蛋白质的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列可以
是内源性的或外源性的。成熟蛋白质中通常不存在信号序列。蛋白质转运之后，通常会在信
号肽酶的作用下将信号序列从该蛋白质上剪切下来。
是内源性的或外源性的。成熟蛋白质中通常不存在信号序列。蛋白质转运之后，通常会在信
号肽酶的作用下将信号序列从该蛋白质上剪切下来。
[0072] 术语“杂合信号序列”是指这样的信号序列，其中序列的一部分从表达宿主获得，并融合至待表达的基因的信号序列。在一些实施方案中，使用合成的序列。
[0073] 术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式是指不具有信号肽序列和前肽序列的功能形式的蛋白质、多肽或肽。
[0074] 术语蛋白质或肽的“前体”形式是指，具有有效连接至蛋白质的氨基端或羰基端的前序列的蛋白质成熟形式。前体也可以具有有效连接至前序列氨基端的“信号”序列。前体
还可以具有参与翻译后活性的其它多核苷酸(例如，为留下成熟形式的蛋白质或肽而从前
体上被剪切下来的多核苷酸)。
还可以具有参与翻译后活性的其它多核苷酸(例如，为留下成熟形式的蛋白质或肽而从前
体上被剪切下来的多核苷酸)。
[0075] 结合氨基酸序列或核酸序列使用的术语“野生型”表示该氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指存在于自然界中(即，尚
未通过重组方法进行操纵)的任何物质(如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
未通过重组方法进行操纵)的任何物质(如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
[0076] 如本文所用，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(如，在实验室中制备的重组多核苷酸或多肽)。
[0077] 如本文所用，对于氨基酸残基位置而言，“对应于”或“对应”是指，在蛋白质或肽中处于所列举的位置处的氨基酸残基，或者与蛋白质或肽中所列举残基类似、同源或等同的
氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。
氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。
[0078] 术语“来源于”和“得自”不仅指由所考虑的生物体株产生的或者可以产生的蛋白质，而且指由此株分离的DNA序列编码的并且在含有此DNA序列的宿主生物体中产生的蛋白
酶。此外，该术语还指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的蛋白质，其中该蛋白质具有
所考虑的蛋白酶的鉴别特征。举例来讲，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”指由芽孢杆菌天然
产生的具有蛋白水解活性的那些酶；也指这样的丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶类似于从
芽孢杆菌来源产生的那些酶、但是其是通过使用遗传工程技术从转化了编码该丝氨酸蛋白
酶的核酸的芽孢杆菌属菌株或非芽孢杆菌属生物体产生的。
酶。此外，该术语还指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的蛋白质，其中该蛋白质具有
所考虑的蛋白酶的鉴别特征。举例来讲，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”指由芽孢杆菌天然
产生的具有蛋白水解活性的那些酶；也指这样的丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶类似于从
芽孢杆菌来源产生的那些酶、但是其是通过使用遗传工程技术从转化了编码该丝氨酸蛋白
酶的核酸的芽孢杆菌属菌株或非芽孢杆菌属生物体产生的。
[0080] 如本文所用，“同源基因”是指来自不同的但通常相关的物种的一对基因，这对基因彼此对应，并且彼此相同或非常相似。该术语包括因物种形成(即，新物种的产生)而分离
的基因(如，直系同源基因)，以及通过基因复制而分离的基因(如，旁系同源基因)。
的基因(如，直系同源基因)，以及通过基因复制而分离的基因(如，旁系同源基因)。
[0081] 如本文所用，“同源性”是指序列相似性或同一性，优选地为序列同一性。可使用本领域已知的标准技术来确定同源性(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482
[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988]；软件程序，诸如Wisconsin遗传学软件包
(Genetics Computer Group,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及
Devereux等人，Nucl.Acid Res.12:387-395[1984])。可用算法的一个例子是PILEUP。
PILEUP通过渐进的、成对的比对方式由一组相关序列创建多序列比对。它还可以绘制树状
图，示出用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用的是Feng和Doolittle的渐进比对方法的简
化版本(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35:351-360[1987])。该方法类似于Higgins和
Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp，CABIOS 5:151-153[1989])。有用的PILEUP参数包
括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权的末端空位。
(Genetics Computer Group,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及
Devereux等人，Nucl.Acid Res.12:387-395[1984])。可用算法的一个例子是PILEUP。
PILEUP通过渐进的、成对的比对方式由一组相关序列创建多序列比对。它还可以绘制树状
图，示出用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用的是Feng和Doolittle的渐进比对方法的简
化版本(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35:351-360[1987])。该方法类似于Higgins和
Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp，CABIOS 5:151-153[1989])。有用的PILEUP参数包
括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权的末端空位。
[0082] 本领域技术人员可以很容易地确定参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分比。通过使用本领域已知的方法比对序列并确定同一性，来直接比较分子间的序
列信息，可以确定多核苷酸或多肽序列共享的同一性百分比。适于确定序列相似性的算法
的例子为BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410[1990])。用于进行
BLAST分析的软件是可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for
Biotechnology Information)公开获得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W
的短字串来鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字串在与数据库序列中相同长度的字串
比对时，或者是匹配的，或者是满足某个正值的阈值分数T。以这些初始的相邻字串命中作
为起始点，找出包含它们的更长的HSP。这些字串命中在两个方向上沿两个相比较的序列中
的每一序列扩展，直到累积的比对分数不能再增加为止。当出现以下情况时，字串命中的扩
展将停止：累积比对得分从最大实现值下降了数量X；累积得分变为0或者0以下；或到达任
一序列的末端。BLAST算法的参数W、T、和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长
(W)11、BLOSUM62计分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:
10915[1992])比对值(B)50、期望值(E)10、M’5、N’-4和两链均比较，作为默认值。
列信息，可以确定多核苷酸或多肽序列共享的同一性百分比。适于确定序列相似性的算法
的例子为BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410[1990])。用于进行
BLAST分析的软件是可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for
Biotechnology Information)公开获得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W
的短字串来鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字串在与数据库序列中相同长度的字串
比对时，或者是匹配的，或者是满足某个正值的阈值分数T。以这些初始的相邻字串命中作
为起始点，找出包含它们的更长的HSP。这些字串命中在两个方向上沿两个相比较的序列中
的每一序列扩展，直到累积的比对分数不能再增加为止。当出现以下情况时，字串命中的扩
展将停止：累积比对得分从最大实现值下降了数量X；累积得分变为0或者0以下；或到达任
一序列的末端。BLAST算法的参数W、T、和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长
(W)11、BLOSUM62计分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:
10915[1992])比对值(B)50、期望值(E)10、M’5、N’-4和两链均比较，作为默认值。
[0083] 然后BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，出处同上)。BLAST算法提供的一种相似度的量度是最小和概率(P(N))，其提供了
两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然地发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸和本
发明丝氨酸蛋白酶核酸的比较中，最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于
约0.001，则认为该测试核酸类似于本发明的丝氨酸蛋白酶核酸。在测试核酸编码丝氨酸蛋
白酶多肽的情况下，如果比较得出最小和概率小于约0.5，并且更优选小于约0.2，则认为该
测试核酸类似于指定的丝氨酸蛋白酶核酸。
两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然地发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸和本
发明丝氨酸蛋白酶核酸的比较中，最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于
约0.001，则认为该测试核酸类似于本发明的丝氨酸蛋白酶核酸。在测试核酸编码丝氨酸蛋
白酶多肽的情况下，如果比较得出最小和概率小于约0.5，并且更优选小于约0.2，则认为该
测试核酸类似于指定的丝氨酸蛋白酶核酸。
[0084] 在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，“同一”或“同一性”百分比是指对序列进行比较并比对以实现最大相似度时，使用序列比较算法或通过目测进行确定，这两个
或更多个序列相同，或者具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基。受试氨基酸序列
与参考(即，查询)氨基酸序列的“序列同一性百分比”或“同一性％”或“序列同一性％”或
“氨基酸序列同一性％”是指，将受试氨基酸序列与查询氨基酸序列最佳比对时，在比较长
度上这两个序列有指定百分比是相同的(即，在逐个比较氨基酸的基础上)。因此，对于两个
氨基酸序列来说，80％的氨基酸序列同一性或80％的同一性是指在两个最佳比对的氨基酸
序列中，有80％的氨基酸残基是相同的。
或更多个序列相同，或者具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基。受试氨基酸序列
与参考(即，查询)氨基酸序列的“序列同一性百分比”或“同一性％”或“序列同一性％”或
“氨基酸序列同一性％”是指，将受试氨基酸序列与查询氨基酸序列最佳比对时，在比较长
度上这两个序列有指定百分比是相同的(即，在逐个比较氨基酸的基础上)。因此，对于两个
氨基酸序列来说，80％的氨基酸序列同一性或80％的同一性是指在两个最佳比对的氨基酸
序列中，有80％的氨基酸残基是相同的。
[0085] 受试核酸序列与参考(即，查询)核酸序列的“序列同一性百分比”或“同一性％”或“序列同一性％”或“核苷酸序列同一性％”是指，将受试核酸序列与查询序列最佳比对时，
在比较长度上这两个序列有指定的百分比是相同的(即，在逐个比较多核苷酸序列的核苷
酸的基础上)。因此，对于两个核酸序列来说，80％的核苷酸序列同一性或80％的同一性是
指在两个最佳比对的核酸序列中，有80％的核苷酸残基是相同的。
在比较长度上这两个序列有指定的百分比是相同的(即，在逐个比较多核苷酸序列的核苷
酸的基础上)。因此，对于两个核酸序列来说，80％的核苷酸序列同一性或80％的同一性是
指在两个最佳比对的核酸序列中，有80％的核苷酸残基是相同的。
[0086] 受试蛋白质序列与参考(即，查询)蛋白质序列的“序列同一性百分比”或“同一性％”或“序列同一性％”或“蛋白质序列同一性％”是指，将受试蛋白质序列与查询序列最
佳比对时，在比较长度上这两个序列有指定的百分比是相同的(即，在逐个比较多肽序列的
残基的基础上)。因此，对于两个多肽序列来说，80％的蛋白质序列同一性或80％的同一性
是指在两个最佳比对的蛋白质序列中，有80％的残基是相同的。
佳比对时，在比较长度上这两个序列有指定的百分比是相同的(即，在逐个比较多肽序列的
残基的基础上)。因此，对于两个多肽序列来说，80％的蛋白质序列同一性或80％的同一性
是指在两个最佳比对的蛋白质序列中，有80％的残基是相同的。
[0087] 在一些实施方案中，可通过最佳比对受试序列与查询序列，并且在比较长度上比较这两个最佳比对的序列，来计算这两个序列的“序列同一性百分比”或“序列同一性％”或
“同一性％”。确定最佳比对中两个序列出现相同残基的位置数目，从而得到匹配位置数目，
然后将匹配位置数目除以比较长度中的位置总数(除非另有规定，否则比较长度是指查询
序列的长度)。将所得的数字乘以100，得到受试序列与查询序列的序列同一性百分比。
“同一性％”。确定最佳比对中两个序列出现相同残基的位置数目，从而得到匹配位置数目，
然后将匹配位置数目除以比较长度中的位置总数(除非另有规定，否则比较长度是指查询
序列的长度)。将所得的数字乘以100，得到受试序列与查询序列的序列同一性百分比。
[0088] “最佳比对”或“最佳比对的”是指两个(或更多个)序列得到最高同一性百分比得分的比对。例如，可通过手动比对两个蛋白质序列使得每个序列中最大数目的相同氨基酸
残基对齐在一起，或通过使用本文所述的或本领域已知的软件程序或方法，实现这两个序
列的最佳比对。可通过手动比对两个核酸序列使得每个序列中最大数目的相同核苷酸残基
对齐在一起，或通过使用本文所述的或本领域已知的软件程序或方法，实现这两个核酸序
列的最佳比对。
残基对齐在一起，或通过使用本文所述的或本领域已知的软件程序或方法，实现这两个序
列的最佳比对。可通过手动比对两个核酸序列使得每个序列中最大数目的相同核苷酸残基
对齐在一起，或通过使用本文所述的或本领域已知的软件程序或方法，实现这两个核酸序
列的最佳比对。
[0089] 在一些实施方案中，当使用定义的参数，诸如定义的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分来比对两个多肽序列以达到这对序列可能的最
高相似度得分时，则视为将这两个序列进行了“最佳比对”。BLOSUM62计分矩阵(参见
Henikoff和Henikoff，出处同上)常被用作多肽序列比对算法(如，BLASTP)中的默认计分置
换矩阵。对于在比对序列之一中引入的单氨基酸空位，施加空位存在罚分；而对于该空位中
的每个残基位置，施加空位延伸罚分。采用的示例性比对参数为：BLOSUM62计分矩阵，空位
存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。通过每个序列中开始和结束比对的氨基酸位置(例如比
对窗口)，以及任选地通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位以实现尽可能高
的相似度分数，而确定比对分数。
高相似度得分时，则视为将这两个序列进行了“最佳比对”。BLOSUM62计分矩阵(参见
Henikoff和Henikoff，出处同上)常被用作多肽序列比对算法(如，BLASTP)中的默认计分置
换矩阵。对于在比对序列之一中引入的单氨基酸空位，施加空位存在罚分；而对于该空位中
的每个残基位置，施加空位延伸罚分。采用的示例性比对参数为：BLOSUM62计分矩阵，空位
存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。通过每个序列中开始和结束比对的氨基酸位置(例如比
对窗口)，以及任选地通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位以实现尽可能高
的相似度分数，而确定比对分数。
[0090] 两个或更多个序列之间的最佳比对可通过目测观察手动确定或使用计算机确定，例如但不限于诸如用于氨基酸序列的BLASTP程序和用于核酸序列的BLASTN程序(参见例
如，Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402(1997)；另请参阅，美国国家生
物技术信息中心(NCBI)网站)。
如，Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402(1997)；另请参阅，美国国家生
物技术信息中心(NCBI)网站)。
[0091] 如果所关注多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至
少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性
的氨基酸序列，那么可认为所关注多肽与参考多肽“基本上相似”。两个这种多肽之间的同
一性百分比可通过观察最佳比对的这两个多肽序列手动确定，或者使用标准参数通过软件
程序或算法来确定(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)。表明两个多肽基本上相同的一个指示是
第一多肽与第二多肽在免疫学上是可交叉反应的。通常情况下，差异在于保守氨基酸置换
的多肽在免疫学上是可交叉反应的。因此，例如当一个多肽与另一个多肽仅存在保守氨基
酸置换的差异或一个或多个保守氨基酸置换的差异，则这两个多肽是基本上相同的。
少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性
的氨基酸序列，那么可认为所关注多肽与参考多肽“基本上相似”。两个这种多肽之间的同
一性百分比可通过观察最佳比对的这两个多肽序列手动确定，或者使用标准参数通过软件
程序或算法来确定(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)。表明两个多肽基本上相同的一个指示是
第一多肽与第二多肽在免疫学上是可交叉反应的。通常情况下，差异在于保守氨基酸置换
的多肽在免疫学上是可交叉反应的。因此，例如当一个多肽与另一个多肽仅存在保守氨基
酸置换的差异或一个或多个保守氨基酸置换的差异，则这两个多肽是基本上相同的。
[0092] 如果所关注核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至
少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一
性的核苷酸序列，那么可认为所关注核酸与参考核酸“基本上相似”。两个这样的核酸之间
的同一性百分比可通过观察最佳比对的这两个核酸序列手动确定，或者使用标准参数通过
软件程序或算法来确定(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)。表明两个核酸序列基本相同的一个
指示是两个核酸分子可在严格条件(例如，在中等严格至高等严格的范围内)下彼此杂交。
少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一
性的核苷酸序列，那么可认为所关注核酸与参考核酸“基本上相似”。两个这样的核酸之间
的同一性百分比可通过观察最佳比对的这两个核酸序列手动确定，或者使用标准参数通过
软件程序或算法来确定(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)。表明两个核酸序列基本相同的一个
指示是两个核酸分子可在严格条件(例如，在中等严格至高等严格的范围内)下彼此杂交。
[0093] 当核酸或多核苷酸部分或完全地与其它组分分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”，所述其它组分包括但不限于例如其它蛋白质、核酸、细胞等。相似地，当多肽、蛋白质或
肽部分或完全地与其它组分分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”，所述其它组分包括但
不限于例如其它蛋白质、核酸、细胞等。以摩尔计，在组合物中分离的物质比其它物质的丰
度更高。例如，分离的物质可占存在的所有大分子物质的至少约50％、至少约70％、至少约
80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约
95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(以摩尔计)。优选地，将
所关注物质纯化至基本上同质(即，通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物质)。
可使用本领域熟知的多种技术测定纯度和同质性，例如蛋白质或核酸样品的琼脂糖凝胶电
泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色进行可视化。如果需要，可利用高分辨率技术，例
如高效液相色谱(HPLC)或类似手段，进行材料的纯化。
肽部分或完全地与其它组分分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”，所述其它组分包括但
不限于例如其它蛋白质、核酸、细胞等。以摩尔计，在组合物中分离的物质比其它物质的丰
度更高。例如，分离的物质可占存在的所有大分子物质的至少约50％、至少约70％、至少约
80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约
95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(以摩尔计)。优选地，将
所关注物质纯化至基本上同质(即，通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物质)。
可使用本领域熟知的多种技术测定纯度和同质性，例如蛋白质或核酸样品的琼脂糖凝胶电
泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色进行可视化。如果需要，可利用高分辨率技术，例
如高效液相色谱(HPLC)或类似手段，进行材料的纯化。
[0094] 用于核酸或多肽的术语“纯化的”通常指，通过本领域熟知的分析技术测得核酸或多肽基本上不含其它组分(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或密
度梯度离心的介质中形成独立的条带)。例如，在电泳凝胶中基本上形成一个条带的核酸或
多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常至少约75％、约80％、约85％、
约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约
99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在一个相
关的意义上，本发明提供了使组合物富集本发明的一个或多个分子(例如本发明的一个或
多个多肽或多核苷酸)的方法。当在施用纯化或富集技术后分子浓度有实质上增加时，则组
合物富集了该分子。基本上纯的本发明多肽或多核苷酸(例如，基本上纯的本发明变体蛋白
酶或编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中全部大分子物质的至少约
55重量％、约60重量％、约70重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约91重量％、约
92重量％、约93重量％、约94重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％、约
99重量％、约99.5重量％或更多(以摩尔计)。
度梯度离心的介质中形成独立的条带)。例如，在电泳凝胶中基本上形成一个条带的核酸或
多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常至少约75％、约80％、约85％、
约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约
99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在一个相
关的意义上，本发明提供了使组合物富集本发明的一个或多个分子(例如本发明的一个或
多个多肽或多核苷酸)的方法。当在施用纯化或富集技术后分子浓度有实质上增加时，则组
合物富集了该分子。基本上纯的本发明多肽或多核苷酸(例如，基本上纯的本发明变体蛋白
酶或编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中全部大分子物质的至少约
55重量％、约60重量％、约70重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约91重量％、约
92重量％、约93重量％、约94重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％、约
99重量％、约99.5重量％或更多(以摩尔计)。
[0095] 在一个相关的意义上，本发明提供了使组合物富集本发明的一种或多种分子的方法，例如，一种或多种本发明的多肽(如，一种或多种本发明的变体蛋白酶)或者一种或多种
本发明的核酸(如，编码一种或多种本发明变体蛋白酶的一种或多种核酸)。当施用纯化或
富集技术后分子浓度有实质上增加时，则组合物富集了该分子。基本上纯的多肽或多核苷
酸通常将占特定组合物中全部大分子物质的至少约55重量％、约60重量％、约70重量％、约
80重量％、约85重量％、约90重量％、约91重量％、约92重量％、约93重量％、约94重量％、约
95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％、约99重量％、约99.5重量％或更多(以摩
尔计)。
本发明的核酸(如，编码一种或多种本发明变体蛋白酶的一种或多种核酸)。当施用纯化或
富集技术后分子浓度有实质上增加时，则组合物富集了该分子。基本上纯的多肽或多核苷
酸通常将占特定组合物中全部大分子物质的至少约55重量％、约60重量％、约70重量％、约
80重量％、约85重量％、约90重量％、约91重量％、约92重量％、约93重量％、约94重量％、约
95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％、约99重量％、约99.5重量％或更多(以摩
尔计)。
[0096] 如本文所用，术语“组合诱变”或“组合”是指生成参考核酸序列的核酸变体文库的方法。在这些文库中，变体包含选自一组预定突变的一个或几个突变。该方法还可以提供引
入不属于该组预定突变成员的随机突变的手段。一些这样的方法包括美国专利6,582,914
中所示的那些，该专利据此以引用方式并入本文。一些这样的组合诱变方法包括和/或涵盖
通过市售试剂盒(例如， 多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)、PCR融
合/延伸PCR)实现的方法。
入不属于该组预定突变成员的随机突变的手段。一些这样的方法包括美国专利6,582,914
中所示的那些，该专利据此以引用方式并入本文。一些这样的组合诱变方法包括和/或涵盖
通过市售试剂盒(例如， 多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)、PCR融
合/延伸PCR)实现的方法。
[0097] 如本文所用，与变体蛋白酶结合使用的“具有改善的性质”是指相对于对应的参考蛋白酶(例如，野生型或天然存在的蛋白酶)，变体蛋白酶具有改善的或增强的洗涤或清洁
性能、和/或改善的或增强的稳定性(任选地保持的洗涤或清洁性能)。变体蛋白酶的改善的
性质可包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施方案中，本发明提供了
本发明的变体蛋白酶，相对于参考蛋白酶(例如，野生型蛋白酶，如野生型LG12)，该变体蛋
白酶具有以下性质中的一种或多种：改善的手洗性能、改善的手动或手工盘碟洗涤性能、改
善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能和/或改善的稳定性。
性能、和/或改善的或增强的稳定性(任选地保持的洗涤或清洁性能)。变体蛋白酶的改善的
性质可包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施方案中，本发明提供了
本发明的变体蛋白酶，相对于参考蛋白酶(例如，野生型蛋白酶，如野生型LG12)，该变体蛋
白酶具有以下性质中的一种或多种：改善的手洗性能、改善的手动或手工盘碟洗涤性能、改
善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能和/或改善的稳定性。
[0098] 如本文所用，术语“功能性测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施方案中，该术语指测定系统，其中可分析蛋白质发挥其常规功能的能力。例如，对于酶而言，
功能性测定包括测定酶在催化反应中的效力。
功能性测定包括测定酶在催化反应中的效力。
[0099] 如本文所用，术语“目标性质”是指将要改变的起始基因的性质。不旨在将本发明限制于任何特定目标性质。然而，在一些实施方案中，目标性质是基因产物的稳定性(例如，
对变性、蛋白水解或其它降解因素的耐受性)，而在其它实施方案中，改变生产宿主中的生
产水平。
对变性、蛋白水解或其它降解因素的耐受性)，而在其它实施方案中，改变生产宿主中的生
产水平。
[0100] 如本文所用，在核酸的上下文中，术语“性质”或其语法同义词是指任何可被选择或检测的核酸的特征或属性。这些性质包括但不限于，影响与多肽结合的性质、对包含特定
核酸的细胞赋予的性质、影响基因转录(例如，启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强
子功能)的性质、影响RNA加工(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)的性质、
影响翻译(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)的性质。例如，可改变
核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以得到期望特征或识别不期望的特征。
核酸的细胞赋予的性质、影响基因转录(例如，启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强
子功能)的性质、影响RNA加工(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)的性质、
影响翻译(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)的性质。例如，可改变
核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以得到期望特征或识别不期望的特征。
[0101] 如本文所用，在多肽(包括蛋白质)的上下文中，术语“性质”或其语法同义词是指任何可被选择或检测的多肽的特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异
性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性分布、对蛋白水解降解的耐受性、KM、
kcat、kcat/kM比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合至配体的能力、结合至受体的能力、被分
泌的能力、被展示于细胞表面的能力、低聚能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞
增殖的能力、诱导凋亡的能力、以磷酸化或糖基化方式修饰的能力，和/或治疗疾病的能力
等。
性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性分布、对蛋白水解降解的耐受性、KM、
kcat、kcat/kM比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合至配体的能力、结合至受体的能力、被分
泌的能力、被展示于细胞表面的能力、低聚能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞
增殖的能力、诱导凋亡的能力、以磷酸化或糖基化方式修饰的能力，和/或治疗疾病的能力
等。
[0102] 如本文所用，术语“筛选”具有其在本领域的通常含义。在一个示例性筛选过程中，提供突变核酸或由其编码的变体多肽，并评估或确定突变核酸或变体多肽的性质。可将确
定的突变核酸或变体多肽的性质分别与对应的前体(亲本)核酸的性质或对应的亲本多肽
的性质进行比较。
定的突变核酸或变体多肽的性质分别与对应的前体(亲本)核酸的性质或对应的亲本多肽
的性质进行比较。
[0103] 对于本领域技术人员将显而易见的是，获得具有改变的性质的核酸或蛋白质的筛选方法取决于起始材料的性质，其中突变核酸的产生旨在利于该性质的修饰。因此，本领域
技术人员将理解，本发明不限于进行筛选的任何特定性质，以下关于性质的描述仅列出例
示性的例子。通常在本领域中描述有用于筛选任何特定性质的方法。例如，可测量突变前后
的结合、pH、特异性等，其中变化表明发生了改变。优选地，筛选是以高通量方式进行的，包
括多个样品同时筛选，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示以及多种底物和/或指示剂的测
定法。
技术人员将理解，本发明不限于进行筛选的任何特定性质，以下关于性质的描述仅列出例
示性的例子。通常在本领域中描述有用于筛选任何特定性质的方法。例如，可测量突变前后
的结合、pH、特异性等，其中变化表明发生了改变。优选地，筛选是以高通量方式进行的，包
括多个样品同时筛选，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示以及多种底物和/或指示剂的测
定法。
[0104] 如本文所用，在一些实施方案中，筛选过程包括一个或多个选择步骤，其中从一组变体中富集所关注变体。这些实施方案的例子包括对赋予宿主生物体生长优势的变体的选
择，以及噬菌体展示或任何其它展示方法，其中可根据其结合或催化性质，从一组变体中捕
获到变体。在一些实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(例如热、变性等)，随后通过筛选识
别仍然完好无损的变体，或通过选择富集仍然完好无损的变体。该术语旨在涵盖用于选择
的任何合适手段。实际上，不旨在将本发明限制于任何特定的筛选方法。
择，以及噬菌体展示或任何其它展示方法，其中可根据其结合或催化性质，从一组变体中捕
获到变体。在一些实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(例如热、变性等)，随后通过筛选识
别仍然完好无损的变体，或通过选择富集仍然完好无损的变体。该术语旨在涵盖用于选择
的任何合适手段。实际上，不旨在将本发明限制于任何特定的筛选方法。
[0105] 术语“修饰的核酸序列”和“修饰的基因”在本文中可互换使用，是指相对于天然存在的(即，野生型)核酸序列，包含缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施方案中，修饰的
核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断)。在一些实施
方案中，截短的蛋白质保持生物活性。在另选的实施方案中，修饰的核酸序列的表达产物是
伸长的蛋白质(例如，修饰包括向核酸序列的插入)。在一些实施方案中，核酸序列中的核苷
酸插入造成截短的蛋白质(例如，当该插入导致终止密码子形成时)。因此，插入可造成截短
的蛋白质或伸长的蛋白质成为表达产物。
核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断)。在一些实施
方案中，截短的蛋白质保持生物活性。在另选的实施方案中，修饰的核酸序列的表达产物是
伸长的蛋白质(例如，修饰包括向核酸序列的插入)。在一些实施方案中，核酸序列中的核苷
酸插入造成截短的蛋白质(例如，当该插入导致终止密码子形成时)。因此，插入可造成截短
的蛋白质或伸长的蛋白质成为表达产物。
[0106] “突变”核酸序列通常是指，在宿主细胞的野生型序列中具有至少一个密码子改变的核酸序列，所述突变核酸序列的表达产物是一种与野生型蛋白质相比具有改变的氨基酸
序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能性能力(例如，增强的酶活性)。
序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能性能力(例如，增强的酶活性)。
[0107] 如本文所用，短语“底物特异性的改变”是指酶的底物特异性的改变。在一些实施方案中，底物特异性的改变被定义为由于酶突变或反应条件变化，导致对于特定底物的kcat
和/或Km发生改变。酶的底物特异性是通过比较其针对不同底物表现出的催化效率来确定
的。这些确定在评估突变酶的有效性时特别有用，因为通常期望产生对于所关注底物表现
出更高kcat/Km比率的变体酶。然而，不旨在将本发明限制于任何特定底物组成或底物特异
性。
和/或Km发生改变。酶的底物特异性是通过比较其针对不同底物表现出的催化效率来确定
的。这些确定在评估突变酶的有效性时特别有用，因为通常期望产生对于所关注底物表现
出更高kcat/Km比率的变体酶。然而，不旨在将本发明限制于任何特定底物组成或底物特异
性。
[0108] 如本文所用，“表面特性”用于指，蛋白质表面表现出的静电荷、以及性质例如疏水性和亲水性。
[0109] 如本文所用，术语“净电荷”被定义为分子中存在的所有电荷的总和。可以对亲本蛋白质分子进行“净电荷改变”，以提供具有与亲本分子不同的净电荷的变体(即，变体的净
电荷与亲本分子的净电荷不同)。例如，将中性氨基酸置换为带负电荷的氨基酸，或者将带
正电荷的氨基酸置换为中性氨基酸，会导致相对于亲本分子的-1净电荷。将带正电荷的氨
基酸置换为带负电荷的氨基酸会导致相对于亲本分子的-2净电荷。将中性氨基酸置换为带
正电荷的氨基酸，或者将带负电荷的氨基酸置换为中性氨基酸，会导致相对于亲本分子的+
1净电荷。将带负电荷的氨基酸置换为带正电荷的氨基酸会导致相对于亲本分子的+2净电
荷。还可通过缺失和/或插入带电荷的氨基酸来改变亲本蛋白质的净电荷。
电荷与亲本分子的净电荷不同)。例如，将中性氨基酸置换为带负电荷的氨基酸，或者将带
正电荷的氨基酸置换为中性氨基酸，会导致相对于亲本分子的-1净电荷。将带正电荷的氨
基酸置换为带负电荷的氨基酸会导致相对于亲本分子的-2净电荷。将中性氨基酸置换为带
正电荷的氨基酸，或者将带负电荷的氨基酸置换为中性氨基酸，会导致相对于亲本分子的+
1净电荷。将带负电荷的氨基酸置换为带正电荷的氨基酸会导致相对于亲本分子的+2净电
荷。还可通过缺失和/或插入带电荷的氨基酸来改变亲本蛋白质的净电荷。
[0110] 术语“热稳定的”和“热稳定性”是指，在被暴露于改变的温度时，蛋白酶在本发明的蛋白分解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件下暴露于指定的温度一段给定的时
间后保留特定量的酶活性。“改变的温度”包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白
酶在暴露于改变的温度一段给定的时间，例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240
分钟、约300分钟等之后，至少保留约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约
90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。
间后保留特定量的酶活性。“改变的温度”包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白
酶在暴露于改变的温度一段给定的时间，例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240
分钟、约300分钟等之后，至少保留约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约
90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。
[0111] 在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的上下文中，术语“增强的稳定性”是指随着时间推移，与其它蛋白酶(例如，LG12蛋白酶)和/或野生型酶相比，保留的蛋白水解活
性更高。
性更高。
[0112] 在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的上下文中，术语“减弱的稳定性”是指随着时间推移，与其它蛋白酶(例如，LG12蛋白酶)和/或野生型酶相比，保留的蛋白水解活
性更低。
性更低。
[0113] 术语“清洁活性”是指，在本发明的蛋白水解、水解、清洁、污垢/污渍去除或其它过程中普遍存在的条件下，由变体蛋白酶或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，
变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可通过清洁物品或表面上的一种或多种不同酶敏感
性污渍(例如，食物、草、血、墨、乳、油和/或卵蛋白产生的污渍)的各种测定方法来确定。变
体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可通过以下方法确定：将物品或表面上的污渍置于标准
洗涤条件下，通过各种色谱法、分光光度法或其它定量方法评估污渍去除程度。示例性清洁
测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于WO 99/34011和美国专利6,605,458中所述的
那些(这两篇专利以引用方式并入本文)，以及以下实施例中包括的那些清洁测定法和方
法。
变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可通过清洁物品或表面上的一种或多种不同酶敏感
性污渍(例如，食物、草、血、墨、乳、油和/或卵蛋白产生的污渍)的各种测定方法来确定。变
体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可通过以下方法确定：将物品或表面上的污渍置于标准
洗涤条件下，通过各种色谱法、分光光度法或其它定量方法评估污渍去除程度。示例性清洁
测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于WO 99/34011和美国专利6,605,458中所述的
那些(这两篇专利以引用方式并入本文)，以及以下实施例中包括的那些清洁测定法和方
法。
[0114] 术语变体蛋白酶或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指，是指在特定清洁组合物中实现所期望的酶活性水平的蛋白酶量。本领域的普通技术人员可以轻易确定这种有效量，这
种有效量取决于多种因素，例如用到的特定蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成，是
需要液体组合物还是干燥组合物(例如，粒状、片状或条状组合物)，等等。术语变体蛋白酶
或参考蛋白酶的“去污指数”(SRI)是指由特定量的酶或酶活性实现的去污程度。
种有效量取决于多种因素，例如用到的特定蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成，是
需要液体组合物还是干燥组合物(例如，粒状、片状或条状组合物)，等等。术语变体蛋白酶
或参考蛋白酶的“去污指数”(SRI)是指由特定量的酶或酶活性实现的去污程度。
[0115] 术语“清洁助剂材料”是指清洁组合物中包含的除本发明变体蛋白酶之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种清洁助剂
材料。通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如，液体、颗粒、粉末、条棒、糊剂、喷雾、片
状物、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁助剂材料。优选的是，每种清洁助剂材料都
与组合物中用到的蛋白酶相容。
材料。通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如，液体、颗粒、粉末、条棒、糊剂、喷雾、片
状物、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁助剂材料。优选的是，每种清洁助剂材料都
与组合物中用到的蛋白酶相容。
[0116] 在清洁活性的上下文中，术语“增强的性能”是指，在标准洗涤循环和/或多次洗涤循环后通过常规评价确定，酶对某些酶敏感性污渍(例如卵、乳、草、墨、油和/或血)具有增
加的或更高的清洁活性。
加的或更高的清洁活性。
[0117] 在清洁活性的上下文中，术语“减弱的性能”是指，标准洗涤循环后通过常规评价确定，酶对某些酶敏感性污渍(例如卵、乳、草或血)具有减少的或更低的清洁活性。
[0118] 清洁性能可通过以下方法确定：在各种关于酶敏感性污渍(例如草、血、墨、油和/或乳)的清洁试验中，在标准洗涤循环条件后，通过常规分光光度法或分析方法，比较本发
明的变体蛋白酶与参考蛋白酶。
明的变体蛋白酶与参考蛋白酶。
[0119] 如本文所用，术语“消费品”是指织物和家庭护理产品。如本文所用，“织物和家庭护理产品”或“织物和家用护理产品”包括通常旨在以其出售形式使用或消费的用于处理织
物、硬质表面和任何其它表面的产品、用于护理和清洁无生命表面的清洁系统、以及织物调
理剂产品和特别设计用于织物护理和维护的其它产品，以及空气护理产品，包括：空气护理
(包括空气清新剂和香味输送系统)、汽车护理、宠物护理、牲畜护理、个人护理、珠宝首饰护
理、盘碟洗涤、织物调理(包括软化和/或清新)、衣物洗涤剂、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、
预处理清洁组合物、硬质表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂和/或处理、玻璃清洁
剂和/或处理、瓷砖清洁剂和/或处理、陶瓷清洁剂和/或处理)，以及供消费者或公共场所使
用的其它清洁产品。在一些实施方案中，织物和家庭护理产品适用于伤口和/或皮肤使用。
“织物和家庭护理产品”包括消费品和公共场所产品。
物、硬质表面和任何其它表面的产品、用于护理和清洁无生命表面的清洁系统、以及织物调
理剂产品和特别设计用于织物护理和维护的其它产品，以及空气护理产品，包括：空气护理
(包括空气清新剂和香味输送系统)、汽车护理、宠物护理、牲畜护理、个人护理、珠宝首饰护
理、盘碟洗涤、织物调理(包括软化和/或清新)、衣物洗涤剂、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、
预处理清洁组合物、硬质表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂和/或处理、玻璃清洁
剂和/或处理、瓷砖清洁剂和/或处理、陶瓷清洁剂和/或处理)，以及供消费者或公共场所使
用的其它清洁产品。在一些实施方案中，织物和家庭护理产品适用于伤口和/或皮肤使用。
“织物和家庭护理产品”包括消费品和公共场所产品。
[0120] 如本文所用，术语“非织物和家庭护理产品”是指添加到其它组合物中以生产最终产品(可为织物和家庭护理产品)的组合物。
[0121] 如本文所用，术语“公共场所清洁组合物”是指适用于公共场所的产品，所述公共场所包括但不限于学校、医院、工厂、商店、企业、建筑、餐馆、办公大楼和建筑、加工和/或制
造工厂、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等。
造工厂、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等。
[0122] 如本文所用，术语“清洁和/或处理组合物”是织物和家庭护理产品的一个子集，除非另有说明，否则清洁和/或处理组合物包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。该产品
包括但不限于，用于处理织物、硬质表面以及织物和家庭护理范围内的任何其它表面的产
品，包括：空气护理(包括空气清新剂和香味输送系统)、汽车护理、盘碟洗涤、织物调理(包
括软化和/或清新)、衣物洗涤剂、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理
(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒状或粉末型的通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤
剂；液体、凝胶或糊剂型通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤
剂；手动盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是那些高发泡型；机洗盘碟洗涤剂，包括供
家庭和公共场所使用的各种片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；汽车或地毯香波、浴室清洁
剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁助剂(例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型)、负载基
质的(substrate-laden)产品如添加的干衣机布(dryer added sheets)。
包括但不限于，用于处理织物、硬质表面以及织物和家庭护理范围内的任何其它表面的产
品，包括：空气护理(包括空气清新剂和香味输送系统)、汽车护理、盘碟洗涤、织物调理(包
括软化和/或清新)、衣物洗涤剂、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理
(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒状或粉末型的通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤
剂；液体、凝胶或糊剂型通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤
剂；手动盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是那些高发泡型；机洗盘碟洗涤剂，包括供
家庭和公共场所使用的各种片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；汽车或地毯香波、浴室清洁
剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁助剂(例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型)、负载基
质的(substrate-laden)产品如添加的干衣机布(dryer added sheets)。
[0123] 事实上，如本文所用，本发明的“清洁组合物”或“清洁制剂”是指可用于从待清洁的物体、物品或表面除去或消除化合物(例如，不期望的化合物)的任何本发明组合物，所述
物体、物品或表面包括但不限于例如织物、织物物品、盘碟物品、餐具物品、玻璃器皿物品、
隐形眼镜、其它固体基底、毛发(香波)(包括人类或动物毛发)、皮肤(肥皂或面霜)、牙齿(漱
口水、牙膏)、物品或物体的表面(例如，硬质表面，诸如桌子、台面、墙壁、家具物品、地板、天
花板、非盘碟物品、非餐具物品的硬质表面等)、过滤器、膜(例如，过滤膜，包括但不限于超
滤膜)等。只要组合物与组合物中使用的蛋白酶和其它酶相容，该术语涵盖可以选择用于所
需特定清洁组合物类型和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒、喷雾或其它组合物)的任何材
料和/或添加的化合物。通过考虑待清洁表面、物体、物品或织物以及使用期间用于清洁条
件的所需组合物形式，将可以容易地对清洁组合物材料进行具体选择。
物体、物品或表面包括但不限于例如织物、织物物品、盘碟物品、餐具物品、玻璃器皿物品、
隐形眼镜、其它固体基底、毛发(香波)(包括人类或动物毛发)、皮肤(肥皂或面霜)、牙齿(漱
口水、牙膏)、物品或物体的表面(例如，硬质表面，诸如桌子、台面、墙壁、家具物品、地板、天
花板、非盘碟物品、非餐具物品的硬质表面等)、过滤器、膜(例如，过滤膜，包括但不限于超
滤膜)等。只要组合物与组合物中使用的蛋白酶和其它酶相容，该术语涵盖可以选择用于所
需特定清洁组合物类型和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒、喷雾或其它组合物)的任何材
料和/或添加的化合物。通过考虑待清洁表面、物体、物品或织物以及使用期间用于清洁条
件的所需组合物形式，将可以容易地对清洁组合物材料进行具体选择。
[0124] 清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如：液体和/或固体组合物，
包括清洁或洗涤剂组合物(例如，液体、片剂、凝胶、条、颗粒和/或固体衣物清洁或洗涤剂组
合物及精细织物洗涤剂组合物)；硬质表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和
金属台面与窗户；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物增
效剂清洁或洗涤剂组合物、衣物添加剂清洁组合物和衣物预去斑剂清洁组合物；盘碟洗涤
组合物，包括手动或手工盘碟洗涤组合物(例如，“手动”或“手工”盘碟洗涤剂)和自动盘碟
洗涤组合物(例如，“自动盘碟洗涤剂”)。
包括清洁或洗涤剂组合物(例如，液体、片剂、凝胶、条、颗粒和/或固体衣物清洁或洗涤剂组
合物及精细织物洗涤剂组合物)；硬质表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和
金属台面与窗户；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物增
效剂清洁或洗涤剂组合物、衣物添加剂清洁组合物和衣物预去斑剂清洁组合物；盘碟洗涤
组合物，包括手动或手工盘碟洗涤组合物(例如，“手动”或“手工”盘碟洗涤剂)和自动盘碟
洗涤组合物(例如，“自动盘碟洗涤剂”)。
[0125] 除非另外指明，否则如本文所用的清洁组合物或清洁制剂包括：颗粒状或粉末型通用型或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒状、凝胶、固体、片剂、或糊剂型通用
型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体(HDL)洗涤剂或重垢型粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精
细织物洗涤剂；手动或手工盘碟洗涤剂，包括那些高发泡型；手动或手工盘碟洗涤、自动盘
碟洗涤、或者盘碟或餐具洗涤剂，包括供家庭和公共场所使用的多种片剂、粉末、固体、颗粒
状、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手类型、清洁条、漱口水、假
牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂；人和其它动物的洗发香波和/或毛发清洗剂；
沐浴露和泡沫浴剂和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类
型。在一些实施方案中，颗粒状组合物为“密实”形式(compact form)；在一些实施方案中，
液体组合物为“浓缩”形式。
型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体(HDL)洗涤剂或重垢型粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精
细织物洗涤剂；手动或手工盘碟洗涤剂，包括那些高发泡型；手动或手工盘碟洗涤、自动盘
碟洗涤、或者盘碟或餐具洗涤剂，包括供家庭和公共场所使用的多种片剂、粉末、固体、颗粒
状、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手类型、清洁条、漱口水、假
牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂；人和其它动物的洗发香波和/或毛发清洗剂；
沐浴露和泡沫浴剂和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类
型。在一些实施方案中，颗粒状组合物为“密实”形式(compact form)；在一些实施方案中，
液体组合物为“浓缩”形式。
[0126] 如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗衣物洗涤剂组合物和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于脏污织物(例如，衣物、亚麻和其它纺织材料)浸泡
和/或预处理的组合物。
和/或预处理的组合物。
[0128] 如本文所用，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的一个子集，除非另外说明，其包括颗粒状或粉末型通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清
洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂型通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织
物洗涤剂；手动盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是那些高发泡类型；机洗盘碟洗涤
剂，包括供家庭和公共场所使用的各种片剂、颗粒剂、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和
消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调理产品(包括软化和/或
清新，可为液体、固体和/或干衣机布形式)；以及清洁助剂(例如，漂白添加剂和“去污棒”或
预处理类型)、负载基质的(substrate-laden)产品如添加的干衣机布。适用的所有此类产
品可为标准形式、浓缩形式或甚至高度浓缩形式，甚至到此类产品在某方面可能为非水性
的程度。
洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂型通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织
物洗涤剂；手动盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是那些高发泡类型；机洗盘碟洗涤
剂，包括供家庭和公共场所使用的各种片剂、颗粒剂、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和
消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调理产品(包括软化和/或
清新，可为液体、固体和/或干衣机布形式)；以及清洁助剂(例如，漂白添加剂和“去污棒”或
预处理类型)、负载基质的(substrate-laden)产品如添加的干衣机布。适用的所有此类产
品可为标准形式、浓缩形式或甚至高度浓缩形式，甚至到此类产品在某方面可能为非水性
的程度。
[0129] 如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的
此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施方案中，本发明的
洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，此外还包括一种或多种表面活性剂、转移酶、水
解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如，助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块
抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷
酸盐的混合物，优选地硅酸盐(例如，偏硅酸钠)比磷酸盐(例如，三聚磷酸钠)多。一些本发
明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(例如，磷酸盐
或磷酸盐助洗剂)。
此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施方案中，本发明的
洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，此外还包括一种或多种表面活性剂、转移酶、水
解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如，助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块
抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷
酸盐的混合物，优选地硅酸盐(例如，偏硅酸钠)比磷酸盐(例如，三聚磷酸钠)多。一些本发
明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(例如，磷酸盐
或磷酸盐助洗剂)。
[0130] 如本文所用，术语“漂白”是指在足够长的一段时间内和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如，织物、衣物、纸浆等)或表面，以实现该材料的增亮(即，增白)和/或
清洁。适用于漂白的化学品的示例包括但不限于(例如)ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
清洁。适用于漂白的化学品的示例包括但不限于(例如)ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
[0131] 如本文所用，蛋白酶(例如，本发明的变体蛋白酶)的“洗涤性能”是指变体蛋白酶对洗涤的贡献，与未向组合物添加变体蛋白酶的洗涤剂相比，这种贡献赋予洗涤剂额外的
清洁性能。洗涤性能是在相关洗涤条件下比较的。在一些测试系统中，可以控制其他相关因
素(例如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)，以模拟某些细分市
场中家居应用(例如，手动或手工盘碟洗涤、自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁
等)的典型条件。
清洁性能。洗涤性能是在相关洗涤条件下比较的。在一些测试系统中，可以控制其他相关因
素(例如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)，以模拟某些细分市
场中家居应用(例如，手动或手工盘碟洗涤、自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁
等)的典型条件。
[0132] 本文所用的术语“相关洗涤条件”表示在手动盘碟洗涤、自动盘碟洗涤或洗衣洗涤剂细分市场中实际用于家庭的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类
型和水硬度。
型和水硬度。
[0133] 术语“改善的洗涤性能”用于表示，在相关洗涤条件下获得了更好的最终去污结果，或者与对应的野生型或起始亲本蛋白酶相比，要获得相同的最终结果，需要更少的变体
蛋白酶(以重量计)。
蛋白酶(以重量计)。
[0134] 如本文所用，术语“消毒”是指从表面去除污染物，以及抑制或杀死物品表面的微生物。不旨在将本发明限制于任何特定表面、物品或者待除去的污染物或微生物。
[0135] 本文的清洁组合物的“密实”(compact)形式由密度以及就组成来说由无机填料盐的量最佳地反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组
合物中，填料盐大量存在，通常占总组合物重量的约17％至约35％。相比而言，在密实组合
物中，填料盐以不超过总组合物约15％的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过组合
物重量约10％、更优选不超过组合物重量约5％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐
选自硫酸和氯化物的碱金属盐和碱土金属盐。在一些实施方案中，填料盐为硫酸钠。
合物中，填料盐大量存在，通常占总组合物重量的约17％至约35％。相比而言，在密实组合
物中，填料盐以不超过总组合物约15％的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过组合
物重量约10％、更优选不超过组合物重量约5％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐
选自硫酸和氯化物的碱金属盐和碱土金属盐。在一些实施方案中，填料盐为硫酸钠。
[0136] 本文通常使用SEQ ID NO:3所示的LG12sprC氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置编号对给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置进行编号。因此，SEQ ID NO:3所示的LG12sprC
氨基酸序列用作参考序列。可使用本文所述的比对算法，将给定氨基酸序列(例如本文所述
的变体蛋白酶氨基酸序列)与LG12sprC序列(SEQ ID NO:3)比对，可参照LG12sprC序列中对
应的氨基酸残基，方便地对给定氨基酸序列中与LG12sprC序列的氨基酸残基对齐(优选地
最佳比对)的氨基酸残基进行编号。
氨基酸序列用作参考序列。可使用本文所述的比对算法，将给定氨基酸序列(例如本文所述
的变体蛋白酶氨基酸序列)与LG12sprC序列(SEQ ID NO:3)比对，可参照LG12sprC序列中对
应的氨基酸残基，方便地对给定氨基酸序列中与LG12sprC序列的氨基酸残基对齐(优选地
最佳比对)的氨基酸残基进行编号。
[0137] 通常，本文使用的命名法和下述许多细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学的实验室操作方法是本领域普通技术人员熟知且通常使用的。制备和操纵
重组核酸的方法、核酸合成、细胞培养方法和转基因掺入(例如，转染、电穿孔)的方法是本
领域技术人员已知的，并在许多标准教科书中有所描述。通常根据说明书进行寡核苷酸的
合成和纯化步骤。技术和操作通常根据本领域熟知的常规方法以及本文档通篇提供的各种
一般参考文献进行。其中的操作是本领域普通技术人员所熟知的，在此处提供以方便读者。
重组核酸的方法、核酸合成、细胞培养方法和转基因掺入(例如，转染、电穿孔)的方法是本
领域技术人员已知的，并在许多标准教科书中有所描述。通常根据说明书进行寡核苷酸的
合成和纯化步骤。技术和操作通常根据本领域熟知的常规方法以及本文档通篇提供的各种
一般参考文献进行。其中的操作是本领域普通技术人员所熟知的，在此处提供以方便读者。
[0138] 本发明的LG12-进化枝酶
[0139] 如本文所用，LG12-进化枝酶包括具有蛋白水解活性的酶、多肽或蛋白质，或者其活性片段。这包括LG12-进化枝的成员，见实施例所述，示于图9A、图9B、图10A、图10B的比对
和/或图8的系统发育树。通过以下方法鉴定了LG12-进化枝成员：选择与LG12sprC具有紧密
同源性的枯草杆菌蛋白酶分子，生成这些序列与其它枯草杆菌蛋白酶的基于结构的比对，
并识别对所有LG12-进化枝酶而言保守的独特序列区域。在一些实施方案中，LG12酶进化枝
包括枯草杆菌蛋白酶，其中亲本、野生型和/或变体序列含有以下氨基酸基序中的一个或多
个：含有Ser221,His64和Asp32的催化三联体；第55位至第58位的Pro,Asp/Asn,Ala,Leu基
序；Thr103-Leu104基序；Tyr86-Asn/Asp87基序；Ala16-His17基序；Val21-Thr22基序；和/
或C端的起始于第267位的基序：Val,Ile,Asp/Asn,Val/Leu,Glu,X,Ala,Leu,Gln，其中X表
示任何氨基酸，并且其中残基编号与LG12sprC(SEQ ID NO:3)对应。任何野生型LG12酶进化
枝序列均可用作亲本序列，用于生成本发明的变体枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，
LG12酶进化枝枯草杆菌蛋白酶可具有任何一个或多个特征基序(signature sequence)，如
上所述。LG12-进化枝的成员被证实在使用邻接法(Saitou,N.和Nei,M.(1987)
MolBiol.Evol.4:406-425)创建的系统发育树中聚类到相同分支点处。LG12-进化枝的序列
同一性包括与LG12sprC序列(SEQ ID NO:3)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的酶。LG12-进化
枝的成员包括：LG12sprC(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E
(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB
(BAD21128.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_
07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)菌株DSM 8719,Bhon03321(SEQ ID
NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽
孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、芽
孢杆菌属BAD21128(SEQ ID NO:20)。
和/或图8的系统发育树。通过以下方法鉴定了LG12-进化枝成员：选择与LG12sprC具有紧密
同源性的枯草杆菌蛋白酶分子，生成这些序列与其它枯草杆菌蛋白酶的基于结构的比对，
并识别对所有LG12-进化枝酶而言保守的独特序列区域。在一些实施方案中，LG12酶进化枝
包括枯草杆菌蛋白酶，其中亲本、野生型和/或变体序列含有以下氨基酸基序中的一个或多
个：含有Ser221,His64和Asp32的催化三联体；第55位至第58位的Pro,Asp/Asn,Ala,Leu基
序；Thr103-Leu104基序；Tyr86-Asn/Asp87基序；Ala16-His17基序；Val21-Thr22基序；和/
或C端的起始于第267位的基序：Val,Ile,Asp/Asn,Val/Leu,Glu,X,Ala,Leu,Gln，其中X表
示任何氨基酸，并且其中残基编号与LG12sprC(SEQ ID NO:3)对应。任何野生型LG12酶进化
枝序列均可用作亲本序列，用于生成本发明的变体枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，
LG12酶进化枝枯草杆菌蛋白酶可具有任何一个或多个特征基序(signature sequence)，如
上所述。LG12-进化枝的成员被证实在使用邻接法(Saitou,N.和Nei,M.(1987)
MolBiol.Evol.4:406-425)创建的系统发育树中聚类到相同分支点处。LG12-进化枝的序列
同一性包括与LG12sprC序列(SEQ ID NO:3)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的酶。LG12-进化
枝的成员包括：LG12sprC(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E
(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB
(BAD21128.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_
07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)菌株DSM 8719,Bhon03321(SEQ ID
NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽
孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、芽
孢杆菌属BAD21128(SEQ ID NO:20)。
[0140] 在一些实施方案中，本发明包括LG12-进化枝的新型酶和变体。在一些实施方案中，本发明包括LG12-进化枝的新型酶和/或变体酶，其中变体与SEQ ID NO:3的LG12sprC
(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发
明包括Bhon03321的新型酶和/或变体酶，其中变体与SEQ ID NO:10的芽孢杆菌属DSM 8719
枯草杆菌蛋白酶Bhon03321序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发
明包括芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_
07707657.1)的新型酶和/或变体酶，其中变体与SEQ ID NO:7的芽孢杆菌属M3-13序列具有
至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属BAD21128的新型
酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)具有至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属WP_010192405.1的新型酶和/或变体
酶，其中变体与芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_
07707658.1)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属
LG12SprD AAC43581的新型酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属LG12sprD(AAC43581.1)
具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_9711(SEQ ID NO:
13)的新型酶和/或变体酶，其中变体与DSM_9711(SEQ ID NO:13)具有至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_9712(SEQ ID NO:16)的新型酶和/或变体
酶，其中变体与DSM_9712(SEQ ID NO:16)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_6951(SEQ ID NO:19)的新型酶和/或变体酶，其中变体与DSM_6951
(SEQ ID NO:19)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属
BAD21128(SEQ ID NO:20)的新型酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属BAD21128(SEQ ID
NO:20)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发
明包括Bhon03321的新型酶和/或变体酶，其中变体与SEQ ID NO:10的芽孢杆菌属DSM 8719
枯草杆菌蛋白酶Bhon03321序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发
明包括芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_
07707657.1)的新型酶和/或变体酶，其中变体与SEQ ID NO:7的芽孢杆菌属M3-13序列具有
至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属BAD21128的新型
酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)具有至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属WP_010192405.1的新型酶和/或变体
酶，其中变体与芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_
07707658.1)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属
LG12SprD AAC43581的新型酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属LG12sprD(AAC43581.1)
具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_9711(SEQ ID NO:
13)的新型酶和/或变体酶，其中变体与DSM_9711(SEQ ID NO:13)具有至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_9712(SEQ ID NO:16)的新型酶和/或变体
酶，其中变体与DSM_9712(SEQ ID NO:16)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括DSM_6951(SEQ ID NO:19)的新型酶和/或变体酶，其中变体与DSM_6951
(SEQ ID NO:19)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明包括芽孢杆菌属
BAD21128(SEQ ID NO:20)的新型酶和/或变体酶，其中变体与芽孢杆菌属BAD21128(SEQ ID
NO:20)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0141] LG12-进化枝酶的生产性位置
[0142] 本发明提供LG12-进化枝酶(例如LG12sprC丝氨酸蛋白酶)的氨基酸位置，其中所述LG12-进化枝酶可用于洗涤剂组合物，其中在所述位置的有利修饰导致该酶在洗涤性能、
洗涤剂组合物中的酶稳定性和酶热稳定性方面具有最低性能指数，同时在这些特性的至少
一个中与其亲本LG12-进化枝酶(例如前面例子中SEQ ID NO:3的LG12sprC)相比具有改善。
这些修饰被认为是本发明的适宜修饰。
洗涤剂组合物中的酶稳定性和酶热稳定性方面具有最低性能指数，同时在这些特性的至少
一个中与其亲本LG12-进化枝酶(例如前面例子中SEQ ID NO:3的LG12sprC)相比具有改善。
这些修饰被认为是本发明的适宜修饰。
[0143] 术语“热稳定的”和“热稳定性”是指，本发明的LG12-进化枝丝氨酸蛋白酶暴露于指定的温度后(常常在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件下暴露
一段给定的时间)保留特定量的酶活性，例如在被暴露于改变的温度时。“改变的温度”包括
升高或降低的温度。在一些实施方案中，LG12-进化枝蛋白酶在暴露于改变的温度一段给定
时间后，例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等后，保留至少
约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白酶活性。
一段给定的时间)保留特定量的酶活性，例如在被暴露于改变的温度时。“改变的温度”包括
升高或降低的温度。在一些实施方案中，LG12-进化枝蛋白酶在暴露于改变的温度一段给定
时间后，例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等后，保留至少
约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白酶活性。
[0144] 如本文所用，LG12-进化枝蛋白酶的改善的性质，包括LG12-进化枝蛋白酶变体相对于对应的亲本LG12-进化枝酶(例如，野生型或天然存在的LG12-进化枝酶)的改善或增强
的洗涤或清洁性能、以及/或者改善或增强的稳定性(任选地保持的洗涤或清洁性能)。变体
LG12-进化枝酶的改善的性质可包括改善的洗涤或清洁性能以及/或者改善的稳定性。在一
些实施方案中，本发明提供了本发明的变体LG12-进化枝酶，相对于参考亲本LG12-进化枝
酶(例如野生型LG12sprC酶，如具有SEQ ID NO:3的成熟序列的野生型LG12sprC蛋白酶)，所
述变体表现出下列一种或多种性质：改善的手洗性能、改善的手动或手工盘碟洗涤性能、改
善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能和/或改善的稳定性。
的洗涤或清洁性能、以及/或者改善或增强的稳定性(任选地保持的洗涤或清洁性能)。变体
LG12-进化枝酶的改善的性质可包括改善的洗涤或清洁性能以及/或者改善的稳定性。在一
些实施方案中，本发明提供了本发明的变体LG12-进化枝酶，相对于参考亲本LG12-进化枝
酶(例如野生型LG12sprC酶，如具有SEQ ID NO:3的成熟序列的野生型LG12sprC蛋白酶)，所
述变体表现出下列一种或多种性质：改善的手洗性能、改善的手动或手工盘碟洗涤性能、改
善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能和/或改善的稳定性。
[0145] 生产性位置描述分子内最可用于形成表现出改善特性的组合变体的那些位置，其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可以被描述为分子内可用于形成组
合变体的那些置换。可组合突变是可以改善分子的至少一种期望性质，同时不会明显降低
如下任一者：表达、活性或稳定性的那些突变。
合变体的那些置换。可组合突变是可以改善分子的至少一种期望性质，同时不会明显降低
如下任一者：表达、活性或稳定性的那些突变。
[0146] 可组合突变是可以改善分子的至少一种期望性质，同时不会明显降低如下任一者：表达、活性或稳定性的那些突变。例如，可以使用从实施例1所述的测定法得到的性能指
数(PI)值，确定LG12-进化枝蛋白酶中的可组合突变，这些测定法为：N-suc-AAPF-pNA蛋白
酶测定法(活性)、EMPA-116测定法(活性)、PAS-38微样布测定法(活性)、洗涤剂稳定性和热
稳定性测定法、和蛋白质测定(表达)。
数(PI)值，确定LG12-进化枝蛋白酶中的可组合突变，这些测定法为：N-suc-AAPF-pNA蛋白
酶测定法(活性)、EMPA-116测定法(活性)、PAS-38微样布测定法(活性)、洗涤剂稳定性和热
稳定性测定法、和蛋白质测定(表达)。
[0147] 除可组合突变外，LG12-进化枝蛋白酶的第二组突变可以是活性可组合突变。活性可组合突变是改善分子的至少一种活性性质(性能指数大于或等于1.5)而同时不使表达PI
值或稳定性PI值降到0.5以下的突变。这些活性可组合突变可用于修饰分子，以获得所需的
性质，又不会显著降低该分子的其它已知性质和所需性质(例如表达或稳定性)。
值或稳定性PI值降到0.5以下的突变。这些活性可组合突变可用于修饰分子，以获得所需的
性质，又不会显著降低该分子的其它已知性质和所需性质(例如表达或稳定性)。
[0148] 被发现为有用位置的LG12-进化枝蛋白酶氨基酸位置可以具有适用于洗涤剂组合物的不同修饰。修饰可包括特定位置处的插入、缺失或置换。在一个实施方案中，修饰为置
换。就每个位置来说，可能适宜的修饰的数目越多，该位置的生产力得分就越高。例如，氨基
酸位置可以是这样的，其中在生产性位置测试的修饰中至少50％、30％或15％为适宜修饰，
其中所述修饰满足下列适宜性标准中的至少一个：
换。就每个位置来说，可能适宜的修饰的数目越多，该位置的生产力得分就越高。例如，氨基
酸位置可以是这样的，其中在生产性位置测试的修饰中至少50％、30％或15％为适宜修饰，
其中所述修饰满足下列适宜性标准中的至少一个：
[0149] a)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.9：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.0的PI；
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.0的PI；
[0150] b)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.8：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.2的PI；或者
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.2的PI；或者
[0151] c)在该位置处，相对于亲本LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶，在如下方面的最低性能指数(PI)大于或等于0.5：1)选自pH9或pH10下的PAS-38微样布清洁和pH6、pH8或pH10下的
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.5的PI。
EMPA-116微样布清洁的至少一种清洁测定；2)对suc-AAPF-pNA的活性；3)蛋白质表达；和4)
选自洗涤剂稳定性和热稳定性的至少一种稳定性测定；此外，就这些测试中的任一者而言，
具有大于或等于1.5的PI。
[0152] 具有至少50％的测试修饰为适宜修饰的本发明LG12-进化枝酶位置包括第27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245、和251位，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。适宜的修饰包括：
[0153] 残基27(K，H，N，A，D，E，G，L，P，Q，R，S，T，M)，40(A，I，Q，L，T，W，D，E，H，K，M，N，R，V，Y)，43(N，V，I，A，F，G，H，K，L，M，Q，S，W，Y，D，E)，78(T，C，S，I，K，L，V，A，D，E，F，G，H，R，W)，98(A，Y，V，D，F，K，N，W，H，M，Q，S，T)，130(S，I，R，H，L，N，Q，T，W，E，F，V，Y)，131(G，I，K，L，T，H，N，A，P，R，S，D，E)，158(S，E，G，H，I，L，Q，K，A，D，M，T，V)，166(G，K，W，C，F，I，L，A，D，E，H，M，N，Q，S，T，Y)，182(S，C，Q，P，W，A，H，I，M，R，Y，D，E)，237(K，L，M，T，Y，F，S，D，G，H，R，A，N，Q)，239(P，Y，C，E，F，G，H，I，N，R，S，T，W，A，D，K，L，M，V)，242(T，G，H，L，I，K，N，V，W，A，E，P，Q，S)，245(Q，C，A，F，H，M，N，R，T，W，D，S，Y)和251(K，C，G，H，Y，W，F，L，R，A，D，M，N，S，T，V)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0154] 具有至少30％但少于50％的测试修饰为适宜修饰的本发明LG12-进化枝酶位置包括第2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、
149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271、和275，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。适宜的修饰包
括残基2(Q，E，F，K，P，R，S，W，Y)、9(P，Y，H，Q，A，G，I，M，R，S，T，V)、15(K，M，Q，T，G，H，R，V，Y，A)，38(N，H，Y，A，Q，T，D，E，K，S)，45(K，L，D，E，F，Q，R，S，W，A)，48(A，W，D，E，G，H，K，N，Q)，52(S，E，T，V，D，H，L，M，N，Q，R，F)，59(Q，F，M，H，N，W，T，I，V)，62(N，E，I，V，A，F，K，L，P，W)，75(L，A，N，H，K，F，Q，R，W，G)，97(S，D，G，H，L，M，N，A，I)，99(S，A，D，N，Q，R，S，I，K，L，V)，103(T，E，A，Y，G，H，K，N，R，S，D)，117(N，M，Q，H，K，R，E，G，S，T，Y)，118(G，T，K，R，Y，D，E，H，Q，S)，119(M，N，V，A，F，H，I，L，Q，S，T)，123(N，I，S，A，D，E，G，H，Q)，129(S，E，I，R，Y，K，Q，A，G，H，D)，133(T，G，H，A，F，L，M，N，Q，V，D，I)，145(R，D，F，G，L，V，M，W，Y，N)，148(V，D，I，L，M，Q，N，G，S)，149(V，A，P，S，E，G，L，N，Q)，156(S，C，E，G，D，H，Q，A，M，K，N)，159(S，C，F，T，M，N，Y，D，E，K，Q)，161(N，F，K，W，M，S，D，E，R，Y)，181(S，T，D，E，Q，A，H，K，N)，209(T，I，K，M，V，F，H，W，Y)，236(A，V，F，G，N，C，D，E，Q，S)，240(S，H，Q，F，I，L，P，V，W，M)，248(E，Q，K，L，N，T，W，D，C，H，M，Y)，256(N，V，A，D，K，M，Q，W，E，P，R)，267(V，H，N，A，F，I，K，S，T，Y)，271(E，D，L，M，Q，H，K，A，F，W，Y)，和275(Q，L，T，Y，G，H，W，E，N，R)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12
sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271、和275，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。适宜的修饰包
括残基2(Q，E，F，K，P，R，S，W，Y)、9(P，Y，H，Q，A，G，I，M，R，S，T，V)、15(K，M，Q，T，G，H，R，V，Y，A)，38(N，H，Y，A，Q，T，D，E，K，S)，45(K，L，D，E，F，Q，R，S，W，A)，48(A，W，D，E，G，H，K，N，Q)，52(S，E，T，V，D，H，L，M，N，Q，R，F)，59(Q，F，M，H，N，W，T，I，V)，62(N，E，I，V，A，F，K，L，P，W)，75(L，A，N，H，K，F，Q，R，W，G)，97(S，D，G，H，L，M，N，A，I)，99(S，A，D，N，Q，R，S，I，K，L，V)，103(T，E，A，Y，G，H，K，N，R，S，D)，117(N，M，Q，H，K，R，E，G，S，T，Y)，118(G，T，K，R，Y，D，E，H，Q，S)，119(M，N，V，A，F，H，I，L，Q，S，T)，123(N，I，S，A，D，E，G，H，Q)，129(S，E，I，R，Y，K，Q，A，G，H，D)，133(T，G，H，A，F，L，M，N，Q，V，D，I)，145(R，D，F，G，L，V，M，W，Y，N)，148(V，D，I，L，M，Q，N，G，S)，149(V，A，P，S，E，G，L，N，Q)，156(S，C，E，G，D，H，Q，A，M，K，N)，159(S，C，F，T，M，N，Y，D，E，K，Q)，161(N，F，K，W，M，S，D，E，R，Y)，181(S，T，D，E，Q，A，H，K，N)，209(T，I，K，M，V，F，H，W，Y)，236(A，V，F，G，N，C，D，E，Q，S)，240(S，H，Q，F，I，L，P，V，W，M)，248(E，Q，K，L，N，T，W，D，C，H，M，Y)，256(N，V，A，D，K，M，Q，W，E，P，R)，267(V，H，N，A，F，I，K，S，T，Y)，271(E，D，L，M，Q，H，K，A，F，W，Y)，和275(Q，L，T，Y，G，H，W，E，N，R)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12
sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0155] 具有至少15％但少于30％的测试修饰为适宜修饰的本发明LG12-进化枝酶位置包括第1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、
85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、
137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、
217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265、和272位，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号
的。适宜的修饰包括残基1(A，L，H，K，G，R)，3(T，A，G，H，E，Y，I，V)，18(A，D，F，S，Q，N，R，T)，19(A，F，K，L，R，M，W)，20(G，H，Q，E，N)，22(T，D，S，E)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，26(V，E，R，N，S)，28(V，N，S，E，T)，30(I，T，A，E，V)，31(L，I，M，Q，T)，44(V，A，I，F)，50(F，R，S，A，K，Q，Y)，53(G，Y，H，A，D，N，R，E)，55(P，I，K，N，R)，57(A，G，W，P)，58(L，F，D，K)，58(L，F，D，K)，67(A，G，A，I，P)，72(V，M，A，G，S，T)，76(N，F，P，A，Q，S，Y，D)，77(N，Q，G，T)，79(T，E，M，A，K，Q，I，L)，80(G，C，P，F，H，M，Y)，85(A，T，V，S)，86(Y，A，P，F)，87(N，Q，M，H，L，S)，89(D，A，R，F)，90(L，D，S，G，Q，E，N，P)，91(Y，H，I，M，N，T，V，W)，93(V，G，I，L，T)，96(L，G，K，R，Y，I，E，H)，100(G，F，K，V，Y，A，E)，101(S，M，A，T，V，R)，102(G，V，F，E，Y)，106(G，A，I，E，N，S，T，V)，107(I，H，Q，V，T)，108(A，S，I，C)，113(W，Y，F，H)，116(S，E，F，M)，121(V，T，S，A，I)，124(M，R，S，Y，A)，126(L，H，W，I，Q，G，K)，127(G，E，H，N)，136(Q，L，H，W，F，R，D)，137(Q，M，V，I，H，T，E)，140(N，I，F，Y，D，Q)，144(N，D，F，H，M，V，W，Y)，147(I，R，K，S，A，H，M)，150(I，A，S，D，N，T，V)，152(A，G，P，V)，153(A，M，G，S)，160(G，N，H，M)，162(R，K，M，V)，170(R，P，K，L)，172(S，C，N，T，G，H)，173(S，A，T，D)，183(N，G，A，Q，D，E)，185(T，C，W，Q，R，M)，187(A，C，G，D，H，P，V，W)，188(S，C，L，N，T，H，Y)，194(S，M，T，F，K，P，R，D)，213(N，V，W，G，M，R，K，Q)，216(S，C，F，I，T，A)，217(F，C，H，K，L，E，R)，218(N，C，H，D)，222(M，C，A，H，L，Q)，225(P，A，G，V)，228(A，C，R，S)，231(A，C，G，S)，234(I，M，Q，V)，235(K，I，N，S，G，D，E，F)，241(M，H，K，I，L，Q，S，W)，243(N，A，T，G)，244(V，A，E，Y)，246(I，N，V，A，T)，252(N，D，Q，F，E)，252(N，D，Q，F，E)，265(K，R，D，S)，和272(S，P，V，M，F，N，Q，K)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。就上述每一组突变来说，列出的第一个置换表示
sprC(SEQ ID NO：3)的天然氨基酸。在本发明的一些实施方案中，变体是sprC的LG12-进化
枝变体，其中突变是以上列出的组中的任何突变(排除列出的第一个置换)。
85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、
137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、
217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265、和272位，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号
的。适宜的修饰包括残基1(A，L，H，K，G，R)，3(T，A，G，H，E，Y，I，V)，18(A，D，F，S，Q，N，R，T)，19(A，F，K，L，R，M，W)，20(G，H，Q，E，N)，22(T，D，S，E)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，24(S，G，F，T，H，I，R，V)，26(V，E，R，N，S)，28(V，N，S，E，T)，30(I，T，A，E，V)，31(L，I，M，Q，T)，44(V，A，I，F)，50(F，R，S，A，K，Q，Y)，53(G，Y，H，A，D，N，R，E)，55(P，I，K，N，R)，57(A，G，W，P)，58(L，F，D，K)，58(L，F，D，K)，67(A，G，A，I，P)，72(V，M，A，G，S，T)，76(N，F，P，A，Q，S，Y，D)，77(N，Q，G，T)，79(T，E，M，A，K，Q，I，L)，80(G，C，P，F，H，M，Y)，85(A，T，V，S)，86(Y，A，P，F)，87(N，Q，M，H，L，S)，89(D，A，R，F)，90(L，D，S，G，Q，E，N，P)，91(Y，H，I，M，N，T，V，W)，93(V，G，I，L，T)，96(L，G，K，R，Y，I，E，H)，100(G，F，K，V，Y，A，E)，101(S，M，A，T，V，R)，102(G，V，F，E，Y)，106(G，A，I，E，N，S，T，V)，107(I，H，Q，V，T)，108(A，S，I，C)，113(W，Y，F，H)，116(S，E，F，M)，121(V，T，S，A，I)，124(M，R，S，Y，A)，126(L，H，W，I，Q，G，K)，127(G，E，H，N)，136(Q，L，H，W，F，R，D)，137(Q，M，V，I，H，T，E)，140(N，I，F，Y，D，Q)，144(N，D，F，H，M，V，W，Y)，147(I，R，K，S，A，H，M)，150(I，A，S，D，N，T，V)，152(A，G，P，V)，153(A，M，G，S)，160(G，N，H，M)，162(R，K，M，V)，170(R，P，K，L)，172(S，C，N，T，G，H)，173(S，A，T，D)，183(N，G，A，Q，D，E)，185(T，C，W，Q，R，M)，187(A，C，G，D，H，P，V，W)，188(S，C，L，N，T，H，Y)，194(S，M，T，F，K，P，R，D)，213(N，V，W，G，M，R，K，Q)，216(S，C，F，I，T，A)，217(F，C，H，K，L，E，R)，218(N，C，H，D)，222(M，C，A，H，L，Q)，225(P，A，G，V)，228(A，C，R，S)，231(A，C，G，S)，234(I，M，Q，V)，235(K，I，N，S，G，D，E，F)，241(M，H，K，I，L，Q，S，W)，243(N，A，T，G)，244(V，A，E，Y)，246(I，N，V，A，T)，252(N，D，Q，F，E)，252(N，D，Q，F，E)，265(K，R，D，S)，和272(S，P，V，M，F，N，Q，K)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。就上述每一组突变来说，列出的第一个置换表示
sprC(SEQ ID NO：3)的天然氨基酸。在本发明的一些实施方案中，变体是sprC的LG12-进化
枝变体，其中突变是以上列出的组中的任何突变(排除列出的第一个置换)。
[0156] 具有至少一个修饰但少于15％的测试修饰为适宜修饰的本发明LG12-进化枝酶位置包括第4，7，8，12，14，16，17，29，33，42，46，51，56，65，69，73，81，83，84，88，94，104，109，
111，114，120，122，125，128，132，138，141，143，146，151，163，165，167，175，176，195，203，
204，205，206，211，212，215，220，224，227，230，232，238，250，260，262，268，273，和274位，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序
列来编号的。适宜的修饰包括残基4(V，C)、7(G，N)、8(I，L)、12(K，G，R)、14(D，L)、16(A，G，V)，17(H，A)，29(A，T，S)，33(T，D)，42(L，D)，46(G，N)，51(V，I)，56(N，E)，65(G，T，V)，69(A，G，T)，73(A，G)，81(V，H，M)，83(G，S)，84(V，A)，88(A，C，G)，94(K，G)，104(L，Y，V)，109(Q，K)，
111(I，V)，114(S，T，G)，120(N，H，E)，122(I，M)，125(S，G)，128(G，E，N)，132(S，A)，138(A，E，S)，141(N，G)，143(Y，D，E)，146(G，N，R)，151(A，H)，163(N，S，D)，165(M，I，V)，167(Y，G)，167(Y，G)，167(Y，G)，195(E，Q)，203(V，C)，204(N，E)，205(I，V)，206(L，Y)，211(G，C)，211(G，C)，215(A，D，E)，220(T，A，G)，224(A，S)，224(A，S)，230(A，S)，232(A，S)，238(Y，W，F)，250(L，I，M)，260(P，Y)、260(P，Y)、268(I，F)、273(A，S)和274(A，S)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
111，114，120，122，125，128，132，138，141，143，146，151，163，165，167，175，176，195，203，
204，205，206，211，212，215，220，224，227，230，232，238，250，260，262，268，273，和274位，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序
列来编号的。适宜的修饰包括残基4(V，C)、7(G，N)、8(I，L)、12(K，G，R)、14(D，L)、16(A，G，V)，17(H，A)，29(A，T，S)，33(T，D)，42(L，D)，46(G，N)，51(V，I)，56(N，E)，65(G，T，V)，69(A，G，T)，73(A，G)，81(V，H，M)，83(G，S)，84(V，A)，88(A，C，G)，94(K，G)，104(L，Y，V)，109(Q，K)，
111(I，V)，114(S，T，G)，120(N，H，E)，122(I，M)，125(S，G)，128(G，E，N)，132(S，A)，138(A，E，S)，141(N，G)，143(Y，D，E)，146(G，N，R)，151(A，H)，163(N，S，D)，165(M，I，V)，167(Y，G)，167(Y，G)，167(Y，G)，195(E，Q)，203(V，C)，204(N，E)，205(I，V)，206(L，Y)，211(G，C)，211(G，C)，215(A，D，E)，220(T，A，G)，224(A，S)，224(A，S)，230(A，S)，232(A，S)，238(Y，W，F)，250(L，I，M)，260(P，Y)、260(P，Y)、268(I，F)、273(A，S)和274(A，S)，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO：3中示出的LG12 sprC蛋白酶氨基酸序列来编号的。
[0157] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶相比亲本具有有益突变，其中所述益处可以为下列任一种或多种：在Kirkland Ultra HDD pH 10.6或OMO Color HDD
pH 10.6中，HDD PI值为1.01或更高；在OMO Klein&Krachtig HDL pH 8.2中，HDL(pH 8)PI
值为1.01或更高；在Blue Moon pH 6.5中，HDL(pH 6)PI值为1.01或更高；在下列洗涤剂和
缓冲液中，洗衣稳定性PI值为1.01或更高：OMO Klein&Krachtig HDL pH 8.2在51℃或LAS-
EDTA缓冲液在52℃；在下列洗涤剂中，ADW PI值为1.01或更高：GSM-B、GSM-B pH 9，GSM-C、
Sun All in One或Finish Quantum片；在下列洗涤剂和缓冲液中，ADW稳定性PI值为1.01或
更高：GSM-B(68.5℃)、GSM-C(62℃)、Tris EDTA缓冲液(51℃)、Tris-钙缓冲液(72.5℃)，详
细数据在下表中列出。每个类别的标准包括：就所述一种或多种益处而言PI值大于1.01，且
表达的PI值大于0.75。
pH 10.6中，HDD PI值为1.01或更高；在OMO Klein&Krachtig HDL pH 8.2中，HDL(pH 8)PI
值为1.01或更高；在Blue Moon pH 6.5中，HDL(pH 6)PI值为1.01或更高；在下列洗涤剂和
缓冲液中，洗衣稳定性PI值为1.01或更高：OMO Klein&Krachtig HDL pH 8.2在51℃或LAS-
EDTA缓冲液在52℃；在下列洗涤剂中，ADW PI值为1.01或更高：GSM-B、GSM-B pH 9，GSM-C、
Sun All in One或Finish Quantum片；在下列洗涤剂和缓冲液中，ADW稳定性PI值为1.01或
更高：GSM-B(68.5℃)、GSM-C(62℃)、Tris EDTA缓冲液(51℃)、Tris-钙缓冲液(72.5℃)，详
细数据在下表中列出。每个类别的标准包括：就所述一种或多种益处而言PI值大于1.01，且
表达的PI值大于0.75。
[0158] 在本发明的一些实施方案中，具有有益于洗衣稳定性的突变的本发明LG12-进化枝酶包含选自下列的置换：A029T，I030A，I030V，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，A040W，A040Y，S101R，T103D，T103E，T103G，T103K，T103R，S052D，
S052F，S052N，S052R，N183E，V093T，L031T，N117E，N117F，N117S，N117T，M124S，L126D，
L126G，L126I，L126K，L126Q，N123D，S125G，S129A，S129D，S129K，S129Q，S130E，S130F，
S130HS130L，S130N，S130Q，S130T，S130V，S130W，S130Y，G131D，G131E，G131R，Q137E，S099K，G102E，G102F，G102Y，I107H，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，
A224P，A224S，K015V，P225G，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，Q136R，Q136W，N163D，E248C，E248D，A019M，
T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，G100F，I147A，I147H，
I147S，V148N，V148S，Q245M，Q245T，Q245V，I246N，N243G，S024H，S024T，S024V，K045D，
K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048G，
A048H，A048Q，A048Y，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078S，
T078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，M241W，V244Y，N252E，K265D，K265S，S272M，
S272Q，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，
K251T，K251V，F050Q，F050R，F050Y，V051I，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，
G166C，G166D，G166E，G166F，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，
G053D，G053E，G053Q，G053R，Y143D，Y143E，S181A，S181H，S181N，S181Q，G154F，G154H，
G154I，G154K，G154T，S194K，S194P，S194R，K237A，K237N，A215D，A215E，Y171G，Y171Q，
K012G，V072A，V072T，S156A，S156D，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，
N256E，N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，
R170K，R170L，A108C，A108I，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，
A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，I150A，I150N，
I150S，I150T，I150V，A152P，A152V，S216I，S216T，A228S，P239A，P239C，P239D，P239E，
P239F，P239G，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，F217R，T220G，S159D，S159E，S159N，
S159Q，G128N，T209F，T209V，T209W，T209Y，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，
S240P，S240Q，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，
L096H，L096I，L096R，L096Y，S116E，V081M，K235D，K235E，K235F，K235G，V267F，V267I，
V267R，V267S，V267T，V267Y、M222A、M222H和M222Q。
S052F，S052N，S052R，N183E，V093T，L031T，N117E，N117F，N117S，N117T，M124S，L126D，
L126G，L126I，L126K，L126Q，N123D，S125G，S129A，S129D，S129K，S129Q，S130E，S130F，
S130HS130L，S130N，S130Q，S130T，S130V，S130W，S130Y，G131D，G131E，G131R，Q137E，S099K，G102E，G102F，G102Y，I107H，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，
A224P，A224S，K015V，P225G，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，Q136R，Q136W，N163D，E248C，E248D，A019M，
T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，G100F，I147A，I147H，
I147S，V148N，V148S，Q245M，Q245T，Q245V，I246N，N243G，S024H，S024T，S024V，K045D，
K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048G，
A048H，A048Q，A048Y，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078S，
T078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，M241W，V244Y，N252E，K265D，K265S，S272M，
S272Q，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，
K251T，K251V，F050Q，F050R，F050Y，V051I，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，
G166C，G166D，G166E，G166F，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，
G053D，G053E，G053Q，G053R，Y143D，Y143E，S181A，S181H，S181N，S181Q，G154F，G154H，
G154I，G154K，G154T，S194K，S194P，S194R，K237A，K237N，A215D，A215E，Y171G，Y171Q，
K012G，V072A，V072T，S156A，S156D，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，
N256E，N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，
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A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，I150A，I150N，
I150S，I150T，I150V，A152P，A152V，S216I，S216T，A228S，P239A，P239C，P239D，P239E，
P239F，P239G，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，F217R，T220G，S159D，S159E，S159N，
S159Q，G128N，T209F，T209V，T209W，T209Y，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，
S240P，S240Q，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，
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V267R，V267S，V267T，V267Y、M222A、M222H和M222Q。
[0159] 在本发明的一些实施方案中，在洗衣HDL pH 6性能上具有有益突变的本发明LG12-进化枝酶包括选自下列的置换：I030A，A040E，A040L，A040T，A040Y，T103D，T103E，
S052D，S052F，S052N，N183E，L031T，N117E，N117F，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，
G102E，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，K027M，
K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，
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Q275N，A048D，A048E，A048Q，T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，M241S，
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G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，
S156H，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，
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V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，
P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，
T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，
P009Q，P009S，P009T，P009V、L096E、K235D、K235E和V267S。
S052D，S052F，S052N，N183E，L031T，N117E，N117F，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，
G102E，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，K027M，
K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，
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G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，
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V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，
P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，
T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，
P009Q，P009S，P009T，P009V、L096E、K235D、K235E和V267S。
[0160] 在本发明的一些实施方案中，在洗衣HDL pH 8性能上具有有益突变的本发明LG12-进化枝酶包括选自下列的置换：A029G，A029T，T033N，T033V，A040D，A040E，G065A，
A069G，K094A，K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，
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T103N，L104I，L104T，S052D，S052F，S052G，S052H，S052L，L058V，N183E，G083A，V084E，
V093I，L031A，L031E，L031N，L031Q，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，
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K015S，K015T，K015V，K015Y，T185M，T185Q，P005D，P005T，K027D，K027E，K027G，K027L，
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S049I，S049K，S049N，S049Q，S049T，S049V，S049W，Q136D，N163D，N163E，G211D，G211Q，
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V021D，L257C，L257G，L257I，S024G，K045E，K045L，K045W，Q275L，Q275T，A048D，A048E，
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K012L，K012M，K012T，K012Y，V072A，V072D，V072E，V072F，V072G，V072I，V072T，Y167D，
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G146N，G146Q，D060E，D060N，D060S，W113F，A138E，N140D，N140G，V149D，V149F，V149G，
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A230F，A230H，A230I，A230M，A230Q，Q059I，A016H，A016W，P210D，P210E，P210W，S159D，
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A236E，A236F，A236L，S240F，S240P，T242E，T242Q，P260C，G258D，N141G，S173D，Y214M，
P009A，P009G，P009I，P009T，H010L，L096E，L096H，L096I，S116E，S116F，G025A，G025F，
V081P，H039G，H039T，K235D，K235E，V267L，V267N，A151H，G160F，G160H，G160M，G160V，
M222L，和M222Y，
A069G，K094A，K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，
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A037M，A037N，A037Q，A037T，A037W，V068D，V068Q，M124S，L126Q，M119A，M119F，M119H，
M119I，M119L，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，A187H，N062A，
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S097M，S097Y，G102E，I107Q，N120P，S182D，S182E，A001G，A001H，A001L，T003E，V004E，
D014E，E197D，L206Y，I011A，I011S，I011T，A013S，K015H，K015M，K015N，K015P，K015Q，
K015S，K015T，K015V，K015Y，T185M，T185Q，P005D，P005T，K027D，K027E，K027G，K027L，
K027M，K027N，K027Q，K027T，K027Y，N043D，N043E，S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，
S049I，S049K，S049N，S049Q，S049T，S049V，S049W，Q136D，N163D，N163E，G211D，G211Q，
G211T，W006A，W006D，W006H，W006L，W006M，W006N，W006P，W006Q，W006S，A019K，A019W，
T022G，T022L，G061E，R145N，R145T，R145W，S158D，S158H，S158Q，L090E，L090G，L090N，
L090Q，G100A，G100E，I147H，I147M，I147S，V148A，V148D，V148E，V148F，V148G，V148L，
V148Q，T164D，T164E，N184A，N184H，F189A，F189D，F189E，F189I，F189L，F189S，F189V，
Q245M，Q245N，Q245P，Q245T，Q245V，I246A，I246C，L274D，L274E，L274G，N243D，H017I，
V021D，L257C，L257G，L257I，S024G，K045E，K045L，K045W，Q275L，Q275T，A048D，A048E，
A048G，A048H，A048L，E054F，E054G，E054H，E054I，E054L，E054M，E054N，E054P，E054R，
E054T，E054V，E054W，A073I，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，N087F，N087H，
N087P，N087Q，N087S，A088D，A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，D089L，Y091T，
Y091V，Y091W，G020E，G020H，G020L，G020V，G020Y，G046E，G046L，G046M，N252E，N252F，
N252I，N252L，N252Q，N252S，F261Y，K265D，K265V，S272F，S272M，S272Q，S272V，N056A，
N056E，N056H，N056I，N056L，N056M，N056Q，N056S，N056V，A074G，N077D，N077G，N077P，
T208A，A231F，A231L，A018F，A018K，A018L，A018N，A018P，A018Q，A018S，A018T，A018V，
A018W，A018Y，N038D，N038E，N038H，N038I，N038K，N038P，N038Q，N038T，N038Y，K251A，
K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271M，
E271W，F050I，F050S，F050Y，V051D，V051E，V051F，V051G，V051K，V051L，V051M，V051N，
V051P，V051Q，V051R，V051T，V051W，V051Y，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，
A057M，A057N，A057Q，A057R，A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075F，L075N，
L075Q，L075S，L075T，L075V，L075W，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，G166M，
G166N，G166Q，G166S，I175A，I175F，I175Q，I175S，I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，
G053I，G053L，G053P，P055A，P055G，P055M，P055W，P055Y，S194G，A232H，A232I，A232N，
A232Q，A232S，A232T，I234M，I234N，I234S，I234T，I234V，I234W，K237A，K237D，K237F，
K237L，K237M，K237N，K237T，K237V，K237W，A215D，A215E，A215M，V203A，V203D，V203E，
V203G，V203I，V203L，L233G，L233H，L233N，L233T，L250I，K012D，K012E，K012G，K012H，
K012L，K012M，K012T，K012Y，V072A，V072D，V072E，V072F，V072G，V072I，V072T，Y167D，
Y167E，Y167F，Y167P，S156D，S156N，S172N，Y238A，Y238C，Y238E，Y238F，Y238G，Y238S，
Y238W，T255L，N256D，N256E，I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，
V227Y，F262E，F262I，G106E，G106T，T133D，N161D，N161E，N161F，N161S，N161W，N161Y，
R170I，R170L，R170M，A108C，A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146H，
G146N，G146Q，D060E，D060N，D060S，W113F，A138E，N140D，N140G，V149D，V149F，V149G，
V149L，I150A，N212I，N212L，N212Q，N212W，S216D，A228G，P239C，P239G，P239H，P239L，
P239N，Q002E，Q002S，F217D，F217E，F217I，F217T，H226D，H226E，H226L，H226Q，H226T，
A230F，A230H，A230I，A230M，A230Q，Q059I，A016H，A016W，P210D，P210E，P210W，S159D，
S159E，S159N，G063D，G063E，G063L，G063M，G063N，G063S，G063T，G063V，A098F，A098S，
I122L，V198A，V198C，V198F，V198T，T209M，T209Q，T209V，N213D，N213E，A236C，A236D，
A236E，A236F，A236L，S240F，S240P，T242E，T242Q，P260C，G258D，N141G，S173D，Y214M，
P009A，P009G，P009I，P009T，H010L，L096E，L096H，L096I，S116E，S116F，G025A，G025F，
V081P，H039G，H039T，K235D，K235E，V267L，V267N，A151H，G160F，G160H，G160M，G160V，
M222L，和M222Y，
[0161] 在本发明的一些实施方案中，在洗衣HDD性能上具有有益突变的本发明LG12-进化枝酶包括选自下列的置换：A029G，A029S，A029T，I030S，I030V，I030Y，T033N，T033V，A040D，A040E，A040G，A040H，A040K，A040L，A040N，A040P，A040Y，G065A，T066S，H067A，H067E，
H067F，H067G，H067K，H067L，H067M，H067N，H067P，H067Q，H067S，H067T，H067V，H067Y，
A069G，K094A，K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，
V095T，G110S，I111M，I111V，Y086D，Y086E，Y086I，Y086K，Y086M，Y086P，Y086Q，Y086T，
Y086W，S101A，S101M，S101T，S101V，T103A，T103D，T103E，T103G，T103L，T103N，T103S，
T103Y，L104I，S052D，S052F，S052G，S052H，S052L，S052M，S052N，S052Q，S052T，S052V，
L058A，L058D，L058H，L058I，L058R，L058T，L058V，NI83E，N183I，N183M，N183P，N183Y，
G083A，G083S，V084L，V084S，V084T，A085I，A085S，V093G，V093I，V093M，V093T，L031A，
L031E，L031N，L031Q，L031T，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，A037M，
A037N，A037Q，A037R，A037S，A037T，A037W，V068D，V068I，V068M，V068Q，N117E，N117F，
N117K，N117M，N117S，N117T，N117Y，M124S，L126G，L126I，L126Q，M119A，M119F，M119H，
M119L，M119Q，M119S，M119T，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，
A187F，A187G，A187H，A187N，A187P，A187W，N062A，N062K，N062L，N062P，N062W，S129A，
S129D，S129G，S129Q，S129T，S129Y，S130E，S130L，S130N，S130P，S130Q，S130T，G131D，
G131P，G131Q，G131S，S132A，Q137E，Q137H，Q137I，Q137T，N144H，N144V，N144Y，A153S，
S097G，S097H，S097I，S097K，S097L，S097M，S097N，S097Y，S099I，S099L，S099V，G102E，
I107Q，N120G，N120P，N120T，V121A，V121F，V121G，V121S，V177I，V177T，A179G，S182A，
S182D，S182E，S182F，S182L，S182M，S182N，S182W，A001G，A001K，A001L，A001R，T003E，
T003H，T003I，T003V，T003Y，V004E，V004F，V004G，V004H，V004P，V004S，V004Y，D014E，
D014F，D014G，D014H，D014T，D014Y，E197D，I205A，I205C，I205M，I205N，L206F，L206K，
L206M，L206N，L206R，L206S，L206V，L206W，L206Y，A224S，I011A，I011M，I011T，I011V，
A013S，K015H，K015M，K015N，K015P，K015Q，K015S，K015T，K015V，K015Y，A092V，T185F，
T185G，T185H，T185M，T185Q，P005D，P005I，P005M，P005S，P005T，P005V，G007Y，K027D，
K027E，K027G，K027H，K027L，K027M，K027N，K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，K027Y，
N043A，N043D，N043E，N043F，N043G，N043H，N043I，N043K，N043L，N043M，N043Q，N043S，
N043V，N043W，S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，S049I，S049K，S049N，S049Q，S049R，
S049T，S049V，S049W，Q136D，Q136G，Q136H，Q136L，Q136N，Q136V，N163D，N163E，N204L，
G211H，G211K，G211Q，G211T，E248A，E248H，I008A，I008G，I008H，I008N，I008P，I008T，
I008V，I008Y，V028E，V028F，V028H，V0281，V028L，V028M，V028N，V028Q，V028S，V028T，
L0421，L042M，L042N，L042Q，L042T，L042V，W006A，W006D，W006H，W006K，W006L，W006M，
W006N，W006P，W006Q，W006S，W006Y，A019F，A019K，A019L，A019M，A019R，A019W，A019Y，
T022E，T022G，T0221，T022L，T022M，T022Q，T022R，T022S，T022V，T022W，V026E，V026F，
V026H，V026L，V026N，V026Q，V026R，V026S，G061A，G061E，G061I，G061M，G061P，G061S，
G061T，G061Y，R145N，R145T，S158D，S158G，S158H，S158M，S158N，S158Q，S155T，S158V，
L090E，L090F，L090G，L090N，L090P，L090Q，L090R，L090Y，G100A，G100E，I147A，I147H，
I147M，I147S，V148D，V148E，V148G，V148L，V148M，V148Q，V148S，N184A，N184S，F189A，
F189D，F189E，F189G，F189H，F189I，F189K，F189L，F189M，F189N，F189P，F189Q，F189S，
F189T，F189V，P201L，P201S，P201T，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245P，Q245R，Q245S，
Q245T，Q245w，Q245Y，I246A，I246F，I246M，I246V，L274F，L274M，L274Y，N243D，N243K，
N243L，N243P，N243R，T253F，T253G，T253K，T253N，A254G，A254T，H017I，H017L，H017P，
H017S，H017T，H017V，V021D，V021F，V021G，V021H，V021K，V021M，V021R，L257A，L257C，
L257G，L257H，L257I，L257M，L257P，L257Q，L257V，V270I，V270L，V270M，V270Q，V270T，
V270W，V270Y，S024G，S024H，S0241，S024P，S024R，S024T，S024V，K045D，K045L，K045Q，
K045R，K045S，K045W，Q275K，Q275L，Q275N，Q275R，Q275W，Q275Y，A048D，A048E，A048G，
A048H，A048I，A048K，A048L，A048N，A048Q，A048W，E054D，E054F，E054G，E054H，E0541，
E054K，E054L，E054M，E054N，E054P，E054R，E054S，E054T，E054V，E054W，A073G，A073I，
A073K，A073L，A073T，A073V，T078A，T078F，T078H，T078I，T078L，T078R，T078V，T078W，
N087F，N087H，N087P，N087Q，N087S，A088D，A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，
D089L，D089R，D089T，D089W，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，Y091V，Y091W，G020E，G020H，
G020L，G020N，G020Q，G020T，G020V，G020Y，M241H，M241I，M241Q，M241S，V244L，V244Q，
N252F，N252I，N252L，N252Q，N252R，N252S，F261Y，K265S，K265V，S272F，S272H，S272K，
S272M，S272N，S272P，S272Q，S272T，S272V，N056A，N056E，N056I，N056L，N056M，N056P，
N056Q，N056S，N056V，A074G，A074S，N077G，L135I，L196M，T208A，T208I，T208L，T208N，
T208V，A231G，A231L，A231S，A231Y，R249K，R249W，A018F，A018K，A018L，A018N，A018S，
A018T，A018W，A018Y，N038A，N038D，N038E，N038I，N038K，N038P，N038T，N038Y，K251A，
K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271L，
E271M，E271Q，E271W，E271Y，F050A，F050I，F050K，F050Q，F050S，F050W，F050Y，V051A，
V051D，V051E，V051F，V051G，V051H，V051I，V051K，V051L，V051M，V051N，V051P，V051Q，
V051R，V051T，V051W，V051Y，N076D，N076E，N076I，N076K，N076Q，N076R，N076S，N076T，
N076Y，T079K，T079L，T079Q，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，A057M，A057N，
A057P，A057Q，A057R，A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075E，L075F，L075G，
L075H，L075I，L075K，L075N，L075Q，L075R，L075S，L075T，L075V，L075W，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166Y，I175A，I175F，
I175Q，I175S，I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，G053I，G053L，G053N，G053P，G053Q，
P055A，P055G，P055K，P055M，P055N，P055R，P055S，P055W，P055Y，Y143E，Y143L，Y143M，
Y143N，Y143Q，Y143T，Y143V，S181A，T071A，T071G，T071M，T071N，T071P，T071S，T071V，
S194G，S194I，S194M，S194V，A232H，A232I，A232L，A232M，A232N，A232Q，A232S，A232T，
I234A，I234F，I234M，I234N，I234Q，I234S，I234V，i234W，I234Y，K237F，K237G，K237I，
K237L，K237M，K237N，K237Q，K237R，K237S，K237T，K237V，K237W，A215D，A215E，A215F，
A215G，A215H，A215K，A215L，A215M，A215N，A215Y，A169S，V203A，V203D，V203E，V203G，
V203L，V203T，L233A，L233D，L233G，L233H，L233M，L233T，L250I，L250T，K012D，K012E，
K012G，K012H，K012L，K012M，K012R，K012T，K012Y，D036A，D036E，D036W，V072A，V072D，
V072E，V072F，V072K，V072P，V072Q，V072T，Y167A，Y167D，Y167E，Y167F，V180A，V180N，
V180S，V180T，G080F，G080M，G080Y，S156A，S156D，S156H，S156I，S156L，S156M，S156N，
S156Q，S156V，S172H，S172I，S172L，S172M，S172N，S172T，S172V，S172Y，S188G，S188H，
S188T，S188Y，Y238A，Y238C，Y238D，Y238F，Y238G，Y238I，Y238K，Y238L，Y238M，Y238Q，
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T255N，T255Q，T255S，T255W，T255Y，N256D，N256E，N256K，N2561，N256M，N256P，N256Q，
N256R，N256V，N256W，I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227T，
V227Y，F262E，F262S，G106E，G106I，G106N，G106S，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，
T133N，T133Q，T133V，N161D，N161E，N161F，N161M，N161Q，N161W，N161Y，R170K，R170L，
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G118Y，G146Q，G146R，D060A，D060E，D060F，D060H，D060K，D060L，D060M，D060N，D060P，
D060Q，D060S，D060T，D060V，D060Y，W113F，W113H，W113Y，A138E，A138S，N140D，N140F，
N140G，N140I，N140L，N140M，N140Q，N140T，N140V，N140W，N140Y，V149A，V149D，V149E，
V149F，V149G，V149H，V149I，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，V149T，I150A，I150M，
I150N，I150T，I150V，N212F，N212G，N212L，N212P，N212W，S216A，A228S，P239F，P239I，
P239K，P239T，7239V，P239W，Q002E，Q002K，Q002P，Q002S，Q002W，Q002Y，S207T，S207V，
F217D，F217E，F217H，F217I，F217R，F217T，F217V，H226D，H226E，H226F，H226G，H226L，
H226Q，H226T，A230D，A230F，A230H，A230M，A230Q，A230Y，Q059I，Q059N，A016E，A016G，
A016H，A016I，A016K，A016L，A016Q，A016T，A016W，G023A，A200S，P210D，P210E，P210F，
P210I，P210L，P210Q，P210S，P210T，P210V，P210W，S159D，S159E，S159N，S159Q，S159T，
G063A，G063D，G063E，G063F，G063H，G063L，G063M，G063N，G063P，G063R，G063S，G063T，
G063V，G063W，G063Y，A098H，A098L，A098M，A098P，A098Q，A098S，A098T，A098V，Q109K，
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S173T，Y214F，Y214G，Y214I，Y214M，Y214N，P009A，P009G，P009H，P009M，P009Q，P009R，
P009T，P009V，H010A，H010L，L096H，L096I，S116F，S116M，G025A，V044A，V044I，V081G，
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M222Y。
H067F，H067G，H067K，H067L，H067M，H067N，H067P，H067Q，H067S，H067T，H067V，H067Y，
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V095T，G110S，I111M，I111V，Y086D，Y086E，Y086I，Y086K，Y086M，Y086P，Y086Q，Y086T，
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L0421，L042M，L042N，L042Q，L042T，L042V，W006A，W006D，W006H，W006K，W006L，W006M，
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T022E，T022G，T0221，T022L，T022M，T022Q，T022R，T022S，T022V，T022W，V026E，V026F，
V026H，V026L，V026N，V026Q，V026R，V026S，G061A，G061E，G061I，G061M，G061P，G061S，
G061T，G061Y，R145N，R145T，S158D，S158G，S158H，S158M，S158N，S158Q，S155T，S158V，
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F189T，F189V，P201L，P201S，P201T，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245P，Q245R，Q245S，
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A018T，A018W，A018Y，N038A，N038D，N038E，N038I，N038K，N038P，N038T，N038Y，K251A，
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V051D，V051E，V051F，V051G，V051H，V051I，V051K，V051L，V051M，V051N，V051P，V051Q，
V051R，V051T，V051W，V051Y，N076D，N076E，N076I，N076K，N076Q，N076R，N076S，N076T，
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L075H，L075I，L075K，L075N，L075Q，L075R，L075S，L075T，L075V，L075W，G166A，G166C，
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I234A，I234F，I234M，I234N，I234Q，I234S，I234V，i234W，I234Y，K237F，K237G，K237I，
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A215G，A215H，A215K，A215L，A215M，A215N，A215Y，A169S，V203A，V203D，V203E，V203G，
V203L，V203T，L233A，L233D，L233G，L233H，L233M，L233T，L250I，L250T，K012D，K012E，
K012G，K012H，K012L，K012M，K012R，K012T，K012Y，D036A，D036E，D036W，V072A，V072D，
V072E，V072F，V072K，V072P，V072Q，V072T，Y167A，Y167D，Y167E，Y167F，V180A，V180N，
V180S，V180T，G080F，G080M，G080Y，S156A，S156D，S156H，S156I，S156L，S156M，S156N，
S156Q，S156V，S172H，S172I，S172L，S172M，S172N，S172T，S172V，S172Y，S188G，S188H，
S188T，S188Y，Y238A，Y238C，Y238D，Y238F，Y238G，Y238I，Y238K，Y238L，Y238M，Y238Q，
Y238T，Y238V，Y238W，T255A，T255D，T255F，T255G，T255H，T255I，T255K，T255L，T255M，
T255N，T255Q，T255S，T255W，T255Y，N256D，N256E，N256K，N2561，N256M，N256P，N256Q，
N256R，N256V，N256W，I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227T，
V227Y，F262E，F262S，G106E，G106I，G106N，G106S，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，
T133N，T133Q，T133V，N161D，N161E，N161F，N161M，N161Q，N161W，N161Y，R170K，R170L，
R170M，A108C，A108I，A108L，S114G，S114T，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，
G118Y，G146Q，G146R，D060A，D060E，D060F，D060H，D060K，D060L，D060M，D060N，D060P，
D060Q，D060S，D060T，D060V，D060Y，W113F，W113H，W113Y，A138E，A138S，N140D，N140F，
N140G，N140I，N140L，N140M，N140Q，N140T，N140V，N140W，N140Y，V149A，V149D，V149E，
V149F，V149G，V149H，V149I，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，V149T，I150A，I150M，
I150N，I150T，I150V，N212F，N212G，N212L，N212P，N212W，S216A，A228S，P239F，P239I，
P239K，P239T，7239V，P239W，Q002E，Q002K，Q002P，Q002S，Q002W，Q002Y，S207T，S207V，
F217D，F217E，F217H，F217I，F217R，F217T，F217V，H226D，H226E，H226F，H226G，H226L，
H226Q，H226T，A230D，A230F，A230H，A230M，A230Q，A230Y，Q059I，Q059N，A016E，A016G，
A016H，A016I，A016K，A016L，A016Q，A016T，A016W，G023A，A200S，P210D，P210E，P210F，
P210I，P210L，P210Q，P210S，P210T，P210V，P210W，S159D，S159E，S159N，S159Q，S159T，
G063A，G063D，G063E，G063F，G063H，G063L，G063M，G063N，G063P，G063R，G063S，G063T，
G063V，G063W，G063Y，A098H，A098L，A098M，A098P，A098Q，A098S，A098T，A098V，Q109K，
I122L，I122M，G128N，V198A，V198C，V198F，T209E，T209M，T209Q，T209R，T209S，T209V，
T209W，N213A，N213D，N213E，N213F，N213G，N213M，A236C，A236F，A236G，A236L，A236N，
A236Q，A236V，S240F，S240I，S240M，S240P，S240Q，S240V，S240W，T242A，T242E，T242G，
T242H，T242I，T242K，T242L，T242P，T242Q，T242S，T242V，T242Y，P260C，P260I，P260L，
P260M，P260N，P260S，P260V，G258D，Y263T，Y263W，N141G，N141T，S173A，S173D，S173N，
S173T，Y214F，Y214G，Y214I，Y214M，Y214N，P009A，P009G，P009H，P009M，P009Q，P009R，
P009T，P009V，H010A，H010L，L096H，L096I，S116F，S116M，G025A，V044A，V044I，V081G，
V081L，V081M，V081P，V081Y，N269K，N269T，N269V，H039G，H039S，H039T，K235A，K235D，
K235E，V267A，V267E，V267F，V267G，V267I，V267K，V267L，V267N，V267S，V267T，V267Y，
A151H，A1511，A151Q，A151S，A151T，G160F，G160H，G160M，G160V，M222E，M222H，M222L，和
M222Y。
[0162] 在本发明的一些实施方案中，在洗衣稳定性和洗衣HDL pH 6性能上具有有益突变的本发明LG12-进化枝酶，包括选自下列的置换：1030A、A040E、A040L、A040T、A040Y、T103D、
T103E、S052D、S052F、S052N、N183E、L031T、N117E、N117F、M124S、N123D、S129D、S130E、
Q137E、G102E、I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，
K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，
R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，
Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，
Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，
M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，
G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，
S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，
R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，
N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，
A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，
S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，
P009M，P009Q、P009S、P009T、P009V、L096E、K235D、K235E、V267S和M222Q。
T103E、S052D、S052F、S052N、N183E、L031T、N117E、N117F、M124S、N123D、S129D、S130E、
Q137E、G102E、I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，
K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，
R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，
Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，
Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，
M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，
G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，
S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，
R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，
N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，
A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，
S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，
P009M，P009Q、P009S、P009T、P009V、L096E、K235D、K235E、V267S和M222Q。
[0163] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于洗衣稳定性和洗衣HDL pH 8性能的突变，包括选自下列的置换：A029T、A040D、A040E、T103D、T103E、
S052D、S052F、N183E、M124S、L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，
R145N，R145T，R145W，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245M，Q245T，Q245V，K045E，
K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，
N087S，N252E，K265D，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，
K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，
G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，
V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，
A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，P239C，P239G，P239H，P239N，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，A236D，A236E，
S240P，T242E，S173D，P009A，P009I，P009T，L096E、L096H、L096I、S116E、K235D和K235E。
S052D、S052F、N183E、M124S、L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，
R145N，R145T，R145W，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245M，Q245T，Q245V，K045E，
K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，
N087S，N252E，K265D，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，
K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，
G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，
V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，
A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，P239C，P239G，P239H，P239N，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，A236D，A236E，
S240P，T242E，S173D，P009A，P009I，P009T，L096E、L096H、L096I、S116E、K235D和K235E。
[0164] 在本发明一些实施方案中，本发明LG12-进化枝酶具有有益于洗衣稳定性和洗衣HDD性能的突变，包括选自下列的置换：A029T，I030V，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，
A040N，A040Y，T103D，T103E，T103G，S052D，S052F，S052N，N183E，V093T，L031T，N117E，
N117F，N117S，N117T，M124S，L126G，L126I，L126Q，N123D，S129A，S129D，S129Q，S130E，
S130L，S130N，S130Q，S130T，G131D，Q137E，G102E，I107Q，V121G，S182D，S182E，T003E，
T003I，T003V，A224S，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，N163D，A019M，T022E，R145N，R145T，S158D，
L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245M，Q245T，S024H，S024T，S024V，
K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048Q，
T078A，T078F，T078H，T078L，T078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，K265S，S272M，
S272Q，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，
K251T，K251V，F050Q，F050Y，V0511，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166Y，G053D，G053E，G053Q，
Y143E，S181A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156A，S156D，S156H，S156M，
S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，
T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，R170L，A108C，A108I，S114G，S114T，G118E，G118Q，
G118S，G118T，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，
I150A，I150N，I150T，I150V，A228S，P239F，P239T，P239W，F217R，S159D，S159E，S159N，
S159Q，G128N，T209V，T209W，A236C，A236N，A236Q，S240P，S240Q，T242E，S173D，P009A，
P009M，P009Q，P009T，P009V，L096H，L096I，V081M，K235D，K235E，V267F，V267I，V267S，
V267T，V267Y和M222H。
A040N，A040Y，T103D，T103E，T103G，S052D，S052F，S052N，N183E，V093T，L031T，N117E，
N117F，N117S，N117T，M124S，L126G，L126I，L126Q，N123D，S129A，S129D，S129Q，S130E，
S130L，S130N，S130Q，S130T，G131D，Q137E，G102E，I107Q，V121G，S182D，S182E，T003E，
T003I，T003V，A224S，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，N163D，A019M，T022E，R145N，R145T，S158D，
L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245M，Q245T，S024H，S024T，S024V，
K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048Q，
T078A，T078F，T078H，T078L，T078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，K265S，S272M，
S272Q，N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，
K251T，K251V，F050Q，F050Y，V0511，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166Y，G053D，G053E，G053Q，
Y143E，S181A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156A，S156D，S156H，S156M，
S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，
T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，R170L，A108C，A108I，S114G，S114T，G118E，G118Q，
G118S，G118T，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，
I150A，I150N，I150T，I150V，A228S，P239F，P239T，P239W，F217R，S159D，S159E，S159N，
S159Q，G128N，T209V，T209W，A236C，A236N，A236Q，S240P，S240Q，T242E，S173D，P009A，
P009M，P009Q，P009T，P009V，L096H，L096I，V081M，K235D，K235E，V267F，V267I，V267S，
V267T，V267Y和M222H。
[0165] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于洗衣稳定性和洗衣HDL pH 8及HDD性能的突变，包括选自下列的置换：A029T，A040D，A040E，T103D，T103E，
S052D，S052F，N183E，M124S，L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，
R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245M，Q245T，K045L，K045W，A048D，
A048E，A048G，A048H，T078F，T078H，T078W，N087S，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，
K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166H，G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，
K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，
R170L，A108C，A108I，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，S240P，T242E，S173D，P009A，P009T，L096H，
L096I，K235D和K235E。
S052D，S052F，N183E，M124S，L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，
R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245M，Q245T，K045L，K045W，A048D，
A048E，A048G，A048H，T078F，T078H，T078W，N087S，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，
K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166H，G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，
K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，
R170L，A108C，A108I，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，S240P，T242E，S173D，P009A，P009T，L096H，
L096I，K235D和K235E。
[0166] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于洗衣稳定性及洗衣HDD和洗衣HDL pH 6和洗衣HDL pH 8的突变，包括选自下列的置换：A040E，T103D，
T103E，S052D，S052F，N183E，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，
R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245T，K045L，K045W，A048D，A048E，T078F，
T078W，N087S，S272M，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，
K251S，K251T，K251V，G166D，G166E，G166H，G166N，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，
K012G，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，
A108C，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，I150A，S159D，
S159E，S159N，T209V，T242E，S173D，P009A，P009T，K235D和K235E。
T103E，S052D，S052F，N183E，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，
S182E，T003E，K015V，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，
R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245T，K045L，K045W，A048D，A048E，T078F，
T078W，N087S，S272M，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，
K251S，K251T，K251V，G166D，G166E，G166H，G166N，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，
K012G，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，
A108C，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，I150A，S159D，
S159E，S159N，T209V，T242E，S173D，P009A，P009T，K235D和K235E。
[0167] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于ADW稳定性的突变，包括选自下列的置换：A001G，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，Q002S，Q002W，T003G，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，P009I，P009M，P009Q，P009R，
P009S，P009T，P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，G025A，G025H，
V026N，K027P，K027R，K027S，K027T，A029S，I030V，T033E，N038A，N038Q，N038T，A040D，
A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，
N043H，N043K，N043L，N043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050Q，F050R，F050S，V051I，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，
G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，H067P，V072A，V072G，V072T，
A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，
T078H，T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，
N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，L096E，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，
G100A，G100E，S101M，S101T，G102F，G102Y，T103D，T103E，T103G，T103S，G106E，G106N，
G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，
G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119Q，V121A，V121G，L126G，L126I，
L126K，G128N，S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，
T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，R145W，G146N，
G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，
I150N，I150V，A151H，A152P，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，S158V，
S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，
G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，
S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，
A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，
P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，
Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，
N256Q，N2，56R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，
S272K，S272N，S272Q和Q275E。
P009S，P009T，P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，G025A，G025H，
V026N，K027P，K027R，K027S，K027T，A029S，I030V，T033E，N038A，N038Q，N038T，A040D，
A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，
N043H，N043K，N043L，N043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050Q，F050R，F050S，V051I，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，
G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，H067P，V072A，V072G，V072T，
A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，
T078H，T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，
N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，L096E，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，
G100A，G100E，S101M，S101T，G102F，G102Y，T103D，T103E，T103G，T103S，G106E，G106N，
G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，
G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119Q，V121A，V121G，L126G，L126I，
L126K，G128N，S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，
T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，R145W，G146N，
G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，
I150N，I150V，A151H，A152P，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，S158V，
S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，
G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，
S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，
A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，
P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，
Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，
N256Q，N2，56R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，
S272K，S272N，S272Q和Q275E。
[0168] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于ADW性能的突变，包括选自下列的置换：A001G，A001H，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，Q002S，Q002W，Q002Y，T003E，T003G，T003H，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，
P009I，P009M，P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，K012G，K012R，K015H，K015V，K015Y，
A018F，A018N，A018Q，A018R，A018T，A019K，A019L，A019M，A019R，A019W，G020N，T022D，
T022E，T022S，S024H，S024I，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，V026S，K027D，K027E，
K027G，K027L，K027M，K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，V028E，V028T，A029S，A029T，
I030A，I030E，I030V，L031Q，L031T，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，
A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，A040W，A040Y，N043A，N043D，N043E，N043F，N043G，
N043H，N043I，N043K，N043L，N043M，N043Q，N043S，N043W，N043Y，K045D，K045E，K045F，
K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，G046N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048K，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050K，F050Q，F050R，F050S，F050Y，S052D，S052H，S052L，S052M，
S052N，S052Q，S052R，S052T，S052V，G053A，G053D，G053E，G053N，G053Q，G053R，P055K，
P055N，P055R，A057P，L058D，Q059I，G061E，G061M，G061Y，N062K，N062L，N062P，N062W，
H067A，H067G，A069G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075Q，L075R，L075W，
N076D，N076Q，N076S，N076Y，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078I，
T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，G080Y，V081M，G083S，
A085S，Y086P，N087H，N087S，D089F，L090E，L090N，L090P，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，
Y091T，Y091V，Y091W，V093T，L096I，L096N，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097N，
A098F，A098H，A098K，A098M，A098N，A098Q，A098S，A098T，S099I，S099K，S099L，S099V，
G100A，G100E，S101A，S101M，S101R，S101T，S101V，G102E，T103D，T103E，T103H，T103K，
T103N，T103R，T103S，G106E，G106N，G106S，G106T，G106V，I107Q，I107T，I107V，A108C，
A108I，Q109K，I111V，W113F，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117G，N117K，
N117S，N117T，N117Y，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119A，
M119F，M119H，M119I，M119L，M119Q，M119S，M119T，N120E，V121A，N123A，N123D，N123E，
N123G，N123H，N123Q，G128N，S129A，S129D，S129G，S129H，S129Q，S129T，S130E，S130F，
S130H，S130L，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131A，G131D，G131H，G131P，G131R，G131S，
S132A，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，T133N，T133Q，T133V，Q136D，Q136F，Q136H，
Q136R，Q136W，Q137E，Q137H，Q137T，A138E，A138S，N140D，N140Q，N140Y，N141T，Y143E，
N144H，N144M，N144V，N144W，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147M，I147S，
V148G，V148S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150A，I150N，
I150S，I150T，I150V，A151H，A152V，A153G，A153S，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，
S158D，S158M，S158T，S158V，S159D，S159E，S159K，S159M，S159N，S159Q，S159Y，G160F，
N161D，N161E，N161K，N161M，N161R，N161S，N163D，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，
G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，R170K，R170L，S172H，
I175Q，I175S，S181A，S181H，S181K，S181N，S181Q，S182A，S182D，S182E，S182H，S182I，
S182M，S182R，S182Y，N183E，T185M，T185Q，T185R，A187D，A187G，A187H，A187P，A187Q，
A187V，A187W，S188H，S188Y，S194F，S194K，S194P，S194R，L206Y，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，A215D，A215E，S216A，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，
I234V，K235D，K235E，A236C，A236D，A236E，A236F，A236G，A236N，A236Q，A236S，K237A，
K237G，K237N，K237Q，K237R，Y238F，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，P239G，P239H，
P239I，P239K，P239L，P239M，P239N，P239R，P239S，P239T，P239V，P239W，S240F，S240I，
S240M，S240P，S240Q，S240V，S240W，M241I，M241Q，M241S，M241W，T242A，T242E，T2421，
T242K，T242P，T242Q，T242S，T242V，N243G，V244F，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245S，
Q245T，Q245W，Q245Y，I246A，I246N，I246V，E248D，E248H，E248K，E248M，E248Y，L250I，
L250M，K251F，K251R，N252E，N252F，T255D，T255I，N256D，N256E，N256K，N256M，N256P，
N256Q，N256R，N256W，F262E，K265D，K265S，V267A，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，
V267Y，E271A，E271F，E271H，E271K，E271W，E271Y，S272F，S272K，S272N、S272Q、Q275E、
Q275G、Q275N和Q275R。
P009I，P009M，P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，K012G，K012R，K015H，K015V，K015Y，
A018F，A018N，A018Q，A018R，A018T，A019K，A019L，A019M，A019R，A019W，G020N，T022D，
T022E，T022S，S024H，S024I，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，V026S，K027D，K027E，
K027G，K027L，K027M，K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，V028E，V028T，A029S，A029T，
I030A，I030E，I030V，L031Q，L031T，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，
A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，A040W，A040Y，N043A，N043D，N043E，N043F，N043G，
N043H，N043I，N043K，N043L，N043M，N043Q，N043S，N043W，N043Y，K045D，K045E，K045F，
K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，G046N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048K，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050K，F050Q，F050R，F050S，F050Y，S052D，S052H，S052L，S052M，
S052N，S052Q，S052R，S052T，S052V，G053A，G053D，G053E，G053N，G053Q，G053R，P055K，
P055N，P055R，A057P，L058D，Q059I，G061E，G061M，G061Y，N062K，N062L，N062P，N062W，
H067A，H067G，A069G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075Q，L075R，L075W，
N076D，N076Q，N076S，N076Y，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078I，
T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，G080Y，V081M，G083S，
A085S，Y086P，N087H，N087S，D089F，L090E，L090N，L090P，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，
Y091T，Y091V，Y091W，V093T，L096I，L096N，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097N，
A098F，A098H，A098K，A098M，A098N，A098Q，A098S，A098T，S099I，S099K，S099L，S099V，
G100A，G100E，S101A，S101M，S101R，S101T，S101V，G102E，T103D，T103E，T103H，T103K，
T103N，T103R，T103S，G106E，G106N，G106S，G106T，G106V，I107Q，I107T，I107V，A108C，
A108I，Q109K，I111V，W113F，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117G，N117K，
N117S，N117T，N117Y，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119A，
M119F，M119H，M119I，M119L，M119Q，M119S，M119T，N120E，V121A，N123A，N123D，N123E，
N123G，N123H，N123Q，G128N，S129A，S129D，S129G，S129H，S129Q，S129T，S130E，S130F，
S130H，S130L，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131A，G131D，G131H，G131P，G131R，G131S，
S132A，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，T133N，T133Q，T133V，Q136D，Q136F，Q136H，
Q136R，Q136W，Q137E，Q137H，Q137T，A138E，A138S，N140D，N140Q，N140Y，N141T，Y143E，
N144H，N144M，N144V，N144W，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147M，I147S，
V148G，V148S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150A，I150N，
I150S，I150T，I150V，A151H，A152V，A153G，A153S，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，
S158D，S158M，S158T，S158V，S159D，S159E，S159K，S159M，S159N，S159Q，S159Y，G160F，
N161D，N161E，N161K，N161M，N161R，N161S，N163D，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，
G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，R170K，R170L，S172H，
I175Q，I175S，S181A，S181H，S181K，S181N，S181Q，S182A，S182D，S182E，S182H，S182I，
S182M，S182R，S182Y，N183E，T185M，T185Q，T185R，A187D，A187G，A187H，A187P，A187Q，
A187V，A187W，S188H，S188Y，S194F，S194K，S194P，S194R，L206Y，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，A215D，A215E，S216A，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，
I234V，K235D，K235E，A236C，A236D，A236E，A236F，A236G，A236N，A236Q，A236S，K237A，
K237G，K237N，K237Q，K237R，Y238F，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，P239G，P239H，
P239I，P239K，P239L，P239M，P239N，P239R，P239S，P239T，P239V，P239W，S240F，S240I，
S240M，S240P，S240Q，S240V，S240W，M241I，M241Q，M241S，M241W，T242A，T242E，T2421，
T242K，T242P，T242Q，T242S，T242V，N243G，V244F，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245S，
Q245T，Q245W，Q245Y，I246A，I246N，I246V，E248D，E248H，E248K，E248M，E248Y，L250I，
L250M，K251F，K251R，N252E，N252F，T255D，T255I，N256D，N256E，N256K，N256M，N256P，
N256Q，N256R，N256W，F262E，K265D，K265S，V267A，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，
V267Y，E271A，E271F，E271H，E271K，E271W，E271Y，S272F，S272K，S272N、S272Q、Q275E、
Q275G、Q275N和Q275R。
[0169] 在本发明的一些实施方案中，本发明的LG12-进化枝酶具有有益于ADW稳定性和ADW性能的突变，包括选自下列的置换：A001G，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，
Q002S，Q002W，T003G，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，P009I，P009M，
P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，
G025A，V026N，K027P，K027R，K027S，K027T，A029S，I030V，N038A，N038Q，N038T，A040D，
A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，
N043H，N043K，N043L，N043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050Q，F050R，F050S，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，
G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，
L075G，L075R，N076Q，N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，
T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，
L090P，Y091I，Y091M，Y091V，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，
S101T，T103D，T103E，T103S，G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，
S116E，S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，
G118Y，M119Q，V121A，G128N，S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，
T133A，T133D，T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，
R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，
V149Q，V149S，I150N，I150V，A151H，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158V，
S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，
G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，
S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，
A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，
P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，
Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，
N256Q，N256R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，
S272K，S272N，S272Q和Q275E。
Q002S，Q002W，T003G，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，P009I，P009M，
P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，
G025A，V026N，K027P，K027R，K027S，K027T，A029S，I030V，N038A，N038Q，N038T，A040D，
A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，
N043H，N043K，N043L，N043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，
A048Q，A048W，F050A，F050Q，F050R，F050S，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，
G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，
L075G，L075R，N076Q，N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，
T078L，T078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，
L090P，Y091I，Y091M，Y091V，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，
S101T，T103D，T103E，T103S，G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，
S116E，S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，
G118Y，M119Q，V121A，G128N，S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，
T133A，T133D，T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，
R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，
V149Q，V149S，I150N，I150V，A151H，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158V，
S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，
G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，
S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，
T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，
A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，
P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，
Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，
N256Q，N256R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，
S272K，S272N，S272Q和Q275E。
[0170] 本发明的多肽
[0171] 本发明提供了新型多肽，可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括具有酶活性(例如蛋白酶活性)的、分离、重组、基本上纯的或非天然存在的变体以及新发现的LG12-
进化枝酶多肽，包括例如变体LG12 sprC酶多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽可用于
清洁应用，而且可掺入清洁组合物，继而适用于清洁需要清洁的物品或表面(例如，物品的
表面)的方法。
进化枝酶多肽，包括例如变体LG12 sprC酶多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽可用于
清洁应用，而且可掺入清洁组合物，继而适用于清洁需要清洁的物品或表面(例如，物品的
表面)的方法。
[0172] 在一些实施方案中，LG12-进化枝酶变体可为源自芽孢杆菌属的亲本LG12-进化枝酶的变体。已在芽孢杆菌属中发现了多种LG12-进化枝酶，这些酶彼此具有高度的同一性，
而且与SEQ ID NO：3所示的源自LG12的LG12sprC成熟酶也具有高度的同一性。参见(例如)
实施例4的表5和6，实施例11的图8，实施例12的图9，以及实施例13的图10。在其它实施方案
中，本发明的LG12-进化枝酶变体可为源自表5或表6列出的任意属的亲本LG12-进化枝酶的
变体，或者可为选自下列的属：芽孢杆菌属(Basillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、脂环
酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微小杆菌属
(Exiguobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、滑
柱菌属(Herpetosiphon)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、
梭菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、标桩
菌属(Stigmatella)、粘球菌属(Myxococcus)、弧菌属(Vibrio)、甲烷八叠球菌属
(Methanosarcina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、克里布所
菌属(Kribbella)、两面神菌属(Janibacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、黄单胞菌属
(Xanthamonas)、小单孢菌属(Micromonospora)、伯克氏菌属(Burkholderia)、脱卤拟球菌
属(Dehalococcoides)、藏红花色杆菌属(Croceibacter)、科迪亚菌属(Kordia)、微颤菌属
(Microscilla)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、绿屈扰菌属(Chloroflexus)、李斯特
菌属(Listeria)、邻囊菌属(Plesiocystis)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、噬纤维菌
属(Cytophaga)、霍氏菌属(Hahella)、节杆菌属(Arthrobacter)、小短杆菌属
(Brachybacterium)、棍状杆菌属(Clavibacter)、微杆菌属(Microbacterium)、间孢囊菌属
(Intrasporangium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、稍栖热菌属(Meiothermus)、假单胞菌属
(Pseudomonas)、蓖麻属(Ricinus)、细小链孢菌属(Catenulispora)、鱼腥藻属(Anabaena)、
念珠藻属(Nostoc)、盐单胞菌属(Halomonas)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、博德特氏
菌属(Bordetella)、贪噬菌属(Variovorax)、迪克氏菌属(Dickeya)、坚固杆菌属
(Pectobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属
(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、拉恩氏菌属(Rahnella)、沙雷氏
菌属(Serratia)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、出芽菌属(Gemmata)、致病杆菌属
(Xenorhabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)、曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属
(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、丛赤壳属
(Nectria)、赤霉属(Gibberella)、绿僵菌属(Metarhizium)、Waddlia、Cyanothece、食纤维
菌属(Cellulophaga)、普罗威登斯菌属(Providencia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、
土壤杆菌属(Agrobacterium)、黏液杆菌属(Mucilaginibacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、
堆囊菌属(Sorangium)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、肾杆菌属(Renibacterium)、气
单胞菌属(Aeromonas)、瑞英克岛菌属(Reinekea)、色杆菌属(Chromobacterium)、摩替亚氏
菌属(Moritella)、海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)、康氏菌属(Kangiella)、海单胞菌属
(Marinomonas)、弧菌目(Vibrionales)、利斯顿氏菌属(Listonella)、盐水弧菌属
(Salinivibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、军团
菌属(Legionella)、船蛆杆菌属(Teredinibacter)、瑞英克岛菌属(Reinekea)、氢杆状菌属
(Hydrogenivirga)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。在多个实施方案中，LG12-进化
枝酶变体可为源自表5或表6中所述任意物种的亲本LG12-进化枝酶的变体。
而且与SEQ ID NO：3所示的源自LG12的LG12sprC成熟酶也具有高度的同一性。参见(例如)
实施例4的表5和6，实施例11的图8，实施例12的图9，以及实施例13的图10。在其它实施方案
中，本发明的LG12-进化枝酶变体可为源自表5或表6列出的任意属的亲本LG12-进化枝酶的
变体，或者可为选自下列的属：芽孢杆菌属(Basillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、脂环
酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微小杆菌属
(Exiguobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、滑
柱菌属(Herpetosiphon)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、
梭菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、标桩
菌属(Stigmatella)、粘球菌属(Myxococcus)、弧菌属(Vibrio)、甲烷八叠球菌属
(Methanosarcina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、克里布所
菌属(Kribbella)、两面神菌属(Janibacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、黄单胞菌属
(Xanthamonas)、小单孢菌属(Micromonospora)、伯克氏菌属(Burkholderia)、脱卤拟球菌
属(Dehalococcoides)、藏红花色杆菌属(Croceibacter)、科迪亚菌属(Kordia)、微颤菌属
(Microscilla)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、绿屈扰菌属(Chloroflexus)、李斯特
菌属(Listeria)、邻囊菌属(Plesiocystis)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、噬纤维菌
属(Cytophaga)、霍氏菌属(Hahella)、节杆菌属(Arthrobacter)、小短杆菌属
(Brachybacterium)、棍状杆菌属(Clavibacter)、微杆菌属(Microbacterium)、间孢囊菌属
(Intrasporangium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、稍栖热菌属(Meiothermus)、假单胞菌属
(Pseudomonas)、蓖麻属(Ricinus)、细小链孢菌属(Catenulispora)、鱼腥藻属(Anabaena)、
念珠藻属(Nostoc)、盐单胞菌属(Halomonas)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、博德特氏
菌属(Bordetella)、贪噬菌属(Variovorax)、迪克氏菌属(Dickeya)、坚固杆菌属
(Pectobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属
(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、拉恩氏菌属(Rahnella)、沙雷氏
菌属(Serratia)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、出芽菌属(Gemmata)、致病杆菌属
(Xenorhabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)、曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属
(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、丛赤壳属
(Nectria)、赤霉属(Gibberella)、绿僵菌属(Metarhizium)、Waddlia、Cyanothece、食纤维
菌属(Cellulophaga)、普罗威登斯菌属(Providencia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、
土壤杆菌属(Agrobacterium)、黏液杆菌属(Mucilaginibacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、
堆囊菌属(Sorangium)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、肾杆菌属(Renibacterium)、气
单胞菌属(Aeromonas)、瑞英克岛菌属(Reinekea)、色杆菌属(Chromobacterium)、摩替亚氏
菌属(Moritella)、海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)、康氏菌属(Kangiella)、海单胞菌属
(Marinomonas)、弧菌目(Vibrionales)、利斯顿氏菌属(Listonella)、盐水弧菌属
(Salinivibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、军团
菌属(Legionella)、船蛆杆菌属(Teredinibacter)、瑞英克岛菌属(Reinekea)、氢杆状菌属
(Hydrogenivirga)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。在多个实施方案中，LG12-进化
枝酶变体可为源自表5或表6中所述任意物种的亲本LG12-进化枝酶的变体。
[0173] 在一些实施方案中，LG12-进化枝酶变体可为，与表5或表6中所述的LG12-进化枝酶，例如SEQ ID NO:3的LG12sprC蛋白酶，或与下列任一项，具有50％、60％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体：LG12sprC(SEQ ID
NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM 8719、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_
9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌
株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、Bac sp BAD21128(SEQ ID NO:20)。
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体：LG12sprC(SEQ ID
NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM 8719、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_
9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌
株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、Bac sp BAD21128(SEQ ID NO:20)。
[0174] 本文描述与LG12-进化枝酶，例如由LG12克隆的LG12sprC，有关的组合物和方法。这些组合物和方法部分地以克隆并表达的LG12在洗涤剂组合物存在下具有蛋白水解活性
这一观测结果为基础。LG12在洗涤剂组合物中还显示出极佳的稳定性。由于LG12具备这些
特征，所以特别适用于多种清洁应用。在这些清洁应用中，LG12在存在洗涤剂组合物中的表
面活性剂与其它组分的情况下可使蛋白质水解。
这一观测结果为基础。LG12在洗涤剂组合物中还显示出极佳的稳定性。由于LG12具备这些
特征，所以特别适用于多种清洁应用。在这些清洁应用中，LG12在存在洗涤剂组合物中的表
面活性剂与其它组分的情况下可使蛋白质水解。
[0175] 在一个方面，本发明的组合物和方法提供变体LG12-进化枝多肽。从LG12中分离了亲本LG12-进化枝多肽。该成熟LG12-进化枝多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。类似地，
基本上相同的LG12-进化枝多肽可在自然界中存在，例如，存在于LG12的其它菌株或分离株
中。本发明的组合物和方法涵盖这些及其它重组的LG12-进化枝多肽。
基本上相同的LG12-进化枝多肽可在自然界中存在，例如，存在于LG12的其它菌株或分离株
中。本发明的组合物和方法涵盖这些及其它重组的LG12-进化枝多肽。
[0176] 在一些实施方案中，本发明包括具有蛋白酶活性的分离、重组、基本上纯的、或非天然存在的变体LG12-进化枝酶，所述多肽包含与本文提供的亲本LG12-进化枝酶(例如SEQ
ID NO:3的LG12sprC蛋白酶)或下列任一项具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少
约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少
约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少
约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％序列同一性的多肽序列：LG12sprC
(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM 8719、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_
9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌
株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、和Bac sp BAD21128(SEQ ID NO:20)。
ID NO:3的LG12sprC蛋白酶)或下列任一项具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少
约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少
约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少
约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％序列同一性的多肽序列：LG12sprC
(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株
DSM 8719、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、LG12sprD(AAC43581.1)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_
9711(SEQ ID NO:13)、堀越氏芽孢杆菌菌株DSM_9712(SEQ ID NO:16)、堀越氏芽孢杆菌菌
株DSM_6951(SEQ ID NO:19)、和Bac sp BAD21128(SEQ ID NO:20)。
[0177] 在一些实施方案中，变体多肽是与例示的LG12-进化枝多肽具有指定的氨基酸序列同源性程度的变体，例如，与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至
少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至99％的序列同源性的变体。可采用
氨基酸序列比对测定同源性，例如，使用本文所述的诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程
序测定。
少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至99％的序列同源性的变体。可采用
氨基酸序列比对测定同源性，例如，使用本文所述的诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程
序测定。
[0178] 本发明还提供了编码具有蛋白酶活性的变体LG12-进化枝酶的分离、重组、基本上纯的、或非天然存在的序列，所述变体LG12-进化枝酶(例如，变体LG12)包含与SEQ ID NO:
3、7、10、13、16、19或20的氨基酸序列相比不同氨基酸残基不超过50个、不超过40个、不超过
30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过
16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过
9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不
超过1个的氨基酸序列；其中，变体LG12的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3的LG12sprC氨基酸
序列中相应氨基酸位置的编号来进行编号，其中所述相应氨基酸位置通过比对变体LG12-
进化枝酶的氨基酸序列与该LG12sprC氨基酸序列而确定。
3、7、10、13、16、19或20的氨基酸序列相比不同氨基酸残基不超过50个、不超过40个、不超过
30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过
16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过
9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不
超过1个的氨基酸序列；其中，变体LG12的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3的LG12sprC氨基酸
序列中相应氨基酸位置的编号来进行编号，其中所述相应氨基酸位置通过比对变体LG12-
进化枝酶的氨基酸序列与该LG12sprC氨基酸序列而确定。
[0179] 如上所述，本发明的变体LG12-进化枝酶多肽具有酶活性(例如，蛋白水解活性)，因而可用于清洁应用，包括但不限于清洁盘碟物品、餐具物品、织物以及具有硬质表面的物
品(例如，桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。下文将描述包含
本发明的一种或多种变体LG12-进化枝酶多肽的示例性清洁组合物。本发明的变体LG12-进
化枝酶多肽的酶活性(例如，LG12-进化枝酶活性)可采用本领域的普通技术人员熟知的程
序轻易测定。下文提供的实施例描述了用于评估酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热
稳定性的多种方法。本发明的变体LG12-进化枝酶在去除污渍(例如，脂质污渍)、清洁硬质
表面或者清洁衣物、盘碟或餐具物品方面的性能，可采用本领域熟知的程序和/或实施例部
分示出的程序轻易测定。
品(例如，桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。下文将描述包含
本发明的一种或多种变体LG12-进化枝酶多肽的示例性清洁组合物。本发明的变体LG12-进
化枝酶多肽的酶活性(例如，LG12-进化枝酶活性)可采用本领域的普通技术人员熟知的程
序轻易测定。下文提供的实施例描述了用于评估酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热
稳定性的多种方法。本发明的变体LG12-进化枝酶在去除污渍(例如，脂质污渍)、清洁硬质
表面或者清洁衣物、盘碟或餐具物品方面的性能，可采用本领域熟知的程序和/或实施例部
分示出的程序轻易测定。
[0180] 可以对本发明的多肽施予多个变化，例如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或置换(保守或非保守的)，包括基本上不会改变本发明多肽的酶活性的此类变化。与此类似，也可
对本发明的核酸施予多个变化，例如：一个或多个核酸在一个或多个密码子中的一个或多
个置换，使得特定密码子编码相同的或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，核苷酸序列中
的突变导致氨基酸序列发生沉默突变，例如在编码的氨基酸不因核酸突变而发生改变时)
或非沉默变异；序列中的一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失；序列中的一个或
多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；以及/或者序列中的一个或多个核酸(或密
码子)的断裂或一个或多个截短。与由初始核酸序列编码的变体LG12-进化枝酶相比，核酸
序列中的许多此类变化可以不实质上改变所得的编码变体LG12-进化枝酶的酶活性。本发
明的核酸也可经修饰，从而包含在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达的一个
或多个密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同的氨基酸。
对本发明的核酸施予多个变化，例如：一个或多个核酸在一个或多个密码子中的一个或多
个置换，使得特定密码子编码相同的或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，核苷酸序列中
的突变导致氨基酸序列发生沉默突变，例如在编码的氨基酸不因核酸突变而发生改变时)
或非沉默变异；序列中的一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失；序列中的一个或
多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；以及/或者序列中的一个或多个核酸(或密
码子)的断裂或一个或多个截短。与由初始核酸序列编码的变体LG12-进化枝酶相比，核酸
序列中的许多此类变化可以不实质上改变所得的编码变体LG12-进化枝酶的酶活性。本发
明的核酸也可经修饰，从而包含在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达的一个
或多个密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同的氨基酸。
[0181] 在一些实施方案中，本发明提供包含具有所需酶活性(例如，LG12-进化枝酶活性或清洁性能活性)的变体LG12-进化枝酶多肽的一类多肽，其中所述多肽包含具有本文所述
氨基酸置换的序列且还包含一个或多个附加的氨基酸置换(例如保守置换和非保守置换)，
其中所述多肽表现出、保持或大致保持所需酶活性(例如，LG12-进化枝酶活性或蛋白水解
活性，反映在变体LG12-进化枝酶的清洁活性或性能方面)。根据本发明的氨基酸置换可包
括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置
换通常涉及将一个氨基酸残基功能类别中的一个成员交换为属于相同功能类别的残基(在
计算功能同源性百分比时，将相同的氨基酸残基视为在功能上同源或保守)。保守氨基酸置
换通常涉及将氨基酸序列中的氨基酸置换成功能类似的氨基酸。举例来说，丙氨酸、甘氨
酸、丝氨酸和苏氨酸在功能上相似，因此它们可充当彼此的保守置换氨基酸。天冬氨酸和谷
氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换氨基酸。
精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬
氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换氨
基酸。
氨基酸置换的序列且还包含一个或多个附加的氨基酸置换(例如保守置换和非保守置换)，
其中所述多肽表现出、保持或大致保持所需酶活性(例如，LG12-进化枝酶活性或蛋白水解
活性，反映在变体LG12-进化枝酶的清洁活性或性能方面)。根据本发明的氨基酸置换可包
括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置
换通常涉及将一个氨基酸残基功能类别中的一个成员交换为属于相同功能类别的残基(在
计算功能同源性百分比时，将相同的氨基酸残基视为在功能上同源或保守)。保守氨基酸置
换通常涉及将氨基酸序列中的氨基酸置换成功能类似的氨基酸。举例来说，丙氨酸、甘氨
酸、丝氨酸和苏氨酸在功能上相似，因此它们可充当彼此的保守置换氨基酸。天冬氨酸和谷
氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换氨基酸。
精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬
氨酸可充当彼此的保守置换氨基酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换氨
基酸。
[0182] 还可设想其它保守氨基酸置换分组。举例来说，可按类似的功能或化学结构或组成将氨基酸分组(例如，酸性氨基酸、碱性氨基酸，脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸，含硫氨基
酸)。例如，被归入脂肪族的氨基酸可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、
异亮氨酸(I)。包含可以被视为彼此的保守置换的氨基酸的其它分组包括：芳香族氨基酸：
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基
酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带
电荷的残基：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基：丝氨酸(S)、
苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组为本领域的技术人员所熟知，并
在多种标准教科书中述及。将本文列出的多肽序列与上文的置换分组结合，可明确提供所
有保守置换多肽序列的一览表。
酸)。例如，被归入脂肪族的氨基酸可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、
异亮氨酸(I)。包含可以被视为彼此的保守置换的氨基酸的其它分组包括：芳香族氨基酸：
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基
酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带
电荷的残基：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基：丝氨酸(S)、
苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组为本领域的技术人员所熟知，并
在多种标准教科书中述及。将本文列出的多肽序列与上文的置换分组结合，可明确提供所
有保守置换多肽序列的一览表。
[0183] 上述氨基酸残基类别内存在更保守的置换，它们同样或另选地可以是适宜的。更保守的保守置换组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙
氨酸-缬氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。
氨酸-缬氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0184] 本发明的多肽序列(例如，本发明的变体蛋白酶)的保守置换变异包括，将该多肽序列的少部分氨基酸，有时低于25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、
7％或6％的氨基酸，或低于5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸，或少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸，用相同保守置换组的保守选择的氨基酸置换。
7％或6％的氨基酸，或低于5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸，或少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸，用相同保守置换组的保守选择的氨基酸置换。
[0185] 如本文其它地方更详细描述的以及本文提供的实施例中所述的，本发明的多肽可具有能够与已知蛋白酶(包括已知丝氨酸蛋白酶)相媲美的清洁能力。
[0186] 在一些实施方案中，蛋白酶变体包含一个或多个突变，并且相对于LG12sprC(SEQ ID NO:3)具有-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4或5的总净电荷。
[0187] 在一些实施方案中，本发明提供分离、重组、基本上纯的、或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶(例如，变体LG12)，所述变体蛋白酶包含与SEQ ID NO:3、7、10、
13、16、19或20所示氨基酸序列相差不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不
超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不
超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不
超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨
基酸位置根据SEQ ID NO:3所示LG12sprC的氨基酸序列中相应氨基酸位置的编号进行编
号，这通过比对变体蛋白酶的氨基酸序列与LG12sprC的氨基酸序列来确定。
13、16、19或20所示氨基酸序列相差不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不
超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不
超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不
超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨
基酸位置根据SEQ ID NO:3所示LG12sprC的氨基酸序列中相应氨基酸位置的编号进行编
号，这通过比对变体蛋白酶的氨基酸序列与LG12sprC的氨基酸序列来确定。
[0188] 本发明的核酸
[0189] 本发明提供编码本发明多肽的分离、非天然存在的、或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”。本发明的核酸(包括
下文描述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(例如，表达)，通常是通过表达包
含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上文所述，多肽包括具有
酶活性(例如，蛋白水解活性)的变体蛋白酶多肽，包括变体LG12-进化枝多肽，其可用于清
洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(例如，物品的表面)。
下文描述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(例如，表达)，通常是通过表达包
含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上文所述，多肽包括具有
酶活性(例如，蛋白水解活性)的变体蛋白酶多肽，包括变体LG12-进化枝多肽，其可用于清
洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(例如，物品的表面)。
[0190] 在一些实施方案中，本发明提供分离、重组、基本上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码题为“本发明的多肽”的上述章节中以及本文其它地方所述的任何本发明多
肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、基本上纯的或非天然存
在的核酸，该核酸包含编码上述和本文其它地方所述的任何本发明多肽中的两种或更多种
的组合的核苷酸序列。
肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、基本上纯的或非天然存
在的核酸，该核酸包含编码上述和本文其它地方所述的任何本发明多肽中的两种或更多种
的组合的核苷酸序列。
[0191] 在一些实施方案中，本发明包括编码具有蛋白酶活性的分离、重组、基本上纯的、或非天然存在的变体LG12-进化枝酶的多核苷酸，该多肽包含与本文所提供的亲本LG12-进
化枝酶具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、
至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、
至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。
化枝酶具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、
至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、
至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。
[0192] 在一些实施方案中，变体多肽是与例示的LG12-进化枝多肽具有特定程度的氨基酸序列同源性的变体，例如，与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至
少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的序列同源性的变体。可采用氨基酸序列比对
测定同源性，例如，使用本文所述的像BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序测定。
少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的序列同源性的变体。可采用氨基酸序列比对
测定同源性，例如，使用本文所述的像BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序测定。
[0193] 本发明也提供分离、重组、基本上纯的、或非天然存在的核酸，该核酸包含编码具有蛋白水解活性的变体蛋白酶的多核苷酸序列，所述变体蛋白酶(例如，变体LG12sprC)包
含与SEQ ID NO:3、7、10、13、16、19或20的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过
30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过
16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过
9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或
不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中变体LG12-进化枝酶的氨基酸位置根据SEQ ID
NO:3所示LG12sprC的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号进行编号，这通过比对蛋白酶变
体的氨基酸序列与LG12sprC的氨基酸序列来确定。
含与SEQ ID NO:3、7、10、13、16、19或20的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过
30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过
16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过
9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或
不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中变体LG12-进化枝酶的氨基酸位置根据SEQ ID
NO:3所示LG12sprC的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号进行编号，这通过比对蛋白酶变
体的氨基酸序列与LG12sprC的氨基酸序列来确定。
[0194] 本发明提供编码芽孢杆菌LG12的LG12-进化枝变体的核酸，其中LG12变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并包含氨基酸序列，所述氨基酸序列含有本说明书所列的氨基酸
置换的组合，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3示出的LG12sprC的氨基
酸序列来编号的。
置换的组合，其中LG12变体的氨基酸位置是通过对应SEQ ID NO:3示出的LG12sprC的氨基
酸序列来编号的。
[0195] 本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的
固相合成技术来产生。在此类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后
连接(如通过酶连接方法或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法连接)，从而可以形
成基本上任何所需的连续核酸序列。还可通过本领域已知的任何合适的方法促进(或者实
现)本发明核酸的合成，所述方法包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法[参见例如
Beaucage等人，Tetrahedron Letters 22:1859-69(1981)]的化学合成；或由Matthes等人
所描述的方法[参见Matthes等人，EMBO J.3:801-805(1984)]，如通常在自动合成方法中实
施的。本发明的核酸也可使用自动DNA合成仪来产生。定制的核酸可以从多种商业来源订购
(例如，The Midland Certified Reagent Company、the Great American Gene Company、
Operon Technologies Inc.和DNA2.0)。用于合成核酸的其它技术和相关原理在本领域中
是已知的(参见例如Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.53:323(1984)；以及Itakura等人，
Science 198:1056(1984))。
固相合成技术来产生。在此类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后
连接(如通过酶连接方法或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法连接)，从而可以形
成基本上任何所需的连续核酸序列。还可通过本领域已知的任何合适的方法促进(或者实
现)本发明核酸的合成，所述方法包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法[参见例如
Beaucage等人，Tetrahedron Letters 22:1859-69(1981)]的化学合成；或由Matthes等人
所描述的方法[参见Matthes等人，EMBO J.3:801-805(1984)]，如通常在自动合成方法中实
施的。本发明的核酸也可使用自动DNA合成仪来产生。定制的核酸可以从多种商业来源订购
(例如，The Midland Certified Reagent Company、the Great American Gene Company、
Operon Technologies Inc.和DNA2.0)。用于合成核酸的其它技术和相关原理在本领域中
是已知的(参见例如Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.53:323(1984)；以及Itakura等人，
Science 198:1056(1984))。
[0196] 如上文所示，可用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域所熟知的。例如，诸如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA产生以及聚合酶链反应(例如，PCR)的技术是本领
域技术人员熟知并易于采用的。本发明的核苷酸还可以通过使用一种或多种可与编码本发
明变体蛋白酶多肽的多核苷酸杂交或使之PCR扩增的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(如使
用本领域常用的诱变技术(包括本文所述的那些)产生的cDNA文库)而获得。筛选和分离
cDNA克隆的工序和PCR扩增工序是本领域技术人员所熟知的，并在本领域技术人员已知的
标准参考文献中有所描述。本发明的一些核酸可通过利用例如已知的诱变工序(例如定点
诱变、点饱和诱变以及体外重组)来改变天然存在的多核苷酸主链(例如编码酶或亲本蛋白
酶的多核苷酸主链)来获得。
域技术人员熟知并易于采用的。本发明的核苷酸还可以通过使用一种或多种可与编码本发
明变体蛋白酶多肽的多核苷酸杂交或使之PCR扩增的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(如使
用本领域常用的诱变技术(包括本文所述的那些)产生的cDNA文库)而获得。筛选和分离
cDNA克隆的工序和PCR扩增工序是本领域技术人员所熟知的，并在本领域技术人员已知的
标准参考文献中有所描述。本发明的一些核酸可通过利用例如已知的诱变工序(例如定点
诱变、点饱和诱变以及体外重组)来改变天然存在的多核苷酸主链(例如编码酶或亲本蛋白
酶的多核苷酸主链)来获得。
[0197] 制备本发明的经修饰变体蛋白酶的方法
[0198] 多种适于产生编码本发明变体蛋白酶的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点
诱变、利用寡核苷酸合成和连接的合成基因构建、定向进化，以及多种其它重组方法。制备
经修饰的多核苷酸和蛋白(例如，变体蛋白酶)的方法包括DNA改组方法、基于基因的非同源
重组的方法，例如ITCHY(参见Ostermeier等人，7:2139-44(1999))、SCRACHY(参见Lutz等
人，98:11248-53(2001))、SHIPREC(参见Sieber等人，19:456-60(2001))、和NRR(参见
Bittker等人，20:1024-9(2001)；Bittker等人，101:7011-6(2004))，以及依赖于使用寡核
苷酸来插入随机和定向突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness等人，20:1251-5(2002)；
Coco等人，20:1246-50(2002)；Zha等人，4:34-9(2003)；Glaser等人，149:3903-13(1992))。
诱变、利用寡核苷酸合成和连接的合成基因构建、定向进化，以及多种其它重组方法。制备
经修饰的多核苷酸和蛋白(例如，变体蛋白酶)的方法包括DNA改组方法、基于基因的非同源
重组的方法，例如ITCHY(参见Ostermeier等人，7:2139-44(1999))、SCRACHY(参见Lutz等
人，98:11248-53(2001))、SHIPREC(参见Sieber等人，19:456-60(2001))、和NRR(参见
Bittker等人，20:1024-9(2001)；Bittker等人，101:7011-6(2004))，以及依赖于使用寡核
苷酸来插入随机和定向突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness等人，20:1251-5(2002)；
Coco等人，20:1246-50(2002)；Zha等人，4:34-9(2003)；Glaser等人，149:3903-13(1992))。
[0199] 用于产生本发明变体蛋白酶的载体、细胞和方法
[0200] 本发明提供分离的或重组的、包含至少一个本文所述的本发明多核苷酸(例如，编码本文所述的本发明变体蛋白酶的多核苷酸)的载体；分离的或重组的、包含至少一个本发
明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、基本上纯的或重组的、包含至少一个本
发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的、包含至少一个本发明多核苷酸的细
胞；包含含有至少一个本发明多核苷酸的细胞的细胞培养物；包含至少一个本发明的核酸
或多核苷酸的细胞培养物；以及包含一个或多个所述载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构
建体、细胞、细胞培养物、或其任何组合或混合物的组合物。
明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、基本上纯的或重组的、包含至少一个本
发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的、包含至少一个本发明多核苷酸的细
胞；包含含有至少一个本发明多核苷酸的细胞的细胞培养物；包含至少一个本发明的核酸
或多核苷酸的细胞培养物；以及包含一个或多个所述载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构
建体、细胞、细胞培养物、或其任何组合或混合物的组合物。
[0201] 在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个本发明载体(例如，表达载体或DNA构建体)的重组细胞，其中所述载体包含至少一个本发明的核酸或多核苷酸。一些此类重组
细胞用所述至少一个载体转化或转染。此类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包含细
菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一
个本发明的变体蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
细胞用所述至少一个载体转化或转染。此类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包含细
菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一
个本发明的变体蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
[0202] 在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施方案中，该载体为表达载体或表达盒，其中编码本发明变体蛋白酶的本发明多核苷酸序
列有效连接至有效基因表达所需的一个或多个其它核酸片段(例如，有效连接至编码本发
明变体蛋白酶的本发明多核苷酸的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗
生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的
宿主细胞进行连续的培养维持。
列有效连接至有效基因表达所需的一个或多个其它核酸片段(例如，有效连接至编码本发
明变体蛋白酶的本发明多核苷酸的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗
生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的
宿主细胞进行连续的培养维持。
[0203] 表达载体可得自质粒或病毒DNA，或在可供选择的实施方案中，包含这二者的元件。示例性载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting编
辑，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus，John Wiley&Sons[1990]；合适
的枯草芽孢杆菌复制质粒包括列于第92页那些质粒；另参见Perego，“Integrational
Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis”，载于Sonenshein等人编
辑的Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,
Physiology and Molecular Genetics，American Society for Microbiology，
Washington,D.C.[1993]，第615-624页)。
辑，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus，John Wiley&Sons[1990]；合适
的枯草芽孢杆菌复制质粒包括列于第92页那些质粒；另参见Perego，“Integrational
Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis”，载于Sonenshein等人编
辑的Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,
Physiology and Molecular Genetics，American Society for Microbiology，
Washington,D.C.[1993]，第615-624页)。
[0204] 为了在细胞中表达和产生所关注的蛋白质(例如，变体蛋白酶)，将包含至少一个拷贝(优选包含多个拷贝)的编码经修饰蛋白酶的多核苷酸的至少一个表达载体在适于表
达该蛋白酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施方案中，将编码变体蛋白酶的多
核苷酸序列(以及载体中包含的其它序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其它实施方案
中，将包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外
元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的进入(incoming)核苷
酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施方案中，编码变
体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于整合载体上，这使得编码变体蛋白酶的多核苷酸可以整
合到细菌染色体中以及任选地扩增。整合位点的例子是本领域的技术人员所熟知的。在一
些实施方案中，编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子对
所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子。在一些其它实施方案中，启动子对于前体蛋白
酶而言是异源的，但在宿主细胞中有功能。具体地讲，适用于细菌宿主细胞的启动子例子包
括但不限于，例如AprE、amyE、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢
杆菌产麦芽糖淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基
因、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因、苏云金芽孢杆菌
cryIIIA、以及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子
以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。
达该蛋白酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施方案中，将编码变体蛋白酶的多
核苷酸序列(以及载体中包含的其它序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其它实施方案
中，将包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外
元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的进入(incoming)核苷
酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施方案中，编码变
体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于整合载体上，这使得编码变体蛋白酶的多核苷酸可以整
合到细菌染色体中以及任选地扩增。整合位点的例子是本领域的技术人员所熟知的。在一
些实施方案中，编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子对
所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子。在一些其它实施方案中，启动子对于前体蛋白
酶而言是异源的，但在宿主细胞中有功能。具体地讲，适用于细菌宿主细胞的启动子例子包
括但不限于，例如AprE、amyE、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢
杆菌产麦芽糖淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基
因、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因、苏云金芽孢杆菌
cryIIIA、以及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子
以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。
[0205] 本发明的变体蛋白酶可在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)宿主细胞中产生。例如，在一些实施方案中，变体蛋白酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一些实
施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希杆菌属
(Escherichia sp.)或曲霉属(Aspergillus sp.)的。在一些实施方案中，变体蛋白酶由芽
孢杆菌属宿主细胞产生。可以用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌属宿主细胞的例子包
括但不限于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽
孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌
(B.alkalophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢
杆菌(B.pumilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、和
巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、以及芽孢杆菌属内的其它生物体。在一些实施方案中，枯草
芽孢杆菌宿主细胞用于产生变体蛋白酶。美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描
述了可用于产生本发明的变体蛋白酶的不同芽孢杆菌宿主菌株，但也可使用其它合适的菌
株。
施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希杆菌属
(Escherichia sp.)或曲霉属(Aspergillus sp.)的。在一些实施方案中，变体蛋白酶由芽
孢杆菌属宿主细胞产生。可以用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌属宿主细胞的例子包
括但不限于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽
孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌
(B.alkalophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢
杆菌(B.pumilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、和
巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、以及芽孢杆菌属内的其它生物体。在一些实施方案中，枯草
芽孢杆菌宿主细胞用于产生变体蛋白酶。美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描
述了可用于产生本发明的变体蛋白酶的不同芽孢杆菌宿主菌株，但也可使用其它合适的菌
株。
[0206] 可用于产生本发明变体蛋白酶的多种工业细菌菌株包括非重组(即，野生型)芽孢杆菌属菌株以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施方案中，宿主菌株为重
组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施方案中，宿主菌株
为枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是
已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753到
PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC
39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics 73:215–228
组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施方案中，宿主菌株
为枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是
已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753到
PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC
39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics 73:215–228
[1973]；另参见美国专利4,450,235和4,302,544以及EP 0134048，这些专利文献全文以引用方式并入本文)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如Palva
等人，Gene 19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，165:796–804[1986]；
以及Wang等人，Gene 69:39–47[1988])。
等人，Gene 19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，165:796–804[1986]；
以及Wang等人，Gene 69:39–47[1988])。
[0207] 在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。优选地，突变在degU基因中，并且更优选
地突变是degU(Hy)32(参见例如Msadek等人，J.Bacteriol.172:824-834[1990]；以及Olmos
等人，Mol.Gen.Genet.253:562-567[1997])。一个合适的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变
的枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主包含如下基因中的突变或缺失：scoC4
(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如Arigoni
等人，Mol.Microbiol.31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其它基因(参见例
如Perego等人，Mol.Microbiol.5:173-185[1991])。实际上，可以设想到，opp操纵子中可导
致与oppA基因突变相同表型的任何突变将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一些实
施方案。在一些实施方案中，这些突变单独地出现，而在其它实施方案中，存在突变的组合。
在一些实施方案中，可用于产生本发明的变体蛋白酶的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株是已
在上述基因的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。此外，可以使用包含内源蛋白
酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包
含aprE和nprE基因的缺失。在其它实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的
缺失，而在其它实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如美
国专利申请公布2005/0202535，该专利以引用方式并入本文)。
地突变是degU(Hy)32(参见例如Msadek等人，J.Bacteriol.172:824-834[1990]；以及Olmos
等人，Mol.Gen.Genet.253:562-567[1997])。一个合适的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变
的枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主包含如下基因中的突变或缺失：scoC4
(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如Arigoni
等人，Mol.Microbiol.31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其它基因(参见例
如Perego等人，Mol.Microbiol.5:173-185[1991])。实际上，可以设想到，opp操纵子中可导
致与oppA基因突变相同表型的任何突变将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一些实
施方案。在一些实施方案中，这些突变单独地出现，而在其它实施方案中，存在突变的组合。
在一些实施方案中，可用于产生本发明的变体蛋白酶的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株是已
在上述基因的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。此外，可以使用包含内源蛋白
酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包
含aprE和nprE基因的缺失。在其它实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的
缺失，而在其它实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如美
国专利申请公布2005/0202535，该专利以引用方式并入本文)。
[0208] 可以使用任何合适的本领域已知的方法，用编码至少一个本发明变体蛋白酶的至少一个核酸转化宿主细胞。无论是核酸是整合在载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使
用核酸，通常会将核酸引入微生物中，在一些实施方案中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态
芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆
菌细胞或大肠杆菌细胞中从而将核酸(如，DNA)引入此类细胞中的方法是众所周知的。在一
些实施方案中，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并且转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用例
如大肠杆菌的中间微生物不是必需的，在一些实施方案中，将DNA构建体或载体直接引入芽
孢杆菌宿主中。
用核酸，通常会将核酸引入微生物中，在一些实施方案中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态
芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆
菌细胞或大肠杆菌细胞中从而将核酸(如，DNA)引入此类细胞中的方法是众所周知的。在一
些实施方案中，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并且转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用例
如大肠杆菌的中间微生物不是必需的，在一些实施方案中，将DNA构建体或载体直接引入芽
孢杆菌宿主中。
[0209] 本领域的技术人员十分了解适于将本发明的核酸或多核苷酸序列引入芽孢杆菌细胞中的方法(参见例如Ferrari等人，“Genetics”载于Harwood等人[编辑]的Bacillus，
Plenum Publishing Corp.[1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.157:718-726
Plenum Publishing Corp.[1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.157:718-726
[1984]；Hoch等人，J.Bacteriol.93:1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbiol.13:131-135[1986]；Holubova,Folia Microbiol.30:97[1985]；Chang等人，
Mol.Gen.Genet.168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS Microbiol.Lett.7:261-263
Mol.Gen.Genet.168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS Microbiol.Lett.7:261-263
[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.51:634[1986]；Fisher等人，Arch.Microbiol.139:213-217[1981]；以及McDonald,J.Gen.Microbiol.130:203[1984])。
实际上，诸如转化(包括原生质体转化)、以及congression、转导和原生质体融合之类的方
法是众所周知的并且适用于本发明。可以使用转化方法将包含编码本发明变体蛋白酶的核
酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括例如
质粒标记拯救转化方法，该方法涉及由携带部分同源的居民质粒的感受态细胞摄入供体质
粒(参见Contente等人，Plasmid 2:555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.223:185-
191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.154:1077-1087[1983]；以及Weinrauch等人，
J.Bacteriol.169:1205-1211[1987])。在该方法中，进入供体质粒与居民“辅助”质粒的同
源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
实际上，诸如转化(包括原生质体转化)、以及congression、转导和原生质体融合之类的方
法是众所周知的并且适用于本发明。可以使用转化方法将包含编码本发明变体蛋白酶的核
酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括例如
质粒标记拯救转化方法，该方法涉及由携带部分同源的居民质粒的感受态细胞摄入供体质
粒(参见Contente等人，Plasmid 2:555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.223:185-
191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.154:1077-1087[1983]；以及Weinrauch等人，
J.Bacteriol.169:1205-1211[1987])。在该方法中，进入供体质粒与居民“辅助”质粒的同
源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
[0210] 除了通常使用的方法，在一些实施方案中，将宿主细胞直接用包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体转化(即，引入宿主细胞之前，未使用中间细胞来扩增
该DNA构建体或载体，或未以别的方式处理该DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或
载体引入宿主细胞包括在本领域已知的那些在不插入质粒或载体的情况下将核酸序列(例
如，DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电
穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施方案中，将DNA构建体或载体与质粒共同转
化，而不插入质粒中。在另外的实施方案中，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌菌
株缺失掉选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.158:411-418[1984]；以及Palmeros等
人，Gene 247:255-264[2000])。
该DNA构建体或载体，或未以别的方式处理该DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或
载体引入宿主细胞包括在本领域已知的那些在不插入质粒或载体的情况下将核酸序列(例
如，DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电
穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施方案中，将DNA构建体或载体与质粒共同转
化，而不插入质粒中。在另外的实施方案中，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌菌
株缺失掉选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.158:411-418[1984]；以及Palmeros等
人，Gene 247:255-264[2000])。
[0211] 在一些实施方案中，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中很好地进行了描
述。在一些实施方案中，本发明提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶或至少一种本发明
的核酸的培养物(例如，细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA
构建体的组合物。
述。在一些实施方案中，本发明提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶或至少一种本发明
的核酸的培养物(例如，细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA
构建体的组合物。
[0212] 在一些实施方案中，将用编码至少一个本发明变体蛋白酶的至少一个多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从
该培养物回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包括任何适于宿主细胞生长的常规培
养基，例如含有适当补充剂的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可以得自商业供应
商或可根据公布的配方(参见例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture
Collection)的目录)制备。在一些实施方案中，通过常规的工序从培养基回收由细胞产生
的蛋白酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(例如，
硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分，进行色谱纯化(如离子交换色谱、凝胶过滤色
谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体蛋白酶的方法均可用于本发明。
该培养物回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包括任何适于宿主细胞生长的常规培
养基，例如含有适当补充剂的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可以得自商业供应
商或可根据公布的配方(参见例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture
Collection)的目录)制备。在一些实施方案中，通过常规的工序从培养基回收由细胞产生
的蛋白酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(例如，
硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分，进行色谱纯化(如离子交换色谱、凝胶过滤色
谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体蛋白酶的方法均可用于本发明。
[0213] 在一些实施方案中，由重组宿主细胞产生的变体蛋白酶分泌进培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用于促进可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体蛋白酶的多核
苷酸序列的载体或DNA构建体，还可以包含编码利于纯化的结构域的核酸序列以促进该变
体蛋白酶的纯化(参见例如Kroll等人，DNA Cell Biol.12:441-53[1993])。此类利于纯化
的结构域包括但不限于，例如金属螯合肽，如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模
块(参见Porath,Protein Expr.Purif.3:263-281[1992])、允许在固定化免疫球蛋白上纯
化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(例如，得自Immunex
Corp.，Seattle，WA的蛋白A结构域)。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可剪切的接头序
列如XA因子或肠激酶(例如，得自Invitrogen，San Diego，CA的序列)也可以用于促进纯化。
苷酸序列的载体或DNA构建体，还可以包含编码利于纯化的结构域的核酸序列以促进该变
体蛋白酶的纯化(参见例如Kroll等人，DNA Cell Biol.12:441-53[1993])。此类利于纯化
的结构域包括但不限于，例如金属螯合肽，如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模
块(参见Porath,Protein Expr.Purif.3:263-281[1992])、允许在固定化免疫球蛋白上纯
化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(例如，得自Immunex
Corp.，Seattle，WA的蛋白A结构域)。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可剪切的接头序
列如XA因子或肠激酶(例如，得自Invitrogen，San Diego，CA的序列)也可以用于促进纯化。
[0214] 用于检测和测量酶(如本发明的变体蛋白酶)的酶活性的测定法是熟知的。各种用于检测和测量蛋白酶(例如，本发明的变体蛋白酶)活性的测定法也是本领域的普通技术人
员已知的。具体地讲，可利用一些测定法来测量蛋白酶活性，这些测定法立足于酸可溶性肽
从酪蛋白或血红蛋白的释放，测定280nm处的吸光度或利用本领域的技术人员熟知的福林
法进行比色测量。其它示例性的测定法涉及显色底物的增溶作用(参见例如Ward，
“Proteinases”，载于Fogarty编辑的Microbial Enzymes and Biotechnology，Applied
Science，London,[1983]，第251-317页)。其它示例性的测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-
Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS
测定法)。本领域人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等
人，Nucleic Acids Res.11:7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.223:
119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal Biochem.242:221-227[1999])。
员已知的。具体地讲，可利用一些测定法来测量蛋白酶活性，这些测定法立足于酸可溶性肽
从酪蛋白或血红蛋白的释放，测定280nm处的吸光度或利用本领域的技术人员熟知的福林
法进行比色测量。其它示例性的测定法涉及显色底物的增溶作用(参见例如Ward，
“Proteinases”，载于Fogarty编辑的Microbial Enzymes and Biotechnology，Applied
Science，London,[1983]，第251-317页)。其它示例性的测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-
Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS
测定法)。本领域人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等
人，Nucleic Acids Res.11:7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.223:
119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal Biochem.242:221-227[1999])。
[0215] 多种方法可用于测定成熟蛋白酶(例如，本发明的成熟变体蛋白酶)在宿主细胞中的产生水平。此类方法包括但不限于例如利用蛋白酶特异性的多克隆或单克隆抗体的方
法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、荧光
免疫测定法(FIA)、以及荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其它测定法是本领域中所熟知
的(参见例如Maddox等人，J.Exp.Med.158:1211[1983])。
法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、荧光
免疫测定法(FIA)、以及荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其它测定法是本领域中所熟知
的(参见例如Maddox等人，J.Exp.Med.158:1211[1983])。
[0216] 在一些其它实施方案中，本发明提供用于制备或产生本发明的成熟变体蛋白酶的方法。成熟变体蛋白酶不包含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞，例如
芽孢杆菌属细胞(如，枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施
方案中，本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括在有利于产生变体蛋白
酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变
体蛋白酶的核酸。一些此类方法还包括从培养物回收变体蛋白酶。
芽孢杆菌属细胞(如，枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施
方案中，本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括在有利于产生变体蛋白
酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变
体蛋白酶的核酸。一些此类方法还包括从培养物回收变体蛋白酶。
[0217] 在一些实施方案中，本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括：(a)将包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的重组表达载体引入细胞群(例如，细菌细胞，如
枯草芽孢杆菌细胞)；以及(b)在有利于产生由该表达载体编码的变体蛋白酶的条件下在培
养基中培养该细胞。一些此类方法还包括：(c)从所述细胞或从所述培养基分离所述变体蛋
白酶。
枯草芽孢杆菌细胞)；以及(b)在有利于产生由该表达载体编码的变体蛋白酶的条件下在培
养基中培养该细胞。一些此类方法还包括：(c)从所述细胞或从所述培养基分离所述变体蛋
白酶。
[0218] 清洁组合物
[0219] 除非另外指明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，排除市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)。酶组分重量基于
总活性蛋白计。除非另外指明，否则所有百分比和比率都按重量计算。除非另外指明，否则
所有百分比和比率都基于总组合物计算。在例示的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总
组合物的重量比表示，并且除非另外指明，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
总活性蛋白计。除非另外指明，否则所有百分比和比率都按重量计算。除非另外指明，否则
所有百分比和比率都基于总组合物计算。在例示的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总
组合物的重量比表示，并且除非另外指明，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
[0220] 如本文所指出，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含辅助材料，包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定系统、螯合
剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料
盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、
抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀
剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如，美国专利6,610,642、6,
605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所有这些
专利文献均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施方案在下文中详细举例说
明。在清洁组合物中清洁助剂材料与本发明的变体蛋白酶不相容的实施方案中，可以使用
保持清洁助剂材料与所述蛋白酶在适于组合在一起之前分离(即，相互不接触)的合适方
法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如，囊形片(gelcap)、包封法、片剂
法、物理分离法等)。
剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料
盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、
抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀
剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如，美国专利6,610,642、6,
605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所有这些
专利文献均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施方案在下文中详细举例说
明。在清洁组合物中清洁助剂材料与本发明的变体蛋白酶不相容的实施方案中，可以使用
保持清洁助剂材料与所述蛋白酶在适于组合在一起之前分离(即，相互不接触)的合适方
法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如，囊形片(gelcap)、包封法、片剂
法、物理分离法等)。
[0221] 有利地，本发明的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、盘碟洗涤应用，以及化妆应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，归因于在低温溶液中效力增加的独特优
势，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可以用于颗粒状和液体组合
物中。
势，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可以用于颗粒状和液体组合
物中。
[0222] 本发明的变体蛋白酶也可以用于清洁添加剂产品。在一些实施方案中，可以使用低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本发明酶的清洁添加
剂产品，当需要附加漂白效力时，该添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。这种情况包
括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加剂产品为其最简单形式，即一种或
多种蛋白酶。在一些实施方案中，添加剂被包装成用于添加至清洁过程的剂型。在一些实施
方案中，添加剂被包装成用于添加到采用过氧源并且需要增加漂白效力的清洁过程中的剂
型。任何合适的单剂量单位形式都可用于本发明，包括但不限于：小丸、片、囊形片，或其它
单剂量单位例如预量的粉末或液体。在一些实施方案中，此类组合物包括填料或载体材料
以增大其体积。合适的填料或载体材料包括但不限于多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑
石、粘土等。合适的液体组合物填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包
括多元醇和二醇)。此类醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案
中，组合物含有约5％至约90％的此类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施方案
中，清洁添加剂包含助剂成分，如下文所更全面描述的。
剂产品，当需要附加漂白效力时，该添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。这种情况包
括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加剂产品为其最简单形式，即一种或
多种蛋白酶。在一些实施方案中，添加剂被包装成用于添加至清洁过程的剂型。在一些实施
方案中，添加剂被包装成用于添加到采用过氧源并且需要增加漂白效力的清洁过程中的剂
型。任何合适的单剂量单位形式都可用于本发明，包括但不限于：小丸、片、囊形片，或其它
单剂量单位例如预量的粉末或液体。在一些实施方案中，此类组合物包括填料或载体材料
以增大其体积。合适的填料或载体材料包括但不限于多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑
石、粘土等。合适的液体组合物填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包
括多元醇和二醇)。此类醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案
中，组合物含有约5％至约90％的此类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施方案
中，清洁添加剂包含助剂成分，如下文所更全面描述的。
[0223] 本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的单独的或与其它蛋白酶和/或附加的酶进行组合的本文所提供的变体蛋白酶中的至少一种。所需的酶水平通过添加一种或
多种本发明的变体蛋白酶来实现。通常，本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约
0.0001重量％至约10重量％、约0.001重量％至约1重量％、或甚至约0.01重量％至约0.1重
量％的至少一种本发明的变体蛋白酶。
多种本发明的变体蛋白酶来实现。通常，本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约
0.0001重量％至约10重量％、约0.001重量％至约1重量％、或甚至约0.01重量％至约0.1重
量％的至少一种本发明的变体蛋白酶。
[0224] 本文的清洁组合物通常配制为使得，在水性清洁操作中使用期间，洗涤水具有约5.0至约11.5的pH，或甚至约7.5至约10.5的pH。液体产品制剂通常配制成具有约3.0至约
9.0或甚至约3至约5的净pH。颗粒状洗衣用产品通常配制成具有约9至约11的pH。用于将pH
控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员
所熟知的。
9.0或甚至约3至约5的净pH。颗粒状洗衣用产品通常配制成具有约9至约11的pH。用于将pH
控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员
所熟知的。
[0225] 合适的“低pH清洁组合物”通常具有约3至约5的净pH，并且通常不含在此类pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基硫酸钠表面活性剂，该表面活性剂可以包
含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物通常包含足
量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，从而得到具有约3至约5的净pH的此类清洁组
合物。此类组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施方案中，所述组合物为液体，
而在其它实施方案中，其为固体。此类液体组合物的pH通常是以净pH度量。此类固体组合物
的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，除非
另外指明，否则所有pH测量值均在20℃取得。
含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物通常包含足
量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，从而得到具有约3至约5的净pH的此类清洁组
合物。此类组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施方案中，所述组合物为液体，
而在其它实施方案中，其为固体。此类液体组合物的pH通常是以净pH度量。此类固体组合物
的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，除非
另外指明，否则所有pH测量值均在20℃取得。
[0226] 在一些实施方案中，当在颗粒组合物或液体中采用变体蛋白酶时，期望变体蛋白酶为包封的颗粒的形式，以在存储过程中保护变体蛋白酶免受该颗粒组合物的其它组分的
影响。此外，包封还是控制变体蛋白酶在清洁过程期间的利用度的方式。在一些实施方案
中，包封可以增强变体蛋白酶和/或附加的酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶
可以使用本领域已知的任何合适的包封材料包封。在一些实施方案中，包封材料通常包封
本发明变体蛋白酶的催化剂的至少部分。通常，包封材料具有水溶性和/或水分散性。在一
些实施方案中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。在WO 97/11151中对玻璃
化转变温度进行了更详细的描述。包封材料通常选自碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲
壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡、
以及它们的组合。当包封材料为碳水化合物时，其通常选自单糖、低聚糖、多糖、以及它们的
组合。在一些典型的实施方案中，包封材料为淀粉(参见例如，EP 0 922 499、US 4,977,
252、US 5,354,559和US5,935,826)。在一些实施方案中，包封材料是由塑料例如热塑性塑
料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的混合物制成的微球体；适用的
市售微球体包括但不限于以 (Stockviksverken,Sweden)和PM6545、PM
6550、PM 7220、PM 7228、 Q- 和
(PQ Corp.,Valley Forge,PA)供应的那些微球体。
影响。此外，包封还是控制变体蛋白酶在清洁过程期间的利用度的方式。在一些实施方案
中，包封可以增强变体蛋白酶和/或附加的酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶
可以使用本领域已知的任何合适的包封材料包封。在一些实施方案中，包封材料通常包封
本发明变体蛋白酶的催化剂的至少部分。通常，包封材料具有水溶性和/或水分散性。在一
些实施方案中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。在WO 97/11151中对玻璃
化转变温度进行了更详细的描述。包封材料通常选自碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲
壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡、
以及它们的组合。当包封材料为碳水化合物时，其通常选自单糖、低聚糖、多糖、以及它们的
组合。在一些典型的实施方案中，包封材料为淀粉(参见例如，EP 0 922 499、US 4,977,
252、US 5,354,559和US5,935,826)。在一些实施方案中，包封材料是由塑料例如热塑性塑
料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的混合物制成的微球体；适用的
市售微球体包括但不限于以 (Stockviksverken,Sweden)和PM6545、PM
6550、PM 7220、PM 7228、 Q- 和
(PQ Corp.,Valley Forge,PA)供应的那些微球体。
[0227] 如本文所述，本发明的变体蛋白酶尤其可用于清洁行业，包括但不限于衣物和盘碟洗涤剂。这些应用将酶置于多种环境胁迫下。本发明的变体蛋白酶由于在多种条件下的
稳定性而提供了优于许多当前所用酶的优点。
稳定性而提供了优于许多当前所用酶的优点。
[0228] 实际上，参与洗涤的蛋白酶会暴露于多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，对于不同地理区域使用的洗涤剂制剂，洗涤水
中其相关组分的存在浓度可以不相同。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500ppm
至5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。
在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
中其相关组分的存在浓度可以不相同。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500ppm
至5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。
在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
[0229] 低洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组
分。
分。
[0230] 中等洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在介于约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有
大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。
大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。
[0231] 高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约4500ppm至
5000ppm的洗涤剂组分。
5000ppm的洗涤剂组分。
[0232] 拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可落入中等洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度中，因为其在洗涤水中具有1500ppm至
6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西洗涤剂通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂
组分。然而，其它高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域(不限于其它拉丁美洲国家)也可具有
高洗涤剂浓度系统，在洗涤水中存在高达约6000ppm的洗涤剂组分。
6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西洗涤剂通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂
组分。然而，其它高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域(不限于其它拉丁美洲国家)也可具有
高洗涤剂浓度系统，在洗涤水中存在高达约6000ppm的洗涤剂组分。
[0233] 按照上文所述，很明显在全世界范围内，洗涤剂组合物在典型洗涤溶液中的浓度在低于约800ppm(“低洗涤剂浓度地理位置”；例如在日本约667ppm)至介于约800ppm至约
2000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理位置”；例如在美国约975ppm，以及在巴西约1500ppm)
再到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”；例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及
在高泡磷酸盐助洗剂地理位置约6000ppm)的洗涤剂组合物间变动。
2000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理位置”；例如在美国约975ppm，以及在巴西约1500ppm)
再到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”；例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及
在高泡磷酸盐助洗剂地理位置约6000ppm)的洗涤剂组合物间变动。
[0234] 典型洗涤溶液的浓度可以凭经验确定。例如，在美国，典型洗衣机容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，必须将约62.79g洗涤
剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加
入洗涤水中的典型量。
剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加
入洗涤水中的典型量。
[0235] 作为另一个例子，不同地理位置使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常介于约10℃至约30℃之间
(例如，约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃至约60℃之间(例如，约40℃)。然而，
为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用
于洗衣以及盘碟洗涤应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”利用适于在如下温度
进行洗涤的“冷水洗涤剂”：约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及
在约15℃至约35℃范围内的所有其它温度组合、和在10℃至40℃内的所有温度范围。
(例如，约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃至约60℃之间(例如，约40℃)。然而，
为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用
于洗衣以及盘碟洗涤应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”利用适于在如下温度
进行洗涤的“冷水洗涤剂”：约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及
在约15℃至约35℃范围内的所有其它温度组合、和在10℃至40℃内的所有温度范围。
[0236] 作为另一个例子，不同地理位置通常具有不同的水硬度。水硬度通常以每加仑中混合的Ca2+/Mg2+的格令数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大多
数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm
换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。
数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm
换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。
[0237]水 每加仑格令数 ppm
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
[0238] 欧洲的水硬度通常是每加仑中的混合Ca2+/Mg2+高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如约15格令/加仑的混合Ca2+/Mg2+)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，
但低于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为
约6格令。日本的水硬度通常低于北美的水硬度，通常小于约4，例如约3格令/加仑的混合
Ca2+/Mg2+。
但低于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为
约6格令。日本的水硬度通常低于北美的水硬度，通常小于约4，例如约3格令/加仑的混合
Ca2+/Mg2+。
[0239] 因此，在一些实施方案中，本发明提供的变体蛋白酶在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出惊人的洗涤性能。在一些实施方案中，本发明的变体
蛋白酶与其它LG12蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施方案中，本文提供的变体
蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在多种条件下的清洁能力和/或
增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可以，单独地或与助洗剂和稳定剂组合
地，用于不包含洗涤剂的清洁组合物中。
蛋白酶与其它LG12蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施方案中，本文提供的变体
蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在多种条件下的清洁能力和/或
增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可以，单独地或与助洗剂和稳定剂组合
地，用于不包含洗涤剂的清洁组合物中。
[0240] 在本发明的一些实施方案中，以组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.00001％至约10％的至少一种本发明变体蛋白酶，以及以组合物的重量计，余量(例如约
99.999％至约90.0％)包含清洁助剂材料。在本发明的一些其它实施方案中，以组合物的重
量计，本发明的清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约
2％、约0.005％至约0.5％的至少一种变体蛋白酶，清洁组合物的余量(例如，约99.9999重
量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包
含清洁助剂材料。
99.999％至约90.0％)包含清洁助剂材料。在本发明的一些其它实施方案中，以组合物的重
量计，本发明的清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约
2％、约0.005％至约0.5％的至少一种变体蛋白酶，清洁组合物的余量(例如，约99.9999重
量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包
含清洁助剂材料。
[0241] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤剂酶，该酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或盘碟洗涤益处。合适的酶的例子包括但不限于半纤维
素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果
胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、普鲁
兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆
酶以及淀粉酶、或它们的任何组合或混合物。在一些实施方案中，使用包含常规应用性酶的
酶组合(即“合剂(cocktail)”)，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。
素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果
胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、普鲁
兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆
酶以及淀粉酶、或它们的任何组合或混合物。在一些实施方案中，使用包含常规应用性酶的
酶组合(即“合剂(cocktail)”)，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。
[0242] 除本文提供的蛋白酶变体之外，任何其它合适的蛋白酶均可用于本发明的组合物。合适的蛋白酶包括源于动物、植物或微生物的蛋白酶。在一些实施方案中，使用微生物
蛋白酶。在一些实施方案中，包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，蛋白酶
是丝氨酸蛋白酶，优选地是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包
括枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些(如枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、
lentus、amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋
白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的例子包括在美国专利RE 34,606、5,955,340、5,
700,676、6,312,936、和6,482,628中所述的那些突变蛋白酶，这些专利均据此以引用方式
并入本文。另外的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶(例如源于猪或牛的胰蛋白酶)和WO
89/06270中所述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施方案中，可用于本发明的市售蛋
白酶包括但不限于 MAXACALTM、MAXAPEMTM、
OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(Genencor)；
DURAZYMTM、
和
TM TM
(Novozymes)；BLAP 和BLAP 变体(Henkel Kommanditgesellschaft auf
Aktien,Duesseldorf,Germany)和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；Kao Corp.，Tokyo，
Japan)。WO 95/23221、WO 92/21760、美国专利公布2008/0090747和美国专利5,801,039，5,
340,735，5,500,364，5,855,625，US RE 34,606，5,955,340，5,700,676，6,312,936，和6,
482,628以及各种其它专利中描述了各种蛋白酶。在一些另外的实施方案中，丝氨酸蛋白酶
可用于本发明，包括但不限于WO 07/044993中所述的中性丝氨酸蛋白酶。
蛋白酶。在一些实施方案中，包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，蛋白酶
是丝氨酸蛋白酶，优选地是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包
括枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些(如枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、
lentus、amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋
白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的例子包括在美国专利RE 34,606、5,955,340、5,
700,676、6,312,936、和6,482,628中所述的那些突变蛋白酶，这些专利均据此以引用方式
并入本文。另外的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶(例如源于猪或牛的胰蛋白酶)和WO
89/06270中所述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施方案中，可用于本发明的市售蛋
白酶包括但不限于 MAXACALTM、MAXAPEMTM、
OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(Genencor)；
DURAZYMTM、
和
TM TM
(Novozymes)；BLAP 和BLAP 变体(Henkel Kommanditgesellschaft auf
Aktien,Duesseldorf,Germany)和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；Kao Corp.，Tokyo，
Japan)。WO 95/23221、WO 92/21760、美国专利公布2008/0090747和美国专利5,801,039，5,
340,735，5,500,364，5,855,625，US RE 34,606，5,955,340，5,700,676，6,312,936，和6,
482,628以及各种其它专利中描述了各种蛋白酶。在一些另外的实施方案中，丝氨酸蛋白酶
可用于本发明，包括但不限于WO 07/044993中所述的中性丝氨酸蛋白酶。
[0243] 此外，任何合适的脂肪酶可用于本发明。合适的脂肪酶包括但不限于来源于细菌或真菌的脂肪酶。本发明涵盖经化学或遗传修饰的突变体。可用的脂肪酶例子包括柔毛腐
质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258 068和EP 305 216)、米黑根毛霉
(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶例如南极
假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如EP 214 761)、假
单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞
菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪
酶(参见例如EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、
荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶
(Dartois et al.,Biochem.Biophys.Acta 1131:253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪
酶(参见例如JP 64/744992)；短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422))。
质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258 068和EP 305 216)、米黑根毛霉
(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶例如南极
假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如EP 214 761)、假
单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞
菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪
酶(参见例如EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、
荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶
(Dartois et al.,Biochem.Biophys.Acta 1131:253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪
酶(参见例如JP 64/744992)；短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422))。
[0244] 此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明一些实施方案中，包括但不限于：沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene，第103卷第61-67
页，1991年)、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.，第106
卷第383-388页，1989年)，以及各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶，例如戴尔根霉(R.delemar)
脂肪酶(参见Hass等人，Gene，第109卷第117-113页，1991年)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶
(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.，第56卷第716-719页，1992年)和米根霉
(R.oryzae)脂肪酶。
页，1991年)、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.，第106
卷第383-388页，1989年)，以及各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶，例如戴尔根霉(R.delemar)
脂肪酶(参见Hass等人，Gene，第109卷第117-113页，1991年)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶
(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.，第56卷第716-719页，1992年)和米根霉
(R.oryzae)脂肪酶。
[0245] 其它类型的脂解酶(例如角质酶)也可用于本发明的一些实施方案，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和源自豌豆
腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
[0246] 另外合适的脂肪酶包括市售的脂肪酶，例如M1LIPASETM、LUMA FASTTM和LIPOMAXTM(Genencor)； 和 ULTRA(Novozymes)；以及LIPASE
PT“M Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.,Japan)。
PT“M Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.,Japan)。
[0247] 在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计脂肪酶水平为约0.00001％至约10％的附加脂肪酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。
在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计脂肪酶水
平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的
脂肪酶。
在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计脂肪酶水
平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的
脂肪酶。
[0248] 在本发明的一些实施方案中，任何合适的淀粉酶均可以用于本发明。在一些实施方案中，还可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(例如，α和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶
包括但不限于来源于细菌或真菌的淀粉酶。一些实施方案包括经化学或遗传修饰的突变
体。用于本发明的淀粉酶，包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α淀粉酶(参见例如，GB 1,
296,839)。用于本发明的市售淀粉酶，包括但不限于
STAINZYME
STAINZYME BANTM(Novozymes)，以及POWERASETM、 和
P(Genencor)。
包括但不限于来源于细菌或真菌的淀粉酶。一些实施方案包括经化学或遗传修饰的突变
体。用于本发明的淀粉酶，包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α淀粉酶(参见例如，GB 1,
296,839)。用于本发明的市售淀粉酶，包括但不限于
STAINZYME
STAINZYME BANTM(Novozymes)，以及POWERASETM、 和
P(Genencor)。
[0249] 在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计淀粉酶水平为约0.00001％至约10％的附加淀粉酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。
在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还可以包含以组合物的重量计淀粉
酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约
0.5％的淀粉酶。
在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还可以包含以组合物的重量计淀粉
酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约
0.5％的淀粉酶。
[0250] 在一些另外的实施方案中，任何合适的纤维素酶均可以用于本发明的清洁组合物中。合适的纤维素酶包括但不限于来源于细菌或真菌的纤维素酶。一些实施方案包括经化
学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)
纤维素酶(参见例如，美国专利4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤
维素酶(参见例如，EP 0 495 257)。用于本发明的市售纤维素酶，包括但不限于
(Novozymes)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。在
一些实施方案中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，
其中N端的一部分缺失(参见例如，美国专利5,874,276)。在一些实施方案中，本发明的清洁
组合物还包含以组合物的重量计纤维素酶水平为约0.00001％至约10％的附加纤维素酶、
和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清
洁组合物还包含以组合物的重量计纤维素酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约
5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的纤维素酶。
学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)
纤维素酶(参见例如，美国专利4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤
维素酶(参见例如，EP 0 495 257)。用于本发明的市售纤维素酶，包括但不限于
(Novozymes)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。在
一些实施方案中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，
其中N端的一部分缺失(参见例如，美国专利5,874,276)。在一些实施方案中，本发明的清洁
组合物还包含以组合物的重量计纤维素酶水平为约0.00001％至约10％的附加纤维素酶、
和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清
洁组合物还包含以组合物的重量计纤维素酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约
5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的纤维素酶。
[0251] 适用于洗涤剂组合物中的任何甘露聚糖酶也可以用于本发明中。合适的甘露聚糖酶包括但不限于来源于细菌或真菌的甘露聚糖酶。一些实施方案包括经化学或遗传修饰的
突变体。已知的多种甘露聚糖酶均可以用于本发明(参见例如，美国专利6,566,114，美国专
利6,602,842和美国专利6,440,991，这些专利均以引用方式并入本文)。在一些实施方案
中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计甘露聚糖酶水平为约0.00001％至约
10％的附加甘露聚糖酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的一些实施
方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计甘露聚糖酶水平为约0.0001％至约
10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。
突变体。已知的多种甘露聚糖酶均可以用于本发明(参见例如，美国专利6,566,114，美国专
利6,602,842和美国专利6,440,991，这些专利均以引用方式并入本文)。在一些实施方案
中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计甘露聚糖酶水平为约0.00001％至约
10％的附加甘露聚糖酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂材料。在本发明的一些实施
方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计甘露聚糖酶水平为约0.0001％至约
10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。
[0252] 在一些实施方案中，在本发明的组合物中组合使用过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)。在一些可供选择的实施方案中，组合使用氧化
酶与氧。这两种类型的酶都可以用于“溶液漂白”(即，当将织物在洗涤液中一起洗涤时，以
防止纺织品染料由染色的织物转移到另一织物)，优选连同增强剂一起(参见例如，WO 94/
12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于来源于植物、细菌或真菌
的过氧化物酶/氧化酶。一些实施方案包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案
中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计过氧化物酶和/或氧化酶水平为约
0.00001％至约10％的附加过氧化物酶和/或氧化酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂
材料。在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计过
氧化物酶和/或氧化酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约
2％、约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶。
酶与氧。这两种类型的酶都可以用于“溶液漂白”(即，当将织物在洗涤液中一起洗涤时，以
防止纺织品染料由染色的织物转移到另一织物)，优选连同增强剂一起(参见例如，WO 94/
12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于来源于植物、细菌或真菌
的过氧化物酶/氧化酶。一些实施方案包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案
中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计过氧化物酶和/或氧化酶水平为约
0.00001％至约10％的附加过氧化物酶和/或氧化酶、和以组合物的重量计余量的清洁助剂
材料。在本发明的一些其它实施方案中，本发明的清洁组合物还包含以组合物的重量计过
氧化物酶和/或氧化酶水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约
2％、约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶。
[0253] 在一些实施方案中，还使用附加的酶，包括但不限于过水解酶(参见例如，WO 05/056782)。此外，在一些实施方案中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其是一种或多种附加的蛋
白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，考虑这些酶的各种混
合物应用于本发明。还可以考虑，变体蛋白酶与一种或多种附加酶的变化水平均可以独立
地达到约10％，该清洁组合物的余量为清洁助剂材料。通过考虑待清洁表面、物品或织物以
及使用(例如，通过使用洗涤剂)期间的清洁条件所需的组合物形式，清洁助剂材料的具体
选择将是容易的。
白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，考虑这些酶的各种混
合物应用于本发明。还可以考虑，变体蛋白酶与一种或多种附加酶的变化水平均可以独立
地达到约10％，该清洁组合物的余量为清洁助剂材料。通过考虑待清洁表面、物品或织物以
及使用(例如，通过使用洗涤剂)期间的清洁条件所需的组合物形式，清洁助剂材料的具体
选择将是容易的。
[0254] 合适的清洁助剂材料的例子包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、污物释放聚合物、染料转移剂、
染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土
污垢去除剂、结构增弹剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化
剂、荧光剂(fluorescers)、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、色
素、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银
护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见
例如，美国专利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,
686,014和5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施
方案在下文中详细举例说明。在清洁组合物中清洁助剂材料与本发明的变体蛋白酶不相容
的实施方案中，可以使用保持清洁助剂材料与所述蛋白酶在适于组合在一起之前分离(即，
相互不接触)的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如，囊形片、包
封法、片剂法、物理分离法等)。
染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土
污垢去除剂、结构增弹剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化
剂、荧光剂(fluorescers)、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、色
素、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银
护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见
例如，美国专利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,
686,014和5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施
方案在下文中详细举例说明。在清洁组合物中清洁助剂材料与本发明的变体蛋白酶不相容
的实施方案中，可以使用保持清洁助剂材料与所述蛋白酶在适于组合在一起之前分离(即，
相互不接触)的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如，囊形片、包
封法、片剂法、物理分离法等)。
[0255] 在一些实施方案中，在用于清洁需要去除蛋白质性污渍的多种表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的变体蛋白酶。此类清洁组合物包括用于(例如)清洁硬质
表面、织物和盘碟等应用的清洁组合物。实际上，在一些实施方案中，本发明提供织物清洁
组合物，而在其它实施方案中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提
供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁齿剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁
组合物)、皮肤以及毛发清洁组合物。预期本发明涵盖任何形式(即，液体、颗粒状、条、半固
体、凝胶、乳液、片剂、胶囊剂等)的洗涤剂组合物。
表面、织物和盘碟等应用的清洁组合物。实际上，在一些实施方案中，本发明提供织物清洁
组合物，而在其它实施方案中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提
供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁齿剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁
组合物)、皮肤以及毛发清洁组合物。预期本发明涵盖任何形式(即，液体、颗粒状、条、半固
体、凝胶、乳液、片剂、胶囊剂等)的洗涤剂组合物。
[0256] 下文将以举例的方式更详细地描述应用本发明的变体蛋白酶的几种清洁组合物。在本发明的清洁组合物配制成适用于洗衣机洗涤方法的组合物的一些实施方案中，本发明
组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物、以及一种或多种清洁助
剂材料，所述清洁助剂材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、附加的酶、抑泡剂、分散
剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施方案中，洗衣组合物还
含有软化剂(即，作为附加的清洁助剂材料)。本发明组合物还可以用于固体或液体形式的
洗涤添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在
清洁过程的任何阶段添加。在一些实施方案中，在20℃测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的
密度在约400g/L至约1200g/L的范围内，而在其它实施方案中，该组合物的密度在约500g/L
至约950g/L的范围内。
组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物、以及一种或多种清洁助
剂材料，所述清洁助剂材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、附加的酶、抑泡剂、分散
剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施方案中，洗衣组合物还
含有软化剂(即，作为附加的清洁助剂材料)。本发明组合物还可以用于固体或液体形式的
洗涤添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在
清洁过程的任何阶段添加。在一些实施方案中，在20℃测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的
密度在约400g/L至约1200g/L的范围内，而在其它实施方案中，该组合物的密度在约500g/L
至约950g/L的范围内。
[0257] 在配制为用于人工盘碟洗涤方法的组合物的实施方案中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂、以及优选地至少一种附加的选自如下的清洁助剂材料：有机聚合
化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和附加的酶。
化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和附加的酶。
[0258] 在一些实施方案中，各种清洁组合物(例如)美国专利6,605,458中提供的组合物与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白
酶的组合物是密实型颗粒状织物清洁组合物；在其它实施方案中，所述组合物是用于洗涤
有色织物的颗粒状织物清洁组合物；在另外的实施方案中，该组合物为凭借洗涤能力提供
软化效果的颗粒状织物清洁组合物；在其它实施方案中，所述组合物是重垢液体织物清洁
组合物。在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，
例如美国专利6,610,642和6,376,450中所述的那些。此外，本发明的变体蛋白酶可以用于
在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如，美国专利6,
610,642)。
酶的组合物是密实型颗粒状织物清洁组合物；在其它实施方案中，所述组合物是用于洗涤
有色织物的颗粒状织物清洁组合物；在另外的实施方案中，该组合物为凭借洗涤能力提供
软化效果的颗粒状织物清洁组合物；在其它实施方案中，所述组合物是重垢液体织物清洁
组合物。在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，
例如美国专利6,610,642和6,376,450中所述的那些。此外，本发明的变体蛋白酶可以用于
在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如，美国专利6,
610,642)。
[0259] 在一些可供选择的实施方案中，本发明提供包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合
物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利6,610,642、6,376,450和6,376,450中所述的那些
组合物。
物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利6,610,642、6,376,450和6,376,450中所述的那些
组合物。
[0260] 在另一些实施方案中，本发明提供包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的盘碟洗涤组合物。因此，在一些实施方案中，包含本发明的至少一种变体蛋白酶的组合物是硬质表
面清洁组合物，例如美国专利6,610,642和6,376,450中所述的那些。在一些另外的实施方
案中，本发明提供包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的盘碟洗涤组合物。在一些另外的
实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物包括口腔护理组合物，例如美国专
利6,376,450和6,376,450中所述的那些组合物。包含在上述美国专利6,376,450、6,605,
458、6,605,458和6,610,642中的化合物和清洁助剂材料的配制和描述可以用于本文提供
的变体蛋白酶。
面清洁组合物，例如美国专利6,610,642和6,376,450中所述的那些。在一些另外的实施方
案中，本发明提供包含本文提供的至少一种变体蛋白酶的盘碟洗涤组合物。在一些另外的
实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物包括口腔护理组合物，例如美国专
利6,376,450和6,376,450中所述的那些组合物。包含在上述美国专利6,376,450、6,605,
458、6,605,458和6,610,642中的化合物和清洁助剂材料的配制和描述可以用于本文提供
的变体蛋白酶。
[0261] 本发明的清洁组合物可以配制成任何合适的形式并通过配制者所选择的任何方法制备，所述方法的非限制性例子在美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,
645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利均以引用方
式并入本文。当需要低pH清洁组合物时，通过添加诸如单乙醇胺的材料或诸如HCl的酸性材
料来调整这种组合物的pH。
645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利均以引用方
式并入本文。当需要低pH清洁组合物时，通过添加诸如单乙醇胺的材料或诸如HCl的酸性材
料来调整这种组合物的pH。
[0262] 下文列出的一系列非限制性助剂适用于本发明的清洁组合物，但这些助剂并非实现本发明目的所必需的。在一些实施方案中，掺入这些助剂是为了(例如)辅助或增强清洁
性能、处理待清洁的基底，或者在助剂为香料、着色剂、染料等的情况下，更改清洁组合物的
美学效果。应当理解，这类助剂是除本发明的变体蛋白酶之外的物质。这些附加组分的确切
性质及其掺入水平，将取决于组合物的物理形式，和将要使用该组合物执行的清洁操作的
性质。合适的助剂材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积
助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化
氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染
料、香料、结构增弹剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开
内容外，此类其它助剂及其使用量的合适例子可以见于美国专利5,576,282、6,306,812和
6,326,348(以引用的方式并入)中。上述助剂成分可以构成本发明清洁组合物的余量。
性能、处理待清洁的基底，或者在助剂为香料、着色剂、染料等的情况下，更改清洁组合物的
美学效果。应当理解，这类助剂是除本发明的变体蛋白酶之外的物质。这些附加组分的确切
性质及其掺入水平，将取决于组合物的物理形式，和将要使用该组合物执行的清洁操作的
性质。合适的助剂材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积
助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化
氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染
料、香料、结构增弹剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开
内容外，此类其它助剂及其使用量的合适例子可以见于美国专利5,576,282、6,306,812和
6,326,348(以引用的方式并入)中。上述助剂成分可以构成本发明清洁组合物的余量。
[0263] 在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂体系，其中表面活性剂选自：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面
活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合
物。在一些低pH清洁组合物实施方案(例如，具有约3至约5净pH的组合物)中，组合物通常不
含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这种表面活性剂可能会被所述组合物的酸性内容物水
解。在一些实施方案中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存
在，而在另外的实施方案中，所述水平是从约1％至约50％，而在其它另外的实施方案中，所
述水平是从约5％至约40％。
活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合
物。在一些低pH清洁组合物实施方案(例如，具有约3至约5净pH的组合物)中，组合物通常不
含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这种表面活性剂可能会被所述组合物的酸性内容物水
解。在一些实施方案中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存
在，而在另外的实施方案中，所述水平是从约1％至约50％，而在其它另外的实施方案中，所
述水平是从约5％至约40％。
[0264] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系。在掺入至少一种助洗剂的一些实施方案中，按清洁组合物重量计，清洁组合物包含至
少约1％、约3％至约60％、或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于：聚磷酸的
碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐，碱金属硅酸盐，碱土金属碳酸盐和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐，
聚羧酸盐化合物，醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟
基苯-2,4,6-三磺酸，羧基甲氧基琥珀酸，多元乙酸(例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的
各种碱金属盐、铵盐和取代铵盐，和多元羧酸(例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀
酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸)，以及它们的可溶性盐。实际上，预期可
以在本发明的各种实施方案中使用任何适宜的助洗剂。
少约1％、约3％至约60％、或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于：聚磷酸的
碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐，碱金属硅酸盐，碱土金属碳酸盐和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐，
聚羧酸盐化合物，醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟
基苯-2,4,6-三磺酸，羧基甲氧基琥珀酸，多元乙酸(例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的
各种碱金属盐、铵盐和取代铵盐，和多元羧酸(例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀
酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸)，以及它们的可溶性盐。实际上，预期可
以在本发明的各种实施方案中使用任何适宜的助洗剂。
[0265] 在一些实施方案中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如多价螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠与六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾，以及三聚磷酸
钠与三聚磷酸钾的混合物等)。预期可以在本发明中使用任何适宜的助洗剂，包括本领域已
知的那些助洗剂(参见例如EP 2 100 949)。
钠与三聚磷酸钾的混合物等)。预期可以在本发明中使用任何适宜的助洗剂，包括本领域已
知的那些助洗剂(参见例如EP 2 100 949)。
[0266] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施方案
中，以主题清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约
3.0％至约10％的螯合剂。
中，以主题清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约
3.0％至约10％的螯合剂。
[0267] 在一些另外的实施方案中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；污物释放聚合物，如聚对苯二
甲酸；粘土，如高岭石、蒙脱石、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土；以及
它们的混合物。
甲酸；粘土，如高岭石、蒙脱石、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土；以及
它们的混合物。
[0268] 如本文所指出，在一些实施方案中，抗再沉积剂用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，使用非离子表面活性剂。例如，在自动盘碟洗涤实施方案中，非离子表面
活性剂用于表面改性目的，尤其用于膜片化(sheeting)，以避免成膜和起斑以及用于改善
光泽度。这些非离子表面活性剂还用于防止污垢再沉积。在一些实施方案中，抗再沉积剂是
本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如，EP 2 100 949)。
活性剂用于表面改性目的，尤其用于膜片化(sheeting)，以避免成膜和起斑以及用于改善
光泽度。这些非离子表面活性剂还用于防止污垢再沉积。在一些实施方案中，抗再沉积剂是
本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如，EP 2 100 949)。
[0269] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-
乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯 唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在
使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，以清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合
物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯 唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在
使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，以清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合
物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
[0270] 在一些实施方案中，本发明的组合物中包含硅酸盐。在一些此类实施方案中，使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐(crystalline phyllosilicates))。
在一些实施方案中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些实施方案中，以组合物的
重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。
在一些实施方案中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些实施方案中，以组合物的
重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。
[0272] 在一些另外的实施方案中，通过任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施方案中，本文所用的酶因成品组合物中存在水溶性的钙和/或镁离子源而稳定，
其中所述水溶性离子源为酶提供此类离子。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和
无机二价金属盐(包括碱土金属盐，如钙盐)。预期用于稳定酶的各种技术将可以用于本发
明。例如，在一些实施方案中，本文所采用的酶因成品组合物中存在锌(II)、钙(II)和/或镁
(II)离子的水溶性来源(为酶提供此类离子)、以及其它金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁
(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))而稳定。氯化物和硫酸
盐也用于本发明的一些实施方案中。合适的寡糖和多糖(例如，糊精)的例子是本领域已知
的(参见例如，WO 07/145964)。在一些实施方案中，还使用可逆性蛋白酶抑制剂，如含硼化
合物(例如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或必要时，使用三肽醛以进一步提高稳定性。
其中所述水溶性离子源为酶提供此类离子。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和
无机二价金属盐(包括碱土金属盐，如钙盐)。预期用于稳定酶的各种技术将可以用于本发
明。例如，在一些实施方案中，本文所采用的酶因成品组合物中存在锌(II)、钙(II)和/或镁
(II)离子的水溶性来源(为酶提供此类离子)、以及其它金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁
(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))而稳定。氯化物和硫酸
盐也用于本发明的一些实施方案中。合适的寡糖和多糖(例如，糊精)的例子是本领域已知
的(参见例如，WO 07/145964)。在一些实施方案中，还使用可逆性蛋白酶抑制剂，如含硼化
合物(例如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或必要时，使用三肽醛以进一步提高稳定性。
[0273] 在一些实施方案中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂
包括但不限于过氧化氢合物盐(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸
盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施方案中，包括的无机
过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无附加保护，但在一些其它实施方案中，所述盐带涂层。
本领域已知的任何合适的盐均可以用于本发明(参见例如，EP 2 100 949)。
包括但不限于过氧化氢合物盐(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸
盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施方案中，包括的无机
过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无附加保护，但在一些其它实施方案中，所述盐带涂层。
本领域已知的任何合适的盐均可以用于本发明(参见例如，EP 2 100 949)。
[0274] 在一些实施方案中，漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃温度的清洁过程中会增强漂白作用。适用
于本文中的漂白活化剂包括在过水解条件下产生脂族过氧羧酸和/或任选地取代的过苯甲
酸的化合物，所述脂族过氧羧酸优选地具有约1个至约10个碳原子，尤其约2个至约4个碳原
子。附加的漂白活化剂是本领域已知的并且可以用于本发明中(参见例如，EP 2 100 949)。
于本文中的漂白活化剂包括在过水解条件下产生脂族过氧羧酸和/或任选地取代的过苯甲
酸的化合物，所述脂族过氧羧酸优选地具有约1个至约10个碳原子，尤其约2个至约4个碳原
子。附加的漂白活化剂是本领域已知的并且可以用于本发明中(参见例如，EP 2 100 949)。
[0275] 此外，在一些实施方案中以及如本文中进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方案中，使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、
铜、锰和铁络合物。其它漂白催化剂可以用于本发明中(参见例如，US 4,246,612、5,227,
084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。
铜、锰和铁络合物。其它漂白催化剂可以用于本发明中(参见例如，US 4,246,612、5,227,
084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。
[0276] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施方案中，使用含金属的漂白催化剂。在一些实施方案中，金属漂白催化剂包含催化
剂体系，所述催化剂体系包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、
钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如，锌或铝
阳离子)，以及对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的多价螯合剂，尤其可
以使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(参见例如，美国专利4,
430,243)。在一些实施方案中，借助锰化合物催化本发明的清洁组合物。此类化合物及其使
用量是本领域熟知的(参见例如，美国专利5,576,282)。在另外的实施方案中，钴漂白催化
剂用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如，美国专利5,
597,936和5,595,967)，并且易于通过已知方法制备。
剂体系，所述催化剂体系包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、
钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如，锌或铝
阳离子)，以及对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的多价螯合剂，尤其可
以使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(参见例如，美国专利4,
430,243)。在一些实施方案中，借助锰化合物催化本发明的清洁组合物。此类化合物及其使
用量是本领域熟知的(参见例如，美国专利5,576,282)。在另外的实施方案中，钴漂白催化
剂用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如，美国专利5,
597,936和5,595,967)，并且易于通过已知方法制备。
[0277] 在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包括大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践(但绝非限制)，在一些实施方案中，调整本发明提供的组合物
和清洁方法以便在水性洗涤介质中提供约至少每一亿分之一的活性MRL物质，而在一些实
施方案中，在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选约0.05ppm至约10ppm，且最优选
约0.1ppm至约5ppm的MRL。
和清洁方法以便在水性洗涤介质中提供约至少每一亿分之一的活性MRL物质，而在一些实
施方案中，在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选约0.05ppm至约10ppm，且最优选
约0.1ppm至约5ppm的MRL。
[0278] 在一些实施方案中，本发明过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于，交叉桥接的特殊超刚性配体(例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-
四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL易于通过已知工序制备(参见例如，WO
2000/32601和美国专利6,225,464)。
四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL易于通过已知工序制备(参见例如，WO
2000/32601和美国专利6,225,464)。
[0279] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。
合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO 9426860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在
一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包含
约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。
合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO 9426860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在
一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些另外的实施方案中，本发明的清洁组合物包含
约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。
[0280] 在一些实施方案中，清洁组合物是含有变体LG12蛋白酶的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可包含去污表面活性剂(10％至40％)，其包括阴离子去污表面活性
剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化
硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐，和/或它们的混合物)，和任选的非离子表面
活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙
氧基化醇和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，任选地其中阴离子去污表面活性剂(具有从6.0
至9的亲水指数(HIc))与非离子去污表面活性剂的重量比大于1:1。
剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化
硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐，和/或它们的混合物)，和任选的非离子表面
活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙
氧基化醇和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，任选地其中阴离子去污表面活性剂(具有从6.0
至9的亲水指数(HIc))与非离子去污表面活性剂的重量比大于1:1。
[0281] 组合物可任选地包含表面活性增强聚合物，其由以下物质组成：两亲性的烷氧基化油脂清洁聚合物(选自具有亲水性和疏水性支链的烷氧基化聚合物，诸如在0.05重量％
至10重量％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚胺)和/或随机接枝聚合物(通常包含亲水性主
链，其包含选自下列的单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油、以及它们的混合物；以及疏水侧链，其选自：C4-C25烷基基团、
聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯，以及它
们的混合物)。
至10重量％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚胺)和/或随机接枝聚合物(通常包含亲水性主
链，其包含选自下列的单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油、以及它们的混合物；以及疏水侧链，其选自：C4-C25烷基基团、
聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯，以及它
们的混合物)。
[0282] 组合物可包含另外的聚合物诸如污物释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)，包含选自糖类、二元羧酸、多元醇以及它们的组合的至少一种单体单元的聚合物(随
机或嵌段构型)，基于对苯二甲酸亚乙酯的聚合物及其共聚物(随机或嵌段构型)，例如
Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和
SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1重量％至10重量％，包括羧酸酯聚合物，诸
如包含选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、延胡索酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲
基丙二酸及其任何混合物的至少一种单体的聚合物，乙烯基吡咯烷酮均聚物和/或聚乙二
醇，分子量在500至100,000Da的范围内)；纤维素聚合物(包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基
烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧烷基纤维素的纤维素聚合物，其例子包括羧甲基纤维
素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和聚合物羧酸
盐(诸如马来酸/丙烯酸无规共聚物或聚丙烯酸均聚物)。
机或嵌段构型)，基于对苯二甲酸亚乙酯的聚合物及其共聚物(随机或嵌段构型)，例如
Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和
SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1重量％至10重量％，包括羧酸酯聚合物，诸
如包含选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、延胡索酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲
基丙二酸及其任何混合物的至少一种单体的聚合物，乙烯基吡咯烷酮均聚物和/或聚乙二
醇，分子量在500至100,000Da的范围内)；纤维素聚合物(包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基
烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧烷基纤维素的纤维素聚合物，其例子包括羧甲基纤维
素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和聚合物羧酸
盐(诸如马来酸/丙烯酸无规共聚物或聚丙烯酸均聚物)。
[0283] 组合物可还包含饱和或不饱和的脂肪酸，优选地饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉积助剂(其例子包括多糖，优选地纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基
卤化铵(DADMAC)，呈无规或嵌段构型的、DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、卤化
咪唑啉 的共聚物及其混合物，阳离子瓜尔胶，阳离子纤维素例如阳离子羟乙基纤维素，
阳离子淀粉，阳离子聚丙烯酰胺，以及它们的混合物)。
卤化铵(DADMAC)，呈无规或嵌段构型的、DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、卤化
咪唑啉 的共聚物及其混合物，阳离子瓜尔胶，阳离子纤维素例如阳离子羟乙基纤维素，
阳离子淀粉，阳离子聚丙烯酰胺，以及它们的混合物)。
[0284] 组合物还可包含染料转移抑制剂，其例子包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基
唑烷酮、聚乙烯基咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚
乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、
甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡
啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨
酸的四钠盐)(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-
羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸
(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)，以及它们的衍生物。
唑烷酮、聚乙烯基咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚
乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、
甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡
啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨
酸的四钠盐)(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-
羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸
(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)，以及它们的衍生物。
[0285] 组合物还可包含酶(0.01重量％的活性酶至0.03重量％的活性酶)，其选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖
酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混
合物。组合物可包含酶稳定剂(其例子包括：多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可
逆的蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯或诸如4-甲酰基苯基硼酸的苯基
硼酸衍生物)。
酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混
合物。组合物可包含酶稳定剂(其例子包括：多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可
逆的蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯或诸如4-甲酰基苯基硼酸的苯基
硼酸衍生物)。
[0286] 组合物还可包含硅氧烷或基于脂肪酸的抑泡剂；调色染料、钙离子和镁离子、可视信号成分、消泡剂(0.001重量％至约4.0重量％)和/或结构剂(structurant)/增稠剂(0.01
重量％至5重量％，选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇双硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素
的材料、微纤纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。
重量％至5重量％，选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇双硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素
的材料、微纤纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。
[0287] 合适的去污表面活性剂也包括阳离子去污表面活性剂(选自烷基吡啶 化合物、烷基季铵化合物、烷基季 化合物、烷基叔锍化合物和/或这些化合物的混合物)；两性离子
和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子型
表面活性剂，以及它们的混合物。
和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子型
表面活性剂，以及它们的混合物。
[0288] 组合物可为任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或它们的任何组合。组合物可为任何单位剂型，例如小袋(pouch)。
[0289] 在一些实施方案中，清洁组合物是含有变体LG12蛋白酶的高密度粉末(HDD)组合物。HDD粉末衣物洗涤剂可包含：去污表面活性剂，包括阴离子去污表面活性剂(选自直链、
支链或无规链的，取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷
酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)、非离子去污表面活性剂(选自直链、支
链或无规链的，取代或未取代的C8至C18烷基乙氧基化物和/或C6至C12烷基酚烷氧基化物)、
阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶 化合物，烷基季铵化合物，烷基季 化合物，烷
基叔锍化合物，以及它们的混合物)、两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺
基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及这些表面活性剂的混合物；助
洗剂(不含磷酸盐的助洗剂)[例如沸石助洗剂，其例子包括沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP，
含量在0重量％至小于10重量％的范围内]；磷酸盐助洗剂(其例子包括三聚磷酸钠，含量在
0重量％至小于10重量％的范围内)；柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐(含量小于15
重量％)；硅酸盐(硅酸钠、硅酸钾或偏硅酸钠，含量在0重量％至小于10重量％的范围内，或
层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(碳酸钠和/或碳酸氢钠，含量在0重量％至小于10重量％的范
围内)；以及漂白剂(光致漂白剂(photobleach)，其例子包括磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、氧杂
蒽染料，以及它们的混合物；疏水性或亲水性漂白活化剂(其例子包括十二烷酰基羟苯磺酸
盐、癸酰基羟苯磺酸盐、癸酰基羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基羟苯磺酸盐、四乙酰
乙二胺(TAED)和壬酰羟苯磺酸盐(NOBS)、nitrile quat，和这些物质的混合物)；过氧化氢；
过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，其例子包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或
过硅酸盐的一水合钠盐或四水合钠盐)；预先形成的亲水性和/或疏水性过酸(选自过羧酸
及其盐、过碳酸及其盐、过亚氨酸及其盐、过氧单硫酸及其盐，和这些物质的混合物)和/或
漂白催化剂(例如亚胺漂白促进剂，示例包括亚铵阳离子和聚离子、亚铵两性离子、改性胺、
改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺；环糖
酮以及它们的混合物；含金属的漂白催化剂，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子连同辅助
金属阳离子诸如锌或铝和多价螯合剂诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶
性盐)。
支链或无规链的，取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷
酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)、非离子去污表面活性剂(选自直链、支
链或无规链的，取代或未取代的C8至C18烷基乙氧基化物和/或C6至C12烷基酚烷氧基化物)、
阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶 化合物，烷基季铵化合物，烷基季 化合物，烷
基叔锍化合物，以及它们的混合物)、两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺
基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及这些表面活性剂的混合物；助
洗剂(不含磷酸盐的助洗剂)[例如沸石助洗剂，其例子包括沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP，
含量在0重量％至小于10重量％的范围内]；磷酸盐助洗剂(其例子包括三聚磷酸钠，含量在
0重量％至小于10重量％的范围内)；柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐(含量小于15
重量％)；硅酸盐(硅酸钠、硅酸钾或偏硅酸钠，含量在0重量％至小于10重量％的范围内，或
层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(碳酸钠和/或碳酸氢钠，含量在0重量％至小于10重量％的范
围内)；以及漂白剂(光致漂白剂(photobleach)，其例子包括磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、氧杂
蒽染料，以及它们的混合物；疏水性或亲水性漂白活化剂(其例子包括十二烷酰基羟苯磺酸
盐、癸酰基羟苯磺酸盐、癸酰基羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基羟苯磺酸盐、四乙酰
乙二胺(TAED)和壬酰羟苯磺酸盐(NOBS)、nitrile quat，和这些物质的混合物)；过氧化氢；
过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，其例子包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或
过硅酸盐的一水合钠盐或四水合钠盐)；预先形成的亲水性和/或疏水性过酸(选自过羧酸
及其盐、过碳酸及其盐、过亚氨酸及其盐、过氧单硫酸及其盐，和这些物质的混合物)和/或
漂白催化剂(例如亚胺漂白促进剂，示例包括亚铵阳离子和聚离子、亚铵两性离子、改性胺、
改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺；环糖
酮以及它们的混合物；含金属的漂白催化剂，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子连同辅助
金属阳离子诸如锌或铝和多价螯合剂诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶
性盐)。
[0290] 组合物还可包含酶，其选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移
酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。
酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。
[0291] 组合物还可包含附加的洗涤剂成分，包括香料微囊、用淀粉包封的谐香剂、调色剂、附加聚合物(包括维持织物完整性的聚合物和阳离子聚合物)、锁住染料的成分、织物软
化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或
环糊精。
化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或
环糊精。
[0292] 在一些实施方案中，清洁组合物是含有变体LG12蛋白酶的自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物。ADW洗涤剂可包含：含量从0重量％至10重量％的两种或更多种非离子表面活
性剂，选自乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧烷基
化)醇或氧化胺表面活性剂；含量在5重量％至60重量％范围内的助洗剂，包括磷酸盐(单磷
酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或寡聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠(STPP))或无磷助洗剂(基于氨
基酸的化合物，其示例包括甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸
(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧甲基菊粉及其盐和衍生
物以及它们的混合物，次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、β-丙氨酸二乙酸
(B-ADA)以及这些物质的盐)；含量在0.5重量％至50重量％范围内的、聚羧酸的均聚物和共
聚物及其部分或完全中和盐，单体聚羧酸和羟基羧酸及其盐；含量在0.1重量％至50重量％
范围内的磺化/羧化聚合物(为产物提供尺寸稳定性)；含量在约0.1重量％至约10重量％范
围内的干燥助剂(选自聚酯，尤其是阴离子聚酯，任选连同另外的具有有利于缩聚的3至6个
官能团(尤其是酸、醇或酯官能团)的单体，聚碳酸酯-，聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化
合物或其前体化合物(活性环状碳酸酯和尿素型))；含量在约1重量％至约20重量％范围内
的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐)；无机漂白剂(例
如过氧化氢合盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂
(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧基十二烷二酸、二过氧基
十四烷二酸、二过氧基十六烷二酸)；含量在约0.1重量％至约10重量％范围内的漂白活化
剂-有机过酸前体；漂白催化剂(选自三氮杂环壬烷合锰及相关络合物，二吡啶基胺合Co、
Cu、Mn、Fe及相关络合物，五胺乙酸合钴(III)及相关络合物)；含量在约0.1重量％至5重
量％范围内的金属护理剂(选自苯并三唑、金属盐及络合物，和/或硅酸盐)；酶，其含量为每
克自动盘碟洗涤剂组合物含约0.01至5.0mg活性酶(选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素
酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶
血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶，以及它们的任何混合物)；以及酶稳定剂组分
(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
性剂，选自乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧烷基
化)醇或氧化胺表面活性剂；含量在5重量％至60重量％范围内的助洗剂，包括磷酸盐(单磷
酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或寡聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠(STPP))或无磷助洗剂(基于氨
基酸的化合物，其示例包括甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸
(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧甲基菊粉及其盐和衍生
物以及它们的混合物，次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、β-丙氨酸二乙酸
(B-ADA)以及这些物质的盐)；含量在0.5重量％至50重量％范围内的、聚羧酸的均聚物和共
聚物及其部分或完全中和盐，单体聚羧酸和羟基羧酸及其盐；含量在0.1重量％至50重量％
范围内的磺化/羧化聚合物(为产物提供尺寸稳定性)；含量在约0.1重量％至约10重量％范
围内的干燥助剂(选自聚酯，尤其是阴离子聚酯，任选连同另外的具有有利于缩聚的3至6个
官能团(尤其是酸、醇或酯官能团)的单体，聚碳酸酯-，聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化
合物或其前体化合物(活性环状碳酸酯和尿素型))；含量在约1重量％至约20重量％范围内
的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐)；无机漂白剂(例
如过氧化氢合盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂
(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧基十二烷二酸、二过氧基
十四烷二酸、二过氧基十六烷二酸)；含量在约0.1重量％至约10重量％范围内的漂白活化
剂-有机过酸前体；漂白催化剂(选自三氮杂环壬烷合锰及相关络合物，二吡啶基胺合Co、
Cu、Mn、Fe及相关络合物，五胺乙酸合钴(III)及相关络合物)；含量在约0.1重量％至5重
量％范围内的金属护理剂(选自苯并三唑、金属盐及络合物，和/或硅酸盐)；酶，其含量为每
克自动盘碟洗涤剂组合物含约0.01至5.0mg活性酶(选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素
酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶
血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶，以及它们的任何混合物)；以及酶稳定剂组分
(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
[0293] 有利地包括本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的代表性洗涤剂制剂包括，如见于WO2013063460，第78-152页中的洗涤剂制剂，具体地讲，第94至152页的表格据此以引用的
方式并入。丝氨酸蛋白酶通常以0.00001％至10％酶蛋白的水平(以组合物的重量计)掺入
到洗涤剂组合物中。在一些实施方案中，洗涤剂组合物包含多于0.0001％、0.001％、0.01％
或0.1％的丝氨酸蛋白酶(以组合物的重量计)。在一些实施方案中，洗涤剂组合物包含少于
1％、0.1％、0.01％或0.001％的丝氨酸蛋白酶(以组合物的重量计)。
方式并入。丝氨酸蛋白酶通常以0.00001％至10％酶蛋白的水平(以组合物的重量计)掺入
到洗涤剂组合物中。在一些实施方案中，洗涤剂组合物包含多于0.0001％、0.001％、0.01％
或0.1％的丝氨酸蛋白酶(以组合物的重量计)。在一些实施方案中，洗涤剂组合物包含少于
1％、0.1％、0.01％或0.001％的丝氨酸蛋白酶(以组合物的重量计)。
[0294] 本发明的清洁组合物可以被配制成任何合适的形式并通过配制者所选择的任何方法制备，所述方法的非限制性例子在美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,
645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利均以引用方式并入本
文。在需要低pH清洁组合物的一些实施方案中，可以通过添加诸如HCl的酸性材料来调整这
种组合物的pH。
645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利均以引用方式并入本
文。在需要低pH清洁组合物的一些实施方案中，可以通过添加诸如HCl的酸性材料来调整这
种组合物的pH。
[0295] 本文所公开的清洁组合物可以用于原位清洁(例如，表面、物品、盘碟或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与本发明清洁组合物的实施方案(纯的形式或稀释在洗涤液
中的形式)接触，随后任选洗涤和/或冲洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限
于擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,
000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述
位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
中的形式)接触，随后任选洗涤和/或冲洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限
于擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,
000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述
位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
[0296] 制备和使用清洁组合物的方法
[0297] 本发明的清洁组合物可以被配制成任何合适的形式并通过配制者所选择的任何合适方法制备(参见例如，美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,
422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,
561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514和6,376,445)。
422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,
561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514和6,376,445)。
[0298] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，包括片、胶囊、小囊、小袋和多隔室小袋。在一些实施方案中，对单位剂量形式进行设计以提供多隔室小袋(或其它
单位剂量形式)内的成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(参
见例如，EP 2 100 949、WO 02/102955、美国专利4,765,916、4,972,017和WO 04/111178关
于适用于单位剂量和控制释放形式的材料)。在一些实施方案中，单位剂型通过用水溶性膜
或水溶性小袋包裹的片提供。EP 2 100 947中提供了各种单位剂量形式，并且这些形式是
本领域已知的。
单位剂量形式)内的成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(参
见例如，EP 2 100 949、WO 02/102955、美国专利4,765,916、4,972,017和WO 04/111178关
于适用于单位剂量和控制释放形式的材料)。在一些实施方案中，单位剂型通过用水溶性膜
或水溶性小袋包裹的片提供。EP 2 100 947中提供了各种单位剂量形式，并且这些形式是
本领域已知的。
[0299] 使用方法
[0300] 在一些实施方案中，本发明的清洁组合物用于清洁表面(例如，盘碟)、衣物、硬质表面、隐形眼镜等。在一些实施方案中，表面的至少一部分与本发明的清洁组合物的至少一
个实施方案接触，所述组合物为纯形式或稀释于洗涤液中，随后任选洗涤和/或冲洗所述表
面。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械洗涤。在一些实施方案中，本发明
的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在洗涤溶剂是水的一些实
施方案中，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。
个实施方案接触，所述组合物为纯形式或稀释于洗涤液中，随后任选洗涤和/或冲洗所述表
面。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械洗涤。在一些实施方案中，本发明
的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在洗涤溶剂是水的一些实
施方案中，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。
[0301] 本发明提供了用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(例如，硬质表面)的方法，包括但不限于，用于清洁或洗涤盘碟物品、餐具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品等
的方法，以及用于清洁或洗涤硬质或柔软表面(例如，物品的硬质表面)的方法。
的方法，以及用于清洁或洗涤硬质或柔软表面(例如，物品的硬质表面)的方法。
[0302] 在一些实施方案中，本发明提供了一种用于清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使物品或表面(或期望清洁的物品或表面的部分)与至少一种本发明变体
LG12蛋白酶或本发明的组合物接触，其中接触在对于清洁所述物品、物体或表面至所需程
度而言充足的时间和/或适宜和/或有效的条件下进行。一些此类方法还包括用水冲洗物
品、物体或表面。对于一些此类方法，清洁组合物为盘碟洗涤剂组合物，待清洁的物品或物
体为盘碟物品或餐具物品。如本文所用，“盘碟物品”为通常用于盛放食物或食用食物的物
品。盘碟物品可以是但不限于(例如)盘子、碟子、杯子、碗等。如本文所用，“餐具”是一个更
广义的术语，其包括但不限于(例如)盘碟、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味
汁碟、饮用容器、盛菜物品等。预期“餐具物品”包括这些或相似的用于盛放食物或食用食物
的物品中的任何一种。对于一些此类方法，清洁组合物为自动盘碟洗涤剂组合物或手洗盘
碟洗涤剂组合物，待清洁的物品或物体为盘碟或餐具物品。对于一些此类方法，清洁组合物
为衣物洗涤剂组合物(例如，粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，并且待清
洁的物品为织物物品。在一些其它实施方案中，清洁组合物为衣物预处理组合物。
LG12蛋白酶或本发明的组合物接触，其中接触在对于清洁所述物品、物体或表面至所需程
度而言充足的时间和/或适宜和/或有效的条件下进行。一些此类方法还包括用水冲洗物
品、物体或表面。对于一些此类方法，清洁组合物为盘碟洗涤剂组合物，待清洁的物品或物
体为盘碟物品或餐具物品。如本文所用，“盘碟物品”为通常用于盛放食物或食用食物的物
品。盘碟物品可以是但不限于(例如)盘子、碟子、杯子、碗等。如本文所用，“餐具”是一个更
广义的术语，其包括但不限于(例如)盘碟、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味
汁碟、饮用容器、盛菜物品等。预期“餐具物品”包括这些或相似的用于盛放食物或食用食物
的物品中的任何一种。对于一些此类方法，清洁组合物为自动盘碟洗涤剂组合物或手洗盘
碟洗涤剂组合物，待清洁的物品或物体为盘碟或餐具物品。对于一些此类方法，清洁组合物
为衣物洗涤剂组合物(例如，粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，并且待清
洁的物品为织物物品。在一些其它实施方案中，清洁组合物为衣物预处理组合物。
[0303] 在一些实施方案中，本发明提供用于清洁或洗涤(任选地需要清洁或洗涤)的织物物品的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供包含变体蛋白酶的组合物(包括但不限
于织物或衣物清洁组合物)以及需要清洁的织物物品或衣物物品，使织物物品或衣物物品
(或期望清洁的物品的部分)与组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需
程度的条件下接触。
于织物或衣物清洁组合物)以及需要清洁的织物物品或衣物物品，使织物物品或衣物物品
(或期望清洁的物品的部分)与组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需
程度的条件下接触。
[0304] 在一些实施方案中，本发明提供了一种用于清洁或洗涤(任选地需要清洁)的物品或表面(例如，硬质表面)的方法，该方法包括提供待清洁或洗涤的物品或表面，以及使物品
或表面(或期望清洁或洗涤的物品或表面的部分)与至少一种本发明LG12变体或本发明的
组合物(包含至少一种所述LG12变体)接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的时间
和/或在足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的条件下接触。此类组合物包括但
不限于，例如，本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(例如，手洗盘碟洗涤剂组合物、手洗盘
碟清洁组合物、衣物洗涤剂或织物洗涤剂或衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体
衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动盘碟洗涤剂组合物、
衣物增效剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预去斑剂组合物等)。在一
些实施方案中，将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要附加的清洁或洗涤的话。例如，
在一些情况下，该方法任选地还包括使物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接
触足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施方案中，该方法
还包括用水和/或其它液体冲洗物品或表面。在一些实施方案中，这些方法还包括使物品或
表面再次与至少一种本发明的变体蛋白酶或本发明的组合物接触，并且使该物品或表面与
至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时
间。在一些实施方案中，清洁组合物为盘碟洗涤剂组合物，待清洁的物品为盘碟物品或餐具
物品。在本发明方法的一些实施方案中，清洁组合物为自动盘碟洗涤剂组合物或手洗盘碟
洗涤剂组合物，待清洁的物品为盘碟或餐具物品。在该方法的一些实施方案中，清洁组合物
为衣物洗涤剂组合物，待清洁的物品为织物物品。
或表面(或期望清洁或洗涤的物品或表面的部分)与至少一种本发明LG12变体或本发明的
组合物(包含至少一种所述LG12变体)接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的时间
和/或在足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的条件下接触。此类组合物包括但
不限于，例如，本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(例如，手洗盘碟洗涤剂组合物、手洗盘
碟清洁组合物、衣物洗涤剂或织物洗涤剂或衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体
衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动盘碟洗涤剂组合物、
衣物增效剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预去斑剂组合物等)。在一
些实施方案中，将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要附加的清洁或洗涤的话。例如，
在一些情况下，该方法任选地还包括使物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接
触足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施方案中，该方法
还包括用水和/或其它液体冲洗物品或表面。在一些实施方案中，这些方法还包括使物品或
表面再次与至少一种本发明的变体蛋白酶或本发明的组合物接触，并且使该物品或表面与
至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时
间。在一些实施方案中，清洁组合物为盘碟洗涤剂组合物，待清洁的物品为盘碟物品或餐具
物品。在本发明方法的一些实施方案中，清洁组合物为自动盘碟洗涤剂组合物或手洗盘碟
洗涤剂组合物，待清洁的物品为盘碟或餐具物品。在该方法的一些实施方案中，清洁组合物
为衣物洗涤剂组合物，待清洁的物品为织物物品。
[0305] 本发明还提供了在自动盘碟洗涤机中清洁餐具或盘碟物品的方法，该方法包括提供自动盘碟洗涤机，在机器中放入足以清洁餐具或盘碟物品的一定量的包含至少一种本发
明LG12变体或本发明组合物的自动盘碟洗涤组合物(例如，通过将该组合物置于机器中的
合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将盘碟或餐具物品放入该机器中，运行该机器以
清洁该餐具或盘碟物品(例如按照制造商的说明书)。在一些实施方案中，该方法包括本文
所述的任何自动盘碟洗涤组合物，该组合物包含但不限于本文提供的至少一种LG12变体。
待使用的自动盘碟洗涤组合物的量可根据制造商的说明书或建议容易地确定，可采用任何
形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物(例如，液体、粉末状、固体、
凝胶、片剂等形式)，包括本文所述的任何形式。
明LG12变体或本发明组合物的自动盘碟洗涤组合物(例如，通过将该组合物置于机器中的
合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将盘碟或餐具物品放入该机器中，运行该机器以
清洁该餐具或盘碟物品(例如按照制造商的说明书)。在一些实施方案中，该方法包括本文
所述的任何自动盘碟洗涤组合物，该组合物包含但不限于本文提供的至少一种LG12变体。
待使用的自动盘碟洗涤组合物的量可根据制造商的说明书或建议容易地确定，可采用任何
形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物(例如，液体、粉末状、固体、
凝胶、片剂等形式)，包括本文所述的任何形式。
[0306] 本发明还提供了用于清洁(任选地需要清洁的)表面、物品或物体的方法，该方法包括使物品或表面(或期望清洁的物品或表面的部分)与至少一种本发明变体LG12或本发
明清洁组合物(所述组合物为纯形式或稀释于洗涤液中)接触足以清洁或洗涤物品或表面
至所需程度的的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的条件下接
触。然后如果需要，可以(任选地)洗涤和/或冲洗表面、物品或物体。出于本发明的目的，“洗
涤”包括但不限于(例如)擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，清洁组合物在溶液(例如，水
溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约
90℃的范围内。
明清洁组合物(所述组合物为纯形式或稀释于洗涤液中)接触足以清洁或洗涤物品或表面
至所需程度的的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的条件下接
触。然后如果需要，可以(任选地)洗涤和/或冲洗表面、物品或物体。出于本发明的目的，“洗
涤”包括但不限于(例如)擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，清洁组合物在溶液(例如，水
溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约
90℃的范围内。
[0307] 本发明还提供了在洗衣机中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包括提供洗衣机，将足以清洁衣物或织物物品的一定量的包含至少一种本发明变体LG12的衣物洗涤剂组
合物置于洗衣机中(例如，通过将该组合物置于洗衣机中的合适的或提供的洗涤剂隔室或
分配器中)，将衣物或织物物品放入洗衣机中，运转洗衣机以清洁衣物或织物物品(例如，按
照制造商的说明书)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限
于本文所提供的任何变体LG12中的至少一种。待使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据制造
商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的衣物
洗涤剂组合物(例如，固体、粉末、液体、片剂、凝胶等形式)，包括本文所述的任何形式。
合物置于洗衣机中(例如，通过将该组合物置于洗衣机中的合适的或提供的洗涤剂隔室或
分配器中)，将衣物或织物物品放入洗衣机中，运转洗衣机以清洁衣物或织物物品(例如，按
照制造商的说明书)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限
于本文所提供的任何变体LG12中的至少一种。待使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据制造
商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的衣物
洗涤剂组合物(例如，固体、粉末、液体、片剂、凝胶等形式)，包括本文所述的任何形式。
[0308] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于动物饲料
[0309] 在本发明的另外一个方面，本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽可用作动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分，其包含LG-12进化枝蛋白酶及其变体。本发明
还涉及制备此类动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，其包括将
LG-12进化枝蛋白酶多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物
食品成分混合。此外，本发明涉及在动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠
物食品的制备过程中使用LG-12进化枝蛋白酶多肽。
还涉及制备此类动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，其包括将
LG-12进化枝蛋白酶多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物
食品成分混合。此外，本发明涉及在动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠
物食品的制备过程中使用LG-12进化枝蛋白酶多肽。
[0310] 术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施方案中，动物为非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的例子包括但不限于家猪(pig)和猪(swine)，如乳猪、
生长猪、母猪；家禽，如火鸡、鸭子、小鸡、肉鸡、产蛋鸡；鱼类，如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳纲动物，如虾米和对虾。在另外的实施方案中，动物为反刍动物，包括但不限
于牛、牛犊、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛羚(nilgai)。
生长猪、母猪；家禽，如火鸡、鸭子、小鸡、肉鸡、产蛋鸡；鱼类，如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳纲动物，如虾米和对虾。在另外的实施方案中，动物为反刍动物，包括但不限
于牛、牛犊、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛羚(nilgai)。
[0311] 在本发明上下文中，应当理解，术语“宠物食品”是指供家养动物食用的食物，这些家养动物例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、龙猫、奇珍鼠、豚鼠；禽宠物，诸如金丝雀、长尾小
鹦鹉、鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、蜥蜴和蛇；水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。
鹦鹉、鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、蜥蜴和蛇；水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。
[0312] 术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“秣料”可互换使用，并且可包含选自下列的一种或多种喂料：a)谷类，例如小粒谷类(如小麦、大麦、黑麦、燕麦和它们的组合)和/或大粒
谷类，如玉蜀黍或高粱；b)谷类副产品，例如玉米面筋粉、干酒糟及其可溶物(DDGS)(尤其是
玉米干酒糟及其可溶物(cDDGS))、小麦麸、粉头(middlings)、小麦次粉(shorts)、米糠、稻
壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)源自例如以下物质的蛋白质：黄豆、向日葵、花生、羽扇豆、
豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、土豆蛋白、乳清、干椰子肉、芝
麻；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
谷类，如玉蜀黍或高粱；b)谷类副产品，例如玉米面筋粉、干酒糟及其可溶物(DDGS)(尤其是
玉米干酒糟及其可溶物(cDDGS))、小麦麸、粉头(middlings)、小麦次粉(shorts)、米糠、稻
壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)源自例如以下物质的蛋白质：黄豆、向日葵、花生、羽扇豆、
豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、土豆蛋白、乳清、干椰子肉、芝
麻；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
[0313] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于纺织物退浆
[0314] 还设想了使用本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽处理织物(例如，以使纺织物退浆)的组合物及方法。处理织物的方法是本领域众所周知的(参见例如美国专利6,077,
316)。例如，可以通过包括在溶液中使织物与LG-12进化枝蛋白酶接触操作的方法改善织物
的触感和外观。可在压力下用这种溶液处理织物。
316)。例如，可以通过包括在溶液中使织物与LG-12进化枝蛋白酶接触操作的方法改善织物
的触感和外观。可在压力下用这种溶液处理织物。
[0315] 可在编织纺织物的过程中或之后、或在退浆阶段期间、或在一个或多个另外的织物加工步骤期间，施用本发明的LG-12进化枝蛋白酶。在编织纺织物的过程中，织物的纱线
要承受相当大的机械应力。在用纺织机编织前，通常把上浆淀粉或淀粉衍生物涂于经纱表
面，提高经纱的抗拉强度，避免断裂。可在编织过程中或之后施加本发明的LG-12进化枝蛋
白酶以去除这些上浆的淀粉或淀粉衍生物。编织完成后，可使用LG-12进化枝蛋白酶除去上
浆涂层，再进一步加工织物，确保其具备均匀的质地和良好的耐水洗性。
要承受相当大的机械应力。在用纺织机编织前，通常把上浆淀粉或淀粉衍生物涂于经纱表
面，提高经纱的抗拉强度，避免断裂。可在编织过程中或之后施加本发明的LG-12进化枝蛋
白酶以去除这些上浆的淀粉或淀粉衍生物。编织完成后，可使用LG-12进化枝蛋白酶除去上
浆涂层，再进一步加工织物，确保其具备均匀的质地和良好的耐水洗性。
[0316] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶可以作为洗涤剂添加剂，例如在含水组合物中，单独使用或与其它退浆化学试剂和/或退浆酶一起使用以退浆织物(包括含棉织物)。在用于在
靛蓝染色牛仔布和服装上产生石洗外观的组合物和方法中，也可使用淀粉酶。就制作衣服
来说，可能会先裁剪织物，将其缝制为衣服或服装，再整理这些衣服或服装。具体地讲，已开
发出多种不同的酶整理方法来制作牛仔裤。整理牛仔服装通常以酶法退浆步骤开始，该步
骤期间，蛋白水解酶作用于服装使织物变得柔软，而且织物中的棉质在该步骤后更容易接
受后续酶整理步骤的处理。LG-12进化枝蛋白酶可用于整理牛仔服装(例如“生物打磨工
艺”)、酶退浆和软化织物的方法和/或整理工艺。
靛蓝染色牛仔布和服装上产生石洗外观的组合物和方法中，也可使用淀粉酶。就制作衣服
来说，可能会先裁剪织物，将其缝制为衣服或服装，再整理这些衣服或服装。具体地讲，已开
发出多种不同的酶整理方法来制作牛仔裤。整理牛仔服装通常以酶法退浆步骤开始，该步
骤期间，蛋白水解酶作用于服装使织物变得柔软，而且织物中的棉质在该步骤后更容易接
受后续酶整理步骤的处理。LG-12进化枝蛋白酶可用于整理牛仔服装(例如“生物打磨工
艺”)、酶退浆和软化织物的方法和/或整理工艺。
[0317] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于纸浆漂白
[0318] 本文所述的LG-12进化枝蛋白酶多肽还可以用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或由亚硫酸盐法制出的纸浆)的酶辅助漂白。一般来讲，纸浆在适于
漂白纸浆的条件下与本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽一起温育。
漂白纸浆的条件下与本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽一起温育。
[0319] 在一些实施方案中，纸浆是经氧气、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施方案中，LG-12进化枝蛋白酶多肽用于由改进或连续制浆方法制备的具有低木质
素含量的纸浆的酶辅助漂白。在一些其它实施方案中，LG-12进化枝蛋白酶多肽可单独施用
或优选与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶联合施
用。
素含量的纸浆的酶辅助漂白。在一些其它实施方案中，LG-12进化枝蛋白酶多肽可单独施用
或优选与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶联合施
用。
[0320] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于蛋白降解
[0321] 本文所述的LG-12进化枝蛋白酶多肽还可以用于将蛋白质从动物(例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等)中酶法移除以及它们随后的降解或处理。在某些情况下，与传统浸于滚烫
水中或去毛方法相比，将动物尸体浸于含有本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽的溶液中可
保护皮肤免受损坏。在一个实施方案中，可在适于浸提(digest)羽毛或引发羽毛发生降解
的条件下，将本发明分离的蛋白酶多肽喷在羽毛上。在一些实施方案中，本发明的LG-12进
化枝蛋白酶可(如上文那样)与氧化剂联合使用。
水中或去毛方法相比，将动物尸体浸于含有本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽的溶液中可
保护皮肤免受损坏。在一个实施方案中，可在适于浸提(digest)羽毛或引发羽毛发生降解
的条件下，将本发明分离的蛋白酶多肽喷在羽毛上。在一些实施方案中，本发明的LG-12进
化枝蛋白酶可(如上文那样)与氧化剂联合使用。
[0322] 在一些实施方案中，使用本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽辅助移除未经加工羽毛的相关油脂或脂肪。在一些实施方案中，LG-12进化枝蛋白酶多肽用于清洁羽毛以及使纤
维消毒和部分脱水的组合物中。在一些其他实施方案中，在洗涤溶液中，联合95％乙醇或其
他极性有机溶剂，在有或无表面活性剂(约0.5％(v/v))的情况下，施用LG-12进化枝蛋白酶
多肽。
维消毒和部分脱水的组合物中。在一些其他实施方案中，在洗涤溶液中，联合95％乙醇或其
他极性有机溶剂，在有或无表面活性剂(约0.5％(v/v))的情况下，施用LG-12进化枝蛋白酶
多肽。
[0323] 在其它实施方案中，可使用本发明所公开的LG-12进化枝蛋白酶多肽从鸟羽中回收蛋白质。在一些实施方案中，回收的蛋白质可随后用于动物或鱼饲料。
[0324] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于组织清创
[0325] 本文所述的LG-12进化枝蛋白酶多肽还可以用于组织的酶法清创。这涉及(例如)去除伤口的坏死或受损组织以帮助愈合。
[0326] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于组织培养
[0327] 本文所述的LG-12进化枝蛋白酶多肽还可以用于组织培养。具体地讲，本发明的LG-12进化枝蛋白酶可用于(例如)在收集细胞的过程中悬浮或重悬粘附到细胞培养壁的细
胞。本发明的LG-12进化枝蛋白酶可用于断裂培养细胞和培养皿之间的蛋白键，使得细胞悬
浮于溶液中。
胞。本发明的LG-12进化枝蛋白酶可用于断裂培养细胞和培养皿之间的蛋白键，使得细胞悬
浮于溶液中。
[0328] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于食物应用
[0330] 本发明的LG-12进化枝蛋白酶多肽用于皮革加工
[0331] 通过去除动物兽皮的毛发、浸泡、脱脂或软化皮革——在制革过程中涉及非结构蛋白的降解的工艺，本文所述的LG-12进化枝蛋白酶多肽还可以用于皮革加工。
[0332] 实验
[0333] 实施例1
[0334] 测定法
[0335] 以下测定法为在后述实施例中使用的标准测定法。偶尔具体方案要求与这些标准测定法有一定偏差。在这些情况下，实施例中确定了与下面这些标准测定方案的偏差。
[0336] 性能指数
[0337] 酶的性能指数(PI)为相同蛋白质浓度下变体的性能(测量值)与亲本酶的性能(理论值或测量值)的比较。亲本酶的理论浓度可通过使用从亲本酶的标准曲线的朗格缪尔拟
合中提取的参数计算。性能指数(PI)大于1(PI>1)表示变体性能相比亲本酶(例如LG12sprC
成熟蛋白，SEQ ID NO:3)提高；PI等于1(PI＝1)表示变体性能与亲本酶相同；PI小于1(PI<
1)表示变体比亲本酶表现差。
合中提取的参数计算。性能指数(PI)大于1(PI>1)表示变体性能相比亲本酶(例如LG12sprC
成熟蛋白，SEQ ID NO:3)提高；PI等于1(PI＝1)表示变体性能与亲本酶相同；PI小于1(PI<
1)表示变体比亲本酶表现差。
[0338] 蛋白测定试验
[0339] 为了确定蛋白表达水平，通过高效液相色谱(HPLC)方法，使用在96孔微量滴定板(MTP)中生长的培养物的上清液进行蛋白测定。使用配备有Acquity UPLC BEH 125SEC
(Waters)尺寸排阻色谱柱的Agilent 1200或1260HPLC。使用含250mM氯化钠的25mM磷酸钠
缓冲液(pH 6.8)，从色谱柱中洗脱样品。在220nm处测量吸光度，并用ChemStation软件
(Agilent Technologies)对峰进行积分处理。基于纯化的野生型蛋白(SEQ ID NO:3所示的
亲本LG12进化枝枯草杆菌蛋白酶sprC)的标准曲线，确定样品的蛋白浓度。
(Waters)尺寸排阻色谱柱的Agilent 1200或1260HPLC。使用含250mM氯化钠的25mM磷酸钠
缓冲液(pH 6.8)，从色谱柱中洗脱样品。在220nm处测量吸光度，并用ChemStation软件
(Agilent Technologies)对峰进行积分处理。基于纯化的野生型蛋白(SEQ ID NO:3所示的
亲本LG12进化枝枯草杆菌蛋白酶sprC)的标准曲线，确定样品的蛋白浓度。
[0340] 蛋白酶活性
[0341] 通过测量N-suc-AAPF-pNA比色底物的水解而检测LG12sprC蛋白酶及其变体的蛋白酶活性。所用试剂溶液为：100mM Tris/HCl，pH 8.6，含有0.005％ (Tris稀
释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH 8.6，含有10mM CaCl2和0.005％ (Tris/
Ca缓冲液)；以及160mM suc-AAPF-pNA的DMSO溶液(suc-AAPF-pNA储备溶液)(Sigma:S-
7388)。为制备底物工作溶液，将1ml suc-AAPF-pNA储备溶液添加至100ml Tris/Ca缓冲液
并充分混合。将酶样品加入盛有1mg/suc-AAPF-pNA工作溶液的MTP板(Greiner 781101)中，
并于室温在405nm处历经3分钟使用SpectraMax读板机以动力学模式测定酶活性。蛋白酶活
性表达为mOD·min-1。
释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH 8.6，含有10mM CaCl2和0.005％ (Tris/
Ca缓冲液)；以及160mM suc-AAPF-pNA的DMSO溶液(suc-AAPF-pNA储备溶液)(Sigma:S-
7388)。为制备底物工作溶液，将1ml suc-AAPF-pNA储备溶液添加至100ml Tris/Ca缓冲液
并充分混合。将酶样品加入盛有1mg/suc-AAPF-pNA工作溶液的MTP板(Greiner 781101)中，
并于室温在405nm处历经3分钟使用SpectraMax读板机以动力学模式测定酶活性。蛋白酶活
性表达为mOD·min-1。
[0342] 用于稳定性测定的总体样品设置
[0343] 通过在升高的温度温育后测量残余的活性，检测变体在不同的胁迫条件下(下表1中所示的缓冲液和洗涤剂)的稳定性。设定所述升高的温度，以获得大概30％残余活性。将
稀释酶样品混合在胁迫因子中并测量未胁迫的蛋白酶活性。将胁迫因子中的稀释样品在升
高的温度下温育，温育之后测量经胁迫的蛋白酶活性。
稀释酶样品混合在胁迫因子中并测量未胁迫的蛋白酶活性。将胁迫因子中的稀释样品在升
高的温度下温育，温育之后测量经胁迫的蛋白酶活性。
[0344] 稳定性测定试验条件描述于下表中，洗涤剂在用于稳定性测定之前已经失活：
[0345] 表1—蛋白稳定性测定试验中所使用的条件
[0346]
[0347] 对于非胁迫条件，立即测定酶对AAPF的活性(见上文测定法)。对于胁迫条件，将PCR板密封并使用Eppendorf 384热循环仪在升高的温度下温育5分钟，然后测定酶活性。
[0348] 通过水解上文所述的合成底物AAPF来测量胁迫和非胁迫活性。残余活性％计算如下：取胁迫活性与非胁迫活性的比率，然后乘以100。变体的残余活性除以野生型蛋白的残
余活性即得稳定性PI。
余活性即得稳定性PI。
[0349] 衣物洗涤剂和自动盘碟洗涤剂中的清洁性能
[0350] 在基于洗衣的应用中测试变体与野生型LG12sprC相比对BMI(棉材上的血/乳/墨)微样布(EMPA-116)的清洁性能；在基于盘碟的应用中测试变体与野生型LG12sprC相比对蛋
黄(老化并经炭黑染料上色的聚丙烯酸织物上的蛋黄)微样布(PAS-38)的清洁性能。
黄(老化并经炭黑染料上色的聚丙烯酸织物上的蛋黄)微样布(PAS-38)的清洁性能。
[0351] 经预冲孔(以安装到MTP上)、冲洗和装液的含样布板(Corning 3641)由Center for Testmaterials BV，Vlaardingen，The Netherlands制备。添加酶之前向微样布板装入
洗涤剂。商业洗涤剂经加热灭活以去除酶，并按照表2所示剂量添加。此外，表2.1示出GSM-B
和GSM-C ADW洗涤剂的组成。
洗涤剂。商业洗涤剂经加热灭活以去除酶，并按照表2所示剂量添加。此外，表2.1示出GSM-B
和GSM-C ADW洗涤剂的组成。
[0352] 为使酶失活，对洗涤剂处理如下：将每个ADW洗涤剂片溶于700mL21GH水中，于65℃下处理该溶液30至45分钟，使酶失活。用于测定试验之前将酶失活溶液用21GH水稀释10倍。
[0353] 将HDL衣物洗涤剂在水浴中加热到95℃并持续16小时，使之失活。失活后使用AAPF底物测定蛋白酶活性，以确保完全失活。通过制备相对于最终清洁测定中所用的溶液浓缩
10倍的溶液并将其在95℃下加热16小时来使HDD衣物洗涤剂失活。失活后使用AAPF底物测
定蛋白酶活性。将HDD洗涤剂和HDL洗涤剂加热16小时后，蛋白酶活性不再存在。制备ADW片
和衣物洗涤HDD的10x浓度，衣物洗涤HDL未经稀释而处理。这些溶液在升高的温度下温育以
使酶失活。失活后使用AAPF-pNA底物测定蛋白酶活性。
10倍的溶液并将其在95℃下加热16小时来使HDD衣物洗涤剂失活。失活后使用AAPF底物测
定蛋白酶活性。将HDD洗涤剂和HDL洗涤剂加热16小时后，蛋白酶活性不再存在。制备ADW片
和衣物洗涤HDD的10x浓度，衣物洗涤HDL未经稀释而处理。这些溶液在升高的温度下温育以
使酶失活。失活后使用AAPF-pNA底物测定蛋白酶活性。
[0354] 表2—用于性能测定试验的洗涤剂条件的列表
[0355]
[0356] *对于提供pH值的洗涤剂，pH是设定的，而对于标记为ND的洗涤剂则未设定pH
[0357] 洗涤剂来源：Kirkland Ultra(Sun Products)、OMO Color(Unilever)、OMO Klein&Krachtig(Unilever)和Blue Moon(Guangzhou Blue Moon)于2012年采购于当地超
市；Finish All in One(Reckitt Benckiser)、Finish Quantum(Reckitt Benckiser)和
SUN All in One(Unilever)洗涤剂片于2012年12月采购于当地超市。
市；Finish All in One(Reckitt Benckiser)、Finish Quantum(Reckitt Benckiser)和
SUN All in One(Unilever)洗涤剂片于2012年12月采购于当地超市。
[0358] 表2.1—GSM-B和GSM-C ADW洗涤剂的组成(采购自WFK Testgewebe GmbH，Brüggen，Deutschland，www.testgewebe.de)
[0359]
[0360] 对于洗衣测定试验，将酶的等分试样加入装有洗涤剂的微样布板，以达到200μL的最终体积，获得5至0.5ppm的最终酶浓度。使用HDL或HDD配方的衣物清洁测定试验在25℃进
行15至20分钟，而自动盘碟(ADW)测定试验在40℃进行30分钟。
行15至20分钟，而自动盘碟(ADW)测定试验在40℃进行30分钟。
[0361] 温育之后，将100μL上清液转移至新鲜MTP(Costar 9017)，并使用SpectraMax读板机在600nm处读取EMPA-116样布的吸光度，或在405nm处读取PAS-38样布的吸光度。将每个
样品的吸光度值减去空白对照样(不含酶)的吸光度值，得到吸光度结果。给定变体的吸光
度值除以相同浓度的预测野生型蛋白的吸光度值，即得每个测定条件下的清洁PI。通过对
亲本酶的标准曲线进行朗格缪尔拟合来确定野生型蛋白的吸光度值。
样品的吸光度值减去空白对照样(不含酶)的吸光度值，得到吸光度结果。给定变体的吸光
度值除以相同浓度的预测野生型蛋白的吸光度值，即得每个测定条件下的清洁PI。通过对
亲本酶的标准曲线进行朗格缪尔拟合来确定野生型蛋白的吸光度值。
[0362] 实施例2
[0363] 芽孢杆菌属LG12 sprC蛋白酶的位点评估文库(SEL)的生成
[0364] 通过由枯草芽孢杆菌aprE启动子、杂合aprE-BPN’信号肽、杂合BPN’-LG12sprC蛋白酶前肽、成熟LG12sprC蛋白酶和BPN’终止子组成的表达盒，在枯草芽孢杆菌中产生
LG12sprC蛋白酶。将这个表达盒，作为EcoRI-BamHI片段，克隆到pHYT复制穿梭载体中。通过
下述由pHY300PLK(Takara)产生pHYT载体：利用BstEII和EcoRI位点，在四环素抗性基因后
添 加 终 止 子 ( 终 止 子 序 列 S E Q I D N O : 2 1 ，
GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTA
TGCATCGATGGAATTC)。还使用克隆在BamHI和HindIII位点中的接头(新接头序列SEQ ID NO:
22，GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)，去掉了pHY300PLK中的HindIII位点。
LG12sprC蛋白酶。将这个表达盒，作为EcoRI-BamHI片段，克隆到pHYT复制穿梭载体中。通过
下述由pHY300PLK(Takara)产生pHYT载体：利用BstEII和EcoRI位点，在四环素抗性基因后
添 加 终 止 子 ( 终 止 子 序 列 S E Q I D N O : 2 1 ，
GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTA
TGCATCGATGGAATTC)。还使用克隆在BamHI和HindIII位点中的接头(新接头序列SEQ ID NO:
22，GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)，去掉了pHY300PLK中的HindIII位点。
[0365] 图1示出携带LG12sprC基因的pHYT载体(pHYT-LG12)图。用质粒pHYT-LG12sprC转化Top10大肠杆菌感受态细胞，然后将转化的细胞接种到含有50ppm羧苄青霉素的LB琼脂板
上。于37℃下温育过夜之后，将培养物置于5ml含有50ppm羧苄青霉素的Luria肉汤中，并在
37℃下振荡过夜培养。第二天，将质粒DNA从培养物中分离出来并对其测序。跨操纵的区域
进行质粒DNA测序来进行序列确认，然后使用具有正确序列的质粒转化枯草芽孢杆菌细胞。
将转化的细胞接种到含有1.6％脱脂乳和10ppm四环素的LB琼脂板上。
上。于37℃下温育过夜之后，将培养物置于5ml含有50ppm羧苄青霉素的Luria肉汤中，并在
37℃下振荡过夜培养。第二天，将质粒DNA从培养物中分离出来并对其测序。跨操纵的区域
进行质粒DNA测序来进行序列确认，然后使用具有正确序列的质粒转化枯草芽孢杆菌细胞。
将转化的细胞接种到含有1.6％脱脂乳和10ppm四环素的LB琼脂板上。
[0366] 在LG12sprC成熟丝氨酸蛋白酶的275个位点的每个位点上生成位置文库[B.Schmidt等人，1995，Applied and Environmental Microbiology 61:4490-4493]。变体
由包含编码LG12sprC变体序列的表达质粒的经转化枯草芽孢杆菌细胞组成。将变体点样在
96孔板中，每个孔一种变体。将包含LG12sprC置换变体的枯草芽孢杆菌转化体在含有胰酶
大豆肉汤(TSB)和12.5ppm四环素的96孔板中过夜培养，并且将10μL这种预培养物加入盛有
340μL培养基(如下文所述)的方形孔MTP(Enzyscreen)中，所述培养基补充有25ppm四环素。
在32℃及80％湿度下，板在300rpm恒定旋转混合的情况下温育2天。细胞经2500rpm离心10
分钟并收集，再使用Millipore真空系统通过Millipore Multiscreen过滤板过滤。将培养
物上清液用于测定。培养基为以MOP缓冲液为基础的半限定富集培养基，其中以尿素为主要
氮源，以葡萄糖为主要碳源，并添加1％的大豆胨促进细胞生长。图2示出如在质粒PHYT-
LG12中编码的LG12sprC蛋白前体的序列。信号肽(信号肽：AprE的第7位氨基酸(Trp)融合至
BPN’的第8位氨基酸(Ile))以下划线示出(来自枯草芽孢杆菌的序列以小写字母示出，前
肽：BPN’的第9位氨基酸(Lys)融合至LG12的第13位氨基酸(Tyr)，来自解淀粉芽孢杆菌的序
列以斜体示出，LG12序列以普通文本示出)，前肽序列突出显示，成熟LG12序列以粗体示出。
由包含编码LG12sprC变体序列的表达质粒的经转化枯草芽孢杆菌细胞组成。将变体点样在
96孔板中，每个孔一种变体。将包含LG12sprC置换变体的枯草芽孢杆菌转化体在含有胰酶
大豆肉汤(TSB)和12.5ppm四环素的96孔板中过夜培养，并且将10μL这种预培养物加入盛有
340μL培养基(如下文所述)的方形孔MTP(Enzyscreen)中，所述培养基补充有25ppm四环素。
在32℃及80％湿度下，板在300rpm恒定旋转混合的情况下温育2天。细胞经2500rpm离心10
分钟并收集，再使用Millipore真空系统通过Millipore Multiscreen过滤板过滤。将培养
物上清液用于测定。培养基为以MOP缓冲液为基础的半限定富集培养基，其中以尿素为主要
氮源，以葡萄糖为主要碳源，并添加1％的大豆胨促进细胞生长。图2示出如在质粒PHYT-
LG12中编码的LG12sprC蛋白前体的序列。信号肽(信号肽：AprE的第7位氨基酸(Trp)融合至
BPN’的第8位氨基酸(Ile))以下划线示出(来自枯草芽孢杆菌的序列以小写字母示出，前
肽：BPN’的第9位氨基酸(Lys)融合至LG12的第13位氨基酸(Tyr)，来自解淀粉芽孢杆菌的序
列以斜体示出，LG12序列以普通文本示出)，前肽序列突出显示，成熟LG12序列以粗体示出。
[0367] 下文示出用于在pHYT-LG12质粒中表达的、编码LG12sprC基因和N-端信号肽区域和前肽区域的开放阅读框的核苷酸序列。
[0368] SEQ ID NO:1示出了编码如在质粒PHYT-LG12中编码的LG12sprC蛋白前体的核苷酸序列。
[0369]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATC
CTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATACTTAGTTGGATTTGCAAAAGGTAATAAAGCAAATG
CCCAGTCTTCTAAAAATTTGATTACTGCTGCTGGTGGGGACATACAACATACATTCCAGTACATGGATGTTGTGGAA
GTATCATTGCCTGAAAAAGCTGCAGAAGCATTAATGAAGAATCCTAACATTGCTTTCGTTGAGGAAAACGTCGAAAT
GATGGCTACTGCTCAAACAGTTCCTTGGGGCATCCCTCATATCAAAGCTGACAAAGCGCATGCTGCTGGAGTGACTG
GAAGCGGTGTGAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCA
AGCTTTGTTTCTGGAGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGC
GTTGAATAACACAACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTGTATGCAGTAAAAGTACTTAGTGCTTCAG
GTAGTGGTACGTTAAGTGGTATTGCTCAAGGTATTGAGTGGTCGATCTCAAATGGAATGAATGTCATCAATATGAGT
CTTGGTGGAAGCTCTGGTTCAACTGCTTTACAACAAGCGTGTAATAATGCTTATAACAGAGGCATTGTCGTAATTGC
TGCTGCTGGGAATTCAGGTTCTTCAGGCAATCGGAATACGATGGGTTATCCTGCGAGATATAGCTCTGTAATCGCAG
TAGGAGCGGTTAGTAGCAATAATACTCGTGCATCATTCTCCAGTGTAGGAAGTGAACTGGAAGTAATGGCACCAGGT
GTCAACATTTTGAGCACAACTCCTGGCAACAATTATGCTTCCTTCAATGGTACATCCATGGCAGCTCCTCATGTTGC
AGGAGCTGCTGCATTAATCAAAGCGAAATACCCAAGCATGACAAATGTTCAAATTCGTGAACGTCTGAAAAATACGG
CTACAAATCTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAG
CTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATACTTAGTTGGATTTGCAAAAGGTAATAAAGCAAATG
CCCAGTCTTCTAAAAATTTGATTACTGCTGCTGGTGGGGACATACAACATACATTCCAGTACATGGATGTTGTGGAA
GTATCATTGCCTGAAAAAGCTGCAGAAGCATTAATGAAGAATCCTAACATTGCTTTCGTTGAGGAAAACGTCGAAAT
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GAAGCGGTGTGAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCA
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CTACAAATCTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAG
[0370] SEQ ID NO：2示出编码成熟LG12 sprC蛋白的核苷酸序列(825个核苷酸)。
[0371]GCTCAAACAGTTCCTTGGGGCATCCCTCATATCAAAGCTGACAAAGCGCATGCTGCTGGAGTGACTGGAAGCGGTGT
GAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCAAGCTTTGTTT
CTGGAGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGCGTTGAATAAC
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CTGGAGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGCGTTGAATAAC
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AGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAG
[0372] SEQ ID NO：3示出了成熟LG12 sprC蛋白的氨基酸序列(275个氨基酸)。
[0373]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSISNGMNVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSSGNRNTMGYPARYSSVIAVGAVSSNNTRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
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[0374] SEQ ID NO：4示出了全长LG12 sprC蛋白的氨基酸序列(信号序列以下划线示出，前肽以斜体示出，添加的3个残基AGK以粗体示出，成熟LG12序列以常规字体示出)。
[0375] VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
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[0376] 实施例3
[0377] 生产性位置和可组合突变
[0378] 生产性位置描述为分子内最可用于形成表现出改善特性的组合变体的那些位置，所述位置本身允许至少一个可组合突变。可组合突变可描述为分子内可用于形成组合变体
的那些置换。可组合突变是可改善分子的至少一种所需性质而不会明显降低表达、活性或
稳定性之任一的突变。
的那些置换。可组合突变是可改善分子的至少一种所需性质而不会明显降低表达、活性或
稳定性之任一的突变。
[0379] 可组合突变是可改善分子的至少一种所需性质而同时不会明显降低表达、活性或稳定性之任一的突变。用实施例1所述以及下文列出的测定法得到性能指数(PI)值，用这些
PI值确定了LG12 sprC中的可组合突变。
PI值确定了LG12 sprC中的可组合突变。
[0380] 蛋白质测定(表达)在实施例1中示出。
[0381] 蛋白酶活性(AAPF测定法)在实施例1中示出。
[0382] 在下列洗涤剂中的清洁活性：Kirkland Ultra HDD(pH 10.6)、OMO Color HDD(pH 10.6)、OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2)、Blue Moon HDL(pH 6.5)、GSM-B、GSM-B(pH 9)、
GSM-C、Sun All in One、Finish Quantum片。
GSM-C、Sun All in One、Finish Quantum片。
[0383] 在下列洗涤剂和缓冲液中的稳定性测定试验：OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2,51℃)、GSM-B(68.5℃)、GSM-C(62℃)、LAS-EDTA缓冲液(52℃)、Tris EDTA缓冲液(51℃)、
Tris-钙缓冲液(72.5℃)。
Tris-钙缓冲液(72.5℃)。
[0384] 根据下列标准将可组合突变分组：
[0385] 变体，相对于LG12sprC亲本，在表达、蛋白酶活性、一种或多种清洁活性测定试验及一种或多种稳定性测定试验中的活性方面，具有大于或等于0.9的最低性能指数(PI)；此
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.0的PI(A组)。
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.0的PI(A组)。
[0386] 变体，相对于LG12sprC亲本，在表达、蛋白酶活性、一种或多种清洁活性测定试验及一种或多种稳定性测定试验中的活性方面，具有大于或等于0.8的最低性能指数(PI)；此
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.2的PI(B组)。
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.2的PI(B组)。
[0387] 变体，相对于LG12sprC亲本，在表达、蛋白酶活性、一种或多种清洁活性测定试验及一种或多种稳定性测定试验中的活性方面，具有大于或等于0.5的最低性能指数(PI)；此
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.5的PI(C组)。
外，就这些测试中的任一者而言，具有大于或等于1.5的PI(C组)。
[0388] 可组合突变的性质汇总于表3。
[0389]
[0390] A组、B组和C组还含有对多重置换的容忍度不同的氨基酸位置。为了识别生产性位置，我们测量每个位置所容忍的置换程度，并给每个位置分配生产力得分。使用下文示出的
标准，根据每个位置中落入A组、B组或C组的置换的百分比，分配了生产力得分。
标准，根据每个位置中落入A组、B组或C组的置换的百分比，分配了生产力得分。
[0391] 生产性位置被定义为：对多重置换表现出一定程度的容忍性、同时又满足下文示出的一系列可组合性标准的位置。
[0392] 用于确定生产性位置的生产力得分的标准如下：
[0393] 若在给定位置处不到15％的置换落入A组、B组或C组，则向该位置分配“1”的生产力得分。
[0394] 若在给定位置处不到30％、但多于或等于15％的置换落入A组、B组或C组，则向该位置分配“2”的生产力得分。
[0395] 若在给定位置处不到50％、但多于或等于30％的置换落入A组、B组或C组，则向该位置分配“3”的生产力得分。
[0396] 若在给定位置处50％或50％以上的置换落入A组、B组或C组，则向该位置分配“4”的生产力得分。
[0397] 生产力得分为“1”的位置列出如下：
[0398] 4，7，8，12，14，16，17，29，33，42，46，51，56，65，69，73，81，83，84，88，94，104，109，111，114，120，122，125，128，132，138，141，143，146，151，163，165，167，175，176，195，203，
204，205，206，211，212，215，220，224，227，230，232，238，250，260，262，268，273，和274.[0399] 生产力得分为“2”的位置列出如下：
204，205，206，211，212，215，220，224，227，230，232，238，250，260，262，268，273，和274.[0399] 生产力得分为“2”的位置列出如下：
[0400] 1，3，18，19，20，22，24，25，26，28，30，31，44，50，53，55，57，58，61，67，72，76，77，79，80，85，86，87，89，90，91，93，96，100，101，102，106，107，108，113，116，121，124，126，
127，136，137，140，144，147，150，152，153，160，162，170，172，173，183，185，187，188，194，
213，216，217，218，222，225，228，231，234，235，241，243，244，246，252，255，265，和272.[0401] 生产力得分为“3”的位置列出如下：
127，136，137，140，144，147，150，152，153，160，162，170，172，173，183，185，187，188，194，
213，216，217，218，222，225，228，231，234，235，241，243，244，246，252，255，265，和272.[0401] 生产力得分为“3”的位置列出如下：
[0402] 2，9，15，38，45，48，52，59，62，75，97，99，103，117，118，119，123，129，133，145，148，149，156，159，161，181，209，236，240，248，256，267，271，和275.
[0403] 生产力得分为“4”的位置列出如下：
[0404] 27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245和251。
[0405] 用实施例1中描述的如下测定法得到性能指数(PI)值，用这些PI值确定了LG12 sprC中的可组合突变：蛋白质测定(表达)，AAPF活性，在洗涤剂(Kirkland Ultra HDD(pH
10.6)、OMO Color HDD(pH 10.6)、OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2)、Blue Moon HDL(pH
6.5)、GSM-B、GSM-B(pH 9)、GSM-C、Sun All in One、和Finish Quantum片)中的清洁活性，
在洗涤剂和缓冲液(OMO Klein&Krachtig HDL洗涤剂(pH 8.2)、GSM-B洗涤剂、GSM-C洗涤
剂、LAS-EDTA缓冲液、Tris EDTA缓冲液、Tris-钙缓冲液，在72.5℃)中的稳定性测定试验。
10.6)、OMO Color HDD(pH 10.6)、OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2)、Blue Moon HDL(pH
6.5)、GSM-B、GSM-B(pH 9)、GSM-C、Sun All in One、和Finish Quantum片)中的清洁活性，
在洗涤剂和缓冲液(OMO Klein&Krachtig HDL洗涤剂(pH 8.2)、GSM-B洗涤剂、GSM-C洗涤
剂、LAS-EDTA缓冲液、Tris EDTA缓冲液、Tris-钙缓冲液，在72.5℃)中的稳定性测定试验。
[0406] 依据实施例4中示出的标准，将可组合突变分配到A组、B组或C组。依据置换所在的组别(A、B、C)，进一步向这些置换分配适宜度得分；适宜度得分越高，表示置换越适用于产
生组合变体。表4给出了适宜度得分的定义。LG12sprC中符合上述标准的各单独置换的适宜
度得分记录于表4中。
生组合变体。表4给出了适宜度得分的定义。LG12sprC中符合上述标准的各单独置换的适宜
度得分记录于表4中。
[0407] 表3.2：适宜度得分的定义
[0408]置换出现在以下组中： 适宜度得分
A、B和C +++++
A和B ++++
A或(B和C) +++
B ++
C +
A、B和C +++++
A和B ++++
A或(B和C) +++
B ++
C +
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413]
[0414] 评估对特定清洁应用有益的LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶突变
[0415] 依据SEL变体在下述不同测定条件下的性能，进一步将这些SEL变体分成各种类别。该分析中排除HPLC PI值小于0.75的SEL变体。此外，在每个测定试验中，若对应的CV值
小于0或大于100，则不考虑该PI值。
小于0或大于100，则不考虑该PI值。
[0416] 为获得对于每一类性能而言最佳的突变，除考虑HPLC(相对蛋白质表达)的PI值之外，还考虑了下列测量结果：
[0417] 1)在Kirkland Ultra HDD(pH 10.6)或OMO Color HDD(pH 10.6)中，HDD PI值为1.01或更高
[0418] 2)在OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2)中，HDL(pH 8)PI值为1.01或更高
[0419] 3)在Blue Moon(pH 6.5)中，HDL(pH 6)PI值为1.01或更高
[0420] 4)在下列洗涤剂和缓冲液中，洗衣稳定性PI值为1.01或更高：OMO Klein&Krachtig HDL(pH 8.2，51℃)或LAS-EDTA缓冲液(52℃)
[0421] 5)在下列洗涤剂中，ADW PI值为1.01或更高：GSM-B、GSM-B(pH 9)，GSM-C、Sun All in One或Finish Quantum片
[0422] 6)在下列洗涤剂和缓冲液中，ADW稳定性PI值为1.01或更高：GSM-B(68.5℃)、GSM-C(62℃)、Tris EDTA缓冲液(51℃)、Tris-钙缓冲液(72.5℃)。
[0423] 用于每个类别中分组的标准：对于表7中列出的具体类别，PI值大于1.01，且表达的PI值大于0.75。
[0424] 最有益于洗衣稳定性的突变列表
[0425] A029T，I030A，I030V，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，A040W，A040Y，S101R，T103D，T103E，T103G，T103K，T103R，S052D，S052F，S052N，
S052R，N183E，V093T，L0031T，N117E，N117F，N117S，N117T，M124S，L126D，L126G，L126I，
L126K，L126Q，N123D，S125G，S129A，S129D，S129K，S129Q，S130E，S130F，S130H，S130L，
S130N，S130Q，S130T，S130V，S130W，S130Y，G131D，G131E，G131R，Q137E，S099K，G102E，
G102F，G102Y，I107H，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，A224P，
A224S，K015V，P225G，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，
N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，Q136R，Q136W，N163D，E248C，E248D，A019M，T022D，
T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，G100F，I147A，I147H，I147S，
V148N，V148S，Q245M，Q245T，Q245V，I246N，N243G，S024H，S024T，S024V，K045D，K045E，
K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048G，A048H，
A048Q，A048Y，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078S，T078W，
N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，M241W，V244Y，N252E，K265D，K265S，S272M，S272Q，
N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，
K251V，F050Q，F050R，F050Y，V051I，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，G053D，
G053E，G053Q，G053R，Y143D，Y143E，S181A，S181H，S181N，S181Q，G154F，G154H，G154I，
G154K，G154T，S194K，S194P，S194R，K237A，K237N，A215D，A215E，Y171G，Y171Q，K012G，
V072A，V0072T，S156A，S156D，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，
N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，
R170L，A108C，A108I，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，
A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，I150A，I150N，I150S，
I150T，I150V，A152P，A152V，S216I，S216T，A228S，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，
P239G，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，F217R，T220G，S159D，S159E，S159N，S159Q，
G128N，T209F，T209V，T209W，T209Y，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，S240P，
S240Q，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，L096H，
L096I，L096R，L096Y，S116E，V081M，K235D，K235E，K235F，K235G，V267F，V267I，V267R，
V267S，V267T，V267Y，M222A，M222H，andM222Q
S052R，N183E，V093T，L0031T，N117E，N117F，N117S，N117T，M124S，L126D，L126G，L126I，
L126K，L126Q，N123D，S125G，S129A，S129D，S129K，S129Q，S130E，S130F，S130H，S130L，
S130N，S130Q，S130T，S130V，S130W，S130Y，G131D，G131E，G131R，Q137E，S099K，G102E，
G102F，G102Y，I107H，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，A224P，
A224S，K015V，P225G，T185Q，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，
N043F，N043L，N043W，Q136D，Q136H，Q136R，Q136W，N163D，E248C，E248D，A019M，T022D，
T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，G100E，G100F，I147A，I147H，I147S，
V148N，V148S，Q245M，Q245T，Q245V，I246N，N243G，S024H，S024T，S024V，K045D，K045E，
K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048G，A048H，
A048Q，A048Y，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078S，T078W，
N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，M241W，V244Y，N252E，K265D，K265S，S272M，S272Q，
N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，
K251V，F050Q，F050R，F050Y，V051I，N076D，N076S，T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，G053D，
G053E，G053Q，G053R，Y143D，Y143E，S181A，S181H，S181N，S181Q，G154F，G154H，G154I，
G154K，G154T，S194K，S194P，S194R，K237A，K237N，A215D，A215E，Y171G，Y171Q，K012G，
V072A，V0072T，S156A，S156D，S156H，S156K，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，
N256P，N256W，F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，
R170L，A108C，A108I，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，
A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149Q，V149S，I150A，I150N，I150S，
I150T，I150V，A152P，A152V，S216I，S216T，A228S，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，
P239G，P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，F217R，T220G，S159D，S159E，S159N，S159Q，
G128N，T209F，T209V，T209W，T209Y，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，S240P，
S240Q，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，L096H，
L096I，L096R，L096Y，S116E，V081M，K235D，K235E，K235F，K235G，V267F，V267I，V267R，
V267S，V267T，V267Y，M222A，M222H，andM222Q
[0426] 最有益于HDL pH6性能的突变列表
[0427] I030A，A040E，A040L，A040T，A040Y，T103D，T103E，S052D，S052F，S052N，N183E，L031T，N117E，N117F，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，N120E，V121G，
S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，
G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，
K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，
T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，
N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，
K251V，F050Q，T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，
S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，
N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，
G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V 149L，
V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，
P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，
A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，
L096E，K235D，K235E，andV267S
S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，
G100A，G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，
K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，
T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，
N038A，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，
K251V，F050Q，T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，
S181H，K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，
N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，
G118E，G118Q，G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V 149L，
V149N，I150A，I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，
P239H，P239M，P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，
A236N，A236Q，A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，
L096E，K235D，K235E，andV267S
[0428] 最有益于HDL pH8性能的突变列表
[0429] A029G，A029T，T033N，T033V，A040D，A040E，G065A，A069G，K094A，K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，G110S，I111M，Y086D，Y086E，
Y086I，Y086P，Y086S，Y086T，S101A，T103A，T103D，T103E，T103N，L104I，L104T，S052D，
S052F，S052G，S052H，S052L，L058V，N183E，G083A，V084E，V093I，L031A，L031E，L031N，
L031Q，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，A037M，A037N，A037Q，A037T，
A037W，V068D，V068Q，M124S，L126Q，M119A，M119F，M119H，M119I，M119L，N123A，N123D，
N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，A187H，N062A，N062K，N062L，N062P，S129D，
S130E，S130P，Q137E，N144M，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097Y，G102E，I107Q，
N120P，S182D，S182E，A001G，A001H，A001L，T003E，V004E，D014E，E197D，L206Y，I011A，
I011S，I011T，A013S，K015H，K015M，K015N，K015P，K015Q，K015S，K015T，K015V，K015Y，
T185M，T185Q，P005D，P005T，K027D，K027E，K027G，K027L，K027M，K027N，K027Q，K027T，
K027Y，N043D，N043E，S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，S049I，S049K，S049N，S049Q，
S049T，S049V，S049W，Q136D，N163D，N163E，G211D，G211Q，G211T，W006A，W006D，W006H，
W006L，W006M，W006N，W006P，W006Q，W006S，A019K，A019W，T022G，T022L，G061E，R145N，
R145T，R145W，S158D，S158H，S158Q，L090E，L090G，L090N，L090Q，G100A，G100E，I147H，
I147M，I147S，V148A，V148D，V148E，V148F，V148G，V148L，V148Q，T164D，T164E，N184A，
N184H，F189A，F189D，F189E，F189I，F189L，F189S，F189V，Q245M，Q245N，Q245P，Q245T，
Q245V，I246A，I246C，L274D，L274E，L274G，N243D，H017I，V021D，L257C，L257G，L257I，
S024G，K045E，K045L，K045W，Q275L，Q275T，A048D，A048E，A048G，A048H，A048L，E054F，
E054G，E054H，E054I，E054L，E054M，E054N，E054P，E054R，E054T，E054V，E054W，A073I，
T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，N087F，N087H，N087P，N087Q，N087S，A088D，
A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，D089L，Y091T，Y091V，Y091W，G020E，G020H，
G020L，G020V，G020Y，G046E，G046L，G046M，N252E，N252F，N252I，N252L，N252Q，N252S，
F261Y，K265D，K265V，S272F，S272M，S272Q，S272V，N056A，N056E，N056II，N056I，N056L，
N056M，N056Q，N056S，N056V，A074G，N077D，N077G，N077P，T208A，A231F，A231L，A018F，
A018K，A018L，A018N，A018P，A018Q，A018S，A018T，A018V，A018W，A018Y，N038D，N038E，
N038H，N038I，N038K，N038P，N038Q，N038T，N038Y，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，
K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271M，E271W，F050I，F050S，F050Y，
V051D，V051E，V051F，V051G，V051K，V051L V051M，V051N，V051P，V051Q，V051R，V051T，
V051W，V051Y，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，A057M，A057N，A057Q，A057R，
A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075F，L075N，L075Q，L075S，L075T，L075V，
L075W，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，I175A，
I175F，I175Q，I175S，I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，G053I，G053L，G053P，P055A，
P055G，P055M，P055W，P055Y，S194G，A232H，A232I，A232N，A232Q，A232S，A232T，I234M，
I234N，I234S，I234T，I234V，I234W，K237A，K237D，K237F，K237L，K237M，K237N，K237T，
K237V，K237W，A215D，A215E，A215M，V203A，V203D，V203E，V203G，V203I，V203L，L233G，
L233H，L233N，L233T，L250I，K012D，K012E，K012G，K012H，K012L，K012M，K012T，K012Y，
V072A，V072D，V072E，V072F，V072G，V072I，V072T，Y167D，Y167E，Y167F，Y167P，S156D，
S156N，S172N，Y238A，Y238C，Y238E，Y238F，Y238G，Y238S，Y238W，T255L，N256D，N256E，
I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227Y，F262E，F262I，G106E，
G106T，T133D，N161D，N161E，N161F，N161S，N161W，N161Y，R170I，R170L，R170M，A08C，A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146H，G146N，G146Q，D060E，D060N，D060S，
W113F，A138E，N140D，N140G，V149D，V149F，V149G，V149L，I150A，N212I，N212L，N212Q，
N212W，S216D，A228G，P239C，P239G，P239H，P239L，P239N，Q002E，Q002S，F217D，F217E，
F217I，F217T，H226D，H226E，H226L，H226Q，H226T，A230F，A230H，A230I，A230M，A230Q，
Q059I，A016H，A016W，P210D，P210E，P210W，S159D，S159E，S159N，G063D，G063E，G063L，
G063M，G063N，G063S，G03T，G063V，A098F，A098S，I122L，V198A，V198C，V198F，V198T，T209M，T209Q，T209V，N213D，N213E，A236C，A236D，A236E，A236F，A236L，S240F，S240P，T242E，
T242Q，P260C，G258D，N141G，S173D，Y214M，P009A，P009G，P009I，P009T，H010L，L096E，
L096H，L096I，S116E，S116F，G025A，G025F，V081P，H039G，H039T，K235D，K235E，V267L，
V267N，A151H，G160F，G160H，G160M，G160V，M222L，和M222Y
Y086I，Y086P，Y086S，Y086T，S101A，T103A，T103D，T103E，T103N，L104I，L104T，S052D，
S052F，S052G，S052H，S052L，L058V，N183E，G083A，V084E，V093I，L031A，L031E，L031N，
L031Q，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，A037M，A037N，A037Q，A037T，
A037W，V068D，V068Q，M124S，L126Q，M119A，M119F，M119H，M119I，M119L，N123A，N123D，
N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，A187H，N062A，N062K，N062L，N062P，S129D，
S130E，S130P，Q137E，N144M，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097Y，G102E，I107Q，
N120P，S182D，S182E，A001G，A001H，A001L，T003E，V004E，D014E，E197D，L206Y，I011A，
I011S，I011T，A013S，K015H，K015M，K015N，K015P，K015Q，K015S，K015T，K015V，K015Y，
T185M，T185Q，P005D，P005T，K027D，K027E，K027G，K027L，K027M，K027N，K027Q，K027T，
K027Y，N043D，N043E，S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，S049I，S049K，S049N，S049Q，
S049T，S049V，S049W，Q136D，N163D，N163E，G211D，G211Q，G211T，W006A，W006D，W006H，
W006L，W006M，W006N，W006P，W006Q，W006S，A019K，A019W，T022G，T022L，G061E，R145N，
R145T，R145W，S158D，S158H，S158Q，L090E，L090G，L090N，L090Q，G100A，G100E，I147H，
I147M，I147S，V148A，V148D，V148E，V148F，V148G，V148L，V148Q，T164D，T164E，N184A，
N184H，F189A，F189D，F189E，F189I，F189L，F189S，F189V，Q245M，Q245N，Q245P，Q245T，
Q245V，I246A，I246C，L274D，L274E，L274G，N243D，H017I，V021D，L257C，L257G，L257I，
S024G，K045E，K045L，K045W，Q275L，Q275T，A048D，A048E，A048G，A048H，A048L，E054F，
E054G，E054H，E054I，E054L，E054M，E054N，E054P，E054R，E054T，E054V，E054W，A073I，
T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，N087F，N087H，N087P，N087Q，N087S，A088D，
A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，D089L，Y091T，Y091V，Y091W，G020E，G020H，
G020L，G020V，G020Y，G046E，G046L，G046M，N252E，N252F，N252I，N252L，N252Q，N252S，
F261Y，K265D，K265V，S272F，S272M，S272Q，S272V，N056A，N056E，N056II，N056I，N056L，
N056M，N056Q，N056S，N056V，A074G，N077D，N077G，N077P，T208A，A231F，A231L，A018F，
A018K，A018L，A018N，A018P，A018Q，A018S，A018T，A018V，A018W，A018Y，N038D，N038E，
N038H，N038I，N038K，N038P，N038Q，N038T，N038Y，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，
K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271M，E271W，F050I，F050S，F050Y，
V051D，V051E，V051F，V051G，V051K，V051L V051M，V051N，V051P，V051Q，V051R，V051T，
V051W，V051Y，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，A057M，A057N，A057Q，A057R，
A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075F，L075N，L075Q，L075S，L075T，L075V，
L075W，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，I175A，
I175F，I175Q，I175S，I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，G053I，G053L，G053P，P055A，
P055G，P055M，P055W，P055Y，S194G，A232H，A232I，A232N，A232Q，A232S，A232T，I234M，
I234N，I234S，I234T，I234V，I234W，K237A，K237D，K237F，K237L，K237M，K237N，K237T，
K237V，K237W，A215D，A215E，A215M，V203A，V203D，V203E，V203G，V203I，V203L，L233G，
L233H，L233N，L233T，L250I，K012D，K012E，K012G，K012H，K012L，K012M，K012T，K012Y，
V072A，V072D，V072E，V072F，V072G，V072I，V072T，Y167D，Y167E，Y167F，Y167P，S156D，
S156N，S172N，Y238A，Y238C，Y238E，Y238F，Y238G，Y238S，Y238W，T255L，N256D，N256E，
I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227Y，F262E，F262I，G106E，
G106T，T133D，N161D，N161E，N161F，N161S，N161W，N161Y，R170I，R170L，R170M，A08C，A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，G118T，G146H，G146N，G146Q，D060E，D060N，D060S，
W113F，A138E，N140D，N140G，V149D，V149F，V149G，V149L，I150A，N212I，N212L，N212Q，
N212W，S216D，A228G，P239C，P239G，P239H，P239L，P239N，Q002E，Q002S，F217D，F217E，
F217I，F217T，H226D，H226E，H226L，H226Q，H226T，A230F，A230H，A230I，A230M，A230Q，
Q059I，A016H，A016W，P210D，P210E，P210W，S159D，S159E，S159N，G063D，G063E，G063L，
G063M，G063N，G063S，G03T，G063V，A098F，A098S，I122L，V198A，V198C，V198F，V198T，T209M，T209Q，T209V，N213D，N213E，A236C，A236D，A236E，A236F，A236L，S240F，S240P，T242E，
T242Q，P260C，G258D，N141G，S173D，Y214M，P009A，P009G，P009I，P009T，H010L，L096E，
L096H，L096I，S116E，S116F，G025A，G025F，V081P，H039G，H039T，K235D，K235E，V267L，
V267N，A151H，G160F，G160H，G160M，G160V，M222L，和M222Y
[0430] 最有益于HDD性能的突变列表
[0431] A029G，A029S，A029T，I030S，I030V，I030Y，T033N，T033V，A040D，A040E，A040G，A040H，A040K，A040L，A040N，A040P，A040Y，G065A，T066S，H067A，H067E，H067F，H067G，
H067K，H067L，H067M，H067N，H067P，H067Q，H067S，H067T，H067V，H067Y，A069G，K094A，
K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，V095T，G110S，
I111M，I111V，Y086D，Y086E，Y086I，Y086K，Y086M，Y086P，Y086Q，Y086T，Y086W，S101A，
S101M，S101T，S101V，T103A，T103D，T103E，T103G，T103L，T103N，T103S，T103Y，L104I，
S052D，S052F，S052G，S052H，S052L，S052M，S052N，S052Q，S052T，S052V，L058A，L058D，
L058H，L058I，L058R，L058T，L058V，N183E，N183I，N183M，N183P，N183Y，G083A，G083S，
V084L，V084S，V084T，A085I，A085S，V093G，V093I，V093M，V093T，L031A，L031E，L031N，
L031Q，L031T，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，A037M，A037N，A037Q，
A037R，A037S，A037T，A037W，V068D，V068I，V068M，V068Q，N117E，N117F，N117K，N117M，
N117S，N117T，N117Y，M124S，L126G，L126I，L126Q，M119A，M119F，M119H，M119L，M119Q，
M119S，M119T，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，A187F，A187G，
A187H，A187N，A187P，A187W，N062A，N062K，N062L，N062P，N062W，S129A，S129D，S129G，
S129Q，S129T，S129Y，S130E，S130L，S130N，S130P，S130Q，S130T，G131D，G131P，G131Q，
G131S，S132A，Q137E，Q137H，Q137I，Q137T，N144H，N144V，N144Y，A153S，S097G，S097H，
S097I，S097K，S097L，S097M，S097N，S097Y，S099I，S099L，S099V，G102E，I107Q，N120G，
N120P，N120T，V121A，V121F，V121G，V121S，V177I，V177T，A179G，S182A，S182D，S182E，
S182F，S182L，S182M，S182N，S182W，A001G，A001K，A001L，A001R，T003E，T003H，T003I，
T003V，T003Y，V004E，V004F，V004G，V004H，V004P，V004S，V004Y，D014E，D014F，D014G，
D014H，D014T，D014Y，E197D，I205A，I205C，I205M，I205N，L206F，L206K，L206M，L206N，
L206R，L206S，L206V，L206W，L206Y，A224S，I011A，I011M，I011T，I011V，A013S，K015H，
K015M，K015N，K015P，K015Q，K015S，K015T，K015V，K015Y，A092V，T185F，T185G，T185H，
T185M，T185Q，P005D，P005I，P005M，P005S，P005T，P005V，G007Y，K027D，K027E，K027G，
K027H，K027L，K027M，K027N，K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，K027Y，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043G，N043H，N043I，N043K，N043L，N043M，N043Q，N043S，N043V，N043W，
S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，S049I，S049K，S049N，S049Q，S049R，S049T，S049V，
S049W，Q136D，Q136G，Q136H，Q136L，Q136N，Q136V，N163D，N163E，N204L，G211H，G211K，
G211Q，G211T，E248A，E248H，I008A，I008G，I008H，I008N，I008P，I008T，I008V，I008Y，
V028E，V028F，V028H，V028I，V028L，V028M，V028N，V028Q，V028S，V028T，L042I，L042M，
L042N，L042Q，L042T，L042V，W006A，W006D，W006H，W006K，W006L，W006M，W006N，W006P，
W006Q，W006S，W006Y，A019F，A019K，A019L，A019M，A019R，A019W，A019Y，T022E，T022G，
T022I，T022L，T022M，T022Q，T022R，T022S，T022V，T022W，V026E，V026F，V026H，V026L，
V026N，V026Q，V026R，V026S，G061A，G061E，G061I，G061M，G061P，G061S，G061T，G061Y，
R145N，R145T，S158D，S158G，S158H，S158M，S158N，S158Q，S158T，S158V，L090E，L090F，
L090G，L090N，L090P，L090Q，L090R，L090Y，G100A，G100E，I147A，I147H，I147M，I147S，
V148D，V148E，V148G，V148L，V148M，V148Q，V148S，N184A，N184S，F189A，F189D，F189E，
F189G，F189H，F189I，F189K，F189L，F189M，F189N，F189P，F189Q，F189S，F189T，F189V，
P201L，P201S，P201T，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245P，Q245R，Q245S，Q245T，Q245W，
Q245Y，I246A，I246F，I246M，I246V，L274F，L274M，L274Y，N243D，N243K，N243L，N243P，
N243R，T253F，T253G，T253K，T253N，A254G，A254T，H017I，H017L，H017P，H017S，H017T，
H017V，V021D，V021F，V021G，V021H，V021K，V021M，V021R，L257A，L257C，L257G，L257H，
L257I，L257M，L257P，L257Q，L257V，V270I，V270L，V270M，V270Q，V270T，V270W，V270Y，
S024G，S024H，S024I，S024P，S024R，S024T，S024V，K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，
K045W，Q275K，Q275L，Q275N，Q275R，Q275W，Q275Y，A048D，A048E，A048G，A048H，A048I，
A048K，A048L，A048N，A048Q，A048W，E054D，E054F，E054G，E054H，E054I，E054K，E054L，
E054M，E054N，E054P，E054R，E054S，E054T，E054V，E054W，A073G，A073I，A073K，A073L，
A073T，A073V，T078A，T078F，T078H，T078I，T078L，T078R，T078V，T078W，N087F，N087H，
N087P，N087Q，N087S，A088D，A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，D089L，D089R，
D089T，D089W，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，Y091V，Y091W，G020E，G020H，G020L，G020N，
G020Q，G020T，G020V，G020Y，M241H，M241I，M241Q，M241S，V244L，V244Q，N252F，N252I，
N252L，N252Q，N252R，N252S，F261Y，K265S，K265V，S272F，S272H，S272K，S272M，S272N，
S272P，S272Q，S272T，S272V，N056A，N056E，N056I，N056L，N056M，N056P，N056Q，N056S，
N056V，A074G，A074S，N077G，L135I，L196M，T208A，T208I，T208L，T208N，T208V，A231G，
A231L，A231S，A231Y，R249K，R249W，A018F，A018K，A018L，A018N，A018S，A018T，A018W，
A018Y，N038A，N038D，N038E，N038I，N038K，N038P，N038T，N038Y，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271L，E271M，E271Q，
E271W，E271Y，F050A，F050I，F050K，F050Q，F050S，F050W，F050Y，V051A，V051D，V051E，
V051F，V051G，V051H，V051I，V051K，V051L，V051M，V051N，V051P，V051Q，V051R，V051T，
V051W，V051Y，N076D，N076E，N076I，N076K，N076Q，N076R，N076S，N076T，N076Y，T079K，
T079L，T079Q，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，A057M，A057N，A057P，A057Q，
A057R，A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075E，L075F，L075G，L075H，L075I，
L075K，L075N，L075Q，L075R，L075S，L075T，L075V，L075W，G166A，G166C，G166D，G166E，
G166F，G166H，G166I，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166Y，I175A，I175F，I175Q，I175S，
I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，G053I，G053L，G053N，G053P，G053Q，P055A，P055G，
P055K，P055M，P055N，P055R，P055S，P055W，P055Y，Y143E，Y143L，Y143M，Y143N，Y143Q，
Y143T，Y143V，S181A，T071A，T071G，T071M，T071N，T071P，T071S，T071V，S194G，S194I，
S194M，S194V，A232H，A232I，A232L，A232M，A232N，A232Q，A232S，A232T，I234A，I234F，
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K237N，K237Q，K237R，K237S，K237T，K237V，K237W，A215D，A215E，A215F，A215G，A215H，
A215K，A215L，A215M，A215N，A215Y，A169S，V203A，V203D，V203E，V203G，V203L，V203T，
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K012L，K012M，K012R，K012T，K012Y，D036A，D036E，D036W，V072A，V072D，V072E，V072F，
V072K，V072P，V072Q，V072T，Y167A，Y167D，Y167E，Y167F，V180A，V180N，V180S，V180T，
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S172H，S172I，S172L，S172M，S172N，S172T，S172V，S172Y，S188G，S188H，S188T，S188Y，
Y238A，Y238C，Y238D，Y238F，Y238G，Y238I，Y238K，Y238L，Y238M，Y238Q，Y238T，Y238V，
Y238W，T255A，T255D，T255F，T255G，T255H，T255I，T255K，T255L，T255M，T255N，T255Q，
T255S，T255W，T255Y，N256D，N256E，N256K，N256L，N256M，N256P，N256Q，N256R，N256V，
N256W，I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227T，V227Y，F262E，
F262S，G106E，G106I，G106N，G106S，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，T133N，T133Q，
T133V，N161D，N161E，N161F，N161M，N161Q，N161W，N161Y，R170K，R170L，R170M，A108C，
A108I，A108L，S114G，S114T，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，G146Q，
G146R，D060A，D060E，D060F，D060H，D060K，D060L，D060M，D060N，D060P，D060Q，D060S，
D060T，D060V，D060Y，W113F，W113H，W113Y，A138E，A138S，N140D，N140F，N140G，N140I，
N140L，N140M，N140Q，N140T，N140V，N140W，N140Y，V149A，V149D，V149E，V149F，V149G，
V149H，V149I，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，V149T，I150A，I150M，I150N，I150T，
I150V，N212F，N212G，N212L，N212P，N212W，S216A，A228S，P239F，P239I，P239K，P239T，
P239V，P239W，Q002E，Q002K，Q002P，Q002S，Q002W，Q002Y，S207T，S207V，F217D，F217E，
F217H，F217I，F217R，F217T，F217V，H226D，H226E，H226F，H226G，H226L，H226Q，H226T，
A230D，A230F，A230H，A230M，A230Q，A230Y，Q059I，Q059N，A016E，A016G，A016H，A016I，
A016K，A016L，A016Q，A016T，A016W，G023A，A200S，P210D，P210E，P210F，P210I，P210L，
P210Q，P210S，P210T，P210V，P210W，S159D，S159E，S159N，S159Q，S159T，G063A，G063D，
G063E，G063F，G063H，G063L，G063M，G063N，G063P，G063R，G063S，G063T，G063V，G063W，
G063Y，A098H，A098L，A098M，A098P，A098Q，A098S，A098T，A098V，Q109K，I122L，I122M，
G128N，V198A，V198C，V198F，T209E，T209M，T209Q，T209R，T209S，T209V，T209W，N213A，
N213D，N213E，N213F，N213G，N213M，A236C，A236F，A236G，A236L，A236N，A236Q，A236V，
S240F，S240I，S240M，S240P，S240Q，S240V，S240W，T242A，T242E，T242G，T242H，T242I，
T242K，T242L，T242P，T242Q，T242S，T242V，T242Y，P260C，P260I，P260L，P260M，P260N，
P260S，P260V，G258D，Y263T，Y263W，N141G，N141T，S173A，S173D，S173N，S173T，Y214F，
Y214G，Y214I，Y214M，Y214N，P009A，P009G，P009H，P009M，P009Q，P009R，P009T，P009V，
H010A，H010L，L096H，L096I，S116F，S116M，G025A，V044A，V044I，V081G，V081L，V081M，
V081P，V081Y，N269K，N269TN269V，H039G，H039S，H039T，K235A，K235D，K235E，V267A，V267E，V267F，V267G，V267I，V267K，V267L，V267N，V267S，V267T，V267Y，A151H，A151I，A151Q，
A151S，A151T，G160F，G160H，G160M，G160V，M222E，M222H，M222L，and M222Y
H067K，H067L，H067M，H067N，H067P，H067Q，H067S，H067T，H067V，H067Y，A069G，K094A，
K094D，K094E，K094H，K094L，K094M，K094N，K094S，K094T，V095A，V095S，V095T，G110S，
I111M，I111V，Y086D，Y086E，Y086I，Y086K，Y086M，Y086P，Y086Q，Y086T，Y086W，S101A，
S101M，S101T，S101V，T103A，T103D，T103E，T103G，T103L，T103N，T103S，T103Y，L104I，
S052D，S052F，S052G，S052H，S052L，S052M，S052N，S052Q，S052T，S052V，L058A，L058D，
L058H，L058I，L058R，L058T，L058V，N183E，N183I，N183M，N183P，N183Y，G083A，G083S，
V084L，V084S，V084T，A085I，A085S，V093G，V093I，V093M，V093T，L031A，L031E，L031N，
L031Q，L031T，G034A，G034E，A037D，A037E，A037F，A037H，A037L，A037M，A037N，A037Q，
A037R，A037S，A037T，A037W，V068D，V068I，V068M，V068Q，N117E，N117F，N117K，N117M，
N117S，N117T，N117Y，M124S，L126G，L126I，L126Q，M119A，M119F，M119H，M119L，M119Q，
M119S，M119T，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123I，N123Q，A187D，A187F，A187G，
A187H，A187N，A187P，A187W，N062A，N062K，N062L，N062P，N062W，S129A，S129D，S129G，
S129Q，S129T，S129Y，S130E，S130L，S130N，S130P，S130Q，S130T，G131D，G131P，G131Q，
G131S，S132A，Q137E，Q137H，Q137I，Q137T，N144H，N144V，N144Y，A153S，S097G，S097H，
S097I，S097K，S097L，S097M，S097N，S097Y，S099I，S099L，S099V，G102E，I107Q，N120G，
N120P，N120T，V121A，V121F，V121G，V121S，V177I，V177T，A179G，S182A，S182D，S182E，
S182F，S182L，S182M，S182N，S182W，A001G，A001K，A001L，A001R，T003E，T003H，T003I，
T003V，T003Y，V004E，V004F，V004G，V004H，V004P，V004S，V004Y，D014E，D014F，D014G，
D014H，D014T，D014Y，E197D，I205A，I205C，I205M，I205N，L206F，L206K，L206M，L206N，
L206R，L206S，L206V，L206W，L206Y，A224S，I011A，I011M，I011T，I011V，A013S，K015H，
K015M，K015N，K015P，K015Q，K015S，K015T，K015V，K015Y，A092V，T185F，T185G，T185H，
T185M，T185Q，P005D，P005I，P005M，P005S，P005T，P005V，G007Y，K027D，K027E，K027G，
K027H，K027L，K027M，K027N，K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，K027Y，N043A，N043D，
N043E，N043F，N043G，N043H，N043I，N043K，N043L，N043M，N043Q，N043S，N043V，N043W，
S049A，S049D，S049E，S049G，S049H，S049I，S049K，S049N，S049Q，S049R，S049T，S049V，
S049W，Q136D，Q136G，Q136H，Q136L，Q136N，Q136V，N163D，N163E，N204L，G211H，G211K，
G211Q，G211T，E248A，E248H，I008A，I008G，I008H，I008N，I008P，I008T，I008V，I008Y，
V028E，V028F，V028H，V028I，V028L，V028M，V028N，V028Q，V028S，V028T，L042I，L042M，
L042N，L042Q，L042T，L042V，W006A，W006D，W006H，W006K，W006L，W006M，W006N，W006P，
W006Q，W006S，W006Y，A019F，A019K，A019L，A019M，A019R，A019W，A019Y，T022E，T022G，
T022I，T022L，T022M，T022Q，T022R，T022S，T022V，T022W，V026E，V026F，V026H，V026L，
V026N，V026Q，V026R，V026S，G061A，G061E，G061I，G061M，G061P，G061S，G061T，G061Y，
R145N，R145T，S158D，S158G，S158H，S158M，S158N，S158Q，S158T，S158V，L090E，L090F，
L090G，L090N，L090P，L090Q，L090R，L090Y，G100A，G100E，I147A，I147H，I147M，I147S，
V148D，V148E，V148G，V148L，V148M，V148Q，V148S，N184A，N184S，F189A，F189D，F189E，
F189G，F189H，F189I，F189K，F189L，F189M，F189N，F189P，F189Q，F189S，F189T，F189V，
P201L，P201S，P201T，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245P，Q245R，Q245S，Q245T，Q245W，
Q245Y，I246A，I246F，I246M，I246V，L274F，L274M，L274Y，N243D，N243K，N243L，N243P，
N243R，T253F，T253G，T253K，T253N，A254G，A254T，H017I，H017L，H017P，H017S，H017T，
H017V，V021D，V021F，V021G，V021H，V021K，V021M，V021R，L257A，L257C，L257G，L257H，
L257I，L257M，L257P，L257Q，L257V，V270I，V270L，V270M，V270Q，V270T，V270W，V270Y，
S024G，S024H，S024I，S024P，S024R，S024T，S024V，K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，
K045W，Q275K，Q275L，Q275N，Q275R，Q275W，Q275Y，A048D，A048E，A048G，A048H，A048I，
A048K，A048L，A048N，A048Q，A048W，E054D，E054F，E054G，E054H，E054I，E054K，E054L，
E054M，E054N，E054P，E054R，E054S，E054T，E054V，E054W，A073G，A073I，A073K，A073L，
A073T，A073V，T078A，T078F，T078H，T078I，T078L，T078R，T078V，T078W，N087F，N087H，
N087P，N087Q，N087S，A088D，A088G，A088N，A088P，A088Q，D089F，D089K，D089L，D089R，
D089T，D089W，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，Y091V，Y091W，G020E，G020H，G020L，G020N，
G020Q，G020T，G020V，G020Y，M241H，M241I，M241Q，M241S，V244L，V244Q，N252F，N252I，
N252L，N252Q，N252R，N252S，F261Y，K265S，K265V，S272F，S272H，S272K，S272M，S272N，
S272P，S272Q，S272T，S272V，N056A，N056E，N056I，N056L，N056M，N056P，N056Q，N056S，
N056V，A074G，A074S，N077G，L135I，L196M，T208A，T208I，T208L，T208N，T208V，A231G，
A231L，A231S，A231Y，R249K，R249W，A018F，A018K，A018L，A018N，A018S，A018T，A018W，
A018Y，N038A，N038D，N038E，N038I，N038K，N038P，N038T，N038Y，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，E271A，E271D，E271F，E271L，E271M，E271Q，
E271W，E271Y，F050A，F050I，F050K，F050Q，F050S，F050W，F050Y，V051A，V051D，V051E，
V051F，V051G，V051H，V051I，V051K，V051L，V051M，V051N，V051P，V051Q，V051R，V051T，
V051W，V051Y，N076D，N076E，N076I，N076K，N076Q，N076R，N076S，N076T，N076Y，T079K，
T079L，T079Q，A057C，A057D，A057E，A057I，A057K，A057L，A057M，A057N，A057P，A057Q，
A057R，A057S，A057T，A057V，A057Y，L075A，L075D，L075E，L075F，L075G，L075H，L075I，
L075K，L075N，L075Q，L075R，L075S，L075T，L075V，L075W，G166A，G166C，G166D，G166E，
G166F，G166H，G166I，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166Y，I175A，I175F，I175Q，I175S，
I175T，I175V，G053A，G053D，G053E，G053I，G053L，G053N，G053P，G053Q，P055A，P055G，
P055K，P055M，P055N，P055R，P055S，P055W，P055Y，Y143E，Y143L，Y143M，Y143N，Y143Q，
Y143T，Y143V，S181A，T071A，T071G，T071M，T071N，T071P，T071S，T071V，S194G，S194I，
S194M，S194V，A232H，A232I，A232L，A232M，A232N，A232Q，A232S，A232T，I234A，I234F，
I234M，I234N，I234Q，I234S，I234V，I234W，I234Y，K237F，K237G，K237I，K237L，K237M，
K237N，K237Q，K237R，K237S，K237T，K237V，K237W，A215D，A215E，A215F，A215G，A215H，
A215K，A215L，A215M，A215N，A215Y，A169S，V203A，V203D，V203E，V203G，V203L，V203T，
L233A，L233D，L233G，L233H，L233M，L233T，L250I，L250T，K012D，K012E，K012G，K012H，
K012L，K012M，K012R，K012T，K012Y，D036A，D036E，D036W，V072A，V072D，V072E，V072F，
V072K，V072P，V072Q，V072T，Y167A，Y167D，Y167E，Y167F，V180A，V180N，V180S，V180T，
G080F，G080M，G080Y，S156A，S156D，S156H，S156I，S156L，S156M，S156N，S156Q，S156V，
S172H，S172I，S172L，S172M，S172N，S172T，S172V，S172Y，S188G，S188H，S188T，S188Y，
Y238A，Y238C，Y238D，Y238F，Y238G，Y238I，Y238K，Y238L，Y238M，Y238Q，Y238T，Y238V，
Y238W，T255A，T255D，T255F，T255G，T255H，T255I，T255K，T255L，T255M，T255N，T255Q，
T255S，T255W，T255Y，N256D，N256E，N256K，N256L，N256M，N256P，N256Q，N256R，N256V，
N256W，I035A，I035F，I035G，I035L，I035M，I035T，V227F，V227S，V227T，V227Y，F262E，
F262S，G106E，G106I，G106N，G106S，T133A，T133D，T133F，T133L，T133M，T133N，T133Q，
T133V，N161D，N161E，N161F，N161M，N161Q，N161W，N161Y，R170K，R170L，R170M，A108C，
A108I，A108L，S114G，S114T，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，G146Q，
G146R，D060A，D060E，D060F，D060H，D060K，D060L，D060M，D060N，D060P，D060Q，D060S，
D060T，D060V，D060Y，W113F，W113H，W113Y，A138E，A138S，N140D，N140F，N140G，N140I，
N140L，N140M，N140Q，N140T，N140V，N140W，N140Y，V149A，V149D，V149E，V149F，V149G，
V149H，V149I，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，V149T，I150A，I150M，I150N，I150T，
I150V，N212F，N212G，N212L，N212P，N212W，S216A，A228S，P239F，P239I，P239K，P239T，
P239V，P239W，Q002E，Q002K，Q002P，Q002S，Q002W，Q002Y，S207T，S207V，F217D，F217E，
F217H，F217I，F217R，F217T，F217V，H226D，H226E，H226F，H226G，H226L，H226Q，H226T，
A230D，A230F，A230H，A230M，A230Q，A230Y，Q059I，Q059N，A016E，A016G，A016H，A016I，
A016K，A016L，A016Q，A016T，A016W，G023A，A200S，P210D，P210E，P210F，P210I，P210L，
P210Q，P210S，P210T，P210V，P210W，S159D，S159E，S159N，S159Q，S159T，G063A，G063D，
G063E，G063F，G063H，G063L，G063M，G063N，G063P，G063R，G063S，G063T，G063V，G063W，
G063Y，A098H，A098L，A098M，A098P，A098Q，A098S，A098T，A098V，Q109K，I122L，I122M，
G128N，V198A，V198C，V198F，T209E，T209M，T209Q，T209R，T209S，T209V，T209W，N213A，
N213D，N213E，N213F，N213G，N213M，A236C，A236F，A236G，A236L，A236N，A236Q，A236V，
S240F，S240I，S240M，S240P，S240Q，S240V，S240W，T242A，T242E，T242G，T242H，T242I，
T242K，T242L，T242P，T242Q，T242S，T242V，T242Y，P260C，P260I，P260L，P260M，P260N，
P260S，P260V，G258D，Y263T，Y263W，N141G，N141T，S173A，S173D，S173N，S173T，Y214F，
Y214G，Y214I，Y214M，Y214N，P009A，P009G，P009H，P009M，P009Q，P009R，P009T，P009V，
H010A，H010L，L096H，L096I，S116F，S116M，G025A，V044A，V044I，V081G，V081L，V081M，
V081P，V081Y，N269K，N269TN269V，H039G，H039S，H039T，K235A，K235D，K235E，V267A，V267E，V267F，V267G，V267I，V267K，V267L，V267N，V267S，V267T，V267Y，A151H，A151I，A151Q，
A151S，A151T，G160F，G160H，G160M，G160V，M222E，M222H，M222L，and M222Y
[0432] 最有益于洗衣稳定性+HDL pH6的突变列表
[0433] I030A，A040E，A040L，A040T，A040Y，T103D，T103E，S052D，S052F，S052N，N183E，L031T，N117E，N117F，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，G12E，I107Q，N120E，V121G，S182D，S182E，T003E，A224S，K015V，K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，
N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，
G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，K045E，
K045F，K045LK045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，N038A，N038D，
N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，
T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，
K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，
F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，
G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，
I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，
P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，
A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，K235D，
K235E，V267S，和M222Q
N043F，N043W，Q136D，N163D，T022D，T022E，R145N，R145T，R145W，S158D，L090P，G100A，
G100E，I147A，I147H，I147S，V148S，Q245T，Q245V，I246N，S024T，S024V，K045D，K045E，
K045F，K045LK045Q，K045R，K045S，K045W，Q275E，Q275N，A048D，A048E，A048Q，T078D，T078E，T078F，T078L，T078W，N087S，Y091H，M241S，M241W，K265D，K265S，S272M，N038A，N038D，
N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，
T079L，G166D，G166E，G166H，G166N，G166Y，G053D，G053E，Y143D，Y143E，S181H，K237A，
K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156H，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，
F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，S114G，S114T，G118D，G118E，G118Q，
G118S，G118T，G146N，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，I150A，
I150N，I150T，I150V，S216I，S216T，A228S，P239C，P239D，P239E，P239F，P239H，P239M，
P239N，P239T，P239W，S159D，S159E，S159N，T209F，T209V，A236D，A236E，A236N，A236Q，
A236S，T242E，S173D，P009A，P009I，P009M，P009Q，P009S，P009T，P009V，L096E，K235D，
K235E，V267S，和M222Q
[0434] 最有益于洗衣稳定性+HDL pH8的突变列表
[0435] A029T，A040D，A040E，T103D，T103E，S052D，S052F，N183E，M124S，L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，
K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，R145T，R145W，S158D，G100A，G100E，
I147H，I147S，Q245M，Q245T，Q245V，K045E，K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，
T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，N087S，N252E，K265D，S272M，S272Q，N038D，
N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，
G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，
K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，
G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，
G118T，G146N，A138E，N140D，V149G，V149L，I150A，P239C，P239G，P239H，P239N，S159D，
S159E，S159N，T209V，A236C，A236D，A236E，S240P，T242E，S173D，P009A，P009I，P009T，
L096E，L096H，L096I，S116E，K235D，和K235E
K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，R145T，R145W，S158D，G100A，G100E，
I147H，I147S，Q245M，Q245T，Q245V，K045E，K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，
T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078W，N087S，N252E，K265D，S272M，S272Q，N038D，
N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Y，
G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G053D，G053E，
K237A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，
G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，A108I，S114T，G118D，G118E，G118Q，G118S，
G118T，G146N，A138E，N140D，V149G，V149L，I150A，P239C，P239G，P239H，P239N，S159D，
S159E，S159N，T209V，A236C，A236D，A236E，S240P，T242E，S173D，P009A，P009I，P009T，
L096E，L096H，L096I，S116E，K235D，和K235E
[0436] 最有益于洗衣稳定性+HDD的突变列表
[0437] A029T，I030V，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040Y，T103D，T103E，T103G，S052D，S052F，S052N，N183E，V093T，L031T，N117E，N117F，N117S，N117T，M124S，
L126G，L126I，L126Q，N123D，S129A，S129D，S129Q，S130E，S130LS130N，S130Q，S130T，G131D，Q137E，G102E，I107Q，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，A224S，K015V，T185Q，
K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，
Q136H，N163D，A019M，T022E，R145N，R145T，S158D，L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，
I147S，V148S，Q245M，Q245T，S024H，S024T，S024V，K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，
K045W，Q275N，A048D，A048，A048G，A048H，A048Q，T078A，T078F，T078H，T078LT078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，K265S，S272M，S272Q，N038A，N038D，N038EN038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，F050Y，V051I，N076D，N076S，
T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，G166D，G166E，G166F，G166H，G166M，G166N，G166Q，
G166S，G166Y，G053D，G053E，G053Q，Y143E，S181A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，
V072T，S156A，S156D，S156H，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，N256P，N256W，
F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，R170L，A108C，
A108I，S114G，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，
V149G，V149L，V149NV149Q，V149S，I150A，I150N，I150T，I150V，A228S，P239F，P239T，P239W，F217R，S159D，S159E，S159N，S159Q，G128N，T209V，T209W，A236C，A236N，A236Q，S240P，
S240Q，T242E，S173D，P009A，P009M，P009Q，P009T，P009V，L096H，L096I，V081M，K235D，
K235E，V267F，V267I，V267S，V267T，V267Y，和M222H
L126G，L126I，L126Q，N123D，S129A，S129D，S129Q，S130E，S130LS130N，S130Q，S130T，G131D，Q137E，G102E，I107Q，V121G，S182D，S182E，T003E，T003I，T003V，A224S，K015V，T185Q，
K027E，K027L，K027M，K027S，K027T，N043A，N043D，N043E，N043F，N043L，N043W，Q136D，
Q136H，N163D，A019M，T022E，R145N，R145T，S158D，L090P，G100A，G100E，I147A，I147H，
I147S，V148S，Q245M，Q245T，S024H，S024T，S024V，K045D，K045L，K045Q，K045R，K045S，
K045W，Q275N，A048D，A048，A048G，A048H，A048Q，T078A，T078F，T078H，T078LT078W，N087S，Y091H，Y091N，M241Q，M241S，K265S，S272M，S272Q，N038A，N038D，N038EN038T，K251A，K251C，K251F，K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，F050Q，F050Y，V051I，N076D，N076S，
T079L，T079Q，L075G，G166A，G166C，G166D，G166E，G166F，G166H，G166M，G166N，G166Q，
G166S，G166Y，G053D，G053E，G053Q，Y143E，S181A，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，
V072T，S156A，S156D，S156H，S156M，S156N，S156Q，T255D，N256D，N256E，N256P，N256W，
F262E，G106E，T133D，T133F，T133M，T133N，T133V，N161D，N161E，R170K，R170L，A108C，
A108I，S114G，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，A138S，N140D，V149A，V149E，
V149G，V149L，V149NV149Q，V149S，I150A，I150N，I150T，I150V，A228S，P239F，P239T，P239W，F217R，S159D，S159E，S159N，S159Q，G128N，T209V，T209W，A236C，A236N，A236Q，S240P，
S240Q，T242E，S173D，P009A，P009M，P009Q，P009T，P009V，L096H，L096I，V081M，K235D，
K235E，V267F，V267I，V267S，V267T，V267Y，和M222H
[0438] 最有益于洗衣稳定性+HDL pH8+HDD的突变列表
[0439] A029T，A040D，A040E，T103D，T103E，S052D，S052F，N183F，M124S，L126Q，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，S182E，T003E，K015V，T185Q，K027E，K027L，
K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，
I147S，Q245M，Q245T，K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，T078F，T078H，T078W，
N087S，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K2511，K251M，K251N，K251R，
K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166M，G166N，G166Q，
G166S，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，
N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，A108I，S114T，G118E，G118Q，
G118S，G118T，A138EN140D，V149G，V149L，I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，S240P，T242E，S 173D，P009A，P009T，L096H，L096I，K235D，和K235E
K027M，K027T，N043D，N043E，Q136D，N163D，R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，
I147S，Q245M，Q245T，K045L，K045W，A048D，A048E，A048G，A048H，T078F，T078H，T078W，
N087S，S272M，S272Q，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K2511，K251M，K251N，K251R，
K251S，K251T，K251V，F050Y，G166A，G166C，G166D，G166E，G166H，G166M，G166N，G166Q，
G166S，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，K012G，V072A，V072T，S156D，S156N，N256D，
N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，N161E，R170L，A108C，A108I，S114T，G118E，G118Q，
G118S，G118T，A138EN140D，V149G，V149L，I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，A236C，S240P，T242E，S 173D，P009A，P009T，L096H，L096I，K235D，和K235E
[0440] 最有益于洗衣稳定性+HDD+HDL pH6+HDL pH8的突变列表
[0441] A040E，T103D，T103E，S052D，S052F，N183E，M124S，N123D，S129D，S130E，Q137E，G102E，I107Q，S182D，S182E，T003E，K015V，K027E，K027L，K027M，K027T，N043D，N043E，
Q136D，N163D，R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245T，K045L，K045W，
A048D，A048E，T078F，T078W，N087S，S272M，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，G166D，G166EG166H，G166N，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，
N161E，R170L，A108C，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，T242E，S173D，P009A，P009T，K235D，和K235E
Q136D，N163D，R145N，R145T，S158D，G100A，G100E，I147H，I147S，Q245T，K045L，K045W，
A048D，A048E，T078F，T078W，N087S，S272M，N038D，N038E，N038T，K251A，K251C，K251F，
K251M，K251N，K251R，K251S，K251T，K251V，G166D，G166EG166H，G166N，G053D，G053E，K237N，A215D，A215E，K012G，V072T，S156D，S156N，N256D，N256E，F262E，G106E，T133D，N161D，
N161E，R170L，A108C，S114T，G118E，G118Q，G118S，G118T，A138E，N140D，V149G，V149L，
I150A，S159D，S159E，S159N，T209V，T242E，S173D，P009A，P009T，K235D，和K235E
[0442] 最有益于ADW稳定性的突变列表
[0443] A001G，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，Q002S，Q002W，T003G，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，009G，P009H，P009I，P009M，P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，G025A，G025H，V026N，K027P，K027R，
K027S，K027T，A029S，I030V，T033E，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，
A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，N043H，N043K，N043LN043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050Q，
F050R，F50S，V051I，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，H067P，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，
N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078LT078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，
L096E，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，S101T，G102F，G102YT103D，T103E，T103G，T103S，G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，
S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，
M119Q，V121A，V121G，L126G，L126I，L126K，G128NS129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，
N144H，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，
V149N，V149P，V149Q，V149S，I150N，I150V，A151H，A152P，A152V，S156A，S156H，S156K，
S156M，S156N，S156Q，S158V，S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，
S181A，S181H，S181N，S182A，S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，
S194P，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222LA224S，A228S，I234V，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，
P239G，P239H，P239K，P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，
N243G，V244F，Q245A，Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，
N256E，N256K，N256P，N256Q，N256R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，
V267Y，E271W，S272F，S272K，S272N，S272Q，和Q275E
K027S，K027T，A029S，I030V，T033E，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，
A040L，A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，N043H，N043K，N043LN043M，N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050Q，
F050R，F50S，V051I，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，Q059I，H067A，H067G，H067P，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，
N076S，N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078LT078R，T078S，T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，
L096E，L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，S101T，G102F，G102YT103D，T103E，T103G，T103S，G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，
S116F，S116M，N117S，N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，
M119Q，V121A，V121G，L126G，L126I，L126K，G128NS129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，T133F，T133L，T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，
N144H，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，
V149N，V149P，V149Q，V149S，I150N，I150V，A151H，A152P，A152V，S156A，S156H，S156K，
S156M，S156N，S156Q，S158V，S159D，S159E，S159N，S159Q，N161M，N161R，M165V，G166A，
G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，
S181A，S181H，S181N，S182A，S182E，S182M，S182R，T185M，T185Q，T185R，A187W，S188H，
S194P，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，S216F，S216I，S216T，F217R，M222LA224S，A228S，I234V，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，
P239G，P239H，P239K，P239N，P239R，P239S，P239W，S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，
N243G，V244F，Q245A，Q245N，Q245S，Q245T，I246N，L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，
N256E，N256K，N256P，N256Q，N256R，N256W，K265S，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，
V267Y，E271W，S272F，S272K，S272N，S272Q，和Q275E
[0444] 最有益于ADW性能的突变列表
[0445] A001G，A001H，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，Q002S，Q002W，Q002Y，T003E，T003G，T003H，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，P009I，P009M，
P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，K012G，K012R，K015H，K015V，K015Y，A018F，A018N，
A018Q，A018R，A018T，A019K，A019LA019M，A019R，A019W，G020N，T022D，T022E，T022S，S024H，S024I，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，V026S，K027D，K027E，K027G，K027L，K027M，
K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，V028E，V028T，A029S，A029T，I030A，I030E，I030V，
L031Q，L031T，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，
A040T，A040V，A040W，A040Y，N043A，N043D，N043E，N043F，N043G，N043H，N043I，N043K，
N043LN043M，N043Q，N043S，N043W，N043Y，K045，K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，G046N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048K，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050K，
F050Q，F050R，F050S，F050Y，S052D，S052H，S052L，S052M，S052N，S052Q，S052R，S052T，
S052V，G053A，G053D，G053E，G053N，G053Q，G053R，P055K，P055N，P055R，A057P，L058D，
Q059I，G061E，G061M，G061Y，N062K，N062L，N062P，N062W，H067A，H067G，A069G，V072A，
V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075Q，L075R，L075W，N076D，N076Q，N076S，N076Y，
N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078I，T078K，T078L，T078R，T078S，
T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，G080Y，V081M，G083S，A085S，Y086P，N087H，N087S，
D089F，L090E，L090N，L090P，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，Y091T，Y091V，Y091W，V093T，
L096I，L096N，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097N，A098F，A098H，A098K，A098M，
A098N，A098Q，A098S，A098T，S099I，S099K，S099L，S099V，G100A，G100E，S101A，S101M，
S101R，S101T，S101V，G102E，T103D，T103E，T103H，T103K，T103N，T103R，T103S，G106E，
G106N，G106S，G106T，G106V，I107Q，I107T，I107V，A108C，A108I，Q109K，I111V，W113F，
W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117G，N117K，N117S，N117T，N117Y，G118D，
G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119A，M119F，M119H，M119I，M119L，
M119Q，M119S，M119T，N120E，V121A，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123Q，G128N，
S129A，S129D，S129G，S129H，S129Q，S129T，S130E，S130F，S130H，S130L，S130N，S130Q，
S130T，S130V，G131A，G131D，G131H，G131P，G131R，G131S，S132A，T133A，T133D，T133F，
T133L，T133M，T133N，T133Q，T133V，Q136D，Q136F，Q136H，Q136R，Q136W，Q137E，Q137H，
Q137T，A138E，A138S，N140D，N140Q，N140Y，N141T，Y143E，N144H，N144M，N144V，N144W，
N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147M，I147S，V148G，V148S，V149A，V149E，
V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150A，I150N，I150S，I150T，I150V，A151H，
A152V，A153G，A153S，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158D，S158M，S158T，S158V，
S159D，S159E，S159K，S159M，S159N，S159Q，S159Y，G160F，N161D，N161E，N161K，N161M，
N161R，N161S，N163D，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，
G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，R170K，R170L，S172H，I175Q，I175S，S181A，S181H，
S181K，S181N，S181Q，S182A，S182D，S182E，S182H，S182I，S182M，S182R，S182Y，N183E，
T185M，T185Q，T185R，A187D，A187G，A187H，A187P，A187Q，A187V，A187W，S188H，S188Y，
S194F，S194K，S194P，S194R，L206Y，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，A215D，A215E，
S216A，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，K235D，K235E，A236C，
A236D，A236E，A236F，A236G，A236N，A236Q，A236S，K237A，K237G，K237N，K237Q，K237R，
Y238F，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，P239G，P239H，P239I，P239K，P239L，P239M，
P239N，P239R，P239S，P239T，P239V，P239W，S240F，S240I，S240M，S240P，S240Q，S240V，
S240W，M241I，M241Q，M241S，M241W，T242A，T242E，T242I，T242K，T242P，T242Q，T242S，
T242V，N243G，V244F，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245S，Q245T，Q245W，Q245Y，I246A，
I246N，I246V，E248D，E248H，E248K，E248M，E248Y，L250I，L250M，K251F，K251R，N252E，
N252F，T255D，T255I，N256D，N256E，N256K，N256M，N256P，N256Q，N256R，N256W，F262E，
K265D，K265S，V267A，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271A，E271F，E271H，
E271K，E271W，E271Y，S272F，S272K，S272N，S272Q，Q275E，Q275G，Q275N，和Q275R
P009Q，P009R，P009S，P009T，P009V，K012G，K012R，K015H，K015V，K015Y，A018F，A018N，
A018Q，A018R，A018T，A019K，A019LA019M，A019R，A019W，G020N，T022D，T022E，T022S，S024H，S024I，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，V026S，K027D，K027E，K027G，K027L，K027M，
K027P，K027Q，K027R，K027S，K027T，V028E，V028T，A029S，A029T，I030A，I030E，I030V，
L031Q，L031T，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，A040N，A040R，
A040T，A040V，A040W，A040Y，N043A，N043D，N043E，N043F，N043G，N043H，N043I，N043K，
N043LN043M，N043Q，N043S，N043W，N043Y，K045，K045E，K045F，K045L，K045Q，K045R，K045S，K045W，G046N，A048D，A048E，A048G，A048H，A048K，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050K，
F050Q，F050R，F050S，F050Y，S052D，S052H，S052L，S052M，S052N，S052Q，S052R，S052T，
S052V，G053A，G053D，G053E，G053N，G053Q，G053R，P055K，P055N，P055R，A057P，L058D，
Q059I，G061E，G061M，G061Y，N062K，N062L，N062P，N062W，H067A，H067G，A069G，V072A，
V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075Q，L075R，L075W，N076D，N076Q，N076S，N076Y，
N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078I，T078K，T078L，T078R，T078S，
T078V，T079K，T079L，T079Q，G080M，G080Y，V081M，G083S，A085S，Y086P，N087H，N087S，
D089F，L090E，L090N，L090P，Y091H，Y091I，Y091M，Y091N，Y091T，Y091V，Y091W，V093T，
L096I，L096N，S097G，S097H，S097I，S097L，S097M，S097N，A098F，A098H，A098K，A098M，
A098N，A098Q，A098S，A098T，S099I，S099K，S099L，S099V，G100A，G100E，S101A，S101M，
S101R，S101T，S101V，G102E，T103D，T103E，T103H，T103K，T103N，T103R，T103S，G106E，
G106N，G106S，G106T，G106V，I107Q，I107T，I107V，A108C，A108I，Q109K，I111V，W113F，
W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117G，N117K，N117S，N117T，N117Y，G118D，
G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119A，M119F，M119H，M119I，M119L，
M119Q，M119S，M119T，N120E，V121A，N123A，N123D，N123E，N123G，N123H，N123Q，G128N，
S129A，S129D，S129G，S129H，S129Q，S129T，S130E，S130F，S130H，S130L，S130N，S130Q，
S130T，S130V，G131A，G131D，G131H，G131P，G131R，G131S，S132A，T133A，T133D，T133F，
T133L，T133M，T133N，T133Q，T133V，Q136D，Q136F，Q136H，Q136R，Q136W，Q137E，Q137H，
Q137T，A138E，A138S，N140D，N140Q，N140Y，N141T，Y143E，N144H，N144M，N144V，N144W，
N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，I147H，I147M，I147S，V148G，V148S，V149A，V149E，
V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150A，I150N，I150S，I150T，I150V，A151H，
A152V，A153G，A153S，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158D，S158M，S158T，S158V，
S159D，S159E，S159K，S159M，S159N，S159Q，S159Y，G160F，N161D，N161E，N161K，N161M，
N161R，N161S，N163D，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，
G166N，G166Q，G166S，G166T，G166Y，R170K，R170L，S172H，I175Q，I175S，S181A，S181H，
S181K，S181N，S181Q，S182A，S182D，S182E，S182H，S182I，S182M，S182R，S182Y，N183E，
T185M，T185Q，T185R，A187D，A187G，A187H，A187P，A187Q，A187V，A187W，S188H，S188Y，
S194F，S194K，S194P，S194R，L206Y，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，A215D，A215E，
S216A，S216F，S216I，S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，K235D，K235E，A236C，
A236D，A236E，A236F，A236G，A236N，A236Q，A236S，K237A，K237G，K237N，K237Q，K237R，
Y238F，P239A，P239C，P239D，P239E，P239F，P239G，P239H，P239I，P239K，P239L，P239M，
P239N，P239R，P239S，P239T，P239V，P239W，S240F，S240I，S240M，S240P，S240Q，S240V，
S240W，M241I，M241Q，M241S，M241W，T242A，T242E，T242I，T242K，T242P，T242Q，T242S，
T242V，N243G，V244F，Q245A，Q245F，Q245M，Q245N，Q245S，Q245T，Q245W，Q245Y，I246A，
I246N，I246V，E248D，E248H，E248K，E248M，E248Y，L250I，L250M，K251F，K251R，N252E，
N252F，T255D，T255I，N256D，N256E，N256K，N256M，N256P，N256Q，N256R，N256W，F262E，
K265D，K265S，V267A，V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271A，E271F，E271H，
E271K，E271W，E271Y，S272F，S272K，S272N，S272Q，Q275E，Q275G，Q275N，和Q275R
[0446] 最有益于ADW稳定性+ADW性能的突变列表
[0447] A001G，A001K，A001R，Q002F，Q002K，Q002P，Q002R，Q002S，Q002W，T003G，T003I，T003V，T003Y，G007N，P009A，P009G，P009H，P009I，P009M，P009Q，P009R，P009S，P009T，
P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，K027P，K027R，
K027S，K027T，A029S，I030V，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，
A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，N043H，N043K，N043L，N043M，
N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050Q，
F050R，F050S，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，
Q059I，H067A，H067G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，N076S，
N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，
T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，
L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，S101T，T103D，T103E，T103S，
G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117S，
N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119Q，V121A，G128N，
S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，T133F，T133L，
T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，
I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150N，I150V，
A151H，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158V，S159D，S159E，S159N，S159Q，
N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，
G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，S182E，S182M，S182R，T185M，
T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，S216F，S216I，
S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，
K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，P239N，P239R，P239S，P239W，
S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，Q245N，Q245S，Q245T，I246N，
L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，N256Q，N256R，N256W，K265S，
V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，S272K，S272N，S272Q，和Q275E
P009V，A018N，A019M，T022E，S024H，S024R，S024T，S024V，G025A，V026N，K027P，K027R，
K027S，K027T，A029S，I030V，N038A，N038Q，N038T，A040D，A040E，A040H，A040K，A040L，
A040N，A040R，A040T，A040V，N043A，N043D，N043E，N043F，N043H，N043K，N043L，N043M，
N043S，K045D，K045Q，K045R，K045S，A048E，A048H，A048N，A048Q，A048W，F050A，F050Q，
F050R，F050S，S052D，S052M，S052N，S052Q，G053D，G053E，G053N，G053Q，P055N，A057P，
Q059I，H067A，H067G，V072A，V072G，V072T，A073G，L075F，L075G，L075R，N076Q，N076S，
N077T，T078A，T078D，T078E，T078F，T078G，T078H，T078K，T078L，T078R，T078S，T078V，
T079K，T079L，T079Q，G080M，V081M，Y086P，N087H，D089F，L090P，Y091I，Y091M，Y091V，
L096N，S097N，A098N，A098Q，A098S，G100A，G100E，S101M，S101T，T103D，T103E，T103S，
G106E，G106N，G106T，I107Q，I107V，W113H，S114G，S114T，S116E，S116F，S116M，N117S，
N117T，G118D，G118E，G118H，G118Q，G118R，G118S，G118T，G118Y，M119Q，V121A，G128N，
S129D，S130E，S130H，S130N，S130Q，S130T，S130V，G131H，T133A，T133D，T133F，T133L，
T133V，Q136H，Q137E，Q137T，A138S，N140D，N144H，N144Y，R145W，G146N，G146R，I147A，
I147H，I147S，V149A，V149E，V149G，V149L，V149N，V149P，V149Q，V149S，I150N，I150V，
A151H，A152V，S156A，S156H，S156K，S156M，S156N，S158V，S159D，S159E，S159N，S159Q，
N161M，N161R，M165V，G166A，G166D，G166E，G166F，G166H，G166I，G166L，G166M，G166N，
G166Q，G166S，G166T，G166Y，S181A，S181H，S181N，S182A，S182E，S182M，S182R，T185M，
T185Q，T185R，A187W，S188H，S194P，T209F，T209V，T209W，T209Y，N213K，S216F，S216I，
S216T，F217R，M222L，A224S，A228S，I234V，A236C，A236D，A236E，A236N，A236Q，A236S，
K237A，Y238F，P239A，P239E，P239F，P239G，P239H，P239K，P239N，P239R，P239S，P239W，
S240F，S240M，S240P，M241W，T242S，N243G，V244F，Q245A，Q245N，Q245S，Q245T，I246N，
L250I，L250M，K251R，N252E，T255I，N256E，N256K，N256P，N256Q，N256R，N256W，K265S，
V267F，V267K，V267N，V267S，V267T，V267Y，E271W，S272F，S272K，S272N，S272Q，和Q275E
[0448]
[0449]
[0450] 实施例4
[0451] LG12sprC蛋白酶与相关分子的比较
[0452] 识别同源蛋白酶
[0453] 对NCBI非冗余蛋白质数据库和GenomeQuest专利数据库执行BLAST搜索(Altschul等人，Nucleic Acids Res，25:3389-402，1997)，识别同源物，其中将搜索参数设为默认值，
并使用LG12sprC蛋白酶的成熟蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO:3)作为查询序列。在这两组
检索中，百分比同一性(PID)被定义为在成对比对中相同残基的数量除以比对的残基的数
量。表中标示为“序列长度”的值对应所列登录号涉及的蛋白质的长度(以氨基酸个数计)，
而“比对长度”是指用于比对和计算PID的序列长度。表5提供了来自NCBI非冗余蛋白质数据
库的与LG12sprC具有百分比同一性的序列列表，表6提供了来自GenomeQuest专利数据库的
序列列表。
并使用LG12sprC蛋白酶的成熟蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO:3)作为查询序列。在这两组
检索中，百分比同一性(PID)被定义为在成对比对中相同残基的数量除以比对的残基的数
量。表中标示为“序列长度”的值对应所列登录号涉及的蛋白质的长度(以氨基酸个数计)，
而“比对长度”是指用于比对和计算PID的序列长度。表5提供了来自NCBI非冗余蛋白质数据
库的与LG12sprC具有百分比同一性的序列列表，表6提供了来自GenomeQuest专利数据库的
序列列表。
[0454]
[0455]
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461] 实施例5
[0462] LG12sprC与芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)蛋白酶的功能比较
[0463] 已发现芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(登录号WP_010192403.1，原ZP_07707657.1)与LG12sprC具有92％的同一性(实施例4，表5)。为比较其与LG12sprC蛋白酶的
特性，按照实施例2中描述的克隆LG12sprC步骤，生成了编码这种蛋白质的合成基因(SEQ
ID NO：5)，并将其克隆到pHYT载体中。简言之，制备了与这种蛋白质的前成熟序列对应的合
成DNA，其两侧连接NheI-HindIII位点，这导致该合成DNA融合至pHYT载体中已有的AprE信
号序列。
特性，按照实施例2中描述的克隆LG12sprC步骤，生成了编码这种蛋白质的合成基因(SEQ
ID NO：5)，并将其克隆到pHYT载体中。简言之，制备了与这种蛋白质的前成熟序列对应的合
成DNA，其两侧连接NheI-HindIII位点，这导致该合成DNA融合至pHYT载体中已有的AprE信
号序列。
[0464] SEQ ID NO：5示出了编码芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)蛋白的前体的核苷酸序列；使用该核苷酸序列，利用NheI-HindIII位点，把基因克隆到pHYT载体中。
[0465]GCTAGCGCAGCAGCTTCTGGTCCGAGTGCTAATGCCAAGAAAGAGTACTTAGTGGGATTTGCTAAAGGAAACAAAGC
GAATGCTCAGTCTTCCAAAAATTTAATTACAGCTGCTGGTGGCGATATTCAACATACATTCCAGTACATGGATGTAG
TGGAAGTGAGCTTGCCTGAAAAAGCGGCTGAAGCATTAGCGAAAAATCCTAACATTGCATTTGTAGAGGTAAACGCA
GAAGTTCAAGCTACTGCACAAACAGTTCCTTGGGGAATTCCTCACATTAAAGCAGACAAAGCGCACGCTTCAGGTGT
AACAGGAAGTGGAGTGAAAGTTGCGGTCCTTGATACAGGAATTGATGCAAACCATGCGGATTTGAATGTTAAAGGTG
GAGCAAGCTTTGTTTCTGGTGAACCAAATGCCCTTCAAGATGGAAACGGGCACGGAACACACGTAGCAGGAACGGTT
GCTGCATTGAATAATACGACAGGAGTGCTTGGTGTAGCTTATAATGCGGATCTTTATGCAGTTAAAGTTCTTAGTGC
TTCCGGAAGCGGTACATTAAGTGGAATCGCACAAGGAATTGAGTGGTCCATTGCTAATGATATGGACGTTATCAATA
TGAGCCTTGGTGGTAGTACCGGTTCCACAGCACTTCAGCAAGCTTGTGACAATGCATATGCAAGTGGAATTGTAGTG
GTTGCAGCTGCTGGAAACTCCGGTTCTAAAGGTAAGAGAAACACAATGGGTTACCCTGCTAGATACAGTTCTGTAAT
TGCAGTTGGTGCGGTCGACAGCAGTAACAACCGTGCATCTTTCTCAAGTGTTGGAAGTGAGCTTGAAGTAATGGCTC
CAGGTGTAAGTATCCTTAGCACGACTCCTGGAAACAACTACTCTTCCTTCAATGGTACGTCTATGGCTTCTCCACAT
GTTGCAGGAGCAGCTGCATTAATCAAAGCAAAATATCCTAGCATGACGAATGTACAAATTCGTGAAAAACTAAAAAA
TACTGCCACTAACCTTGGCGATGCGTTCTATTATGGACATGGTGTAATTAACGTTGAAAGTGCTTTGCAATAAAAGC
TT
GAATGCTCAGTCTTCCAAAAATTTAATTACAGCTGCTGGTGGCGATATTCAACATACATTCCAGTACATGGATGTAG
TGGAAGTGAGCTTGCCTGAAAAAGCGGCTGAAGCATTAGCGAAAAATCCTAACATTGCATTTGTAGAGGTAAACGCA
GAAGTTCAAGCTACTGCACAAACAGTTCCTTGGGGAATTCCTCACATTAAAGCAGACAAAGCGCACGCTTCAGGTGT
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GAGCAAGCTTTGTTTCTGGTGAACCAAATGCCCTTCAAGATGGAAACGGGCACGGAACACACGTAGCAGGAACGGTT
GCTGCATTGAATAATACGACAGGAGTGCTTGGTGTAGCTTATAATGCGGATCTTTATGCAGTTAAAGTTCTTAGTGC
TTCCGGAAGCGGTACATTAAGTGGAATCGCACAAGGAATTGAGTGGTCCATTGCTAATGATATGGACGTTATCAATA
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GTTGCAGCTGCTGGAAACTCCGGTTCTAAAGGTAAGAGAAACACAATGGGTTACCCTGCTAGATACAGTTCTGTAAT
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CAGGTGTAAGTATCCTTAGCACGACTCCTGGAAACAACTACTCTTCCTTCAATGGTACGTCTATGGCTTCTCCACAT
GTTGCAGGAGCAGCTGCATTAATCAAAGCAAAATATCCTAGCATGACGAATGTACAAATTCGTGAAAAACTAAAAAA
TACTGCCACTAACCTTGGCGATGCGTTCTATTATGGACATGGTGTAATTAACGTTGAAAGTGCTTTGCAATAAAAGC
TT
[0466] SEQ ID NO：6示出了全长芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)蛋白的氨基酸序列(383个氨基酸)，该序列由pHYT质粒中的基因序列SEQ ID NO：5表达。
[0467] MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSASA
[0468] 后续转化到枯草芽孢杆菌细胞中以及分离蛋白质的步骤也按实施例2中所述操作。利用多种测定法，并排检测了成熟芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)蛋白(SEQ ID
NO：7)的澄清上清液样品和LG12sprC野生型蛋白质样品。用到的方法在实施例1中描述过。
NO：7)的澄清上清液样品和LG12sprC野生型蛋白质样品。用到的方法在实施例1中描述过。
[0469] SEQ ID NO：7示出了成熟芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)蛋白的氨基酸序列(275个氨基酸)
[0470]AQTVPWGIPHIKADKAHASGVTGSGVKVAVLDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANDMDVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYASGIVVVAAAG
NSGSKGKRNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGSELEVMAPGVSILSTTPGNNYSSFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIREKLKNTATNLGDAFYYGHGVINVESALQ
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANDMDVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYASGIVVVAAAG
NSGSKGKRNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGSELEVMAPGVSILSTTPGNNYSSFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIREKLKNTATNLGDAFYYGHGVINVESALQ
[0471] 执行MTP测定，测量使用OMO或Kirkland HDL洗涤剂在BMI样布上的洗衣清洁活性、使用GSM(pH 9)或Sun all in One洗涤剂在蛋样布上的ADW清洁性能、在OMO HDL或LAS/
EDTA中的蛋白质稳定性，以及对AAPF-pNA的蛋白酶活性，测试结果汇总于表7中。在测试的
系统中，芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(登录号WP_010192403.1，原登录号ZP_
07707657.1)与LG12sprC蛋白酶显示极其相似的性质。
EDTA中的蛋白质稳定性，以及对AAPF-pNA的蛋白酶活性，测试结果汇总于表7中。在测试的
系统中，芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(登录号WP_010192403.1，原登录号ZP_
07707657.1)与LG12sprC蛋白酶显示极其相似的性质。
[0472] 表7芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)与LG12sprC蛋白酶在各种测定中比较
[0473]
[0474] 实施例6
[0475] 发现并鉴定丝氨酸蛋白酶Bhon03321
[0476] 选择堀越氏芽孢杆菌菌株DSM 8719(得自Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，作为可用于工业应用的酶的
潜在来源。为了鉴定由DSM 8719产生的酶与编码这些酶的基因，使用 边合成边测
序(SBS)技术对DSM 8719的整个基因组进行测序。BaseClear(Leiden，The Netherlands)执
行基因组测序和序列数据组装。BioXpr(Namur，Belgium)标注并解释重叠群。以这种方式在
菌株DSM 8719中鉴定出多种基因，其中一种基因编码的蛋白质与各种其它细菌的丝氨酸蛋
白酶具有同源性。该基因是Bhon03321.n，其序列以SEQ ID NO：8示出。
潜在来源。为了鉴定由DSM 8719产生的酶与编码这些酶的基因，使用 边合成边测
序(SBS)技术对DSM 8719的整个基因组进行测序。BaseClear(Leiden，The Netherlands)执
行基因组测序和序列数据组装。BioXpr(Namur，Belgium)标注并解释重叠群。以这种方式在
菌株DSM 8719中鉴定出多种基因，其中一种基因编码的蛋白质与各种其它细菌的丝氨酸蛋
白酶具有同源性。该基因是Bhon03321.n，其序列以SEQ ID NO：8示出。
[0477] SEQ ID NO：8示出了Bhon03321基因的核苷酸序列。
[0478]TTGAAGAAGTGGATGAAGAGTTTTTCAGTTATACTTATTGCAATATTGGCTTTCTCGTTAGCTTTTGGAACTGCTCA
GGCAGAGTCTTCTAATCCGAATGCTAGTGTAAAGAAAGAATACTTAATTGGGTTTGCAAAAGGAAACAAGGCAAGTG
CACAGACCTCCCAAAATCTGGTTACAGCAGCAGGGGGAGAAGTTCAACACACATTCCAATACATGGATGTAGTGGAA
GTTTCGTTACCTGAAAAAGCTGCAGAAGCATTGAAGAAGAATCCTAACATAGCATTCGTAGAGGAAAACGTAGAGGT
TATGGCGACTGCCCAAACAGTACCTTGGGGCATCCCGCATATCAAAGCAGACAAAGCACATGCTGCCGGTGTGACAG
GAAGCGGAGTGAAAGTGGCAATCCTTGATACAGGGATCGACGCCAATCATGCAGACTTAAATGTAAGAGGCGGAGCA
AGTTTTGTGGCAGGTGAGCCGAATGCCCTTCAAGATGGAAATGGACACGGAACTCACGTGGCCGGTACGGTTGCCGC
ATTGAATAATTCAACTGGCGTTCTAGGGGTCGCTTACAACGCAGACCTTTATGCGGTAAAAGTTCTTAGCGCTTCAG
GTAGTGGGACTTTAAGTGGCATCGCACAAGGTATTGAATGGTCCATTGCAAATGGAATGGATGTAATCAATATGAGT
CTTGGTGGAAGCTCTGGGTCTACTGCACTCCAACAAGCTTGTAATAATGCCTACAATAGAGGCATTGTTGTAATTGC
TGCTGCTGGGAATTCCGGCTCTTCAGGAAATCGCAACACTATCGGGTACCCTGCAAGATATAGTTCAGTAATCGCAG
TGGGAGCAGTGGATTCCAATAACAACCGCGCTTCTTTCTCCAGTGTTGGAAATGAGCTGGAAGTAATGGCGCCGGGT
GCTAATATCTTGAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCATCCTTCAACGGAACGTCCATGGCAGCTCCACATGTTGC
AGGAGCAGCAGCATTGATAAAAGCAAAATATCCTAGCATGACAAATGTCCAAATTCGTGATCGTTTAAGAAATACGG
CTACAAACCTTGGTGATCCTTTCTTTTATGGAAACGGAGTAATCAATGTAGAAAGTGCTTTACAA
GGCAGAGTCTTCTAATCCGAATGCTAGTGTAAAGAAAGAATACTTAATTGGGTTTGCAAAAGGAAACAAGGCAAGTG
CACAGACCTCCCAAAATCTGGTTACAGCAGCAGGGGGAGAAGTTCAACACACATTCCAATACATGGATGTAGTGGAA
GTTTCGTTACCTGAAAAAGCTGCAGAAGCATTGAAGAAGAATCCTAACATAGCATTCGTAGAGGAAAACGTAGAGGT
TATGGCGACTGCCCAAACAGTACCTTGGGGCATCCCGCATATCAAAGCAGACAAAGCACATGCTGCCGGTGTGACAG
GAAGCGGAGTGAAAGTGGCAATCCTTGATACAGGGATCGACGCCAATCATGCAGACTTAAATGTAAGAGGCGGAGCA
AGTTTTGTGGCAGGTGAGCCGAATGCCCTTCAAGATGGAAATGGACACGGAACTCACGTGGCCGGTACGGTTGCCGC
ATTGAATAATTCAACTGGCGTTCTAGGGGTCGCTTACAACGCAGACCTTTATGCGGTAAAAGTTCTTAGCGCTTCAG
GTAGTGGGACTTTAAGTGGCATCGCACAAGGTATTGAATGGTCCATTGCAAATGGAATGGATGTAATCAATATGAGT
CTTGGTGGAAGCTCTGGGTCTACTGCACTCCAACAAGCTTGTAATAATGCCTACAATAGAGGCATTGTTGTAATTGC
TGCTGCTGGGAATTCCGGCTCTTCAGGAAATCGCAACACTATCGGGTACCCTGCAAGATATAGTTCAGTAATCGCAG
TGGGAGCAGTGGATTCCAATAACAACCGCGCTTCTTTCTCCAGTGTTGGAAATGAGCTGGAAGTAATGGCGCCGGGT
GCTAATATCTTGAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCATCCTTCAACGGAACGTCCATGGCAGCTCCACATGTTGC
AGGAGCAGCAGCATTGATAAAAGCAAAATATCCTAGCATGACAAATGTCCAAATTCGTGATCGTTTAAGAAATACGG
CTACAAACCTTGGTGATCCTTTCTTTTATGGAAACGGAGTAATCAATGTAGAAAGTGCTTTACAA
[0479] Bhon03321.n基因编码的前原酶以SEQ ID NO：9示出。第1位处的甲硫氨酸由Bhon03321.n基因的ttg起始密码子编码。用SignalP-NN预测(Emanuelsson等人，Nature
Protocols(2007)2：953-971)，这种蛋白质在N端有长度27个氨基酸的信号肽。该信号肽序
列在SEQ ID NO：9中用黑体加下划线表示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性
酶。这种酶与其它丝氨酸蛋白酶类似，也有前序列，预测该前序列为79个氨基酸(在SEQ ID
NO：9中用斜体表示)。这种预测是以同源丝氨酸蛋白酶(如BPN’)中的前-成熟接合点为基础
作出的(Wells等人，Nucleic Acids Res.(1983)11：7911-25)。预测的完全加工成熟链的序
列(Bhon03321，275个氨基酸)以SEQ ID NO：10示出。SEQ ID NO：9示出了丝氨酸蛋白酶前体
Bhon03321的氨基酸序列。
Protocols(2007)2：953-971)，这种蛋白质在N端有长度27个氨基酸的信号肽。该信号肽序
列在SEQ ID NO：9中用黑体加下划线表示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性
酶。这种酶与其它丝氨酸蛋白酶类似，也有前序列，预测该前序列为79个氨基酸(在SEQ ID
NO：9中用斜体表示)。这种预测是以同源丝氨酸蛋白酶(如BPN’)中的前-成熟接合点为基础
作出的(Wells等人，Nucleic Acids Res.(1983)11：7911-25)。预测的完全加工成熟链的序
列(Bhon03321，275个氨基酸)以SEQ ID NO：10示出。SEQ ID NO：9示出了丝氨酸蛋白酶前体
Bhon03321的氨基酸序列。
[0480]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVRGGASFVAGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSSGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGNELEVMAPGANILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGNGVINVESALQ
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSSGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGNELEVMAPGANILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGNGVINVESALQ
[0481] SEQ ID NO：10示出了成熟Bhon03321蛋白酶的氨基酸序列(275个氨基酸)
[0482]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVRGGASFVAGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSSGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGNELEVMAPGANILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGNGVINVESALQ
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSSGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGNELEVMAPGANILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGNGVINVESALQ
[0483] 实施例7
[0484] 发现并鉴定另外的堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶
[0485] 还选择了堀越氏芽孢杆菌DSM 9711、堀越氏芽孢杆菌DSM 9712和堀越氏芽孢杆菌DSM 6951，作为LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶和可用于工业应用的其它酶的潜在来源。这些
菌株得自Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH。为了鉴定由这些菌株产生的酶与编码这些酶的基因，使用
边合成边测序(SBS)技术对所有这三种堀越氏芽孢杆菌菌株的基因组进行测序。BaseClear
(Leiden，The Netherlands)执行基因组测序、序列数据组装，和重叠群的标注解释。以这种
方式在堀越氏芽孢杆菌DSM 9711菌株中鉴定出多种基因，其中一种基因编码的蛋白质属于
LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶。该基因是DSM9711_sprC，其序列以SEQ ID NO：11示出。
菌株得自Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH。为了鉴定由这些菌株产生的酶与编码这些酶的基因，使用
边合成边测序(SBS)技术对所有这三种堀越氏芽孢杆菌菌株的基因组进行测序。BaseClear
(Leiden，The Netherlands)执行基因组测序、序列数据组装，和重叠群的标注解释。以这种
方式在堀越氏芽孢杆菌DSM 9711菌株中鉴定出多种基因，其中一种基因编码的蛋白质属于
LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶。该基因是DSM9711_sprC，其序列以SEQ ID NO：11示出。
[0486] SEQ ID NO：11示出了DSM9711_sprC基因的核苷酸序列：
[0487]TTGAAGAAGTGGATGAAAGGTTTTTCGGTCATACTTATTGCAATATTGGCTTTCTCGTTAGCATTTGGTACTGCGCA
GGCAGAATCGTCCAGTCCCAATGCTAGTGCAAAGAAAGAATACTTAGTTGGCTTTACAAAAGGAAATAAGGCAAGTG
CACAATCTTCTAAAAACTTGATTGCCGCAGCAGGTGGGGAAGTACAGCACACGTTCCAATACATGGATGTTGTGGAA
GTGTCTTTACCTGAAAAAGCGGTAGATGCATTGAAGAAAAATCCTAACATCGCTTTTGTAGAAGAAAACGCAGAAGT
TCAAGCAACTGCACAAACTGTGCCATGGGGTATCCCTCATATCAAGGCTGACAAAGCGCATGCCTCTGGTGTGACAG
GAAGCGGTGTCAAAGTCGCGATCCTAGATACAGGAATTGACGCAAACCATACTGATCTTAATGTAAAAGGCGGAGCG
AGCTTTGTTTCAGGTGAGCCAAATGCCCTTCAAGATGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCAGGAACAGTTGCTGC
GTTAAATAATTCTACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTTTATGCGGTGAAAGTACTTAGTGCTTCAG
GTAGTGGAACATTAAGTGGAATCGCACAAGGGATTGAGTGGTCCATTGCAAATGGAATGAACGTCATCAATATGAGT
TTAGGAGGCAGCACTGGATCAACTGCATTGCAACAAGCTTGTGATAATGCTTATGCAAGAGGTATTGTCGTCATTGC
GGCAGCTGGAAACTCTGGTTCTAGAGGGAAGCAAAACACAATGGGTTATCCTGCAAGATACAGCTCCGTCATCGCAG
TAGGAGCGGTAGATTCCAGTAACAACCGTGCTTCTTTCTCCAGTGTAGGAAACGAATTGGAAGTAATGGCACCGGGT
GTTAACATTTTAAGCACAACTCCTGGTAACAACTATGCATCCTTCAATGGAACGTCCATGGCGTCTCCACACGTTGC
TGGAGCTGCTGCATTAATCAAAGCGAAGTATCCAAGCATGACAAATGTTCAAATCCGTGACCGTCTGAAAAATACGG
CTACAAACTTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGTAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
GGCAGAATCGTCCAGTCCCAATGCTAGTGCAAAGAAAGAATACTTAGTTGGCTTTACAAAAGGAAATAAGGCAAGTG
CACAATCTTCTAAAAACTTGATTGCCGCAGCAGGTGGGGAAGTACAGCACACGTTCCAATACATGGATGTTGTGGAA
GTGTCTTTACCTGAAAAAGCGGTAGATGCATTGAAGAAAAATCCTAACATCGCTTTTGTAGAAGAAAACGCAGAAGT
TCAAGCAACTGCACAAACTGTGCCATGGGGTATCCCTCATATCAAGGCTGACAAAGCGCATGCCTCTGGTGTGACAG
GAAGCGGTGTCAAAGTCGCGATCCTAGATACAGGAATTGACGCAAACCATACTGATCTTAATGTAAAAGGCGGAGCG
AGCTTTGTTTCAGGTGAGCCAAATGCCCTTCAAGATGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCAGGAACAGTTGCTGC
GTTAAATAATTCTACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTTTATGCGGTGAAAGTACTTAGTGCTTCAG
GTAGTGGAACATTAAGTGGAATCGCACAAGGGATTGAGTGGTCCATTGCAAATGGAATGAACGTCATCAATATGAGT
TTAGGAGGCAGCACTGGATCAACTGCATTGCAACAAGCTTGTGATAATGCTTATGCAAGAGGTATTGTCGTCATTGC
GGCAGCTGGAAACTCTGGTTCTAGAGGGAAGCAAAACACAATGGGTTATCCTGCAAGATACAGCTCCGTCATCGCAG
TAGGAGCGGTAGATTCCAGTAACAACCGTGCTTCTTTCTCCAGTGTAGGAAACGAATTGGAAGTAATGGCACCGGGT
GTTAACATTTTAAGCACAACTCCTGGTAACAACTATGCATCCTTCAATGGAACGTCCATGGCGTCTCCACACGTTGC
TGGAGCTGCTGCATTAATCAAAGCGAAGTATCCAAGCATGACAAATGTTCAAATCCGTGACCGTCTGAAAAATACGG
CTACAAACTTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGTAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
[0488] DSM9711_sprC基因编码的前原酶以SEQ ID NO：12示出。用SignalP-NN预测(Emanuelsson等人，Nature Protocols(2007)2：953-971)，这种蛋白质在N端有27个氨基酸
的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO：12中用黑体加下划线表示。存在信号肽表明，这种丝
氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为79个氨基酸(在SEQ ID NO：12中
用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM9711_SprC，275个氨基酸)以SEQ ID NO：
13示出。
的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO：12中用黑体加下划线表示。存在信号肽表明，这种丝
氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为79个氨基酸(在SEQ ID NO：12中
用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM9711_SprC，275个氨基酸)以SEQ ID NO：
13示出。
[0489] SEQ ID NO：12示出了DSM9711_SprC丝氨酸蛋白酶前体的氨基酸序列：
[0490]AQTVPWGIPHIKADKAHASGVTGSGVKVAILDTGIDANHTDLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMNVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYARGIVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMNVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYARGIVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
[0491] SEQ ID NO：13示出了成熟蛋白酶DSM9711_SprC的氨基酸序列(275个氨基酸)：
[0492]AQTVPWGIPHIKADKAHASGVTGSGVKVAILDTGIDANHTDLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMNVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYARGIVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
STGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMNVINMSLGGSTGSTALQQACDNAYARGIVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRDRLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
[0493] 在堀越氏芽孢杆菌DSM 9712中鉴定出了另一种编码LGl2-进化枝枯草杆菌蛋白酶的基因。该基因是DSM9712_sprC，其序列以SEQ ID NO：14示出。
[0494] SEQ ID NO：14示出了DSM9712_sprC基因的核苷酸序列：
[0495]TTGAAGAAGTGGATGAAAGGTTTTTCGGTCATACTTATAGCAATATTGGCTTTCTCATTAGCCTTCGGAACTGGAAC
TGCCCAGGCGGAATCTTCAGGACCGAGTGCTGGTGCAAAGAAAGAGTACTTAATTGGATTTACGAAAGGAAATAAAG
CAAGCGCACAATCCTCCCAAAATCTAGTCACTGCTGCAGGTGGCGATATTCAATACACATTCCAATACATGGATGTA
GTGGAAGTAACTTTACCTGAAAAAGCTGCTGAGGCATTAAAGAAGAACCCTAACATTGCATTTGTAGAGGAAAACGT
AGAAATGATGGCGACTGCACAGACAGTACCATGGGGTATTCCGCACATCAAAGCAGATAAGGCACATGCCGCTGGTG
TAACTGGAAGTGGTGTGAAGGTAGCGATCCTTGACACAGGAATTGACGCTAACCATGCCGACCTTAATGTAAAAGGT
GGAGCAAGCTTTGTTTCTGGTGAACCAAATGCCCTACAAGATGGCAATGGCCATGGAACACATGTAGCGGGAACGGT
TGCTGCGTTAAATAACACAACTGGTGTGCTTGGAGTGGCTTACAATGCGGATCTTTATGCAGTTAAAGTCCTTAACG
CATCTGGTAGTGGGACGTTAAGTGGCATTGCCCAAGGAATTGAGTGGTCCATTGCAAATGGAATGGATGTAATCAAT
ATGAGCCTTGGTGGCAGCACTGGATCAACTGCATTACAACAAGCTAGTAATAATGCTTACAATAGAGGCATTGTCGT
CATTGCAGCTGCCGGAAATTCAGGTTCTTTAGGCAATCGGAATACAATTGGGTATCCTGCCAGATATAGTTCTGTTA
TCGCGGTAGGAGCGGTTGACTCCAACAACAACCGTGCTTCCTTCTCTAGTGTAGGAAGTGAATTGGAAGTAATGGCA
CCTGGTGTAAATATTCTGAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCTTCTTTCAATGGTACATCTATGGCAGCTCCACA
TGTTGCAGGAGCAGCAGCATTAATCAAGGCGAAATACCCGAATATGACAAACGTCCAAATTCGTGATCGCCTGAGAA
ATACAGCTACAAACCTTGGTGATCCATTCTTCTATGGAAGAGGAGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
TGCCCAGGCGGAATCTTCAGGACCGAGTGCTGGTGCAAAGAAAGAGTACTTAATTGGATTTACGAAAGGAAATAAAG
CAAGCGCACAATCCTCCCAAAATCTAGTCACTGCTGCAGGTGGCGATATTCAATACACATTCCAATACATGGATGTA
GTGGAAGTAACTTTACCTGAAAAAGCTGCTGAGGCATTAAAGAAGAACCCTAACATTGCATTTGTAGAGGAAAACGT
AGAAATGATGGCGACTGCACAGACAGTACCATGGGGTATTCCGCACATCAAAGCAGATAAGGCACATGCCGCTGGTG
TAACTGGAAGTGGTGTGAAGGTAGCGATCCTTGACACAGGAATTGACGCTAACCATGCCGACCTTAATGTAAAAGGT
GGAGCAAGCTTTGTTTCTGGTGAACCAAATGCCCTACAAGATGGCAATGGCCATGGAACACATGTAGCGGGAACGGT
TGCTGCGTTAAATAACACAACTGGTGTGCTTGGAGTGGCTTACAATGCGGATCTTTATGCAGTTAAAGTCCTTAACG
CATCTGGTAGTGGGACGTTAAGTGGCATTGCCCAAGGAATTGAGTGGTCCATTGCAAATGGAATGGATGTAATCAAT
ATGAGCCTTGGTGGCAGCACTGGATCAACTGCATTACAACAAGCTAGTAATAATGCTTACAATAGAGGCATTGTCGT
CATTGCAGCTGCCGGAAATTCAGGTTCTTTAGGCAATCGGAATACAATTGGGTATCCTGCCAGATATAGTTCTGTTA
TCGCGGTAGGAGCGGTTGACTCCAACAACAACCGTGCTTCCTTCTCTAGTGTAGGAAGTGAATTGGAAGTAATGGCA
CCTGGTGTAAATATTCTGAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCTTCTTTCAATGGTACATCTATGGCAGCTCCACA
TGTTGCAGGAGCAGCAGCATTAATCAAGGCGAAATACCCGAATATGACAAACGTCCAAATTCGTGATCGCCTGAGAA
ATACAGCTACAAACCTTGGTGATCCATTCTTCTATGGAAGAGGAGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
[0496] DSM9712_sprC基因编码的前原酶以SEQ ID NO：15示出。用SignalP-NN预测，这种蛋白质在N端有29个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO：15中用黑体加下划线表
示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为79
个氨基酸(在SEQ ID NO：15中用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM9712_SprC，
275个氨基酸)以SEQ ID NO：16示出。
示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为79
个氨基酸(在SEQ ID NO：15中用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM9712_SprC，
275个氨基酸)以SEQ ID NO：16示出。
[0497] SEQ ID NO：15示出了DSM9712_SprC丝氨酸蛋白酶前体的氨基酸序列：
[0498]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLNASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSTGSTALQQASNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSLGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPNMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGRGVINVESALQ
TTGVLGVAYNADLYAVKVLNASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSTGSTALQQASNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSLGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPNMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGRGVINVESALQ
[0499] SEQ ID NO：16示出了成熟蛋白酶DSM9712_SprC的氨基酸序列(275个氨基酸)：
[0500]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLNASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSTGSTALQQASNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSLGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPNMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGRGVINVESALQ
TTGVLGVAYNADLYAVKVLNASGSGTLSGIAQGIEWSIANGMDVINMSLGGSTGSTALQQASNNAYNRGIVVIAAAG
NSGSLGNRNTIGYPARYSSVIAVGAVDSNNNRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAA
ALIKAKYPNMTNVQIRDRLRNTATNLGDPFFYGRGVINVESALQ
[0501] 在堀越氏芽孢杆菌DSM 6951中鉴定出了另一种编码LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的基因。这种基因是DSM6951_sprC，其序列以SEQ ID NO：17示出。
[0502] SEQ ID NO：17示出了DSM6951_sprC基因的核苷酸序列：
[0503]TTGAAAAAGTGGATGAAAGGTTTTTCGGTCATACTTATCGCAATATTGGCTTTCTCGTTAGCCTTCGGAACTGCTCA
GGCAGAAGCATCAAATCCGAATGCTAGTGCAAAGAAAGAATACTTAGTTGGATTTGCAAAAGGTAATAAAGCAAATG
CCCAGTCTTCTAAAAATTTGATTACCGCTGCTGGTGGGGACATACAACATACATTCCAGTACATGGATGTTGTGGAA
GTATCGTTGCCTGTAAAAGCTGCAGAAGCATTAATGAAGAATCCTAACATTGCTTTCGTTGAGGAAAACGTCGAAAT
GATGGCTACTGCTCAAACAGTTCCTTGGGGCATCCCTCATATCAAAGCTGACAAAGCGCATGCTGCTGGAGTGACTG
GAAGCGGTGTGAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCA
AGCTTTGTTTCTGGTGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGC
TTTGAATAACACAACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTATATGCAGTAAAAGTACTTAGTGCTTCAG
GTAGTGGAACATTAAGTGGCATTGCGCAAGGTATTGAGTGGTCCGTTGCTAACGGAATGGATGTCATCAATATGAGT
CTTGGTGGAAGCTCTGGATCTTCAGCTTTACAACAAGCTTGTGATAATGCTTATGCTAGAGGAGTTGTAGTAATTGC
CGCAGCTGGGAACTCTGGTTCAAGAGGAAAGCAAAACACAATGGGGTATCCTGCTAGATACAGTTCTGTTATCGCAG
TAGGAGCGGTGGATTCCAGTAACAACCGTGCCTCTTTCTCCAGTGTTGGGAATGAACTGGAAGTAATGGCTCCTGGA
GTGAATATTTTAAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCTTCTTTCAATGGTACGTCCATGGCATCTCCGCACGTTGC
AGGAGCTGCTGCATTAATCAAGGCGAAATACCCAAGCATGACAAATGTTCAAATTCGTGAACGTCTGAAAAATACGG
CTACAAATTTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
GGCAGAAGCATCAAATCCGAATGCTAGTGCAAAGAAAGAATACTTAGTTGGATTTGCAAAAGGTAATAAAGCAAATG
CCCAGTCTTCTAAAAATTTGATTACCGCTGCTGGTGGGGACATACAACATACATTCCAGTACATGGATGTTGTGGAA
GTATCGTTGCCTGTAAAAGCTGCAGAAGCATTAATGAAGAATCCTAACATTGCTTTCGTTGAGGAAAACGTCGAAAT
GATGGCTACTGCTCAAACAGTTCCTTGGGGCATCCCTCATATCAAAGCTGACAAAGCGCATGCTGCTGGAGTGACTG
GAAGCGGTGTGAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCA
AGCTTTGTTTCTGGTGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGC
TTTGAATAACACAACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTATATGCAGTAAAAGTACTTAGTGCTTCAG
GTAGTGGAACATTAAGTGGCATTGCGCAAGGTATTGAGTGGTCCGTTGCTAACGGAATGGATGTCATCAATATGAGT
CTTGGTGGAAGCTCTGGATCTTCAGCTTTACAACAAGCTTGTGATAATGCTTATGCTAGAGGAGTTGTAGTAATTGC
CGCAGCTGGGAACTCTGGTTCAAGAGGAAAGCAAAACACAATGGGGTATCCTGCTAGATACAGTTCTGTTATCGCAG
TAGGAGCGGTGGATTCCAGTAACAACCGTGCCTCTTTCTCCAGTGTTGGGAATGAACTGGAAGTAATGGCTCCTGGA
GTGAATATTTTAAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCTTCTTTCAATGGTACGTCCATGGCATCTCCGCACGTTGC
AGGAGCTGCTGCATTAATCAAGGCGAAATACCCAAGCATGACAAATGTTCAAATTCGTGAACGTCTGAAAAATACGG
CTACAAATTTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAATAA
[0504] DSM6951_sprC基因编码的前原酶以SEQ ID NO：18示出。用SignalP-NN预测，这种蛋白质在N端有长27个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO：18中用黑体加下划线
表示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为
79个氨基酸(在SEQ ID NO：18中用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM6951_
SprC，275个氨基酸)以SEQ ID NO：19示出。
表示。存在信号肽表明，这种丝氨酸蛋白酶为分泌性酶。这种酶有前序列，预测该前序列为
79个氨基酸(在SEQ ID NO：18中用斜体表示)。预测的完全加工成熟链的序列(DSM6951_
SprC，275个氨基酸)以SEQ ID NO：19示出。
[0505] SEQ ID NO：18示出了DSM6951_SprC丝氨酸蛋白酶前体的氨基酸序列：
[0506]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSVANGMDVINMSLGGSSGSSALQQACDNAYARGVVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSVANGMDVINMSLGGSSGSSALQQACDNAYARGVVVIAAAG
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ALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
[0507] SEQ ID NO：19示出了成熟蛋白酶DSM6951_SprC的氨基酸序列(275个氨基酸)：
[0508]AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
TTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSVANGMDVINMSLGGSSGSSALQQACDNAYARGVVVIAAAG
NSGSRGKQNTMGYPARYSSVIAVGAVDSSNNRASFSSVGNELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMASPHVAGAA
ALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
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ALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
[0509] SEQ ID NO：20示出了芽孢杆菌属KSM-LD1，SB(BAD21128)成熟蛋白酶的氨基酸序列(276个氨基酸)：
[0510]SQTVPYGVPHIKADVAHSQNVTGNGVKVAILDTGIDAAHEDLRVVGGASFVAGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNN
QVGVLGVAYDVDLYAVKVLGADGSGTLSGIAQGIEWSIANNMDVINMSLDDSTGSTTLKQAADNAYNSGLVVVAAAG
NSGDFFGLINTIGYPARYDSVIAVGAVDSNNRRASFSSVGSQLEVMAPGVNILSTLPGNSYGSLNGTSMASPHVAGA
AALLLAQDPTLTNVQVREILRDTATNLGSSFYYGNGVIDVEKALQ
QVGVLGVAYDVDLYAVKVLGADGSGTLSGIAQGIEWSIANNMDVINMSLDDSTGSTTLKQAADNAYNSGLVVVAAAG
NSGDFFGLINTIGYPARYDSVIAVGAVDSNNRRASFSSVGSQLEVMAPGVNILSTLPGNSYGSLNGTSMASPHVAGA
AALLLAQDPTLTNVQVREILRDTATNLGSSFYYGNGVIDVEKALQ
[0511] 实施例8
[0512] 堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的异源表达
[0513] 使用表达盒在枯草芽孢杆菌中产生Bhon03321、DSM9711、DSM9712和DSM6951蛋白酶，该表达盒由编码Bhon03321、DSM9711_SprC、DSM9712_SprC、DSM6951_SprC的前-成熟序
列的DNA序列组成，这些DNA序列前面是枯草芽孢杆菌aprE启动子和枯草芽孢杆菌aprE信号
肽序列，并以BPN’转录终止子序列结束。把四个不同的表达盒克隆进pHYT复制型穿梭载体，
然后将pHYT载体转化到适宜的枯草芽孢杆菌菌株中。通过如下方法由pHY300PLK(Takara)
产生pHYT载体：利用BstEII和EcoRI位点，在四环素抗性基因后添加终止子(终止子序列SEQ
ID NO：21，GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGG
CGTTTTTTATGCATCGATGGAATTC)。还使用克隆在BamHI和HindIII位点中的接头(新接头序列
SEQ ID NO：22，GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)，去掉了pHY300PLK中的HindIII位点。
列的DNA序列组成，这些DNA序列前面是枯草芽孢杆菌aprE启动子和枯草芽孢杆菌aprE信号
肽序列，并以BPN’转录终止子序列结束。把四个不同的表达盒克隆进pHYT复制型穿梭载体，
然后将pHYT载体转化到适宜的枯草芽孢杆菌菌株中。通过如下方法由pHY300PLK(Takara)
产生pHYT载体：利用BstEII和EcoRI位点，在四环素抗性基因后添加终止子(终止子序列SEQ
ID NO：21，GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGG
CGTTTTTTATGCATCGATGGAATTC)。还使用克隆在BamHI和HindIII位点中的接头(新接头序列
SEQ ID NO：22，GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)，去掉了pHY300PLK中的HindIII位点。
[0514] 包含Bhon03321基因的pHY载T体(pHYT-Bhon03321)的图谱如图3所示。DSM9711_SprC、DSM9712_SprC和DSM6951_SprC的表达质粒(未示出)相似，只有编码相应蛋白酶的前-
成熟部分的序列不同。
成熟部分的序列不同。
[0515] 为了生产Bhon03321、DSM9711、DSM9712和DSM6951蛋白酶，我们将包含pHYT-Bhon03321、pHYT-DSM9711_SprC、pHYT-DSM9712_SprC或DSM6951_SprC的枯草芽孢杆菌转化
株分别接种于半限定富集培养基中培养，这种培养基以MOP缓冲液为基础，主要氮源为尿
素，主要碳源为葡萄糖，还补充了1％的大豆胨以促进细胞生长。向培养基中补充25ppm的四
环素。在温育后(32℃下两天)，在所有四种菌株的生长培养基中检测到了蛋白酶。在离心和
过滤后，使用含Bhon03321、DSM9711、DSM9712和DSM6951蛋白酶的培养上清液用于分析和纯
化。
株分别接种于半限定富集培养基中培养，这种培养基以MOP缓冲液为基础，主要氮源为尿
素，主要碳源为葡萄糖，还补充了1％的大豆胨以促进细胞生长。向培养基中补充25ppm的四
环素。在温育后(32℃下两天)，在所有四种菌株的生长培养基中检测到了蛋白酶。在离心和
过滤后，使用含Bhon03321、DSM9711、DSM9712和DSM6951蛋白酶的培养上清液用于分析和纯
化。
[0516] 实施例9
[0517] 堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的清洁性能
[0518] 我们测试了堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶Bhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)和DSM9712_SprC(DSM_9712)在洗衣类应用中对BMI(染污血渍/奶
渍/油墨的棉布)微样布(EMPA-116，Center for Testmaterials，The Netherlands)的清洁
性能，以及在清洗盘碟类应用中对蛋黄(老化并经炭黑染料上色的聚丙烯酸织物上的蛋黄)
微样布(PAS-38，Center for Testmaterials，The Netherlands)的清洁性能。
渍/油墨的棉布)微样布(EMPA-116，Center for Testmaterials，The Netherlands)的清洁
性能，以及在清洗盘碟类应用中对蛋黄(老化并经炭黑染料上色的聚丙烯酸织物上的蛋黄)
微样布(PAS-38，Center for Testmaterials，The Netherlands)的清洁性能。
[0519] 在40℃执行自动盘碟洗涤(ADW)清洁测定(GSM-B 9和GSM-B 10.5)，时长30分钟。温育之后，将100μL上清液转移到新鲜MTP(Costar 9017)中，对于PAS-38样布，使用
SpectraMax读板机读取在405nm处的吸光度。扣除仅含缓冲液的对照的吸光度，并将由此得
到的405nm的OD值作为蛋白酶浓度的函数作图。用Sigmoidal拟合法拟合数据。
SpectraMax读板机读取在405nm处的吸光度。扣除仅含缓冲液的对照的吸光度，并将由此得
到的405nm的OD值作为蛋白酶浓度的函数作图。用Sigmoidal拟合法拟合数据。
[0520] 采用市售的HDL(OMO Klein&Krachtig,Unilever)或HDD(OMO Color，Unilever)洗涤剂配方，在25℃执行洗衣清洁测定，时长15分钟。温育之后，将100μL上清液转移到新鲜
MTP(Costar 9017)中，对于BMI样布(染污血渍、奶渍和油墨，Center for Testmaterials，
The Netherlands)，使用SpectraMax读板机读取在405nm处的吸光度。扣除仅含缓冲液的对
照的吸光度，并将由此得到的405nm的OD值作为蛋白酶浓度的函数作图。在使用HDL洗涤剂
的测定中，每个孔中放置两片样布；在使用HDD洗涤剂的测定中，每个孔中只放置一片微样
布。用朗格缪尔方程拟合数据。图4至图7示出了LG12进化枝蛋白酶Bhon03321、DSM6951_
SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)和DSM9712_SprC(DSM_9712)的清洁性能。
MTP(Costar 9017)中，对于BMI样布(染污血渍、奶渍和油墨，Center for Testmaterials，
The Netherlands)，使用SpectraMax读板机读取在405nm处的吸光度。扣除仅含缓冲液的对
照的吸光度，并将由此得到的405nm的OD值作为蛋白酶浓度的函数作图。在使用HDL洗涤剂
的测定中，每个孔中放置两片样布；在使用HDD洗涤剂的测定中，每个孔中只放置一片微样
布。用朗格缪尔方程拟合数据。图4至图7示出了LG12进化枝蛋白酶Bhon03321、DSM6951_
SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)和DSM9712_SprC(DSM_9712)的清洁性能。
[0521] 实施例10
[0522] LG12与同源物的稳定性
[0523] 将Bhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)、DSM9712_SprC(DSM_9712)和LG12SprC蛋白酶置于40℃至80℃温度范围，在50mM Tris(pH9)和2mM
CaCl2中，通过测量在升高的温度下温育后残留的活性，检测了这些蛋白酶的稳定性。将稀
释的酶样品混入胁迫因子中，并测量非胁迫蛋白酶活性。在升高的温度下温育胁迫因子中
的稀释样品，并在温育后测量胁迫蛋白酶活性。对于非胁迫条件，立即用DMC方法(下文将描
述该方法)测定酶的活性。对于胁迫条件，将PCR板密封，用Eppendorf384热循环仪在升高的
温度下温育5分钟，然后测定活性。采用DMC方法测量了胁迫活性和非胁迫活性。
CaCl2中，通过测量在升高的温度下温育后残留的活性，检测了这些蛋白酶的稳定性。将稀
释的酶样品混入胁迫因子中，并测量非胁迫蛋白酶活性。在升高的温度下温育胁迫因子中
的稀释样品，并在温育后测量胁迫蛋白酶活性。对于非胁迫条件，立即用DMC方法(下文将描
述该方法)测定酶的活性。对于胁迫条件，将PCR板密封，用Eppendorf384热循环仪在升高的
温度下温育5分钟，然后测定活性。采用DMC方法测量了胁迫活性和非胁迫活性。
[0524] DMC测定使用的试剂溶液为：溶于100mM碳酸钠(pH 9.5)的2.5％二甲基酪蛋白(DMC,Sigma)溶液，溶于100mM碳酸钠(pH 9.5)的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，
Thermo Scientific)溶液。稀释溶液为：10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80、
0.02％叠氮化钠。向MTP(Greiner PS-384微孔)的每孔中添加5μL 20ppm的蛋白酶上清液，
再加入27.5μL DMC底物。然后在缓缓混合的情况下添加27.5μL TNBSA溶液。在室温下使用
动力学模式采用SpectraMax读板机在405nm处历经5分钟测定活性，活性用mOD/min表示。
Thermo Scientific)溶液。稀释溶液为：10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80、
0.02％叠氮化钠。向MTP(Greiner PS-384微孔)的每孔中添加5μL 20ppm的蛋白酶上清液，
再加入27.5μL DMC底物。然后在缓缓混合的情况下添加27.5μL TNBSA溶液。在室温下使用
动力学模式采用SpectraMax读板机在405nm处历经5分钟测定活性，活性用mOD/min表示。
[0525] 扣除仅含缓冲液的对照的吸光度，并将由此得到的405nm处的OD值作为蛋白酶浓度的函数作图。在可能的情况下，将数据拟合成四参数逻辑函数(y＝a+b/(1+(x/c)^d))。计
算使LG12、Bhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)和DSM9712_
SprC(DSM_9712)蛋白酶保留50％活性的温度，结果示于表8中。
算使LG12、Bhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)和DSM9712_
SprC(DSM_9712)蛋白酶保留50％活性的温度，结果示于表8中。
[0526]
[0527] 实施例11
[0528] 成熟LG12-进化枝与其它枯草杆菌蛋白酶的系统发育树
[0529] 使用邻接法(NJ)(Saitou,N.；and Nei,M.(1987).The neighbor-joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.Mol Biol Evol 4,406-425)构
建系统发育树，该系统发育树包含NCBI搜索鉴定出的一系列成熟序列的子集(示于实施例4
表5中)、以及下列新发现的堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶：Bhon03321(SEQ ID NO:10)、
DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID NO:19)。NJ法在待
分析的所有序列对之间的距离矩阵上工作。这些距离与序列两两之间的趋异度有关。采用
以下参数计算发育树的结构：Kimura校正序列距离，忽略带空位的位置。使用MEGA6程序显
示系统发育树，如图8所示。Bhon03321、DSM_9711、DSM_9712和DSM_6951的序列出现在组成
LG12-进化枝的十种蛋白酶的簇中。迄今已鉴定出的LG12-进化枝成员为：LG12sprC(SEQ ID
NO:3)、DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID NO:19)、
Bhon03321(SEQ ID NO:10)、Bac sp WP_010192403.1、Bac sp LG12SprD AAC43581、Bac sp
WP_010192405.1以及Bac sp BAD21128。
建系统发育树，该系统发育树包含NCBI搜索鉴定出的一系列成熟序列的子集(示于实施例4
表5中)、以及下列新发现的堀越氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶：Bhon03321(SEQ ID NO:10)、
DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID NO:19)。NJ法在待
分析的所有序列对之间的距离矩阵上工作。这些距离与序列两两之间的趋异度有关。采用
以下参数计算发育树的结构：Kimura校正序列距离，忽略带空位的位置。使用MEGA6程序显
示系统发育树，如图8所示。Bhon03321、DSM_9711、DSM_9712和DSM_6951的序列出现在组成
LG12-进化枝的十种蛋白酶的簇中。迄今已鉴定出的LG12-进化枝成员为：LG12sprC(SEQ ID
NO:3)、DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID NO:19)、
Bhon03321(SEQ ID NO:10)、Bac sp WP_010192403.1、Bac sp LG12SprD AAC43581、Bac sp
WP_010192405.1以及Bac sp BAD21128。
[0530] 实施例12
[0531] 比对同源序列
[0532] 对鉴定在LG12-进化枝中的下列成熟枯草杆菌蛋白酶序列的氨基酸序列进行了相互比对，并与更为远源的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(P29600)进行了比对：LG12sprC
(SEQ ID NO:3)、DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID
NO:19)、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、Bac sp BAD11988、Bac sp WP_010192403.1、Bac sp
LG12SprD AAC43581、Bac sp WP_010192405.1、Bac sp BAD21128。使用默认参数的
CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research,22:4673-4680,1994)，在
LG12sprC的第1位至第275位残基的区域中，执行了蛋白质序列比对。这十一种蛋白酶的比
对在图9中示出。
(SEQ ID NO:3)、DSM_9711(SEQ ID NO:13)、DSM_9712(SEQ ID NO:16)、DSM_6951(SEQ ID
NO:19)、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、Bac sp BAD11988、Bac sp WP_010192403.1、Bac sp
LG12SprD AAC43581、Bac sp WP_010192405.1、Bac sp BAD21128。使用默认参数的
CLUSTALW软件(Thompson等人，Nucleic Acids Research,22:4673-4680,1994)，在
LG12sprC的第1位至第275位残基的区域中，执行了蛋白质序列比对。这十一种蛋白酶的比
对在图9中示出。
[0533] 实施例13
[0534] 鉴定LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶共有的独特序列
[0535] LG12sprC蛋白酶与其它枯草杆菌蛋白酶的基于结构的序列比对在图10中示出。将迟缓芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶(pdb代码1JEA)、解淀粉芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶(pdb代码
2ST1.A)和地衣芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶(pdb代码3UNX.A)的成熟蛋白质序列与下列酶的序
列比对：LG12sprC(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)及其同源物：芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白
酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SA
(BAD11988.2)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E
(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、DSM_9711、DSM_
9712、DSM_6951和LG12sprD(AAC43581.1)。
2ST1.A)和地衣芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶(pdb代码3UNX.A)的成熟蛋白质序列与下列酶的序
列比对：LG12sprC(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)及其同源物：芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白
酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SA
(BAD11988.2)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E
(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、Bhon03321(SEQ ID NO:10)、DSM_9711、DSM_
9712、DSM_6951和LG12sprD(AAC43581.1)。
[0536] 图10示出了三个加下划线的区域，这些区域中LG12sprC蛋白酶及其同源物的序列与其它洗涤剂蛋白酶的序列存在差异。第一个区域为LG12sprC蛋白酶及其同源物的第55位
至第58位处出现的P、N或D、A和L，该区域替代了其它洗涤剂蛋白酶(例如Carlsberg、BPN’、
迟缓芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶)中存在的高度异源区域。
至第58位处出现的P、N或D、A和L，该区域替代了其它洗涤剂蛋白酶(例如Carlsberg、BPN’、
迟缓芽孢杆菌洗涤剂蛋白酶)中存在的高度异源区域。
[0537] 所有LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶共有的另一个区域为LG12sprC蛋白酶及其同源物的第86位处出现的Y，以及随后第87位处出现的N或D，该区域替代了其它商品洗涤剂蛋白
酶中存在的P和S序列。最后一个区域为LG12sprC蛋白酶及其同源物的第103位和第104位处
出现的T和L，该区域替代了商品洗涤剂蛋白酶中存在的Q/S与Y/V。
酶中存在的P和S序列。最后一个区域为LG12sprC蛋白酶及其同源物的第103位和第104位处
出现的T和L，该区域替代了商品洗涤剂蛋白酶中存在的Q/S与Y/V。
[0538] 以地衣芽孢杆菌Carlsberg(pdb代码3UNX.A)的结构为基础制备LG12sprC蛋白酶的同源模型，所述结构与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌
(B.licheniformis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)的枯草杆菌蛋白酶结构具有最高的序列同
一性。LG12sprC蛋白酶同源模型中Tyr86和Asn87附近的结构示于图11中。Tyr86的侧链形成
与His17连接的氢键，Asn87的侧链处于与Thr22形成氢键的位置。我们从图10的比对结果中
发现了一个有趣的现象，即所有LG12样序列中His17，连同前一位Ala16，都是保守的；而且
所有LG12sprC样序列中Thr22连同前一位Val21也都是保守的。这些氢键有助于稳定环结
构，并预期这些氢键是所有LG12sprC蛋白酶样酶共有的结构基序。在其它已知的枯草杆菌
蛋白酶结构中，在与LG12sprC蛋白酶及其同源物的第86位同源的位置发现Pro，其可能充当
稳定分子中的这一区域的另一可选方式。
(B.licheniformis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)的枯草杆菌蛋白酶结构具有最高的序列同
一性。LG12sprC蛋白酶同源模型中Tyr86和Asn87附近的结构示于图11中。Tyr86的侧链形成
与His17连接的氢键，Asn87的侧链处于与Thr22形成氢键的位置。我们从图10的比对结果中
发现了一个有趣的现象，即所有LG12样序列中His17，连同前一位Ala16，都是保守的；而且
所有LG12sprC样序列中Thr22连同前一位Val21也都是保守的。这些氢键有助于稳定环结
构，并预期这些氢键是所有LG12sprC蛋白酶样酶共有的结构基序。在其它已知的枯草杆菌
蛋白酶结构中，在与LG12sprC蛋白酶及其同源物的第86位同源的位置发现Pro，其可能充当
稳定分子中的这一区域的另一可选方式。
[0539] 在LG12sprC蛋白酶及其同源物中鉴定到的另一个共有序列基序是保守的Thr103和Leu104。如图12所示，这些残基构成底物结合裂隙的一部分。由Ser221、His64和Asp32构
成的催化三联体连同残基Thr103和Leu104以棍形图示出。预期在底物结合裂隙中发现的这
种残基组合对LG12sprC蛋白酶和LG12进化枝蛋白酶的底物特异性有贡献。
成的催化三联体连同残基Thr103和Leu104以棍形图示出。预期在底物结合裂隙中发现的这
种残基组合对LG12sprC蛋白酶和LG12进化枝蛋白酶的底物特异性有贡献。
[0540] 在275个残基的成熟序列中，LG12-进化枝野生型酶共有的独特序列基序包括：Thr103、Leu104、和Tyr86、Asp/Asn87。此外，LG12进化枝蛋白酶在C-端显示特征基序，该特
征基序从第267位开始：V,I,N/D,V/L,E,X,A,L,Q，其中X表示任意氨基酸。从V267至Q275的
这些序列(V,I,N/D,V/L,E,X,A,L,Q)独特地存在于LG12进化枝枯草杆菌蛋白酶中。
征基序从第267位开始：V,I,N/D,V/L,E,X,A,L,Q，其中X表示任意氨基酸。从V267至Q275的
这些序列(V,I,N/D,V/L,E,X,A,L,Q)独特地存在于LG12进化枝枯草杆菌蛋白酶中。
[0541] 已在LG12-进化枝枯草杆菌蛋白酶的所有成员[LG12sprC(SEQ ID NO:3,AAC43580.1)及其同源物：芽孢杆菌属m3-13枯草杆菌蛋白酶E(1)(SEQ ID NO:7，WP_
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、Bhon03321(SEQ ID
NO:10)、DSM_9711、DSM_9712、DSM_6951和LG12sprD(AAC43581.1)]中,鉴定了特征序列基
序。这些序列基序组成如下：Pro55-Asp/Asn56-Ala57-Leu58，Tyr86-Asp/Asn87，Thr103-
Leu104。在LG12-SprC的结构中观察到，第55位至第58位的残基赋予了环中的独特构型。第
86位至第88位残基看起来在该整个三维结构中填充了空间，而第103位至第104位残基靠近
活性位点，可能会影响该进化枝中枯草杆菌蛋白酶的底物结合特性。
010192403.1，之前为ZP_07707657.1)、芽孢杆菌属KSM-LD1,SB(BAD21128.1)、芽孢杆菌属
m3-13枯草杆菌蛋白酶E(2)(WP_10192405.1，之前为ZP_07707658.1)、Bhon03321(SEQ ID
NO:10)、DSM_9711、DSM_9712、DSM_6951和LG12sprD(AAC43581.1)]中,鉴定了特征序列基
序。这些序列基序组成如下：Pro55-Asp/Asn56-Ala57-Leu58，Tyr86-Asp/Asn87，Thr103-
Leu104。在LG12-SprC的结构中观察到，第55位至第58位的残基赋予了环中的独特构型。第
86位至第88位残基看起来在该整个三维结构中填充了空间，而第103位至第104位残基靠近
活性位点，可能会影响该进化枝中枯草杆菌蛋白酶的底物结合特性。
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