多转基因重组腺病毒
专利汇可以提供多转基因重组腺病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含两个(或更多个) 治疗 性转基因例如CD80和CD137L的重组腺病毒。所述转基因优选被插入到E1b-19K插入位点和/或E3插入位点中。，下面是多转基因重组腺病毒专利的具体信息内容。
1.一种重组腺病毒，其包含：
(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间；和
(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。
3.如权利要求1或2所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。
5.如权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸的缺失。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的202个核苷酸的缺失。
7.如权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的203个核苷酸的缺失。
8.如权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917位核苷酸的缺失。
9.如权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1916位核苷酸的缺失。
10.如权利要求1-9任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间。
11.如权利要求1-9任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1916位的核苷酸之间。
12.如权利要求1-11任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。
13.如权利要求1-12任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
14.如权利要求1-13任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含约500至约
3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约
1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约
1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约
2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
15.如权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。
16.如权利要求1-15任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。
17.如权利要求1-16任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约
1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。
18.如权利要求1-17任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。
19.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。
20.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。
21.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。
22.如权利要求1-21任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。
23.如权利要求1-22任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。
24.如权利要求1-23任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间。
25.如权利要求1-24任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。
26.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约
1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。
27.如权利要求26所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。
28.如权利要求26或27所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。
29.如权利要求26-28任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。
30.如权利要求26-29任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。
31.如权利要求26-30任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间。
32.如权利要求26-31任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。
33.一种重组腺病毒，其包含：
(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中；和(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，
其中所述E1b-19k插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
34.如权利要求33所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。
35.如权利要求33或34所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。
36.如权利要求33-35任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约
100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。
37.如权利要求33-36任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸的缺失。
38.如权利要求33-37任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的202个核苷酸的缺失。
39.如权利要求33-37任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的203个核苷酸的缺失。
40.如权利要求33-39任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917位核苷酸的缺失。
41.如权利要求33-39任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1916位核苷酸的缺失。
42.如权利要求33-41任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间。
43.如权利要求33至31任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1916位的核苷酸之间。
44.如权利要求33-43任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。
45.如权利要求33-44任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
46.如权利要求33-45任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述第二核苷酸序列和第三核苷酸序列被第二内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
47.如权利要求46所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。
48.如权利要求46或47所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
49.如权利要求33-48任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含E3缺失，其中所述E3缺失位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。
50.如权利要求49所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含约500至约3185、约500至约
3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约
1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约
2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
51.如权利要求49或50所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。
52.如权利要求49-51任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失位于E3-10.5K的终止位点和E3-14.7K的终止位点和Fiber的起始位点之间。
53.如权利要求49-52任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约
1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。
54.如权利要求49-53任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。
55.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。
56.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-
10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。
57.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。
58.如权利要求49-57任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。
59.如权利要求49-51任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约
1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。
60.如权利要求59所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。
61.如权利要求59或60所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。
62.如权利要求59-61任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。
63.如权利要求33-45任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。
64.如权利要求63所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约
3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约
3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约
2500、约2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
65.如权利要求63或64所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。
66.如权利要求63-65任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。
67.如权利要求63-66任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。
68.如权利要求63-67任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。
69.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。
70.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。
71.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。
72.如权利要求63-71任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。
73.如权利要求63-72任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。
74.如权利要求63-73任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间。
75.如权利要求63-74任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。
76.如权利要求63-65任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。
77.如权利要求76所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。
78.如权利要求76或77所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-
gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。
79.如权利要求76-78任一项所示的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。
80.如权利要求76-79任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。
81.如权利要求76-80任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间。
82.如权利要求76-81任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。
83.如权利要求33-82任一项所述的重组腺病毒，其中所述IRES选自脑心肌炎病毒
IRES、口蹄疫病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。
84.如权利要求1-83任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含E4缺失，其中所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与右侧末端反向重复序列(ITR)之间。
85.如权利要求84所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间。
86.如权利要求84或85所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约
1500、约1500至约2500、约1500至约2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。
87.如权利要求84-86任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约
250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、约1000至约1250或约1250至约1500个核苷酸的缺失。
88.如权利要求84-87任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失。
89.如权利要求84-88任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的1449个核苷酸的缺失。
90.如权利要求84-89任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。
91.如权利要求1-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因不可操作连接到外源启动子序列。
92.如权利要求46-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因不可操作连接到外源启动子序列。
93.如权利要求1-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因都不可操作连接到外源启动子序列。
94.如权利要求1-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约
1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约
5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约
5000个核苷酸。
95.如权利要求1-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约
3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约
5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约
6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约
6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约
5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000或约6000至约7000个核苷酸。
96.如权利要求46-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约
500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约
2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约
4000至约5000个核苷酸。
97.如权利要求46-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约
500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约
6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约
5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
98.如权利要求1-97任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约
2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。
99.如权利要求1-97任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约
1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约
2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约
3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000或、约6000至约7000个核苷酸。
100.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约5000个核苷酸。
101.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约
5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约
6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约
6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约
5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
102.如权利要求46-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约
2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约
2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约
4000、或约4000至约5000个核苷酸。
103.如权利要求46-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约
4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约
2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约
3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约
4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
104.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约
1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约
5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约
5000个核苷酸。
105.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约
3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约
5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约
6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约
6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约
5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
106.如权利要求1-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、或约5000个核苷酸。
107.如权利要求1-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。
108.如权利要求46-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、或约5000个核苷酸。
109.如权利要求46-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约
7000个核苷酸。
110.如权利要求1-109任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000或约5000个核苷酸。
111.如权利要求1-109任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。
112.如权利要求1-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。
113.如权利要求1-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。
114.如权利要求46-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。
115.如权利要求46-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。
116.如权利要求1-115任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。
117.如权利要求1-115任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。
118.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。
119.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。
120.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。
121.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
122.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-
24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
123.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-
1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-
1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
124.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
125.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
126.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
127.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因分别编码异二聚体细胞因子的第一和第二亚基。
128.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自CD80和CD137L。
129.如权利要求46-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因选自CD80、CD137L和ICAM-1。
130.如权利要求127或128所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码CD80。
131.如权利要求127-130任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码CD137L。
132.如权利要求128-131任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因编码ICAM-1。
133.如权利要求128-132任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列的核苷酸序列。
134.如权利要求128-133任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
135.如权利要求128-134任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的核苷酸序列。
136.如权利要求128-135任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。
137.如权利要求128-136任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列。
138.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：32编码的氨基酸序列的核苷酸序列。
139.如权利要求128-128任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：9的核苷酸序列。
140.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：31的核苷酸序列。
141.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：22的核苷酸序列。
142.如权利要求1-127任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-27A/p28和IL-27B/EBI3。
143.如权利要求142所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码IL-27A/p28。
144.如权利要求142或143所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码IL-
27B/EBI3。
145.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自内皮抑素和血管抑素。
146.如权利要求145所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码内皮抑素。
147.如权利要求145或146所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码血管抑素。
148.如权利要求145-147任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的氨基酸序列的核苷酸序列。
149.如权利要求145-148任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列的核苷酸序列。
150.如权利要求145-149任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
151.如权利要求1-150任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含Pea3结合位点或其功能性片段的缺失。
152.如权利要求151所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游约-300至约-250位的核苷酸的缺失。
153.如权利要求151或152所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游-305至-255位的核苷酸的缺失。
154.如权利要求151或152所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游-304至-255位的核苷酸的缺失。
155.一种重组腺病毒，其包含SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有80％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
156.如权利要求1-155任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中复制。
157.如权利要求1-156任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中表达所述第一和/或第二治疗性转基因。
158.如权利要求46-157任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中表达所述第一、第二和/或第三治疗性转基因。
159.如权利要求156-158任一项所述的重组腺病毒，其中所述过度增殖性细胞是癌细胞。
160.如权利要求1-159任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是溶瘤病毒。
161.一种药物组合物，其包含权利要求1-160任一项的重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。
162.一种在靶细胞中表达两个治疗性转基因的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以表达所述两个治疗性转基因。
163.一种在靶细胞中表达三个治疗性转基因的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求46-160任一项的重组腺病毒，以便表达所述三个治疗性转基因。
164.一种抑制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。
165.一种在需要的受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤的生长。
166.一种在需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、梅克尔细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺癌。
168.如权利要求165-167所述的方法，其中所述重组腺病毒与选自手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种或多种疗法相组合给药。
2 15
169.如权利要求162-168任一项所述的方法，其中所述重组腺病毒的有效量是10-10噬斑形成单位(pfu)。
170.如权利要求165-169任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
171.如权利要求170所述的方法，其中所述受试者是人类儿童。
172.如权利要求165-171任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答。
173.如权利要求165-172任一项所述的方法，其中所述重组病毒的有效量通过在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答来鉴定。
174.如权利要求172或173所述的方法，其中所述针对抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受试者并在所述注射位点处测量硬结的大小来测量。
多转基因重组腺病毒
技术领域
背景技术
准治疗的潜力的平台技术(Kumar，S.等，(2008)，CURRENT OPINION IN MOLECULAR
THERAPEUTICS 10(4)：371-379；Kim，D.，(2001)，EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY
1(3)：525-538；Kim D.(2000)ONCOGENE 19(56)：6660-6669)。已显示，这些病毒有希望作为不仅通过感染-繁殖-裂解的链式反应直接破坏恶性细胞，而且间接地诱导抗肿瘤免疫力的
溶瘤剂。这些免疫刺激性质，通过在每次病毒复制时复制并表达的治疗性转基因的插入而
被增强。
255载体实现这种肿瘤选择性的机制是通过用于转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)
结合位点的靶向缺失，所述转录因子是通过结合到特定DNA序列来调控病毒进入宿主细胞
后将会转录的最早基因E1a的腺病毒表达的蛋白质。
发明内容
并且所述病毒可以无视并入到病毒基因组中的转基因的大小，复制并高效表达所述两个或
更多个治疗性转基因。
列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始
位点之间。
点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或203个
核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间或对
应于所述Ad5基因组的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约
3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约
3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3
插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约
1000、约1000至约1551、约1000至约1500、或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例
如所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核苷酸的缺失。在某
些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方
式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ
ID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以
5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约
1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止
位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的
1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。在某些实
施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。
苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一
内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250、或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或
203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核
苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之
间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约
2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始
位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终
止位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500、或约1500至约
1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点
的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或
1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失
的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的
29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止
位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约
1500、或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述
E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-
gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。
一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。所述第三治疗性转基因也可被插入到E3缺失位点中，即在某些实施方式中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E3插
入位点中。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组的
29773和30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到
CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：
4)。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID
NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT
(SEQ ID NO：30)。
些实施方式中，所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约
2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述
E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约
1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失，例如所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。
3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有
所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约
7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约
6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约3100个核苷酸。
23A/p19、p40、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、和TGF-β阱的治疗性多肽。
23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
CD137L。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列。
22的核苷酸序列。
列，或者包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。
编码血管抑素。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：37或SEQ ID
NO：38编码的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
的核苷酸的缺失或对应于所述E1a的起始位点上游-305至-255或-304至-255位的核苷酸的
缺失。
98％或99％序列同一性的序列。
或更多个治疗性转基因。所述过度增殖性细胞可以是癌细胞例如肺癌细胞、结肠癌细胞和
胰腺癌细胞。在某些实施方式中，每个前述重组腺病毒可以是溶瘤腺病毒。
实施方式中，所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、梅克尔细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺癌。
者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受试者并在所述注射位点处测量硬结的尺寸
来测量。
基因。
附图说明
度2/2。
长度·宽度2/2。
每四天以每剂1x 109PFU的剂量给药，总共三剂。每条线表示单个小鼠的肿瘤体积，每个治疗组10只小鼠。
并且所述病毒可以无视并入到病毒基因组中的转基因的大小，复制并高效表达所述两个或
更多个治疗性转基因。
1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，
例如对应于SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间；和(b)编码第二治疗性转基因的第
二核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点(即
编码pVIII的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的27855-27857位核苷
酸)与Fiber的起始位点(即编码Fiber的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：
23的31042-31044位核苷酸)之间。在整个本描述和权利要求书中，两个位点之间的插入，例如(i)第一基因(例如E1b-19k)的起始位点与第二基因(例如E1b-55K)的起始位点、(ii)第
一基因的起始位点与第二基因的终止位点、(iii)第一基因的终止位点与第二基因的起始
位点或(iv)第一基因的终止位点与第二基因的终止位点之间的插入，被理解为意味着在所
述插入周围的构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸，可能存在或不存在于
最终病毒中。同样地，两个核苷酸之间的插入被理解为意味着所述插入周围的核苷酸可能
存在或不存在于最终病毒中。术语“转基因”是指外源基因或多核苷酸序列。术语“治疗性转基因”是指当在病毒中或被病毒复制和/或表达时，在靶细胞、体液、组织、器官、生理系统或受试者中提供治疗效果的转基因。
19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的
2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-
19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约
150、约150至约305、约150至约300、约150至约250、或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸
例如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714与1917位的
核苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714与1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。CTGACCTC(SEQ ID NO：1)和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)内的E1b-19K插入位点定义了独特的边界序列。在整个本描述和权
利要求书中，邻近位点的缺失，例如邻近基因的起始位点的缺失或邻近基因的终止位点的
缺失，被理解为意味着所述缺失可以包括构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核
苷酸的缺失或不包括所述核苷酸的缺失。
3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约
3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约
3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应
于SEQ ID NO：23的29770-29772位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止
密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至
约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个
核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核
苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺
失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的
29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773与30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。CAGTATGA(SEQ ID NO：3)和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)内的E3插入位点定义了独特的边界序列。
14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-
gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约
1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包
含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近
所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包
含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218与
30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。
TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：
23)的E3插入位点定义了独特的边界序列。
苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19k的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716
位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于
SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的
2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-
19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约
150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例
如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述
Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组的1714与1917位的核苷酸之
间或对应于所述Ad5基因组的1714与1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。
1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约
2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位于pVIII的终止位点(即编码pVIII的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的27855-27857位核苷酸)与Fiber的起始
位点(即编码Fiber的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的位核苷酸)之
间。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的29770-29772位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-
30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点
的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约
1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的
终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的
1063或1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5 dl309
E3缺失的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。
30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终
止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约
1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终
止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。
一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。所述第三治疗性转基因也可被插入到E3缺失位点中，即在某些实施方式中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E3插
入位点中。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29772与30837位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以
5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218与30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT
(SEQ ID NO：30)。
(ITR；例如对应于SEQ ID NO：23的35836-35938位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点(即编码E4-ORF1的起始密码子的核
苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的35524-35526位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失包含E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间的核苷酸序列的缺失。在某
些实施方式中，所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约
2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述
E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约
1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失，例如所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。
实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖性细胞中的表达为所述基因在所述过度增殖性细
胞中的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性细胞中不表现出治疗性转基因的可检测的表达。治疗性转基因的表达可以通过本领域中已知的任何适合方法例如Western印迹
或ELISA来确定。
二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转
基因的大小在组合时，包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约
2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约
2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约
4000、或约4000至约5000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约
500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约
5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。
小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约3100个核苷酸。
(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87：2264-2268；Altschul，(1993)
J.MOL.EVOL.36，290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25：3389-3402，通过参考并入本文)，被定制用于序列相似性检索。对于检索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS 6：119-129，其整体通过参考并入本文。本领域技术人员可以为用于测量对齐、包括在待比较的序列的整个长度上获得最大对齐所需的任何
算法，确定适合的参数。用于直方图、描述、比对、期望值(即报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和筛选程序的搜索参数，采用缺省设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)
PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89：10915-10919，其整体通过参考并入本文)。四种blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙扩展罚分)；wink＝1(在沿着查询的每个wink位置处产生词命中数)；和gapw＝16(设置在其中产生带间隙的比对的窗口宽度)。等效的Blastp参数设置可以是Q＝9，R＝2，wink＝1和gapw＝32。检索也可以使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，间隙开放罚分[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，间隙扩展罚分
[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[Integer]：
缺省值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[Integer]：缺省值＝1；-e，期望值[Real]：缺省值＝10；-W，词大小[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说
3；-y，以字节为单位的blast扩展的衰减(X)：缺省值＝对于blastn来说20/对于其他来说
7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：缺省值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和-Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。也可以将ClustalW用于成对蛋白质比对(缺省参数可以包括例如Blosum62矩阵和
间隙开放罚分＝10和间隙扩展罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的
Bestfit比较，使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙扩展罚分)，在蛋白质比较中的等同设置是GAP＝8和LEN＝2。
胞、T细胞的功能和/或抗体的生产。示例性的免疫调节性转基因包括检验点抑制剂。示例性的免疫调节性转基因可以包括例如PD-1或PD-L1或调节其活性的任何转基因。其他示例性
免疫调节性转基因可以包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。某些免疫调节性转基因可能包含
肽连接物例如长度为2至5000或更多个氨基酸的肽连接物，其可能是免疫原性的，即易受中和抗体攻击。设想了可以通过用非免疫原性序列代替所述免疫原性序列来降低这些连接物
的免疫原性。
的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒，优选地选自杆状病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、痘病毒或腺病毒。重组修饰的病毒在本文中被称为“重组病毒”。重组病毒可以通过重组DNA技术修饰成复制缺陷型、条件复制型或复制型，和/或通过重组DNA技术修饰成包含外源转基因的表达。利用每种母体载体性质的有利要素的嵌合病毒载体(参见例如Feng等，
(1997)NATURE BIOTECHNOLOGY 15：866-870)也可用于本发明的实践。尽管使用来自于待治疗物种的病毒通常是有利的，但在某些情况下，使用源自于具有有利致病特点的不同物种
的载体，可能是有利的。例如，在PCT公布号WO 98/27216中描述了将马疱疹病毒载体用于人类基因疗法。由于所述马病毒对人类不致病，因此所述载体被描述为可用于人类的治疗。同样地，绵羊腺病毒载体可用于人类基因疗法，因为它们据称避免了针对人类腺病毒载体的
抗体。这些载体描述在PCT公布号WO97/06826中。
35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型腺病毒。优选的是源自于人类2和5型腺病毒的重组病毒。除非另有陈述，否则所有5型腺病毒的核苷酸编号是相对于本文中描绘在SEQ ID NO：23中的NCBI参比序列AC_000008.1。
或染色体反式起作用。
录因子的亲和性。在某些实施方式中，所述其他的修饰的调控序列增强在肿瘤细胞中的表
达但减弱在正常细胞中的表达。
序列。在某些实施方式中，所述E1a基因被可操作连接到所述修饰的调控序列。
用完整结合位点缺失和功能部分缺失的任何组合。
(SEQ ID NO：28)的E1a启动子。
子。因此，在某些实施方式中，提供了包含E1b-19K插入位点的重组病毒，例如所述腺病毒具有插入到E1b-19K插入位点中的编码治疗性转基因的核苷酸序列。在某些实施方式中所述
腺病毒包含编码治疗性转基因的核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于
SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子
的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间。
适合条件下培养，以便允许生产感染性病毒粒子。可以将编码病毒基因的核酸并入到质粒
中，并通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。适合于生产本公开的病毒的示例性
宿主细胞包括人类细胞系例如HeLa、Hela-S3、HEK293、911、A549、HER96或PER-C6细胞。具体的生产和纯化条件随着病毒和使用的生产系统而变。对于腺病毒来说，用于病毒粒子的产
生的传统方法是穿梭质粒(通常含有少部分腺病毒的基因组并任选地含有可能的转基因表
达盒)和腺病毒辅助质粒(含有完整腺病毒基因组的大部分)的共转染和随后的体内重组。
二核苷酸序列。在某些实施方式中，本公开的重组病毒可以包含分别编码第一、第二和第三治疗性转基因的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列。
23A/p19、p40、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。
23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。
用。当T细胞受体(TCR)结合到呈递所述TCR识别的肽的抗原呈递细胞(APC)上的I类主要组
织相容性复合物(MHC)时，CD8+T细胞被活化。除了所述TCR-MHC相互作用之外，所述T细胞还必须通过T细胞上的CD28分子结合到APC上的CD80或CD86来接受辅助刺激信号。然后所述T
细胞变得被活化，分裂并获得对展示同一种肽的其他细胞产生应答的能力。活化也引起T细胞上的其他分子包括CTLA-4和CD137的表达。CTLA-4以比CD28更高的亲和性结合到CD80，并且CTLA-4结合到CD80导致所述T细胞的失活。CD137结合到CD137L，并且在结合后它进一步
活化所述T细胞并促进细胞分裂和免疫应答的持续。
例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：5中，编码人类CD137L的示例性核苷酸序列描绘在SEQ
ID NO：7中。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：
7编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7具有80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8的核苷酸序列或与SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列或与SEQ ID NO：27具有80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。
93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22的核苷酸序列或与SEQ ID NO：
31、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。
描绘在SEQ ID NO：12中，并且编码人类p40的示例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：10中。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：10具有80％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列或与SEQ ID NO：13具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、或99％序列同一性的序列。
子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素8(IL-8)和血管生成素。内皮抑素和血管抑素是天然存在的抗血管生成蛋白，其据报道抑制新生血管化。
管抑素。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因是血管抑素，并且所述第二治疗性转基因是内皮抑素。
构域通常被认为负责内皮抑素的抗血管生成效应。示例性的人类胶原蛋白XVIII NC1结构
域的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：37中。因此，当在本文中使用时，术语“内皮抑素”被理解为意味着包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：37具有高于80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，或任何上述蛋白质的能够例如通过SEQ ID NO：37中呈现的缔合结构域非共价寡聚成三聚体的片段。寡聚化可以通过本领域中已知的任何方法来测定，
例如孔径排阻层析、分析型超速离心、散射技术、NMR波谱术、等温滴定量热术、荧光各向异性和质谱术。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，或任何上述蛋白质的能够拮抗内皮细胞迁移和/或内皮
细胞增殖的片段。内皮细胞迁移和/或增殖可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如在Guo等，(2014)METHODS MOL.BIOL.1135：393-402中描述的方法。
99％序列同一性的序列的核苷酸序列。
97％、98％、或99％序列同一性的序列。
例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透黏膜和直肠给药。用于融合蛋白的优选的给药途径是IV输注。有用的配方可以通过制药技术领域中已知的方法来制备。例如参见
《Remington制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第18版(Mack Publishing Company，1990)。适合于肠胃外给药的配方组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的药剂例如氯化钠或右旋糖。
1015噬斑形成单位(pfu)例如102至1010、102至105、105至1015、105至1010或1010至1015噬斑形成单位的范围内。给药的量取决于多种变量，例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、抗体的体内效能、药物配方和给药途径。初始剂量可以提高到超过上限，以便快速获得所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最适剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计从0.5mg/kg运行到20mg/kg的常规I期
升剂量研究中进行优化。给药频率可以随着多种因素而变，例如给药途径、剂量、抗体的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是肠胃外，例如静脉内输注。基于病毒的药物的配制在本领域的普通技术范围之
内。在某些实施方式中，重组腺病毒被冷冻干燥，然后在给药时在缓冲盐水中重构。
细胞的增殖。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者
单独地或与另一种治疗剂相组合给药有效量的本发明的重组腺病毒，以在所述受试者中治
疗所述癌症。在某些实施方式中，向受试者给药有效量的重组腺病毒，将该受试者中的肿瘤负荷降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。
性肿瘤。
Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗( Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001
(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗( Genentech)、duvalumab(AstraZeneca)、MEDI4736、
avelumab和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
时观察到的相比，所述第二种治疗更大程度地减轻症状，或者对于所述第一种治疗来说观
察到类似的情形。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的减轻，大于在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下观察到的减轻。所述两种治疗的效果可
以是部分累加、完全累加或大于累加的。所述递送可以使得在递送第二种治疗时，递送的第一种治疗的效果仍然可检测。
疫应答。过度增殖性疾病例如癌症可以通过免疫抑制来表征，并且在所述受试者中测量针
对抗原的免疫应答可以指示所述受试者中免疫抑制的水平。因此，在所述受试者中测量针
对抗原的免疫应答可以指示所述治疗的效能和/或所述重组病毒的有效量。所述受试者中
针对所述抗原的免疫应答可以通过本领域中已知的任何方法来测量。在某些实施方式中，
针对所述抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受
试者，并在所述注射位点处测量硬结的大小或炎症的量来测量。在某些实施方式中，针对所述抗原的免疫应答通过在暴露于所述抗原后从所述受试者的细胞释放的细胞因子(例如干
扰素-γ、IL-4和/或IL-5)来测量。
由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
要素或组分可以选自两种或更多种所述叙述的要素或组分。
式可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本发明的教授。例如，应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点可以适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
的)。得到的病毒在后文中被称为TAV。
核苷酸序列如下，其中来自于融合的SalI和XhoI位点的残余碱基被下划线：
区中仍具有RIDα、RIDβ和14.7k基因缺失。
图1和图2中所示，在用TAV-mCD80或TAV-mCD80-137L感染后mCD80被表达，并且在用TAV-
mCD137L或TAV-mCD80-137L感染后CD137L被表达。重要的是，两种基因均与TAV-mCD80-137L病毒一起被表达，证实了所述单一病毒驱动两种治疗性基因的表达。
TAV-mCD80-137L感染后CD80和CD137L两者都被表达(图3和图4)。
免疫细胞化学针对CD80和CD137L进行染色。如图5中所示，TAV-hCD80-137L病毒在癌性A549细胞中诱导人类CD80和人类CD137L的表达，并且在非癌性WI-38和MRC5细胞中诱导很低或
不诱导表达。这些结果证实在人类以及鼠类细胞中可以实现双转基因的表达，并且转基因
的表达可以对癌性细胞具有选择性。
IRES-137L病毒在癌性A549细胞中诱导人类CD80和人类CD137L两者的表达。这些结果证实
通过将两个转基因插入到单一基因组区例如E1b-19k区中并用内部核糖体进入位点(IRES)
隔开，可以实现双转基因的表达。
染后指示的时间点用结晶紫染色，所述结晶紫将活细胞染为蓝色。
显著性的肿瘤大小较小的趋势，用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠的肿瘤明显更小。这些结果
证实，表达CD80和137L的双基因腺病毒在减小肿瘤大小中最为有效。
137L治疗的小鼠具有更小的肿瘤大小。这些结果证实，表达CD80和137L的双基因腺病毒在
减小肿瘤大小中最为有效。
病毒TAV-Δ19k治疗的小鼠相比具有明显更小的肿瘤(图12)。
述)。得到的病毒在后文中被称为TAV。
SalI和XhoI限制性位点被下划线：
SalI和XhoI限制性位点被下划线：
如图14中所示，使用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒时每个基因被表达，证实了所述单一病毒驱动了三个治疗性基因的表达。
出在图16中。与用缓冲液治疗相比，用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠中的肿瘤更小。与用TAV-mCD80-m137L或缓冲液治疗相比，用TAV-mCD80-137L-ICAM治疗的小鼠的肿瘤更小，其中许
多小鼠显示出肿瘤体积完全丧失。这些结果证实，表达CD80和137L的病毒和表达CD80、
CD137L和mICAM-1的病毒在减小肿瘤大小中有效。
美国专利号9,073,980中所述)。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV质粒，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为TAV病毒。
毒(EMCV)IRES、然后是编码人类纤溶酶原的1-19位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是人
类纤溶酶原的97-549位残基(对应于三环结构域1-5)的核苷酸序列克隆到所述修饰的E1b-
19k区中。所有人类胶原蛋白XVIII的氨基酸残基编号是相对于在本文中被描绘为SEQ ID
NO：33的NCBI参考序列：NP_085059.2。所有人类纤溶酶原的氨基酸残基编号是相对于在本文中被描绘为SEQ ID NO：34的NCBI参考序列：NP_000292.1。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV-hEndo-IRES-hAng质粒，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为TAV-
hEndo-IRES-hAng病毒。所述E1b-19k区中的TAV-hEndo-IRES-hAng质粒的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用小写字母表示，并且两侧的E1b-19k序列包括SalI和
XhoI限制性位点被下划线：
毒(EMCV)IRES、然后是编码小鼠纤溶酶原的1-19位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是小
鼠纤溶酶原的96-549位残基(对应于三环结构域1-5)的核苷酸序列克隆到所述修饰的E1b-
19k区中。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV-Endo-IRES-Ang质粒，并且从其产生的任何
得到的病毒粒子在后文中被称为TAV-Endo-IRES-Ang病毒。所述E1b-19k区中的TAV-Endo-
IRES-Ang质粒的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用下鞋子吗表示，并且两侧的E1b-19k序列包括SalI和XhoI限制性位点被下划线：
由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性
范围之内的所有变化涵盖在其中。
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