一种生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用
阅读：78发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了具有如结构式I所示的化合物在制备用于 预防 和\或 治疗 肺 纤维 化药物中的新用途。具有结构式I的化合物，能够显著减轻病变肺组织 炎症 程度，降低病变肺组织中促纤维化因子TGF-β1的含量，减少病变肺组织中胶原的过度沉积，对肺纤维化具有显著的预防和治疗作用，下面是一种生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用专利的具体信息内容。
一种生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及具有抗肺纤维化活性的一类生物碱，特别涉及如结构式I所示的生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用。
背景技术
[0002] 肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是由于肺部炎症引起的肺泡持续性损伤导致细胞过度修复，细胞外基质过度沉积，致使正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病，临床表现为进行性呼吸困难、气短、乏力，病情呈持续性发展。通俗地说，肺纤维化就是肺组织疤痕累累，由于肺泡逐渐被纤维物质取代，导致肺组织变硬变厚，交换氧气的能力逐渐丧失，患者出现不同程度的缺氧而呼吸困难，最终因呼吸衰竭而死亡。近20余年来，由于环境污染导致其发病率逐年上升。目前肺纤维化的治疗以糖皮质激素、免疫抑制剂为主，如泼尼松、环磷酰胺、秋水仙碱等。近年来的临床实践已经证实，使用糖皮质激素、抗生素及免疫抑制剂对抗器官纤维化虽可减轻肺泡早期炎症，减轻患者临床症状，但是并不能抑制纤维化的发展，长期大剂量使用激素、抗生素不仅带来了严重的并发症，还会加剧纤维化进程。由于病因和发病机理不清，肺纤维化的治疗一直是医学领域的难题之一，虽然不断地研发新药，但仍然没有有效的治疗方案和专业治疗药物，预后极差，平均存活期仅为3年，5年生存率小于50％，被称为不是癌症的癌症。
[0003] 虽然肺纤维化的发病机制尚不明确，其共同特征是体内胶原代谢的失衡，胶原合成大于分解，因此，肺纤维化的发生是一个由多种细胞因子启动和维持的胶原蛋白代谢调控失衡的结果。近年来，国内外的研究热点集中于对肺成纤维细胞增殖、转化和分泌具有重要调节作用的细胞因子。多数肺纤维化病人的组织中可以观察到炎症与纤维化并存。持续的炎症损伤可引起纤维化，在肺纤维化发生过程中，TGF-β1、FGFs、PDGFs、VEGFs等细胞因子起到关键性作用。其中，TGF-β1是公认的促纤维化标记物，是与肺纤维化的发生和形成关系最为密切的介导因子，TGF-β1的上调可激活下游经典的Smad信号通路，刺激细胞大量合成并分泌细胞外基质，加剧胞外基质的沉积和纤维化进程中的上皮细胞间质化，加速纤维化的发展，因此TGF-β1成为抗纤维化的主要靶向目标。肺组织中羟脯氨酸含量能表明胶原的含量，TGF-β1的表达水平则显示药物干预肺纤维化的可能作用机制，即药物不是通过抗炎、而是通过降低TGF-β1的水平抑制了TGF-β1/Smad通路，从而减轻了肺纤维化程度。如刚刚在日本、印度和欧盟上市的吡非尼酮(pirfenidone)，可抑制TGF-β1等致纤维化因子，但临床上具有较多副作用如光敏等。
[0004] 咳嗽是呼吸系统疾病的常见症状，如同很多呼吸系统疾病一样，肺纤维化早期也会出现咳嗽症状。咳嗽和肺纤维化虽然有一定的联系，但它们完全不同。严格来说，咳嗽是诸多呼吸系统疾病的表现形式，但不是一种真正的疾病。尽管在肺纤维化的早期和发展过程中也会有咳嗽现象出现，通过止咳药可以缓解肺纤维化早期引起的咳嗽、气喘等症状，但病情发展严重时止咳药无效，则只能使用激素、抗生素来缓解症状。以上这些都是治标不治本，不能从根本上治疗或阻止肺纤维化，激素、抗生素的长期使用甚至还会加重、加速肺纤维化进程。
[0005] 综上所述，肺纤维化目前尚缺乏有效的治疗手段，急需开发新的、疗效好的药物，用于减轻或治疗肺纤维化症状。
[0006] 中药百部为百部科(Stemonaceae)百部属(Stemona)多种植物，具有润肺下气、止咳、杀虫灭虱的功效，临床主要用于治疗百日咳、肺结核、新久咳嗽，外用治疗头、体、蛲虫病。百部生物碱是百部的主要活性成分，已有研究表明，从对叶百部中分离得到的tuberostemonine J，tuberostemonine H，isostenine和neotuberostemonine等化合物对柠檬酸诱发的豚鼠咳嗽具有很好的镇咳作用，其中isostenine、neotuberostemonine的镇咳效果与可待因相近，tuberostemonine J和tuberostemonine H的镇咳效果稍弱一些。亦有研究发现对叶百部中的croomine、neotuberostemonine、stemoninine的止咳活性相当，tuberostemonine活性较弱；机理研究表明neotuberostemonine、tuberostemonine和
stemoninine作用于外周咳嗽反射通路，属外周性镇咳，croomine则通过抑制咳嗽中枢发挥镇咳作用。尽管肺纤维化的症状之一是咳嗽，但目前为止，没有任何关于止咳药可以改善或治疗肺纤维化的研究报道。
stemoninine作用于外周咳嗽反射通路，属外周性镇咳，croomine则通过抑制咳嗽中枢发挥镇咳作用。尽管肺纤维化的症状之一是咳嗽，但目前为止，没有任何关于止咳药可以改善或治疗肺纤维化的研究报道。
[0007]
[0008] 关于百部生物碱的专利不多，且多为总碱制备方法或生物碱的止咳、杀虫活性。除此之外，涉及如结构式I所示生物碱的专利仅有1例(201210149954.X)，其用途是用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂。目前，尚未有文献报道新对叶百部碱具有预防或治疗肺纤维化疾病的功效或其在治疗肺纤维化疾病药物中的应用。
发明内容
[0009] 针对缺乏有效的预防或治疗肺纤维化药物的不足，本发明公开了如结构式I所示的生物碱的新用途，该生物碱可以有效地预防或治疗肺纤维化疾病。
[0010] 本发明的技术方案是：如结构式I所示的生物碱在制备预防或治疗肺纤维化的药物组合物中的应用
[0011]
[0012] 其中：
[0013] R1选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；
[0014] R2选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；
[0015] R3选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；
[0016] 或R2、R3以α或β构型如下式成环：
[0017]
[0018] 其中：R8选自α或β烷基；
[0019] R4选自α或β烷基；
[0020] R5选自α或β氢；
[0021] R6选自α或β氢，α或β羟基；
[0022] R7选自α或β氢。
[0023] 一种化合物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用，其特征在于所述的化合物具有结构式Ia。
[0024]
[0025] 其中：
[0026] R1选自氢，α或β羟基，α或β羧基、α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；
[0027] R2选自α或β氢；
[0028] R3选自α或β氢；
[0029] R4选自α或β烷基；
[0030] R5选自α或β氢；
[0031] R6选自α或β氢，α或β羟基；
[0032] R7选自α或β氢；
[0033] R8选自α或β烷基。
[0034] 所述的应用，其特征在于，所述的化合物是结构式I所示的生物碱或其药用衍生物。
[0035] 所述的应用，其特征在于，所述的化合物药用衍生物是结构式I所示生物碱的盐或酯。
[0036] 所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物至少包括一种活性成分如结构式I所示的生物碱和一种药用载体。
[0037] 所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括质量百分比为0.01％～99％的如结构式I所示的生物碱和质量百分比为0.01％～99％的药用载体。
[0038] 本发明中所述的“肺纤维化”是指以特发性肺纤维化病理改变为特征的、由各种原因导致的人或动物的肺纤维化。
[0039] 所述的“预防”是指在可能的导致肺纤维化的因素存在的情况下，使用后防止或降低肺纤维化的发生；所述的“治疗”是指减轻肺纤维化的程度，或者治愈肺纤维化使之正常，或者减缓肺纤维化的进程。
[0040] 生物碱的盐或酯指的是药物学上可接受的盐、酯等形式。
[0041] 所述的药物组合物至少包括一种如结构式I所示生物碱的活性成分和一种药用载体。所谓“活性成分”是指具有预防或治疗肺纤维化的功能。在该组合物中，该生物碱可以单独或与其他化合物一起作为活性成分。所述的药用载体包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。在该药物组合物中，结构如式1所示的生物碱的含量是0.01％～99％，药用载体的含量是0.01％～99％，百分比是质量百分比。
[0042] 所述药物组合的剂型没有特别限制，可以是固体、半固体或液体形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，可以经口服给药、经静脉、肌肉、皮内或皮下给药。该药物组合物的每日剂量药为0.01～1000mg，优选1～500mg。
[0043] 在预防或治疗肺纤维化时，所述的如结构式I的生物碱的药物组合物可以单独使用或与其他药物联合使用。
[0045] 有益效果
[0046] 1.本发明提供了一种新的预防或治疗肺纤维化的化合物如结构式I所示的生物碱，通过体外实验证明该化合物对于博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化具有显著的预防和治疗作用，明显减轻实验动物的肺纤维化程度，可用于制备治疗肺纤维疾病的药物。同时也说明普通止咳药物对肺纤维化没有作用。本发明第一次发现如结构式I所示的多种化合物(I-VIII)具有抗肺纤维化作用，之前并没有文献报道。
[0047] 具体来说：
[0048] 本发明结果表明，具有如结构式I所示母核的化合物，如化合物I～VIII等8个化合物，具有显著的预防和/或治疗肺纤维化的作用(实施例3)。化合物I和VII(有R1侧链))、VIII(无R1侧链)等3个化合物的活性研究进一步说明了如结构式I所示的结构具有明显的抗肺纤维化作用。多指标的动物实验结果表明，该类化合物改善肺纤维化的效果优于新近在日本上市的阳性对照药吡菲尼酮，能显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠死亡，显著降低模型小鼠的肺系数，改善模型小鼠的肺纤维化程度，明显降低肺组织中Hyp和促纤维化因子TGF-β1的含量，说明具有结构式I所示结构的化合物能够减轻博莱霉素造模引起的小鼠肺部炎症，减少肺部胶原沉积。本发明结果为具有如结构式I所示结构的化合物在预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用提供了科学依据。
[0050] 图1 八个生物碱与咳必清对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的影响。A：羟脯氨酸含量；B：HE染色病理切片；C：Masson染色病理切片。其中，1-假手术组，2-模型组，3-咳必清，4-吡菲尼酮，5-化合物I，6-化合物II，7-化合物III，8-化合物IV，9-化合物V，10-化合物VI，11-化合物VII，12-化合物VIII。与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0051] 图2 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺系数的影响。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0052] 图3 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织病理学改变的影响(HE染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。
[0053] 图4 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织炎性评分的影响(HE染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜
0.01。
0.01。
[0054] 图5 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织病理学改变的影响(Masson染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。
[0055] 图6 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织胶原含量的影响(平均光密度值统计)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0056] 图7 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸(Hyp)含量的影响。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮# ##
(300mg/kg)组。与假手术组相比，P＜0.05，P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜
0.01。
(300mg/kg)组。与假手术组相比，P＜0.05，P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜
0.01。
[0057] 图8 三个生物碱对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织TGF-β1含量的影响(ELISA)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-化合物VII低剂量(30mg/kg)组，6-化合物VII高剂量(60mg/kg)组，7-化合物VIII低剂量(30mg/kg)组，4-化合物VIII高剂量(60mg/kg)组，9-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
具体实施方式
[0058] 实施例1 生物碱的制备和结构鉴定
[0059] 1.药材与试剂
[0060] 药材为对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥根，购于河北安国药材市场。乙醇、二氯甲烷、甲醇等试剂均为分析纯。
[0061] 2.提取分离
[0062] 对叶百部药材采用90％乙醇渗漉提取，直至渗漉液浓缩后TLC检测基本无碘化铋钾反应为止。渗漉浓缩液加5％稀盐酸酸化至pH1-2，过滤，滤液用浓氨水碱化至pH10，氯仿萃取，回收氯仿得总生物碱部位。总生物碱经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇梯度(100∶0～1∶5)洗脱，根据TLC结果合并相同流分，再经过反复硅胶柱层析，从二氯甲烷-甲醇(100∶0)洗脱部分分离得到化合物I和化合物VII，剩余部分采用制备高效液相色谱法乙腈-水(42∶58)洗脱，分离得到化合物II；从二氯甲烷-甲醇(100∶2)洗脱部分分离得到化合物IV和化合物III，剩余部分继续采用制备高效液相色法乙腈-水(23∶77)洗脱，分离得到化合物V和化合物VI；从二氯甲烷-甲醇(100∶4)洗脱部分分离得到化合物VIII。以上化合物经HPLC分析，纯度均在98％以上。
[0063] 3.结构鉴定
[0064] 化合物I(Tuberostemonine，对叶百部碱)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.80(1H，m，H-1)，2.18(1H，m，H-2α)，1.10(1H，m，H-2β)，3.43(1H，m，H-3)，3.47(1H，m，H-5α)，2.67(1H，m，H-5β)，1.57(1H，m，H-8)，1.82(1H，m，H-9)，3.07(1H，dd，J＝3.5，4.0Hz，H-9a)，1.55(1H，m，H-10)，4.44(1H，dd，J＝3.0，3.5Hz，H-11)，2.00(1H，m，H-12)，2.41(1H，dq，J＝6.5，7.5Hz，H-13)，1.28(3H，d，J＝7.0Hz，H-15)，1.52(1H，m，H-16)，0.96(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，4.31(1H，m，H-18)，2.38(1H，ddd，J＝5.5，13.5，15.5Hz，H-19)，2.60(1H，ddq，J＝7.0，5.5，12.0Hz，H-20)，1.26(3H，d，J＝7.0Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：41.6(C-1)，32.1(C-2)，65.0(C-3)，48.1(C-5)，28.1(C-6)，29.9(C-7)，30.4(C-8)，40.7(C-9)，63.6(C-9a)，45.0(C-10)，80.3(C-11)，
47.3(C-12)，40.9(C-13)，179.2(C-14)，14.7(C-15)，24.3(C-16)，11.2(C-17)，81.4(C-
18)，34.6(C-19)，34.8(C-20)，179.4(C-21)，14.9(C-22)。
47.3(C-12)，40.9(C-13)，179.2(C-14)，14.7(C-15)，24.3(C-16)，11.2(C-17)，81.4(C-
18)，34.6(C-19)，34.8(C-20)，179.4(C-21)，14.9(C-22)。
[0065]
[0066] 化合物II(Tuberostemonine A)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.81(1H，m，H-1)，1.84(1H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-2)，3.09(1H，m，H-3)，2.98(1H，m，H-5)，2.44(1H，m，H-5)，1.65(1H，m，H-8)，1.57(1H，m，H-9)，2.63(1H，dd，J＝3.5，4.0Hz，H-9a)，1.42(1H，m，H-10)，4.44(1H，dd，J＝3.0，3.5Hz，H-11)，2.01(1H，m，H-12)，2.33(1H，dq，J＝6.5，7.5Hz，H-13)，1.26(3H，d，J＝7.0Hz，H-15)，1.64(1H，m，H-16)，0.91(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，4.31(1H，m，H-18)，2.37(1H，ddd，J＝5.5，13.5，15.5Hz，H-19)，2.69(1H，ddq，J＝7.0，5.5，12.0Hz，H-20)，1.30(3H，d，J＝
7.0Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：41.4(C-1)，32.6(C-2)，65.1(C-3)，53.3(C-5)，26.0(C-6)，29.9(C-7)，29.9(C-8)，40.6(C-9)，68.3(C-9a)，42.5(C-10)，80.2(C-11)，46.9(C-
12)，40.1(C-13)，179.2(C-14)，15.2(C-15)，22.4(C-16)，9.8(C-17)，80.8(C-18)，32.5(C-
19)，35.6(C-20)，179.4(C-21)，15.2(C-22)。
7.0Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：41.4(C-1)，32.6(C-2)，65.1(C-3)，53.3(C-5)，26.0(C-6)，29.9(C-7)，29.9(C-8)，40.6(C-9)，68.3(C-9a)，42.5(C-10)，80.2(C-11)，46.9(C-
12)，40.1(C-13)，179.2(C-14)，15.2(C-15)，22.4(C-16)，9.8(C-17)，80.8(C-18)，32.5(C-
19)，35.6(C-20)，179.4(C-21)，15.2(C-22)。
[0067]
[0068] 化合物III(Tuberostemonine J)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.40～2.10(15H，H-1，2，6～10，12，16，19)，3.02(2H，m，H-3，H-9a)，2.98(1H，m，H-5)，2.74(2H，H-5，H-13)，4.46(1H，m，H-11)，1.18(3H，d，J＝7.5Hz，H-15)，0.91(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，4.39(1H，m，H-18)，2.25(1H，m，H-
19)，2.50(1H，m，H-20)，1.22(3H，d，J＝7.5Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：38.4(C-1)，
32.4(C-2)，64.6(C-3)，50.1(C-5)，33.3(C-6)，29.5(C-7)，30.6(C-8)，34.8(C-9)，66.3(C-
9a)，34.5(C-10)，80.3(C-11)，41.1(C-12)，45.8(C-13)，179.3(C-14)，11.6(C-15)，25.4(C-16)，12.9(C-17)，81.2(C-18)，34.3(C-19)，45.1(C-20)，179.2(C-21)，14.8(C-22)。
19)，2.50(1H，m，H-20)，1.22(3H，d，J＝7.5Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：38.4(C-1)，
32.4(C-2)，64.6(C-3)，50.1(C-5)，33.3(C-6)，29.5(C-7)，30.6(C-8)，34.8(C-9)，66.3(C-
9a)，34.5(C-10)，80.3(C-11)，41.1(C-12)，45.8(C-13)，179.3(C-14)，11.6(C-15)，25.4(C-16)，12.9(C-17)，81.2(C-18)，34.3(C-19)，45.1(C-20)，179.2(C-21)，14.8(C-22)。
[0069]
[0070] 化合物IV(Tuberostemonine H)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.30～2.00(16H，H-1，2，6～10，12，16，19)，3.20(1H，m，H-3)，2.84(1H，m，H-5)，2.78(1H，H-5)，，4.57(1H，m，H-11)，2.61(1H，m，H-
13)，1.18(3H，d，J＝7.2Hz，H-15)，1.00(3H，t，J＝7.2Hz，H-17)，4.37(1H，m，H-18)，2.35
13
(1H，m，H-19)，2.45(1H，m，H-20)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-22)。C NMR(CDCl3，75MHz)δ：
41.9(C-1)，31.1(C-2)，78.0(C-3)，54.7(C-5)，27.3(C-6)，24.1(C-7)，27.1(C-8)，41.1(C-
9)，67.5(C-9a)，35.3(C-10)，80.7(C-11)，44.1(C-12)，47.2(C-13)，179.4(C-14)，11.6(C-
15)，21.2(C-16)，11.9(C-17)，79.2(C-18)，33.4(C-19)，44.8(C-20)，179.1(C-21)，15.0(C-22)。
13)，1.18(3H，d，J＝7.2Hz，H-15)，1.00(3H，t，J＝7.2Hz，H-17)，4.37(1H，m，H-18)，2.35
13
(1H，m，H-19)，2.45(1H，m，H-20)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-22)。C NMR(CDCl3，75MHz)δ：
41.9(C-1)，31.1(C-2)，78.0(C-3)，54.7(C-5)，27.3(C-6)，24.1(C-7)，27.1(C-8)，41.1(C-
9)，67.5(C-9a)，35.3(C-10)，80.7(C-11)，44.1(C-12)，47.2(C-13)，179.4(C-14)，11.6(C-
15)，21.2(C-16)，11.9(C-17)，79.2(C-18)，33.4(C-19)，44.8(C-20)，179.1(C-21)，15.0(C-22)。
[0071]
[0072] 化合物V(Tuberostemonine N)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.75(1H，m，H-1)，2.21(1H，ddd，J＝11.8，6.3，5.6Hz，H-2α)，1.09(1H，m，H-2β)，3.21(1H，m，H-3)，3.31(1H，dd，J＝15.1，6.3Hz，H-5α)，2.79(1H，m，H-5β)，1.33(1H，m，H-6)，1.49(1H，m，H-6)，1.19(1H，m，H-7)，1.76(1H，m，H-
7)，1.60(1H，m，H-8)，1.77(1H，m，H-8)，2.01(1H，d，J＝12.0Hz，H-9)，3.12(1H，dd，J＝11.9，
3.8Hz，H-9a)，1.98(1H，t，J＝7.3Hz，H-10)，4.20(1H，dd，J＝4.3，1.8Hz，H-11)，2.261(1H，ddd，J＝10.2，7.3，4.3Hz，H-12)，2.81(1H，dq，J＝7.3，7.3Hz，H-13)，I.27(3H，d，J＝7.3Hz，H-15)，1.42(2H，m，H-16)，1.00(3H，t，J＝7.3Hz，H-17)，4.19(1H，m，H-18)，1.54(1H，m，H-19α)，2.36(1H，ddd，J＝12.5，8.4，5.4Hz，H-19β)，2.62(1H，m，H-20)，1.27(3H，d，J＝7.1Hz，H-
22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：35.2(C-1)，33.7(C-2)，65.2(C-3)，50.7(C-5)，26.9(C-6)，
29.8(C-7)，32.8(C-8)，40.1(C-9)，64.2(C-9a)，46.9(C-10)，81.7(C-11)，45.2(C-12)，
41.5(C-13)，178.7(C-14)，11.9(C-15)，25.9(C-16)，13.1(C-17)，83.4(C-18)，34.2(C-
19)，35.2(C-20)，179.4(C-21)，15.0(C-22)。
7)，1.60(1H，m，H-8)，1.77(1H，m，H-8)，2.01(1H，d，J＝12.0Hz，H-9)，3.12(1H，dd，J＝11.9，
3.8Hz，H-9a)，1.98(1H，t，J＝7.3Hz，H-10)，4.20(1H，dd，J＝4.3，1.8Hz，H-11)，2.261(1H，ddd，J＝10.2，7.3，4.3Hz，H-12)，2.81(1H，dq，J＝7.3，7.3Hz，H-13)，I.27(3H，d，J＝7.3Hz，H-15)，1.42(2H，m，H-16)，1.00(3H，t，J＝7.3Hz，H-17)，4.19(1H，m，H-18)，1.54(1H，m，H-19α)，2.36(1H，ddd，J＝12.5，8.4，5.4Hz，H-19β)，2.62(1H，m，H-20)，1.27(3H，d，J＝7.1Hz，H-
22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：35.2(C-1)，33.7(C-2)，65.2(C-3)，50.7(C-5)，26.9(C-6)，
29.8(C-7)，32.8(C-8)，40.1(C-9)，64.2(C-9a)，46.9(C-10)，81.7(C-11)，45.2(C-12)，
41.5(C-13)，178.7(C-14)，11.9(C-15)，25.9(C-16)，13.1(C-17)，83.4(C-18)，34.2(C-
19)，35.2(C-20)，179.4(C-21)，15.0(C-22)。
[0073]
[0074] 化合物VI(Tuberostemonine K)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：1.79(1H，m，H-1)，2.25(1H，m，H-2α)，1.10(1H，m，H-2β)，3.22(1H，dd，J＝9.0，12.1Hz，H-3)，2.81(1H，dd，J＝9.3，15.1Hz，H-5α)，
3.41(1H，dd，J＝5.8，9.3Hz，H-5β)，1.28(2H，m，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.06(1H，m，H-8α)，
1.88(1H，m，H-8β)，1.89(1H，m，H-9)，3.11(1H，dd，J＝3.9，11.2Hz，H-9a)，1.89(1H，m，H-
10)，4.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-11)，2.17(1H，m，H-12)，2.88(1H，dq，J＝6.8，7.4Hz，H-13)，
1.32(3H，d，J＝7.4Hz，H-15)，1.2～1.4(2H，m，H-16)，0.87(3H，t，J＝7.4Hz，H-17)，4.26(1H，m，H-18)，1.49(1H，ddd，J＝12Hz，H-19α)，2.21(1H，m，H-19β)，2.64(1H，dq，J＝4.0，
6.8Hz，H-20)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：35.6(C-1)，33.6(C-
2)，65.5(C-3)，50.4(C-5)，27.6(C-6)，30.1(C-7)，33.0(C-8)，47.3(C-9)，64.1(C-9a)，
41.0(C-10)，81.6(C-11)，45.1(C-12)，41.6(C-13)，178.9(C-14)，12.1(C-15)，26.1(C-
16)，13.1(C-17)，83.6(C-18)，34.2(C-19)，35.3(C-20)，179.5(C-21)，15.2(C-22)。
3.41(1H，dd，J＝5.8，9.3Hz，H-5β)，1.28(2H，m，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.06(1H，m，H-8α)，
1.88(1H，m，H-8β)，1.89(1H，m，H-9)，3.11(1H，dd，J＝3.9，11.2Hz，H-9a)，1.89(1H，m，H-
10)，4.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-11)，2.17(1H，m，H-12)，2.88(1H，dq，J＝6.8，7.4Hz，H-13)，
1.32(3H，d，J＝7.4Hz，H-15)，1.2～1.4(2H，m，H-16)，0.87(3H，t，J＝7.4Hz，H-17)，4.26(1H，m，H-18)，1.49(1H，ddd，J＝12Hz，H-19α)，2.21(1H，m，H-19β)，2.64(1H，dq，J＝4.0，
6.8Hz，H-20)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ：35.6(C-1)，33.6(C-
2)，65.5(C-3)，50.4(C-5)，27.6(C-6)，30.1(C-7)，33.0(C-8)，47.3(C-9)，64.1(C-9a)，
41.0(C-10)，81.6(C-11)，45.1(C-12)，41.6(C-13)，178.9(C-14)，12.1(C-15)，26.1(C-
16)，13.1(C-17)，83.6(C-18)，34.2(C-19)，35.3(C-20)，179.5(C-21)，15.2(C-22)。
[0075]
[0076] 化合物VII(Neotuberostemonine，新对叶百部碱)：无色针晶(甲醇)，mp：160.5-162℃，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：376[M+H]+)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.75(1H，m，H-1)，1.65(2H，m，H-2)，3.33(1H，dd，J＝7.5，14.0Hz，H-3)，3.08(1H，m，H-5α)，2.98(1H，m，H-5β)，1.94(1H，m，H-8)，1.84(1H，m，H-9)，3.21(1H，dd，J＝3.5，4.0Hz，H-9a)，1.72(1H，m，H-10)，4.52(1H，dd，J＝3.0，3.5Hz，H-11)，2.10(1H，m，H-12)，2.88(1H，dq，J＝6.5，
7.5Hz，H-13)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-15)，1.37(1H，m，H-16)，1.00(1H，t，J＝7.5Hz，H-
17)，4.43(1H，m，H-18)，2.39(1H，ddd，J＝5.5，13.5，15.5Hz，H-19)，2.61(1H，ddq，J＝7.0，
5.5，12.0Hz，H-20)，1.26(3H，d，J＝7.0Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，125MHz)δ：37.3(C-1)，
32.6(C-2)，67.7(C-3)，51.0(C-5)，29.1(C-6)，22.8(C-7)，28.6(C-8)，35.9(C-9)，67.2(C-
9a)，34.8(C-10)，80.4(C-11)，41.5(C-12)，42.6(C-13)，178.8(C-14)，10.2(C-15)，21.1(C-16)，11.1(C-17)，78.4(C-18)，34.5(C-19)，34.9(C-20)，178.6(C-21)，14.8(C-22)。
7.5Hz，H-13)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-15)，1.37(1H，m，H-16)，1.00(1H，t，J＝7.5Hz，H-
17)，4.43(1H，m，H-18)，2.39(1H，ddd，J＝5.5，13.5，15.5Hz，H-19)，2.61(1H，ddq，J＝7.0，
5.5，12.0Hz，H-20)，1.26(3H，d，J＝7.0Hz，H-22)。13C NMR(CDCl3，125MHz)δ：37.3(C-1)，
32.6(C-2)，67.7(C-3)，51.0(C-5)，29.1(C-6)，22.8(C-7)，28.6(C-8)，35.9(C-9)，67.2(C-
9a)，34.8(C-10)，80.4(C-11)，41.5(C-12)，42.6(C-13)，178.8(C-14)，10.2(C-15)，21.1(C-16)，11.1(C-17)，78.4(C-18)，34.5(C-19)，34.9(C-20)，178.6(C-21)，14.8(C-22)。
[0077]
[0078] 化合物VIII(Sessilifoline B)：无色柱晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：278[M+H]+)。1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：4.52(1H，d，J＝3.5Hz，H-11)，3.29(1H，m，H-3)，2.94(1H，m，H-5)，2.86(1H，m，H-13)，2.51(2H，m，H-9a，H-3)，2.40(1H，m，H-5)，2.30(1H，m，H-12)，2.02(1H，m，H-2)，1.93(1H，m，H-9)，1.58(1H，m，H-7)，1.21(3H，d，J＝7.5Hz，13
15-CH3)，0.99(3H，d，J＝7.5Hz，17-CH3)。C-NMR(CDCl3，75MHz)δ：37.3(C-1)，29.9(C-2)，
55.9(C-3)，55.8(C-5)，28.1(C-6)，21.0(C-7)，28.0(C-8)，34.0(C-9)，71.1(C-9a)，37.2(C-10)，79.2(C-11)，42.5(C-12)，42.4(C-13)，179.5(C-14)，10.1(C-15)，21.1(C-16)，
11.4(C-17)。
15-CH3)，0.99(3H，d，J＝7.5Hz，17-CH3)。C-NMR(CDCl3，75MHz)δ：37.3(C-1)，29.9(C-2)，
55.9(C-3)，55.8(C-5)，28.1(C-6)，21.0(C-7)，28.0(C-8)，34.0(C-9)，71.1(C-9a)，37.2(C-10)，79.2(C-11)，42.5(C-12)，42.4(C-13)，179.5(C-14)，10.1(C-15)，21.1(C-16)，
11.4(C-17)。
[0079]
[0080] 实施例2 肺纤维化动物模型的制备
[0081] 1.主要试剂及实验动物
[0082] 实验所用博莱霉素购自日本化药株式会社，批号730342。
[0083] 实验所用的SPF级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)，购自扬州大学比较医学中心。
[0084] 2.模型制备
[0085] 博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化是国际公认的筛选抗肺纤维化药物的动物模型。博莱霉素造模后造成急性肺损伤，初期主要表现为炎症，10天左右开始出现纤维化，大量胶原集中出现在肺部，这些病理改变与临床中特发性肺纤维化的病理改变极为相似。虽然特发性肺纤维化的发病原因和机制并不清楚，但博来霉素诱导的肺纤维化和特发性肺纤维化均为肺组织受损伤导致免疫和炎症反应，继而引发纤维化病理改变，因此博来霉素诱导的肺纤维化模型可代表特发性肺纤维化和一系列由不同致病因素造成的病理改变类似的肺纤维化疾病。
[0086] 肺纤维化模型制备方法：雌性C57BL/6小鼠(8周龄)，适应环境7天后开始造模。小鼠隔夜禁食，3％水合氯醛(10ml/kg，i.p.)麻醉，固定小鼠，消毒小鼠颈部，以尽量小的创伤纵向切开颈部皮肤，用镊子纵向分开筋膜与肌肉，暴露气管，用微量注射器刺入气管注入药35μl(3.5mg/kg)博莱霉素，然后迅速直立并旋转小鼠3～5分钟，以便使博来霉素均匀地进入左右肺叶，观察小鼠呼吸情况，用75％酒精棉消毒颈部伤口，缝合，在缝合处滴1-2滴青霉素注射液，放回干燥洁净的鼠笼休息，待苏醒后正常饲养。手术操作在药60℃左右的手术台进行。假手术(sham)组气管内注射等量的注射用生理盐水。
[0087] 实施例3 八个生物碱与咳必清抗小鼠肺纤维化活性的鉴定
[0088] 本实施例旨在对实施例1中分得的生物碱进行抗小鼠肺纤维化活性的研究，以鉴定其是否具有抗肺纤维化的作用。由于这些生物碱都是中药百部的止咳有效成分，为了了解止咳药是否可以抗肺纤维化，本实施例选择临床常用的止咳药——咳必清(pentoxyverine，枸橼酸喷托维林片，止咳药理实验中常用的阳性对照药)同步进行抗肺纤维化活性筛选。
[0089] 1.主要试剂及实验动物
[0090] 化合物I～VIII按照实施例1分得，纯度＞98％。咳必清购自国药集团容生制药有限公司，批号13110221。实验所用博莱霉素购自日本化药株式会社，批号730342。吡菲尼酮(prifenidone，阳性药)购于大连美仑生物，纯度＞99％。吡菲尼酮是美国Marnac公司开发的治疗肺纤维化新药，并将日本、台湾、韩国的开发权授权给了日本盐野义公司，2008年10月17日该公司率先在日本上市。
[0091] 实验用SPF级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)，购自扬州大学比较医学中心。
[0092] 2.实验方法
[0093] 实验小鼠随机分为12组，模型组与咳必清组各10只，其余各组均5只。第1组为假手术组，第2组为模型组，第3组为咳必清组，第4组为阳性药吡菲尼酮组，第5～12组分别为化合物I～VIII给药组。第2～12组以博莱霉素造模，方法同实施例2。在造模后第1天开始，第3组每天灌胃给予30mg/kg的咳必清，第4组每天灌胃给予300mg/kg的吡菲尼酮，第5～12组每天分别灌胃给予30mg/kg的化合物I～VIII，假手术组和模型组给予相同剂量溶剂，至第21天结束。末次给药后处死小鼠，取出肺组织，右小叶用于测定羟脯氨酸的含量，左小叶用于制作病理切片。
[0094] 3.实验结果
[0095] 由图1-A可见，与假手术组比，模型组小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量显著性增高，说明模型组小鼠肺组织中胶原蛋白明显增多，纤维化病变严重；8个百部生物碱单体给药后均可显著降低小鼠造模引起的羟脯氨酸含量增高，其效果均优于阳性对照吡菲尼酮；但咳必清给药后Hyp含量与模型组无显著差异，与假手术组相比却显著升高。由图1-B、1-C可见，造模21天后，假手术组小鼠肺小叶结构正常，肺泡壁完整，未见炎症和纤维化病理改变；模型组小鼠肺脏出现明显的炎症损伤和组织团块，正常肺组织消失，肺泡闭塞，有明显的胶原沉积；8个百部生物碱单体给药后均可显著减轻博来霉素引起的小鼠肺部炎症，明显改善肺损伤程度，化合物I、II、III、VII、VIII可基本恢复模型小鼠肺部正常结构；而咳必清并不能改善模型小鼠的肺组织损伤和纤维化程度，其组织切片与模型组相似，炎症损伤严重，肺泡闭塞，胶原沉积明显。本实验结果说明了具有结构式I母核的生物碱具有显著抑制和改善博来霉素模型小鼠肺纤维化的作用，而止咳药并不能改善模型小鼠的肺纤维化。
[0096] 实施例4 化合物I、化合物VII和化合物VIII预防和治疗肺纤维化的作用
[0097] 1.实验材料及方法
[0098] (1)主要试剂及实验动物
[0099] 化合物I、VII和VIII按照实施例1分得，纯度＞98％。吡菲尼酮(prifenidone，阳性药)购于大连美仑生物，纯度＞99％。
[0100] 实验动物为按实施例2制备的模型小鼠，造模当天为0天。
[0101] (2)实验方法
[0102] 将模型动物按照预防、治疗分别分组给药。按照本模型国际通用给药方法，预防给药从造模第2天开始，到第14天结束，连续灌胃给药；治疗给药从造模后第8天开始，到第21天结束，连续灌胃给药。分组和给药情况如表1所示。
[0103] 表1.肺纤维化小鼠造模后分组及给药方案
[0104]
[0105] 2.小鼠死亡率的测定
[0106] 预防给药从造模当天即第0天开始到第14天，治疗给药从造模第8天开始到第21天，每天统计预防给药各组动物死亡情况，并计算各组动物的存活率，结果见表2。
[0107] 由表2可见，与假手术组相比，博莱霉素造模小鼠14天的死亡率为20％，21天的死亡率为33％。与模型组相比，3个化合物对模型小鼠都具有一定的保护作用，其中预防给药化合物I、VII的效果好于化合物VIII，低剂量组(30mg/kg)效果更佳；治疗给药，3个化合物降低小鼠死亡率的作用基本相当，低剂量组略好于高剂量组。本实验结果也显示，无论预防给药还是治疗给药，低剂量组对模型小鼠的保护作用均优于高剂量组。总体而言，3个化合物降低小鼠死亡率的作用明显优于阳性对照吡菲尼酮。
[0108] 表2.预防和治疗给药各组小鼠死亡情况
[0109]
[0110] 3.小鼠肺系数的检测
[0111] 末次给药后处死小鼠，剥离小鼠肺脏并称取湿重，将肺重(mg)除以小鼠体重(g)得到肺系数(图2)。由图1可见，与假手术组相比，模型组的肺系数显著升高。无论预防给药还是治疗给药，化合物I、VII和VIII的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著降低模型小鼠的肺系数，其中预防组中低剂量效果更佳。总体来看，3个化合物降低模型小鼠肺系数的作用略优于阳性对照吡菲尼酮。
[0112] 4.HE染色病理评价与炎性评分
[0113] 末次给药后麻醉处死小鼠，取出小鼠肺组织，左小叶肺浸入10％福尔马林固定后石蜡包埋，切片，HE染色观察其病理改变。由图3可见，假手术组小鼠肺小叶结构正常，肺泡壁完整，未见明显炎症和纤维化病理改变。模型组小鼠肺脏出现明显的炎症损伤和组织团块，正常肺组织消失，肺泡闭塞。无论是预防给药还是治疗给药，化合物I、VII和VIII均可显著减轻博来霉素引起的肺部炎症，改善肺损伤，恢复肺部正常结构，3个化合物均表现出低剂量组(30mg/kg)效果明显优于高剂量组，肺部炎症基本消失，肺泡结构清晰。
[0114] 对HE染色结果炎性分级，进行半定量统计分析。0级：正常组织或极小的炎症改变；1级(+)：轻微到中等的炎症改变，没有明显的肺组织破坏；2级(++)：中等到重度的炎症损伤，肺泡隔膜增厚，形成组织团块，或局限性肺炎区导致肺组织结构破坏；3级(+++)：严重的炎症损伤，局部区域肺组织结构严重破坏引起管腔闭合等。预防给药和治疗给药各组的炎性评分结果见图4。与假手术组相比，博来霉素造模小鼠肺部出现显著炎症；化合物I、VII和VIII的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著地降低博来霉素引起的肺部炎症，低剂量的效果优于高剂量；总体来讲，3个化合物改善肺部炎症的效果优于阳性对照吡菲尼酮。
[0115] 5.Masson染色病理评价与影像学分析
[0116] Masson染色是针对纤维性胶原进行特异性染色的方法。末次给药后麻醉处死小鼠，取出小鼠肺组织，左小叶肺浸入10％福尔马林固定后石蜡包埋，切片，Masson染色观察胶原纤维沉积情况，预防给药和治疗给药各组的Masson染色结果分别见图5。使用Image-Pro Plus6.0进行半定量分析，测量每个视野Masson染色后胶原的积分光密度值(IOD)，每组分析5个标本，每个标本随机取5个视野，取均值作为每组胶原的相对含量进行统计学分析。预防和治疗给药各组的分析结果分别见图6。
[0117] 由图5和图6可见，假手术组小鼠肺部未见明显Masson胶原沉积；给予博来霉素14天和21天后小鼠肺脏出现明显胶原堆积，大量纤维化组织形成，21天的较14天的更为严重。化合物I、VII和VIII的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著减轻博来霉素引起的胶原沉积，肺纤维化改善效果极其明显。其中，3个化合物预防给药的低剂量组效果优于高剂量组，治疗给药的高剂量组效果略优于低剂量组。总体而言，化合物I、VII改善模型小鼠胶原沉积的效果略优于化合物VIII，3个化合物均明显优于阳性对照吡菲尼酮。
[0118] 6.羟脯氨酸含量测定
[0119] 羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，弹性蛋白中含量极少，其他蛋白中不存在，因此通过测定羟脯氨酸的含量可以表明胶原蛋白含量的高低，从而评价肺纤维化的程度。羟脯氨酸的测定采用试剂盒(南京建成生物技术公司)方法，按照试剂盒说明书进行，结果见图7。
[0120] 由图7可见，与假手术组比，模型组小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量显著性增高，说明模型组小鼠肺组织纤维化病变严重。无论是预防给药还是治疗给药，化合物I、VII和VIII的高、低剂量组(30、60mg/kg)均可有效地降低模型小鼠羟脯氨酸的含量，低剂量组效果略优于高剂量组，说明3个化合物均能显著改善博莱霉素造模诱导的小鼠肺纤维化，减少胶原沉积。
[0121] 7.TGF-β1的Elisa含量测定
[0122] TGF-β1是公认的强力致纤维化因子，可以刺激细胞合成并分泌细胞外基质组分，还可改变基质降解酶成分的活性，直接加剧ECM的沉积。降低肺组织中TGF-β1含量可减缓肺纤维化进程。采用Elisa试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)测定小鼠肺组织中TGF-β1的含量，按照试剂盒说明书进行，结果见图8。
[0123] 由图8可见，与假手术组比，博来霉素给药小鼠肺组织的TGF-β1含量显著增高。与模型组相比，无论是预防给药还是治疗给药，化合物I、VII和VIII的高、低剂量(30、60mg/kg)均可明显降低模型小鼠中TGF-β1的水平，显著改善肺纤维化程度，其中低剂量的效果好于高剂量，化合物I、VIII的效果略优于化合物VII。
[0124] 讨论
[0125] 本发明结果表明，具有如结构式I所示母核的化合物，如化合物I～VIII等8个化合物，具有显著的预防和/或治疗肺纤维化的作用(实施例3)。化合物I和VII(有R1侧链))、VIII(无R1侧链)等3个化合物的活性研究进一步说明了如结构式I所示的结构具有明显的抗肺纤维化作用。多指标的动物实验结果表明，该类化合物改善肺纤维化的效果优于新近在日本上市的阳性对照药吡菲尼酮，能显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠死亡，显著降低模型小鼠的肺系数，改善模型小鼠的肺纤维化程度，明显降低肺组织中Hyp和促纤维化因子TGF-β1的含量，说明具有结构式I所示结构的化合物能够减轻博莱霉素造模引起的小鼠肺部炎症，减少肺部胶原沉积。
[0126] 本发明结果为具有如结构式I所示结构的化合物在预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用提供了科学依据。
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