工程改造的蛋白质，例如能够结合2种或更多抗原的多特异性抗体 是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、 或重组DNA技术来产生。
基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤 (quadroma)技术(参见Milstein，C.和A.C.Cuello，Nature，1983.305 (5934)：第537-40页)生产了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达 具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体。因为2种不同Ig重和 轻链在所得到的杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以 产生最高达10种不同免疫球蛋白种类，其中只有一种是功能性双特异 性抗体。错配对副产品的存在和显著减少的产物得率意味着需要复杂的 纯化操作。
双特异性抗体可以通过2种不同mAbs的化学缀合来生产(参见， Staerz，U.D.，等人，Nature，1985.314(6012)：第628-31页)。这 种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同单克隆抗体或较小抗 体片段的化学缀合(参见Brennan，M.，等人，Science，1985.229(4708)： 第81-3页)。另一种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所 得到的双特异性抗体制剂经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗 体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同 Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(参见 Glennie，M.J.，等人，J Immunol，1987.139(7)：第2367-75页)。 但这种方法产生Fab’2片段，而不是全IgG分子。
近来已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(参见 Kriangkum，J.，等人，Biomol Eng，2001.18(2)：第31-40页)。在 它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是 用于构建重组双特异性抗体的最广泛使用的形式。常规地，这些分子的 构建从识别不同抗原的2个单链Fv(scFv)片段开始(参见Economides， A.N.，等人，Nat Med，2003.9(1)：第47-52页)。串联scFv分子(taFv) 代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的简单形式。这些串联scFv 分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连 接2个scFv片段和接头具有最高达63个残基的长度(参见Nakanishi， K.，等人，Annu Rev Immunol，2001.19：第423-74页)。尽管亲本scFv 片段可以以可溶形式在细菌中正常表达，然而，常常观察到串联scFv 分子在细菌中形成不溶性聚集物。因此，重折叠规程或哺乳动物表达系 统的使用常规应用于生产可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了 通过转基因兔和牛体内表达针对CD28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚 糖(参见Gracie，J.A.，等人，J Clin Invest，1999.104(10)：第1393-401 页)。在这个构建体中，2个scFv分子通过CH1接头进行连接，且得 到最高达100mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域 顺序变化或使用具有变化长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶 性表达。少数研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富甘氨 酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung，B.P.， 等人，J Immunol，2000.164(12)：第6495-502页；Ito，A.，等人，J Immunol，2003.170(9)：第4802-9页；Karni，A.，等人，J Neuroimmunol， 2002.125(1-2)：第134-40页)。在近期研究中，包含长度为3或6 个残基的随机化中间接头的串联scFv谱(repertoire)噬菌体展示，用于 富集以可溶和活性形式在细菌中生产的那些分子。这种方法导致分离具 有6个氨基酸残基接头的优选串联scFv分子(参见Arndt，M.和J.Krauss， Methods Mol Biol，2003.207：第305-21页)。这种接头序列是否代表 串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证 明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力 工具，所述分子可以以活性形式在细菌中表达。
双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接 VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段生产双抗 体(参见Peipp，M.和T.Valerius，Biochem Soc Trans，2002.30(4)： 第507-11页)。接头尺寸的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对 促进2条多肽链的二聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条 多肽链来生产，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL 构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已生产了 大量品种繁多的不同双特异性双抗体，并且它们中的大多数可以以可溶 形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以 影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack，M.，G.Riethmuller，和 P.Kufer，Proc Natl Acad Sci U S A，1995.92(15)：第7021-5页)。 然而，在细菌中的可溶性表达代表关于串联scFv分子的重要优点。然而， 因为2条不同多肽链在单个细胞内表达，所以可以生产无活性同二聚体 连同活性异二聚体。这使另外纯化步骤的执行成为必需，以获得双特异 性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的一种方法是结进孔 (knob-into-hole)双抗体的生产(参见Holliger，P.，T.Prospero和G. Winter，Proc Natl Acad Sci U S A，1993.90(14)：第6444-8.18页)。 这对于针对HER2和CD3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe 交换Val37和用Trp交换Leu45将大结引入VH结构域内，且在抗HER2 或抗CD3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为 Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体 的生产可以从经由亲本双抗体的72％增至经由结进孔双抗体的超过90 ％。重要的是，作为这些突变的结果生产得率只有轻微减少。然而，对 于几种分析的构建体观察到抗原结合活性的减少。因此，这种相当精细 的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异二聚分 子的那些突变。此外，此类方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修 饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性增 加、体内稳定性差、以及不希望有的药物代谢动力学。
单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代 策略(参见Holliger，P.和G.Winter，Cancer Immunol Immunother， 1997.45(3-4)：第128-30页；Wu，A.M.，等人，Immunotechnology， 1996.2(1)：第21-36页)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接 头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约15 个氨基酸残基。因此，分子量对应于单体单链双抗体(50-60kDa)的 所有分子都是双特异性的。几项研究已证明双特异性单链双抗体在细菌 中以可溶和活性形式表达，其中大多数纯化的分子呈现为单体(参见 Holliger，P.和G.Winter，Cancer Immunol Immunother，1997.45(3-4)： 第128-30页；Wu，A.M.，等人，Immunotechnology，1996.2(1)：第 21-36页；Pluckthun，A.和P.Pack，Immunotechnology，1997.3(2)： 第83-105页；Ridgway，J.B.，等人，Protein Eng，1996.9(7)：第617-21 页)。因此，单链双抗体组合了串联scFvs(所有单体都是双特异性的) 和双抗体(在细菌中可溶性表达)的优点。
更近地，双抗体已与Fc融合以产生更Ig样的分子，称为双-双抗体 (di-diabody)(参见Lu，D.，等人，J Biol Chem，2004.279(4)：第 2856-65页)。此外，已描述了在IgG重链中包含2个Fab重复且能够 结合4个抗原分子的多价抗体构建体(参见WO 0177342A1，和Miller， K.，等人，J Immunol，2003.170(9)：第4854-61页)。
本领域需要能够结合2种或更多抗原的改良的多价结合蛋白。本发 明提供了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族。
发明概述
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价结合蛋白。本发明提供 了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多肽链的结合蛋白，其中所 述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个可变 结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸 或多肽，X2代表Fc区和n是0或1。在优选实施方案中，结合蛋白中 的VD1和VD2是重链可变结构域。更优选地，重链可变结构域选自鼠 重链可变结构域、人重链可变结构域、CDR嫁接的重链可变结构域、和 人源化重链可变结构域。在优选实施方案中，VD1和VD2能够结合相 同抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合不同抗原。优选 地C是重链恒定结构域。更优选地X1是接头，条件是X1不是CH1。 最优选地X1是选择下述的接头：AKTTPKLEEGEFSEAR； AKTTPKLEEGEFSEARV；AKTTPKLGG；SAKTTPKLGG； AKTTPKLEEGEFSEARV；SAKTTP；SAKTTPKLGG；RADAAP； RADAAPTVS；RADAAAAGGPGS；RADAAAA(G4S)4；SAKTTP； SAKTTPKLGG；SAKTTPKLEEGEFSEARV；ADAAP；ADAAPTVSIFPP； TVAAP；TVAAPSVFIFPP；QPKAAP；QPKAAPSVTLFPP；AKTTPP； AKTTPPSVTPLAP；AKTTAP；AKTTAPSVYPLAP；ASTKGP； ASTKGPSVFPLAP，GGGGSGGGGSGGGGS；GENKVEYAPALMALS； GPAKELTPLKEAKVS；和GHEAAAVMQVQYPAS。优选地X2是Fc区。 更优选地X2是变体Fc区。
在优选实施方案中，上文公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多 肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变 结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是 接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区。
在另一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是轻链可变结构 域。优选地轻链可变结构域选自鼠轻链可变结构域、人轻链可变结构域、 CDR嫁接的轻链可变结构域、和人源化轻链可变结构域。在一个实施方 案中，VD1和VD2能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VD1和 VD2能够结合不同抗原。优选地C是轻链恒定结构域。更优选地X1是 接头，条件是X1不是CL1。优选地X1是选择下述的接头： AKTTPKLEEGEFSEAR；AKTTPKLEEGEFSEARV；AKTTPKLGG； SAKTTPKLGG；AKTTPKLEEGEFSEARV；SAKTTP；SAKTTPKLGG； RADAAP；RADAAPTVS；RADAAAAGGPGS；RADAAAA(G4S)4； SAKTTP；SAKTTPKLGG；SAKTTPKLEEGEFSEARV；ADAAP； ADAAPTVSIFPP；TVAAP；TVAAPSVFIFPP；QPKAAP； QPKAAPSVTLFPP；AKTTPP；AKTTPPSVTPLAP；AKTTAP； AKTTAPSVYPLAP；ASTKGP；和ASTKGPSVFPLAP。优选地结合蛋白 不包含X2。
在优选实施方案中，上文公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多 肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变 结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是 接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含2条多肽链的结合蛋 白，其中所述第一条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重 链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且所 述第二条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一 个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构 域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。最优选地双 重可变结构域(DVD)结合蛋白包含4条多肽链，其中首先2条多肽链 分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变 结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是 接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且其次2条多肽链分别包含 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域， VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条 件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。此种双重可变结构域(DVD)蛋 白具有4个抗原结合部位。
在另一个优选实施方案中，上文公开的结合蛋白能够结合一种或多 种靶。优选地靶选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。优选地结合 蛋白能够调节一种或多种靶的生物学功能。更优选地结合蛋白能够中和 一种或多种靶。本发明的结合蛋白能够结合选自淋巴因子、单核因子和 多肽激素的细胞因子。在具体实施方案中，结合蛋白能够结合选自下述 的细胞因子对：IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18，TNFα和IL-23，TNFα 和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF 和IL-17；和TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；IL-13和 IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13 和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13 和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；和TNFα 和PGE4，IL-13和PED2，TNF和PEG2。在另一个实施方案中，本发明 的结合蛋白能够结合选自下述的靶对：CD138和CD20；CD138和CD40； CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38 和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CSPGs和RGM A；CTLA-4 和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；IL-12和TWEAK；IL-13 和IL-1β；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp 和RGM A；PDL-1和CTLA-4；RGM A和RGM B；Te38和TNFα；TNFα 和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和 IL-12p40；和TNFα和RANK配体。
在一个实施方案中，能够结合人IL-1α和人IL-1β的结合蛋白包含 选自SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.45、 SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、和SEQ ID NO.59的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、 和SEQ ID NO.60的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能 够结合鼠IL-1α和鼠IL-1β的结合蛋白包含DVD重链氨基酸序列SEQ ID NO.105和DVD轻链氨基酸序列SEQ ID NO.109。
在一个实施方案中，能够结合IL-12和IL-18的结合蛋白包含选自 SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、和 SEQ ID NO.114的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.96、和SEQ ID NO.116的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD20和CD3的结合蛋白包含DVD 重链氨基酸序列SEQ ID NO.97和DVD轻链SEQ ID NO.101。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自下述的1种、 2种或更多细胞因子、细胞因子相关蛋白、和细胞因子受体：BMP1、 BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、 CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、 FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、 FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、 FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、 IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1 (ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、 IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、 IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、 IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA (TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5 (CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8 (CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、 TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、 VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、 IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、 IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、 IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、 IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、 AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN、和THPO。
本发明的结合蛋白能够结合选自下述的一种或多种趋化因子、趋化 因子受体、和趋化因子相关蛋白：CCL1(I-309)、CCL2(MCP -1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、 CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、 CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、 CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、 CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26 (嗜伊红粒细胞趋化蛋白-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1 (GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、 CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(I-TAC)、 CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化蛋 白)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、 CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、 CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、 GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB (IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、 CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、 C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、 IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、 TREM2、和VHL。本发明的结合蛋白能够结合选自整联蛋白的细胞表 面蛋白。本发明的结合蛋白能够结合选自激酶和蛋白酶的酶。本发明的 结合蛋白能够结合选自淋巴因子受体、单核因子受体、和多肽激素受体 的受体。
在优选实施方案中，结合蛋白是多价的。更优选地结合蛋白是多特 异性的。上文所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来 看需要的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(1)经由细胞 比二价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)，所述细胞表达抗体与 之结合的抗原；(2)是激动剂抗体；和/或(3)诱导表达多价抗体能够 与之结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异 性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，经由表达 抗体与之结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/ 或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文 所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展示这些特性中的一种或多种 中的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的一种或多种，但如本 文所述构建为多价结合蛋白时可以赋予这些特性。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振测量的，本发明的 结合蛋白具有的对于一种或多种靶的结合速率(on rate)常数(Kon) 选自：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约 105M-1s-1；和至少约106M-1s-1。优选地，如通过表面等离子体共振测量 的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有的结合速率常数(Kon) 为102M-1s-1-103M-1s-1；103M-1s-1-104M-1su；104M-1s-1-105M-1s-1；或 105M-1s-1-106M-1s-1。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振测量的，结合蛋白 具有的对于一种或多种靶的解离速率(off rate)常数(Koff)选自：至 多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；和至多约10-6s-1。优选地， 如通过表面等离子体共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或 多种靶的解离速率常数(Koff)为10-3s-1-10-4s-1；10-4s-1-10-5s-1；或 10-5s-1-10-6s-1。
在另一个实施方案中，结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离常 数(KD)选自：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约 10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；和至多10-13M。优选地，本 发明的结合蛋白具有的对于IL-12或IL-23的解离常数(KD)为10-7M -10-8M；10-8M-10-9M；10-9M-10-10M；10-10-10-11M；10-11M- 10-12M；或10-12-M 10-13M。
在另一个实施方案中，上文所述的结合蛋白是进一步包含选自下述 的试剂的缀合物：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。优选 地显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、 磁性标记、和生物素。更优选地显像剂是选自下述的放射性标记：3H、 14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、和153Sm。优选地， 治疗或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因 子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素、和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，上文所述的结合蛋白是结晶结合蛋白且作为 晶体存在。优选地，晶体是无载体的药学控释晶体。更优选地，结晶结 合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。最优选 地，结晶结合蛋白保留生物活性。
在另一个实施方案中，上文所述的结合蛋白是糖基化的。优选地糖 基化是人糖基化模式。
本发明的一个方面涉及编码上文公开的任何一种结合蛋白的分离 的核酸。进一步的实施方案提供包含上文公开的分离的核酸的载体，其 中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等人，Nucleic Acids Research 2002，第30卷，No.2)；pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT；pEFBOS (Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research第18卷， No.17)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO，pEF6 TOPO和pBJ。
在另一个方面，宿主细胞用上文公开的载体转化。优选地宿主细胞 是原核细胞。更优选地宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在相关实施方 案中，宿主细胞是真核细胞。优选地真核细胞选自原生生物细胞、动物 细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地宿主细胞是哺乳动物细胞，包括 但不限于，CHO和COS；或真菌细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆虫细胞例如Sf9。
本发明的另一个方面提供了生产上文公开的结合蛋白的方法，所述 方法包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养同样在上文公 开的任何一种宿主细胞。优选地通过这种方法生产的50％-75％的结合 蛋白是双重特异性四价结合蛋白。更优选地通过这种方法生产的75％- 90％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。最优选地生产的90％-95 ％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。
另一个实施方案提供了根据上文公开的方法生产的结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物 包含制剂，所述制剂依次包含如上文公开的结晶结合蛋白和成分；以及 至少一种聚合载体。优选地聚合载体是选自下述的一种或多种的聚合 物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚 乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二 氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、 聚有机磷氰、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯 基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生 物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、 硫酸化多糖(polyeaccharides)、掺合物及其共聚物。优选地，成分选 自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、 甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物 的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的上文公开的组合物的步 骤。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含如上文公开的结 合蛋白和药学可接受的载体。在进一步的实施方案中，药物组合物包含 用于治疗病症的至少一种另外的治疗剂。优选地另外的试剂选自：治疗 剂，显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗 体或VEGF-trap)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)； 共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)； 粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-1Abs、抗E/L选择蛋白Abs、 小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、 抗TNF、抗IL-6/细胞因子受体抗体)；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素； FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂， 麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部 麻醉剂，神经肌肉阻断剂；抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促 蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制 剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药， 刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物， 细胞因子，和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有病症的人受试者的方 法，在所述病症中能够由上文公开的结合蛋白结合的一种或多种靶是有 害的，所述方法包括给人受试者施用上文公开的结合蛋白，从而使得人 受试者中的一种或多种靶的活性被抑制且达到治疗。优选地病症选自关 节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛 皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn 氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮 喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排 斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬 化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢 性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、 中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得 性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、 心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性 II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、 斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthopathy)、关节病、 Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、 衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病 (spondyloarthopathy)、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、 自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性 IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶 性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤 念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝 炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙 型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张 型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原 性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性 间质性肺病、混合性结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质 性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺 病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、氏病相关性肺病、强直性脊柱 炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、 药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、 慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性 关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼 疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导 的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与 器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、 骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白 细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、 肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆 病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发 性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、 Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿 性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、氏综合征、Takayasu氏 病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫 性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状 腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、 原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、 白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、 choleosatatis、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变 态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精 神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的 疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺 和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症 (Abetalipoprotemia)、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性 白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、 急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial) 异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性 接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、 肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗cd3 治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主(aordic)和周围性动脉瘤 (aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、 共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻 滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导 阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、 心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病 症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性 白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白 血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、 结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、 冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、 细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementia pugilistica)、脱髓鞘 病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动 脉硬化性(ateriosclerotic)疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性 心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体 的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心 内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束 和小脑病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴组织细胞增多症、 胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真 菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移 植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的 肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、 枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合 征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常 (arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动 障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、 下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、 抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行 性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再 灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、 卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓 系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿(lymphederma)、疟疾、 恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌 血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、 单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内 分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血 性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神 经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动 脉及其分支闭塞、闭塞性(occulsive)动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/ 附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、 骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、 甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性 动脉粥样硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫 血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官 巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注 后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核 上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现 象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾 血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞 蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清阴性关节病、中风、镰状细胞贫 血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体 瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链 球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅 毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合征、全身发作 性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭 塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反 应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏 瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性 颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细 胞(hemaphagocytic)综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、 任何器官或组织的异种移植排斥。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方 法包括在如上文讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用上文公 开的任何一种结合蛋白的步骤。在优选实施方案中，第二种试剂选自布 地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水 杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉 秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂， 抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制 剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF 抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、 CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素， FK 506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固 醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂， 肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换 酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传导抑制剂，金属蛋白酶抑 制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂， 可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体， sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 和TGFβ。
在优选实施方案中，上文公开的药物组合物经由选自下述的至少一 种模式给受试者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结 肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、 胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、 胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、 舌下、鼻内、和经皮。
本发明的一个方面提供针对本发明的至少一种结合蛋白的至少一 种抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白质或肽，所述 分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于，重或轻链的至少一 个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链 或轻链恒定区，构架区，或；其可以掺入本发明的结合蛋白内的任何部 分。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自下述的一种 或多种靶：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1； ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1； AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4； ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2； BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)； BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A； BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)； C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6/JAB61)；CCL1(I-309)；CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)； CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-1d)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)； CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20 (MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)； CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)；CCL25 (TECK)；CCL26(嗜伊红粒细胞趋化蛋白-3)；CCL27(CTACK/ILC)； CCL28；CCL3(MIP-1a)；CCL4(MIP-1b)；CCL5(RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1； CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3 (CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)； CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22； CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40； CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B； CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘着蛋白)；CDH10； CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8； CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21Wapl/Cipl)；CDKN1B(p27Kipl)；CDKN1C；CDKN2A (p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA； CHGB；壳多糖酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5； CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密蛋白-7)；CLN3； CLU(簇蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1； COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB (组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)； CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13； CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5 (ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5； CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCL1；DPP4； E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2； ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG； ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2； FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B； FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20； FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)； FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纤 连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)； GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1； GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81 (FKSG80)；GRCC10(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1； HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1； 组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A； ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6； IFNA7；IFNB1；IFNγ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2； IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12； IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14； IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1； IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8； IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1； IL1RL2 IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2； IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB； IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST (糖蛋白130)；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R； ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2； ITGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整联蛋 白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5 (GC Box BP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15； KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)； KRT2A；KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦蛋白)； Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)； LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)； MDK；MIB1；中期因子；MIF；MIP-2；MKI67(Ki-67)；MMP2；MMP9； MS4A1；MSMB；MT3(金属硫蛋白(metallothionectin)-III)；MTSS1； MUC1(粘蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1； NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)； NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2； NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1； NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2； NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2； NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR； PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF； PGR；磷酸聚糖(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG； PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC； PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2 (p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)； ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白 (mammaglobin)2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYE1(内皮单核 细胞活化细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5(乳 腺丝抑蛋白)；SERPINE1(PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2； SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1； STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK； TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2； TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO； TIE(Tie-1)；TIMP3；组织因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5； TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3； TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B； TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40 配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27 配体)；TNFSF8(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP； Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Iia)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD； TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2； TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖； VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)；XCL2(SCM-1b)； XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；和ZFPM2。
附图简述
图1A是双重可变结构域(DVD)-Ig构建体的示意图示，且显示了 从2种亲本抗体产生DVD-Ig的策略；图1B是构建体DVD1-Ig、DVD2-Ig， 以及来自杂交瘤克隆2D13.E3(抗-IL-1α)和13F5.G5(抗-IL-1β)的2 种嵌合单特异性抗体的示意图示。
发明详述
本发明涉及能够2种或更多抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。具 体而言，本发明涉及双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其药物 组合物、以及用于制备此类DVD-Igs的核酸、重组表达载体和宿主细胞。 本发明还包含了使用本发明的DVD-Igs在体外或体内检测特异性抗原 的方法。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领 域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而， 在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来 定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语 应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。 此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具 体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及 包含超过一个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、 微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术 是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和 技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所 述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。 酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本 文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药 物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通 常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配 制、和递送、以及患者治疗。
本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋 白质”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽” 包含天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽 可以是单体或聚合的。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其衍生起源或来源不与 天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随； 基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达； 或在自然界中不存在的蛋白质或多肽。因此，化学合成或在不同于其天 然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离 的”。蛋白质还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术， 使得基本上不含天然结合的组分。
如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知 的蛋白质纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分 的过程。
如本文使用的，“生物学活性”指抗原的所有固有生物学特性。生物 学特性包括但不限于结合受体；诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其 他细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶促活性。
如本文使用的，关于抗体、蛋白质、或肽与第二种化学种类相互作 用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种 类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且 与特定蛋白质结构结合而不是一般地与蛋白质结合。如果抗体对表位 “A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或 游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链-2条重(H) 链和2条轻(L)链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的 基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此类突变体、 变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨 论。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。 每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定 区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称 为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域 点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，以下列顺序从氨 基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完 整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc 区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域-CH2结构域和CH3 结构域，且任选包含CH4结构域。Fc区中改变抗体效应子作用的氨基 酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5,648,260； 5624821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子作用，例如细胞因子 诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗 原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些 效应子作用对于治疗抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或 甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs 和补体Clq结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体 循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基 在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子作用 被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化来 介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人，Nature；264：415-20； Thies等人，1999 J Mol Biol；293：67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基 突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责 CH3二聚化的残基已得到鉴定(Dall’Acqua 1998 Biochemistry 37： 9266-73.)。因此，可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现 关于IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman 1978 Ann Immunol 129：855-70.；Biewenga等人，1983 Clin Exp Immunol 51：395-400)。 FcRn：Ig Fc区的化学计量已测定为2：1(West等人，2000 Biochemistry 39：9698-708)，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人，1994 Eur J Immunol；24：542-548.)。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其FcRn 结合没有更大的不利作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3 b 折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的 外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以 在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基 在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的 二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)， 指保留与抗原特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的 抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以 是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2种或更多抗原特异性 结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′) 2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii) 由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结 构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341： 544-546，Winter等人，PCT公开WO 90/05144A1，引入本文作为参考)， 它包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外， 尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使 用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条 蛋白质链制备，在所述单条蛋白质链中VL和VH区配对以形成单价分 子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242： 423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85： 5879-5883)。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分” 内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性 抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短 而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条 链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，P. 等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak.R.J 等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。此种抗体结合部分是本领域 已知的(Kontermann和Dubel eds.，Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN 3-540-41354-5)。此外单 链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”， 所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata 等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。
术语“多价结合蛋白”在本说明书自始至终用于指包含2种或更多抗 原结合部位的结合蛋白。多价结合蛋白优选工程改造为具有3个或更多 抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白” 指能够结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白。本发明的双重可变结 构域(DVD)结合蛋白包含2个或更多抗原结合部位，且是四价或多价 结合蛋白。DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异 性的，即能够结合2种或更多抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻 链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD Ig。每一半DVD Ig包含重链 DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包 含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合部位总共6个 涉及抗原结合的CDRs。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体， 四源杂交瘤技术(参见Milstein，C.和A.C.Cuello，Nature，1983.305 (5934)：第537-40页)，2种不同mAbs的化学缀合(参见Staerz， U.D.等人，Nature，1985.314(6012)：第628-31页)，或结进孔或在 Fc区中引入突变的类似方法(参见Holliger，P.，T.Prospero和G. Winter，Proc Natl Acad Sci U S A，1993.90(14)：第6444-8.18页)， 从而导致其中只有一种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白 种类。通过分子功能，双特异性抗体结合其2个结合臂之一(1对HC/LC) 上的一种抗原(或表位)，且结合其第二个臂(不同对的HC/LC)上的 不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗 原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单 价的。
如本文使用的，术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每 一个中(一对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见 PCT公开WO 02/02773)。因此双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗 原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每 种抗原是二价的。
结合蛋白的“功能性抗原结合部位”是能够结合靶抗原的结合部位。 抗原结合部位的抗原结合亲和力不必与抗原结合部位由其衍生的亲本 抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评估与抗原结合 的抗体的多种方法中的任何一种测量的。此外，本文的多价抗体的每个 抗原结合部位的抗原结合亲和力无需在量上相同。
术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的蛋白质的一般术语，所述 蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞群体。此类细胞因子的例子是 淋巴因子、单核因子、和常规的多肽激素。在细胞因子中包括的是生长 激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁 腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激 素例如促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，和黄体生成素(LH)； 肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因 子α和β；米勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素； 血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子 例如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和 TGF-β；胰岛素样生长因子-1和-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导 因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细 胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF (G-CSF)；白细胞介素(ILs)例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23； 肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子包括LIF和kit配 体(KL)。如本文使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组 细胞培养的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。
术语“接头”用于指包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多 肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所 周知的(参见例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。 优选的接头包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR； AKTTPKLEEGEFSEARV；AKTTPKLGG；SAKTTPKLGG； AKTTPKLEEGEFSEARV；SAKTTP；SAKTTPKLGG；RADAAP； RADAAPTVS；RADAAAAGGPGS；RADAAAA(G4S)4；SAKTTP； SAKTTPKLGG；SAKTTPKLEEGEFSEARV；ADAAP；ADAAPTVSIFPP； TVAAP；TVAAPSVFIFPP；QPKAAP；QPKAAPSVTLFPP；AKTTPP； AKTTPPSVTPLAP；AKTTAP；AKTTAPSVYPLAP；ASTKGP； ASTKGPSVFPLAP。
免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链 恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质抗体群体中获得 的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天 然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与 一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对 照，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解 释为需要通过任何具体方法生产抗体。
如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有来源于人种系免疫球蛋 白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs 且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例 如，在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。 然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一种哺乳 动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
如本文使用的，术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表 达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达 载体表达的抗体(在下文部分IIC中进一步描述)，从重组、组合人抗 体文库中分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70； Azzazy H.和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H. 和Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)，从对于人免疫 球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如， Taylor，L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：593-597； Little M.等人，(2000)Immunology Today 21：364-370)，或通过包括 使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、 表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋 白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体 实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞 诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于 人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的 人抗体种系谱内非天然存在的序列。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDRs中具有一种或多种改 变的抗体，与没有这些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对抗 原的亲和力改善。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚 至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序来产生。 Marks等人，BidlTechnology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL 结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述： Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier 等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004 (1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和 Hawkins等人，J.Mol.BioL 226：889-896(1992)。
术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及 来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重 和轻链可变区的抗体。
术语“CDR嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序 列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列用另一 个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一 个或多个鼠CDRs(例如，CDR3)已用人CDR序列替换。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链 可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人 样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接 的抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列以替换相应的非人 CDR序列。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使 用。本领域公认的这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比 抗体的重和轻链可变区，或其抗原结合部分中的其他氨基酸残基更可变 (即高变)(Kabat等人，(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和 Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开 号91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31- 35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95 -102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24-34，对 于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置89-97。
如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。 在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可 变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指 在能够结合抗原的单个可变区中出现的3个CDRs的组。这些CDRs的 确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health， Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于 抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精 确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事 (Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等 人，Nature 342：877-883(1989))发现Kabat CDRs内的某些亚部分采 取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。 这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别 指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs 的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum (J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。再其他的CDR边界定 义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管 按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测 或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些 系统中的任何一种限定的CDRs，尽管优选的实施方案使用Kabat或 Chothia限定的CDRs。
如本文使用的，术语“构架”或“构架序列”指减去CDRs的可变区的 剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统来决定，所以对 构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2 和-L3，以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的构架区 分成在每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位 于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3 和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人 提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR′s。 如本文使用的，FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个 亚区中的2个或更多。
如本文使用的，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细 胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述 成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变(参见，例如， Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis 等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。由本发明的各种实施 方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可 能保存物种中个体的基本氨基酸序列结构特征，因此当在那个物种中治 疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
如本文使用的，术语“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似 物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的 氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互 补决定区(CDR)。如本文使用的，在CDR上下文中的术语“基本上” 指具有的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、 至少98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源 化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab′、 F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫 球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫 球蛋白共有序列的那些。优选地，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋 白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人 源化抗体包含轻链以及重链的至少可变结构域。抗体还可以包括重链的 CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体 只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。 在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人 源化重链。
如本文使用的，术语“中和”指结合蛋白特异性结合细胞因子时，中 和细胞因子的生物学活性。优选地中和结合蛋白结合细胞因子且使其生 物学活性减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
术语“活性”包括活性例如DVD-Ig对于2种或更多抗原的结合特异 性/亲和力。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何 多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖 侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些 实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是 由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分 子复杂混合物中优先识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。
如本文使用的，术语“表面等离子体共振”指通过检测生物传感器矩 阵内的蛋白质浓度改变，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)，允许分析实时生物特异性 相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见U.，等人， (1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；U.，等人，(1991) Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等人，(1995)J.Mol.Recognit. 8： 125-131；和Johnnson，B.，等人，(1991)Anal.Biochem.198： 268-277。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Kon”意指抗体与抗原结合以 形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Koff”意指抗体从抗体/抗原复 合物中解离的解离速率常数。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互 作用的解离常数。
如本文使用的，术语“标记的结合蛋白”指具有标记掺入的蛋白质， 所述标记为结合蛋白的鉴定作准备。优选地，标记是可检测标记，例如， 掺入放射标记的氨基酸或使生物素化部分与多肽附着，所述生物素化 (biotinyl)部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学 或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测。 关于多肽的标记例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素 (例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或 153Sm)；荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶促标记 (例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记； 生物素化部分；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉 链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)； 和磁性试剂，例如钆螯合物。
术语“缀合物”指与第二化学部分，例如治疗或细胞毒性剂化学连接 的结合蛋白例如抗体。术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物混合 物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。优选地，治疗或细胞 毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽 D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、 长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二 酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普 鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或 其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式例如 无定形固态或液体晶态。晶体由常规、重复、三维排列的原子、离子、 分子(例如，蛋白质例如抗体)、或分子部件(例如，抗原/抗体复合物) 组成。这些三维排列根据本领域众所周知的特异性数学关系排列。晶体 中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学 对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3 个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix， A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第2版，第201-16页，Oxford University Press，New York， New York，(1999)。＂
如本文提及的，术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式， 所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰 形式。该术语包括单和双链形式的DNA，但优选是双链DNA。
如本文使用的，术语“分离的多核苷酸”应意指下述多核苷酸(例如， 基因组的、cDNA、或合成来源的，或其某一组合)，由于其来源，“分 离的多核苷酸”：不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之结合的全部 或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地 连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
如本文使用的，术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核 酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以 连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中 另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引 入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和 游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引 入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组 一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因 表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载 体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形 式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用 的载体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达载体，例如提 供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随 病毒)。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方 式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这 样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完 成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反 式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的，术 语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所需的 多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增 强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细 胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增 强蛋白质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列。此种控制 序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般 包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种 控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其 存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组 分，例如前导序列和融合配偶体序列。
如本文定义的，“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方 法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发 生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的 任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但 不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细 胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分 复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限 时间段的细胞。
如本文使用的，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指 其中已引入外源DNA的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定的受试 细胞，还意指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世 代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍 包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。优选地宿主细胞包括选 自任何生物界的原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物、真菌、 植物和动物细胞。最优选地宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆 菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌 细胞啤酒糖酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化 (例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的 说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序 一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中 所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨 论。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.(1989))，所述参考文献为了任何目的引入本文作为参考。
如本领域已知和如本文使用的，“转基因生物”指具有包含转基因的 细胞的生物，其中引入生物(或生物祖先)内的转基因表达在该生物中 非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且 可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码 的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
术语“调节”和“调谐”可互换使用，且如本文使用的，指目的分子活 性(例如，细胞因子的生物学活性)中的变化或改变。调谐可以是目的 分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能 包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
相应地，如本文使用的，术语“调节剂”是能够改造或改变目的分子 活性或功能(例如，细胞因子的生物学活性)的化合物。例如，与在不 存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起 分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂 是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不 限于，蛋白质、肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或小有机 分子。肽体在例如WO01/83525中描述。
如本文使用的，术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在 激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或 功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，多肽、 核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时， 与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子 某一活性或功能量级中的减少的调节剂。具体目的拮抗剂包括阻断或调 节抗原生物学或免疫活性的那些。抗原拮抗剂和抑制剂可以包括但不限 于，蛋白质、核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“有效量”指疗法的量，其足以减少或改善病症 或其一种或多种症状严重性和/或持续时间，预防病症进展，引起病症消 退，预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展，检测 病症，或增强或改善另一种疗法(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗 作用。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的， “生物学样品”包括但不限于，来自生物(living thing)或从前生物的任 何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和 其他动物。此物质包括但不限于，血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、 组织、骨髓、淋巴结和脾。
I.DVD结合蛋白的产生
本发明涉及能够结合一种或多种靶的双重可变结构域结合蛋白及 其制备方法。优选地结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第 二个可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc 区且n是0或1。本发明的结合蛋白可以使用各种技术产生。本发明提 供了产生结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法。
A.亲本单克隆抗体的产生
DVD结合蛋白的可变结构域可以从亲本抗体获得，包括能够结合 目的抗原的多克隆和单克隆抗体。这些抗体可以是天然存在的或可以通 过重组技术产生。
单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使 用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体 可以使用杂交瘤技术来制备，包括本领域已知和例如Harlow等人， Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第2版1988)；Hammerling，等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献整体引入 作为参考)中教导的那些。如本文使用的，术语“单克隆抗体”不限于通 过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单个克隆，包括 任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生其的方法的抗体。如下文 实施例1中讨论的，杂交瘤被选择、克隆和进一步筛选所需特性，包括 强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体 内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩张。 选择、克隆和扩张杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在 优选实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个优选实施方案中，杂 交瘤在非人、非小鼠物种，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中生产。 在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表 达能够结合特定抗原的抗体的人细胞融合。
重组单克隆抗体也使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM) 的程序从单个、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号 5,627,052、PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人，(1996)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中所述。在这种方法中，鉴定分泌目 的抗体的单细胞，例如来源于免疫动物的淋巴细胞，且通过逆转录酶 PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，随后可以在合适的免疫球蛋 白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS 或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来 源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析 和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对目的抗原的抗体的细 胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外处理，例如通过体外亲 和力成熟法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中 描述的那些。
单克隆抗体也通过用目的抗原免疫非人动物来生产，所述非人动物 包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在优选实施方案中，非人动物是 XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠 抗体产生方面有缺陷的工程改造小鼠品系。参见，例如，Green等人， Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、 5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。 还参见于1991年7月25日公开的WO 91/10741，于1994年2月3日公 开的WO 94/02602，均于1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，于1998年4月23日公开的WO 98/16654，于1998年6月11 日公开的WO 98/24893，于1998年11月12日公开的98/50433，于1999 年9月10日公开的WO 99/45031，于1999年10月21日公开的WO 99/53049，于2000年2月24日公开的WO 00 09560，和于2000年6月 29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠生产全人抗体的 成体样人谱，且产生抗原特异性人Mabs。通过引入兆碱基大小的、人 重链基因座和x轻链基因座的的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转 基因小鼠包含约80％人抗体谱。参见Mendez等人，Nature Genetics 15： 146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)， 所述参考文献的公开内容在此引入作为参考。
体外方法也可以用于制备亲本抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有 所需结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选方法是本领域已 知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，Ladner等人，美国 专利号5,223,409；Kang等人，PCT公开号WO 92/18619；Dower等人， PCT公开号WO91/17271；Winter等人，PCT公开号WO 92/20791； Markland等人，PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人，PCT公开号 WO 93/01288；McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047；Garrard等 人，PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9： 1370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse 等人，(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990) 348：552-554；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins 等人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人， (1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982， US专利申请公开20030186374，和PCT公开号WO 97/29131，所述每 个参考文献的内容都引入本文作为参考。
本发明的亲本抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法 来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上 展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。特别地，此种噬菌 体可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合 结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行 选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗 原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状 噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结 构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白 质重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下 述参考文献中公开的那些：Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182： 41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)； Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等 人，Gene 187 9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57： 191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426； 5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047； 5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和 5,969,108；所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
如上文参考文献中所述，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区 可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完 整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动 物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。 例如，也可以采用重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，其中使 用本领域已知的方法，例如下述参考文献中公开的那些：PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)； 和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等人，Science 240： 1041-1043(1988)(所述参考文献整体引入作为参考)。可以用于生产 单链Fvs和抗体的技术例子包括下述参考文献中描述的那些：美国专利 4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88 (1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；以及Skerra等 人，Science 240：1038-1040(1988)。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于 筛选大组合文库的其他方法可以应用于亲本抗体的鉴定。如Szostak和 Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W. (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中描述的，一类可 替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白质融合物表达的表 达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素-肽基受体抗 生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白质之间 产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质， 例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从 mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此类文库筛选回 收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上所述的重组方法(例 如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物 的另外筛选循环，或通过如上所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他 方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引 入最初选择的序列内。
在另一种方法中，亲本抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法 来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母 细胞壁，且将它们显示在酵母表面上。特别地，此种酵母可以用于展示 由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用 于制备亲本抗体的酵母展示方法的例子包括在Wittrup等人，美国专利 号6,699,658中公开的那些，所述专利引入本文作为参考。
上述抗体可以进一步进行修饰以产生CDR嫁接的和人源化的亲本 抗体。CDR嫁接的亲本抗体包含来自人抗体的重和轻链可变区序列，其 中VH和/或VL的一个或多个CDR区替换为能够结合目的抗原的鼠抗体 的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模 板。然而，在此种构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的 一些丧失。人抗体与最初鼠抗体越同源，使鼠CDRs与人构架组合将在 CDRs中引入可减小亲和力的变形的可能性越小。因此，选择替换除 CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％ 的序列同一性是优选的。除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70％的序 列同一性是更优选的。除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75％的序列 同一性是更加优选的。除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80％的序列 同一性是最优选的。用于生产此种抗体的方法是本领域已知的(参见EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101； 和5,585,089)，镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP 592,106； EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)； Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska 等人，PNAS 91：969-973(1994))，和链改组(美国专利号5,565,352)。
人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有 来自非人物种的一个或多个互补性决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋 白分子的构架区。已知的人Ig序列在下述网站上公开，例如，
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；
www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；
www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；
www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-
heidelberg.de/SD/TT/TT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；
www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；
www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-
logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；
www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；
www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；
www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-
marburg.de/.about.rek/AEP-Start,html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-
hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；
www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；
abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-
inar/Slide 01.btml；www.cryst.bbk.ac.uk/.about ubcg07s/；
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-
umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-
pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et
al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，
其各自整体引入本文作为参考。如本领域已知的，此种输入的序列可以 用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解 离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代， 以改变，优选改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法 鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合 重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。 (参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人， Nature 332：323(1988)，所述参考文献整体引入本文作为参考)。三 维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说 明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序 是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能 发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残 基。以这种方式，可以选择FR残基且从共有和输入序列组合，从而使 得达到所需抗体特征例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而 言，CDR残基直接且最重要地涉及抗原结合的影响。抗体可以使用本领 域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那 些：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239： 1534(1988))，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia 和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)， Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka 等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人， PNAS 91：969-973(1994)；PCT公开WO 91/09967，PCT/：US98/16280， US96/18978，US91/09630，US91/05939，US94/01234，GB89/01334， GB91/01134，GB92/01755；WO90/14443，WO90/14424，WO90/14430， EP229246，EP592,106；EP519,596，EP239,400，美国专利号5,565,332、 5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、 5，766886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、 5,585,089、5,225,539；4,816,567，所述参考文献各自整体引入本文作为 参考，包括其中引用的参考文献。
亲本单克隆抗体可以选自能够结合特定靶且本领域众所周知的各 种单克隆抗体。这些包括但不限于，抗TNF抗体(美国专利号6,258,562)， 抗IL-12和或抗IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128)；抗IL-18抗体 (US2005/0147610A1)，抗C5，抗CBL，抗CD147，抗gp120，抗 VLA-4，抗CD11a，抗CD18，抗VEGF，抗CD40L，抗Id，抗ICAM-1， 抗CXCL13，抗CD2，抗EGFR，抗TGF-β2，抗E-选择蛋白，抗Fact VII， 抗Her2/neu，抗F gp，抗CD11/18，抗CD14，抗ICAM-3，抗CD80， 抗CD4，抗CD3，抗CD23，抗β2整联蛋白，抗α4β7，抗CD52，抗 HLA DR，抗CD22，抗CD20，抗MIF，抗CD64(FcR)，抗TCRαβ， 抗CD2，抗Hep B，抗CA 125，抗EpCAM，抗gp120，抗CMV，抗gpIIbIIIa， 抗IgE，抗CD25，抗CD33，抗HLA，抗VNR整联蛋白，抗IL-1α抗 IL-1β，抗IL-1受体，抗IL-2受体，抗IL-4，抗IL-4受体，抗IL5，抗 IL-5受体，抗IL-6，抗IL-8，抗IL-9，抗IL-13，抗IL-13受体，抗IL-17， 和抗IL-23(参见Presta LG.2005 Selection，design，and engineering of therapeutic antjbodies J Allergy Clin Immunol.116：731-6和http： //www.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/antibodies.html)。
亲本单克隆抗体还可以选自批准用于在临床试验，或临床用途开发 中使用的各种治疗性抗体。此类治疗性抗体包括但不限于，利妥希玛 (，IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5,736,137)， 批准治疗非何杰金氏淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20，目前 由Genmab开发中的抗CD20，在美国专利号5,500,362中描述的抗C20 抗体，AME-133(Applied Molecular Evolution)，hA20(Immunomedics， Inc.)，HumaLYM(Intracel)，和PRO70769(PCT/US2003/040426， 名称为“Immunoglobulin Variants and Uses Thereof”)，曲妥珠单抗 (trastuzumab)(Genentech)(参见例如美国专利号 5,677,171)，批准治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗 (pertuzumab)(rhuMab-2C4，)，目前由Genentech开发中； 在美国专利号4,753,894中描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(cetuximab) Imclone)(美国专利号4,943,533；PCT WO 96/40210，在 用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(美国专利 号6,235,883)，目前由Abgenix-Immunex-Amgen开发中；HuMax-EGFr (U.S.Ser.No.10/172,317)，目前由Genmab开发中；425，EMD55900， EMD62000，和EMD72000(Merck KGaA)(美国专利号5,558,864； Murthy等人，1987，Arch Biochem Biophys.252(2)：549-60；Rodeck 等人，1987，J Cell Biochem.35(4)：315-20；Kettleborough等人， 1991，Protein Eng.4(7)：773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045；Modjtahedi等人，1993，J.Cell Biophys.1993， 22(1-3)：129-46；Modjtahedi等人，1993，Br J Cancer.1993，67 (2)：247-53；Modjtahedi等人，1996，Br J Cancer，73(2)：228-35； Modjtahedi等人，2003，Int J Cancer，105(2)：273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences，Canada and Centro de Immunologia Molecular， Cuba(美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo等人， 1997，Immunotechnology，3(1)：71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等人， 2003，Proc Natl Acad Sci USA.100(2)：639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；和SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)；阿来组单 抗(alemutuzumab)(，Millenium)，目前批准用于治疗B 细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体；莫罗莫那 (muromonab)-CD3(Orthoclone )，由Ortho Biotech/Johnson 和Johnson开发的抗CD3抗体，替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan) ()，由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体，吉妥珠单抗 奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)()，由Celltech/Wyeth 开发的抗CD33(p67蛋白质)抗体，阿来塞普(alefacept)()， 由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物)，阿昔单抗()，由 Centocor/Lilly开发，巴利昔单抗(basiliximab)()，由Novartis 开发，帕利珠单抗(palivizumab)()由Medimmune开发， 英夫单抗()，由Centocor开发的抗TNFα抗体，阿达木单 抗(adalimumab)()，由Abbott开发的抗TNFα抗体， 由Celltech开发的抗TNFα抗体，依那西普(etanercept)()， 由Immunex/Amgen开发的抗TNFαFc融合物，ABX-CBL，由Abgenix 开发中的抗CD147抗体，ABX-IL8，由Abgenix开发中的抗IL8抗体， ABX-MA1，由Abgenix开发中的抗MUC18抗体，Pemtumomab(R1549， 90Y-muHMFG1)，由Antisoma开发的抗MUC1，Therex(R1550)， 由Antisoma开发中的抗MUC1抗体，AngioMab(AS1405)，由Antisoma 开发中，HuBC-1，由Antisoma开发中，由Antisoma开发中的Thioplatin (AS1407)，(那他珠单抗(natalizumab))，由Biogen开 发中的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体，VLA-1mAb，由Biogen开 发中的抗VLA-1整联蛋白抗体，LTBR mAb，由Biogen开发中的抗淋巴 毒素β受体(LTBR)抗体，CAT-152，由Cambridge Antibody Technology 开发中的抗TGF-β2抗体，J695，由Cambridge Antibody Technology和 Abbott开发中的抗IL-12抗体，CAT-192，由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发中的抗TGFβ1抗体，CAT-213，由Cambridge Antibody Technology开发中的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白1抗体， Lympho 由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences，Inc.开发中的抗Blys抗体，TRAIL-RlmAb，由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences，Inc.开发中的抗 TRAIL-R1抗体，贝伐单抗(bevacizumab)，rhuMAb-VEGF)， 由Genentech开发中的抗VEGF抗体，由Genentech开发中的抗HER受 体家族抗体，抗组织因子(ATF)，由Genentech开发中的抗组织因子 抗体，(奥马佐单抗(omalizumab))，由Genentech开发中的 抗IgE抗体，(依法利珠单抗(efalizumab))，由Genentech 和Xoma开发中的抗CD11a抗体，MLN-02抗体(以前为LDP-02)，由 Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发中，HuMax CD4，由Genmab 开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Genmab和Amgen开发中的抗 IL15抗体，HuMax-Inflam，由Genmab和Medarex开发中，HuMax-Cancer， 由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发中的抗类肝素酶 (heparanase)I抗体，HuMax-Lymphoma，由Genmab和Amgen开发中， HuMax-TAC，由Genmab开发中，IDEC-131，由IDEC Pharmaceuticals 开发中的抗CD40L抗体，IDEC-151(克立昔单抗(clenoliximab))， 由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD4抗体，IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD80抗体，IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD23，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗 巨噬细胞移动因子(MIF)抗体，BEC2，由Imclone开发中的抗独特型 抗体，IMC-1C11，由Imclone开发中的抗KDR抗体，DC101，由Imclone 开发中的抗flk-1抗体，由Imclone开发中的抗VE钙粘着蛋白抗体， (拉贝珠单抗(labetuzumab))，由Immunomedics开发中 的抗癌胚抗原(CEA)抗体，(依帕珠单抗(epratuzumab))， 由Immunomedics开发中的抗CD22抗体，AFP-Cide，由Immunomedics 开发中，MyelomaCide，由Immunomedics开发中，LkoCide，由 Immunomedics开发中，ProstaCide，由Immunomedics开发中，MDX-010， 由Medarex开发中的抗CTLA4抗体，MDX-060，由Medarex开发中的 抗CD30抗体，由Medarex开发中的MDX-070，由Medarex开发中的 MDX-018，(IDM-1)，以及由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发中的抗Her2抗体，，由Medarex和Genmab 开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Medarex和Genmab开发中的 抗IL15抗体，CNTO 148，由Medarex和Centocor/J&J开发中的抗TNFα 抗体，CNTO 1275，由Centocor/J&J开发中的抗细胞因子抗体，MOR101 和MOR102，由MorphoSys开发中的抗细胞间粘附分子1(ICAM-1) (CD54)抗体，MOR201，由MorphoSys开发中的抗成纤维细胞生长因 子受体3(FGFR-3)抗体，(维西珠单抗(visilizumab))， 由Protein Design Labs开发中的抗CD3抗体，由Protein Design Labs开发中的抗γ干扰素抗体，抗α5β1整联蛋白，由Protein Design Labs 开发中，抗IL-12，由Protein Design Labs开发中，ING-1，由Xoma开 发中的抗Ep-CAM抗体，(奥马佐单抗)，由Genentech和Novartis 开发的人源化抗IgE抗体，和MLN01，由Xoma开发中的抗β2整联蛋 白抗体，这个段落中所有上文引用的参考文献都特别引入本文作为参 考。
B.DVD分子的构建：
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子被这样设计，从而使得 来自2种不同亲本mAbs的2个不同轻链可变结构域(VL)通过重组 DNA技术直接或经由短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域。类似地， 重链包含串联连接的2个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结 构域CH1和Fc区(图1A)。
可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗 体通过上述方法中的任何一种产生。在优选实施方案中，可变结构域是 鼠重或轻链可变结构域。更优选地，可变结构域是CDR嫁接的或人源 化的可变重或轻链结构域。最优选地，可变结构域是人重或轻链可变结 构域。
在一个实施方案中，第一个和第二个可变结构域使用重组DNA技 术直接互相连接。在另一个实施方案中，可变结构域经由接头序列进行 连接。优选地连接2个可变结构域。3个或更多可变结构域也可以直接 或经由接头序列进行连接。可变结构域可以结合相同抗原或可以结合不 同抗原。本发明的DVD分子可以包括1个免疫球蛋白可变结构域和1 个非免疫球蛋白可变结构域，例如受体的配体结合结构域，酶活性结构 域。DVD分子也可以包含2个或更多非Ig结构域。
接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。优选地，接头序列选自 AKTTPKLEEGEFSEAR；AKTTPKLEEGEFSEARV；AKTTPKLGG； SAKTTPKLGG；AKTTPKLEEGEFSEARV；SAKTTP；SAKTTPKLGG； RADAAP；RADAAPTVS；RADAAAAGGPGS；RADAAAA(G4S)4； SAKTTP；SAKTTPKLGG；SAKTTPKLEEGEFSEARV；ADAAP； ADAAPTVSIFPP；TVAAP；TVAAPSVFIFPP；QPKAAP； QPKAAPSVTLFPP；AKTTPP；AKTTPPSVTPLAP；AKTTAP； AKTTAPSVYPLAP；ASTKGP；ASTKGPSVFPLAP； GGGGSGGGGSGGGGS；GENKVEYAPALMALS；GPAKELTPLKEAKVS； 和GHEAAAVMQVQYPAS。接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体 结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构 域之间存在天然柔性键合。这种天然键合包含约10-12个氨基酸残基， 由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末 端的4-6个残基促成。本发明的DVD Igs使用CL或CH1的N末端5 -6个氨基酸残基，或11-12个氨基酸残基分别作为DVD-Igs轻链和重 链中的接头来产生。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6 个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，因此可以充当2个可变结 构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的 天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，因此使可能由接头和接点引起的 任何免疫原性大程度地降到最低。
其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但 不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨 基酸残基；轻链接头可以来自Cκ或Cλ；且重链接头可以来源于任何同 种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。 接头序列还可以来源于其他蛋白质例如Ig样蛋白质，(例如，TCR、FcR、 KIR)；基于G/S的序列(例如，G4S重复)；铰链区衍生的序列；和 来自其他蛋白质的其他天然序列。
在优选实施方案中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接 的可变结构域连接。优选地包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒 定结构域连接，且包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域 连接。优选地恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构 域。最优选地DVD重链与Fc区进一步连接。Fc区可以是天然序列Fc 区，或变体Fc区。最优选地Fc区是人Fc区。在优选实施方案中，Fc 区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc 区。
在最优选的实施方案中，将2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多 肽组合，以形成DVD-Ig分子。能够结合特定靶的特异性DVD-Ig分子 的详细描述及其制备方法，在下文实施例部分中提供。
C.DVD蛋白质的生产
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种 来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD重和DNA轻链的 一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各 种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广 泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽 管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的DVD蛋白质，但在真核 细胞中表达DVD蛋白质是优选的，且在哺乳动物宿主细胞中是最优选 的，因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装 配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD蛋白质。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓 鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77：4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO 细胞，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621 中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码DVD蛋 白质的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，DVD蛋白质通过将 宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许DVD蛋白质在宿主细胞中表 达，或更优选地，DVD蛋白质分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。 DVD蛋白质可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。
在用于重组表达本发明的DVD蛋白质的优选系统中，编码DVD重 链和DVD轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细 胞内。在重组表达载体内，DVD重和轻链基因各自与CMV增强子 /AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重 组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择 /扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许 表达DVD重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD蛋白质。使用标准 分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培 养宿主细胞和从培养基中回收DVD蛋白质。更进一步地本发明提供了 合成本发明的DVD蛋白质的方法，其通过在合适的培养基中培养本发 明的宿主细胞直至本发明的DVD蛋白质被合成实现。该方法可以进一 步包括从培养基中分离DVD蛋白质。
DVD-Ig的重要特征是它可以以与常规抗体相似的方式生产和纯 化。DVD-Ig的生产导致具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要 产物，而无恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰。产生“双特 异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其他先前描述方法 不导致单一的主要产物，而是导致装配的无活性、单特异性、多特异性、 多价、全长结合蛋白，和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的 混合物的细胞内或分泌的生产。例如，基于由Miller和Presta(PCT公 开WO2001/077342(A1)描述的设计，存在重和轻链的16种可能组合。 因此只有6.25％的蛋白质可能处于所需活性形式。使用标准层析技术使 完全活性形式的蛋白质与无活性和部分活性形式的蛋白质分离仍有待 证实，所述标准层析技术一般在大规模制备中使用。
令人惊讶的是，本发明的“双重特异性多价全长结合蛋白”的设计导 致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，所述轻链和重链主要装 配成所需“双重特异性多价全长结合蛋白”。
至少50％、优选75％且更优选90％装配且表达的双重可变结构域 免疫球蛋白分子是所需双重特异性四价蛋白质。本发明的这个方面特别 增强了本发明的商业效用。因此，本发明包括在单个细胞中表达双重可 变结构域轻链和双重可变结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长 结合蛋白”的单一主要产物的方法。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变 结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”的 优选方法，其中“主要产物”超过所有装配蛋白质的50％，包含双重可变 结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变 结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产 物”的更优选方法，其中“主要产物”超过所有装配蛋白质的75％，包含 双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变 结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产 物”的最优选方法，其中“主要产物”超过所有装配蛋白质的90％，包含 双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
II.衍生化的DVD结合蛋白：
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的结合蛋白用另 一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)衍生化或连接。例如，本发 明的标记的结合蛋白可以通过使本发明的结合蛋白与一种或多种其他 分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方 式)来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体 或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药学试剂、和/或可以介导结合 蛋白与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标记)结 合的蛋白质或肽。
本发明的结合蛋白可以由之衍生化的有用的可检测试剂包括荧光 化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、 5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。结合蛋白也可以用可检测酶衍生化， 例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当结合蛋白用可检 测酶衍生化时，它通过添加酶用于生产可检测反应产物的另外的试剂进 行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和 二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。结合蛋白也可以用生物素衍 生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检 测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白以及包含此类晶体 的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的 可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结 晶化后保留生物学活性。
本发明的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如WO 02072636 中公开的方法来生产，所述专利引入本文作为参考。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其 抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可 以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可以酶 促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋 白质被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中 具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残 基对Fc结构域的效应子作用有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有 最低限度的作用(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，第11-16页)。 相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可 变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于 空间位阻(Co，M.S.等人，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)， 或导致对抗原的亲和力增加(Wallick，S.C.等人，Exp.Med.(1988)168： 1099-1109；Wright，A.等人，EMBO J.(1991)10：27172723)。
本发明的一个方面涉及产生糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O 或N联糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周 知的技术来产生此类突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合 活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。
在另外一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分的糖基化 得到修饰。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即该抗体缺 乏糖基化)。糖基化可以进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。 此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基 化位点来完成。例如，可以制备导致一个或多个可变区糖基化位点消除 的一个或多个氨基酸置换，从而消除那个位点上的糖基化。此种无糖基 化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法在PCT公开 WO2003016466A2，以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详 细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。
此外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的本发明修饰的 结合蛋白，例如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足 (hypofucosylated)抗体，或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种 改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰 可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成。 具有改变的糖基化机器的细胞已在本领域得到描述，且可以用作在其中 表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而生产具有改变的糖基化的抗 体。参见，例如，Shields，R.L等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740； Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-1，以及欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/5434280，所述参考文献 各自整体引入本文作为参考。
蛋白质糖基化取决于目的蛋白质的氨基酸序列，以及在其中表达蛋 白质的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移 酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于此类因素， 蛋白质糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白质 的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡 萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选地糖基 化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
不同的蛋白质糖基化可以导致不同的蛋白质特征，这是本领域技术 人员已知的。例如，与哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白 质的那种比较，在微生物宿主例如酵母中生产，和利用酵母内源性途径 糖基化的治疗蛋白质的功效可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是 免疫原性的，且在施用后显示在体内减少的半衰期。人和其他动物中的 特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白质从血流中快速清除。其他 不利效应可以包括蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转 运、区室化、分泌、由其他蛋白质或因子识别、抗原性、或变应原性中 的变化。因此，从业者可能更喜欢具有特定糖基化组成和模式的治疗蛋 白质，例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性 细胞中生产的那种的糖基化组成和模式。
不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白质表达可以通过遗传修饰宿主 细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以 产生显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已 进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株 中生产的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞那种 的蛋白质糖基化(美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT 申请WO2005100584 A2)。
除了结合蛋白，本发明还涉及对本发明的此种结合蛋白特异的抗独 特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别独特决定簇的抗体，所述独特决定 簇一般与另一种抗体的抗原结合部分相关。抗Id可以通过用结合蛋白或 其含CDR区免疫动物来制备。免疫的动物将识别，且对免疫抗体的独 特型决定簇应答且产生抗Id抗体。抗Id抗体也可以用作“免疫原”以在 另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗Id抗体。
此外，本领域技术人员将理解，目的蛋白质可以使用宿主细胞文库 来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使 得文库的成员宿主细胞生产具有变体糖基化模式的目的蛋白质。从业者 随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白质。优选地，具 有特定选择的新糖基化模式的蛋白质显示改善或改变的生物学性质。
III.DVD-Ig的用途
已知其与2种或更多抗原结合的能力，本发明的结合蛋白可以用于 检测抗原(例如，在生物样品中，例如血清或血浆)，其中使用常规免 疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或 组织免疫组织化学。DVD-Ig用可检测物质直接或间接标记，以促进结 合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光 材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱 性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括 链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例 子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺 (dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例 子包括鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、 111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm。
本发明的结合蛋白优选能够在体外和体内中和抗原活性。因此，此 种DVD-Igs可以例如，在包含抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在 具有本发明的结合蛋白与其交叉反应的抗原的其他哺乳动物受试者中 用于抑制抗原活性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少受试 者中的抗原活性的方法，所述受试者患有其中抗原活性是有害的疾病或 病症。本发明的结合蛋白可以施用于人受试者用于治疗目的。
如本文使用的，术语“其中抗原活性是有害的病症”预期包括疾病或 其他病症，其中患有该病症的受试者中抗原的存在已显示或怀疑负责病 症的病理生理学或是促进病症恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害 的病症是其中抗原活性减少预期减轻病症症状和/或进展的病症。此种病 症可以例如由患有病症的受试者生物学流体中抗原浓度的增加(例如受 试者血清、血浆、滑液等中抗原浓度的增加)来证实。可以用本发明的 结合蛋白治疗的病症的非限制性例子包括下文以及关于本发明抗体的 药物组合物部分中讨论的那些病症。
本发明的DVD-Igs可以结合一种抗原或多种抗原。此种抗原包括但 不限于，下述数据库中列出的靶，所述数据库引入本文作为参考。这些 靶数据库包括下述列表：
治疗靶(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；
细胞因子和细胞因子受体(http://www.cytokinewebfacts.com/，http: //www.copewithcytokines.de/cope.cgi，和
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.k umamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；
趋化因子(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；
趋化因子受体和GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html，http://www.gpcr.org /7tm/)；
嗅感受器(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；
受体(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；
癌症靶(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；
作为可能的抗体靶的分泌的蛋白(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；
蛋白激酶(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)，和
人CD标记(http: //content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(Zola H，2005 CD molecules 2005：human cell differentiation molecules Blood， 106：3123-6)。
DVD-Igs作为治疗剂以同时阻断2种不同靶以增强功效/安全性和/ 或增加患者覆盖度是有用的。此种靶可包括可溶性靶(IL-13和TNF) 和细胞表面受体靶(VEGFR和EGFR)。它还可以用于诱导肿瘤细胞和 T细胞(Her2和CD3)之间改变方向的细胞毒性用于癌症治疗，或自体 反应细胞或效应(effectoe)细胞之间改变方向的细胞毒性用于自身免疫 /移植，或任何靶细胞和效应细胞之间改变方向的细胞毒性以消除任何给 定疾病中的致病细胞。
此外，当DVD-Ig设计成靶向相同受体上的2种不同表位时，它可 以用于触发受体成簇和活化。这在制备激动性和拮抗性抗GPCR治疗剂 中可能具有益处。在这种情况下，DVD-Ig可以用于靶向一种细胞上的2 种不同表位用于成簇/信号传导(2种细胞表面分子)或信号传导(对于 一种分子)。类似地，DVD-Ig分子可以设计成通过靶向CTLA-4细胞外 结构域的2种不同表位(或相同表位的2个拷贝)，触发CTLA-4连接 和负信号，从而导致免疫应答下调。CTLA-4是用于治疗性处理许多免 疫学病症的临床上确认的靶。CTLA-4/B7相互作用通过减弱细胞周期进 展、IL-2生产、和活化后的T细胞增殖负调节T细胞活化，且CTLA-4 (CD152)衔接可以下调T细胞活化且促进免疫耐受性的诱导。然而， 通过激动性抗体衔接CTLA-4减弱T细胞活化的策略仍是不成功的，因 为CTLA-4活化需要连接。如通过晶体结构分析证实的(Stamper 2001 Nature 410：608)，CTLA-4/B7的分子相互作用为“歪斜拉链”排列。然 而，目前可用的CTLA-4结合试剂没有一种具有连接性质，包括抗 CTLA-4单克隆抗体。已存在解决这个问题的几种尝试。在一种情况下， 细胞膜结合的单链抗体被产生，且显著抑制小鼠中的同种异体排斥 (Hwang 2002 JI 169：633)。在分开的情况下，针对CTLA-4的人工 APC表面连接的单链抗体被产生且显示减弱T细胞应答(Griffin 2000 JI 164：4433)。在2种情况下，CTLA-4连接通过使膜结合的抗体紧密局 限在人工系统中来完成。尽管这些实验提供了通过触发CTLA-4负信号 传导用于免疫下调的概念验证(proof-of-concept)，但这些报道中使用 的试剂不适合于治疗用途。为此，CTLA-4连接可以通过使用DVD-Ig 分子来达到，所述DVD-Ig靶向CTLA-4细胞外结构域的2种不同表位 (或相同表位的2个拷贝)。基本原理是跨越IgG2个结合位点的距离 为约，太大而不能有效连接CTLA-4(2个CTLA-4同二聚体 之间)。然而，DVD-Ig上2个结合部位(1个臂)之间的距离 短得多，也在范围中，从而允许CTLA-4适当连接。
类似地，DVD-Ig可以靶向细胞表面受体复合物的2个不同成员(例 如IL-12Rα和β)。此外，DVD-Ig可以靶向CR1和可溶蛋白/病原体， 以驱动靶可溶蛋白/病原体的快速清除。
另外，本发明的DVD-Igs可以用于组织特异性递送(靶向组织标记 和疾病介质用于增强局部PK，从而达到较高的功效和/或较低的毒性)， 包括细胞内递送(靶向内在化受体和细胞内分子)，递送至脑内(靶向 转铁蛋白受体和CNS疾病介质用于穿过血脑屏障)。DVD-Ig也可以充当 载体蛋白，以经由与那种抗原的非中和表位结合将抗原递送至特定位 置，并且也增加抗原的半衰期。此外，DVD-Ig可以设计成与植入患者内 的医学装置物理连接，或靶向这些医学装置(参见Burke，Sandra E.； Kuntz，Richard E.；Schwartz，Lewis B.，Zotarolimus(ABT-578)eluting stents.Advanced Drug Delivery Reviews(2006)，58(3)，437-446； Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices，Hildebrand，H.F.；Blanchemain，N.；Mayer，G.；Chai，F.； Lefebvre，M.；Boschin，F.，Surface and Coatings Technology(2006)， 200(22-23)，6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis，Wu，Peng；Grainger，David W.， Biomaterials(2006)，27(11)，2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices.，Marques，A.P.；Hunt， J.A.；Reis，Rui L.，Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine(2005)，377-397)。简言之，将合适的细胞类 型导向医学植入物部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。可替代地， 也提供了通过与装置偶联或靶向装置的DVD对装置植入后释放的介质 (包括但不限于细胞因子)的抑制。例如，支架多年来已在介入性心脏 病学中使用，以清除闭塞动脉且改善至心肌的血流。然而，常规裸金属 支架已知在某些患者中引起再狭窄(治疗区域中动脉的再变窄)，且可 以导致血凝块。近来，抗CD34抗体包被的支架已得到描述，它通过捕获 在血液中各处循环的内皮祖细胞(EPC)来减少再狭窄且阻止血凝块发 生。内皮细胞是血管衬里的细胞，允许血液平稳流动。EPCs与支架硬表 面附着形成平滑层，所述平滑层不仅促进愈合还阻止再狭窄和血凝块， 所述再狭窄和血块是以前与支架使用相关的并发症(Aoji等人，2005 J Am Coll Cardiol.45(10)：1574-9)。除了改善需要支架的患者的结果 外，还存在需要心血管旁路手术的患者的牵涉。例如，用抗EPC抗体包 被的假体血管管道(人工动脉)将消除使用来自患者腿或臂动脉用于旁 路手术移植的需要。这将减少外科手术和麻醉时间，这依次将减少冠状 动脉外科手术死亡。DVD-Ig以这样的方式设计，从而使得它与细胞表面 标记(例如CD34)以及蛋白质(或任何种类的表位，包括但不限于脂质 和多糖)结合，所述细胞表面标记以及蛋白质已包被在植入的装置上以 促进细胞募集。一般而言此种方法也可以应用于其他医学植入物。可替 代地，DVD-Igs可以包被在医学装置上，并且在植入且从装置中释放所 有DVDs后(或可能需要另外的新鲜DVD-Ig的任何其他需要，包括已装 载的DVD-Ig的老化和变性)，装置可以通过给患者全身施用新鲜DVD-Ig 进行再装载，其中DVD-Ig被设计成用一组结合位点与目的靶(细胞因子、 细胞表面标记(例如CD34)等)结合，且用另一组与包被在装置上的靶 (包括蛋白质，任何种类的表位，包括但不限于脂质、多糖和聚合物) 结合。这种技术具有扩展包被的植入物有用性的优点。
A.DVD-Igs在各种疾病中的用途
本发明的DVD-Ig分子也可用作治疗分子以治疗各种疾病。此类 DVD分子可以结合涉及特定疾病的一种或多种靶。各种疾病中的此种靶 的例子在下文描述。
1.人自身免疫和炎症应答
许多蛋白质已普遍牵涉于自身免疫和炎症应答，包括C5、CCL1 (I-309)、CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、CCL13(mcp-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、 CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25 (TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10 (IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、 CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、 IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、 IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、 IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、 SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、 IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、 ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、 IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、 TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、 ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、 CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、 FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、 TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、 CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、 CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、 CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、 CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、 XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、 C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、 FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、 IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、 IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、 IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、 IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、 IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、 LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、 TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、 TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、 TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、 TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、和RNF110 (ZNF144)。在一个方面，提供了能够结合上文列出的一种或多种靶的 DVD-Igs。
2.哮喘
变应性哮喘的特征在于存在嗜曙红细胞增多、杯形细胞组织转化、 上皮细胞改变、气道高反应性(AHR)、和Th2和Th1细胞因子表达、以 及血清IgE水平升高。目前已普遍接受气道炎症是成为哮喘发病机理基 础的关键因素，涉及炎症细胞及其分泌的介质包括细胞因子和趋化因子 的复杂相互影响，所述炎症细胞例如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥 大细胞和巨噬细胞。皮质类固醇是目前用于哮喘的最重要抗炎治疗，然 而，它们的作用机理是非特异性的，且特别是在青少年患者群体中存在 安全性关心。因此证明开发更特异性和靶向的治疗是有正当理由的。越 来越多的证据表明小鼠中的IL-13模拟许多哮喘特征，包括AHR、粘液分 泌过多和气道纤维化、不取决于嗜酸性炎症(Finotto等人，International Immunology(2005)，17(8)，993-1007；Padilla等人，Journal of Immunology (2005)，174(12)，8097-8105)。
已暗示IL-13在引起与哮喘有关的病理应答中具有关键作用。开发 抗IL-13单克隆抗体治疗以减少IL-13在肺中的作用是激动人心的新方 法，它提供作为哮喘新治疗的相当大的希望。然而，差别免疫途径的其 他介质也涉及哮喘发病机理，且除IL-13外，阻断这些介质可能提供另 外的治疗利益。此种靶对包括但不限于，IL-13和促炎细胞因子，例如 肿瘤坏死因子α(TNF-α)。TNF-α可以放大哮喘中的炎症应答且可能与 疾病严重性关联(McDonnell等人，Progress in Respiratory Research (2001)，31(New Drugsfor Asthma，Allergy and COPD)，247-250.)。 这暗示阻断IL-13和TNF-α可能具有有益作用，特别是在严重气道疾病 中。在优选实施方案中，本发明的DVD-Ig结合靶IL-13和TNFα且用于 治疗哮喘。
其中炎症和AHR两者可以被评估的动物模型例如OVA-诱导的哮喘 小鼠模型，是本领域已知的且可以用于确定各种DVD-Ig分子治疗哮喘的 能力。用于研究哮喘的动物模型在下述参考文献中公开：Coffman等人， Journal of Experimental Medicine(2005)，201(12)，1875-1879；Lloyd 等人，Advances in Immunology(2001)，77，263-295；Boyce等人，Journal of Experimental Medicine(2005)，201(12)，1869-1873；和Snibson 等人，Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005)，35(2)，146-52。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于 免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的 和有帮助的(参见，Luster等人，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43； Descotes等人，Developments in biological standardization(1992)，77 99-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001)， 108(2)，250-257)。
基于上文公开的基本原理以及使用关于功效和安全性的相同评估 模型，可以确定DVD-Ig分子可以结合且用于治疗哮喘的其他靶对。优选 地此种靶包括但不限于，IL-13和IL-1β，因为IL-1β也涉及哮喘中的炎症 应答；IL-13和涉及炎症的细胞因子和趋化因子，例如IL-13和IL-9；IL-13 和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13 和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和 SPRR2a；IL-13和SPRR2b；以及IL-13和ADAM8。本发明还提供了能够 结合选自下述的涉及哮喘的一种或多种靶的DVD-Igs：CSF1(MCSF)、 CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、 组胺和组胺受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、 IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、 IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、 IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、 CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、 CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、 FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、 CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR、和壳多糖酶。
3.类风湿性关节炎
全身性疾病类风湿性关节炎(RA)的特征在于关节滑膜中的慢性炎 症反应，且伴随软骨变性和近关节骨侵蚀。包括TNF、细胞因子和生长 因子的许多促炎细胞因子在患病关节中表达。给RA小鼠模型全身施用抗 TNF抗体或sTNFR融合蛋白显示是抗炎和关节保护的。其中用静脉内施 用的英夫单抗(嵌合型抗TNF单克隆抗体(mAB))(Harriman G，Harper LK，Schaible TF.1999Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab，an anti-TNFalpha treatment.Ann Rheum Dis 58 Suppl 1： I61-4.)阻断RA患者的TNF活性的临床研究，已提供了下述证据：TNF 调节IL-6、IL-8、MCP-1和VEGF生产，免疫和炎症细胞募集到关节内， 血管发生，和基质金属蛋白酶1和3的血液水平减少。类风湿性关节炎中 炎症途径的更佳理解已导致涉及类风湿性关节炎的其他治疗靶的鉴定。 有希望的治疗例如白细胞介素-6拮抗剂(MRA)、CTLA4Ig(abatacept， Genovese Mc等人，2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition.N Engl J Med.353：1114-23.)，以 及抗B细胞治疗(利妥希玛，Okamoto H，Kamatani N.2004 Rituximab for rheumatoid arthritis.N Engl J Med.351：1909)，在过去的一年中已在随 机对照试验中进行测试。其他细胞因子已被鉴定且已显示在动物模型中 是有利的，包括白细胞介素-15、白细胞介素-17和白细胞介素-18，并且 这些试剂的临床试验目前在进行中。组合抗TNF和另一种介质的双重特 异性抗体疗法在增强临床功效和/或患者覆盖度方面具有很大的潜能。例 如，阻断TNF和VEGF两者可以潜在地根除炎症和血管发生，所述炎症和 血管发生都涉及RA的病理生理学。也预期了用特定DVD Igs阻断涉及RA 的其他靶对，包括但不限于，TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-23； TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-17；以及TNF和IL-15。除了这些靶 对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的 选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992)，7799-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001)，108(2)，250-257)。DVD Ig分子是否 可用于治疗类风湿性关节炎可以使用临床前动物RA模型，例如胶原诱导 的关节炎小鼠模型进行评估。其他有用的模型也是本领域众所周知的 (参见Brand DD.，Comp Med.(2005)55(2)：114-22)。
4.SLE
SLE的免疫病理学标志是多克隆B细胞活化，这导致血球蛋白过多 症、自身抗体产生和免疫复合物形成。基本异常似乎是由于广泛性T细 胞调节异常，T细胞不能抑制禁忌B细胞克隆。此外，B和T细胞的相 互作用通过几种细胞因子例如IL-10，以及共刺激分子例如CD40和 CD40L、B7和CD28和CTLA-4得到促进，所述细胞因子和共刺激分子 起始第二信号。这些相互作用连同免疫复合物和细胞凋亡材料的受损吞 噬清除，使免疫应答与所产生的组织损害永存。下述靶可能涉及SLE且 可以潜在地用于DVD-Ig方法用于治疗干预：B细胞靶向的治疗：CD-20、 CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、 TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、 HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、 TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、 HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、 KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、 FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、 CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、 CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA、和NT5E.；共刺激信号：CTLA4 或B7.1/B7.2；B细胞存活抑制：BlyS，BAFF；补体失活：C5；细胞因 子调节：关键原理是任何组织中的净生物学应答是促炎或抗炎细胞因子 局部水平之间平衡的结果(参见Sfikakis PP等人，2005 Curr Opin Rheumatol 17：550-7)。SLE被视为具有文件证明的血清IL-4、IL-6、 IL-10升高的Th-2驱动的疾病。也预期了能够结合选自下述的一种或多 种靶的DVD Igs：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-a、和TNF-a。上文讨论的靶 组合将增强关于SLE的治疗功效，所述治疗功效可以在许多狼疮临床前 模型中进行测试(参见Peng SL(2004)Methods Mol Med.；102：227-72)。
5.多发性硬化
多发性硬化(MS)是具有主要未知病因的复杂人自身免疫型疾病。 遍及神经系统的髓鞘碱性蛋白(MBP)的免疫学破坏是多发性硬化的主 要病理学。MS是具有复杂病理学的疾病，所述病理学涉及经由CD4+ 和CD8+T细胞的浸润和中枢神经系统内的应答。细胞因子、活性氮种 类和共刺激分子在CNS中的表达都已在MS中得到描述。主要考虑是促 成自身免疫发展的免疫学机制。特别地，抗原表达、细胞因子和白细胞 相互作用、以及帮助平衡/调节其他T细胞例如Th1和Th2细胞的调节 性T细胞，是关于治疗靶鉴定的重要范围。
IL-12是由APC生产且促进Th1效应细胞分化的促炎细胞因子。 IL-12在患有MS的患者的发展中的疾灶中以及受EAE影响的动物中产 生。先前显示干扰IL-12途径有效阻止啮齿类动物中的EAE，且使用抗 IL-12 mAb体内中和IL-12p40在普通狨猴中在髓鞘诱导的EAE模型中具 有有利作用。
TWEAK是TNF家族成员，在中枢神经系统(CNS)中组成型表达， 取决于细胞类型具有促炎、增殖或细胞凋亡作用。它的受体Fn14由内 皮细胞、反应性星形胶质细胞和神经元在CNS中表达。TWEAK和Fn14 mRNA表达在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)期间在脊髓中增加。 当小鼠在初始期(priming phase)后进行处理时，在C57BL/6小鼠中抗 TWEAK抗体处理髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)诱导的EAE导致疾病 严重性减少和白细胞浸润。
本发明的一个方面涉及能够结合选自下述的一种或多种，优选2种 靶的DVD Ig分子：IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、 IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、 FGF、C5、CD52、和CCR2。优选实施方案包括双重特异性抗 IL-12/TWEAK DVD Ig作为对MS治疗有利的治疗剂。用于评估DVD分 子治疗MS有用性的几种动物模型是本领域已知的(参见Steinman L等 人，(2005)Trends Immunol.26(11)：565-71；Lublin FD.等人，(1985) Springer Semin Immunopathol.8(3)：197-208；Genain CP等人，(1997) J Mol Med.75(3)：187-97；Tuohy VK等人，(1999)J Exp Med.189 (7)：1033-42；Owens T等人，(1995)Neurol Clin.13(1)：51-73； 和’t Hart BA等人，(2005)J Immunol 175(7)：4761-8。除了这些靶 对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的 选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992)，7799-102；Jones R.2000 Rovelizumab(ICOS Corp).IDrugs.3(4)：442-6)。
6.脓毒病
脓毒病的病理生理学由革兰氏阴性生物(脂多糖[LPS]、脂质A、内 毒素)和革兰氏阳性生物(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜组分起始。这些 外膜组分能够与单核细胞表面上的CD14受体结合。由于近期描述的toll 样受体，信号随后传递给细胞，从而导致促炎细胞因子肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素-1(IL-I)的最终生产。压倒性的炎症和免疫应 答是脓毒性休克的基本特征，且在由脓毒病诱导的组织损伤、多器官衰 竭和死亡发病机理中起重要作用。细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF) 和白细胞介素(IL)-1，已显示是脓毒性休克的关键介质。这些细胞因 子对组织具有直接的毒性作用；它们还激活磷脂酶A2。这些及其他作 用导致血小板活化因子浓度增加，促进氧化氮合酶活性，促进经由嗜中 性粒细胞的组织浸润，和促进嗜中性粒细胞的活性。
脓毒病和脓毒性休克治疗仍是临床难题，且使用针对炎症应答的生 物学反应调节剂(即抗TNF、抗MIF)的近期预期试验仅显示适度的临 床利益。近期，兴趣已转向针对逆转伴随的免疫抑制时间段的治疗。实 验动物和危急患病患者中的研究已证实淋巴器官和某些实质组织细胞 凋亡增加促成这种免疫抑制、无反应性、和器官系统功能障碍。在脓毒 病综合征期间，淋巴细胞的细胞凋亡可以由IL-2的不存在或由糖皮质激 素、粒酶或所谓的‘死亡’细胞因子：肿瘤坏死因子α或Fas配体释放来 触发。细胞凋亡经由胞质和/或线粒体胱天蛋白酶的自体活化而进展，所 述自体活化可以受Bcl-2家族的促或抗细胞凋亡成员的影响。在实验动 物中，使用细胞凋亡抑制剂的处理不仅可以阻止淋巴样细胞的细胞凋 亡；它还改善结果。尽管在很大程度上由于与其施用和组织靶向相关的 技术困难，使用抗细胞凋亡剂的临床试验仍然遥远，但淋巴细胞的细胞 凋亡抑制代表关于脓毒性患者的吸引人的治疗靶。同样地，靶向炎症介 质和细胞凋亡介质两者的双重特异性试剂可能具有附加利益。本发明的 一个方面涉及能够结合选自下述的涉及脓毒病的一种或多种靶，优选2 种靶的DVD Ig分子：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、 FasL、LPS、Toll样受体、TLR-4、组织因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、 CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、IL10、IL1B、 IL6、ADORA2A、CCR3、IL10、IL1B、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、 TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、 SERPINE1、和TREM1。此种DVD Igs对于脓毒病的功效可以在本领域 已知的临床前动物模型中进行评估(参见Buras JA等人，(2005)Nat Rev Drug Discov.4(10)：854-65和Calandra T等人，(2000)Nat Med.6 (2)：164-70)。
7.神经障碍
7.1.神经变性疾病
慢性神经变性疾病通常是依赖年龄的疾病，其特征在于神经元功能 的渐进性丧失(神经元细胞死亡、脱髓鞘)，活动度丧失和记忆丧失。 成为慢性神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)基础的机制的新出现 的知识显示了复杂的病因学，且多种因素已被识别为促进其发展和进 展，例如年龄、升糖(glycemic)状态，淀粉状蛋白生产和多聚化，与 其受体RAGE(关于AGE的受体)结合的晚期糖化终产物(AGE)积 聚，脑氧化应激增加，脑血流量减少，神经炎症包括炎症细胞因子和趋 化因子释放，神经元功能障碍和小胶质细胞活化。因此这些慢性神经变 性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此类疾病的 治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂(例如皮质类固醇、 COX抑制剂)或试剂阻断炎症性过程，以阻止神经元丧失和/或突触功 能。这些治疗不能阻止疾病进展。近期研究暗示更加靶向的治疗，例如 针对可溶性A-b肽(包括A-b寡聚形式)的抗体，不仅帮助阻止疾病进 展还帮助维持记忆。这些初步观察暗示靶向超过一种疾病介质(例如 A-b和促炎细胞因子例如TNF)的特异疗法，可以提供比使用靶向单一 疾病机制(例如单独的可溶性A-b)观察到的甚至更好的对慢性神经变 性疾病的治疗功效(参见C.E.Shepherd等人，Neurobiol Aging.2005 Oct 24；Nelson RB.，Curr Pharm Des.2005；11：3335；William L.Klein.； Neurochem Int.2002；41：345；Michelle C Janelsins等人，J Neuroinflammation.2005；2：23；Soloman B.，Curr Alzheimer Res. 2004；1：149；Igor Klyubin等人，Nat Med.2005；11：556-61； Arancio O等人，EMBO Journal(2004)1-10；Bornemann KD等人，Am J Pathol.2001；158：63；Deane R等人，Nat Med.2003；9：907-13； 和Eliezer Masliah等人，Neuron.2005；46：857)。
本发明的DVD-Ig分子可以结合涉及慢性神经变性疾病例如阿尔茨 海默病的一种或多种靶。此种靶包括但不限于，涉及AD发病机理的任 何介质，可溶性或细胞表面的，例如AGE(S100A，两性蛋白 (amphoterin))、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MCP1)、 抑制神经再生的分子(例如Nogo，RGM A)、增强神经突生长的分子 (神经营养蛋白)。DVD-Ig分子的功效可以在临床前动物模型中进行 验证，例如超表达淀粉状前体蛋白或RAGE且发展阿尔茨海默氏病样症 状的转基因小鼠。此外，可以构建DVD-Ig分子并在动物模型中测试功 效，并且可以选择最佳的治疗DVD-Ig用于在人患者中测试。DVD-Ig 分子也可以用于治疗其他神经变性疾病例如帕金森氏病。α-突触核蛋白 (Synuclein)涉及帕金森氏病理学。能够靶向α-突触核蛋白和炎症介质 例如TNF、IL-1、MCP-1的DVD-Ig可以证明是对于帕金森氏病的有效 治疗，且在本发明中被预期。
7.2神经元再生和脊髓损伤
尽管病理学机制的知识增加，但脊髓损伤(SCI)仍是破坏性状况 且代表特征在于高医学需要的医学适应症。大多数脊髓损伤是挫伤或压 迫损伤，并且原发性损伤通常随后为继发性损伤机制(炎症介质例如细 胞因子和趋化因子)，所述继发性损伤机制使最初损伤恶化且导致损害 区域显著放大，有时超过10倍。SCI中的这些原发性和继发性机制非常 类似于由其他方式例如中风引起的脑损伤中的那些。没有令人满意的治 疗，且高剂量单次快速静脉注射甲基强的松龙(MP)是损伤后8小时 窄时间窗内唯一使用的治疗。然而，这种治疗只预期阻止继发性损伤而 不产生任何显著的功能恢复。它因为缺乏明确功效和严重的不利作用而 受到猛烈批评，所述不利作用如具有后续感染的免疫抑制和严重组织病 理学肌肉改变。没有批准刺激内源性再生潜能的其他药物、生物制剂或 小分子，但近年来有希望的治疗原理和药物候选物已在SCI动物模型中 显示功效。人SCI中的功能恢复缺乏在很大程度上由抑制神经突生长的 因子引起，所述因子在损害部位处、在瘢痕组织中、在髓鞘质中以及损 伤相关细胞上。此种因子是髓鞘相关蛋白髓鞘相关蛋白NogoA、OMgp 和MAG、RGM A、瘢痕相关CSPG(硫酸软骨素蛋白聚糖)和关于反应 性星形胶质细胞的抑制因子(有时为脑信号蛋白和肝配蛋白)。然而， 在损害部位处，不仅发现了生长抑制分子，还发现了神经突生长刺激因 子，如神经营养蛋白、层粘连蛋白、L1等。神经突生长抑制和生长促进 分子的这种总体可能解释了，阻断单一因子如NogoA或RGM A在啮齿 类动物SCI模型中导致显著的功能恢复，因为抑制影响的减少可以使平 衡从生长抑制转移到生长促进。然而，对于阻断单个神经突长出抑制分 子观察到的恢复并不完全。为了达到更快速和更显著的恢复，可能需要 阻断2种神经突长出抑制分子例如Nogo和RGM A，或阻断神经突长出 抑制分子并增强神经突长出增强分子例如Nogo和神经营养蛋白的功 能，或阻断神经突长出抑制分子例如Nogo和促炎分子例如TNF(参见 McGee AW等人，Trends Neurosci.2003；26：193；Marco Domeniconi 等人，J Neurol Sci.2005；233：43；Milan Makwanal等人，FEBS J. 2005；272：2628；Barry J.Dickson，Science.2002；298：1959； Felicia Yu Hsuan Teng等人，J Neurosci Res.2005；79：273；Tara Karnezis等人，Nature Neuroscience 2004；7，736；Gang Xu等人，J. Neurochem.2004；91；1018)。
在一个方面，提供了能够结合下述靶对的DVD-Igs，所述靶对例如 NgR和RGM A；NogoA和RGM A；MAG和RGM A；OMGp和RGM A； RGM A和RGM B；CSPGs和RGM A；聚集蛋白聚糖、中期因子、神经 蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、磷酸聚糖、Te38和TNF-a；与促进树突和 轴突萌发的抗体组合的Aβ globulomer-特异性抗体。树突病理学是非常 早期的AD病征，且已知NOGO A限制树突生长。人们可以将此种ab 类型与任何SCI候选(髓鞘蛋白质)Ab组合。其他DVD-Ig靶可以包括 NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、 Lingo-p75、MAG或Omgp的任何组合。此外，靶还可以包括涉及神经 突抑制的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如Nogo、Ompg、MAG、 RGM A、脑信号蛋白、肝配蛋白、可溶性A-b、促炎细胞因子(例如IL-1)、 趋化因子(例如MIP1a)、抑制神经再生的分子。抗nogo/抗RGM A 或类似DVD-Ig分子的功效可以在脊髓损伤的临床前动物模型中进行验 证。此外，可以构建这些DVD-Ig分子并在动物模型中测试功效，并且 可以选择最佳的治疗DVD-Ig用于在人患者中测试。此外，可以构建靶 向单个受体上的2个不同配体结合位点的DVD-Ig分子，所述受体例如 结合3种配体Nogo、Ompg和MAG的Nogo受体，以及结合A-b和S100 A的RAGE。此外，神经突长出抑制剂例如nogo和nogo受体，也在免 疫学疾病如多发性硬化中阻止神经再生方面起作用。nogo-nogo受体相 互作用的抑制已显示增强多发性硬化动物模型中的恢复。因此，可以阻 断一种免疫介质例如细胞因子如IL-12和神经突长出抑制剂分子例如 nogo或RGM功能的DVD-Ig分子，可以提供比阻断单独的免疫或神经 突长出抑制剂分子更快和更大的功效。
8.肿瘤学病症
单克隆抗体治疗已显现为关于癌症的重要治疗方式(von Mehren M， 等人，2003 Monoclonal antibody therapy for cancer.Annu Rev Med.；54： 343-69)。抗体可以通过下述发挥抗肿瘤作用：诱导细胞凋亡、改变方 向的细胞毒性、干扰配体-受体相互作用、或阻止对瘤表型关键的蛋白质 表达。此外，抗体可以靶向肿瘤微环境组分，干扰重要结构例如肿瘤相 关脉管系统的形成。抗体还可以靶向其配体是生长因子的受体，例如表 皮生长因子受体。抗体因此抑制刺激细胞生长的天然配体与靶向的肿瘤 细胞结合。可替代地，抗体可以诱导抗独特型网络、补体介导的细胞毒 性、或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。与单特异性治疗比较，靶向2 种分开的肿瘤介质的双重特异性抗体的使用将可能产生附加利益。能够 结合下述靶对以治疗肿瘤学疾病的DVD Igs也是预期的：IGF1和IGF2； IGF1/2和Erb2B；VEGFR和EGFR；CD20和CD3、CD138和CD20、 CD38和CD20、CD38和CD138、CD40和CD20、CD138和CD40、CD38 和CD40。其他靶组合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一个或多个成员。涉 及肿瘤学疾病的、DVD Igs可以结合的其他靶(一种或多种)包括但不 限于，选自下述的那些：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、 IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、 FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、 FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、 FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、 IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、EGF、 FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、 CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、 CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、 AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、 EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、 MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、 FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、 GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、 NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、 NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、 NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、 NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、 APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、 ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、 FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、 FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、 IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、 KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、 MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、 SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、 CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、 CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、 MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、 CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、 ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、 GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、 MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、 SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、 ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、 FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、 VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、 NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、 CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、 IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、 EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、 TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、 ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、 CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-钙粘着蛋白)、CDKN1B (p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-连环蛋 白)、CTSB(组织蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3 (TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶胶蛋白)、IGFBP2、 IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整联蛋白)、 JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、 NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、SERPINB5 (乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板反 应蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A (拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、BPAG1(网蛋白)、 CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(密蛋白-7)、CLU(簇蛋白)、 ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP(GABAa)、 GNAS1、ID2、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGB4(b4整联蛋白)、KLF5 (GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛发特异性II型角 蛋白)、MACMARCKS、MT3(金属硫蛋白-III)、MUC1(粘蛋白)、 PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、 SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、 THBS1、THBS2、THBS4、和TNFAIP2(B94)。
IV.药物组合物
本发明还提供了包含本发明的结合蛋白，和药学可接受的载体的药 物组合物。包含本发明的结合蛋白的药物组合物用于在下述方面使用， 但不限于下述方面，病症诊断、检测或监控，病症或其一种或多种症状 的预防、治疗、管理或改善和/或研究。在具体实施方案中，组合物包含 本发明的一种或多种结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含 本发明的一种或多种结合蛋白，以及除本发明结合蛋白外用于治疗病症 的一种或多种预防或治疗剂。优选地，预防或治疗剂已知在病症或其一 种或多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目 前正在其中使用。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀 释剂或赋形剂。
本发明的结合蛋白可以掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。 一般地，药物组合物包含本发明的结合蛋白和药学可接受的载体。如本 文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分 散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接 受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄 糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂 将是优选的，所述等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或 氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂 或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存 期限或效力。
各种递送系统是已知的，且可以用于施用本发明的一种或多种抗体 或本发明的一种或多种抗体与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、 治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如被囊化在脂质体中、微粒、 微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见， 例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、作为逆转 录病毒或其他载体部分的核酸构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方 法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和 皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。 此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含雾化剂的制剂。 参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、 5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903， 所述专利各自整体引入本文作为参考。在一个实施方案中，本发明的结 合蛋白、组合疗法、或本发明的组合物使用Alkermes 肺药物递送 技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)来施用。在具体实施方案中， 本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下 施用。预防或治疗剂可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或单次 快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠 和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以 是全身或局部的。
在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂的局部施用 在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过 植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅 橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，)、或胶原基 质。在一个实施方案中，有效量的本发明拮抗剂的一种或多种抗体局部 施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其症 状。在另一个实施方案中，有效量的本发明的一种或多种抗体，与有效 量的除本发明结合蛋白外的一种或多种疗法(例如，一种或多种预防或 治疗剂)组合，局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、 和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中 递送。在一个实施方案中，可以使用泵以达到控释或持续释放(参见 Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20； Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Engl. J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发 明疗法的控释或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)； Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance， Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas， 1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy 等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25： 351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利号5,679,377； 美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463； 美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚甲 基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯 共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯- 乙醇酸交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在优选实施方案中，持续 释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌 和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接 近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分(参见，例如， Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷， 第115-138页(1984))。
控释系统在Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中讨论。 本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含本发明的一种或 多种治疗剂的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT 公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人，1996，＂Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，＂Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等人， 1995，＂Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，＂ PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397，Cleek 等人，1997，＂Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，＂Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater. 24：853-854，和Lam等人，1997，＂Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，＂Proc.Int′l.Symp. Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，所述参考文献各自整体引入本 文作为参考。
在具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸 时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下 述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用，从而使得其成 为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)， 或直接注射，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)， 或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框 样肽连接施用(参见，例如，Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)。可替代地，核酸可以引入细胞内且通过同源重组整合 入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例 子包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例 如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在具体实施 方案中，组合物依照常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合 于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于 静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合 物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne)，以减 轻注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳 膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形 式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。对于不可喷雾 的局部剂型，一般使用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形 剂，且具有优选大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的 制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、 油膏等，必要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓 冲液或盐)混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂 型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，优选与固体或液体惰性载 体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如氟利昂)在混合物中 包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以 加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为 气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，用于根据本发明使用的 预防或治疗剂可以以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式常规 递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单 位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合 适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(由例如明胶组 成)，用于在吸入器或吹入器中使用。如果本发明的方法包括经口施用， 那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊(gelcaps)、溶 液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的 赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯 吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如，乳糖、微晶纤维素、 或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例 如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸 钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的 液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液， 或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体构 建。此类液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述 添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用 脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁 油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲 酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调 味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓 慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组 合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号 6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、 5,290,540、和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、 WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，所述专利各自整体引入 本文作为参考。在具体实施方案中，本发明的结合蛋白、组合疗法、和 /或本发明的组合物使用Alkermes 肺药物递送技术(Alkermes， Inc.，Cambridge，Mass.)来施用。
本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过单次快速静脉 注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与 添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂容器中)呈递。组 合物可以采取此种形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂， 且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分 可以为粉末形式用于在使用前用合适的载体(例如，无菌无致热原水) 构建。
本发明的方法可以另外包括配制为积存(depot)制剂的组合物的施 用。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来 施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为 在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例 如，作为微溶盐)。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接 受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、 酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于氢氧化钠、钾、 铵、钙、铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的 那些。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如， 作为在密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如 安瓿或囊剂，其指示活性剂的量。当施用方式是输注时，组合物可以用 包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是注射时，可 以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混 合。
特别地，本发明还提供了包装在密封容器中的本发明的一种或多种 预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或囊剂，其指示活 性剂的量。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药 物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩剂提 供，且可以重建(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用。 优选地，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封 容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5mg、更优选至 少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50 mg、至少75mg、或至少100mg。冷冻干燥的本发明的预防或治疗剂或 药物组合物应在其原容器中贮存于2℃-8℃，并且本发明的预防或治疗 剂或药物组合物应在重建后1周内施用，优选5天内、72小时内、48 小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1 小时内。在可替代的实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或 药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。优 选地，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25 mg/ml，更优选至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5 mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、 至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式应在其原容 器中贮存于2℃-8℃。
本发明的结合蛋白可以掺入适用于肠胃外施用的药物组合物内。优 选地，抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250mg/ml结合蛋白的可注射 溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的 液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM)，最 佳5-10mM，pH5.0-7.0(最佳pH6.0)。其他合适的缓冲液包括但 不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰 浓度0-300mM(对于液体剂型最佳150mM)的溶液的毒性。对于冷 冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0 ％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可 以包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可以 在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最佳5 -10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0-0.05 ％聚山梨醇酯80(最佳0.005-0.01％)包括。另外的表面活性剂包括 但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为可注射溶液用于 肠胃外施用、包含本发明的结合蛋白的药物组合物可以进一步包含用作 佐剂的试剂，例如用于增加治疗蛋白质(例如，抗体)吸收、或分散的 那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，例如(重组人透明质酸 酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善肠胃外施用，特别是皮下施 用后的人生物药效率。它还允许具有较少疼痛和不适的更大注射部位体 积(即大于1ml)，和最低限度的注射部位反应发生率。(参见引入本 文作为参考的WO2004078140和US2006104968)
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和 固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬 浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用方 式和治疗应用。一般的优选组合物为可注射和可输注溶液形式，例如类 似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。优选施用方式是 肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选实施方案中， 抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个优选实施方案中，抗体通 过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物一般必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合 物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的 其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化 合物(即，抗体或抗体部分)与上文列举的一种成分或成分组合一起掺 入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活 性化合物掺入无菌载体内来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来 自上文列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无 菌、冷冻干燥粉末的情况下，优选制备方法是由其先前无菌过滤的溶液 产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液 的正确流动性可以通过下述来维持，例如利用涂层例如卵磷脂，在分散 体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长 吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单 硬脂酸盐和明胶。
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管对 于许多治疗应用，优选施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。 如技术人员应当理解的，施用途径和/或模式将依所需结果而变。在某些 实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物 免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送 系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯 酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的 许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见，例 如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的结合蛋白可以例如，与惰性稀释剂或 可同化食用载体一起经口施用。化合物(和若需要，其他成分)也可以 装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。 对于经口部治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口 腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafel)等的形 式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用材 料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发 明的结合蛋白与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗 剂对治疗其中IL-12活性是有害的病症是有用的。例如，本发明的结合 蛋白可以与结合其他靶的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞 因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，本发明的 一种或多种抗体可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此类组合疗法 可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相 关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，结合蛋白与本领域已知的半衰期延长载体连 接。此类载体包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此类载 体在例如美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044 中描述，所述专利为了任何目的在此引入作为参考。
在具体实施方案中，施用编码本发明的结合蛋白或本发明的另一种 预防或治疗剂的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理、或改善 病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表 达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生产其编码的 抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
本领域可用的任何关于基因治疗的方法可以根据本发明使用。关于 基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993， Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science 260： 926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem. 62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215。可使用的重组 DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和 Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。各种基因治疗方法的详细描述在引入本文作为参 考的US20050042664 A1中公开。
本发明的结合蛋白可用于治疗其中由结合蛋白识别的靶是有害的 各种疾病。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎、骨关节炎、青少 年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性 关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、 炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮 癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的 急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、 Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏 肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、 脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄 生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、 帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫 血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I 型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫 综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛 皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔 森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬 化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天 疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳 性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝 炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺 陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低 丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰 竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性 肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合性结缔组织病相关性肺病、 全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、 全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、氏病 相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血 黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维 化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传 染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝 炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗 体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、 甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相 关的慢性免疫性疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2 型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏 病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性 男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感 性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性 多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性 硬皮病、氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板 减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、 甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自 身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原 发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的 肝损伤、choleosatatis、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性 肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如， 抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不 同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、 前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血 症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴 细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细 菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS 痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应 性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬 化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受 体超敏反应、主和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉 硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房 扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT) 排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综 合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑 皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病 症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢 性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、 肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒 病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登 革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化 性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、 中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运 动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、 EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴 组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外 周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任 何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、 由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、 hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液 透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎 (A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过 度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运 动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺 纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎 症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、 缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓 性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、 皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋 巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、 代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克 隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核 分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、 新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、 嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、 闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆 转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿 瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性 鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、 恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、 器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、 灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行 性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、 Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血 压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy 小体型老年性痴呆、血清阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种 异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律 失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、 亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身 炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植 物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒 症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、 静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性 脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson 氏病、任何器官或组织的异种移植排斥。(参见Peritt等人PCT公开号 WO2002097048A2，Leonard等人，PCT公开号WO9524918 A1和Salfeld 等人，PCT公开号WO00/56772A1)。
本发明的结合蛋白可以用于治疗患有自身免疫性疾病的人，所述自 身免疫性疾病特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性关节炎、脊椎炎、 变态反应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。
优选地，本发明的结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗类风湿性关 节炎、Crohn氏病、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和牛皮癣。
本发明的结合蛋白也可以与各种疾病治疗中有用的一种或多种另 外治疗剂一起施用。
本发明的结合蛋白可以单独或组合使用以治疗此种疾病。应当理解结 合蛋白可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由 技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为 治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外的试剂也可以 是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解将包括在本发明内的组合是对其预期目的有用的那 些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。作为 本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的 试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的 试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以执行其预期功能 的话。
治疗自身免疫和炎性疾病的优选组合是非类固醇消炎药，也称为 NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其他优选组合是皮质类固醇，包括强 的松龙；当与本发明的DVD Igs组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的 类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本 发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的 非限制性例子包括下述：细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；针对其他 人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、 干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的结合蛋白或其 抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或 CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、 CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、 CD90、CTLA。
治疗剂的优选组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上 进行干扰；优选例子包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体， D2E7、(PCT公开号WO97/29131)、CA2(RemicadeTM)、CDP571、 和可溶性p55或p75 TNF受体，其衍生物(p75TNFR1gG(EnbrelTM) 或p55TNFR1gG(Lenercept)，以及TNFα转换酶(TACE)抑制剂；类 似地由于相同原因IL-1抑制剂(白细胞介素-1转换酶抑制剂，IL-1RA 等)可以是有效的。其他优选组合包括白细胞介素11。另外一种优选组 合包括自身免疫应答的关键参与物(player)，所述关键参与物与IL-12 功能平行作用，依赖于IL-12功能或与IL-12功能一致；特别优选的是 IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体，或IL-18结合蛋白。 已显示IL-12和IL-18具有重叠但不同的功能，且针对二者的拮抗剂组 合可能是最有效的。另外一种优选组合是非耗尽性抗CD4抑制剂。另外 一种优选组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)拮抗剂， 包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、 6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine) /羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、 皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁 胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、 萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、 霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、 磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、 干扰经由促炎细胞因子例如或IL-1的信号传导的试剂(例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、 TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、 金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素 转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或 p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM和p55TNFRIgG (Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如， IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、 洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲 基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹 林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、 吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸 二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞 素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴 胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利 多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米 替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、 甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1TRAP、MRA、 CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、 AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和 美苏帕玛(Mesopram)。优选组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，并且在 中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
也可以与结合蛋白组合使用以治疗类风湿性关节炎的非限制性的 另外试剂包括但不限于，下述：非类固醇消炎药(NSAIDs)；细胞因子 抑制性消炎药(CSAIDs)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗 体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合抗TNFα抗体；Centocor)； 75kdTNFR-IgG/依那西普(75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex； 参见例如，Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med. (1996)第44卷，235A)；55 kdTNF-IgG(55 kD TNF受体-IgG融合 蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE 9.1/SB 210396(非耗尽性灵长类 动物源化(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline；参见，例如Arthritis & Rheumatism(1995)第38卷，S185)；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2 (IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1993) 第36卷，1223)；抗Tac(人源化抗IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)； IL-4(抗炎细胞因子DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10， 抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例 如，激动性抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿 那白滞素(/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白； 参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)， S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268 卷，第37-42页)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；MK-966(COX-2 抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增 刊)，S81)；伊落前列素(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996) 第39卷，No.9(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；沙立度胺(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)和沙立度胺相 关药物(例如，Celgen)；来氟洛米(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例 如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S131； Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)；氨甲环酸(纤 溶酶原活化抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷， No.9(增刊)，S284)；T-614(细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；前列腺素E1 (参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)， S282)；替尼达普(非类固醇消炎药；参见例如，Arthritis & Rheumatism (1996)第39卷，No.9(增刊)，S280)；萘普生(非类固醇消炎药； 参见例如，Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)；美洛昔康 (非类固醇消炎药)；布洛芬(非类固醇消炎药)；吡罗昔康(非类固 醇消炎药)；扶他林(非类固醇消炎药)；吲哚美辛(非类固醇消炎药)； 柳氮磺吡啶(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9 (增刊)，S281)；硫唑嘌呤(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996) 第39卷，No.9(增刊)，S281)；ICE抑制剂(白细胞介素-1转换酶 抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)； VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮 细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇消炎药(例 如，SB203580)；TNF-转变酶抑制剂；抗-IL-12抗体；抗-IL-18抗体； 白细胞介素-11(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷， No.9(增刊)，S296)；白细胞介素-13(参见例如，Arthritis & Rheumatism (1996)第39卷，No.9(增刊)，S308)；白细胞介素-17抑制剂(参 见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S120)； 金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋 巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；经口施用的肽 和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs)HP228和HP466 (Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核 苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10； T Cell Sciences，Inc.)；强的松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺 环素；抗-IL2R抗体；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例 如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21：759-777)； 金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通； 阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷 帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱 氧腺苷)；氨甲蝶呤；抗病毒剂；和免疫调谐剂。
在一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分与下述试剂之一组 合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂(ABT-123)， Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟 氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫单抗；来氟洛米；萘普生；伐地考昔； 柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙； 硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/ 扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸 钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚 酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水 杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松 龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌 素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定； 米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希 玛；IL-1TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18BP；ABT-874；ABT-325(抗 IL18)；抗IL15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740； 罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美苏帕玛。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制 性例子包括下述：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、 柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加 氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂； IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β单克隆抗体；抗-IL-6单克隆抗体；生长因子； 弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其他人细胞因子或生长因 子的抗体或其拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、 IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、 FGF、和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面 分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、 CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的 抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环 孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、 皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、 补体抑制物、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1 的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、 IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如 激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、 血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶 性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例 如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
其中结合蛋白可以组合用于Crohn氏病的治疗剂的优选例子包括下 述：TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体，D2E7(PCT公开号WO 97/29131； HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体， (p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑制剂 和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇组 合，例如布地奈德和地塞米松。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分还 可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪， 以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶 抑制剂和IL-1ra。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号 传导抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的 结合蛋白或其抗原结合部分可以与IL-11组合。本发明的结合蛋白或其 抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯 基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐 酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重 酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞 /硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸 咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异噁唑/ 甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种 维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hc1)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰 素γ。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限 制性例子包括下述：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤； 环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a (AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)； 干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙 二醇化干扰素(Peginterferon)α2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1 (Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧； 静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；针对其他人细胞因子或生 长因子及其受体的抗体或其拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和 PDGF。本发明的结合蛋白可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组 合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、 CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本 发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、 FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类 固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑 制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号 传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β 转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、 金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素 转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、 IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于多发性硬化的治疗剂的优选 例子包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；考帕松，皮质类固醇，胱 天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1抑制剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂， 以及针对CD40配体和CD80的抗体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如阿来组单抗、 屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、 盐酸扎利罗登(xaliproden hydrochloride)、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪 尔、那他珠单抗、辛纳必醇(sinnabidol)、a-免疫因子(a-immunokine) NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、 BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体被囊化 的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)、MBP-8298、美苏帕玛(PDE4 抑制剂)、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼 酮allotrap1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特 立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮 抗剂(例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、 干扰素γ拮抗剂和IL-4拮抗剂。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于心绞痛的治疗剂的非限制性 例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛 尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫、硝 酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋 塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸普萘洛尔、卡维地洛、 赖诺普利、螺内酯、氢氯噻嗪、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、 依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝 (ezetimibe)、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢氯噻嗪、非洛地平、 卡托普利、富马酸比索洛尔。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于强直性脊柱炎的治疗剂的非 限制性例子包括下述：布洛芬、扶他林和米索前列醇、萘普生、美洛昔 康、吲哚美辛、扶他林、塞来昔布、洛芬昔布、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、 硫唑嘌呤、米诺环素、强的松、依那西普、英夫单抗。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于哮喘的治疗剂的非限制性例 子包括下述：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡 松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐(sameterol xinafoate)、 盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩 松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的 松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马 酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼 缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿 莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地 塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗 喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星、盐酸西替立嗪、 糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可 待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯福林/cod/ 异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻 黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、 甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于COPD的治疗剂的非限制性 例子包括下述：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替 卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水 茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特 罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙 酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、 加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯 那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米 他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫 酸特布他林、噻托溴铵(tiotropium bromide)、(R，R)-福莫特罗、TgAAT、 西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于HCV的治疗剂的非限制性例 子包括下述：干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-αcon1、干扰素-α-n1、 聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、三氮唑核苷、聚乙二 醇干扰素α-2b+三氮唑核苷、熊脱氧胆酸、甘草酸、胸腺法新、马克胺 (Maxamine)、VX-497以及通过干扰下述靶用于治疗HCV的任何化合 物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解旋酶、HCV IRES(内部核糖 体进入位点)。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于特发性肺纤维化的治疗剂的 非限制性例子包括下述：强的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、秋水仙碱、硫 酸沙丁胺醇、地高辛、γ干扰素、甲基强的松龙琥珀酸钠(sod succ)、 劳拉西泮、呋塞米、赖诺普利、硝酸甘油、螺内酯、环磷酰胺、异丙托 溴铵、放线菌素d、阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氟沙星、硫酸间羟异 丙肾上腺素、硫酸吗啡、盐酸羟可酮、氯化钾、曲安缩松、无水他克莫 司、钙、干扰素-α、氨甲蝶呤、霉酚酸酯、干扰素-γ-1β。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于心肌梗死的治疗剂的非限制 性例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、酒石酸美托洛尔、依诺肝素钠、 肝素钠、重硫酸氯吡格雷、卡维地洛、阿替洛尔、硫酸吗啡、琥珀酸美 托洛尔、华法林钠、赖诺普利、单硝酸异山梨酯、地高辛、呋塞米、斯 伐他汀、雷米普利、替尼普酶、马来酸依那普利、托拉塞米(torsemide)、 瑞替普酶、氯沙坦钾、盐酸喹那普利/mag carb、布美他尼、阿替普酶、 依那普利拉、盐酸胺碘酮、盐酸替罗非班一水合物、盐酸地尔硫、卡 托普利、依贝沙坦、缬沙坦、盐酸普萘洛尔、福辛普利钠、盐酸利多卡 因、表非替得、头孢唑啉钠、硫酸阿托品、氨基已酸、螺内酯、干扰素、 盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠、盐酸多巴酚丁胺、阿普唑仑、普伐 他丁钠、阿托伐他汀钙、盐酸咪达唑、盐酸哌替啶、单硝酸异山梨酯、 肾上腺素、盐酸多巴胺、比伐卢定、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、依泽 替米贝/斯伐他汀、阿伐麦布(avasimibe)、卡立泊来德(cariporide)。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于牛皮癣的治疗剂的非限制性 例子包括下述：KDR(ABT-123)的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制 剂、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他 索、他佐罗汀、氨甲蝶呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻 松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮 康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米 松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化 可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司(pimecrolimus)、 煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素、hc/ 次五倍子酸铋(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的 松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦 油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/ 润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、 补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫单抗、 环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、 UVB、柳氮磺吡啶。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于牛皮癣性关节炎的治疗剂的 非限制性例子包括下述：氨甲蝶呤、依那西普、洛芬昔布、塞来昔布、 叶酸、柳氮磺吡啶、萘普生、来氟洛米、乙酸甲基强的松龙、吲哚美辛、 硫酸羟氯喹、强的松、舒林酸、增强型二丙酸倍他米松、英夫单抗、氨 甲蝶呤、叶酸盐、曲安缩松、扶他林、二甲基亚砜、吡罗昔康、双氯酚 酸钠、酮基布洛芬、美洛昔康、甲基强的松龙、萘普酮、托美汀钠、卡 泊三醇、环孢菌素、双氯酚酸钠/米索前列醇、氟轻松、硫酸葡糖胺、硫 代苹果酸金钠、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、布洛芬、利塞膦酸钠、 磺胺嘧啶、硫鸟嘌呤、伐地考昔、阿来塞普、依法利珠单抗。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于再狭窄的治疗剂的非限制性 例子包括下述：西罗莫司、紫杉醇、依维莫司(everolimus)、他克莫 司、ABT-578、扑热息痛。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于坐骨神经痛的治疗剂的非限 制性例子包括下述：重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、洛芬昔布、盐酸 环苯扎林、甲基强的松龙、萘普生、布洛芬、盐酸羟可酮+/扑热息痛、 塞来昔布、伐地考昔、乙酸甲基强的松龙、强的松、磷酸可待因/扑热息 痛、盐酸曲马多/扑热息痛、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫、盐酸利多 卡因、双氯酚酸钠、加巴喷丁、地塞米松、卡立普多、酮咯酸氨基丁三 酸醇盐、吲哚美辛、扑热息痛、地西泮、萘普酮、盐酸羟可酮、盐酸替 扎尼定、双氯酚酸钠/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、asa/oxycod/ 羟可酮ter、布洛芬/二氢可待因酮bit、盐酸曲马多、依托度酸、盐酸丙 氧芬、盐酸阿米替林、卡立普多/磷酸可待因/asa、硫酸吗啡、多种维生 素、甲氧萘丙酸钠、柠檬酸奥芬那君、替马西泮。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于SLE(狼疮)的治疗剂的优选 例子包括下述：NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、 吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗 疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、 地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲蝶 呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如Cellcept。本发明的结合蛋白 还可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉 嗪、依木兰，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成、生产或作用的试剂， 例如胱天蛋白酶抑制剂，如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的结 合蛋白还可以与T细胞信号传导抑制剂一起使用，例如酪氨酸激酶抑制 剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗 体，抗PD-1家族抗体。本发明的结合蛋白可以与IL-11或抗细胞因子抗 体组合，例如芬突利珠单抗(fonotolizumab)(抗IFNg抗体)，或抗 受体受体抗体，例如抗IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。本 发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂一起使用：LJP 394(阿 贝莫司(abetimus))，耗尽或灭活B细胞的试剂，例如利妥希玛(抗 CD20抗体)，淋弗斯特(lymphostat)-B(抗BlyS抗体)，TNF拮抗 剂，例如，抗TNF抗体，D2E7(PCT公开号WO 97/29131；HUMIRA)， CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG(ENBREL) 和p55TNFRIgG(LENERCEPT))。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发 明的结合蛋白。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗 结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可 以根据下述因素而变：个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及结合 蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用 大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所 需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在 疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效 量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应 答)。例如，可以施用快速灌注方式，几个分份剂量可以随着时间过去 而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增 加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有 利的。如本文使用的，单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳 动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含计算的预定量的活性化 合物以产生与所需药学载体相关的所需疗效。关于本发明的单位剂型的 详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征 和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)配合这种用于治疗个体中敏 感性的活性化合物的领域固有的局限性。
关于本发明的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范 围是0.1-20mg/kg，更优选1-10mg/kg。应当指出剂量值可以依待减 轻的状况类型和严重性而变。应进一步理解对于任何特定受试者，根据 个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当 随着时间过去进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不 希望限制要求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明方法的其 他合适修改和适应是明显的，且无需背离本发明或本文公开的实施方案 的范围使用合适的等价方案即可进行。尽管本发明目前已得到详细描 述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括 仅用于举例说明性目的且不希望限制本发明。
实施例
实施例1：双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)的产生
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子被这样设计，从而使得 来自2种不同亲本mAbs的2个不同轻链可变结构域(VL)直接地，或 通过重组DNA技术经由短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域。类 似地，重链包含串联连接的2个不同重链可变结构域(VH)，随后为 恒定结构域CH1和Fc区(图1A)。
实施例1.1：针对IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体的产生
针对IL-1α和IL-1β的单克隆抗体使用本领域众所周知的杂交瘤技 术如下产生。
实施例1.1.A：小鼠的免疫接种
纯化的重组人IL-1α和鼠IL-1β(R&D Systems)用作免疫原以及效 价测定和筛选ELISA中的包被抗原。对于所有抗原对于初次免疫接种和 加强免疫接种，免疫剂量为5.0-20.0μg/小鼠/注射。ImmunEasy佐剂购 自Qiagen(Waltham，MA)，且以20ml ImmunEasy佐剂/10.0μg抗原 的佐剂/抗原比使用。待免疫的每组动物包含从Dr.Yoichiro Iwakura (University of Tokyo，Minato-ku，Tokyo，日本)获得的5IL-1αβ KO 小鼠。小鼠根据下述给药方案进行免疫。MRC-5细胞购自ATCC (Manassas，VA)且用于IL-1生物测定。人IL-8 ELISA试剂盒和对照 小鼠抗hIL-1α和β抗体(MAB200和MAB201)购自R&D Systems (Minneapolis，MN)。
简言之，佐剂-抗原混合物通过首先使用旋涡在小瓶中轻轻混合佐剂 来制备。所需量的佐剂从小瓶中取出且放入高压灭菌的1.5mL微量离心 管内。抗原在浓度为0.5-1.0mg/ml的PBS或盐水中制备。随后向含有 佐剂的微量离心管中加入计算量的抗原，且通过上下轻轻移液5次使溶 液混合。佐剂-抗原混合物在室温下温育15分钟，随后通过再次上下轻 轻移液5次进行混合。将佐剂-抗原溶液吸到正确的注射器内用于动物注 射。总共5-20μg抗原在50-100μl的体积中进行注射。对每只动物进 行免疫，随后取决于效价加强2-3次。具有良好效价的动物在融合和 产生杂交瘤之前给予最终静脉内加强。
实施例1.1.B：筛选杂交瘤：
如上所述产生的杂交瘤进行筛选且使用ELISA测定抗体效价：将蛋 白质抗原直接包被在ELISA板上，用于使用标准ELISA程序检测特异 性抗体。简言之，ELISA板用100μl rhIL-1α或rhIL-1β(溶于PBS中的 1.0μg/ml)于4℃包被过夜。板用250μl PBS/0.5％Tween20洗涤3次， 且用200μl封闭缓冲液(溶于含0.5％Tween20的PBS中的2％BSA)进 行封闭。向每个孔中加入稀释的血清或杂交瘤上清液(100μl)，且在室 温下温育2小时。板随后用PBS/0.5％ Tween20洗涤3次，使用HRP-山 羊抗鼠IgG用于检测，且在450nm处观察结合ODs。产生在ELISA中 显示高特异性结合活性的抗体的杂交瘤细胞进行亚克隆和纯化，且如下 所述表征抗体的亲和力(Biacore)和效力(MRC-5生物测定)。
实施例1.1.C：针对IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体的表征：
使用下述测定以表征由实施例1.1.B中所述杂交瘤产生的抗体。
实施例1.1.C.1：表面等离子体共振：
捕获的抗体(经由山羊抗小鼠IgG捕获在生物传感器基质上的小鼠 抗rmIL1抗体)和rmIL-1之间的实时结合相互作用，通过表面等离子体 共振(SPR)使用BIAcore系统(Biacore AB，Uppsala，瑞典)，根据 制造商的说明书和标准程序来测量。简言之，rmIL-1在HBS运行缓冲 液(Biacore AB)中进行稀释，且50μl等分试样以5ml/分钟的流速注 射通过固定化蛋白质基质。使用的rhIL1浓度为62.5、125、187.5、250、 375、500、750、1000、1500和2000nM。为了测定解离常数(解离速 率)，结合常数(结合速率)，使用BIAcore动力学评估软件(版本3.1)。
实施例1.1.C.2：抗IL-1生物测定：
MRC-5细胞系是以剂量依赖性方式响应人IL-1α和IL-1β生产IL-8的 人肺成纤维细胞细胞系(参见Dinarello，C.A.，K.Muegge和S.K.Durum. 2000.Current Protocols in Immunology 6：1)。MRC-5细胞在10％FBS完 全MEM中培养，且在5％CO2培养箱中于37℃生长。为了测定针对重组 人IL-1α或IL-1β的mAbs的中和效力，向96孔板中加入不同浓度(0- 10μg/ml)的mAb(50μl)，且于37℃与50μl rhIL-1a或rhIL-1b(10-50pg/ml) 预温育1小时。收获上清液，进行稀释，且通过ELISA使用标准IL-8 ELISA 试剂盒(R&D Systems)测量IL-8浓度。抗体效力通过其抑制经由MRC-5 细胞的IL-8生产的能力来测定。
如下表1中所示，基于Biacore和MRC-5生物测定，鉴定了许多具有 高亲和力和效力的鼠抗hIL-1a和抗hIL-1b抗体：
表1.鼠抗hIL-1a/b mAbs的产生和表征。

实施例1.1.D：针对IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体的克隆和测序：
使用Trizol试剂(Invitrogen)根据制造商的说明书，从每个杂交瘤 细胞系中分离和纯化总RNA后，对表1中所述所有抗IL-1a/b mAbs和 另外抗体的可变重(VH)和轻(VL)基因进行克隆和测序。使用来自 Mouse Ig-Primer Set(Novagen，Madison，WI)的IgGVH和IgκVL寡核 苷酸与One-tube RT-PCR试剂盒(Qiagen)，如制造商所建议的进行VH 和VL基因的扩增。根据制造商的说明书，将由生产性扩增产生的DNA 片段克隆到pCR-TOPO载体(Invitrogen)内。随后通过双脱氧链终止法 使用ABI3000测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)对多个 VH和VL克隆进行测序。所有mAb VL和VH基因的序列显示于下表2 中。
表2：能够结合人IL-1α或IL-1β的鼠单克隆抗体
  蛋白质 序列标识符 序列 12345678901234567890 VH 3D12.E3 SEQ ID NO. ：1 QIQLVQSGPELKKPGETVKI SCKASGYTFRNYGMNWVKQA PGKDLKRMAWINTYTGESTY ADDFKGRFAFSLETSASTAY LQINNLKNEDTATYFCARGI YYYGSSYAMDYWGQGTSVTV SS VL 3D12.E3 SEQ ID NO.：2 NIQMTQTTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNCLNWYQQKP DGTVKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYSLTISNLEQ EDIATYFCQQGKTLPYAFGG GTKLEINR VH 18F4.2C8 SEQ ID NO.：3 EVQLQQSGAELVKPGASVKL SCTASGLNIKDTYMHWLKQR PEQGLEWIGRIDPANGNAKY DPRFLGKATITADTSSNTAY LQLSSLTSEDTAVYYCARGD GNFHFDYWGQGTTLTVSS VL 18F4.2C8 SEQ ID NO.：4 DIVMTQSQRFMSTSVGDRVS VTCKASQNVGTNIAWYQQKP GQSPRALIYSASYRYSGVPD RFTGSGSGTDFTLTISNVQS VDLAEYFCQQYTRYPLTFGG GTKLEIKR VH 6H3.1A4.3E11 SEQ ID NO.：5 QVQLQQPGAELVRPGASVKL SCKASGYTFTTYWMNWVKQR PEQGLEWIGRIDPYDSETLY SQKFKDTAILTVDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYG FDYWGQGTTLTVSS VL 6H3.1A4.3E11 SEQ ID NO.：6 QIVLTQSPALMSASPGEKVT MTCSASSSVNYMYWYQQKPR SSPKPWIYLTSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTIgSMEAE DAATYYCQQWNSNPYTFGGG TKLEMKR
  蛋白质 序列标识符 序列 12345678901234567890 VH 13F5.G5 SEQ ID NO.：7 QVQLQQSGAELVRPGSSVKI SCKASGYAFSSYWMNWVKQR PGQGLEWIGQIYPGDGDTNY NGKFKGKATLTADKSSSTSY MQLSGLTSEDSAMYFCVRFP TGNDYYAMDYWGQGTSVTVS S VL 13F5.G5 SEQ ID NO.：8 NIVLTQSPASLAVSLGQRAT ISCRASESVDSYGNSYMHWY QQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTID PVEADDAATYYCQQNNEDPF TFGSGTKLEIKR VH 1B12.4H4 SEQ ID NO.：9 QVHLKESGPGLVAPSQSLSI TCTVSGFSLTDYGVSWIRQP PGKGLEWLGLIWGGGDTYYN SPLKSRLSIRKDNSKSQVFL KMNSLQTDDTAVYYCAKQRT LWGYDLYGMDYWGQGTSVTV SS VL 1B12.4H4 SEQ ID NO.：10 ETTVTQSPASLSMAIGEKVT IRCITSTDIDVDMNWYQQKP GEPPKLLISQGNTLRPGVPS RFSSSGSGTDFVFIIENMLS EDVADYYCLQSDNLPLTFGA GTKLELKR VH 6B12.4F6 SEQ ID NO.：11 EVQLQQSGPELVKTGTSVKI SCKASGYSFTGYYMHWVRQS HGKSLEWIGYISCYNGFTSY NPKFKGKATFTVDTSSSTAY IQFSRLTSEDSAVYYCARSD YYGTNDYWGQGTTLTVSS VL 6B12.4F6 SEQ ID NO.：12 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT ITCSASSSVSYMHWFQQKPG ASPKLWIYSTSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTVSRMEAE DAATYYCQQRSTYPYTFGGG TKLEIKR
实施例1.2：鼠-人嵌合抗体的产生和表征
将所有上述mAbs转变成嵌合的(具有人恒定区)且进行表达、纯 化和表征以证实活性，且将用作后续DVD-Ig分析的对照。为了将 3D12.E3转变成嵌合形式，使用引物P1和P2 PCR扩增3D12.E3-VL； 同时使用引物P3和P4扩增人Ck基因(在ABC内部产生的pBOS载体 中)。2种PCR反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR 产物进行凝胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中 使用引物P1和P4使用标准PCR条件。通过TOPO克隆根据制造商的 说明书，将最终的PCR产物-嵌合轻链3D12.E3-VL-hCk亚克隆到pEF6 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)内。表3显示了PCR引物的序列：
表3：
  P1：5’ATG GTG TCC ACA GCT CAG TTC C3’ SEQ ID NO.13 P2：5’GC AGC CAC CGT ACG CCG GTT TAT TTC CAG 3’ SEQ ID NO.14 P3：5’CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC 3’ SEQ ID NO.15 P4：5’TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GC3’ SEQ ID NO.16
为了将3D12.E3重链转变成嵌合形式，使用引物P5和P6 PCR扩增 3D12.E3-VH；同时使用引物P7和P8扩增人Cγ1基因(在ABC内部产 生的pBOS载体中)。2种PCR反应都根据标准PCR技术和程序来进行。 将2种PCR产物进行凝胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR 反应，其中使用引物P5和P8使用标准PCR条件。根据制造商的说明 书，将最终的PCR产物-嵌合轻链3D12.E3-VH-hCγ1亚克隆到 pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)内。表4显示了PCR 引物的序列：
表4：
  P5：5’ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG C3’ SEQ ID NO.17 P6：5’GGG CCC TTG GTC GAC GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG G3’ SEQ ID NO.18 P7：5’GCG TCG ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC C3’ SEQ ID NO.19 P8：5’TC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA GGC 3’ SEQ ID NO.20
类似地，使用引物P21/P22(对于VH)和P7/P8(对于hCγ1)产生 嵌合13F5.G5-VH-Cγ1，且克隆到pcDNA3.1 TOPO载体内，且使用引物 P23/P24(对于VL)和P3/P4(对于hCk)产生嵌合13F5.G5-VL-Cκ，且 克隆到pEF6 TOPO载体内。表5显示了PCR引物的序列：
表5：
  P21：5’ATA GAA TGG AGC TGG GTT TTC CTC 3’ SEQ ID NO.21 P22：5’GGG CCC TTG GTC GAC GC TGA GGA GAC GGT GAC TGA 3’ SEQ ID NO.22 P23：5’ATG GTC CTC ATG TCC TTG CTG TTC 3’ SEQ ID NO.23 P24：5’GC AGC CAC CGT ACG CCG TTT TAT TTC CAG CTT TG3’ SEQ ID NO.24
为了表达嵌合Abs，使用Lipofectamin(Invitrogen)使13F5.G5-VL-Cκ 和13F5.G5-VH-Cγ1在COS中共表达72小时，且收集培养基并通过A 蛋白层析进行IgG纯化。类似地，使用Lipofectamin(Invitrogen)使 13F5.G5-VL-Cκ和13F5.G5-VH-Cγ1在COS中共表达72小时，且收集培 养基并通过A蛋白层析进行IgG纯化。2种纯化的嵌合Abs通过Biacore 和MRC-5生物测定进行表征以证实活性。结果显示这些嵌合Abs显示 与原始鼠mAbs那种类似的亲和力和效力。
实施例1.3：IL-1α/β双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)的构 建、表达、和纯化
图1B中举例说明了用于产生能够结合hIL-1α和hIL-1β的DVD-Ig 的构建体。简言之，通过分别用重组IL-1α蛋白质(rhIL-1α)和重组IL-1β 蛋白质(rhIL-1β)免疫Balb/c小鼠，获得包括2种高亲和力鼠Abs-抗 hIL-1α(克隆3D12.E3)和抗hIL-1β(克隆13F5.G5)的亲本mAbs。通 过RT-PCR使用小鼠Ig Primer Kit(Novagen，Madison，WI)来分离这 2种杂交瘤克隆的VL/VH基因。首先将VL/VH基因转变成嵌合抗体(具 有人恒定区)以证实活性和效力。为了产生DVD1-Ig，将13F5.G5的 VH和VL分别与3D12.E3的VH和VL的N末端直接融合(如图1B中 所示)。类似地构建DVD2-Ig，除了它在轻链(接头序列为ADAAP) 和重链(接头序列为AKTTPP)中的2个可变结构域之间具有接头。这 些序列选自鼠Ck和CH1序列的N末端。选自鼠Ck和CH1的N末端的 这些接头序列是可变结构域的天然延伸，且基于几种Fab晶体结构分析 显示柔性构象而无显著的二级结构。PCR克隆的详细程序在下文描述：
实施例1.3.A：hIL-1a/bDVD1-Ig的分子克隆：
使用引物P21和P25PCR扩增13F5.G5-VH；同时使用引物P14和 P8扩增3D12.E3-VH-hCγ1。2种PCR反应都根据标准PCR技术和程序 来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续 重叠PCR反应，其中使用引物P21和P8使用标准PCR条件。根据制造 商的说明书，将最终的PCR产物-DVD1-Ig重链hIL-1a/bDVD1-VH-hCγ1 亚克隆到pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)内。表6显 示了PCR引物的序列：
表6
  P14：5’CAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GG3’ SEQ ID NO.25 P25：5’CAC CAA CTG GAT CTG TGA GGA GAC GGT GAC TGA GG3’ SEQ ID NO.26
为了产生hIL-1a/bDVD1-Ig轻链，使用引物P23和P26 PCR扩增 13F5.G5-VL；同时使用引物P16和P4扩增3D12.E3-VL-hCK。2种PCR 反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯 化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物P23 和P4使用标准PCR条件。根据制造商的说明书，将最终的PCR产物- hIL-1a/bDVD1-Ig轻链hIL-1a/bDVD1-VL-hCK亚克隆到pEF6 TOPO哺乳 动物表达载体(Invitrogen)内。表7显示了PCR引物的序列：
表7
  P16：5’AAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC 3’ SEQ ID NO.27 P26：5’GTGT CAT CTG GAT ATT CCG TTT TAT TTC CAG CTT TG3’ SEQ ID NO.28
实施例1.3.B：hIL-1a/bDVD2-Ig的分子克隆：
使用引物P21和P17 PCR扩增13F5.G5-VH；同时使用引物P18和 P8扩增3D12.E3-VH-hCγ1。2种PCR反应都根据标准PCR技术和程序 来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续 重叠PCR反应，其中使用引物P21和P8使用标准PCR条件。根据制造 商的说明书，将最终的PCR产物-DVD2-Ig重链hIL-1a/bDVD2-VH-hCγ1 亚克隆到pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)内。表8显 示了PCR引物的序列：
表8
  P17：5’TGG GGG TGT CGT TTT GGC TGA GG3’ SEQ ID NO.29 P18：5’GCC AAA ACG ACA CCC CCA CAG ATC CAG TTG GTG CAG 3’ SEQ ID NO.30
为了产生hIL-2a/bDVD2-Ig轻链，使用引物P23和P19 PCR扩增 13F5.G5-VL；同时使用引物P20和P4扩增3D12.E3-VL-hCκ。2种PCR 反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯 化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物P23 和P4使用标准PCR条件。根据制造商的说明书，将最终的PCR产物- hIL-1a/bDVD2-Ig轻链hIL-1a/bDVD2-VL-hCK亚克隆到pEF6 TOPO哺乳 动物表达载体(Invitrogen)内。表9显示了PCR引物的序列：
表9
  P19：5’TGGTGCAGCATCAGCCCGTTTTATTTC3’ SEQ ID NO.31 P20：5’GCTGATGCTGCACCAAATATCCAGATGACACAG3’ SEQ ID NO.32
hIL-1a/bDVD1-Ig和hIL-1a/bDVD2-Ig的最终序列在表10中描述：
表10：hIL-1α/βDVD1-Ig和hIL-1α/βDVD2-Ig的氨基酸序列




实施例1.3.C：hIL-1a/bDVD1-Igs的表达和纯化
将每种构建体的重和轻链分别亚克隆到pcDNA3.1 TOPO和pEF6 TOPO载体(Invitrogen Inc.)内，且进行测序以确保精确性。编码每种 构建体的重和轻链的质粒使用Lipofectamine 2000和293 fectin试剂分别 在COS细胞以及人胚肾293细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas， VA)中进行瞬时表达。瞬时转染后72小时收获细胞培养基，且使用A 蛋白层析(Pierce，Rockford，IL)根据制造商的说明书纯化抗体。Abs 通过SDS-PAGE进行分析，且通过A280和BCA(Pierce，Rockford，IL) 进行定量。表11显示hIL-1a/bDVD1-Ig和hIL-1a/bDVD2-Ig的表达水平 比得上嵌合Abs的那种，从而指出DVD-Ig可以在哺乳动物细胞中有效 表达。
表11.hIL-1a/bDVD-Ig的表达和分子量分析

圆括号中显示的是通过质谱分析法实验上测定的DVD1-Ig和 DVD2-Ig轻链、重链和全长的分子量。
实施例1.4：hIL-1a/b DVD-Ig的质谱分析法和SEC分析
为了测量DVD-Ig的轻和重链的分子量(MW)，通过1.0M DTT 溶液(5uL)还原10uL DVD-Ig(0.8ug/uL)。使用PLRP-S，8u，4000A， 和1x150mm蛋白质柱(Michrom BioResource，Auburn，MA)以分离 DVD-Ig的重和轻链。使用Agilent HP1100 Capillary HPLC(Agilent Technologies Inc.，Pala Alto，CA)与质谱仪QSTAR(Applied Biosystems， Foster City，CA)。valco值设定为10分钟以使流动从废物转到MS用 于使样品脱盐。缓冲液A是0.02％ TFA、0.08％ FA、0.1％ ACN和99.8 ％ HPLC-H2O。缓冲液B包含0.02％ TFA、0.08％ FA、0.1％ HPLC-H2O 和99.8％ ACN。HPLC流速为50uL分钟，且样品注射体积为8.0mL。 柱烘箱的温度设定为60℃，且分离梯度为：5％B 5分钟；5％B-65％B 35分钟；65％B-95％B另5分钟；和95％B-5％B 5分钟。TOFMS 扫描为800-2500amu，且循环为3600。为了测定全长DVD-Ig的MW， 使用Protein MicroTrap药液筒(Michrom BioResource，Auburn，MA) 使样品脱盐。HPLC梯度为：5％B 5分钟；5％B-95％B 1分钟；和95 ％B-5％B另4分钟。QSTAR TOFMS扫描为2000-3500amu，且循环 为899。所有MS原始数据使用Analyst QS软件(Applied Biosystems) 进行分析。对于DVD-Ig的SEC分析，将溶于PBS中的纯化的DVD-Ig 和嵌合Abs施加到Superose 6 10/300 G2，300x10mm柱(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)上。对于SEC使用HPLC仪器，Model 10A (Shimadzu，Columbia，MD)。所有蛋白质都使用UV检测在280nm 和214nm处进行测定。洗脱是等度的(isocratic)，流速为0.5mL/分钟。 对于稳定性研究，溶于PBS中的浓度为0.2-0.4mg/ml的样品经历-80℃ 至25℃的3次冷冻融化循环，或于4℃、25℃或40℃温育4周和8周， 随后进行SEC分析。
DVD-Ig和嵌合Abs通过A蛋白层析进行纯化。纯化得率(3-5mg/L) 与每种蛋白质的表达培养基的hIgG定量一致。纯化的DVD-Ig和嵌合 Abs的组成和纯度通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下进行分析。在 非还原条件下，4种蛋白质的每一种作为单一条带迁移。如预期的， DVD-Ig蛋白质显示比嵌合Abs更大的M.W.。在非还原条件下，4种蛋 白质的每一种产生2个条带，1个重链和1个轻链。再次，DVD-Igs的 重和轻链在尺寸方面大于嵌合Abs的那种。SDS-PAGE显示每种DVD-Ig 作为单一种类表达，且重和轻链有效配对以形成IgG样分子。基于氨基 酸序列，重和轻链的大小以及2种DVD-Ig分子的全长蛋白质与其计算 分子量一致(参见表11)。
为了测定DVD-Ig的精确分子量，使用质谱分析法。如表I中所示， 每种DVD-Ig，包括轻链、重链、和全长蛋白质的实验上测定的分子量 与预期值良好一致。为了进一步研究DVD-Ig在溶液中的物理性质，使 用大小排阻层析(SEC)以分析每种蛋白质。嵌合Abs和DVD2-Ig两者 都显示单个峰，从而显示作为单体蛋白质的物理同质性。3D12.E3嵌合 Ab显示比13F5.G5嵌合Ab更小的物理大小，从而指出3D12.E3嵌合 Ab采取更紧凑的球形。DVD1-Ig揭示主峰以及在右侧的肩峰，从而暗 示部分DVD1-Ig在目前的缓冲条件下可能为聚集形式。
实施例1.5：hIL-1a/b DVD-Igs的体外稳定性分析
DVD-Ig的物理稳定性如下测试。溶于PBS中的浓度为0.2-0.4 mg/ml的纯化的抗体经历-80℃至25℃的3次冷冻融化循环，或于4℃、 25℃或40℃温育4周和8周，随后使用大小排阻层析(SEC)分析进行 分析(参见表12)。
表12.hIL-1a/b DVD-Ig经由SEC的体外稳定性分析

1.聚集和片段化程度以百分比显示，而Ab百分比表示完整分子。
2.Agg：聚集；
3.Ab：完整抗体；
4.Frgm：片段。
2种嵌合Abs都显示对于常规IgG分子正常的较小程度的聚集和片 段化。纯化后DVD1-Ig显示在SCE上的某些聚集。在稳定性分析中， 在不同条件下DVD1-Ig也显示在PBS中的聚集；然而，在延长贮存期 间或在较高温度下，聚集形式的DVD1-Ig百分比没有增加。片段化形式 的DVD1-Ig百分比在正常范围内，类似于嵌合3D12.E3 Ab的那种。相 比之下，DVD2-Ig显示异常的稳定性。在所有测试的条件下对于DVD2-Ig 没有检测到聚集或片段化，且100％的DVD2-Ig维持为完整单体分子。
实施例1.6：hIL-1a/bDVD-Igs的抗原结合亲和力测定
与rhIL1-α和rhIL1-β结合的DVD-Ig动力学通过基于表面等离子体 共振的测量，用Biacore 3000仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)使用 HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，和0.005 ％表面活性剂P20)于25℃进行测定。所有化学药品都得自Biacore AB (Uppsala，瑞典)或否则来自如本文所述的不同来源。使用标准胺偶联 试剂盒根据制造商的说明书和25mg/ml时的程序，将在10mM乙酸钠 (pH4.5)中稀释的约5000 RU 山羊抗人IgG Fcγ片段特异性多克隆抗 体(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定化在CM5研究 级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。 在流动室2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动室 1和3中不含山羊抗人IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对 于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1：1 Langmuir 结合模型的速率方程式同时对所有10次注射(使用总体拟合分析)的 结合和解离相拟合。纯化的DVD-Ig样品在HEPES缓冲盐水中进行稀释， 以用于在山羊抗人IgG Fc特异性反应表面上捕获，且以5ml/分钟的流 速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon(M-1s-1)和koff(s-1) 在25ml/分钟的连续流速下进行测定。通过在1.25-1000nM的10种不 同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过下式由动 力学速率常数来计算DVD-Ig和rhIL1α/β之间反应的平衡解离常数(M)： KD＝koff/kon。同时也将等分试样的rhIL1α/β样品注射在空白参照和反 应CM表面上，以记录和减去任何非特异性结合背景以消除大多数折射 率变化和注射噪声。用流速为5ml/分钟的10mM甘氨酸(pH1.5)的2 次后续25ml注射使表面再生。抗Fc抗体固定化的表面被完全再生且经 过12个循环保持其全部捕获能力。捕获的DVD-Ig-rhIL1α/β复合物的表 观化学计量在饱和结合条件下(稳态平衡)使用下式进行计算：

Biacore分析指出嵌合Abs对于IL-1具有的结合动力学和亲和力与 原始杂交瘤mAbs相似，从而指出正确的VL/VH序列已被分离(表III)。 2种DVD-Igs对于hIL-1α的总体结合参数类似，其中DVD-Igs的亲和力 仅为嵌合3D12.E3 Ab的那种的1/3-1/2。DVD2-Ig对于hIL-1β的结合亲 和力略微小于嵌合Ab 13F5.G5，但为DVD1-Ig的那种的3倍。如通过 对于IL-1的化学计量评估指出的，与嵌合Abs对于hIL-1的亲和力相比 较，2种DVD-Igs对于hIL-1的亲和力类似。二价单特异性的2种嵌合 Abs分别以1.6和1.7的化学计量与Biocore上的IL-1α和IL-1β结合。 当抗体密集地固定化在Biacore传感器芯片上时，由于分子间干扰，这 对于IgG是常见的，从而导致1.5-2.0的化学计量。2种DVD-Igs对于 hIL-1α和hIL-1β的化学计量类似于2种嵌合Abs的那种，从而指出2种 DVD-Igs对于每种抗原都具有二价结合能力。
表13.抗IL-1DVD-Ig分子的功能表征
  抗原 kon (M-1s-1) koff (s-1) Kd (M) 化学计量 效力 IC50(M) 3D13.E3 3D12.E3-Ch DVD1-Ig DVD2-Ig hIL-1α hIL-1α hIL-1α hIL-1α 6.43E+05 4.12E+05 3.70E+04 7.35E+04 7.13E-04 5.52E-04 1.05E-04 2.52E-04 1.11E-09 1.34E-09 2.83E-09 3.42E-09 2.0 1.6 1.8 2.0 6.70E-10 7.00E-10 2.30E-09 2.90E-09 13F5.G5 13F5.G5-Ch DVD1-Ig DVD2-Ig hIL-1β hIL-1β hIL-1β hIL-1β 2.13E+06 1.41E+06 6.09E+05 1.19E+06 6.21E-04 6.54E-04 1.59E-03 9.50E-04 2.91E-10 4.62E-10 2.60E-09 7.98E-10 1.8 1.7 1.5 1.8 6.00E-10 5.30E-10 3.10E-09 1.60E-09
亲和力和化学计量通过Biacore测量；效力(IC50)通过MRC-5生 物测定测定。
此外，还通过Biacore分析了DVD-Ig的四价双重特异性抗原结合 (表14)。DVD-Ig首先经由Biacore传感器芯片上的山羊抗人Fc抗体 捕获，且注射第一种抗原并观察到结合信号。当DVD-Ig由第一种抗原 饱和时，随后注射第二种抗原并观察到第二种信号。这通过首先注射 IL-1β随后为IL-1α，或对于DVD2-Ig首先注射IL-1α随后为IL-1β来进 行。在任一顺序中，检测到双重结合活性。对于DVD1-Ig获得类似结果。 因此与双重特异性四价分子一样，每种DVD-Ig能够同时结合2种抗原。 如表IV中所示，2种DVD-Ig对于第一种抗原hIL-1α或hIL-1β的化学 计量大于1.5，类似于非特异性二价结合的那种。在注射第二种抗原后， 尽管DVD-Ig已由第一种抗原占据，但2种DVD-Igs对于第二种抗原(即 hIL-1α或hIL-1β)的化学计量为1.0-1.3。因此DVD-Ig能够结合2个 IL-1α和2个IL-1β分子。DVD-Ig首先经由Biacore传感器芯片上的山羊 抗人Fc抗体捕获，且注射第一种抗原并观察到结合信号，随后注射第 二种抗原。
表14.与IL-1α/β四价双重特异性结合的hIL-1a/b DVD-Ig的化 学计量分析

实施例1.7：DVD-Ig的功能同质性测定
因为DVD2-Ig通过A蛋白层析而不是靶特异性亲和层析进行纯化， 所以任何可能错折叠和/或错配的VL/VH结构域(若存在的话)可以通 过针对2种不同抗原的结合研究进行评估。此类结合分析通过大小排阻 液相层析(SEC)来进行。向柱中施加单独的DVD2-Ig，或以等摩尔比 与IL-1α、IL-1β或IL-1α和IL-1β温育120分钟时间段后的DVD2-Ig。抗 原的每一种也作为对照单独运行。SEC结果指出DVD2-Ig能够结合溶液 中的IL-1α和IL-1β，且此种结合导致SEC信号变化，从而指出当其与 任一抗原复合时DVD2-Ig的动力学大小增加。DVD2-Ig信号的变化是 100％而不是部分的，从而暗示所有DVD2-Ig分子都能够结合抗原。在 IL-1α和IL-1β两者存在下，DVD2-Ig信号有进一步和完全的变化，从而 指出所有DVD2-Ig分子都能够以一致形式结合2种抗原。这个实验证明 DVD-Ig作为功能均质蛋白质表达。这具有显著意义，因为它证实DVD-Ig 可以作为均质单一的功能种类生产，这不同于所有先前描述的双特异 性、多特异性、和多价免疫球蛋白样和免疫球蛋白衍生分子。
实施例1.8：DVD-Ig生物学活性的测定
DVD-Ig的生物学活性使用MRC-5生物测定进行测量。MRC-5细胞 系是以剂量依赖性方式响应人IL-1α和IL-1β生产IL-8的人肺成纤维细 胞细胞系。MRC-5细胞得自ATCC，且在10％ FBS完全MEM中于37℃ 在5％CO2培养箱中进行培养。为了测定DVD-Ig针对人IL-1α或IL-1β 的中和活性，向96孔板中加入溶于MEM/10％ FBS中的50ul Ab(1E-7 -1E-12M)，且与50ul hIL-1α或hIL-1β(200pg/ml)于37℃，5％ CO2 预温育1小时。随后向所有孔中加入浓度为1E5/ml的MRC-5细胞 (100ul)，且使板在5％ CO2培养箱中于37℃温育过夜。收获上清液， 且通过标准ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)测量人IL-8生 产。DVD-Ig的中和活性通过其抑制IL-8生产的能力来测定。
如表13中所示，2种DVD-Igs都能够中和hIL-1α和hIL-1β。与对 于hIL-1α的结合亲和力一致，DVD1-Ig和DVD2-Ig针对hIL-1α的中和 活性也是类似的，即为嵌合Abs的那种的1/3(参见表III)。与其对于 hIL-1β的结合亲和力一致，DVD2-Ig对于hIL-1β的中和活性略微小于 嵌合Ab 13F5.G5的那种，但为DVD1-Ig的那种的3倍。总的来说，与 原始mAbs相比较，DVD-Ig分子的生物学活性没有显著减少。
为了确定在IL-1α和IL-1β的存在下DVD-Ig是否能够抑制IL-8生 产，在MRC-5测定的相同培养系统中加入等量的hIL-1α和hIL-1β。在 IL-1α和IL-1β两者存在下，DVD1-Ig和DVD2-Ig都能够抑制经由MRC-5 细胞的IL-8合成，其活性类似于只存在1种细胞因子时的单一测定的那 种(表13)。在这种测定中，当存在IL-1α和IL-1β两者时，DVD2-Ig 的双重抑制活性(1.2nM)高于DVD1-Ig的那种(2.2nM)。
实施例2：DVD-Ig分子中的接头大小和可变结构域方向分析
如表15中所示，构建具有不同亲本mAb对的另外DVD-Ig分子。 对于每个mAbs对，产生4种不同的DVD-Ig构建体：2种具有短接头且 2种具有长接头，各自为2种不同结构域方向：a-b-C(α-β-恒定结构域) 和b-a-C(β-α-恒定结构域)。来源于人Ck或CH1结构域的N末端序列 的接头序列如下：
短接头：轻链：TVAAP；重链：ASTKGP
长接头：轻链：TVAAPSVFIFPP；重链：ASTKGPSVFPLAP
将所有重和轻链构建体亚克隆到pBOS表达载体内，且在COS细胞 或freestyle 293细胞中表达。
为了构建新DVD克隆，如对于hIL-1abDVD1-Ig和hIL-1abDVD2-Ig 描述的，使用重叠PCR首先将2种mAbs的轻链和重链可变结构域串联 连接。随后使用同源重组将连接的部分亚克隆到pBOS载体中。简言之， 载体通过限制酶切消化进行线性化(2ug pBOS-hCk载体在O+缓冲液中 用FspAI和BsiWI进行消化，且2ug pBOS-hCγz，non a载体在O+缓冲液 中用FspAI和SaII进行消化)。消化的样品在1％琼脂糖凝胶上电泳且 在50ul水中纯化主链片段。对于同源重组和转化，使DH5α感受态细胞 在冰上融化，且与20-50ng连接的PCR产物和20-50ng线性化载体 混合(每50ul DH5α细胞)。随后将混合物轻轻混合且在冰上温育45 分钟，随后于42℃热激1分钟。随后加入100ul SOC培养基且于37℃ 温育1小时。将转化培养物接种到包含氨苄青霉素的LB/琼脂板上，且 于37℃温育18-20小时。分离细菌克隆，从其纯化DNA并实施测序分 析。如先前所述，将最终序列验证的克隆共转染(匹配相同Ab对的HV 和LC)到COS或293细胞中，用于Ab表达和纯化。
纯化的DVD-Ig蛋白质的特征概括于表16中。表16的左侧部分显 示用于构建新hIL-1a/bDVD-Ig分子的2个mAbs对的特异性、结合亲和 力和中和效力。抗体18F4.2C8和1B12.4H4(参见实施例1.1.D)用于构 建hIL-1a/bDVD3a-Ig、hIL-1a/bDVD4a-Ig、hIL-1a/bDVD3b-Ig、和 hIL-1a/bDVD4b-Ig。hIL-1a/bDVD3a-Ig和hIL-1a/bDVD4a-Ig为a-b-C方 向，分别具有短和长接头。hIL-1a/bDVD3b-Ig和hIL-1a/bDVD4b-Ig为 b-a-C方向，分别具有短和长接头。抗体6H3.1A4和6B12.4F6用于构建 hIL-1a/bDVD5a-Ig、hIL-1a/bDVD6a-Ig、hIL-1a/bDVD5b-Ig、和 hIL-1a/bDVD6b-Ig。hIL-1a/bDVD5a-Ig和hIL-1a/bDVD6a-Ig为a-b-C方 向，分别具有短和长接头。hIL-1a/bDVD5b-Ig和hIL-1a/bDVD6b-Ig为 b-a-C方向，分别具有短和长接头。使用重叠PCR程序，使用先前对于 hIL-1a/bDVD1-Ig描述的程序(参见实施例1.3)来进行这些另外 hIL-1a/bDVD-Igs的分子克隆。这些另外hIL-1a/bDVD-Igs的氨基酸序列 公开于表15中。
表15：能够结合IL-1α和IL-1β的6个DVD Ig的重链和轻链氨基酸 序列。












新DVD构建体的特征概括于表16中。亲和力(Kd)和生物学活性 (IC50)分别通过Biacore和MRC-5生物测定来测定。所有新DVD蛋 白质的SDS-PAGE分析显示在还原和非还原条件下正常的迁移模式，类 似于常规抗体和DVD1/2-Ig。
表16.来源于新mAb对的新DVD-Ig分子的表征

NA：没有检测到中和活性。
新DVD分子的功能表征揭示对于任一方向，就2种抗原的结合和 中和而言，具有长接头的DVDs比具有短接头的DVDs表现更佳。就具 有长接头的DVDs而言，具有b-a-C方向的那些显示与2种抗原良好结 合且中和2种抗原，而具有a-b-C方向的DVDs显示与IL-1α良好结合 且中和IL-1α，以及与IL-1β减少的结合且较低中和IL-1β(例如，DVD4b 对DVD4a)。DVD-Ig分子DVD4b以亚nM结合且中和IL-1α和IL-1β 两者，且完全保留亲本mAbs的结合和中和特征。
实施例3：能够结合IL-12和IL-18的DVD-Ig的产生
使用2种亲本mAbs，一种针对人IL-12p40(ABT874)且另一种针 对人IL-18(ABT325)，如上所述构建能够结合IL-12和IL-18的DVD-Ig 分子。产生了4种不同的抗IL12/18 DVD-Ig：2种具有短接头且2种具 有长接头，各自为2种不同结构域方向：12-18-C和18-12-C(表VI)。 来源于人Cλ/Cκ或CH1结构域的N末端序列的接头序列如下：
对于DVD1218构建体(ABT874具有Vλ)：
轻链(λ)：短接头：QPKAAP；长接头：QPKAAPSVTLFPP
重链(γ1)::短接头：ASTKGP；长接头：ASTKGPSVFPLAP
对于DVD1812构建体(ABT325具有Vκ)：
轻链(κ)：短接头：TVAAP；长接头：TVAAPSVFIFPP
重链(γ1)::短接头：ASTKGP；长接头：ASTKGPSVFPLAP
将所有重和轻链构建体亚克隆到pBOS表达载体内，且在COS细胞 或freestyle 293细胞中表达，随后通过A蛋白层析纯化。对纯化的材料 实施SDS-PAGE和SEC，且其特征类似于DVD2-Ig的那种。
下表17描述了用于表达每种抗IL12/IL18 DVD-Ig蛋白质的重链和 轻链构建体。
表17.表达抗IL12/IL18 DVD-Ig蛋白质的构建体
  DVD-Ig蛋白质 重链构建体 轻链构建体 DVD1218SL DVD1218HC-SL DVD1218LC-SL DVD1218LL DVD1218HC-LL DVD1218LC-LL DVD1812SL DVD1812HC-SL DVD1812LC-SL DVD1812LL DVD1812HC-LL DVD1812LC-LL
实施例3.1.1：关于DVD1218SL和DVD1218LL的DVD构建体的 分子克隆：
为了产生重链构建体DVD1218HC-LL和DVD1218HC-SL，分别使 用引物1和引物2L或引物2S PCR扩增ABT-874的VH结构域；同时分 别使用引物3L或引物3S和引物4扩增ABT-325的VH结构域。2种PCR 反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯 化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物1和4 使用标准PCR条件。通过使用标准同源重组方法，将重叠PCR产物亚 克隆到Srf I和Sal I双重消化的pBOS-hCγ1，z non-a哺乳动物表达载体 (Abbott)内。
为了产生轻链构建体DVD1218LC-LL和DVD1218LC-SL，分别使用 引物5和引物6L或引物6S PCR扩增ABT-874的VL结构域；同时分别 使用引物7L或引物7S和引物8扩增ABT-325的VL结构域。2种PCR 反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行凝胶纯 化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物5和8 使用标准PCR条件。通过使用标准同源重组方法，将重叠PCR产物亚 克隆到Srf I和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体(Abbott) 内。用于这些构建的引物在下表18中列出：
表18：
  引物1：TAGAGATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCA CCATGGAGTTTGGGCTGAGC SEO ID NO.：61 引物2- S：CACCTCTGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTGT SEQ ID NO.：62 引物2- L：GGGTGCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGA GACGGTGACCATTGT SEQ ID NO.：63 引物3- S：TCTTCAGCGTCGACCAAGGGCCCAGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT SEQ ID NO.：64 引物3- L：GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCGAGGTG CAGCTGGTGCAGTCT SEQ ID NO.：65 引物4：GTAGTCCTTGACCAGGCAGCC SEQ ID NO.：66 引物5：TAGAGATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCA CCATGACTTGGACCCCACTC SEQ ID NO.：67 引物6- S：TATTTCGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGTACTGTGACCTTGGT SEQ ID NO.：68 引物6- L：GGGCGGGAACAGAGTGACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTA GTACTGTGACCTTGGT SEQ ID NO.：69 引物7- S：CTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCGAAATAGTGATGACGCAGTCT SEQ ID NO.：70 引物7- L：CAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTT CCCGCCCGAAATAG TGATGACGCAGTCT SEQ ID NO.：71 引物8：GTCCCAGGTGGGGACCCTCACTCTAGAGTCGCGGCCGCCTA ACACTCTCCCCTGTTGAA SEQ ID NO.：72
类似方法已用于如下所述产生DVD1812SL和DVD1812LL：
实施例3.1.2：关于DVD1812SL和DVD1812LL的DNA构建体的 分子克隆：
为了产生重链构建体DVD 1812HC-LL和DVD1812HC-SL，分别使 用引物1和引物9L或引物9S PCR扩增ABT-325的VH结构域；同时分 别使用引物10L或引物10S和引物4扩增ABT-874的VH结构域。2种 PCR反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行凝 胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物1 和4使用标准PCR条件。通过使用标准同源重组方法，将重叠PCR产 物亚克隆到Srf I和Sal I双重消化的pBOS-hCγ1，z non-a哺乳动物表达载 体(Abbott)内。下述是引物的序列：
为了产生轻链构建体DVD1812LC-LL和DVD1812LC-SL，分别使用 引物11和引物12L或引物12S PCR扩增ABT-325的VL结构域；同时 分别使用引物13L或引物13S和引物14扩增ABT-874的VL结构域。2 种PCR反应都根据标准PCR技术和程序来进行。将2种PCR产物进行 凝胶纯化，且一起用作重叠模板用于后续重叠PCR反应，其中使用引物 11和14使用标准PCR条件。通过使用标准同源重组方法，将重叠PCR 产物亚克隆到Srf I和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体 (Abbott)内。用于这些构建的引物在下表19中列出：
表19：
  引物9-S： CACCTGTGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTGT SEQ ID NO.：73 引物9-L： GGGTGCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAG ACGGTGACCATTGT SEQ ID NO.：74 引物10- S：TCTTCAGCGTCGACCAAGGGCCCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT SEQ ID NO.：75 引物10- L：GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCCAGGTG CAGCTGGTGGAGTCT SEQ ID NO.：76 引物11： TAGAGATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATG GAAGCCCCAGCGCAGCTT SEQ ID NO.：77 引物12-S： AGACTGTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTAATCTCCAGTCGTGT SEQ ID NO.：78 引物12- L：TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTAAT CTCCAGTCGTGT SEQ ID NO.：79 引物13-S： AAACGAACTGTGGCTGCACCACAGTCTGTGCTGACTCAGCCC SEQ ID NO.：80 引物13- L：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCACAGTCTGTGC TGACTCAGCCC SEQ ID NO.：81 引物14： GTCCCAGGTGGGGACCCTCACTCTAGAGTCGCGGCCGCTCATGAAC ATTCTGTAGGGGC SEQ ID NO.：82
关于抗IL12/IL-18 DVD-Ig的8个重和轻链构建体的最终DNA序列 显示于表20中：
表20：能够结合IL-12和IL-18的DVD结合蛋白的氨基酸序列







实施例3.2.：IL-12/IL-18 DVD Igs的抗原结合亲和力的测定
抗IL-12/18DVD-Igs对于hIL-12和hIL-18的结合亲和力通过Biacore 来测定(表21)。针对IL-18的中和活性通过KG-1测定(Konishi，K. 等人)来测定。简言之，IL-18样品(终浓度为2ng/ml)与DVD-Ig(终 浓度为0-10mg/ml)于37℃预温育1小时，随后加入在包含10ng/ml hTNF的RPMI培养基中的KG-1细胞(3 x 106/ml)中，随后于37℃温育 16-20小时。收集培养上清液且通过ELISA(R&D Systems)测定每种 样品中的人IFN-γ生产。针对IL-18的DVD分子的抑制活性呈现为IC50 值，显示于表VI中。为了测定抗IL-12/18 DVD分子针对IL-12的抑制 活性，使用来自活化的PHA母细胞的IL-12诱导的IFN-γ生产测定 (D’Andrea，A等人)。对于人IFN-γ的生产，PHA母细胞与人IL-12 温育18小时。用200pg/ml的人IL-12浓度获得亚最大刺激(最大值的 55-75％)。使用特异性人IFN-γ ELISA(Endogen，Cambridge，MA) 测定上清液的IFN-γ。中和性IL-12DVDs干扰IL-12诱导的IFN-γ生产。 如表21中所示，通过测量抑制50％经由人PHA母细胞的IFN-γ生产所 需的DVD浓度来测定DVD的中和活性。
表21.抗IL-18/IL-12 DVD-Ig分子的表征

亲和力(Kd)通过Biacore来测定，且效力(IC50)通过KG-1生 物测定(IL-18)和PBMC测定(IL-12)来测定。
表21显示了用于构建抗IL-12/IL-18DVD分子的2种全人mAbs的 特异性、结合亲和力和中和活性。如表VI中所示，这些mAbs具有高亲 和力和中和活性。抗IL-18/IL-12DVD构建体的特征概括显示于表VI中。 所有新DVD蛋白质的SDS-PAGE分析显示在还原和非还原条件下正常 的迁移模式，类似于常规抗体和DVD 1/2-Ig。SEC分析指出所有分子都 是正常的，显示200 kD区域中的峰。Biacore结合数据与生物学测定中 的中和活性一致。
实施例3.3：抗IL-12/IL-18 DVD-Ig的体内生物学活性
IL-12和IL-18两者都是响应各种刺激产生最佳IFNγ所需的。抗 IL-12/IL-18DVD-Ig的体内生物学活性使用huPBMC-SCID小鼠模型来 测定。在这种模型中，腹膜内或静脉内注射(各为250mg/小鼠)抗IL-12 抗体(ABT-874)、抗IL-18抗体(ABT-325)或抗IL-12/抗-IL-18DVD-Ig， 随后将新鲜纯化的人PBMCs(huPBMC)腹膜内转移到SCID小鼠内。 15分钟后，小鼠用干燥的金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细 胞(SAC)进行攻击，以诱导人IFNγ生产。18-20小时后处死动物(n＝7 -8/组)，且通过ELISA测定血清huIFNγ水平。ABT 874和ABT-325 使SAC诱导的IFNγ抑制约70％，这代表每种化合物在这种模型中最大 限度的IFNγ抑制。然而，用ABT-874+ABT-325和抗IL-12/抗IL-18 DVD-Ig处理小鼠使IFN-γ生产抑制几乎100％。这些结果暗示抗IL-12/ 抗IL-18 DVD-Ig分子在体内是有功能活性的。
实施例3.4 抗IL-12/IL-18 DVD-Ig的药物代谢动力学和药物动力学 研究
抗IL-12/IL-18 DVD-Ig的总体药物代谢动力学和药物动力学特征在 小鼠中类似于亲本mAbs，即73％的生物药效率，比得上常规IgG。对 于其他mAbs(例如，人，大鼠等)同样观察到类似的药物代谢动力学， 即6-8天后快速清除，可能是由于抗人IgG应答。
雄性SD大鼠用抗IL-12/IL-18 DVD-Ig以4mg/kg静脉内或皮下给 药。PK曲线的早期部分看起来正常且非常类似于其他人抗体的那些。 因为在第6天时开始的DVD-Ig快速清除，所以无法获得2个组中的精 确半衰期。DVD-Ig浓度在第6天后的突然下降可能是由于RAHA应答。 然而，对于在这个具体实验中用于构建这种DVD-Ig的亲本抗体之一 (ABT-874)，以及先前研究的其他单特异性人抗体也已观察到类似特 征。基于皮下和静脉内组中最高至第6天的DVD-Ig浓度，估计DVD-Ig 的生物药效率。3只大鼠中的2只显示80-95％的生物药效率，且3只 大鼠中的平均生物药效率为73％。
实施例3.5：抗IL-12/抗IL-18 DVD-Ig的物理/化学表征
293细胞衍生的、A蛋白纯化的、抗IL-12/抗IL-18 DVD-Ig的物理 和化学表征结果概括于表22中。
表22.抗IL-12/抗IL-18 DVD-Ig的物理/化学表征

实施例3.6：另外的抗12/抗18 DVD-Ig(1D4.1-ABT325)的产生
如表23中所示，用不同亲本抗IL-12 mAb(克隆#1D4.1)构建另 外的抗IL-12/IL-18 DVD-Ig分子。用来源于人Ck和CH1结构域的N末 端序列的如下短接头产生1D4.1-ABT325 DVD-Ig构建体：
短接头：轻链：TVAAP；重链：ASTKGP
将所有重和轻链构建体亚克隆到pBOS表达载体内，且在COS细胞 或freestyle 293细胞中表达，且如上所述进行表征。1D4.1-ABT325 DVD-Ig完全保留了2种原始mAbs的活性(表24)。
表23：1D4.1-ABT325 DVD-Ig的氨基酸序列


表24.1D4.1-ABT325 DVD-Ig分子的表征

亲和力(Kd)通过Biacore来测定，且效力(IC50)通过KG-1生 物测定(IL-18)和PBMC测定(IL-12)来测定。
实施例4：抗CD20/抗CD3 DVD-Ig的产生
抗CD20/抗CD3 DVD-Igs使用鼠抗人CD20(克隆5F1)和抗人CD3 (克隆OKT3)亲本抗体来产生。最初的构建体包括具有不同结构域方 向的2种DVD-Igs。抗CD3/抗CD20 DVD-Ig以VCD3-接头-VCD20-恒定区 的顺序构建，且抗CD20/抗CD3 DVD-Ig以VCD20-接头-VCD3-恒定区的顺 序构建。然而，在初步细胞表面结合研究中，抗CD20结合活性在抗CD3/ 抗CD20 DVD-Ig分子中减小，尽管抗CD3活性在这种设计中保留。相 比之下，抗CD3和抗CD20结合活性在抗CD20/抗CD3 DVD-Ig分子中 完全保留，从而指出这对于DVD-Ig形式的这2种mAbs/靶组合是最佳 结构域方向。因此选择抗CD20/抗CD3 DVD-Ig构建体用于后续研究。
抗CD20/抗CD3 DVD-Ig作为嵌合Ig产生，即恒定区是人恒定区。 对于结合分析，人T细胞系Jurkat和B细胞系Raji用人IgG封闭，且随 后用鼠抗hCD3 mAb OKT3、鼠抗hCD20 mAb 1F5、和抗CD20/抗CD3 DVD-Ig染色。细胞随后进行洗涤，且用FITC标记的山羊抗鼠IgG(无 抗hIgG交叉反应性)染色。抗CD20/CD3 DVD-Ig结合T和B细胞两者， 而CD3和CD20 mAbs只分别结合T或B细胞。CD20/CD3 DVD-Ig的氨 基酸序列公开于表25中。
表25：CD20CD3DVD-Ig的氨基酸序列



实施例5：mIL-1α/βDVD-Ig的产生
为了研究关于DVD-Ig分子的药物代谢动力学、体内功效、组织穿 透和免疫原性的主要问题，如下所述构建小鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig分 子。
实施例5.1：mIL-1α/β DVD-Ig的构建
使用由IL-1αβ双重KO小鼠产生的2种小鼠抗小鼠IL-1α/β mAbs (9H10和10G11)构建小鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig分子。小鼠抗小鼠 IL-1α和小鼠抗小鼠IL-1β单克隆抗体通过分别用小鼠IL-1α或小鼠IL-1β 免疫IL-1 α/β双重KO小鼠来产生。选择一种小鼠抗小鼠IL-1α(克隆 9H10)、和一种小鼠抗小鼠IL-1β mAb(克隆10G11)，且用于产生 mIL-1α/β DVD-Ig分子。测试各种接头大小和不同结构域方向。最终功 能性mIL-1α/β DVD-Ig分子以V(抗mIL-1β)-接头-V(抗mIL-1β)-鼠 恒定区(Cγ2a和Cκ)的方向构建。克隆、表达和纯化程序类似于hIL-1 α/β DVD-Ig的那种。mIL-1α/β DVD-Ig的克隆使用如对于hIL-1α/β DVD3-Ig 所述的类似重叠PCR和同源重组来进行。mIL-1α/β DVD-Ig序列显示于 下表26中：
表26：mIL-1 α/β DVD-Ig的氨基酸序列


鼠mIL-1α/βDVD-Ig保留针对IL-1α和IL-1β的亲和力/体外效力。表 27显示了mAbs 9H10(抗mIL-1α)、10G11(抗mIL-1β)、和 mIL-1α/β DVD-Ig的特征。
表27.m DVD4-Ig的特征
  抗原 KD(M) IC50(M) 9H10 mIL-1α 1.73E-10 2.00E-10 10G11 mIL-1D 2.30E-10 3.70E-10 mIL-1α/βDVD-Ig mIL-1α 7.66E-10 2.00E-09 mIL-1β 6.94E-10 8.00E-10
实施例5.2：mIL-1α/β DVD-Ig在关节炎模型中的体内活性：
在本领域众所周知的胶原诱导的关节炎小鼠模型中评估抗IL-1α、抗 IL-1β、组合抗IL-1α/抗IL-1β、和鼠抗IL-1α/β DVD4-Ig的疗效。简言之， 雄性DBA-1小鼠用牛II型胶原在CFA中在尾基部进行免疫。小鼠在第21 天时用酵母聚糖腹膜内(i.p)加强。疾病在第24-27天时发作后，选择 小鼠且分成各10只小鼠的分开组。对照组和抗细胞因子组的平均关节炎 得分在处理开始时是可比较的。为了中和IL-1，小鼠每隔一天用1-3 mg/kg抗IL-1αmAb、抗IL-1βmAb、抗IL-1α/抗IL-1βmAbs组合、或鼠抗 IL-1α/β DVD4-Ig进行腹膜内注射。每周仔细检查3次小鼠在外周关节中的 关节炎视觉表现，且测定关于疾病活性的得分。
治疗模式中的IL-1封闭有效降低关节炎的严重性，其中抗IL-1β显示 比抗IL-1α(减少10％)更大的功效(与对照组比较，平均关节炎得分减 少24％)。在抗IL-1α和抗IL-1β之间观察到加性效应，其中在用抗IL-1α 和抗IL-1β mAbs处理的小鼠中，平均关节炎得分减少40％。令人惊讶的 是，在相同剂量水平上，m DVD-Ig处理显示平均关节炎得分减少47％， 从而证实了m DVD-Ig的体内治疗效果。类似功效也在该动物模型的关节 肿胀测量中观察到。
本发明整体引入分子生物学和药物递送领域中众所周知的技术作 为参考。这些技术包括但不限于，下述出版物中描述的技术：
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5,624,821；5,627,052，5,641,870；5,648,260；5,658,727；5,677,171；5,679,377；5,693,762；
5,698,426；5,714,350；5,714,352；5,723,323；5,733,743；5,736,137；5,750,753；5,763,192；
5,766,886；5,780,225；5,814,476；5,817,483；5,821,047；5,824,514；5,855,913；5,874,064；
5,891,996；5,912,015；5,916,771；5,934,272；5,939,598；5,969,108；5,976,862；5,985,320；
5,985,309；5,985,615；5,989,463；5,998,209；6,019,968；6,075,181；6,091,001；6,114,598；
6,130,364；6,180,370；6,204,023；6,235,883；6,258,5626,350,861；6,506,883；6,699,658；6,914,128
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尽管上文已描述了许多实施方案和特征，但本领域技术人员将理 解，在不背离如附加权利要求中限定的本公开内容或本发明的情况下， 即可进行所述实施方案和特征的修改和变化。本文提及的每种出版物都 引入作为参考。
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2005年8月19日提交的美国临时申请号60/709,911、 和于2005年11月2日提交的美国临时申请号60/732,892的优先权利 益。