关节炎的治疗药
阅读：777发布：2020-05-16
专利汇可以提供关节炎的治疗药专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供作为有效成分含有抗FGF－8中和 抗体 的关节炎的 预防 药或 治疗 药、 软骨保护剂 、关节破坏 抑制剂 、滑膜增殖抑制剂，以及作为有效成分含有抗FGF－8抗体的关节炎的诊断药和使用该抗体的关节炎的判定方法。，下面是关节炎的治疗药专利的具体信息内容。
1、一种关节炎的预防药或治疗药，其中，作为有效成分含有与FGF -8特异性结合并且抑制FGF-8活性的抗体。
2、根据权利要求1所述的医药，其特征在于，与FGF-8特异性结合 并且抑制FGF-8活性的抗体是单克隆抗体。
3、根据权利要求2所述的医药，其中，单克隆抗体是选自杂交瘤产 生的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
4、根据权利要求3所述的医药，其中，杂交瘤是杂交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
5、根据权利要求3所述的医药，其中，人源化抗体是人型嵌合抗体 或人型互补决定区CDR移植抗体。
6、根据权利要求5所述的医药，其中，人型嵌合抗体是由与FGF-8 特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的抗体重链可变区VH和 抗体轻链可变区VL、以及人抗体的抗体重链恒定区CH以及抗体轻链恒定 区CL构成的人型嵌合抗体。
7、根据权利要求6所述的医药，其中，人型嵌合抗体是以下(a)～ (c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列并且VL含有序列编号6所示 氨基酸序列的人型嵌合抗体。
8、根据权利要求7所述的医药，其中，人型嵌合抗体是转化体KM3034 (FERM BP-7836)产生的人型嵌合抗体。
9、根据权利要求5所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是含有与 FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH和VL的CDR以 及人抗体的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
10、根据权利要求9所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是由与FGF -8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人 抗体的VH以及VL的框架区FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移 植抗体。
11、根据权利要求9或10所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12所示 的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
12、根据权利要求9或10所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸 序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号 的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr 中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列 的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸 序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体。
13、根据权利要求9或10所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列，并且VL含有序列 编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人 型CDR移植抗体。
14、根据权利要求13所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以下 (a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号21 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号44 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且含有为VL序列编号 50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
15、根据权利要求9或10所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗体。
16、根据权利要求3所述的医药，其中，抗体片段是选自Fab、Fab’、 F(ab’)2、单链抗体scFv、二聚体可变区V区片段diabody、二硫键稳 定的V区片段dsFv以及含有CDR的肽的抗体片段。
17一种关节炎的诊断药，其中，作为有效成分含有与FGF-8特异性 结合的抗体。
18、根据权利要求17所述的诊断药，其中，与FGF-8特异性结合的 抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
19、根据权利要求18所述的诊断药，其中，单克隆抗体是选自杂交 瘤产生的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
20、根据权利要求19所述的诊断药，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
21、根据权利要求19所述的诊断药，其中，人源化抗体是人型嵌合 抗体或人型CDR移植抗体。
22、根据权利要求21所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是由与FGF -8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以及CL构成 的人型嵌合抗体。
23、根据权利要求22所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是以下 (a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列并且VL含有序列编号6所示 氨基酸序列的人型嵌合抗体。
24、根据权利要求23所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是转化体 KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
25、根据权利要求21所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是含 有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗体的CH以 及CL的人型CDR移植抗体。
26、根据权利要求25所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是由 与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的VH以及 VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗体。
27、根据权利要求25或26所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12所示 的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
28、根据权利要求25或26所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的以上氨基酸 序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号 的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr 中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列 的人型CDR移植抗体
(c)含有VH序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸 序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体。
29、根据权利要求25或26所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)含有LV为序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或 51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列 编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人 型CDR移植抗体。
30、根据权利要求29所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号21所 示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号44所 示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号50所 示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
31、根据权利要求25或26所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)产生的人型CDR移植抗体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)产生的人型CDR移植抗体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)产生的人型CDR移植抗体。
32、根据权利要求19所述的诊断药，其中，抗体片段是选自Fab、 Fab’、F(ab’)2、单链抗体scFv、二聚体化V区片段diabody、二硫键 稳定的V区片段dsFv以及含有CDR的肽的抗体片段。
33、一种关节炎的判定方法，其特征在于，利用与FGF-8特异性结 合的抗体检测和/或定量试样中的FGF-8。
34、根据权利要求33所述的判定方法，其中，与FGF-8特异性结合 的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
35、根据权利要求34所述的判定方法，其中，单克隆抗体是选自杂 交瘤产生的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
36、根据权利要求35所述的判定方法，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
37、根据权利要求35所述的判定方法，其中，人源化抗体是人型嵌 合抗体或人型CDR移植抗体。
38、根据权利要求37所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是由与 FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以及CL构 成的人型嵌合抗体。
39、根据权利要求38所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是以下 (a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6所 示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
40、根据权利要求39所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是转化 体KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
41、根据权利要求37所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体是 含有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗体的CH 以及CL的人型CDR移植抗体。
42、根据权利要求41所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体是 由与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的VH以 及VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗体。
43、根据权利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗 体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12所示 的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所示的氨 基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
44、根据权利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗 体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸 序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号 的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr 中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列 的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13 号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、 74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号 的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸 序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体。
45、根据权利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗 体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列 编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人 型CDR移植抗体。
46、根据权利要求45所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体是 以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号21所 示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号44 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号50 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
47、根据权利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗 体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗体。
48、根据权利要求(35)所述的判定方法，其中，抗体片段是选自 Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体scFv、二聚体V区片段diabody、二 硫键稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
49、一种关节破坏抑制剂，其中，作为有效成分含有与FGF-8特异 性结合并且抑制FGF-8活性的抗体。
50、一种软骨保护剂，其中，作为有效成分含有与FGF-8特异性结 合并且抑制FGF-8活性的抗体。
51、一种滑膜增殖抑制剂，其中，作为有效成分含有与FGF-8特异 性结合并且抑制FGF-8活性的抗体。
技术领域
本发明涉及到作为有效成分含有抗FGF-8抗体的关节炎的预防药 或治疗药、关节炎破坏抑制剂、软骨保护剂、滑膜增殖抑制剂、关节炎 的诊断药以及采用该抗体的关节炎的判定方法。
背景技术
在高龄社会中，患有关节病症的人确实正在增加。对称之为关节疾 病的代表性的变形性关节病、或关节风湿病的疾病进行早期诊断和筛 选、或患者的预后判定确实非常重要，该治疗可以提高很多高龄人的生 活质量，但十分有效的诊断和治疗方法还没有确立。
关节软骨是富含包被关节可动面的少数软骨细胞和丰富的细胞外 基质的组织，没有血管和神经分布，主要接受来自包被关节内面的滑膜 产生的滑液的营养补给。另外不仅没有血管，而且对来自富含血管网的 周围组织的血管的侵入表现出强的抵抗性。软骨细胞对细胞外基质合 成、分解两方面进行复杂调控，对细胞外基质的恒定性的维持起着中心 作用。细胞因子、生长因子等化学因子和荷重负荷等的力学因子通过作 用于软骨细胞，改变细胞外基质合成、分解的两者平衡，影响细胞外基 质代谢。
变形性关节病的原因为年龄增长或机械的应力，引起关节软骨表面 的崩坏以及伴随而来的关节边缘的新的软骨的增殖、关节的变形、适合 性的破绽，甚至发展到关节滑膜的发炎。变形性关节炎是关节的软骨的 慢行变性，以常常疼痛和功能丧失为特征的单关节病(Manek M.J.and Lane N.E.，Am.Fam.Physician，61，1795-1804，2000)。
关节风湿病是以免疫异常或感染症为起因，炎性细胞浸润滑膜，进 而，伴随血管新生，滑膜纤维芽细胞的增殖亢进，形成称之为血管翳的 炎性滑膜肉芽组织。如果形成血管翳，骨和软骨的破坏发展，引起关节 不可逆的损伤。在骨和软骨被破坏过程中，大量存在的胶原和蛋白聚糖 等各种细胞外基质被分解。
在变形性关节病和关节风湿病等的关节病中，滑膜炎症和细胞外基 质的破坏与关节软骨的功能丧失有关。
变形性关节病和关节风湿病从病因论的观点看是完全不同的疾病， 但在关节软骨破坏机制上有许多共通点。在关节滑液以及滑膜、软骨等 的关节局部产生、分泌多种基质金属蛋白酶，在关节局部检测出过量的 基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶由于分解多种细胞外基质，这是关节 破坏的一个原因。虽然他们是由炎症滑膜、巨噬细胞、中性白细胞和软 骨细胞产生的，但他们的产生受到在相同的关节局部产生分泌的种种细 胞因子、活性氧、一氧化氮、前列腺素、生长因子等调节。有报道说他 们诱导滑膜细胞、软骨细胞产生基质金属蛋白酶后，促进细胞外基质的 分解。
根据这些报道认为除了变形性关节病和关节风湿病之外，在由于自 身抗体的出现和免疫复合体的组织沉着引起的炎性组织损伤的原因不 明的疾病中，关节病高频率出现的全身性红斑狼疮、强直性关节炎、伴 随合并干癣病患者的滑膜增殖直至骨破坏的干癣性关节炎、确认椎间盘 的细胞外基质的破坏的椎问盘疾病、急性结晶性滑膜炎(痛风、假痛风) 的关节病(広 和志等人编风湿病学同人书院1989年)中，通过抑 制滑膜的增殖和软骨破坏，可以进行治疗。
以往，关节风湿病的药物疗法主要是为了减轻关节的疼痛和炎症， 使用以种种非甾体消炎药、氢化泼尼松等类固醇剂和氨甲蝶呤为首的抗 风湿药(治疗，78，3553-3558，南山堂，1996)。在变形性关节病中， 为了消除疼痛和炎症，给予各种非甾体消炎药和镇痛剂，关节注入剂透 明质酸制剂等。抑制软骨破坏的透明质酸作为软骨保护剂使用 (Creamer P.，J.Rheum.，20，1461-1464，1993，Arthritis Rheum.，43，1905-1915，2000)。另外也实施理疗法、骨切除术、人工关 节置换术等手术疗法．对于全身性红斑狼疮，使用非甾体消炎药和氢化 泼尼松等类固醇剂，对强直性关节炎的非甾体消炎药和抗风湿药柳氮磺 胺吡啶，对于伴随合并干癣病患者的滑膜增殖直至骨破坏的干癣性关节 炎使用非甾体消炎药、抗风湿药和类固醇的关节内注入，对于确认椎间 盘的细胞外基质的破坏的椎间盘疾病使用非甾体消炎药和镇痛药，对于 急性结晶性滑膜炎使用非甾体消炎药和秋水仙素(広 和志等人编风 湿病学同文书院1989年)，这样的药物疗法是对症疗法，充分抑制关 节的破坏是困难的。
现在，在关节风湿病的治疗中，要预防关节破坏少的积极疗法的选 择正被人们接受，在尽可能早的阶段诊断为关节风湿病，如何适当选择 以柳氮磺胺吡啶为首的抗风湿药成为关键，但还不是充分有效的疗法。
作为存在于生物体内的各种各样的生长因子之一的纤维芽细胞增 殖因子(以下略为FGF)作为作用于血管内皮细胞的乙酰肝素结合性增 殖因子已为人们所知。另外，在FGF家族中存在19种以上，而FGF-2 (碱性FGF)和FGF-1(酸性FGF)等人们很早就知道。FGF受体到 现在为止已经发现了7种，在细胞内区域编码酪氨酸激酶。
FGF-8是作为雄激素诱导增殖因子(AIGF)从表现出性激素依赖 性增殖的鼠乳腺癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J.Steroid Biochem.，27，459-464，1987)的培养上清中分离出的因子，由于雄激素刺 激，产生诱导，自分泌使SC-3细胞增殖的增殖因子(Tanaka A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)。有报道说FGF-8促 进前列腺癌的细胞和纤维芽细胞的增殖(Tanaka A.et al.，FEBS Lett.， 363，226-230，1995)。报道说FGF-8与FGF受体-2IIIc、FGF受体- 3IIIc、FGF受体-4的3种受体结合(Ornitz D.M.et al.，J.Biol.Chem.，271，15292-15297，1996)。在FGF的作用中与多配体蛋 白聚糖等膜型乙酰肝素硫酸蛋白聚糖的结合是不可缺的。与乙酰肝素硫 酸的结合是为了在局部稳定蓄积FGF所必需的。认为在炎症等组织改变 的状况下，通过乙酰肝素硫酸被分解，FGF由细胞外基质游离出来，发 挥其活性。在软骨中含有象FGF-2那样的强的血管新生因子(Satoh H.et al.，J.Biol.Chem.，273，12307-12315，1998)。而对于关节炎来说，滑 膜细胞、软骨细胞和侵入的炎症细胞显著地合成高水平的FGF-1和 FGF-2(Sano H.et al.，J.Cell Biol.，110，1417-1426，1990、Remmers E.F.，Growth factors，2，179-188，1990)、风湿病患者的关节液中的FGF -2的浓度与关节病症有关(Manabe N.et al.，Rheumatology，38， 714-720，1999)。FGF-2与变形性关节病中的骨刺形成有关(Uchino M.et al.，Clin.Orthopl.，377，119-125，2000)。这些报告表明FGF-1和FGF -2与关节炎有关。
在使用FGF-8人工破坏特定基因小鼠的报告中，认为FGF-8出现 在关节发生阶段(Haraguchi R.et al.，Development，127，2471-2479， 2000；Lewandoski M.et al.，Nat.Genet.，26，460-463，2000)，但还不了解 FGF-8与关节炎的关系。
关节软骨是富含包被关节可动面的少数软骨细胞和丰富的细胞外 基质的组织，没有血管和神经分布，主要接受来自包被关节内面的滑膜 产生的滑液的营养补给。另外不仅没有血管，而且对来自富含血管网的 周围组织的血管的侵入表现出强的抵抗性。软骨细胞对细胞外基质合 成、分解两方面进行复杂调控，对细胞外基质的恒定性的维持起着中心 作用。细胞因子、生长因子等化学因子和荷重负荷等的力学因子通过作 用于软骨细胞，改变细胞外基质合成、分解的两者平衡，影响细胞外基 质代谢。
变形性关节病的原因为年龄增长或机械的应力，引起关节软骨表面 的崩坏以及伴随而来的关节边缘的新的软骨的增殖、关节的变形、适合 性的破绽，甚至发展到关节滑膜的发炎。变形性关节炎是关节的软骨的 慢行变性，以常常疼痛和功能丧失为特征的单关节病(Manek M.J.and Lane N.E.，Am.Fam.Physician，61，1795-1804，2000)。
关节风湿病是以免疫异常或感染症为起因，炎性细胞浸润滑膜，进 而，伴随血管新生，滑膜纤维芽细胞的增殖亢进，形成称之为血管翳的 炎性滑膜肉芽组织。如果形成血管翳，骨和软骨的破坏发展，引起关节 不可逆的损伤。在骨和软骨被破坏过程中，大量存在的胶原和蛋白聚糖 等各种细胞外基质被分解。
在变形性关节病和关节风湿病等的关节病中，滑膜炎症和细胞外基 质的破坏与关节软骨的功能丧失有关。
变形性关节病和关节风湿病从病因论的观点看是完全不同的疾病， 但在关节软骨破坏机制上有许多共通点。在关节滑液以及滑膜、软骨等 的关节局部产生、分泌多种基质金属蛋白酶，在关节局部检测出过量的 基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶由于分解多种细胞外基质，这是关节 破坏的一个原因。虽然他们是由炎症滑膜、巨噬细胞、中性白细胞和软 骨细胞产生的，但他们的产生受到在相同的关节局部产生分泌的种种细 胞因子、活性氧、一氧化氮、前列腺素、生长因子等调节。有报道说他 们诱导滑膜细胞、软骨细胞产生基质金属蛋白酶后，促进细胞外基质的 分解。
根据这些报道认为除了变形性关节病和关节风湿病之外，在由于自 身抗体的出现和免疫复合体的组织沉着引起的炎性组织损伤的原因不 明的疾病中，关节病高频率出现的全身性红斑狼疮、强直性关节炎、伴 随合并干癣病患者的滑膜增殖直至骨破坏的干癣性关节炎、确认椎间盘 的细胞外基质的破坏的椎问盘疾病、急性结晶性滑膜炎(痛风、假痛风) 的关节病(広 和志等人编风湿病学同人书院1989年)中，通过抑 制滑膜的增殖和软骨破坏，可以进行治疗。
以往，关节风湿病的药物疗法主要是为了减轻关节的疼痛和炎症， 使用以种种非甾体消炎药、氢化泼尼松等类固醇剂和氨甲蝶呤为首的抗 风湿药(治疗，78，3553-3558，南山堂，1996)。在变形性关节病中， 为了消除疼痛和炎症，给予各种非甾体消炎药和镇痛剂，关节注入剂透 明质酸制剂等。抑制软骨破坏的透明质酸作为软骨保护剂使用 (Creamer P.，J.Rheum.，20，1461-1464，1993，Arthritis Rheum.，43，1905-1915，2000)。另外也实施理疗法、骨切除术、人工关 节置换术等手术疗法．对于全身性红斑狼疮，使用非甾体消炎药和氢化 泼尼松等类固醇剂，对强直性关节炎的非甾体消炎药和抗风湿药柳氮磺 胺吡啶，对于伴随合并干癣病患者的滑膜增殖直至骨破坏的干癣性关节 炎使用非甾体消炎药、抗风湿药和类固醇的关节内注入，对于确认椎间 盘的细胞外基质的破坏的椎间盘疾病使用非甾体消炎药和镇痛药，对于 急性结晶性滑膜炎使用非甾体消炎药和秋水仙素(広 和志等人编风 湿病学同文书院1989年)，这样的药物疗法是对症疗法，充分抑制关 节的破坏是困难的。
现在，在关节风湿病的治疗中，要预防关节破坏少的积极疗法的选 择正被人们接受，在尽可能早的阶段诊断为关节风湿病，如何适当选择 以柳氮磺胺吡啶为首的抗风湿药成为关键，但还不是充分有效的疗法。
作为存在于生物体内的各种各样的生长因子之一的纤维芽细胞增 殖因子(以下略为FGF)作为作用于血管内皮细胞的乙酰肝素结合性增 殖因子已为人们所知。另外，在FGF家族中存在19种以上，而FGF-2 (碱性FGF)和FGF-1(酸性FGF)等人们很早就知道。FGF受体到 现在为止已经发现了7种，在细胞内区域编码酪氨酸激酶。
FGF-8是作为雄激素诱导增殖因子(AIGF)从表现出性激素依赖 性增殖的鼠乳腺癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J.Steroid Biochem.，27，459-464，1987)的培养上清中分离出的因子，由于雄激素刺 激，产生诱导，自分泌使SC-3细胞增殖的增殖因子(Tanaka A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)。有报道说FGF-8促 进前列腺癌的细胞和纤维芽细胞的增殖(Tanaka A.et al.，FEBS Lett.， 363，226-230，1995)。报道说FGF-8与FGF受体-2IIIc、FGF受体- 3IIIc、FGF受体-4的3种受体结合(Ornitz D.M.et al.，J.Biol.Chem.，271，15292-15297，1996)。在FGF的作用中与多配体蛋 白聚糖等膜型乙酰肝素硫酸蛋白聚糖的结合是不可缺的。与乙酰肝素硫 酸的结合是为了在局部稳定蓄积FGF所必需的。认为在炎症等组织改变 的状况下，通过乙酰肝素硫酸被分解，FGF由细胞外基质游离出来，发 挥其活性。在软骨中含有象FGF-2那样的强的血管新生因子(Satoh H.et al.，J.Biol.Chem.，273，12307-12315，1998)。而对于关节炎来说，滑 膜细胞、软骨细胞和侵入的炎症细胞显著地合成高水平的FGF-1和 FGF-2(Sano H.et al.，J.Cell Biol.，110，1417-1426，1990、Remmers E.F.，Growth factors，2，179-188，1990)、风湿病患者的关节液中的FGF -2的浓度与关节病症有关(Manabe N.et al.，Rheumatology，38， 714-720，1999)。FGF-2与变形性关节病中的骨刺形成有关(Uchino M.et al.，Clin.Orthopl.，377，119-125，2000)。这些报告表明FGF-1和FGF -2与关节炎有关。
在使用FGF-8人工破坏特定基因小鼠的报告中，认为FGF-8出现 在关节发生阶段(Haraguchi R.et al.，Development，127，2471-2479， 2000；Lewandoski M.et al.，Nat.Genet.，26，460-463，2000)，但还不了解 FGF-8与关节炎的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供关节炎的预防药或治疗药、关节炎破坏抑制 剂、软骨保护剂、滑膜增殖抑制剂、关节炎的诊断药以及关节炎的判定 方法。
本发明提供以下(1)～(51)。
(1)一种关节炎的预防药或治疗药，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(2)根据上述(1)所述的医药，其中，与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体是单克隆抗体。
(3)根据上述(2)所述的医药，其中，单克隆抗体是选自杂交瘤 产生的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(4)根据上述(3)所述的医药，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(5)根据上述(3)所述的医药，其中，人源化抗体是人型嵌合抗 体或人型互补决定区(CDR)移植抗体。
(6)根据上述(5)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是由与FGF -8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的抗体重链可变区 (VH)以及抗体轻链可变区(VL)、以及人抗体的抗体重链恒定区(CH) 以及抗体轻链恒定区(CL)构成的人型嵌合抗体。
(7)根据上述(6)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是以下(a)～ (c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(8)根据上述(7)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是转化体 KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(9)根据上述(5)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是含有 与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及 VL的CDR和人抗体的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(10)根据上述(9)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是由 与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及 VL的CDR、人抗体的VH以及VL的框架区(FR)、以及人抗体的CH以 及CL构成的人型CDR移植抗体。
(11)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(12)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有以下氨基酸序列的人型CDR移植抗体，即序列编号19 所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的 Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸 残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(13)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(14)根据上述(13)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(15)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(16)根据上述(3)所述的医药，其中，抗体片段是选自Fab、Fab’、 F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体可变区(V区)片段(diabody)、 二硫化物稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(17)一种关节炎的诊断药，其中，作为有效成分含有与FGF-8 特异性结合的抗体。
(18)根据上述(17)所述的诊断药，其中，与FGF-8特异性结 合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
(19)根据上述(18)所述的诊断药，其中，单克隆抗体是选自杂 交瘤生产的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(20)根据上述(19)所述的诊断药，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(21)根据上述(19)所述的诊断药，其中，人源化抗体是人型嵌 合抗体或人型CDR移植抗体。
(22)根据上述(21)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是由与 FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以及 CL构成的人型嵌合抗体。
(23)根据上述(22)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是以下 (a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(24)根据上述(23)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是转化 体KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(25)根据上述(21)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 含有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗体 的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(26)根据上述(25)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 由与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的 VH以及VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗体。
(27)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(28)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(29)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(30)根据上述(29)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号21 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号44 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号50 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(31)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(32)根据上述(19)所述的诊断药，其中，抗体片段是选自Fab、 Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区片段(diabody)、 二硫键稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(33)一种关节炎的判定方法，其特征在于，利用与FGF-8特异 性结合的抗体检测和/或定量试样中的FGF-8。
(34)根据上述(33)所述的判定方法，其中，与FGF-8特异性 结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
(35)根据上述(34)所述的判定方法，其中，单克隆抗体是选自 杂交瘤生产的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(36)根据上述(35)所述的判定方法，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(37)根据上述(35)所述的判定方法，其中，人源化抗体是人型 嵌合抗体或人型CDR移植抗体。
(38)根据上述(37)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是由 与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以 及CL构成的人型嵌合抗体。
(39)根据上述(38)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是以 下(a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(40)根据上述(39)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是转 化体KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(41)根据上述(37)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是含有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗 体的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(42)根据上述(41)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是由与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体 的VH以及VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗 体。
(43)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(44)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(45)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(46)根据上述(45)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(47)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(48)根据(35)所述的判定方法，其中，抗体片段是选自Fab、 Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体可变区(V区)片段(diabody)、 二硫化物稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(49)一种关节破坏抑制剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(50)一种软骨保护剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并且抑 制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(51)一种滑膜增殖抑制剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中所用的抗体，只要是与FGF- 8特异性结合，并且抑制FGF-8活性的抗体(以下，也称为“抗FGF-8 中和抗体”)就可以，例如可以举出对FGF-8具有中和活性的抗体以及 该抗体的片段等。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中所用的抗FGF-8中和抗体， 可以通过从与FGF-8特异性结合的抗体(以下也称为“抗FGF-8抗 体”)中选择具有抑制FGF-8活性能力的抗体而获得。作为FGF-8的 活性，只要是FGF-8具有的生物活性，可以是任意的活性，具体可以 举出促进小鼠乳腺癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J Steroid Biochem.，27，459-464，1987)、小鼠纤维胚细胞株NIH/3T3(ATCC编号： CRL-1658)或人前列腺癌细胞株LNCaP(ATCC编号：CRL-1740)的 增殖的活性；促进滑膜细胞增殖的活性；促进软骨细胞的细胞外基质的 分解的活性；促进源于软骨细胞的基质金属蛋白酶-3的产生的活性。
抗FGF-8抗体可以采用众所周知的手段(Harlow E.and Lane D.， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， 1988)制备。
作为在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的抗FGF-8中和 抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中任一种，但最好使用单克隆 抗体。
作为单克隆抗体可以举出由杂交瘤产生的抗体、人源化抗体以及这 些抗体的抗体片段。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的、通过杂交瘤产生的 抗FGF-8中和单克隆抗体，具体的可以通过下述方法制备。
即，作为抗原制备FGF-8蛋白质，从免疫该抗原的动物诱导具有 抗原特异性的浆细胞，进而使其与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，或培养 该杂交瘤或给予动物该杂交瘤细胞使该动物腹水癌化，从该培养液或腹 水中分离纯化与FGF-8特异性结合的抗体。从所得抗体中选择抑制 FGF-8活性的抗体。作为这种抗FGF-8中和单克隆抗体，可以举出特 开平9-271391中公开的属于小鼠IgG1亚类的杂交瘤KM1334(FREM BP-5451)产生的单克隆抗体KM1334。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人源化抗体，可以 举出利用基因重组技术改变上述抗FGF-8中和单克隆抗体的人源化抗 体。该抗体为抗原性低，并且血液中半衰期延长的抗体，作为预防药或 治疗药是优选的。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人源化抗体，包括 人型嵌合抗体以及人型互补决定区(complementarity determining region；以下简称为CDR)移植抗体。
人型嵌合抗体是指由人以外的动物的抗体的重链可变区(以下将可 变区称为V区，将重链可变区称为VH)以及轻链V区(以下称为VL)、 人抗体的重链恒定区(以下将恒定区称为C区，将重链恒定区称为CH 区)以及人抗体的轻链C区(以下称为CL)构成的抗体。作为人以外的 动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，只要能够制作杂交瘤，可以使用任何 动物。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人型嵌合抗体，可 以通过以下方法制备，即，从对由产生抗FGF-8中和单克隆抗体的杂 交瘤获得的编码该抗体的H链以及L链的cDNA中，取得编码VH以及VL 的DNA，分别插入具有编码人抗体的CH以及CL的DNA的动物细胞用表 达载体中，构建人型嵌合抗体表达载体，然后再导入动物细胞中，最后 使其表达制备。
作为人型嵌合抗体的CH，只要是属于免疫球蛋白(hIg)，则可以 是任何CH，但是，优选hIgG类的CH，可以使用属于hIgG类的γ1、γ2、 γ3、γ4等的亚类中的任一种。另外，作为人型嵌合抗体的CL，只要是 属于hIg就可以，可以使用κ类或λ类的CL。
作为与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的人型嵌合抗体 (以下也称为抗FGF-8中和嵌合抗体)，可以举出由与FGF-8特异性 结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL和人抗体的CH 以及CL构成的抗FGF-8中和嵌合抗体，优选VH含有序列编号5所示的 氨基酸序列的人型嵌合抗体、VL含有序列编号6所示的氨基酸序列的人 型嵌合抗体以及VH含有序列编号5所示的氨基酸序列并且VL含有序列 编号6所示的氨基酸序列的人型嵌合抗体。具体可以举出抗体的VH由序 列编号5记载的氨基酸序列构成、CH由人γ1亚类的氨基酸序列构成、抗 体的VL由序列编号6记载的氨基酸序列构成、CL由人κ类的氨基酸序列 构成的人型嵌合抗体KM3034以及KM3334。
生产人型嵌合抗体KM3034的转化体KM3034于平成13年12月26日 以保藏号FERM BP-7836保藏于独立行政法人产业技术研究所专利生 物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
人型CDR移植抗体是指在人抗体上以人以外的动物抗体的CDR序 列分别置换人以外的动物抗体的VH以及VL的CDR的抗体。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人型CDR移植抗体，可 以通过以下方法制备，即，构建对以人以外的动物抗FGF-8中和抗体 的VH以及VL的CDR序列分别置换任意的人抗体的VH以及VL的CDR 序列的V区进行编码的DNA，分别插入具有编码人抗体的CH以及人抗 体的CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人型CDR移植抗体表达 载体，然后导入动物细胞中，最后使其表达而制备。
作为人型CDR移植抗体的CH，只要是属于hIg就可以，但是优选 hIgG类的CH，可以使用属于hIgG类的γ1、γ2、γ3、γ4等的亚类中的任 一种。另外，作为人型CDR移植抗体的CL，只要是属于hIg就可以，可 以使用κ类或λ类的CL。
作为与FGF-8特异性结合，并且抑制FGF-8活性的人型CDR移植 抗体(以下也称为“抗FGF-8中和CDR移植抗体”)，可以举出含有与 FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL 的CDR和人抗体的CH以及CL的CDR移植抗体、由与FGF-8特异性结 合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的 VH以及VL的框架区(以下简称为FR)以及人抗体的CH以及CL构成的 人型CDR移植抗体。优选(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有 序列编号7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(b)VL的 CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12所示的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体，(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有 序列编号7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3 分别含有序列编号10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体， 更优选(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体， (b)VL含有序列编号19所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(c) VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号19所示氨基 酸序列的人型CDR移植抗体。进一步优选(a)VH含有序列编号18所示 的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、 48号的Met、68号的Val、70号的Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的 Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号的Tyr中的至少一种以上的氨基 酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列，(b)VL含有序列编号 19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的 Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上的氨基 酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列，(c)VH含有序列编号 18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13号的Lys、40号的Ala、41 号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、74号的Thr、76号的Thr、 82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号的Tyr中的至少一种以上 的氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、 15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上 氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体。具体地说，可以举出(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体，(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、 45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(c)VH 含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列编号19、21、 42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体，优选(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编 号21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(b)VH含有序列编号18 所示氨基酸序列并且VL含有序列编号44所示氨基酸序列的人型CDR移 植抗体，(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编 号50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。作为这种人型CDR移植抗 体，可以举出VH由序列编号18记载的氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的 氨基酸序列构成、VL由序列编号21记载的氨基酸序列并且CL由人κ类 的氨基酸序列构成的人型CDR移植抗体HVOLV6、HVOLV6/CHO；VH 由序列编号18记载的氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的氨基酸序列构 成、VL由序列编号44记载的氨基酸序列并且CL由人κ类的氨基酸序列 构成的人型CDR移植抗体HVOLV3-1/CHO；VH由序列编号18记载的 氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的氨基酸序列构成、VL由序列编号50记 载的氨基酸序列并且CL由人κ类的氨基酸序列构成的人型CDR移植抗 体HVOLV4-1/CHO。
生产人型CDR移植抗体HVOLV6的转化体KM8037于平成14年6月 20日以保藏号FERM BP-8084保藏于独立行政法人产业技术研究所专 利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央 第6)。生产人型CDR移植抗体HVOLV3-1的转化体KM8036，于平成 14年6月20日以保藏号FERM BP-8083保藏于独立行政法人产业技术 研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1 番地中央第6)。生产人型CDR移植抗体HVOLV4-3的转化体KM8035， 在平成14年6月20日作为FERM BP-8082保藏在独立行政法人产业技 术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地中央第6)。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的抗FGF-8中和抗体 中也包括抗体片段。抗体片段包括作为与FGF-8特异性结合并且抑制 FGF-8活性的抗体片段的Fab(fragment of antigen binding的简称)、 F(ab’)2、Fab’、单链抗体(single chain Fv，以下简称为scFv)、二 聚体V区片段(diabody)、二硫键稳定化抗体(disulfide stabilized Fv， 以下简称为dsFv)以及含有CDR的肽。
Fab是由H链的N末端侧大致一半与整个L链构成的、分子量约5万 的具有抗原结合活性的片段，他是通过木瓜蛋白酶对在IgG的铰链区交 联两根H链的两个二硫键结合的上部肽部分进行分解而得到。
F(ab’)2是分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段，在通 过蛋白质分解酶胃蛋白酶处理IgG的铰链区的两个二硫键结合的下部而 得到的片段中(在H链的234号氨基酸残基处切断)比Fab借助铰链区的 二硫键结合的片段稍大。
Fab’是切断上述F(ab’)2的铰链间的二硫键的分子量约5万的、具 有抗原结合活性的片段。
ScFv是利用适当的肽接头(以下称为P)对一条VH以及一条VL进 行连接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽。在本发明的关节炎的预防药 或治疗药中使用的ScFv所含有的VH以及VL只要是抗FGF-8中和单克 隆抗体，可以是任意的VH和VL。
diabody(双抗体)是由抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二 聚体的抗体片段，对相同的抗原具有二价的抗原结合活性或者对于不同 的抗原分别具有特异的抗原结合活性。
dsFv是指通过二硫键使VH以及VL中的各1个氨基酸残基被置换为 半胱氨酸残基的多肽结合的片段。置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基， 可以通过Reiter等提出的方法(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7 697-704， 1994)，根据抗体的立体结构预测进行选择。在本发明的关节炎的预防 药或治疗药中使用的dsFv所含有的VH或VL只要是抗FGF-8中和单克 隆抗体，可以是任意的VH和VL。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的含有CDR的肽，其构 成中含有抗FGF-8中和抗体的VH或VL的CDR的至少一个区以上。含 有多个CDR的肽，可以直接制备或通过适当的肽接头结合制备。
以下对本发明中使用的抗FGF-8中和抗体的具体制作方法和活性 评价方法、含有该抗体的关节炎的预防药或治疗药、抗FGF-8抗体的 关节炎的诊断药、使用抗FGF-8抗体的关节炎的判定方法进行说明。
1.抗FGF-8中和抗体(多克隆抗体、单克隆抗体)的制作方法
(1)抗原的制备
作为制备抗FGF-8中和抗体所必需的抗原，可以举出产生FGF-8 的细胞或细胞组分、或FGF蛋白质、该蛋白质的部分片段、具有该蛋白 质的氨基酸序列的部分序列的肽等。
FGF-8蛋白质以及该蛋白质的部分片段可以通过以下方式制备， 即，制备将编码FGF-8的全长或其部分片段DNA(Tanaka A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992，Tanaka A.et al.，FEBS Lett.，363，226-230，1996)插入适当的载体的启动子下游的重组载体， 将其导入宿主细胞获得FGF-8表达细胞，然后通过在适当的培养基中培 养该FGF-8表达细胞，从而在细胞内或培养上清液中直接产生或作为融 合蛋白而产生。另外，具有FGF-8蛋白质的部分序列的肽，可以利用 肽合成仪制备。
编码FGF-8的全长或其部分片段的DNA，可以通过以表达FGF-8 的SC-3等的细胞制备的cDNA作为模板的聚合酶链式反应[Polymerase Chain Reaction，以下简称为PCR；Sambrook J.，et al.，Molecular Cloning 3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，2001，Ausubel F. M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons， 1987-2001(以下记为Current Protocols in Molecular Biology)]制备。
作为宿主，只要是能够表达目的基因的都可以，例如细菌、酵母、 动物细胞、昆虫细胞等。作为细菌可以举出大肠杆菌(Escherichia coil)、 枯草杆菌(Bacillus subtilis)等的大肠杆菌属，芽孢杆菌属的细菌。作 为酵母可以举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 Schizosaccharomyces pombe等。作为动物细胞可以举出人的细胞，即 Namalwa细胞、猴的细胞即COS细胞、中国仓鼠细胞即CHO细胞等。 作为昆虫细胞可以举出Sf9、Sf21(フア一ミンジエン公司生产)、High Five(インビトロジエン公司生产)等。
作为导入编码FGF-8的全长或其部分片段DNA的载体，可以只要 是能够重组该DNA并在宿主细胞内表达的载体，可以使用任何载体。
以细菌例如大肠杆菌(Escherichia coil)作为宿主使用时的表达载 体，优选由启动子、核糖体结合序列、编码FGF-8的全长或其部分片 段DNA、复制终结序列、基于不同情况的启动子控制序列构成的载体， 例如可以举出市售的pGEX-2T(Amersham Biosciences公司生产)、 pET17b(Novagen公司生产)等。
作为向细菌导入重组载体的方法，只要是在细菌中导入DNA的方 法，可以使用任何方法，例如使用钙离子的方法(Cohen S.N.et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110-2114，1972)、原生质体法(特开昭 63-248394)等方法。
在作为宿主细胞使用酵母时，作为表达载体例如可以使用 YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。
作为向酵母导入重组载体的方法，只要是将DNA导入酵母的方法可 以使用任意的方法，例如电穿孔法(Becker D.M.and Guarente L.， Methods.Enzymol.，194，182-187，1991)、原生质体法(Hinnen A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1929-1933，1978)、醋酸锂法(Ito H.et.， J.Bacteriol.，153，163-168，1983)等。
在作为宿主细胞使用动物细胞时，作为表达载体例如可以使用 pAGE107(特开平3-22979；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140， 1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310， 1987)等。
作为启动子只要是在动物细胞中能够表达的都可以使用，例如可以 举出巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的启动子、SV40 或金属硫因的启动子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与 启动子一起使用。
作为向动物细胞导入重组载体的方法，只要是将DNA导入动物细胞 的方法都可以使用，例如电穿孔法(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3， 133-140，1990)、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂[质]转[染]法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)等。
在作为宿主使用昆虫细胞时，例如可以通过Current Protocols in Molecular Biology，O’Reilly et al.，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，Oxford University Press，1994等记载的方法表达 蛋白质。即，将以下叙述的重组基因导入载体与(昆虫)杆状病毒 (Baculovirus)共同导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清液中获得重组 病毒，然后使昆虫感染重组病毒，从而获得蛋白质表达昆虫细胞。
作为基因导入载体，例如可以使用pVL1392、pVL1393(都是フア 一ミンジエン社制)、pBlueBac4.5(イン ビトロジエン公司生产)等。
作为Baculovirus，例如可以使用作为感染射干科昆虫病毒的 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus等。
作为用于制备重组病毒的、向昆虫细胞共同导入上述重组基因导入 载体和上述Baculovirus的方法，例如可以使用磷酸钙法(特开平2- 227075)、脂[质]转[染]法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84，7413-7417，1987)等。
另外，也可以通过使用フア一ミンジエン公司生产的バキユロゴ一 ルド引酵物试剂盒(starter kit)等制作重组杆状病毒，然后使该重组 病毒感染前述的Sf9、Sf21或High Five等的昆虫细胞，从而产生蛋白质 (Bio/Technology，6，47，1988)。
作为基因的表达方法，除了只让FGF-8蛋白质在细胞内表达外， 也开发了分泌产生、融合蛋白质表达等，可以使用任意方法。例如可以 根据《分子克隆》第3版记载的方法进行。
将通过上述方式得到的转化体在培养基中培养，使在培养物中蓄积 产生FGF-8蛋白质，然后从培养物中提取FGF-8蛋白质，从而可以将 FGF-8蛋白质的全长或部分片段直接作为FGF-8蛋白质或作为融合 蛋白而制备。
在培养基中培养转化体的方法，可以根据在宿主培养中通常所用的 方法进行。
作为以大肠菌或酵母等的微生物为宿主对得到的转化体进行培养 的培养基，只要是含有微生物生长所需的碳源、氮源、无机盐类并且能 够有效进行转化体的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基 中的任一种(分子克隆第3版)。培养是在通常的振荡培养或深部通气 搅拌培养等的好氧条件下、15～40℃培养16～96小时。在培养期间将pH 保持在3.0～9.0。pH的调节可以使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳 酸钙、氨等进行。在培养中根据需要也可以在培养基中添加氨苄青霉素 或四环素等抗生素。
作为以动物细胞为宿主对得到的转化体进行培养的培养基，可以使 用通常所用的RPMI 1640培养基、Eagle的MEM培养基或者在这些培养 基中添加胎牛血清(以下简称为FBS)等的培养基等。通常在5％CO2存在下、35～37℃，培养3～7天，在培养中根据需要也可以在培养基中 添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为以昆虫细胞为宿主对得到的转化体进行培养的培养基，可以使 用通常所用的TNM-FH培养基(フア一ミンジエン公司生产)、 SF900IISFM(インビトロジエン公司生产)、EX-CELL400、EX- CELL405[都是JRH Biosciences公司生产]等。培养可以在25～30℃培养 1～4天，在培养过程中也可以根据需要在培养基中添加庆大霉素等抗生 素。
在上述的动物细胞以及昆虫细胞的培养中，可能的话，由于很容易 直接将FGF-8的全长或部分片段作为FGF-8蛋白，或进行融合蛋白的 纯化，因此优选使用不添加血清的培养基。
在使FGF-8的全长或者部分片段直接或作为融合蛋白在宿主细胞 内蓄积时，培养结束后，对细胞进行离心，悬浮于水系缓冲液中后，通 过超声波法、法式冲压法等对细胞进行破碎，从该离心上清液中回收该 蛋白质。
另外，在细胞内形成不溶体时，通过蛋白质变性剂使不溶体可溶化 后，在不含有蛋白质变性剂的溶液或蛋白质变性剂的浓度稀释成蛋白质 不变性的程度的溶液中，进行稀释或透析，可以形成蛋白质的立体结构。
在FGF-8蛋白质的全长或部分片段、或者这些蛋白质的融合蛋白 是在细胞外分泌时，可以从培养上清液中回收表达蛋白。
对于分离纯化，可以单独或组合使用溶剂萃取、基于有机溶剂的分 级沉淀、盐析、透析、离心、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏 水性色谱、亲水性色谱、逆相色谱、结晶、电泳等的分离操作来进行。
具有FGF-8的氨基酸序列的部分序列的肽，可以通过Fmoc(芴基 甲基氧基羰基)法、tBoc(叔丁基氧基羰基)法等的化学合成法制备。 另外，也可以使用Advanced ChemTech公司、Applied Biosystems公司、 Protein Technologies公司、岛津制作所等的肽合成机制备。
(2)动物的免疫与抗体产生细胞的制备
以上述得到的该蛋白质作为抗原对动物进行免疫。作为免疫的方 法，可以直接在动物的皮下、静脉或腹腔内给予抗原，但是优选使抗原 性高的载体蛋白质与抗原结合而给予，或者将抗原与适当的佐剂一起给 予。
作为载体蛋白质，可以举出匙孔X血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲状球蛋白等，作为佐剂可以举出弗 罗因德完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)、氢氧化铝凝胶与百 日咳菌疫苗等。
作为免疫动物，可以举出兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠等的非人哺 乳动物。
抗原的给予，在第一次给予后，每1～2周给予3～10次。抗原的给 予量优选每只动物50～100μg。在各给予后，在第3～7日从免疫动物的 眼底静脉丛或尾静脉采血，对于与该血清的抗原的特异性结合性，可以 通过以下所示的酶免疫测定法[酶免疫测定法第3版医学书院1987年 antibodies a laboratory manual(Chapter 14)、Goding J.W.，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1996(以下简称 为单克隆抗体)]等确认。
酶免疫测定法可以通过以下方式进行。
将抗原蛋白或表达抗原蛋白的细胞等涂层在板上，将从免疫动物採 集的血清作为第一抗体使其反应。在第一抗体反应后，对板进行清洗添 加第二抗体。反应后，进行对应于标记第二抗体的物质的检测反应，测 定抗体效价。
所谓第二抗体，是指用过氧化物酶等酶或生物素等对可以识别第一 抗体的抗体进行标记的物质。具体的说，若免疫动物使用小鼠，则作为 第二抗体使用能够识别小鼠免疫球蛋白的抗体。
另外，将该血清显示充分抗体效价的非人哺乳动物作为抗体产生细 胞的供给源。
在抗原最终给予后3～7日，根据众所周知的方法(antibodies a laboratory manual)从免疫动物摘出抗体产生细胞，使抗体产生细胞与 骨髓瘤细胞融合。
多克隆抗体可以通过对该血清进行分离纯化而制备。该多克隆抗体 是否具有抑制FGF-8活性的中和活性，可以通过以下1.(4)中所述的 细胞增殖抑制分析法进行检测。
单克隆抗体可以通过使该抗体产生细胞与源于非人哺乳动物的骨 髓瘤细胞融合制作杂交瘤，对该杂交瘤进行培养或给予动物后使该细胞 腹水癌化，对该培养液或腹水进行分离或纯化而制备。
抗体产生细胞是从给予抗原后的非人哺乳动物脾细胞、淋巴结、末 梢血液等中採集的细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞可以使用从小鼠中获得的株化细胞即8-氮杂鸟嘌 呤耐性小鼠(BALB/c由来)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(Kohler G and Milstein C，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976)、SP2/0-Ag14 (Shulman M.et al.，Nature，276 269-270，1998)、P3-X63-Ag8653 (Kearney J.F.et al.，J.Immunol.，123 1548-1550，1979)、P3-X63- Ag8(Koler G and Milstein C，Nature，256 495-479，1975)等，只要是 在体外(in vitro)能够增殖的骨髓瘤细胞，可以是任意的骨髓瘤细胞。 对于这些细胞株的培养以及传代可以根据众所周知的方法(antibodies a laboratory manual)，在细胞融合前确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合与单克隆抗体的选择
对上述得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行清洗后，加入聚乙二 醇1000(PEG-1000)等细胞凝集性溶剂，使细胞融合，悬浮于培养基 中。在细胞的清洗中可以使用MEM培养基或PBS(1.83g/L Na2HPO4、 0.21g/LK2HPO4、7.65g/L NaCl，pH7.2)等。另外，作为使融合细胞悬 浮的培养基，使用HAT培养基[在正常培养基(添加1.5mmol/L白蛋白、 50μmol/L 2-巯基乙醇、10mg/mL庆大霉素以及10％FBS的RPMI 1640 培养基)中加入100μmol/L贺克沙霉素、15μmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷以 及0.4μmol/L氨基蝶呤的培养基]，以便可以选择性地只获得目的融合蛋 白。
在培养后，取部分上清液，通过下述的酶免疫测定法，选择与抗原 蛋白质反应而与非抗原蛋白质不反应的样品。然后，通过限界稀释法进 行克隆，通过酶免疫测定法选择稳定并且抗体效价高的杂交瘤株作为与 FGF-8特异性结合的单克隆抗体产生杂交瘤株。
酶免疫测定法通过与1.(2)中所述方法相同的方法进行，作为第一 抗体使用杂交瘤培养上清液或通过后述方法得到的纯化抗体。
单克隆抗体与FGF-8的特异性结合也可以根据表面胞质团共鸣 (Karlsson R et al.，J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)来评价。
作为抗FGF-8单克隆抗体的具体例子，可以举出特开平9-271391 中记载的属于小鼠IgG1亚类的杂交瘤KM1334(FREM BP-5451)产生 的单克隆抗体KM1334。
通过在靶细胞中使用小鼠乳癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J Steriod Biochem.，27，495-464，1987)、小鼠纤维牙细胞株NIH/3TS (ATCC编号：CRL-1658)、或者人前列腺癌细胞株LNCap(ATCC 编号：CRL-1740)的增殖抑制分析法来检测由上述选择的杂交瘤产生 的抗FGF-8单克隆抗体是否抑制FGF-8活性。作为方法，在利用含有 FGF-8(1～100ng/mL或睾丸素的培养基培养靶细胞时，以培养上清液 或根据下述2.(5)纯化的抗FGF-8单克隆抗体的最终浓度变为0.001～ 100μg/mL的方式进行阶段稀释并添加在培养基中。在培养24～72小时 后，利用MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四 唑 溴化物]溶液、セルカウンテイク试剂盒或WST-1试剂盒等测定活 细胞数。与不添加抗FGF-8单克隆抗体的情况相比，在活细胞数减少 与抗FGF-8单克隆抗体有浓度依赖性时，可以确认该抗FGF-8单克隆 抗体是抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和抗体。
另外，也可以利用以Bolton-Hunter法(Bolton A.E.and Hunter W. M.，Biochem.J.，133，529-539，1973)等125I标记的FGF-8与上述细胞株 结合系统，测定抗FGF-8单克隆抗体向FGF-8细胞表面上的受体结合 抑制活性。
上述单克隆抗体KM1334是具有抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和 抗体，优选作为关节炎的预防药或治疗药。
(5)单克隆抗体的制备
单克隆抗体可以通过以下方式进行制备，即，在腹腔内给予培养杂 交瘤细胞所得的培养液或降植烷(Pristane，2，6，10，14-四甲基十五烷) 0.5mL，饲育2周，在如此所得的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔给予产生 单克隆抗体的杂交瘤细胞使其腹水癌化，然后从腹水中分离纯化，从而 制备单克隆抗体。
作为分离、纯化单克隆抗体的方法，可以举出离心、基于40～50％ 饱和硫酸铵的盐析、辛酸沉淀法、利用DEAE-葡聚糖柱、阴离子交换 柱、蛋白质A或G-柱或凝胶过滤柱等的色谱层析法等，这些方法可以 单独使用也可以组合使用。根据该方法可以回收IgG或IgM级分而获得 纯化单克隆抗体。
纯化的单克隆抗体的亚类的确定，可以利用单克隆抗体的类型试剂 盒进行确定。蛋白质量可以通过劳里(Lowry)法或通过280nm的吸光 度计算出。
所谓抗体的亚类是指在一类内的不同类型，对于小鼠可以举出 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，对于人可以举出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。 特别是小鼠IgG3、IgG2a、人IgG1类型具有补体依存性细胞损伤活性以 及抗体依存性细胞损伤活性，在治疗应用上是有效的。
2.抗FGF-8中和人源化抗体的制作方法
(1)人源化抗体表达用载体的构建
为了从人以外的动物的抗体制作人源化抗体，要构建必要的人源化 抗体表达用载体。所谓人源化抗体表达用载体是指导入编码人抗体的C 区，即CH以及CL的基因的动物细胞用表达载体，可以通过在动物细胞 用表达载体上分别插入编码人抗体的CH以及CL的基因来构建。
人抗体的C区可以是任意的人抗体的CH以及CL，例如可以举出人 抗体的γ1亚类的CH、γ4亚类的CH以及κ类的CL等。作为编码人抗体的 CH以及CL的DNA，可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA，另 外也可以使用cDNA。作为动物细胞用表达载体，只要是能够导入编码 人抗体C区的基因并且表达的载体，可以使用任意载体。
例如可以举出pAGE107(特开平3-22979；Miyaji H.et al.， Cytotechnology，3，133-140，1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.， J.Biochem.，101，1307-1310，1987)、pHSG274(Brady G.et al.，Gene，27， 223-232，1984)、pKCR(O’Hare K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 78，1527-1531，1981)、pSG1βd2-4(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，4， 173-180，1990)等。作为动物细胞用表达载体中所用的启动子和增强子， 可以举出SV40的初期启动子和增强子(Mizukami T.and Itoh S.，J. Biochem.，101，1307-1310，1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子 和增强子(Kuwana Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，149， 960-968，1987)、以及免疫球蛋白H链的启动子(Mason J.O.et al.，Cell， 41，479-487，1985)和增强子(Gillies S.D.et al.，Cell，33，717-728，1983) 等。
人源化抗体表达用载体可以使用抗体H链、L链存在各个载体上的 类型或存在同一载体上的类型(串连型)中任一类型，但是从人源化抗 体表达载体的构建的容易程度、向动物细胞导入的容易程度、在动物细 胞内的抗体H链和L链的表达量的平衡的观点来看，串连型的人源化抗 体表达用载体是优选的(Shitara K.et al.，J Immunol.Methods，167， 271-278，1994)。作为串连型的人源化抗体表达用载体可以举出 pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Bentley K.J.et al.，Hybridoma， 17，559-567，1998)等。
构建的人源化抗体表达用载体可以在人型嵌合抗体以及人型CDR 移植抗体在动物细胞内表达中使用。
(2)编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA 的获得
编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体、例如小鼠抗FGF-8中和 单克隆抗体的VH以及VL的DNA可以通过以下方式获得。
从产生小鼠抗FGF-8中和单克隆抗体的细胞、例如产生小鼠FGF -8中和抗体的杂交瘤等提取mRNA，合成cDNA。将合成的cDNA插入 噬菌体或质粒等的载体中，制作cDNA文库。作为探针使用小鼠抗体的 C区部分或V区部分，分别从该文库中分离具有编码VH的cDNA的重组 噬菌体或重组质粒以及具有编码VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。
对重组噬菌体或重组质粒上的VH以及VL的全部碱基序列进行确 定，从而由碱基序列推定VH以及VL的全部氨基酸序列。
作为人以外的动物，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔等，只要能够 制作杂交瘤可以使用任意动物。作为从杂交瘤中制备全RNA的方法，可 以举出硫氰酸胍-三氟乙酸硒法(Okayama H.et al.，Methods Enzymol.， 154，3-28，1987)，另外作为从全RNA制备mRNA的方法，可以举出低 聚(dT)固定化纤维素柱法(《分子克隆》，第3版)等。另外，作为 从杂交瘤制备mRNA的试剂盒，可以举出FastTrack mRNA分离试剂盒 (インビトロジエン公司生产)、QuickPrep mRNA分离试剂盒 (Amersha Biosciences公司生产)等。
作为cDNA的合成以及cDNA文库的制作法可以举出通常的方法 (《分子克隆》，第3版；Current Protocols in Molecular Biology)、 或者使用市售的试剂盒例如cDNA合成用SuperScript Choice System (SuperScript Choice System for cDNA Synthesis，インビトロジエン公 司生产)或ZAP-cDNA合成试剂盒(ストラタジ-ン公司生产)、 TimeSaver cDNA合成试剂盒(Amersha Biosciences公司生产)的方法 等。
在cDNA文库的制作时导入将从杂交瘤提取的mRNA作为铸模合成 的cDNA的载体，只要是导入该cDNA的载体，可以使用任意载体。例如 可以使用ZAP Express(ストラタジ-ン公司生产)、pBlurescript IISK (±)(ストラタジ-ン公司生产)、λZAPII(ストラタジ-ン公司生产)、 λgt10(ストラタジ-ン公司生产)、λgt11(ストラタジ-ン公司生产)、 Lambda BlueMid(Clontech公司生产)、λExcell(Amersha Biosciences 公司生产)、pcD2(Okayama H.and Berg P.，Mol.Cell.Biol.，3，280-289， 1983)以及pUC18(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985) 等的噬菌体或质粒载体。
作为导入通过噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠菌，只要 是导入该cDNA文库并且能够表达以及维持的大肠菌，可以任意使用。 例如可以使用XL1-Blue MRF’(ストラタジ-ン公司生产)、C600 (Appleyard R.K.Genetics，39，440-452，1954)、Y1088(Yong R.A.and Davis R.，Science，222，778-782，1983)、Y1090(Yong R.A.and Davis R.，Science，222，778-782，1983)、NM522(Gough J.A.and Murray N.E.，J.Mol.Bio.，166，1-19，1983)、K802(Wood W.B.，J.Mol.Biol.，16， 118-133，1966)和JM(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985) 等。
作为编码来自cDNA文库的人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的 VH以及VL的cDNA克隆的选择法，可以使用从用同位素或荧光标记的 探针的菌落杂交法或噬斑杂交法(分子克隆第3版)选择的方法。而制 备引物，将由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，通过PCR也可 以制备编码VH以及VL的cDNA。
通过上述方法选择的cDNA的碱基序列可以用被克隆到适当载体的 该cDNA，进行双脱氧反应(Sanger F.et al.，Proc.Natl.Acad.USA 74，5463-5467，1977)，通过使用ABI377(Applied Biosystem公司生产) 等DNA测序仪进行解析决定。
(3)人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的氨基酸序 列解析和CDR的氨基酸序列鉴定
通过对从2.(2)获得的、决定的cDNA的碱基序列推定该cDNA编 码的VH和VL的全氨基酸序列，与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序 列(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services，1991，以下记为“Sequences of Proteins of Immunological Interest”)进行比较，可以确认获得的cDNA是否编码含 有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完全氨基酸序列。有关含有分泌信 号序列的抗体的VH和VL的完全氨基酸序列通过与已知的抗体的VH和 VL的全氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest) 进行比较，可以推定分泌的信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进一 步了解他们属于的亚类。
另外，利用BLAST(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.，215， 403-410，1990)等同源性检索程序对任意的数据库，例如SWISS-PROT 和PIR-Protein等进行获得的VH和VL的完全氨基酸序列的同源性检索， 可以研究序列是否是新序列。
形成抗体的抗原结合部位的VH和VL是由序列相对保守的4个FR和 连接他们的序列富于变化的3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)构成的 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)。而VH和VL的各 个CDR的氨基酸序列可以通过与已知的抗体的V区的氨基酸序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)比较进行鉴定。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体的构建
在编码2.(1)中构建的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和CL 的基因的上游插入编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及 VL的DNA，可以构建抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体。例如，以含有 编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA的质粒作 为模板，通过使用由适当的限制性内切酶的识别序列和编码V区的碱基 序列构成的5’末端一侧和3’末端一侧的引物的PCR法对抗体的VH和VL 进行扩增，将各个扩增产物克隆到pBluescriptIISK(-)(ストラタジ-ン 公司生产)等质粒中，利用2.(2)所述的方法决定碱基序列，获得具有 编码抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的氨基酸序列的DNA序列的质 粒。从得到的质粒分离编码抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA， 使他们可以以适当方式表达那样克隆到编码2.(1)所述的人源化抗体表 达用载体的人抗体的CH和CL的基因的上游，可以构建抗FGF-8中和 嵌合抗体表达载体。
(5)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的V区的DNA的构建
编码抗FGF-8中和移植抗体的VH和VL的DNA可以象以下那样构 建。首先，选择移植人以外动物的抗FGF-8中和抗体的VH和VL的CDR 的氨基酸序列的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列。作为人抗体的 VH和VL的FR的氨基酸序列只要是来自人抗体的序列，可以用任意序 列。例如登录在Protein Data Bank等的数据库的人抗体的VH和VL的FR 的氨基酸序列、人抗体的VH和VL的FR的各个亚类的共通氨基酸序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)等，为了制作具有 充分活性的人型CDR移植抗体，希望选择与人以外动物的抗FGF-8中 和抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列尽可能高的同源性、最好是具有60 ％以上同源性的氨基酸序列。
接下来，将作为目的的人以外动物的抗FGF-8中和抗体的VH和 VL的CDR的氨基酸序列移植到选择的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸 序列，设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列。考 虑抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率(Sequences of Proteins of Immunological Interest)将设计的氨基酸序列转换为碱基序 列，设计编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列的 碱基序列。根据设计的碱基序列，合成由100～150碱基长构成的数条合 成DNA，用他们实施PCR法。此时，优选根据PCR的反应效率和可合成 的DNA长度设计VH、VL 4条合成的DNA。另外通过在位于两端的合成 DNA的5’末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，可以很容易地克隆 到2.(1)构建的人源化抗体表达用载体。PCR反应后，将扩增产物克 隆到pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生产)等质粒中，利用2. (2)所述的方法决定碱基序列，获得具有编码所期望的抗FGF-8中和 CDR抗体的VH以及VL的氨基酸序列的碱基序列的质粒。
(6)抗FGF-8中和CDR抗体的VH以及VL的氨基酸序列的改变
人型CDR移植抗体只是将作为目的的人以外动物的抗体的VH和 VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR，其抗原结合活性与原来的人 以外动物的抗体活性相比降低了(Tempest P.R.et al.，Bio/technology，9，266-271，1991)。其原因可能是在原来的人以外的动 物的抗体的VH和VL中，不仅CDR，而且FR的几个氨基酸残基也直接 或间接地与抗原结合活性有关，这些氨基酸残基伴随着CDR的移植，变 化为与人抗体的VH和VL的FR不同的氨基酸残基。为了解决这一问题， 在人型CDR移植抗体的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中，对与 直接参与与抗原结合的氨基酸残基或与CDR的氨基酸残基相互作用，维 持抗体的空间结构，间接参与与抗原结合的氨基酸残基进行鉴定，将他 们改变为原来人以外的动物抗体中出现的氨基酸残基，可以使低下的抗 原结合活性上升(Tempest P.R.et al.，Bio/technology，9，266-271，1991)。 在人型CDR移植抗体的制作中，如何有效地对那些与抗原结合活性有关 的FR的氨基酸残基进行鉴定是最重要的方面，因此通过X射线晶体解析 (Bernstein F.C.et al.，J.Mol.Biol.，112，535-542，1977)或计算机模拟 (Tempest P.R.et al.，Protein Engineering，7，1501-1507，1994)等可以进 行抗体的空间结构的构建和解析。这些抗体空间结构的信息为人型CDR 移植抗体的制作带来了许多有益的信息，但可适应所有抗体的人型CDR 移植抗体的制作法还未确立，目前，就各种各样的抗体制作数种改变体， 研究与各个抗原结合活性的关系等种种试行错误是必要的。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基的改变可以用改变用合成 DNA作引物进行PCR达到。有关PCR后的扩增产物通过2.(2)所述的方法 决定其碱基序列，确认实施目的改变后可以获得含有导入目的变异的 DNA的载体(以下称之为氨基酸序列改变载体)。
只要是在窄的区域的氨基酸序列的改变，可以通过使用由20～35碱 基构成的变异导入引物的PCR变异导入法进行。具体来说，合成由含有 编码改变后的氨基酸残基的DNA序列的20～35碱基构成的有意义变异 引物和反义变异引物，以含有编码应当改变的VH和VL的氨基酸序列的 DNA的质粒为模板，进行2阶段的PCR。将最终扩增片段亚克隆到适当 的载体后，决定其碱基序列，获得含有导入目的变异的DNA的氨基酸序 列改变载体。
(7)抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
在编码2.(1)中记载的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和CL 的DNA的上游插入编码2.(5)和(6)中构建的编码抗FGF-8中和CDR 移植抗体的VH以及VL的DNA，可以构建抗FGF-8中和CDR移植抗体 表达载体。例如，在2.(5)和(6)中构建编码抗FGF-8中和CDR移 植抗体的VH以及VL时使用的合成DNA中，在位于两端的合成DNA的5， 末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，使他们可以以适当方式表达 那样克隆到编码2.(1)所述的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和 CL的DNA的上游。
(8)人源化抗体的一过性表达和活性评价
为了有效地对制作的多种人源化抗体的抗原结合活性进行评价，可 以使用2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体，2.(7)所述的 抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体，或对他们进行改变后的表达载 体，进行人源化抗体的一过性表达。作为导入表达载体的宿主细胞，只 要是可以表达人源化抗体的宿主细胞，可以使用任意细胞，从其表达量 高出发，一般使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL-1651)(Warr G.W.et al.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)。作为表 达载体向COS-7细胞的导入法，如DEAE-葡聚糖法(Warr G.W.et al.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)、脂(质) 转染法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987) 等。
表达载体导入后，培养上清中的人源化抗体的表达量以及抗原结合 活性可以通过作为第一抗体使用培养上清、作为第二抗体可以使用标记 的抗人免疫球蛋白抗体的1.(2)所述的酶免疫测定法等测定。另外，通 过1.(4)所述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中 和活性。
(9)人源化抗体稳定表达以及活性评价
通过将2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体，2.(7)所 述的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体导入适当的宿主细胞，可以 获得稳定生产人源化抗体的转化体。
作为表达载体向宿主细胞的导入法，如电穿孔法(特开平2- 257891；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)等。
作为导入抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体和抗FGF-8中和CDR 移植抗体表达载体的宿主细胞，只要是可以使人源化抗体表达的宿主细 胞，可以使用任意的细胞。例如，小鼠SP2/0--Ag14细胞(ATCC编号： CRL-1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC编号：CRL-1580)、 二氢叶酸还原酶(以下略为DHFR)基因缺损的CHO细胞的CHO/DG44 细胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，4216-4220，1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号： CRL-1662、以下称之为YB/0细胞)等。
表达载体导入后，稳定生产人源化抗体的转化体可以通过在含有 G418(G418 Sulfate；Sigma Aldrich公司生产)等药物的动物细胞培养 用培养基中培养进行选择(Shitara K.et al.，J.Immunol. Methods，167，271-278，1994)。作为动物细胞培养用培养基可以使用 RPMI 1640培养基(日水制药公司生产)、GIT培养基(日本制药公司 生产)、EX-CELL302培养基(JRH Bio Sciences公司生产)、IMDM 培养基(インビトロジエン公司生产)、杂交瘤SFM培养基(インビト ロジエン公司生产)、或向这些培养基中添加了FBS等各种添加物的培 养基等。通过在培养基中对得到的转化体进行培养，可以使人源化抗体 表达蓄积在培养上清中。培养上清中的人源化抗体的表达量以及抗原结 合活性可以通过上述1.(4)所述的ELISA等测定。另外转化体利用DHFR 基因扩增体系等可以使人源化抗体的产量上升(Shitara K.et al.，J. Immunol.Methods，167.271-278，1994)。
人源化抗体可以用蛋白A柱从转化体的培养上清进行纯化 (Antibodies A Laboratory Manual，chapter 8；monoclone antibodies)。 另外，也可以使用通常蛋白质中使用的纯化方法。例如，将凝胶过滤、 离子交换色谱以及超滤等组合进行纯化。纯化的人源化抗体的H链、L 链或抗体分子整体的分子量可以通过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE； Laemmli U.K.，Nature，227，680-685，1970)或Western Blotting法 (Antibodies A Laboratory Manual)等测定。
纯化的人源化抗体的抗原结合活性可以通过作为第一抗体使用纯 化的人源化抗体、作为第二抗体可以使用标记的抗人免疫球蛋白抗体的 上述1.(2)所述的酶免疫测定法、表面胞质团共振(Karlsson R et al.，J. Immunol.Methods，145，229-240，1991)等测定。另外，通过1.(4)所 述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中和活性。
3.抗体片段的制作
抗体片段可以通过1.和2.所述的抗FGF-8中和单克隆抗体、抗FGF -8中和人源化抗体为基础的基因工程手法或蛋白质化学手法进行制 作。作为抗体片段如Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFv、含有 CDR的肽等。
(1)Fab的制作
Fab可以通过用蛋白水解酶番木瓜蛋白酶对抗FGF-8中和抗体进 行处理制作。番木瓜蛋白酶处理后，只要原来抗体是具有蛋白A结合性 的IgG亚类，通过蛋白A柱，分离为IgG分子和Fc片段，可以回收均一的 Fab(monoclonal antibodies)。不带有蛋白A结合性的IgG亚类的抗体 情形，通过离子交换层析，Fab可以回收在以低盐浓度洗脱的级分中 (monoclonal antibodies)。而Fab也可以用大肠杆菌通过基因工程手法 进行制作。例如将编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA克 隆到Fab表达用载体，可以制作Fab表达载体。作为Fab表达用载体只要 是Fab用的可以整合表达DNA的载体，可以使用任意载体。例如pIT106 (Better M.et al.，Science，240，1041-1043，1988)等。将Fab表达载体导入 适当的大肠杆菌，可以使Fab生成蓄积在包涵体或外周胞质层。由包涵 体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变成具有活性的Fab，而表达在胞 质时，具有活性的Fab漏出到培养上清中。再折叠后或从培养上清中可 以通过使用使抗原结合的柱子对均一的Fab进行纯化(BorrebeckK.， Antibody Engineering：A Practical Guide，Oxford Univesrsity Press，1991)。
(2)F(ab’)2的制作
F(ab’)2可以通过用蛋白水解酶胃蛋白酶对抗FGF-8中和抗体进行 处理制作。胃蛋白酶处理后，通过与Fab同样的纯化操作，可以回收均 一的F(ab’)2(monoclonal antibodies)。另外，也可以通过用N，N’-o-亚 苯基二马来酰亚胺或二马来酰亚胺己烷等那样的马来酰亚胺对3.(3)所 述的Fab’进行处理，使硫醚键生成的方法，以及用二硫代二(2-硝基 苯甲酸)进行处理，使二硫键生成的方法也可以制作(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(3)Fab’的制作
Fab’可以通过用二硫苏糖醇等还原剂对3.(2)所述的F(ab’)2进行处 理得到。而Fab’也可以用大肠杆菌通过基因工程手法进行制作。例如将 编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA克隆到Fab’表达用载 体，可以制作Fab’表达载体。作为Fab’表达用载体只要是可以整合表达 编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA的载体，可以使用任 意载体。例如pAK19(Carter P.et al.，Bio/Technology，10，163-167， 1992)等。将Fab’表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使Fab’生成蓄积 在包涵体或外周胞质层。由包涵体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变 成具有活性的Fab’，而表达在胞质层时，通过溶菌酶进行部分消化、渗 透压冲击、超声等处理破碎细菌，可以从菌体外回收。再折叠后或从菌 的破碎液中通过使用蛋白G柱等，可以纯化均一的Fab’(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(4)svFv的制作
svFv可以通过基因工程手法用噬菌体或大肠杆菌制作。例如，通过 编码由12个残基以上的氨基酸序列构成的多肽接头的DNA连接编码 2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的VH以及VL的DNA，制作编码scFv的 DNA。多肽接头的付加要不妨碍VH、VL与抗原的结合那样最适化是重 要的，例如，可以使用Pantoliano等人报道的(Pantoliano M.W.et al.，Biochemistry，30，10117-10125，1991)或对他进行改变的多肽接头。
将制作的DNA克隆到scFv表达用载体，可以制作scFv表达载体。作 为scFv表达用载体只要是可以整合表达scFv的DNA的，可以使用任意的 载体。如，pCANTAB5E(Amersham Biosciences公司生产)、Phfa(Lah M.et al.，Hum.Antibodies Hybridomas，5，48-56，1994)等。通过将scFv表 达载体导入适当的大肠杆菌，使辅助噬菌体感染，可以得到在噬菌体表 面scFv以与噬菌体表面蛋白质融合的形式表达的噬菌体。另外，将scFv 表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使scFv生成蓄积在包涵体或外周胞 质层。由包涵体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变成具有活性的 scFv，而表达在胞质层时，通过溶菌酶进行部分消化、渗透压冲击、超 声等处理破碎细菌，可以从菌体外回收。再折叠后或从菌的破碎液中通 过使用阳离子交换柱等，可以纯化均一的scFv(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(5)diabody的制作
通过将制作上述的scFv时的多肽接头做成3～10个残基左右可以制 作diabody。使用一种抗体的VH和VL时，可以制作2价抗体，使用两种 抗体的VH和VL时，可以制作具有2种特异性的diabody(Le Gall F.et al.，FEBS Lett.，453，164-168，1999，Courage C.et al.，Int.J.Cancer， 77.763-768，1998)。
(6)dsFv的制作
dsFv可以通过基因工程手法用大肠杆菌制作。首先，在编码2.(2)、 (5)和(6)所述的抗体的VH以及VL的DNA的适当位置导入变异，制 作编码的氨基酸残基被置换为半胱氨酸的DNA。氨基酸残基向半胱氨酸 残基的改变可以通过使用2.(6)的PCR法的变异导入法进行。将制作 的各个DNA克隆到dsFv表达用载体，可以制作VH和VL的表达载体。作 为dsFv表达用载体只要是可以整合表达dsFv用的DNA的载体，可以使用 任意载体。例如pUL19(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994) 等。将VH和VL的表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使VH和VL生成 蓄积在包涵体或外周胞质层。由包涵体或外周胞质层得到VH和VL，进 行混合，通过通常蛋白质用的再折叠法使二硫键形成，可以制作具有活 性的dsFv。在重折叠后，可以通过离子交换层析和凝胶过滤等进一步进 行纯化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(7)含有CDR的肽的制作
含有CDR的肽可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法制作。另外 制作编码含有CDR的肽的DNA，将制作的DNA克隆到适当的表达载体， 可以制作CDR肽表达载体。作为表达用载体只要是可以整合表达编码含 有CDR的肽的DNA的载体，可以使用任意载体。例如pLEX(インビト ロジエン公司生产)、pAX4a+[MoBiTec公司生产]等。将表达载体导入 适当的大肠杆菌，可以使含有CDR的肽生成蓄积在包涵体或外周胞质 层。由包涵体或外周胞质层可以得到含有CDR的肽，通过离子交换色谱 和凝胶过滤等进行纯化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(8)活性评价
上述抗体片段的抗原结合活性可以使用抗体片段作为第一抗体，通 过上述1.(2)所述的酶免疫测定法、表面胞质团共振(Karlsson R et al.， J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)等进行测定。另外，通过1. (4)所述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中和活 性。
4.本发明的预防药和治疗药
抗FGF-8中和抗体由于可以与滑膜和软骨的细胞以及组织上的 FGF-8结合，抑制由于FGF-8诱导的软骨细胞外基质的分解，抑制软 骨的破坏，所以成为软骨的保护剂。另外由于该抗体具有抑制由FGF- 8诱导的滑膜细胞的增殖的能力，所以成为滑膜细胞的增殖抑制剂。由 于关节的破坏伴随着软骨的破坏和滑膜细胞的增殖，所以该抗体通过抑 制滑膜细胞的增殖和软骨的破坏而成为关节破坏的抑制剂。关节炎是伴 随着关节的破坏的疾病，该抗体由于抑制关节的破坏而成为关节炎的治 疗药和预防药。关节炎包括变形性关节病和关节风湿病、全身性红斑狼 疮、强直性关节炎、干癣性关节炎、椎间盘疾病、急性结晶性滑膜炎(包 括痛风、假痛风)等。
人源化抗体与人以外的动物的单克隆抗体比较，由于几乎是来自人 抗体的氨基酸序列的一部分，所以在人体内表现出很高的效果，而且免 疫原性低，预期其效果持续时间长，所以作为预防药和治疗药很理想。
含有抗FGF-8中和抗体的药，作为治疗药虽然可单独给药，但通 常都是与药理学上容许的一种或一种以上的载体一起混合，作为通过制 剂学技术领域中常见的任意方法制造的药剂提供最好。
给药途径希望使用治疗时效果最好的途径，如可以口服给药、或经 口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内、关节内、以及静脉内等非口 服给药，抗体或肽制剂时，最好是经关节内和静脉内给药。
给药方式，如喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆制剂、乳剂、 栓剂、注射剂、软膏、贴剂等。
作为适用于口服的制剂，如乳剂、糖浆、胶囊、片剂、散剂、颗粒 剂等。
象乳剂和糖浆那样的液体制品可以使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖 等糖类，聚乙二醇、丙二醇等醇类，芝麻油、橄榄油、大豆油等油类， p-羟基苯甲酸酯等防腐剂，草莓香料、薄荷香料等香料类等作为添加剂 制造。
胶囊、片剂、散剂、颗粒剂等可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖醇等赋形剂，淀粉、藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石等滑润剂，聚 乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂， 甘油等可塑剂等作为添加剂制造。
作为适用于非口服的制剂，如注射剂、栓剂、喷雾剂等。
注射剂可以用盐溶液、葡萄糖溶液、或由两者混合物组成的载体等 制备。
栓剂可以用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体制备。
而喷雾剂可以用抗体或肽本身、或者不刺激患者口腔和气管粘膜， 而且使该抗体或肽以微细的粒子分散，使其容易吸收的载体等制备。
作为载体，具体来说，如乳糖、甘油等。根据该抗体或肽以及使用 的载体的性质，可以做成烟雾剂、干燥粉末等制剂。另外，在这些非口 服制剂中，也可以添加口服制剂中作为添加剂列举的成分。
给药量或给药次数因目的治疗效果、给药方法、治疗期间、年龄、 体重等而有所不同，通常成人为每天10μg/kg～20mg/kg。
抗FGF-8中和抗体抑制软骨细胞外基质的分解以及抑制滑膜细胞 的增殖可以使用以下(1)和(2)所示的体外的分析体系确认。而作为 关节炎的治疗药和预防药也可以将该抗体用于以下(3)所示的关节炎 病理模型鼠，通过看是否可以减轻他的关节炎症状进行评价。
(1)FGF-8对软骨破坏的抑制活性
软骨的破坏通过将使用软骨细胞或软骨器官的软骨的细胞外基质 的分解、从软骨细胞或滑膜细胞产生的破坏因子的增加作为指标的分 析，以及由于软骨破坏的进展引起的软骨下骨的破坏可以分别通过以骨 吸收量作为指标的分析进行评价。
(a)软骨细胞外基质的分解
在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗体的情况下对初 代培养的兔关节软骨细胞进行培养，通过测定培养后残留在培养板上的 细胞外基质的量对软骨破坏作用进行评价。细胞外基质量是以经番木瓜 蛋白酶处理能够游离出来的葡萄糖胺聚糖的量进行测定。由于FGF-8 诱导的细胞外基质的减少在由于抗FGF-8中和抗体的添加受到抑制 时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。
软骨破坏作用也可以按照Price等人的方法(Price J.S.et al.，Arthritis Rheum.，42，137-147，1999)在FGF-8存在下添加和不添加抗 FGF-8中和抗体的情况下对初代培养的牛鼻中隔软骨器官进行培养， 通过测定培养后软骨器官中的细胞外基质的量对软骨破坏作用进行评 价。由于FGF-8诱导的细胞外基质的减少在通过抗FGF-8中和抗体的 添加受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。细胞外基 质的量是以通过二甲基亚甲基法(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)对经番木瓜蛋白酶处理培养后的器 官，能够游离出来的葡萄糖胺聚糖的量进行测定，或根据东京卫生年报， 36，277，1985，以胶原的量作为羟脯氨酸浓度的测定来测定的。
(b)与软骨破坏有关的因子的产生
作为与软骨破坏有关的因子如前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、 一氧化氮。在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗体的情况下 对兔关节软骨细胞或兔滑膜细胞进行培养，以这些因子从该细胞的产生 量对培养上清的前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、一氧化氮进行测定。 FGF-8促进前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、一氧化氮的产生由于抗 FGF-8中和抗体的添加受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破 坏的作用。
前列腺素E2可以通过前列腺素E2 EIA系统(Amersham Biosciences 公司生产)、基质金属蛋白激酶3可以通过兔基质金属蛋白激酶3ELISA 系统(Amersham Biosciences公司生产)，一氧化氮可以通过使用Griess 试剂的方法(Green L.C.et al.，Anal.Biiochem.126，131-138 1982)进行测 定。
(c)骨吸收
骨吸收可以通过在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗 体的情况下对鼠头盖骨进行培养，测定培养上清中的钙浓度或羟脯氨酸 浓度来测定。由于FGF-8促进骨吸收在添加抗FGF-8中和抗体时受到 抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。培养上清中的钙浓 度可以使用钙C-测试和光(和光纯药工业公司生产)进行测定。培养 上清中的羟脯氨酸浓度可以根据东京卫生年报，36，277，1985的报道 进行测定。
(2)滑膜细胞的增殖抑制作用
滑膜细胞的增殖可以在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中 和抗体的情况下对人或兔的滑膜细胞进行培养，通过测定[3H]胸腺嘧啶 整合量来评价。由于FGF-8促进的[3H]胸腺嘧啶整合量在添加抗FGF -8中和抗体时受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制滑膜细胞增殖的 作用。
(3)用关节炎病理模型动物在体内的评价
用下述的关节炎病模型动物，可以评价FGF-8或抗FGF-8中和抗 体对关节破坏的效果。将抗FGF-8中和抗体用于关节炎病理模型动物， 当该模型动物的关节炎症状减轻时，认为可以用作关节炎的治疗药和预 防药。
作为表现出类似于关节风湿病的病理模型动物，主要有在足关节自 然发生关节炎的MRL-lpr小鼠(Hang L.et al.，J.Exp.Med.，155， 1690-1701，1982、可从日本チヤ-ルス·リバ-购买到)、对免疫结核死菌 后诱导的大鼠·佐剂关节炎模型(Pearson CM.et al.，Arth.Rheum.， 5，654-658，1962；Taurog J.D.et al.，Cell.Immunol.，75，271-282，1983； Bendele A.et al.，J.Rheumatol.，26，1225-1229，1999)，将关节中许多II型 胶原与佐剂一起免疫后发病的小鼠·胶原关节炎模型(Stuart J.M.et al.，Annu.Rev.Immunol.，2，199-218，1984；Kamada H.et al.，Jpn.J. Pharmacol.，70，169-175，1996)等。这些模型动物表现出类似于关节风湿 病的症状，可以广泛地用于关节炎治疗药的评价。
使用大鼠·佐剂关节炎模型时，分别就佐剂处理足(在急性炎症之后 又发生慢性炎症的二相性炎症反应)和佐剂非处理足(从致敏1周左右 引起慢性炎症)随时间对后肢足浮肿容积进行测定。另外进行左右后 肢的软X射线摄影，就骨破坏和关节的变形进行评价。另外通过测定尿 中的葡萄糖胺聚糖量可以对全身的软骨破坏进行评价，通过测定尿中的 脱氧吡啶啉量和羟脯氨酸量对全身的骨破坏进行评价。尿中的葡萄糖胺 聚糖量可以用二甲基亚甲基蓝法(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)，而尿中的脱氧吡啶啉量可以使 用オステオリンクス「DPD」(住友制药公司生产)，尿中的羟脯氨酸 量可以根据池田的方法(池田真悟等，东京卫研年报.36，277-282，1985) 进行测定。另外可以使用アスプロ-GP(大塚制药)对作为全身的炎 症反应指标的血清中的粘蛋白浓度进行测定，按照Tracey等人的方法 (Tracey W.R.，et al.，J.Pharmacol.Exp.ther.，272，1011-1015，1995)对血 清中的一氧化氮浓度进行测定。
使用小鼠·胶原关节炎模型时，对体重和关节炎记分的随时间变化、 血清中抗胶原抗体效价进行测定。另外解剖后，进行关节部的病理组织 学研究。关节炎记分通过0至4分、全肢最高16分的记分进行评价。记分 基准为0：正常；1：发现弱红斑，2：发现弱肿胀和红斑，3：发现强肿 胀和红斑，通过触知发现温感，4：发现随着手指变形引起的显著的肿 胀。
作为变形性关节病模型，更多地使用用狗、兔等大动物，通过膝半 月的切除和韧带的切离，使关节产生动摇，使慢性关节的变性发生的模 型(以下称之为实验变形性关节病模型)(伊腾隆太，用于新药开发的 动物模型利用集成，变形性关节病，R&D计划，1985年，Guingamp C.et al.，Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997；van der Kraan P.M.et al.，Am.J.Pathol.，135，1001-1014，1989)。另外，通过向大鼠膝关节内注 入一碘代乙酸，促进关节软骨的细胞外基质葡萄糖胺聚糖的游离，作为 引起关节破坏的大鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节病模型。
通过兔膝关节半月板部分切除形成实验变形性关节病模型可以通 过Colombo等人的方法(Colombo C.et al.，Arthritis Rheum.， 26，875-886，1983)和菊地等人的方法(菊地寿辛等人，关节外科，15， 92-98，1966)制作。
大鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节病模型基于Guingamp等人的方 法(Guingamp C.et al.Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997)，向大鼠的 膝关节内注入一碘代乙酸进行制作。
这些变形性关节病动物模型可以通过在一定期间后摘出膝关节膝 盖骨，用番木瓜蛋白酶进行处理，通过用二甲基亚甲基蓝法 (Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)测定葡萄糖 胺聚糖量，对关节破坏(细胞外基质的分解)进行评价。另外进行膝关 节的病理组织学的研究。
作为将抗FGF-8中和抗体用于模型动物时的剂型以及给药途径， 可以根据对象模型动物的性质和病情适当地选择。例如，可以直接地， 或者与其他药理学上容许的载体、赋形剂、稀释剂等一起对模型动物经 口或不经过口(腹腔内、静脉内、关节内、肌肉内、皮下给药等)给药。
抗FGF-8中和抗体的配合量以及给药量可以根据该制剂的给药方 法、给药方式、使用目的、模型动物的具体症状、模型动物的体重等分 别决定，没有特别限定，给药量每天大概为1μg/kg～100mg/kg，给药间 隔可以是1天1次，也可以1天分为2～4次，或4次以上的次数给药。另外 也可以通过点滴等连续给药。当给药到关节等局部时，每一处大约可给 药1pg至100mg。
5.本发明的诊断药
FGF-8诱导关节中的滑膜细胞的增殖、软骨细胞外基质的破坏。 上述的FGF-8抗体由于与FGF-8特异性结合，可以对FGF-8进行检 测和定量，所以可以用作关节炎的诊断药。作为可以诊断的关节炎，如 上述4.所述的疾病。FGF-8的检测和定量可以按照下述6.所述方法进 行。
作为本发明诊断药使用的抗FGF-8抗体，只要是与FGF-8特异性 结合的抗体都可以，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种，最 好使用单克隆抗体。
作为单克隆抗体，如通过杂交瘤生产的抗体、人源化抗体和这些抗 体的抗体片段。
本发明诊断药中使用的抗FGF-8抗体可以象上述的抗FGF-8中 和抗体的制造法那样制造，但不需要抑制FGF-8的活性。也可以将抗 FGF-8中和抗体作为本发明的诊断药所用的抗FGF-8抗体来使用。作为 本发明诊断药使用的抗FGF-8抗体的具体例子如杂交瘤KM1334 (FERM BP-5451)生产的单克隆抗体KM1334、转化体KM3034 (FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体KM3034、转化体KM3334生 产的人型嵌合抗体KM3334、转化体KM8037(FERM BP-8084)生产 的人型CDR移植抗体HV0LV6、转化体KM8034生产的人型CDR移植抗 体HV0LV6/CHO、转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR 移植抗体HV0LV3-1/CHO以及转化体KM8035(FERM BP-8082)生 产的人型CDR移植抗体HV0LV4-3/CHO。
含有抗FGF-8抗体的诊断药根据下述6.所述那样的判定方法也可 以含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于 进行抗原抗体反应的试剂，如缓冲剂、盐等。作为检测用试剂如识别抗 FGF-8抗体的标记二次抗体、在对应于标记的底物等通常的免疫学检 测法中使用的试剂。
6.本发明的关节炎的判定方法
作为用本发明的判定方法判定的关节炎如上述4.所述的疾病。在这 些疾病的患者的关节中，与健康人比较，认为具有诱导滑膜细胞的增殖、 软骨的细胞外基质的破坏的活性的FGF-8的量增加了。
作为本发明的关节炎的判定方法，例如使用通过活组织等检查从被 检查者採取的关节的滑膜和软骨的细胞或组织切片、以及由该细胞或组 织制备的细胞提取液、滑液等，象下述那样对细胞或组织中存在的FGF -8进行免疫学检测和/或定量的方法。
作为使用针对FGF-8的抗体对在关节中表达的FGF-8进行免疫 学检测和/或定量的方法，可以使用荧光抗体法、酶免疫测定法(ELISA)、 放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法、免疫细胞染色 法、免疫印迹法、免疫沉降法、三明治(Sandwich)ELISA法(富山朔 二和安东民卫，单克隆抗体实验手册，讲谈社科学，1987年、日本生化 学会、续生化学实验讲座5，免疫生化学研究法，东京化学同人，1986 年)等。
荧光抗体法可以使用文献(单克隆·抗体、富山朔二和安东民卫，单 克隆抗体实验手册，讲谈社科学，1987年)等所述方法进行。具体来说， 在分离的关节的细胞和组织等中使抗FGF-8抗体反应，再使用异硫氰 酸酯荧光素(FITC)或藻红素等荧光物质标记的抗免疫球蛋白抗体反 应后，用细胞流式细胞计进行测定荧光色素的方法。
酶免疫测定法(ELISA)是使抗FGF-8抗体与分离的关节的细胞 或组织、滑液等反应，再使实施了过氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶标记 的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通过酶反应发色的底物，进行反应， 用吸光光度计测定发色色素的方法。
放射性物质标记免疫抗体法(RIA)是使抗FGF-8抗体与分离的 关节的细胞或组织、滑液等反应，再使实施了放射性同位素标记的抗免 疫球蛋白抗体反应后，用闪烁计数器等测定放射能的方法。
免疫组织染色法、免疫细胞染色法是使抗FGF-8抗体与分离的关 节的细胞或组织等反应，再使实施了FITC等荧光物质、过氧化物酶、 碱性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应；酶标记的情形下，加 入通过酶反应发色的底物，进行反应后，用显微镜进行观察的方法，可 以使用文献(单克隆抗体，富山朔二和安东民卫，单克隆抗体实验手册， 讲谈社科学，1987年)等所述方法进行。
免疫印迹是将分离的关节的细胞或组织、他们的破碎液、滑液等溶 解于含有SDS的样品用缓冲液，进行SDS-PAGE后，转移到聚偏氟乙 烯(PVDF)膜上，使抗FGF-8抗体反应，再使实施了过氧化物酶、碱 性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通过酶反应发色 或化学发光的底物，进行反应，作为带检测出的方法。
免疫沉降法是使分离的关节的细胞或组织的破碎液、滑液与固定于 颗粒等上的抗FGF-8抗体等反应，通过离心等将颗粒分离后，用含有 SDS的样品用缓冲液进行处理颗粒，用闪烁计数器等检测溶解的FGF- 8的方法。
三明治ELISA是使用抗原表位各不相同的两种抗FGF-8抗体的酶 免疫测定法中的一种。将其中的一种抗体固定于培养板上，使分离的关 节的细胞或组织、他们的破碎液、滑液反应后，再使另一种抗FGF-8 抗体与结合于培养板上的抗FGF-8抗体的FGF-8反应。再使实施了过 氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通 过酶反应发色的底物，进行反应，用吸光光度计测定发色色素的方法。
附图的简单说明
图1是表示兔软骨细胞的FGF-8引起细胞外基质的分解作用的图。 纵轴表示残留在细胞外基质中的葡萄糖胺聚糖的量，横轴表示FGF-8 的浓度(ng/mL)。值表示平均值±标准误差，***表示P＜0.001(无刺激 组对比、Dunnett检测)。
图2是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对兔软骨细胞的FGF-8引 起细胞外基质的分解的抑制作用的图。纵轴表示残留在细胞外基质中的 葡萄糖胺聚糖的量，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平均 值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Student的t-检测)， **表示P＜0.01，***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett检测)。
图3是表示由兔软骨细胞的FGF-8促进细胞外基质金属蛋白激酶3 的产生和抗FGF-8中和抗体KM1334产生的抑制作用的图。纵轴表示残 留在培养液中的基质金属蛋白激酶3的量(ng/孔)，横轴表示KM1334 的浓度(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表示P＜0.01(无刺激 组对比、Aspin-Welch检测)，***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett 检测)。
图4是表示兔滑膜细胞的FGF-8促进增殖作用的图。纵轴表示整合 到兔滑膜细胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示FGF的浓度 (ng/mL)。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05(无刺激组对比、 Steel检测)。
图5是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对由兔滑膜细胞的FGF-8 引起的增殖促进的抑制作用的图。纵轴表示整合到兔滑膜细胞中的[3H] 胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平 均值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Student的t-检测)， ***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett检测)。
图6是表示由人滑膜细胞的FGF-8引起的增殖促进作用的图。纵轴 表示整合到人滑膜细胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示FGF-8 的浓度(ng/mL)。值表示平均值±标准误差，***表示P＜0.001(无刺激 组对比，Dunnett检测)。
图7是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对由人滑膜细胞的FGF-8 引起的增殖促进的抑制作用的图。纵轴表示整合到兔滑膜细胞中的[3H] 胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平 均值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Aspin-Welch检测)， *表示P＜0.05(0组为对比，Steel检测)。
图8是表示由于FGF-8注入引起的关节细胞外基质分解的图。纵轴 表示关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖浓度(μg/mL)。值表示平均值±标 准误差，**表示P＜0.01(生理盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图9是表示由于FGF-8注入引起的关节的膝盖骨破坏的图。纵轴表 示膝盖骨重量(mg)。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05(生理 盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图10是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对胶原关节炎病小鼠的关 节炎记分的随时间变化的抑制作用的图。纵轴表示关节炎记分，横轴表 示从胶原初次致敏开始的经过天数。值表示平均值±标准误差，*表示 P＜0.05(给予生理盐水组对比，Wilcoxon顺位和检测)，#表示P＜0.05 (给予溶剂组对比，Wilcoxon顺位和检测)。
图11是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠的佐 剂非处置足的足容积量增加的抑制作用的图。纵轴表示足容积(mL)。 值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组对比、Aspin- Welch检测)，**表示P＜0.01(生理盐水注入组对比，Student的t-检 测)。
图12是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠的佐剂非处置足的足容积量增加的抑制作用的图。纵轴表示足容 积(mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组对比、 Aspin-Welch检测)，***表示P＜0.001(给予溶剂组对比，Student的t 检测)， 表示P＜0.01， 表示P＜0.001(给予溶剂组对比，Aspin- Welch检测)。
图13是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的图。纵轴表示葡萄糖胺聚糖浓度/ 肌酸酐浓度比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001 (未处置组对比、Aspin-Welch检测)，**表示P＜0.01(生理盐水注入 组对比，Student的t-检测)。
图14是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠尿中的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的图。纵轴表示葡萄糖胺 聚糖浓度/肌酸酐浓度比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表示 P＜0.01(未处置组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05(生理盐 水注入组对比，Student的t-检测)。
图15是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)上升的抑制作用的图。纵轴表示脱 氧吡啶啉浓度/肌酸酐浓度比(nmol/mmol)。值表示平均值±标准误差， ###表示P＜0.001(未处置组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05 (生理盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图16是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠尿中的脱氧吡啶啉量上升的抑制作用的图。纵轴表示脱氧吡啶啉 浓度/肌酸酐浓度比(nmol/mmol)。值表示平均值±标准误差，###表示 P＜0.001(未处置组对比、Student的t-检测)，**表示P＜0.01(溶剂注 入组对比，Student的t-检测)。
图17是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的羟脯氨酸上升的抑制作用的图。纵轴表示羟脯氨酸浓度/肌酸酐浓度 比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组 对比、Student的t-检测)，**表示P＜0.01(溶剂给予组对比，Student 的t-检测)。
图18是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对一碘代乙酸诱发变形性 关节病模型大鼠中的关节软骨破坏的抑制作用的图。纵轴表示关节洗净 液中的葡萄糖胺聚糖浓度(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表 示P＜0.01(假手术组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05(生理 盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图19是表示质粒pKM1334CH-H5的构建步骤的图。
图20是表示质粒pKM1334CH-L4的构建步骤的图。
图21是表示质粒pKANTEX1334的构建步骤的图。
图22是表示抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、抗FGF-8中和抗体 KM3034和KM3334对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8依赖增殖 的中和活性的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了 FGF-8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM1334、□为 KM3034、△为KM3334、×为阴性对照的KM2760的活性。
图23是表示质粒pKM1334HVO的构建步骤的图。
图24是表示质粒pKANTEX1334HVOLVO的构建步骤的图。
图25是表示通过ELISA测定抗FGF-8中和嵌合抗体KM3334、抗 FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6对FGF-8 的结合活性的结果的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示结合 活性(OD415)。△为KM3334、○为HVOLVO、□为HVOLV6、×为HV6LV6 的活性。
图26是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6 对FGF-8的结合活性的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共 振信号(RU)。
图27是表示质粒pKM1334LV3-1的构建步骤的图。
图28是表示质粒pKM1334LV4-2的构建步骤的图。
图29是表示质粒pKM1334LV3-2的构建步骤的图。
图30是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO/CHO、 HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV4-2/CHO、HVOLV3- 1/CHO、HVOLV3-2/CHO、HVOLV2-1/CHO、HVOLV2-2/CHO 对FGF-8的结合活性的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共 振信号(RU)。
图31是表示抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR 移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV3-1/CHO、 HVOLV2-1/CHO对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8依赖增殖 的中和活性的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了 FGF-8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM3034、●为 HVOLV6/CHO、◇为HVOLV4-1/CHO、△为HVOLV3-1/CHO、□ 为HVOLV2-1/CHO、×为阴性对照的KM2760的活性。
图32是表示质粒pKM1334LV3-3的构建步骤的图。
图33是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV3- 1/CHO、HVOLV4-3/CHO、HVOLV3-3/CHO对FGF-8的结合活性 的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共振信号(RU)。
图34是表示抗FGF-8中和嵌合抗体KM3334、抗FGF-8中和CDR 移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-3/CHO、 HVOLV3-3/CHO对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8的结合活 性的结果的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了FGF -8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM3034、●为 HVOLV6/CHO、△为HVOLV3-1/CHO、▲为HVOLV4-3/CHO、■ 为HVOLV3-3/CHO、×为阴性对照的KM2760的活性。
本发明提供以下(1)～(51)。
(1)一种关节炎的预防药或治疗药，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(2)根据上述(1)所述的医药，其中，与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体是单克隆抗体。
(3)根据上述(2)所述的医药，其中，单克隆抗体是选自杂交瘤 产生的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(4)根据上述(3)所述的医药，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(5)根据上述(3)所述的医药，其中，人源化抗体是人型嵌合抗 体或人型互补决定区(CDR)移植抗体。
(6)根据上述(5)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是由与FGF -8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的抗体重链可变区 (VH)以及抗体轻链可变区(VL)、以及人抗体的抗体重链恒定区(CH) 以及抗体轻链恒定区(CL)构成的人型嵌合抗体。
(7)根据上述(6)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是以下(a)～ (c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(8)根据上述(7)所述的医药，其中，人型嵌合抗体是转化体 KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(9)根据上述(5)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是含有 与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及 VL的CDR和人抗体的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(10)根据上述(9)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是由 与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及 VL的CDR、人抗体的VH以及VL的框架区(FR)、以及人抗体的CH以 及CL构成的人型CDR移植抗体。
(11)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(12)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有以下氨基酸序列的人型CDR移植抗体，即序列编号19 所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的 Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸 残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(13)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(14)根据上述(13)所述的医药，其中，人型CDR移植抗体是以 下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(15)根据上述(9)或(10)所述的医药，其中，人型CDR移植 抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(16)根据上述(3)所述的医药，其中，抗体片段是选自Fab、Fab’、 F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体可变区(V区)片段(diabody)、 二硫化物稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(17)一种关节炎的诊断药，其中，作为有效成分含有与FGF-8 特异性结合的抗体。
(18)根据上述(17)所述的诊断药，其中，与FGF-8特异性结 合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
(19)根据上述(18)所述的诊断药，其中，单克隆抗体是选自杂 交瘤生产的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(20)根据上述(19)所述的诊断药，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(21)根据上述(19)所述的诊断药，其中，人源化抗体是人型嵌 合抗体或人型CDR移植抗体。
(22)根据上述(21)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是由与 FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以及 CL构成的人型嵌合抗体。
(23)根据上述(22)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是以下 (a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(24)根据上述(23)所述的诊断药，其中，人型嵌合抗体是转化 体KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(25)根据上述(21)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 含有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗体 的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(26)根据上述(25)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 由与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的 VH以及VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗体。
(27)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(28)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(29)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(30)根据上述(29)所述的诊断药，其中，人型CDR移植抗体是 以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号21 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号44 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号50 所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(31)根据上述(25)或(26)所述的诊断药，其中，人型CDR移 植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(32)根据上述(19)所述的诊断药，其中，抗体片段是选自Fab、 Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区片段(diabody)、 二硫键稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(33)一种关节炎的判定方法，其特征在于，利用与FGF-8特异 性结合的抗体检测和/或定量试样中的FGF-8。
(34)根据上述(33)所述的判定方法，其中，与FGF-8特异性 结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
(35)根据上述(34)所述的判定方法，其中，单克隆抗体是选自 杂交瘤生产的抗体、人源化抗体以及它们的抗体片段中的抗体。
(36)根据上述(35)所述的判定方法，其中，杂交瘤是杂交瘤 KM1334(FERM BP-5451)。
(37)根据上述(35)所述的判定方法，其中，人源化抗体是人型 嵌合抗体或人型CDR移植抗体。
(38)根据上述(37)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是由 与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL、以及人抗体的CH以 及CL构成的人型嵌合抗体。
(39)根据上述(38)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是以 下(a)～(c)中任一种人型嵌合抗体：
(a)VH含有序列编号5所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(b)VL含有序列编号6所示氨基酸序列的人型嵌合抗体
(c)VH含有序列编号5所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号6 所示氨基酸序列的人型嵌合抗体。
(40)根据上述(39)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗体是转 化体KM3034(FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体。
(41)根据上述(37)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是含有与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR和人抗 体的CH以及CL的人型CDR移植抗体。
(42)根据上述(41)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是由与FGF-8特异性结合的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体 的VH以及VL的FR、以及人抗体的CH以及CL构成的人型CDR移植抗 体。
(43)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号7、8和9所 示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号 10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(44)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3 号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的 Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、 13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的 Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及 95号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列、并且VL含有序列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的 Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及 92号的Tyr中的至少一种以上氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨 基酸序列的人型CDR移植抗体。
(45)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体
(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51 所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的 人型CDR移植抗体。
(46)根据上述(45)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗体 是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(b)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体
(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列，并且VL含有序列编号 50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。
(47)根据上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR 移植抗体是以下(a)～(c)中的任一种人型CDR移植抗体：
(a)转化体KM8037(FERM BP-8084)生产的人型CDR移植抗 体
(b)转化体KM8035(FERM BP-8082)生产的人型CDR移植抗 体
(c)转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR移植抗 体。
(48)根据(35)所述的判定方法，其中，抗体片段是选自Fab、 Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体可变区(V区)片段(diabody)、 二硫化物稳定的V区片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗体片段。
(49)一种关节破坏抑制剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(50)一种软骨保护剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并且抑 制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
(51)一种滑膜增殖抑制剂，其中，含有与FGF-8特异性结合并 且抑制FGF-8活性的抗体作为有效成分。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中所用的抗体，只要是与FGF- 8特异性结合，并且抑制FGF-8活性的抗体(以下，也称为“抗FGF-8 中和抗体”)就可以，例如可以举出对FGF-8具有中和活性的抗体以及 该抗体的片段等。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中所用的抗FGF-8中和抗体， 可以通过从与FGF-8特异性结合的抗体(以下也称为“抗FGF-8抗 体”)中选择具有抑制FGF-8活性能力的抗体而获得。作为FGF-8的 活性，只要是FGF-8具有的生物活性，可以是任意的活性，具体可以 举出促进小鼠乳腺癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J Steroid Biochem.，27，459-464，1987)、小鼠纤维胚细胞株NIH/3T3(ATCC编号： CRL-1658)或人前列腺癌细胞株LNCaP(ATCC编号：CRL-1740)的 增殖的活性；促进滑膜细胞增殖的活性；促进软骨细胞的细胞外基质的 分解的活性；促进源于软骨细胞的基质金属蛋白酶-3的产生的活性。
抗FGF-8抗体可以采用众所周知的手段(Harlow E.and Lane D.， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， 1988)制备。
作为在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的抗FGF-8中和 抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中任一种，但最好使用单克隆 抗体。
作为单克隆抗体可以举出由杂交瘤产生的抗体、人源化抗体以及这 些抗体的抗体片段。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的、通过杂交瘤产生的 抗FGF-8中和单克隆抗体，具体的可以通过下述方法制备。
即，作为抗原制备FGF-8蛋白质，从免疫该抗原的动物诱导具有 抗原特异性的浆细胞，进而使其与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，或培养 该杂交瘤或给予动物该杂交瘤细胞使该动物腹水癌化，从该培养液或腹 水中分离纯化与FGF-8特异性结合的抗体。从所得抗体中选择抑制 FGF-8活性的抗体。作为这种抗FGF-8中和单克隆抗体，可以举出特 开平9-271391中公开的属于小鼠IgG1亚类的杂交瘤KM1334(FREM BP-5451)产生的单克隆抗体KM1334。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人源化抗体，可以 举出利用基因重组技术改变上述抗FGF-8中和单克隆抗体的人源化抗 体。该抗体为抗原性低，并且血液中半衰期延长的抗体，作为预防药或 治疗药是优选的。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人源化抗体，包括 人型嵌合抗体以及人型互补决定区(complementarity determining region；以下简称为CDR)移植抗体。
人型嵌合抗体是指由人以外的动物的抗体的重链可变区(以下将可 变区称为V区，将重链可变区称为VH)以及轻链V区(以下称为VL)、 人抗体的重链恒定区(以下将恒定区称为C区，将重链恒定区称为CH 区)以及人抗体的轻链C区(以下称为CL)构成的抗体。作为人以外的 动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，只要能够制作杂交瘤，可以使用任何 动物。
作为本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人型嵌合抗体，可 以通过以下方法制备，即，从对由产生抗FGF-8中和单克隆抗体的杂 交瘤获得的编码该抗体的H链以及L链的cDNA中，取得编码VH以及VL 的DNA，分别插入具有编码人抗体的CH以及CL的DNA的动物细胞用表 达载体中，构建人型嵌合抗体表达载体，然后再导入动物细胞中，最后 使其表达制备。
作为人型嵌合抗体的CH，只要是属于免疫球蛋白(hIg)，则可以 是任何CH，但是，优选hIgG类的CH，可以使用属于hIgG类的γ1、γ2、 γ3、γ4等的亚类中的任一种。另外，作为人型嵌合抗体的CL，只要是 属于hIg就可以，可以使用κ类或λ类的CL。
作为与FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的人型嵌合抗体 (以下也称为抗FGF-8中和嵌合抗体)，可以举出由与FGF-8特异性 结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL和人抗体的CH 以及CL构成的抗FGF-8中和嵌合抗体，优选VH含有序列编号5所示的 氨基酸序列的人型嵌合抗体、VL含有序列编号6所示的氨基酸序列的人 型嵌合抗体以及VH含有序列编号5所示的氨基酸序列并且VL含有序列 编号6所示的氨基酸序列的人型嵌合抗体。具体可以举出抗体的VH由序 列编号5记载的氨基酸序列构成、CH由人γ1亚类的氨基酸序列构成、抗 体的VL由序列编号6记载的氨基酸序列构成、CL由人κ类的氨基酸序列 构成的人型嵌合抗体KM3034以及KM3334。
生产人型嵌合抗体KM3034的转化体KM3034于平成13年12月26日 以保藏号FERM BP-7836保藏于独立行政法人产业技术研究所专利生 物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
人型CDR移植抗体是指在人抗体上以人以外的动物抗体的CDR序 列分别置换人以外的动物抗体的VH以及VL的CDR的抗体。
本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的人型CDR移植抗体，可 以通过以下方法制备，即，构建对以人以外的动物抗FGF-8中和抗体 的VH以及VL的CDR序列分别置换任意的人抗体的VH以及VL的CDR 序列的V区进行编码的DNA，分别插入具有编码人抗体的CH以及人抗 体的CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人型CDR移植抗体表达 载体，然后导入动物细胞中，最后使其表达而制备。
作为人型CDR移植抗体的CH，只要是属于hIg就可以，但是优选 hIgG类的CH，可以使用属于hIgG类的γ1、γ2、γ3、γ4等的亚类中的任 一种。另外，作为人型CDR移植抗体的CL，只要是属于hIg就可以，可 以使用κ类或λ类的CL。
作为与FGF-8特异性结合，并且抑制FGF-8活性的人型CDR移植 抗体(以下也称为“抗FGF-8中和CDR移植抗体”)，可以举出含有与 FGF-8特异性结合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL 的CDR和人抗体的CH以及CL的CDR移植抗体、由与FGF-8特异性结 合并且抑制FGF-8活性的单克隆抗体的VH以及VL的CDR、人抗体的 VH以及VL的框架区(以下简称为FR)以及人抗体的CH以及CL构成的 人型CDR移植抗体。优选(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有 序列编号7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(b)VL的 CDR1、CDR2以及CDR3分别含有序列编号10、11和12所示的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体，(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分别含有 序列编号7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3 分别含有序列编号10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体， 更优选(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体， (b)VL含有序列编号19所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(c) VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编号19所示氨基 酸序列的人型CDR移植抗体。进一步优选(a)VH含有序列编号18所示 的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13号的Lys、40号的Ala、41号的Pro、 48号的Met、68号的Val、70号的Ile、74号的Thr、76号的Thr、82号的 Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号的Tyr中的至少一种以上的氨基 酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列，(b)VL含有序列编号 19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、15号的 Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上的氨基 酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列，(c)VH含有序列编号 18所示的氨基酸序列中选自第12号的Lys、13号的Lys、40号的Ala、41 号的Pro、48号的Met、68号的Val、70号的Ile、74号的Thr、76号的Thr、 82号的Glu、84号的Ser、87号的Arg以及95号的Tyr中的至少一种以上 的氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列、并且VL含有序 列编号19所示的氨基酸序列中选自第2号的Ile、3号的Val、14号的Thr、 15号的Pro、50号的Gln、51号的Leu以及92号的Tyr中的至少一种以上 氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体。具体地说，可以举出(a)VH含有序列编号18或20所示的氨基酸序 列的人型CDR移植抗体，(b)VL含有序列编号19、21、42、43、44、 45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(c)VH 含有序列编号18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列编号19、21、 42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗 体，优选(a)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编 号21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体，(b)VH含有序列编号18 所示氨基酸序列并且VL含有序列编号44所示氨基酸序列的人型CDR移 植抗体，(c)VH含有序列编号18所示氨基酸序列并且VL含有序列编 号50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗体。作为这种人型CDR移植抗 体，可以举出VH由序列编号18记载的氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的 氨基酸序列构成、VL由序列编号21记载的氨基酸序列并且CL由人κ类 的氨基酸序列构成的人型CDR移植抗体HVOLV6、HVOLV6/CHO；VH 由序列编号18记载的氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的氨基酸序列构 成、VL由序列编号44记载的氨基酸序列并且CL由人κ类的氨基酸序列 构成的人型CDR移植抗体HVOLV3-1/CHO；VH由序列编号18记载的 氨基酸序列并且CH由人γ1亚类的氨基酸序列构成、VL由序列编号50记 载的氨基酸序列并且CL由人κ类的氨基酸序列构成的人型CDR移植抗 体HVOLV4-1/CHO。
生产人型CDR移植抗体HVOLV6的转化体KM8037于平成14年6月 20日以保藏号FERM BP-8084保藏于独立行政法人产业技术研究所专 利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央 第6)。生产人型CDR移植抗体HVOLV3-1的转化体KM8036，于平成 14年6月20日以保藏号FERM BP-8083保藏于独立行政法人产业技术 研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1 番地中央第6)。生产人型CDR移植抗体HVOLV4-3的转化体KM8035， 在平成14年6月20日作为FERM BP-8082保藏在独立行政法人产业技 术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地中央第6)。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的抗FGF-8中和抗体 中也包括抗体片段。抗体片段包括作为与FGF-8特异性结合并且抑制 FGF-8活性的抗体片段的Fab(fragment of antigen binding的简称)、 F(ab’)2、Fab’、单链抗体(single chain Fv，以下简称为scFv)、二 聚体V区片段(diabody)、二硫键稳定化抗体(disulfide stabilized Fv， 以下简称为dsFv)以及含有CDR的肽。
Fab是由H链的N末端侧大致一半与整个L链构成的、分子量约5万 的具有抗原结合活性的片段，他是通过木瓜蛋白酶对在IgG的铰链区交 联两根H链的两个二硫键结合的上部肽部分进行分解而得到。
F(ab’)2是分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段，在通 过蛋白质分解酶胃蛋白酶处理IgG的铰链区的两个二硫键结合的下部而 得到的片段中(在H链的234号氨基酸残基处切断)比Fab借助铰链区的 二硫键结合的片段稍大。
Fab’是切断上述F(ab’)2的铰链间的二硫键的分子量约5万的、具 有抗原结合活性的片段。
ScFv是利用适当的肽接头(以下称为P)对一条VH以及一条VL进 行连接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽。在本发明的关节炎的预防药 或治疗药中使用的ScFv所含有的VH以及VL只要是抗FGF-8中和单克 隆抗体，可以是任意的VH和VL。
diabody(双抗体)是由抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二 聚体的抗体片段，对相同的抗原具有二价的抗原结合活性或者对于不同 的抗原分别具有特异的抗原结合活性。
dsFv是指通过二硫键使VH以及VL中的各1个氨基酸残基被置换为 半胱氨酸残基的多肽结合的片段。置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基， 可以通过Reiter等提出的方法(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7 697-704， 1994)，根据抗体的立体结构预测进行选择。在本发明的关节炎的预防 药或治疗药中使用的dsFv所含有的VH或VL只要是抗FGF-8中和单克 隆抗体，可以是任意的VH和VL。
在本发明的关节炎的预防药或治疗药中使用的含有CDR的肽，其构 成中含有抗FGF-8中和抗体的VH或VL的CDR的至少一个区以上。含 有多个CDR的肽，可以直接制备或通过适当的肽接头结合制备。
以下对本发明中使用的抗FGF-8中和抗体的具体制作方法和活性 评价方法、含有该抗体的关节炎的预防药或治疗药、抗FGF-8抗体的 关节炎的诊断药、使用抗FGF-8抗体的关节炎的判定方法进行说明。
1.抗FGF-8中和抗体(多克隆抗体、单克隆抗体)的制作方法
(1)抗原的制备
作为制备抗FGF-8中和抗体所必需的抗原，可以举出产生FGF-8 的细胞或细胞组分、或FGF蛋白质、该蛋白质的部分片段、具有该蛋白 质的氨基酸序列的部分序列的肽等。
FGF-8蛋白质以及该蛋白质的部分片段可以通过以下方式制备， 即，制备将编码FGF-8的全长或其部分片段DNA(Tanaka A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992，Tanaka A.et al.，FEBS Lett.，363，226-230，1996)插入适当的载体的启动子下游的重组载体， 将其导入宿主细胞获得FGF-8表达细胞，然后通过在适当的培养基中培 养该FGF-8表达细胞，从而在细胞内或培养上清液中直接产生或作为融 合蛋白而产生。另外，具有FGF-8蛋白质的部分序列的肽，可以利用 肽合成仪制备。
编码FGF-8的全长或其部分片段的DNA，可以通过以表达FGF-8 的SC-3等的细胞制备的cDNA作为模板的聚合酶链式反应[Polymerase Chain Reaction，以下简称为PCR；Sambrook J.，et al.，Molecular Cloning 3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，2001，Ausubel F. M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons， 1987-2001(以下记为Current Protocols in Molecular Biology)]制备。
作为宿主，只要是能够表达目的基因的都可以，例如细菌、酵母、 动物细胞、昆虫细胞等。作为细菌可以举出大肠杆菌(Escherichia coil)、 枯草杆菌(Bacillus subtilis)等的大肠杆菌属，芽孢杆菌属的细菌。作 为酵母可以举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 Schizosaccharomyces pombe等。作为动物细胞可以举出人的细胞，即 Namalwa细胞、猴的细胞即COS细胞、中国仓鼠细胞即CHO细胞等。 作为昆虫细胞可以举出Sf9、Sf21(フア一ミンジエン公司生产)、High Five(インビトロジエン公司生产)等。
作为导入编码FGF-8的全长或其部分片段DNA的载体，可以只要 是能够重组该DNA并在宿主细胞内表达的载体，可以使用任何载体。
以细菌例如大肠杆菌(Escherichia coil)作为宿主使用时的表达载 体，优选由启动子、核糖体结合序列、编码FGF-8的全长或其部分片 段DNA、复制终结序列、基于不同情况的启动子控制序列构成的载体， 例如可以举出市售的pGEX-2T(Amersham Biosciences公司生产)、 pET17b(Novagen公司生产)等。
作为向细菌导入重组载体的方法，只要是在细菌中导入DNA的方 法，可以使用任何方法，例如使用钙离子的方法(Cohen S.N.et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110-2114，1972)、原生质体法(特开昭 63-248394)等方法。
在作为宿主细胞使用酵母时，作为表达载体例如可以使用 YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。
作为向酵母导入重组载体的方法，只要是将DNA导入酵母的方法可 以使用任意的方法，例如电穿孔法(Becker D.M.and Guarente L.， Methods.Enzymol.，194，182-187，1991)、原生质体法(Hinnen A.et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1929-1933，1978)、醋酸锂法(Ito H.et.， J.Bacteriol.，153，163-168，1983)等。
在作为宿主细胞使用动物细胞时，作为表达载体例如可以使用 pAGE107(特开平3-22979；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140， 1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310， 1987)等。
作为启动子只要是在动物细胞中能够表达的都可以使用，例如可以 举出巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的启动子、SV40 或金属硫因的启动子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与 启动子一起使用。
作为向动物细胞导入重组载体的方法，只要是将DNA导入动物细胞 的方法都可以使用，例如电穿孔法(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3， 133-140，1990)、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂[质]转[染]法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)等。
在作为宿主使用昆虫细胞时，例如可以通过Current Protocols in Molecular Biology，O’Reilly et al.，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，Oxford University Press，1994等记载的方法表达 蛋白质。即，将以下叙述的重组基因导入载体与(昆虫)杆状病毒 (Baculovirus)共同导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清液中获得重组 病毒，然后使昆虫感染重组病毒，从而获得蛋白质表达昆虫细胞。
作为基因导入载体，例如可以使用pVL1392、pVL1393(都是フア 一ミンジエン社制)、pBlueBac4.5(イン ビトロジエン公司生产)等。
作为Baculovirus，例如可以使用作为感染射干科昆虫病毒的 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus等。
作为用于制备重组病毒的、向昆虫细胞共同导入上述重组基因导入 载体和上述Baculovirus的方法，例如可以使用磷酸钙法(特开平2- 227075)、脂[质]转[染]法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84，7413-7417，1987)等。
另外，也可以通过使用フア一ミンジエン公司生产的バキユロゴ一 ルド引酵物试剂盒(starter kit)等制作重组杆状病毒，然后使该重组 病毒感染前述的Sf9、Sf21或High Five等的昆虫细胞，从而产生蛋白质 (Bio/Technology，6，47，1988)。
作为基因的表达方法，除了只让FGF-8蛋白质在细胞内表达外， 也开发了分泌产生、融合蛋白质表达等，可以使用任意方法。例如可以 根据《分子克隆》第3版记载的方法进行。
将通过上述方式得到的转化体在培养基中培养，使在培养物中蓄积 产生FGF-8蛋白质，然后从培养物中提取FGF-8蛋白质，从而可以将 FGF-8蛋白质的全长或部分片段直接作为FGF-8蛋白质或作为融合 蛋白而制备。
在培养基中培养转化体的方法，可以根据在宿主培养中通常所用的 方法进行。
作为以大肠菌或酵母等的微生物为宿主对得到的转化体进行培养 的培养基，只要是含有微生物生长所需的碳源、氮源、无机盐类并且能 够有效进行转化体的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基 中的任一种(分子克隆第3版)。培养是在通常的振荡培养或深部通气 搅拌培养等的好氧条件下、15～40℃培养16～96小时。在培养期间将pH 保持在3.0～9.0。pH的调节可以使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳 酸钙、氨等进行。在培养中根据需要也可以在培养基中添加氨苄青霉素 或四环素等抗生素。
作为以动物细胞为宿主对得到的转化体进行培养的培养基，可以使 用通常所用的RPMI 1640培养基、Eagle的MEM培养基或者在这些培养 基中添加胎牛血清(以下简称为FBS)等的培养基等。通常在5％CO2存在下、35～37℃，培养3～7天，在培养中根据需要也可以在培养基中 添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为以昆虫细胞为宿主对得到的转化体进行培养的培养基，可以使 用通常所用的TNM-FH培养基(フア一ミンジエン公司生产)、 SF900IISFM(インビトロジエン公司生产)、EX-CELL400、EX- CELL405[都是JRH Biosciences公司生产]等。培养可以在25～30℃培养 1～4天，在培养过程中也可以根据需要在培养基中添加庆大霉素等抗生 素。
在上述的动物细胞以及昆虫细胞的培养中，可能的话，由于很容易 直接将FGF-8的全长或部分片段作为FGF-8蛋白，或进行融合蛋白的 纯化，因此优选使用不添加血清的培养基。
在使FGF-8的全长或者部分片段直接或作为融合蛋白在宿主细胞 内蓄积时，培养结束后，对细胞进行离心，悬浮于水系缓冲液中后，通 过超声波法、法式冲压法等对细胞进行破碎，从该离心上清液中回收该 蛋白质。
另外，在细胞内形成不溶体时，通过蛋白质变性剂使不溶体可溶化 后，在不含有蛋白质变性剂的溶液或蛋白质变性剂的浓度稀释成蛋白质 不变性的程度的溶液中，进行稀释或透析，可以形成蛋白质的立体结构。
在FGF-8蛋白质的全长或部分片段、或者这些蛋白质的融合蛋白 是在细胞外分泌时，可以从培养上清液中回收表达蛋白。
对于分离纯化，可以单独或组合使用溶剂萃取、基于有机溶剂的分 级沉淀、盐析、透析、离心、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏 水性色谱、亲水性色谱、逆相色谱、结晶、电泳等的分离操作来进行。
具有FGF-8的氨基酸序列的部分序列的肽，可以通过Fmoc(芴基 甲基氧基羰基)法、tBoc(叔丁基氧基羰基)法等的化学合成法制备。 另外，也可以使用Advanced ChemTech公司、Applied Biosystems公司、 Protein Technologies公司、岛津制作所等的肽合成机制备。
(2)动物的免疫与抗体产生细胞的制备
以上述得到的该蛋白质作为抗原对动物进行免疫。作为免疫的方 法，可以直接在动物的皮下、静脉或腹腔内给予抗原，但是优选使抗原 性高的载体蛋白质与抗原结合而给予，或者将抗原与适当的佐剂一起给 予。
作为载体蛋白质，可以举出匙孔X血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲状球蛋白等，作为佐剂可以举出弗 罗因德完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)、氢氧化铝凝胶与百 日咳菌疫苗等。
作为免疫动物，可以举出兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠等的非人哺 乳动物。
抗原的给予，在第一次给予后，每1～2周给予3～10次。抗原的给 予量优选每只动物50～100μg。在各给予后，在第3～7日从免疫动物的 眼底静脉丛或尾静脉采血，对于与该血清的抗原的特异性结合性，可以 通过以下所示的酶免疫测定法[酶免疫测定法第3版医学书院1987年 antibodies a laboratory manual(Chapter 14)、Goding J.W.，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1996(以下简称 为单克隆抗体)]等确认。
酶免疫测定法可以通过以下方式进行。
将抗原蛋白或表达抗原蛋白的细胞等涂层在板上，将从免疫动物採 集的血清作为第一抗体使其反应。在第一抗体反应后，对板进行清洗添 加第二抗体。反应后，进行对应于标记第二抗体的物质的检测反应，测 定抗体效价。
所谓第二抗体，是指用过氧化物酶等酶或生物素等对可以识别第一 抗体的抗体进行标记的物质。具体的说，若免疫动物使用小鼠，则作为 第二抗体使用能够识别小鼠免疫球蛋白的抗体。
另外，将该血清显示充分抗体效价的非人哺乳动物作为抗体产生细 胞的供给源。
在抗原最终给予后3～7日，根据众所周知的方法(antibodies a laboratory manual)从免疫动物摘出抗体产生细胞，使抗体产生细胞与 骨髓瘤细胞融合。
多克隆抗体可以通过对该血清进行分离纯化而制备。该多克隆抗体 是否具有抑制FGF-8活性的中和活性，可以通过以下1.(4)中所述的 细胞增殖抑制分析法进行检测。
单克隆抗体可以通过使该抗体产生细胞与源于非人哺乳动物的骨 髓瘤细胞融合制作杂交瘤，对该杂交瘤进行培养或给予动物后使该细胞 腹水癌化，对该培养液或腹水进行分离或纯化而制备。
抗体产生细胞是从给予抗原后的非人哺乳动物脾细胞、淋巴结、末 梢血液等中採集的细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞可以使用从小鼠中获得的株化细胞即8-氮杂鸟嘌 呤耐性小鼠(BALB/c由来)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(Kohler G and Milstein C，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976)、SP2/0-Ag14 (Shulman M.et al.，Nature，276 269-270，1998)、P3-X63-Ag8653 (Kearney J.F.et al.，J.Immunol.，123 1548-1550，1979)、P3-X63- Ag8(Koler G and Milstein C，Nature，256 495-479，1975)等，只要是 在体外(in vitro)能够增殖的骨髓瘤细胞，可以是任意的骨髓瘤细胞。 对于这些细胞株的培养以及传代可以根据众所周知的方法(antibodies a laboratory manual)，在细胞融合前确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合与单克隆抗体的选择
对上述得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行清洗后，加入聚乙二 醇1000(PEG-1000)等细胞凝集性溶剂，使细胞融合，悬浮于培养基 中。在细胞的清洗中可以使用MEM培养基或PBS(1.83g/L Na2HPO4、 0.21g/LK2HPO4、7.65g/L NaCl，pH7.2)等。另外，作为使融合细胞悬 浮的培养基，使用HAT培养基[在正常培养基(添加1.5mmol/L白蛋白、 50μmol/L 2-巯基乙醇、10mg/mL庆大霉素以及10％FBS的RPMI 1640 培养基)中加入100μmol/L贺克沙霉素、15μmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷以 及0.4μmol/L氨基蝶呤的培养基]，以便可以选择性地只获得目的融合蛋 白。
在培养后，取部分上清液，通过下述的酶免疫测定法，选择与抗原 蛋白质反应而与非抗原蛋白质不反应的样品。然后，通过限界稀释法进 行克隆，通过酶免疫测定法选择稳定并且抗体效价高的杂交瘤株作为与 FGF-8特异性结合的单克隆抗体产生杂交瘤株。
酶免疫测定法通过与1.(2)中所述方法相同的方法进行，作为第一 抗体使用杂交瘤培养上清液或通过后述方法得到的纯化抗体。
单克隆抗体与FGF-8的特异性结合也可以根据表面胞质团共鸣 (Karlsson R et al.，J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)来评价。
作为抗FGF-8单克隆抗体的具体例子，可以举出特开平9-271391 中记载的属于小鼠IgG1亚类的杂交瘤KM1334(FREM BP-5451)产生 的单克隆抗体KM1334。
通过在靶细胞中使用小鼠乳癌细胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J Steriod Biochem.，27，495-464，1987)、小鼠纤维牙细胞株NIH/3TS (ATCC编号：CRL-1658)、或者人前列腺癌细胞株LNCap(ATCC 编号：CRL-1740)的增殖抑制分析法来检测由上述选择的杂交瘤产生 的抗FGF-8单克隆抗体是否抑制FGF-8活性。作为方法，在利用含有 FGF-8(1～100ng/mL或睾丸素的培养基培养靶细胞时，以培养上清液 或根据下述2.(5)纯化的抗FGF-8单克隆抗体的最终浓度变为0.001～ 100μg/mL的方式进行阶段稀释并添加在培养基中。在培养24～72小时 后，利用MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四 唑 溴化物]溶液、セルカウンテイク试剂盒或WST-1试剂盒等测定活 细胞数。与不添加抗FGF-8单克隆抗体的情况相比，在活细胞数减少 与抗FGF-8单克隆抗体有浓度依赖性时，可以确认该抗FGF-8单克隆 抗体是抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和抗体。
另外，也可以利用以Bolton-Hunter法(Bolton A.E.and Hunter W. M.，Biochem.J.，133，529-539，1973)等125I标记的FGF-8与上述细胞株 结合系统，测定抗FGF-8单克隆抗体向FGF-8细胞表面上的受体结合 抑制活性。
上述单克隆抗体KM1334是具有抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和 抗体，优选作为关节炎的预防药或治疗药。
(5)单克隆抗体的制备
单克隆抗体可以通过以下方式进行制备，即，在腹腔内给予培养杂 交瘤细胞所得的培养液或降植烷(Pristane，2，6，10，14-四甲基十五烷) 0.5mL，饲育2周，在如此所得的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔给予产生 单克隆抗体的杂交瘤细胞使其腹水癌化，然后从腹水中分离纯化，从而 制备单克隆抗体。
作为分离、纯化单克隆抗体的方法，可以举出离心、基于40～50％ 饱和硫酸铵的盐析、辛酸沉淀法、利用DEAE-葡聚糖柱、阴离子交换 柱、蛋白质A或G-柱或凝胶过滤柱等的色谱层析法等，这些方法可以 单独使用也可以组合使用。根据该方法可以回收IgG或IgM级分而获得 纯化单克隆抗体。
纯化的单克隆抗体的亚类的确定，可以利用单克隆抗体的类型试剂 盒进行确定。蛋白质量可以通过劳里(Lowry)法或通过280nm的吸光 度计算出。
所谓抗体的亚类是指在一类内的不同类型，对于小鼠可以举出 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，对于人可以举出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。 特别是小鼠IgG3、IgG2a、人IgG1类型具有补体依存性细胞损伤活性以 及抗体依存性细胞损伤活性，在治疗应用上是有效的。
2.抗FGF-8中和人源化抗体的制作方法
(1)人源化抗体表达用载体的构建
为了从人以外的动物的抗体制作人源化抗体，要构建必要的人源化 抗体表达用载体。所谓人源化抗体表达用载体是指导入编码人抗体的C 区，即CH以及CL的基因的动物细胞用表达载体，可以通过在动物细胞 用表达载体上分别插入编码人抗体的CH以及CL的基因来构建。
人抗体的C区可以是任意的人抗体的CH以及CL，例如可以举出人 抗体的γ1亚类的CH、γ4亚类的CH以及κ类的CL等。作为编码人抗体的 CH以及CL的DNA，可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA，另 外也可以使用cDNA。作为动物细胞用表达载体，只要是能够导入编码 人抗体C区的基因并且表达的载体，可以使用任意载体。
例如可以举出pAGE107(特开平3-22979；Miyaji H.et al.， Cytotechnology，3，133-140，1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.， J.Biochem.，101，1307-1310，1987)、pHSG274(Brady G.et al.，Gene，27， 223-232，1984)、pKCR(O’Hare K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 78，1527-1531，1981)、pSG1βd2-4(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，4， 173-180，1990)等。作为动物细胞用表达载体中所用的启动子和增强子， 可以举出SV40的初期启动子和增强子(Mizukami T.and Itoh S.，J. Biochem.，101，1307-1310，1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子 和增强子(Kuwana Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，149， 960-968，1987)、以及免疫球蛋白H链的启动子(Mason J.O.et al.，Cell， 41，479-487，1985)和增强子(Gillies S.D.et al.，Cell，33，717-728，1983) 等。
人源化抗体表达用载体可以使用抗体H链、L链存在各个载体上的 类型或存在同一载体上的类型(串连型)中任一类型，但是从人源化抗 体表达载体的构建的容易程度、向动物细胞导入的容易程度、在动物细 胞内的抗体H链和L链的表达量的平衡的观点来看，串连型的人源化抗 体表达用载体是优选的(Shitara K.et al.，J Immunol.Methods，167， 271-278，1994)。作为串连型的人源化抗体表达用载体可以举出 pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Bentley K.J.et al.，Hybridoma， 17，559-567，1998)等。
构建的人源化抗体表达用载体可以在人型嵌合抗体以及人型CDR 移植抗体在动物细胞内表达中使用。
(2)编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA 的获得
编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体、例如小鼠抗FGF-8中和 单克隆抗体的VH以及VL的DNA可以通过以下方式获得。
从产生小鼠抗FGF-8中和单克隆抗体的细胞、例如产生小鼠FGF -8中和抗体的杂交瘤等提取mRNA，合成cDNA。将合成的cDNA插入 噬菌体或质粒等的载体中，制作cDNA文库。作为探针使用小鼠抗体的 C区部分或V区部分，分别从该文库中分离具有编码VH的cDNA的重组 噬菌体或重组质粒以及具有编码VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。
对重组噬菌体或重组质粒上的VH以及VL的全部碱基序列进行确 定，从而由碱基序列推定VH以及VL的全部氨基酸序列。
作为人以外的动物，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔等，只要能够 制作杂交瘤可以使用任意动物。作为从杂交瘤中制备全RNA的方法，可 以举出硫氰酸胍-三氟乙酸硒法(Okayama H.et al.，Methods Enzymol.， 154，3-28，1987)，另外作为从全RNA制备mRNA的方法，可以举出低 聚(dT)固定化纤维素柱法(《分子克隆》，第3版)等。另外，作为 从杂交瘤制备mRNA的试剂盒，可以举出FastTrack mRNA分离试剂盒 (インビトロジエン公司生产)、QuickPrep mRNA分离试剂盒 (Amersha Biosciences公司生产)等。
作为cDNA的合成以及cDNA文库的制作法可以举出通常的方法 (《分子克隆》，第3版；Current Protocols in Molecular Biology)、 或者使用市售的试剂盒例如cDNA合成用SuperScript Choice System (SuperScript Choice System for cDNA Synthesis，インビトロジエン公 司生产)或ZAP-cDNA合成试剂盒(ストラタジ-ン公司生产)、 TimeSaver cDNA合成试剂盒(Amersha Biosciences公司生产)的方法 等。
在cDNA文库的制作时导入将从杂交瘤提取的mRNA作为铸模合成 的cDNA的载体，只要是导入该cDNA的载体，可以使用任意载体。例如 可以使用ZAP Express(ストラタジ-ン公司生产)、pBlurescript IISK (±)(ストラタジ-ン公司生产)、λZAPII(ストラタジ-ン公司生产)、 λgt10(ストラタジ-ン公司生产)、λgt11(ストラタジ-ン公司生产)、 Lambda BlueMid(Clontech公司生产)、λExcell(Amersha Biosciences 公司生产)、pcD2(Okayama H.and Berg P.，Mol.Cell.Biol.，3，280-289， 1983)以及pUC18(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985) 等的噬菌体或质粒载体。
作为导入通过噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠菌，只要 是导入该cDNA文库并且能够表达以及维持的大肠菌，可以任意使用。 例如可以使用XL1-Blue MRF’(ストラタジ-ン公司生产)、C600 (Appleyard R.K.Genetics，39，440-452，1954)、Y1088(Yong R.A.and Davis R.，Science，222，778-782，1983)、Y1090(Yong R.A.and Davis R.，Science，222，778-782，1983)、NM522(Gough J.A.and Murray N.E.，J.Mol.Bio.，166，1-19，1983)、K802(Wood W.B.，J.Mol.Biol.，16， 118-133，1966)和JM(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985) 等。
作为编码来自cDNA文库的人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的 VH以及VL的cDNA克隆的选择法，可以使用从用同位素或荧光标记的 探针的菌落杂交法或噬斑杂交法(分子克隆第3版)选择的方法。而制 备引物，将由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，通过PCR也可 以制备编码VH以及VL的cDNA。
通过上述方法选择的cDNA的碱基序列可以用被克隆到适当载体的 该cDNA，进行双脱氧反应(Sanger F.et al.，Proc.Natl.Acad.USA 74，5463-5467，1977)，通过使用ABI377(Applied Biosystem公司生产) 等DNA测序仪进行解析决定。
(3)人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的氨基酸序 列解析和CDR的氨基酸序列鉴定
通过对从2.(2)获得的、决定的cDNA的碱基序列推定该cDNA编 码的VH和VL的全氨基酸序列，与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序 列(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services，1991，以下记为“Sequences of Proteins of Immunological Interest”)进行比较，可以确认获得的cDNA是否编码含 有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完全氨基酸序列。有关含有分泌信 号序列的抗体的VH和VL的完全氨基酸序列通过与已知的抗体的VH和 VL的全氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest) 进行比较，可以推定分泌的信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进一 步了解他们属于的亚类。
另外，利用BLAST(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.，215， 403-410，1990)等同源性检索程序对任意的数据库，例如SWISS-PROT 和PIR-Protein等进行获得的VH和VL的完全氨基酸序列的同源性检索， 可以研究序列是否是新序列。
形成抗体的抗原结合部位的VH和VL是由序列相对保守的4个FR和 连接他们的序列富于变化的3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)构成的 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)。而VH和VL的各 个CDR的氨基酸序列可以通过与已知的抗体的V区的氨基酸序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)比较进行鉴定。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体的构建
在编码2.(1)中构建的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和CL 的基因的上游插入编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及 VL的DNA，可以构建抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体。例如，以含有 编码人以外的动物的抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA的质粒作 为模板，通过使用由适当的限制性内切酶的识别序列和编码V区的碱基 序列构成的5’末端一侧和3’末端一侧的引物的PCR法对抗体的VH和VL 进行扩增，将各个扩增产物克隆到pBluescriptIISK(-)(ストラタジ-ン 公司生产)等质粒中，利用2.(2)所述的方法决定碱基序列，获得具有 编码抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的氨基酸序列的DNA序列的质 粒。从得到的质粒分离编码抗FGF-8中和抗体的VH以及VL的DNA， 使他们可以以适当方式表达那样克隆到编码2.(1)所述的人源化抗体表 达用载体的人抗体的CH和CL的基因的上游，可以构建抗FGF-8中和 嵌合抗体表达载体。
(5)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的V区的DNA的构建
编码抗FGF-8中和移植抗体的VH和VL的DNA可以象以下那样构 建。首先，选择移植人以外动物的抗FGF-8中和抗体的VH和VL的CDR 的氨基酸序列的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列。作为人抗体的 VH和VL的FR的氨基酸序列只要是来自人抗体的序列，可以用任意序 列。例如登录在Protein Data Bank等的数据库的人抗体的VH和VL的FR 的氨基酸序列、人抗体的VH和VL的FR的各个亚类的共通氨基酸序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)等，为了制作具有 充分活性的人型CDR移植抗体，希望选择与人以外动物的抗FGF-8中 和抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列尽可能高的同源性、最好是具有60 ％以上同源性的氨基酸序列。
接下来，将作为目的的人以外动物的抗FGF-8中和抗体的VH和 VL的CDR的氨基酸序列移植到选择的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸 序列，设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列。考 虑抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率(Sequences of Proteins of Immunological Interest)将设计的氨基酸序列转换为碱基序 列，设计编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列的 碱基序列。根据设计的碱基序列，合成由100～150碱基长构成的数条合 成DNA，用他们实施PCR法。此时，优选根据PCR的反应效率和可合成 的DNA长度设计VH、VL 4条合成的DNA。另外通过在位于两端的合成 DNA的5’末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，可以很容易地克隆 到2.(1)构建的人源化抗体表达用载体。PCR反应后，将扩增产物克 隆到pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生产)等质粒中，利用2. (2)所述的方法决定碱基序列，获得具有编码所期望的抗FGF-8中和 CDR抗体的VH以及VL的氨基酸序列的碱基序列的质粒。
(6)抗FGF-8中和CDR抗体的VH以及VL的氨基酸序列的改变
人型CDR移植抗体只是将作为目的的人以外动物的抗体的VH和 VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR，其抗原结合活性与原来的人 以外动物的抗体活性相比降低了(Tempest P.R.et al.，Bio/technology，9，266-271，1991)。其原因可能是在原来的人以外的动 物的抗体的VH和VL中，不仅CDR，而且FR的几个氨基酸残基也直接 或间接地与抗原结合活性有关，这些氨基酸残基伴随着CDR的移植，变 化为与人抗体的VH和VL的FR不同的氨基酸残基。为了解决这一问题， 在人型CDR移植抗体的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中，对与 直接参与与抗原结合的氨基酸残基或与CDR的氨基酸残基相互作用，维 持抗体的空间结构，间接参与与抗原结合的氨基酸残基进行鉴定，将他 们改变为原来人以外的动物抗体中出现的氨基酸残基，可以使低下的抗 原结合活性上升(Tempest P.R.et al.，Bio/technology，9，266-271，1991)。 在人型CDR移植抗体的制作中，如何有效地对那些与抗原结合活性有关 的FR的氨基酸残基进行鉴定是最重要的方面，因此通过X射线晶体解析 (Bernstein F.C.et al.，J.Mol.Biol.，112，535-542，1977)或计算机模拟 (Tempest P.R.et al.，Protein Engineering，7，1501-1507，1994)等可以进 行抗体的空间结构的构建和解析。这些抗体空间结构的信息为人型CDR 移植抗体的制作带来了许多有益的信息，但可适应所有抗体的人型CDR 移植抗体的制作法还未确立，目前，就各种各样的抗体制作数种改变体， 研究与各个抗原结合活性的关系等种种试行错误是必要的。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基的改变可以用改变用合成 DNA作引物进行PCR达到。有关PCR后的扩增产物通过2.(2)所述的方法 决定其碱基序列，确认实施目的改变后可以获得含有导入目的变异的 DNA的载体(以下称之为氨基酸序列改变载体)。
只要是在窄的区域的氨基酸序列的改变，可以通过使用由20～35碱 基构成的变异导入引物的PCR变异导入法进行。具体来说，合成由含有 编码改变后的氨基酸残基的DNA序列的20～35碱基构成的有意义变异 引物和反义变异引物，以含有编码应当改变的VH和VL的氨基酸序列的 DNA的质粒为模板，进行2阶段的PCR。将最终扩增片段亚克隆到适当 的载体后，决定其碱基序列，获得含有导入目的变异的DNA的氨基酸序 列改变载体。
(7)抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
在编码2.(1)中记载的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和CL 的DNA的上游插入编码2.(5)和(6)中构建的编码抗FGF-8中和CDR 移植抗体的VH以及VL的DNA，可以构建抗FGF-8中和CDR移植抗体 表达载体。例如，在2.(5)和(6)中构建编码抗FGF-8中和CDR移 植抗体的VH以及VL时使用的合成DNA中，在位于两端的合成DNA的5， 末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，使他们可以以适当方式表达 那样克隆到编码2.(1)所述的人源化抗体表达用载体的人抗体的CH和 CL的DNA的上游。
(8)人源化抗体的一过性表达和活性评价
为了有效地对制作的多种人源化抗体的抗原结合活性进行评价，可 以使用2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体，2.(7)所述的 抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体，或对他们进行改变后的表达载 体，进行人源化抗体的一过性表达。作为导入表达载体的宿主细胞，只 要是可以表达人源化抗体的宿主细胞，可以使用任意细胞，从其表达量 高出发，一般使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL-1651)(Warr G.W.et al.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)。作为表 达载体向COS-7细胞的导入法，如DEAE-葡聚糖法(Warr G.W.et al.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)、脂(质) 转染法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987) 等。
表达载体导入后，培养上清中的人源化抗体的表达量以及抗原结合 活性可以通过作为第一抗体使用培养上清、作为第二抗体可以使用标记 的抗人免疫球蛋白抗体的1.(2)所述的酶免疫测定法等测定。另外，通 过1.(4)所述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中 和活性。
(9)人源化抗体稳定表达以及活性评价
通过将2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体，2.(7)所 述的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体导入适当的宿主细胞，可以 获得稳定生产人源化抗体的转化体。
作为表达载体向宿主细胞的导入法，如电穿孔法(特开平2- 257891；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)等。
作为导入抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体和抗FGF-8中和CDR 移植抗体表达载体的宿主细胞，只要是可以使人源化抗体表达的宿主细 胞，可以使用任意的细胞。例如，小鼠SP2/0--Ag14细胞(ATCC编号： CRL-1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC编号：CRL-1580)、 二氢叶酸还原酶(以下略为DHFR)基因缺损的CHO细胞的CHO/DG44 细胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，4216-4220，1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号： CRL-1662、以下称之为YB/0细胞)等。
表达载体导入后，稳定生产人源化抗体的转化体可以通过在含有 G418(G418 Sulfate；Sigma Aldrich公司生产)等药物的动物细胞培养 用培养基中培养进行选择(Shitara K.et al.，J.Immunol. Methods，167，271-278，1994)。作为动物细胞培养用培养基可以使用 RPMI 1640培养基(日水制药公司生产)、GIT培养基(日本制药公司 生产)、EX-CELL302培养基(JRH Bio Sciences公司生产)、IMDM 培养基(インビトロジエン公司生产)、杂交瘤SFM培养基(インビト ロジエン公司生产)、或向这些培养基中添加了FBS等各种添加物的培 养基等。通过在培养基中对得到的转化体进行培养，可以使人源化抗体 表达蓄积在培养上清中。培养上清中的人源化抗体的表达量以及抗原结 合活性可以通过上述1.(4)所述的ELISA等测定。另外转化体利用DHFR 基因扩增体系等可以使人源化抗体的产量上升(Shitara K.et al.，J. Immunol.Methods，167.271-278，1994)。
人源化抗体可以用蛋白A柱从转化体的培养上清进行纯化 (Antibodies A Laboratory Manual，chapter 8；monoclone antibodies)。 另外，也可以使用通常蛋白质中使用的纯化方法。例如，将凝胶过滤、 离子交换色谱以及超滤等组合进行纯化。纯化的人源化抗体的H链、L 链或抗体分子整体的分子量可以通过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE； Laemmli U.K.，Nature，227，680-685，1970)或Western Blotting法 (Antibodies A Laboratory Manual)等测定。
纯化的人源化抗体的抗原结合活性可以通过作为第一抗体使用纯 化的人源化抗体、作为第二抗体可以使用标记的抗人免疫球蛋白抗体的 上述1.(2)所述的酶免疫测定法、表面胞质团共振(Karlsson R et al.，J. Immunol.Methods，145，229-240，1991)等测定。另外，通过1.(4)所 述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中和活性。
3.抗体片段的制作
抗体片段可以通过1.和2.所述的抗FGF-8中和单克隆抗体、抗FGF -8中和人源化抗体为基础的基因工程手法或蛋白质化学手法进行制 作。作为抗体片段如Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFv、含有 CDR的肽等。
(1)Fab的制作
Fab可以通过用蛋白水解酶番木瓜蛋白酶对抗FGF-8中和抗体进 行处理制作。番木瓜蛋白酶处理后，只要原来抗体是具有蛋白A结合性 的IgG亚类，通过蛋白A柱，分离为IgG分子和Fc片段，可以回收均一的 Fab(monoclonal antibodies)。不带有蛋白A结合性的IgG亚类的抗体 情形，通过离子交换层析，Fab可以回收在以低盐浓度洗脱的级分中 (monoclonal antibodies)。而Fab也可以用大肠杆菌通过基因工程手法 进行制作。例如将编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA克 隆到Fab表达用载体，可以制作Fab表达载体。作为Fab表达用载体只要 是Fab用的可以整合表达DNA的载体，可以使用任意载体。例如pIT106 (Better M.et al.，Science，240，1041-1043，1988)等。将Fab表达载体导入 适当的大肠杆菌，可以使Fab生成蓄积在包涵体或外周胞质层。由包涵 体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变成具有活性的Fab，而表达在胞 质时，具有活性的Fab漏出到培养上清中。再折叠后或从培养上清中可 以通过使用使抗原结合的柱子对均一的Fab进行纯化(BorrebeckK.， Antibody Engineering：A Practical Guide，Oxford Univesrsity Press，1991)。
(2)F(ab’)2的制作
F(ab’)2可以通过用蛋白水解酶胃蛋白酶对抗FGF-8中和抗体进行 处理制作。胃蛋白酶处理后，通过与Fab同样的纯化操作，可以回收均 一的F(ab’)2(monoclonal antibodies)。另外，也可以通过用N，N’-o-亚 苯基二马来酰亚胺或二马来酰亚胺己烷等那样的马来酰亚胺对3.(3)所 述的Fab’进行处理，使硫醚键生成的方法，以及用二硫代二(2-硝基 苯甲酸)进行处理，使二硫键生成的方法也可以制作(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(3)Fab’的制作
Fab’可以通过用二硫苏糖醇等还原剂对3.(2)所述的F(ab’)2进行处 理得到。而Fab’也可以用大肠杆菌通过基因工程手法进行制作。例如将 编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA克隆到Fab’表达用载 体，可以制作Fab’表达载体。作为Fab’表达用载体只要是可以整合表达 编码2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的V区的DNA的载体，可以使用任 意载体。例如pAK19(Carter P.et al.，Bio/Technology，10，163-167， 1992)等。将Fab’表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使Fab’生成蓄积 在包涵体或外周胞质层。由包涵体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变 成具有活性的Fab’，而表达在胞质层时，通过溶菌酶进行部分消化、渗 透压冲击、超声等处理破碎细菌，可以从菌体外回收。再折叠后或从菌 的破碎液中通过使用蛋白G柱等，可以纯化均一的Fab’(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(4)svFv的制作
svFv可以通过基因工程手法用噬菌体或大肠杆菌制作。例如，通过 编码由12个残基以上的氨基酸序列构成的多肽接头的DNA连接编码 2.(2)、(5)和(6)所述的抗体的VH以及VL的DNA，制作编码scFv的 DNA。多肽接头的付加要不妨碍VH、VL与抗原的结合那样最适化是重 要的，例如，可以使用Pantoliano等人报道的(Pantoliano M.W.et al.，Biochemistry，30，10117-10125，1991)或对他进行改变的多肽接头。
将制作的DNA克隆到scFv表达用载体，可以制作scFv表达载体。作 为scFv表达用载体只要是可以整合表达scFv的DNA的，可以使用任意的 载体。如，pCANTAB5E(Amersham Biosciences公司生产)、Phfa(Lah M.et al.，Hum.Antibodies Hybridomas，5，48-56，1994)等。通过将scFv表 达载体导入适当的大肠杆菌，使辅助噬菌体感染，可以得到在噬菌体表 面scFv以与噬菌体表面蛋白质融合的形式表达的噬菌体。另外，将scFv 表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使scFv生成蓄积在包涵体或外周胞 质层。由包涵体可以通过通常蛋白质用的再折叠法变成具有活性的 scFv，而表达在胞质层时，通过溶菌酶进行部分消化、渗透压冲击、超 声等处理破碎细菌，可以从菌体外回收。再折叠后或从菌的破碎液中通 过使用阳离子交换柱等，可以纯化均一的scFv(McCafferty J.et al.，Antibody Engineering：A Practical Approach，IRL Press，1996)。
(5)diabody的制作
通过将制作上述的scFv时的多肽接头做成3～10个残基左右可以制 作diabody。使用一种抗体的VH和VL时，可以制作2价抗体，使用两种 抗体的VH和VL时，可以制作具有2种特异性的diabody(Le Gall F.et al.，FEBS Lett.，453，164-168，1999，Courage C.et al.，Int.J.Cancer， 77.763-768，1998)。
(6)dsFv的制作
dsFv可以通过基因工程手法用大肠杆菌制作。首先，在编码2.(2)、 (5)和(6)所述的抗体的VH以及VL的DNA的适当位置导入变异，制 作编码的氨基酸残基被置换为半胱氨酸的DNA。氨基酸残基向半胱氨酸 残基的改变可以通过使用2.(6)的PCR法的变异导入法进行。将制作 的各个DNA克隆到dsFv表达用载体，可以制作VH和VL的表达载体。作 为dsFv表达用载体只要是可以整合表达dsFv用的DNA的载体，可以使用 任意载体。例如pUL19(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994) 等。将VH和VL的表达载体导入适当的大肠杆菌，可以使VH和VL生成 蓄积在包涵体或外周胞质层。由包涵体或外周胞质层得到VH和VL，进 行混合，通过通常蛋白质用的再折叠法使二硫键形成，可以制作具有活 性的dsFv。在重折叠后，可以通过离子交换层析和凝胶过滤等进一步进 行纯化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(7)含有CDR的肽的制作
含有CDR的肽可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法制作。另外 制作编码含有CDR的肽的DNA，将制作的DNA克隆到适当的表达载体， 可以制作CDR肽表达载体。作为表达用载体只要是可以整合表达编码含 有CDR的肽的DNA的载体，可以使用任意载体。例如pLEX(インビト ロジエン公司生产)、pAX4a+[MoBiTec公司生产]等。将表达载体导入 适当的大肠杆菌，可以使含有CDR的肽生成蓄积在包涵体或外周胞质 层。由包涵体或外周胞质层可以得到含有CDR的肽，通过离子交换色谱 和凝胶过滤等进行纯化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(8)活性评价
上述抗体片段的抗原结合活性可以使用抗体片段作为第一抗体，通 过上述1.(2)所述的酶免疫测定法、表面胞质团共振(Karlsson R et al.， J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)等进行测定。另外，通过1. (4)所述的细胞增殖抑制分析确认是否保持抑制FGF-8活性的中和活 性。
4.本发明的预防药和治疗药
抗FGF-8中和抗体由于可以与滑膜和软骨的细胞以及组织上的 FGF-8结合，抑制由于FGF-8诱导的软骨细胞外基质的分解，抑制软 骨的破坏，所以成为软骨的保护剂。另外由于该抗体具有抑制由FGF- 8诱导的滑膜细胞的增殖的能力，所以成为滑膜细胞的增殖抑制剂。由 于关节的破坏伴随着软骨的破坏和滑膜细胞的增殖，所以该抗体通过抑 制滑膜细胞的增殖和软骨的破坏而成为关节破坏的抑制剂。关节炎是伴 随着关节的破坏的疾病，该抗体由于抑制关节的破坏而成为关节炎的治 疗药和预防药。关节炎包括变形性关节病和关节风湿病、全身性红斑狼 疮、强直性关节炎、干癣性关节炎、椎间盘疾病、急性结晶性滑膜炎(包 括痛风、假痛风)等。
人源化抗体与人以外的动物的单克隆抗体比较，由于几乎是来自人 抗体的氨基酸序列的一部分，所以在人体内表现出很高的效果，而且免 疫原性低，预期其效果持续时间长，所以作为预防药和治疗药很理想。
含有抗FGF-8中和抗体的药，作为治疗药虽然可单独给药，但通 常都是与药理学上容许的一种或一种以上的载体一起混合，作为通过制 剂学技术领域中常见的任意方法制造的药剂提供最好。
给药途径希望使用治疗时效果最好的途径，如可以口服给药、或经 口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内、关节内、以及静脉内等非口 服给药，抗体或肽制剂时，最好是经关节内和静脉内给药。
给药方式，如喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆制剂、乳剂、 栓剂、注射剂、软膏、贴剂等。
作为适用于口服的制剂，如乳剂、糖浆、胶囊、片剂、散剂、颗粒 剂等。
象乳剂和糖浆那样的液体制品可以使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖 等糖类，聚乙二醇、丙二醇等醇类，芝麻油、橄榄油、大豆油等油类， p-羟基苯甲酸酯等防腐剂，草莓香料、薄荷香料等香料类等作为添加剂 制造。
胶囊、片剂、散剂、颗粒剂等可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖醇等赋形剂，淀粉、藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石等滑润剂，聚 乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂， 甘油等可塑剂等作为添加剂制造。
作为适用于非口服的制剂，如注射剂、栓剂、喷雾剂等。
注射剂可以用盐溶液、葡萄糖溶液、或由两者混合物组成的载体等 制备。
栓剂可以用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体制备。
而喷雾剂可以用抗体或肽本身、或者不刺激患者口腔和气管粘膜， 而且使该抗体或肽以微细的粒子分散，使其容易吸收的载体等制备。
作为载体，具体来说，如乳糖、甘油等。根据该抗体或肽以及使用 的载体的性质，可以做成烟雾剂、干燥粉末等制剂。另外，在这些非口 服制剂中，也可以添加口服制剂中作为添加剂列举的成分。
给药量或给药次数因目的治疗效果、给药方法、治疗期间、年龄、 体重等而有所不同，通常成人为每天10μg/kg～20mg/kg。
抗FGF-8中和抗体抑制软骨细胞外基质的分解以及抑制滑膜细胞 的增殖可以使用以下(1)和(2)所示的体外的分析体系确认。而作为 关节炎的治疗药和预防药也可以将该抗体用于以下(3)所示的关节炎 病理模型鼠，通过看是否可以减轻他的关节炎症状进行评价。
(1)FGF-8对软骨破坏的抑制活性
软骨的破坏通过将使用软骨细胞或软骨器官的软骨的细胞外基质 的分解、从软骨细胞或滑膜细胞产生的破坏因子的增加作为指标的分 析，以及由于软骨破坏的进展引起的软骨下骨的破坏可以分别通过以骨 吸收量作为指标的分析进行评价。
(a)软骨细胞外基质的分解
在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗体的情况下对初 代培养的兔关节软骨细胞进行培养，通过测定培养后残留在培养板上的 细胞外基质的量对软骨破坏作用进行评价。细胞外基质量是以经番木瓜 蛋白酶处理能够游离出来的葡萄糖胺聚糖的量进行测定。由于FGF-8 诱导的细胞外基质的减少在由于抗FGF-8中和抗体的添加受到抑制 时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。
软骨破坏作用也可以按照Price等人的方法(Price J.S.et al.，Arthritis Rheum.，42，137-147，1999)在FGF-8存在下添加和不添加抗 FGF-8中和抗体的情况下对初代培养的牛鼻中隔软骨器官进行培养， 通过测定培养后软骨器官中的细胞外基质的量对软骨破坏作用进行评 价。由于FGF-8诱导的细胞外基质的减少在通过抗FGF-8中和抗体的 添加受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。细胞外基 质的量是以通过二甲基亚甲基法(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)对经番木瓜蛋白酶处理培养后的器 官，能够游离出来的葡萄糖胺聚糖的量进行测定，或根据东京卫生年报， 36，277，1985，以胶原的量作为羟脯氨酸浓度的测定来测定的。
(b)与软骨破坏有关的因子的产生
作为与软骨破坏有关的因子如前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、 一氧化氮。在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗体的情况下 对兔关节软骨细胞或兔滑膜细胞进行培养，以这些因子从该细胞的产生 量对培养上清的前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、一氧化氮进行测定。 FGF-8促进前列腺素E2、基质金属蛋白激酶3、一氧化氮的产生由于抗 FGF-8中和抗体的添加受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破 坏的作用。
前列腺素E2可以通过前列腺素E2 EIA系统(Amersham Biosciences 公司生产)、基质金属蛋白激酶3可以通过兔基质金属蛋白激酶3ELISA 系统(Amersham Biosciences公司生产)，一氧化氮可以通过使用Griess 试剂的方法(Green L.C.et al.，Anal.Biiochem.126，131-138 1982)进行测 定。
(c)骨吸收
骨吸收可以通过在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗 体的情况下对鼠头盖骨进行培养，测定培养上清中的钙浓度或羟脯氨酸 浓度来测定。由于FGF-8促进骨吸收在添加抗FGF-8中和抗体时受到 抑制时，可以认为该抗体具有抑制软骨破坏的作用。培养上清中的钙浓 度可以使用钙C-测试和光(和光纯药工业公司生产)进行测定。培养 上清中的羟脯氨酸浓度可以根据东京卫生年报，36，277，1985的报道 进行测定。
(2)滑膜细胞的增殖抑制作用
滑膜细胞的增殖可以在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中 和抗体的情况下对人或兔的滑膜细胞进行培养，通过测定[3H]胸腺嘧啶 整合量来评价。由于FGF-8促进的[3H]胸腺嘧啶整合量在添加抗FGF -8中和抗体时受到抑制时，可以认为该抗体具有抑制滑膜细胞增殖的 作用。
(3)用关节炎病理模型动物在体内的评价
用下述的关节炎病模型动物，可以评价FGF-8或抗FGF-8中和抗 体对关节破坏的效果。将抗FGF-8中和抗体用于关节炎病理模型动物， 当该模型动物的关节炎症状减轻时，认为可以用作关节炎的治疗药和预 防药。
作为表现出类似于关节风湿病的病理模型动物，主要有在足关节自 然发生关节炎的MRL-lpr小鼠(Hang L.et al.，J.Exp.Med.，155， 1690-1701，1982、可从日本チヤ-ルス·リバ-购买到)、对免疫结核死菌 后诱导的大鼠·佐剂关节炎模型(Pearson CM.et al.，Arth.Rheum.， 5，654-658，1962；Taurog J.D.et al.，Cell.Immunol.，75，271-282，1983； Bendele A.et al.，J.Rheumatol.，26，1225-1229，1999)，将关节中许多II型 胶原与佐剂一起免疫后发病的小鼠·胶原关节炎模型(Stuart J.M.et al.，Annu.Rev.Immunol.，2，199-218，1984；Kamada H.et al.，Jpn.J. Pharmacol.，70，169-175，1996)等。这些模型动物表现出类似于关节风湿 病的症状，可以广泛地用于关节炎治疗药的评价。
使用大鼠·佐剂关节炎模型时，分别就佐剂处理足(在急性炎症之后 又发生慢性炎症的二相性炎症反应)和佐剂非处理足(从致敏1周左右 引起慢性炎症)随时间对后肢足浮肿容积进行测定。另外进行左右后 肢的软X射线摄影，就骨破坏和关节的变形进行评价。另外通过测定尿 中的葡萄糖胺聚糖量可以对全身的软骨破坏进行评价，通过测定尿中的 脱氧吡啶啉量和羟脯氨酸量对全身的骨破坏进行评价。尿中的葡萄糖胺 聚糖量可以用二甲基亚甲基蓝法(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)，而尿中的脱氧吡啶啉量可以使 用オステオリンクス「DPD」(住友制药公司生产)，尿中的羟脯氨酸 量可以根据池田的方法(池田真悟等，东京卫研年报.36，277-282，1985) 进行测定。另外可以使用アスプロ-GP(大塚制药)对作为全身的炎 症反应指标的血清中的粘蛋白浓度进行测定，按照Tracey等人的方法 (Tracey W.R.，et al.，J.Pharmacol.Exp.ther.，272，1011-1015，1995)对血 清中的一氧化氮浓度进行测定。
使用小鼠·胶原关节炎模型时，对体重和关节炎记分的随时间变化、 血清中抗胶原抗体效价进行测定。另外解剖后，进行关节部的病理组织 学研究。关节炎记分通过0至4分、全肢最高16分的记分进行评价。记分 基准为0：正常；1：发现弱红斑，2：发现弱肿胀和红斑，3：发现强肿 胀和红斑，通过触知发现温感，4：发现随着手指变形引起的显著的肿 胀。
作为变形性关节病模型，更多地使用用狗、兔等大动物，通过膝半 月的切除和韧带的切离，使关节产生动摇，使慢性关节的变性发生的模 型(以下称之为实验变形性关节病模型)(伊腾隆太，用于新药开发的 动物模型利用集成，变形性关节病，R&D计划，1985年，Guingamp C.et al.，Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997；van der Kraan P.M.et al.，Am.J.Pathol.，135，1001-1014，1989)。另外，通过向大鼠膝关节内注 入一碘代乙酸，促进关节软骨的细胞外基质葡萄糖胺聚糖的游离，作为 引起关节破坏的大鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节病模型。
通过兔膝关节半月板部分切除形成实验变形性关节病模型可以通 过Colombo等人的方法(Colombo C.et al.，Arthritis Rheum.， 26，875-886，1983)和菊地等人的方法(菊地寿辛等人，关节外科，15， 92-98，1966)制作。
大鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节病模型基于Guingamp等人的方 法(Guingamp C.et al.Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997)，向大鼠的 膝关节内注入一碘代乙酸进行制作。
这些变形性关节病动物模型可以通过在一定期间后摘出膝关节膝 盖骨，用番木瓜蛋白酶进行处理，通过用二甲基亚甲基蓝法 (Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)测定葡萄糖 胺聚糖量，对关节破坏(细胞外基质的分解)进行评价。另外进行膝关 节的病理组织学的研究。
作为将抗FGF-8中和抗体用于模型动物时的剂型以及给药途径， 可以根据对象模型动物的性质和病情适当地选择。例如，可以直接地， 或者与其他药理学上容许的载体、赋形剂、稀释剂等一起对模型动物经 口或不经过口(腹腔内、静脉内、关节内、肌肉内、皮下给药等)给药。
抗FGF-8中和抗体的配合量以及给药量可以根据该制剂的给药方 法、给药方式、使用目的、模型动物的具体症状、模型动物的体重等分 别决定，没有特别限定，给药量每天大概为1μg/kg～100mg/kg，给药间 隔可以是1天1次，也可以1天分为2～4次，或4次以上的次数给药。另外 也可以通过点滴等连续给药。当给药到关节等局部时，每一处大约可给 药1pg至100mg。
5.本发明的诊断药
FGF-8诱导关节中的滑膜细胞的增殖、软骨细胞外基质的破坏。 上述的FGF-8抗体由于与FGF-8特异性结合，可以对FGF-8进行检 测和定量，所以可以用作关节炎的诊断药。作为可以诊断的关节炎，如 上述4.所述的疾病。FGF-8的检测和定量可以按照下述6.所述方法进 行。
作为本发明诊断药使用的抗FGF-8抗体，只要是与FGF-8特异性 结合的抗体都可以，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种，最 好使用单克隆抗体。
作为单克隆抗体，如通过杂交瘤生产的抗体、人源化抗体和这些抗 体的抗体片段。
本发明诊断药中使用的抗FGF-8抗体可以象上述的抗FGF-8中 和抗体的制造法那样制造，但不需要抑制FGF-8的活性。也可以将抗 FGF-8中和抗体作为本发明的诊断药所用的抗FGF-8抗体来使用。作为 本发明诊断药使用的抗FGF-8抗体的具体例子如杂交瘤KM1334 (FERM BP-5451)生产的单克隆抗体KM1334、转化体KM3034 (FERM BP-7836)生产的人型嵌合抗体KM3034、转化体KM3334生 产的人型嵌合抗体KM3334、转化体KM8037(FERM BP-8084)生产 的人型CDR移植抗体HV0LV6、转化体KM8034生产的人型CDR移植抗 体HV0LV6/CHO、转化体KM8036(FERM BP-8083)生产的人型CDR 移植抗体HV0LV3-1/CHO以及转化体KM8035(FERM BP-8082)生 产的人型CDR移植抗体HV0LV4-3/CHO。
含有抗FGF-8抗体的诊断药根据下述6.所述那样的判定方法也可 以含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于 进行抗原抗体反应的试剂，如缓冲剂、盐等。作为检测用试剂如识别抗 FGF-8抗体的标记二次抗体、在对应于标记的底物等通常的免疫学检 测法中使用的试剂。
6.本发明的关节炎的判定方法
作为用本发明的判定方法判定的关节炎如上述4.所述的疾病。在这 些疾病的患者的关节中，与健康人比较，认为具有诱导滑膜细胞的增殖、 软骨的细胞外基质的破坏的活性的FGF-8的量增加了。
作为本发明的关节炎的判定方法，例如使用通过活组织等检查从被 检查者採取的关节的滑膜和软骨的细胞或组织切片、以及由该细胞或组 织制备的细胞提取液、滑液等，象下述那样对细胞或组织中存在的FGF -8进行免疫学检测和/或定量的方法。
作为使用针对FGF-8的抗体对在关节中表达的FGF-8进行免疫 学检测和/或定量的方法，可以使用荧光抗体法、酶免疫测定法(ELISA)、 放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法、免疫细胞染色 法、免疫印迹法、免疫沉降法、三明治(Sandwich)ELISA法(富山朔 二和安东民卫，单克隆抗体实验手册，讲谈社科学，1987年、日本生化 学会、续生化学实验讲座5，免疫生化学研究法，东京化学同人，1986 年)等。
荧光抗体法可以使用文献(单克隆·抗体、富山朔二和安东民卫，单 克隆抗体实验手册，讲谈社科学，1987年)等所述方法进行。具体来说， 在分离的关节的细胞和组织等中使抗FGF-8抗体反应，再使用异硫氰 酸酯荧光素(FITC)或藻红素等荧光物质标记的抗免疫球蛋白抗体反 应后，用细胞流式细胞计进行测定荧光色素的方法。
酶免疫测定法(ELISA)是使抗FGF-8抗体与分离的关节的细胞 或组织、滑液等反应，再使实施了过氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶标记 的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通过酶反应发色的底物，进行反应， 用吸光光度计测定发色色素的方法。
放射性物质标记免疫抗体法(RIA)是使抗FGF-8抗体与分离的 关节的细胞或组织、滑液等反应，再使实施了放射性同位素标记的抗免 疫球蛋白抗体反应后，用闪烁计数器等测定放射能的方法。
免疫组织染色法、免疫细胞染色法是使抗FGF-8抗体与分离的关 节的细胞或组织等反应，再使实施了FITC等荧光物质、过氧化物酶、 碱性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应；酶标记的情形下，加 入通过酶反应发色的底物，进行反应后，用显微镜进行观察的方法，可 以使用文献(单克隆抗体，富山朔二和安东民卫，单克隆抗体实验手册， 讲谈社科学，1987年)等所述方法进行。
免疫印迹是将分离的关节的细胞或组织、他们的破碎液、滑液等溶 解于含有SDS的样品用缓冲液，进行SDS-PAGE后，转移到聚偏氟乙 烯(PVDF)膜上，使抗FGF-8抗体反应，再使实施了过氧化物酶、碱 性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通过酶反应发色 或化学发光的底物，进行反应，作为带检测出的方法。
免疫沉降法是使分离的关节的细胞或组织的破碎液、滑液与固定于 颗粒等上的抗FGF-8抗体等反应，通过离心等将颗粒分离后，用含有 SDS的样品用缓冲液进行处理颗粒，用闪烁计数器等检测溶解的FGF- 8的方法。
三明治ELISA是使用抗原表位各不相同的两种抗FGF-8抗体的酶 免疫测定法中的一种。将其中的一种抗体固定于培养板上，使分离的关 节的细胞或组织、他们的破碎液、滑液反应后，再使另一种抗FGF-8 抗体与结合于培养板上的抗FGF-8抗体的FGF-8反应。再使实施了过 氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶标记的抗免疫球蛋白抗体反应后，加入通 过酶反应发色的底物，进行反应，用吸光光度计测定发色色素的方法。
附图的简单说明
图1是表示兔软骨细胞的FGF-8引起细胞外基质的分解作用的图。 纵轴表示残留在细胞外基质中的葡萄糖胺聚糖的量，横轴表示FGF-8 的浓度(ng/mL)。值表示平均值±标准误差，***表示P＜0.001(无刺激 组对比、Dunnett检测)。
图2是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对兔软骨细胞的FGF-8引 起细胞外基质的分解的抑制作用的图。纵轴表示残留在细胞外基质中的 葡萄糖胺聚糖的量，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平均 值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Student的t-检测)， **表示P＜0.01，***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett检测)。
图3是表示由兔软骨细胞的FGF-8促进细胞外基质金属蛋白激酶3 的产生和抗FGF-8中和抗体KM1334产生的抑制作用的图。纵轴表示残 留在培养液中的基质金属蛋白激酶3的量(ng/孔)，横轴表示KM1334 的浓度(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表示P＜0.01(无刺激 组对比、Aspin-Welch检测)，***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett 检测)。
图4是表示兔滑膜细胞的FGF-8促进增殖作用的图。纵轴表示整合 到兔滑膜细胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示FGF的浓度 (ng/mL)。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05(无刺激组对比、 Steel检测)。
图5是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对由兔滑膜细胞的FGF-8 引起的增殖促进的抑制作用的图。纵轴表示整合到兔滑膜细胞中的[3H] 胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平 均值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Student的t-检测)， ***表示P＜0.001(0组为对比，Dunnett检测)。
图6是表示由人滑膜细胞的FGF-8引起的增殖促进作用的图。纵轴 表示整合到人滑膜细胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示FGF-8 的浓度(ng/mL)。值表示平均值±标准误差，***表示P＜0.001(无刺激 组对比，Dunnett检测)。
图7是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对由人滑膜细胞的FGF-8 引起的增殖促进的抑制作用的图。纵轴表示整合到兔滑膜细胞中的[3H] 胸腺嘧啶的放射活性，横轴表示KM1334的浓度(μg/mL)。值表示平 均值±标准误差，###表示P＜0.001(无刺激组对比、Aspin-Welch检测)， *表示P＜0.05(0组为对比，Steel检测)。
图8是表示由于FGF-8注入引起的关节细胞外基质分解的图。纵轴 表示关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖浓度(μg/mL)。值表示平均值±标 准误差，**表示P＜0.01(生理盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图9是表示由于FGF-8注入引起的关节的膝盖骨破坏的图。纵轴表 示膝盖骨重量(mg)。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05(生理 盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图10是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对胶原关节炎病小鼠的关 节炎记分的随时间变化的抑制作用的图。纵轴表示关节炎记分，横轴表 示从胶原初次致敏开始的经过天数。值表示平均值±标准误差，*表示 P＜0.05(给予生理盐水组对比，Wilcoxon顺位和检测)，#表示P＜0.05 (给予溶剂组对比，Wilcoxon顺位和检测)。
图11是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠的佐 剂非处置足的足容积量增加的抑制作用的图。纵轴表示足容积(mL)。 值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组对比、Aspin- Welch检测)，**表示P＜0.01(生理盐水注入组对比，Student的t-检 测)。
图12是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠的佐剂非处置足的足容积量增加的抑制作用的图。纵轴表示足容 积(mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组对比、 Aspin-Welch检测)，***表示P＜0.001(给予溶剂组对比，Student的t 检测)， 表示P＜0.01， 表示P＜0.001(给予溶剂组对比，Aspin- Welch检测)。
图13是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的图。纵轴表示葡萄糖胺聚糖浓度/ 肌酸酐浓度比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001 (未处置组对比、Aspin-Welch检测)，**表示P＜0.01(生理盐水注入 组对比，Student的t-检测)。
图14是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠尿中的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的图。纵轴表示葡萄糖胺 聚糖浓度/肌酸酐浓度比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表示 P＜0.01(未处置组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05(生理盐 水注入组对比，Student的t-检测)。
图15是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)上升的抑制作用的图。纵轴表示脱 氧吡啶啉浓度/肌酸酐浓度比(nmol/mmol)。值表示平均值±标准误差， ###表示P＜0.001(未处置组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05 (生理盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图16是表示双氯芬酸钠、甲氨蝶呤、以及氢化泼尼松对佐剂关节炎 病大鼠尿中的脱氧吡啶啉量上升的抑制作用的图。纵轴表示脱氧吡啶啉 浓度/肌酸酐浓度比(nmol/mmol)。值表示平均值±标准误差，###表示 P＜0.001(未处置组对比、Student的t-检测)，**表示P＜0.01(溶剂注 入组对比，Student的t-检测)。
图17是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对佐剂关节炎病大鼠尿中 的羟脯氨酸上升的抑制作用的图。纵轴表示羟脯氨酸浓度/肌酸酐浓度 比(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，###表示P＜0.001(未处置组 对比、Student的t-检测)，**表示P＜0.01(溶剂给予组对比，Student 的t-检测)。
图18是表示抗FGF-8中和抗体KM1334对一碘代乙酸诱发变形性 关节病模型大鼠中的关节软骨破坏的抑制作用的图。纵轴表示关节洗净 液中的葡萄糖胺聚糖浓度(μg/mL)。值表示平均值±标准误差，##表 示P＜0.01(假手术组对比、Aspin-Welch检测)，*表示P＜0.05(生理 盐水注入组对比，Student的t-检测)。
图19是表示质粒pKM1334CH-H5的构建步骤的图。
图20是表示质粒pKM1334CH-L4的构建步骤的图。
图21是表示质粒pKANTEX1334的构建步骤的图。
图22是表示抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、抗FGF-8中和抗体 KM3034和KM3334对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8依赖增殖 的中和活性的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了 FGF-8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM1334、□为 KM3034、△为KM3334、×为阴性对照的KM2760的活性。
图23是表示质粒pKM1334HVO的构建步骤的图。
图24是表示质粒pKANTEX1334HVOLVO的构建步骤的图。
图25是表示通过ELISA测定抗FGF-8中和嵌合抗体KM3334、抗 FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6对FGF-8 的结合活性的结果的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示结合 活性(OD415)。△为KM3334、○为HVOLVO、□为HVOLV6、×为HV6LV6 的活性。
图26是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6 对FGF-8的结合活性的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共 振信号(RU)。
图27是表示质粒pKM1334LV3-1的构建步骤的图。
图28是表示质粒pKM1334LV4-2的构建步骤的图。
图29是表示质粒pKM1334LV3-2的构建步骤的图。
图30是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLVO/CHO、 HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV4-2/CHO、HVOLV3- 1/CHO、HVOLV3-2/CHO、HVOLV2-1/CHO、HVOLV2-2/CHO 对FGF-8的结合活性的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共 振信号(RU)。
图31是表示抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034、抗FGF-8中和CDR 移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV3-1/CHO、 HVOLV2-1/CHO对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8依赖增殖 的中和活性的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了 FGF-8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM3034、●为 HVOLV6/CHO、◇为HVOLV4-1/CHO、△为HVOLV3-1/CHO、□ 为HVOLV2-1/CHO、×为阴性对照的KM2760的活性。
图32是表示质粒pKM1334LV3-3的构建步骤的图。
图33是表示通过BIAcore 2000测定抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV3- 1/CHO、HVOLV4-3/CHO、HVOLV3-3/CHO对FGF-8的结合活性 的结果的图。横轴表示时间(秒)，纵轴表示共振信号(RU)。
图34是表示抗FGF-8中和嵌合抗体KM3334、抗FGF-8中和CDR 移植抗体HVOLV6/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-3/CHO、 HVOLV3-3/CHO对小鼠乳腺癌细胞株SC-3细胞的FGF-8的结合活 性的结果的图。横轴表示抗体浓度(μg/mL)，纵轴表示将只添加了FGF -8时的增殖作为100％时的相对增殖(％)。○为KM3034、●为 HVOLV6/CHO、△为HVOLV3-1/CHO、▲为HVOLV4-3/CHO、■ 为HVOLV3-3/CHO、×为阴性对照的KM2760的活性。
具体实施方式
以下给出本发明的实施例和参考例。
实施例1兔软骨细胞的FGF-8引起的细胞外基质的分解和抗体引 起的抑制
兔关节软骨细胞是按照田村等人的方法(Tamura T.et al.，Eur.J.Pharmacol.，419，269-274，2001)从3周龄的雌性新西兰白兔的两 膝和肩分离培养的。即摘出两膝关节和两肩关节，採取骨端软骨。用磷 酸缓冲生理盐水洗净后，将软骨切碎，通过在含有0.4％肌动蛋白酶(ア クチナ-ゼ)E的添加10vol％FBS的DMEM(以下将含有FBS的DMEM 记为FBS/DMEM)中，37℃下处理1小时，再在含有0.025w/v％的胶原 酶P的添加10vol％FBS的DMEM中，37℃下处理5～6小时，将软骨细胞 从软骨组织中分离出来、採取。将採取的软骨细胞悬浮于10vol％ FBS/DMEM，调整到100,000个/mL。将含有该软骨细胞的培养液接种 到24孔板的各个孔中，每孔1mL，然后在5％CO2-95％空气气相下于 37℃下进行培养。在软骨细胞达到铺满程度后，将培养液置换成0.5vol ％FBS/DMEM，培养24小时。除去培养液，添加1mL的0.5vol％ FBS/DMEM(无刺激组)，或含有FGF-8[1、10或100ng/mL；Peprotech 公司生产]的0.5vol％FBS/DMEM后培养48小时。在研究抗FGF-8中和 抗体的作用时，添加1mL含有FGF-8(100ng/mL)的0.5vol％ FBS/DMEM(0组)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗 体KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol％FBS/DMEM后培养48小时。 除去培养液，通过二甲基亚甲基法(DMMB)(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161103-108，1987)对残留在板上的细胞外基质的葡萄 糖胺聚糖量进行测定。即，向加入5mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐-水和 物后活化的保存用番木瓜蛋白酶缓冲液(0.1mol/L乙酸钠、50mmol//L EDTA、pH5.8)加入终浓度为20μg/mL的番木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich 公司生产)，将该液添加到培养上述软骨细胞的板的各个孔中，每孔 1mL，于60℃下消化过夜。向75μL的该消化液添加25μL盐酸胍缓冲液 (2.88mol/L盐酸胍、50mmol/L乙酸钠、pH6.8)和200μL DMMB溶液， 测定530/590nm的吸光度。由作为标准使用的硫酸软骨素(来自鲸的软 骨，生化学工业公司生产)的吸光度算出各个样品的葡萄糖胺聚糖的浓 度。实验在各个条件下都进行了3例，求平均值和标准误差。
图1和图2给出了算出的结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以使细 胞外基质中的葡萄糖胺聚糖残存量显著地降低(图1)。
这表明FGF-8具有促进细胞外基质的分解的作用。另外，抗FGF -8中和抗体KM1334在3μg/mL以上的抗体浓度下对FGF-8促进软骨 的细胞外基质的分解显著地抑制(图2)。因此通过给予抗FGF-8中和 抗体可以抑制关节炎的细胞外基质的分解。
实施例2 FGF-8促进兔软骨细胞的细胞外基质金属蛋白激酶3的产 生和抗体引起的抑制
兔关节软骨细胞是按照实施例1所述方法分离培养的。在软骨细胞 达到铺满程度后，将培养液置换成0.5vol％FBS/DMEM，培养24小时。 除去培养液，添加1mL的0.5vol％FBS/DMEM(无刺激组)，含有FGF -8(100ng/mL)的0.5vol％FBS/DMEM(0组)、或含有FGF-8 (100ng/mL)和抗FGF-8中和抗体KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol ％FBS/DMEM后培养48小时。48小时后，回收培养液，用兔细胞外基 质金属蛋白激酶3 ELISA系统(Amersham·Biosciences公司生产)测定 培养液中的细胞外基质金属蛋白激酶3浓度。实验在各个条件下都进行 了3例，求平均值和标准误差。
图3给出了实验结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以使来自软骨 细胞的细胞外基质金属蛋白激酶3量显著地增加(无刺激组对0组、P＝ 0.0079)。这表明FGF-8通过来自软骨细胞的细胞外基质金属蛋白激酶 3的产生诱导具有促进细胞外基质的分解的作用。另外，抗FGF-8中和 抗体KM1334在1μg/mL以上的抗体浓度下对FGF-8促进软骨细胞的细 胞外基质金属蛋白激酶3的产生显著地抑制(图2)。抗FGF-8中和抗 体KM1334的1、3或10μg/mL的抑制率分别为72、74、100％。因此通过 给予抗FGF-8中和抗体可以抑制来自软骨细胞的细胞外基质金属蛋白 激酶3的产生，抑制关节炎的细胞外基质的分解。
实施例3 FGF-8促进兔滑膜细胞的增殖和抗体产生的抑制
兔关节滑膜细胞是按照Hamilton等人的方法(Hamilton J.and Slywka J.，J.Immunol.126，851-855，1981)採集。将分离的滑膜细胞悬浮 于含有10vol％FBS的RPMI 1640培养基(以下将含有FBS的RPMI 1640 培养基记为FBS/RPMI 1640培养基)，每10,000个接种到96孔的培养板 中，培养24小时后，除去各个孔的培养液，添加200μL的0.2vol％ FBS/RPMI 1640(无刺激组)，或含有FGF-8(1、10或100ng/mL)的 0.2vol％FBS/RPMI 1640。当研究抗FGF-8中和抗体的作用时，向各个 孔添加200μL含有FGF-8(100ng/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640(0 组)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗体KM1334(0.1、 0.3、1、3或10μg/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640。培养48小时后，每 孔添加9.25kBq的[3H]胸腺嘧啶。再培养24小时，用液相闪烁计数器 (1205β板，Perkin Elmer Life scence日本)测定整合到细胞内的[3H] 胸腺嘧啶的放射性活性。实验在各个条件下都进行了6例，求平均值和 标准误差。
图4和图5给出了实验结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以有意义 地促进[3H]胸腺嘧啶向兔滑膜细胞的整合(图4)。这表明FGF-8具有 促进兔滑膜细胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗体KM1334在 3μg/mL以上的抗体浓度下对依赖FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促进 显著地抑制(图5)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体可以抑制关节炎 的滑膜的增殖。
实施例4 FGF-8促进人滑膜细胞的增殖和抗体产生的抑制
使用关节风湿病患者的人滑膜细胞(由东洋纺购入)，进行与实施 例3同样的实验。FGF-8的浓度为10、100或500ng/mL，与抗FGF-8 中和抗体KM1334共存的FGF-8浓度调整到500ng/mL。实验在各个条 件下都进行了6例，求平均值和标准误差。
图6和图7给出了实验结果。FGF-8在500ng/mL浓度下可以显著 地促进[3H]胸腺嘧啶向人滑膜细胞的整合(图6)。这表明FGF-8具有 促进人滑膜细胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗体KM1334在 1μg/mL以上的抗体浓度下对依赖FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促进 显著地抑制(第7图)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体可以抑制关节 炎的滑膜的增殖。
实施例5使用抗FGF-8抗体的滑膜染色
从人关节风湿病患者摘出滑膜，按照文献的方法(Tanaka A.et al，Cancer Res.58，2053-2056，1998)，制作石蜡切片，用抗FGF-8抗体 KM1334进行组织免疫染色。结果4例人关节风湿病中有3例的滑膜细胞 中FGF-8呈阳性。因此，可以确认FGF-8存在于人滑膜中。另外通过 使用抗FGF-8抗体检测人关节风湿病的滑膜细胞，可以判定人关节风 湿病。
实施例6由关节内注入FGF-8而诱发的关节炎
用FGF-8，象以下那样诱发Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周 龄、日本チヤ-ルス·リバ-公司)关节炎样病症。使用生理盐水(大塚 制药工厂公司生产)终浓度为1mg/mL那样地制备的50μL FGF-8注入 到大鼠膝关节内。另外，建立向膝关节内注入50μL生理盐水的对照组。 一组3只。注入FGF-8或生理盐水3天后，按照Yamada等人的方法 (Yamada A.et al.，Inflamm.Res.，49，144-146，2000)，用含有0.38％w/v 柠檬酸钠的生理盐水30μL洗膝关节包内，回收洗净液。该操作重复进行 10次，回收300μL的关节洗净液。按照实施例1所述的DMMB法测定关 节洗净液中的葡萄糖胺聚糖的量。另外，将膝关节的膝盖骨取出，按照 实施例1所述的方法用番木瓜蛋白酶消化软骨部分，测定硬骨的重量。
图8和图9给出了实验结果。图8表示关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖 的浓度。由于注入FGF-8，关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖的浓度比注 入生理盐水组上升1.9倍(P＝0.0034)。这表明由于FGF-8的注入，关 节软骨的细胞外基质分解亢进。图9表示番木瓜蛋白酶消化后的膝盖骨 重量。由于FGF-8的注入，膝盖骨的重量下降到注入生理盐水组的40 ％(P＝0.0454)。这表明由于FGF-8的注入，膝盖骨的破坏亢进。因 此，FGF-8在生物体内诱导关节破坏，引起关节炎那样的症状。
实施例7用小鼠·胶原关节炎模型的评价
小鼠·胶原关节炎模型用DBA/1J系小鼠(雄性、7周龄、日本チヤ- ルス·リバ-公司)，按照鎌田等人的方法(Kamada H.et al.，Jpn.J.Pharmacol.，70，169-175，1996)象以下那样制作。
将来自牛软骨的II型胶原溶液(胶原技术研修公司生产)在冰冷下 与付氏完全佐剂(ヤトロン公司生产)混合，使其形成乳剂，将II型胶 原的终浓度调整到1.5mg/mL，然后将调整后的乳剂100μL注射到鼠的尾 根部皮内，进行致敏，再于21天后，按照同样操作进行追加免疫。一组 10只。对于给予KM1334组，用生理盐水(大塚制药工厂公司生产)将 抗FGF-8抗体KM1334溶解，使终浓度为2mg/mL，于从上述小鼠·胶原 关节炎模型的初次致敏开始后的第21、25、28、32、35和39天，1天1次 地向各个个体腹腔内给药200μL。另外对于给予生理盐水对照组，代替 抗FGF-8抗体KM1334溶液，只向腹腔内注入生理盐水。而作为阳性对 照，对于给予双氯芬酸组，将非甾体抗炎药双氯芬酸钠(Sigma Aldrich 公司生产)溶解于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为0.3mg/mL，于 从上述小鼠·胶原关节炎模型的初次致敏开始后的第21、25、28、32、35 和39天，1天1次地按照每100g体重1mL经口给药。另外预设未处置组， 不进行胶原致敏和给药。胶原关节炎中的全肢浮肿的随时间变化用一肢 0到4分、全肢合计最高16分的记分评价。记分基准为0：正常；1：发现 弱红斑，2：发现弱肿胀和红斑，3：发现强肿胀和红斑，通过触知发现 温感，4：发现随着手指变形引起显著的肿胀。
图10给出了实验结果。在给予抗FGF-8抗体KM1334组，在第42 天确认34％(P＝0.0204)的显著的关节炎记分的抑制，其抑制程度与 阳性对照的给予双氯芬酸组同等程度(图10)。这表明通过给予抗FGF -8中和抗体，可以抑制关节炎。
实施例8用大鼠·佐剂关节炎模型的评价
大鼠·佐剂关节炎模型用Lewis系大鼠(雌性、8周龄、日本チヤ-ル ス·リバ-公司)，按照Pearson等人的方法(Pearson CM.et al.，Arth.Rheum.，5，654-658，1962)象以下那样制作。
将Mycobacterium butyricum(デイフコ公司生产)悬浮于液体石 蜡(和光纯药工业公司生产)，终浓度为6mg/mL，高压灭菌，然后将 灭菌后的溶液100μL注射到大鼠的右侧足蹠部皮内，进行致敏。一组8～ 10只。对于给予KM1334组，用生理盐水将抗FGF-8抗体KM1334溶解， 使终浓度为2mg/mL，于从上述大鼠·佐剂关节炎模型的致敏日以及致敏 开始后的第3、7、10、14和17天，1天1次地向各个个体腹腔内给药 0.5mLμL。另外对于给予生理盐水组，代替抗FGF-8抗体KM1334溶液 只向腹腔内注入生理盐水。而作为阳性对照，对于给予双氯芬酸组，将 消炎药双氯芬酸钠溶解于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为 0.3mg/mL，于从佐剂致敏日开始后的第4、从7开始的11天、从14开始 的第18天，1天1次地按照每100g体重1mL经口给药。对于给予甲氨蝶呤 组，将作为代谢拮抗药的注射用甲氨蝶呤R50mg(日本ワイスレダリ- 公司生产)悬浮于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为0.01mg/mL， 象与双氯芬酸组同样那样给药。对于氢化泼尼松给予组，将作为甾体类 药氢化泼尼松(Sigma-Aldrich公司生产)悬浮于0.5w/v％甲基纤维素溶 液中，终浓度为0.3mg/mL，象双氯芬酸组那样给药。另外作为溶剂给 予组，同样经口只给予0.5w/v％甲基纤维素溶液。另外预设未处置组， 进行Mycobacterium butyricum致敏和给药。佐剂处置足和非处置足的 容积用大鼠后肢足浮肿测定装置(TK-101、ユニコム公司生产)随时 间进行测定。
图11和图12给出了致敏后第21天的测定结果。在抗FGF-8中和抗 体KM1334给予组，于佐剂非处置足可以看到69％(P＝0.0010)的显著 的足容积增加的抑制(图11)。在双氯芬酸给予组可以看到45％ (P＜0.0001)，在甲氨蝶呤给予组可以看到90％(P＜0.0001)，在氢化 泼尼松给予组可以看到51％(P＝0.0029)的显著的足容积增加的抑制 (图12)。即，抗FGF-8中和抗体KM1334表现出比双氯芬酸或氢化泼 尼松高的浮肿抑制作用。
用致敏开始后第20天至第21天24小时蓄尿，测定尿中的葡萄糖胺聚 糖、脱氧吡啶啉、羟脯氨酸以及肌酸酐。尿中的葡萄糖胺聚糖量按照实 施例1所述的DMMB法进行测定。尿中羟脯氨酸量按池田等人方法(池 田真悟等，东京卫研年报.36，277-282，1985)进行测定。即，向0.8mL 尿中添加0.8mL氨基酸分析用盐酸(关东化学公司生产)，于110℃下水 解15小时。向水解的样品0.5mL添加2mL的1.2mol/L的氢氧化钠溶液， 进行中和。向0.5mL中和处理的样品中添加1mL异丙醇，添加 1mLOxidant溶液后充分搅拌，于室温下静置5分钟。Oxidant溶液是将 醋酸钠3水和物5.7g、柠檬酸三钠2水和物3.75g、柠檬酸一水和物0.602g 溶解于约50mL蒸馏水中，加38.5mL异丙醇，再加蒸馏水，成为100mL 的醋酸柠檬酸缓冲液，使用时将该缓冲液与用蒸馏水配制的7w/v％氯胺 T溶液(对甲苯磺氯酰胺钠三水和物，和光纯药工业公司生产)按照4∶1 比例充分混合后的溶液。然后添加1mL Ehrlich试剂，充分搅拌，于恒 温器中于60℃，加热20分钟。Ehrlich试剂是将17.6g的p-二甲基氨基苯 醛(和光纯药工业公司生产)溶解于20.9mL的过氯酸(关东化学公司生 产)，加异丙醇做成100mL的溶液。加温后，用流水冷却，测定562nm 的吸光度。用L-羟脯氨酸(和光纯药工业公司生产)的吸光度做成的 检量线，算出各个样品的羟脯氨酸浓度。尿中的脱氧吡啶啉量用オステ オリンクス「DPD」(住友制药公司生产)测定。尿中的肌酸酐量用肌 酸酐测试和光(和光纯药工业公司生产)检测。由于要对个体间的尿浓 度的差进行修正，对于每个个体算出葡萄糖胺聚糖浓度/肌酸酐浓度、 脱氧吡啶啉浓度/肌酸酐浓度、或羟脯氨酸浓度/肌酸酐浓度的比，作为 各自的指标。
图13到图17给出了实验结果。尿中的葡萄糖胺聚糖量在生理盐水给 予组上升到未处置组的2.2倍(P＜0.0001)(图13)。这表明随着关节 炎的进展，软骨破坏亢进。在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于 尿中的葡萄糖胺聚糖量的上升，可以看到73％(P＝0.0064)的显著的 抑制(图13)。在给予甲氨蝶呤组，可以看到对尿中的葡萄糖胺聚糖量 的上升的79％(P＝0.0465)的显著的抑制。虽然不显著，但在双氯芬 酸给予组可以看到40％，在氢化泼尼松给予组可以看到18％的尿中的葡 萄糖胺聚糖量的降低(图14)，即，抗FGF-8中和抗体KM1334显示出 与甲氨蝶呤同等程度的软骨破坏抑制作用。
尿中的脱氧吡啶啉量在生理盐水给予组上升到未处置组的1.8倍(P ＜0.0001)(图15)。这表明随着关节炎的进展，软骨破坏亢进。在给 予抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于尿中的脱氧吡啶啉量的上升，可 以看到41％(P＝0.0185)的显著的抑制。在双氯芬酸给予组可以看到 88％(P＝0.0016)的显著的尿中的脱氧吡啶啉量上升的抑制。虽然不 显著，但在给予甲氨蝶呤组，可以看到34％，在氢化泼尼松给予组可以 看到38％的脱氧吡啶啉量的降低(图16)。即，抗FGF-8中和抗体 KM1334显示出超过甲氨蝶呤和氢化泼尼松的骨破坏抑制作用。
尿中的羟脯氨酸量在生理盐水给予组上升到未处置组的1.8倍(P ＝0.0002)(图17)。这表明随着关节炎的进展，骨破坏亢进。在给予 抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于尿中的羟脯氨酸量的上升，虽然不 显著，但可以看到48％的降低。
在致敏后第21天，在胫骨骨干部切断佐剂非处置足，採集，用10vol ％磷酸缓冲液福尔马林溶液固定。然后，用软X射线发生装置 SOFRONSRO-M50(ソフロン公司生产)，于29kV、4mA、2分钟的 条件下拍摄软X射线照片。用实体显微镜观察照片，对骨破坏打分。打 分是通过观察有无踵骨(一边作为1个部位，合计5个部位)的骨糜烂， 有糜烂为1分，没有为0分，一肢最高为5分来进行。
第1表和第2表给出了打分结果。值表示平均值±标准误差，*表示 P＜0.05、**表示P＜0.01，***表示P＜0.001(溶剂给予组对比，Wilcoxon 顺位和检测)。
第1表
给予组 骨破坏打分 (抑制率)
未处置组 0.0±0.0 -
生理盐水 4.4±0.3 -
KM1334 3.2±0.5 27％
第2表
给予组 骨破坏打分 (抑制率)
未处置组 0.0±0.0 -
溶剂 4.6±0.3 -
双氯芬酸 3.1±0.6* 33％
甲氨蝶呤 0.9±0.4*** 80％
氢化泼尼松 1.8±0.7** 61％
在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，虽然不显著，但可看到骨破 坏打分的27％降低(第1表)。在双氯芬酸给予组可以看到33％(P＝ 0.0362)、在给予甲氨蝶呤组，可以看到80％(P＝0.0006)，在氢化泼 尼松给予组可以看到61％(P＝0.0032)骨破坏打分降低(第2表)。即， 抗FGF-8中和抗体KM1334显示出与双氯芬酸同等程度的骨破坏打分 降低。
制作福尔马林固定的佐剂非处置足的石蜡切片。进行苏木精/伊红 染色，对从胫骨到中足骨的骨、关节和关节周围区域进行组织病理学评 价。对于向关节周围组织或关节腔的血浆漏出通过一肢0到4分的打分进 行评价。打分的基准为0：没有变化，1：发现极轻度的变化，2：发现 轻度变化，3：发现中等程度变化，4：发现重度变化。
第3表给出了结果。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05、**表 示P＜0.01(生理盐水给予组对比，Wilcoxon顺位和检测)。
第3表
给予组 病理打分
向关节周围 (抑制率) 向关节腔的 (抑制率)
的血液漏出 血细胞和血
浆漏出
未处置 0.0±0.0 - 0.0±0.0
生理盐水 3.4±0.2 - 2.7±0.2
KM1334 2.0±0.4** 41％ 1.6±0.3* 41％
在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，可以看到血浆向关节周围组 织的漏出降低41％(P＝0.0022)、血细胞和血浆向关节腔的漏出降低 41％(P＝0.0156)(第3表)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体，可 以抑制关节炎中的浮肿形成，和软骨以及骨破坏。
实施例9用小鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节炎模型的评价
小鼠·佐剂关节炎模型用Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周龄、 日本チヤ-ルス·リバ-公司)，按照Guingamp等人的方法(Guingamp C.et al.，Arthritic Rheum.，40，1670-1679，1997)象以下那样制作。
用生理盐水配制终浓度为10mg/mL的一碘代乙酸(Sigma Aldrich 公司生产)，将25μL配制的一碘代乙酸注入大鼠的右膝关节内。一组10 只。对于KM1334给予组，用生理盐水(大塚制药工厂公司生产)溶解 抗FGF-8中和抗体，使终浓度为4mg/mL，在注入一碘代乙酸时，每100g 体重向腹腔内一次注入0.5mL。而对于生理盐水组，取代抗体溶液，只 向腹腔内注入生理盐水。另设置假手术组，将生理盐水注入膝关节内， 不给药。一碘代乙酸注入3日后，按照实施例6所述的方法，回收关节洗 净液。用实施例1所述的DMMB法测定关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖量。
图18给出了测定结果。由于一碘代乙酸的注入，关节洗净液中的葡 萄糖胺聚糖浓度上升到假手术组的1.6倍(P＝0.0014)。这表明由于一 碘代乙酸注入，关节软骨的细胞外基质分解亢进。对于由于一碘代乙酸 注入使得关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖浓度上升，在抗FGF-8中和抗 体给予组，可以看到42％(P＝0.0188)的有意义的抑制。因此，通过 给予抗FGF-8中和抗体，可以抑制关节炎中的关节软骨的破坏。
参考例1抗FGF-8中和嵌合抗体的生产
1.编码小鼠的抗FGF-8中和抗体的V区的cDNA的分离和解析
(1)从生产小鼠的抗FGF-8中和抗体的杂交瘤细胞制备mRNA
使用mRNA制备试剂盒フアストトラツクmRNA分离试剂盒(イン ビトロジエン公司生产)，按照附带的使用说明书从生产小鼠的抗FGF -8中和抗体的杂交瘤KM1334(FERM BP-5451、特开平9-271391) 的1×107细胞制备约8μg的mRNA。
(2)抗FGF-8中和鼠抗体的H链和L链cDNA文库的制作
使用タイムセ-バ-cDNA合成试剂盒(Amersha Biosciences公司生 产)，按照附带的使用说明书由上述(1)中获得的KM1334的mRNA 5μg 合成两端含有EcoRI-NotI接头的cDNA。然后，使用λZAPII克隆试剂 盒(ストラタジ-ン公司生产)，制作cDNA文库。首先，将cDNA全量 溶解于20μL的灭菌水后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，分别回收大约 0.1μg的对应于IgG类抗体的H链的约1.5kb的cDNA片段和对应于κ类的 L链的约1.0kb的cDNA片段。然后，按照附带的使用说明书将约1.5kb的 cDNA片段0.1μg以及约1.0kb的cDNA片段0.1μg和用限制性内切酶 RcoRI消化后经小牛小肠由来的碱性磷酸酶对末端进行脱磷酸化的 λAPII载体1μg连接起来。
使用Gigapack II Packaging Extracts Gold(ストラタジ-ン公司生 产)，按照附带的使用说明书，将连接后的各个反应液中的4μL包装到λ 噬菌体中，使适量的噬菌体感染大肠杆菌菌株XL1-Blue(ストラタジ -ン公司生产)，作为KM1334的H链cDNA文库和L链cDNA文库分别获 得约8.1×104个和5.5×104个的噬菌体克隆。接下来，按照常规方法(《分 子克隆》，第3版)，将各个噬菌体固定于尼龙膜上。
(3)抗FGF-8中和小鼠抗体的H链和L链cDNA的克隆
使用ECL直接核酸标记检测系统(ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems，Amershm Biosciences公司生产)， 按照附带的使用说明书，以含有小鼠抗体的C区的cDNA[H链含有鼠 Cγ1cDNA的DNA片段(French D.L.et al.，J/Immunol.，146， 2010-2016，1991)，L链含有鼠CκcDNA的DNA片段(Hieter P.A.et al.，Cell，22，197-207，1980)]作为探针检测上述(2)制作的KM1334的H 链cDNA文库和L链cDNA文库的尼龙膜，获得H链、L链各10个与探针密 切结合的噬菌体克隆。接下来，按照λZAPII克隆试剂盒(ストラタジ- ン公司生产)的使用说明书，通过体内切除(in vivo excision)将各个 噬菌体克隆转换为质粒。使用Big Dye Terminator Kit Ver.2(0)和DNA 测序仪决定上述得到的各个质粒中含有的cDNA的碱基序列。结果，得 到了含有存在推定cDNA的5’末端起始密码子为ATG序列存在的全长的 功能的H链cDNA的质粒pKM1334H7-1和含有L链cDNA的质粒 pKM1334L7-1。
(4)抗FGF-8中和小鼠抗体的V区的氨基酸序列解析
序列1表示质粒pKM1334H7-1含有的VH的全碱基序列、序列2表 示推定的全氨基酸序列、序列3表示质粒pKM1334L7-1含有的VL的全 碱基序列、序列4表示推定的全氨基酸序列。由与已知的小鼠抗体的序 列资料(Sequence of Proteins of Immunological interest)的比较和与通 过使用蛋白质测序仪PPSQ-10(岛津制作所制造)进行自动Edman降 解对纯化的抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的H链和L链的N末端氨基 酸序列解析的结果比较，分离的各个cDNA是编码含有分泌信号序列的 抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的全长cDNA，就H链来说，序列2表示 的氨基酸序列的1至19，就L链来说，序列4表示的氨基酸序列的1至19 是分泌信号序列。序列5和6分别表示除去分泌信号序列的VH和VL的氨 基酸序列。
接下来，就抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH和VL的氨基酸序 列是否为新的序列进行研究。作为序列解析系统使用GCG数据库[版本 9.1、Genetics Computer Group公司制作]，通过BLAST(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)对已知的蛋白质的氨基酸序列数据 [PIR-Protein(Release 56.0)]进行检索。结果，没有看到与H链、L 链完全一致的序列，确认抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH和VL的 氨基酸序列是新的氨基酸序列。
另外，通过与已知的抗体的氨基酸序列比较，对抗FGF-8中和小 鼠抗体KM1334的VH和VL的氨基酸序列进行了鉴定。序列7、8和9分别 表示抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH的CDR1、CDR2和CDR3的 氨基酸序列，序列10、11和12分别表示VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨 基酸序列。
2.抗FGF-8中和嵌合抗体用动物细胞稳定表达
(1)含有编码抗FGF-8中和嵌合抗体的VH的DNA的质粒 pKM1334CH-H5的构建
以参考例1的1.(3)得到的50ng的质粒pKM1334H7-1为模板，以 分别含有序列13、14所述的碱基序列的合成DNA[GENSET公司生产]作 为引物，使他们的终浓度为0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶(东洋纺 织公司生产)附带的使用说明书，总量为50μL，首先在94℃加热2分钟 后，于94℃15秒钟、57℃30秒钟、68℃1分钟的条件下进行30次循环的 PCR。对该反应液进行纯化后，溶解于灭菌水，用10单位的限制性内切 酶EcoRI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼 脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.48kb的EcoRI片段(5’末端 一侧为EcoRI、3’末端一侧为平末端)。
然后，使10单位的限制性内切酶EcoRI和10单位的限制性内切酶 EcoRV(宝酒造公司生产)于37℃下与3μg的质粒pBluescript SK(-) 反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约 2.95kb的EcoRI-EcoRV片段。
然后，将上述得到的编码VH的DNA的EcoRI片段0.1μg和来自质粒 pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中， 用Ligation High(东洋纺织公司生产)进行连接。用这样得到的重组质 粒DNA溶液转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图19给出的含有编码抗 FGF-8中和嵌合抗体的VH的DNA的质粒pKM1334CH-H5。
(2)编码抗FGF-8中和嵌合抗体的LH的DNA的质粒的构建
以参考例1的1.(3)得到的50ng的质粒pKM1334L7-1为模板，以 分别含有序列15、16所述的碱基序列的合成DNA(ジエンセツト公司生 产)作为引物，使他们的终浓度为0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶附 带的使用说明书，总量为50μL，首先在94℃加热2分钟后，于94℃15秒 钟、57℃30秒钟、68℃1分钟的条件下进行30次循环的PCR。对该反应 液进行纯化后，溶解于灭菌水，用10单位的限制性内切酶EcoRI于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg 的约0.45kb的EcoRI片段(5’末端一侧为EcoRI、3’末端一侧为平末端)。
然后，将上述得到的编码VL的DNA的EcoRI片段0.1μg和来自质粒 pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中， 用Ligation High进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌 XL1-Blue株，得到图20给出的含有编码抗FGF-8中和嵌合抗体的VL 的DNA的质粒pKM1334CH-L4。
(3)抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体pKANTEX1334的构建
用WO97/10354所述的人源化抗体表达用载体pKANTEX93和参考 例1的2.(1)和(2)得到的质粒pKM1334CH-H5和pKM1334CH-L4， 象下述那样构建抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体pKANTEX1334。
向参考例1的2.(1)得到的3μg的质粒pKM1334CH-H5中添加10 单元的限制性内切酶NotI[New England Biolabs公司生产]和10单元的限 制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应 液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.48kb的NotI-ApaI 片段。
然后向3μg的人源化抗体表达用载体pKANTEX93中添加10单元的 限制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)和10单元的限制性内切酶NotI， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约2μg的约12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334CH-H5的NotI-ApaI片 段0.1μg和来自质粒pKANTEX93的ApaI-NotI片段0.1μg加到总量10μl的 灭菌水中，用Ligation High进行连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液 转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图21所示的质粒pKANTEX1334H。
向参考例1的2.(2)得到的3μg的质粒pKM1334CH-L4中添加10 单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶BsiWI(New England Biolabs公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼 脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10单元的限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶BsiWI与上述 得到的3μg的质粒pKANTEX1334H于37℃下反应1小时。将该反应液通 过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约13.30kb的EcoRI-BsiWI片 段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334CH-L4的EcoRI-BsiWI 片段0.1μg和来自质粒pKANTEX1334H的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到 总量10μl的灭菌水中，用Ligation High进行连接。用这样得到重组质粒 DNA溶液转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图21所示的质粒 pKANTEX1334。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪，用得到的质粒 pKANTEX1334 400ng进行碱基序列解析。结果确认得到了目的DNA被 克隆的质粒。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
用上述参考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体 pKANTEX1334，象以下那样进行以DHFR基因缺损的CHO细胞 CHO/DG44细胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，4216-4220，1980)作为宿主的抗FGF-8中和嵌合抗体表达。
将10μg的质粒pKANTEX1334通过电穿孔法(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)导入到1.6×106细胞的CHO/GD44细 胞后，悬浮于10～30mL的IMDM-1×HTsupplement-dFBS(10)[含 有10％透析FBS(以下略为dFBS)和1×HTsupplement(インビトロジ エン公司生产)的IMDM培养基(インビトロジエン公司生产)]，注 入96孔微量培养板(旭テクノゲラス公司生产)，每孔分注100μL。于5 ％CO2培养箱内，在37℃下培养24小时后，将培养液换成培养基 IMDM-dFBS(10)[不含有HTsupplement，而含有10％dFBS的IMDM 培养基]，再培养1～2周。从抗性菌落出现，且铺满的孔回收上清，通 过下述的参考例1的2.(6)所示的ELISA测定上清中的抗FGF-8中和嵌 合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中抗FGF-8中和嵌合抗体的表达的孔的转化 体，再接种到24孔板中，目的是利用dhfr基因扩增体系，使抗体表达量 增加，用含有50nmol/L的作为dhfr的抑制剂的甲氨蝶呤(Sigma Aldrich 公司生产，以下略为MTX)IMDM-dFBS(10)培养2周。再将MTX浓 度提高到200nmol/L、500nmol/L，在各个阶段各培养2周，诱导表现出 500nmol/L MTX抗性的转化株。在转化株铺满孔时，通过参考例1的2. (6)所述的ELISA测定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活 性。最终，得到在含有500nmol/L MTX的IMDM-dFBS(10)的培养 基中可增殖、而且高效表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化株。对于得 到的转化株，通过限界稀释法进行单一细胞化(克隆)，将抗FGF-8 中和嵌合抗体表达最高的转化细胞命名为KM3034。而KM3034于平成 13年12月26日以FERM BP-7836保藏于独立行政法人产业技术综合研 究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地 中央第6)。
(5)抗FGF-8中和嵌合抗体用YB2/0细胞的稳定表达
用上述参考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体 pKANTEX1334，象以下那样进行抗FGF-8中和嵌合抗体在大鼠杂交瘤 YB2/0细胞(ATCC No.CRL-1662)的表达。
将10μg的质粒pKANTEX1334通过电穿孔法导入4×106细胞的 YB2/0细胞后，悬浮于40mL的杂交瘤-SFM-FBS(5)[含有5％FBS (PAA实验室公司生产)的杂交瘤-SFM培养基(インビトロジエン公 司生产)]，注入96孔培养板(住友ベ-クライト公司生产)，每孔分 注200μL。于5％CO2培养箱内，在37℃下培养24小时后，添加终浓度为 1mg/mL的G418后，培养1～2周。从出现表现出G418抗性的转化株的菌 落，且铺满的孔回收培养上清，通过下述的参考例1的2.(6)所述的ELISA 测定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中抗FGF-8中和嵌合抗体的表达的孔的转化 株，为了利用dhfr基因扩增体系使抗体表达量增加，将上述转化株悬浮 于用含有1mg/mL的G418和50nmol/L MTX的杂交瘤-SFM-FBS(5) 培养基中，使之变为1～2×105细胞/mL，分注于24孔培养板，每孔为1mL。 于5％CO2培养箱内，在37℃下培养1～2周诱导表现出50nmol/L MTX抗 性的转化株。通过参考例1的2.(6)所述的ELISA测定确认转化株增殖 的孔的培养上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体表达的孔的转化 株，按照与上述同样的方法，使MTX浓度上升，得到在含有终浓度为 1mg/mL的G418、200nmol/L MTX的杂交瘤-SFM-FBS(5)培养基 中可增殖、而且高效表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化株5-D。对于得 到的转化株，通过限界稀释法进行单一细胞化(克隆)，得到抗FGF- 8中和嵌合抗体表达最高的转化细胞株。将抗FGF-8中和嵌合抗体表达 最高的转化细胞株命名为KM3334。
(6)通过ELISA测定抗体对FGF-8部分肽的结合活性
作为可与抗FGF-8抗体反应的人FGF-8的部分肽，合成由与抗 FGF-8中和小鼠抗体KM1334(特开平9-271391)的抗原肽相同序列 的序列17表示的氨基酸序列构成的肽。序列17是在人FGF-8的氨基酸 序列的23～46的序列的C末端附加了用于制作结合的半胱氨酸残基的序 列。以下，将该肽称之为化合物1。为了用于ELISA，用以下的方法制 作与牛血清清蛋白(ナカライテスク公司生产，以下略称为BSA)的结 合(以下称之为BSA-化合物1)。即，在一边搅拌下，一边向含有10mg 的BSA的PBS 900μL滴入100μL的25mg/mL SMCC[4-(N-马来酰亚胺甲 基)环己烷-1-羧基N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma Aldrich公司生产]的 DMSO溶液，缓慢搅拌30分钟。将1mL反应液载到用25mL的PBS平衡的 凝胶过滤柱(NAP-10柱)，将用1.5mL的PBS洗脱的洗脱液作为BSA -SMCC溶液。各个级分的BSA浓度用280nm的吸光度进行测定。然后 向1.0mg的化合物1中加入200μL DMSO，再加入800μL PBS，使其完全 溶解后，在搅拌下添加上述的BSA-SMCC溶液(BSA换算2.5mg)， 于室温下缓慢搅拌3小时。于4℃下将反应液对PBS透析过夜，添加终浓 度为0.05％的迭氮钠后，将经孔径0.22μm膜过滤器过滤后的溶液作为 BSA-化合物1溶液。
以0.5～1.0μg/ml的浓度向96孔的ELISA用板(ゲライナ-公司生 产)分注上述制备的BSA-化合物1溶液，每孔50μL，于4℃下放置过夜， 使其吸附。用PBS洗净后，加入含有1％BSA的PBS(以下称之为BSA- PBS)，每孔100μL，于室温下反应1小时，封闭残存的活性基团。用含 有0.05％Tween的PBS(以下称之为Tween-PBS)洗净各孔后，加入转 化株的培养上清或纯化抗体，每孔50μl，于室温下反应1小时。反应后 的各孔用Tween-PBS洗净后，将用BSA-PBS稀释到3000～6000倍的 过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H&L)抗体溶液[American Qualex公 司生产]作为二次抗体溶液，每孔加50μL，于室温下反应1小时。反应后 的各个孔用Tween-PBS洗净后，每孔加入50μL的ABTS底物溶液 [0.55g的2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵溶解于1L的0.1M柠 檬酸缓冲液(pH4.2)，在使用前以1μL/mL的比例添加30％过氧化氢的 溶液]，进行发色反应，5分钟后，每孔加入50μL的5％SDS溶液，终止 反应。然后测定415nm的吸光度。
3.抗FGF-8中和嵌合抗体的纯化
(1)来自CHO/DG44细胞的表达细胞的培养和抗体的纯化
将参考例1的2.(4)中得到的表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化细 胞株KM3034，使终浓度为1～2×105细胞/ml那样悬浮于含有500nmol/L MTX的IMDM-dFBS(10)的培养基中，向175cm2烧瓶(ゲライナ- 公司生产)中各注入40mL。在5％CO2培养箱中于37℃下培养5～7日， 达到铺满时除去培养上清，用20mL的PBS洗净细胞。除去PBS，加入 40mL的EX-CELL 301培养基(JRH生物科学公司生产)，在5％CO2培养箱中于37℃下培养7～14日后，回收培养上清。用Prosep- A[Millipore公司生产]柱，按照附带的说明书，从培养上清中纯化抗FGF -8中和嵌合抗体。得到的抗FGF-8中和嵌合抗体取名为KM3034。
(2)来自YB2/0细胞的表达细胞的培养和抗体的纯化
将参考例1的2.(5)中得到的表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化细 胞株KM3334，在175cm2烧瓶，用含有200nmol/L MTX和5％ダイゴ GF21(和光纯药公司生产)杂交瘤-SFM培养基，在5％CO2培养箱中 于37℃下进行培养。培养8～10天后，从回收的培养上清用Prosep-A柱， 按照附带的说明书，纯化抗FGF-8中和嵌合抗体。得到的抗FGF-8中 和嵌合抗体取名为KM3334。
4.纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的解析
按照众所周知的方法(Nature，227，680，1970)对在参考例1的3.中得 到的通过各种动物细胞表达、纯化的2种抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3034和KM3334各4μg进行电泳，对分子量和纯度进行解析。确认纯 化的各个抗FGF-8中和嵌合抗体无论哪一种在非还原条件下分子量都 是约150Kd的单一的带，而在还原条件下存在约50Kd和约25Kd的2条 带。这些分子量几乎与由抗体的H链和L链的cDNA的碱基序列推定的分 子量(H链：约49Kd，L链：约23Kd，分子全体：约144Kd)一致，另 外，IgG型抗体与在非还原条件下分子量约150Kd，在还原条件下分子 内的S-S键被切断，分解为分子量约为50Kd的H链和约25Kd的L链的报 道(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and practice Academic Press Limited，1996)一致，由此确认抗FGF-8中 和嵌合抗体是以正确的结构的抗体分子表达的，而且被纯化的。
5.纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的中和活性评价
纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的中和活性的评价通过以下所示的 小鼠乳腺癌细胞株SC-3的FGF-8依赖性增殖的抑制效果(Tanaka A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)测定。即，向 含有2％浓度的经活性炭处理的FBS的DMEM：Ham’s F12(1∶1)培养 基[DMEM培养基和Ham’s F12培养基，(インビトロジエン公司生产) 以1∶1混合的培养基]以3.0×104细胞/mL的浓度悬浮SC-3细胞，以每孔 150μL(4.5×103细胞)接种到96孔板。在5％CO2培养箱中于37℃下18 小时后，用每孔100μL的试验培养基进行培养基交换。试验培养基通过 将50ng/mL的FGF-8(R&D公司生产)和各种稀释浓度的抗FGF-8中 和嵌合抗体溶解于含有0.1％BSA的DMEM：Ham’s F12(1∶1)培养基 制作。而作为阴性对照的抗体使用WO01/64754报道的针对人趋化因子 CCR4的嵌合抗体KM2760。在5％CO2培养箱中于37℃下48小时后，换 成新配制的试验培养基，再培养48小时。每孔添加10μL的WST-1试剂 (ロシユ公司生产)，轻轻搅拌后，在5％CO2培养箱中于37℃下1小时， 然后测定吸光度(OD450/650)。图22中横轴表示添加的抗体浓度、纵轴 表示相对于只添加50ng/mL的FGF-8时增殖的相对增殖(％)。相对 于只添加50ng/mL的FGF-8时增殖的相对增殖(％)通过下面式子算 出。
(式)相对于添加FGF-8时增殖的相对增殖(％)
＝{(添加FGF-8和抗体时的吸光度-未添加FGF-8和抗体时的 吸光度)/
(只添加FGF-8时的吸光度-未添加FGF-8和抗体时的吸光 度)}×100
就象图22所示的那样，抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、抗FGF -8中和嵌合抗体KM3034和KM3334无论哪一个都表现出同等的SC-3 细胞增殖抑制活性，没有看到嵌合抗体化引起中和活性的降低。
参考例2抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作
1.编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的DNA的构建
(1)抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计
首先象以下那样设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨 基酸序列。选择用于移植参考例1的1项(4)中鉴定的抗FGF-8中和小 鼠抗体KM1334的VH的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH的FR的氨基 酸序列。カバツト等人报道了从氨基酸序列的同源性将已知的各种各样 的人抗体的VH分为3种亚类(HSG I～II)，以及对于每个亚类的共通 序列(Sequences of Proteins of Immunological interest)。由于认为这 些共有序列对于人免疫原性有降低的可能性，所以以这些共有的序列作 为基础，设计了抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列。为了 制作活性更高的抗FGF-8中和CDR移植抗体，在设计时，在人抗体的 VH的3种亚类的共有序列的FR的氨基酸序列中，选择与KM1334的VH 的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序列。在第4表中， 给出了同源性检索的结果。就象第4表所示那样，KM1334的VH的FR的 氨基酸序列具有与亚类1最高的同源性。
第4表
人抗体的VH的各个亚类的共通序列的FR的氨基酸序列和
KM1334的VH的FR的氨基酸序列的同源性
HSG I HSG II HSG III
79.3％ 51.7％ 59.8％
根据以上结果，将KM1334的VH的CDR的氨基酸序列移植到人抗 体的VH的亚类I的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置，设计了序列 18给出的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0。
然后象以下那样设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸 序列。选择用于移植参考例1的1.(4)中鉴定的抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VL的FR的氨基酸序列。 カバツト等人报道了从氨基酸序列的同源性将已知的各种各样的人抗 体的VL分为4种亚类(HSG I～IV)，以及对于每个亚类的共有序列 (Sequences of Proteins of Immunological interest)。与VH的情形一样， 在人抗体的VL的4种亚类的共通序列的FR的氨基酸序列中，选择与 KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序 列。
在第5表中，给出了同源性检索的结果。就象第5表所示那样， KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有与亚类II最高的同源性。
第5表
人抗体的VL的各个亚类的共通序列的FR的氨基酸序列和
KM1334的VL的FR的氨基酸序列的同源性
HSG I HSG II HSG III HSG IV
66.3％ 83.8％ 66.2％ 73.8％
根据以上结果，将KM1334的VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体 的VH的亚类II的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置，设计了序列 19给出的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸序列LV.0。
上述设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0 和VL的氨基酸序列LV.0只是将抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的 CDR的氨基酸序列移植到选择的人抗体的FR的氨基酸序列的序列。在 多数场合下，就人型CDR移植抗体来说，只是通过小鼠抗体的CDR的氨 基酸序列的移植，结合活性就已经降低了。为了避免这一现象，比较人 抗体和鼠抗体的FR的氨基酸序列，在不同的FR的氨基酸残基中，可以 将认为对结合活性有影响的氨基酸残基与CDR的氨基酸序列一起进行 移植。因此在本参考例中，也研究了认为对结合活性有影响的FR的氨 基酸残基的鉴定。
首先，利用计算机模拟手法构建了由上述设计的抗FGF-8中和 CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0和VL的氨基酸序列LV.0构成的 抗体V区(HVOLVO)的三维结构。关于三维结构座标制作使用 softwareAbM[Oxford Molecular公司生产]，关于三维结构的表示使用软 件Pro-Explore(Oxford Molecular公司生产)或RasMol[Glaxo公司生 产]，分别按照附带的使用说明书进行。而抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的V区的三维结构的计算机模型也同样构建。另外，在HVOLVO 的VH和VL的FR的氨基酸序列中，就与抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334不同的氨基酸残基，由为依次改变为在抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的相当位置看到的氨基酸残基的氨基酸序列构成的改变体的V 区三维结构模型也同样构建，对抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、 HVOLVO以及改变体的V区的三维结构进行比较。结果，在HVOLVO 的FR的氨基酸残基中，作为认为使抗原结合部位的三维结构变化、对 抗体活性有影响的残基，在HV.0中选择12位的Lys、13位的Lys、40位 的Ala、41位的Pro、48位的Met、68位的Val、70位的Ile、74位的Thr、 76位的Thr、82位的Glu、87位的Arg、95位的Tyr，在LV.0中选择2位的 Ile、3位的Val、14位的Thr、15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92 位的Tyr，进行氨基酸改变。在这些选择的氨基酸残基中，至少有一个 以上改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基，象以下那样设计具 有各种各样改变的人型CDR移植抗体的VH和VL。
具体来说，作为VH，设计了将序列12位的Lys、13位的Lys、40位 的Ala、41位的Pro、48位的Met、95位的Tyr 6个残基分别改变为鼠抗体 KM1334中出现的氨基酸残基Ala、Arg、Arg、Ser、Ile、Phe的序列20 给出的氨基酸序列HV.6。作为VL，设计了将序列2位的Ile、14位的Thr、 15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 6个残基分别改变为鼠 抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Ser、Leu、Lys、Val、Phe的序 列21给出的氨基酸序列LV.6。
(2)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的DNA的构建
利用PCR，象以下那样构建编码参考例2的1项(1)设计的抗FGF -8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列HV.0的DNA。
首先，将抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的H链的分泌信号序列 (序列2的1～19位的氨基酸序列)与设计的氨基酸序列相连。然后将得 到的氨基酸序列转换为遗传密码子。当对一个氨基酸存在多个遗传密码 子时，考虑抗体的基因的碱基序列中出现的使用频率(Sequences of Proteins of Immunological interest)，决定对应的遗传密码子。连接决 定的遗传密码子，设计编码完全抗体V区的氨基酸序列的DNA的碱基序 列。在该碱基序列的5’端和3’端付加含有用于对人源化抗体表达用载体 克隆的限制性内切酶识别序列，另外在5’末端付加M13引物RV(宝酒造 公司生产)的序列、3’末端付加与M13引物M4(宝酒造公司生产)序列 互补的序列。将设计的碱基序列(序列22)从5’末端一侧开始每141个 碱基，末端20个碱基重复那样分成4段，化学合成相当于各个序列的有 意义链、反意义链、有意义链、反意义链的序列23～26所示序列构成的 4条DNA(GENSET公司生产)。
按照KOD聚合酶附带的使用说明书，用0.1μmol/L的各个合成DNA、 0.5μmol/L的M13引物RV、0.5μmol/L的M13引物M4以及2.5单位的KOD 聚合酶(东洋纺织公司生产)，配制总量50μL的PCR反应液，进行PCR。 反应条件为在94℃加热5分钟后，进行每一循环为94℃30秒钟、50℃30 秒钟、74℃60秒钟的30次循环，再于74℃加热5分钟。将该反应液进行 乙醇沉淀后，溶解于灭菌水中，用10单位的限制性内切酶EcoRI和10单 位的限制性内切酶SpeI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将 该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.47kb的 EcoRI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶EcoRI和10单位的限制性内切酶SpeI 与3μg的质粒pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生产)于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2.9μg 的约2.95kb的EcoRI-SpeI片段。
然后，将上述得到的编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的PCR 产物的EcoRI-SpeI片段0.1μg和质粒pBluescript SK(-)的EcoRI-SpeI 片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用ligation high进行连接。用这样 得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺织公司生产)， 从转化株的10个克隆制备各个质粒DNA，利用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪进行碱基序列解析。碱基序列解析的结果，得到了 图23给出的含有目的碱基序列的质粒pKM1334HVO。
与上述编码HV.0的DNA同样设计(序列27)，用由序列28～31所 示序列构成的4条合成DNA(GENSET公司生产)，与上述同样通过PCR 进行构建编码在参考例2的1.(1)设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体 的VH的氨基酸序列HV.6的DNA。采取与pKM1334HVO同样的过程， 得到含有编码HV.6的DNA的质粒pKM1334HV6。
(3)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的DNA的构建
与编码HV.0的DNA同样设计编码参考例2的1项(1)设计的抗FGF -8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列LV.0的DNA(序列32)。但合成 DNA的设计时，作为分泌信号序列，使用抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的L链的分泌信号序列(序列4的1～19位的氨基酸序列)。与 编码HV.0的DNA同样，通过使用分别由序列33至36的序列构成的4条合 成DNA(GENSET公司生产)的PCR，构建编码LV.0的DNA。采取与 pKM1334HVO同样的过程，得到含有编码LV.6的DNA的质粒 pKM1334LV0。
另外，与编码LV.0的DNA同样设计编码参考例2的1项(1)设计的 抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸序列LV.6的DNA(序列37)， 用分别由序列38至41的序列构成的4条合成DNA(GENSET公司生产)， 象上述那样通过PCR构建。采取与pKM1334HVO同样的过程，得到含 有编码LV.6的DNA的质粒pKM1334LV6。
2.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
用WO97/10354所述的人源化抗体表达用载体pKANTEX93和参考 例2的1.(2)和(3)得到的质粒pKM1334HVO和pKM1334LV0，象下 述那样构建抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体 pKANTEX1334HVOLVO。
向参考例2的1.(2)得到的3μg的质粒pKM1334HVO中添加10单元 的限制性内切酶ApaI和10单元的限制性内切酶NotI(宝酒造公司生产)， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约0.3μg的约0.47kb的ApaI-NotI片段。
然后向3μg的人源化抗体表达用载体pKANTEX93中添加10单元的 限制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)和10单元的限制性内切酶NotI， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约2μg的约12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334HVO的NotI-ApaI片段 0.1μg和来自质粒pKANTEX93的NotI-ApaI片段0.1μg加到总量10μl的灭 菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化 大肠杆菌DH5α株，得到图24所示的pKANTEX1334HVO。
然后，向参考例2的1.(3)得到的3μg的质粒pKM1334LVO中添加 10单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶BsiWI，于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg 的约0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶 BsiWI与上述得到的3μg的质粒pKANTEX1334HVO于37℃下反应1小 时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约13.30kb 的EcoRI-BsiWI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334LVO的EcoRI-BsiWI片段 0.1μg和来自质粒pKANTEX1334HVO的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到总 量10μl的灭菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA 溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到图24所示的pKANTEX1334HVOLVO。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪，用得到的质粒 400ng进行碱基序列解析。结果确认得到了目的DNA被克隆的质粒。
另外，用上述参考例2的1.(2)得到的质粒pKM1334HVO和参考例 2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6，用与上述同样的方法构建表达载 体pKANTEX1334HVOLV6。
另外，用上述参考例2的1.(2)得到的质粒pKM1334HV6和参考例 2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6，用与上述同样的方法构建表达载 体pKANTEX1334HV6LV6。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体用YB2/0细胞的稳定表达
分别用上述参考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达 载体pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6、 pKANTEX1334HV6LV6，按照上述参考例1的2.(5)所述的方法通过 YB2/0细胞进行抗FGF-8中和CDR移植抗体的稳定表达。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(2)所述的方法，从参考例2的3.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的YB2/0的转化株的培养和上 清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。将来自导入 pKANTEX1334HVOLVO的转化株的抗体取名为HVOLVO，将来自导 入pKANTEX1334HVOLV6的转化株的抗体取名为HVOLV6，将来自导 入pKANTEX1334HV6LV6转化株的抗体取名为HV6LV6。
5.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例2的4.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
6.通过ELISA进行抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合 活性的测定
在参考例2的4.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8 的结合活性通过上述参考例1的2.(6)所述的ELISA测定。作为阳性对 照使用来自参考例1的3.(2)得到的YB2/0细胞的抗FGF-8中和嵌合抗 体KM1334。结果如图25所示。就象图25所示的那样，无论哪一种抗FGF -8中和嵌合抗体都表现出与KM3334同等的FGF-8结合活性，没有看 到由于CDR移植引起的明显的结合活性的下降。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性的测定
为了对在参考例2的4.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体 对FGF-8的结合活性进行更详细地研究，利用BIAcore 2000[BIACORE 公司生产]，象以下那样对各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8 的结合活性进行测定、比较。作为阳性对照使用来自参考例1的3.(2) 得到的YB2/0细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM1334。
以下作为样品的稀释和测定中的缓冲液使用HBS-EP (BIACORE公司生产)。首先，组装传感器片CM5(BIACORE公司 生产)，通过胺偶合法将用10mmol/L乙酸缓冲液(pH4.0)溶解的 31.25μg/mL的FGF-8(R&D公司生产)固定于传感器片表面。以共 振信号(RU)为指标的固定化量是4498RU。
向FGF-8固定化流动池中以20μL/分的流速，添加60μL的各种抗体 溶液，然后，过3分钟后监测解离反应。解离反应后，连续2次向流动池 中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。 就各种浓度(50-0.068μg/mL)的抗体溶液进行该循环，得到各种浓度 下的传感曲线。各个抗体的传感曲线是通过扣除作为阴性对照使用针对 GD3的嵌合抗体KM871(Shitara K.et al.，Cancer Immunol.Immunother.，36，373-380，1993)得到的传感曲线作为特异的反 应的传感曲线。图25表示50μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲 线所表明的那样，无论哪一种抗体在解离反应中几乎看不到解离，求正 确的解离速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过 比较结合反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。结果如图26 所示，嵌合抗体KM3334表现出最高的结合反应，CDR移植抗体 HVOLV6也表现出与KM3334同等高的结合反应。另外，CDR移植抗体 HVOLVO和CDR移植抗体HV6LV6与KM3334和HVOLV6比较，表现出 低一些的结合反应。以上结果表明用ELISA没有确认的抗体间的结合活 性的比较可以通过BIAcore 2000进行，而且通过VL的FR的6氨基酸残基 的改变，CDR移植抗体的结合活性恢复到与嵌合抗体同等水平。而有关 VH的FR的6氨基酸残基没有看到对应于结合活性恢复的效果。
将来自表现出与嵌合抗体KM3334同等高的结合反应的YB2/0细胞 的CDR移植抗体HVOLV6命名为KM8037，来自高表达KM8037的YB2/0 细胞的转化细胞株也同样命名为KM8037。转化细胞株KM8037于平成 14年6月20日以FERM BP-8084保藏于独立行政法人产业技术综合研 究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番 地中央第6)。
参考例3免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作(1)
参考例2的结果清楚表明VL的FR含有来自小鼠抗体KM1334的6氨 基酸残基的改变的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6表现出与嵌合 抗体同等的结合活性。在此，进一步对6残基的活性恢复的效果进行研 究，象以下那样进行期待具有充分活性，而且来自小鼠抗体的氨基酸残 基少，免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作。
1.VL的氨基酸材料的设计
就上述6氨基酸残基设计具有以下那样改变的6种VL氨基酸序列。 无论哪一种都表现出来自LV.0的氨基酸残基的改变。
在LV.4-1中，将2位的Ile、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 4 个残基分别改变为鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Lys、Val、 Phe。
在LV.4-2中，将序列2位的Ile、14位的Thr、15位的Pro、92位的 Tyr 4个残基分别改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、 Ser、Leu、Phe。
在LV.3-1中，将2位的Ile、51位的Leu、92位的Tyr 3个残基分别改 变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Val、Phe。
在LV.3-2中，将14位的Thr、15位的Pro、92位的Tyr 3个残基分别 改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、Phe。
在LV.2-1中，将51位的Leu、92位的Tyr 2个残基分别改变为小鼠 抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Phe。
在LV.2-2中，将2位的Ile、92位的Tyr 2个残基分别改变为小鼠抗 体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Phe。
序列42～47分别表示LV.4-1、LV.4-2、LV.3-1、LV.3-2、LV.2 -1、LV.2-2的氨基酸序列。
2.编码VL的DNA的构建
象以下那样构建编码参考例3的1.设计的抗FGF-8中和CDR移植 抗体的各种VL的氨基酸序列DNA。
(1)编码LV.4-1的DNA的构建
编码LV.4-1的DNA用由序列38、34、40、41的序列构成的4条合成 DNA(GENSET公司生产)，按照参考例2的1.(3)所述方法进行构建。 结果得到了含有编码LV.4-1的DNA的质粒pKM1334LV4-1。
(2)编码LV.3-1的DNA的构建
以参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6 50ng为模板，以由 M13引物RV和由序列48的碱基序列构成的合成DNA(GENSET公司生 产)作为引物，终浓度为0.3μmol/L，按照KOD聚合酶附带的使用说明 书，总量50μL，首先在94℃加热2分钟后，进行每一循环为94℃15秒钟、 50℃30秒钟、68℃1分钟秒钟的35次循环的PCR。将该反应液进行纯化 后，溶解于灭菌水中，用10单位的限制性内切酶KpnI(宝酒造公司生产) 和10单位的限制性内切酶SpeI，于37℃下反应1小时。将该反应液通过 琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.22kb的KpnI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例3的2.(1)得到3μg的 质粒pKM1334LV4-1于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶 电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.21kb的KpnI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI和10单位的限制性内切酶SpeI 与3μg的质粒pBluescript II SK(-)于37℃下反应1小时。将该反应液通 过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约2.95kb的KpnI-SpeI片段。
然后，将上述得到的VL DNA的KpnI-SpeI片段0.1μg和来自质粒 pKM1334LV4-1的KpnI片段0.1μg，以及来自质粒pBluescript SK(-) 的KpnI-SpeI片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行 连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到了图 27给出的含有编码LV.3-1的DNA的质粒pKM1334LV3-1。
(3)编码LV.2-1的DNA的构建
除了使用参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LVO代替质粒 pKM1334LV4-1以外，利用与参考例3的2.(1)所述方法同样的方法得 到含有编码LV.2-1的DNA的质粒pKM1334LV2-1。
(4)编码LV.2-2的DNA的构建
除了作为引物用序列49的合成DNA代替序列48的合成DNA以外，利 用与参考例3的2.(1)所述方法同样的方法得到含有编码LV.2-2的DNA 的质粒pKM1334LV2-2。
(5)编码LV.4-2的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例参考例3的2.(4)得到的3μg 质粒pKM1334LV2-2于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶 电泳进行分级，回收约2μg的约3.16kb的KpnI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例2的1.(3)得到的3μg 质粒pKM1334LV6于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电 泳进行分级，回收约0.2μg的约0.21kb的KpnI片段。
将上述得到的来自质粒pKM1334LV2-2的KpnI片段0.1μg和来自质 粒pKM1334LV6的KpnI片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株， 得到了图28给出的含有编码LV.4-2的DNA的质粒pKM1334LV4-2。
(6)编码LV.3-2的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶Tth111I(宝酒造公司生产)和Xmn I(New England Biolabs公司生产)与参考例3的2.(5)得到的3μg质粒 pKM1334LV4-2于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳 进行分级，回收约2μg的约2.24kb的Tth111I-Xmn I片段。
然后使10单位的限制性内切酶Tth111I和Xmn I与参考例参考例2的 1.(3)得到的3μg质粒pKM1334LVO于37℃下反应1小时。将该反应液 通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约1μg的约1.11kb的Tth111I-Xmn I片段。
然后，将上述得到的来自质粒pKM1334LV4-2的Tth111I-Xmn I 片段0.1μg和来自质粒pKM1334LVO的Tth111I-Xmn I片段0.1μg加到 总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行连接。用这样得到重组质粒 DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到了图29给出的含有编码LV.3-2 的DNA的质粒pKM1334LV3-2。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
通过用含有在参考例3的2.构建的编码各种VL的DNA的 EcoRI-BsiWI片段置换参考例2的2.得到的含有编码表达载体 pKANTEX1334HVOLV6的DNA的EcoRI-BsiWI片段，构建含有编码各 种VL的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体。具体来说构建 pKANTEX1334HVOLV4-1、pKANTEX1334HVOLV4-2、 pKANTEX1334HVOLV3-1、pKANTEX1334HVOLV3-2、 pKANTEX1334HVOLV2-1、pKANTEX1334HVOLV2-26种。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
分别用上述参考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达 载体pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6和参考例3的 3.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体表达用载体，按照上述参考 例1的2.(4)所述的方法进行FGF-8中和CDR移植抗体在CHO/DG44 细胞的稳定表达。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(1)所述的方法，从参考例3的4.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的CHO/DG4细胞的转化株的 培养和上清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。
将来自导入pKANTEX1334HVOLVO的转化株的抗体取名为 HVOLVO/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV6的转化株的抗体取名为 HVOLV6/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV4-1的转化株的抗体取名为 HVOLV4-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV4-2的转化株的抗体取名为 HVOLV4-2/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-1的转化株的抗体取名为 HVOLV3-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-2的转化株的抗体取名为 HVOLV3-2/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV2-1的转化株的抗体取名为 HVOLV2-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV2-2的转化株的抗体取名为 HVOLV2-2/CHO。
6.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例3的5.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
7.利用BIAcore生物传感器对抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF -8的结合活进行测定
为了对在参考例3的5.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对 FGF-8的结合活性进行更详细地研究，利用BIAcore 2000，用对FGF -8的部分肽化合物1的C末端进行生物素标记的标记化合物，象以下那 样对各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性进行测定、 比较。作为阳性对照使用来自参考例1的3.(1)得到的CHO/DG44细胞 的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034。
以下作为样品的稀释和测定中的缓冲液使用HBS-EP。首先，组装 传感器片SA(BIACORE公司生产)，以5μL/min的流速添加5μL的制备 成0.05μg/mL的C末端标记生物素的标记化合物1，然后，连续2次添加 5μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，将片洗净。FGF-8肽的 固定化量是35RU。
以20μL/分的流速，向FGF-8固定化流动池中添加60μL的各种抗体 溶液，然后，过3分钟后监测解离反应。解离反应后，连续2次向流动池 中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。 就各种浓度(50-1.85μg/mL)的抗体溶液进行该循环，得到各种浓度 下的传感曲线。各个抗体的传感曲线是通过扣除作为阴性对照使用针对 GD3的嵌合抗体KM871得到的传感曲线作为特异的反应的传感曲线。
图30表示16.7μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲线所表明 的那样，无论哪一种抗体在解离反应时几乎看不到解离，求正确的解离 速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过比较结合 反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。
结果如图30所示，嵌合抗体KM3034和HVOLV6/CHO表现出最高 的结合反应，其次，HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2 -1/CHO也表现出高的结合反应。而HVOLV3-2/CHO、HVOLV2- 2/CHO、HVOLV4-2/CHO表现出低的结合反应，HVOLVO/CHO表现 出最低的结合反应。这些结果与用参考例2的7.所述的来自YB2/0细胞的 CDR移植抗体的结果一致。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的中和活性的测定
按照参考例2的5项所述的方法对在参考例3的7项中对FGF-8有 高的结合反应的4种抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO、 HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2-1/CHO的FGF-8 中和活性进行评价。作为阳性对照使用参考例1的3项(1)得到的来自 CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034，作为阴性对照使用 W001/64754所述的针对人趋化因子CCR4的嵌合抗体KM2760。结果如 图31所示。就象图31所示的那样，HVOLV6/CHO表现出与嵌合抗体 KM3034同等的FGF-8中和活性，其次HVOLV3-1/CHO也表现出高 的FGF-8中和活性。HVOLV4-1/CHO与HVOLV3-1/CHO相比，表 现出比较低的FGF-8中和活性，HVOLV2-1/CHO的FGF-8中和活性 最低。确认FGF-8中和活性的强弱与利用BIAcore的结合反应的强弱之 间存在相关性。
参考例4.免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作(2)
参考例3的结果清楚表明LV6的6个氨基酸残基的改变中，51位的改 变对于活性恢复是必需的。另外还暗示了2位的改变如果单独改变，对 活性恢复的效果小，而通过与51位的改变组合，协同地对活性恢复有贡 献。对于14位、15位的改变也表明通过与51位的改变的组合协调对活性 恢复有贡献。另外，暗示了50位的改变效果小。在此为了对2位的改变 和14位、15位的改变的哪一个对活性恢复的效果是否更高进行研究，另 外为了对92位的改变的效果进行研究，对抗FGF-8中和CDR移植抗体 的制作再进行研究。
1.VL的氨基酸序列的再设计
设计具有以下那样改变的2种VL氨基酸序列。无论哪一种都表现出 来自LV.0的氨基酸残基的改变。
在LV.4-3中，将14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu、92位的Tyr 4个残基分别改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、 Val、Phe。
在LV.3-3中，将14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu 3个残基分别 改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、Val。
序列50表示LV.4-3的氨基酸序列，而序列表示51LV.3-3的氨基酸 序列。
2.编码VL的DNA的构建
象以下那样构建编码参考例4的1.设计的抗FGF-8中和CDR移植 抗体的各种VL的氨基酸序列DNA。
(1)编码LV.4-3的DNA的构建
按照参考例3的2.(5)所述方法构建。但是，用参考例3的2.(3) 得到的质粒pKM1334LV2-1代替质粒pKM1334LV2-2，用参考例3的2. (6)得到的质粒pKM1334LV3-2代替质粒pKM1334LV6。结果得到了 含有编码LV.4-3的DNA的质粒pKM1334LV4-3。
(2)编码LV.3-3的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶BamHI和10单位的限制性内切酶SpeI与 3μg参考例4的2.(1)得到的质粒pKM1334LV4-3于37℃下反应1小时。 将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2.5μg的约3.23kb的 BamHI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶BamHI和10单位的限制性内切酶 SpeI与3μg的参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LVO于37℃下反应1小 时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.15μg的约0.13kb 的BamHI-SpeI片段。
然后，将上述得到的质粒pKM1334LV4-3的BamHI-SpeI片段0.1μg 和来自质粒pKM1334LVO的BamHI-SpeI片段0.1μg加到总量10μl的灭 菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化 大肠杆菌DH5α株，得到了图32给出的含有编码LV.3-3的DNA的质粒 pKM1334LV3-3。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
通过用含有在参考例4的2.构建的编码各种VL的DNA的 EcoRI-BsiWI片段置换参考例2的2.得到的含有编码表达载体 pKANTEX1334HVOLV6的VL的DNA的EcoRI-BsiWI片段，构建含有编 码各种VL的DNA的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体。具体来说
构建pKANTEX1334HVOLV4-3、pKANTEX1334HVOLV3-3这2 种载体。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
用上述参考例4的3.得到的各种抗FGF-8中和移植抗体表达载体， 按照上述参考例1的2.(4)所述的方法进行各种FGF-8中和CDR移植 抗体在CHO/DG44细胞的稳定表达。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(1)所述的方法，从参考例4的4.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的CHO/DG4细胞的转化株的 培养和上清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。将来自导入 pKANTEX1334HVOLV4-3的转化株的抗体取名为HVOLV4- 3/CHO，将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-3的转化株的抗体取名 为HVOLV3-3/CHO。
6.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例4的5.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性的测定
按照参考例3的7.所示的方法，对参考例3的5.得到的抗FGF-8中 和CDR移植抗体HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、参考例4的5.得到 的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO和HVOLV3- 3/CHO对FGF-8的结合活性进行测定。作为阳性对照使用来自参考例1 的3.(1)得到的CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034。
图33表示16.7μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲线所表明 的那样，无论哪一种抗体在解离反应中几乎看不到解离，求正确的解离 速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过比较结合 反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。结果就象图33所表示的 那样，嵌合抗体KM3034表现出最高的结合反应，其次，HVOLV4- 3/CHO比HVOLV3-1/CHO还高、表现出与HVOLV6/CHO同等的结合 反应。而HVOLV3-3/CHO比HVOLV3-1/CHO更低。以上结果表明有 关结合反应的强弱，比起2位的改变，14位、15位的改变更协调地起作 用，另外92位的改变对于活性的恢复是必需的。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗体的对FGF-8的中和活性的测定
按照参考例2的5项所述的方法对在参考例3的5中得到的抗FGF-8 中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、参考例4的5中 得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO和HVOLV3- 3/CHO的FGF-8中和活性进行评价。作为阳性对照使用参考例1的3项 (1)得到的来自CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034， 作为阴性对照使用W001/64754所述的针对人趋化因子CCR4的嵌合抗 体KM2760。结果如图34所示。就象图34所表示的那样，HVOLV6/CHO 和HVOLV3-1/CHO表现出与嵌合抗体KM3034同等的FGF-8中和活 性。而HVOLV4-3/CHO和HVOLV3-3/CHO表现出同等的中和活性， 其活性是嵌合抗体KM3034的1/2左右。HVOLV3-1/CHO和HVOLV4 -3/CHO的FGF-8中和活性与由BIAcore引起的结合反应的强弱不相 关，2位的氨基酸残基和14位、15位的氨基酸残基在对FGF-8的结合活 性和对细胞的FGF-8中和活性中给予独立的影响。
通过以上的各种评价结果，将表现出与嵌合抗体KM3034同等的高 结合反应和FGF-8中和活性的CHO/DG4细胞由来的CDR移植抗体 HVOLV6/CHO命名为KM8034，而来自高表达KM8034的CHO/DG4细 胞的转化细胞克隆也同样命名为KM8034，将表现出与KM8034同等的 高结合反应的CHO/DG4细胞的CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO命名为 KM8035，而来自高表达KM8035的CHO/DG4细胞的转化细胞株也同样 命名为KM8035。序列38给出了KM8035的VL的氨基酸序列LV.4-3。 转化细胞株KM8035于平成14年6月20日以FERM BP-8082保藏于独立 行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国 茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。将表现出与KM8034同等的高 FGF-8中和活性的CHO/DG4细胞由来的CDR移植抗体HVOLV3- 1/CHO命名为KM8036，而来自高表达KM8036的CHO/DG4细胞的转化 细胞克隆也同样命名为KM8036。序列39给出了KM8036的VL的氨基酸 序列LV.3-1。转化细胞株KM8036于平成14年6月20日以FERM BP- 8083保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305 -8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
抗FGF-8中和CDR移植抗体KM8034表现出与嵌合抗体KM3034 同等的高结合反应和FGF-8中和活性，而且，在人的免疫原性比嵌合 抗体更低，所以预期治疗效果比嵌合抗体更高。就抗FGF-8中和CDR 移植抗体KM8036和KM8035来说，与KM8034相比，结合活性和FGF- 8中和活性可能低一些，由于各个来自小鼠抗体KM1334的V区FR的氨基 酸残基变成了3残基和4残基，所以预期免疫原性比KM8034更低。
本发明提供作为有效成分含有抗FGF-8中和抗体的关节炎预防药 或治疗药、软骨保护剂、关节破坏抑制剂、滑膜增殖抑制剂、以及作为 有效成分含有抗FGF-8中和抗体的关节炎诊断药和使用该抗体的关节 炎的判定方法。
序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>关节炎的治疗药
<130>1442
<150>JP2001-400677
<151>2001-12-28
<160>51
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>420
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<223>发明人：田村忠史；内井雅子；须田敏郎
发明人：三木一郎；田中亨
<220>
<221>来源
<222>(1)..(420)
<223>/生物＝″小家鼠″
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(420)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>1
atg gaa tgg atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt 48
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc tac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga gct gag gtg gcg agg 96
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
ccc ggg gct tca gtg aaa ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
act gac tac tat cta aac tgg gtg aag cag agg tct gga cag ggc ctt 192
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga gag att gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat 240
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
gaa aac ttg gag ggc agg gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat ttc tgt gca aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc 384
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca 420
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210>2
<211>140
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>2
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210>3
<211>393
<212>DNA
<213>小家鼠
<220>
<221>来源
<222>(1)..(393)
<223>/生物＝″小家鼠″
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(393)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>3
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
tcc agg agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agt ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
gta cat agt aat gga aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cct 192
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tca cca aag gtc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga att tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
ttt cag ggt tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210>4
<211>131
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>4
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210>5
<211>121
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
115 120
<210>6
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>6
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>7
Asp Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>8
Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Glu
1 5 10 15
Gly
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>9
Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr
1 5 10
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>11
Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>12
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VH的扩增的引物
<400>13
ctgaattcgc ggccgctagt cc 22
<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VH的扩增的引物
<400>14
atgggccctt ggtggaggct gtagagacag tgaccagag 39
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VL的扩增的引物
<400>15
ctgaattcgc ggccgctgct gt 22
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VL的扩增的引物
<400>16
atcgtacgtt ttatttccag cttggtcc 28
<210>17
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>C末端附加半胱氨酸残基的人FGF-8的肽(23～46的氨基酸残基)
<400>17
Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr Gln His Val Arg Glu
1 5 10 15
Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Cys
20 25
<210>18
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列、HV.0
<400>18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>19
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.0
<400>19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>20
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列、HV.6
<400>20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>21
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.6
<400>21
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>22
<211>504
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码HV.0的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(466)
<220>
<221>信号肽
<222>(47)..(103)
<400>22
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55
Met Glu Trp
atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103
Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser
-15 -10 -5 -1
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag ccc ggg gcc 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
tat cta aac tgg gtg cgg cag gcc ccc gga caa ggg ctt gag tgg atg 247
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 391
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
agtcgtgact gggaaaac 504
<210>23
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>23
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60
gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120
gtctggggct gaggtgaaga a 141
<210>24
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>24
aggatcgatc tctcccatcc actcaagccc ttgtccgggg gcctgccgca cccagtttag 60
atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120
cttcttcacc tcagccccag a 141
<210>25
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>25
ggatgggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60
gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120
gatctgagga cacggccgtg t 141
<210>26
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>26
gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60
ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagtaa 120
tacacggccg tgtcctcaga t 141
<210>27
<211>504
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码HV.6的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(466)
<220>
<221>信号肽
<222>(47)..(103)
<400>27
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55
Met Glu Trp
atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103
Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser
-15 -10 -5 -1
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg gcg agg ccc ggg gcc 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
tat cta aac tgg gtg cgg cag agg tct gga caa ggg ctt gag tgg att 247
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat ttc tgt 391
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
agtcgtgact gggaaaac 504
<210>28
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>28
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60
gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120
gtctggggct gaggtggcga g 141
<210>29
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>29
aggatcgatc tctccaatcc actcaagccc ttgtccagac ctctgccgca cccagtttag 60
atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120
cctcgccacc tcagccccag a 141
<210>30
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>30
ggattggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60
gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120
gatctgagga cacggccgtg t 141
<210>31
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>31
gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60
ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagaaa 120
tacacggccg tgtcctcaga t 141
<210>32
<211>459
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码LV.0的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(432)
<220>
<221>信号肽
<222>(40)..(96)
<400>32
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54
Met Lys Leu Pro Val
-15
agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat atc 102
Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Ile
-10 -5 -1 1
gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg 150
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro
5 10 15
gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198
Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
20 25 30
aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca cag 246
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
35 40 45 50
ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg
55 60 65
ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
70 75 80
gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat tac tgc ttt cag ggt tca cat 390
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His
85 90 95
gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459
<210>33
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>33
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60
ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgata tcgtgatgac tcagtctcca 120
ctctccctgc 130
<210>34
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>34
agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60
actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca ggggtgacgg gcagggagag 120
tggagactga 130
<210>35
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>35
tgcagaagcc aggccagtct ccacagctcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60
gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120
gggtggaggc 130
<210>36
<211>129
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>36
gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60
gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagta ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120
gctgatttt 129
<210>37
<211>459
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码LV.6的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(432)
<220>
<221>信号肽
<222>(40)..(96)
<400>37
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54
Met Lys Leu Pro Val
-15
agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat gtt 102
Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Val
-10 -5 -1 1
gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc agt ctt gga gag ccg 150
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Glu Pro
5 10 15
gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198
Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
20 25 30
aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aag 246
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
35 40 45 50
gtc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294
Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg
55 60 65
ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
70 75 80
gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat ttc tgc ttt cag ggt tca cat 390
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly Ser His
85 90 95
gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
120 125 130
cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459
<210>38
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>38
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60
ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgatg ttgtgatgac tcagtctcca 120
ctctccctgc 130
<210>39
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>39
agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60
actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca agactgacgg gcagggagag 120
tggagactga 130
<210>40
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>40
tgcagaagcc aggccagtct ccaaaggtcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60
gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120
gggtggaggc 130
<210>41
<211>129
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>41
gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60
gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagaa ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120
gctgatttt 129
<210>42
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-1
<400>42
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>43
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-2
<400>43
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>44
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-1
<400>44
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>45
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-2
<400>45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>46
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.2-1
<400>46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.2-2
<400>47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.3-1的DNA的构建的引物
<400>48
atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acaggtcct 39
<210>49
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.2-2的DNA的构建的引物
<400>49
atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acagctcct 39
<210>50
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-3
<400>50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>51
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-3
<400>51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
实施例1兔软骨细胞的FGF-8引起的细胞外基质的分解和抗体引 起的抑制
兔关节软骨细胞是按照田村等人的方法(Tamura T.et al.，Eur.J.Pharmacol.，419，269-274，2001)从3周龄的雌性新西兰白兔的两 膝和肩分离培养的。即摘出两膝关节和两肩关节，採取骨端软骨。用磷 酸缓冲生理盐水洗净后，将软骨切碎，通过在含有0.4％肌动蛋白酶(ア クチナ-ゼ)E的添加10vol％FBS的DMEM(以下将含有FBS的DMEM 记为FBS/DMEM)中，37℃下处理1小时，再在含有0.025w/v％的胶原 酶P的添加10vol％FBS的DMEM中，37℃下处理5～6小时，将软骨细胞 从软骨组织中分离出来、採取。将採取的软骨细胞悬浮于10vol％ FBS/DMEM，调整到100,000个/mL。将含有该软骨细胞的培养液接种 到24孔板的各个孔中，每孔1mL，然后在5％CO2-95％空气气相下于 37℃下进行培养。在软骨细胞达到铺满程度后，将培养液置换成0.5vol ％FBS/DMEM，培养24小时。除去培养液，添加1mL的0.5vol％ FBS/DMEM(无刺激组)，或含有FGF-8[1、10或100ng/mL；Peprotech 公司生产]的0.5vol％FBS/DMEM后培养48小时。在研究抗FGF-8中和 抗体的作用时，添加1mL含有FGF-8(100ng/mL)的0.5vol％ FBS/DMEM(0组)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗 体KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol％FBS/DMEM后培养48小时。 除去培养液，通过二甲基亚甲基法(DMMB)(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161103-108，1987)对残留在板上的细胞外基质的葡萄 糖胺聚糖量进行测定。即，向加入5mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐-水和 物后活化的保存用番木瓜蛋白酶缓冲液(0.1mol/L乙酸钠、50mmol//L EDTA、pH5.8)加入终浓度为20μg/mL的番木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich 公司生产)，将该液添加到培养上述软骨细胞的板的各个孔中，每孔 1mL，于60℃下消化过夜。向75μL的该消化液添加25μL盐酸胍缓冲液 (2.88mol/L盐酸胍、50mmol/L乙酸钠、pH6.8)和200μL DMMB溶液， 测定530/590nm的吸光度。由作为标准使用的硫酸软骨素(来自鲸的软 骨，生化学工业公司生产)的吸光度算出各个样品的葡萄糖胺聚糖的浓 度。实验在各个条件下都进行了3例，求平均值和标准误差。
图1和图2给出了算出的结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以使细 胞外基质中的葡萄糖胺聚糖残存量显著地降低(图1)。
这表明FGF-8具有促进细胞外基质的分解的作用。另外，抗FGF -8中和抗体KM1334在3μg/mL以上的抗体浓度下对FGF-8促进软骨 的细胞外基质的分解显著地抑制(图2)。因此通过给予抗FGF-8中和 抗体可以抑制关节炎的细胞外基质的分解。
实施例2 FGF-8促进兔软骨细胞的细胞外基质金属蛋白激酶3的产 生和抗体引起的抑制
兔关节软骨细胞是按照实施例1所述方法分离培养的。在软骨细胞 达到铺满程度后，将培养液置换成0.5vol％FBS/DMEM，培养24小时。 除去培养液，添加1mL的0.5vol％FBS/DMEM(无刺激组)，含有FGF -8(100ng/mL)的0.5vol％FBS/DMEM(0组)、或含有FGF-8 (100ng/mL)和抗FGF-8中和抗体KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol ％FBS/DMEM后培养48小时。48小时后，回收培养液，用兔细胞外基 质金属蛋白激酶3 ELISA系统(Amersham·Biosciences公司生产)测定 培养液中的细胞外基质金属蛋白激酶3浓度。实验在各个条件下都进行 了3例，求平均值和标准误差。
图3给出了实验结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以使来自软骨 细胞的细胞外基质金属蛋白激酶3量显著地增加(无刺激组对0组、P＝ 0.0079)。这表明FGF-8通过来自软骨细胞的细胞外基质金属蛋白激酶 3的产生诱导具有促进细胞外基质的分解的作用。另外，抗FGF-8中和 抗体KM1334在1μg/mL以上的抗体浓度下对FGF-8促进软骨细胞的细 胞外基质金属蛋白激酶3的产生显著地抑制(图2)。抗FGF-8中和抗 体KM1334的1、3或10μg/mL的抑制率分别为72、74、100％。因此通过 给予抗FGF-8中和抗体可以抑制来自软骨细胞的细胞外基质金属蛋白 激酶3的产生，抑制关节炎的细胞外基质的分解。
实施例3 FGF-8促进兔滑膜细胞的增殖和抗体产生的抑制
兔关节滑膜细胞是按照Hamilton等人的方法(Hamilton J.and Slywka J.，J.Immunol.126，851-855，1981)採集。将分离的滑膜细胞悬浮 于含有10vol％FBS的RPMI 1640培养基(以下将含有FBS的RPMI 1640 培养基记为FBS/RPMI 1640培养基)，每10,000个接种到96孔的培养板 中，培养24小时后，除去各个孔的培养液，添加200μL的0.2vol％ FBS/RPMI 1640(无刺激组)，或含有FGF-8(1、10或100ng/mL)的 0.2vol％FBS/RPMI 1640。当研究抗FGF-8中和抗体的作用时，向各个 孔添加200μL含有FGF-8(100ng/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640(0 组)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗体KM1334(0.1、 0.3、1、3或10μg/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640。培养48小时后，每 孔添加9.25kBq的[3H]胸腺嘧啶。再培养24小时，用液相闪烁计数器 (1205β板，Perkin Elmer Life scence日本)测定整合到细胞内的[3H] 胸腺嘧啶的放射性活性。实验在各个条件下都进行了6例，求平均值和 标准误差。
图4和图5给出了实验结果。FGF-8在100ng/mL浓度下可以有意义 地促进[3H]胸腺嘧啶向兔滑膜细胞的整合(图4)。这表明FGF-8具有 促进兔滑膜细胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗体KM1334在 3μg/mL以上的抗体浓度下对依赖FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促进 显著地抑制(图5)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体可以抑制关节炎 的滑膜的增殖。
实施例4 FGF-8促进人滑膜细胞的增殖和抗体产生的抑制
使用关节风湿病患者的人滑膜细胞(由东洋纺购入)，进行与实施 例3同样的实验。FGF-8的浓度为10、100或500ng/mL，与抗FGF-8 中和抗体KM1334共存的FGF-8浓度调整到500ng/mL。实验在各个条 件下都进行了6例，求平均值和标准误差。
图6和图7给出了实验结果。FGF-8在500ng/mL浓度下可以显著 地促进[3H]胸腺嘧啶向人滑膜细胞的整合(图6)。这表明FGF-8具有 促进人滑膜细胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗体KM1334在 1μg/mL以上的抗体浓度下对依赖FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促进 显著地抑制(第7图)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体可以抑制关节 炎的滑膜的增殖。
实施例5使用抗FGF-8抗体的滑膜染色
从人关节风湿病患者摘出滑膜，按照文献的方法(Tanaka A.et al，Cancer Res.58，2053-2056，1998)，制作石蜡切片，用抗FGF-8抗体 KM1334进行组织免疫染色。结果4例人关节风湿病中有3例的滑膜细胞 中FGF-8呈阳性。因此，可以确认FGF-8存在于人滑膜中。另外通过 使用抗FGF-8抗体检测人关节风湿病的滑膜细胞，可以判定人关节风 湿病。
实施例6由关节内注入FGF-8而诱发的关节炎
用FGF-8，象以下那样诱发Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周 龄、日本チヤ-ルス·リバ-公司)关节炎样病症。使用生理盐水(大塚 制药工厂公司生产)终浓度为1mg/mL那样地制备的50μL FGF-8注入 到大鼠膝关节内。另外，建立向膝关节内注入50μL生理盐水的对照组。 一组3只。注入FGF-8或生理盐水3天后，按照Yamada等人的方法 (Yamada A.et al.，Inflamm.Res.，49，144-146，2000)，用含有0.38％w/v 柠檬酸钠的生理盐水30μL洗膝关节包内，回收洗净液。该操作重复进行 10次，回收300μL的关节洗净液。按照实施例1所述的DMMB法测定关 节洗净液中的葡萄糖胺聚糖的量。另外，将膝关节的膝盖骨取出，按照 实施例1所述的方法用番木瓜蛋白酶消化软骨部分，测定硬骨的重量。
图8和图9给出了实验结果。图8表示关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖 的浓度。由于注入FGF-8，关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖的浓度比注 入生理盐水组上升1.9倍(P＝0.0034)。这表明由于FGF-8的注入，关 节软骨的细胞外基质分解亢进。图9表示番木瓜蛋白酶消化后的膝盖骨 重量。由于FGF-8的注入，膝盖骨的重量下降到注入生理盐水组的40 ％(P＝0.0454)。这表明由于FGF-8的注入，膝盖骨的破坏亢进。因 此，FGF-8在生物体内诱导关节破坏，引起关节炎那样的症状。
实施例7用小鼠·胶原关节炎模型的评价
小鼠·胶原关节炎模型用DBA/1J系小鼠(雄性、7周龄、日本チヤ- ルス·リバ-公司)，按照鎌田等人的方法(Kamada H.et al.，Jpn.J.Pharmacol.，70，169-175，1996)象以下那样制作。
将来自牛软骨的II型胶原溶液(胶原技术研修公司生产)在冰冷下 与付氏完全佐剂(ヤトロン公司生产)混合，使其形成乳剂，将II型胶 原的终浓度调整到1.5mg/mL，然后将调整后的乳剂100μL注射到鼠的尾 根部皮内，进行致敏，再于21天后，按照同样操作进行追加免疫。一组 10只。对于给予KM1334组，用生理盐水(大塚制药工厂公司生产)将 抗FGF-8抗体KM1334溶解，使终浓度为2mg/mL，于从上述小鼠·胶原 关节炎模型的初次致敏开始后的第21、25、28、32、35和39天，1天1次 地向各个个体腹腔内给药200μL。另外对于给予生理盐水对照组，代替 抗FGF-8抗体KM1334溶液，只向腹腔内注入生理盐水。而作为阳性对 照，对于给予双氯芬酸组，将非甾体抗炎药双氯芬酸钠(Sigma Aldrich 公司生产)溶解于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为0.3mg/mL，于 从上述小鼠·胶原关节炎模型的初次致敏开始后的第21、25、28、32、35 和39天，1天1次地按照每100g体重1mL经口给药。另外预设未处置组， 不进行胶原致敏和给药。胶原关节炎中的全肢浮肿的随时间变化用一肢 0到4分、全肢合计最高16分的记分评价。记分基准为0：正常；1：发现 弱红斑，2：发现弱肿胀和红斑，3：发现强肿胀和红斑，通过触知发现 温感，4：发现随着手指变形引起显著的肿胀。
图10给出了实验结果。在给予抗FGF-8抗体KM1334组，在第42 天确认34％(P＝0.0204)的显著的关节炎记分的抑制，其抑制程度与 阳性对照的给予双氯芬酸组同等程度(图10)。这表明通过给予抗FGF -8中和抗体，可以抑制关节炎。
实施例8用大鼠·佐剂关节炎模型的评价
大鼠·佐剂关节炎模型用Lewis系大鼠(雌性、8周龄、日本チヤ-ル ス·リバ-公司)，按照Pearson等人的方法(Pearson CM.et al.，Arth.Rheum.，5，654-658，1962)象以下那样制作。
将Mycobacterium butyricum(デイフコ公司生产)悬浮于液体石 蜡(和光纯药工业公司生产)，终浓度为6mg/mL，高压灭菌，然后将 灭菌后的溶液100μL注射到大鼠的右侧足蹠部皮内，进行致敏。一组8～ 10只。对于给予KM1334组，用生理盐水将抗FGF-8抗体KM1334溶解， 使终浓度为2mg/mL，于从上述大鼠·佐剂关节炎模型的致敏日以及致敏 开始后的第3、7、10、14和17天，1天1次地向各个个体腹腔内给药 0.5mLμL。另外对于给予生理盐水组，代替抗FGF-8抗体KM1334溶液 只向腹腔内注入生理盐水。而作为阳性对照，对于给予双氯芬酸组，将 消炎药双氯芬酸钠溶解于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为 0.3mg/mL，于从佐剂致敏日开始后的第4、从7开始的11天、从14开始 的第18天，1天1次地按照每100g体重1mL经口给药。对于给予甲氨蝶呤 组，将作为代谢拮抗药的注射用甲氨蝶呤R50mg(日本ワイスレダリ- 公司生产)悬浮于0.5w/v％甲基纤维素溶液中，终浓度为0.01mg/mL， 象与双氯芬酸组同样那样给药。对于氢化泼尼松给予组，将作为甾体类 药氢化泼尼松(Sigma-Aldrich公司生产)悬浮于0.5w/v％甲基纤维素溶 液中，终浓度为0.3mg/mL，象双氯芬酸组那样给药。另外作为溶剂给 予组，同样经口只给予0.5w/v％甲基纤维素溶液。另外预设未处置组， 进行Mycobacterium butyricum致敏和给药。佐剂处置足和非处置足的 容积用大鼠后肢足浮肿测定装置(TK-101、ユニコム公司生产)随时 间进行测定。
图11和图12给出了致敏后第21天的测定结果。在抗FGF-8中和抗 体KM1334给予组，于佐剂非处置足可以看到69％(P＝0.0010)的显著 的足容积增加的抑制(图11)。在双氯芬酸给予组可以看到45％ (P＜0.0001)，在甲氨蝶呤给予组可以看到90％(P＜0.0001)，在氢化 泼尼松给予组可以看到51％(P＝0.0029)的显著的足容积增加的抑制 (图12)。即，抗FGF-8中和抗体KM1334表现出比双氯芬酸或氢化泼 尼松高的浮肿抑制作用。
用致敏开始后第20天至第21天24小时蓄尿，测定尿中的葡萄糖胺聚 糖、脱氧吡啶啉、羟脯氨酸以及肌酸酐。尿中的葡萄糖胺聚糖量按照实 施例1所述的DMMB法进行测定。尿中羟脯氨酸量按池田等人方法(池 田真悟等，东京卫研年报.36，277-282，1985)进行测定。即，向0.8mL 尿中添加0.8mL氨基酸分析用盐酸(关东化学公司生产)，于110℃下水 解15小时。向水解的样品0.5mL添加2mL的1.2mol/L的氢氧化钠溶液， 进行中和。向0.5mL中和处理的样品中添加1mL异丙醇，添加 1mLOxidant溶液后充分搅拌，于室温下静置5分钟。Oxidant溶液是将 醋酸钠3水和物5.7g、柠檬酸三钠2水和物3.75g、柠檬酸一水和物0.602g 溶解于约50mL蒸馏水中，加38.5mL异丙醇，再加蒸馏水，成为100mL 的醋酸柠檬酸缓冲液，使用时将该缓冲液与用蒸馏水配制的7w/v％氯胺 T溶液(对甲苯磺氯酰胺钠三水和物，和光纯药工业公司生产)按照4∶1 比例充分混合后的溶液。然后添加1mL Ehrlich试剂，充分搅拌，于恒 温器中于60℃，加热20分钟。Ehrlich试剂是将17.6g的p-二甲基氨基苯 醛(和光纯药工业公司生产)溶解于20.9mL的过氯酸(关东化学公司生 产)，加异丙醇做成100mL的溶液。加温后，用流水冷却，测定562nm 的吸光度。用L-羟脯氨酸(和光纯药工业公司生产)的吸光度做成的 检量线，算出各个样品的羟脯氨酸浓度。尿中的脱氧吡啶啉量用オステ オリンクス「DPD」(住友制药公司生产)测定。尿中的肌酸酐量用肌 酸酐测试和光(和光纯药工业公司生产)检测。由于要对个体间的尿浓 度的差进行修正，对于每个个体算出葡萄糖胺聚糖浓度/肌酸酐浓度、 脱氧吡啶啉浓度/肌酸酐浓度、或羟脯氨酸浓度/肌酸酐浓度的比，作为 各自的指标。
图13到图17给出了实验结果。尿中的葡萄糖胺聚糖量在生理盐水给 予组上升到未处置组的2.2倍(P＜0.0001)(图13)。这表明随着关节 炎的进展，软骨破坏亢进。在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于 尿中的葡萄糖胺聚糖量的上升，可以看到73％(P＝0.0064)的显著的 抑制(图13)。在给予甲氨蝶呤组，可以看到对尿中的葡萄糖胺聚糖量 的上升的79％(P＝0.0465)的显著的抑制。虽然不显著，但在双氯芬 酸给予组可以看到40％，在氢化泼尼松给予组可以看到18％的尿中的葡 萄糖胺聚糖量的降低(图14)，即，抗FGF-8中和抗体KM1334显示出 与甲氨蝶呤同等程度的软骨破坏抑制作用。
尿中的脱氧吡啶啉量在生理盐水给予组上升到未处置组的1.8倍(P ＜0.0001)(图15)。这表明随着关节炎的进展，软骨破坏亢进。在给 予抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于尿中的脱氧吡啶啉量的上升，可 以看到41％(P＝0.0185)的显著的抑制。在双氯芬酸给予组可以看到 88％(P＝0.0016)的显著的尿中的脱氧吡啶啉量上升的抑制。虽然不 显著，但在给予甲氨蝶呤组，可以看到34％，在氢化泼尼松给予组可以 看到38％的脱氧吡啶啉量的降低(图16)。即，抗FGF-8中和抗体 KM1334显示出超过甲氨蝶呤和氢化泼尼松的骨破坏抑制作用。
尿中的羟脯氨酸量在生理盐水给予组上升到未处置组的1.8倍(P ＝0.0002)(图17)。这表明随着关节炎的进展，骨破坏亢进。在给予 抗FGF-8中和抗体KM1334组，对于尿中的羟脯氨酸量的上升，虽然不 显著，但可以看到48％的降低。
在致敏后第21天，在胫骨骨干部切断佐剂非处置足，採集，用10vol ％磷酸缓冲液福尔马林溶液固定。然后，用软X射线发生装置 SOFRONSRO-M50(ソフロン公司生产)，于29kV、4mA、2分钟的 条件下拍摄软X射线照片。用实体显微镜观察照片，对骨破坏打分。打 分是通过观察有无踵骨(一边作为1个部位，合计5个部位)的骨糜烂， 有糜烂为1分，没有为0分，一肢最高为5分来进行。
第1表和第2表给出了打分结果。值表示平均值±标准误差，*表示 P＜0.05、**表示P＜0.01，***表示P＜0.001(溶剂给予组对比，Wilcoxon 顺位和检测)。
第1表
给予组 骨破坏打分 (抑制率)
未处置组 0.0±0.0 -
生理盐水 4.4±0.3 -
KM1334 3.2±0.5 27％
第2表
给予组 骨破坏打分 (抑制率)
未处置组 0.0±0.0 -
溶剂 4.6±0.3 -
双氯芬酸 3.1±0.6* 33％
甲氨蝶呤 0.9±0.4*** 80％
氢化泼尼松 1.8±0.7** 61％
在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，虽然不显著，但可看到骨破 坏打分的27％降低(第1表)。在双氯芬酸给予组可以看到33％(P＝ 0.0362)、在给予甲氨蝶呤组，可以看到80％(P＝0.0006)，在氢化泼 尼松给予组可以看到61％(P＝0.0032)骨破坏打分降低(第2表)。即， 抗FGF-8中和抗体KM1334显示出与双氯芬酸同等程度的骨破坏打分 降低。
制作福尔马林固定的佐剂非处置足的石蜡切片。进行苏木精/伊红 染色，对从胫骨到中足骨的骨、关节和关节周围区域进行组织病理学评 价。对于向关节周围组织或关节腔的血浆漏出通过一肢0到4分的打分进 行评价。打分的基准为0：没有变化，1：发现极轻度的变化，2：发现 轻度变化，3：发现中等程度变化，4：发现重度变化。
第3表给出了结果。值表示平均值±标准误差，*表示P＜0.05、**表 示P＜0.01(生理盐水给予组对比，Wilcoxon顺位和检测)。
第3表
给予组 病理打分
向关节周围 (抑制率) 向关节腔的 (抑制率)
的血液漏出 血细胞和血
浆漏出
未处置 0.0±0.0 - 0.0±0.0
生理盐水 3.4±0.2 - 2.7±0.2
KM1334 2.0±0.4** 41％ 1.6±0.3* 41％
在给予抗FGF-8中和抗体KM1334组，可以看到血浆向关节周围组 织的漏出降低41％(P＝0.0022)、血细胞和血浆向关节腔的漏出降低 41％(P＝0.0156)(第3表)。因此通过给予抗FGF-8中和抗体，可 以抑制关节炎中的浮肿形成，和软骨以及骨破坏。
实施例9用小鼠·一碘代乙酸诱发变形性关节炎模型的评价
小鼠·佐剂关节炎模型用Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周龄、 日本チヤ-ルス·リバ-公司)，按照Guingamp等人的方法(Guingamp C.et al.，Arthritic Rheum.，40，1670-1679，1997)象以下那样制作。
用生理盐水配制终浓度为10mg/mL的一碘代乙酸(Sigma Aldrich 公司生产)，将25μL配制的一碘代乙酸注入大鼠的右膝关节内。一组10 只。对于KM1334给予组，用生理盐水(大塚制药工厂公司生产)溶解 抗FGF-8中和抗体，使终浓度为4mg/mL，在注入一碘代乙酸时，每100g 体重向腹腔内一次注入0.5mL。而对于生理盐水组，取代抗体溶液，只 向腹腔内注入生理盐水。另设置假手术组，将生理盐水注入膝关节内， 不给药。一碘代乙酸注入3日后，按照实施例6所述的方法，回收关节洗 净液。用实施例1所述的DMMB法测定关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖量。
图18给出了测定结果。由于一碘代乙酸的注入，关节洗净液中的葡 萄糖胺聚糖浓度上升到假手术组的1.6倍(P＝0.0014)。这表明由于一 碘代乙酸注入，关节软骨的细胞外基质分解亢进。对于由于一碘代乙酸 注入使得关节洗净液中的葡萄糖胺聚糖浓度上升，在抗FGF-8中和抗 体给予组，可以看到42％(P＝0.0188)的有意义的抑制。因此，通过 给予抗FGF-8中和抗体，可以抑制关节炎中的关节软骨的破坏。
参考例1抗FGF-8中和嵌合抗体的生产
1.编码小鼠的抗FGF-8中和抗体的V区的cDNA的分离和解析
(1)从生产小鼠的抗FGF-8中和抗体的杂交瘤细胞制备mRNA
使用mRNA制备试剂盒フアストトラツクmRNA分离试剂盒(イン ビトロジエン公司生产)，按照附带的使用说明书从生产小鼠的抗FGF -8中和抗体的杂交瘤KM1334(FERM BP-5451、特开平9-271391) 的1×107细胞制备约8μg的mRNA。
(2)抗FGF-8中和鼠抗体的H链和L链cDNA文库的制作
使用タイムセ-バ-cDNA合成试剂盒(Amersha Biosciences公司生 产)，按照附带的使用说明书由上述(1)中获得的KM1334的mRNA 5μg 合成两端含有EcoRI-NotI接头的cDNA。然后，使用λZAPII克隆试剂 盒(ストラタジ-ン公司生产)，制作cDNA文库。首先，将cDNA全量 溶解于20μL的灭菌水后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，分别回收大约 0.1μg的对应于IgG类抗体的H链的约1.5kb的cDNA片段和对应于κ类的 L链的约1.0kb的cDNA片段。然后，按照附带的使用说明书将约1.5kb的 cDNA片段0.1μg以及约1.0kb的cDNA片段0.1μg和用限制性内切酶 RcoRI消化后经小牛小肠由来的碱性磷酸酶对末端进行脱磷酸化的 λAPII载体1μg连接起来。
使用Gigapack II Packaging Extracts Gold(ストラタジ-ン公司生 产)，按照附带的使用说明书，将连接后的各个反应液中的4μL包装到λ 噬菌体中，使适量的噬菌体感染大肠杆菌菌株XL1-Blue(ストラタジ -ン公司生产)，作为KM1334的H链cDNA文库和L链cDNA文库分别获 得约8.1×104个和5.5×104个的噬菌体克隆。接下来，按照常规方法(《分 子克隆》，第3版)，将各个噬菌体固定于尼龙膜上。
(3)抗FGF-8中和小鼠抗体的H链和L链cDNA的克隆
使用ECL直接核酸标记检测系统(ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems，Amershm Biosciences公司生产)， 按照附带的使用说明书，以含有小鼠抗体的C区的cDNA[H链含有鼠 Cγ1cDNA的DNA片段(French D.L.et al.，J/Immunol.，146， 2010-2016，1991)，L链含有鼠CκcDNA的DNA片段(Hieter P.A.et al.，Cell，22，197-207，1980)]作为探针检测上述(2)制作的KM1334的H 链cDNA文库和L链cDNA文库的尼龙膜，获得H链、L链各10个与探针密 切结合的噬菌体克隆。接下来，按照λZAPII克隆试剂盒(ストラタジ- ン公司生产)的使用说明书，通过体内切除(in vivo excision)将各个 噬菌体克隆转换为质粒。使用Big Dye Terminator Kit Ver.2(0)和DNA 测序仪决定上述得到的各个质粒中含有的cDNA的碱基序列。结果，得 到了含有存在推定cDNA的5’末端起始密码子为ATG序列存在的全长的 功能的H链cDNA的质粒pKM1334H7-1和含有L链cDNA的质粒 pKM1334L7-1。
(4)抗FGF-8中和小鼠抗体的V区的氨基酸序列解析
序列1表示质粒pKM1334H7-1含有的VH的全碱基序列、序列2表 示推定的全氨基酸序列、序列3表示质粒pKM1334L7-1含有的VL的全 碱基序列、序列4表示推定的全氨基酸序列。由与已知的小鼠抗体的序 列资料(Sequence of Proteins of Immunological interest)的比较和与通 过使用蛋白质测序仪PPSQ-10(岛津制作所制造)进行自动Edman降 解对纯化的抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的H链和L链的N末端氨基 酸序列解析的结果比较，分离的各个cDNA是编码含有分泌信号序列的 抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的全长cDNA，就H链来说，序列2表示 的氨基酸序列的1至19，就L链来说，序列4表示的氨基酸序列的1至19 是分泌信号序列。序列5和6分别表示除去分泌信号序列的VH和VL的氨 基酸序列。
接下来，就抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH和VL的氨基酸序 列是否为新的序列进行研究。作为序列解析系统使用GCG数据库[版本 9.1、Genetics Computer Group公司制作]，通过BLAST(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)对已知的蛋白质的氨基酸序列数据 [PIR-Protein(Release 56.0)]进行检索。结果，没有看到与H链、L 链完全一致的序列，确认抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH和VL的 氨基酸序列是新的氨基酸序列。
另外，通过与已知的抗体的氨基酸序列比较，对抗FGF-8中和小 鼠抗体KM1334的VH和VL的氨基酸序列进行了鉴定。序列7、8和9分别 表示抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的VH的CDR1、CDR2和CDR3的 氨基酸序列，序列10、11和12分别表示VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨 基酸序列。
2.抗FGF-8中和嵌合抗体用动物细胞稳定表达
(1)含有编码抗FGF-8中和嵌合抗体的VH的DNA的质粒 pKM1334CH-H5的构建
以参考例1的1.(3)得到的50ng的质粒pKM1334H7-1为模板，以 分别含有序列13、14所述的碱基序列的合成DNA[GENSET公司生产]作 为引物，使他们的终浓度为0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶(东洋纺 织公司生产)附带的使用说明书，总量为50μL，首先在94℃加热2分钟 后，于94℃15秒钟、57℃30秒钟、68℃1分钟的条件下进行30次循环的 PCR。对该反应液进行纯化后，溶解于灭菌水，用10单位的限制性内切 酶EcoRI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼 脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.48kb的EcoRI片段(5’末端 一侧为EcoRI、3’末端一侧为平末端)。
然后，使10单位的限制性内切酶EcoRI和10单位的限制性内切酶 EcoRV(宝酒造公司生产)于37℃下与3μg的质粒pBluescript SK(-) 反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约 2.95kb的EcoRI-EcoRV片段。
然后，将上述得到的编码VH的DNA的EcoRI片段0.1μg和来自质粒 pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中， 用Ligation High(东洋纺织公司生产)进行连接。用这样得到的重组质 粒DNA溶液转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图19给出的含有编码抗 FGF-8中和嵌合抗体的VH的DNA的质粒pKM1334CH-H5。
(2)编码抗FGF-8中和嵌合抗体的LH的DNA的质粒的构建
以参考例1的1.(3)得到的50ng的质粒pKM1334L7-1为模板，以 分别含有序列15、16所述的碱基序列的合成DNA(ジエンセツト公司生 产)作为引物，使他们的终浓度为0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶附 带的使用说明书，总量为50μL，首先在94℃加热2分钟后，于94℃15秒 钟、57℃30秒钟、68℃1分钟的条件下进行30次循环的PCR。对该反应 液进行纯化后，溶解于灭菌水，用10单位的限制性内切酶EcoRI于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg 的约0.45kb的EcoRI片段(5’末端一侧为EcoRI、3’末端一侧为平末端)。
然后，将上述得到的编码VL的DNA的EcoRI片段0.1μg和来自质粒 pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中， 用Ligation High进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌 XL1-Blue株，得到图20给出的含有编码抗FGF-8中和嵌合抗体的VL 的DNA的质粒pKM1334CH-L4。
(3)抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体pKANTEX1334的构建
用WO97/10354所述的人源化抗体表达用载体pKANTEX93和参考 例1的2.(1)和(2)得到的质粒pKM1334CH-H5和pKM1334CH-L4， 象下述那样构建抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体pKANTEX1334。
向参考例1的2.(1)得到的3μg的质粒pKM1334CH-H5中添加10 单元的限制性内切酶NotI[New England Biolabs公司生产]和10单元的限 制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应 液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.48kb的NotI-ApaI 片段。
然后向3μg的人源化抗体表达用载体pKANTEX93中添加10单元的 限制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)和10单元的限制性内切酶NotI， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约2μg的约12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334CH-H5的NotI-ApaI片 段0.1μg和来自质粒pKANTEX93的ApaI-NotI片段0.1μg加到总量10μl的 灭菌水中，用Ligation High进行连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液 转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图21所示的质粒pKANTEX1334H。
向参考例1的2.(2)得到的3μg的质粒pKM1334CH-L4中添加10 单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶BsiWI(New England Biolabs公司生产)，于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼 脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10单元的限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶BsiWI与上述 得到的3μg的质粒pKANTEX1334H于37℃下反应1小时。将该反应液通 过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约13.30kb的EcoRI-BsiWI片 段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334CH-L4的EcoRI-BsiWI 片段0.1μg和来自质粒pKANTEX1334H的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到 总量10μl的灭菌水中，用Ligation High进行连接。用这样得到重组质粒 DNA溶液转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到图21所示的质粒 pKANTEX1334。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪，用得到的质粒 pKANTEX1334 400ng进行碱基序列解析。结果确认得到了目的DNA被 克隆的质粒。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
用上述参考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体 pKANTEX1334，象以下那样进行以DHFR基因缺损的CHO细胞 CHO/DG44细胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，4216-4220，1980)作为宿主的抗FGF-8中和嵌合抗体表达。
将10μg的质粒pKANTEX1334通过电穿孔法(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)导入到1.6×106细胞的CHO/GD44细 胞后，悬浮于10～30mL的IMDM-1×HTsupplement-dFBS(10)[含 有10％透析FBS(以下略为dFBS)和1×HTsupplement(インビトロジ エン公司生产)的IMDM培养基(インビトロジエン公司生产)]，注 入96孔微量培养板(旭テクノゲラス公司生产)，每孔分注100μL。于5 ％CO2培养箱内，在37℃下培养24小时后，将培养液换成培养基 IMDM-dFBS(10)[不含有HTsupplement，而含有10％dFBS的IMDM 培养基]，再培养1～2周。从抗性菌落出现，且铺满的孔回收上清，通 过下述的参考例1的2.(6)所示的ELISA测定上清中的抗FGF-8中和嵌 合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中抗FGF-8中和嵌合抗体的表达的孔的转化 体，再接种到24孔板中，目的是利用dhfr基因扩增体系，使抗体表达量 增加，用含有50nmol/L的作为dhfr的抑制剂的甲氨蝶呤(Sigma Aldrich 公司生产，以下略为MTX)IMDM-dFBS(10)培养2周。再将MTX浓 度提高到200nmol/L、500nmol/L，在各个阶段各培养2周，诱导表现出 500nmol/L MTX抗性的转化株。在转化株铺满孔时，通过参考例1的2. (6)所述的ELISA测定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活 性。最终，得到在含有500nmol/L MTX的IMDM-dFBS(10)的培养 基中可增殖、而且高效表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化株。对于得 到的转化株，通过限界稀释法进行单一细胞化(克隆)，将抗FGF-8 中和嵌合抗体表达最高的转化细胞命名为KM3034。而KM3034于平成 13年12月26日以FERM BP-7836保藏于独立行政法人产业技术综合研 究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地 中央第6)。
(5)抗FGF-8中和嵌合抗体用YB2/0细胞的稳定表达
用上述参考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗体表达载体 pKANTEX1334，象以下那样进行抗FGF-8中和嵌合抗体在大鼠杂交瘤 YB2/0细胞(ATCC No.CRL-1662)的表达。
将10μg的质粒pKANTEX1334通过电穿孔法导入4×106细胞的 YB2/0细胞后，悬浮于40mL的杂交瘤-SFM-FBS(5)[含有5％FBS (PAA实验室公司生产)的杂交瘤-SFM培养基(インビトロジエン公 司生产)]，注入96孔培养板(住友ベ-クライト公司生产)，每孔分 注200μL。于5％CO2培养箱内，在37℃下培养24小时后，添加终浓度为 1mg/mL的G418后，培养1～2周。从出现表现出G418抗性的转化株的菌 落，且铺满的孔回收培养上清，通过下述的参考例1的2.(6)所述的ELISA 测定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中抗FGF-8中和嵌合抗体的表达的孔的转化 株，为了利用dhfr基因扩增体系使抗体表达量增加，将上述转化株悬浮 于用含有1mg/mL的G418和50nmol/L MTX的杂交瘤-SFM-FBS(5) 培养基中，使之变为1～2×105细胞/mL，分注于24孔培养板，每孔为1mL。 于5％CO2培养箱内，在37℃下培养1～2周诱导表现出50nmol/L MTX抗 性的转化株。通过参考例1的2.(6)所述的ELISA测定确认转化株增殖 的孔的培养上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体的抗原结合活性。
对于确认培养上清中的抗FGF-8中和嵌合抗体表达的孔的转化 株，按照与上述同样的方法，使MTX浓度上升，得到在含有终浓度为 1mg/mL的G418、200nmol/L MTX的杂交瘤-SFM-FBS(5)培养基 中可增殖、而且高效表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化株5-D。对于得 到的转化株，通过限界稀释法进行单一细胞化(克隆)，得到抗FGF- 8中和嵌合抗体表达最高的转化细胞株。将抗FGF-8中和嵌合抗体表达 最高的转化细胞株命名为KM3334。
(6)通过ELISA测定抗体对FGF-8部分肽的结合活性
作为可与抗FGF-8抗体反应的人FGF-8的部分肽，合成由与抗 FGF-8中和小鼠抗体KM1334(特开平9-271391)的抗原肽相同序列 的序列17表示的氨基酸序列构成的肽。序列17是在人FGF-8的氨基酸 序列的23～46的序列的C末端附加了用于制作结合的半胱氨酸残基的序 列。以下，将该肽称之为化合物1。为了用于ELISA，用以下的方法制 作与牛血清清蛋白(ナカライテスク公司生产，以下略称为BSA)的结 合(以下称之为BSA-化合物1)。即，在一边搅拌下，一边向含有10mg 的BSA的PBS 900μL滴入100μL的25mg/mL SMCC[4-(N-马来酰亚胺甲 基)环己烷-1-羧基N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma Aldrich公司生产]的 DMSO溶液，缓慢搅拌30分钟。将1mL反应液载到用25mL的PBS平衡的 凝胶过滤柱(NAP-10柱)，将用1.5mL的PBS洗脱的洗脱液作为BSA -SMCC溶液。各个级分的BSA浓度用280nm的吸光度进行测定。然后 向1.0mg的化合物1中加入200μL DMSO，再加入800μL PBS，使其完全 溶解后，在搅拌下添加上述的BSA-SMCC溶液(BSA换算2.5mg)， 于室温下缓慢搅拌3小时。于4℃下将反应液对PBS透析过夜，添加终浓 度为0.05％的迭氮钠后，将经孔径0.22μm膜过滤器过滤后的溶液作为 BSA-化合物1溶液。
以0.5～1.0μg/ml的浓度向96孔的ELISA用板(ゲライナ-公司生 产)分注上述制备的BSA-化合物1溶液，每孔50μL，于4℃下放置过夜， 使其吸附。用PBS洗净后，加入含有1％BSA的PBS(以下称之为BSA- PBS)，每孔100μL，于室温下反应1小时，封闭残存的活性基团。用含 有0.05％Tween的PBS(以下称之为Tween-PBS)洗净各孔后，加入转 化株的培养上清或纯化抗体，每孔50μl，于室温下反应1小时。反应后 的各孔用Tween-PBS洗净后，将用BSA-PBS稀释到3000～6000倍的 过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H&L)抗体溶液[American Qualex公 司生产]作为二次抗体溶液，每孔加50μL，于室温下反应1小时。反应后 的各个孔用Tween-PBS洗净后，每孔加入50μL的ABTS底物溶液 [0.55g的2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵溶解于1L的0.1M柠 檬酸缓冲液(pH4.2)，在使用前以1μL/mL的比例添加30％过氧化氢的 溶液]，进行发色反应，5分钟后，每孔加入50μL的5％SDS溶液，终止 反应。然后测定415nm的吸光度。
3.抗FGF-8中和嵌合抗体的纯化
(1)来自CHO/DG44细胞的表达细胞的培养和抗体的纯化
将参考例1的2.(4)中得到的表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化细 胞株KM3034，使终浓度为1～2×105细胞/ml那样悬浮于含有500nmol/L MTX的IMDM-dFBS(10)的培养基中，向175cm2烧瓶(ゲライナ- 公司生产)中各注入40mL。在5％CO2培养箱中于37℃下培养5～7日， 达到铺满时除去培养上清，用20mL的PBS洗净细胞。除去PBS，加入 40mL的EX-CELL 301培养基(JRH生物科学公司生产)，在5％CO2培养箱中于37℃下培养7～14日后，回收培养上清。用Prosep- A[Millipore公司生产]柱，按照附带的说明书，从培养上清中纯化抗FGF -8中和嵌合抗体。得到的抗FGF-8中和嵌合抗体取名为KM3034。
(2)来自YB2/0细胞的表达细胞的培养和抗体的纯化
将参考例1的2.(5)中得到的表达抗FGF-8中和嵌合抗体的转化细 胞株KM3334，在175cm2烧瓶，用含有200nmol/L MTX和5％ダイゴ GF21(和光纯药公司生产)杂交瘤-SFM培养基，在5％CO2培养箱中 于37℃下进行培养。培养8～10天后，从回收的培养上清用Prosep-A柱， 按照附带的说明书，纯化抗FGF-8中和嵌合抗体。得到的抗FGF-8中 和嵌合抗体取名为KM3334。
4.纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的解析
按照众所周知的方法(Nature，227，680，1970)对在参考例1的3.中得 到的通过各种动物细胞表达、纯化的2种抗FGF-8中和嵌合抗体 KM3034和KM3334各4μg进行电泳，对分子量和纯度进行解析。确认纯 化的各个抗FGF-8中和嵌合抗体无论哪一种在非还原条件下分子量都 是约150Kd的单一的带，而在还原条件下存在约50Kd和约25Kd的2条 带。这些分子量几乎与由抗体的H链和L链的cDNA的碱基序列推定的分 子量(H链：约49Kd，L链：约23Kd，分子全体：约144Kd)一致，另 外，IgG型抗体与在非还原条件下分子量约150Kd，在还原条件下分子 内的S-S键被切断，分解为分子量约为50Kd的H链和约25Kd的L链的报 道(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and practice Academic Press Limited，1996)一致，由此确认抗FGF-8中 和嵌合抗体是以正确的结构的抗体分子表达的，而且被纯化的。
5.纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的中和活性评价
纯化的抗FGF-8中和嵌合抗体的中和活性的评价通过以下所示的 小鼠乳腺癌细胞株SC-3的FGF-8依赖性增殖的抑制效果(Tanaka A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)测定。即，向 含有2％浓度的经活性炭处理的FBS的DMEM：Ham’s F12(1∶1)培养 基[DMEM培养基和Ham’s F12培养基，(インビトロジエン公司生产) 以1∶1混合的培养基]以3.0×104细胞/mL的浓度悬浮SC-3细胞，以每孔 150μL(4.5×103细胞)接种到96孔板。在5％CO2培养箱中于37℃下18 小时后，用每孔100μL的试验培养基进行培养基交换。试验培养基通过 将50ng/mL的FGF-8(R&D公司生产)和各种稀释浓度的抗FGF-8中 和嵌合抗体溶解于含有0.1％BSA的DMEM：Ham’s F12(1∶1)培养基 制作。而作为阴性对照的抗体使用WO01/64754报道的针对人趋化因子 CCR4的嵌合抗体KM2760。在5％CO2培养箱中于37℃下48小时后，换 成新配制的试验培养基，再培养48小时。每孔添加10μL的WST-1试剂 (ロシユ公司生产)，轻轻搅拌后，在5％CO2培养箱中于37℃下1小时， 然后测定吸光度(OD450/650)。图22中横轴表示添加的抗体浓度、纵轴 表示相对于只添加50ng/mL的FGF-8时增殖的相对增殖(％)。相对 于只添加50ng/mL的FGF-8时增殖的相对增殖(％)通过下面式子算 出。
(式)相对于添加FGF-8时增殖的相对增殖(％)
＝{(添加FGF-8和抗体时的吸光度-未添加FGF-8和抗体时的 吸光度)/
(只添加FGF-8时的吸光度-未添加FGF-8和抗体时的吸光 度)}×100
就象图22所示的那样，抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、抗FGF -8中和嵌合抗体KM3034和KM3334无论哪一个都表现出同等的SC-3 细胞增殖抑制活性，没有看到嵌合抗体化引起中和活性的降低。
参考例2抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作
1.编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的DNA的构建
(1)抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计
首先象以下那样设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH和VL的氨 基酸序列。选择用于移植参考例1的1项(4)中鉴定的抗FGF-8中和小 鼠抗体KM1334的VH的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH的FR的氨基 酸序列。カバツト等人报道了从氨基酸序列的同源性将已知的各种各样 的人抗体的VH分为3种亚类(HSG I～II)，以及对于每个亚类的共通 序列(Sequences of Proteins of Immunological interest)。由于认为这 些共有序列对于人免疫原性有降低的可能性，所以以这些共有的序列作 为基础，设计了抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列。为了 制作活性更高的抗FGF-8中和CDR移植抗体，在设计时，在人抗体的 VH的3种亚类的共有序列的FR的氨基酸序列中，选择与KM1334的VH 的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序列。在第4表中， 给出了同源性检索的结果。就象第4表所示那样，KM1334的VH的FR的 氨基酸序列具有与亚类1最高的同源性。
第4表
人抗体的VH的各个亚类的共通序列的FR的氨基酸序列和
KM1334的VH的FR的氨基酸序列的同源性
HSG I HSG II HSG III
79.3％ 51.7％ 59.8％
根据以上结果，将KM1334的VH的CDR的氨基酸序列移植到人抗 体的VH的亚类I的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置，设计了序列 18给出的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0。
然后象以下那样设计抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸 序列。选择用于移植参考例1的1.(4)中鉴定的抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VL的FR的氨基酸序列。 カバツト等人报道了从氨基酸序列的同源性将已知的各种各样的人抗 体的VL分为4种亚类(HSG I～IV)，以及对于每个亚类的共有序列 (Sequences of Proteins of Immunological interest)。与VH的情形一样， 在人抗体的VL的4种亚类的共通序列的FR的氨基酸序列中，选择与 KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序 列。
在第5表中，给出了同源性检索的结果。就象第5表所示那样， KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有与亚类II最高的同源性。
第5表
人抗体的VL的各个亚类的共通序列的FR的氨基酸序列和
KM1334的VL的FR的氨基酸序列的同源性
HSG I HSG II HSG III HSG IV
66.3％ 83.8％ 66.2％ 73.8％
根据以上结果，将KM1334的VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体 的VH的亚类II的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置，设计了序列 19给出的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸序列LV.0。
上述设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0 和VL的氨基酸序列LV.0只是将抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的 CDR的氨基酸序列移植到选择的人抗体的FR的氨基酸序列的序列。在 多数场合下，就人型CDR移植抗体来说，只是通过小鼠抗体的CDR的氨 基酸序列的移植，结合活性就已经降低了。为了避免这一现象，比较人 抗体和鼠抗体的FR的氨基酸序列，在不同的FR的氨基酸残基中，可以 将认为对结合活性有影响的氨基酸残基与CDR的氨基酸序列一起进行 移植。因此在本参考例中，也研究了认为对结合活性有影响的FR的氨 基酸残基的鉴定。
首先，利用计算机模拟手法构建了由上述设计的抗FGF-8中和 CDR移植抗体的VH的氨基酸序列HV.0和VL的氨基酸序列LV.0构成的 抗体V区(HVOLVO)的三维结构。关于三维结构座标制作使用 softwareAbM[Oxford Molecular公司生产]，关于三维结构的表示使用软 件Pro-Explore(Oxford Molecular公司生产)或RasMol[Glaxo公司生 产]，分别按照附带的使用说明书进行。而抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的V区的三维结构的计算机模型也同样构建。另外，在HVOLVO 的VH和VL的FR的氨基酸序列中，就与抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334不同的氨基酸残基，由为依次改变为在抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的相当位置看到的氨基酸残基的氨基酸序列构成的改变体的V 区三维结构模型也同样构建，对抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334、 HVOLVO以及改变体的V区的三维结构进行比较。结果，在HVOLVO 的FR的氨基酸残基中，作为认为使抗原结合部位的三维结构变化、对 抗体活性有影响的残基，在HV.0中选择12位的Lys、13位的Lys、40位 的Ala、41位的Pro、48位的Met、68位的Val、70位的Ile、74位的Thr、 76位的Thr、82位的Glu、87位的Arg、95位的Tyr，在LV.0中选择2位的 Ile、3位的Val、14位的Thr、15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92 位的Tyr，进行氨基酸改变。在这些选择的氨基酸残基中，至少有一个 以上改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基，象以下那样设计具 有各种各样改变的人型CDR移植抗体的VH和VL。
具体来说，作为VH，设计了将序列12位的Lys、13位的Lys、40位 的Ala、41位的Pro、48位的Met、95位的Tyr 6个残基分别改变为鼠抗体 KM1334中出现的氨基酸残基Ala、Arg、Arg、Ser、Ile、Phe的序列20 给出的氨基酸序列HV.6。作为VL，设计了将序列2位的Ile、14位的Thr、 15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 6个残基分别改变为鼠 抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Ser、Leu、Lys、Val、Phe的序 列21给出的氨基酸序列LV.6。
(2)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的DNA的构建
利用PCR，象以下那样构建编码参考例2的1项(1)设计的抗FGF -8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列HV.0的DNA。
首先，将抗FGF-8中和小鼠抗体KM1334的H链的分泌信号序列 (序列2的1～19位的氨基酸序列)与设计的氨基酸序列相连。然后将得 到的氨基酸序列转换为遗传密码子。当对一个氨基酸存在多个遗传密码 子时，考虑抗体的基因的碱基序列中出现的使用频率(Sequences of Proteins of Immunological interest)，决定对应的遗传密码子。连接决 定的遗传密码子，设计编码完全抗体V区的氨基酸序列的DNA的碱基序 列。在该碱基序列的5’端和3’端付加含有用于对人源化抗体表达用载体 克隆的限制性内切酶识别序列，另外在5’末端付加M13引物RV(宝酒造 公司生产)的序列、3’末端付加与M13引物M4(宝酒造公司生产)序列 互补的序列。将设计的碱基序列(序列22)从5’末端一侧开始每141个 碱基，末端20个碱基重复那样分成4段，化学合成相当于各个序列的有 意义链、反意义链、有意义链、反意义链的序列23～26所示序列构成的 4条DNA(GENSET公司生产)。
按照KOD聚合酶附带的使用说明书，用0.1μmol/L的各个合成DNA、 0.5μmol/L的M13引物RV、0.5μmol/L的M13引物M4以及2.5单位的KOD 聚合酶(东洋纺织公司生产)，配制总量50μL的PCR反应液，进行PCR。 反应条件为在94℃加热5分钟后，进行每一循环为94℃30秒钟、50℃30 秒钟、74℃60秒钟的30次循环，再于74℃加热5分钟。将该反应液进行 乙醇沉淀后，溶解于灭菌水中，用10单位的限制性内切酶EcoRI和10单 位的限制性内切酶SpeI(宝酒造公司生产)，于37℃下反应1小时。将 该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.47kb的 EcoRI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶EcoRI和10单位的限制性内切酶SpeI 与3μg的质粒pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生产)于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2.9μg 的约2.95kb的EcoRI-SpeI片段。
然后，将上述得到的编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH的PCR 产物的EcoRI-SpeI片段0.1μg和质粒pBluescript SK(-)的EcoRI-SpeI 片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用ligation high进行连接。用这样 得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺织公司生产)， 从转化株的10个克隆制备各个质粒DNA，利用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪进行碱基序列解析。碱基序列解析的结果，得到了 图23给出的含有目的碱基序列的质粒pKM1334HVO。
与上述编码HV.0的DNA同样设计(序列27)，用由序列28～31所 示序列构成的4条合成DNA(GENSET公司生产)，与上述同样通过PCR 进行构建编码在参考例2的1.(1)设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体 的VH的氨基酸序列HV.6的DNA。采取与pKM1334HVO同样的过程， 得到含有编码HV.6的DNA的质粒pKM1334HV6。
(3)编码抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的DNA的构建
与编码HV.0的DNA同样设计编码参考例2的1项(1)设计的抗FGF -8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列LV.0的DNA(序列32)。但合成 DNA的设计时，作为分泌信号序列，使用抗FGF-8中和小鼠抗体 KM1334的L链的分泌信号序列(序列4的1～19位的氨基酸序列)。与 编码HV.0的DNA同样，通过使用分别由序列33至36的序列构成的4条合 成DNA(GENSET公司生产)的PCR，构建编码LV.0的DNA。采取与 pKM1334HVO同样的过程，得到含有编码LV.6的DNA的质粒 pKM1334LV0。
另外，与编码LV.0的DNA同样设计编码参考例2的1项(1)设计的 抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL的氨基酸序列LV.6的DNA(序列37)， 用分别由序列38至41的序列构成的4条合成DNA(GENSET公司生产)， 象上述那样通过PCR构建。采取与pKM1334HVO同样的过程，得到含 有编码LV.6的DNA的质粒pKM1334LV6。
2.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
用WO97/10354所述的人源化抗体表达用载体pKANTEX93和参考 例2的1.(2)和(3)得到的质粒pKM1334HVO和pKM1334LV0，象下 述那样构建抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体 pKANTEX1334HVOLVO。
向参考例2的1.(2)得到的3μg的质粒pKM1334HVO中添加10单元 的限制性内切酶ApaI和10单元的限制性内切酶NotI(宝酒造公司生产)， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约0.3μg的约0.47kb的ApaI-NotI片段。
然后向3μg的人源化抗体表达用载体pKANTEX93中添加10单元的 限制性内切酶ApaI(宝酒造公司生产)和10单元的限制性内切酶NotI， 于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收 约2μg的约12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334HVO的NotI-ApaI片段 0.1μg和来自质粒pKANTEX93的NotI-ApaI片段0.1μg加到总量10μl的灭 菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化 大肠杆菌DH5α株，得到图24所示的pKANTEX1334HVO。
然后，向参考例2的1.(3)得到的3μg的质粒pKM1334LVO中添加 10单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶BsiWI，于37℃ 下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg 的约0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10单元的限制性内切酶EcoRI和10单元的限制性内切酶 BsiWI与上述得到的3μg的质粒pKANTEX1334HVO于37℃下反应1小 时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约13.30kb 的EcoRI-BsiWI片段。
接下来，将上述得到的来自质粒pKM1334LVO的EcoRI-BsiWI片段 0.1μg和来自质粒pKANTEX1334HVO的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到总 量10μl的灭菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA 溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到图24所示的pKANTEX1334HVOLVO。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA测序仪，用得到的质粒 400ng进行碱基序列解析。结果确认得到了目的DNA被克隆的质粒。
另外，用上述参考例2的1.(2)得到的质粒pKM1334HVO和参考例 2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6，用与上述同样的方法构建表达载 体pKANTEX1334HVOLV6。
另外，用上述参考例2的1.(2)得到的质粒pKM1334HV6和参考例 2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6，用与上述同样的方法构建表达载 体pKANTEX1334HV6LV6。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体用YB2/0细胞的稳定表达
分别用上述参考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达 载体pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6、 pKANTEX1334HV6LV6，按照上述参考例1的2.(5)所述的方法通过 YB2/0细胞进行抗FGF-8中和CDR移植抗体的稳定表达。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(2)所述的方法，从参考例2的3.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的YB2/0的转化株的培养和上 清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。将来自导入 pKANTEX1334HVOLVO的转化株的抗体取名为HVOLVO，将来自导 入pKANTEX1334HVOLV6的转化株的抗体取名为HVOLV6，将来自导 入pKANTEX1334HV6LV6转化株的抗体取名为HV6LV6。
5.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例2的4.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
6.通过ELISA进行抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合 活性的测定
在参考例2的4.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8 的结合活性通过上述参考例1的2.(6)所述的ELISA测定。作为阳性对 照使用来自参考例1的3.(2)得到的YB2/0细胞的抗FGF-8中和嵌合抗 体KM1334。结果如图25所示。就象图25所示的那样，无论哪一种抗FGF -8中和嵌合抗体都表现出与KM3334同等的FGF-8结合活性，没有看 到由于CDR移植引起的明显的结合活性的下降。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性的测定
为了对在参考例2的4.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体 对FGF-8的结合活性进行更详细地研究，利用BIAcore 2000[BIACORE 公司生产]，象以下那样对各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8 的结合活性进行测定、比较。作为阳性对照使用来自参考例1的3.(2) 得到的YB2/0细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM1334。
以下作为样品的稀释和测定中的缓冲液使用HBS-EP (BIACORE公司生产)。首先，组装传感器片CM5(BIACORE公司 生产)，通过胺偶合法将用10mmol/L乙酸缓冲液(pH4.0)溶解的 31.25μg/mL的FGF-8(R&D公司生产)固定于传感器片表面。以共 振信号(RU)为指标的固定化量是4498RU。
向FGF-8固定化流动池中以20μL/分的流速，添加60μL的各种抗体 溶液，然后，过3分钟后监测解离反应。解离反应后，连续2次向流动池 中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。 就各种浓度(50-0.068μg/mL)的抗体溶液进行该循环，得到各种浓度 下的传感曲线。各个抗体的传感曲线是通过扣除作为阴性对照使用针对 GD3的嵌合抗体KM871(Shitara K.et al.，Cancer Immunol.Immunother.，36，373-380，1993)得到的传感曲线作为特异的反 应的传感曲线。图25表示50μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲 线所表明的那样，无论哪一种抗体在解离反应中几乎看不到解离，求正 确的解离速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过 比较结合反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。结果如图26 所示，嵌合抗体KM3334表现出最高的结合反应，CDR移植抗体 HVOLV6也表现出与KM3334同等高的结合反应。另外，CDR移植抗体 HVOLVO和CDR移植抗体HV6LV6与KM3334和HVOLV6比较，表现出 低一些的结合反应。以上结果表明用ELISA没有确认的抗体间的结合活 性的比较可以通过BIAcore 2000进行，而且通过VL的FR的6氨基酸残基 的改变，CDR移植抗体的结合活性恢复到与嵌合抗体同等水平。而有关 VH的FR的6氨基酸残基没有看到对应于结合活性恢复的效果。
将来自表现出与嵌合抗体KM3334同等高的结合反应的YB2/0细胞 的CDR移植抗体HVOLV6命名为KM8037，来自高表达KM8037的YB2/0 细胞的转化细胞株也同样命名为KM8037。转化细胞株KM8037于平成 14年6月20日以FERM BP-8084保藏于独立行政法人产业技术综合研 究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番 地中央第6)。
参考例3免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作(1)
参考例2的结果清楚表明VL的FR含有来自小鼠抗体KM1334的6氨 基酸残基的改变的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6表现出与嵌合 抗体同等的结合活性。在此，进一步对6残基的活性恢复的效果进行研 究，象以下那样进行期待具有充分活性，而且来自小鼠抗体的氨基酸残 基少，免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作。
1.VL的氨基酸材料的设计
就上述6氨基酸残基设计具有以下那样改变的6种VL氨基酸序列。 无论哪一种都表现出来自LV.0的氨基酸残基的改变。
在LV.4-1中，将2位的Ile、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 4 个残基分别改变为鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Lys、Val、 Phe。
在LV.4-2中，将序列2位的Ile、14位的Thr、15位的Pro、92位的 Tyr 4个残基分别改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、 Ser、Leu、Phe。
在LV.3-1中，将2位的Ile、51位的Leu、92位的Tyr 3个残基分别改 变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Val、Phe。
在LV.3-2中，将14位的Thr、15位的Pro、92位的Tyr 3个残基分别 改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、Phe。
在LV.2-1中，将51位的Leu、92位的Tyr 2个残基分别改变为小鼠 抗体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Phe。
在LV.2-2中，将2位的Ile、92位的Tyr 2个残基分别改变为小鼠抗 体KM1334中出现的氨基酸残基Val、Phe。
序列42～47分别表示LV.4-1、LV.4-2、LV.3-1、LV.3-2、LV.2 -1、LV.2-2的氨基酸序列。
2.编码VL的DNA的构建
象以下那样构建编码参考例3的1.设计的抗FGF-8中和CDR移植 抗体的各种VL的氨基酸序列DNA。
(1)编码LV.4-1的DNA的构建
编码LV.4-1的DNA用由序列38、34、40、41的序列构成的4条合成 DNA(GENSET公司生产)，按照参考例2的1.(3)所述方法进行构建。 结果得到了含有编码LV.4-1的DNA的质粒pKM1334LV4-1。
(2)编码LV.3-1的DNA的构建
以参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LV6 50ng为模板，以由 M13引物RV和由序列48的碱基序列构成的合成DNA(GENSET公司生 产)作为引物，终浓度为0.3μmol/L，按照KOD聚合酶附带的使用说明 书，总量50μL，首先在94℃加热2分钟后，进行每一循环为94℃15秒钟、 50℃30秒钟、68℃1分钟秒钟的35次循环的PCR。将该反应液进行纯化 后，溶解于灭菌水中，用10单位的限制性内切酶KpnI(宝酒造公司生产) 和10单位的限制性内切酶SpeI，于37℃下反应1小时。将该反应液通过 琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.3μg的约0.22kb的KpnI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例3的2.(1)得到3μg的 质粒pKM1334LV4-1于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶 电泳进行分级，回收约0.2μg的约0.21kb的KpnI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI和10单位的限制性内切酶SpeI 与3μg的质粒pBluescript II SK(-)于37℃下反应1小时。将该反应液通 过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2μg的约2.95kb的KpnI-SpeI片段。
然后，将上述得到的VL DNA的KpnI-SpeI片段0.1μg和来自质粒 pKM1334LV4-1的KpnI片段0.1μg，以及来自质粒pBluescript SK(-) 的KpnI-SpeI片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行 连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到了图 27给出的含有编码LV.3-1的DNA的质粒pKM1334LV3-1。
(3)编码LV.2-1的DNA的构建
除了使用参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LVO代替质粒 pKM1334LV4-1以外，利用与参考例3的2.(1)所述方法同样的方法得 到含有编码LV.2-1的DNA的质粒pKM1334LV2-1。
(4)编码LV.2-2的DNA的构建
除了作为引物用序列49的合成DNA代替序列48的合成DNA以外，利 用与参考例3的2.(1)所述方法同样的方法得到含有编码LV.2-2的DNA 的质粒pKM1334LV2-2。
(5)编码LV.4-2的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例参考例3的2.(4)得到的3μg 质粒pKM1334LV2-2于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶 电泳进行分级，回收约2μg的约3.16kb的KpnI片段。
然后使10单位的限制性内切酶KpnI与参考例2的1.(3)得到的3μg 质粒pKM1334LV6于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电 泳进行分级，回收约0.2μg的约0.21kb的KpnI片段。
将上述得到的来自质粒pKM1334LV2-2的KpnI片段0.1μg和来自质 粒pKM1334LV6的KpnI片段0.1μg加到总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株， 得到了图28给出的含有编码LV.4-2的DNA的质粒pKM1334LV4-2。
(6)编码LV.3-2的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶Tth111I(宝酒造公司生产)和Xmn I(New England Biolabs公司生产)与参考例3的2.(5)得到的3μg质粒 pKM1334LV4-2于37℃下反应1小时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳 进行分级，回收约2μg的约2.24kb的Tth111I-Xmn I片段。
然后使10单位的限制性内切酶Tth111I和Xmn I与参考例参考例2的 1.(3)得到的3μg质粒pKM1334LVO于37℃下反应1小时。将该反应液 通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约1μg的约1.11kb的Tth111I-Xmn I片段。
然后，将上述得到的来自质粒pKM1334LV4-2的Tth111I-Xmn I 片段0.1μg和来自质粒pKM1334LVO的Tth111I-Xmn I片段0.1μg加到 总量10μl的灭菌水中，用Ligation high进行连接。用这样得到重组质粒 DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株，得到了图29给出的含有编码LV.3-2 的DNA的质粒pKM1334LV3-2。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
通过用含有在参考例3的2.构建的编码各种VL的DNA的 EcoRI-BsiWI片段置换参考例2的2.得到的含有编码表达载体 pKANTEX1334HVOLV6的DNA的EcoRI-BsiWI片段，构建含有编码各 种VL的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体。具体来说构建 pKANTEX1334HVOLV4-1、pKANTEX1334HVOLV4-2、 pKANTEX1334HVOLV3-1、pKANTEX1334HVOLV3-2、 pKANTEX1334HVOLV2-1、pKANTEX1334HVOLV2-26种。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
分别用上述参考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达 载体pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6和参考例3的 3.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体表达用载体，按照上述参考 例1的2.(4)所述的方法进行FGF-8中和CDR移植抗体在CHO/DG44 细胞的稳定表达。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(1)所述的方法，从参考例3的4.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的CHO/DG4细胞的转化株的 培养和上清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。
将来自导入pKANTEX1334HVOLVO的转化株的抗体取名为 HVOLVO/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV6的转化株的抗体取名为 HVOLV6/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV4-1的转化株的抗体取名为 HVOLV4-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV4-2的转化株的抗体取名为 HVOLV4-2/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-1的转化株的抗体取名为 HVOLV3-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-2的转化株的抗体取名为 HVOLV3-2/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV2-1的转化株的抗体取名为 HVOLV2-1/CHO，
将来自导入pKANTEX1334HVOLV2-2的转化株的抗体取名为 HVOLV2-2/CHO。
6.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例3的5.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
7.利用BIAcore生物传感器对抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF -8的结合活进行测定
为了对在参考例3的5.得到的各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对 FGF-8的结合活性进行更详细地研究，利用BIAcore 2000，用对FGF -8的部分肽化合物1的C末端进行生物素标记的标记化合物，象以下那 样对各种抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性进行测定、 比较。作为阳性对照使用来自参考例1的3.(1)得到的CHO/DG44细胞 的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034。
以下作为样品的稀释和测定中的缓冲液使用HBS-EP。首先，组装 传感器片SA(BIACORE公司生产)，以5μL/min的流速添加5μL的制备 成0.05μg/mL的C末端标记生物素的标记化合物1，然后，连续2次添加 5μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，将片洗净。FGF-8肽的 固定化量是35RU。
以20μL/分的流速，向FGF-8固定化流动池中添加60μL的各种抗体 溶液，然后，过3分钟后监测解离反应。解离反应后，连续2次向流动池 中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-盐酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。 就各种浓度(50-1.85μg/mL)的抗体溶液进行该循环，得到各种浓度 下的传感曲线。各个抗体的传感曲线是通过扣除作为阴性对照使用针对 GD3的嵌合抗体KM871得到的传感曲线作为特异的反应的传感曲线。
图30表示16.7μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲线所表明 的那样，无论哪一种抗体在解离反应时几乎看不到解离，求正确的解离 速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过比较结合 反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。
结果如图30所示，嵌合抗体KM3034和HVOLV6/CHO表现出最高 的结合反应，其次，HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2 -1/CHO也表现出高的结合反应。而HVOLV3-2/CHO、HVOLV2- 2/CHO、HVOLV4-2/CHO表现出低的结合反应，HVOLVO/CHO表现 出最低的结合反应。这些结果与用参考例2的7.所述的来自YB2/0细胞的 CDR移植抗体的结果一致。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的中和活性的测定
按照参考例2的5项所述的方法对在参考例3的7项中对FGF-8有 高的结合反应的4种抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO、 HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2-1/CHO的FGF-8 中和活性进行评价。作为阳性对照使用参考例1的3项(1)得到的来自 CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034，作为阴性对照使用 W001/64754所述的针对人趋化因子CCR4的嵌合抗体KM2760。结果如 图31所示。就象图31所示的那样，HVOLV6/CHO表现出与嵌合抗体 KM3034同等的FGF-8中和活性，其次HVOLV3-1/CHO也表现出高 的FGF-8中和活性。HVOLV4-1/CHO与HVOLV3-1/CHO相比，表 现出比较低的FGF-8中和活性，HVOLV2-1/CHO的FGF-8中和活性 最低。确认FGF-8中和活性的强弱与利用BIAcore的结合反应的强弱之 间存在相关性。
参考例4.免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗体的制作(2)
参考例3的结果清楚表明LV6的6个氨基酸残基的改变中，51位的改 变对于活性恢复是必需的。另外还暗示了2位的改变如果单独改变，对 活性恢复的效果小，而通过与51位的改变组合，协同地对活性恢复有贡 献。对于14位、15位的改变也表明通过与51位的改变的组合协调对活性 恢复有贡献。另外，暗示了50位的改变效果小。在此为了对2位的改变 和14位、15位的改变的哪一个对活性恢复的效果是否更高进行研究，另 外为了对92位的改变的效果进行研究，对抗FGF-8中和CDR移植抗体 的制作再进行研究。
1.VL的氨基酸序列的再设计
设计具有以下那样改变的2种VL氨基酸序列。无论哪一种都表现出 来自LV.0的氨基酸残基的改变。
在LV.4-3中，将14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu、92位的Tyr 4个残基分别改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、 Val、Phe。
在LV.3-3中，将14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu 3个残基分别 改变为小鼠抗体KM1334中出现的氨基酸残基Ser、Leu、Val。
序列50表示LV.4-3的氨基酸序列，而序列表示51LV.3-3的氨基酸 序列。
2.编码VL的DNA的构建
象以下那样构建编码参考例4的1.设计的抗FGF-8中和CDR移植 抗体的各种VL的氨基酸序列DNA。
(1)编码LV.4-3的DNA的构建
按照参考例3的2.(5)所述方法构建。但是，用参考例3的2.(3) 得到的质粒pKM1334LV2-1代替质粒pKM1334LV2-2，用参考例3的2. (6)得到的质粒pKM1334LV3-2代替质粒pKM1334LV6。结果得到了 含有编码LV.4-3的DNA的质粒pKM1334LV4-3。
(2)编码LV.3-3的DNA的构建
使10单位的限制性内切酶BamHI和10单位的限制性内切酶SpeI与 3μg参考例4的2.(1)得到的质粒pKM1334LV4-3于37℃下反应1小时。 将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约2.5μg的约3.23kb的 BamHI-SpeI片段。
然后使10单位的限制性内切酶BamHI和10单位的限制性内切酶 SpeI与3μg的参考例2的1.(3)得到的质粒pKM1334LVO于37℃下反应1小 时。将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，回收约0.15μg的约0.13kb 的BamHI-SpeI片段。
然后，将上述得到的质粒pKM1334LV4-3的BamHI-SpeI片段0.1μg 和来自质粒pKM1334LVO的BamHI-SpeI片段0.1μg加到总量10μl的灭 菌水中，用ligation high进行连接。用这样得到重组质粒DNA溶液转化 大肠杆菌DH5α株，得到了图32给出的含有编码LV.3-3的DNA的质粒 pKM1334LV3-3。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体的构建
通过用含有在参考例4的2.构建的编码各种VL的DNA的 EcoRI-BsiWI片段置换参考例2的2.得到的含有编码表达载体 pKANTEX1334HVOLV6的VL的DNA的EcoRI-BsiWI片段，构建含有编 码各种VL的DNA的抗FGF-8中和CDR移植抗体表达载体。具体来说
构建pKANTEX1334HVOLV4-3、pKANTEX1334HVOLV3-3这2 种载体。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗体用CHO/DG44细胞的稳定表达
用上述参考例4的3.得到的各种抗FGF-8中和移植抗体表达载体， 按照上述参考例1的2.(4)所述的方法进行各种FGF-8中和CDR移植 抗体在CHO/DG44细胞的稳定表达。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗体的纯化
按照上述参考例1的3.(1)所述的方法，从参考例4的4.中得到的来 自表达各种抗FGF-8中和CDR移植抗体的CHO/DG4细胞的转化株的 培养和上清纯化抗FGF-8中和CDR移植抗体。将来自导入 pKANTEX1334HVOLV4-3的转化株的抗体取名为HVOLV4- 3/CHO，将来自导入pKANTEX1334HVOLV3-3的转化株的抗体取名 为HVOLV3-3/CHO。
6.纯化的抗FGF-8中和CDR移植抗体的解析
按照上述参考例1的4.所述的方法，对在参考例4的5.得到的各种抗 FGF-8中和CDR移植抗体进行SDS-PAGE。结果确认无论哪一种抗体 都是以正确结构的抗体分子表达的，而且被纯化了。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗体对FGF-8的结合活性的测定
按照参考例3的7.所示的方法，对参考例3的5.得到的抗FGF-8中 和CDR移植抗体HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、参考例4的5.得到 的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO和HVOLV3- 3/CHO对FGF-8的结合活性进行测定。作为阳性对照使用来自参考例1 的3.(1)得到的CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034。
图33表示16.7μg/mL的各种抗体的传感曲线。就象传感曲线所表明 的那样，无论哪一种抗体在解离反应中几乎看不到解离，求正确的解离 速度常数是困难的。在此，各种抗体的结合活性的比较是通过比较结合 反应时的结合[共振信号(RU)]的强弱进行的。结果就象图33所表示的 那样，嵌合抗体KM3034表现出最高的结合反应，其次，HVOLV4- 3/CHO比HVOLV3-1/CHO还高、表现出与HVOLV6/CHO同等的结合 反应。而HVOLV3-3/CHO比HVOLV3-1/CHO更低。以上结果表明有 关结合反应的强弱，比起2位的改变，14位、15位的改变更协调地起作 用，另外92位的改变对于活性的恢复是必需的。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗体的对FGF-8的中和活性的测定
按照参考例2的5项所述的方法对在参考例3的5中得到的抗FGF-8 中和CDR移植抗体HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、参考例4的5中 得到的抗FGF-8中和CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO和HVOLV3- 3/CHO的FGF-8中和活性进行评价。作为阳性对照使用参考例1的3项 (1)得到的来自CHO/DG44细胞的抗FGF-8中和嵌合抗体KM3034， 作为阴性对照使用W001/64754所述的针对人趋化因子CCR4的嵌合抗 体KM2760。结果如图34所示。就象图34所表示的那样，HVOLV6/CHO 和HVOLV3-1/CHO表现出与嵌合抗体KM3034同等的FGF-8中和活 性。而HVOLV4-3/CHO和HVOLV3-3/CHO表现出同等的中和活性， 其活性是嵌合抗体KM3034的1/2左右。HVOLV3-1/CHO和HVOLV4 -3/CHO的FGF-8中和活性与由BIAcore引起的结合反应的强弱不相 关，2位的氨基酸残基和14位、15位的氨基酸残基在对FGF-8的结合活 性和对细胞的FGF-8中和活性中给予独立的影响。
通过以上的各种评价结果，将表现出与嵌合抗体KM3034同等的高 结合反应和FGF-8中和活性的CHO/DG4细胞由来的CDR移植抗体 HVOLV6/CHO命名为KM8034，而来自高表达KM8034的CHO/DG4细 胞的转化细胞克隆也同样命名为KM8034，将表现出与KM8034同等的 高结合反应的CHO/DG4细胞的CDR移植抗体HVOLV4-3/CHO命名为 KM8035，而来自高表达KM8035的CHO/DG4细胞的转化细胞株也同样 命名为KM8035。序列38给出了KM8035的VL的氨基酸序列LV.4-3。 转化细胞株KM8035于平成14年6月20日以FERM BP-8082保藏于独立 行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国 茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。将表现出与KM8034同等的高 FGF-8中和活性的CHO/DG4细胞由来的CDR移植抗体HVOLV3- 1/CHO命名为KM8036，而来自高表达KM8036的CHO/DG4细胞的转化 细胞克隆也同样命名为KM8036。序列39给出了KM8036的VL的氨基酸 序列LV.3-1。转化细胞株KM8036于平成14年6月20日以FERM BP- 8083保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305 -8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
抗FGF-8中和CDR移植抗体KM8034表现出与嵌合抗体KM3034 同等的高结合反应和FGF-8中和活性，而且，在人的免疫原性比嵌合 抗体更低，所以预期治疗效果比嵌合抗体更高。就抗FGF-8中和CDR 移植抗体KM8036和KM8035来说，与KM8034相比，结合活性和FGF- 8中和活性可能低一些，由于各个来自小鼠抗体KM1334的V区FR的氨基 酸残基变成了3残基和4残基，所以预期免疫原性比KM8034更低。
本发明提供作为有效成分含有抗FGF-8中和抗体的关节炎预防药 或治疗药、软骨保护剂、关节破坏抑制剂、滑膜增殖抑制剂、以及作为 有效成分含有抗FGF-8中和抗体的关节炎诊断药和使用该抗体的关节 炎的判定方法。
序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>关节炎的治疗药
<130>1442
<150>JP2001-400677
<151>2001-12-28
<160>51
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>420
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<223>发明人：田村忠史；内井雅子；须田敏郎
发明人：三木一郎；田中亨
<220>
<221>来源
<222>(1)..(420)
<223>/生物＝″小家鼠″
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(420)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>1
atg gaa tgg atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt 48
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc tac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga gct gag gtg gcg agg 96
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
ccc ggg gct tca gtg aaa ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
act gac tac tat cta aac tgg gtg aag cag agg tct gga cag ggc ctt 192
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga gag att gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat 240
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
gaa aac ttg gag ggc agg gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat ttc tgt gca aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc 384
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca 420
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210>2
<211>140
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>2
Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
130 135 140
<210>3
<211>393
<212>DNA
<213>小家鼠
<220>
<221>来源
<222>(1)..(393)
<223>/生物＝″小家鼠″
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(393)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>3
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
tcc agg agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agt ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
gta cat agt aat gga aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cct 192
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tca cca aag gtc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga att tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
ttt cag ggt tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210>4
<211>131
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>4
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210>5
<211>121
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
115 120
<210>6
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>6
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>7
Asp Tyr Tyr Leu Asn
1 5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>8
Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Glu
1 5 10 15
Gly
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>9
Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr
1 5 10
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>11
Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>12
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VH的扩增的引物
<400>13
ctgaattcgc ggccgctagt cc 22
<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VH的扩增的引物
<400>14
atgggccctt ggtggaggct gtagagacag tgaccagag 39
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VL的扩增的引物
<400>15
ctgaattcgc ggccgctgct gt 22
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于KM1334的VL的扩增的引物
<400>16
atcgtacgtt ttatttccag cttggtcc 28
<210>17
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>C末端附加半胱氨酸残基的人FGF-8的肽(23～46的氨基酸残基)
<400>17
Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr Gln His Val Arg Glu
1 5 10 15
Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Cys
20 25
<210>18
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列、HV.0
<400>18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>19
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.0
<400>19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>20
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VH氨基酸序列、HV.6
<400>20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>21
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.6
<400>21
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>22
<211>504
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码HV.0的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(466)
<220>
<221>信号肽
<222>(47)..(103)
<400>22
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55
Met Glu Trp
atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103
Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser
-15 -10 -5 -1
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag ccc ggg gcc 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
tat cta aac tgg gtg cgg cag gcc ccc gga caa ggg ctt gag tgg atg 247
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 391
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
agtcgtgact gggaaaac 504
<210>23
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>23
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60
gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120
gtctggggct gaggtgaaga a 141
<210>24
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>24
aggatcgatc tctcccatcc actcaagccc ttgtccgggg gcctgccgca cccagtttag 60
atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120
cttcttcacc tcagccccag a 141
<210>25
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>25
ggatgggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60
gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120
gatctgagga cacggccgtg t 141
<210>26
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>26
gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60
ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagtaa 120
tacacggccg tgtcctcaga t 141
<210>27
<211>504
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码HV.6的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(466)
<220>
<221>信号肽
<222>(47)..(103)
<400>27
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55
Met Glu Trp
atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103
Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser
-15 -10 -5 -1
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg gcg agg ccc ggg gcc 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
tat cta aac tgg gtg cgg cag agg tct gga caa ggg ctt gag tgg att 247
Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu
50 55 60
gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat ttc tgt 391
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439
Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
agtcgtgact gggaaaac 504
<210>28
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>28
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60
gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120
gtctggggct gaggtggcga g 141
<210>29
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>29
aggatcgatc tctccaatcc actcaagccc ttgtccagac ctctgccgca cccagtttag 60
atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120
cctcgccacc tcagccccag a 141
<210>30
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>30
ggattggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60
gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120
gatctgagga cacggccgtg t 141
<210>31
<211>141
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码HV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>31
gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60
ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagaaa 120
tacacggccg tgtcctcaga t 141
<210>32
<211>459
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码LV.0的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(432)
<220>
<221>信号肽
<222>(40)..(96)
<400>32
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54
Met Lys Leu Pro Val
-15
agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat atc 102
Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Ile
-10 -5 -1 1
gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg 150
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro
5 10 15
gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198
Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
20 25 30
aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca cag 246
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
35 40 45 50
ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg
55 60 65
ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
70 75 80
gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat tac tgc ttt cag ggt tca cat 390
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His
85 90 95
gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459
<210>33
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>33
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60
ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgata tcgtgatgac tcagtctcca 120
ctctccctgc 130
<210>34
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>34
agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60
actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca ggggtgacgg gcagggagag 120
tggagactga 130
<210>35
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>35
tgcagaagcc aggccagtct ccacagctcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60
gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120
gggtggaggc 130
<210>36
<211>129
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.0的DNA的构建的合成DNA
<400>36
gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60
gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagta ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120
gctgatttt 129
<210>37
<211>459
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码LV.6的DNA
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(432)
<220>
<221>信号肽
<222>(40)..(96)
<400>37
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54
Met Lys Leu Pro Val
-15
agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat gtt 102
Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Val
-10 -5 -1 1
gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc agt ctt gga gag ccg 150
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Glu Pro
5 10 15
gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198
Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
20 25 30
aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aag 246
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
35 40 45 50
gtc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294
Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg
55 60 65
ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
70 75 80
gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat ttc tgc ttt cag ggt tca cat 390
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly Ser His
85 90 95
gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
120 125 130
cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459
<210>38
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>38
caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60
ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgatg ttgtgatgac tcagtctcca 120
ctctccctgc 130
<210>39
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>39
agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60
actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca agactgacgg gcagggagag 120
tggagactga 130
<210>40
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>40
tgcagaagcc aggccagtct ccaaaggtcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60
gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120
gggtggaggc 130
<210>41
<211>129
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.6的DNA的构建的合成DNA
<400>41
gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60
gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagaa ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120
gctgatttt 129
<210>42
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-1
<400>42
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>43
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-2
<400>43
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>44
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-1
<400>44
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>45
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-2
<400>45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>46
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.2-1
<400>46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.2-2
<400>47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.3-1的DNA的构建的引物
<400>48
atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acaggtcct 39
<210>49
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于编码LV.2-2的DNA的构建的引物
<400>49
atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acagctcct 39
<210>50
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.4-3
<400>50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>51
<211>112
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的抗FGF-8中和CDR移植抗体的VL氨基酸序列、LV.3-3
<400>51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 促进骨和关节的生长、修复以及维持的食品添加剂 | 2020-05-11 | 687 |
| 三元天然聚合物粘弹性组合物 | 2020-05-24 | 978 |
| 套盒及优化软骨保护组合物的效力的方法 | 2020-05-13 | 286 |
| 一种远红外热磁灸疗贴保护剂及其磁灸疗贴 | 2020-05-21 | 664 |
| 一种角膜表面保护剂在全麻手术中的应用 | 2020-05-16 | 798 |
| 低碳水化合物组合物、其套盒及其使用方法 | 2020-05-18 | 94 |
| 魟鱼提取物的制备方法及在酒精性肝保护药物中的应用 | 2020-05-24 | 27 |
| 角膜表面保护剂及其制备方法和应用 | 2020-05-19 | 783 |
| 一种生物工程脱细胞软骨的制备方法 | 2020-05-14 | 972 |
| 一种可获得高活性软骨细胞的消化液 | 2020-05-18 | 246 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈