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一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法

阅读：632发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种RNAi技术联合小剂量5‑ 氨基酮戊酸（ALA）诱导肿瘤细胞原卟啉IX（PpIX）积聚的方法，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi基因沉默技术抑制亚铁螯合酶（FECH）的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞。本发明还提供了上述RNAi所用的三个双链siRNA 片段，对FECH具有很高的沉默效率。利用本发明的方法和双链siRNA片段，可在只使用小剂量外源性ALA的情况下，即可获得大量的PpIX并使其积聚在肿瘤细胞，实现肿瘤病灶的标示，尤其是对于早期肿瘤的标示，具有显著的意义。，下面是一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种利用RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的试剂盒，其特征在于，包含有ALA和利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所需的试剂；该试剂盒的使用方法是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞；其中，所述利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补；所述沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达是利用双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者联用；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反义链的核苷酸序列分别与SEQ ID NO.1所示序列的740、1072、3389位开始的一段核苷酸序列互补；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～
7所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述添加小剂量ALA是指体外细胞实验中低于或等于0.1mM 的ALA浓度，或动物实验中低于或等于1毫克/公斤体重的ALA浓度。
3.一种干扰抑制亚铁螯合酶FECH表达的双链siRNA，其特征在于，为双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者的组合；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。
4.权利要求3所述双链siRNA在制备肿瘤诊断试剂方面的应用。

说明书全文

一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法。

背景技术

[0002] 癌症已成为威胁人类健康和生命的一大杀手，而癌症的发现往往都已处于中晚期，约75％的患者就诊时肿瘤已到进展期，肿瘤已发生转移。而早期癌症病灶的发现对癌症的治疗具有至关重要的意义，但是目前大部分癌症均缺乏早期症状及有效的诊断方法。

[0003] 肿瘤选择性积聚原卟啉IX(Pp1X)已被证实伴随于成瘤过程的早期，可发生在有或无外源性5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)诱导的情况下。研究发现，亚铁螯合酶(FECH)可催化二价铁嵌入原卟啉IX(PpIX)生成血红素，而很多类型肿瘤的亚铁螯合酶(FECH)活力较正常细胞为低，所以将PpIX转化为血红素减少，从而导致肿瘤组织中PpIX增多，在此基础上，使用合适波长及能量的光源激发肿瘤内部蓄积的PpIX后，比较不同组织部位的PpIX荧光含量及分布差异，就可发现早期微小癌灶。

[0004] 目前，国内外一直采用大剂量外源性5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)的方式来增加肿瘤细胞内PpIX的合成量，以便标示肿瘤病灶。而因为部分肿瘤的FECH活性并未明显降低，故能够将外源性ALA诱导产生的细胞内源性PpIX转化为血红素，从而使PpIX迅速流失，因此该方式往往只能产生低浓度的肿瘤PpIX，必须使用更大剂量的ALA，才能产生足够的Pp1X在肿瘤组织积聚。采用大剂量使用5-氨基酮戊酸(ALA)的方式，不仅存在上述的缺陷，而且大剂量的ALA用量还极易产生严重的全身尤其神经毒副作用。

[0005] 发明人前期研究利用RNAi技术阻断FECH基因的表达，在此基础上辅小剂量的外源性ALA，通过增加合成、减少去路的双重效能的方式以提高肿瘤细胞原卟啉IX积聚浓度，从而改善了单用大剂量外源性ALA的模式难收集较高浓度的PpIX的方法上的不足。但是，在利用RNAi技术阻断FECH表达的效能方面，目前所使用单段siRNA的方法仍有很大的改进空间，虽然理论上使用单段siRNA可达到很高的基因敲减率，但是以我们多年的实际操作经验及实验结果分析可知，实际工作中该方法一般只能达到约60～65％范围水平的基因敲减率，因此，在此基础上辅以小剂量外源性ALA标示肿瘤病灶的效果不甚理想，尤其是针对早期病灶的标示。

[0006] 因提高RNAi技术阻断FECH表达的效能是提高肿瘤细胞PpIX积聚浓度的最关键的环节，因此，探索更有效地提高对肿瘤细胞FECH基因的敲减率的方法，已成为此技术领域中的一项重大挑战。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有RNAi技术结合小剂量外源性ALA标示肿瘤病灶技术的缺陷和不足，提供一种更有效的RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，该方法利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶(FECH)的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞，达到使用小剂量外源性ALA即可有效标示肿瘤病灶的目的，提高肿瘤的检出率。

[0008] 本发明的目的是提供一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法。

[0009] 本发明另一目的是提供上述方法中所使用的RNAi干扰序列及其在肿瘤诊断方面的应用。

[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0011] 一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞；其中，所述利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补。

[0012] 进一步地，所述沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达是利用双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者联用；所述740FECH-siRNA、
1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反义链的核苷酸序列分别与SEQ ID NO.1所示序列的
740、1072、3389位开始的一段核苷酸序列互补；该段互补的核苷酸序列由18～29个连续的核苷酸组成。

[0013] 优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19～25个连续的核苷酸组成。

[0014] 更优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19～23个连续的核苷酸组成。

[0015] 最优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19个连续的核苷酸组成。

[0016] 另外，优选地，所述双链siRNA片段的两条链的3’端含有二核苷酸，而且这二核苷酸最好是uu。

[0017] 具体地，作为一种优选的实施方案，所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。即如下所示：

[0018] (1)双链740FECH-siRNA

[0019] 正义链740FECH-S1(如SEQ ID NO.2所示)：

[0020] 5'GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3'(第二条链)；

[0021] 反义链740FECH-AS1(如SEQ ID NO.3所示)：

[0022] 3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'(第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。

[0023] (2)双链1072FECH-siRNA

[0024] 正义链1072FECH-S2(如SEQ ID NO.4所示)：

[0025] 5'GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3'(第二条链)；

[0026] 反义链1072FECH-AS2(如SEQ ID NO.5所示)：

[0027] 3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'(第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。

[0028] (3)双链3389FECH-siRNA

[0029] 正义链3389FECH-S3(如SEQ ID NO.6所示)：

[0030] 5'CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3'(第二条链)；

[0031] 反义链3389FECH-AS4(如SEQ ID NO.7所示)：

[0032] 3'UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5'(第一条链，与与SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸：
caggcaaagaggaatttat)。

[0033] 另外，进一步地，上述的添加小剂量ALA是指本发明所述之体外细胞实验中低于或等于0.1mM的ALA浓度，或本发明所述之动物实验中低于或等于1毫克/公斤体重的ALA浓度。

[0034] 另外，根据所述的内容，一种干扰抑制亚铁螯合酶FECH表达的双链siRNA也在本发明的保护范围之内，所述双链siRNA为双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者的组合；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。

[0035] 而且，上述双链siRNA在制备肿瘤诊断试剂方面的应用也应在本发明的保护范围之内。这种核酸分子可以单独使用或与其它物质结合使用时可作为药物和/或诊断试剂。例如，这项发明的核酸分子可能包含给药的运输载体，包括脂质体，载体和稀释剂及它们的盐和/或这种载体是药学中被接受的某种剂型。

[0036] 上述双链siRNA还可用于制备药物组合物，这个组合含有一个或多个本发明的核酸分子，即所述的双链siRNA，核酸分子位于一个可接受的载体中，如稳定剂，缓冲剂等类似物质。

[0037] 上述的药物组合物也可以制造成口服的片剂，胶囊或酏剂，直肠给药的栓剂，可注射给药的无菌溶液，悬浮液，和其它已知的复合体。

[0038] 另外，上述运输载体，即运输该核酸分子(双链siRNA)的载体最好是表达载体，并且最好能提供特异性的或靶向的运输方式。

[0039] 本发明具有以下有益效果：

[0040] 本发明提供了一种有效诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，并且只需使用小剂量的外源性ALA，具体方法是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得大量的PpIX积聚在肿瘤细胞。

[0041] 同时，本发明提供了上述RNAi所用的双链siRNA片段，即740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA，对FECH具有很高的沉默效率，利用其沉默处理的同时，添加小剂量外源性ALA，即可快速、有效地使得PpIX大量积聚在肿瘤细胞，可实现肿瘤病灶的标示，尤其是对于早期肿瘤的标示，具有显著的意义。
附图说明

[0042] 图1为荧光定量PCR检测FECH基因表达水平的结果。

[0043] 图2为Western blot转膜时的叠放顺序。

[0044] 图3为Western blot结果。

[0045] 图4为荧光定量光谱仪检测转染siRNA和/或加ALA处理后的MDA-MB-435细胞内的PpIX浓度。

[0046] 图5为显微荧光定量检测0.1mM ALA处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。

[0047] 图6为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。

[0048] 图7为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上0.1mM剂量的ALA细胞内的PpIX的积聚情况。

[0049] 图8为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上1mM剂量的ALA,细胞内的PpIX的积聚情况。

[0050] 图9为激光共聚焦显微镜检查肿瘤细胞内积聚的PpIX荧光。

[0051] 图10为动物实验的肿瘤组织所产生的PpIX红色荧光观察结果。

具体实施方式

[0052] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0053] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0054] 以下实施例中所用细胞株为人乳腺癌细胞株MDA-MB-435。

[0055] 所用培养基：DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、磷酸缓冲液(PBS)、青链霉素双抗溶液(Penicillin-Streptomycin)均购自Gibco公司。

[0056] 所用试剂：阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit，Qiagen公司)、阴性对照siRNA(negative control siRNA，Qiagen)、Trizol(Invitrogen公司)、 RT Master Mix kit(TaKaRa)、 Premix EX TaqTM II kit(TaKaRa)、基因表达试剂盒(美国应用生物系统公司)、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)、抗体Anti-FECH(Santa Cruz)、抗体anti-GAPDH(Santa Cruz)、30％甲叉双丙烯酰胺(30％Acrylamide/Bis Solution，Bio-rad)、TEMED(Bio-rad)、细胞裂解液(Bio-rad)、磷酸酶抑制剂(Bio-rad)。

[0057] 所用仪器：水套式CO2培养箱(Forma II Water Jacketed CO2Incubator，Thermo)、激光共聚焦显微镜、倒置显微镜、Spectra Max M2多功能酶标仪、ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪等均为市购。

[0058] 另外，以下实施例中所用的统计学方法：采用spss 15.0统计软件进行统计学处理，实验结果(均数±标准差)表示。应用组间t检验，p<0.05有统计学意义，纵坐标每个值代表三次独立实验平均值。

[0059] 实施例1FECH-siRNA的设计

[0060] 以NCBI网站上的序列NM_000140.2(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为根据，设计了3个双链siRNA片段，分别为740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示：

[0061] 1、双链740FECH-siRNA

[0062] (1)740FECH-S1(如SEQ ID NO.2所示)：

[0063] 5'GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3'(正义链，第二条链)；

[0064] (2)740FECH-AS1(如SEQ ID NO.3所示)：

[0065] 3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'(反义链，第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸互补)。

[0066] (SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。

[0067] 2、双链1072FECH-siRNA

[0068] (1)1072FECH-S2(如SEQ ID NO.4所示)：

[0069] 5'GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3'(正义链，第二条链)；

[0070] (2)1072FECH-AS2(如SEQ ID NO.5所示)：

[0071] 3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'(反义链，第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸互补)。

[0072] (SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。

[0073] 3、双链3389FECH-siRNA

[0074] (1)3389FECH-S3(如SEQ ID NO.6所示)：

[0075] 5'CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3'(正义链，第二条链)；

[0076] (2)3389FECH-AS4(如SEQ ID NO.7所示)：

[0077] 3'UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5'(反义链，第一条链，与与SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸互补)。

[0078] (SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸：caggcaaagaggaatttat)。

[0079] 实施例2FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的mRNA表达水平

[0080] 1、细胞培养

[0081] (1)人乳腺癌细胞株MDA-MB-435培养液条件为90％DMEM培养基+10％FBS+1％双抗(青霉素100IU/ml+链霉素100μg/ml)，于恒温细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养。

[0082] (2)待细胞生长至85％左右时用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化传代培养。取对数生长期的细胞用阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit)进行转染。

[0083] 2、细胞转染

[0084] (1)细胞分组，实验共设6组，分别为：

[0085] 1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；

[0086] 2)单用0.1mM ALA组；

[0087] 3)50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；

[0088] 4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0089] 5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0090] 6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。

[0091] (2)细胞转染siRNA及加ALA处理

[0092] 1)将对数生长期的MDA-MB-435单细胞悬液按2×105/孔接种至6孔板，用含双链霉素Penicillin-Streptomycin的完全培养基培养24小时。

[0093] 2)24h后待细胞融合度达到60％进行转染，用转染试剂盒内的buffer将各组siRNA浓度稀释至0.1ug/μL。按表1所示进行操作：

[0094] 表1

[0095]

[0096]

[0097] 3)将以上各组分用移液枪吹打三次混匀，室温(15℃～25℃)，静置5min。

[0098] 4)向以上6组的管中各加入转染剂(Transmessenger)8.8μL。

[0099] 5)用移液枪吹打五次混匀，室温(15℃～25℃)，静置10min。

[0100] 6)从细胞培养箱取出六孔板，去掉旧的培养基，用PBS洗两次。

[0101] 7)每孔加500μL DMEM培养基(不含血清不含双抗)，然后相应每孔直接加入以上混合液100μL，使得每孔总体积为600μL，混合摇匀。

[0102] 8)在正常培养情况下孵育12h。

[0103] 9)孵育12h后，去除旧的培养基每孔直接加入2ml DMEM完全培养基。

[0104] 10)接种48h后进行二次转染，去除旧的培养基后，操作同上。

[0105] 11)100mM ALA的配制：精确称取16.76mg的ALA，溶于1ml PBS。

[0106] 12)接种72h后，去除旧的培养基，用PBS洗两次，每次2ml。之后加入1ml无血清无双抗的DMEM培养基，相应组加0.1mM ALA，即从100mM ALA吸取1μL，加入ALA后，轻轻摇匀。

[0107] 13)ALA作用4个小时，进行定量PCR。

[0108] 3、荧光定量PCR

[0109] (1)分别利用FECH基因(FECH-1、FECH-2、FECH-3)引物和GAPDH引物，进行荧光定量PCR。

[0110] 上述引物的序列如下，均由invitrogen公司合成。其核苷酸序列如下所示：

[0111] FECH基因引物：

[0112] 上游引物：atggaggtggaagtcaggtg

[0113] 下游引物：gtcatgaggtctcggtccaa

[0114] 内参基因GAPDH引物：

[0115] 上游引物：agcctcaagatcatcagc

[0116] 下游引物：gagtccttccacgatacc

[0117] (2)从转染的细胞中提取总RNA

[0118] 转染72h后，细胞融合度达到90％，按照下面实验步骤提取细胞的总RNA：

[0119] 1)预冷Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇；

[0120] 2)吸掉细胞培养基，用预冷的PBS洗2次，加1ml Trizol，反复吹打，然后转移至无RNA酶的1.5ml的EP管中，室温静置5min；

[0121] 3)加200μL氯仿，上下用力颠倒15s，室温静置3min；

[0122] 4)离心12000rpm，4℃，15min；

[0123] 5)吸取上清液至新的1.5ml的EP管中，加异丙醇500μL，上下轻柔颠倒15s，室温静置10min；

[0124] 6)离心12000rpm，4℃，10min；

[0125] 7)去掉上清液，加入1ml的无水乙醇轻柔漂洗沉淀；

[0126] 8)离心7500rpm，4℃，5min；

[0127] 9)去掉液体，加入1ml的80％乙醇轻柔漂洗沉淀；

[0128] 10)7500rpm，4℃，5min；

[0129] 11)去掉上清液，干燥RNA 5min；

[0130] 12)加入15μL的0.1％DEPC灭菌水溶解。

[0131] (3)总RNA逆转录为cDNA

[0132] 1)总RNA浓度的测定：将各个样品稀释50倍，用UV板分别测定每个样品在260nm和280nm的吸亮度，选择OD260/OD280的比值为1.7至2.2之间的样品进行下一步实验；根据以下公式计算总RNA的浓度：总RNA(μg/μl)＝40×OD260×50/1000。

[0133] 2)各样品取500ng的总RNA按照Takara的逆转录试剂盒 RT Master Mix的说明书，用随机引物进行逆转录成cDNA，于-20℃保存。

[0134] (4)PCR扩增人FECH基因

[0135] 1)将逆转录后的cDNA稀释3倍后，各取1μl的cDNA稀释液进行PCR扩增；实验重复3次。

[0136] 2)扩增体系如下：

[0137]

[0138]

[0139] 其中，上下游引物混合液的终浓度为10μM。

[0140] 在0.2ml PCR管中加入下列组分后，充分混匀。

[0141] 3)扩增条件如下：95℃30s，40循环(95℃5s、61℃30s)。

[0142] (5)Taqman荧光定量PCR按基因表达试剂盒说明操作。

[0143] 4、实验结果

[0144] 荧光定量PCR检测FECH基因表达水平的结果如附图1所示。图中，从左至右依次为：

[0145] (1)NCT：只加转染剂处理组(阴性对照组)；

[0146] (2)ALA：单用0.1mM ALA组；

[0147] (3)PCTsiRNA：50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；

[0148] (4)740siRNA：50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0149] (5)1072siRNA：50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0150] (6)3389siRNA：50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。

[0151] 结果显示：PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组，在抑制FECH mRNA表达方面的作用，分别和只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组比较，均有统计学的明显差异(P<0.01)，说明PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM
1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组敲减FECH mRNA表达的作用明显高于只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA这两组。而且，PCTsiRNA组敲减FECH mRNA表达的作用明显高于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。

[0152] 实施例3FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的蛋白表达水平

[0153] 1、本实施例用Western blotting法检测实施例2中各组细胞FECH蛋白表达水平，方法如下：

[0154] (1)提取总蛋白：收集二次转染后的MDA-MB-435细胞，按照以下方法提取细胞总蛋白(整个过程在冰上进行)：

[0155] 1)去除培养液，用预冷的PBS洗2次。

[0156] 2)每孔加入加100μl含PMSF的裂解液，用刮刀来回滑动，使裂解液和细胞充分接触。

[0157] 3)充分裂解后，将细胞裂解液移至500μl的离心管，4℃，12000g离心10分钟，取上清移至新的离心管。

[0158] 4)用考马斯亮蓝法测定总蛋白的浓度。

[0159] 2、Western blot：按照以下步骤进行western blot：

[0160] 1)制10％的SDS-PAGE凝胶：先加10％分离胶，用去离子水密封胶顶部，然后凝固20分钟；倒掉水，用滤纸吸干，然后加5％的浓缩胶，迅速插入加样梳，再用浓缩胶液将气泡排除，再凝固30分钟即可。

[0161] 2)SDS-PAGE电泳：各样品总蛋白上样量为90μg。

[0162] 3)转膜：将滤纸、海绵垫、放置于电转液中，浸泡30-60min，同时准备与大小与凝胶相同的PVDF膜(蛋白分子量大于100kD用0.45μm的PVDF膜，小于100kD的则用0.2μm的PVDF膜)，在甲醇中提前浸泡20s，使PVDF膜半透明，然后用ddH2O洗2次，然后放置于转移液中泡30min，或更久。SDS-PAGE完成后，取下分离胶，将分离胶，PVDF膜以及两层滤纸按顺序放好，放到放好海绵的黑白板上。(即：从黑色负极端依次从下至上为：海绵垫/滤纸/胶/PVDF膜/滤纸/海绵垫。)

[0163] 使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300mA，转膜时间为90分钟。电转时要释放很多热量，所以槽内要放入专用的冰盒，整个电泳槽置于盛有冰的盆中，叠放顺序如图2所示。

[0164] 4)封闭：转膜完成后，立即将PVDF膜用TBS洗涤2次，5min/次；膜吸干后放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭90min。封闭结束后，用TBST洗3次，10min/次。

[0165] 5)一抗孵育：用TBST配制anti-FECH抗体(稀释比为1：300)和anti-GAPDH抗体(稀释比为1：1000)，将膜放入其中，在摇床上缓慢摇动孵育(常温1h→4℃过夜→常温1h)。孵育结束后，用TBST洗3次，10min/次。

[0166] 6)二抗孵育：用TBST配制相应的二抗(稀释比为1：3000)，将膜放入其中，在摇床上缓慢摇动孵育(常温2h)。孵育结束后，用TBST洗3次，10min/次。

[0167] 7)ECL显影：ECL Western Blotting Substrate reagent试剂盒，A液和B液按1：1混合两种分光底物，均匀铺在膜上，作用1分钟。用凝胶成像系统ChemiDoc XRS拍照。

[0168] 2、Western Blot结果如附图3所示。图3中，从左至右依次为：

[0169] (1)NCT：只加转染剂处理组(阴性对照组)；

[0170] (2)ALA：单用0.1mM ALA组；

[0171] (3)740siRNA：50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0172] (4)1072siRNA：50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0173] (5)3389siRNA：50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0174] (6)PCTsiRNA：50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs。

[0175] 结果显示：PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组,分别和只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组比较,对FECH基因在蛋白水平的抑制作用明显增加,均有统计学的明显差异(P<0.01).说明PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、
50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组对FECH基因在蛋白水平的抑制作用远强于只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组。而且，PCTsiRNA组对FECH基因在蛋白水平的抑制作用远强于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。

[0176] 实施例4用FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后在细胞内检测到的PpIX浓度

[0177] 1、细胞培养，同实施例2。

[0178] 2、细胞转染

[0179] (1)细胞分组

[0180] 同实施例2，实验共设6组，分别为：

[0181] 1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；

[0182] 2)单用0.1mM ALA组；

[0183] 3)50nMPCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；

[0184] 4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0185] 5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0186] 6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。

[0187] (2)细胞转染siRNA及加ALA处理，同实施例2，不同之处仅在于在最后ALA作用4个小时后，是作相关定量检测(而不是定量PCR)。

[0188] 3、荧光定量光谱仪检测

[0189] 荧光定量光谱仪检测转染siRNA和/或加ALA处理后的MDA-MB-435细胞内的PpIX浓度，结果如附图4所示。图4中，从左至右依次为：

[0190] (1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；

[0191] (2)单用0.1mM ALA组；

[0192] (3)50nMPCTsiRNA+0.1mM ALA组：

[0193] 是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；

[0194] (4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0195] (5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；

[0196] (6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。

[0197] 结果显示，用0.1mM的ALA处理后不能诱导明显的PpIX在肿瘤细胞内积聚，但如果用50nM 3389-FECH-siRNA+0.1mM ALA处理MDA-MB-435细胞，在肿瘤细胞内积聚的PpIX浓度比单用ALA处理组要高出近50倍。而且，其他两组(50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组)也都显著高于单用ALA处理组。

[0198] 因此，分别利用本发明所提供的三个双链siRNA和小剂量ALA联用，均可大幅提高肿瘤细胞内积聚的PpIX浓度，而且三个双链siRNA联用效果更好。

[0199] 4、显微荧光定量检测

[0200] 分别利用0.1mM ALA、50nM 3389FECH-siRNA(单用siRNA阻断FECH表达)的处理、50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA(siRNA阻断FECH表达+ALA)的处理，以及50nM 3389FECH-siRNA+1mM ALA(siRNA阻断FECH表达+ALA)的处理，显微荧光定量检测处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。

[0201] 结果如附图5～8所示。

[0202] (1)阴性对照组(单用0.1mM ALA)的显微荧光定量检查的结果如附图5所示：X轴代表背景杂散光，y轴代表PpIX荧光。scatter plots图显示代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值很低，只有约25个PpIX计量单位/每毫秒。

[0203] (2)如图6所示，用50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值高达250个PpIX计量单位/每毫秒。

[0204] 检查的结果表明：单用siRNA阻断肿瘤细胞亚铁螯合酶的表达就可以导致PpIX在肿瘤细胞内积聚，产生有诊断性价值的PpIX红色荧光。

[0205] (3)如图7所示,联用50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA处理MDA-MB-435细胞后,可以在肿瘤细胞内检测到PpIX荧光斑点峰值约达490个PpIX计量单位/每毫秒.[0206] (4)如图8所示，用50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上1mM剂量的ALA，可诱导更高浓度的PpIX在肿瘤细胞内积聚，代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值高达3000个PpIX计量单位/每毫秒。

[0207] 这些结果表明了：与单用ALA处理组相比，先用siRNA处理再加上同等剂量的ALA，可诱导肿瘤细胞合成更高产量的内源性PpIX。

[0208] 5、激光共聚焦显微镜检测

[0209] 利用激光共聚焦显微镜检查肿瘤细胞内积聚的PpIX荧光，同时还设置了阴性对照siRNA组，目的是为了证明有效的实验组siRNA没有脱靶作用而设计的一段与实验组siRNA核苷酸数目相同，但打乱序列，并经过“BLAST”证实与人类基因无关的一段siRNA。

[0210] 结果如附图9所示。肿瘤细胞先用siRNA处理再加上0.05mM的极低剂量的ALA，可以在肿瘤细胞内观察到很强的PpIX红色荧光(图9C)，而单用ALA组(图9A)和阴性对照siRNA加ALA组(图9B)则观察不到PpIX荧光。

[0211] 实施例5动物体内试验

[0212] 1、材料及仪器

[0213] siRNA由本发明人设计后交由广州锐博生物有限公司合成；ALA购自Sigma-Aldrich Corporation,Beijing local agent,China；阳离子类脂DOTAP、胆固醇Cholesterol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、叶酸修饰聚乙二醇磷脂DSPE-PEG(2000)-Folate购自美国avanti磷脂公司，HP1100型高效液相色谱仪(Agilent，美国)，Nano Series Zen 4003ZetaSizer(Malvern instruments，英国)，SPI3800N series SPA-400型原子力显微镜(日本)。

[0214] 2、脂质体各组份摩尔比如表2所示：

[0215] 表2脂质体的组成和配方(1000μl脂质体)

[0216]

[0217] 3、包裹siRNA脂质体的制备：

[0218] 1)安装好旋转蒸发仪的各部件，使得仪器稳固，装上接受瓶，用卡口卡牢，打开冷凝水。将阳离子类脂DOTAP，胆固醇Cholesterol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC，二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE，叶酸修饰聚乙二醇磷脂DSPE-PEG(2000)-Folate按以上配方的摩尔比溶解在氯仿中混合溶解后加入烧瓶中，装好烧瓶，用卡口卡牢。

[0219] 2)打开水泵电源，抽真空，待烧瓶吸住后，用升降控制开关将烧瓶置于水浴内。

[0220] 3)打开旋转蒸发仪的电源，转速旋钮慢慢往右旋，调整至稳定的转速。

[0221] 4)加热水浴，设定加热温度58℃。

[0222] 5)在设定温度下旋转蒸发，待烧瓶内液体挥发完全，瓶壁上形成一层均匀薄膜.[0223] 6)蒸发完后使用升降控制开关使烧瓶离开水浴，关闭转速旋钮,停止旋转,打开真空活塞，通大气，取下烧瓶，关闭水泵。在烧瓶内加入2ml PBS溶液以溶解薄膜，[0224] 7)在摇床上避光振摇过夜，

[0225] 8)通过脂质体挤压器，制成100nm～120nm的ALA脂质体。

[0226] 9)测脂质体纳米颗粒的平均粒径、多分散系数以及zeta电位后4℃保存。

[0227] 4、动物实验过程

[0228] (1)选取5周龄雌性裸鼠36只，每组6只，用DMEM培养基制备细胞悬液，皮下注射细7
胞悬液0.2ml(每毫升细胞悬液含有MDA-MB-435细胞1×10个)，在SPF级中饲养。

[0229] (2)待肿瘤长至5mm大小时，动物标记好，开始进行实验。

[0230] (3)动物分组处理，共设6组，分别如下：

[0231] 1)单用50μL转染剂瘤内注射组(空白对照组)；

[0232] 2)单用1mg/kg ALA瘤内注射组；

[0233] 3)0.067nmol/g of PCTsiRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；

[0234] 4)0.067nmol/g of 740FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；

[0235] 5)0.067nmol/g of 1072FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；

[0236] 6)0.067nmol/g of 3389FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组。

[0237] (4)经上处理后用小动物成像仪检测裸鼠体内PpIX荧光。

[0238] 5、结果

[0239] (1)单用50μL转染剂组、单用ALA组的裸鼠均看不到肿瘤组织所产生的PpIX荧光。

[0240] 而联用FECH-siRNA和1mg每公斤体重浓度的小剂量的ALA后，直接用肉眼就能在裸鼠活体上观察到肿瘤组织所产生的PpIX红色荧光(如附图9所示)。

[0241] (2)统计结果如表3所示

[0242] 表3

[0243]

[0244]

[0245] 生物医学实验有一个特点，很多体外实验数据很不错，但一旦进入动物体内实验其效果就大打折扣了，所以，就采用外源性ALA的方式来增加肿瘤细胞内PpIX的合成量以便标示肿瘤病灶而言，实现体内试验的肿瘤灶的PpIX积蓄量才是硬指标，本发明利用RNAi技术成功阻断了亚铁螯合酶基因的表达，在此基础上辅以1mg/kg的极小剂量的外源性ALA，就能达到极佳的肿瘤荧光定位的效果。

[0246] 本发明以纯天然的内源性PpIX作为荧光标示剂，所获得的实验数据会更加客观可信，因为在生命科学的领域中，以原生态的方式做研究是应该被优先考虑的，原生态方式是指被研究对象如肿瘤细胞等并没有被任何外来物标记，其各种生物过程并没有受到外来因素的干扰，不会因为被研究而失真，属真实天然环境下的行为，所以具备将来应用于人体的潜在优势，将PpIX介导的肿瘤荧光成像技术开发成为筛检早期肿瘤的首选方法之一，将会有巨大的医疗及商业价值。

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