新的免疫刺激载体系统
阅读：587发布：2023-03-06
专利汇可以提供新的免疫刺激载体系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了用于免疫刺激的新的载体和在免疫 治疗 (特别是癌症免疫治疗)中使用其的方法。所述新的载体包含编码4-1BB配体(4-1BBL，CD137配体)、单链IL-12(sc IL-12)和IL-2的核酸序列，其中所述载体提供与sc IL-12和IL-12的表达 水 平相比4-1BBL的增加的表达。特别地，编码4-1BBL、sc IL-12和IL-2的核酸序列在所述载体中在5’到3’方向上以1、2、3的顺序组装，条件是编码sc IL-12的基因不在第1位。本公开的实施方案包括包含所述新的载体的病毒颗粒以及用所述新的载体转导或 转染 的癌细胞或免疫细胞。，下面是新的免疫刺激载体系统专利的具体信息内容。
1.载体，其包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的核酸序列，并且还包含至少一个调控核酸序列，优选启动子序列，提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比
4-1BBL增加的表达水平。
2.根据权利要求1所述的载体，其中，与由载体Im01(图20)的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比，所述4-1BBL的表达水平增加。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，与由载体Im01(图20)的表达构体获得的scIL-
12和/或IL-2的表达水平相比，所述scIL-12的表达水平减少和/或所述IL-2的表达水平增加。
4.根据权利要求1-3任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列在5’到3’方向上以1、2、3的顺序组装，条件是编码scIL-12的序列不在第1位。
5.根据权利要求1-4任一项所述的载体，其中，所述载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA载体、质粒载体、纳米粒载体和裸DNA中的任一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的核酸序列是人cDNA，所述编码scIL-12的核酸序列是人cDNA，和/或所述编码IL-2的核酸序列是人cDNA。
7.根据权利要求1-6任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的核酸序列显示出与SEQ ID NO:1的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码能够特异性结合活化的T细胞的4-1BBL蛋白。
8.根据权利要求1-6任一项所述的载体，其中，所述编码IL-2的核酸序列显示出与SEQ ID NO:3的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的IL-2蛋白。
9.根据权利要求1-6任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12的核酸序列显示出与SEQ ID NO:5的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的scIL-12蛋白。
10.根据权利要求1-9任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12和IL-2的核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的下游。
11.根据权利要求10所述的载体，其中，所述编码IL-2的核酸序列位于所述编码4-1BBL的核酸序列的下游，并且所述编码scIL-12的核酸序列位于所述编码IL-2的核酸序列的下游。
12.根据权利要求10或11所述的载体，其中，启动子位于所述编码4-1BBL的核酸序列的上游，但是不在所述编码scIL-12和/或IL-2的核酸序列的上游。
13.根据权利要求1-12任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。
14.用权利要求1-13任一项所述的载体转导或转染的癌细胞或免疫细胞。
15.包含权利要求1-13任一项所述的载体或权利要求14所述的癌细胞或免疫细胞的药物。
16.权利要求1-13任一项所述的载体、权利要求14所述的癌细胞或免疫细胞或权利要求15所述的药物，用于在治疗癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的方法中使用。
17.根据权利要求16所述用于使用的载体，或根据权利要求16所述用于使用的癌细胞或免疫细胞，或根据权利要求16所述用于使用的药物，其中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑上皮癌、头颈癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、非小细胞肺癌、头或颈上皮癌、乳腺上皮癌、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小细胞肺上皮癌、维尔姆斯瘤、宫颈上皮癌、睾丸上皮癌、膀胱上皮癌、胰腺上皮癌、胃上皮癌、结肠上皮癌、前列腺上皮癌、泌尿生殖器上皮癌、甲状腺上皮癌、食管上皮癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺上皮癌、肾细胞上皮癌、子宫内膜上皮癌、肾上腺皮质上皮癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类上皮癌、绒毛膜上皮癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤中的任一种。
18.权利要求1-13任一项所述的载体、权利要求14所述的癌细胞或免疫细胞、或权利要求15所述的药物，用于预防或治疗癌症转移的方法。
新的免疫刺激载体系统
技术领域
[0001] 本公开大体上涉及免疫领域，更具体地涉及免疫治疗领域。特别地，本公开涉及用于免疫刺激的新的载体系统和在免疫治疗中使用其的方法。新的载体系统的特征在于包含编码4-1BB配体(4-1BBL，CD137配体)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的核酸序列的一种或多种载体。
背景技术
[0002] 免疫系统提供了用于识别和破坏外来侵入物(例如细菌或病毒)以及体内受损、患病或异常细胞(包括癌细胞)的方式。免疫系统应答中的初始参与者包括巨噬细胞和自然杀伤细胞，其提供了一般或非特异性的免疫保护水平。其他细胞类型(包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和B淋巴细胞)起对抗特异性靶标的作用。免疫应答包括体液应答(其中B细胞产生抗原特异性抗体)和细胞介导的应答(其中抗原或载有抗原的细胞被多种类型的T细胞通过使用各种不同的机制识别和破坏)。细胞介导的免疫应答(包括CTL应答)被认为是消除肿瘤细胞和病毒感染的细胞的关键。
[0003] 通常认为免疫系统检测和破坏异常细胞的固有能力阻止了许多癌症的发展。尽管如此，一些癌症细胞发展了策略以逃避被免疫系统破坏。例如，存在几种不同的机制，癌症细胞可以使用其抑制免疫应答。它们也可以经历导致失去癌症相关抗原的遗传改变，使得它们对于免疫系统来说较不“可见”。相似的考虑对于不同的病毒适用，其也采取了免疫逃避策略，导致宿主的免疫系统不能控制病毒感染。
[0004] 免疫治疗的目标是克服这些障碍以达到有效的免疫应答。基于免疫治疗的生物治疗恢复或增强特异性免疫系统组分的活性或者抵消由癌症细胞或在病毒感染性疾病期间产生的免疫抑制信号。除其他外，肿瘤细胞被CTL以抗原特异性方式杀死。因此，对于增强肿瘤特异性免疫来说，提高T细胞活性并且赋予强的细胞溶解和炎性性质的试剂是理想的候选物。
[0005] 仍然需要新形式的治疗，并且免疫治疗的一种主要手段是基于基因转移技术。已经建立了基因治疗作为实现免疫治疗的一种方式。20年前最初建议将非复制性病毒和病毒载体作为抗癌试剂,其除其他以外利用免疫激活(例如，IL-2)模式(参见，例如，Crofts和Krimsky,2005,Hum Gene Ther.16:169-177)。WO2004/035799描述了包含编码单链IL-12(scIL-12)、共刺激蛋白4-1BB配体(4-1BBL)和IL-2的核酸序列的腺病毒载体，在感染性疾病和癌症的治疗中用于基因治疗。
[0006] 本公开涉及一种新的基于载体的免疫治疗，其代表了先前基因治疗方法的改进，有效用于将不活跃的免疫微环境转变为活跃的免疫微环境并从而治疗癌症和病毒感染。发明内容
[0007] 本公开提供包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的基因的核酸序列的载体，其中所述载体提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达。具体地，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列在所述载体中在5’到3’方向上以1、2、
3的顺序组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。本公开还提供了该新的载体用于将不活跃的免疫微环境转变为活跃的免疫微环境并从而治疗癌症或感染性疾病的方法和用途。
本公开的方法和组合物包括所请求保护的病毒载体的构建和验证，所述病毒载体引起针对癌细胞和病毒感染的免疫应答以增强和/或刺激针对癌症和病毒感染的免疫力。
3的顺序组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。本公开还提供了该新的载体用于将不活跃的免疫微环境转变为活跃的免疫微环境并从而治疗癌症或感染性疾病的方法和用途。
本公开的方法和组合物包括所请求保护的病毒载体的构建和验证，所述病毒载体引起针对癌细胞和病毒感染的免疫应答以增强和/或刺激针对癌症和病毒感染的免疫力。
[0008] 本公开的方面包括：
[0009] 1、载体，其包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的核酸序列，并且还包含至少一个调控核酸序列，优选启动子序列，提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平。
[0010] 2、第1项所述的载体，其中，与由载体Im01(图20)的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比，所述4-1BBL的表达水平增加。
[0011] 3、第1项或第2项所述的载体，其中，与由载体Im01(图20)的表达构体获得的scIL-12和/或IL-2的表达水平相比，所述scIL-12的表达水平减少和/或所述IL-2的表达水平增加。
[0012] 4、第1项至第3项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列在5’到3’方向上以1、2、3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的核酸序列不在第1位。
[0013] 5、第1项至第4项中任一项所述的载体，其中，所述载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA载体、质粒载体、纳米粒载体和裸DNA中的任一种。
[0014] 6、第1项至第5项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的核酸序列是人cDNA，所述编码scIL-12的核酸序列是人cDNA，和/或所述编码IL-2的核酸序列是人cDNA。
[0015] 7、第1项至第6项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的核酸序列显示出与SEQ ID NO:1的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码能够特异性结合活化的T细胞的4-1BBL蛋白。
[0016] 8、第1项至第6项中任一项所述的载体，其中，所述编码IL-2的核酸序列显示出与SEQ ID NO:3的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的IL-2蛋白。
[0017] 9、第1项至第6项中任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12的核酸序列显示出与SEQ ID NO:5的核酸序列至少70％的序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的scIL-12蛋白。
[0018] 10、第1项至第9项中任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12和IL-2的核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的下游。
[0019] 11、第10项所述的载体，其中，所述编码IL-2的核酸序列位于所述编码4-1BBL的核酸序列的下游，并且所述编码scIL-12的核酸序列位于所述编码IL-2的核酸序列的下游。
[0020] 12、第10项或第11项所述的载体，其中，启动子位于所述编码4-1BBL的核酸序列的上游，但是不在所述编码scIL-12和/或IL-2的核酸序列的上游。
[0021] 13、第1项至第12项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。
[0022] 14、用第1项至第13项中任一项所述的载体转导或转染的癌细胞或免疫细胞。
[0023] 15、包含第1项至第13项中任一项所述的载体或第14项所述的癌细胞或免疫细胞的药物。
[0024] 16、第1项至第13项中任一项所述的载体、第14项所述的癌细胞或免疫细胞或第15项所述的药物，用于在治疗癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱中使用，或用于在治疗癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的方法中使用。
[0025] 17、根据第16项所述的用于使用的载体，或根据第16项所述的用于使用的癌细胞或免疫细胞，或根据第16项所述的用于使用的药物，其中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑上皮癌、头颈癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、非小细胞肺癌、头或颈上皮癌、乳腺上皮癌、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小细胞肺上皮癌、维尔姆斯瘤、宫颈上皮癌、睾丸上皮癌、膀胱上皮癌、胰腺上皮癌、胃上皮癌、结肠上皮癌、前列腺上皮癌、泌尿生殖器上皮癌、甲状腺上皮癌、食管上皮癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺上皮癌、肾细胞上皮癌、子宫内膜上皮癌、肾上腺皮质上皮癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类上皮癌、绒毛膜上皮癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤中的任一种。
[0026] 18、第1项至第13项中任一项所述的载体、或第14项所述的癌细胞或免疫细胞、或第15项所述的药物，用于预防或治疗癌症转移，或用于预防或治疗癌症转移的方法。
附图说明
[0028] 图1显示了鼠和人Im01的IL-12、IL-2和4-1BBL的转基因表达以及IFN-γ应答的比较。MOI(感染复数)数值显示于[括号]中；“m”＝鼠；“hu”＝人。
[0029] 图2显示了穿梭质粒pE1.1 Im02的示意性基因图谱。人4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12这三个治疗基因的cDNA组装在三顺反子构体中，由内部核糖体进入位点(IRES)连接并由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。转录本聚腺苷酸化由SV40衍生的信号诱导。Im02的表达盒被图示为基于质粒pE1.1的前体转移质粒，其适用于亚克隆到携带有例如腺病毒载体DNA的质粒。
[0030] 图3显示了Im02和较早载体Im01的转基因表达和IFN-γ应答的比较。MOI(感染复数)数值显示于[括号]中。显示的数据点是4个独立供体的平均值，每个供体具有4个重复。
[0031] 图4显示了Im02和Im01在基于膀胱组织的模型中的比较。“T”＝膀胱肿瘤组织；“B”＝正常膀胱组织。
[0032] 图5显示了Im02和Im01在不同剂量水平下的比较。剂量ivp是指感染性病毒颗粒的剂量。“T”＝膀胱肿瘤组织；“B”＝正常膀胱组织。
[0033] 图6显示了描述人膀胱RT-4肿瘤细胞与人PBMC的共培养物中免疫细胞类型的活化的热图。后续行显示基本的和活化的(“act”)免疫细胞类型。没有载体的RT-4细胞(“对照”)和用空的腺病毒载体转导的细胞(“Ad0”)用作对照。Th＝T辅助细胞；Tc＝细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)；PC＝血浆细胞；NK＝自然杀伤细胞；mono＝单核细胞；DC＝树突细胞；neutro＝中性粒细胞。
[0034] 图7显示了用Im02或Ad0刺激的样品或作为对照没有处理的样品在苏木精和伊红染色之后的组织学检测。A：没有培养的膀胱肿瘤组织；B：膀胱肿瘤组织，108ivp Ad0，处理后6天；C：膀胱肿瘤组织，108ivp Im02，处理后6天。
[0035] 图8显示了用或没用Im02刺激的样品在苏木精和伊红染色之后的组织学检测。上子图：没有培养的尿路上皮肿瘤组织，下子图：膀胱肿瘤组织，用108ivp Im02刺激，处理后6天。
[0036] 图9显示了通过透射电子显微术的靶细胞分析和摄取机制。子图1：概览(右图)，和细节(A)：颗粒在没有囊泡下被未知的细胞类型摄取。细节(B)，白色：囊泡状颗粒被朗格汉斯细胞/巨噬细胞/树突细胞形态的细胞摄取。子图2：概览(B)和细节(A)：囊泡状的腺病毒颗粒被朗格汉斯细胞/巨噬细胞/树突细胞形态的细胞摄取。子图3：概览(B)和细节(A)：通过强的囊泡结构腺病毒颗粒被淋巴细胞形态的细胞摄取。子图4：概览(B)和细节(A)：腺病毒颗粒在没有囊泡下被成纤维细胞形态的细胞摄取。子图5：概览(B)和细节(A)：大群体的腺病毒颗粒在没有囊泡下被未知的靶细胞类型摄取。子图6：概览：在具有上皮细胞或肿瘤细胞的形态学特征的靶细胞中，丰富的囊泡结构之间没有囊泡包被的腺病毒颗粒(白色箭头)。细节(A)：粘附到质膜的腺病毒颗粒的早期内吞图。细节(B)：在还含有其他非病毒结构的大囊泡中的腺病毒颗粒的胞饮作用。
[0037] 图10显示了在正常膀胱样品和膀胱肿瘤样品中不同表达的比较。Im02是指实施例2中描述的腺病毒载体。Ad0是指空的腺病毒载体，用作对照。n＝膀胱样品/肿瘤样品的数值。
[0038] 图11显示了在细胞培养物中不同转染子的检测。GFP＝绿色荧光蛋白。CAR＝柯萨奇-腺病毒-受体。MOI＝感染复数(每个靶细胞的感染性病毒颗粒)。
[0039] 图12显示了硫酸鱼精蛋白对转基因表达和IFN-γ诱导的作用。Im02是指实施例2中描述的腺病毒载体；Ad0＝空的腺病毒载体，用作对照。ivp＝感染性病毒颗粒。“T”＝膀胱肿瘤组织；“B”＝正常膀胱组织。
[0040] 图13显示了人4-1BBL(CD137L)的核苷酸和氨基酸序列。
[0041] 图14显示了人IL-2的核苷酸和氨基酸序列。
[0042] 图15显示了人单链IL-12(scIL-12)的核苷酸和氨基酸序列，该人单链IL-12包含由连接子连接的人IL-12的p40和p35亚基。该连接子序列分别在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中用粗体并加下划线显示。
[0043] 图16显示了人IL-12的35kDa和40kDa亚基的核苷酸和氨基酸序列。
[0044] 图17显示了在图2中描述的穿梭载体hu pE1.1 Im02的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。该核苷酸序列总共具有7,845bp。在SEQ ID NO:11的核苷酸序列中可以如下识别CMV启动子、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-2、PV IRES、人scIL-12和SV40polyA：CMV启动子：第484-
1,059位核苷酸；人4-1BBL：第1,080-1,844位核苷酸；EMCV IRES：第1,885-2,388位核苷酸；
人IL-2：第2,409-2,870位核苷酸；PV IRES：第2,914-3,545位核苷酸；人scIL-12：p40亚基第3,581-4,564位核苷酸，连接子第4,565-4,609位核苷酸，p35亚基第4,610-5,203位核苷酸；和SV40polyA：第5,271-5,510位核苷酸。
1,059位核苷酸；人4-1BBL：第1,080-1,844位核苷酸；EMCV IRES：第1,885-2,388位核苷酸；
人IL-2：第2,409-2,870位核苷酸；PV IRES：第2,914-3,545位核苷酸；人scIL-12：p40亚基第3,581-4,564位核苷酸，连接子第4,565-4,609位核苷酸，p35亚基第4,610-5,203位核苷酸；和SV40polyA：第5,271-5,510位核苷酸。
[0045] 图18显示了分别包含在图2描述的穿梭质粒hu pE1.1 Im02和SEQ ID NO:11(图17)中的含有CMV、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-2、PV IRES、人scIL-12和SV40polyA的表达盒的示意图和核苷酸序列。
[0046] 图19显示了在不同MOI下的Im02和单基因表达载体的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达以及IFN-γ应答。指定为“4-1BBL+细胞的％”的底部的轴是指对于4-1BBL的表达为阳性的细胞。左边的条指示IL-12和IL-2(二者均为[5]MOI)与不同MOI的4-1BBL([10]、[25]、[50]和[100])的组合。Im02是指实施例2中描述的腺病毒载体。MOI＝感染复数(即，每个靶细胞的感染性病毒颗粒)。Im02以及单基因表达载体的组合的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达和IFN-γ应答揭示了IFN-γ表达依赖于增加的4-1BBL水平。
[0047] 图20显示了穿梭质粒pE1.1 Im01的示意性基因图谱。人4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12这三个治疗基因的cDNA组装在三顺反子构体中，由内部核糖体进入位点(IRES)连接并由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。转录本聚腺苷酸化由SV40衍生的信号诱导。Im01的表达盒被图示为基于质粒pE1.1的前体转移质粒，其适用于亚克隆到携带有例如腺病毒载体DNA的质粒。
具体实施方式
[0048] 如在本文和所附的权利要求中使用地，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文中清楚地指示其他。因此，例如，提到“一种抗原”包括多个这种抗原，并且提到“一种细胞”或“所述细胞”包括提到一个或多个细胞以及本领域技术人员已知的其等价物(例如，多个细胞)等等。类似地，提到“一种化合物”或“一种组合物”包括多个这种化合物或组合物，并且分别指一个或多个化合物或组合物，除非上下文清楚地指示其他。当述及数值或数值范围时，术语“约”是指该述及的数值或数值范围是在实验变动性内(或在统计实验误差内)的近似值，因此该数值或数值范围可以在所表明的数值或数值范围的1％和15％之间变化。术语“包含(comprising)”(和相关的术语，例如“含有(comprise)”或“含有(comprises)”或“具有(having)”或“包括(including)”)并不意指排除在其他特定的实施方案(例如，本文描述的任何物质的组合物、成分、方法或工艺等的实施方案)中，)可以由所描述的特征“组成”或“基本组成”。
[0049] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可以将与本文描述的那些类似的或等价的方法和材料用于所公开的方法和组合物的实践中，但是示例性的方法、设备和材料在本文中进行了描述。
[0050] 术语“密码子优化序列”通常是指针对特定的宿主物种通过将任何具有使用频率小于约20％的密码子进行替换而优化了的核苷酸序列。为了在给定的宿主物种中表达，除了密码子优化外，通过消除假的聚腺苷酸化序列、消除外显子/内含子剪接信号、消除转座子样重复和/或优化GC含量而优化了的核苷酸序列在本文中称为“表达增强序列”。
[0051] 术语“启动子区”以其普通意义用于本文中，来指代包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中该调控序列衍生自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的基因。该调控序列与所期望的基因序列可以是同源的或异源的。例如，可以使用大范围的启动子，包括如本文描述的病毒或哺乳动物启动子。相对于DNA序列该启动子是定向的，这样它能够起始所述DNA序列的转录。
[0052] 术语“调控核酸序列”总体上指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、增强子等等，其总体上用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。不是所有的这些控制序列都需要存在，只要所选择的编码序列在合适的宿主细胞中能够复制、转录和翻译。本领域技术人员容易从公共数据库和材料中识别调控核酸序列。另外，本领域技术人员可以识别适用于意欲用途(例如，体内、离体或体外)的调控序列。优选地，术语“调控核酸序列”是指启动子或启动子序列。
[0053] 在多种实施方案中，术语“调控核酸序列”也指IRES序列(内部核糖体进入位点)。这特别适用于多种优选的实施方案，其中术语“调控核酸序列”包括每个含有编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的三顺反子表达盒/载体的一个启动子，并且也包括针对不位于紧邻启动子的下游的每个顺反子的IRES序列。在含有编码4-1BBL、IL-2和scIL-12(以该顺序)的核酸序列，具有针对4-1BBL的启动子和针对IL-2和scIL-12的IRES序列的三顺反子表达盒/载体中，与IL-2和scIL-12的表达水平或表达速率相比，启动子和IRES序列的组合被认为并且已表明能提高4-1BBL的表达水平或表达速率。
[0054] 短语“可操作地放置”、“可操作地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下”是指相对于核酸序列启动子是在正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以与“增强子”结合使用或者也可以不与其结合使用，所述增强子是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调控序列。
[0055] WO 2004/035799描述了包含表达构体的腺病毒载体，该表达构体在5’到3’方向上以小鼠/人单链IL-12(scIL-12)、4-1BB配体(4-1BBL)和IL-2的顺序包含它们的基因，即，编码scIL-12的基因位于第1位、编码4-1BBL的基因位于第2位、编码IL-2的基因位于第3位。该表达构体示于WO 2004/035799的图1，并且对应的载体命名为“Ad-3”。在本公开中，所述较早载体“Ad-3”的内部载体编码是“Im01”，也参见本公开的实施例1。
[0056] 鼠和人Im01的scIL-12、4-1BBL和IL-2的转基因表达已经揭示转基因的表达水平在鼠和人物种之间明显地变化，如本公开的实施例1和图1所示。显著地，与携带小鼠scIL-12、小鼠4-1BBL和小鼠IL-2的基因的Im01(“小鼠Im01”或“m Im01”)的表达相比，携带人scIL-12、人4-1BBL和人IL-2的基因的Im01(“人Im01”或“hu Im01”)的表达引起了IL-12的显著增加。因此，尽管在scIL-12、4-1BBL和IL-2基因的组装顺序上小鼠和人Im01具有相同的载体结构，但还是观察到转基因的表达水平上的显著差异。至少这些在小鼠和人Im01之间的转基因表达的差异中的一些是完全预料不到的。
[0057] 本公开提供的载体在编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因方面含有全新的结构。与scIL-12和IL-2的表达水平相比，该新的载体提供4-1BBL增加的表达。特别地，本公开提供的载体包含表达盒，其中编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个核酸序列(或三个基因)在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。与人Im01中的相同基因的布置相比，该新的载体结构提供(尤其是)4-1BBL的增加的表达，同时有IL-
12的降低。令人惊奇地，已经发现该新的载体结构导致IFN-γ应答增加(参见本公开的实施例3和图3以及实施例11和图19)。由本公开的新的载体提供的惊奇作用已经证明对于需要免疫治疗的患者的这种治疗特别有效。具体地，已经显示本公开的载体对于将不活跃的免疫微环境转变为活跃的免疫微环境特别有效，从而治疗癌症或病毒感染。因此，本公开的载体特别适用于在癌症免疫治疗中使用。例如，本公开的图4和图5显示本公开的载体显示出与较早载体Im01相比，提高肿瘤微环境中的免疫刺激作用，如在对应的实施例4和5中解释地。另外，转录组分析显示了本公开的载体的治疗基因表达情况是独一无二的并且是优越的，特别是优越于较早载体Im01(参见实施例6以及表1和2)。另外，如图6所示，主要免疫细胞类型的活化的基因表达分析显示了通过本公开的载体的T辅助细胞和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的活化优于通过较早载体Im01的相同免疫细胞的活化(参见实施例7)。
12的降低。令人惊奇地，已经发现该新的载体结构导致IFN-γ应答增加(参见本公开的实施例3和图3以及实施例11和图19)。由本公开的新的载体提供的惊奇作用已经证明对于需要免疫治疗的患者的这种治疗特别有效。具体地，已经显示本公开的载体对于将不活跃的免疫微环境转变为活跃的免疫微环境特别有效，从而治疗癌症或病毒感染。因此，本公开的载体特别适用于在癌症免疫治疗中使用。例如，本公开的图4和图5显示本公开的载体显示出与较早载体Im01相比，提高肿瘤微环境中的免疫刺激作用，如在对应的实施例4和5中解释地。另外，转录组分析显示了本公开的载体的治疗基因表达情况是独一无二的并且是优越的，特别是优越于较早载体Im01(参见实施例6以及表1和2)。另外，如图6所示，主要免疫细胞类型的活化的基因表达分析显示了通过本公开的载体的T辅助细胞和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的活化优于通过较早载体Im01的相同免疫细胞的活化(参见实施例7)。
[0058] 本公开的新的载体包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因，其中所述基因在5’到3’方向上进行组装，这样编码scIL-12的基因不在所述三个基因的最上游位置。因此，本公开的新的载体包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。更具体地说，该载体包含编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。更具体地说，该载体包含编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列，其中所述基因的所述核酸序列在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因的核酸序列不在第1位。
[0059] 在本公开的多种实施方案中，所述新的载体包含表达构体(或表达盒)，所述表达构体(或表达盒)包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因(更具体地说，三个基因的核酸序列)，其中所述基因在所述表达盒中进行组装，使得编码scIL-12的基因不在表达盒的最上游位置。表达盒的最上游位置可以更具体地描述为表达盒的5’端位置。另外，表达盒的最上游位置可以更具体地描述为紧邻调控表达盒的三个基因转录的启动子的下游的位置。该启动子可以是为表达盒的部分的启动子，或者可以是表达盒的上游的启动子。表达盒中三个转基因(即，编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的三个基因)的组装可以更具体地描述为如下效果：所述三个基因的核酸序列在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因的核酸序列不在表达盒的三个基因的第1位。
[0060] 在本公开的多种实施方案中，本公开的新的载体包含表达构体(或表达盒)，所述表达构体(或表达盒)包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。更具体地，所述载体包含表达构体(或表达盒)，所述表达构体(或表达盒)包含编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。更具体地，所述载体包含表达构体(或表达盒)，所述表达构体(或表达盒)包含编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列，其中所述基因的所述核酸序列在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因的核酸序列不在第1位。在多种实施方案中，本公开的表达盒或表达构体包含启动子。所述启动子可以更具体地描述为调控表达盒(或表达构体)的转录的启动子。在多种实施方案中，表达盒包含位于表达盒的上游(或5’端)(或表达盒的5’端的上游)的启动子。
[0061] 如本文所述，上述限制性条件的“第1位”可以更具体地描述为所述1、2和3的顺序的第1位。
[0062] 在多种实施方案中，编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因在5’到3’方向上的组装是指编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因在相对于包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因的本公开的表达盒或表达构体的5’到3’方向上的组装。因此，5’到3’方向是指表达盒(或表达构体)的5’到3’方向或表达盒的启动子的5’到3’方向。
[0063] 在本公开的多种其他实施方案中，编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因在5’到3’方向上的组装是指编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因在相对于启动子的5’到3’方向上的组装，所述启动子不是本公开的表达盒(或表达构体)的部分，但是其位于表达盒(或表达构体)的上游，即，表达盒(或表达构体)的5’端的上游。在此，5’到3’方向是指表达盒(或表达构体)的5’端的上游启动子的5’到3’方向。位于表达盒的上游(或表达盒的5’端的上游)的启动子可以更具体地描述为调控表达盒(或表达构体)的转录的启动子。
[0064] 另外，5’到3’方向可以指本公开的三个转基因(即，编码scIL-12、4-1BBL和IL-2)中位于所述三个转基因的最上游位置的基因的上游启动子的5’到3’方向。
[0065] 本公开提供的载体在编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的三个基因方面含有全新的结构，其也可以被描述为如下效果，所述三个基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位，其中所述第1位是启动子的下游，特别是用于所述三个基因的表达的启动子的下游。因此，关于包含编码4-1BBL配体(4-1BBL)、单链IL-12(sc-IL12)和IL-2的三个基因的本公开的表达盒(或表达构体)，所述三个基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序进行组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位，其中所述第1位是启动子的下游，特别是用于所述表达盒(或表达构体)的转录/表达的启动子的下游。
[0066] 如本文所述，“位于……上游”可以更具体地描述为“位于紧邻……上游”。另外，“位于……5’端”或“位于……5’端的上游”可以更具体地描述为“位于……转录起始位点的5’端”或“位于……转录起始位点的5’端的上游”。
[0067] 本公开的新的载体能够表达编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因(或基因的核酸序列)。因此，更具体地，本公开的新的载体是表达载体，更具体为重组表达载体。
[0068] 如本文所述，在多种实施方案中，术语“编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列”是指“编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的核酸序列”，反之亦然。相应地，在多种实施方案中，术语“编码4-1BBL的基因的核酸序列”是指“编码4-1BBL的核酸序列”，反之亦然。因此，在多种实施方案中，术语“编码scIL-12的基因的核酸序列”是指“编码scIL-12的核酸序列”，反之亦然，并且“编码IL-2的基因的核酸序列”是指“编码IL-2的核酸序列”，反之亦然。同样地，在多种实施方案中，术语“编码sc-IL12和IL-2的基因的核酸序列”是指“编码sc-IL12和IL-2的核酸序列”，反之亦然。如本文进一步描述地，在多种实施方案中，术语“编码
4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因”是指“编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的核酸序列”，反之亦然。
相应地，在多种实施方案中，术语“编码4-1BBL的基因”是指“编码4-1BBL的核酸序列”，反之亦然。同样地，在多种实施方案中，术语“编码sc-IL12和IL-2的基因”是指“编码sc-IL12和IL-12的核酸序列”，反之亦然。
4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因”是指“编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的核酸序列”，反之亦然。
相应地，在多种实施方案中，术语“编码4-1BBL的基因”是指“编码4-1BBL的核酸序列”，反之亦然。同样地，在多种实施方案中，术语“编码sc-IL12和IL-2的基因”是指“编码sc-IL12和IL-12的核酸序列”，反之亦然。
[0069] 本公开的新的载体提供与scIL-12和IL-2的表达相比4-1BBL的更高的表达。因此，本公开也提供包含一种或多种载体的载体系统，所述一种或多种载体包含编码至少4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的核酸序列，其中所述载体系统提供与scIL-12和IL-2的表达相比4-1BBL的更高的表达。4-1BBL的更高的表达是由调控三个转基因的转录的启动子的不同启动子强度调控的。所述一种或多种载体是能够表达编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的表达载体。更具体地，所述表达载体是重组表达载体。在多种实施方案中，所述包含一种或多种载体的载体系统提供在IL-12和IL-2的恒定水平下4-1BBL的更高的或增加的水平的产生。在多种实施方案中，所述包含一种或多种载体的载体系统可以用于医疗环境以实现至少5％的用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞或免疫细胞表达4-1BBL。
[0070] 在一个方面，本公开提供包含一种或多种载体的载体系统，所述一种或多种载体包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列，其中所述载体系统提供在IL-12和IL-2的恒定水平下4-1BBL的更高的或增加的水平的产生。这反映了显示于图19的发现，即IFN-γ表达依赖于增加的4-1BBL水平。二者均为MOI[5]的恒定水平的IL-12和IL-2与增加水平的高达MOI[100]的4-1BBL的组合导致在中等的IL-12水平下增加的IFN-γ诱导，如图19所示。在多种实施方案中，以在IL-12和IL-2的恒定水平下具有4-1BBL的增加的水平，本公开的载体系统可以用于医疗环境，优选用于治疗癌症。具体地，用MOI[10]的编码4-1BBL的载体和MOI[5]的编码IL-2和IL-12的载体，载体系统可以用于医疗环境。另外，用MOI[10]的编码4-1BBL的载体和MOI[5]的各自分别编码IL-2和IL-12的两种载体，载体系统可以用于医疗环境。在多种实施方案中，用MOI[25]的编码4-1BBL的载体和MOI[5]的编码IL-2和IL-12的一种或两种载体，载体系统可以用于医疗环境。在多个其他实施方案中，用MOI[50]的编码4-1BBL的载体和MOI[5]的编码IL-2和IL-12的一种或两种载体，载体系统可以用于医疗环境。在多个进一步的实施方案中，用MOI[100]的编码4-1BBL的载体和MOI[5]的编码IL-2和IL-12的一种或两种载体，载体系统可以用于医疗环境。优选地，应用于编码4-1BBL的载体的MOI实现至少5％的用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞或免疫细胞表达4-1BBL。
[0071] 以上所述的医疗环境包括，但不限于，治疗癌症或病毒感染，优选地，医疗环境是指治疗癌症，更优选地治疗实体癌或实体瘤。
[0072] 本公开的新的载体系统能够表达编码4-1BBL、sc-IL12和IL-2的基因(或基因的核酸序列)。因此，更具体地，本公开的新的载体系统是包含一种或多种表达载体的表达载体系统，甚至更具体地是包含一种或多种重组表达载体的重组表达载体系统。在多个优选的实施方案中，包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体的载体类型对于载体系统的所有载体来说是相同的。载体通常是能够携带编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的类型。因此，载体是具有容纳编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的能力的类型。优选地，包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体(优选MVA)、腺病毒载体(adenovirus vector)、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、α病毒载体和麻疹病毒载体中的任一种。更优选地，包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、逆转录病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体(优选MVA)、腺病毒载体(adenovirus vector)、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体。仍更优选地，包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、疱疹病毒载体或牛痘病毒载体(优选MVA)。
[0073] 本公开证实了在免疫刺激载体系统的背景下IFN-γ表达和增加的4-1BBL水平之间的联系，所述免疫刺激载体系统是基于包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体。如实施例11中所述和图19所示，Im02以及单基因表达载体的组合的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达和IFN-γ应答揭示了IFN-γ表达依赖于增加的4-1BBL水平。二者均为MOI[5]的恒定水平的IL-12和IL-2与增加水平的高达MOI[100]的4-1BBL的组合导致在中等的IL-12水平下增加的IFN-γ诱导，如图19所示。本公开的重要发现是IFN-γ的最大诱导和相关的免疫激活不仅可以通过如载体Im02中描述的编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的特定布置实现，也可以通过提供与scIL-12和IL-2的表达相比增加的或更高的4-1BBL表达的替代实施方案实现。因此，本公开提供了包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的载体，其中所述载体提供在IL-12和IL-2的恒定水平下4-1BBL的更高的或增加的水平的产生。更具体地，本公开还提供一种载体，其包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列，并且还包含至少一个调控核酸序列，提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL的增加的或更高的表达水平。该方面反应了以下发现，载体Im02已经显示提供与scIL-12和IL-2的表达相比4-1BBL的更高的表达，并且二者均为MOI[5]的恒定水平的IL-12和IL-2与增加水平的高达MOI[100]的4-1BBL的组合导致在中等的IL-12水平下增加的IFN-γ诱导，如以上讨论地。
[0074] 图3和图19显示用本公开的载体或载体系统获得的4-1BBL的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比增加。因此，在一个优选的实施方案中，4-1BBL的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比增加。
[0075] 图3和图19也显示scIL-12的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比降低。因此，在一个优选的实施方案中，scIL-12的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比降低。
[0076] 图3和图19还显示IL-2的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比增加。因此，在一个优选的实施方案中，IL-2的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比增加。
[0077] 本公开包括一种载体，其包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列并且还包含至少一个调控核酸序列，提供与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比增加的或更高的4-1BBL的表达水平。优选地，scIL-12的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比降低和/或IL-2的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比增加。更具体地，至少一个调控核酸序列提供与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比降低的scIL-12的表达水平和/或所述至少一个调控核酸序列提供与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比增加的IL-2的表达水平。
[0078] 载体Im01的表达构体描述于实施例1，并且包含在5’到3’方向上按照以下顺序组装的CMV启动子、两个IRES元件、scIL-12、4-1BBL、IL-2和poly-A信号:5’-CMV-scIL-12-IRES-4-1BBL-IRES-IL-2-poly-A信号-3’。
[0079] 更具体地，载体Im01的表达构体对应于WO 2004/035799 A2的图1中所示的指定为“Ad-3”的载体的表达构体。载体“Ad-3”的表达构体特此并入本公开引作参考。在WO 2004/035799 A2的图1中，指定的“Ad-3”是指携带所述图1中显示的相应表达构体或表达盒的完整载体。相应地，载体“Ad-3”的表达构体是指WO 2004/035799 A2的图1的下面一行所示的表达构体。在本公开中，载体Im01的表达构体优选对应于WO 2004/035799 A2的图1所示并且包含编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的核酸序列的人cDNA的载体“Ad-3”的表达构体。相应地，本公开中所指的载体Im01的表达构体包含在5’到3’方向上按照以下顺序组装的以下元件：5’-CMV-人scIL-12-PV-IRES-人4-1BBL-EMCV-IRES-人IL-2-SV-40poly-A-3’。
[0080] 在本公开的多种实施方案中，提到“由载体Im01的表达构体获得的表达水平”是指“由载体Im01获得的表达水平”。载体Im01是一种腺病毒载体。因此，在本公开的多种实施方案中，提到“由载体Im01获得的表达水平”包括一种腺病毒载体，其包含如WO 2004/035799 A2的图1中所示的具有编码scIL-12、4-1BBL和IL-2的核酸序列的人cDNA的载体“Ad-3”的表达构体。更具体地，提到“由载体Im01获得的表达水平”是指由一种腺病毒载体获得的表达水平，所述腺病毒载体包含在5’到3’方向上按照以下顺序组装的以下元件：5’-CMV-人scIL-12-PV-IRES-人4-1BBL-EMCV-IRES-人IL-2-SV-40 poly-A-3’。因此，在优选的实施方案中，提到“由载体Im01的表达构体获得的表达水平”是指由如图20所示的“载体Im01的表达构体获得的表达水平”。相应地，参考图20，载体Im01是指穿梭载体hu pE1.1 Im01。图20所示的载体Im01的表达构体包括CMV启动子、人scIL-12、PV IRES、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-2和SV40polyA。图20描述的穿梭载体hu pE1.1Im01的核苷酸序列总共具有7,845bp。CMV启动子、人scIL-12、PV IRES、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-2和SV40polyA的核苷酸序列可以在SEQ ID NO:11(图17)的核苷酸序列中进行识别，SEQ ID NO:11显示了图2中描述的穿梭载体hu pE1.1 Im02的核苷酸序列。穿梭载体hu pE1.1 Im01的CMV启动子、人scIL-12、PV IRES、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-2和SV40polyA的核苷酸序列对应于穿梭载体hu pE1.1 Im02的CMV启动子、人4-1BBL、EMCV IRES、人IL-12、PV IRES、人scIL-2和SV40polyA的相应的核苷酸序列。
[0081] 在多种优选的实施方案中，提到“由载体Im01的表达构体获得的表达水平”是指由克隆或亚克隆到携带例如腺病毒载体DNA的质粒或载体的载体Im01的表达构体获得的表达水平。更优选地，提到“由载体Im01的表达构体获得的表达水平”是指由克隆或亚克隆到腺病毒载体的载体Im01的表达构体获得的表达水平。
[0082] 在多种实施方案中，对于包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的载体和包含载体Im01的表达构体的载体来说，载体类型是相同的。该载体通常是能够携带编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的类型。因此，该载体是具有容纳编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的能力的类型。优选地，包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体(优选MVA)、腺病毒载体(adenovirus vector)、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、α病毒载体和麻疹病毒载体中的任一种。更优选地，包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、逆转录病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体(优选MVA)、腺病毒载体(adenovirus vector)、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体。仍更优选地，包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的一种或多种载体中的每一种是腺病毒载体(adenoviral vector)、疱疹病毒载体或牛痘病毒载体(优选MVA)。
[0083] 在本公开的多种实施方案中，提到“由载体Im01的表达构体获得的表达水平”或“由载体Im01获得的表达水平”是指由应用标准体外表达系统获得的表达水平，所述标准体外表达系统包括待用载体(即本公开的载体或载体系统，或载体Im01或包含载体Im01的表达构体载体(优选腺病毒载体))转导的肿瘤细胞系(优选人A549细胞)和随后覆盖的作为靶细胞的人血免疫细胞。
[0084] 因此，本公开提供一种载体，其包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列，并且还包含至少一个调控核酸序列，该调控核酸序列提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平，其中该表达水平是在体外表达系统(或表达实验)中确定的，该体外表达系统(或表达实验)包括：用包含载体Im01的表达构体的载体(优选腺病毒载体)转导的肿瘤细胞系(优选人A549细胞系)和人血免疫细胞(优选外周血单核细胞(PBMC))。
[0085] 在本公开中，术语表达水平或转基因表达水平和表达速率或转基因表达速率可以互换使用。
[0086] 由本公开的载体或载体系统提供的4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平诱导免疫应答，该免疫应答是转基因特异性地，即特异于由本公开的载体或载体系统提供的4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平。由本公开的载体或载体系统提供的表达水平诱导免疫应答，该免疫应答特别特异于与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平。优选地，由本公开的载体或载体系统提供的4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平诱导免疫应答，该免疫应答特别特异于与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平，其中4-1BBL的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比是增加的。更优选地，由本公开的载体或载体系统提供的4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平诱导免疫应答，该免疫应答特别特异于与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平，其中scIL-12的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比是降低的，和/或IL-2的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比是增加的。仍更优选地，由本公开的载体或载体系统提供的4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平诱导免疫应答，该免疫应答特别特异于与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平，其中4-1BBL的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比是增加的，并且其中scIL-12的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比是降低的，和/或IL-2的表达水平与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比是增加的。
[0087] 转基因特异性免疫应答优选是指转基因特异性IFN-γ应答或IFN-γ的转基因特异性表达或产生。包括IFN-γ水平的细胞因子水平可以通过ELISA常规检测。
[0088] 在优选的实施方案中，由4-1BBL、IL-2和scIL-12的表达水平诱导的转基因特异性免疫应答通过体外实验(优选ELISA)检测或测定。
[0089] 在本公开的多种实施方案中，编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的核酸序列由一种载体的两个独立的调控核酸序列表达，其中一个调控核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，而另一个调控核酸序列位于包含编码IL-2和scIL-12的核酸序列的表达盒的上游。优选地，所述表达盒在5’到3’方向上按照5’-IL-2-scIL-12-3’的顺序包含编码IL-2和scIL-12的核酸序列。根据本公开，该两个调控核酸序列提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的或更高的表达水平，和/或提供与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比4-1BBL增加的或更高的表达水平。优选地，该两个调控核酸序列也提供或进一步提供与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比scIL-12降低的表达水平，和/或与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比IL-2增加的表达水平。优选地，调控核酸序列是启动子序列。
[0090] 在本公开的多种实施方案中，编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的核酸序列由一种载体的三个独立的调控核酸序列表达，其中一个调控核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，一个调控核酸序列位于编码IL-2的核酸序列的上游，一个调控核酸序列位于编码scIL-12的核酸序列的上游。根据本公开，该三个调控核酸序列提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的或更高的表达水平，和/或提供与由载体Im01的表达构体获得的4-1BBL的表达水平相比4-1BBL增加的或更高的表达水平。优选地，该三个调控核酸序列也提供或进一步提供与由载体Im01的表达构体获得的scIL-12的表达水平相比scIL-12降低的表达水平，和/或与由载体Im01的表达构体获得的IL-2的表达水平相比IL-2增加的表达水平。优选地，调控核酸序列是启动子序列。
[0091] 如本文所述，一个或多个调控核酸序列优选是指一个或多个启动子(序列)或，更具体地，是指一个或多个表达启动子(序列)。可以用于意欲的4-1BBL水平的增加的或高表达的强启动子包括但不限于以下任一种：巨细胞病毒(CMV)、延伸因子1α(EF1A)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒40(SV40)。CMV是特别优选的启动子。这些启动子可以用于本公开的多种实施方案，并且代表可以提供与scIL-12和IL-2的表达水平相比4-1BBL增加的表达水平的优选启动子。这特别适用于这样的实施方案，其中编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的三个核酸序列在三顺反子盒中在5’到3’方向上以1、2和3的顺序组装，并且编码4-1BBL的核酸序列位于编码IL-2和scIL-12的核酸序列的上游，优选地，其中编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的三个核酸序列从5’到3’按照以下顺序进行组装：5’-4-1BBL-IL-2-scIL-12-3’。
[0092] 可以用于意欲的IL-2和/或IL-12的表达的启动子包括但不限于磷酸甘油酸激酶(PGK)和泛素C(UBC)。这些启动子可以用于本公开的多种实施方案，并且代表可以提供意欲的IL-2和IL-12的表达水平的优选启动子。尤其是，这些启动子可以用于这样的实施方案，其中编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的核酸序列由一种载体的两个独立的调控核酸序列表达，其中一个调控核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，而另一个调控核酸序列位于包含编码IL-2和scIL-12的核酸序列的表达盒的上游。这些启动子可以进一步用于这样的实施方案，其中编码4-1BBL、IL-2和scIL-12的核酸序列由一种载体的三个独立的调控核酸序列表达，其中一个调控核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，一个调控核酸序列位于编码IL-2的核酸序列的上游，一个调控核酸序列位于编码scIL-2的核酸序列的上游。
[0093] 在多种实施方案中，包含编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的核酸序列的载体的至少一个调控核酸序列提供与用载体Im02获得的4-1BBL、scIL-12和IL-2相同的表达水平或表达比率。
[0094] 本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体可以是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA载体、质粒载体、纳米颗粒载体和裸DNA中的任一种或其组合。
[0096] 在本公开的特定实施方案中，本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体选自逆转录病毒载体基因组、慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、牛痘病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组、α病毒载体基因组、质粒DNA和RNA。
[0097] 期望包括病毒载体的安全特征，例如整合缺陷。在特定的实施方案中，整合缺陷可以由载体基因组的元件赋予，但是也可以衍生自包装系统的元件(例如，非功能性整合酶蛋白，其可以不是载体基因组的部分而是在转导中提供)。
[0098] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体是复制型载体。优选地，所述复制型载体是复制型病毒载体，更优选地是复制型腺病毒载体。在多种其他实施方案中，本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体是非复制型载体，优选地是非复制型病毒载体，更优选地是非复制型腺病毒载体。
[0099] 如果本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体是RNA载体，这些可以包括插入的修饰的核糖核苷酸。
[0100] 本公开的示例性病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒载体和α病毒载体。优选地，所述病毒载体是腺病毒载体。
[0101] 在特定的实施方案中，腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体可以用于表达4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2三个基因。已经描述了几种腺病毒载体系统和用于施用载体的方法(参见，例如Mercier等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004,101:6188-93)。
[0102] 逆转录病毒载体可以包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、嗜亲性逆转录病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些。
[0103] 在特定的实施方案中，本公开的新的载体/载体系统的一种或多种载体是逆转录病毒载体，优选慢病毒载体。用于人基因治疗的合适的基于基因组的慢病毒载体包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、水疱性口炎病毒(VSV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)的那些。
[0104] 在多种实施方案中，所述载体是质粒DNA或粘粒DNA。使用本领域公知的标准技术，含有编码如本文所述的至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的一种或多种多核苷酸的质粒DNA或粘粒DNA容易构建。所述载体通常可以以质粒形式构建，然后可以将其转染进包装或生产细胞系。所述质粒通常包含对于细菌中质粒的复制有用的序列。这种质粒在本领域是公知的。另外，包括原核复制起点的载体也可以包括其表达赋予可检测或可筛选标记(例如抗药性)的基因。
[0105] 在一个实施方案中，提供了重组表达载体，其包含编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在传染性疾病或癌症背景中诱导免疫应答。为了指导
4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达，每个载体中的编码核苷酸序列应该包括至少一个合适的表达控制序列(也称为调控表达序列或特征)，其可操作地连接到一个或多个多核苷酸序列。
可以用于调控所编码的多肽的表达的表达控制元件在本领域是已知的，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子、前导子和其他调控序列。
4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达，每个载体中的编码核苷酸序列应该包括至少一个合适的表达控制序列(也称为调控表达序列或特征)，其可操作地连接到一个或多个多核苷酸序列。
可以用于调控所编码的多肽的表达的表达控制元件在本领域是已知的，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子、前导子和其他调控序列。
[0106] 如本文所述，表达载体可以包含至少一个调控表达序列(表达控制序列)。在特定的实施方案中，当表达载体包含病毒载体基因组时，在特定靶细胞中4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达是期望的。通常，例如，在病毒载体中，编码4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的多核苷酸序列位于5’LTR和3’LTR序列之间。另外，一个或多个编码核苷酸序列优选地可操作地与其他遗传或调控序列或特征以功能联系连接，所述其他遗传或调控序列或特征例如为包括启动子或增强子的转录调控序列，其以特定的方式调控编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的基因的表达。对于病毒载体构体，“内部”启动子/增强子位于病毒载体的5’LTR和3’LTR之间并且可操作地连接到感兴趣的编码多核苷酸序列。内部启动子/增强子可以是已知增加与其有功能联系的基因的表达的任意启动子、增强子或启动子/增强子组合。“功能联系”和“可操作地连接”是指(不限于)相对于启动子和/或增强子位于正确的位置和方向上，这样当启动子和/或增强子与合适的分子接触时，感兴趣的序列会表达。在特定的实例中，有用的转录调控序列是在时间上和空间上都高度调控活性的那些。内部启动子/增强子的选择是基于4-
1BBL、scIL-12和IL-2三个基因的期望的表达模式以及已知的启动子/增强子的具体的性质。因此，内部启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括CMV启动子。在本公开的多种实施方案中，新的载体/载体系统包括内部启动子/增强子，其提供与scIL-12和IL-2相比4-1BBL更高的表达。已经识别和表征了病毒基因组和哺乳动物基因组中的许多增强子(参见，例如，公开提供的数据库，例如GenBank)。
1BBL、scIL-12和IL-2三个基因的期望的表达模式以及已知的启动子/增强子的具体的性质。因此，内部启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括CMV启动子。在本公开的多种实施方案中，新的载体/载体系统包括内部启动子/增强子，其提供与scIL-12和IL-2相比4-1BBL更高的表达。已经识别和表征了病毒基因组和哺乳动物基因组中的许多增强子(参见，例如，公开提供的数据库，例如GenBank)。
[0107] 增强子通常是DNA的顺式作用元件，通常长度约为10至300bp，其作用于启动子以增加它的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因和来自真核细胞病毒。实例包括在复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在编码感兴趣的一个或多个基因的多核苷酸序列的5’或3’位置剪接进载体，但是优选地位于启动子的5’位点。增强子可以与异源启动子组合使用。本领域普通技术人员能够基于4-1BBL、scIL-12和IL-2的期望的表达模式选择合适的增强子。
[0108] 在多种实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是靶细胞特异性启动子。另外，启动子可以选择为允许4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的诱导表达。许多用于诱导表达的系统在本领域是已知的，包括四环素应答系统、乳糖操纵子-阻遏物系统(lac operator-repressor system)，以及应答于多种环境或生理变化(包括热击、金属离子、干扰素、缺氧、类固醇和辐射)的启动子。也可以使用启动子的组合来获得编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的三个基因的各自期望的表达。本领域普通技术人员能够基于感兴趣的生物体或靶组织或靶细胞中的一个或多个多核苷酸序列的期望的表达模式选择启动子。
[0109] 如本文所述，表达载体(包括病毒载体基因组)可以包含至少一个RNA聚合酶II或III响应启动子。该启动子可以可操作地连接到编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个多核苷酸序列并且也可以连接到终止序列。另外，可以包含多于一个RNA聚合酶II或III启动子。RNA聚合酶II或III启动子对于本领域技术人员来说是公知的。
[0110] 当靶向递送重组表达载体(包括病毒载体基因组)到特定的靶细胞或靶组织以诱导细胞介导的免疫应答时，载体基因组通常会含有启动子，所述启动子被靶细胞或靶组织识别并且可操作地连接到感兴趣的一个或多个序列、病毒成分(当载体是病毒载体时)和/或本文讨论的其他序列。
[0111] 启动子可以是诱导型、组成型、暂时活化或组织特异性的。诱导型启动子是遗传工程中的有用工具，因为它们可操作地连接的基因的表达可以开启或关闭，例如，在特定的组织中。诱导型启动子可以分组为化学调控的启动子以及物理调控的启动子。典型的化学调控的启动子包括但不限于类固醇调控的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体(GR)的启动子、基于人雌激素受体(ER)的启动子)、金属调控的启动子(例如，基于金属硫蛋白基因的启动子)和病程相关启动子(例如，基于拟南芥和玉米病程相关(PR)蛋白的启动子)。典型的物理调控的启动子包括但不限于温度调控的启动子(例如，热击启动子)和光调控的启动子(例如，大豆SSU启动子)。其他示例性启动子对于本领域技术人员是公知的。
[0112] 在多种实施方案中，可以使用人巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因启动子、SV40早期启动子和劳氏肉瘤病毒长末端重复。还构思了在本领域公知的来实现多核苷酸的表达的其他病毒启动子或哺乳动物细胞启动子或细菌噬菌体启动子的使用。本领域技术人员基于特定的情况能够选择合适的启动子。本领域描述了许多不同的启动子，同样也描述了用于可操作地连接启动子到待表达的多核苷酸序列的方法。可以使用原生启动子序列和许多异源启动子来指导在包装细胞和靶细胞或靶组织中的表达。通常使用异源启动子，因为与原生启动子相比，它们一般允许期望的蛋白的更大的转录和更高的产率。启动子可以例如从病毒的基因组获得，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)。启动子也可以是例如异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热击启动子或通常与原生序列相关联的启动子，只要这种启动子与靶细胞或靶组织相容。在一个实施方案中，启动子是在病毒表达系统中自然存在的病毒启动子。在一些实施方案中，启动子是肿瘤细胞特异性启动子。
[0113] 表达载体也可以含有对于转录的终止和稳定mRNA来说必需的序列。这些序列常常发现于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区，偶尔发现于3’非翻译区，并且是本领域公知的。
[0114] 本公开的新的载体/载体系统可以进一步编码一种或多种免疫原，其包括但不限于来自致癌病毒(例如，EBV、HPV、HBV、HCV、HTLV和KSHV)的免疫原和肿瘤相关抗原。优选地，所述肿瘤相关抗原是来自膀胱癌、肝癌、Merkel细胞上皮癌、肾细胞上皮癌、前列腺癌、间皮瘤、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌的肿瘤相关抗原。更优选地，所述肿瘤相关抗原来自膀胱癌。在特定的实施方案中，所述肿瘤相关抗原是p53、Ras、c-Myc、A-Raf、B-Raf、C-Raf、NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、CT7、CT10、GAGE、IMP3、BK T抗原、MART-1、DAM-6、NA88-A、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、MUC1、MUC2、TRK受体、PRAME、P15、SART-1、SART-2、SART-3、威尔姆斯肿瘤抗原(WT1)、AFP、CEA、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、RAGE、707-AP、BCR-ABL、干扰素调控因子4(IRF4)、肿瘤相关钙信号转导因子1(TACSTD1)、TACSTD2、受体酪氨酸激酶、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、细胞质酪氨酸激酶、src家族、核因子κB(NF-κB)、Notch受体、c-Met、细胞外信号调节激酶(ERK)、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞上皮癌-5T4、SM22-α、STEAD、hTERT、肉瘤易位断点、EpCAM、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、BORIS、精子蛋白17、SSX2、B7H3、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2和fos相关抗原1中的任一种。在另一个实施方案中，本文提供一种方法，其中肿瘤相关抗原选自膀胱癌抗原。在一个实施方案中，膀胱癌抗原是CTA、NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A10、CT7、CT10、GAGE、PRAME、BAGE、RAGE、SAGE、HAGE、MPHOSPH1、DEPDCI、IMP3和MAGE-A和BK T抗原中的任一种。
[0115] 当表达载体是病毒载体基因组时，病毒载体基因组通常可以以质粒形式构建，可以将其转染进包装或生产细胞系以生产病毒载体基因组构体。所述质粒通常包含对于细菌中质粒的复制有用的序列。这种质粒是本领域公知的。另外，包括原核复制起点的载体也可以包括其表达赋予可检测或可筛选标记(例如抗药性)的基因。如本领域技术人员将理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达会是有优势的。遗传密码子是丰富的，具有64个可能的密码子，但是大部分生物体优先地使用这些密码子中的一个子集。在一种物种中最常用的密码子被称为最佳密码子，不是很常用的那些被归类为稀有或低利用率密码子。可以取代密码子以反映宿主的优选密码子使用，一种有时称为“密码子优化”或“控制物种密码子偏好”的方法。可以产生含有特定的原核或真核宿主偏爱的密码子的优化的编码序列，例如，以增加翻译的速率或产生具有期望性质(例如，与由非优化的序列产生的转录本相比，较长的半衰期)的重组RNA转录本。在多种实施方案中，编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个核酸序列是密码子优化的以在人中表达。在本公开的优选的实施方案中，编码4-1BBL的核酸序列是人cDNA(人4-1BBL基因)，编码scIL-12的核酸序列是人cDNA(人scIL-12基因)，和/或编码IL-2的核酸序列是人cDNA(人IL-2基因)。
[0116] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统的一个或多个核酸序列是cDNA序列。在本公开的新的载体/载体系统中包含的4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的基因的核酸序列可以认为是异源核酸序列。术语一个或多个核酸序列和一个或多个多核苷酸可以在本文中互换使用。如本文所述，术语“核酸序列”可以包含单链和双链核酸序列二者。在多种实施方案中，核酸序列是DNA序列。
[0117] 在多种实施方案中，载体是DNA载体。在多种实施方案中，载体是RNA载体。本公开的新的载体可以更具体地描述为环状载体，甚至更具体地为环状表达载体。如本文所述，术语“载体”可以包括单链和双链载体二者，包括但不限于单链和双链DNA载体。
[0118] 如本文所述，编码4-1BBL的基因的核酸序列包括编码4-1BBL的变体的核酸序列，特别是具有SEQ ID NO:2(图13)所示的氨基酸序列的4-1BBL的变体。这种变体序列在下文中进一步详述。同样地，编码IL-2的基因的核酸序列包括编码IL-2的变体的核酸序列，特别是具有SEQ ID NO:4(图14)所示的氨基酸序列的IL-2的变体。这种变体序列在下文中进一步详述。另外，编码scIL-12的基因的核酸序列包括编码scIL-12的变体的核酸序列，特别是具有SEQ ID NO:6(图15)所示的氨基酸序列的scIL-12的变体。这种变体序列在下文中进一步详述。
[0119] 在本公开的多种实施方案中，编码4-1BBL的(基因的)核酸序列包含(i)SEQ ID NO:1的核酸序列，其中所述核酸序列是密码子优化的以在人中表达，(ii)编码IL-2的(基因的)核酸序列包含SEQ ID NO:3的核酸序列，其中所述核酸序列是密码子优化的以在人中表达，和/或(iii)编码scIL-12的(基因的)核酸序列包含SEQ ID NO:5的核酸序列，其中所述核酸序列是密码子优化的以在人中表达。
[0120] 4-1BB是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族中的成员。CD137是根据CD命名法对4-1BB的命名。在本公开中，术语CD137和4-1BB可以互换使用。相应地，术语4-1BB配体(4-1BBL)和CD137配体在本公开中也可以互换使用。在本公开的多种实施方案中，编码4-1BBL(或CD137配体)的核酸序列显示与SEQ ID NO:1(图13)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码能特异性结合活化的T细胞(优选CD4+辅助细胞和CD8+T细胞)的4-1BBL蛋白。优选地，编码4-1BBL的核酸序列显示与SEQ ID NO:1(图13)的核酸序列至少80％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码能特异性结合活化的T细胞(优选CD4+辅助细胞和CD8+T细胞)的4-1BBL蛋白。更优选地，编码4-1BBL的核酸序列显示与SEQ ID NO:1(图13)的核酸序列至少90％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码能特异性结合活化的T细胞(优选CD4+辅助细胞和CD8+T细胞)的4-1BBL蛋白。甚至更优选地，编码4-1BBL的核酸序列显示与SEQ ID NO:1(图13)的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码能特异性结合活化的T细胞(优选CD4+辅助细胞和CD8+T细胞)的4-1BBL蛋白。在特定的实施方案中，如上所述的4-1BBL的变体显示与由SEQ ID NO:1(图13)的序列编码的原生4-1BBL相同的对T细胞(优选CD4+辅助细胞和CD8+T细胞)的结合特异性。在一个特别优选的实施方案中，编码4-1BBL的核酸序列包含SEQ ID NO:1(图13)的序列(或由该序列组成)。在多种优选的实施方案中，如本文所述的人4-1BBL的核酸序列的变体序列不是编码小鼠4-1BBL的核苷酸序列。因此，在多种优选的实施方案中，本公开的新的载体/载体系统不包含编码小鼠来源的4-1BBL的核酸序列。
[0121] 在本公开的多种实施方案中，编码IL-2的核酸序列显示与SEQ ID NO:3(图14)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-2蛋白。优选地，编码IL-2的核酸序列显示与SEQ ID NO:3(图14)的核酸序列至少80％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-2蛋白。更优选地，编码IL-2的核酸序列显示与SEQ ID NO:3(图14)的核酸序列至少90％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-2蛋白。甚至更优选地，编码IL-2的核酸序列显示与SEQ ID NO:3(图14)的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-2蛋白。在特定的实施方案中，如上所述的IL-2的变体显示与由SEQ ID NO:3(图14)的序列编码的原生IL-2相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个特别优选的实施方案中，编码IL-2的核酸序列包含SEQ ID NO:3(图14)的序列(或由该序列组成)。在多种优选的实施方案中，如本文所述的人IL-2的核酸序列的变体序列不是编码小鼠IL-2的核苷酸序列。因此，在多种优选的实施方案中，本公开的新的载体/载体系统不包含编码小鼠来源的IL-2的核酸序列。
[0122] 在本公开的多种实施方案中，编码scIL-12的核酸序列显示与SEQ ID NO:5(图15)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的scIL-12蛋白。优选地，编码scIL-12的核酸序列显示与SEQ ID NO:5(图15)的核酸序列至少80％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的scIL-12蛋白。更优选地，编码scIL-12的核酸序列显示与SEQ ID NO:5(图15)的核酸序列至少90％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的scIL-12蛋白。甚至更优选地，编码scIL-12的核酸序列显示与SEQ ID NO:5(图15)的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的scIL-12蛋白。如本文所述，如果蛋白包含构成作为融合蛋白的原生IL-12蛋白的两个亚基的氨基酸序列，则该蛋白被认为是scIL-12蛋白。SEQ ID NO:5(图15)的序列显示编码由连接子连接的人IL-12的40kDa和35kDa亚基的基因的序列。在图15中描述的SEQ ID NO:5的核苷酸序列中，连接子序列以粗体显示。在特定的实施方案中，如上所述的scIL-12的变体显示与由SEQ ID NO:5(图15)的序列编码的原生scIL-12相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个特别优选的实施方案中，编码scIL-12的核酸序列包含SEQ ID NO:5(图15)的序列(或由该序列组成)。在多种优选的实施方案中，如本文所述的人scIL-12的核酸序列的变体序列不是编码小鼠scIL-12的核苷酸序列。因此，在多种优选的实施方案中，本公开的新的载体/载体系统不包含编码小鼠来源的scIL-12的核酸序列。
[0123] 在本公开的多种实施方案中，4-1BBL的(基因的)核酸序列编码4-1BBL多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中4-1BBL多肽能特异性结合活化的T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。优选地，4-1BBL的(基因的)核酸序列编码4-1BBL多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中4-1BBL多肽能特异性结合T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。更优选地，4-1BBL的(基因的)核酸序列编码4-1BBL多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中4-1BBL多肽能特异性结合活化的T细胞(优选CD8+T细胞)。甚至更优选地，4-1BBL的(基因的)核酸序列编码4-1BBL多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中4-1BBL多肽能特异性结合活化的T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。在特定的实施方案中，如上所述4-1BBL的(基因的)变体核酸序列编码4-1BBL多肽，其显示与具有SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列的原生4-1BBL相同的对T细胞(优选CD8+T细胞)的结合特异性。在一个优选的实施方案中，4-1BBL的(基因的)核酸序列编码包含SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列的多肽(或由SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列组成的多肽)。
[0124] 在本公开的多种实施方案中，IL-2的(基因的)核酸序列编码IL-2多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中IL-2多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，IL-2的(基因的)核酸序列编码IL-2多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中IL-2多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，IL-2的(基因的)核酸序列编码IL-2多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中IL-2多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，IL-2的(基因的)核酸序列编码IL-2多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中IL-2多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在特定的实施方案中，如上所述IL-2的(基因的)变体核酸序列编码IL-2多肽，其显示与具有SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列的原生IL-2相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，IL-2的(基因的)核酸序列编码包含SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列的多肽(或由SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列组成的多肽)。
[0125] 在本公开的多种实施方案中，scIL-12的(基因的)核酸序列编码scIL-12多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12多肽具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，scIL-12的(基因的)核酸序列编码scIL-12多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12多肽具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，scIL-12的(基因的)核酸序列编码scIL-12多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12多肽具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，scIL-12的(基因的)核酸序列编码scIL-12多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12多肽具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在特定的实施方案中，如上所述scIL-12的变体核酸序列编码scIL-12多肽，其显示与具有SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列的原生scIL-12相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，scIL-12的(基因的)核酸序列编码包含SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列的多肽(或由SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列组成的多肽)。
[0126] 如本文所述，可以使用一个或多个多顺反子表达单位(polycistronic expression unit或multicistronic expression unit)，包括编码两种蛋白或全部三种蛋白的两个或三个多核苷酸序列，即两个多核苷酸序列，其每个编码至少(i)4-1BBL或scIL-
12，或(ii)4-1BBL或IL-2，或(iii)scIL-12或IL-2；或者三个多核苷酸序列，其每个分别编码至少4-1BBL、scIL-12或4-1BBL。多顺反子载体(或表达单位)的使用减少所需要的核酸分子的总数，并因此可以避免与从多个载体基因组协调表达相关的可能的困难。在一种多顺反子载体中，待表达的多个元件可以可操作地连接到一个或多个启动子(和其他表达控制元件(如果必要))。
12，或(ii)4-1BBL或IL-2，或(iii)scIL-12或IL-2；或者三个多核苷酸序列，其每个分别编码至少4-1BBL、scIL-12或4-1BBL。多顺反子载体(或表达单位)的使用减少所需要的核酸分子的总数，并因此可以避免与从多个载体基因组协调表达相关的可能的困难。在一种多顺反子载体中，待表达的多个元件可以可操作地连接到一个或多个启动子(和其他表达控制元件(如果必要))。
[0127] 当使用数个启动子时，可能观察到启动子的相互抑制。使用如下载体可以实现尤其高的表达率，所述载体至少是三顺反子的并且其特征还在于它们每个表达盒只含有一个启动子，并且不位于紧邻启动子的下游的每个顺反子进一步包含IRES序列。考虑启动子和IRES(内部核糖体进入位点)序列的组合以提供提高的蛋白表达。不同的IRES序列的使用可以提供另外的优势，即这些序列之间的重组频率可以最小化。在本公开的多种实施方案中，IRES来自EMCV(脑心肌炎病毒)。在本公开的多种实施方案中，IRES来自PV(脊髓灰质炎病毒)。在本公开的多种实施方案中，新的载体/载体系统在三个转基因4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12之间包含两个IRES，其中一个IRES可以是EMCV IRES，另一个IRES可以是PV IRES。在本公开的多种实施方案中，新的载体/载体系统在三个转基因4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12之间包含两个IRES，其中两个IRES可以都是EMCV IRES，或两个IRES可以都是PV IRES。当使用四顺反子载体时，将它们分离到不同的表达盒可能是有用的。在这种情况中，优选的是每个表达盒存在一个启动子。在两个表达盒中分开(其优选显示距彼此最大的可能距离)提供在空间上分离启动子，以此减少相互抑制。
[0128] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统在由内部核糖体进入位点(IRES)连接的三顺反子构体中包含以4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12的顺序(即，5’到3’，编码IL-2的基因位于编码4-1BBL的基因的下游，并且编码scIL-12的基因位于编码IL-2的基因的下游)组装的这三个基因。优选地，所述三个基因是人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12的基因。更优选地，所述三个基因由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，即，载体系统在包含人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12三个基因的三顺反子构体的上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即新的载体/载体系统在包含人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12(人scIL-12)三个基因的三顺反子构体的下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因。甚至更优选地，载体DNA是腺病毒载体DNA。
[0129] 因此，在一个优选的实施方案中，本公开的新的载体/载体系统包含表达盒，所述表达盒(i)在由内部核糖体进入位点(IRES)连接的三顺反子构体中包含按照人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12的顺序(即，5’到3’，编码IL-2的基因位于编码4-1BBL的基因的下游，并且编码scIL-12的基因位于编码IL-2的基因的下游)组装的这三个基因，(ii)在包含人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12三个基因的三顺反子构体的上游包含CMV启动子，和(iii)在所述三顺反子构体的下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，其中所述载体是腺病毒载体。
[0130] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统包含表达构体，其中4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12三个基因按照以下(a)至(f)中任一个所描述的进行组装(Prom.＝启动子)：
[0131]
[0132] 在多种实施方案中，本公开的新的载体在按照本文别处所述的顺序组装的4-1BBL、IL-2和scIL-12三个基因(或包含该三个基因的表达构体)的上游包含启动子。优选地，人4-1BBL的基因在新的载体的三个基因的第1位，更优选地，在包含所述三个基因的表达构体的第1位。
[0133] 在多种实施方案中，本公开的新的载体包含表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列的表达提供与SEQ ID NO:12的表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，所述表达盒包含与SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列的表达提供与SEQ ID NO:12的表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，所述表达盒包含与SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列的表达提供与SEQ ID NO:12的表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，所述表达盒包含与SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列的表达提供与SEQ ID NO:12的表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，本公开的新的载体包含含有SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列的表达盒(或由SEQ ID NO:12(图18)的核酸序列组成的表达盒)。
[0134] 在多种实施方案中，本公开的新的载体包含表达盒，所述表达盒包含与参考表达盒具有至少70％的同源性或序列同一性的核酸序列，所述参考表达盒包含SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列：(i)bp1,080-1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(ii)bp1,885-2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iii)bp2,409-2,870的核酸序列(人IL-2)，(iv)bp2,914-3,545的核酸序列(PV IRES)，和(v)bp3,581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-12的p40和p35亚基的人scIL-12)，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少80％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少90％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，本公开的新的载体包含含有SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列的表达盒(或由SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列组成的表达盒)：(i)bp1,080-
1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(ii)bp1,885-2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iii)bp2,
409-2,870的核酸序列(人IL-2)，(iv)bp2,914-3,545的核酸序列(PV IRES)，和(v)bp3,
581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-12的p40和p35亚基的人scIL-12)。
1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(ii)bp1,885-2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iii)bp2,
409-2,870的核酸序列(人IL-2)，(iv)bp2,914-3,545的核酸序列(PV IRES)，和(v)bp3,
581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-12的p40和p35亚基的人scIL-12)。
[0135] 在多种实施方案中，本公开的新的载体包含表达盒，所述表达盒包含与参考表达盒具有至少70％的同源性或序列同一性的核酸序列，所述参考表达盒包含SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列：(i)bp 484-1,059的核酸序列(CMV启动子)，(ii)bp1,080-1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(iii)bp1,885-2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iv)bp 2,409-2,870的核酸序列(人IL-2)，(v)bp2,914-3,545的核酸序列(PV IRES)，(vi)bp 3,581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-12的p40和p35亚基的人scIL-12)，和(vii)bp 5,271-5,510的核酸序列(SVpolyA)，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少80％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少90％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，所述表达盒包含与所述参考表达盒具有至少
95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，本公开的新的载体包含含有SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列的表达盒(或由SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列组成的表达盒)：(i)bp 484-1,
059的核酸序列(CMV启动子)，(ii)bp1,080-1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(iii)bp1,885-
2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iv)bp 2,409-2,870的核酸序列(人IL-2)，和(v)bp2,914-
3,545的核酸序列(PV IRES)，(vi)bp 3,581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-
12的p40和p35亚基的人scIL-12)，和(vii)bp 5,271-5,510的核酸序列(SVpolyA)。
95％、96％、97％、98％或99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体表达盒的表达提供与所述参考表达盒的表达相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在一个优选的实施方案中，本公开的新的载体包含含有SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列的表达盒(或由SEQ ID NO:11(图17)的以下核酸序列组成的表达盒)：(i)bp 484-1,
059的核酸序列(CMV启动子)，(ii)bp1,080-1,844的核酸序列(人4-1BBL)，(iii)bp1,885-
2,388的核酸序列(EMCV IRES)，(iv)bp 2,409-2,870的核酸序列(人IL-2)，和(v)bp2,914-
3,545的核酸序列(PV IRES)，(vi)bp 3,581-5,203的核酸序列(包含由连接子连接的人IL-
12的p40和p35亚基的人scIL-12)，和(vii)bp 5,271-5,510的核酸序列(SVpolyA)。
[0136] 在多种实施方案中，载体系统包含在三种独立载体中组装的4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12三种基因。优选地，三种基因是人4-1BBL(CD137L)基因、人IL-2基因和人单链IL-12基因。更优选地，三种基因的每种都由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，即，每种载体分别在人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12的基因的上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，每个载体系统分别在人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12(人scIL-12)基因的下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
[0137] 因此，在一个优选的实施方案中，载体系统包含三种腺病毒载体，每种包含(i)人4-1BBL(CD137L)、人IL-2或人单链IL-12的基因，(ii)分别在人4-1BBL(CD137L)、人IL-2或人单链IL-12的基因上游的CMV启动子，和(iii)分别在人4-1BBL(CD137L)、人IL-2和人单链IL-12的基因下游的编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。
[0138] 在多个方面，载体系统包含在两种独立载体中组装的4-1BBL(CD137L)、IL-2和单链IL-12三种基因。具体地，在多种实施方案中，两种载体中的一种包含4-1BBL(CD137L)和IL-2的基因，另一种载体包含单链IL-12的基因。优选地，基因是人4-1BBL(CD137L)基因、人IL-2基因和人单链IL-12基因。更优选地，基因由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子，或者在人IL-2的基因位于人
4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子，并且包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，两种载体中的每种包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人IL-2的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，并且包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子，并且包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，两种载体中的每种包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人IL-2的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，并且包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
[0139] 因此，在一个优选的实施方案中，载体系统包含两种腺病毒载体，一种包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因，另一种包含人scIL-12的基因，其中(i)在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体进一步在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子，或者在人IL-2的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游进一步包含CMV启动子，并且其中包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子，和(ii)在人4-1BBL(CD137L)的核酸序列位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体还进一步在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人IL-2的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人IL-2的基因的载体还进一步在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，并且其中包含人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因。
[0140] 在多种其他实施方案中，载体系统包含两种独立载体，其中两种载体中的一种包含4-1BBL(CD137L)和单链IL-12的基因，另一种载体包含IL-2的基因。优选地，基因是人4-1BBL(CD137L)基因、人scIL-12基因和人IL-2基因。更优选地，基因都由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人4-
1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子，或者在人scIL-12的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子，并且包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，两种载体中的每种包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人scIL-12的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-
1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，并且包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子，或者在人scIL-12的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子，并且包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，两种载体中的每种包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，即，在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人scIL-12的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-
1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，并且包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
[0141] 因此，在一个优选的实施方案中，载体系统包含两种腺病毒载体，一种包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因，另一种包含人IL-2的基因，其中(i)在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游进一步包含CMV启动子，或者在人scIL-12的基因位于人4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游进一步包含CMV启动子，并且其中包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子，和(ii)在人4-1BBL(CD137L)的基因位于人scIL-
12的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体还在人scIL-12的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人scIL-12的基因位于人
4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体还在人4-1BBL(CD137L)的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，并且其中包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。
12的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体还在人scIL-12的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人scIL-12的基因位于人
4-1BBL(CD137L)的基因上游的情况下，包含人4-1BBL(CD137L)和人scIL-12的基因的载体还在人4-1BBL(CD137L)的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，并且其中包含人IL-2的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。
[0142] 在多种其他实施方案中，载体系统包含两种独立载体，其中两种载体中的一种包含IL-2和单链IL-12(scIL-12)的基因，另一种载体包含4-1BBL(CD137L)的基因。优选地，基因是人IL-2基因、人scIL-12基因和人4-1BBL(CD137L)基因。更优选地，基因都由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，即，在人IL-2的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人IL-2的基因上游包含CMV启动子，或者在人scIL-12的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游包含CMV启动子，并且包含人4-1BBL(CD137L)的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子。仍更优选地，转录本聚腺苷酸化是由SV40衍生的信号诱导的，即，两种载体中的每种包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，即，在人IL-2的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，或者在人scIL-12的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人IL-2的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，并且包含人4-1BBL(CD137L)的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。甚至更优选地，每种独立载体的载体DNA是腺病毒载体DNA。
[0143] 因此，在一个优选的实施方案中，载体系统包含两种腺病毒载体，一种包含人IL-2和人scIL-12的基因，另一种包含人4-1BBL(CD137L)的基因，其中(i)在人IL-2的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人IL-2的基因上游进一步包含CMV启动子，或者在人scIL-12的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体在人scIL-12的基因上游进一步包含CMV启动子，并且其中包含人4-1BBL(CD137L)的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因上游包含CMV启动子，和(ii)在人IL-2的基因位于人scIL-12的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体还在人scIL-12的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的基因，或者在人scIL-12的基因位于人IL-2的基因上游的情况下，包含人IL-2和人scIL-12的基因的载体还在人IL-2的基因下游进一步包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列，并且其中包含人4-1BBL(CD137L)的基因的载体在人4-1BBL(CD137L)的基因下游包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核酸序列。
[0144] 对于本公开的病毒颗粒，表达单元进一步包括编码包膜/衣壳分子或对于在包装细胞中产生期望的载体颗粒来说必需的一种或多种成熟因子的序列。
[0145] 内部核糖体进入位点(IRES)元件用于产生多基因或多顺反子的信息(multicistronic message或polycistronic message)。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并且在内部位点开始翻译。IRES元件可以连接到异源开放阅读框。各自都被产生多顺反子信息的IRES分离的多个开放阅读框可以一起转录。多顺反子表达载体中待表达的每个组分可以被IRES元件分开以允许多种蛋白从同一启动子单独表达。
可以用于分开多顺反子载体中的遗传元件的工具(特别是IRES元件)在本领域是已知的。特定的多顺反子载体的功效可以容易地通过使用标准程序检测每种基因的表达而进行检验。
可以用于分开多顺反子载体中的遗传元件的工具(特别是IRES元件)在本领域是已知的。特定的多顺反子载体的功效可以容易地通过使用标准程序检测每种基因的表达而进行检验。
[0146] 在本公开的多种实施方案中，编码至少4-1BBL、scIL-12和IL-2的一个或多个核酸序列组装在一个载体中，其中编码scIL-12和IL-2的一个或多个核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的下游。这种载体被认为是多顺反子表达载体。在特定的实施方案中，所述多顺反子表达载体是含有编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的(基因的)核酸序列的三顺反子表达载体，其中基因在5’到3’方向上以1、2、3的顺序组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。在多种实施方案中，编码scIL-12和IL-2的一个或多个核酸序列位于编码4-1BBL的核酸序列的下游。优选地，在多顺反子或三顺反子表达载体中，编码IL-2的核酸序列位于编码4-
1BBL的核酸序列的下游，并且编码scIL-12的核酸序列位于编码IL-2的核酸序列的下游。在多顺反子或三顺反子表达的多种实施方案中，启动子位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，但不在编码scIL-12和/或IL-2的一个或多个核酸序列的上游。
1BBL的核酸序列的下游，并且编码scIL-12的核酸序列位于编码IL-2的核酸序列的下游。在多顺反子或三顺反子表达的多种实施方案中，启动子位于编码4-1BBL的核酸序列的上游，但不在编码scIL-12和/或IL-2的一个或多个核酸序列的上游。
[0147] 在多顺反子或三顺反子表达载体的特定实施方案中，编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个核酸序列由内部核糖体进入位点(IRES)连接。
[0148] 在一个特定的示例中，病毒载体基因组包含：增强子/启动子序列(优选巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子序列)；来自病毒5’LTR的R和U5序列；任选地包装序列；内部增强子；内部启动子；编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个多核苷酸；其增强子序列缺失的U3元件；和病毒3’LTR的R和U5序列。载体基因组的构建可以使用本领域已知的任何合适的遗传工程技术完成，包括但不限于，限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如在Sambrook等(1989和2001版)；Molecular Cloning：A Laboratory Maual,Cold Spring Harbor Laboratory出版社，纽约)中所描述的。
[0149] 也可以使用构建用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，这样宿主细胞积累许多拷贝的表达载体，并且继而合成高水平的在表达载体中由多核苷酸编码的多肽。参见Sambrook等(同上)，第16.17-16.22页，1989。适合适用到多肽的表达的其他载体和方法在本领域是公知的并且容易适用到特定的情形。
[0150] 通过使用本文提供的教导和本领域的知识，本领域技术人员会认识到特定表达系统的功效可以通过用包含编码报告蛋白的多核苷酸序列的载体转染包装细胞并使用合适的技术测量表达(例如，测量来自绿色荧光蛋白缀合物的荧光)而进行检测。其他合适的报告基因是本领域公知的。
[0151] 本公开还构思了在特定的实施方案中，由本公开提供的新的载体/载体系统可以包含原生IL-12而非scIL-12，即，可以包含编码原生IL-12的(基因的)核酸序列。IL-12是二硫连接的异二聚体细胞因子，由两个分开编码的p35和p40亚基组成。在多种实施方案中，(基因的)核酸序列可以编码原生人IL-12。相应地，在多种实施方案中，由本公开提供的新的载体/载体系统可以包含编码(i)4-1BBL配体(4-1BBL)，(ii)IL-12p40和p35亚基，和(iii)IL-2的三个基因，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序组装，条件是编码IL-12p35和IL-12p40亚基的一个或多个基因不在第1位。
[0152] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统可以包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、原生IL-12和IL-2的三个基因，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序组装，条件是编码IL-12p35和p40亚基的一个或多个基因不在第1位，其中编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少
70％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。优选地，编码IL-12亚基p35和p40的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。更优选地，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。甚至更优选地，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或
99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。在特别优选的实施方案中，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列。在特定的实施方案中，如上所述IL-12亚基p35和p40的变体显示出与由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的序列编码的IL-12亚基p35和p40相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。
70％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。优选地，编码IL-12亚基p35和p40的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。更优选地，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。甚至更优选地，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或
99％的同源性或序列同一性的核酸序列，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)的IL-12蛋白。在特别优选的实施方案中，编码IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因可以包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9(图16)的核酸序列。在特定的实施方案中，如上所述IL-12亚基p35和p40的变体显示出与由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的序列编码的IL-12亚基p35和p40相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。
[0153] 在多种实施方案中，IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因编码与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10(图16)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的多肽，其中该多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因编码与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10(图16)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的多肽，其中该多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因编码与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10(图16)的氨基酸序列具有至少90％或95％的同源性或序列同一性的多肽，其中该多肽具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，IL-12亚基p40和p35的一个或多个基因编码具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10(图16)的氨基酸序列的多肽。
[0154] 优选地，如本文所述人IL-12亚基p35和p40的核酸序列的变体序列不是编码小鼠IL-12亚基p35和p40的核苷酸序列。因此，优选地，包含如上所述编码4-1BB配体(4-1BBL)、IL-12亚基p35和p40以及IL-2三个基因的本公开的新的载体/载体系统(即，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2和3的顺序组装，条件是编码IL-12亚基p35和p40的一个或多个基因不在第1位)不包含编码小鼠来源的IL-12亚基p35和p40的核酸序列。
[0155] 在另一个实施方案中，提供了载体颗粒。本公开提供包含本公开的载体系统的病毒颗粒。载体颗粒包含本文所述的新的载体/载体系统的任一种，所述新的载体/载体系统包含含有编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个多核苷酸序列的一种或多种载体。本文还提供用于将编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2(如本文所述)的本公开的载体系统递送到靶细胞的方法。这种方法包括将靶细胞与递送本公开的载体系统的运载工具接触(即允许相互作用)。在特定的实施方案中，用于递送新的载体/载体系统的方法包括通过施用给受试者包含本公开的新的载体/载体系统的载体颗粒而接触细胞，所述本公开的新的载体/载体系统包含含编码至少4-1BBL、scIL-12和/或IL-2的一个或多个多核苷酸序列的一种或多种载体。
[0156] 在特定的实施方案中，载体颗粒是病毒载体颗粒并且新的载体/载体系统的一种或多种载体是RNA载体、质粒载体、纳米颗粒载体和裸DNA中的任一种。在另外特定的实施方案中，载体颗粒是衍生自细菌(例如，单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌属的种(Salmonella spp.)、牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏菌属的种(Shigella spp.)和耶尔森氏菌属的种(Yersinia spp.))的颗粒并且载体系统的一种或多种载体是RNA载体、质粒载体、纳米颗粒载体和裸DNA中的任一种。
[0157] 示例性病毒载体颗粒包括包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒、包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒、包含牛痘病毒载体基因组的牛痘病毒载体颗粒、包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒、包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒、包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒(例如，单纯疱疹病毒I或II)或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。
[0158] 载体颗粒(例如本文所述的病毒载体颗粒)可以体内注射，特别是注射到肿瘤，其中颗粒通过4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达提供免疫刺激作用。病毒颗粒的量为至少3×106ivp(感染性病毒颗粒)，并且可以为至少1×107ivp，至少3×107ivp，至少1×108ivp，至
8 9 9
少3×10ivp，至少1×10ivp或至少3×10ivp。以所选择的间隔，可以使用来自接受者的恶性(肿瘤)或目标病原体感染的组织的细胞来测量4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达，例如，通过观测标志物(例如，如果由包括在载体颗粒中的载体系统中存在的多核苷酸序列共表达，GFP或荧光素酶)表达。尤其是，可以测量来自载体颗粒处理的接受者的恶性(肿瘤)或目标病原体感染的组织的T细胞的4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达。
8 9 9
少3×10ivp，至少1×10ivp或至少3×10ivp。以所选择的间隔，可以使用来自接受者的恶性(肿瘤)或目标病原体感染的组织的细胞来测量4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达，例如，通过观测标志物(例如，如果由包括在载体颗粒中的载体系统中存在的多核苷酸序列共表达，GFP或荧光素酶)表达。尤其是，可以测量来自载体颗粒处理的接受者的恶性(肿瘤)或目标病原体感染的组织的T细胞的4-1BBL、scIL-12和IL-2的表达。
[0159] 术语“复制型腺病毒载体”是指在特定的细胞或组织中病毒复制所要求的任何基因功能方面没有缺陷的任意腺病毒载体。该载体必须能够复制和被包装，但是在特定的细胞或组织中可能只是条件型复制。
[0160] 腺病毒(Ad)是一种大(约36kb)的DNA病毒，其感染人但是显示宽的宿主范围。大约有50种人腺病毒的血清型，其基于分子、免疫和功能标准被划分为6个家族。到成年，几乎每个人都被多于一种常见的腺病毒血清型感染过，主要作用是类似感冒的症状。宿主细胞的腺病毒感染引起腺病毒DNA保持为游离形式，其降低与整合载体相关的潜在基因毒性。另外，腺病毒在结构上是稳定的并且在大量扩增后没有检测到有基因组重排。
[0161] 在本公开中使用的腺病毒载体可以是适合用于处理人或动物的方法的任何腺病毒载体。或者，根据本公开可以使用腺病毒载体的多种类型。另外，载体可以以本领域已知的任何方式进行修饰，例如通过缺失、插入、突变或修饰任何病毒区域。可以将载体制备为在复制方面是肿瘤特异性的。例如，腺病毒载体可以包含在E1、E3和/或E4中的修饰，例如肿瘤特异性启动子的插入、区域的缺失和转基因的插入。
[0162] 人Ad-5是在遗传上和生化上已被良好地表征的一种人腺病毒血清型(GenBank M73260；AC_000008)。因此，在一个优选的实施方案中，腺病毒是复制型Ad5血清型或含有Ad5成分的混合血清型。腺病毒可以是野生型菌株或者可以是遗传修饰的以增强肿瘤选择性，例如通过减弱病毒在普通休眠细胞中的复制能力而不影响病毒在肿瘤细胞中的复制能力。本公开包括的腺病毒的非限制性实例包括δ-24、δ-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、ONYX-015、ColoAd1和H1O1。在一个特定的实施方案中，腺病毒是δ-24或δ-24-RGD。δ-24腺病毒衍生自5型腺病毒(Ad-5)并且在E1A基因的CR2部分内含有一个24碱基对缺失。δ-24-RGD进一步包含RGD-4C序列的插入。E1A缺失增加了病毒对癌细胞的选择性；RGD-4C序列增加了病毒在胶质瘤中的感染性。
[0163] 另外，腺病毒载体的骨架可以是任意血清型的。仍进一步地，载体可以是嵌合载体，例如Ad5/3载体。作为一个实例，“Ad5/3载体”是指具有Ad5载体和Ad3载体二者的部分的嵌合载体。
[0164] 腺病毒是具有吸引力的递送系统，并且被很好地建立以用于若干治疗性应用中的基因转移。腺病毒通过细胞表面受体进入受纳宿主细胞，然后其被内化。
[0165] 肿瘤类型上的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的缺乏或其低水平存在可以限制腺病毒的功效。修饰衣壳允许CAR依赖性靶细胞感染。另外，可以通过添加转染子样聚阳离子化合物提高腺病毒摄取到靶组织。本文已经证实(参见实施例10)使用转染子硫酸鱼精蛋白尤其提高腺病毒摄取。因此，在多种实施方案中，硫酸鱼精蛋白用于本公开的载体系统的转染，优选用于本公开的腺病毒载体系统的转染。
[0166] 在表达方面，通常会包括聚腺苷酸化信号以产生转录本的合适的聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的性质不认为是对本公开的成功实践是关键的，可以采用任何这种序列。优选的实施方案包括方便的和/或已知在多种靶细胞中很好发挥功能的SV40聚腺苷酸化信号和/或牛生长激素聚腺苷酸化信号。转录终止位点在本文也被构思为表达构体的元件。这些元件可以有助于增强信号水平和/或最小化从盒到其他序列的通读。
[0167] 在本公开的特定的实施方案中，被本公开的新的载体/载体系统感染的细胞可以通过在载体系统中包括报告基因而在体外识别。一般地，可选择的报告子是赋予允许选择的性质的那种。可选择的阳性报告子是其中报告基因的存在允许其选择的那种，而可选择的阴性报告子是其中报告基因的存在阻止其选择的那种。可选择的阳性标志物的实例是抗药性标志物。其他类型的报告子包括可筛选的报告子(例如GFP(绿色荧光蛋白))。
[0168] 本公开的实施方案可以使用被设计以产生疫苗或基因治疗构体的现有的病毒载体平台技术。病毒载体构建的方面包括将遗传材料插入到病毒载体并通过核酸、病毒和病毒产物的表征和测序来确认构体。然后病毒载体进行被设计以评估可扩展性的一系列的可行性研究。
[0169] 本公开提供包含编码本公开的新的载体/载体系统的核酸序列的多核苷酸。
[0170] 另外，本公开提供包含如本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒的组合物。本公开还提供包含本文公开的多核苷酸(即，包含编码本公开的新的载体/载体系统的核酸序列的多核苷酸)的组合物。
[0171] 不受理论约束地，表达4-1BBL、scIL-12和IL-2的新的载体/载体系统的使用引起细胞因子在肿瘤中或肿瘤周围的局部产生，其会将系统或局部诱导的肿瘤特异性细胞毒性T细胞指引到癌症的部位。通过由这种机制提供的免疫刺激作用，癌症、病毒感染和免疫系统紊乱的免疫治疗的功效将会极大增强。在实施例中已经证实了由本公开的新的载体/载体系统提供的免疫刺激作用。
[0172] 本公开包括用作药物的包含本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒的组合物。本公开提供一种药物，其包含本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒。本公开还提供一种药物，其包含本文公开的多核苷酸，即包含编码本公开的新的载体/载体系统的核酸序列的多核苷酸。
[0173] 本公开包括用作治疗性疫苗，尤其是用作用于治疗癌症或病毒感染的治疗性疫苗的本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒。
[0174] 本公开还提供用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的免疫细胞或癌细胞。这种转导或转染的细胞可以用于离体治疗，特别是离体癌症治疗。在这种治疗的多种实施方案中，至少5％的用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞表达4-1BBL。
[0175] 在本公开中，癌细胞优选是肿瘤的细胞，即，肿瘤细胞，更具体地是实体瘤的细胞。
[0176] 另外，本公开提供包含这种用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的免疫细胞或癌细胞的组合物。更进一步地，本公开提供包含这种用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的免疫细胞或癌细胞的药物。在多种实施方案中，免疫细胞是T细胞、NK细胞、单核细胞系细胞类型(巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、肥大细胞)、成纤维细胞。在多种实施方案中，至少5％的用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞表达4-1BBL。
[0177] 本公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒可以用于治疗或改善癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的方法中。同样地，本公开的多核苷酸可以用于癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的治疗。同样地，本公开的上述组合物或药物可以用于癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的治疗。在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒可以认为是活性试剂。同样地，在多种实施方案中，本公开的多核苷酸(即，包含编码本公开的新的载体或载体系统的核酸序列的多核苷酸)和用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞可以认为是活性试剂。这尤其适用于本文公开的药物治疗的上下文中。
[0178] 本公开提供用于治疗或改善癌症、病毒感染性疾病(病毒感染)或免疫系统紊乱的方法，其包括施用给需要其的受试者治疗有效量的本公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒。本公开还提供用于治疗或改善癌症、病毒感染性疾病(病毒感染)或免疫系统紊乱的方法，其包括施用给需要其的受试者治疗有效量的本公开的多核苷酸，即，包含编码本公开的新的载体或载体系统的核酸序列的多核苷酸。本公开还提供用于治疗或改善癌症、病毒感染性疾病(病毒感染)或免疫系统紊乱的方法，其包括施用给需要其的受试者治疗有效量的本公开的免疫细胞或癌细胞，即，用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的免疫细胞或癌细胞。在多种实施方案中，治疗或改善癌症的方法是以离体治疗进行的，其包括从患者获得癌细胞，用本文公开的载体系统或病毒颗粒转导或转染自体癌细胞，并且将用本文公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒转导或转染的自体癌细胞施用给患者。本公开还提供治疗或改善癌症、病毒感染性疾病(病毒感染)或免疫系统紊乱的方法，其包括施用给需要其的受试者治疗有效量的上述本公开的药物或组合物。
[0179] 如本文使用地，术语“治疗有效量”是指本文公开的活性试剂、组合物或药物的量，在该量下疾病或紊乱(例如，癌症或感染性疾病)的有害作用是最小的、改善的。
[0180] 在优选的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑上皮癌、头颈癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈上皮癌、乳腺上皮癌、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小细胞肺上皮癌、维尔姆斯瘤、宫颈上皮癌、睾丸上皮癌、膀胱上皮癌、胰腺上皮癌、胃上皮癌、结肠上皮癌、前列腺上皮癌、泌尿生殖器上皮癌、甲状腺上皮癌、食管上皮癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺上皮癌、肾细胞上皮癌、子宫内膜上皮癌、肾上腺皮质上皮癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类上皮癌、绒毛膜上皮癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤中的任一种。
[0181] 在其他优选的实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、癌转移、腺上皮癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌和胰腺癌中的任一种。在特别优选的实施方案中，所述癌症是泌尿生殖器癌，优选膀胱癌。在其他特别优选的实施方案中，所述癌症是肝癌。在又其他特别优选的实施方案中，所述癌症是皮肤癌。本公开提供的手段和方法在用于治疗或预防癌转移的方法中也是特别有用的。
[0182] 在多种实施方案中，所述癌症包括可接近的以允许本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物直接注射进入肿瘤或注射到肿瘤周围的一种或多种肿瘤。在特别优选的实施方案中，所述癌症包括实体瘤或为实体瘤。在特定的实施方案中，所述实体瘤是上皮癌(carcinoma)、肉瘤或淋巴瘤。在这方面，尽管淋巴瘤一般被认为是液体瘤，可接近的“实体”瘤可以在淋巴结中形成，并因此可以根据本文公开的方法和应用进行治疗。
[0183] 在多种实施方案中，感染性疾病是由致病性细菌引起的感染性疾病。在其他实施方案中，感染性疾病是由病毒引起的感染性疾病。在又其他的实施方案中，感染性疾病是由致病性寄生虫、原生动物或真菌引起的感染性疾病。
[0184] 可以根据本公开治疗、防范和/或管理的病毒疾病包括但不限于由甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感(例如，甲型流感或乙型流感)、水痘、腺病毒、单纯疱疹I型(HSV-I)、单纯疱疹II型(HSV-II)、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘状病毒、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)、人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人类免疫缺陷病毒II型(HIV-II)、埃博拉病毒、寨卡以及病毒疾病(例如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热或天花)的病原体(agents)引起的那些。
[0185] 可以根据本公开治疗、防范和/或管理的由细菌引起的细菌疾病包括但不限于莱姆病、炭疽病、破伤风、霍乱、瘟疫、白喉、衣原体病和百日咳。
[0186] 可以根据本公开治疗、防范和/或管理的由原生动物引起的原生动物疾病包括但不限于利什曼虫病和疟疾。可以根据本公开治疗、防范和/或管理的由寄生虫引起的寄生虫疾病包括但不限于衣原体病和立克次氏体病。
[0187] 在本公开中，免疫系统紊乱的特征在于免疫系统的下调，尤其是免疫应答的下调。本公开的新的载体/载体系统能够通过将不活跃的免疫微环境转换为活跃的免疫微环境来控制这种免疫系统紊乱并且从而治疗免疫系统紊乱。
[0188] 同样地，在本公开中，癌症的特征可以在于免疫系统的下调，尤其是免疫应答的下调。因此，本公开的新的载体/载体系统能够通过将不活跃的肿瘤微环境转换为活跃的肿瘤微环境来控制或治疗癌症并且从而治疗或控制癌症。
[0189] 同样地，在本公开中，感染性疾病的特征可以在于免疫系统的下调，尤其是免疫应答的下调。因此，本公开的新的载体/载体系统能够通过将不活跃的免疫微环境转换为活跃的免疫微环境来控制或治疗感染性疾病并且从而治疗或控制感染性疾病。
[0190] 在本公开的多种实施方案中，载体系统以每剂量单位不超过1×1011ivp，优选不超过1×1010ivp，更优选不超过1×109ivp，甚至更优选不超过1×107或1×106ivp的浓度存在。这特别适用于(但不限于)本文公开的药物治疗。
[0191] 另外，在本公开的多种实施方案中，病毒颗粒以每剂量单位不超过1×1011ivp，优选不超过1×1010ivp，更优选不超过1×109ivp，甚至更优选不超过1×107或1×106ivp的浓度存在。这特别适用于(但不限于)本文公开的药物治疗。
[0192] 在多种实施方案中，本公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒的5×106ivp(感染性病毒颗粒)施用给需要其的患者。在多种其他实施方案中，本公开的新的载体/载体系统或病毒颗粒的5×107ivp施用给需要其的患者。在多种其他实施方案中，本公开的新的载8
体/载体系统或病毒颗粒的5×10ivp施用给需要其的患者。
体/载体系统或病毒颗粒的5×10ivp施用给需要其的患者。
[0193] 在本公开中，术语“药物”或“药物组合物”可以互换使用。所述药物或药物组合物可以是以适于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。配方可以是(但不限于)溶液、乳剂或悬液中的任一种。用于配制本公开的药物制剂的手段和方法对于本领域的技术人员是已知的并且可以以其已知的方法制成。药物(或药物组合物)可以与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合施用。药学上可接受的载体在本领域中是公知的，并且包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、氨基酸、无菌等渗水缓冲液及其组合。
[0194] 本公开的活性试剂(例如，新的载体/载体系统或病毒颗粒)、组合物和药物可以肠道外施用。这些活性化合物的溶液或悬液可以在水中合适地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合而制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。示例性油是石油、动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液以及二醇类(例如，丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，尤其是用于可注射溶液。在储藏和使用的普通条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。用于肠道外和非肠道外药物递送的制剂在本领域是已知的并且在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack出版(1995)中示出，其以其整体包含在此引作参考。
[0195] 适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的以达到存在容易的可注射性的程度。它必须在制造和储藏的条件下是稳定的并且必须保存防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。
[0196] 根据本公开待治疗的受试者是处于有发展癌症、感染性疾病或免疫系统紊乱的风险或已经发展成癌症、感染性疾病或免疫系统紊乱的受试者。这种受试者包括人和非人动物，优选哺乳动物或禽鸟物种。示例性哺乳动物受试者包括但不限于人、非人灵长类、狗、猫、啮齿类、牛、马、绵羊和猪。示例性的禽鸟受试者包括但不限于鸡、鹌鹑、火鸡、鸭或鹅。
[0197] 本公开的治疗性或预防性活性试剂、组合物或药物的有效量是在意欲目标(例如针对肿瘤或感染性疾病的免疫应答的刺激)的基础上决定的。本领域技术人员熟知如何在体内和离体应用基因递送。对于病毒载体，通常会制备病毒载体储液。取决于病毒的种类和可得到的效价，会递送至少约，至多约，或约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、10 11 12
1×10 、1×10 或1×10 个感染性病毒颗粒或它们之间的任意值或范围到受试者。在其他方面，根据本公开的一种或多种病毒载体可以以单次施用或多次施用进行施用。一种或多种病毒载体可以以1×105个感染性病毒颗粒(ivp)、5×105ivp，至少1×106ivp、5×106或约
5×106ivp、1×107、至少1×107ivp、1×108或约1×108ivp、至少1×108ivp、约或至少5×
108ivp、1×109或至少1×109ivp、5×109或至少5×109ivp、1×1010ivp或至少1×1010ivp、5×1010或至少5×1010ivp、1×1011或至少1×1011、1×1012或至少1×1012、1×1013或至少1×
1013ivp的剂量施用。例如，一种或多种病毒载体可以以约107-1013ivp之间、约108-1013ivp之间、约108-1012ivp之间或约109-1012ivp之间的剂量施用。
1×10 、1×10 或1×10 个感染性病毒颗粒或它们之间的任意值或范围到受试者。在其他方面，根据本公开的一种或多种病毒载体可以以单次施用或多次施用进行施用。一种或多种病毒载体可以以1×105个感染性病毒颗粒(ivp)、5×105ivp，至少1×106ivp、5×106或约
5×106ivp、1×107、至少1×107ivp、1×108或约1×108ivp、至少1×108ivp、约或至少5×
108ivp、1×109或至少1×109ivp、5×109或至少5×109ivp、1×1010ivp或至少1×1010ivp、5×1010或至少5×1010ivp、1×1011或至少1×1011、1×1012或至少1×1012、1×1013或至少1×
1013ivp的剂量施用。例如，一种或多种病毒载体可以以约107-1013ivp之间、约108-1013ivp之间、约108-1012ivp之间或约109-1012ivp之间的剂量施用。
[0198] 治疗作用可以用本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物的一次施用实现。另一方面，治疗可以含有几次施用。
[0199] 载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、疾病的类型和疾病的阶段。剂量可以例如从约1×108ivp(感染性病毒颗粒)至约1×1014ivp，特别地从约1×109ivp至约1×1013ivp，更特别地从约5×109ivp至约1×1012ivp变化。
[0200] 本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物的施用可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。在本公开的一个实施方案中，施用是通过瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、泡内、腔内或腹膜注射或口服施用进行的。在本公开的一个另外的实施方案中，施用是肌肉内、皮内、皮下、肠道外、滴鼻、气管内、经皮、脊柱内、经眼或颅内进行的。也可能结合不同的施用途径。在一个优选的实施方案中，施用是通过瘤内施用进行的，即，将本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物的施用进肿瘤。
[0201] 本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物也可以与其他治疗性试剂或治疗性方法或治疗的组合(同时、顺序或伴随地)一起使用。例如，本公开的治疗性方法或应用可以进一步包括放射治疗、化学治疗、施用其他药物(例如针对肿瘤生长机制的抗体、免疫细胞检查点靶标、癌症疫苗)或任何临床操作。
[0202] 如本文所述，提供了用于免疫刺激(即，在治疗癌症、感染性疾病或免疫系统紊乱的背景中诱导、控制和/或活化和/或刺激免疫应答机制)，尤其是用于吸引或募集通过对感兴趣的部位(例如，对肿瘤或感染的粘膜部位)免疫刺激而诱导、活化和/或刺激的细胞的方法和应用。在免疫应答中涉及的免疫系统的细胞一般是指免疫细胞并且包括淋巴细胞和非淋巴样细胞(例如辅助细胞)。淋巴细胞是特异性识别和应答外来抗原的细胞。淋巴细胞的主要种类包括B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和自然杀伤(NK)细胞(其是大颗粒的淋巴细胞)。B细胞能够产生抗体。T淋巴细胞进一步细分并且包括辅助T细胞(CD4+T细胞)和细胞溶解性或细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)。辅助细胞分泌促进T细胞和其他细胞(包括B细胞和巨噬细胞)的增殖和分化的细胞因子并募集和活化炎性白细胞。T细胞的另一个子类(被称为调节性T细胞或抑制性T细胞)活跃地抑制免疫系统的活化并且防止病理性自身反应性(即，自身免疫疾病)。
[0203] 本文所述的免疫刺激方法被认为诱导涉及多种类型的T细胞的细胞介导的免疫应答。在细胞介导的应答中，多种类型的T淋巴细胞通过许多机制作用以消除抗原。例如，能够识别特异性抗原的辅助T细胞可以通过释放可溶性介质(例如细胞因子)以募集免疫系统的额外细胞来参与免疫应答进行应答。同样地，细胞毒性T细胞能够特异性识别抗原并且通过结合并摧毁或损伤携带抗原的细胞或颗粒而应答。
[0204] 宿主或受试者中的免疫应答可以通过本领域普通技术人员将会熟悉的任何数量的公知的免疫学方法测定。如本文所述，用于测定免疫应答的存在和水平的方法和技术包括例如荧光共振能量转移、荧光偏振、时间分辨荧光共振能量转移、临近闪烁实验、报告基因测定、荧光淬灭酶底物、显色酶底物和电化学发光、免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、免疫印迹、免疫组织化学等等)、表面等离子体共振、基于细胞的测定(例如使用报告基因的那些)和功能测定(例如，测量免疫功能和免疫应答的实验)。
[0205] 这种测定包括但不必限于可溶性抗体、可溶性介质(例如细胞因子(如，IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-6、IL-23、TNF-α和TGF-β)、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等)以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介质的存在和水平的体内或体外测定。细胞因子的水平可以根据本领域描述和实践的方法测定，包括，例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。
[0206] 免疫测定也包括通过分析免疫系统的细胞的如下改变的功能性质或结构性质来测定细胞活化状态变化：例如细胞增殖、改变的运动性、特定活性的诱导(例如特定基因表达)或细胞溶解性行为；、细胞成熟(例如，应答刺激的树突细胞的成熟)；Th1应答和Th2应答之间的关系的改变；通过免疫系统的细胞的细胞分化(包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的开启(程序性细胞死亡))。其他方法也可以用于测量细胞表面标志物以鉴别多种免疫细胞群，例如但不限于抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞、效应记忆T细胞(Tem)、中央记忆T细胞(Tcm)和/或组织原位记忆T细胞(Trm)。用于进行这些和类似测定的步骤描述于文献中。可以使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任一种进行用于测定CTL活性(或CD8+T细胞活性)的细胞毒性实验。
[0207] 在特别的实施方案中，在本文公开的方法和应用之后观察到局部浸润抗原特异性T细胞的2-50倍增加。在特定的实施方案中，观察到局部浸润(例如，肿瘤浸润)抗原特异性T细胞的2-40倍增加、2-30倍增加、2-20倍增加、2-10倍增加、3-8倍增加、4-7倍增加或5-6倍增加。通常，局部浸润抗原特异性T细胞的增加是与没有给药的情况下存在的局部浸润抗原特异性T细胞的数目进行比较的或者是与适当的对照给药进行比较的。本文公开的方法和应用被认为，与没有施用本公开的活性试剂、组合物或药物情况下的适当的对照相比，提供统计学上、生物学上和/或临床上显著的形式的局部浸润抗原特异性T细胞的增加。
[0208] 生物样品可以获得自这样的受试者，所述受试者用于确定根据本文公开的方法接受用本公开的活性试剂(例如，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物治疗的受试者中免疫应答的存在和水平。如本文使用的“生物样品”可以是来自受试者或生物来源的血液样品(可以由其制备血清或血浆)、单采(apheresis)样品、活检标本、肿瘤活检标本、体液(例如，肺灌洗、腹水、粘膜洗液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或任何其他组织或细胞制品。
[0209] 对于用于确定免疫应答的本文所述的所有免疫检测和方法，本领域技术人员也会容易领会和理解当实践这些方法时适当地包括哪些对照。足以允许反应成分的相互作用的反应成分的浓度、缓冲液、温度和时间周期可以根据本领域技术人员熟悉的方法确定和/或调整。
[0210] 本公开的另一个方面提供增加肿瘤微环境中T细胞的方法，其包括根据本文公开的方法向具有肿瘤的受试者施用本公开的活性试剂(例如载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物，以此诱导对抗肿瘤的免疫应答。
[0211] 如医疗领域的技术人员所理解的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指受试者(即，患者)的疾病、紊乱或病症的医疗处理。通常，合适的剂量和治疗方案提供足够量的本公开的活性试剂(即，载体系统或病毒颗粒)、组合物或药物以提供治疗和/或预防益处。治疗和/或预防益处包括，例如，改进的临床结果，对于治疗处理和预防或防御措施二者，其中目标是防止或减缓或延迟(减轻)不希望的生理学变化或紊乱，或防止或减缓或延迟(减轻)这种疾病或紊乱的发展或严重度。来自治疗受试者的有益的或期望的临床结果包括但不限于由待治疗的疾病或紊乱引起的或与其相关的症状的消除、减轻或缓和；症状的发生减少；生活质量的改善；更长的无疾病状态(即，减少了受试者会出现基于其进行疾病诊断的症状的可能性或倾向性)；疾病的程度降低；疾病的稳定(即不恶化)的状态；疾病发展的延迟或减缓；疾病状态的改善或减轻；以及可检测或不可检测的缓解(部分或全部)；和/或总存活。“治疗”也可以是指与受试者如果不接受治疗时的预期的存活相比，延长了存活。需要治疗的受试者包括那些已经具有疾病或紊乱的受试者以及有患有疾病或紊乱的倾向或有发展疾病或紊乱的风险的受试者。
[0212] 根据本领域所述的一些方法中的任一种可以将核酸分子(包括根据本公开的载体系统)递送进入细胞。本领域技术人员已知的这种递送方法包括但不限于在脂质体中封装，通过离子电渗法或掺入到其他运载工具(例如可生物降解聚合物、水凝胶、环糊精、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球、可生物降解纳米胶囊和生物粘附微球)或通过蛋白质载体。
[0213] 本公开提供包含4-1BB配体(4-1BBL)、IL-2和单链IL-12(scIL-12)的蛋白的组合，其中4-1BBL的量高于scIL-12和IL-2的量。
[0214] 在多种实施方案中，4-1BB配体包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或同一性的氨基酸序列，其中4-1BB配体能特异性结合T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。优选地，4-1BB配体包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少80％的同源性或同一性的氨基酸序列，其中4-1BB配体能特异性结合T细胞(优选CD8+T细胞)。更优选地，4-1BB配体包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少90％的同源性或同一性的氨基酸序列，其中4-1BB配体能特异性结合T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。甚至更优选地，4-1BB配体包含与SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列具有至少95％的同源性或同一性的氨基酸序列，其中4-1BB配体能特异性结合T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)。在特定的实施方案中，如上所述4-1BBL的变体显示与具有SEQ ID NO:2(图13)的氨基酸序列的原生4-1BBL相同的对T细胞(优选活化的CD4+T辅助细胞和CD8+T细胞)的结合特异性。
[0215] 在本公开的多种实施方案中，IL-2蛋白显示与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中IL-2蛋白具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，IL-2蛋白显示与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列至少80％的同源性或序列同一性，其中IL-2蛋白具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，IL-2蛋白显示与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列至少90％的同源性或序列同一性，其中IL-2蛋白具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，IL-2蛋白显示与SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列至少95％的同源性或序列同一性，其中IL-2蛋白具有免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在特定的实施方案中，如上所述IL-2的变体显示与具有SEQ ID NO:4(图14)的氨基酸序列的原生IL-2相同的免疫刺激活性(优选T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。
[0216] 在本公开的多种实施方案中，scIL-12蛋白包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少70％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12蛋白具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。优选地，scIL-12蛋白包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少80％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12蛋白具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。更优选地，scIL-12蛋白包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少90％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12蛋白具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。甚至更优选地，scIL-12蛋白包含与SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列具有至少95％的同源性或序列同一性的氨基酸序列，其中scIL-12蛋白具有免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。在特定的实施方案中，如上所述scIL-2的变体显示与具有SEQ ID NO:6(图15)的氨基酸序列的原生scIL-2相同的免疫刺激活性(优选单核细胞、T辅助细胞和CD8+T细胞刺激活性)。
[0217] 如本文公开的，如果蛋白包含含有作为融合蛋白的原生IL-12蛋白的p35和p40两个亚基的氨基酸序列时，其被认为是scIL-12蛋白。SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的序列示出人IL-12的40kDa和35kDa亚基的氨基酸序列。在特定的实施方案中，如上所述scIL-12的变体显示与由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的氨基酸序列编码的原生scIL-12相同的免疫刺激活性。优选地，本公开的scIL-12的连接子是肽或多肽连接子。本公开包括如本文所述的scIL-12的变体，其中特别地图15(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)中粗体显示的连接子序列是改变的(modified)，特别是在连接子序列的长度方面。连接子的氨基酸序列的长度可以根据经验或根据来自结构信息的引导或使用两种方法的组合进行选择。本领域技术人员会理解存在许多这种在长度上变化的序列或可以起连接子作用的组分，主要的考虑是它们既不过长也不过短。
[0218] 本公开提供的新的载体/载体系统或病毒颗粒可以包装为试剂盒。试剂盒可以任选地包括一个或多个成分，例如使用和给药说明、装置(例如，用于将一种或多种组合物施用给受试者)和额外的试剂以及成分，例如管、容器(例如用于实践方法和应用的小瓶和注射器)。本文也构思包含含有编码本公开的载体系统的核酸序列的多核苷酸的试剂盒。本文也构思包含用本公开的载体系统或病毒颗粒转导或转染的癌细胞的试剂盒。本文也构思包含本公开的活性试剂、组合物或药物的试剂盒。本文也构思包含本公开的新的病毒载体/载体系统以及任选的编码成熟因子的多核苷酸序列的试剂盒。
[0219] 根据本公开，本文包含但不限于以下项目，在本文别处描述的方面和实施方案的上下文中要考虑这些项目：
[0220] 1、载体，其包含编码4-1BB配体(4-1BBL)、单链IL-12(scIL-12)和IL-2的基因的核酸序列，其中所述基因在5’到3’方向上以1、2、3的顺序组装，条件是编码scIL-12的基因不在第1位。
[0221] 2、第1项所述的载体，其中，所述载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA载体、质粒载体、纳米粒载体和裸DNA中的任一种。
[0222] 3、第2项所述的载体，其中所述RNA载体包含插入的修饰的核糖核苷酸。
[0223] 4、第1项至第3项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的基因的核酸序列是人cDNA，所述编码scIL-12的基因的核酸序列是人cDNA，和/或所述编码IL-2的基因的核酸序列是人cDNA。
[0224] 5、第1项至第4项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL的基因的核酸序列显示出与SEQ ID NO:1(图13)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码能够特异性结合T细胞(优选地活化的T细胞)的4-1BBL蛋白。
[0225] 6、第1项至第4项中任一项所述的载体，其中，所述编码IL-2的基因的核酸序列显示出与SEQ ID NO:3(图14)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的IL-2蛋白。
[0226] 7、第1项至第4项中任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12的基因的核酸序列显示出与SEQ ID NO:5(图15)的核酸序列至少70％的同源性或序列同一性，其中变体核酸序列编码具有免疫刺激活性的scIL-12蛋白。
[0227] 8、第1项至第7项中任一项所述的载体，其中，所述编码scIL-12和IL-2的基因的核酸序列位于编码4-1BBL的基因的核酸序列的下游。
[0228] 9、第8项所述的载体，其中，所述编码IL-2的基因的核酸序列位于所述编码4-1BBL的基因的核酸序列的下游，并且所述编码scIL-12的基因的核酸序列位于所述编码IL-2的核酸序列的下游。
[0229] 10、第8项或第9项所述的载体，其中，启动子位于所述编码4-1BBL的基因的核酸序列的上游，但是不在所述编码scIL-12和/或IL-2的基因的核酸序列的上游。
[0230] 11、第8项至第10项中任一项所述的载体，其中，所述编码4-1BBL、scIL-12和IL-2的基因的核酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。
[0231] 12、包含第1项至第11项中任一项所述的载体的病毒颗粒。
[0232] 13、包含编码第1项至第11项中任一项所述的载体的核酸序列的多核苷酸。
[0233] 14、用第1项至第11项中任一项所述的载体或第12项所述的病毒颗粒转导或转染的癌细胞或免疫细胞。
[0234] 15、包含第1项至第11项中任一项所述的载体、第12项所述的病毒颗粒、第13项所述的多核苷酸或第14项所述的癌细胞或免疫细胞的组合物。
[0235] 16、包含第1项至第11项中任一项所述的载体、第12项所述的病毒颗粒、第13项所述的多核苷酸或第14项所述的癌细胞或免疫细胞的药物。
[0236] 17、第1项至第11项中任一项所述的载体、第12项所述的病毒颗粒、第13项所述的多核苷酸或第14项所述的癌细胞或免疫细胞、第15项所述的组合物或第16项所述的药物，用于在治疗癌症、病毒感染和/或免疫系统紊乱的方法中使用。
[0237] 18、根据第17项所述的用于使用的载体，根据第17项所述的用于使用的病毒颗粒，根据第17项所述的用于使用的多核苷酸，根据第17项所述的用于使用的癌细胞或免疫细胞，根据第17项所述的用于使用的组合物或根据第17项所述的用于使用的药物，其中，所述癌症是以下中的任一种：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑上皮癌、头颈癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈上皮癌、乳腺上皮癌、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小细胞肺上皮癌、维尔姆斯瘤、宫颈上皮癌、睾丸上皮癌、膀胱上皮癌、胰腺上皮癌、胃上皮癌、结肠上皮癌、前列腺上皮癌、泌尿生殖器上皮癌、甲状腺上皮癌、食管上皮癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺上皮癌、肾细胞上皮癌、子宫内膜上皮癌、肾上腺皮质瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类上皮癌、绒毛膜上皮癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。
[0238] 19、第1项至第11项中任一项所述的载体、第12项所述的病毒颗粒、第13项所述的组合物或第14项所述的药物，用于在预防或治疗癌转移的方法中使用。
[0239] 20、根据第17项至第19项中任一项所述的用于使用的载体，其特征在于，所述载体系统以每剂量单位不超过1×1011ivp(感染性病毒颗粒)，优选不超过1×1010ivp，更优选不9 7 6
超过1×10ivp，甚至更优选不超过1×10ivp或1×10ivp的浓度存在。
超过1×10ivp，甚至更优选不超过1×10ivp或1×10ivp的浓度存在。
[0240] 21、根据第17项至第19项中任一项所述的用于使用的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒以每剂量单位不超过1×1011ivp，优选不超过1×1010ivp，更优选不超过1×109ivp，甚至更优选不超过1×107ivp或1×106ivp的浓度存在。
[0241] 22、包含4-1BB配体(4-1BBL)、IL-2和单链IL-12(scIL-12)的蛋白组合，其中4-1BBL的量高于scIL-12和IL-2的量。
[0242] 会被认可的是本公开不限于本文所述的特定的方法学、方案、细胞系、属(genera)和试剂，因为这些可以变化。还会被认可的是本文使用的术语仅仅是用于描述特定的实施方案的目的，并不意于限定本公开的范围。
[0243] 通过说明的方式而非限制的方式提供以下实施例。
[0244] 根据本公开，其他的实施方案和应用对本领域技术人员会是明显的。提供以下实施例仅仅作为多种实施方案的说明，不应该被解释为以任何方式限制本公开。
[0245] 实施例
[0246] 实施例1：鼠和人Im01的IL-12、IL-2和4-1BBL的转基因表达以及IFN-γ应答[0247] Im01是包含表达构体的腺病毒载体，该表达构体包含按照如以下方案所示的顺序的人单链IL-12、4-1BBL和IL-2基因：
[0248]
[0249] 载体Im01的构建描述于WO 2004/035799，以上方案描绘于WO 2004/035799的图1。WO 2004/036799中的载体名称为“Ad-3”。在本公开中，该较早载体的内部载体编码是Im01。
[0250] 以表明的感染复数(MOI，在[括号]中给出的数值)，分别用携带三种人或小鼠基因的Im01转导人A549细胞和鼠Hepa 1-6细胞1小时。在转导后4小时加入人外周血单核细胞(PBMC)或小鼠淋巴细胞并且在共培养34小时后收集上清液用于细胞因子检测。细胞因子水平通过ELISA(eBioscience)检测。针对4-1BBL表达，通过流式细胞术分离并检测肿瘤细胞。结果，虽然鼠和人载体架构是相同的，但是转基因的表达水平在鼠和人物种之间明显变化，即人Im01显示比鼠Im01高达15倍的更高的IL-12表达。在临床环境中，这种增加的IL-12水平带有毒性和有限的治疗适用性的风险。
[0251] 实施例2：载体设计和研究概述
[0252] Im02
[0253] 已经设计并制备了根据本公开的载体以用于离体治疗模拟研究。该载体基于腺病毒载体并且已经命名为Im02(内部载体编码“Im02”)。Im02包含表达构体，该表达构体包含按照如以下方案所示的顺序的人4-1BBL、IL-2和单链IL-12(scIL-12)基因：
[0254]
[0255] 图2显示穿梭质粒pE1.1 Im02的示意性基因图谱。Im02的表达盒被图示为基于质粒pE1.1的前体转移质粒，其适用于亚克隆到携带有例如腺病毒载体DNA的质粒。更具体地，包含在腺病毒载体Im02中的表达盒是包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的如图18所示的表达盒。本公开的载体已经被证实通过瘤内免疫微环境的多重改变(multivalent modification)诱导针对膀胱癌中的肿瘤细胞的免疫防御机制
[0256] 患者群概述
[0257] 选择人肿瘤活检样品的离体培养物作为新的载体系统的研究模型。样品由汉堡-巴姆贝克，阿斯克莱皮奥斯医院泌尿科诊所(Clinic of Urology,Asklepios hospital,Hamburg-Barmbek)提供。分析了来自43个患者的总共244个肿瘤样品和270个正常膀胱组织对照活检。在经尿道切除术(TUR)期间收集来自8个患者的样品，研究所包括的样品的大部分来自膀胱切除术。在本研究中，横跨宽范围的疾病分期(从早期到晚期变化)分析肿瘤和膀胱组织。分析了来自16个女性和27个男性的样品。由于伴随的前列腺上皮癌的诊断，在该患者群中的预处理是连续的TUR、化疗、抗雄激素治疗。
[0258] 实施例3：Im02和较早载体Im01的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达以及IFN-γ应答
[0259] 比较了Im02的4-1BBL、IL-2和IL-12的转基因表达以及IFN-γ应答(参见实施例2)和较早载体Im01的4-1BBL、IL-2和IL-12的转基因表达以及IFN-γ应答(参见实施例1)。
[0260] 以图3中表明的MOI(感染复数，即，每个靶细胞中的感染性病毒颗粒)(在括号中的MOI数值)用Im01或Im02转导人A549细胞1小时。在转导后4小时加入人外周血单核细胞(PBMC)并且在共培养34小时后收集上清液用于细胞因子检测。细胞因子水平通过ELISA检测。通过流式细胞术分离肿瘤细胞并检测4-1BBL阳性细胞。显示的数值点是各具有4个重复的4个个体捐赠者的平均值。
[0261] 如图3所示，Im02中4-1BBL、IL-2和scIL-12基因的布置提供了与在Im01中相同基因的布置相比4-1BBL的增加的表达，同时IL-12减少，引起IFN-γ应答增加。
[0262] 特别地，Im02中4-1BBL、IL-2和scIL-12基因的布置引起与在较早载体Im01中基因的布置相比平均4-1BBL表达增加1.7倍，IL-2表达增加1.5倍。这联合有IL-12表达水平的2.6倍减少。对于Im02中基因的布置，IL-2/IL-12的摩尔比平均从2.5％增加到9.1％。另外，在所有剂量范围(MOI 2.5、5、10和50)检测到，更高的IL-2和4-1BBL表达引起1.4倍更高的IFN-γ诱导。
[0263] Im02提供IFN-γ应答，其优于Im01的IFN-γ应答。结果，Im02显示与较早载体Im01相比在免疫刺激上的改善作用。
[0264] 实施例4：在基于组织的模型中单个载体与Im02以及Im01的比较
[0265] 检查了使用单独表达scIL-12、IL-2或4-1BBL的腺病毒载体以及Im02和Im01的单次剂量处理(对于后者的进一步的细节参见实施例1)。
[0266] 为了研究Im02对肿瘤微环境的作用，建立基于未离解的肿瘤组织样品的治疗模拟模型。使用来自经尿道切除术或膀胱切除术的组织样品。
[0267] 用108ivp(感染性病毒颗粒)的Im02或Im01转导膀胱肿瘤(“T”)和正常膀胱(“B”)组织。使用酶LDH-释放实验监测培养基上清液中的肿瘤和膀胱组织样品的存活。在转导后第6天在培养上清液中通过ELISA测量转基因的表达和IFN-γ应答。结果显示于图4。即使在单独的scIL-12和IL-2的高表达水平下，IFN-γ应答也接近于背景。该结果表明在膀胱和肿瘤的组织背景中三种基因的协同作用。此外，Im02引起与Im01相比增加的IL-2和IFN-γ应答。图4显示与较早载体Im01相比Im02在肿瘤微环境中的免疫刺激上的改善作用。
[0268] 实施例5：不同剂量水平下Im02和Im01的比较
[0269] 针对肿瘤微环境中转基因表达和IFN-γ应答，在逐步上升的剂量下比较Im02和Im01(对于这些载体的进一步的细节参见实施例2和3)。
[0270] 肿瘤样品来自个体患者，对于107和108ivp(感染性病毒颗粒)的剂量水平检测成对的膀胱肿瘤(“T”)和正常膀胱(“B”)组织。在第6天通过ELISA检测表达。结果显示于图5。在不同的剂量水平下，Im02提供IFN-γ应答，其优于Im01的IFN-γ应答。结果，不同剂量水平下Im02显示与较早载体Im01相比在肿瘤微环境中免疫刺激上的改善作用。
[0271] 实施例6：Im02和Im01的基因表达情况
[0272] 已经进行了转录组分析以显示Im02的治疗基因表达情况。特别是，为了获得Im02和Im01的白细胞活化的全面情况，用Im02、Im01和Ad0(空载体)转导肿瘤细胞和PBMC的共培养实验的肿瘤细胞，进行白细胞的mRNA基因活性分析(Illumina Chip HT12全基因表达分析)。为了这个目的，在转导后向共培养物加入外周白细胞。使用在未转导的肿瘤细胞上的白细胞作为对照。在4、24、32、48、72和96小时后，收集白细胞并分离和纯化RNA。在质量核查后，将RNA反转录为互补DNA(cDNA)，根据珠片(bead chip)的方案进行标记并装载到珠片HT12，进行扫描(Life&Brain,波恩大学人类遗传学系)。将获得的数据转移到GenomeStudio软件(Illumina)。随后，使用 软件(Ingenuity)评价数据。进行核心分析显示区别调控的过程。为了获得调控过程的概览，并且为了说明它们的重要性以及所涉及的分子数，进行过程分析。参见表1和2：
[0273] 表1：Im02，在24h五个最剧烈调控的过程
[0274] 分子和细胞功能
[0275]名称 p值 #分子
细胞间信号传导和相互作用 1.28E-22—4.91E-03 103
细胞功能和维持 4.34E-22—4.52E-03 90
细胞死亡和存活 3.48E-17—3.98E-03 69
细胞发育 1.46E-16—5.71E-03 101
细胞生长和增殖 1.46E-16—5.71E-03 89
细胞间信号传导和相互作用 1.28E-22—4.91E-03 103
细胞功能和维持 4.34E-22—4.52E-03 90
细胞死亡和存活 3.48E-17—3.98E-03 69
细胞发育 1.46E-16—5.71E-03 101
细胞生长和增殖 1.46E-16—5.71E-03 89
[0276] 生理系统发育和功能
[0277]名称 p值 #分子
血液系统发育和功能 1.28E-22—5.71E-03 162
免疫细胞转运 1.28E-22—4.96E-03 108
组织形态学 9.81E-17—5.59E-03 86
细胞介导的免疫应答 6.66E-10—3.84E-03 61
组织发育 1.53E-08—4.91E-03 54
血液系统发育和功能 1.28E-22—5.71E-03 162
免疫细胞转运 1.28E-22—4.96E-03 108
组织形态学 9.81E-17—5.59E-03 86
细胞介导的免疫应答 6.66E-10—3.84E-03 61
组织发育 1.53E-08—4.91E-03 54
[0278] 表2：Im01，在24h五个最剧烈调控的过程
[0279] 分子和细胞功能
[0280]
[0281]
[0282] 生理系统发育和功能
[0283]名称 p值 #分子
血液系统发育和功能 8.05E-17—7.51E-03 83
免疫细胞转运 8.05E-17—7.51E-03 64
组织发育 4.10E-07—6.95E-03 31
造血作用 1.04E-06—6.95E-03 35
组织形态学 2.17E-06—6.95E-03 40
血液系统发育和功能 8.05E-17—7.51E-03 83
免疫细胞转运 8.05E-17—7.51E-03 64
组织发育 4.10E-07—6.95E-03 31
造血作用 1.04E-06—6.95E-03 35
组织形态学 2.17E-06—6.95E-03 40
[0284] 结果，Im02提供免疫刺激，其特征在于在生理发育和功能的五个最剧烈调控的过程中涉及61个被调控基因(参见表1，下部)的“细胞介导的免疫应答”(凭借所涉及的分子的重要性和数量)。对于Im01(参见表2，下部)，该功能(即，“细胞介导的免疫应答”)没有出现在生理发育和功能的五个最剧烈调控的过程中，因为其中只有总共28个分子是差异调控的。在表中提到的其他系统(如血液系统、免疫细胞转运、组织形态学和一般组织发育)，表明由多重免疫治疗引起的广泛变化。从转录组分析变得清楚的是Im02的治疗基因表达情况是独一无二的并且是优越的，特别是优于较早载体Im01的治疗基因表达情况。
[0285] 使用 软件(Ingenuity Pathway Analysis，Qiagen)已经将调控的过程分配到特异性调控的(细胞)功能。这允许关于生物过程的活化/失活的更准确的信息。
[0286] 结果(数据未显示)，五个最剧烈诱导的功能是白细胞活化、单核白细胞的活化、白细胞的细胞毒性、单核白细胞的分化和T淋巴细胞(T细胞)的活化。
[0287] 实施例7：针对主要免疫细胞类型的活化的基因表达分析
[0288] 使用CELLMIX软件已经分析了在96小时的时间进程中主要免疫细胞类型的活化，其允许分析所有主要免疫细胞类型的活化的存在和状态的基因表达数据。图6中的热点表明在与人膀胱RT-4上皮癌细胞的共培养物中，在4天(96小时)的时间进程中除了B细胞(外周血单核细胞，PBMC)之外的所有主要血液免疫细胞亚型的活化。如图6所示，由Im02引起的T辅助细胞和细胞毒性T细胞的活化优于由Im01引起的相同免疫细胞的活化。
[0289] 实施例8：离体组织研究结果
[0290] 组织学表明的组织情况
[0292] 如图7所示，Im02诱导组织学重排(C)，其在用Ad0对照载体(B)或单个基因载体(数据未显示)时没有观察到。在肿瘤组织中观察到的Im02诱导的形态学改变(图7，子图C)包括相对于用对照Ad0/AdNull(子图B)或单个基因载体(数据未显示)处理的组织的免疫细胞浸润物的数量和分布。
[0293] 此外，图8显示Im02诱导在白细胞浸润物的分布和频率中明显的组织学重排。在图8的下部子图中的箭头标明具有细胞死亡迹象的肿瘤区域。这些形态学改变提供了Im02诱导的免疫应答的组织学证据。
[0294] 靶细胞类型的鉴定
[0295] 在用Im02转导的组织上进行透射电子显微术(TEM)来例如鉴定腺病毒颗粒摄取的靶细胞类型、摄取途径，通过囊泡膜的存在和形态学以及每个细胞的颗粒的丰度进行判断。
[0296] 将来自膀胱切除术的肿瘤组织切开并通过将样品在37℃浸入含有108ivp Im02的500μl培养基1小时进行转导，通过将培养基置换为含有2％戊二醛的冰冷固定溶液来终止摄取。然后通过标准操作处理组织样品并且通过透射电子显微镜(由Vironova SA，斯德哥尔摩，瑞典提供)获取图像。
[0297] 在阳性染色透射电子显微术中，通过腺病毒颗粒的大小为约80nm以及颗粒几何结构来鉴定腺病毒颗粒。结果显示于图9。在转导1小时后，在通过超微形态学分析鉴定的多种细胞类型中Im02腺病毒颗粒是可检测的。在腺病毒颗粒周围的囊泡结构的存在和形态学表明摄取机制。
[0298] 通过它们的个体形态学，在膀胱上皮癌样品中不同的细胞类型被发现为靶细胞，包括肿瘤细胞(未显示)、肿瘤基质的结缔组织细胞(成纤维细胞，子图4)和免疫细胞。腺病毒颗粒在淋巴细胞(子图3)和单核细胞形态(子图2)的细胞中检测到。在膀胱上皮癌中，单核细胞形态指示朗格汉斯细胞、巨噬细胞或树突细胞的存在。
[0299] 重要地，该发现对于作用方式是特别有价值的，因为所有这些鉴定的靶免疫细胞被描述为在用细胞因子转导后经受活化和分化成为效应细胞类型，同时当4-1BBL表达于抗原呈递细胞中和淋巴细胞上时，通过反向信号转导4-1BBL表达显示支持活化过程(Ju等，2009，International Immunology，21(10)，1135-1144)。
[0300] 摄取的途径和丰度：腺病毒颗粒发现于靶细胞的细胞质的不同位置和不同环境中。经典的摄取是在结合到柯萨奇和腺病毒受体后介导的，之后在内吞囊泡中穿梭。
[0301] 在子图6A中该途径表明是活跃的，其中颗粒在囊泡形成过程中成像。在子图6B中，腺病毒颗粒位于还含有其他未确定的结构的大囊泡中，表明胞饮方式的摄取。在子图3A中，腺病毒颗粒在圆形膜结构中被捕获，表明高级的内吞摄取。
[0302] 根据未来的囊泡内滴注方案选择暴露于Im02仅1小时的组织样品。在我们的组织模型中，颗粒达到几层细胞的深度的区域。规律地鉴定了每个细胞高达30个腺病毒颗粒的群(子图5A)。
[0303] 实施例9：在正常膀胱和膀胱肿瘤样品中差异表达的比较
[0304] 用108ivp Im02转导正常膀胱和肿瘤组织。继续培养直至第6天。与用作为对照的Ad0(空腺病毒载体)处理的样品进行比较以确定差异表达。图10显示对于9个膀胱和10个肿瘤组织样品的集合的结果。在肿瘤组织中的总体刺激(即，免疫应答过程的诱导)高于在正常膀胱组织中总体刺激(参见图10)。该效应指向正常和肿瘤组织之间微环境中的差异，例如，在免疫细胞浸润物数量或肿瘤细胞附近的抑制水平的差异。
[0305] 实施例10：用于腺病毒摄取的转染子的检查
[0306] 通过添加转染子样聚阳离子化合物可以提高进入完整膀胱组织的腺病毒摄取。对于Im02的离体组织样品灌注，在一组细胞系中的候选化合物筛选中，硫酸鱼精蛋白(10μg/ml)被认为能使得腺病毒产物摄取不依赖柯萨奇-腺病毒-受体(CAR)的表达(参见图11)。据报道人膀胱上皮癌细胞系RT-4表达CAR，而小鼠结肠上皮癌细胞系CT-26不表达CAR。将腺病毒产物配制于图11的图例所示的缓冲液中。在每个靶细胞不同的复数(MOI：感染复数)下用Ad-GFP(携带GFP的腺病毒载体)转导人膀胱癌细胞系RT-4和CAR阴性鼠结肠癌细胞系CT-26。结果表示为转导后48小时GFP阳性细胞的百分数，通过流式细胞术测量。结果，在两种细胞系中，10μg/ml的硫酸鱼精蛋白都能获得最高的转导效率。
[0307] 缩写：Merck缓冲液：5mM Tris pH8.0、75mM NaCl、5％蔗糖、0.005％聚山梨醇酯80、1mM MgCl2；所有另外的添加物都配制于Merck缓冲液中；壳聚糖：1％，甘露醇：1M；鱼精蛋白：10μg/ml硫酸鱼精蛋白，普朗尼克F68：001％；混合：蔗糖、甘露醇和普朗尼克F68的混合物。Merck缓冲液指示不含有支持转染子添加剂的基础配方。在低的感染复数(MOI，每个靶细胞的感染性病毒颗粒)下的充分的转导指示CAR的存在。在不存在CAR的情况下，摄取仅通过经由整合素介导的摄取的低亲和摄取来实现。无添加剂的作用显示在RT-4(在MOI 100下大约25％转导)对CT-26(在MOI 5000下<5％的转导)中。添加10μg/ml的硫酸鱼精蛋白使得RT-4中的转导翻倍并且使得在CT-26中的转导为三倍。
[0308] 在离体组织培养物中也发现硫酸鱼精蛋白的协同佐剂效应(参见图12)。在添加或不添加10μg/ml硫酸鱼精蛋白的情况下用108ivp Im02或Ad0(空腺病毒载体)转导肿瘤组织和膀胱组织。在转导后第6天通过ELISA在培养上清液中测量转基因表达和作为应答细胞因子的IFN-γ表达。在存在10μg/ml硫酸鱼精蛋白的情况下，在即使较低的转基因表达下应答细胞因子IFN-γ的表达也是较高的，其表明在硫酸鱼精蛋白的存在下Im02刺激更多的免疫细胞。
[0309] 基于在细胞系组上的结果以及靶细胞状态的评价，将该配方适用于离体治疗刺激研究。
[0310] 实施例11:在不同MOI下Im02和单基因表达载体的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达以及IFN-γ应答
[0311] Im02和单基因表达载体的组合的4-1BBL、IL-2和scIL-12的转基因表达以及IFN-γ应答揭示IFN-γ表达依赖于增加的4-1BBL水平。
[0312] 在括号中的数值表示的感染复数(MOI，即，每个靶细胞的感染性病毒颗粒)下，分别用Im02或表达scIL-12，IL-2和4-1BBL的单基因腺病毒载体的组合转导人A549细胞1小时(参见图19)。在转导后4小时添加人外周血单核细胞(PBMC)并且在共培养34小时后收集上清液用于细胞因子检测。通过ELISA检测细胞因子水平。分离肿瘤细胞并且通过流式细胞术检测4-1BBL阳性细胞。标明的数值点是各具有4个重复的4个个体捐赠者的平均值。
[0313] 如图19所示，在MOI[5]下单独表达IL-12，IL-2和4-1BBL的单基因载体引起高达4.2ng/ml IFN-γ的基本水平的诱导。IL-12和IL-2的组合不显著增加该水平。均在MOI[5]下的IL-12和IL-2的恒定水平与高达MOI[100]的4-1BBL的增加的水平的组合，引起在中等IL-12水平下增加的IFN-γ诱导。
[0314] 重要的是要注意到IL-12表达必须不可以如由在实施例3中所述的载体Im01表达的那样无限制的增加(参见图3)。高的IL-12表达被认为诱导免疫活化的下调并引起毒性。这种高IFN-γ和中等IL-12表达的状态被本公开的载体实现，特别是被载体Im02中所示的
4-1BBL、IL-2和IL-12的布置实现。
4-1BBL、IL-2和IL-12的布置实现。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 生物学指导的适应性治疗方案制定 | 2020-05-12 | 902 |
| 使用抗NKG2A抗体的治疗方案 | 2020-05-12 | 182 |
| 治疗中风后尿失禁的一种治疗方案 | 2020-05-11 | 99 |
| 治疗法布里病的给药方案 | 2020-05-12 | 590 |
| 治疗方案推荐方法和系统 | 2020-05-12 | 309 |
| 患者定制的治疗方案 | 2020-05-11 | 477 |
| 使用多种药剂的治疗方案 | 2020-05-13 | 459 |
| 诊断、预后、治疗和筛选方案 | 2020-05-13 | 922 |
| 2型糖尿病的治疗方案 | 2020-05-11 | 116 |
| 治疗方案 | 2020-05-11 | 464 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈