一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药及其制备方法
阅读：338发布：2023-03-09
专利汇可以提供一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种促进神经干 细胞增殖 的养脑通脉中药，其主要由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿 角 霜15‑45份、干金线莲6‑15份、丹参6‑15份、白术10‑30份。优选方案为：鹿角霜18份、干金线莲6份、丹参10份、白术15份。该发明 申请 其避免了现有 治疗 认知功能障碍 疾病 中采用的神经再生技术所会面临的安全、伦理方面问题，克服了采用西药治疗的疗效不佳、 副作用 明显的缺点，其能够方便有效地促进内源性神经干细胞增殖分化以替代 坏死 的神经元，从而达到改善 认知障碍 的疗效。，下面是一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其特征在于：其由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜15-45份、干金线莲6-15份、丹参6-15份、白术10-30份。
2.根据权利要求1所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其特征在于：其中鹿角霜18份、干金线莲6份、丹参10份、白术15份。
3.根据权利要求1或2所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其特征在于：其步骤如下，
①预处理：按所述重量份数分别称取干金线莲、丹参、鹿角霜、白术，将干金线莲、丹参和白术放入与其总重量比为1:8-12的预冷的水中浸泡25-35min，将鹿角霜加入与其重量比为1:8-12的预冷的水中浸泡25-35min后以武火煮沸改文火煎煮25-35min；
②煎煮：将步骤①获得的两部分药材及水进行混合，以武火煮沸后改文火继续煎煮10-
20min，将药液倒出；
③二次煎煮：向步骤②取出药液后的药材中加入与其总重量比为1:8-12的预冷水后，再以文火煎煮10-20min；
④制备成品：将步骤②和步骤③两次获得的药液混合制备成药剂。
4.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其特征在于：所述水为蒸馏水。
5.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其特征在于：步骤④中制备成药剂为制成袋装中药剂或浓缩成膏状或制成颗粒剂或制成软胶囊剂。
6.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其特征在于：步骤②中煎煮时间为15min。
7.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其特征在于：步骤③中加入的预冷水为500ml，煎煮时间为15min。
一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 认知功能障碍，是长期慢性脑组织缺血缺氧或者脑组织急性大面积缺血梗塞、关键部位缺血梗塞后导致的神经系统学习、记忆、分析判断等认知能力减退、甚至丧失的一系列临床表现的总称。任何情况的脑缺血缺氧影响到与认知功能密切相关的大脑区域，如大脑皮层、海马、纹状体，都会发生认知功能障碍。由于脑组织富含对自由基敏感的多不饱和脂肪酸，极易被氧化；而且神经细胞的氧自由基清除酶含量较低，故自由基清除能力相对较弱。因此，神经细胞易受氧化应激损伤。自由基失衡引起组织脂质过氧化损伤是认知障碍性疾病发病的重要因素之一。脑缺血等病理情况下氧自由基生产增多，自由基清除酶活性降低，加重了缺血造成的神经组织损伤。
[0003] 在治疗脑血管病、神经退行性疾病中，最关键的问题在于疾病对神经的伤害是不可逆的，神经系统难以完成自身修复，目前在临床上迄今尚缺乏有效地根治手段。
[0004] 而组织和细胞再生工程的发展为中枢神经系统创伤和疾病的治疗带来新的希望。目前研究较多的神经再生技术包括：将胚胎干细胞或成体干细胞定向诱导分化为神经细胞、将体细胞重编程为诱导性多潜能干细胞并进一步分化为神经细胞以及将成体细胞通过谱系转换获得神经细胞等。但是这种组织再生技术面临着诸多不足。例如：一是神经细胞的来源存在不安全性。这些由谱系转换诱导产生的神经细胞可能具有起始细胞的分子痕迹，无法排除肿瘤或畸变的风险。二是无法保证体内诱导过程准确靶向。三是载体本身的安全性值得考量。且这种组织再生技术还面临着诸多问题。例如，急性排斥反应、伦理学问题、移植细胞功能建立等等。因此，诱导脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖分化以替代坏死的神经元是其研究重点。
[0005] 另外，尽管世界各国在寻找改善认知障碍有效治疗药物的研究中投入了大量的人力和物力，但成果却十分有限，目前治疗药物一般都使用乙酰胆碱前体物、卵磷脂、三氟拉嗪和T588.乙酰胆碱前体物。其不仅疗效差，副作用也明显。临床通常还使用血管扩张类药物，如长春胺等，然而只适合部分轻微患者，且副作用较大。
[0006] 而中医药在认知障碍的防治方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的开发前景。因此提供一种能够治疗认知障碍的中药己成为当务之亟。
发明内容
[0007] 本发明提供一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其避免了现有治疗认知功能障碍疾病中采用的神经再生技术所会面临的安全、伦理方面问题，克服了采用西药治疗的疗效不佳、副作用明显的缺点，其能够方便有效地促进内源性神经干细胞增殖分化以替代坏死的神经元，从而达到改善认知障碍的疗效。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其特征在于：其主要由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜15-45份、干金线莲 6-15份、丹参6-15份、白术10-30份。
[0010] 中医学认为：认知障碍的发病是以肾虚髓减为内因，血瘀、毒邪等病理产物为害。肾精亏虚，脏腑失养，瘀血内生，久滞不化，则化热化毒，进而损伤脑髓，元神受损，神机不用。脑者，髓之海，诸髓皆属于脑，故上至脑，下至尾骶，皆精髓升降之道路也。而中医学的“脑髓”当包括神经元、胶质细胞、神经干细胞、基质细胞、胞外基质等结构。故肝肾精血盛衰是内源性神经干细胞增殖分化的物质基础。现代研究认为，脑缺血级联反应产生的一系列神经生化毒素，如自由基、兴奋性氨基酸、粘附因子等，类似于中医的“毒”，成为损伤脑细胞的主要毒性物质，这样炎症物质及毒性病理产物的释放，加重神经元的损害，加重脑缺血，是患者发生认知障碍的重要因素。依据该理论依据，申请人认为瘀血化热、化毒损髓是认知障碍的病理关键，创新提出补肾清解之法，选用鹿角霜、干金线莲、丹参、白术药物，在运用活血化瘀药物的同时，又重视补肾清解，鹿角霜补肾填精为主药，臣药以干金线莲清热解毒，丹参活血化瘀为佐药，使以白术健脾益气。
[0011] 本申请所使用的原料介绍：
[0012] 鹿角霜：为鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck或马鹿 C.elaphusL.等的角熬制鹿角胶后剩余的骨渣。
[0014] 丹参：为唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。
[0015] 白术:为菊科植物白术Atractylodes macrocephala的根茎。
[0016] 传统中医在改善认知障碍的中成药用药一般是以活血化瘀为治疗原则，而本申请则是以补肾清解为主要原则，因而有别于市面上的现有的中成药，能取得更佳的疗效。诸药配合，攻补兼施，标本同治，共奏补益脾肾、益智健脑、清热解毒、活血通脉之功，具有提高抗氧化酶活性的功能，通过抗氧化作用可以改善慢性脑缺血诱导的认知障碍。本申请的中药促进神经干细胞增殖有以下特点：1.它促进的是内源性神经干细胞增殖分化，无需体外移植神经干细胞；2.内源性神经干细胞存活率升高；3.中医药促进内源性神经干细胞增殖的机理在于直接影响体内的微环境，促进相关细胞因子、基因的表达，比如提高抗氧化酶活性，提高氧自由基清除酶含量等从而间接作用于体内的成体干细胞促进其增殖分化。本中药配方配伍合理科学，原材料药源丰富，服用方便，疗效明显，易于推广使用。
[0017] 其中鹿角霜18份、干金线莲6份、丹参10份、白术15份，该配方为优选方案，其效果治疗认知障碍疾病的功效更为显著。
[0018] 所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其步骤如下，[0019] ①预处理：按所述重量份数分别称取干金线莲、丹参、鹿角霜、白术，将干金线莲、丹参和白术放入与其总重量比为1:8-12的预冷的水中浸泡25-35min，将鹿角霜加入与其重量比为1:8-12的预冷的水中浸泡25-35min后以武火煮沸改文火煎煮25-35min；
[0020] ②煎煮：将步骤①获得的两部分药材及水进行混合，以武火煮沸后改文火继续煎煮10-20min，将药液倒出；
[0021] ③二次煎煮：向步骤②取出药液后的药材中加入与其总重量比为1:8-12的预冷水后，再以文火煎煮10-20min；
[0022] ④制备成品：将步骤②和步骤③两次获得的药液混合制备成药剂。
[0023] 所述水为蒸馏水。
[0024] 步骤④中制备成药剂为制成代煎中药袋剂或浓缩成膏状或制成颗粒剂或制成软胶囊剂。
[0025] 步骤①中干金线莲、丹参和白术浸泡用预冷的水为500ml，浸泡时间为30min；鹿角霜浸泡用预冷的水为500ml，浸泡时间为30min；文火煎煮时间为30min。
[0026] 步骤②中煎煮时间为15min。
[0027] 步骤③中加入的预冷水为500ml，煎煮时间为15min。
[0028] 与现有技术相比，本发明申请具有以下优点：
[0029] 1)本中药复方依据补肾清解、活血通脉的治法建立，由鹿角霜、干金线莲、丹参、白术四味中药组成，在运用活血化瘀药物的同时，又重视补肾清解，诸药配合，攻补兼施，标本同治，共奏补益脾肾、益智健脑、清热解毒、活血通脉之功，具有提高抗氧化酶活性的功能，通过抗氧化作用可以改善慢性脑缺血诱导的认知障碍；
[0030] 2)针对目前治疗认知障碍疾病所使用的组织再生工程技术的不足，本发明技术可直接促进神经干细胞自身增殖,减少干细胞体外诱导分化的风险；
[0031] 3)克服了现有治疗认知功能障碍疾病所主要使用的西药疗效不佳，副作用大的缺点；
[0033] 图1是本发明所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对 C17.2神经干细胞形态影响实验中各组细胞在40倍镜下的形态图；
[0034] 图2是MTT法检测药物干预对C17.2神经干细胞增殖能力的影响实验中经药物干预后各组细胞24h的存活率图表；
[0035] 图3是Brdu标记测药物干预对C17.2神经干细胞增殖能力的影响实验中各组细胞图；
[0036] 图4是本发明所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对认知障碍大鼠海马区CAT、GSH-Px蛋白表达的影响实验中各组大鼠海马区CAT、GSH-PX蛋白表达电泳图；
[0037] 图5是本发明所述的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对认知障碍大鼠海马区CAT、GSH-Px基因表达的影响实验中各组大鼠海马区CAT、GSH-P1mRNA表达电泳图。
具体实施方式
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0039] 实施例1
[0040] 一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其主要由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜15份、干金线莲6份、丹参10份、白术10份。
[0041] 该促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其步骤如下：
[0042] ①预处理：按所述重量份数分别称取干金线莲、丹参、鹿角霜、白术，将干金线莲、丹参和白术放入与其总重量比为1:8的预冷的水浸泡35min，将鹿角霜加入与其重量比为1:12的预冷的水浸泡25min 后以武火煮沸改文火煎煮35min；
[0043] ②煎煮：将步骤①获得的两部分药材及水进行混合，以武火煮沸后改文火继续煎煮10min，将药液倒出；
[0044] ③二次煎煮：向步骤②取出药液后的药材中加入与其总重量比为1:12的预冷水后，再以文火煎煮20min；
[0046] 实施例2
[0047] 一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其主要由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜18份、干金线莲6份、丹参10份、白术15份。
[0048] 该促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其步骤如下：
[0049] ①预处理：按所述重量份数分别称取干金线莲、丹参、鹿角霜、白术，将干金线莲、丹参和白术放入与其总重量比为1:10的预冷的蒸馏水浸泡30min，将鹿角霜加入与其重量比为1:10的预冷的蒸馏水浸泡30min后以武火煮沸改文火煎煮30min；
[0050] ②煎煮：将步骤①获得的两部分药材及水进行混合，以武火煮沸后改文火继续煎煮15min，将药液倒出；
[0051] ③二次煎煮：向步骤②取出药液后的药材中加入与其总重量比为1:10的预冷蒸馏水后，再以文火煎煮15min；
[0052] ④制备成品：将步骤②和步骤③两次获得的药液混合制成颗粒剂备用。
[0053] 实施例3
[0054] 一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其主要由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜20份、干金线莲10份、丹参15份、白术15份。
[0055] 该促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药的制备方法，其步骤如下：
[0056] ①预处理：按所述重量份数分别称取干金线莲、丹参、鹿角霜、白术，将干金线莲、丹参和白术放入与其总重量比为1:12的预冷的蒸馏水浸泡25min，将鹿角霜加入与其重量比为1:8的预冷的蒸馏水浸泡35min后以武火煮沸改文火煎煮25min；
[0057] ②煎煮：将步骤①获得的两部分药材及水进行混合，以武火煮沸后改文火继续煎煮20min，将药液倒出；
[0058] ③二次煎煮：向步骤②取出药液后的药材中加入与其总重量比为1:8的预冷蒸馏水后，再以文火煎煮10min；
[0059] ④制备成品：将步骤②和步骤③两次获得的药液混合制成软胶囊剂备用。
[0060] 实施例4
[0061] 所述促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其与实施例1的区别在于：其由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜25份、干金线莲10份、丹参6份、白术18份。步骤④为将步骤②和步骤③两次获得的药液混合制成代煎中药袋剂。
[0062] 实施例5
[0063] 所述促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其与实施例2的区别在于：其由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜30份、干金线莲10份、丹参12份、白术12份。
[0064] 实施例6
[0065] 所述促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其与实施例3的区别在于：其由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜40份、干金线莲12份、丹参10份、白术30份。
[0066] 实施例7
[0067] 所述促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药，其与实施例1的区别在于：其由以下中药原料按重量份数制备而成：鹿角霜45份、干金线莲15份、丹参15份、白术15份。
[0068] 相关实验：
[0069] 一、临床试验
[0070] (一)典型病例：
[0071] 1.李某，男，70岁，2010年患病，检查诊断为“老年血管性痴呆”，服用银杏叶片，症状无改善，后又求治其他中医服用其他中药治疗，病情无好转。就诊时表情呆滞，记忆力下降，记不得事情，不识亲友，语无伦次，喃喃自语，不能正确计算100以内的简单加减数，定时间、地点的能力下降。舌暗红，苔薄白，脉沉涩无力。服用促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药每日两次，连续服用2月后，症状明显好转，3个月后，表情灵活，言语可自行控制。治疗半年后，行为自主性增强，记忆力增强，记得事情，可识亲人。
[0072] 2.曾某，男，6岁。3岁时家长发现其智力发育迟缓，就诊妇幼医院诊断为轻度自闭症，并于康复医院训练治疗。5岁开始说话，沟通交流，理解能力障碍，情绪较不稳定，无攻击性表现。纳食可，夜寐安，二便自调，舌偏红，苔薄脉细缓。服用促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药1个月后，孩子与人沟通，语言表达秩序可，但对理解力差，对家人的劝说听得懂，但容易忘记，继续服用该合剂3个月后语言表达能力、理解能力均提高。
[0073] (二)临床试验数据统计
[0074] 本发明临床治疗420例患者,均接受养脑通脉中药的治疗。其中每个实施例均选取60例作为统计对象.其中男性230例，最大90岁，最小3岁，平均年龄62±11.4岁；女性190例，最大86岁，最小4 岁，平均年龄63±11.5岁。
[0075]
[0076]
[0077] 其中，从改善主要症状方面统计：
[0078] 1.症状(1)智能减退:每组实施例选取52例
[0079]
[0080]
[0081] 2.症状(2)注意力不集中:每组实施例选取36例
[0082]
[0083]
[0085] 使用最优实施例2的配方进行下述二-四的实验。
[0086] 二、促进神经干细胞增殖实验
[0087] 1.细胞培养
[0088] 1.1 C17.2神经干细胞复苏
[0089] (1)拿出冻存细胞，放进37℃解冻至小结冰；
[0090] (2)把解冻液体吸入试管，加PBS(其与PBS的体积比为1：5)；
[0091] (3)离心1000rpm 5min；
[0092] (4)去上清液，加1ml培养液，用移液器吹打10-12次；
[0093] (5)加培养液进培养瓶，25cm的培养瓶加5-6ml培养液，75cm的培养瓶加10-12ml培养液。
[0094] 该培养液包含：高糖DMEM(11965-092)、10％FBS、1％PS、1％L-G。
[0095] 1.2 细胞传代
[0096] (1)待培养瓶内的C17.2神经干细胞长满80％左右后进行传代；
[0097] (2)倒掉培养液，用PBS洗1-2遍，25cm的培养瓶加入2-3mlPBS 洗，75cm的培养瓶加入4-5mlPBS洗；
[0098] (3)培养瓶内加入胰酶2ml，放进培养箱内消化1min；
[0099] (4)加入PBS终止消化；
[0100] (5)离心1000rpm 5min，去上清；
[0101] (6)加入1-2ml培养液用移液枪吹打10-12次；
[0102] (7)加入步骤1.1中含FBS的培养液到培养瓶中培养。
[0103] 1.3 体外培养
[0104] 将C17.2神经干细胞置于含高糖DMEM、10％FBS、1％PS、1％L-g的培养基中，于37℃的CO2培养箱中培养。C17.2神经干细胞按1x108/L的密度接种，每两天换液传代一次，用胰酶消化1min，1000rpm离心5min，弃上清，按1:3传代。
[0105] 2.细胞分组
[0106] 取传代培养的C17.2神经干细胞，按每孔1x104接种至48孔板中，培养24h后弃旧液；然后分别加入浓度为0.0625mg成药/ml、0.125mg 成药/ml、0.25mg成药/ml的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药培养，以正常培养液为阴性对照，培养24h后弃旧液。
[0107] 3.MTT法观测细胞存活率
[0108] MTT法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
[0109] 在细胞分组步骤中的48孔板中，每孔加入20ul的浓度为5mg/L 的MTT溶液，避光培养4h后弃旧液；接下来每孔加入200ul二甲基砜(DMSO)溶液，振荡10min，至颗粒溶解，置于自动酶标仪读数，测定OD值；根据OD值计算不同组别的细胞存活率，各个组别的细胞存活率(％)＝实验组吸光均值/阴性对照组吸光度均值×100％。
[0110] 4.Brdu标记测细胞增殖
[0111] Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)，活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
[0112] 将经细胞分组步骤测量后的细胞接种于6孔板中，在接种的培养基中加入Brdu(10ug/ml)培养，并用4％多聚甲醛固定20min；用PBS洗3 遍，每遍5min，用0.5％TRION X-100破膜10min；用PBS洗3遍，每遍5min，用2N HCL避光室温保温(26-28℃)30min，使核变性；
用PBS洗3遍，每遍5min，用0.01mol/L Tris-HCL缓冲液洗10min；用PBS洗3遍，每遍5min，用
0.1mol/L硼酸10min；用PBS洗3遍，每遍5min，用5％山羊血清孵育30min(；加一抗Brdu(1:
1000)，4℃过夜；用PBS洗3遍，每遍5min，加二抗(1:600)2h，镜下观察。
用PBS洗3遍，每遍5min，用0.01mol/L Tris-HCL缓冲液洗10min；用PBS洗3遍，每遍5min，用
0.1mol/L硼酸10min；用PBS洗3遍，每遍5min，用5％山羊血清孵育30min(；加一抗Brdu(1:
1000)，4℃过夜；用PBS洗3遍，每遍5min，加二抗(1:600)2h，镜下观察。
[0113] 5.结果显示：
[0114] 5.1 本申请促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对C17.2神经干细胞形态的影响[0115] C17.2神经干细胞呈单层生长，细胞形态呈长梭形、扁平，用药各组细胞形态基本一致，药物组细胞增长较空白组为快，见图1。
[0116] 5.2 MTT法检测药物干预对C17.2神经干细胞增殖能力的影响
[0117] 经药物干预后，细胞在0.0625mg成药/ml(低浓度)、0.125mg 成药/ml中(浓度)、0.25mg成药/ml(高浓度)活性都有增加，24h 的存活率分别为(95.560±3.699)％、(98.465±5.872)％、(97.593 ±6.683)％；以中、高剂量给药后细胞增殖明显，与空白组(90.217 ±4.163)％相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。
[0118] 5.3 Brdu标记测药物干预对C17.2神经干细胞增殖能力的影响
[0119] 经药物干预后，细胞在0.0625mg成药/ml(低浓度)、0.125mg 成药/ml中(浓度)、0.25mg成药/ml(高浓度)浓度活性都有增加；以中、高剂量给药后细胞增殖明显，与空白组相比差异有统计学意义 (P＜0.05)，见图3。
[0120] 5.1-5.3 的结果表明：所述促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药可促进神经干细胞增殖。
[0121] 备注：本实验目的在于证明促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药可促进神经干细胞增殖。其空白组指的是神经干细胞本身的自身分裂增殖。而其他三组是不同浓度的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药干预下的神经干细胞分裂增殖。
[0122] 三、促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药抗氧化
[0123] Wistar大鼠36只，随机分成6组：空白组(分离大鼠双侧颈总动脉，但不予结扎，每天分别给予与使用的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药等体积的蒸馏水)、模型组(造成有认知障碍的动物模型，但未给药物治疗)、阳性对照组(给予大鼠银杏叶片水溶液，其由购自沈阳格林制药有限公司生产的银杏叶分散片(国药准字Z20060440， 0.5g/片)配制成银杏叶片水溶液，比例为1g银杏叶片溶于100ml水溶液，银杏叶分散片是治疗认知障碍的常规使用药物)、用药高中低剂量组(每日分别给大鼠灌胃低、中、高剂量的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药煎剂)。其中高剂量浓度为0.742g成药/ml溶液，中剂量浓度为0.371g成药/ml溶液，低剂量浓度为0.1856g成药/ml溶液。总共灌胃15d，2次/d。末次给药后0.5h冰浴下快速脱颈椎开颅取脑。
[0124] 1.抗氧化酶含量比较研究：
[0125] 冰台上迅速分离海马组织，冰0.9％氯化钠溶液冲洗除去血液，滤纸吸干，称质量。在冰浴下按1:9(即1g组织加0.9％氯化钠溶液9ml) 加入冰冷的0.9％氯化钠溶液，用超声细胞破碎仪破碎成10％的匀浆， 3000g 4℃低温离心10min，取上清分装置-80℃冰箱保存备用。检测时取适量上清液，按试剂盒要求测定SOD(试剂盒为：大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA Kit,产品型号：fk1927Y)、GSH(试剂盒为：还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒，上海沪峰试剂公司生产)、 CAT(试剂盒为：CAT Rabbit mAb，购自Cell Signaling公司，过氧化氢酶(CAT)测试盒,产品型号：A007)和MDA(大鼠丙二醛(MDA) ELISA Kit，产品型号：
fk1926Y)的含量。
fk1926Y)的含量。
[0126] 在正常情况下，体内氧化和抗氧化处于一种动态平衡，机体细胞内超氧化物歧化酶(S0D)可将体内生成的少量的超氧阴离子自由基 (O2-)歧化成过氧化氢，过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)再将过氧化氢分解为水分子与氧气，从而细胞免受损伤,维持细胞膜结构和功能的稳定。因此，SOD、CAT、GPx是反应组织抗氧化能力的敏感指标。GSH为清除氧自由基提供NADP，也是反应组织细胞抗损伤能力及受损程度的敏感指标。MDA是氧自由基损伤导致组织脂质过氧化的代谢产物，MDA含量的高低反映了机体受自由基攻击的严重程度，是衡量机体自由基代谢的敏感指标。当直接或间接原因引起自由基大量生成时，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px及GSH的活性降低，脂质过氧化反应增强，其产物MDA的含量增加，从而损伤细胞膜结构，导致细胞膜功能障碍的活性。
[0127] 结果显示：
[0128] 与空白组相比，模型组海马的MDA水平升高，SOD和CAT活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，用药高中低剂量组和阳性对照组能够降低海马的MDA水平，提高SOD和CAT活性(P<0.05)，在用药高中低剂量组中以中高剂量组的效果明显，见表1。
[0129] 表1 各组大鼠海马SOD、CAT、GSH、MDA的变化
[0130]
[0131] 与空白组比较，﹟P＜0.05；与模型组比较，﹡P＜0.05。
[0132] 2.促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对认知障碍大鼠海马区 CAT、GSH-Px蛋白表达的影响
[0133] 冰台上迅速分离海马组织，取少量组织置于2ml匀浆器中球部，用干净剪刀将组织尽量剪碎后，加入1mL蛋白裂解液RIPA和 10uL100mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF(购自碧云天生物技术研究所)。冰里裂解30min，低温14000rpm离心，收集上清，转移至无菌离心管中，-20℃保存。取20uL的细胞裂解液，加入5uL 5×电泳上样缓冲液(预染Maker取5uL)，沸水浴
5min，4000rpm离心，去除不溶性蛋白后上样。电泳，转膜，脱脂奶粉室温封闭，加一抗(CAT Rabbit mAb、β-Actin(13E5)Rabbit mAb均购自Cell Signaling Technology,Inc.GPx-
1Rabbit mAb购自Abcam公司)过夜，洗膜，加二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术有限公司)，洗膜后加入ECL化学发光试剂(使用试剂盒：超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所)，X光片记录结果。
5min，4000rpm离心，去除不溶性蛋白后上样。电泳，转膜，脱脂奶粉室温封闭，加一抗(CAT Rabbit mAb、β-Actin(13E5)Rabbit mAb均购自Cell Signaling Technology,Inc.GPx-
1Rabbit mAb购自Abcam公司)过夜，洗膜，加二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术有限公司)，洗膜后加入ECL化学发光试剂(使用试剂盒：超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所)，X光片记录结果。
[0134] 结果显示：
[0135] 与空白组比较，模型组海马区CAT、GSH-Px蛋白的表达水平下降；与模型组比较，用药高中低剂量组CAT、GSH-Px蛋白的表达水平上调，且以高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2、图4)。其中β-actin为内参照。
[0136] 表2 各组大鼠海马CAT、GSH-Px蛋白的表达水平
[0137]组别 N CAT/β-actin GSH-Px/β-actin
空白组 6 0.84±0.12﹡ 0.71±0.10﹡
模型组 6 0.30±0.06﹟ 0.27±0.06﹟
空白组 6 0.84±0.12﹡ 0.71±0.10﹡
模型组 6 0.30±0.06﹟ 0.27±0.06﹟
[0138]阳性对照组 6 0.47±0.06﹟﹡ 0.41±0.06﹟
用药低剂量组 6 0.43±0.01﹟﹡ 0.56±0.06﹡
用药中剂量组 6 0.44±0.00﹟﹡ 0.73±0.13﹡
用药高剂量组 6 0.75±0.09﹡ 1.04±0.16﹟﹡
用药低剂量组 6 0.43±0.01﹟﹡ 0.56±0.06﹡
用药中剂量组 6 0.44±0.00﹟﹡ 0.73±0.13﹡
用药高剂量组 6 0.75±0.09﹡ 1.04±0.16﹟﹡
[0139] 与空白组比较，﹟P＜0.05；与模型组比较，﹡P＜0.05。
[0140] 3.促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药对认知障碍大鼠海马区 CAT、GSH-Px基因表达的影响
[0141] 冰浴下加0.5ml液氮制作脑组织匀浆悬液。加入Trizol试剂提取总mRNA，用紫外-可见分光光度计测定RNA纯度和浓度。根据 RT-PCR试剂盒说明书，取适量总mRNA，在逆转录酶(MLV)催化下合成 cDNA。以适量cDNA为模板，将目的基因和内参照基因引物、TaqDNA 聚合酶加入到PCR反应体系中进行扩增。β-actin为内参照。β -actin上游引物序列F:5’-CTGA CCGA GCGT GGCT AC-3’，下游引物序列R:5’-CCTG CTTG CTGA TCCA CA-3’；CAT上游引物序列F:5'-CTA TCC TGA CAC TCA CCG CCA T-3',下游引物序列R: 5'-TTC TTG ACC GCT TTC TTC TGG A-3'；GPx上游引物序列F:5'-CTC GGT TTC CCG TGC AAT CAG-3'，下游引物序列R:5'-GTG CAG CCA GTA ATC ACC AAG-3'。准备反应体系，94℃预变性4min，94℃1min，65℃ 50s,72℃1min共30个循环，最后延伸10min进行PCR反应。反应结束后取PCR产物8μl行1％琼脂糖凝胶电泳，实验重复3次。
[0142] 附：
[0143] (1)使用试剂及试剂盒信息：β-Actin(13E5)Rabbit mAb、 GPx-1Rabbit mAb购自Abcam公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术有限公司，cDNA逆转录用试剂盒、Green PCR master MIX(2x)均购自Fermentas公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、 TBE、MARKER均购自Solarbio公司，琼脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10购自SPAIN公司，引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，其他试剂(乙醇、异丙醇、氯仿等均为国产试剂分析纯)。
[0144] (2)使用仪器：台式低温高速冷冻离心机(德国Hettich公司)；超声波细胞破碎仪(美国Sonics公司)；全自动酶标仪(美国Bioteck 公司)；电泳仪、电转仪、化学发光成像仪(美国BIO-RAD公司)； PCR分析仪(Eppendorf公司)。
[0145] 结果显示：
[0146] 与空白组比较，模型组海马区CAT、GSH-Px基因的表达水平下降；与模型组比较，用药高中低剂量组CAT、GSH-Px基因的表达水平上调， CAT以高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，与银杏叶组比较，CAT、GSH-Px基因的表达水平上调(见表3、图5)。
[0147] 表3 各组大鼠海马CAT、GPx-1mRNA的表达水平
[0148]组别 N CAT/β-actin GSH-Px/β-actin
[0149]空白组 6 0.25±0.002﹡ 0.56±0.06﹡
模型组 6 0.10±0.0001﹟ 0.33±0.00﹟
阳性对照组 6 0.16±0.0003﹟﹡ 0.52±0.01﹟﹡
用药低剂量组 6 0.25±0.00﹡ 0.61±0.00﹟﹡
用药中剂量组 6 0.25±0.00﹡ 0.61±0.00﹟﹡
用药高剂量组 6 0.40±0.005﹟﹡ 0.62±0.01﹟﹡
模型组 6 0.10±0.0001﹟ 0.33±0.00﹟
阳性对照组 6 0.16±0.0003﹟﹡ 0.52±0.01﹟﹡
用药低剂量组 6 0.25±0.00﹡ 0.61±0.00﹟﹡
用药中剂量组 6 0.25±0.00﹡ 0.61±0.00﹟﹡
用药高剂量组 6 0.40±0.005﹟﹡ 0.62±0.01﹟﹡
[0150] 与空白组比较，﹟P＜0.05；与模型组比较，﹡P＜0.05。
[0151] 结果表明：促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药通过抗氧化作用提高抗氧化酶活性从而对慢性脑缺血诱导的认知障碍起保护作用。四、改善认知障碍行为学实验[0152] 1.实验分组
[0153] 3月龄Wistar大鼠72只，随机分成6组，每组12只。
[0154] 组1用药高剂量组：促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药混悬液为0.742g成药/ml溶液，相当于人常用剂量的10倍，按1ml/100g 体重灌胃，2次/天。
[0155] 组2用药中剂量组：促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药混悬液为0.371g成药/ml溶液，相当于人常用剂量的5倍。按1ml/100g 体重灌胃，2次/天。
[0156] 组3用药低剂量组：促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药混悬液为0.1856g成药/ml溶液，相当于人常用剂量。按1ml/100g体重灌胃，2次/天。
[0157] 组4阳性对照组(给予大鼠银杏叶片水溶液，其由购自沈阳格林制药有限公司生产的银杏叶分散片(国药准字Z20060440，0.5g/片) 配制成银杏叶片水溶液，比例为1g银杏叶片溶于100ml水溶液，银杏叶分散片是治疗认知障碍的常规使用药物)：混悬液浓度为0.01g 成药/ml，相当于人常用剂量。按1ml/100g体重灌胃，2次/天。
[0158] 组5模型组：蒸馏水1ml/100g体重灌胃，2次/天
[0159] 组6空白组：蒸馏水1ml/100g体重灌胃，2次/天
[0160] 采用双侧颈总动脉永久结扎法(2-VO)制作认知障碍型大鼠，造模(造模指的是通过2-VO法把正常的大鼠制作成认知障碍型的大鼠)后分别给6组大鼠给药或给蒸馏水14天。在治疗前、治疗后第 7天、治疗后第14天予测试空间记忆。
[0161] 2.水迷宫
[0162] ①治疗前、治疗后第7天、治疗后第14天，开始水迷宫实验。
[0163] ②水迷宫适应训练和游泳能力测定：造模前撤除平台上的泡沫塑料，让大鼠在水迷宫中自由游泳2分钟，记录游泳距离。
[0164] ③定位航行试验：历时3d，1次/d，将大鼠面向池壁，按顺时针方向依次由东、西、南、北4个入水点放入水中，记录大鼠60s内寻找平台泡沫塑料的时间，即逃避潜伏期；若在60s内未找到平台，则由实验者引其上平台并停留10s，逃避潜伏期记录为60s。
[0165] ④空间探索实验：第4天撤除平台泡沫塑料，任选一个入水点将大鼠放入水中，记录其2min内跨越原平台相应位置的次数。如果训练过的大鼠的空间记忆是清晰的，那么大鼠会在周围的空间中找到平台的确切位置。因此，大鼠的空间记忆越清晰，则大鼠游到先前平台位置的时间会越少。每次测试中，大鼠会被迅速用毛巾擦干，再放回笼中。
[0166] 把逃避潜伏期作为评价养脑通脉合剂在空间记忆疗效的指标。造模前各组大鼠的游泳能力无统计学意义(见表4)。造模后治疗前用药高中低剂量组、阳性对照组、模型组在游泳能力、定向航行、空间探索实验中均低于空白组，差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗7天、 14天后用药高中低剂量组、阳性对照组、空白组逃避潜伏期短于模型组，游泳能力、空间探索跨越平台次数高于模型组(P＜0.05)(见表5)。
[0167] 3.旷场试验
[0168] ①材料：旷场实验箱为100cm(长)x100cm(宽)x50cm(高), 将其分为25个20cm(长)x20cm(宽)x5cm(高)的小格。
[0169] ②检测方法：将大鼠放在旷场实验箱正中格内，观察并记录2min 其翻越小格的灵活程度。
[0170] 各组均见到有不同程度的通过试验箱格子行动缓慢或停滞不前的现象。造模前各组大鼠的翻越旷场试验箱格数无统计学意义(见表 4)。造模后治疗前用药高中低剂量组、阳性对照组、模型组与空白组比较具有统计学意义P＜0.05。治疗7天、14天后用药高中低剂量组、阳性对照组、空白组翻越旷场实验箱格数高于模型组(P＜0.05) (见表5)。
[0171] 表4 6组认知障碍模型大鼠造模前游泳能力、旷场实验比较
[0172]
[0173] 注：各组组间比较P＞0.05
[0174] 表5 6组认知障碍模型大鼠游泳能力、水迷宫、旷场实验比较
[0175]
[0176]
[0177]
[0178] 注：与空白组比较，aP＜0.05
[0179] 与治疗7天模型组比较，bP＜0.05,cP＜0.01
[0180] 与治疗14天模型组比较，dP＜0.05,eP＜0.01
[0181] 结果显示：促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药可有效改善认知障碍大鼠的行为，提高认知能力。
[0182] 五、综上所述，由上述实验可见，证明用药高中低剂量组的C17.2细胞增长较空白组为快。经0.0625mg成药/ml(低浓度)、0.125mg成药/ml(中浓度)、 0.25mg成药/ml(高浓度)浓度的药物干预后，细胞的活性都有增加；以中、高剂量给药后细胞增殖明显。抗氧化酶活性实验提示该申请促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药能够降低认知障碍大鼠海马区的MDA的水平，提高SOD和CAT活性；用药高中低剂量组中，以中高剂量效果明显。在大鼠海马区CAT、GSH-Px 蛋白的表达水平实验中发现促进神经干细胞增殖的促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药能上调认知障碍大鼠海马区CAT、GSH-Px蛋白的表达水平，且以高剂量组最为明显。通过改善认知障碍行为学实验发现：该申请促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药能明显改善认知障碍模型大鼠的行为学障碍，提高其智力。
[0183] 本发明所述的一种促进神经干细胞增殖的养脑通脉中药并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
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