用于治疗用途的方法
阅读：100发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于治疗用途的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及在 治疗 疾病 和病症中用于 治疗用途 的方法，其中在所述疾病或病症的治疗中T辅助细胞非依赖性 抗体 应答是有利的。特别地，本发明涉及方法，其中在免疫受损或患有自身免疫疾病的动物或人中治疗上述疾病和病症。甚至更特别地，本发明涉及在免疫受损或患有自身免疫疾病的动物或人中，或在需要特别避免 炎症 反应的情况下，治疗阿尔茨海默病。，下面是用于治疗用途的方法专利的具体信息内容。
1.使用包含经修饰的抗原肽的抗原组合物制备药物的方法，所述药物用于患者群中诱发T细胞非依赖性免疫应答，所述免疫应答有效治疗疾病或病症，其中所述抗原肽以高度重复的阵列呈递在脂质体表面，其中所述疾病或病症选自β-淀粉状蛋白相关的和tau蛋白相关的疾病或病症，
其中所述患者患有T细胞缺陷，
其中所述抗原肽来源于选自β-淀粉状蛋白(Aβ)和tau蛋白的淀粉状蛋白或类淀粉状蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述药物用于在人中使用。
3.权利要求1的方法，其中所述组合物作为免疫刺激剂有效。
4.权利要求1的方法，其中所述患者患有自身免疫疾病。
5.权利要求1的方法，其中所述患者是CD4T细胞衰竭的。
6.权利要求5的方法，其中所述患者显示降低的在CD4T细胞上的CD14和/或CD40L的表达。
7.权利要求1的方法，其中所述T细胞缺陷由年龄、免疫抑制或疾病导致。
8.权利要求7的方法，其中所述疾病是HIV或癌症。
9.权利要求1的方法，其中所述T细胞缺陷由于针对炎症疾病的治疗而引起，所述炎症疾病选自：类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、和韦格纳肉芽肿。
10.根据权利要求1-9之任一的方法，其中所述抗原不含有T细胞表位。
11.根据权利要求1-9之任一的方法，其中所述抗原是构象抗原，其全部或部分包含β-折叠构象。
12.根据权利要求1-9之任一的方法，其中所述抗原是肽抗原，其被便于插入脂质体的脂质双层的亲脂性或疏水性部分修饰。
13.根据权利要求12的方法，其中所述亲脂性或疏水性部分是脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂。
14.根据权利要求13的方法，其中所述亲脂性或疏水性部分是脂肪酸。
15.根据权利要求14的方法，其中所述亲脂性或疏水性部分是具有至少10个碳原子的碳骨架的脂肪酸。
16.根据权利要求15的方法，其中所述疏水性部分是棕榈酸。
17.根据权利要求16的方法，其中所述肽抗原包含2个棕榈酸部分。
18.根据权利要求17的方法，其中所述肽抗原包含4个棕榈酸部分。
19.根据权利要求1-9之任一的方法，其中所述脂质体包含佐剂，所述佐剂选自：脂质A，脱毒的脂质A，单磷酰脂质A、二磷酰脂质A和铝佐剂。
20.根据权利要求1的方法，其中所述修饰的抗原肽是来源于Aβ肽N-端的Aβ肽片段。
21.根据权利要求20的方法，其中Aβ肽N-端包含
a.Aβ1-30；
b.Aβ1-20；
c.Aβ1-16。
22.根据权利要求20的方法，其中Aβ肽片段包含4-20个氨基酸。
23.根据权利要求20的方法，其中Aβ肽片段包含5-16个氨基酸。
24.根据权利要求20的方法，其中Aβ肽片段包含6-12个氨基酸。
25.根据权利要求20的方法，其中Aβ肽片段包含4-8个氨基酸。
26.根据权利要求20的方法，其中所述Aβ肽片段是
a.Aβ1-15；
b.Aβ1-16；
c.Aβ1-5。
27.权利要求1的方法，其中所述修饰的抗原肽是模仿tau蛋白的主要病理学磷酸表位的磷酸肽。
28.权利要求27的方法，其中所述tau蛋白是人蛋白。
29.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:2的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:2的第18位氨基酸残基(P-Tyr18)的氨基酸残基是磷酸化的。
30.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:3的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:3的第212位(P-Thr212)和第214位(P-Ser214)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个或至少2个是磷酸化的。
31.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:4的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:4的第202位(P-Ser202)和第205位(P-Thr205)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个或至少2个是磷酸化的。
32.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:5的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:5的第396位(P-Ser396)和第404位(P-Ser404)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个或所有是磷酸化的。
33.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:6的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:6的第404位(P-Ser404)和第409位(P-Ser409)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个或所有是磷酸化的。
34.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:7的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:7的第202(P-Ser202),205(P-Thr205),212(P-Thr212)，和214(P-Ser214)位氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个或至少2个是磷酸化的。
35.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并与SEQ ID NO:7的所述抗原肽具有相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO:7的第202(P-Ser202),205(P-Thr205),212(P-Thr212)，和214(P-Ser214)位氨基酸残基的氨基酸残基全部是磷酸化的。
36.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
37.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
38.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
39.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
40.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
41.权利要求28的方法，其中所述tau磷酸肽为SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
42.权利要求20-26中任一项的方法，其中所述患者患有由β-淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病或病症。
43.权利要求27-41中任一项的方法，其中所述患者患有由tau蛋白或tau样蛋白引起的或与之相关的疾病或病症。
44.根据权利要求1的方法，其中所述淀粉状蛋白相关疾病或病症的特征是，在个体中认知记忆能力的丧失。
45.权利要求44的方法，其中所述个体是动物。
46.权利要求45的方法，其中所述个体是人。
47.权利要求44的方法，其中所述疾病是来自淀粉样变组的疾病或病症。
48.权利要求44的方法，其中所述疾病是神经学病症。
49.权利要求1的方法，其中所述疾病是选自阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变-荷兰型；关岛帕金森痴呆综合征；进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、和青光眼的疾病或病症。
50.权利要求49的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默病。
51.根据权利要求1的方法，其中所述tau相关疾病或病症是神经变性病症。
52.权利要求51的方法，其中所述神经变性疾病或病症是由神经原纤维病变的形成引起或与其相关。
53.根据权利要求51的方法，其中所述神经变性疾病或病症是tau蛋白病。
54.权利要求51的方法，其中所述神经变性疾病或病症是选自阿尔茨海默病、克雅氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、 病、包涵体肌炎和
朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症/关岛帕金森痴呆综合征、非关岛型运动神经元疾病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、与17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆症、哈－斯二氏病、多系统萎缩症、尼曼-皮克病C型、皮克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结痴呆、脑炎后帕金森综合症、强直性肌营养不良。
55.权利要求54的方法，其中所述神经变性病症是阿尔茨海默病。
56.权利要求1-9、13-18、20-41和44-55之任一的方法，其中所述个体没有经历任何不良炎症效应。
用于治疗用途的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及在治疗患者的疾病或病症，特别是由淀粉状蛋白(amyloid proteins)或类淀粉状蛋白(amyloid-like proteins)引起或由tau或tau样蛋白引起或与之相关的疾病或病症(包括阿尔茨海默病)时，在个体中，特别是动物或人中诱发T细胞非依赖性免疫应答的方法。
[0002] 特别地，本发明涉及在治疗由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病或病症中用于治疗和诊断用途的方法，所述疾病或病症包括淀粉样变(amyloidosis)，与淀粉状蛋白有关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病。本发明还涉及在治疗由神经原纤维缠结引起的或与其相关的疾病或病症中用于治疗和诊断用途的方法和组合物。特别地，本发明涉及在治疗包括阿尔茨海默病(AD)的tau蛋白病(tauopathies)中用于治疗和诊断用途的方法和组合物。
[0003] 发明背景
[0004] 抗原经典地分为T-依赖性和T-非依赖性抗原(Alugupulli 2008)。蛋白质和肽被称为T-依赖性抗原，因为它们通过提供关联(cognate)和非关联(noncognate)相互作用，诱发帮助B细胞的抗原特异性T细胞。许多疫苗是T-依赖性抗原。T-依赖性抗原通常需要多次加强以产生抗体应答。
[0005] 诱发抗体应答而不需要T细胞帮助的抗原被称为T-非依赖性抗原(Bachmann和Zinkernagel 1997)。这些抗原可以在体内不存在T辅助细胞时诱发抗体应答，例如在无胸腺的裸(nu/nu)鼠中。T-非依赖性抗原一般是不能够刺激T细胞应答的抗原，因为它们不能被MHC-II分子加工和呈递。LPS和细菌多糖是典型的T细胞非依赖性抗原。此外，某些病毒和细菌的一些蛋白质可在缺乏T细胞时刺激抗体应答，原因最可能是它们的重复性结构可有效交联BCR。T-非依赖性抗原比T-依赖性抗原要快得多地诱发B细胞扩增和强抗体滴度。
[0006] 通常仅仅通过交联B细胞表面Ig不能完全活化B细胞使其增殖和产生免疫球蛋白(Ig)。为了得到最佳的抗体产生，需要第二种信号，即T辅助细胞提供的信号。抗原结合B细胞表面的Ig，被内化并然后在MHC II类分子的背景中被呈递给抗原特异性T辅助细胞。B细胞也表达CD40以及B7(CD86)，其分别与T细胞上的CD40配体(CD40L)和CD28相互作用，由此诱发T细胞分泌细胞因子，该细胞因子进一步调节B细胞应答。这些细胞因子触发B细胞增殖和分化为抗体生产细胞(浆细胞)。至IgG、IgA或IgE的同种型转换被称为类别转换重组(CSR)。一旦此转换发生，一个特定的B细胞就不能再产生其他同种型，IgM或IgD。
[0007] 尽管绝大多数抗原需要T细胞辅助用于B细胞活化并因此被称为T细胞辅助依赖性抗原(TD抗原)，但少数抗原可诱发抗体而不依赖T细胞辅助，被称为TI抗原(Mond JJ，Vos Q，Lees A，Snapper CM.T-cell independent antigens.Curr Opin Immunol 1995；7：349-54)。基于它们在先天无胸腺(nu/nu)小鼠和具有X连锁的免疫B细胞缺陷的小鼠(xid小鼠，缺乏布鲁顿酪氨酸激酶Btk的功能)中的免疫原性，TI抗原经典地被进一步细分为TI 1型抗原(TI-1)和TI 2型(TI-2)抗原。TI-1抗原在nu/nu小鼠和xid小鼠中刺激极佳的抗体应答，TI-2抗原也在nu/nu小鼠中刺激极佳的抗体应答，但在xid小鼠中不刺激抗体应答。TI-1抗原含有多克隆的B细胞活化物，其典型地是脂多糖(LPS)。相反地，TI-2抗原一般是由重复的生化结构组成的抗原，例如聚合蛋白质抗原或细菌的荚膜多糖。
[0008] 大多数肽或蛋白质疫苗是基于以下原理，即B和T细胞都被活化且抗体应答是T细胞依赖性的。这在由于年龄、免疫抑制或疾病而患有T细胞缺陷的患者中可能造成问题。
[0009] 在衰老的免疫系统中，就T细胞数量和质量而言会出现显著变化，这是胸腺退化的直接后果。胸腺，位于心脏正上方的前上部胸腔中的中枢淋巴器官，在被称为thymopoiesis的过程中负责成熟幼稚T细胞的发育、选择和输出至外周。随着进行性衰老，胸腺退化。结果是幼稚T细胞的输出随年龄剧烈下降。减少的胸腺输出和对抗原的终生暴露导致在老年个体中幼稚T细胞库的缩减和由此宿主应答新抗原的能力的限制。当老年个体感染新出现的疾病时这点特别令人困扰，例如严重急性呼吸道综合症(SARS)，其杀死50％年龄在50岁以上的感染者。此外，在老年人中发现的幼稚T细胞已经在外周中驻留数十年且已暴露过一系列因子，例如氧化胁迫和有限浓度的生存因子，这可能对细胞功能具有负面影响。来自老年动物的幼稚CD4+T细胞相比来自年轻小鼠的细胞产生显著更少的IL-2，扩增弱且产生较少的效应物，具有较低活化的表型和减少的产生细胞因子的能力。然而，在老年动物中新生成的CD4+T细胞可以在体内和体外对抗原产生强烈应答，能够增殖，产生IL-2和展示关联辅助细胞功能。因此，年龄相关的对抗原刺激的应答缺陷可能至少部分是由CD4+T细胞的实足年龄引起的。
[0010] 记忆CD4+T细胞在控制体液和细胞应答中很关键，因此其寿命和对免疫接种的应答对保护性免疫的维持是决定性的。由年老的幼稚T细胞产生的记忆T细胞在体内存活和维持良好，但它们在回忆应答期间在其增殖和细胞因子分泌中有明显缺陷，而在年轻个体中产生的记忆细胞在其宿主衰老时可以较长期保持功能。这些来自动物研究的数据最近已在人中被证实。当进行抗流感免疫接种时，健康老年个体能够发动和年轻个体中观察到的相当的CD4+T细胞应答，但他们展示出被削弱的针对流感疫苗的长期CD4+T细胞免疫应答。
[0012] 发明概述
[0013] 在本发明的特定实施方案中产生了抗原组合物，其包含与MPLA组合的在脂质体上呈递的棕榈酰化肽，所述疫苗是T细胞非依赖性的。所述肽是β-折叠构象。此疫苗诱发快速和强烈的抗体应答。其不依赖于其他载体蛋白质并可在T细胞的缺乏下诱发抗体应答，如由在裸鼠中的抗体诱导所证明的。最后，其在老年小鼠中诱发强烈和有效的抗体应答，尽管在此老龄时存在T细胞缺陷(Miller R.A，等人，1996；Adolfsson O，等人，2001；Linton P.J.，等人1996)。
[0014] 所述疫苗的特征概述如下：
[0015] -特定的构象(β-折叠)
[0016] -强应答(免疫后7天1000000ng/ml)
[0017] -快速应答(第一次免疫后7天)
[0018] -不需要T细胞辅助
[0019] -不需要载体蛋白质
[0020] -在老年小鼠中的有效性，尽管在此老龄时存在T细胞缺陷。
[0021] 在现有技术中已知的Aβ抗原组合物，例如来自Elan Inc公司(CA；USA)的AN1792，通常是典型的T依赖性抗原(Aβ1-42)，其与强Th1驱动佐剂(QS21)一起施用。在阿尔茨海默病患者中AN1792的最初研究显示了有希望的效力，在接受疫苗的患者中比在用安慰剂治疗的患者中具有较慢的认知衰退速度(Gilman等人2005)。然而6％的治疗患者患上脑膜脑炎，此反应被认为是由于T细胞介导的抗全长Aβ1-42应答引起的(Orgogozo等人2003)。尽管此炎症应答在大多数患者中是可逆的，但该反应仍导致临床试验的中断。
[0022] 因此需要的是这样的方法，其中，在具有T细胞缺陷的患者，特别是CD4T细胞衰竭的患者中，使用抗原，例如抗-Aβ抗原或抗-tau抗原，在缺乏抗原特异性，即Aβ-或tau-特异性T细胞的情况下通过直接活化B细胞而诱发抗体应答，以治疗、减轻症状，延缓疾病和病症的发作、或预防疾病和病症，例如由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与该蛋白相关的疾病或病症，包括淀粉样变(与淀粉状蛋白有关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与其相关的疾病或病症，包括tau蛋白病。特别地，脂质体呈递的棕榈酰化Aβ肽或tau肽与MPLA组合可以诱发Aβ特异性抗体而不需要T细胞辅助和不需要提供T细胞辅助的载体蛋白质。
[0023] 本发明提供了在治疗、减轻症状、或预防疾病和病症中用于治疗和诊断用途的方法，包括对患者施用包含修饰的抗原的T细胞非依赖性抗原组合物，其中所述抗原以高度重复的阵列(highly repetitive array)形式呈递在脂质体表面。特别地，所述疾病和病症为在患者中由淀粉状或类淀粉状蛋白引起或与上述蛋白相关的疾病和病症，包括淀粉样变(与淀粉状蛋白有关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与其相关的疾病或病症，包括tau蛋白病，其中所述患者特别是免疫耐受患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4T细胞衰竭和/或CD4T细胞上的CD14和/或CD40L表达降低引起的T细胞缺陷，例如免疫受损(immuno-compromised)患者或具有自身免疫疾病的患者。
[0024] 此外，在本发明的范围内，现在令人惊讶地发现，对于个体，特别是动物或人，在需要T细胞非依赖性免疫应答的患者中，特别是在免疫耐受患者中，特别是在患有T细胞免疫缺陷疾病的患者中，疾病可以被避免，其中可以在疾病，例如淀粉状蛋白或tau蛋白相关疾病发作前，对个体接种疫苗，或在患有淀粉状蛋白或tau蛋白相关疾病或病症的情况下，可以通过本文描述的方法治疗所述个体。
[0025] 本发明的一个技术问题是，提供在治疗患者、减轻症状、或预防疾病和病症时治疗和诊断性应用抗原组合物的方法，其中所述患者特别是需要T细胞非依赖性免疫应答的患者，例如免疫耐受患者或T细胞活化患者，其中T细胞非依赖性免疫应答在治疗的个体中被诱发。特别地，在本发明的范围内待治疗的疾病和病症是，例如由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病或病症，包括淀粉样变(与淀粉状蛋白有关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与之相关的疾病或病症，包括tau蛋白病。
[0027] 本发明因此在第一个实施方案中涉及包含修饰抗原的抗原组合物，用于在治疗疾病、病况或病症时在患者，特别是动物或人患者，特别是需要T细胞非依赖性应答的患者，例如免疫耐受患者或T细胞活化患者中诱发T细胞非依赖性免疫应答，其中所述抗原呈递在脂质体的表面。
[0028] 在一个实施方案中，如本文描述的本发明的抗原组合物作为免疫刺激剂起作用。
[0029] 在本发明的特定实施方案中，所述抗原是肽抗原，其以高度重复阵列呈递在脂质体的表面。在另一个特定实施方案中，所述抗原不含有T细胞表位。
[0030] 在本发明的一个实施方案中，如本文描述的本发明的抗原组合物用于治疗免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是免疫受损患者，特别是患有自身免疫疾病的患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4T细胞衰竭和/或CD4T细胞上的CD14和/或CD40L表达降低引起的T细胞缺陷。
[0031] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的和如本文描述的抗原组合物，其中所述T细胞缺陷由年龄、免疫抑制或疾病导致，特别是选自HIV、癌症或其他恶性肿瘤的疾病，包括，例如，用免疫抑制性化合物或化学治疗性化合物治疗而导致患者的免疫抑制状态的炎症疾病，例如类风湿性关节炎；银屑病、系统性红斑狼疮，韦格纳肉芽肿，等等。
[0032] 在一个实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含构象抗原，其中所述抗原的全部或部分是β-折叠构象。在特定的实施方案中，所述抗原肽是经修饰的，所述修饰能够维持和稳定抗原的确定构象，特别是这样的构象，该构象的特征在于平衡比例的无规卷曲、α-螺旋和β-折叠部分。此确定的构象导致在引入动物或人后诱发强烈和高度特异的免疫应答，特别是T细胞非依赖性免疫应答。
[0033] 特别地，本发明的和如本文描述的抗原组合物可包含构象抗原，其中30％以上，特别地40％以上，特别地50％以上，特别地60％以上，特别地70％以上，特别地80％以上，特别地90％以上，特别地95％以上和多达100％是β-折叠构象。
[0034] 在一个实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物可包含肽抗原，该肽抗原被便于插入脂质体的脂质双层的亲脂性或疏水性部分，特别是脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，修饰。
[0036] 在本发明的另一个特定实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含肽抗原，其包含2个棕榈酸部分，特别地4个棕榈酸部分。
[0037] 在本发明的另一个特定实施方案中，亲脂性或疏水性部分的大小(dimension)与抗原肽及载体/佐剂(肽所连接、掺入或于其中重构的载体/佐剂)的总净电荷组合起来导致：抗原肽以高度生物活性的构象被暴露、稳定和呈递，这允许靶生物的免疫系统与处于暴露的、稳定的和高度生物活性的构象中的该抗原构建体含有的抗原决定簇自由地相互作用，导致强免疫应答。
[0039] 在一个实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含抗原构建体，特别是Aβ抗原构建体，其包含来源于Aβ肽N-端的单个或重复Aβ肽片段。
[0040] 在本发明的特定实施方案中，该Aβ肽N-端包含
[0041] a)Aβ1-30；
[0042] b)Aβ1-20；或
[0043] c)Aβ1-16；
[0044] 在本发明的另一个特定实施方案中，所述Aβ肽片段包含
[0045] a)4-20个氨基酸；
[0046] b)5-16个氨基酸；
[0047] c)6-12个氨基酸；或
[0048] d)4-8个氨基酸。
[0049] 在本发明的另一个特定实施方案中，所述Aβ肽片段是
[0050] a)Aβ1-15；
[0051] b)Aβ1-16；
[0052] c)Aβ1-5。
[0053] 在一个实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含含有抗原肽的抗原构建体，所述抗原肽是模仿tau蛋白，特别是人tau蛋白的主要病理磷酸表位的磷酸肽。
[0054] 在本发明的特定实施方案中，所述tau蛋白具有下述氨基酸序列同一性：
[0055] a)与SEQ ID NO：2至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：2的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：2的第18位氨基酸残基(P-Tyr18)的氨基酸残基是磷酸化的(T1)；
[0056] b)与SEQ ID NO：3至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：3的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：3的第212位(P-Thr212)和第214位(P-Ser214)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个是磷酸化的；
[0057] c)与SEQ ID NO：4至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：4的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：4的第202位(P-Ser202)和第205位(P-Thr205)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个是磷酸化的；
[0058] d)与SEQ ID NO：5至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：5的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：5的第396位(P-Ser396)和第404位(P-Ser404)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，但特别地所有，是磷酸化的；
[0059] e)与SEQ ID NO：6至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：6的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：6的第404位(P-Ser404)和第409位(P-Ser409)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，但特别地所有，是磷酸化的；
[0060] f)与SEQ ID NO：7至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：7的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：7的第202(P-Ser202)，205(P-Thr205)，212(P-Thr212)和214位(P-Ser214)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个，特别地至少3个，但特别地所有是磷酸化的。
[0061] 在另一个特定实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含具有下述氨基酸序列的tau蛋白
[0062] a)SEQ ID NO：2；
[0063] b)SEQ ID NO：3；
[0064] c)SEQ ID NO：4；
[0065] d)SEQ ID NO：5；
[0066] e)SEQ ID NO：6；或
[0067] f)SEQ ID NO：7。
[0068] 在另一个实施方案中，本发明涉及任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物，用于在患者中治疗疾病、病症或病症以克服或降低在所述患者中的免疫耐受，所述患者特别是动物或人患者，特别是需要T细胞非依赖性应答的患者，例如免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是免疫受损患者，特别是患有自身免疫疾病的患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4T细胞衰竭和/或CD4T细胞上的CD14和/或CD40L表达降低引起的T细胞缺陷，其中所述抗原以高度重复阵列呈递在脂质体的表面，其中所述患者患有由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病或病症。
[0069] 在另一个实施方案中，本发明涉及任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物，用于在患者中治疗疾病、病症或病症以克服或降低在所述患者中的免疫耐受，所述患者特别是动物或人患者，特别是需要T细胞非依赖性应答的患者，例如免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是免疫受损患者，特别是患有自身免疫疾病的患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4 T细胞衰竭和/或CD4 T细胞上的CD14和/或CD40L的表达降低引起的T细胞缺陷，其中所述抗原以高度重复阵列呈递在脂质体的表面，其中所述患者患有由tau或tau样蛋白引起的或与之相关的疾病或病症。
[0070] 在本发明的特定实施方案中，淀粉状蛋白相关疾病或病症的特征在于，在个体，特别是动物或人中认知记忆能力的丧失。
[0071] 在本发明的另一个特定实施方案中，所述疾病或病症是例如神经学疾病或病症，特别是淀粉样变组的疾病或病症，特别是选自阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、黄斑变性和青光眼的疾病或病症。
[0072] 在一个特定实施方案中，所述疾病是阿尔茨海默病。
[0073] 在本发明的另一个特定实施方案中，所述tau相关疾病或病症是神经变性病症，特别是由神经原纤维病变的形成引起或与之相关的神经变性疾病或病症。
[0074] 在本发明的特定实施方案中，神经变性疾病或病症是tau蛋白病，特别地选自阿尔茨海默病、克雅氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann- -Scheinker病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症/关岛帕金森痴呆综合征、非关岛型运动神经元疾病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆(argyrophilic grain dementia)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、与17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆症、哈-斯二氏病、多系统萎缩症、尼曼-皮克病C型、皮克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结痴呆(dementia with only tangles)、脑炎后帕金森综合症、强直性肌营养不良。
[0075] 在本发明的特定实施方案中，所述神经变性病症是阿尔茨海默病。
[0076] 在本发明的一个方面，任一前述实施方案的抗原组合物没有显示任何不良炎症效应。
[0077] 在一个实施方案中，本发明涉及使用根据任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物制备药物的方法，所述药物用于在治疗疾病、病况或病症时在患者，特别是动物或人患者，特别是需要T细胞非依赖性应答的患者中诱发T细胞非依赖性免疫应答，其中所述抗原呈递在脂质体表面，特别是以高度重复的阵列形式。
[0078] 在本发明的一个实施方案中所述抗原组合物作为免疫刺激剂起作用。
[0079] 在一个实施方案中，本发明涉及使用根据任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物制备药物的方法，所述药物用于治疗免疫耐受患者或T细胞活化患者以克服或降低所述患者中的免疫耐受或避免所述患者中T细胞应答的过度刺激，所述患者特别是动物或人患者，特别是免疫受损患者，特别是患有自身免疫疾病的患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4T细胞衰竭和/或CD4T细胞上的CD14和/或CD40L表达降低引起的T细胞缺陷，其中所述抗原以高度重复的阵列呈递在脂质体表面。
[0080] 本发明也包含在治疗疾病、病况或病症时在患者，特别是动物或人患者，特别是需要T细胞非依赖性应答的患者中诱发T细胞非依赖性免疫应答的方法，其中所述抗原呈递在脂质体表面，特别是以高度重复的阵列形式。在本发明的一个实施方案中，所述抗原组合物作为免疫刺激剂起作用。
[0081] 本发明也包含在治疗患者的疾病或病症时用于在免疫耐受患者中克服或降低免疫耐受或在T细胞活化患者中避免T细胞应答的过度刺激的方法，其中所述患者特别是动物或人患者，特别是免疫受损患者，特别是患有自身免疫疾病的患者，特别是患有T细胞缺陷的患者，特别是由在所述患者中的CD4T细胞衰竭和/或CD4T细胞上的CD14和/或CD40L表达降低引起的T细胞缺陷，所述方法包括对所述患者施用根据任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物，其中所述抗原以高度重复阵列呈递在脂质体的表面；和任选地另一个步骤，即通过测量IgG和/或IgM的抗体浓度，确定所述个体中的免疫应答。
[0082] 本发明在另一个实施方案中还涉及在免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是动物或人中治疗、减轻症状、或预防疾病或病症，特别是淀粉状蛋白或tau蛋白相关疾病或病症的方法，其中所述患者患有T细胞缺陷，特别是由T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭引起的T细胞缺陷，例如免疫受损患者或具有自身免疫疾病的患者，所述方法包括对所述患者施用根据任一前述实施方案的包含经修饰的抗原的抗原组合物，其中所述抗原以高度重复的阵列呈递在脂质体的表面，其中在治疗的患者中诱发T细胞非依赖性免疫应答。
[0083] 本发明因此还涉及，在个体中，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人，例如免疫受损患者或具有自身免疫疾病的患者中，用于在免疫耐受患者或T细胞活化患者中诱发T细胞非依赖性免疫应答的方法，尤其是用于在这样的免疫耐受患者或T细胞活化患者中治疗、减轻症状，延缓疾病或病症的发作、或预防疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症是由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病或病症，包括淀粉样变(与淀粉状蛋白有关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与之相关的疾病或病症，包括tau蛋白病，所述方法包括以下步骤：(a)对所述个体施用抗原构建体，特别是包含T非依赖性抗原的抗原构建体；和(b)在所述个体中确定免疫应答，特别地通过测量IgG的抗体浓度来确定免疫应答。
[0084] 在本发明的特定实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的老年人患者，特别是免疫受损患者或具有自身免疫疾病的患者。
[0085] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的免疫抑制人患者。
[0086] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的且患有免疫缺陷疾病，特别是患有HIV的人患者。
[0087] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是人患者，其患有癌症或另外的恶性肿瘤且是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的。
[0088] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的且患有自身免疫疾病的人患者。
[0089] 本发明还在另一个实施方案中涉及在个体中诱发T细胞非依赖性免疫应答，特别是Aβ免疫应答或tau相关免疫应答的方法，所述个体特别是动物或人，特别是需要这样的T细胞非依赖性Aβ免疫应答的个体，特别是免疫耐受个体或T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的患者，例如免疫受损患者或具有自身免疫疾病的患者，所述方法包括以下步骤(a)对所述个体施用抗原构建体，特别是Aβ或tau相关抗原构建体，特别是包含T非依赖性抗原的Aβ或tau相关抗原构建体；和(b)在所述个体中测定免疫应答，特别地是通过测量IgG的抗体浓度来测定免疫应答。
[0090] 在另一个实施方案中，本发明涉及根据前述实施方案的方法，其中所述Aβ或tau相关抗原在体内在T辅助细胞缺乏时诱发抗体应答。
[0091] 在本发明的另一个实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的方法，其中Aβ或tau相关免疫应答是IgG应答。
[0092] 在如本文描述的一个实施方案中提供了根据任一前述实施方案的方法，其中免疫耐受个体或患者或T细胞活化患者，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人不显示任意不良炎症效应。
[0093] 在本发明的另一个实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的方法，其中免疫耐受个体或患者，特别是动物或人是T细胞衰竭的，特别是CD4T细胞衰竭的，例如免疫受损患者或具有自身免疫疾病的患者。
[0094] 在另一个实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的方法，其中所述Aβ抗原构建体包含单个或重复的来源于Aβ肽N-端的Aβ肽片段。
[0095] 在本发明的另一个实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的方法，其中所述Aβ肽N-端包括Aβ1-30；Aβ1-20；或Aβ1-16。
[0096] 在另一个实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的方法，其中Aβ肽片段包含4-20个氨基酸；5-16个氨基酸；6-12个氨基酸；或4-8个氨基酸。
[0097] 特别地，本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中所述Aβ肽片段是Aβ1-15；Aβ1-16；或Aβ1-5。
[0098] 在一个实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案的方法，其中抗原组合物包含含有抗原肽的抗原构建体，所述抗原肽是模仿tau蛋白，特别是人tau蛋白的主要病理磷酸表位的磷酸肽。
[0099] 在本发明的特定实施方案中，所述tau蛋白具有下述氨基酸序列同一性：
[0100] a)与SEQ ID NO：2至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：2的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：2的第18位氨基酸残基(P-Tyr18)的氨基酸残基是磷酸化的(T1)；
[0101] b)与SEQ ID NO：3至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：3的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：3的第212位(P-Thr212)和第214位(P-Ser214)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个是磷酸化的；
[0102] c)与SEQ ID NO：4至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：4的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：4的第202位(P-Ser202)和第205位(P-Thr205)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个是磷酸化的；
[0103] d)与SEQ ID NO：5至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：5的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：5的第396位(P-Ser396)和第404位(P-Ser404)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，但特别地所有，是磷酸化的；
[0104] e)与SEQ ID NO：6至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：6的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：6的第404位(P-Ser404)和第409位(P-Ser409)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，但特别地所有，是磷酸化的；
[0105] f)与SEQ ID NO：7至少95％序列相同，并与SEQ ID NO：7的所述抗原肽具有基本上相同的免疫原性活性，其中对应SEQ ID NO：7的第202(P-Ser202)，205(P-Thr205)，212(P-Thr212)和214位(P-Ser214)氨基酸残基的氨基酸残基中至少1个，特别地至少2个，特别地至少3个，但特别地所有是磷酸化的。
[0106] 在另一个特定实施方案中，本发明的和如本文描述的抗原组合物包含具有下述氨基酸序列的tau蛋白：
[0107] a)SEQ ID NO：2；
[0108] b)SEQ ID NO：3；
[0109] c)SEQ ID NO：4；
[0110] d)SEQ ID NO：5；
[0111] e)SEQ ID NO：6；或
[0112] f)SEQ ID NO：7。
[0113] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中抗原，特别是Aβ或tau肽抗原，在载体例如小泡(vesicle)、微粒体(particulate body)或分子中重构而呈递。
[0114] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中抗原，特别是Aβ或tau肽抗原，在脂质体中重构而呈递。
[0115] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中抗原，特别是Aβ或tau肽抗原，被便于插入脂质体载体/佐剂的脂质双层的亲脂性或疏水性部分修饰。
[0116] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中亲脂性或疏水性部分的大小(dimension)与抗原肽及载体/佐剂(肽所连接、掺入或于其中重构的载体/佐剂)的总净电荷组合起来导致：抗原肽以高度生物活性的构象被暴露、稳定和呈递，这允许处于暴露的、稳定的和高度生物活性的构象中的该抗原构建体含有的抗原决定簇与靶生物的免疫系统自由地相互作用，导致强免疫应答。
[0117] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中亲脂性或疏水性部分是脂肪酸，甘油三酯或磷脂，特别是具有至少10个碳原子的碳骨架的脂肪酸，特别是棕榈酸。
[0118] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中抗原，特别是Aβ或tau肽抗原，包含2个棕榈酸部分，特别地4个棕榈酸部分。
[0119] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中脂质体制剂包含佐剂，特别是脂质A，特别是脱毒的脂质A，例如单磷酰或二磷酰脂质A，或铝佐剂。
[0120] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中淀粉状蛋白相关疾病或病症选自由包括但不限于下述的疾病组成的组：神经学病症，例如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；以及其他基于类淀粉状蛋白或与其相关的疾病，例如进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、所有眼疾病和其他，包括黄斑变性和青光眼，但特别是阿尔茨海默病。
[0121] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中淀粉状蛋白相关病症的特征为个体，特别是免疫耐受个体或患者或T细胞活化患者，特别是动物或人中的认知记忆能力的丧失。
[0122] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中对患有以认知记忆能力丧失为特征的淀粉状蛋白相关病症的免疫耐受个体或患者或T细胞活化患者，特别是动物或人的治疗导致认知记忆能力保留的增加，特别是认知记忆能力的完全恢复。
[0123] 在本发明的另一个特定实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中tau相关疾病或病症是神经变性疾病，特别是由神经原纤维病变的形成引起或与其相关的神经变性疾病或病症，特别是tau蛋白病，特别是选自以下的tau蛋白病：阿尔茨海默病、克雅氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann- -Scheinker病、包涵体肌炎，和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症/关岛帕金森痴呆综合征、非关岛型运动神经元疾病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、与17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆症、哈-斯二氏病、多系统萎缩症、尼曼-皮克病C型、皮克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结痴呆、脑炎后帕金森综合征、强直性肌营养不良，但特别是阿尔茨海默病。
[0124] 本发明在另一个实施方案中涉及抗原，特别是如任一前述实施方案中描述的Aβ肽抗原或tau肽抗原在个体，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人中诱发T细胞非依赖性免疫应答(特别是Aβ相关的或tau相关的免疫应答)的用途。
[0125] 本发明在另一个实施方案中涉及在个体，特别是免疫耐受个体或患者或T细胞活化患者中治疗、减轻症状、或预防疾病或病症，特别是淀粉状蛋白或tau蛋白相关疾病或病症的方法，包括对所述患有这样的疾病或病症的个体或患者，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人施用如在任一前述实施方案中所述的抗原构建体，特别是Aβ或tau抗原构建体，或包含所述抗原构建体的T细胞非依赖性抗原组合物，其中在治疗的个体中诱发T细胞非依赖性免疫应答，特别是Aβ或tau免疫应答。
[0126] 在本发明的特定实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的老年人患者。
[0127] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的免疫抑制人患者。
[0128] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的且患有免疫缺陷疾病，特别是患有HIV的人患者。
[0129] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是人患者，其具有癌症或另外的恶性肿瘤且是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的。
[0130] 在本发明的另一个实施方案中，所述个体是展示T细胞活化的人患者且其中T细胞应答的再刺激将导致医学危险。
[0131] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中没有诱发不良炎症效应。
[0132] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中施用所述抗原，特别是Aβ或tau抗原构建体，主要导致非炎症性亚型，特别是非炎症性Th2亚型，特别是IgG1和IgG2b同种型，的抗体的产生。
[0133] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中施用所述Aβ抗原构建体主要导致T细胞非依赖性IgG亚型，特别是IgG3同种型的抗体的产生。
[0134] 本发明在另一个实施方案中涉及根据前述实施方案的方法，其中施用所述Aβ抗原构建体不导致脑中炎症标记物，特别是选自IL-1β，IL-6，IFN-γ和TNFα的标记物的显著增加。
[0135] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中施用所述Aβ抗原构建体导致脑中不溶性的斑块相关Aβ1-40和Aβ1-42的显著减少。
[0136] 本发明在另一个实施方案中涉及根据实施方案(49)的方法，其中施用所述Aβ抗原构建体导致脑中可溶性Aβ1-42水平的显著减少。
[0137] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的方法，其中淀粉状蛋白相关疾病或病症选自由包括但不限于下述的疾病组成的组：神经学病症，例如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；以及其他基于类淀粉状蛋白或与其相关的疾病，例如进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、所有眼疾病和其他，包括黄斑变性和青光眼，但特别是阿尔茨海默病。
[0138] 本发明在另一个实施方案中涉及根据任一前述实施方案的用于在个体，特别是免疫耐受个体或患者，或T细胞活化患者中治疗、减轻症状、或预防疾病或病症，特别是tau蛋白相关疾病或病症的方法，其中所述tau相关疾病或病症是神经变性疾病，特别是由神经原纤维病变的形成引起或与其相关的神经变性疾病或病症，特别是tau蛋白病，特别是选自以下的tau蛋白病：阿尔茨海默病、克雅氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann- -Scheinker病、包涵体肌炎，和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症/关岛帕金森痴呆综合征、非关岛型运动神经元疾病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节退化、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、与17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆症、哈-斯二氏病、多系统萎缩症、尼曼-皮克病C型、皮克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结痴呆、脑炎后帕金森综合征、强直性肌营养不良，特别是阿尔茨海默病。
[0139] 其他方法、候选物、化合物和细节在PCT/EP2006/011861(以WO2007/068411公开)和在2009年4月3日提交的EP专利申请09157303.0中描述，其公开以其整体引入本文作为参考。
[0140] 发明详述
[0141] 本发明在特定实施方案中也考虑可在个体，特别是动物或人中避免T细胞免疫缺陷疾病。可在疾病发作前对这样的个体接种疫苗，或在患有疾病或病症的情况下，可通过本文描述的方法治疗所述个体。在一个实施方案中，疾病是淀粉状蛋白相关疾病。在另一个实施方案中，疾病是tau蛋白相关疾病。这样的疾病可为例如迪乔治综合征(Di George′s syndrome)、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、或慢性粘膜皮肤念珠菌病。
[0142] 根据本发明的超分子抗原构建体或包含这样的抗原构建体的抗原组合物可用于制备疫苗组合物，用于在个体，特别是免疫耐受个体或患者，或T细胞活化患者，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人中诱发T细胞非依赖性免疫应答。在一个实施方案中，超分子抗原构建体用于在个体(特别是免疫耐受个体或患者、或T细胞活化患者)，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人中预防、治疗淀粉样变、或减轻淀粉样变的效应的方法中，所述淀粉样变(与淀粉状蛋白斑块形成相关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变和年龄相关的淀粉样变)包括但不限于，神经学病症，例如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；以及其他基于类淀粉状蛋白或与其相关的疾病，例如进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、所有眼疾病和其他，包括黄斑变性和青光眼，但特别是以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)，所述方法包括对所述个体施用根据本发明的超分子抗原构建体，但特别是对患有该病症并因此需要这样的治疗的动物，特别是哺乳动物或人施用包含根据本发明的超分子抗原构建体的疫苗组合物。
[0143] 在本发明的另一个实施方案中提供了制备药物的方法，所述药物用于在个体(特别是免疫耐受个体或患者，或T细胞活化患者)，特别是动物或人，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)衰竭的动物或人中预防、治疗或减轻淀粉样变的效应，所述淀粉样变(与淀粉状蛋白斑块形成相关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变和年龄相关的淀粉样变)包括但不限于，神经学病症，例如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；以及其他基于类淀粉状蛋白或与其相关的疾病，例如进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、所有眼疾病和其他，包括黄斑变性和青光眼，但特别是以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)，所述方法包括以可药用的形式配制根据本发明的抗体。
[0144] 在特定的实施方案中，本发明利用抗原呈递作用，其导致优选抗原构象的增强的暴露和稳定化，最终导致高度特异的免疫应答和导致具有独特特性的抗体的产生。
[0145] 本发明提供了T细胞非依赖性免疫原性组合物和包含所述免疫原性组合物的治疗性疫苗组合物，其中所述组合物含有使用抗原肽的超分子构建体，用于在具有T细胞缺陷的免疫耐受患者，特别是CD4T细胞衰竭的患者中治疗、减轻病症，延缓疾病和病症的发作、或预防疾病和病症，特别是由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与所述蛋白相关的疾病和病症，包括淀粉样变(与淀粉状蛋白相关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与其相关的疾病和病症，包括tau蛋白病。所述抗原肽可包括，但不限于，淀粉状或类淀粉状蛋白，例如朊蛋白、tau蛋白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白等等。在一个实施方案中，本发明提供了包含超分子抗原构建体，特别是包含下述肽抗原的抗原构建体，的免疫原性组合物，所述肽抗原来源于淀粉状蛋白或类淀粉状蛋白例如朊蛋白、tau蛋白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白等等，特别是根据本发明的和如本文前述的代表β-淀粉状蛋白肽的N-端部分的β-淀粉状蛋白肽抗原或tau肽抗原，所述抗原肽经修饰使其能够维持和稳定抗原的确定构象，特别是以平衡比例的无规卷曲、α-螺旋和β-折叠部分为特征的构象。此确定的构象导致在引入动物或人后诱发强烈和高度特异的免疫应答，特别是T细胞非依赖性免疫应答。
[0146] 特别地，本发明的和如本文描述的抗原组合物可包含构象抗原，其中30％以上，特别地40％以上，特别地50％以上，特别地60％以上，特别地70％以上，特别地80％以上，特别地90％以上，特别地95％以上和多达100％是β-折叠构象。
[0147] 实现抗原肽的期望构象的形成和稳定化的一种方式是，呈递连接于、或掺入或重构(部分或全部地)在载体中的抗原肽，所述载体例如小泡、微粒体或分子、或任何其他可合适地充当抗原肽的载体/佐剂的手段。在本发明的特定实施方案中，抗原肽通过弱相互作用例如范德华、疏水或静电相互作用或所述相互作用的2种或多种的组合而连接于、掺入或重构在载体中，从而肽以特定构象被呈递，其中所述构象，由于所述抗原肽的三维移动自由度被限制以致防止或严重限制了构象变化，而得到维持和稳定。
[0148] 在本发明的特定实施方案中，抗原肽以高度重复的阵列呈递在载体分子的表面，特别地重复阵列包含至少10个重复抗原单位/载体分子，特别地至少50个重复抗原单位/载体分子，特别地至少100个重复抗原单位/载体分子，特别地至少200个重复抗原单位/载体分子，特别地至少300个重复抗原单位/载体分子，特别地至少400个重复抗原单位/载体分子，特别地至少500个重复抗原单位/载体分子。
[0149] 当使用小泡、颗粒体或微粒体例如脂质体作为载体/佐剂时，可选择抗原肽的组成使其总净电荷与肽所连接的载体/佐剂表面的总净电荷相同。在带相同电荷的载体/佐剂表面和抗原肽之间，但特别是在带相同电荷的载体表面和组成抗原肽的氨基酸残基之间，更特别地在带相同电荷的载体表面和抗原肽中包含的带相同电荷的氨基酸残基之间的有效静电排斥力可导致抗原肽采取确定的高度特异和稳定的构象，其中该构象保证高生物活性。作为结果，抗原肽以具有高度生物活性的构象暴露和呈递，从而允许靶生物的免疫系统与处于该生物活性构象的抗原构建体中含有的抗原决定簇自由地相互作用，导致强烈和构象特异性的免疫应答，引起例如在靶生物中的高抗体滴度。通过小心地协调抗原肽一方和肽所连接、掺入或重构入的载体另一方的总净电荷，抗原肽可以以这样的构象被呈递暴露在载体表面上或紧靠载体表面，其中所述构象通过在相同电荷的载体表面和抗原肽之间，但特别是在相同电荷的载体表面和组成抗原肽的氨基酸残基之间和更特别地在相同电荷的载体表面和抗原肽所包含的相同电荷的氨基酸残基之间的有效静电排斥力而被诱导和稳定。这导致抗原构建体被呈递以致其可以自由地被靶生物的免疫防御机器接近并因此能够在对动物或人施用后诱发强烈和高度特异的免疫原性应答。通过使用脂质体作为载体可进一步增强免疫原性应答，其中脂质体可充当佐剂以在将要使用根据本发明的治疗性疫苗治疗的靶动物或人中增强或刺激免疫应答。任选地，脂质体还可以包含另外的佐剂，例如脂质A、铝佐剂、磷酸钙、白介素1，和/或多糖微囊和蛋白质，但特别是脱毒的脂质A，例如单磷酰或二磷酰脂质A，或铝佐剂。
[0150] 在本发明的特定实施方案中，使用根据本发明的和如本文前述的抗原肽，特别是带有负总净电荷的抗原肽，在脂质体，特别是下述脂质体中重构，所述脂质体的成分经选择使得脂质体头部基团的总净电荷为负的。特别地，所述脂质体由选自下述的成分构成：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和胆固醇，和任选地还可以包含单磷酰脂质A或在本发明范围内可合适地使用的任何其他佐剂，例如铝佐剂、磷酸钙、白介素1，和/或多糖微囊和蛋白质。
[0151] 在本发明的另一个特定实施方案中，提供了根据本发明的和如本文前述的经修饰的肽抗原，其与能够插入载体/佐剂的锚定型分子共价结合，从而将肽固定在载体/佐剂上并将肽呈递在载体/佐剂分子的表面上或紧靠载体/佐剂分子的表面，由此如本文前述静电力可以生效。
[0152] 当使用脂质体作为载体/佐剂时，抗原肽构建体在其形成时通常具有插入脂质体膜的疏水性尾部。另外，可将抗原肽修饰为包含疏水性尾部从而使其能够插入脂质体。
[0153] 本发明的超分子抗原构建体通常可以包含经修饰的肽以增强抗原性效果，其中该肽可通过聚乙二醇化(使用聚乙二醇或经修饰的聚乙二醇)修饰，或通过其他方法修饰，例如如本文前述的棕榈酸，聚氨基酸(例如聚甘氨酸、聚组氨酸)，聚糖(例如聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚乙交酯、几丁质、壳聚糖)，合成聚合物(聚酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚酯)或共聚物(例如聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺)等等。
[0154] 在本发明的特定实施方案中，提供了根据本发明的和如本文前述的抗原肽，其经修饰以包含疏水性尾部从而所述肽可以插入脂质体。特别地，可通过亲脂性或疏水性部分修饰β-淀粉状蛋白肽以利于插入载体/佐剂的脂质双层。本发明的亲脂性或疏水性部分可为脂肪酸、甘油三酯和磷脂，特别是其中的脂肪酸碳骨架具有至少10个碳原子的脂肪酸、甘油三酯和磷脂，特别地亲脂性部分具有含至少约14个碳原子至不超过约24个碳原子的碳骨架的脂肪酸，更特别地疏水性部分具有至少14个碳原子的碳骨架。疏水性部分的实例包括但不限于棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和胆固醇或DSPE。在本发明的特定实施方案中疏水性部分是棕榈酸。
[0155] 棕榈酰化，由于C16:0脂肪酸部分的相对减少的长度，当为肽提供在脂质体双层中的锚时，导致肽被呈递暴露在脂质体表面上或紧靠脂质体表面。因此，加工抗原的细胞将不得不摄取携带该肽的整个脂质体。
[0156] 在本发明的另一个实施方案中，在制备超分子构建体时使用PEG，其中游离PEG端与磷脂酰乙醇胺分子(其中的脂肪酸可为：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等等或其组合)共价连接。此超分子结构可在由磷脂和胆固醇(各种摩尔比例的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、胆固醇)组成的脂质体中重构。可使用其他磷脂。可以以约40μg/pmol磷脂的浓度使用脂质A。
[0157] 在某些实施方案中，本发明的超分子抗原构建体包含如本文前述的抗原肽序列，其与聚乙二醇化赖氨酸共价连接——在每一端至少连接1个或特别地在每一端连接1或2个。PEG(聚乙二醇)链的长度可从n＝8变化至n＝150,000或更长，特别地从n＝10至n＝80,000，特别地从n＝10至n＝10,000。在本发明的特定实施方案中PEG链的长度不超过n＝45，特别地在n＝5和n＝40之间，更特别地在n＝10和n＝30之间，和甚至更特别地n＝10。
[0158] 可以在本发明的组合物中使用的脂质体包括本领域技术人员已知的那些。可使用可用于制备脂质体的任何标准脂质。可使用标准双层和多层脂质体制备本发明的组合物。尽管可使用本领域技术人员已知的任何制备脂质体的方法，但最优选的脂质体根据Alving等人，Infect.Immun.60：2438-2444，1992(在此引入作为参考)的方法制备。脂质体可任选地包含佐剂或免疫调节剂或二者。优选的免疫调节剂是脂质A，特别是脱毒的脂质A例如单磷酰或二磷酰脂质A。
[0159] 脂质体可具有双重功能，即其可用作包含如本文前述的超分子构建体的载体，和同时充当佐剂以在将要使用根据本发明的治疗性疫苗治疗的靶动物或人中增强或刺激免疫应答。任选地，脂质体还可以包含另外的佐剂或免疫调节剂或二者，例如脂质A、铝佐剂、磷酸钙、白介素1，和/或多糖微囊和蛋白质，但特别是脂质A，更特别是脱毒的脂质A例如单磷酰或二磷酰脂质A，或铝佐剂。
[0160] 包含根据本发明和如本文前述的超分子抗原构建体的本发明免疫原性组合物和/或治疗性疫苗可制备为液体溶液，或可注射的悬浮液形式，或适于在注射前溶解的固体形式，于例如应用本发明组合物的试剂盒中，见下述。
[0161] 对人或动物，特别是对患有淀粉状蛋白或tau相关疾病的人或动物施用包含超分子抗原构建体的本发明免疫原性组合物和/或治疗性疫苗，在所述人或动物中诱发免疫应答以减轻与疾病相关的症状或恢复成存在于未患有疾病的健康个体中的状况。
[0162] 可以通过任意适当的标准施用途径，对人或动物施用本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗。通常，可通过局部、口服、直肠、鼻内或胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌内)途径施用组合物。另外，可将组合物掺入持续释放的基质例如可生物降解的聚合物，将聚合物植入期望递送的位置的附近，例如肿瘤位置的附近。方法包括单个剂量的施用，以预定时间间隔的重复剂量的施用，和预定一段时间的持续施用。
[0163] 特别地，根据本发明的抗原肽通过胃肠外，特别是通过腹膜内、静脉内、皮下和肌肉内注射施用。
[0164] 组合物的剂量将取决于待治疗的病况，使用的具体组合物，和其他临床因素例如患者的体重、大小和状况，体表面积，待施用的具体化合物或组合物，并行施用的其他药物，和施用途径。
[0165] 根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗可与其他生物活性物质和用于治疗疾病的程序组合施用。该其他生物活性物质可为以混合物的形式已经包含根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗的相同组合物的部分，其中治疗性疫苗和其他生物活性物质混入相同的可药用溶剂和/或载体中、或与相同的可药用溶剂和/或载体混合，或治疗性疫苗和其他生物活性物质可分开地作为分开的组合物的部分提供，所述分开的组合物可分开地提供或以成套试剂盒的形式一起提供。
[0166] 根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗可与其他生物活性物质(一种或多种)间断地或相继地并行施用。例如，根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗可与第一另外的生物活性物质同时施用，或在所述组合物施用之后或之前相继施用。如果选择了下述应用方案，即一种以上的另外生物活性物质与至少一种根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗共同施用，则该化合物或物质可以以多种组合形式部分同时施用，部分相继施用。
[0167] 本发明的另一个目的是提供根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗和任选地一种或多种其他生物活性物质的混合物，以及使用这样的根据本发明的组合物或其混合物在免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是具有T细胞缺陷的患者，特别是CD4T细胞衰竭的患者中预防和/或治疗如本文前述的淀粉样变(与淀粉状蛋白斑块形成相关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变和年龄相关的淀粉样变)或tau蛋白病(由神经原纤维病变的形成引起或与其相关的tau-相关神经变性疾病或病症)和/或减轻淀粉样变或tau蛋白病的效应的方法。
[0168] 除了根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗以外，根据本发明的混合物可包含生物活性物质，例如在淀粉样变(与淀粉状或类淀粉状蛋白(例如涉及阿尔茨海默病的Aβ蛋白)相关的一组疾病或病症)的药物治疗中使用的已知化合物，包括针对促淀粉样变肽抗原产生的抗体，特别是针对以超分子抗原构建体形式呈递的促淀粉样变抗原产生的抗体，更特别地根据本发明的和如本文描述的抗体。
[0169] 在本发明的另一个实施方案中，其他生物活性物质或化合物也可为治疗剂，所述治疗剂可用于治疗由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病和病症，包括由淀粉状蛋白β引起的淀粉样变，或tau相关神经变性疾病或病症，包括tau蛋白病，或可用于其他神经学病症的药物治疗。其他生物活性物质或化合物可通过与根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗相同或相似的机制或通过不相关的作用机制或通过多种相关和/或不相关的作用机制，施加其生物效应。
[0170] 通常，其他生物活性化合物可包括神经元传递增强剂(neutron-transmission enhancers)、精神障碍治疗药、乙酰胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻断剂、生物胺、苯并二氮杂镇静剂、乙酰胆碱合成、储存或释放增强剂、乙酰胆碱突触后受体激动剂、单胺氧化酶A或B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾体抗炎药、抗氧化剂和5-羟色胺能受体拮抗剂。
[0171] 特别地，根据本发明的混合物可包含至少一种选自下述的其他生物活性化合物：对抗氧化胁迫的化合物，抗凋亡化合物，金属螯合剂，DNA修复抑制剂例如pirenzepin和代谢物3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1，3-丙二磺酸(1，3PDS)，分泌酶激活剂，β-和γ-分泌酶抑制剂，tau蛋白，神经递质，β-折叠破坏剂，抗炎症分子，或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)例如他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏，和其他药物和营养补充剂，以及根据本发明的治疗性疫苗和任选地可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
[0172] 在另一个实施方案中，根据本发明的混合物可包含烟酸或美金刚和根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗，和任选地可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
[0173] 在本发明的另一个实施方案中提供了混合物，其包含“非典型抗精神病药物”，例如用于治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉、妄想、思维紊乱(表现为明显的无条理、出轨、言不及义(tangeniality))和古怪或错乱的行为、以及快感缺乏、情感单调、冷淡、和社交退缩，的药物，例如，氯氮平、齐拉西酮(ziprasidone)、利哌利酮(risperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)或奥氮平，连同根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗，和任选地可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂，用于在免疫耐受患者或T细胞活化患者，特别是具有T细胞缺陷的患者，特别是CD4T细胞衰竭的患者中治疗、减轻症状、或预防由淀粉状或类淀粉状蛋白引起的或与之相关的疾病和病症，包括淀粉淀粉样变(与淀粉状蛋白相关的一组病症和异常，例如阿尔茨海默病)，或由tau蛋白引起的或与其相关的疾病和病症，例如由神经原纤维病变引起的或与其相关的tau相关神经变性疾病或病症，包括tau蛋白病。
[0174] 在本发明的特定实施方案中，根据本发明的和如本文前述的组合物和混合物以治疗或预防有效量包含根据本发明的免疫原性组合物和生物活性物质。
[0175] 合适在混合物中与根据本发明的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗组合使用的其他化合物已有描述，例如在WO 2004/058258中(特别见第16和17页)，包括治疗性药物靶(第36-39页)，烷基磺酸和烷醇硫酸(第39-51页)，胆碱酯酶抑制剂(第51-56页)，NMDA受体拮抗剂(第56-58页)，雌激素(第58-59页)，非甾体抗炎药(第60-61页)，抗氧化剂(第61-62页)，过氧化物增殖物激活受体(PPAR)激动剂(第63-67页)，降胆固醇剂(第68-75页)、淀粉状蛋白抑制剂(第75-77页)，淀粉状蛋白形成抑制剂(第77-78页)，金属螯合剂(第78-79页)，抗精神病和抗抑郁剂(第80-82页)，营养补充剂(第83-89页)和提高生物活性物质在脑中的可得性的化合物(见第89-93页)和前体药物(第
93和94页)，所述文件引入本文作为参考，但特别引入在上面指示的页中提及的化合物。
93和94页)，所述文件引入本文作为参考，但特别引入在上面指示的页中提及的化合物。
[0176] 早就知道用正常宿主蛋白质免疫接种动物或人宿主可导致针对所述宿主蛋白质的自身抗体的产生，引起统称为自身免疫病症的疾病。Aβ及其APP前体蛋白就是这样的正常蛋白质。在接种中使用这些宿主蛋白质因此具有产生不期望的副作用的可能。在文献中有一些证据显示Aβ可激活神经炎症反应，这可能部分是由补体系统的过度激活引起的(在患有阿尔茨海默病或其他神经变性疾病的患者中补体系统已经高度活化)。
[0177] 处于β-折叠构象的人Aβ是人补体系统的强有力的激活剂。其强烈结合人补体C1q的胶原尾部。补体系统的过度激活可导致宿主的天然防御系统转向并导致对细胞和组织(包括神经元及其突起)的自身破坏。例如，膜攻击复合物(MAC)是宿主天然防御系统的一部分并通过将其自身插入细菌和病毒中而保护宿主对抗入侵的细菌和病毒，在过度激活时其可将自身插入宿主细胞并导致自身破坏。过度激活可进一步导致刺激小神经胶质细胞产生有毒化合物例如氧自由基和有害蛋白酶。
[0178] 因此本发明的另一个目的是，防止由使用自身抗原(具有进一步刺激已经过度激活的补体系统的潜能)免疫接种患有自身免疫疾病的动物或人所导致的可能副作用，例如神经学并发症。这在本发明的范围内可以通过施用Aβ肽抗原，特别是棕榈酰化的Aβ肽抗原，更特别地棕榈酰化的Aβ1-15肽抗原，但特别是棕榈酰化的Aβ1-15肽抗原(ACI-24，Aβ1-15)，以及补体抑制剂，而实现。
[0179] 因此本发明的另一个实施方案提供了疫苗组合物，除了Aβ肽抗原，特别是根据本发明的和如本文前述的Aβ肽抗原以外，其还包含补体系统抑制剂。
[0180] 补体抑制剂可为选自下述的化合物：可溶性人补体受体1，抗人补体蛋白C5例如人源化的抗C5单克隆抗体或人源化单克隆抗体的单链片段，C1酯酶抑制剂-N和天然人C1抑制剂。
[0181] 可遵循Nicolau et.al.(2002)Proc Natl.Acad.Sci USA 99，2332-2337中报导的方法，合成经修饰的淀粉状蛋白肽抗原例如淀粉状蛋白β1-15肽。在Nicolau等人中报导的方法可被修改，首先合成抗原肽，然后通过在树脂上嫁接亲脂性或疏水性部分至该预形成的肽的末端氨基酸残基上而进一步修饰所述抗原肽。具体地，使用已知偶联化学，将受保护的氨基酸，特别是受Fmoc保护的氨基酸，连接至树脂。去除保护基并偶联第二受保护的氨基酸残基。然后使用标准自动化肽合成，使用已知保护化学，特别是Fmoc/tBu化学，和标准侧链保护基，合成Aβ抗原肽，特别是Aβ1-15抗原肽(通过偶联上淀粉状蛋白Aβ1-42的第1位至15位氨基酸，产生具有给定序列的肽片段)。在最后一步中将2个另外的受保护氨基酸偶联至生长的肽片段上。然后可选择性断裂Mtt基团并偶联棕榈酸。在洗涤树脂后，去除保护基并同时切下树脂，接着使用标准方法进行侧链去保护。然后可得到高纯度的终产物，可以通过本领域已知的方法例如电喷射质谱确认其身份。
[0182] 根据本发明的亲脂性或疏水性部分可为脂肪酸、甘油三酯或磷脂，其中脂肪酸碳骨架具有至少10个碳原子。特别地，亲脂性或疏水性部分是具有至少约14个碳原子至最多约24个碳原子(落入此范围内的每个碳原子数也是本发明的一部分)的碳骨架的脂肪酸。更特别地，亲脂性或疏水性部分具有至少14个碳原子，但特别是16个碳原子的碳骨架。疏水性部分的实例包括但不限于棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。在本发明的特定实施方案中亲脂性或疏水性部分是棕榈酸。
[0183] 然后可如Nicolau等人，2002中描述的，制备根据本发明的脂质体抗原。可在由脂质体组成的构建体中重构经修饰的淀粉状蛋白Aβ抗原肽，特别是经修饰的Aβ1-15抗原肽，所述脂质体特别由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和胆固醇组成，任选地包含单磷酰脂质A。
[0184] 在本发明的特定实施方案中使用具有脂质A的脂质体作为佐剂制备抗淀粉状蛋白疫苗。混合二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和胆固醇，特别地以0.9∶1.0∶0.7的摩尔比例。然后以合适的浓度加入强免疫调节剂例如单磷酰脂质A，特别地以30-50mg/mmol，更特别地以40mg/mmol磷脂的浓度。然后以1∶30和1∶200之间的肽和磷脂的摩尔比例，特别地以1∶50和1∶120之间的摩尔比例，更特别地以1∶100，加入经修饰的抗原Aβ肽。去除溶剂，例如通过蒸发，并用无菌缓冲溶液例如PBS水合得到的薄膜。
[0185] 也可通过如在Wagner等人(2002)Journal of Liposome Research Vol 12(3)，pp 259-270中描述的交叉流注射(crossflow injection)技术，制备脂质体。在将脂质溶液注射至水性缓冲体系的过程中，脂质倾向于形成“沉淀”，接着自我排列成小泡。得到的小泡大小取决于例如脂质浓度、搅拌速度、注射速度和脂质的选择等因素。该制备体系可由交叉流注射模块、用于极性相(例如PBS缓冲溶液)的容器、乙醇/脂质溶液容器和压力装置，但特别是氮气压力装置组成。当将水性或极性溶液泵过交叉流注射模块时，将乙醇/脂质溶液注射至该极性相中，其间可以应用变化的压力。
[0186] 为了测定经修饰的Aβ抗原构建体的免疫原性，可以使用抗原肽免疫选自小鼠、大鼠、兔、猪、鸟等的合适动物，但特别是小鼠，特别是C57BL/6小鼠。通过使用免疫测定试验例如ELISA测定试验，在免疫后以合适时间间隔检测血清样品，测定抗原构建体的免疫原性。
[0187] 可以使用经修饰的抗原构建体，特别是棕榈酰化的抗原构建体，和更特别地棕榈酰化的Aβ1-15构建体或棕榈酰化的Tau5-20[pY18]免疫免疫耐受动物或人患者或T细胞活化患者，所述患者患有与淀粉样变(与淀粉状蛋白斑块形成相关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变和年龄相关淀粉样变)或任何其他淀粉状蛋白相关疾病相关的症状，或与tau蛋白病(由tau蛋白引起的或与其相关的、以及由神经原纤维病变的形成引起的或与其相关的一组疾病和病症)相关的症状，其中所述动物，特别地所述哺乳动物或人，具有T细胞缺陷，特别是CD4T细胞缺陷。
[0188] 可以通过任何合适的标准施用途径，对动物，特别是哺乳动物或人，施用根据本发明的超分子抗原构建体，特别是本发明的包含该超分子抗原构建体的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗。通常，组合物可通过局部、口服、直肠、鼻内或胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌肉内)途径施用，其中所述动物，特别是所述哺乳动物或人，具有T细胞缺陷，特别是CD4T细胞缺陷。另外，可将组合物掺入持续释放基质例如可生物降解的聚合物，将聚合物植入期望递送的位置例如肿瘤位置的附近。方法包括单个剂量的施用，以预定时间间隔的重复剂量的施用，和预定一段时间的持续施用。
[0189] 在本发明的特定实施方案中，根据本发明的抗原构建体，特别是包含所述抗原构建体的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗以可药用的形式以重复剂量，特别是以1-15个剂量，更特别地以2-10个剂量，更特别地以3-7个剂量和甚至更特别地以4-6个剂量，以1-10周的时间间隔，特别地1-6周的时间间隔，特别地1-4周的时间间隔，和甚至更特别地2-3周的时间间隔，施用。可以通过在加强后于合适时间，特别地加强后3-10天，更特别地加强后4-8天和更特别地加强后5-6天，采集血清样品，并使用已知方法，特别是通常使用的免疫测定试验之一，例如ELISA测定法，测定抗原构建体的免疫原性，从而监控免疫应答。
[0190] 使用可药用形式的根据本发明的抗原构建体，但特别是包含根据本发明的抗原构建体的免疫原性组合物和/或治疗性疫苗，进行免疫，在治疗的动物或人中导致显著和高度特异的T细胞非依赖性免疫应答。
[0191] 可以对免疫耐受的人或动物患者或T细胞活化患者，特别是T细胞(特别是CD4T细胞)基本耗竭的人或动物，施用本发明的超分子抗原构建体组合物，以诱发对抗原剂例如感染性生物或对其他病理状况例如β-淀粉状蛋白聚集(阿尔茨海默病)或过度增生性病症例如癌症的抗原方面的免疫。免疫的人或动物产生抗感染性生物的循环抗体，由此降低或失活其刺激疾病的能力。
[0192] 可以通过任何合适方式对人或动物施用本发明的组合物，优选通过注射。例如，通过皮下注射施用在脂质体中重构的经修饰的抗原肽。循环抗体(无论是内生的或从外部来源提供的)可以结合抗原并降低或失活其刺激疾病的能力。
[0193] 在某些实施方案中，超分子抗原构建体包含具有β-淀粉状蛋白的氨基酸序列的肽。所述肽也可包括或对应于整个淀粉状蛋白β肽及其活性片段。另外，可用于本发明的肽还包括Aβ。
[0194] 定义
[0195] 术语“个体，特别是动物或人，是T细胞缺陷的”，“T细胞缺陷的”，“基本上T细胞缺陷的”或“T细胞缺陷”，如本文使用的，指基本缺乏功能性T细胞的个体。
[0196] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”，如本文描述的，可互换使用并被定义为指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
[0197] 术语“肽”是氨基酸(通常是L-氨基酸)的链，氨基酸的α碳通过肽键连接，肽键由一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成。在链一端的末端氨基酸(即氨基端)具有游离的氨基，而链另一端的末端氨基酸(即羧基端)具有游离的羧基。由此，术语“氨基端”(简称N-端)指位于肽的氨基端的氨基酸上的游离α-氨基，或指肽内任何其他位置上的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基端”(简称C-端)指位于肽的羧基端的氨基酸上的游离羧基，或指肽内任何其他位置上的氨基酸的羧基基团。
[0198] 通常，顺序编号组成肽的氨基酸，从氨基端开始并朝肽的羧基端方向递增。因此，当称一个氨基酸“接着”另一个时，该氨基酸的位置比该前面的氨基酸更靠近肽的羧基端。
[0199] 本文使用的术语“残基”指通过酰胺键掺入肽的氨基酸。由此，氨基酸可为天然存在的氨基酸，或除非另有限制，可涵盖天然氨基酸的已知类似物，所述类似物以和天然存在的氨基酸类似的方式起作用(即氨基酸模拟物)。此外，酰胺键模拟物包括本领域技术人员熟知的肽骨架修饰。
[0200] 本文使用的措辞“基本上由...组成”排除可实质性地改变该措辞所述及的肽的基本性质的任何元素。因此，描述肽“基本上由...组成”，排除可实质性地改变该肽的生物活性的任何氨基酸取代、添加或缺失。
[0201] 此外，技术人员明了，如上所述，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常低于5％，更通常低于1％)的各个取代、缺失或添加可以是保守性修饰变异，其中这些改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。以下6组分别包含彼此为保守取代的氨基酸：
[0202] 1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
[0203] 2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
[0204] 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0205] 4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
[0206] 5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
[0207] 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
[0208] 措辞“分离的”或“生物纯的”指物质实质上或基本上不含在其天然状态中通常伴随其的成分。因此，本文描述的肽不含通常与其原位环境相关的物质。典型地，本文描述的分离的免疫原性肽为至少约80％纯，常常至少约90％，和优选至少约95％纯，如在银染凝胶上通过条带强度测量的。
[0210] 当免疫原性肽长度相对短时(即少于约50个氨基酸)，经常使用标准化学肽合成技术合成所述肽。
[0211] 固相合成是本文描述的免疫原性肽的优选化学合成方法，其中序列的C端氨基酸连接至不可溶的支持物，接着顺序加入序列中的其余氨基酸。固相合成的技术是本领域技术人员已知的。
[0212] 可选地，本文描述的免疫原性肽可使用重组核酸方法合成。大体上，这涉及生成编码肽的核酸序列，将所述核酸置于表达盒中处于特定启动子控制下，在宿主中表达肽，分离表达的肽或多肽和如果需要，使肽复性。在文献中可找到足以指导技术人员贯穿这些程序的技术。
[0213] 一旦表达了，可根据标准程序纯化重组肽，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等等。优选约50％至95％同质性，和最优选80％至95％或更高同质性的基本纯的组合物作为治疗剂。
[0214] 本领域技术人员将意识到在化学合成、生物表达或纯化后，免疫原性肽可能具有与组分肽的天然构象基本不同的构象。在这种情况下，经常有必要变性和还原该抗增殖肽和然后使所述肽重新折叠成优选的构象。还原和变性蛋白质和诱导重新折叠的方法是本领域技术人员熟知的。
[0215] 可确认纯化的蛋白质的抗原性，例如通过展示与免疫血清或与针对蛋白质自身产生的抗血清的反应。
[0216] 如本文描述的术语“一”和“所述(the)”被定义为指“一个或多个”并包括复数，除非上下文不恰当。
[0217] 如本文描述的术语“检测”指，使用检测生物分子的已知技术例如免疫化学或组织学方法，并涉及定性或定量测定研究中的生物分子的存在或浓度。
[0218] “分离”指生物分子不含其天然存在时与其在一起的至少一些成分。
[0219] 如本文描述的术语“抗体”是本领域公认的术语，应理解为指结合已知抗原的分子或分子的活性片段，特别是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的结合位点的分子。根据本发明的免疫球蛋白可为任何类型(IgG，IgM，IgD，IgE，IgA和IgY)或类别(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
[0220] 在本发明的范围内“抗体”旨在包括单克隆抗体、多克隆、嵌合、单链、双特异性、猿源化、人、人源化抗体及其活性片段。结合已知抗原的分子的活性片段的实例包括Fab和F(ab′)2片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和任何上述抗体和片段的表位结合片段。
[0221] 这些活性片段可通过多种技术从本发明的抗体得到。例如，可使用酶例如胃蛋白酶切割纯化的单克隆抗体，然后经HPLC凝胶过滤。然后可收集含有Fab片段的合适部分并通过膜过滤等等浓缩。有关分离抗体的活性片段的一般技术的描述，见例如Khaw，B.A.等人J.Nucl.Med.23：1011-1019(1982)；Rousseaux等人Methods Enzymology，121：663-69，Academic Press，1986。
[0222] “人源化抗体”指一种工程抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的CDR，所述分子的其余免疫球蛋白来源部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。另外，构架支持残基可被改变以保存结合亲和力。得到“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的。(见，例如Queen等人，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等人，Bio/Technoloy，9：421(1991))。
[0223] “人源化抗体”也可通过新的基因工程方法得到，该方法能够在大型动物例如兔中产生亲和力成熟的类人多克隆抗体(http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php)。
[0224] 术语“单克隆抗体”也是本领域中公认的，指这样的抗体，其可以在实验室中从单克隆大量产生并仅识别一个抗原。单克隆抗体通常通过正常短命的抗体生产B细胞和快速生长细胞例如癌细胞(有时被称为“永生”细胞)的融合而产生。得到的杂交细胞或杂交瘤迅速扩增，生成产生大量抗体的克隆。
[0225] “功能等同抗体”在本发明的范围内被理解为指这样的抗体，其与上述和本文描述的抗体基本共有至少一个主要功能性质，包括：针对β-淀粉状蛋白，特别是针对Aβ1-42蛋白和更特别地针对Aβ1-42蛋白的4-16表位区的结合特异性，体外免疫反应性，抑制Aβ1-42单体聚集成高分子聚合原纤维和/或解聚预先形成的Aβ1-42聚合原纤维，和/或β-折叠破坏性质、以及当预防性或治疗性施用时减轻以下病症的效应：与淀粉样变(与淀粉状蛋白斑块形成有关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变和年龄相关淀粉样变)相关的病症，包括，但不限于，神经学病症，例如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)；关岛帕金森痴呆综合征；以及其他基于类淀粉状蛋白或与其相关的疾病，例如进行性核上麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变；内分泌肿瘤、中风、创伤性脑损伤、所有眼疾病和其他，包括黄斑变性和青光眼。抗体可为任何类型例如IgG，IgM，或IgA等等或任何亚类例如IgG1，IgG2a等等和其他本文上述或本领域已知的亚类。此外，抗体可通过任何方法产生，例如噬菌体展示，或在任何能够产生具有期望特征的抗体(例如人源化抗体)的生物或细胞系中产生，包括细菌、昆虫、哺乳动物或其他类型的细胞或细胞系。抗体也可通过组合来自不同物种的Fab部分和Fc区形成。
[0226] 术语“抗原”指可在生物，特别是动物，更特别是哺乳动物包括人中诱发免疫应答的实体或其片段。此术语包括免疫原和负责免疫原性的区域或抗原决定簇。
[0227] 如本文描述的，术语“可溶的”指部分或完全溶解在水溶液中。
[0228] 如本文描述的，术语“免疫原性”指这样的物质，其引起或增强抗免疫原性剂的抗体、T细胞和其他反应性免疫细胞的产生并有助于人或动物中的免疫应答。当个体针对所施用的本发明免疫原性组合物产生足够的抗体、T细胞和其他反应性免疫细胞时，免疫应答发生，以缓解或减轻待治疗的病症。
[0229] 术语“杂交瘤”是本领域公认的术语，本领域普通技术人员理解其是指，通过抗体生产细胞和永生化细胞(例如多发性骨髓瘤细胞)的融合而产生的细胞。此杂交细胞能够产生抗体的连续供应。有关融合方法的详细描述见上文的“单克隆抗体”定义和下文的实施例。
[0230] 如本文描述的术语“载体”(carrier)指这样的结构，其中，抗原肽或超分子构建体可以掺入该结构中或可与该结构连接，由此将抗原肽或该肽的部分呈递或暴露给人或动物的免疫系统。可在动物或人治疗中合适地使用的任何颗粒，例如小泡(vesicle)、颗粒(particle)或微粒体(particulate body)，均可在本发明中使用作为载体。
[0231] 术语“载体”还包括递送方法，其中包含抗原肽的超分子抗原构建体组合物可通过递送机制被运输到期望的位点。这样的递送系统的一个实例利用胶体金属，例如胶体金。
[0232] 在本发明的超分子抗原构建体组合物中可使用的载体蛋白质包括但不限于麦芽糖结合蛋白“MBP”；牛血清白蛋白“BSA”；匙孔血蓝蛋白“KLH”；卵白蛋白；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；同基因细胞；具有la抗原的同基因细胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。
[0233] 在根据本发明的超分子抗原构建体中，脂质体可具有双重功能，即，其可被用作如本文前述的包含超分子构建体的载体，并同时起到佐剂的作用以增强或刺激使用根据本发明的治疗性疫苗治疗的靶动物或人中的免疫应答。也应当理解，本发明的超分子抗原构建体组合物还可包含另外的佐剂，包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和其他佐剂例如脂质A、铝佐剂、磷酸钙、白介素1和/或多糖微囊和蛋白质，但特别是脱毒的脂质A，例如单磷酰或二磷酰脂质A，或铝佐剂，并还可以包含疫苗现有技术中已知的和使用的其他防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂和其他成分。此外，在本发明的组合物中可使用本领域已知的任何佐剂系统。这样的佐剂包括，但不限于，弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、多分散的β-(1，4)连接的乙酰甘露聚糖(“Acemannan”)、 (来自CytRx公司的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物佐剂)、来自Chiron公司的改性脂质佐剂、来自Cambridge Biotech的皂素衍生物佐剂、灭活的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、大的聚合物阴离子例如硫酸葡聚糖、和无机凝胶例如铝佐剂，氢氧化铝或磷酸铝。
[0234] 此外，术语“有效量”指抗原/免疫原性组合物的量，当对人或动物施用所述量时诱发免疫应答。有效量可由本领域技术人员遵循常规程序容易地测定。
[0235] 如本文描述的“免疫耐受患者”指这样的动物或人患者，其显示对抗原，特别是非自身抗原，但特别是新抗原例如在新出现的疾病中存在的新抗原，的有限应答能力。此限制可能至少部分由于CD4+T细胞的实足年龄引起。此外，“免疫耐受患者”可由于在回忆应答期间记忆T细胞的增殖和细胞因子分泌中的缺陷，对抗原暴露展示出受损的长期CD4+T细胞免疫应答。
[0236] 如本文描述的“T细胞活化患者”指这样的动物或人患者，其展示T细胞的活化且其中T细胞应答的进一步刺激将导致医学危险。
[0237] 如本文描述的“免疫受损患者”指这样的动物或人患者，其具有由于年龄、疾病例如HIV或癌症、或治疗例如针对炎症疾病(包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、韦格纳肉芽肿等等)的治疗而已经受损的免疫系统。
[0238] 在本发明的范围内，已证明，针对本发明抗原组合物的抗体诱发应答主要是T细胞非依赖性的。在这方面使用了裸鼠模型，免疫接种裸鼠，然后测量抗体应答以评估在免疫的裸鼠中由本发明的抗原组合物诱发的Aβ-特异性抗体应答。裸鼠携带Foxn1nu突变并因此由于缺乏正常的胸腺而具有降低的T细胞功能。
[0239] 如在以下实施例中显示的，根据本发明的抗原组合物在此小鼠模型中诱发了有力的持久的抗-AβIgG应答。抗体应答的持续性在野生型小鼠和裸鼠中是相似的，这清楚的说明该作用机制主要是T细胞非依赖性的。具体地，当与野生型小鼠比较时，裸鼠的接种诱发了非常相似的抗体生产动力学，但具有较高的抗体滴度，和相似的IgG谱。
[0240] 抗体应答的持续性和IgG同种型的分布在野生型和裸鼠中是相似的，这也说明了这些参数在ACI-24接种的情况下是不依赖于T细胞的。
[0241] 来自裸鼠研究的结果反映了，响应本发明抗原组合物的治疗，Aβ抗体产生的T细胞非依赖性作用机制；通过检查在CD4衰竭和未衰竭小鼠中的Aβ特异性抗体应答，该结果进一步获得了支持。可将根据本发明的抗原组合物和已知依赖CD4+T细胞(T辅助细胞)的疫苗，例如卵白蛋白和铝佐剂(OVA/氢氧化铝)相比较。在这样的比较下，可证明根据本发明的抗原组合物诱发与在CD4未衰竭的小鼠中所观察到的类似的强抗-Aβ抗体滴度，并因此诱发T细胞非依赖性抗Aβ抗体应答。
[0242] 从上文可知，根据本发明的抗原组合物可在T细胞，特别是T辅助细胞不存在时诱发有力的抗-Aβ抗体滴度，并因此被归类为所谓的TI非依赖性抗原/疫苗。
[0243] 在降低不适当的T细胞活化风险和相关的不希望的炎症反应例如脑炎方面，T细胞非依赖性作用机制是有利的。
[0244] 此外，T细胞非依赖性作用机制代表了低临床安全风险并因此使本发明的抗原组合物特别适于治疗用途。
[0245] 在本发明的另一个方面，本发明的抗原组合物可用于克服人AD患者中的免疫耐受。以下实施例支持本发明的此方面，其中在猴模型中证明本发明的抗原组合物在食蟹猴中诱发抗-AβIgG应答。诱发抗-AβIgG应答的最低剂量是50μg至150μg，特别是65μg至120μg，特别是70μg至100μg，特别是75μg至80μg，的经修饰的抗原肽。
[0246] 在另一个实施方案中，本发明因此提供了克服人AD患者，特别是具有T细胞缺陷(特别是CD4T细胞缺陷)的人AD患者中的免疫耐受的方法，其包括对所述患者施用治疗有效剂量的根据本发明的抗原组合物，特别是包含50μg至150μg，特别是65μg至12065μg，特别是70μg至100μg，特别是75μg至80μg的经修饰的抗原肽，特别是棕榈酰化的抗原肽，特别是棕榈酰化的Aβ1-15抗原肽的抗原组合物。
[0248] SEQ ID NO：1对照序列T5：Tau 379-408[pS396，pS404]
[0249] SEQ ID NO：2序列1(T1)：Tau 5-20[pY18]
[0250] SEQ ID NO：3序列8(T8)：Tau 206-221[pT212，pS214]
[0251] SEQ ID NO：4序列9(T9)：Tau 196-211[pS202，pT205
[0252] SEQ ID NO：5序列3(T3)：Tau 393-408[pS396，pS404]
[0253] SEQ ID NO：6序列4(T4)：Tau 401-418[pS404，pS409]
[0254] SEQ ID NO：7序列2(T2)：Tau 200-216[pS202+pT205&pT212+pS214][0255] SEQ ID NO：8抗原肽Aβ1-15
[0256] SEQ ID NO：9抗原肽Aβ1-16
[0257] SEQ ID NO：10抗原肽Aβ1-16(Δ14)
[0258] SEQ ID NO：11抗原肽Aβ4-11
[0259] SEQ ID NO：12抗原肽Aβ22-35
[0260] SEQ ID NO：13抗原肽Aβ29-40
[0261] SEQ ID NO：14抗原肽Aβ1-5实施例
[0262] 实施例1：在雌性裸鼠中的抗体应答
[0263] 此研究的目的是评估ACI-24批次在雌性裸鼠中诱发的淀粉状蛋白-β(Aβ)特异nu性抗体应答。裸鼠携带Foxn1 突变，由于缺乏功能正常的胸腺而具有降低的T细胞功能。
因此，此研究的目的是分析由ACI-24诱发的抗体应答是否是T细胞非依赖性的。
因此，此研究的目的是分析由ACI-24诱发的抗体应答是否是T细胞非依赖性的。
[0264] 皮下(s.c.)注射11或13周龄具有C57BL/6背景的裸鼠和对应同窝出生幼崽。以2周的时间间隔免疫小鼠3次并在每次免疫后1周取血。通过ELISA测量总抗-AβIgG应答。另外，分析了抗-AβIgG的同种型模式。
[0265] 为了证明在裸鼠中的T辅助细胞的缺乏，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)评估+ +CD3CD4细胞的百分比。
[0266] 1.1方法
[0267] 疫苗ACI-24的制备
[0268] 通过在40-60℃在EtOH中以9∶1∶7的摩尔比例溶解二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，Lipoid，Switzerland)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG，Lipoid，Switzerland)和胆固醇(Solvay，Netherlands)，制备脂质体。在60℃在pH 11.5的PBS中的1％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(β-OG，Pentapharm)中溶解棕榈酰化的Aβ1-15(Pal1-15，人Aβ序列)。无菌过滤脂质/乙醇溶液并注入β-OG/PBS溶液，然后立即在PBS中稀释。无菌过滤生成的脂质体并通过超渗滤浓缩以达到确定的脂质浓度。在加入磷脂的同时加入单磷酰脂质A(MPLA，Avanti Polar Lipids，Inc.AL，USA)。
[0269] 1.1.2免疫
[0270] 在JSW Life Sciences，具有C57BL/6背景的裸鼠(B6.Cg-Foxn1nu/J)和对应同窝出生幼崽(11只小鼠/组)接受ACI-24或PBS的皮下注射3次，根据表1在每次施用之间相隔2周(第0、14、28天)。在首次注射前7天和注射后第7，21，35，56，70，84和98天自颌静脉丛收集血浆样品。通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG和IgM抗体滴度和IgG同种型模式。在首次注射后第77天或第63天也收集血样用于FACS分析以测定CD3+/CD4+细胞的百分比。
[0271] Aβ特异性抗体的定量
[0272] 通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG抗体。用10μg/ml Aβ1-42(Bachem，Bubendorf，Switzerland)在4℃过夜包被板。在用0.05％于PBS中的Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-小鼠IgM或IgG同种型特异性抗体(IgG1-AP，IgG2a-生物素，IgG3-生物素(均来自Pharmingen BD，San Diego，CA，USA)或IgG2b-HRP(Zymed Laboratories，San Francisco，CA))在37℃孵育板2小时。对IgG2a和IgG3抗体，用链霉亲和素-HRP在室温进行另外的45分钟的孵育。在最终洗涤后，用AP底物(pNPP)或HRP底物(ABTS)孵育板，并在405nm处使用ELISA读板仪读数。通过参照市售抗体(6E10，Covance，Emeryville，CA，USA)的连续稀释物表示结果，或结果表示为光密度(O.D.)。
[0273] 1.1.3CD3+/CD4+细胞定量
[0274] 用氯化铵裂解小鼠血样直到澄清，然后以400xg离心7分钟并在含有EDTA的PBS中重悬沉淀。然后用CD16/CD32封闭试剂封闭细胞并用CD4(PE缀合物)和CD3(PE-Cy5)抗体在4℃染色30分钟。样品用PBS洗涤，在固定液(1∶40在BD FACSFlow中稀释的DB Cellfix)中重悬并在BDFACS Calibur细胞仪上捕获。评估了CD3+和CD4+染色呈阳性的设门细胞(gated cell)(T辅助细胞)的百分比。
[0275] 下表1说明了小鼠至不同组的分配。
[0276] 表1.小鼠至不同组的分配
[0277] 下表说明了小鼠至不同组的分配。
[0278]
[0279] a：理论体积
[0280] b：s.c.：皮下
[0281] c：分析后确定的实测量
[0282] d：理论量
[0283] e：不适用
[0284] 1.2结果
[0285] 没有动物发生成熟前死亡，无必需报告的由于治疗引起的副作用。在所有B6.Cg-Foxn1nu/J动物中，出现典型的裸体表型，而Wt(野生型)同窝出生幼崽具有正常的皮毛。
[0286] CD3+/CD4+细胞定量
[0287] CD3+/CD4+染色和之后的FACS分析揭示相比Wt动物，在裸鼠中T辅助细胞(CD3+/CD4+细胞)计数显著下降(图1)。
[0288] 接受PBS或ACI-24的裸鼠和接受ACI-24的Wt小鼠的CD3和CD4染色阳性设门细胞的百分比。每个柱代表11只小鼠的组的平均值加SD。右图：示意表示裸鼠组和Wt组的2只小鼠中的FACS分析。
[0289] 免疫应答分析
[0290] 分析了Wt和裸鼠的滴度以验证由ACI-24诱发的应答是否不依赖于T细胞功能。在Wt小鼠和裸鼠二者中，与PBS相比，ACI-24疫苗(批次GMP-样4号)诱发了有力＊的抗-AβIgG应答(图2；双向ANOVA免疫：P＜0.0001，取血P＜0.015和免疫 取血，P＜0.015)。在首次免疫后，裸鼠的滴度和Wt小鼠的类似。在所有其他取血日，裸鼠的滴度明显高于Wt小鼠(双向ANOVA)。然而，当用单向ANOVA分析时，裸鼠滴度仅在第35天保持显著更高。
[0291] 为了验证加强效果，分析了在每次注射后(即第7、21和35天)的滴度。在用ACI-24处理的裸鼠中，在这些取血日之间没有显著差异，说明没有加强效果。在用ACI-24处理的Wt小鼠组中，在第二次注射后有加强效果(单向ANOVA，第21天对第7天)。
[0292] 为了验证免疫应答的持久性，分析了在最后一次注射后(第35，56，70，84和98天)的滴度。在用ACI-24处理的裸鼠和Wt小鼠二者中，滴度维持高水平，甚至在最后一次免疫后3个月(单向ANOVA：对任一组，在第7天和第98天之间没有显著差异)。在用ACI-24处理的Wt小鼠中，相比第35天的滴度，第98天的滴度略微但显著地降低，而在裸鼠中没有观察到显著降低。
[0293] 总之，这些结果显示ACI-24在裸鼠和Wt小鼠中均诱发有力和持久的抗体应答。
[0294] 在首次免疫后7，21，35，56，70，84和98天分析接受ACI-24疫苗的裸鼠和Wt小鼠的血浆中的抗-AβIgG抗体。结果表示为在11只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0295] ACI-24疫苗在裸鼠和Wt小鼠中在第7和35天诱发了与PBS显著不同的抗-AβIgM抗体应答(图3)。在两组中，IgM滴度在首次免疫后第7天更高并在第35天显著降低。在同一取血日，在用ACI-24处理的裸鼠和Wt小鼠中IgM抗体应答是类似的。
[0296] 在首次免疫后7和35天分析接受ACI-24疫苗的裸鼠和Wt小鼠的血浆中的抗-AβIgM抗体。结果表示为在11只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0297] 在裸鼠和Wt组二者中，ACI-24疫苗诱发了IgG1，IgG2a，和IgG2b和IgG3同种型的抗-Aβ抗体，其中IgG2b是主要的亚型(图4)。
[0298] IgG亚型谱在Wt和裸鼠中是类似的。
[0299] 在首次免疫后7和35天分析接受ACI-24疫苗的裸鼠和Wt小鼠的血浆中的抗-AβIgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3抗体。结果表示为在1/200(IgG1)、1/1600(IgG2a)、1/6400(IgG2b)和1/1600(IgG3)稀释度的O.D.，显示为在11只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0300] 当在相同的稀释度上比较IgG2a和IgG2b滴度时，IgG2b抗体在Wt和裸鼠二者中都是主要的(图5)。和IgG滴度一致，在第7和35天，在裸鼠中的IgG2b滴度比Wt小鼠中的显著更高。
[0301] 在首次免疫后7和35天分析接受ACI-24疫苗的裸鼠和Wt小鼠的血浆中的抗-AβIgG2a和IgG2b抗体。结果表示为在1/3200稀释度的O.D.，显示为在11只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0302] 尽管在裸鼠中CD3+和CD4+细胞的小百分比，ACI-24疫苗诱发了有力的抗-AβIgG应答。在Wt和裸鼠中抗体应答的持续性和IgG同种型分布是类似的，提示在ACI-24接种的情况下这些参数不依赖T细胞。与具有免疫能力的小鼠相比，ACI-24免疫在T细胞缺陷小鼠中诱发了相同的抗体动力学、更高的抗体滴度和类似的IgG谱，说明ACI-24在裸鼠和Wt小鼠二者中诱发了T细胞非依赖性抗体应答。
[0303] 实施例2：ACI-24在CD4衰竭小鼠中的效能——在免疫前衰竭1次
[0304] 此研究的目的是评估ACI-24在CD4衰竭和未衰竭的C57BL/6小鼠中诱发的淀粉状蛋白-β(Aβ)特异性抗体应答。将此疫苗与已知依赖CD4+T细胞(T辅助细胞)的疫苗，卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝(Alum)，比较。用抗-CD4单克隆抗体腹膜内(i.p.)注射C57BL/6小鼠，3天后用ACI-24或OVA/Alum皮下(s.c.)免疫。在免疫后第4，7，14和21天收集血样。在免疫后第21天使用荧光激活细胞分选仪(FACS)以确认CD4衰竭。通过ELISA测量每次取血的总抗-AβIgG应答。
[0305] 2.1方法
[0306] 2.1.1ACI-24疫苗的制备
[0307] 如实施例1.1中描述的，制备脂质体。
[0308] 2.1.2OVA/Alum疫苗的制备
[0309] 通过在1ml无菌水中稀释10mg OVA(Sigma)，制备OVA疫苗，并在PBS中进一步稀释以得到1mg/ml的浓度。在0.9％NaCl中制备0.5mg/ml OVA：5mg/ml Alum(Alhydrogel2％；Brenntag Biosector，Frederikssund，Denmark)的最终溶液。
[0310] 2.1.3CD4衰竭
[0311] 通过在免疫前3天(第-3天)腹膜内注射(200μl)稀释在PBS中的抗-CD4抗体(克隆YTS191.1；AbD Serotec，Oxford，UK)(100μg/剂/小鼠)，实现CD4+细胞的衰竭。在免疫后第21天在所有动物中进行了FACS分析。
[0312] 2.1.4免疫
[0313] 根据表2在第0天C57BL/6成年小鼠(5只雌性/组)接受200μl/小鼠的ACI-24或OVA/Alum的皮下注射。在第4、7和14天，以及处死日(第21天)进行取血。从所有取血样品中制备血浆并通过ELISA测定抗-Aβ1-42特异性IgG和抗-OVA特异性IgG。
[0314] 2.1.5FACS分析
[0315] 在免疫后第21天收集所有动物的血液用于FACS分析以确认CD4衰竭。通过将血液制品和ACK裂解缓冲液(Invitrogen，Paisley，UK)在4℃孵育10分钟，进行红细胞的裂解。在冷PBS中洗涤剩余的细胞并与APC-标记的抗-CD3(克隆KT3；AbD Serotec)和FITC-标记的抗-CD4(克隆RM4-5；AbD Serotec)在4℃黑暗中孵育30分钟。然后在冷PBS中洗细胞，在1％于PBS中的多聚甲醛中重悬并用CyAn ADP流式细胞分析仪(Beckman Coulter GMBH，Lausanne，Switzerland)捕获。使用Summit V4.3.01软件(Beckman Coulter GMBH)，对CD3+/CD4+染色阳性的设门细胞的百分比进行处理和确定。
[0316] 表2说明了小鼠至不同组的分配。
[0317] 表2.小鼠至不同组的分配。
[0318]
[0319] a：i.p.：腹膜内
[0320] b：s.c.：皮下
[0321] c：分析后确定的实测量
[0322] d：MPLA同类物(congener)A+B的和
[0323] 2.1.6Aβ特异性抗体的定量
[0324] 通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG应答。用10μg/ml Aβ1-42(Bachem，Bubendorf，Switzerland)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用AP底物(pNPP)孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。参照市售抗体(6E10，Covance，Emeryville，CA，USA)的连续稀释物，表示结果。
[0325] 2.1.7OVA-特异性抗体的定量
[0326] 通过ELISA测定OVA特异性IgG抗体。用30μg/ml OVA(Sigma，A5503)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用AP缀合的抗-小鼠IgG总抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用pNPP孵育板并，使用ELISA读板仪在405nm处读数。结果表示为光密度(O.D.)。
[0327] 2.2结果
[0328] 没有动物成熟前死亡，并且没有观察到因为CD4衰竭、ACI-24或OVA/Alum免疫引起的副作用。组之间的体重类似，但在第21天在衰竭和未衰竭的ACI-24免疫小鼠之间观察到显著变化(双向ANOVA，P＜0.05)。尽管在组间观察到其他显著变化，但是这些不是在可比较的处理之间的并因此被认为是无关的。
[0329] CD4衰竭和未衰竭的ACI-24和OVA/Alum免疫小鼠的体重分析。结果表示为平均值+标准差，每个组n＝5。
[0330] 2.2.1CD3+/CD4+细胞定量
[0331] CD3+/CD4+染色和之后的FACS分析揭示在具有CD4衰竭的动物组中CD3+/CD4+(T辅助细胞)计数较低(图6)。在CD4衰竭和未衰竭的OVA/Alum免疫的小鼠之间发现显著差异(图6，单向ANOVA P＜0.05)。
[0332] 2.2.2在ACI-24免疫后的免疫应答
[0333] 分析了在CD4衰竭和未衰竭的小鼠中的抗-Aβ滴度以验证由ACI-24诱发的应答是否是CD3+/CD4+(T辅助细胞)非依赖性的。ACI-24疫苗从第7天开始直到第21天诱发了有力的抗-AβIgG应答。总体上，从第7天直到最后1次取血(第21天)，CD4衰竭小鼠记录到更高，尽管不显著，抗-Aβ滴度(图7)。
[0334] 在ACI-24免疫后第4，7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-AβIgG抗体滴度。结果表示为在5只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0335] 2.2.3在OVA/Alum免疫后的免疫应答
[0336] 因为针对OVA的高IgG滴度依赖于CD3+/CD4+细胞(T辅助细胞)，故分析了抗-OVA IgG滴度以验证是否实现了CD4衰竭。在CD4衰竭和未衰竭动物二者中在第4和第7天观察到可以忽略的滴度，此时在1/100或1/800上记录O.D.。在第14天，当与未衰竭小鼠比较时，在CD4衰竭小鼠中的抗-OVA IgG滴度显著较低(图8，双向ANOVA，P＜0.001)；当在1/800上记录O.D.时确认了此发现(图9，双向ANOVA P＜0.05)。在第21天抗-OVA IgG滴度在CD4衰竭和未衰竭小鼠中是相同的，提示CD4T细胞群在此时间范围期间(从第-3天至第21天)恢复。
[0337] 在OVA/Alum免疫后第4，7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-OVA IgG抗体滴度。结果表示为当在1/100上读取时，在5只小鼠的组中得到的OD平均值+标准差。
[0338] 在OVA/Alum免疫后第4，7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-OVA IgG滴度。结果表示为，当在1/800上读取时，在5只小鼠的组中得到的OD平均值+标准差。
[0339] 尽管在CD4衰竭小鼠中小百分比的CD3+/CD4+细胞，ACI-24疫苗诱发了与未衰竭小鼠相似的强烈抗-Aβ滴度。如预料地，在免疫后第14天在CD4衰竭小鼠中针对OVA的IgG滴度比在未衰竭小鼠中观察到的滴度显著更低，证明CD4衰竭对经典T依赖性抗体应答的直接影响。总之，结果显示CD4衰竭是成功的，且在C57BL/6小鼠中ACI-24诱发了针对Aβ的T细胞非依赖性抗体应答。
[0340] 实施例3：ACI-24在CD4衰竭小鼠中的效能——在免疫前每周进行衰竭[0341] 此研究的目的是评估ACI-24在CD4衰竭和未衰竭的C57BL/6小鼠中诱发的淀粉状蛋白-β(Aβ)特异性抗体应答。将此疫苗与已知依赖CD4+T细胞(T辅助细胞)的疫苗，卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝(Alum)，比较。C57BL/6小鼠经腹膜内(i.p.)途径每周注射抗-CD4单克隆抗体，并在首次抗-CD4注射后3天用ACI-24或OVA/Alum皮下(s.c.)免疫。在免疫后第7，14和21天收集血样。在每个取血日使用荧光激活细胞分选仪(FACS)以确认CD4衰竭。通过ELISA测量每次取血时的总抗-AβIgG和抗-OVA应答。
[0342] 3.1方法
[0343] 3.1.1ACI-24疫苗的制备
[0344] 如实施例1.1中描述的，制备脂质体。
[0345] 3.1.2OVA/Alum疫苗的制备
[0346] 通过在1ml无菌水中稀释10mg OVA(Sigma)，制备OVA疫苗，并在PBS中进一步稀释以得到1mg/ml的浓度。在0.9％NaCl中制备0.5mg/ml OVA比5mg/ml Alum(Alhydrogel2％；Brenntag Biosector，Frederikssund，Denmark)的最终溶液。
[0347] 3.1.3CD4衰竭
[0348] 通过在免疫前3天(第-3天)和之后每周1次(第4、11和18天)腹膜内注射(200μl)稀释在PBS中的抗-CD4抗体(克隆YTS191.1；AbDSerotec，Oxford，UK)(100μg/剂量/小鼠)，实现在组A和C中的CD4+细胞的衰竭。用PBS注射组B和D。在所有取血日(第7、14和21天)对所有动物进行FACS分析。
[0349] 3.1.4免疫
[0350] 根据表3，在首次CD4衰竭后3天(第0天)C57BL/6成年小鼠(8只雌性/组)接受200μl/小鼠的ACI-24或OVA/Alum皮下注射。在第7、14和21天进行取血。从所有取血样品中制备血浆并通过ELISA测定抗-Aβ1-42特异性IgG和抗-OVA特异性IgG。
[0351] 在免疫后第7、14和21天收集所有动物的血液用于FACS分析以确认CD4衰竭。通过将血液制品和ACK裂解缓冲液(Invitrogen，Paisley，UK)在4℃孵育10分钟进行红血球的裂解。在冷PBS中洗涤剩余的细胞并与APC-标记的抗-CD3(克隆KT3；AbD Serotec)和FITC-标记的抗-CD4(克隆RM4-5；AbD Serotec)在4℃黑暗中孵育30分钟。然后在冷PBS中洗细胞，在1％于PBS中的多聚甲醛中重悬，并用CyAn ADP流式细胞分析仪(Beckman Coulter GMBH，Lausanne，Switzerland)捕获。使用Summit V4.3.01软件(Beckman Coulter GMBH)，对设门细胞中CD3+/CD4+染色阳性细胞的百分比进行处理和确定。
[0352] 表3说明了小鼠至不同组的分配。
[0353] 表3.小鼠至不同组的分配。
[0354]
[0355] a：i.p.：腹膜内
[0356] b：s.c.：皮下
[0357] c：分析后确定的实测量
[0358] d：MPLA同类物A+B的和
[0359] 3.1.5Aβ特异性抗体的定量
[0360] 通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG应答。用10μg/ml Aβ1-42(Bachem，Bubendorf，Switzerland)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用AP底物(pNPP)孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。参照市售抗体(6E10，Covance，Emeryville，CA，USA)的连续稀释物，表示结果。
[0361] 3.1.6OVA-特异性抗体的定量
[0362] 通过ELISA测定OVA特异性IgG抗体应答。用30μg/ml OVA(Sigma，A5503)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用AP缀合的抗-小鼠IgG总抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用pNPP孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。结果表示为光密度(O.D.)。
[0363] 3.2结果
[0364] 尽管由于和处理/免疫无关的原因处死了1只动物(组C中的3号)，但没有观察到动物在成熟前死亡和因为CD4衰竭、ACI-24或OVA/Alum免疫引起的副作用。组之间的体重也不受不同处理的影响。
[0365] 3.2.1
[0366] CD3+/CD4+染色和之后的FACS分析揭示在所有取血日CD4衰竭组的动物中的CD3+/CD4+(T辅助细胞)计数显著地较低(P＜0.001，双向ANOVA)(图10)。
[0367] 在第7、14和21天在ACI-24和OVA/Alum免疫组中设门细胞中CD3和CD4染色阳性细胞的百分比。结果表示为从10只小鼠的组中得到的CD3+/CD4+％平均值+标准差。
[0368] 3.2.2在ACI-24免疫后的免疫应答
[0369] 分析了在CD4衰竭和未衰竭的小鼠中的抗-Aβ滴度以验证由ACI-24诱发的应答是否是CD3+/CD4+(T辅助细胞)非依赖性的。ACI-24疫苗从第7天开始直到第21天诱发了有力的抗-AβIgG应答。当将CD4衰竭小鼠与未衰竭小鼠比较时，没有观察到在抗-Aβ滴度中的显著差异(图11)。
[0370] 在ACI-24免疫后第7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-AβIgG抗体滴度。结果表示为在10只小鼠的组中得到的平均值+标准差。
[0371] 3.2.3在OVA/Alum免疫后的免疫应答
[0372] 因为针对OVA的高IgG滴度依赖于CD3+/CD4+细胞(T辅助细胞)，故分析了抗-OVA IgG滴度以确认CD4衰竭。当在1/100或1/800上记录O.D.时，在第7天在CD4衰竭和未衰竭动物二者中观察到可以忽略的滴度。在第14天，当与未衰竭小鼠比较时，在CD4衰竭小鼠中的抗-OVA IgG滴度显著较低(图12，双向ANOVA，P＜0.001)；当在1/800上记录O.D.时在第14和21天确认了此发现(图13，双向ANOVA，分别为P＜0.001和P＜0.01)。
[0373] 在OVA/Alum免疫后第7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-OVA IgG抗体滴度。结果表示为，当在1/100上读取时，在10只小鼠的组中得到的OD平均值+标准差。
[0374] 在OVA/Alum免疫后第7，14和21天在C57BL/6小鼠血浆中的抗-OVA IgG滴度。结果表示为，当在1/800上读取时，在10只小鼠的组中得到的OD平均值+标准差。
[0375] 尽管在CD4衰竭小鼠中小百分比的CD3+/CD4+细胞，但ACI-24疫苗诱发了与未衰竭小鼠相似的强烈的抗-Aβ滴度。如预料地，在免疫后第14天(1/100O.D.)和21天(1/100和1/800O.D.)，在CD4衰竭小鼠中针对OVA的IgG滴度比在未衰竭小鼠中观察到的滴度显著更低，证明CD4衰竭对经典T依赖性抗体应答的直接影响。总之，结果显示CD4衰+竭是成功的，且在C57BL/6小鼠中ACI-24诱发了针对Aβ的CD4T细胞非依赖性抗体应答。
[0376] 实施例4：ACI-24在食蟹猴中的免疫原性
[0377] 此研究的目的是评估ACI-24在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的免疫原性。挑选食蟹猴用于此研究是因为当比较猴和人时淀粉状蛋白肽的氨基酸序列完全同源。猴表达β-淀粉状蛋白(Aβ)作为自身蛋白质并因此可以具有一定水平的针对此肽的免疫耐受性。我们着手分析了用含有棕榈酰化的人Aβ1-15肽(Pal1-15)的ACI 24免疫是否能够打破在这些猴中的免疫耐受。
[0378] 为了测定ACI-24的免疫原性，以4周的间隔对猴皮下(s.c.)给药6剂ACI-24。通过在接种后的不同时间点用ELISA测量免疫的猴血清中的抗-AβIgM和IgG抗体滴度，分析抗体应答。
[0379] 4.1方法
[0380] 4.1.1ACI-24疫苗的制备
[0381] 通过在40-60℃在EtOH中以9∶1∶7的摩尔比例溶解二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，Lipoid，Switzerland)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG，Lipoid，Switzerland)和胆固醇(Solvay，Netherlands)，制备脂质体。在2％于PBS中的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(β-OG，Fluka)中，溶解棕榈酰化的Aβ1-15(Pal1-15，人Aβ1-15序列)。将脂质/乙醇溶液注入β-OG/PBS溶液并立即在PBS中稀释。生成的脂质体通过超渗滤浓缩以达到预定的脂质浓度。在加入磷脂的同时加入单磷酰脂质A(MPLA，Avanti Polar Lipids，Inc.AL，USA)。由Polymun Scientific GmbH(Austria)制备不同疫苗制品ACI-24-125(R/ACI/PAL115/合并/140607+180607)，ACI-24-30(稀释的/R/ACI/PAL1-15/合并/140607+180607)和ACI-空(R/ACI/Pal1-15/110607/E)，并运送至Maccine Ltd.(Singapore)。Pal1-15，MPLA，胆固醇和DMPC的理论和分析量在附录(表2)中显示。
[0382] 4.1.2免疫
[0383] 根据表4，将18只幼稚猴( monkey)分配至5个不同组之一。组1接受PBS。组2接受空脂质体，即具有MPLA但没有Pal1-15的脂质体(标为“ACI-24-空”)。4组接受含有不同剂量的Pal1-15的ACI-24，即ACI-24-30，ACI 24-125，ACI-24-500和ACI-24-1000。
每4周1次皮下(s.c.)免疫猴6次，即在第0，28，56，84，112和140天免疫。
每4周1次皮下(s.c.)免疫猴6次，即在第0，28，56，84，112和140天免疫。
[0384] 表4说明猴至不同组的分配。
[0385] 表4.猴至不同组的分配
[0386]
[0387] a：理论剂量以μg表示并在疫苗名中于ACI-24后指示
[0388] b：理论体积
[0389] c：分析后确定的实测量
[0390] 4.1.3取血样
[0391] 从第-1周至24周以每周1次的基准收集血样(共8ml)并分离血液血清和白血球。
[0392] 从股静脉采集约4ml的全血样至普通管(plain tube)并允许在室温凝血至多达1小时。然后通过在4000rpm离心10分钟分离血清。将血清分装为1ml的小份并将一半样品在80℃贮存于Maccine。将其余等分试验在处理开始后第6，10，14，18，20和24周冷冻运送至AC Immune。
[0393] 从股静脉采集约4ml的全血样至EDTA管(2x2ml)。在采集血样后立即通过Neubauer小室和台盼蓝挤出，控制血细胞的裂解。在从2007年8月直到研究期结束，在收集的样品的立刻评估中记录到存在不超过20％的裂解的血细胞。在收集后将管子置于血液滚筒上。将具有2ml全血的一个管子分成2个1ml的小份并在-80℃冷冻直到运送至AC Immune。使用Histopaque梯度法从另外2ml中分离白血球。在15ml离心管中将2ml血液铺在2ml Histopaque-1077(Sigma)上。然后将梯度在400g旋转30分钟并禁用刹车。收获在Histopaque/血浆界面上发现的白血球，用等渗的磷酸缓冲盐水洗涤并以400g离心5分钟。2次洗涤后，在2ml冷的冷冻培养基(70％RPMI；20％FBS；10％DMSO)中重悬离心的细胞。然后将细胞置于预冷的Nalgene细胞冷冻容器并在-80℃放置约24小时，之后将2个小瓶置于液氮中直到运送(在干冰上)至AC Immune用于分析。
[0394] 4.1.4Aβ特异性抗体的定量
[0395] 通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG和IgM抗体。用10μg/ml Aβ1-42(Bachem，Bubendorf，Switzerland)或10μg/ml人Aβ1-15(NeoMPS，France)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-猴IgG或IgM抗体(KPL Inc，Gaithersburg，Maryland，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用HRP底物(ABTS)孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。
[0396] 4.1.5MPLA特异性抗体的定量
[0397] 通过ELISA测定MPLA特异性IgG抗体。用10μg/ml MPLA(AvantiPolar Lipids，Inc.AL，USA)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-猴IgG抗体(KPL Inc，Gaithersburg，Maryland，USA)在37℃孵育板2小时。在最终洗涤后，用HRP底物(ABTS)孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。
[0398] 4.1.6疫苗应答者的定义
[0399] 来自猴的血清，当显示的O.D.是在同一只猴中在首次免疫前得到的O.D.的2倍高时，被认为是疫苗应答者。
[0400] 4.2结果
[0401] ACI-24在食蟹猴中诱发的抗体应答的评估
[0402] 皮下注射的ACI-24疫苗在9只猴中诱发了有力的Aβ特异性IgG(图14)。应答的猴已接种了ACI-24-30(1只猴，编号2066)，ACI-24-125(2只猴，编号6178和033B)，ACI-24-500(所有3只猴，7815，4C73，194A)或ACI-24-1000(所有3只猴，740B，5951和4B2E)。如预期地，接种PBS或空脂质体的猴没有显示任何可检测到的抗-AβIgG抗体(图
14)。
14)。
[0403] 在接种ACI-24-30(1只猴，编号2066)，ACI-24-125(1只猴，编号033B)或ACI-24-500(1只猴，编号7815；图15)后ACI-24在3只猴中诱发了抗-AβIgM滴度。
[0404] 在ACI-24-30(1只猴，编号2066)或ACI-24-500(1只猴，编号7815)接种后ACI-24也在2只猴中诱发了抗-MPLA IgG应答(图16)。
[0405] 在首次免疫后不同天在食蟹猴血清中的抗-AβIgG抗体的分析。在第1，28，56，84，112和140天用PBS、空脂质体或不同剂量ACI-24皮下免疫猴。结果表示为相对对照的x倍(每天的O.D.除以在免疫前得到的O.D.)。每张图代表1个剂量组。数字表示动物编号。
[0406] 在首次免疫后不同天在食蟹猴血清中的抗-AβIgM抗体的分析。在第1，28，56，84，112和140天用PBS、空脂质体或不同剂量ACI-24皮下免疫猴。结果表示为相对对照的x倍(每天的O.D.除以在免疫前得到的O.D.)。每张图代表1个剂量组。数字表示动物编号。
[0407] 在首次免疫后不同天在食蟹猴血清中的抗-MPLA IgG抗体的分析。在第1，28，56，84，112和140天用PBS、空脂质体或不同剂量ACI-24皮下免疫猴。结果表示为相对对照的x倍(每天的O.D.除以在免疫前得到的O.D.)。数字表示动物编号。
[0408] 因此，ACI-24在食蟹猴中诱发了抗-AβIgG应答。含有78μg Pal1-15的ACI-24-125疫苗是诱发抗-AβIgG应答的最低剂量。因此，ACI-24能够在猴中起作用，提示ACI-24也可克服在人AD患者中的免疫耐受。
[0409] 实施例5：ACI-24在裸鼠和CD40L，CD14或TLR4缺陷的小鼠中诱发的抗体应答的评估
[0410] 此研究的目的是评估ACI-24在裸鼠和CD40L，CD14和TLR4缺陷的小鼠中诱发的淀粉状蛋白-β(Aβ)特异性抗体应答。
[0411] 裸鼠携带Foxn1nu突变，由于缺乏功能正常的胸腺而具有降低的T细胞功能。因此，此研究的一个目的是分析由ACI-24诱发的抗体应答是否是T细胞非依赖性的。
[0412] CD40L敲除小鼠显示对T依赖性抗原的有缺陷的初级和次级抗体应答但对T非依赖性抗原正常应答(Renshaw，J Exp Med，1994，180，1889；Borrow，J.Exp.Med.，1996，183，2129；Xu，Immunity，1994，1，423)。在CD4T细胞上的CD40L的表达对B细胞的同种型转换也是关键的。分析了CD40L缺陷小鼠以确定CD40L/CD40是否是ACI-24诱发抗体应答所必需的。
[0413] CD14和TLR4是参与应答脂多糖(LPS)的分子。TLR4和CD14一起和髓样分化蛋白-2形成模式识别受体，起始对LPS的先天免疫应答。单磷酰脂质A(MPLA)是LPS的低毒性衍生物并用作ACI-24疫苗中的佐剂。在CD14或TLR4缺陷的小鼠中测定了CD14和TLR4的MPLA识别在ACI-24诱发的抗体应答中的必要性。
[0414] 对所有小鼠皮下(s.c.)注射ACI-24。以2周的间隔免疫小鼠3次并在不同的时间间隔取血。通过ELISA测量总抗-AβIgG应答。
[0415] 5.1方法
[0416] 5.1.1小鼠
[0417] TLR4(TLR4敲除(KO))，CD14(CD14KO)或CD40L(CD40L KO)缺陷小鼠和裸鼠(均是C57Bl/6背景)购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)。
[0418] 5.1.1.1TLR4敲除——B6.B10ScN-Tlr4lps-del/JthJ(Jackson货号：007227)[0419] 此自发突变是在Tlr4基因中的7kb缺失，其导致mRNA和蛋白质二者的缺乏并因此展示了对LPS刺激的有缺陷的应答。在C3H/HeJ小鼠中发现的功能类似的Tlr4Lps-d突变是导致氨基酸取代的点突变。用于正常LPS应答的等位基因Tlr4lps-n存在于大多数的其他C3H和C57BL/10亚株和大多数小鼠株中。此株系可用于研究Toll信号转导途径并对革兰氏阴性菌感染敏感。
[0420] 5.1.1.2CD14敲除——B6.129S-Cd14tm1Frm/J(Jackson货号：003726)[0421] 纯合无CD14的小鼠是可以存活和繁殖的。通过蛋白质印迹分析在巯基乙酸引发的腹膜(T-EP)巨噬细胞中检测不到CD14蛋白产物。与野生型T-EP巨噬细胞不同，来源于这些动物的T-EP巨噬细胞不能应答脂多糖(LPS)而分泌TNF-α和IL-6。当CD14-T-EP巨噬细胞暴露于完整细菌(以大肠杆菌生物颗粒的形式)时观察到此类应答，明显是通过CD14非依赖性机制。
[0422] 5.1.1.3裸鼠——B6.Cg-Foxn1nu/J(Jackson货号：000819)
[0423] 纯合裸体自发突变(Foxn1nu，以前的Hfh11nu)小鼠的2个主要缺陷是异常的毛发生长和胸腺上皮的发育缺陷。尽管该小鼠表现出没有毛发，但它们天生具有功能性的但缺陷的毛发生长囊。毛发生长周期和模式是明显的，尤其在有颜色的小鼠中，但缺陷的毛囊不允许毛发正确地长出。通过胡须的缺乏或发育不良的变皱的胡须，可在24小时大的年龄时就鉴定出纯合的幼崽。裸鼠也是无胸腺的，这是由“胸腺原基”的发育失败引起的。因此，纯合裸鼠缺乏T细胞并缺乏细胞介导的免疫。然而在T细胞前体中没有缺陷，并且在正确条件下可找到一些功能成熟的T细胞，特别是在成年小鼠中。因为辅助T细胞活性的缺陷，对胸腺依赖性抗原的应答，如可检测的话，主要限于IgM。纯合裸鼠显示在B细胞发育中的部分缺陷，这可能是由于功能性T细胞的缺乏引起的。
[0424] 5.1.1.4CD40L敲除小鼠——B6.129S2-Cd40lgtm1Imx/J(Jackson货号：002770)[0425] 该靶向突变的纯合小鼠是可以存活和繁殖的。纯合突变小鼠没有显示明显的表型异常。B和T细胞亚群的百分比是正常的。纯合子的确显示在体液免疫中的选择性缺陷(低基础血清同种型水平和检测不到的IgE)以及对胸腺依赖性抗原免疫的异常次级抗原特异性应答。小鼠的表型类似人X-连锁的超IgM综合症。
[0426] 5.1.2疫苗ACI-24的制备
[0427] 如实施例1.1中描述的，制备脂质体。
[0428] 疫苗制品，ACI-24(批次：ACI24-0709-A)由Polymun Scientific GmbH(Austria)制备并运送至苏黎世大学(Switzerland)。
[0429] 5.1.3免疫
[0430] C57BL/6小鼠、裸鼠、CD40L KO小鼠、CD14KO小鼠和TLR4KO小鼠(6只小鼠/组)根据表5以在每次施用之间2周的间隔(第0、14、28天)接受3次ACI-24的皮下注射。一组C57BL/6小鼠接受PBS作为阴性对照。另一个对照组接受Aβ1-15肽。在首次注射后第0，7，14，28和56天收集血浆样品。通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG抗体滴度。
[0431] 5.1.4Aβ特异性抗体的定量
[0432] 通过ELISA测定Aβ1-42特异性IgG应答。用10μg/ml Aβ1-42(Bachem，Bubendorf，Switzerland)在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)孵育板。在最终洗涤后，用AP底物(pNPP)或HRP底物(ABTS)孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。参照市售抗体(6E10，Covance，Emeryville，CA，USA)的连续稀释度，表示结果。
[0433] 表5.小鼠至不同组的分配。
[0434]
[0435] a：理论体积
[0436] b：s.c.：皮下
[0437] c：分析后确定的实测量
[0438] d：不适用
[0439] 5.2结果
[0440] 5.2.1抗体应答分析
[0441] 分析了Wt，裸和CD14，CD40L或TLR4KO小鼠的抗-AβIgG滴度以验证ACI-24诱发的应答是否依赖于T细胞和/或CD14、CD40L或TLR4。
[0442] 在Wt小鼠中，相比PBS，ACI-24疫苗诱发了有力的抗-AβIgG应答(图17；双向ANOVA在第7、28和56天P＜0.05)。
[0443] 在CD40L KO小鼠中，相比PBS，ACI-24疫苗诱发了有力的抗-AβIgG应答(图17；双向ANOVA在第7、28和56天P＜0.05)且滴度不显著低于在Wt小鼠中诱发的抗-AβIgG滴度(在所有时间点P＜0.05)。
[0444] 在首次免疫后(第7和14天)，裸鼠的滴度和Wt小鼠的滴度类似。在其他取血日，裸鼠的滴度显著高于Wt小鼠的滴度(双向ANOVA在第28和56天P＜0.001)。如预期地，Aβ1-15肽没有诱发任何抗-AβIgG滴度。
[0445] 在分析的所有天中CD14KO小鼠中的滴度也与在Wt小鼠中观察到的滴度类似(图18，P＞0.05)。
[0446] 相反地，在用ACI-24免疫1或2次后在TLR4KO小鼠中没有诱发抗-AβIgG滴度且在第7、14和28天滴度均显著低于在Wt小鼠中观察到的滴度(双向ANOVA在第7、14和28天P＜0.001)。
[0447] 总之，这些结果显示ACI-24诱发了不依赖于T细胞、CD40L和CD14但依赖于TLR4的有力抗体应答。
[0448] 5.3结论
[0449] ACI-24疫苗在Wt和裸鼠中诱发了有力的抗-AβIgG应答，证明在ACI-24免疫接种下抗体应答是不依赖于T细胞的。抗体应答也不依赖于CD40L，进一步支持T细胞非依赖性。在CD14KO小鼠中的抗体应答也类似Wt小鼠，指示CD14无需作为MPLA(ACI-24的佐剂)的受体来诱发抗体应答。最后，通过在TLR4 KO小鼠中抗体应答的完全缺乏，清楚地证明TLR4在ALI-24诱发的抗体应答中是必需的。
[0450] 实施例6：在雌性裸鼠中的抗-pTau抗体应答
[0451] 此研究的目的是评估在雌性裸鼠中注射ACI-33(Tau5-20[pY18])疫苗诱发的nu抗-pTau抗体应答。裸鼠携带Foxn1 突变，由于缺乏功能正常的胸腺而具有降低的T细胞功能。因此，此研究的目的是分析由ACI-33诱发的抗体应答是否是T细胞非依赖性的。
[0452] 皮下(s.c.)注射11或13周龄具有C57BL/6背景的裸鼠和对应的同窝出生幼崽。以2周的时间间隔免疫小鼠3次并在每次免疫后1周取血。通过ELISA测量总抗-pTau(Tau5-20[pY18])肽IgG应答。另外，在3次免疫后分析了抗体应答的同种型模式以评估IgG以及IgM的不同亚型的分布。也分析了针对对应的非-pTau(Tau5-20)，全长(441aa)Tau蛋白和磷酸化全长(441aa)Tau蛋白的抗体滴度。
[0453] 为了验证在裸鼠中缺乏T辅助细胞，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)评估了CD3+/CD4+细胞的百分比。
[0454] 6.1方法
[0455] 6.1.1ACI-33疫苗的制备
[0456] 称重脂质二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、胆固醇以及佐剂单磷酰脂质A(MPLA)(均来自Avanti Polar Lipids Inc.AL，USA)和Tau-衍生的四棕榈酰化磷酸肽Tau5-20[pY18](人Tau 5-20，在Y18上具有磷酸基团；5.2mg)并放入250ml玻璃圆底烧瓶(分别为9∶1∶7∶0.2∶0.1的摩尔比例)。然后加入氯仿(30ml)并在室温温和搅拌后在40℃在减压下然后在高真空下蒸发溶液1小时。通过加入PBS(60ml)再水化得到的薄膜并在室温温和搅拌18小时。然后将脂质体悬浮液(批号ACI-33-090818-A)分成等分小份然后贮存于2-8℃。最终的肽/磷脂摩尔比例是1∶100。将疫苗运送至JSW Life Sciences GmbH(Austria)。
[0457] 6.1.2免疫
[0458] 在JSW Life Sciences GmbH，具有C57BL/6背景的裸鼠(B6.Cg-Foxn1nu/J)和对应野生型同窝出生幼崽(6只雌性小鼠/组)根据表6以每次施用之间2周的间隔(第0、14、28天)接受3次ACI-33的皮下注射。在首次注射前7天和注射后2，4，7，21，35和56天从面部静脉/动脉收集血浆样品。通过ELISA测定Tau5-20[pY18]特异性IgG和IgM抗体滴度和IgG同种型模式。也通过ELISA测定针对非-pTau5-20，全长(441aa)Tau蛋白和磷酸化全长(441aa)Tau蛋白的特异性IgG抗体滴度。在第-7天也收集血样用于FACS分析以测定CD3+/CD4+细胞的百分比。
[0459] 6.1.3Tau肽特异性抗体的定量
[0460] 在5个血清采血样(第2、7、21、35和56天)中通过ELISA测量针对Tau5-20[pY18]的特异性IgG抗体。自第35天，在血清中测量Tau5-20，全长(441aa)Tau蛋白和磷酸化全长(441aa)Tau蛋白特异性IgG。在第35天的血清血样中通过ELISA测定Tau5-20[pY18]特异性IgM和IgG同种型抗体。用10μg/ml对应的Tau肽和1μg/ml对应的Tau蛋白在4℃过夜包被板。在用PBS-0.05％Tween 20洗涤和用1％BSA封闭后，将连续稀释的血清加入板中并在37℃孵育2小时。洗涤后，用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-小鼠IgG总抗体(Jackson Immunoresearch West Grove，PA，USA)或同种型特异性抗体(辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-小鼠IgM，AP缀合的抗-小鼠IgG1，生物素缀合的抗-小鼠IgG3，购自Pharmingen BD San Diego，CA，USA；生物素缀合的抗小鼠IgG2a，购自Invitrogen CA，USA和HRP缀合的抗小鼠IgG2b，来自Zymed Laboratories，San Francisco，CA)在37℃孵育板2小时。在洗涤后，用AP的磷酸酶底物pNPP(对硝基苯磷酸酯)或HRP的底物ABTS(2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))孵育板并使用ELISA读板仪在405nm处读数。对生物素缀合的抗体进行补充步骤，其中在使用ABTS检测以前将板在链霉亲和素-HRP(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)中孵育45分钟。结果表示为O.D.(光密度)，对于IgG、IgG同种型和IgM在未饱和的O.D.上。
[0461] 6.1.4CD3+/CD4+细胞定量
[0462] 用氯化铵裂解小鼠血样直到澄清，然后以400xg离心7分钟并在含有EDTA的PBS中重悬沉淀。然后用CD16/CD32封闭试剂封闭细胞并用CD4(PE缀合物)和CD3(PE-Cy5)抗体在4℃染色30分钟。样品用PBS洗涤，在固定溶液(在BD FACSFlow中1∶40稀释的DB Cellfix)中重悬并在BD FACS Calibur细胞仪上捕获。评估了设门细胞中CD3+和CD4+染色阳性细胞(T辅助细胞)的百分比。
[0463] 表6：小鼠免疫
[0464]
[0465] a：理论体积
[0466] b：s.c.：皮下
[0467] c：分析后确定的实测值
[0468] 6.2结果
[0469] 6.2.1一般观察
[0470] 没有动物在成熟前死亡且未报告由于处理引起的副作用。在所有B6.Cg-Foxn1nu/J动物中存在典型的裸体表型，而野生型(wt)同窝出生幼崽具有正常的皮毛。
[0471] 6.2.2CD3+/CD4+细胞定量
[0472] CD3+/CD4+染色和之后的FACS分析揭示与wt动物相比，在裸鼠中T辅助细胞计数(CD3+/CD4+细胞)的显著降低(图19)。
[0473] 6.2.3免疫应答分析
[0474] 分析了ACI-33接种产生的抗-Tau5-20[pY18]IgG滴度以研究疫苗在wt和裸鼠中的免疫原性。分析了裸鼠的抗-Tau5-20[pY18]IgG滴度以研究ACI-33诱发的应答是否不依赖于T细胞功能。疫苗在裸鼠中诱发了抗-Tau5-20[pY18]IgG应答，在检测的所有时间点上ACI-33在wt或裸鼠中诱发的抗体应答之间没有显著差异(图20；双向ANOVA，在裸和wt小鼠之间针对所有血样，P＜0.05)。
[0475] 在皮下注射后ACI-33疫苗在2种小鼠类型中均诱发了抗-Tau5-20[pY18]IgG应答，在2次免疫后(第27天)达到峰值(图20)。
[0476] ACI-33接种在裸和wt小鼠之间诱发了对于不同IgG亚型和IgM而言相同的抗体滴度谱，因为在3次疫苗的皮下免疫后在2种小鼠类型之间没有显著差异(图21，单向ANOVA，P＞0.05 IgG1裸对IgG1wt，IgG2a/2b裸对IgG2a/2b wt，IgG3裸对IgG3wt，IgM裸对IgM wt)。在2种小鼠类型中，相比IgG2b和IgM，存在显著更低水平的IgG1(图21，单向ANOVA，裸鼠：P＜0.01 IgG1对IgG2b或IgM；Wt小鼠：P＜0.05IgG1对IgG2b或IgM)。此外裸鼠显示了比IgG3显著更低水平的IgG1(图21，单向ANOVA，裸鼠：P＜0.05 IgG1对IgG3)，IgG2a的水平相比IgG2b，IgG3和IgM也较低(图21，单向ANOVA，裸鼠：P＜0.05 IgG2a对IgG2b，IgG3或IgM)。
[0477] 也在不同Tau肽(抗-Tau5-20[pY18]和抗-Tau5-20)和蛋白(抗-磷酸化全长(441aa)Tau蛋白＝抗-pTau蛋白和抗-全长(441aa)Tau蛋白＝抗-Tau蛋白)上，分析了在ACI-33的3次皮下注射后诱发的IgG滴度(图22)。在wt和裸鼠之间针对这些不同肽和蛋白质的滴度没有差异。在裸鼠组中抗-Tau5-20[pY18]和抗-Tau5-20滴度之间有显著差异，前者比后者高(图22，单向ANOVA，P＜0.05抗-Tau5-20[pY18]滴度对抗-Tau5-20滴度)。
[0478] 6.3结论
[0479] 尽管在裸鼠中的小百分比CD3+和CD4+细胞，ACI-33疫苗诱发了有力的抗-Tau5-20[pY18]IgG应答。在Wt和裸鼠中抗体应答的持续性和IgG同种型分布是类似的，提示在ACI-33接种下这些参数不依赖T细胞。与具有免疫能力的小鼠相比，ACI-33免疫在T细胞缺陷小鼠中诱发了相同的抗体滴度和动力学以及类似的IgG谱。此外在具有免疫能力的小鼠和T细胞缺陷的小鼠之间针对不同Tau肽和蛋白的抗体滴度是类似的。这些数据说明，ACI-33在裸和Wt小鼠二者中诱发了T细胞非依赖性抗体应答。
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