本发明涉及具有抗表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制活性 的化合物的治疗用途。

本发明特别涉及这样的化合物抑制正常细胞向癌细胞转化的用 途，即所述化合物是癌症化学预防药物。

近年来发现由于其DNA的一部分向癌基因即激活时导致恶性肿瘤 细胞形成的基因的转化，细胞可以变成癌细胞(Bradshaw，诱变 (Mutagenesis)，1986，1，91)。几种这样的癌基因导致了是生长因 子受体蛋白质的产生。该生长因子受体复合体接着导致细胞增殖的增 加。已知，例如，几种癌基因编码酪氨酸激酶并且一些生长因子受体 也是酪氨酸激酶(Yarden等，生物化学年度综述(Ann.Rev. Biochem.)，1988，57，443；Larsen等，药物化学年度报告(Ann. Reports in Med.Chem.)1989，第13章)。

受体酪氨酸激酶在引发细胞复制的生物化学信号的传递中是重要 的。它们是跨越细胞膜的大的酶并且具有对生长因子例如表皮生长因 子(EGF)的胞外结合域和作为对蛋白质中磷酸化酪氨酸氨基酸的激酶 发挥功能的胞内部分，因此影响细胞增殖。在结合不同受体酪氨酸激 酶的生长因子家族的基础上已知各类受体酪氨酸激酶(Wilks，癌症研 究进展(Avances in Cancer Research)，1993，60，43-73)。分类包 括I类受体酪氨酸激酶，包括EGF家族的受体酪氨酸激酶，例如EGF， TGFα，NEU，erbB，Xmrk，HER和let23受体，II类受体酪氨酸激酶， 包括胰岛素家族的受体酪氨酸激酶，例如胰岛素，IGFI和胰岛素-相 关受体(IRR)受体和III类受体酪氨酸激酶，包括血小板衍生的生长 因子(PDGF)家族的受体酪氨酸激酶，例如PDGFαa，PDGFβb和集落刺激 因子1(CSF1)受体。

已知I类激酶例如EGF家族的受体酪氨酸激酶常常存在于普通的 人上皮癌症例如乳腺癌(Sainsbury等，大不列颠癌症杂志(Brit.J. Cancer)，1988，58，458；Guerin等；癌基因研究(Oncogene Res.)， 1988，3，21和Klijn等，乳腺癌研究与治疗(Breast Cancer Res. Treat.)，1994，29，73)，非小细胞肺癌(NSCLCs)包括腺癌(Cerny等， 大不列颠癌症杂志(Brit.J.Cancer)，1986，54，265；Reubi等， 国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，1990，45，269；和Rusch等， 癌症研究(Cancer Research)，1993，53，2379)和肺鳞状细胞癌 (Hendler等，癌症细胞(Cancer Cells)，1989，7，347)，膀胱癌 (Neal等，柳叶刀(Lancet)，1985，366)，食道癌(Mukaida等，癌 症(Cancer)，1991，68，142)，胃肠癌例如结肠癌、直肠癌或胃癌 (Bolen等，癌基因研究(Oncogene Res.)，1987，1，149)，前列腺癌 (Visakorpi等，组织化学杂志(Histochem.J.)，1992，24，481)， 白血病(Konaka等，细胞(Cell)，1984，37，1035)和卵巢癌、支 气管癌或胰腺癌(EP-A-0400586)。随着对其它人肿瘤组织测试EGF家 族的受体酪氨酸激酶，预期将确立其广泛流行于其它肿瘤例如甲状腺 癌和子宫癌。更近一些时候证明(W J Gullick，Brit.Med.Bull.， 1991，47，87)具有酪氨酸激酶活性的EGF受体在很多人类癌灶中过 量表达，例如在脑、肺鳞状细胞、膀胱、胃、乳腺、头和颈、食 管，妇科和甲状腺肿瘤中。

因此认识到受体酪氨酸激酶的抑制剂应该具有作为上皮癌细胞生 长的选择性抑制剂的价值(Yaish等，科学(Science)，1988，242， 933)。

从EP-A-0566226和国际专利申请WO-A-96/33980和 WO-A-97/30034已知一些在4-位具有苯胺基取代基的喹唑啉衍生物 具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性并且是癌组织增生的抑制剂。

进一步从国际专利申请WO-A-96/30347和WO-A-97/38983得知 一些在4-位具有苯胺基取代基的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸 激酶抑制活性。

接下来已经证明很多其它4-苯胺基喹唑啉衍生物及其结构相关的 化合物具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。任何具有该活性和适当的生 物利用度的这样的化合物适合在本发明中使用。

曾陈述过的具有强的EGFR酪氨酸激酶抑制活性的特定化合物包 括：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4- 胺(下文用编号ZD1839表示)；N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧 基乙氧基)喹唑啉-4-胺(下文用编号CP358774表示)；6-丙烯酰胺 基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(下文用 编号PD0183805表示)，公开于，例如，药物化学杂志(J.Med.Chem.)， 1999，42，1803-1815；和吡咯并嘧啶(下文用编号PKI 166 (CGP75166)表示)。

所有上述化合物都涉及全癌细胞的治疗。因此，相信这样的EGFR 酪氨酸激酶抑制剂操作抑制ER-癌细胞中EGFR向下游传递信号并且从 而抑制这样的细胞增生。

对于正常细胞，已知EGF在于培养基中生长的各种没有转化的上 皮细胞中可能具有致有丝分裂作用(Carpenter等，生物化学年度综 述(Annual Reviews in Biochemistry)，1979，48，193)，包括 来自小鼠乳腺的细胞，但是EGF在某些细胞系中和在小鼠天然增殖乳 腺组织中也具有生长抑制作用(Coleman等，高等生物学 (Developmental Bioloqy)，1990，137，425)。

我们发现EGFR酪氨酸激酶抑制剂不仅对转化的上皮癌细胞的生 长有影响而且还对正常上皮细胞的组成型生长也有影响。例如，在正 常女性乳腺上皮组织中，雌激素刺激正常生长并且诱导黄体酮受体的 表达。

这使得在乳腺上皮中介导第二性甾体的激素作用。例如乳腺上皮 细胞的组成型生长包括随着妇女年龄而降低和更年期之后的细胞非雌 激素依赖性基准转换。

因此，使用涉及在无胸腺的BALB/c nu/nu小鼠中人正常乳腺组织 和原位乳腺癌的移植和生长的异种移植模型(Holland等，国家癌症 研究所杂志(J.National Cancer Institute)，(1997)，89，1059和 Gandhi等，癌症研究(Cancer Research)，(2000)，60，4284-4288)， 我们现在发现EGFR酪氨酸激酶抑制剂对绝经期之前良性和恶性前 [原位导管癌(Ductal Carcinoma In Situ)(DCIS)]乳腺上皮的组成 型和雌激素-刺激增殖有影响。对组成型和雌激素-刺激生长的抑制影 响提供了一种抑制正常细胞转化为癌细胞的方法，即妇女化学预防治 疗的基础，特别是那些有着发生恶性乳腺癌高度危险的那些妇女。

因此可以使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂来降低优选抑制上皮细胞 特别是乳腺上皮细胞从正常转化为恶性状态。

假设已知EGF对某些细胞系和小鼠天然增殖乳组织能够具有生 长抑制作用，大概是通过其生长受体，令人惊奇的是实际上阻断这样的 生长接受的化合物(EFGR抑制剂)也应该减少增殖。

因此，不象有效操作阻断雌激素对雌激素受体的作用并且降低细 胞产生EGF/TGFα的常规抗雌激素例如他莫昔芬，并且与先前提到的 EGFR抑制剂对ER癌细胞的操作机理(也与EGFR阻断相关)相反， 相信当体内对良性乳腺上皮癌或体内对非侵袭性乳腺癌(或者ER+或 者ER-)施用时，EGFR抑制剂是通过直接阻断酪氨酸激酶的细胞增殖 作用而工作的。因此，通过直接阻断EGFR酪氨酸激酶，细胞的激素敏 感性性质变得无关；即，药物通过非激素机理发挥作用。

更详细地，首先关于乳腺中的细胞生长，大多数生长细胞是EGFR+ 和ER-。在没有EGFR抑制剂存在下，雌激素(只)刺激ER+细胞，其分 泌EGF产生，其接着作用于ER-细胞以旁分泌方式诱导增殖。本发明的 EGFR TK抑制剂直接结合ER-细胞上的EGFR来抑制这样的增殖。

另一方面，通过来自组织基体和生长因子的存活信号防止细胞死 亡(编程性细胞死亡)。胰岛素样生长因子(IGFI)通过IGFI受体传 递信号来防止乳腺中细胞死亡。

Roudabush等人的近期工作(生物化学杂志(J.Biol.Chem)， (2000)，275，22583-22589)证明IGFR诱导的IGFR刺激作用导致在 细胞外分泌一种EGF家族成员，其接着对细胞本身和邻近细胞的EGFR 起作用。因此本发明中的EGFR TK抑制剂阻断乳腺中的EGFR，因而 导致体内和体外乳腺上皮中的细胞死亡(编程性细胞死亡)。

令人惊奇地，EGFR TKI不仅能直接作用于ER-细胞上表达的 EGFR，而且还独立地作用于ER+细胞。

R B Clarke等，在癌症研究(Cancer Research)(1997 57 4987-4991)中证明，正常ER+/EGFR-上皮乳腺细胞不增殖，而邻近 ER-/EGFR+细胞增殖，这表明存在两种增殖机理，即下面两种细胞的 雌激素刺激：

(1)ER+细胞和

(2)EGF和由ER+细胞分泌的相关配体，这样旁分泌刺激邻近 EGFR+/ER-细胞。

通过用EGFR TKI抑制TK，防止邻近ER-/EGFR+细胞增殖。

另外，我们的数据证明EGFR TKI也防止雌激素诱导的黄体酮受 体在ER+细胞中的表达并且减少ER+细胞转换。

因此，雌激素诱导在正常ER+细胞中的甾体化合物激素受体和蛋 白质合成，使得细胞增殖和生长和激素反应性，并且分泌作用于邻近 ER-乳腺上皮细胞的生长刺激因子(例如，EGF)。

另外，EGFR TK抑制剂防止雌激素在ER+细胞中诱导黄体酮受体， 因此降低乳腺上皮的激素敏感性和刺激并且防止正常组织向癌组织的 转化。

在没有达到绝经期前雌激素水平的正常乳腺组织中降低至大约5％ 的黄体酮受体标记指数(PRLI)在施用雌激素时提高至15％(I J Laidlaw等，内分泌学(Endocrinology)(1994)，136，164-171)。 使用ZD 1839拮抗雌激素刺激消除了该提高，从而导致10％的PRLI。

另外，可以对上皮组织特别是乳腺上皮组织使用EGFR酪氨酸激 酶抑制剂，其已经发展至正常上皮特别是正常乳腺上皮和恶性侵入上 皮特别是恶性侵入乳腺上皮之间的非侵入中间阶段，或者防止这样的 细胞增殖或者引起上皮组织这样的细胞实质上恢复至正常状态。

这样的中间阶段细胞的例子是与乳腺管和/或腔中存在的非典型 的管增生、小叶瘤形成和非侵入原位癌细胞相关的那些细胞。乳腺癌 高危发生患者体内可能存在这样的细胞。

根据本发明的第一方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备用 于降低、优选抑制没有侵入乳腺癌的人特别是妇女体内上皮细胞特别 是乳腺上皮细胞从正常转化为恶性状态的药物的用途。

根据本发明的第二方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备用 于降低、优选抑制没有侵入乳腺癌的人特别是妇女体内上皮细胞特别 是乳腺上皮细胞从如上定义的中间状态转化为恶性状态的药物的用 途。

根据第一和第二方面的本发明特别应用于乳腺癌高危发生患者， 称之为“高危”患者。已知在称之为Gail Risk的模型上将高危患者 分类作为具有至少1.5分的患者，Gail Risk模型是评价乳腺癌危险 度可接受的计算机生成的程序(参见M.H.Gail等，J.Natl.Cancer Inst.，(1989)，81，1879-1886)。增加发生乳腺癌危险度的因素包 括存在与非典型的增生(包括直系亲属确实有乳腺癌的历史)、小叶瘤 形成、非侵入原位癌相关的中间细胞或者存在突变体BRCAI基因(参 见D.L.Page等，BMJ，(1994)，309，61-64)。

因此，本发明特别应用于中间细胞的处理。

在上述本发明第一方面的优选方案中，提供了选自ZD1839、 CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备 用于抑制人特别是妇女乳腺上皮细胞从正常转化为恶性状态的药物的 用途。

在本发明该方面的更优选的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制 剂ZD1839在制备用于抑制人特别是妇女乳腺上皮细胞从正常转化为 恶性状态的药物的用途。

在上述本发明第二方面的优选方案中，提供了选自ZD1839、 CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备 用于抑制人特别是妇女乳腺上皮细胞从中间状态转化为恶性状态的药 物的用途。

在本发明该方面的更优选的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制 剂ZD1839在制备用于抑制人特别是妇女乳腺上皮细胞从中间状态转 化为恶性状态的药物的用途。

根据本发明的第三方面，提供了降低、优选抑制没有侵入乳腺癌 的人特别是妇女上皮细胞特别是乳腺上皮细胞从正常转化为恶性状态 的方法，该方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。

在本发明该第三方面的优选方案中，提供了抑制人特别是妇女乳 腺上皮细胞从正常转化为恶性状态的方法，该方法包括施用有效量的 选自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶 抑制剂。

在本发明该方面的更优选的方案中，提供了抑制人特别是妇女乳 腺上皮细胞从正常转化为恶性状态的方法，该方法包括施用有效量的 EGFR酪氨酸激酶抑制剂ZD1839。

根据本发明的第四方面，提供了降低、优选抑制没有侵入乳腺癌 的人特别是妇女上皮细胞特别是乳腺上皮细胞从中间状态转化为恶性 状态的方法，该方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。

在本发明该第四方面的优选方案中，提供了抑制人特别是妇女乳 腺上皮细胞从中间状态转化为恶性状态的方法，该方法包括施用有效 量的选自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨 酸激酶抑制剂。

在本发明该方面的更优选的方案中，提供了抑制人特别是妇女乳 腺上皮细胞从中间状态转化为恶性状态的方法，该方法包括施用有效 量的EGFR酪氨酸激酶抑制剂ZD1839。

在本发明第一和第二方面情况下，本发明的这些第三和第四方面 特别应用于高危患者并且用于治疗如前定义的中间细胞。

根据本发明的第五方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制剂制备用于 引起上皮组织特别是乳腺上皮组织从如上定义的处于正常上皮特别是 正常乳腺上皮和恶性侵入上皮特别是恶性侵入乳腺上皮之间的中间状 态实质逆转回正常状态的药物的用途。

在本发明该第五方面的优选方案中，提供了选自ZD1839、 CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备 用于引起乳腺上皮组织从处于正常乳腺上皮和恶性侵入乳腺上皮之间 的中间状态实质逆转回正常状态的药物的用途。

在本发明该第五方面的更优选的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶 抑制剂ZD1839制备用于引起乳腺上皮组织从处于正常乳腺上皮和恶 性侵入乳腺上皮之间的中间状态实质上逆转回正常状态的药物的用 途。

根据本发明的第六方面，提供了引起上皮组织特别是乳腺上皮组 织从处于正常上皮特别是正常乳腺上皮和恶性侵入上皮特别是恶性侵 入乳腺上皮之间的中间状态实质上逆转回正常状态的方法，包括对没 有侵入乳腺癌的人特别是妇女施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。

在本发明该第六方面的优选方案中，提供了引起乳腺上皮组织从 处于正常乳腺上皮和恶性侵入乳腺上皮之间的中间状态实质上逆转回 正常状态的方法，包括对人特别是对妇女施用有效量的选自ZD1839、 CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。

在本发明该第六方面的更优选的方案中，提供引起乳腺上皮组织 从处于正常乳腺上皮和恶性侵入乳腺上皮之间的中间状态实质上返回 正常状态的方法，包括对人特别是妇女施用有效量的EGFR酪氨酸激酶 抑制剂ZD1839。

使用中，可以单独施用EGFR酪氨酸激酶抑制剂或者以含有药学 可接受赋形剂的组合物形式施用。优选地，以片剂形式施用。

一般以给予有效的无毒剂量施用。剂量的大小自然根据选择的具 体EGFR酪氨酸激酶抑制剂和给药途径而不同。一般可以使用每种EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的常规剂量。特别地，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂 CP358774、PD0183805和PKI 166，可以根据关于这些化合物的出版 物的常规剂量进行使用。更具体地，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂 ZD1839，以例如大约10mg至5g、优选大约10mg至1000mg、更 优选大约10mg至500mg(即大约0.2mg/kg至100mg/kg体重、优 选大约0.2mg/kg至20mg/kg体重、更优选大约0.2mg/kg至10mg/kg 体重)范围的日剂量施用，如果需要，分次给药。

上文定义的细胞转化的抑制作用可以作为单独治疗施用或者除了 EGFR酪氨酸激酶抑制剂例如ZD1839之外，可以涉及一种或多种其它物 质和/或治疗。通过同时、依次或间歇施用治疗的各成分可以实现这样 的联合治疗。例如，对于有发生乳腺癌平均危险度以上的妇女，当使用 EGFR酪氨酸激酶抑制剂来抑制乳组织转化为乳腺癌时，一般情况下可 以使用不同形式治疗的组合。这样的联合治疗的其它成分可以包括抗 雌激素例如他莫昔芬、fulvestrant(ICI 182，780：faslodex)或 雷洛昔芬。例如采用大约1-6个月的第一治疗期，在这段时间期间施 用常规剂量的EGFR酪氨酸激酶抑制剂例如ZD1839，接着是大约1-6 个月的第二治疗期，在这段时间期间施用常规剂量的抗雌激素例如他 莫昔芬、fulvestrant或雷洛昔芬，这样的持续治疗可能是有益的。 从而允许通过这样一个时期允许乳腺组织一定的组成型生长以使组织 萎缩程度最小。

或者联合治疗可以包括连续施用抗雌激素例如他莫昔芬、 fulvestrant或雷洛昔芬，并且间歇地施用EGFR酪氨酸激酶抑制剂例 如ZD1839。EGFR酪氨酸激酶抑制剂间歇性治疗可以包括例如两个月一 周期的治疗，其包括涉及用EGFR酪氨酸激酶抑制剂例如ZD1839给药 大约一个月时间的第一部分和接着的涉及不施用EGFR酪氨酸激酶大 约一个月的第二部分。此后可以给予又一个两个月一周期的这样的治 疗。

现在参照下面的实施例和附图将更详细地描述本发明的实施方 案，其中：

图1对于实施例2详细说明ER-/EGFR+和ER+/EGFR-DCIS上皮 中增殖(Ki67 LI)和编程性细胞死亡(AI)；以及

图2对于实施例3详细说明(a)DCIS和(b)正常乳腺中的 ZD18389剂量响应。

实施例1

利用涉及在雌性无胸腺BALB/c nu/nu小鼠中人正常乳腺组织和 原位乳腺癌的移植和生长的异种移植模型(Holland等，国家癌症研 究所杂志(J.National Cancer Institute)，(1997)，89，1059和 Gandhi等，癌症研究(Cancer Research)，(2000)，60，4284-4268)， 测定本发明EGFR酪氨酸激酶抑制剂的作用。对雌性小鼠以异种移植 植入来自接受治疗手术的妇女的正常乳腺组织和原位导管癌(DCIS)组 织。14天后，以10至200mg/kg每天给药ZD1839，持续14天。在 第0、14、21和28天对异种移植组织切片。在第二套实验中(使用 正常乳腺异种移植)在第14天对对照和治疗小鼠皮下植入17β-雌二醇 (2mg)小丸，并且使用常规Ki67免疫染色评价上皮增殖(Ki67是对 细胞中一种标记物的单克隆抗体)。

得到下面的结果： Ki67指数   第0天         第21天        第28天 正常乳腺    对照     对照   ZD1839组    对照 ZD1839组    中值    7.6     3.3     0.7    6.1    1.8   Ki67指数   第0天          第21天         第28天 DCIS组织   对照    对照   ZD1839组     对照   ZD1839组     中值     19.9    10.6    7.2     23     3.2  Ki67指数   第0天              第21天            第28天 雌激素刺 激的正常   乳腺   对照   对照 ZD1839组     对照 ZD1839组    中值    10.4    15.7    1.5     14.8    1.2

实施例2

方法概述

在每个实验中，将来自接受DCIS手术的16名妇女的乳腺组织植 入16-20只免疫抑制小鼠(8个异种移植物/小鼠)。移植后2星期开始 治疗，并且包括每日管饲10-200mg/Kg的ZD1839持续14-28天；存 在适当对照物。在第14、21、28和42天取出异种移植物，然后通过 Ki67免疫染色评价增殖(LI)，通过形态学评价编程性细胞死亡(AI)。

材料和方法

患者

这项实验的参与者是在1998年11月至2000年1月期间在 Nightingale Breast Screening Assessment Centre或the Symptomatic Breast Clinic at the University Hospital of South Manchester，U.K.就诊的妇女。如果其乳房X线照片表明DCIS广 泛微钙化或者细胞病理学或组织病理学证实了诊断，则这样的妇女包 括在该项研究中(n＝16)。所有的组织样品在治疗性切除DCIS时获得。 the South Manchester Medical Research Ethics Committee批准 从这些病理样品取出组织。

动物

从Paterson癌症研究所饲养中心获得完整的、成年的、雌性、8-10 周龄、无胸腺裸鼠(BALB/c nu/nu)。在常规情况下圈养，在顶部置滤 网的笼中给与12-小时光暗周期(暗期从7PM至7AM)。它们自由进食 照射过的饲料和过滤过的水并且在饲养期间照射褥草。在实验期间使 用正常食物、水、和褥草。根据Home Office Regulations and the UK Scientific Procedures(1986)Act小心照料动物并且进行手术过 程。对所有的手术使用氟烷吸入麻醉(2-4％氧上的氟烷；Halovet Vapouriser，International Market Supplies，Congleton，U.K.)。

组织样品的处理

为了制备用于移植给小鼠的组织样品，在手术时从主要样品取出 包含微钙化的1-2cm3乳腺组织切片。将该新鲜组织剥离过量脂肪并 且立即在无菌条件下分成3或4小份，并且在对小鼠移植之前在室温 下置于Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)，其中有4.5g/L 葡萄糖并且没有丙酮酸钠(Gibco Life Technology， Paisley，Scotland，UK)中。在实验室中，将组织置于无菌培养皿中 的新鲜DMEM中，并且用解剖刀片小心将组织切成2-mm×2-mm×1-mm 的样品。根据可获得的组织的体积，从培养皿随机选择5至20片并且 不植入小鼠，但是取而代之的是用于组织学分析。立即在缓冲的福尔 马林(4％-甲醛)中将这些没有植入(第0天)的移植物的一半固定24小 时，另外一半在Carnoy’s固定液中固定1小时，然后将所有的样品保 存在70％乙醇中。至少24小时之后，分别将固定的组织样品置于组 织盒中(Tissue Tek 111；Bayer Diagnostics Ltd.，Basingstoke， UK.)并且保存在70％乙醇中直到用石蜡包埋。将这些代表从每一位患 者切下的DCIS的样品标记为“第0天”的样品，并且预留用于组织学 观察、免疫染色、和编程性细胞死亡。将剩下的异种移植物移植给裸 鼠。

异种移植物移植给裸鼠

和在实施例1中一样，将每一名患者的样品分给10至32只小鼠 (取决于组织的体积和可获得的小鼠数目；中值，16)。从患者取出组织 的90分钟内完成对小鼠的异种移植物的移植。在背部皮肤上交叉切两 个小的中线皮肤切口，通过该切口对称放入8片组织(每边4片)。 在需要再次麻醉小鼠的合适的时间点提取回这些异种移植物，并且使 用利刃解剖切除每一个移植物。然后处理移植物用于如上对第0天样 品所述的组织学分析。对于100-200mg/kg ZD1839实验，在第14、 21和28天取出移植物；以较低剂量(10-75mg/kg)，在第14、28和 42天取出移植物。在每个期中时间点从每一只小鼠取出两个异种移植 物，并且在每个终时间点取出4个异种移植物。

处理

在取出头两个异种移植物之后第14天开始或者用ZD1839 (10-200mg/kg)或者用赋形剂对小鼠管饲14-28天。ZD1839(4-(3- 氯-4-氟苯基胺)-7-甲氧基-6(3-(4-吗啉基)喹唑啉)是口服活性的选 择性EGFR-TKI，由AstraZeneca Pharmaceuticals馈赠。赋形剂(对 照)是0.5％多乙氧基醚。

异种移植物的组织学评价

将所有的第0天样品和每一个异种移植物包埋在石蜡块中。由一 名有经验的乳腺病理学家对来自每一块的H & E染色的3-μm切片检 查是否存在DCIS；如先前所述对含有DCIS的那些评价编程性细胞死 亡和Ki67抗原免疫原性(作为上皮增殖的标记物)。

也对所有的第0天样品确定核级(nuclear grade)以及存在或不 存在粉刺-坏死。另外，对第0天样品免疫组织化学评价ER， c-erbB-2，EGFR状态。

编程性细胞死亡的评价

使用光学显微镜对H & E-染色的DCIS样品切片检查编程性细胞 死亡的形态学证据。用来鉴定编程性细胞死亡的标准是认识充分的， 并且包括在核缘处开始的染色质的浓缩；胞质的浓缩(嗜染性)；从 周围细胞分离，由垂死细胞周围特征性白色晕圈的存在所指示；并且胞 质发育形成与膜结合的片段(编程性细胞死亡体)。为了获得Al，使用 Zeiss显微镜以×400放大倍数计数至少1000个细胞，并且显示出编 程性细胞死亡形态学的细胞数表示为总计数的百分比。 ER和Ki67核抗原的免疫组织化学测定

使用ER和Ki67免疫组织化学方法。这些先前都描述过(Gandhi 等，大不列颠癌症杂志(Br.J.Cancer.)(1998)，78，785-794)。 ER和Ki67染色主要是核，有少量胞质摄入。染色强度是不同的，但是 这不分开评价，对细胞判断为阳性或阴性。从计数1000个上皮细胞最 小值计算Ki67标记指数(LI)，并且将阳性染色细胞核数表示为总计 数的百分比。还计数1000个细胞确定ER状态，如果对于ER阳性染色 ＞5％细胞，则认为是损伤ER+。

c-erbB-2，EGFR和pErk1/Erk2的免疫组织化学测定

从每一个样品切下石蜡切片(3μm厚)，在APES(3-氨基丙基乙 氧基甲硅烷)包被的载玻片上固定，在对c-erbB-2、EGFR和磷酸化(p) Erk1/Erk2免疫化学染色之前脱蜡和水合。通过微波方法(650W)使抗 原恢复30分钟(min)。通过在磷酸缓冲盐水(PBS)中在过氧化氢[对于 EGFR和c-erbB-2是1.5％(v/v)以及对于pErk1/Erk2是3％(v/v)] 中温育15分钟来封闭内源过氧化物酶活性。对于c-erbB-2和EGFR 抗原，在使用10％正常兔血清之前在TBS中洗涤载玻片来阻断特异性 结合，然后对于EGFR(小鼠单克隆抗人，NCL-EGFR；Novocastra labs， Newcastle upon Tyne，UK)以1∶20的稀释度，对于c-erbB-2(小 鼠单克隆，MAB4022，Chemicon，Harrow，UK)以1∶40的稀释度，在 室温下与第一抗体温育1小时。使用生物素化兔抗-小鼠免疫球蛋白 (E413，Dako，High Wycombe，UK)作为第二抗体(1∶350稀释度，温育30 分钟)，接着对于c-erbB-2和EGFR在室温下与标准三层链霉抗生物素 -抗生物素蛋白-生物素辣根(K0377，Dako)温育30分钟。

对于pErk1/Erk2抗原检测，在用以1∶20的稀释度使用多克隆 兔抗-人pMEK，pErk1/Erk2，pElk1第一抗体(9101L，New England Biolabs，UK)之前用20％正常人血清封闭切片15分钟。施用1∶100 (Euro/DPC，Llanberis，UK)稀释度的Biogenex Multil Link为第二抗 体1小时。使用抗生物素蛋白/生物素复合物免疫组织化学试剂盒程序 (Biogenex Concentrated Label，Euro/DPC)。

施用发色团二氨基联苯胺(Sigma，Poole，UK)5分钟，然后施用 苏木精作为复染剂5分钟。

使用阴性(小鼠属IgG，X0931，Dako)和阳性对照(对于EGFR是 A431细胞的切片，对于c-erbB-2和pErk1/Erk2是先前表现出强阳性 的DCIS组织)。

对于c-erbB-2和EGFR主要是膜染色，但是也有胞质和细胞核摄 入。相对于阳性和阴性对照载玻片，将这些评分为正(等级为1-4)或 负。对于pErk1/Erk2是细胞核和胞质染色，并按照前述方法(Gee等， Int.J.Cancer(1995)，64，269-273)根据细胞核和胞质成分中染色的 强度来评分。

由对处理组不知情的研究人员进行所有的组织学评价。由同一研 究人员评价计数的再现性，对用Ki67抗体染色的10个载玻片重新评 分，开始的评价之后几个月对10个H & E载玻片评价编程性细胞死亡。 通过回归分析表明这样获得的两套结果相关性很好(r＝0.95，P＜0. 001)

正常小鼠肠中上皮增殖

用于Ki67评价的肠组织的取出和处理以及计分方法都如前所述 (Potten和Grant，大不列颠癌症杂志(Br.J.Cancer)，(1998)，78， 993-1003)。

统计方法

由Paterson癌症研究所的计算机和生物数学CRC部使用SPSS软 件(SPSS，Chicago，IL，USA)进行统计学分析。对于表现出正常乳腺 上皮或DCIS的每一种情况，在各评价时间点上，在从ZD1839处理的和 对照小鼠得到的样品之间进行比较。认为两个研究组中每个测评时间 获得的组织样品有统计学依赖性并且利用Mann Whitney U检验比较。 所有的统计显著性检验都是两面的(two-side)，使用常规的5％的统 计显著性水平。在证明所有剂量下作用的最初分析后折算出 (collapse)来自各ZD1839剂量的数据。利用Pearson’s相关系数 来检查测量变数之间的相关度。通过比较隐窝中个上皮细胞位置中值 对肠上皮中增殖进行统计学分析。

结论

接受手术的妇女的中值年龄是n＝范围(绝经状态)。

异种移植物植入和取回

DCIS

手术时发现16个含有DCIS的乳腺组织样品中，13(81.3％)个 产生含有DCIS的第0天样品，其中11个免疫组织化学表达EGFR+，中 值分数是2(范围1-3)，并且2个是EGFR-。其中有11例EGFR+情况，7 例是ER-/c-erbB-2阳性(都是高核级)，并且3例ER+/c-erbB-2阳性 (1例高级，2例中间级)，以及1例ER+/c-erbB-2阴性(低级)。13个乳 腺组织样品给出共273个第0天样品，其中44例(16.1％)含有DCIS 病灶。共植入1904个异种移植物，其中1858个(97.5％)成功取回。在 1858个取回的异种移植物中，329个(17.7％)含有DCIS。每项实验DCIS 的中值取回是预期的71％(范围14-91.3％)。在第14、21、28天取回 DCIS，在所有13个实验中共取出42个异种移植物。

正常乳腺

在对于DCIS经手术取出的所有16个样品中都发现组织学正常的 乳腺组织。取回了大部分(97.6％)植入的异种移植物，其中22.4％含有 正常乳腺。100％所有的实验中所有的时间点都取回了正常乳腺。所有 16种情况都是中值分数是1(范围1-2)的ER+和EGFR+，并且2也是弱 c-erbB-2阳性。

正常乳腺(表1)

表1显示不同时间点ZD1839(10-200mg/kg[折算数据(collapsed data)])相对赋形剂处理的(a)正常乳腺(b)DCIS上皮中EGFR+增殖 (LI)和编程性细胞死亡(AI)。括号中的数字代表四分位数的间距 (interquartile range)**p＜0.01，***p＜0.001相对对照物。

正常乳腺异种移植物中值Ll从第0至14天降低(4.9[IQR：4. 0-5.7]对3.8[IQR：2.7-5.1]，p＜0.05)，其然后对其它时间点保持 不变(第21、28、和42天)。与对照物相比ZD1839处理组中的中值Ll 降低，第21天(2.3[IQR：1.0-3.8]对4.1[IQR：2.8-5.2])，第28 天(2.2[IQR：1.7-3.3]对4.1[IQR：2.4-5.4])，以及第42天(1. 7[IQR：1.1-2.6]对2.8[IQR：2.3-5.1])(均为p＜0.01).

Al发现与上面DCIS处理的异种移植物的发现相似。从第0天至 第14天，没有观察到中值Al的降低(0.20[IQR：0.17-0.29] 对0.18[IQR：0.10-0.21]，p＝0.90)。第21天，与对照相 比，ZD1839处理的异种移植物中的中值Al有所增大(0.36[IQR：0. 23-0.53]对0.18[IQR：0.10-0.25，p＜0.001]。处理14天之 后(第28天)，中值Al平衡到对照物水平(ZD1839 0.19[IQR：0. 10-0.28]对对照0.18[IQR：0.10-0.20]，p＝0.35)。 表1 正常乳腺和DCIS上皮上的ZD1839对增殖和编程性细胞死亡的影响

           第0天        第14天           第21天                     第28天 中值                                    对照       ZD1839         对照        ZD1839 Ll   正常乳腺      4.9          3.8         4.1        2.3**        3.4         2.2**

         (4.0-5.7)    (2.7-5.1)   (2.8-5.3)   (1.0-3.8)    (2.4-5.4)    (1.7-3.3)   DCIS          13.9         12.6        11.2       4.6**        13.1        5.1**

         (11.9-15)    (9.1-14.1)  (9.7-12.9)  (3.2-7.2)    (11.8-15.8)  (3.2-10.6) Al   正常乳腺      0.20         0.18        0.18       0.36**       0.18        0.19

         (0.18-0.29)  (0.10-0.21) (0.10-0.25) (0.23-0.53)  (0.10-0.20)  (0.10-0.28)   DCIS          1.07         0.79        0.72       1.47**       0.46        0.64

         (0.89-1.21)  (0.53-1.19) (0.55-0.91) (1.25-2.18)  (0.34-0.85)  (0.38-1.15) Ll/Al   正常乳腺      23.9         25.7        15.9       3.9***       33.8        8.5***

        (18.3-43.3)    (13.4-33.3) (8.0-26.3)  (1.6-5.2)    (21.4-70.6)  (5.8-17.4)   DCIS

            12.1         12.1        17.7       2.7***       29.7        4.4***

         (8.4-15.8)   (8.2-19.9)  (12.7-22.0) (2.2-3.6)    (13.1-40.2)  (2.7-6.9)

EGFR+DCIS(图1)

图1分别显示ER-/EGFR+(1a和1c)和ER+/EGFR+(1b和1d) DCIS中ZD1839诱导的LI and AI的变化。从第14天开始给予ZD1839 或赋形剂。第0和14天的值来自未处理的小鼠。处理7和14天之后 在ER-/EGFR+和ER+/EGFR+DCIS两者中在ZD1839组中都见到AI的 升高和LI的降低(*p＜0.05，**p＜0.01相对对照物)。括号中的 数字代表对特定时间点和对于那个组观察的次数。粗水平线表示中值， 方框代表四分位数的间距。

在ER/EGFR+DCIS的7种情况中第0天样品的中值Ll和Al分别 比ER+/EGFR-DCIS的4种情况高(14.0[IQR：13.0-15.3]对7.8 [IQR：6.5-11.2]，和1.3[IQR：1.0-1.6]对0.79[IQR：0. 6-1.0]，两者p＜0.05)。

与赋形剂对照组相比ZD1839-处理组中的ER-/EGFR+DCIS中值 Ll降低，第21天(4.7[IQR：2.6-17.2]对11.6[IQR：10.7-15. 1]，p＝0.19)，第28天(8.3[IQR：2.7-10.9]对13.5[IQR：12. 0-16.3]，p＜0.01))和第42天(11.4[IQR：10.8-11.8]对 13.0[IQR：12.0-14.8]，p＜0.05)(图1a)。

从第0-14天ER-/EGFR+DCIS中值Al没有变化(1.3[IQR：1. 0-1.6]对1.0[IQR：0.8-1.44]，p＝0.14)。处理7天之后(第 21天)，与赋形剂对照组相比，ZD1839-处理组中值Al显著提高(2.1 [IQR：1.0-2.3]对0.7[IQR：0.5-1.1]，p＜0.01)，但 是处理14天之后(第28天)，中值Al恢复至对照水平(ZD1839 1.1 [IQR：0.8-1.2]对对照物1.2[IQR 0.5-1.5]，p＝0.44)(图 1b)。

第14天明显可见ER+/EGFR+DCIS(图1b和1d)中的LI和AI 的相似变化，第14天(ZD1839 4.6(IQR 3.9-5.2％)对11.2对照 物(IQR 9.2-15.55)有明显的下降并且编程性细胞死亡增加(ZD1839 1.5(IQR 1.3-1.6)对对照物(IQR 0.6-0.9％)。

EGFR+中的K167 LI(图2)

图2显示用不同剂量的ZD1839(10-200mg/kg)或赋形剂对照物 管饲2周之后(第28天)在EGFR+(a)DCIS和(b)正常乳腺异种移植物 中上皮增殖速度(Ki67 LI)。括号中的数字代表对特定时间点和对那 个组观察的次数。粗水平线表示中值，方框代表四分位数的间距。

渐增剂量的ZD1839与ER-/EGFR+和ER+/EGFR+DCIS中上皮增殖 的递降有关，但是在正常乳腺中不是这样(图2)。

增殖与编程性细胞死亡的相关关系

我们前面已经证明DCIS中Ll与Al的正相关关系。正常乳腺中 和ZD1839(即第0天，第14天，和赋形剂对照物情况)没有处理的 DCIS中(分别是r＝0.10、p＝0.02和r＝0.25，p＜0.01)，Ll表现与 Al正相关。

利用中值Ll/AI比(作为细胞反转的比例)比较细胞群，揭示在 DCIS和正常乳腺中的ZD1839处理明显抑制细胞反转，第28天(分别是 4.4[2.7-6.9]对29.7[13.1-40.2]，和8.5[5.8-17.4]对33.8[21. 4-70.6]，p＜0.001)。

EGFR TKI处理的DCIS和正常乳腺中pErk1/2的负调节

为了测定EGFR酪氨酸激酶抑制对MAP激酶信号传导途径是否有影 响，对用ZD1839或赋形剂处理的DCIS和正常乳腺异种移植物的第0 天和第42天切片进行磷酸化(p)ErK1/Erk2的免疫组织化学检测。中 值第0天DCIS和正常乳腺核H评分是30(IQR：12-45)和22(IQR： 12-34)。在DCIS中，28天处理之后，与对照相比较，ZD1839处理组中 核H评分降低(8[IQR：5-18]对25[IQR：8-30]，p＜0.05)。正 常乳腺中有类似差别(7[IQR：3-17.5]对18[IQR：8-32]，p＜0. 01)。

pErK1/Erk2的核H评分与DCIS和正常乳腺中的Ki67 Ll相关(两 者都是r＝0.52，p＝0.05)。

讨论

ER-DCIS过量表达c-erbB-2癌基因，据报道50％情况下表达 EGFR。我们发现ER-DCIS的11个中有10个(90％)在相同细胞群上双 重表达两个受体。ER-DCIS具有高增殖速度，在预处理样品中其与MAP 激酶信号转导酶的高表达相关。

因此我们假设EGFR/c-erbB-2异二聚体的形成是高增殖速度和 MAP激酶表达的原因，并且利用EGFR-TKI肽、ZD1839，我们验证了 我们的理论。用ZD1839处理时，观察到的上皮增殖的延长降低和激活 的MAP-激酶表达的降低以及早期编程性细胞死亡的增加证实我们的假 设。已知EGFR产生致有丝分裂的信号并且与侵入乳腺癌中增殖和肿瘤 倍增相关，对该途径的抑制导致DCIS异种移植物中Ki67标记指数的 降低。

处理7天之后看到DCIS和正常乳腺上皮中编程性细胞死亡的增 加。尽管相信胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在细胞存活中是重要的，但 是最近Roudabush等的工作(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)， (2000)，275，22583-22589)指明了IGF-1受体刺激导致胞外分泌肝 素结合-EGF并且促进EGF受体的反式激活。因此，与先前认识的相 比，在正常乳腺中EGFR对细胞存活可能更重要。因为上皮增殖与正 常乳腺中编程性细胞死亡相关，预计增殖的降低与编程性细胞死亡的 减少相关。ZD1839处理组7天之后编程性细胞死亡开始增加之后，标 记指数的降低(增殖)导致14天编程性细胞死亡的减少。但是，DCIS 和正常乳腺中ZD1839处理组中总Ll/Al比例降低，表明EGFR-TK抑 制减少总的细胞反转。此外，细胞反转总的减少表明EGFR TKI对正常 乳腺的潜在的化学预防作用。

据报道广泛局部切除术之后，ER-高级别DCIS容易复发，复发时 至少50％变成侵入高级乳腺癌，并且涉及结或远端转移。防止复发和 发展成为侵入癌症需要抑制增殖或增加编程性细胞死亡的物质，描述 的EGFR-TKI符合该标准。

与编程性细胞死亡增加结合的正常乳腺上皮增殖的抑制表明 EGFR-TK抑制剂作为有乳腺癌增加危险的妇女的化学预防药物的潜 力。

相信在细胞增殖、成活和分化中EGFR MAP激酶途径是重要的。DCIS 和正常乳腺中pErk1/Erk2与Ki67标记指数的显著性正相关关系提示 MAP-激酶信号传导对在乳腺上皮中介导细胞增殖中是重要的。ZD1839 处理组中pErk1/Erk2的降低与增殖减少相关，并且通过该途径的 EGFR信号和MAP激酶改变有可能预示药物反应。

实施例3

利用实施例1的方法，其中操作步骤在实施例2中更完全地描述， 测定了ZD 1839对雌激素刺激的正常乳腺上皮增殖的影响(Ki67 LI)。 表2给出了结果。

在正常乳腺上皮中，第0天，即对小鼠植入的这天，Ki67 LI值 是4.1，并且在第14天降低至2.6。然后单独用雌激素处理对照小 鼠，同时用雌激素和ZD1839处理试验小鼠。施用的雌激素的量相当于 绝经前水平；即17-β-雌二醇小丸(2mg)(参见Holland等，参见实 施例1)。

21天之后，对照小鼠的Ki67 LI值高达6.5高，而试验小鼠的 值大大降低至1.4的值。28天之后，对照小鼠的Ki67 LI值是5.4， 而对于试验小鼠，该值持续降低至1.1这样低的水平。

                     表2 ZD 1839对雌激素刺激的正常乳腺上皮增殖(Ki67 LI)的影响 中值Ki67   标记   指数   第0天 第14天             第21天               第28天   对照     ZD  1839     对照     ZD  1839 雌激素刺 激的正常   乳腺   4.1   (3.2-5.3)   2.6   (2.1-4)   6.5   (5-8.5)   1.4***   (0.8-1.9)   5.4   (4.6-6.1)   1.1***   (0.9-1.6)

括号中的数代表四分位数的间距*p＜0.05，**p＜0.01，***p ＜0.001对对照物

实施例4

再次利用实施例1的方法，测定ZD 1839对雌激素刺激的正常乳腺 上皮编程性细胞死亡(AI)的影响。表3给出了结果。

在正常乳腺上皮中，第0天，即对小鼠植入的这天，AI值是0.3， 并且在第14天降低至0.2。然后单独用雌激素处理对照小鼠，同时用 雌激素和ZD1839处理试验小鼠。施用的雌激素的量相当于绝经前水 平。21天之后，对照小鼠的AI值高达0.5，而对于实验小鼠，该值甚 至更高，是0.7的值。28天之后，对照小鼠的AI值是0.6，而对于实 验小鼠该值保持在0.7水平。

                        表3 ZD 1839对雌激素刺激的正常乳腺上皮编程性细胞死亡(AI)的影响     中值  编程性细胞   死亡指数     第0天     第14天              第21天              第28天     对照     ZD 1839     对照     ZD 1839 雌激素刺激 的正常乳腺      0.3   (0.19-0.3)      0.2   (0.1-0.2)      0.5   (0.45-0.65)       0.7   (0.55-0.78)      0.6   (0.45-0.66)      0.7   (0.57-0.81)

括号中的数代表四分位数的间距    **p＜0.01相对于对照物

实施例5

利用和实施例1相同的实施方案，测定ZD 1839对雌激素刺激的正 常乳腺上皮中黄体酮受体表达(PR LI)的影响(黄体酮受体增强细胞的 激素响应)。表4给出了结果。

在正常乳腺上皮中，第0天，即对小鼠植入的这天，PR LI值是 11.8，并且在第14天降低至5.8。然后单独用雌激素处理对照小鼠，同 时用雌激素和ZD1839处理试验小鼠。施用的雌激素的量相当于绝经前 水平。21天之后，对照小鼠的值PR LI升至高达17.2，而对小鼠，该 值只是10.4。因此ZD1839抑制PR表达的雌激素诱导。因此，性甾族 化合物黄体酮和雄激素的激素作用(正常下通过黄体酮受体介导)被抑 制。

                             表4

          ZD 1839对雌激素刺激的正常乳腺上皮PR表达(PR LI)的影响 中值 PR LI (％) 第0天 第14天             第21天 对照 ZD1839 雌激素刺激的 正常乳腺 11.8 (6.9-13.5) 5.8 (4.5-7.7) 17.2 (13.5-22.0) 10.4 (8.9-13.1)

圆括号中的数代表四分位数的间距  **p＜0.01对对照物

从上面这些结果可以看到，如上文所述，对正常乳腺细胞组织组 成型生长的抑制作用和对正常乳腺细胞组织死亡的促进作用提供了一 种抑制正常细胞转化为癌细胞的方法，即对妇女、特别是具有较高的发 生恶性乳腺癌危险的那些妇女化学预防性治疗的基础。

对正常乳腺上皮的研究表明激素替代治疗(HRT)提高了黄体酮受 体的表达(参见Hargreaves等，大不列颠癌症杂志(Br.J Cancer)， (1998年10月)，78(7)，945-949和Hofscth等，临床内分泌代谢 杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)，(1999年12月)，84(12)， 4559-4565)并且结合的HRT(雌激素和黄体酮)提高乳腺上皮增殖的 程度显著大于只用雌激素时的HRT(参见Hofstch，上文)。长期使用 结合的HRT与只用雌激素的HRT相比提高了乳腺癌的诱导比率(参见 Persson等，Cancer Causes Control，(1999年8月)，10(4)， 253-260；Colditz，妇女健康杂志(J.Womens Health)，(1999年4 月)，8(3)，347-357；和Magnusson等，国际癌症杂志(Int.J. Cancer)，(1999年5月5日)，81(3)，339-344)。通过抑制黄体酮 受体的诱导，黄体酮不能发挥其作用，并且乳腺癌发生率降低。

另外，对雌激素刺激的正常乳腺组织的抑制作用表明，EGFR酪氨 酸激酶抑制剂即使在高水平雌激素存在下也单独工作：即对绝经前妇 女提供化学预防作用。

因此，EGFR-TK抑制作用提供了治疗和预防癌症的一个新的途径 而不用考虑ER状态，并且提供了一种有潜力的新的化学预防方法，特 别是对高危乳腺癌家族的成员。