生物材料和其治疗用途
阅读：529发布：2020-05-13
专利汇可以提供生物材料和其治疗用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于调节慢性 炎症 反应的药剂，其中所述药剂调节瓜 氨 酸化 的生 腱 蛋白‑C的 生物 活性。还提供了鉴定调节瓜氨酸化的生腱蛋白‑C和慢性炎症的药剂的方法。还提供了这样的药剂的 治疗 用途 。，下面是生物材料和其治疗用途专利的具体信息内容。
1.一种用于调节慢性炎症反应的药剂，其中所述药剂调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
2.如权利要求1所述的药剂，其中所述药剂通过改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一种或多种物理特性来调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
3.如权利要求1至2中任一项所述的药剂，其中所述药剂通过改变所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结合特性来调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的药剂，其中所述药剂通过改变所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的抗原性来调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药剂，其中所述药剂通过改变所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的瓜氨酸化的水平来调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药剂，其中所述药剂通过改变所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C与非瓜氨酸化的生腱蛋白-C的比率来调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
7.如权利要求5所述的药剂，其中在一个或多个特定的结构域(例如FBG结构域)处改变所述瓜氨酸化的水平；或如权利要求6所述的药剂，其中改变所述一个或多个特定的结构域(例如所述FBG结构域)与一个或多个其它特定的结构域的瓜氨酸化的比率。
8.如权利要求5所述的药剂，其中在如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、
220、50、51、72、120、169、173以及222中的一个或多个处改变所述瓜氨酸化；或如权利要求6所述的药剂，其中改变如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、220、50、51、72、
120、169、173以及222中的一个或多个与如SEQ ID NO：70中所编号的一个或多个其它残基
55、209、214、219、220、50、51、72、120、169、173以及222的瓜氨酸化的比率。
9.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述药剂下调所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药剂，其中所述药剂上调所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
11.如权利要求1至10中任一项所述的药剂，其中所述药剂是生腱蛋白-C的瓜氨酸化的抑制剂。
12.如权利要求1至11中任一项所述的药剂，其中所述药剂是所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结合特性的抑制剂。
13.如权利要求1至12中任一项所述的药剂，其中所述药剂是瓜氨酸化的生腱蛋白-C的竞争结合抑制剂。
14.如权利要求1至9或12中任一项所述的药剂，其中所述药剂是TLR-4受体和/或Fcγ受体的拮抗剂。
15.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述药剂选自由以下各项组成的组：短干扰RNA(SiRNA)分子、短发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物、抗体(多克隆或单克隆)和其抗原结合片段、小抑制剂化合物、瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结构域或其变体、多肽以及蛋白质。
16.如权利要求15所述的药剂，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下各项组成的组：Fv片段、scFv片段、Fab、单个可变域以及结构域抗体。
17.如权利要求15至16中任一项所述的药剂，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
18.如权利要求15至17中任一项所述的药剂，其中所述抗体或其抗原结合片段对Toll样受体4(TLR4)、瓜氨酸化的生腱蛋白-C或其结构域具有特异性。
19.如权利要求15至17中任一项所述的药剂，其中所述药剂对所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域具有结合亲和力。
20.如权利要求15至17中任一项所述的药剂，其中所述抗体或其抗原结合片段对所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域具有特异性。
21.如权利要求15至17中任一项所述的药剂，其中所述抗体或其抗原结合片段对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、220、50、51、72、
120、169、173以及222中的一个或多个具有特异性。
22.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述药剂调节所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域的生物活性。
23.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C在所述FBG结构域处被瓜氨酸化。
24.如权利要求22所述的药剂，其中所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C仅在所述FBG结构域处被瓜氨酸化。
25.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个特定的瓜氨酸化的残基包括如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、220、
50、51、72、120、169、173以及222中的一个或多个。
26.如权利要求1至23中任一项所述的药剂，其中所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C在除所述FBG结构域以外的一个或多个结构域(例如III型纤维连接蛋白样重复序列)处被瓜氨酸化。
27.如前述权利要求中任一项所述的药剂，其中所述药剂调节对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合特异性的自身抗体的生物活性。
28.如权利要求27所述的药剂，其中所述药剂结合单独的所述对瓜氨酸化的生腱蛋白具有结合特异性的自身抗体和/或在所述自身抗体是与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的复合物的一部分时结合所述自身抗体。
29.一种鉴定调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性的药剂的方法，所述方法包括：
(i)提供一种或多种候选药剂；
(ii)使一种或多种细胞与瓜氨酸化的生腱蛋白-C和所述一种或多种候选药剂接触；
(iii)使一种或多种细胞与瓜氨酸化的生腱蛋白-C接触而不与候选药剂接触：
(iv)与所述对照步骤(iii)的一种或多种细胞相比，确定所述候选药剂是否调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C对步骤(ii)中的所述一种或多种细胞的作用。
30.如权利要求29所述的方法，其中上调所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性。
31.如权利要求29所述的方法，其中下调所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述步骤(ii)和(iii)的细胞表达Toll样受体4(TLR4)。
33.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞选自由以下各项组成的组：炎症细胞、成纤维细胞、成纤维细胞样细胞(包括RA滑膜成纤维细胞，也被称为滑膜细胞)、小鼠胚胎成纤维细胞、人类胚肾细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述炎症细胞选自由以下各项组成的组：巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、淋巴细胞、单核细胞样细胞以及巨噬细胞样细胞。
35.一种鉴定调节慢性炎症反应的药剂的方法，所述方法是通过执行如权利要求29至
34所述的方法来实现的。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述慢性炎症反应与特征在于不适当的炎症的病况有关。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述慢性炎症反应与以下各项有关：类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和渍疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述慢性炎症与类风湿性关节炎(RA)有关。
39.一种药剂，所述药剂是根据如权利要求29至38中任一项所述的方法鉴定的。
40.如权利要求39所述的药剂，其中所述所鉴定的药剂调节慢性炎症反应。
41.如权利要求40所述的药剂，其中所述药剂下调所述慢性炎症反应。
42.如权利要求40所述的药剂，其中所述药剂上调所述慢性炎症反应。
43.如权利要求39至42中任一项所述的药剂，其中所述药剂选自由以下各项组成的组：
短干扰RNA(SiRNA)分子、短发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物、抗体(多克隆或单克隆)和其抗原结合片段、小抑制剂化合物、瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结构域或其变体、多肽以及蛋白质。
44.如权利要求1至28以及39至43中任一项所述的药剂，其中所述慢性炎症反应与特征在于不适当的炎症的病况有关。
45.如权利要求1至28以及39至43所述的药剂，其中所述慢性炎症反应与以下各项有关：类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
46.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至28以及39至45中任一项所述的药剂以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
47.如权利要求46所述的组合物，所述组合物还包含至少一种其它药剂。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述至少一种其它药剂是抗炎剂、他汀类、生物制剂(生物制品)、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述抗炎剂选自由以下各项组成的组：非类固醇抗炎剂(NSAID)、皮质类固醇、疾病调节抗风湿药物(DMARD)或免疫抑制剂。
50.如权利要求1至29以及39至49所述的药剂或组合物，所述药剂或组合物用作药物。
51.如权利要求1至29以及39至49所述的药剂或组合物，所述药剂或组合物用于治疗慢性炎症性病况。
52.如权利要求1至29以及39至49所述的药剂或组合物用于制造用于治疗慢性炎症性病况的药物的用途。
53.一种治疗慢性炎症性病况的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如权利要求1至29以及39至49所述的药剂或组合物。
54.如权利要求50至53所述的药剂、组合物、用途或方法，其中所述慢性炎症性病况处于具有瓜氨酸化的生腱蛋白-C的受试者体内。
55.如权利要求50至54所述的药剂、组合物、用途或方法，其中所述慢性炎症性病况处于具有对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有特异性的自身抗体的受试者体内。
56.如权利要求54或55所述的药剂、组合物、用途或方法，其中所述瓜氨酸化的生腱蛋白-C或自身抗体在源自于所述受试者的血液、滑液或关节组织中的一种或多种的样品中被找到。
57.如权利要求50至56所述的药剂、组合物或用途，其中所述慢性炎症反应与特征在于不适当的炎症的病况有关。
58.如权利要求50至57所述的药剂、组合物或用途，其中所述慢性炎症反应与以下各项有关：类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、合格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
59.一种用于执行如权利要求29至38所述的方法的多部分试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)一种或多种细胞；
(ii)一种或多种细胞的对照样品；
(iii)瓜氨酸化的生腱蛋白-C的样品；
(iv)它们的使用说明书。
60.如权利要求59所述的多部分试剂盒，所述试剂盒任选地包括：
(v)候选药剂。
61.如权利要求60所述的多部分试剂盒，所述试剂盒任选地包括：
(vi)确定候选药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C活性或慢性炎症的作用的装置。
62.一种多部分试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)如权利要求1至29以及39至49所述的药剂或组合物；
(ii)施用装置；
(iii)它们的使用说明书。
63.如权利要求62所述的多部分试剂盒，所述试剂盒任选地包括：
(iv)至少一种其它药剂。
64.一种药剂，所述药剂基本上如本文参考实施例和附图所述。
65.一种方法，所述方法基本上如本文参考实施例和附图所述。
66.一种组合物，所述组合物基本上如本文参考实施例和附图所述。
67.一种多部分试剂盒，所述试剂盒基本上如本文参考实施例和附图所述。
生物材料和其治疗用途
技术领域
背景技术
[0002] 炎症是组织对有害刺激，如病原体、组织损伤、或刺激物的复杂的生物反应。它是组织去除有害刺激以及启动组织的愈合过程的保护性尝试。与炎症相关的异常包括构成多种人类疾病的基础的一大组无关的病症(炎症性病症)。伴有炎症方面的疾病的实例包括(但不限于)哮喘、自身免疫性疾病、肾小球肾炎、过敏(超敏感性)、炎症性肠病、再灌注损伤、类风湿性关节炎以及移植排斥反应。
[0003] 具体来说，慢性炎症是与上述疾病中的许多相关的一种消耗性的和严重的病况并且特征在于持续的炎症和/或发生改变的免疫应答，如在自身免疫性疾病中。
[0004] 类风湿性关节炎(RA)是慢性炎症性病况的一个典型的实例，尽管绝不是唯一的慢性炎症性病况。RA的特征在于滑膜炎症以及由促炎性细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)的持续合成所介导的对关节软骨和骨骼的破坏。抑制炎症性细胞因子，如TNFα和IL-6合成的生物化合物在短期治疗RA上获得成功。然而，需要重复治疗，使得这成为一种昂贵的治疗方法，并且不提供长期的缓解。此外，对细胞因子功能的总体全身抑制并非没有诸如感染风险增大等固有的问题。因此，尽管在护理方面有进步，但对长期有效的对慢性炎症的经济的治疗方式的需要仍未得到满足(Smolen(2006)和Williams(2007))。
[0005] 支持疾病慢性的机制仍不清楚并且驱动炎症性和破坏性介质的长时间表达的一种或多种因子目前是未知的。
[0006] Toll样受体(TLR)在驱动炎症性介质在RA中的产生中起关键的作用，并且阻断TLR功能可能具有显著的临床益处(Brentano(2005)和O′Neill(2002)中所综述)。这一受体家族形成了免疫系统的不可分割的一部分。TLR通过识别病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)这两者来介导宿主对感染和损伤的防御(Matzinger(2002))。DAMP是在组织损伤时产生的内源性促炎性分子并且包括从受损的或坏死的细胞中释放的细胞内分子、细胞外基质(ECM)分子的片段或在损伤时上调的ECM分子(Bianchi(2007)和Gordon(2002)中所综述)。
[0007] 在激活时，TLR促进先天免疫应答和适应性免疫应答这两者，包括刺激促炎性细胞因子和MMP的表达(Medzhitov(2002))。TLR以高水平表达在来自RA患者的滑膜组织中(Radstake(2004)、Roelofs(2005)、Sacre(2007)、以及Sacre(2008))，并且带有TLR4中的靶向缺失或功能突变丧失的小鼠受到保护而免受实验性关节炎(Choe(2003)和Lee(2005))。此外，TLR4的抑制剂可以减轻小鼠的破坏性关节炎(Abdollahi-Roodsaz(2007))，并且推定的TLR4抑制剂在初步的I期试验中改善了患有中度至重度RA的23名患者中15名的症状(Vanags(2006))。然而，不清楚是哪种或哪些TLR配体参与疾病的发病机制。
[0008] 生腱蛋白-C是与组织损伤和伤口修复有关的一种ECM糖蛋白。生腱蛋白-C在胚胎发生期间在活跃的组织重塑期间特异性地表达，最初在原肠胚形成和体节形成期间被观测到。在发育的后期阶段，表达局限于乳腺和肺的分支形态发生的部位、发育中的骨骼、心血管系统以及上皮细胞向间质细胞转化的部位处的结缔组织中。一旦这些过程停止并且在胚胎发生完成之前，表达下调(Jones(2000))。
[0009] 生腱蛋白-C在健康成人组织中通常是不表达的，但是在成人中，在急性炎症期间特异性地并且短暂地上调，并且在慢性炎症中持续地表达(Chiquet-Ehrismann(2003)中所综述)。免疫组织化学研究证实有很少的生腱蛋白-C在正常人的关节中表达，但是在RA滑膜中，在炎症和纤维化的区域中，特别是在滑膜内层下方、在入侵的血管翳中以及在血管周围，水平大幅升高(Cutolo(1992)、MacCachren(1992)以及Salter(1993))。生腱蛋白-C的水平还在来自RA患者的滑液中(Chevalier(1994)和Hasegawa(2007))以及在RA软骨中(Salter(1993)和Chevalier(1994))显著升高。
[0010] 生腱蛋白-C是1500000Da的大型六聚体蛋白质。每一条链包含不同的结构域，包括组装结构域(TA)、EGF样重复序列(EGF-L)、III型纤维连接蛋白样重复序列(TNIII)以及纤维蛋白原样球状结构域(FBG)(Orend(2005)中所综述)。生腱蛋白-C和它的结构域的序列示于图13中。
[0011] 本申请的发明人先前已经证实生腱蛋白-C是一种内源性TLR4配体，它对于在关节炎中所观测到的破坏性关节炎症来说是必需的并且涉及作为慢性炎症性病况的特征的炎症反应的延长。具体来说，生腱蛋白-C已经被证实为一种内源性TLR4激活因子并且已表明这种分子对于破坏性关节炎症来说是必需的(WO 2010/103289)。
[0012] 在WO 2010/103289中，生腱蛋白-C在介导关节中的免疫应答中的作用是通过在将生腱蛋白-C的FBG结构域关节内注射到小鼠体内后诱发关节炎症来表明的。此外，由酵母多糖诱发的急性关节炎症不像在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中那样长时间。野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除的小鼠这两者同样地对由酵母多糖引起的急性炎症诱发作出反应，这表明了生腱蛋白-C似乎不涉及炎症的引发。然而，由生腱蛋白-C基因敲除的小鼠所表现出的不太持续的滑膜炎表明了在维持关节炎症中的作用。生腱蛋白-C在延长关节炎症中的重要性是通过以下观测结果来凸显的，即生腱蛋白-C的靶向缺失在通过用mBSA进行免疫接种所诱发的关节炎期间保护小鼠防止持续的侵蚀性关节炎症。
[0013] 生腱蛋白-C被证实能够激活关节中的细胞并且生腱蛋白-C的主要活性结构域已经被定位到纤维蛋白原样球状结构域(FBG)，即处于分子的C末端处的具有227个氨基酸(26.9kDa)的球状结构域(Siri(1991))。
[0014] 将FBG添加到来自RA患者的滑膜培养物中提高了促炎性细胞因子的自发释放。它还经由激活TLR4和MyD88依赖性信号转导通路来刺激原代人类巨噬细胞中的TNF-α、IL-6和IL-8以及RA滑膜成纤维细胞中的IL-6的合成。
[0015] 已经证实的是，如同LPS一样，TLR4的表达是为FBG对细胞因子合成的诱导所必需的。然而，不同于LPS，CD14和MD-2这两者似乎都不是为TLR-4激活所必需的。CD14对于其它配体对TLR4的激活来说是可有可无的。它对于TLR4以MyD88依赖性方式对脂质A作出反应来说不是必需的(Jiang(2005))，纤维连接蛋白EDA甚至可以在不存在CD14的情况下激活肥大细胞(Gondokaryono(2007))并且人类单核细胞THP-1细胞的透明质酸激活需要TLR4、CD44以及MD-2的复合物，但是不需要CD14(Taylor(2007))。
[0016] 由每一种TLR4配体所引起的不同的受体复合物的形成可以促进不同的细胞内衔接/信号转导分子的募集。这可以解释我们在FBG和LPS的情况下所观测到的差异性的细胞反应，例如在RA滑膜成纤维细胞中FBG对IL-8的诱导的缺乏。类似地，TLR4和CD44复合物的透明质酸激活诱导了小鼠肺泡巨噬细胞系中与LPS不同的基因表达谱(Taylor(2007))。FBG诱导人类巨噬细胞中IL-8的合成表明了存在细胞类型特异性配体识别和/或信号转导。.[0017] 生腱蛋白-C的受到严格调控的表达谱使得它成为一种用于治疗慢性炎症的有吸引力的靶标。它主要不存在于健康的成人中，然而，在组织损伤时表达被特异性地诱导。在急性炎症期间，生腱蛋白-C瞬时表达：诱导往往在炎症之前并且mRNA和蛋白质这两者到炎症消退时不存在于组织中(Chiquet-Ehrismann(2003)中所综述)。
[0018] 生腱蛋白-C的持续表达现在已经被证实为与慢性炎症相关。除了RA之外，升高的生腱蛋白-C水平还在包括多发性硬化(Gutowski(1999))和舍格伦病(Sjogrens disease)(Amin(2001))的其它自身免疫性疾病中以及在非愈合伤口和糖尿病性溃疡以及静脉性溃疡(Loots(1998))中被观测到。生腱蛋白-C的从头合成与口腔粘膜疾病中炎症的强度具有良好的相关性，并且生腱蛋白-C的血浆水平是药物治疗或手术之前和之后炎症性肠病的活动性的一个可靠的指标(Chiquet-Ehrismann(2003)中所综述)。
[0019] WO 2010/103289描述了用于调节慢性炎症反应的药剂，其中所述药剂调节了生腱蛋白-C的生物活性；以及它们用于治疗与慢性炎症相关的病况的用途。然而，仍持续需要用于这样的病况的新的和改进的治疗。
发明内容
[0020] 本申请的发明人现在已经证实，惊人的是，生腱蛋白-C可以在体外被瓜氨酸化并且瓜氨酸化的生腱蛋白-C优先地在患有慢性炎症性病况的患者中被发现。
[0021] 瓜氨酸化是由精氨酸残基向瓜氨酸的转化所引起，所述转化是由肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)介导的。这一翻译后修饰生理性地发生在皮肤和中枢神经系统中并且病理性地发生在炎症部位。所述变化显著地影响蛋白质构象、离子相互作用以及对蛋白水解切割的敏感性。瓜氨酸化还形成新的表位，从而引起特异性抗体的产生。针对瓜氨酸化的蛋白质的抗体(ACPA)特异性地识别这些瓜氨酸化的蛋白质抗原。此外，由瓜氨酸化形成的表位还可以决定与先天免疫系统内的HLA DR、T细胞受体以及特异性配体结合的蛋白质(67)。
[0022] 已经在RA患者中发现ACPA并且这是诊断这种疾病的一种方式。最近，这些抗体还已经被证实为积极促进疾病。然而，这些抗体所识别的蛋白质没有得到很好的描述。到目前为止，瓜氨酸化的抗原中只有纤维蛋白原、II型胶原、波形蛋白以及α-烯醇化酶已经在RA滑液中被鉴定出，经过表位定位并且在多个实验室中可再现确认了它们的抗体的特异性(67)。
[0023] 本申请的发明人先前鉴定出瓜氨酸化的α-烯醇化酶为RA中的自身抗原并且证实了它在诊断和病因这两者中的重要性(68-74)。来自其它研究小组的最新数据表明ACPA和它们的抗原也积极地导致疾病发病。举例来说，含有瓜氨酸化的纤维蛋白原的免疫复合物增强了实验性鼠类关节炎(75，76)并且通过激活人类单核细胞中的toll样受体4(TLR4)和Fcγ受体来协同地促进细胞因子合成(77，78)。
[0024] 一直以来已知的是，纤维蛋白原被瓜氨酸化，并且针对这种形式的纤维蛋白原的抗体存在于RA患者中。Sokolove(2011)(16)证实纤维蛋白原在被瓜氨酸化时是一种优于原生纤维蛋白原的TLR4激活因子，并且瓜氨酸化的纤维蛋白原与抗体形成经由协同的TLR-Fcγ受体信号转导激活炎症的复合物。以这种方式，这种蛋白质的修饰加剧了RA中的炎症。
[0025] 本申请的发明人先前鉴定出促炎性糖蛋白生腱蛋白-C为先天免疫应答和适应性免疫应答的内源性激活因子并且证实它的表达在体内是为慢性关节炎症所必需的(79，80)。此外，在RA滑膜(81)和血清(82)中发现了高水平的生腱蛋白-C。
[0026] 然而，先前没有考虑到生腱蛋白-C可以被瓜氨酸化，也没有考虑到这样的瓜氨酸化可能调节生腱蛋白-C的促炎性活性或瓜氨酸化的生腱蛋白-C可能是自身抗原。
[0027] 本申请的发明人现在已经鉴定出全长的生腱蛋白-C以及它的单个结构域，包括(但不仅仅)FBG结构域，可以在体外通过瓜氨酸化来翻译后修饰。本申请的发明人证实瓜氨酸化的FBG在刺激原代人类巨噬细胞的细胞因子(例如TNFα)合成方面优于原生FBG。本申请的发明人已经发现只有RA患者具有识别瓜氨酸化的生腱蛋白-C的抗体，而正常的健康对照没有，并且来自RA患者和正常健康对照的血清不与原生的或非瓜氨酸化的生腱蛋白-C反应。本申请的发明人还证实连同FBG结构域一起，RA患者的生腱蛋白-C的其它结构域被瓜氨酸化。
[0028] 这是首次发现生腱蛋白-C可以被瓜氨酸化并且首次证实了这种对生腱蛋白-C的修饰在RA中具有相关性。本申请的发明人还证实瓜氨酸化起到了增强生腱蛋白-C的炎症能力的作用，从而提供了这种蛋白质用以驱动RA中的炎症的至少三种新的主要机制。瓜氨酸化的抗原，即生腱蛋白-C的促炎性作用是具有重大意义的发现，这是因为它证实了含有ACPA的生腱蛋白-C免疫复合物的抗体组分(例如经由Fcγ受体信号转导)和抗原组分(例如通过TLR信号转导)这两者均具有促炎性。因此，单独的瓜氨酸化的生腱蛋白-C、单独的针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的自身抗体或瓜氨酸化的生腱蛋白-C-抗体复合物可以在疾病中驱动炎症。
[0029] 甚至更惊人的是，本申请的发明人已经发现纤维蛋白原中被瓜氨酸化的氨基酸位于与生腱蛋白-C的FBG结构域不同源的区域中。换句话说，FBG-C中被瓜氨酸化的并且作为ACPA的靶标的氨基酸与纤维蛋白原中的区域不同源。这是惊人的，这是因为可能预期每一种蛋白质中相同的序列被修饰。
[0030] 因此，这是首次证实了生腱蛋白-C的结构域，包括FBG结构域在RA中被瓜氨酸化并且针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的抗体优先在RA患者中被发现。
[0031] 在本发明的第一个方面，提供了一种用于调节慢性炎症反应的药剂，其中所述药剂调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
[0032] 所谓瓜氨酸化的生腱蛋白-C的“生物活性”，我们包括：1)瓜氨酸化的生腱蛋白-C经由TLR或其它受体所产生的作用；和/或2)识别瓜氨酸化的生腱蛋白-C，从而激活Fcγ受体或其它受体的抗体的作用；和/或3)通过生腱蛋白-ACPA免疫复合物共同进行的信号转导的作用，所述免疫复合物例如可能协同地激活TLR和Fcy或其它受体。
[0033] 在优选的实施方案中，对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性的调节包括以下各项中的一项/或多项：1)调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C对TLR(例如TLR4)和/或单独以及在与TLR的复合物中起作用的其它受体(例如整合素)的作用；2)调节针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的ACPA的产生以及它们对Fcy受体的激活；以及3)调节生腱蛋白-C经由与ACPA抗体形成复合物以及经由Fcγ/TLR受体复合物或其它受体复合物进行的所得信号转导所发挥的作用。对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性的调节可以包括这些当中的两项/或更多项，或在一些实施方案中，包括所有这些。
[0034] “瓜氨酸化的生腱蛋白-C”意图包括已经在任何程度上在任何位置处由翻译后的瓜氨酸化过程，即精氨酸残基向瓜氨酸的转化修饰的生腱蛋白-C。“瓜氨酸化的生腱蛋白-C”还包括瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段。因此，意图在于本发明的药剂可以调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段的生物活性。“瓜氨酸化的生腱蛋白-C”可以包括已经在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化的生腱蛋白-C，例如，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220、222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，生腱蛋白-C可以在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
[0035] 本发明的第一个方面的药剂可以通过改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的物理特性中的一种或多种、改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结合特性和/或改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的抗原性来调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
[0036] 改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的抗原性意指增加或减少针对瓜氨酸化的型式所形成的抗体的数量。瓜氨酸化使得蛋白质更具抗原性，并且这些抗体在驱动RA的发病中是重要的。优选地，降低生腱蛋白-C的抗原性。
[0037] 所谓改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的物理特性，我们包括改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的以下特性中的一种或多种：(i)电荷；(ii)折叠模式(如增强更加纤维状的结构)；以及(iii)瓜氨酸化的生腱蛋白-C的隐蔽的结构域、模块或序列的暴露或隐藏。
[0038] 本发明的第一个方面的药剂还可以通过改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的瓜氨酸化的水平或通过改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C与非瓜氨酸化的生腱蛋白-C的比率来调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
[0039] 生腱蛋白的瓜氨酸化的总体水平可能被改变(即更多的或更少的精氨酸残基被修饰)。瓜氨酸化的水平可能在整个生腱蛋白-C上或只在一个或多个特定的片段或结构域(例如FBG结构域)上降低。优选地，瓜氨酸化的水平降低。
[0040] 生腱蛋白-C中瓜氨酸化可以被改变的单个结构域包括组装结构域(TA结构域)、EGF-L重复序列(EGF-L结构域)、III型纤维连接蛋白样重复序列(TNIII结构域)以及FBG结构域中的一个或多个。在一个优选的实施方案中，III型纤维连接蛋白样重复序列和/或FBG结构域的瓜氨酸化被改变。在一个最优选的实施方案中，FBG结构域的瓜氨酸化被改变。优选地，瓜氨酸化的改变是瓜氨酸化的减少。
[0041] 类似地，生腱蛋白-C的一个或多个特定结构域(例如FBG结构域)与生腱蛋白-C的一个或多个其它结构域的瓜氨酸化的比率可能被改变。或者，生腱蛋白-C的一个或多个特定的残基(例如残基55、209、214、219、220、50、51、72、120、169、173以及222中的一个或多个(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号))与生腱蛋白-C的一个或多个其它残基(例如残基55、209、214、219、220、50、51、72、120、169、173以及222中的一个或多个)的瓜氨酸化的比率可能被改变。
[0042] 瓜氨酸化的水平可能通过将生腱蛋白-C或其片段的一个或多个特定的瓜氨酸化的残基变成所述一个或多个残基的非瓜氨酸化的形式来降低，其中所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)；或其组合；或其中所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、51、55、72、
120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合。
120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合。
[0043] 特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219以及CIT220中的一个或多个。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
[0044] 特定的瓜氨酸化的残基可以是表位或存在于表位中并且可以在这样的表位中被检测到。举例来说，所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT55、CIT209、CIT214、CIT219以及CIT220；或其组合。所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT50、CIT51、CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、CIT220以及CIT222；或其组合。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。
[0045] 瓜氨酸化的水平可能通过首先阻止瓜氨酸化(例如通过使用PAD抑制剂)、通过总体上减少生腱蛋白的表达、通过提高原生生腱蛋白表达、和/或通过施用生腱蛋白-C的精氨酸基因敲除的突变体)来降低。
[0046] 这样的药剂可以使用本领域公知的方法来鉴定，如：
[0047] (a)通过确定测试剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的表达水平的作用，这例如通过蛋白质印迹法或相关的杂交技术来实现；
[0048] (b)通过确定测试剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C蛋白质的水平的作用，这例如通过使用抗瓜氨酸化的生腱蛋白-C抗体进行免疫测定来实现；
[0049] (c)通过确定测试剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C活性的功能标志物或结果的作用，这例如经由实施例的方法来实现；
[0050] (d)通过使用例如在SDSPAGE上迁移时电荷或尺寸的变化来显示瓜氨酸化；和/或[0051] (e)通过使用质谱分析和蛋白质组学方法来定量瓜氨酸化的比率以及鉴定经过修饰的特定的精氨酸残基。
[0052] 本发明的第一个方面的药剂可以下调瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
[0053] 本发明的第一个方面的药剂可以上调瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。上调免疫和炎症分子和细胞的活性的可取性是与用于免疫受损和炎症患者的治疗的产生有关以及在疫苗的研发中具有相关性。(参见Harandi(2009))。
[0054] 本发明的第一个方面的药剂可以是生腱蛋白-C的转录的抑制剂。
[0055] 本发明的第一个方面的药剂可以是生腱蛋白-C的翻译的抑制剂。
[0056] 本发明的第一个方面的药剂可以是生腱蛋白-C的瓜氨酸化的抑制剂。对瓜氨酸化的抑制可以例如以与其中可以降低瓜氨酸化的水平的方式相同的方式(例如通过抑制肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD))实现。
[0057] 本发明的第一个方面的药剂可以是瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结合特性的抑制剂。举例来说，所述药剂可以改变瓜氨酸化的生腱蛋白-C的构象以使得它不再能够与它的受体结合。
[0058] 本发明的第一个方面的药剂可以是瓜氨酸化的生腱蛋白-C的竞争结合抑制剂。本领域技术人员将了解的是，所述药剂还可以通过直接(通过用作瓜氨酸化的生腱蛋白-C受体拮抗剂)或间接(通过结合中间分子或辅助分子)阻断瓜氨酸化的生腱蛋白-C受体功能来抑制瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性。
[0059] 本发明的第一个方面的药剂可以是TLR-4受体和/或Fcγ受体和/或任何其它受体、或复合物中的受体的拮抗剂。
[0060] 本领域技术人员将了解的是，本发明的药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性的抑制可以是完全抑制或部分抑制。举例来说，与瓜氨酸化的生腱蛋白-C对没有暴露于所述药剂的炎症细胞的生物活性相比，所述药剂可以将瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性抑制至少10％，优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，并且最优选地100％。
[0061] 本发明的第一个方面的药剂可以选自由以下各项组成的组：短干扰RNA(SiRNA)分子、短发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物、抗体(多克隆或单克隆)和其抗原结合片段、小抑制剂化合物、多肽以及蛋白质。
[0062] 在本发明的一个实施方案中，所述药剂是siRNA。RNA干扰是一个两步过程。第一步骤被称作引发步骤，将输入dsRNA消化成具有21个-23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，这可能是在切丁酶(Dicer)作用下实现的，所述切丁酶是dsRNA特异性核糖核酸酶的RNA酶III家族的成员，它以ATP依赖性方式加工(切割)dsRNA(直接或经由转基因或病毒引入)。连续的切割事件将RNA降解成各自具有2-核苷酸3′突出端的19bp-21bp双链体(siRNA)(Hutvagner和Zamore，2002，Curr.Opin.Genetics and Development 12：225-232；Bernstein，2001，Nature 409：363-366)。
[0063] 在效应步骤中，siRNA双链体与核酸酶复合物结合以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。siRNA双链体的ATP依赖性解旋是为RISC的激活所必需的。活性RISC然后通过碱基配对相互作用靶向同源转录物，并且从siRNA的3′末端将mRNA切割成具有12个核苷酸的片段(Hutvagner和Zamore，2002(同上)；Hammond等，2001，Nat.Rev.Gen.2：110-119(2001)；Sharp，2001，Genes.Dev.15：485-90)。尽管切割的机制仍有待阐明，但是研究表明每一个RISC含有单个siRNA和RNA酶(Hutvagner和Zamore，2002(同上))。
[0064] 鉴于RNAi的显著效能，RNAi途径内的扩增步骤已经被表明。扩增可以通过拷贝输入dsRNA，从而将产生更多的siRNA，或通过复制形成的siRNA来进行。作为另外一种选择或除此之外，扩增可以通过RISC的多个转换事件来实现(Hammond等，2001(同上)；Hutvagner和Zamore，2002(同上))。有关RNAi的另外的信息可以见于以下综述中：Tuschl，2001，Chem.Biochem.2：239-245；Cullen，2002，Nat.Immunol.3：597-599；以及Brantl，2002，Biochem.Biophys Act.1575：15-25。
[0065] 适用于与本发明一起使用的RNAi分子的合成可以如下实现。首先，在AUG起始密码子的下游针对AA二核苷酸序列对生腱蛋白-C的mRNA序列进行扫描。将每一个AA和3′相邻的19个核苷酸的出现记录为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自开放阅读框，这是因为非翻译区(UTR)在调节蛋白结合位点中更丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能会干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合(Tuschl，ChemBiochem.2：239-245)。然而，将了解的是，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的。
[0066] 其次，使用序列比对软件，如BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将潜在的靶位点与适当的基因组数据库(例如人类、小鼠、大鼠等)相比较。将与其它编码序列表现出显著的同源性的推定的靶位点滤出。
[0067] 将合格的靶序列选为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的那些，这是因为这些已经被证明在介导基因沉默方面与具有高于55％的G/C含量的那些相比更为有效。优选地沿着靶基因的长度选择多个靶位点来评价。为了更好地评价所选择的siRNA，优选地结合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与siRNA相同的核苷酸组成，但是与基因组缺少显著的同源性。因此，优选地使用siRNA的乱序核苷酸序列，前提条件是它与任何其它基因没有显示出任何显著的同源性。
[0068] 合适的SiRNA分子可以如上文所述来合成以使得它们是互补的并且因此与生腱蛋白-C的整个核苷酸序列或其部分结合。生腱蛋白-C的核苷酸序列见于图14中。
[0069] 在一个实施方案中，所述药剂可以是短发夹RNA(ShRNA)。
[0070] 小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是形成紧密发夹弯的RNA序列，所述发夹弯可以用于经由RNA干扰使基因表达沉默。shRNA使用被引入到细胞中的载体(通常是腺病毒或慢病毒)并且利用U6启动子来确保shRNA始终表达。这一载体通常被传递到子代细胞上，从而允许基因沉默被遗传。shRNA发夹结构由细胞器切割成siRNA，所述siRNA然后与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。这一复合物结合并且切割与所结合的siRNA匹配的mRNA(McIntyre(2006)和Paddison(2002))。
[0071] 本发明的第一个方面的药剂可以是瓜氨酸化的生腱蛋白-C的结构域或其变体。FBG结构域已经被证实为主要参与生腱蛋白-C与它的靶标的与慢性炎症的持续有关的相互作用。FBG结构域特别是也已经被证实为被瓜氨酸化。因此，优选的结构域是FBG结构域(序列示于图13中)或其变体。瓜氨酸化的生腱蛋白-C的另外的或可选择的结构域是III型纤维连接蛋白样重复序列。瓜氨酸化的生腱蛋白-C或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段可以在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220、222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，瓜氨酸化的生腱蛋白-C或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段可以在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、
209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
[0072] 特定的瓜氨酸化的残基可以是表位或存在于表位中并且可以在这样的表位中被检测到。举例来说，所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT55、CIT209、CIT214、CIT219以及CIT220；或其组合。所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT50、CIT51、CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、CIT220以及CIT222；或其组合。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。
[0073] 在一个替代性实施方案中，所述药剂是反义寡核苷酸。
[0074] 可以用于有效地降低瓜氨酸化的生腱蛋白-C的水平/活性的反义分子的设计需要考虑对于反义方法来说重要的两个方面。第一个方面是将所述寡核苷酸递送到癌细胞的细胞质中，而第二个方面是以抑制细胞内指定的mRNA的翻译的方式特异性结合所述mRNA的寡核苷酸的设计。
[0075] 现有技术教导了可以用于有效地将寡核苷酸递送到多种多样的细胞类型中的许多递送策略(例如参见Luft，1998，J Mol Med 76：75-6；Kronenwett等，1998，Blood 91：852-62；Rajur等，1997，Bioconjug Chem 8：935-40；Lavigne等，1997，Biochem Biophys Res Commun 237：566-71；Aoki等，1997，Biochem Biophys Res Commun 231：540-5)。
[0076] 此外，基于热力学循环鉴定对靶mRNA具有最高的预测结合亲和力的那些序列的算法是可获得的，所述热力学循环说明了靶mRNA和寡核苷酸这两者中结构改变的能量学(例如参见Walton等，1999，Biotechnol Bioeng 65：1-9)。
[0077] 使用体外系统设计特异性寡核苷酸和预测所述特异性寡核苷酸的效率的多种方法也是已知的(例如参见Matveeva等，1998，Nature biotechnology 16：1374-1375)。
[0078] 许多临床试验已经证实了反义寡核苷酸的安全性、可行性以及活性。举例来说，适用于治疗癌症的反义寡核苷酸已经被成功使用(Holmlund等，1999，Curr Opin Mol Ther 1：372-85；Gerwitz，1999，Curr Opin Mol Ther 1：297-306)。最近，反义介导的对人类肝素酶基因表达的抑制已经被报道可抑制小鼠模型中人类癌细胞的胸膜播散(Uno等，2001，Cancer Res 61：7855-60)。
[0079] 因此，本领域技术人员能够容易地设计和实施适用于调节生腱蛋白-C的表达并且因此调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性的反义方法。
[0080] 有利的是，反义寡核苷酸具有15个至35个碱基的长度。举例来说，20聚体寡核苷酸已经被证实可抑制表皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等，Breast Cancer Res Treat 53：41-50(1999))并且25聚体寡核苷酸已经被证实使促肾上腺皮质激素的表达减少大于
90％(Frankel等，J Neurosurg 91：261-7(1999))。然而，应当了解的是，可能期望使用具有在这个范围之外的长度的寡核苷酸，例如10个、11个、12个、13个、或14个碱基、或36个、37个、38个、39个或40个碱基。
90％(Frankel等，J Neurosurg 91：261-7(1999))。然而，应当了解的是，可能期望使用具有在这个范围之外的长度的寡核苷酸，例如10个、11个、12个、13个、或14个碱基、或36个、37个、38个、39个或40个碱基。
[0081] 本领域技术人员还将了解的是，寡核苷酸会被细胞内源性核酸酶降解或灭活。为了应对这个问题，有可能使用修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸例如具有改变了的核苷酸间键，其中天然存在的磷酸二酯键已经被另一键置换。举例来说，Agrawal等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，7079-7083证实了使用寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯在组织培养物中对HIV-1提高的抑制。Sarin等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，7448-7451证实了使用寡核苷酸甲基膦酸酯对HIV-1提高的抑制。Agrawal等(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7790-7794证实了使用核苷酸序列特异性寡核苷酸硫代磷酸酯对早期感染的细胞培养物和慢性感染的细胞培养物这两者中HIV-1复制的抑制。Leither等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3430-3434报道了寡核苷酸硫代磷酸酯在组织培养物中对流感病毒复制的抑制。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7790-7794证实了使用核苷酸序列特异性寡核苷酸硫代磷酸酯对早期感染的细胞培养物和慢性感染的细胞培养物这两者中HIV-1复制的抑制。Leither等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3430-3434报道了寡核苷酸硫代磷酸酯在组织培养物中对流感病毒复制的抑制。
[0082] 具有人工键的寡核苷酸已经被证实为在体内对降解具有抗性。举例来说，Shaw等(1991)，Nucleic Acids Res.19，747-750报道了另外未修饰的寡核苷酸在它们在3′末端处由某些加帽结构封端时在体内对核酸酶更具抗性，并且未加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯在体内不会被降解。
[0083] 对合成寡核苷硫代磷酸酯的H-膦酸酯方法的详细说明提供于Agrawal和Tang(1990)Tetrahedron Letters 31，7541-7544中，该文献的教导在此以引用的方式并入本文。寡核苷甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、桥联氨基磷酸酯以及桥联硫代磷酸酯的合成是本领域已知的。参见例如Agrawal和Goodchild(1987)Tetrahedron Letters 28，3539；Nielsen等(1988)Tetrahedron Letters 29，2911；Jager等(1988)Biochemistry 27，7237；Uznanski等(1987)Tetrahedron Letters 28，3401；Bannwarth(1988)Helv.Chim.Acta.71，1517；Crosstick和Vyle(1989)Tetrahedron Letters 30，4693；Agrawal等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1401-1405，这些文献的教导以引用的方式并入本文。用于合成或产生的其它方法也是可能的。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)，尽管核糖核酸(RNA)序列也可以被合成和应用。
[0084] 可用于本发明中的寡核苷酸优选地被设计成能抵抗内源性溶核酶所引起的降解。寡核苷酸的体内降解会产生具有缩短的长度的寡核苷酸分解产物。这样的分解产物很可能参与非特异性杂交并且相对于它们的全长对应物，不太可能具有有效性。因此，期望使用在体内对降解具有抗性并且能够到达所靶向的细胞的寡核苷酸。可以通过用一个或多个内部人工核苷酸间键取代原生磷酸二酯键，例如通过在所述键中将磷酸酯用硫置换来使得本发明的寡核苷酸在体内对降解更具抗性。可以被使用的键的实例包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、各种氨基磷酸酯、磷酸酯、桥联硫代磷酸酯以及桥联氨基磷酸酯。这样的实例是说明性的，而不是限制性的，这是因为其它核苷酸间键是本领域公知的。具有取代磷酸二酯核苷酸间键的这些键中的一个或多个的寡核苷酸的合成是本领域公知的，包括用于产生具有混合核苷酸间键的寡核苷酸的合成途径。
[0085] 可以通过“加帽”或将相似的基团并入到5′末端核苷酸或3′末端核苷酸上来使得寡核苷酸对由内源性酶所引起的延伸具有抗性。用于加帽的试剂是可以Amino-Link IITM商购自加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied BioSystems Inc，Foster City，CA)。用于加帽的方法例如由以下文献所描述：Shaw等(1991)Nucleic Acids Res.19，747-750；以及Agrawal等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(17)，7595-7599。
[0086] 制备对核酸酶攻击具有抗性的寡核苷酸的另一种方法是使得它们“自稳定”，如由Tang等(1993)Nucl.Acids Res.21，2729-2735所述。自稳定的寡核苷酸在它们的3′末端处具有发夹环结构，并且表现出提高的对由蛇毒磷酸二酯酶、DNA聚合酶I以及胎牛血清所引起的降解的抗性。寡核苷酸的自稳定的区域不干扰与互补核酸的杂交，并且在小鼠中进行的药物代谢动力学和稳定性研究已经证实自稳定的寡核苷酸相对于它们的线性对应物有提高的体内持久性。
[0087] 在其中所述药剂是对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物的一个实施方案中，所述化合物可以与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性位点基本上可逆地或基本上不可逆地结合。在另一个实施例中，所述化合物可以与瓜氨酸化的生腱蛋白-C中不是活性位点的一部分结合，以干扰瓜氨酸化的生腱蛋白-C与配体或受体的结合。在再另一个实施例中，所述化合物可以与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一部分结合以通过变构效应降低蛋白质活性。这种变构效应可以是涉及瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性的天然调节，例如瓜氨酸化的生腱蛋白-C由“上游激活因子”激活的变构效应。或者，所述化合物可以与瓜氨酸化的生腱蛋白-C和ACPA的免疫复合物结合。
[0088] 用于检测测试化合物与瓜氨酸化的生腱蛋白-C之间的相互作用的方法是本领域公知的。举例来说，可以使用超滤连同离子喷雾质谱分析/HPLC方法或其它物理和分析方法。此外，可以使用荧光能量共振转移(FRET)方法，其中两个荧光标记的实体的结合可以通过测量荧光标记在彼此靠近时的相互作用来测量。
[0089] 检测多肽与高分子，例如DNA、RNA、蛋白质以及磷脂的结合的替代方法包括表面等离子体共振测定，例如如Plant等，1995，Ahalyt Biochem 226(2)，342-348中所述。方法可以利用经过标记，例如经过放射性标记或荧光标记所标记的多肽。
[0090] 鉴定能够与多肽结合的化合物的另一种方法是其中使所述多肽暴露于所述化合物并且检测和/或测量所述化合物与所述多肽的任何结合的方法。可以测定所述化合物与所述多肽结合的结合常数。用于检测和/或测量(定量)化合物与多肽的结合的合适的方法是本领域技术人员公知的，并且可以例如使用能够高通量操作的方法，例如基于芯片的方法来执行。被称作VLSIPSTM的新技术已经使得能够生产含有数十万个或更多个不同的分子探针的非常小的芯片。这些生物芯片或阵列具有被排列成阵列的探针，每一个探针被分配以特定的位置。已经生产出生物芯片，其中每一个位置具有例如十微米的规模。所述芯片可以用于确定靶分子是否与芯片上探针中的任一个相互作用。在所选择的测试条件下使所述阵列暴露于靶分子之后，扫描设备可以研究所述阵列中的每一个位置并且确定靶分子是否与处于该位置处的探针相互作用。
[0091] 鉴定对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物的另一种方法是酵母双杂交系统，其中本发明的多肽可以用于“捕捉”结合瓜氨酸化的生腱蛋白-C的蛋白质。酵母双杂交系统描述于Fields和Song，Nature 340：245-246(1989)中。
[0092] 在本发明的另一个实施方案中，所述药剂是对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有配体结合能力的化合物。
[0093] 举例来说，所述药剂可以是瓜氨酸化的生腱蛋白-C受体(如FPRL1)的可溶性片段。或者，所述药剂可以是模拟抗体的高亲和力分子(所谓的‘亲和体’)(例如参见US 5,831,
012和www.affibody.se)。这些配体是由三螺旋束构成的小的简单蛋白质，所述三螺旋束是基于蛋白A(来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白)的IgG结合域中的一个的支架。这一支架具有作为亲和配体的优良的特征并且可以被设计成以高亲和力与任何给定的靶蛋白结合。
012和www.affibody.se)。这些配体是由三螺旋束构成的小的简单蛋白质，所述三螺旋束是基于蛋白A(来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白)的IgG结合域中的一个的支架。这一支架具有作为亲和配体的优良的特征并且可以被设计成以高亲和力与任何给定的靶蛋白结合。
[0094] 本发明的第一个方面的药剂可以是抗体或其抗原结合片段。所述抗原结合片段可以选自由以下各项组成的组：Fv片段(例如单链Fv和二硫化物键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab′片段以及F(ab)2片段)、单个可变域(例如VH结构域和VL结构域)以及结构域抗体(dAb，包括单一形式和双重形式[即dAb-接头-dAb])。
[0095] 优选地，所述抗体或其抗原结合片段与瓜氨酸化的生腱蛋白-C特异性结合(即它不与非瓜氨酸化的生腱蛋白-C结合)。
[0096] 所述抗体可以优选地与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的激活TLR4的FBG结构域特异性结合，和/或所述抗体可以优选地与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的可选择的结构域结合。那些结构域中的一个或多个特别是可以被瓜氨酸化。
[0097] 使用抗体片段，而不是使用全抗体的优势是数倍的。更小尺寸的片段可以产生提高的药理学特性，如对实体组织更好的渗透。此外，抗原结合片段，如Fab、Fv、ScFv以及dAb抗体片段可以在大肠杆菌中表达并且由大肠杆菌分泌，从而允许容易地产生大量的所述片段。
[0098] 在本发明的范围内还包括抗体和其抗原结合片段的修饰型式，例如通过共价连接聚乙二醇或其它合适的聚合物来修饰。
[0099] 产生抗体和抗体片段的方法是本领域公知的。举例来说，可以经由多种方法中的任一种来产生抗体，所述方法利用对抗体分子的体内产生进行的诱导、对免疫球蛋白文库进行筛选(Orlandi.等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837；Winter等，1991，Nature 349：293-299)或在培养物中由细胞系产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术、以及埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)杂交瘤技术(Kohler等，1975.Nature 256：4950497；Kozbor等，1985.J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote等，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030；Cole等，
1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。
1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。
[0100] 合适的针对所选择的抗原的单克隆抗体可以通过已知的技术来制备，例如以下文献中所公开的那些技术：“单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A manual of techniques)”，H Zola(CRC Press，1988)；以及“单克隆杂交瘤抗体：技术与应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications)”，J G R Hurrell(CRC Press，1982)。
[0101] 抗体片段可以使用本领域公知的方法来获得(参见例如Harlow和Lane，1988，“抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)”，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。举例来说，根据本发明的抗体片段可以通过对抗体进行蛋白水解或通过使编码所述片段的DNA在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达来制备。或者，抗体片段可以通过常规方法对全抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。
[0102] 本领域技术人员将了解的是，对于人类治疗或诊断来说，优选地使用人源化的抗体。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是基因工程嵌合抗体或抗体片段，它们优选地具有源自于非人类抗体的最小部分。人源化的抗体包括其中人类抗体(接受体抗体)的互补决定区被来自非人类物种(如小鼠、大鼠或兔)的具有所期望的功能的互补决定区(供体抗体)的残基置换的抗体。在一些情况下，人类抗体的Fv框架残基被相应的非人类残基置换。人源化的抗体还可以包含既不存在于接受体抗体中，也不存在于所引入的互补决定区或框架序列中的残基。一般来说，人源化的抗体将包含至少一个，并且通常两个可变域的基本上全部，其中所有的或基本上所有的互补决定区对应于非人类抗体的那些互补决定区并且所有的或基本上所有的框架区对应于相关人类共有序列的那些框架区。人源化的抗体最佳地还包括通常源自于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分，如Fc区(参见例如Jones等，1986.Nature 321：522-525；Riechmann等，1988，Nature 332：323-329；Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596)。
[0103] 用于将非人类抗体人源化的方法是本领域公知的。一般来说，人源化的抗体具有从非人类来源引入它当中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基经常被称为引入的残基，所述残基通常是取自引入的可变域。人源化可以基本上如所述(参见例如Jones等，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等，1988.Nature 332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-15361；US 4,816,567)，通过将人类互补决定区用相应的啮齿类动物互补决定区取代来进行。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人类可变域已经被来自非人类物种的相应序列所取代。实际上，人源化抗体通常可以是其中一些互补决定区残基以及可能的一些框架残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基所取代的人类抗体。
[0104] 人类抗体还可以使用本领域已知的各种技术来鉴定，所述技术包括噬菌体展示文库(参见例如Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581；Cole等，1985，《单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal antibodies and Cancer Therapy)》，Alan R.Liss，第77页；Boerner等，1991.J.Immunol.147：86-95)。
[0105] 一旦获得合适的抗体，就可以例如通过ELISA来测试它们的活性。
[0106] 本发明的第一个方面的药剂可以是对Toll样受体4(TLR4)或Toll样受体4的辅助受体、或Fcγ受体、或生腱蛋白-C或这些物质中的任一种的结构域具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
[0107] 初级受体(如TLR4)的辅助受体有助于信号转导分子与初级受体的结合以促进配体识别和结合并且引发/维持由受体结合引起的生物过程。
[0108] 本发明的第一个方面的药剂可以是对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域具有结合亲和力的药剂。
[0109] 本发明的第一个方面的药剂可以是对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
[0110] 本发明的第一个方面的药剂可以是如下的药剂，所述药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222中的一个或多个具有结合亲和力；或所述药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220中的一个或多个具有结合亲和力；或所述药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、
209、214、219、以及220中的一个或多个具有结合亲和力。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基55具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基209具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基214具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基219具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基220具有结合亲和力的药剂。
209、214、219、以及220中的一个或多个具有结合亲和力。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基55具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基209具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基214具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基219具有结合亲和力的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基220具有结合亲和力的药剂。
[0111] 本发明的第一个方面的药剂可以是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222中的一个或多个具有特异性；或所述抗体或其抗原结合片段对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、72、120、169、173、
209、214、219、以及220中的一个或多个具有特异性；或所述抗体或其抗原结合片段对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、以及220中的一个或多个具有特异性。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基55具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基209具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基214具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基219具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基220具有特异性的药剂。
209、214、219、以及220中的一个或多个具有特异性；或所述抗体或其抗原结合片段对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、以及220中的一个或多个具有特异性。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基55具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基209具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基214具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基219具有特异性的药剂。本发明的第一个方面的药剂可以是对残基220具有特异性的药剂。
[0112] 本发明的第一个方面的药剂可以是调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域的生物活性的药剂。所述药剂除了瓜氨酸化的生腱蛋白-C的其它结构域的生物活性之外还可以调节FBG结构域的生物活性，或所述药剂可以仅调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的FBG结构域的生物活性。
[0113] 本发明的第一个方面的药剂可以调节在FBG结构域处被瓜氨酸化的瓜氨酸化的生腱蛋白-C。被调节的瓜氨酸化的生腱蛋白-C因此除了在生腱蛋白-C的一个或多个(或所有)其它结构域处被瓜氨酸化之外还可以在FBG结构域处被瓜氨酸化。瓜氨酸化的生腱蛋白-C也可以仅在FBG结构域处被瓜氨酸化。或者，瓜氨酸化的生腱蛋白-C可以仅在除FBG结构域以外的一个或多个结构域处被瓜氨酸化。换句话说，瓜氨酸化的生腱蛋白-C可能不是瓜氨酸化的FBG结构域，而在生腱蛋白-C的一个或多个或所有其它结构域处被瓜氨酸化。生腱蛋白-C的可以被瓜氨酸化的非FBG结构域的优选实例是III型纤维连接蛋白样重复序列。
[0114] 本发明的第一个方面的药剂可以调节在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化的瓜氨酸化的生腱蛋白-C，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220、222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，瓜氨酸化的生腱蛋白-C或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段可以在一个或多个特定的残基处被瓜氨酸化，其中所述一个或多个特定的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
[0115] 特定的瓜氨酸化的残基可以是表位或存在于表位中并且可以在这样的表位中被检测到。举例来说，所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT55、CIT209、CIT214、CIT219以及CIT220；或其组合。所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT50、CIT51、CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、CIT220以及CIT222；或其组合。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。
[0116] 本发明的第一个方面的药剂可以调节对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合特异性的自身抗体的生物活性。在优选的实施方案中，所述药剂结合单独的对瓜氨酸化的生腱蛋白具有结合特异性的自身抗体和/或在所述自身抗体是与瓜氨酸化的生腱蛋白-C的复合物的一部分时结合所述自身抗体。
[0117] 对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有结合特异性的自身抗体可以对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222中的一个或多个具有结合特异性；或可以对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220中的一个或多个具有结合特异性；或可以对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的如SEQ ID NO：70中所编号的残基55、209、214、219、以及220中的一个或多个具有结合特异性。
[0118] 在本发明的第二个方面，提供了一种鉴定调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性的药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
[0119] (i)提供一种或多种候选药剂；
[0120] (ii)使一种或多种细胞与瓜氨酸化的生腱蛋白-C和所述一种或多种候选药剂接触；
[0121] (iii)使一种或多种细胞与瓜氨酸化的生腱蛋白-C接触而不与候选药剂接触；
[0122] (iv)与对照步骤(iii)的一种或多种细胞相比，确定所述候选药剂是否调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C对步骤(ii)中的一种或多种细胞的作用。
[0123] 确定候选药剂是否调节瓜氨酸化的生腱蛋白-C的作用的方法可以使用实施例的方法来进行。
[0124] 与TLR4或任何其它适当的受体结合的生腱蛋白-C可以通过固相结合测定、表面等离子体共振、分析型凝胶过滤+/-抑制剂来测试。生腱蛋白-C/ACPA复合物的活性可以通过使用与用于单独的FBG相同的方法以及通过细胞+/-抑制剂对细胞因子的刺激进行的测试来说明。
[0125] 本发明的第二个方面的方法可以使得瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性上调。
[0126] 本发明的第二个方面的方法可以使得瓜氨酸化的生腱蛋白-C的活性下调。
[0127] 本发明的第二个方面的方法可以包括表达Toll样受体4(TLR4)和/或Fcγ受体的步骤(ii)和(iii)(上文所述)的细胞。
[0128] 本发明的第二个方面的方法可以具有选自由以下各项组成的组的一种或多种细胞：炎症细胞、成纤维细胞、成纤维细胞样细胞(包括RA滑膜成纤维细胞，也被称为滑膜细胞)、小鼠胚胎成纤维细胞、人类胚肾细胞。
[0129] 所述炎症细胞可以选自由以下各项组成的组：巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、淋巴细胞、单核细胞样细胞以及巨噬细胞样细胞。
[0130] 在本发明的第三个方面，提供了一种鉴定调节慢性炎症反应的药剂的方法，所述方法是通过执行本发明的第二个方面的方法来实现的。
[0131] 在这种方法中，慢性炎症可以与和不适当的炎症相关的任何病况相关。这样的病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
[0132] 具体来说，但在非排他性意义上，慢性炎症与类风湿性关节炎(RA)有关。
[0133] 在本发明的第四个方面，提供了一种根据本发明的第二个方面和第三个方面的方法所鉴定的药剂。这样的药剂可以调节慢性炎症反应。
[0134] 第四个方面的药剂可以下调慢性炎症反应。
[0135] 第四个方面的药剂可以上调慢性炎症反应。
[0136] 第四个方面的药剂可以选自由以下各项组成的组：短干扰RNA(SiRNA)分子、短发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物、抗体(多克隆或单克隆)和其抗原结合片段、小抑制剂化合物、多肽以及蛋白质。
[0137] 在本发明的第一个方面或第四个方面，所述慢性炎症可能与和不适当的炎症相关的任何病况相关。这样的病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
[0138] 在本发明的第五个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明的第一个方面或第四个方面所限定的药剂以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0139] 本领域技术人员将了解的是，这样的有效量的药剂或其制剂可以作为单次推注剂量(即急性施用)或更优选地，作为随时间推移一系列的剂量(即长期施用)来递送。
[0140] 本发明的药剂可以各种浓度被配制，这取决于所使用的化合物的功效/毒性和它所用于的适应症。优选地，所述制剂包含以下浓度的本发明的药剂：0.1μM至1mM，更优选地1μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至40μM，并且最优选地约30μM。对于体外施用，制剂可以包含更低浓度的本发明的化合物，例如0.0025μM至1μM。
[0141] 本领域技术人员将了解的是，本发明的药剂一般将在与关于预期施用途径和标准药学实践所选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物中被施用(例如参见《雷明顿：药学科学和实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)》，第19版，1995，Alfonso Gennaro编著，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA)。
[0142] 举例来说，本发明的药剂可以可能含有调味剂或着色剂的片剂、胶囊、卵形栓剂、酏剂、溶液或混悬液的形式口服、颊面或舌下施用以用于立即释放、延迟释放或受控释放应用。本发明的药剂还可以经由海绵体内注射来施用。
[0143] 这样的片剂可以含有赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙以及甘氨酸、崩解剂，如淀粉(优选地玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠以及某些复合硅酸盐；以及造粒粘结剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶以及阿拉伯树胶。此外，可以包括润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯以及滑石粉。
[0144] 相似类型的固体组合物还可以用作明胶胶囊中的填料。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬液和/或酏剂，本发明的化合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂以及与诸如水、乙醇、丙二醇以及甘油的稀释剂、以及其组合相组合。
[0145] 本发明的药剂还可以肠胃外施用，例如静脉内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下施用，或它们可以通过输注技术来施用。它们最好是以无菌水溶液的形式使用的，所述水溶液可以含有其它物质，例如足以使得所述溶液与血液等渗的盐或葡萄糖。如果需要的话，应当将水溶液适当地缓冲(优选地达到3至9的pH值)。通过为本领域技术人员公知的标准药学技术容易实现在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂。
[0146] 适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得所述制剂与预期接受体的血液等渗的溶质；以及可以包括助悬剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬液。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，从而在临用前只需要添加无菌液体载体，例如注射用水。临时的注射溶液和混悬液可以由先前所述种类的无菌粉末、颗粒以及片剂来制备。
[0147] 对于向人类患者口服和肠胃外施用，本发明的药剂的日剂量水平通常将是每个成人1mg至1000mg(即约0.015mg/kg至15mg/kg)，以单次剂量或分次剂量施用。
[0148] 本发明的药剂还可以鼻内或通过吸入来施用，并且方便地以借助于合适的推进剂来自加压容器、泵、喷雾器或雾化器的干粉吸入剂或气溶胶喷雾剂表现形式递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷，如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)；二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门以递送经过计量的量来确定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以容纳活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，它可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(由例如明胶制成)可以被配制成容纳本发明的化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0149] 气溶胶或干粉制剂优选地被布置成每一次计量剂量或‘每喷’含有至少1mg的本发明的化合物以向患者递送。将了解的是，在气溶胶的情况下总日剂量将因患者而异，并且可以单次剂量或更通常，在全天内以分次剂量施用。
[0150] 或者，本发明的药剂可以栓剂或子宫托的形式施用，或它们可以洗剂、溶液、乳膏剂、软膏剂或扑粉剂的形式局部施用。本发明的化合物还可以透皮施用，例如通过使用皮肤贴剂。它们还可以通过眼部途径来施用。
[0151] 对于眼科使用来说，本发明的药剂可以被配制成于等渗的经过pH值调节的无菌盐水中的微粉化的混悬液，或优选地被配制成于等渗的经过pH值调节的无菌盐水中的溶液，任选地与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。或者，它们可以被配制在软膏剂中，如矿脂。
[0152] 对于向皮肤局部施用，本发明的药剂可以被配制成合适的软膏剂，所述软膏剂含有悬浮在或溶解在例如含有以下各项中的一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡以及水。或者，它们可以被配制成合适的洗剂或乳膏剂，悬浮在或溶解在例如以下各项中的一种或多种的混合物中：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇以及水。
[0153] 适用于在口腔中局部施用的制剂包括糖锭，所述糖锭在调味基质中包含活性成分，所述调味基质通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；锭剂，所述锭剂在诸如明胶和甘油、或蔗糖以及阿拉伯树胶的惰性基质中包含活性成分；以及漱口剂，所述漱口剂在合适的液体载体中包含活性成分。
[0154] 在所述药剂是多肽的情况下，可能优选使用持续释放药物递送系统，如微球体。这些被特别设计成减小注射的频率。这样的系统的实例是Nutropin贮库，它将重组人生长激素(rhGH)封装在可生物降解的微球体中，所述微球体一旦被注射，就在一段持续时间内缓慢释放rhGH。
[0155] 或者，本发明的多肽药剂可以通过手术植入的设备来施用，所述设备将药物直接释放到所需的部位。
[0157] 蛋白质和多肽还可以通过电导入(electroincorporation，EI)来递送。当具有最多30微米的直径的小颗粒在皮肤表面上经受与用于电穿孔中的电脉冲相同或相似的电脉冲时发生EI。在EI中，这些颗粒被驱动穿过角质层并且进入皮肤的更深层。所述颗粒可以负载或包被有药物或基因或可以单纯用作在皮肤中产生药物可以进入的孔隙的“弹丸”。
[0158] 蛋白质和多肽递送的替代方法是热敏性ReGel注射剂。在低于体温下，ReGel是可注射的液体，而在体温下，它立即形成凝胶储库，它缓慢溶蚀和溶解成已知的安全的可生物降解的聚合物。活性药物随时间推移随着生物聚合物溶解而被递送。
[0159] 蛋白质和多肽药物还可以口服递送。一种这样的系统利用维生素B12在体内的口服吸收的自然过程来共同递送蛋白质和多肽。通过搭乘维生素B12吸收系统，蛋白质或多肽可以移动穿过肠壁。在维生素B12类似物与药物之间产生复合物，所述复合物保留了复合物的维生素B12部分对内因子(IF)的显著亲和力以及复合物的药物部分的显著生物活性这两者。
[0160] 用于施用本发明的寡核苷酸或多核苷酸药剂的方法也是本领域公知的(参见Dass，2002，J Pharm Pharmacol.54(1)：3-27；Dass，2001，Drug Deliv.8(4)：191-213；Lebedeva等，2000，Eur J Pharm Biopharm.50(1)：101-19；Pierce等，2005，Mini Rev Med Chem.5(1)：41-55；Lysik和Wu-Pong，2003，J Pharm Sci.20032(8)：1559-73；Dass，2004，Biotechnol Appl Biochem.40(Pt 2)：113-22；Medina，2004，Curr Pharm Des.10(24)：
2981-9)。
2981-9)。
[0161] 本发明的第五个方面的组合物还可以包含至少一种其它药剂。
[0162] 这样的另外的药剂可以是抗炎剂，它包括但不限于非类固醇抗炎剂(NSAID)、疾病调节抗风湿药物(DMARD)、他汀类(statin)(包括HMG-CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀(simvastatin))、生物制剂(生物制品)、类固醇、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。非类固醇抗炎剂包括抗代谢剂(如甲氨蝶呤(methotrexate))和抗炎金剂(包括硫代苹果酸金钠、硫代苹果酸金或金盐，如金诺芬(auranofin))。生物制品包括抗TNF剂(包括阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、抗IL-1试剂、抗IL-
6试剂、抗B细胞试剂(利妥昔单抗(retoximab))、抗T细胞试剂(抗CD4抗体)、抗IL-15试剂、抗CLTA4试剂、抗RAGE试剂)、抗体、可溶性受体、受体结合蛋白、细胞因子结合蛋白、具有改变了的或减弱的功能的突变蛋白、RNAi、多核苷酸适体、反义寡核苷酸或ω3脂肪酸。类固醇(也被称为皮质类固醇)包括可的松(cortisone)、泼尼松龙(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone)。免疫抑制剂包括环孢素(cylcosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)。水杨酸盐包括阿司匹林(aspirin)、水杨酸钠、水杨酸胆碱以及水杨酸镁。杀微生物剂包括奎宁(quinine)和氯喹(chloroquine)。举例来说，所述药剂可以与NSAID、DMARD或免疫抑制剂中的一种或多种组合施用。
6试剂、抗B细胞试剂(利妥昔单抗(retoximab))、抗T细胞试剂(抗CD4抗体)、抗IL-15试剂、抗CLTA4试剂、抗RAGE试剂)、抗体、可溶性受体、受体结合蛋白、细胞因子结合蛋白、具有改变了的或减弱的功能的突变蛋白、RNAi、多核苷酸适体、反义寡核苷酸或ω3脂肪酸。类固醇(也被称为皮质类固醇)包括可的松(cortisone)、泼尼松龙(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone)。免疫抑制剂包括环孢素(cylcosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)。水杨酸盐包括阿司匹林(aspirin)、水杨酸钠、水杨酸胆碱以及水杨酸镁。杀微生物剂包括奎宁(quinine)和氯喹(chloroquine)。举例来说，所述药剂可以与NSAID、DMARD或免疫抑制剂中的一种或多种组合施用。
[0163] 在本发明的第六个方面，提供了一种用作药物的如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物。
[0164] 在本发明的第七个方面，提供了一种用于治疗慢性炎症性病况的如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物。
[0165] 在本发明的第八个方面，提供了如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物用于制造用于治疗慢性炎症性病况的药物的用途。
[0166] 在本发明的第九个方面，提供了一种治疗慢性炎症性病况的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物。
[0167] 在优选的实施方案中，如本发明的第六个方面、第七个方面、第八个方面或第九个方面所限定的药剂、组合物、用途或方法与治疗慢性炎症性病况有关，其中所述慢性炎症性病况在具有瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有特异性的自身抗体的受试者体内。
[0168] 所述受试者所具有的瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或自身抗体可以在源自于所述受试者的血液、滑液和/或关节组织的样品中被找到。
[0169] “具有”瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有特异性的自身抗体意指任何瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体在样品中被检测到。
[0170] 可以通过使用不结合原生生腱蛋白-C的对瓜氨酸化的生腱蛋白-C具有特异性的抗体，然后例如通过ELISA和/或蛋白质印迹法进行免疫测定来将受试者鉴定为具有瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段。对于血清或组织/细胞，这优选地是夹心ELISA，即使用一种瓜氨酸化的生腱蛋白-C(citTNC)Ab作为捕捉剂，然后添加作为合适的稀释液的血清/组织裂解物，然后添加不同的二级citTNC抗体以进行检测。二级抗体可以被标记以用于进行检测或间接检测，如在任何标准ELISA方案中那样。在不能找到两种不同的合适的citTNC抗体的情况下，所述方法使用直接ELISA，所述直接ELISA由板上的血清/组织裂解物和被直接添加到其中的抗体构成。或者，可以使用非瓜氨酸化的TNC抗体进行捕捉，并且可以使用瓜氨酸化的TNC抗体进行检测，或反之亦然。这还允许测定原生TNC与瓜氨酸化的TNC的比率。
[0171] 或者，可以使生腱蛋白-C进行免疫沉淀，然后可以使用蛋白质印迹法或质谱分析来确定生腱蛋白-C是否被瓜氨酸化。
[0172] 可以通过用RA血清进行蛋白质印迹法来将受试者鉴定为具有对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体，如实施例中那样。
[0173] 或者，TNC中被瓜氨酸化的残基可以被更好地限定，然后建立肽测定(如上的蛋白质印迹法和/或在大蛋白质的情况下不可能的ELISA方法)。仅形成被瓜氨酸化的肽以及作为对照的非瓜氨酸化的肽。将板用肽包被并且施加RA血清并且用于检测抗体(关于所述方法的细节，参见Lundberg(2008))。用于所述测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包括包含选自包括以下残基的组中的任一个的瓜氨酸化的残基的任何生腱蛋白-C肽：残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。用于所述测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包括包含选自包括以下残基的组中的任一个的瓜氨酸化的残基的任何生腱蛋白-C肽：残基55、72、120、169、173、209、214、
219、以及220；或其组合。在一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT209和/或CIT214。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT219和/或CIT220。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。可以将上述肽的组合用于池中。可以使用具有相同序列的等同非瓜氨酸化的肽作为测定对照。
219、以及220；或其组合。在一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、和/或CIT220。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。在另一个实施方案中，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT209和/或CIT214。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT219和/或CIT220。或者，所述肽可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。可以将上述肽的组合用于池中。可以使用具有相同序列的等同非瓜氨酸化的肽作为测定对照。
[0174] 用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以呈环形或环状形式，例如以有助于抗体识别。
[0175] 用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有选自以下各项的一个或多个瓜氨酸化的残基：CIT50、CIT51、CIT55、CIT72、CIT120、CIT169、CIT173、CIT209、CIT214、CIT219、CIT220以及CIT222；或其组合。或者，用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有选自以下各项的一个或多个瓜氨酸化的残基：CIT55、CIT72、CIT120、CIT169、CIT173、CIT209、CIT214、CIT219、以及CIT220；或其组合。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT50。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT51。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT55。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT72。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT120。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT169。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT173。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT209。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT214。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT219。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT220。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或其片段可以包含SEQ ID NO：70的一部分的序列，该序列具有瓜氨酸化的残基CIT222。可以使用SEQ ID NO：70的两个或更多个不同的片段，所述片段相对于彼此具有不同的瓜氨酸化的残基。在提到SEQ ID NO：70的片段或序列时，还可以包括其变体。举例来说，变体可以具有来自SEQ ID NO：70的序列加上另外的氨基酸残基或修饰。
[0176] 瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或SEQ ID NO：70的一部分的序列可以包含约5个至约25个连续氨基酸残基。瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或SEQ ID NO：70的一部分的序列可以包含约10个至约25个连续氨基酸残基。瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或SEQ ID NO：70的一部分的序列可以包含约15个至约25个连续氨基酸残基。瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或SEQ ID NO：70的一部分的序列可以包含约18个至约22个连续氨基酸残基。瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽或SEQ ID NO：70的一部分的序列可以包含约8个至约20个连续氨基酸残基。
[0177] 举例来说，用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含选自包括以下各项的组中的任一个的肽序列：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63以及SEQ ID NO：64；或其变体和/或其组合。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：55的肽序列或其变体。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：57的肽序列或其变体。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：59的肽序列或其变体。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：61的肽序列或其变体。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：63的肽序列或其变体。用于肽测定的瓜氨酸化的生腱蛋白-C肽可以包含SEQ ID NO：64的肽序列或其变体。
[0178] 样品中瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段的存在以及任选的水平可以通过任何合适的测定来确定，所述测定可以包括使用包括以下各项的组中的任一种：免疫测定、光谱测定法、蛋白质印迹法、ELISA、免疫沉淀、狭线印迹或斑点印迹测定、等电聚焦、SDS-PAGE和抗体微阵列免疫组织染色、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定、使用亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素系统进行的免疫测定等或其组合。这些方法是本领域技术人员公知的。
[0179] 如本发明的第六个方面、第七个方面、第八个方面或第九个方面所限定的药剂、组合物、用途或方法可以与治疗慢性炎症性病况有关，其中所述病况与和不适当的炎症相关的任何病况有关。这样的病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
[0180] 在本发明的第十个方面，提供了一种多部分试剂盒，所述试剂盒用于执行本发明的第二个方面的方法，所述试剂盒包括：
[0181] (i)一种或多种细胞；
[0182] (ii)一种或多种细胞的对照样品；
[0183] (iii)瓜氨酸化的生腱蛋白-C的样品；
[0185] 本发明的第十个方面的试剂盒可以任选地包括：
[0186] (v)候选药剂。
[0187] 本发明的第十个方面的试剂盒还可以任选地包括
[0188] (vi)确定候选药剂对瓜氨酸化的生腱蛋白-C活性或慢性炎症的作用的装置。
[0189] 在本发明的第十一个方面，提供了一种多部分试剂盒，所述试剂盒包括：
[0190] (i)如本发明的第一个方面、第四个方面或第五个方面所限定的药剂或组合物；
[0191] (ii)施用装置；
[0192] (iii)它们的使用说明书。
[0193] 本发明的第十一个方面的试剂盒还可以任选地包括
[0194] (iv)至少一种其它药剂。
[0195] 在本发明的第十二个方面，提供了一种基于以下各项的存在或不存在确定用于患有慢性炎症性病况的受试者的适当的治疗的方法：(i)瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段；和/或(ii)对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体。
[0196] 在一个实施方案中，第十二个方面的方法包括以下步骤：
[0197] (i)提供源自于所述受试者的样品；
[0198] (ii)针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在测试所述样品，其中瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在或不存在决定了适当的治疗。
[0199] 在一个替代性实施方案中，第十二个方面的方法包括针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在测试来自所述受试者的样品，其中瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在或不存在决定了适当的治疗。
[0200] 在优选的实施方案中，所述样品是源自于所述受试者的血液、滑液和/或关节组织的样品。
[0201] 在一个优选的实施方案中，瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在决定了应当向所述受试者施用有效量的如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物。
[0202] 在一些实施方案中，所述方法用于确定用于患有炎症性病症的受试者的适当的治疗。
[0203] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0204] (i)提供源自于所述受试者的样品；以及
[0205] (ii)针对(i)瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段；和/或(ii)对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在测试所述样品，其中(i)瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段；和/或(ii)对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在或不存在指示了适当的治疗。
[0206] 在一个优选的实施方案中，(i)瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段；和/或(ii)对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在决定了应当向所述受试者施用有效量的药剂或组合物，所述药剂或组合物可以是以下各项中的一种或多种：抗TNF药物；抗IL17治疗；T细胞共刺激调节剂(如OrenciaTM-阿巴西普(abatacept))；白细胞介素-6(IL-6)抑制剂(如ActemraTM-托珠单抗(tocilizumab))；抗CD20抗体(如RituxanTM-利妥昔单抗)；B细胞激活因子(如抗BAFF)；janus激酶(JAK)抑制剂(如TofacitinibTM)；脾脏酪氨酸激酶(Syk)抑制剂(如FostamatinibTM)；抗TNC抗体或针对瓜氨酸化的生腱蛋白-C结构域的抗体；以及调节瓜氨酸化的和/或非瓜氨酸化的生腱蛋白-C的生物活性的药剂。
[0207] 在本发明的第十三个方面，提供了用于确定用于患有慢性炎症性病况的受试者的适当的治疗的方法中的瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段。
[0208] 在本发明的第十四个方面，提供了用于确定用于患有慢性炎症性病况的受试者的适当的治疗的方法中的对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体。
[0209] 在本发明的第十二个方面、第十三个方面或第十四个方面的优选的实施方案中，适当的治疗是施用有效量的如本发明的第一个方面、第四个方面以及第五个方面所限定的药剂或组合物。在优选的实施方案中，瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或对瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在决定了应当施用的适当的治疗。
[0210] 如本发明的第十二个方面、第十三个方面或第十四个方面所限定的方法、瓜氨酸化的生腱蛋白-C、瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段或自身抗体可以与确定慢性炎症性病况的适当治疗有关，其中所述病况与和不适当的炎症相关的任何病况有关。这样的病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、非愈合伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤、银屑病、强直性脊柱炎以及心血管疾病。
[0211] 在本发明的方法、试剂盒、测定或设备中，检测瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段的存在或不存在、或水平可以包括检测包含一个或多个特定的瓜氨酸化的残基的生腱蛋白-C或其片段。所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、
209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。
209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。
[0212] 特定的瓜氨酸化的残基可以是表位或存在于表位中并且可以在这样的表位中被检测到。举例来说，所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT55、CIT209、CIT214、CIT219以及CIT220；或其组合。所述表位可以包含选自以下各项的至少一个瓜氨酸化的残基：CIT50、CIT51、CIT55、CIT209、CIT214、CIT219、CIT220以及CIT222；或其组合。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT50。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT51。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT55。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT209。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT214。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT219。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT220。所述表位可以包含瓜氨酸化的残基CIT222。
[0213] 在本发明的方法、试剂盒、测定或设备中，检测对瓜氨酸化的生腱蛋白-C和/或瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段具有特异性的自身抗体的存在或不存在、或水平可以包括检测对包含一个或多个特定的瓜氨酸化的残基的表位具有特定亲和力的自身抗体。所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基50、
51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：
70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
51、55、72、120、169、173、209、214、219、220以及222；或其组合(如根据SEQ ID NO：70所确定的残基编号)。或者，所述一个或多个特定的瓜氨酸化的残基可以选自包括以下残基的组中的任一个：残基55、72、120、169、173、209、214、219、以及220；或其组合(如根据SEQ ID NO：
70所确定的残基编号)。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55、CIT209、CIT214、CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT50。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT51。
特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT55。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT214。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT220。在另一个实施方案中，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT209和/或CIT214。或者，特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT219和/或CIT220。特定的瓜氨酸化的残基可以包括CIT222。
[0214] 定义
[0215] 所谓“炎症”，我们包括了以下含义：由组织损伤、感染或局部免疫应答所引发的流体、血浆蛋白、以及白细胞的局部积聚。
[0216] 所谓“急性炎症”，我们包括了以下含义：在损伤、感染或局部免疫应答后立即出现的炎症的初始阶段(起始)以及短期短暂的炎症反应。通常，急性炎症会快速消退，持续几分钟到不超过几天。
[0217] 所谓“慢性炎症”，我们包括了持续的和/或不消退的炎症的含义。它往往与对健康组织的不适当的破坏相关。这可以是进行性的并且持续数周或更长的一段时间。慢性炎症通常与持续感染或包括但不限于自身免疫性病况的疾病相关。
[0218] 所谓“慢性关节炎症”，我们包括了持续性炎症的含义，所述持续性炎症在数周至数月的时间段内是进行性的并且不缓解，从而导致受影响的关节变形以及软骨和骨破坏的影像学证据，如在人类疾病中所观测到(Kelly，Harris，Ruddy以及Sledge，《风湿病学(Textbook of Rheumatology)》，第4版)。
[0219] 在实验性鼠类模型中，慢性关节炎症的特征在于不消退并且导致不适当的组织破坏，甚至是在一段相对短的时间内也会导致不适当的组织破坏的炎症。这在组织学上是通过滑膜和关节间隙中炎症细胞的长期存在、软骨细胞死亡、以及软骨和骨侵蚀来表征的(并且可以被鉴定)。
[0220] 所谓“药剂”，我们包括了所有的化学实体，例如寡核苷酸、多核苷酸、多肽、拟肽以及小化合物。
[0221] 所谓“瓜氨酸化”，我们意指蛋白质中的一个或多个精氨酸氨基酸转化成氨基酸瓜氨酸。
[0222] 所谓“瓜氨酸化的生腱蛋白-C的片段”或“瓜氨酸化的生腱蛋白-C的一个或多个片段”，我们意指源自于瓜氨酸化的生腱蛋白-C的瓜氨酸化的肽或结构域。瓜氨酸化的生腱蛋白-C的片段可以是瓜氨酸化的FBG结构域、瓜氨酸化的TA结构域、瓜氨酸化的EGF-L结构域、瓜氨酸化的TNIII结构域或来自于瓜氨酸化的生腱蛋白-C内部的任何其它序列。优选地，瓜氨酸化的生腱蛋白-C的片段具有抗原性。优选地，瓜氨酸化的生腱蛋白-C的片段具有生物活性。
[0223] 所谓“片段”，我们意指至少10个核苷酸，例如至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。
[0224] 所谓“变体”，我们意指核苷酸序列与所关注的全长序列共有至少90％的序列同一性，例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0225] 两个多核苷酸之间的序列同一性百分比可以使用合适的计算机程序，例如威斯康星大学(University of Wisconsin)遗传计算小组(Genetic Computing Group)的GAP程序来确定，并且将了解的是，同一性百分比是对于序列已经被最佳比对的多核苷酸来计算的。
[0226] 比对可以可选择地使用Clustal W程序来进行(如Thompson等，1994，Nuc.Acid Res.22：4673-4680中所述)。
[0227] 所使用的参数可以如下：
[0228] 快速成对比对参数：K-元组(字)长：1；窗口大小：5；空位罚分：3；顶部对角线数：5。计分方法：x％。
[0229] 多重比对参数：空位开放罚分：10；空位延伸罚分：0.05。
[0230] 计分矩阵：BLOSUM。
[0231] 或者，可以使用BESTFIT程序以确定局部序列比对。
[0232] 所谓“抗体”，我们包括了基本上完整的抗体分子、以及嵌合抗体、人源化的抗体、人类抗体(其中相对于天然存在的人类抗体，至少一个氨基酸突变)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、以及其抗原结合片段和衍生物。
[0233] 所谓“自身抗体”，我们意指由受试者的免疫系统制造的针对受试者自身的蛋白质中的一种或多种的任何抗体。
[0234] “自身抗原”是刺激自身抗体产生的内源性抗原。
[0235] 所谓“抗原结合片段”，我们意指抗体的能够与瓜氨酸化的生腱蛋白-C结合的功能片段。
[0236] 术语“受试者”意指包括人类在内的所有动物。受试者的实例包括人类、牛、狗、猫、山羊、绵羊、以及猪。术语“患者”意指患有需要治疗的病症的受试者。
[0237] 如本文所用的‘药物制剂’意指根据本发明的治疗有效制剂。
[0238] 如本文所用的‘治疗有效量’、或‘有效量’、或‘治疗有效的’指的是为给定的病况和施用方案提供治疗作用的量。这是经过计算以结合所需的附加剂和稀释剂，即载体或施用媒介物产生所期望的治疗作用的活性物质的预定量。此外，它意在意指足以减少并且最优选地防止在宿主中的活性、功能以及反应方面的临床上显著的缺陷的量。或者，治疗有效量足以使得宿主的临床上显著的病况有所改善。如本领域技术人员所了解的那样，化合物的量可以根据它的具体活性而不同。合适的剂量可以含有经过计算以结合所需的稀释剂产生所期望的治疗作用的预定量的活性组合物。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。治疗有效量可以由普通的熟练医学或兽医学工作人员，基于患者的特征，如年龄、体重、性别、病况、并发症、其它疾病等来确定，如本领域公知的那样。附图说明
[0239] 现在将参考以下附图描述体现本发明的一个方面的实施例：
[0240] 图1：生腱蛋白-C缺陷型小鼠的急性炎症的加速消退。
[0241] (a)在注射酵母多糖后随时间推移野生型小鼠(+/+)(白色条柱)和生腱蛋白-C基因敲除小鼠(-/-)(黑色条柱)的足肿胀。数据被显示为与注射前足直径相比足直径的平均增加+/-SEM(每种基因型n＝24只小鼠)。**＝p＜0.01。(b-e)在酵母多糖注射后的4天时来自野生型小鼠(b、c)和生腱蛋白-C基因敲除小鼠(d、e)的踝关节的代表性切片，所述切片是用苏木精和伊红(b、d)以及番红精-O(c、e)染色的。方框突出显示了一个或多个关节滑膜和软骨蛋白多糖(cp)。放大倍率×10。在注射酵母多糖后的4天时来自野生型小鼠(白色条柱)和生腱蛋白-C基因敲除小鼠(黑色条柱)的膝关节中关节炎症(f)和软骨细胞死亡(g)的定量。数据被表示为平均值(+/-SD)(每种基因型n＝24只小鼠)。*＝p＜0.05。
[0242] 图2：在注射抗原后在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中诱发了滑膜炎症。
[0243] (a-b、g)接受假注射的野生型小鼠的膝关节的代表性切片。(c-f、h-i)在关节内注射mBSA后24小时之时野生型小鼠(c、d、h)或生腱蛋白-C基因敲除小鼠(e、f、i)的膝关节的代表性切片。野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除小鼠这两者的关节囊、半月板以及关节间隙中的炎症细胞浸润分别由(cap)、(M)以及(J)突出显示。(S)突出显示了接受假注射的小鼠的沿整个骨表面不多于1个-3个细胞厚的健康滑膜，并且(ST)突出显示了野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除小鼠的显著变厚的滑膜。切片是用苏木精和伊红(a、c、e、g、h、i)以及番红精-O(b、d、f)染色的。放大倍率×10(a-f)或×40(g-i)。(每种基因型n＝5只小鼠)。
[0244] 图3：在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中滑膜炎症快速消退。
[0245] 在关节内注射mBSA后3天之时野生型小鼠(a、b、f)或生腱蛋白-C基因敲除小鼠(c、d、e)的膝关节的代表性切片。(a、c)线突出显示了与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比野生型小鼠的关节囊的炎症增加。(b、d)(cp)突出显示了与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比野生型小鼠的软骨蛋白多糖的丧失增加。(e、f)与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，在野生型小鼠中观测到显著的滑膜增生(线)、关节间隙中细胞和纤维蛋白的沉积物(箭头)以及血管翳的入侵(箭头尖)。切片是用苏木精和伊红(a、c、e、f)以及番红精-O(b、d)染色的。放大倍率×10(a-d)或×20(e-f)。(每种基因型n＝5只小鼠)。
[0246] 图4：在抗原诱发的关节炎期间生腱蛋白-C缺陷型小鼠被保护而免受组织破坏。
[0247] (a-b)在关节内注射mBSA后7天时野生型小鼠的膝关节的代表性切片，所述切片是用苏木精和伊红(a)以及番红精-O(b)染色的。放大倍率×10。(每种基因型n＝24只小鼠)。箭头尖突出显示了骨侵蚀的区域。箭头突出显示了进入关节软骨中的血管翳入侵。(c-d)在关节内注射mBSA后7天时生腱蛋白-C基因敲除型小鼠的膝关节的代表性切片，所述切片是用苏木精和伊红(c)以及番红精-O(d)染色的。放大倍率×10。(每种基因型n＝24只小鼠)。J突出显示了关节间隙并且AC突出显示了完整的关节软骨。(e)在注射mBSA后24小时、3天以及7天时来自野生型小鼠(白色条柱)和生腱蛋白-C基因敲除小鼠(黑色条柱)的膝关节炎症的组织学评分。数据表示平均值+/-SD(每种基因型n＝5(24小时、3天)或每种基因型n＝24(7天))。(f)在注射mBSA后在来自野生型小鼠(白色条柱)和生腱蛋白-C基因敲除小鼠(黑色条柱)的膝关节中软骨细胞死亡、软骨表面侵蚀以及骨侵蚀的定量。示出了在24小时、3天以及7天时的软骨细胞死亡，并且示出了在7天时的软骨表面侵蚀和骨侵蚀。数据表示平均值+/-SD(每种基因型n＝5(24小时、3天)或每种基因型n＝24(7天))。
[0248] 图5：生腱蛋白-C诱导了原代人类巨噬细胞和RA滑膜成纤维细胞中TNF-α、IL-6以及IL-8的合成。
[0249] (a-b)原代人类巨噬细胞(a)和RA滑膜成纤维细胞(b)未受刺激(无添加)或用LPS(1ng/ml(a)或10ng/ml(b))或重组生腱蛋白-C(1.0μM-1.0nM)刺激24小时。所示的数据是来自三次代表性实验中的一次实验的三次重复测量值的平均值(+/-SD)。(c)原代人类巨噬细胞未受刺激(无添加)或用LPS(1ng/ml)或重组生腱蛋白-C(1.0μM)刺激24小时。(-)指示将细胞与单独的培养基一起预孵育。(P)在刺激前将细胞与25μg/ml的多粘菌素B一起预孵育30分钟。(H)将细胞与无添加的或含有LPS或生腱蛋白-C的培养基一起孵育，所述培养基在被添加到细胞中之前被煮沸15分钟。所示的数据是来自三次代表性实验中的一次实验的三次重复测量值的平均值(+/-SD)。
[0250] 图6：生腱蛋白-C的FBG结构域在体内和体外介导了对细胞因子合成的刺激。
[0251] (a)原代人类巨噬细胞未受刺激(无添加)或用LPS(1ng/ml)、重组生腱蛋白-C(TNC)或1.0μM生腱蛋白-C结构域(TA、EGF-L、TNIII1-5、TNIII1-3、TNIII3-5、TNIII5-7、TNIII6-8以及FBG)刺激24小时。所示的数据是来自三次代表性实验中的一次实验的三次重复测量值的平均值(+/-SD)。(b)RA滑膜细胞未受刺激(无添加)或用LPS(10ng/ml)或重组FBG(1.0μM-0.01μM)刺激24小时。所示的数据是来自五名不同患者的与未受刺激的细胞相比细胞因子水平的平均变化％(+/-SEM)。(c-h)在关节内注射PBS(c-e)或1μg FBG(f-h)后3天时野生型小鼠的膝关节的代表性切片。切片是用苏木精和伊红(c、d、f、g)或番红精-O(e、h)染色的。放大倍率×10(c、f)或×25(d、e、g、h)(每种基因型n＝5只小鼠)。(i)在关节内注射PBS(黑色条柱)或1μg FBG(白色条柱)后3天时在野生型小鼠的膝关节中关节炎症、骨侵蚀、软骨表面侵蚀以及软骨细胞死亡的定量。数据表示平均值+/-SD(每种基因型n＝5)。
[0252] 图7：FBG介导的细胞因子合成具有MyD88依赖性。
[0253] (a)人类RA滑膜成纤维细胞未受感染、感染了单独表达GFP的腺病毒(AdGFP)或感染了表达显性负性MyD88的腺病毒(AdMyD88dn)。细胞未受刺激、用LPS(10ng/ml)刺激或用FBG(1μM)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。(b)从野生型(+/+)小鼠或MyD88缺陷型(-/-)小鼠分离的小鼠胚胎成纤维细胞未受刺激(-)或用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)、TNFα(100ng/ml)、IL-l(5ng/ml)以及FBG(1μM)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。
[0254] 图8：FBG介导的细胞因子合成具有TLR4依赖性，但是不需要CD14或MD-2。
[0255] (a)在刺激之前将原代人类巨噬细胞与单独的培养基或含有针对TLR2的功能阻断抗体(10μg/ml)、针对TLR4的功能阻断抗体(25μg/ml)或同种型对照抗体(25μg/ml)的培养基一起预孵育30分钟。细胞未受刺激、或用LPS(1ng/ml)、FBG(1μM)或PAM3(10ng/ml)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。(b)从野生型小鼠、TLR2缺陷型(TLR2 -/-)小鼠或TLR4缺陷型(TLR4 -/-)小鼠分离的小鼠胚胎成纤维细胞未受刺激或用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)、IL-1(5ng/ml)以及FBG(1μM)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。(c)从野生型小鼠、TLR2缺陷型(TLR2 -/-)小鼠或TLR4缺陷型(TLR4 -/-)小鼠分离的骨髓衍生的巨噬细胞未受刺激或用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)或FBG(1μM)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。(d)将人类巨噬细胞不与抑制剂一起预孵育、与1μg/ml的msbB LPS或10μg/ml的抗CD14抗体一起预孵育30分钟，之后用LPS(1ng/ml)、FBG(1μM)或PAM3(10ng/ml)刺激24小时。所示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。
[0256] 图9：在注射酵母多糖后随时间推移的足肿胀。
[0257] 未接受注射的生腱蛋白-C基因敲除小鼠(a、e)(直径1.6mm)、在酵母多糖注射后24小时(d、f)(直径2.5mm)和4天(b、h)(直径1.7mm)之时的生腱蛋白-C基因敲除小鼠以及在酵母多糖注射后4天时的野生型小鼠(c、g)(直径2.1mm)的足部的代表性图像。
[0258] 图10：重组蛋白的合成。
[0259] (a)生腱蛋白-C单体的结构域结构，所述生腱蛋白-C单体包含不同的结构域，包括组装结构域(TA)、14个半EGF样重复序列(EGF-L)、17个III型纤维连接蛋白样重复序列(TNIII)(8个是组成性表达的(1-8)并且9个可以是选择性剪接的)以及纤维蛋白原样球状结构域(FBG)。(b)由合成的重组蛋白所覆盖的区域、每一种蛋白质的相应氨基酸残基以及分子量。
[0260] 图11：蛋白质纯度的分析。
[0261] 显示出由SDS-PAGE在还原条件下分析的1μg的每一种重组蛋白的银染色的凝胶。泳道：1(TA)、2(EGF-L)、3(TNIII1-5)、4(TNIII5-7)、5(TNIII6-8)、6(TNIII1-3)、7(TNIII3-
5)以及8(FBG)。
5)以及8(FBG)。
[0262] 图12：在体内FBG介导的关节炎症需要TLR4的表达。
[0263] 在关节内注射1μg的FBG后3天时TLR2基因敲除小鼠(a)和TLR4基因敲除小鼠(b)的膝关节的代表性切片。切片是用苏木精和伊红染色的。放大倍率×10(每种基因型n＝5只小鼠)。(c)在关节内注射1μg FBG后3天时TLR2基因敲除小鼠(白色条柱)和TLR4基因敲除小鼠(黑色条柱)的膝关节中关节炎症、骨侵蚀、软骨表面侵蚀以及软骨细胞死亡的定量。数据表示平均值+/-SD(每种基因型n＝5)。
[0264] 图13：人类生腱蛋白-C和它的结构域的氨基酸序列。
[0265] 图14：人类生腱蛋白-C的核苷酸序列。
[0266] 图15：响应于特定的FBG肽的TNF合成。
[0267] 在无添加的情况下孵育或与100μM的每一种FBG肽(P1、P3-P9)一起孵育24小时的RA膜培养物的TNF合成。
[0268] 图16：响应于不同浓度的特定FBG肽的TNF和IL8合成。
[0269] 在无添加的情况下孵育或与25μM、100μM或250μM的FBG肽一起孵育24小时的RA膜培养物的TNF和IL8合成。
[0270] 图17：响应于LPS、完整FBG结构域或特定的FBG肽的IL8合成。
[0271] 在无添加的情况下孵育、与1ng/ml的LPS、1μM的完整FBG结构域(FBG)或1μM或20μM的FBG肽(P1、P3-P9)一起孵育24小时后巨噬细胞的IL8合成。
[0272] 图18：在与FBG肽一起预孵育后响应于LPS和FBG的IL8和TNF合成。
[0273] 在与20μM的FBG肽一起预孵育或没有预孵育的情况下，在无添加的情况下孵育、与1ng/ml的LPS或1μM的完整FBG结构域(FBG)一起孵育24小时后巨噬细胞的TNF和IL8合成。
[0274] 图19：响应于靶向生腱蛋白-C的siRNA的IL8和TNF合成。
[0275] 经过荧光素酶特异性siRNA(对照)、或经过以下靶向生腱蛋白-C的siRNA转染的RA成纤维细胞中生腱蛋白-C mRNA的水平：寡核苷酸1(si1)、寡核苷酸2(si 2)或寡核苷酸1+寡核苷酸2的组合(si1+2)。在存在或不存在10ng/ml的LPS的情况下，经过荧光素酶siRNA(对照)或经过靶向生腱蛋白-C的寡核苷酸1+寡核苷酸2的组合(siRNA)转染24小时的RA成纤维细胞中IL6的合成。
[0276] 图20：纯化的纤维蛋白原和FBG可以在体外被瓜氨酸化。
[0277] 考马斯染色的凝胶，示出了保持未修饰的(泳道2、6)或通过与瓜氨酸化缓冲液、PAD以及CaCl一起孵育而被瓜氨酸化的(泳道3、7)纯化的纤维蛋白原(泳道2-5)和FBG(泳道6-9)。通过观测这种蛋白质的MW增加来确认纤维蛋白原的瓜氨酸化。然而，FBG尺寸的变化不太明显。在不存在CaCl的情况下将蛋白质与PAD一起孵育或在不存在PAD的情况下将蛋白质与CaCl一起孵育对蛋白质尺寸没有影响(泳道4、5和8、9)。
[0278] 图21：纯化的全长生腱蛋白-C可以在体外被瓜氨酸化。
[0279] 考马斯染色的凝胶，所述凝胶示出了保持未修饰的(泳道9)或通过与瓜氨酸化缓冲液、PAD以及CaCl一起孵育而被瓜氨酸化的(泳道6)纯化的全长生腱蛋白-C。通过观测这种蛋白质的MW增加来确认生腱蛋白-C的瓜氨酸化。在不存在CaCl的情况下将生腱蛋白与PAD一起孵育或在不存在PAD的情况下将生腱蛋白与CaCl一起孵育对蛋白质尺寸没有影响(泳道7、8)。包括纯化的纤维连接蛋白作为上样对照(泳道2)。
[0280] 图22：FBG和TNC的瓜氨酸化的蛋白质印迹法确认。
[0281] 使用AMC检测试剂盒探测的原生TNC和瓜氨酸化的TNC(泳道8、9)以及原生FBG和瓜氨酸化的FBG(泳道4、5)的蛋白质印迹。包括原生纤维连接蛋白和瓜氨酸化的纤维连接蛋白(泳道2、3)、原生纤维蛋白原和瓜氨酸化的纤维蛋白原(泳道6、7)以及原生烯醇化酶和瓜氨酸化的烯醇化酶(泳道11、10)作为已知被瓜氨酸化的阳性对照。
[0282] 图23：FBG在体外由PAD瓜氨酸化。
[0283] 在体外通过在37℃在瓜氨酸化缓冲液(100mM Tris(pH 7.4)、10mM CaCl2、5mM DTT)中与不同浓度(每毫克蛋白质2单位、7单位以及20单位)的兔PAD2、人类PAD2以及人类PAD4一起孵育3小时、8小时以及24小时来将纯化的重组FBG瓜氨酸化。作为阴性对照，将2+
FBG-C在瓜氨酸化缓冲液中在不存在钙(-Ca )或不存在酶(PAD)的情况下孵育。(A)将1μg的每一个样品在SDS-PAGE上分离并且用考马斯蓝染色。由PAD瓜氨酸化的FBG迁移到略高于非瓜氨酸化的FBG的分子量处。(B)将蛋白质转移到硝化纤维素膜上并且在化学修饰混合物(0.0125％的FeCl3、2.3M的H2SO4、1.52M的H3PO4、0.25M的乙酸、0.25％的2，3-丁二酮一肟、
0.125％的安替比林(antipyrine))中孵育。用抗经过修饰的瓜氨酸的特异性抗体检测瓜氨酸化的蛋白质。
FBG-C在瓜氨酸化缓冲液中在不存在钙(-Ca )或不存在酶(PAD)的情况下孵育。(A)将1μg的每一个样品在SDS-PAGE上分离并且用考马斯蓝染色。由PAD瓜氨酸化的FBG迁移到略高于非瓜氨酸化的FBG的分子量处。(B)将蛋白质转移到硝化纤维素膜上并且在化学修饰混合物(0.0125％的FeCl3、2.3M的H2SO4、1.52M的H3PO4、0.25M的乙酸、0.25％的2，3-丁二酮一肟、
0.125％的安替比林(antipyrine))中孵育。用抗经过修饰的瓜氨酸的特异性抗体检测瓜氨酸化的蛋白质。
[0284] 图24：瓜氨酸化增强了FBG刺激的细胞因子产生。
[0285] 保持未受刺激(UN)或受到0.1μM-1.0μM非瓜氨酸化的FBG(nFBG)或瓜氨酸化的FBG(cFBG)刺激的原代人类巨噬细胞中TNF的合成。包括单独的瓜氨酸化缓冲液(CIT)和含有PAD的缓冲液(CIT+PAD)作为对照。在不存在PAD的情况下与瓜氨酸化缓冲液一起孵育或在不存在钙的情况下与PAD一起孵育的FBG没有被瓜氨酸化并且没有表现出细胞因子合成的提高(未示)。
[0286] 图25：50名RA患者中有十名患者(20％)以及50名对照中无一名通过蛋白质印迹法与瓜氨酸化的生腱蛋白-C反应。
[0287] (A)原生的纯化的人类重组生腱蛋白-C(nTNC)和瓜氨酸化的纯化的人类重组生腱蛋白-C(cTNC)的考马斯染色凝胶(上图)。用AMC试剂盒通过蛋白质印迹法所证实的生腱蛋白-C的瓜氨酸化(下图)。(B)用来自RA患者(RA)或正常健康对照(NH)(n＝50)的血清探测的cTNC的代表性蛋白质印迹。使用任何血清在nTNC的印迹中没有观测到反应性(未示)。
[0288] 图26：来自RA患者的一个子集的血清表现出与citTNC的反应性。
[0289] 用来自7名不同的RA患者的血清探测的cTNC的蛋白质印迹显示出一名阳性患者(泳道4)。
[0290] 图27：来自RA患者的一个子集的血清表现出与citTNC的反应性。
[0291] 用来自8名另外的RA患者的血清探测的cTNC的蛋白质印迹显示出一名阳性患者(泳道4)。
[0292] 图28：来自正常健康对照的血清没有表现出与citTNC的反应性。
[0293] 用来自8名不同对照的血清探测的cTNC的蛋白质印迹没有显示出阳性患者。
[0294] 图29：示出了针对瓜氨酸化的TNC加上瓜氨酸化的FBG的RA血清。
[0295] 共同在同一个孔中进行电泳并且用来自7名不同的RA患者的血清探测的cTNC加上cFBG的蛋白质印迹。观测到与全长TNC(320kD)反应，但不与FBG反应的患者子集(泳道4、5)或与cit FBG(27kd)反应，但不与全长TNC反应的患者(泳道6)。
[0296] 图30：通过LC-MS/MS限定瓜氨酸化的位点。
[0297] (A)通过LC-MS/MS确定了由rPAD2(圆圈)、hPAD2(矩形)以及hPAD4(三角形)瓜氨酸化的精氨酸残基。瓜氨酸化的位点加下划线，非瓜氨酸化的位点加下划虚线，并且没有由LC-MS/MS分析所覆盖的位点用*标记。(B)FBG结构域的序列。示出了所有的精氨酸残基，被修饰成瓜氨酸残基的精氨酸残基加下划线。用*标记的精氨酸没有由LC-MS/MS分析所覆盖。
[0298] 图31：鉴定瓜氨酸化的抗体表位
[0299] (A)设计了具有对应于FBG的氨基酸序列的序列的肽，其中在氨基末端和羧基末端处添加有半胱氨酸残基并且在由LC-MS/MS所鉴定出的位置处将精氨酸残基换成瓜氨酸残基。(B)在患有类风湿性关节炎的患者(RA；n＝20)和健康对照(n＝20)中对瓜氨酸化的FBG肽和含有精氨酸的对照肽的IgG反应。使用对照血清的第95个百分位数来确定阳性(虚线)。使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)来计算组间差异的p值(n.s.＝无显著性差异；*＝p＜0.05；以及**＝p＜0.01；***＝p＜0.001；****＝p＜0.001)。
[0300] 图32：FBG的瓜氨酸化减少了HDF和RAF的细胞粘附。
[0301] (A)被鉴定为结合整合素αvβ3的序列以白色示出(Yokoyama等，2000)。在这个序列内，两个精氨酸(以黑色示出)被鉴定为被瓜氨酸化。(B)将96孔板的孔用不同浓度的FBG、瓜氨酸化的FBG(cFBG)、在不含钙的缓冲液中孵育的FBG(FBG-Ca2+)、或在不存在PAD的情况下孵育的FBG(FBG-PAD)包被。作为阳性对照，将孔用纤维连接蛋白(FN)(1μg/ml)包被，并且用BSA(10mg/ml)包被用作阴性对照。将板与人类真皮成纤维细胞(HDF)或来自RA患者的滑膜成纤维细胞(RAF)孵育45分钟并且通过测定在用结晶紫(0.1％)染色后贴壁细胞的吸光度来测量粘附。数据被示为至少四次独立实验的平均值+s.e.m.，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。
具体实施方式
[0302] 实施例1：一般方法
[0303] 试剂
[0304] 酵母多糖、甲基化的BSA以及弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)、抗FLAG M2抗体(小鼠单克隆抗体)、杀稻瘟菌素、以及同种型对照抗体(小鼠IgG2a、IgG1)来自于西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(英国的多塞特(Dorset，UK))。Hypnorm(芬太尼-氟阿尼酮)来自于VetaPharma有限公司(英国的利兹(Leeds，UK))。鲎阿米巴样细胞裂解物测定来自于Associates of Cape Cod公司(英国的利物浦(Liverpool，UK))。野生型人类胚肾(HEK293-EBNA)细胞来自于英杰公司(Invitrogen)(荷兰的格罗宁根(Groningen，Netherlands))。M-CSF和鼠类IL-1β来自于派普泰克公司(PeproTech)(法国的塞纳河畔讷伊(Neuilly-Sur-Seine，France))。DMEM、RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素、抗生素-抗霉菌溶液PSA以及β-巯基乙醇来自于PAA实验室公司(PAA Laboratories)(英国的约维尔(Yeovil，UK))。稳定表达人类TLR2和TLR4/CD14/MD-2的HEK293细胞系、多粘菌素B、msbB LPS以及功能阻断TLR2(克隆：TL2.1；同种型：小鼠IgG2a)和TLR4抗体(克隆：HTA125；同种型：小鼠IgG2a)来自于Invivogen公司(英国的卡恩(Calne，UK))。苯酚-氯仿纯化的大肠杆菌LPS(粗糙型和光滑型)和Pam3Cys-Ser-Lys4(Pam3C)来自于亚历克西斯公司
(Alexis)(英国的伯明翰(Birmingham，UK))。鼠类TNF-α和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra-IL-
1F3)来自于R&D系统公司(R&D Systems)(英国的阿宾登(Abingdon，UK))。功能阻断抗CD14抗体(同种型：小鼠IgG1)来自于艾博抗公司(Abcam)(英国的剑桥(Cambridge，UK))。人类和鼠类TNF-α、IL-6、以及IL-8ELISA来自于Pharmingen公司(英国的牛津(Oxford，UK))。
(Alexis)(英国的伯明翰(Birmingham，UK))。鼠类TNF-α和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra-IL-
1F3)来自于R&D系统公司(R&D Systems)(英国的阿宾登(Abingdon，UK))。功能阻断抗CD14抗体(同种型：小鼠IgG1)来自于艾博抗公司(Abcam)(英国的剑桥(Cambridge，UK))。人类和鼠类TNF-α、IL-6、以及IL-8ELISA来自于Pharmingen公司(英国的牛津(Oxford，UK))。
[0305] 全长生腱蛋白-C的纯化
[0306] 为了确保细胞因子的产生不是归因于细菌污染物，如LPS和LPS相关分子，我们将重组全长人类生腱蛋白-C从经过pCEP-pu载体中的his标记的人类生腱蛋白-C转染的哺乳动物细胞系HEK293的条件培养基中纯化，如所述(Lange(2007))。如所述(Lange(2007))将生腱蛋白-C纯化到均一并且使用鲎阿米巴样细胞裂解物测定，根据制造商的说明书测定它无LPS污染。
[0307] 重组蛋白的合成
[0308] 合成对应于生腱蛋白-C的每一个结构域的蛋白质(TA、EGF-L、各种TNIII重复序列以及FBG)并且将它们纯化。参见实施例2。
[0309] 重组蛋白中LPS污染的测量
[0310] 为了确定每一种重组蛋白中LPS的水平，根据制造商的说明书使用鲎阿米巴样细胞裂解物测定(灵敏度：每毫克蛋白质约0.7pg±0.5pg LPS)。用于这一研究的所有重组蛋白均具有低于10pg/ml的LPS水平。
[0311] 腺病毒载体和它们的繁殖
[0312] 编码野生型MyD88(AdMyD88wt)、MyD88的显性负性形式(AdMyD88dn)以及GFP对照(AdGFP)的重组复制缺陷型腺病毒载体是在内部构建的。对这些病毒的合成的说明见于Andreakos(2004)中。用于这一研究的所有病毒均是E1/E3缺失的，属于Ad5血清型。使病毒在293人类胚肾细胞中繁殖，通过超速离心法，经由两个氯化铯梯度纯化，并且通过空斑测定来确定病毒滴度，如先前所述(Sacre(2007))。
[0313] 动物
[0314] 来自由Saga(1992)所描述的原种的基于129/sv的纯合的生腱蛋白-C缺陷型小鼠是由Charles French-Constant教授(英国的爱丁堡大学(University of Edinburgh，UK))提供的，所述129/sv是具有白色腹部和刺鼠外观背景的小鼠的近交系。年龄匹配的同类系近交系野生型129/sv小鼠是从查尔斯河公司(Charles River)(英国的马盖特(Margate，UK))获得的。所有的生腱蛋白-C缺陷型小鼠和野生型129/sv小鼠均是雄性的并且在实验时是8周-10周大。
[0315] 基于C57BL/6背景(具有黑色皮毛的小鼠的近交系)的纯合的TLR2和TLR4缺陷型小鼠是从B&K Universal公司(英国的胡尔(Hull，UK))获得的(Hoshino(1999)和Takeuchi(1999))。基于C57BL/6背景的纯合的MyD88缺陷型小鼠是由桑格研究所(Sanger Institute)(英国的剑桥(Cambridge，UK))提供的。年龄匹配的同类系近交系野生型C57B/L6小鼠是从查尔斯河公司(英国的马盖特)获得的。对于小鼠胚胎成纤维细胞的分离，使8周-10周大的一只雌性与8周-10周大的两只雄性交配。对于骨髓衍生的巨噬细胞的分离，小鼠是雌性的并且在实验时是10周-12周大。
[0317] 统计方法
[0318] 使用GraphPad 3版(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA))计算平均值、SD、SEM、以及统计检验。在适当时，通过单因素方差分析，继而通过杜奈特多重比较检验(Dunnett Multiple Comparisons test)来分析多组平均值。将非配对t检验用于仅包括两组的实验。
[0319] 实施例2：重组蛋白的合成
[0320] 合成对应于生腱蛋白-C的每一个结构域的蛋白质(TA、EGF-L、各种TNIII重复序列以及FBG)并且将它们纯化。所合成的重组蛋白描绘于图9中。
[0321] 试剂
[0322] Pfu Turbo聚合酶来自于Stratagene公司(荷兰的阿姆斯特丹(Amsterdam，Netherlands))。Easy mix 50 PCR管来自于分子生物制品公司(Molecular Bioproducts)(英国的拉特沃思(Lutterworth，UK))。RNeasy试剂盒和Ni2+-NTA-琼脂糖柱来自于快而精公司(Qiagen)(英国的克劳利(Crawley，UK))。pCR Blunt载体、pCEP4质粒载体、人类胚肾(HEK293-EBNA)细胞以及4％-12％Bis-Tris梯度凝胶来自于英杰公司(荷兰的格罗宁根)。pET32b载体和BL21(DE3)Rosetta细胞来自于Novagen公司(英国的肯特(Kent，UK))。HiTrap Q柱、HiTrap S柱、Sephacryl S500 HR柱以及肝素琼脂糖凝胶柱来自于阿默舍姆公司(Amersham)(英国的白金汉郡(Buckinghamshire，UK))。
[0323] 限制性内切酶是从新英格兰生物实验室公司(New England BioLabs)(英国的希钦(Hitchin，UK))获得的。DMEM、胎牛血清(FBS)以及青霉素/链霉素来自于PAA实验室公司(英国的约维尔)。FuGENE6转染试剂来自于罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)(瑞士的巴塞尔(Basel，Switzerland))。
[0324] 抗FLAG M2抗体(小鼠单克隆抗体)、抗FLAG M2-琼脂糖、FLAG肽来自于西格玛-奥德里奇公司(英国的多塞特)。抗四组氨酸抗体(小鼠单克隆抗体)来自于快而精公司(英国的克劳利)。碱性磷酸酶缀合的山羊抗(小鼠IgG)IgG和Western Blue稳定化的碱性磷酸酶底物来自于普洛麦格公司(Promega)(英国的南安普敦(Southampton，UK))。SDS-PAGE的精确蛋白标准品来自于伯乐公司(BioRad)(英国的赫默尔亨普斯特德(Hemel Hempstead，UK))。
[0325] 引物设计
[0326] 结构域边界是使用人类生腱蛋白-C序列(Siri(1991)，登录号：P24821(Swiss-Prot))中公开的比对来确定的。为了克隆每一个结构域，我们设计了PCR引物，其中正向引物和反向引物这两者均含有对应于必要的编码序列的5′末端和3′末端序列的18个-21个碱基。正向引物含有Nde1限制性酶切位点，后面是N末端his标签，紧接着是编码序列。Nde1位点的最后3个碱基形成了ATC甲硫氨酸起始密码子。反向引物包括紧跟在编码序列后的TTA终止密码子，后面是BamH1或Kpn1位点以允许单向克隆到pET32b表达载体中。
[0327] 表1
[0328]
[0329]
[0330] 上述所有引物均是按5′到3′写出的。Flag序列以粗体表示，His标签(CATCATCATCATCATCAT[SEQ ID NO：19])加下划线，并且限制性内切酶切割位点(CATATG＝Nde1位点；GGATCC＝BamH1；GGTACC＝Kpn1位点)以粗斜体表示。
[0331] PCR
[0332] 使用10pmol/μl的每一种引物、1μg模板、5μl的DMSO、以及1.25单位的Pfu Turbo聚合酶，以25μl的最终体积进行PCR扩增。将这添加到Easy mix 50管中的缓冲液和dNTP中。用于所有反应的模板是使用以RNeasy试剂盒分离的RNA由U87MG人类神经胶质瘤细胞制备的cDNA。使反应循环40次，变性温度、退火温度以及延伸温度分别是95℃、55℃-65℃(这取决于引物的解链温度(Tm))以及72℃。
[0333] 克隆
[0334] 使PCR产物连接到pCR Blunt载体中并且测序以确保没有错误由PCR引入。选择没有错误或沉默突变的克隆。然后使用被工程化到引物(TN5-7和TN6-8)中的Nde1和BamH1限制性酶切位点将插入序列连接到pET32b中。人类生腱蛋白-C在TA结构域(位置494)和TNIII2(位置2509)内具有内部BamH1位点。因此使用正向引物中的Nde1位点和pCRBlunt的克隆位点中的Kpn1位点来克隆TA和TN1-8。人类生腱蛋白-C不含内部Kpn1位点。使用引物中的Nde1和Kpn1位点来克隆TN1-5、TN1-3以及TN3-5。FBG含有内部Nde1位点(位置6439)并且因此使用Nde1和BamH1消化，继而Nde1消化的两步连接来克隆。(位置指的是图14中所给出的生腱蛋白-C的全长核苷酸序列内的位点)
[0335] 细菌生长、诱导以及裂解
[0336] 将质粒转化到BL21(DE3)Rosetta细胞中，将所述细胞培养在含有50μg/ml羧苄青霉素的3L卢里亚-贝尔塔尼培养基(Luria-Bertani medium)中并且用1mM的异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷来诱导。在3小时后，通过以4,000rpm离心20分钟来收集细胞，将所述细胞用冰冷的洗涤缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH 8.0)、100mM的NaCl、以及1mM的EDTA)洗涤两次，并且用法式压机(French press)来裂解。通过在4℃以12,000rpm离心20分钟来收集包涵体。除了TA和FBG之外，蛋白质完全位于上清液中。在室温在恒定搅拌下用6M盐酸胍、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、以及10mM β-巯基乙醇从包涵体中提取重组TA和FBG蛋白，持续2小时。
[0337] 细菌蛋白质的纯化
[0338] 将含有重组蛋白的溶液施加到Ni2+-NTA-琼脂糖柱上并且用含有20mM咪唑的50mM的Tris-HCl(pH 8.0)洗涤。随后将柱用50mM的Tris-HCl(pH8.0)洗涤并且将蛋白质用含有60mM咪唑的50mM的Tris-HCl(pH 8.0)洗脱。对于TA和FBG，每一种洗涤缓冲液和洗脱缓冲液含有6M盐酸胍。在Ni色谱后，TA和FBG不需要后续的纯化。将TN1-3和TN6-8通过使用HiTrap Q柱进行阴离子交换色谱法来进一步纯化，将TN1-5、TN3-5以及TN5-7通过使用HiTrap S柱进行阳离子交换色谱法来纯化，并且将TN1-8使用HiTrap S柱，继而使用Sephacryl S500 HR柱进行凝胶过滤来纯化。
[0339] 不溶性蛋白质的重新折叠
[0340] 通过用含有6M盐酸胍的50mM的Tris-HCl(pH 8.0)稀释到20μg/ml，然后在搅拌下在4℃用20mM胱胺处理16小时来使TA和FBG重新折叠。然后将溶液在4℃相对于15倍体积的含有150mM NaCl、10mM CaCl2、5mM β-巯基乙醇、以及1mM 2-羟乙基二硫化物的50mM Tris-HCl(pH 8.0)透析两次，持续24小时，在4℃相对于20mM Tris-HCl(pH 8.0)透析两次，持续8小时，然后在4℃以12,000rpm离心30分钟。在还原条件和非还原条件下使用SDS PAGE通过尺寸变化来评估重新折叠。通过TA结构域聚合和与肝素琼脂糖凝胶柱结合的FBG来确认蛋白质的活性。
[0341] 使用哺乳动物细胞合成EGF-L结构域
[0342] 最初使用大肠杆菌表达系统来表达和纯化EGF-L重复序列区域的尝试是不成功的。这最有可能归因于由于在该区域中有总共91个半胱氨酸而难以实现蛋白质折叠。因此，使用HEK293细胞表达TN-C的EGF样结构域。
[0343] 进行了两个PCR反应。第一PCR产物由限制性内切酶KpnI位点、Kozak序列、之后的TN-C信号序列组成。第二PCR产物由FLAG肽、EGF样结构域序列、之后的组氨酸标签和BamH1限制性内切酶序列组成。
[0344] 将这两个PCR产物连接在一起，如由Ho(1989)所述。如上文所述进行PCR反应。将整个构建体克隆到PCR blunt载体中并且测序。然后将它亚克隆到pCEP4载体中。使用Fugene将DNA转染到HEK293细胞中，并且在含有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100单位/毫升)以及链霉素(100单位/毫升)的杜氏改良伊格氏培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)中针对潮霉素抗性(200μg/ml)来选择细胞。将来自稳定转染的细胞的2升条件培养基(在培养基中培养细胞后所收集)收集并且汇集。将所汇集的条件培养基(2升)以3000rpm离心以从培养基中分离细胞碎片。
[0345] 然后将培养基施加到抗FLAG柱上。将物质收集在流过的50ml级分中。将柱用10倍柱体积的1M NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)洗涤，然后用10倍柱体积的60％异丙醇洗涤以确保去除LPS。然后将柱用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤，并且最终在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中使用200μg/ml的FLAG肽洗脱蛋白质。
[0346] 蛋白质纯度的分析
[0347] 将每一种蛋白质相对于1000倍体积的150mM NaCl和50mM Tris(pH 7.5)透析。在还原条件下通过SDSPAGE来分析蛋白质纯度。为了做到这样，使1μg的每一种纯化的重组蛋白在4％-12％Bis-Tris梯度凝胶上进行电泳并且随后对凝胶进行银染色以显示单个条带(图10)。还进行蛋白质印迹分析。将由SDS-PAGE分离的蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用含5％BSA的Tris缓冲盐水封闭，然后与识别FLAG M2的一抗(1∶2000稀释)(EGF-L)或四组氨酸抗体(1∶2000)(所有其它蛋白质)一起孵育。然后将印迹与和碱性磷酸酶缀合的二抗一起孵育，并且使用Western Blue稳定化的底物使蛋白质条带可视化，借此凝胶显示出在预期的Mw处由每一种抗体识别的单个特异性条带(未示)。
[0348] 实施例3：动物模型
[0349] 酵母多糖诱发的关节炎
[0350] 在生腱蛋白-C缺陷型小鼠和野生型小鼠中，通过注射酵母多糖(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))来诱发酵母多糖诱发的关节炎(ZIA)，如Keystone(1977)中所述。通过将15mg的酵母多糖溶解在1ml的无菌PBS中来制备酵母多糖。将溶液煮沸两次并且超声处理。通过腹膜内注射150μl的Hypnorm(在无菌水中1∶10稀释)来使小鼠麻醉，然后将酵母多糖(10μl)注射到右侧足垫中(d＝0)。
[0351] 对照小鼠接受单独的10μl PBS的注射或不接受注射。对于关节炎的肉眼评估，每天用测微计(德国Schluchlem的Kroeplin公司(Kroeplin，Schluchlem，Germany))测量每只后足的厚度并且将直径表示为每只小鼠每只发炎的后足的平均值。
[0352] 在实验完成后(天数＝4)，使小鼠安乐死并且将后足固定在10％(v/v)缓冲的福尔马林中，用10％EDTA脱钙并且处理到石蜡中。
[0353] 抗原诱发的关节炎
[0354] 在生腱蛋白-C缺陷型小鼠和野生型小鼠中诱发抗原诱发的关节炎(AIA)，如先前由Brackertz(1977)所述。简单地说，在第0天，通过腹膜内注射150μl的Hypnorm(在无菌水中1∶10稀释)使小鼠麻醉，然后用200μg的甲基化BSA进行免疫接种。将mBSA在0.2ml的弗氏完全佐剂中乳化并且在尾基部进行真皮内注射。
[0355] 在第7天，通过使用无菌的33号微型插管将mBSA(100μg于10μl的无菌PBS中)关节内注射到右侧膝关节中来诱发关节炎。对照小鼠接受单独的101PBS的注射或不接受注射。
[0356] 在第14天，使小鼠安乐死，将膝关节切除并且固定在10％(体积/体积)缓冲福尔马林中，用10％EDTA脱钙并且处理到石蜡中。
[0357] FBG的注射
[0358] 通过腹膜内注射150μl的Hypnorm(在无菌水中1∶10稀释)使野生型小鼠麻醉，然后使用无菌的33号微型插管将于10μl的无菌PBS中的100ng、1μg或3μg的FBG注射到右侧膝关节中。对照小鼠接受单独的10μl PBS的注射或不接受注射。
[0359] 在第3天和第7天，使小鼠安乐死，将膝关节切除并且固定在10％(体积/体积)缓冲福尔马林中，用10％EDTA脱钙并且处理到石蜡中。
[0360] 膝关节的组织学
[0361] 将冠状组织切片(4μm)在整个关节中以7个深度切割；相隔80μm并且用苏木精和伊红或番红精-O染色以评估关节病理。使用以下参数对组织病理学变化进行评分，如Van Lent(2006)中所述。
[0362] 使用从0(无炎症)到3(重度炎症)的任意标度对炎症(炎症细胞向滑膜(浸润)和关节腔(渗出液)中的流入)进行分级。软骨细胞死亡被测定为含有空骨陷窝的软骨面积相对于总面积的百分比。软骨表面侵蚀被测定为相对于总软骨面积，软骨丧失的量。在整个膝关节切片的10个不同的区域中测定骨破坏。按0(无损伤)到3(骨结构完全丧失)的标度对破坏进行分级。由对实验组不知情的研究人员进行组织学分析。通过将组织病理学分数在每个关节至少5个切片深度上取平均值来计算实验组中每一只动物的平均分数。
[0363] 结果
[0364] 酵母多糖诱发的关节炎症在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中不是持续的。
[0365] 利用向足垫中进行的酵母多糖注射来诱发小鼠的急性滑膜炎。野生型小鼠表现出快速的足肿胀，到24小时之时达到最大的足直径(2.56mm，增加了初始足直径的62％)。这维持了另外的24小时。在2天后，足直径减小，但是足部到4天时仍肿胀(2.08mm，增加了32％)(图1a)。生腱蛋白-C缺陷型小鼠在注射后24小时之时表现出与野生型小鼠相似程度的足肿胀(2.41mm，增加了初始足直径的57％)。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠的肿胀比野生型小鼠消退得更快；在2天时足直径显著减小并且到4天时已经下降到1.7mm(仅增加了11％)(图1a)。到注射后第4天时，野生型小鼠的足部仍明显肿胀并且发红，而生腱蛋白-C基因敲除小鼠的足部不明显肿胀或发红并且类似于未注射的足部(图9)。
[0366] 这一差异在组织学上在4天时被反映出。野生型小鼠的滑膜显著发炎并且表现出细胞浸润，并且观测到软骨蛋白多糖丧失(图1b、c)。相比之下，生腱蛋白-C缺陷型小鼠的滑膜没有表现出滑膜炎、细胞浸润或软骨蛋白多糖丧失(图1d、e)并且类似于接受假注射的小鼠和未注射的小鼠的关节(未示)。对关节炎症的定量揭示了虽然在野生型小鼠或生腱蛋白-C基因敲除小鼠中有很少的渗出液(关节腔中的细胞团)，但是在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中浸润(滑膜层中的细胞团)的水平显著降低(图1f)。在任何一种基因型的小鼠中均没有发生软骨或骨的侵蚀(未示)，然而在野生型小鼠中发生低水平的软骨细胞死亡，这在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中没有被观测到(图1g)。因此，生腱蛋白-C的表达似乎促进了急性炎症的维持。
[0367] 在抗原诱发的关节炎期间生腱蛋白-C基因敲除小鼠被保护而免受持续的炎症和结构破坏。
[0368] 为了确定生腱蛋白-C是否还导致更具破坏性的炎症性关节疾病，通过将mBSA关节内注射到膝关节中而在用mBSA进行免疫接种后诱发侵蚀性关节炎。这一模型涉及细胞免疫应答和体液免疫应答这两者并且诱发类似于人类RA的病理变化(Brackertz(1977))。注射mBSA在生腱蛋白-C基因敲除小鼠和野生型小鼠这两者中均诱发了相似的炎症反应。与接受假注射的小鼠(图2a、b、g)或未注射的小鼠(未示)相比，到24小时之时，在这两种基因型的小鼠中细胞浸润和滑膜变厚是明显的(图2c-f、h、i)。
[0369] 然而，这在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中不像在野生型小鼠中那样是持续存在的。到注射后的3天时，野生型小鼠表现出半月板和关节囊的炎症增加、滑膜增生、关节间隙中有细胞和纤维蛋白沉积物、血管翳形成以及局部软骨蛋白多糖丧失(图3a、b、f)。相比之下，到3天时，在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中，炎症局限于关节囊，滑膜炎症已经消退并且在关节间隙中不存在纤维蛋白/细胞集合体、无血管翳形成以及无软骨蛋白多糖丧失(图3c、d、e)。
[0370] 到7天时，野生型小鼠表现出持续的炎症细胞浸润和关节间隙渗出液、广泛的滑膜炎以及血管翳形成和关节软骨的破坏以及骨侵蚀(图4a、b)。接受假注射的膝关节和来自没有接受注射的小鼠的膝关节是健康的并且没有表现出炎症或关节破坏(未示)。生腱蛋白-C缺陷型小鼠也具有健康的关节，所述关节仅表现出轻度的炎症细胞浸润，没有关节间隙渗出液、滑膜炎、血管翳形成、关节软骨的破坏或骨侵蚀(图4c、d)。来自接受假注射的和/或没有接受注射的生腱蛋白-C缺陷型小鼠的关节也是健康的(未示)。
[0371] 这些组织学数据在如材料和方法中所述对关节疾病进行评分时被反映出。在注射后24小时之时在野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除小鼠这两者中所观测到的细胞浸润和渗出液的水平没有显著差异。然而，虽然在野生型小鼠中细胞团随时间推移继续增加，但随时间推移，这一反应在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中减弱，并且关节中的细胞数减少(图4e)。随时间推移在野生型小鼠的软骨中发生越来越高水平的软骨细胞死亡，但是在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中没有观测到显著的死亡(图4f)。在24小时或3天时，在野生型小鼠中，软骨表面侵蚀和骨侵蚀是不明显的(未示)，但是到7天时，已经发生显著的组织破坏。相比之下，生腱蛋白-C基因敲除小鼠在24小时、3天(未示)或7天(图4f)时没有表现出组织破坏。这些数据表明虽然在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中关节炎症的引发(细胞流入到滑膜和关节间隙中)未受影响，但是不同于在野生型小鼠中，疾病不进展到组织破坏和细胞死亡。这些结果证实了生腱蛋白-C的表达在这一模型中是为持续的滑膜炎症和关节破坏所需的。
[0372] 实施例4：细胞培养
[0373] 患者样品
[0374] 从外周血液(伦敦血库(London Blood Bank))中分离人类单核细胞并且在用100ng/ml的M-CSF分化4天后由单核细胞衍生巨噬细胞，如先前所述(Foxwell(1998))。
[0375] 从自接受关节置换手术的患者获得的滑膜中分离RA膜细胞(代表所有滑膜细胞类型的混合群体)，如先前所述(Brennan(1989))。从RA膜细胞的混合群体中分离RA滑膜成纤维细胞，如先前所述(Brennan(1989))。所述研究是由当地Trust伦理委员会(Riverside NHS研究委员会)批准的，并且仅在收到来自患者的签署的知情同意书并且将组织匿名化以保护患者身份之后获得废弃的组织(关节置换手术后的滑膜)。
[0376] 在分离后立即将RA膜细胞和巨噬细胞在刺激之前在含有10％(v/v)FBS和100U/ml(单位/毫升)的青霉素/链霉素的RPMI 1640中以1×105个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。在刺激之前将滑膜成纤维细胞(仅在传代2次或3次时使用)在含有10％(v/v)FBS和100U/ml青霉素/链霉素的DMEM中以1×104个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。
[0377] 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)
[0378] MEF表达高水平的所有9种鼠类TLR的mRNA，并且对TLR配体激活有特异性的和高度的反应性。来自具有TLR2、TLR4以及MyD88的靶向缺失的小鼠的MEF在它们对特异性配体的IL-6反应方面表现出严重缺陷(Kurt-Jones(2004))。从自年龄匹配的妊娠的雌性野生型小鼠、TLR2基因敲除小鼠以及TLR4基因敲除小鼠收集的第13天胚胎分离MEF(如Todaro(1963)中所述)。在刺激之前将成纤维细胞在含有10％(v/v)FBS和100U/ml青霉素/链霉素的DMEM中以2×104个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。
[0379] 通过抽吸年龄匹配的雌性野生型小鼠、TLR2基因敲除小鼠以及TLR4基因敲除小鼠的股骨(如Butler(1999)中所述)，并且将细胞在DMEM、20％(v/v)FBS、10ml/L(v/v)抗生素-抗霉菌溶液PSA、50μM的β-巯基乙醇以及10ng/ml的M-CSF中培养7天来获得BMDM。然后在刺激之前将巨噬细胞在DMEM、20％(v/v)FBS、10ml/L(v/v)抗生素-抗霉菌溶液PSA、50μMβ-巯基乙醇中以1×105个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。
[0380] HEK293细胞系
[0381] 在刺激之前将表达TLR2和TLR4/CD14/MD-2的HEK293细胞系在含有10％(v/v)FBS和10μg/ml杀稻瘟菌素的DMEM中以1×104个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。
[0382] 细胞刺激和对细胞因子合成的评估
[0383] 将细胞在37℃与所示剂量的生腱蛋白-C和重组生腱蛋白-C片段(1.0μM-1.0nM)一起孵育24小时。在指明的情况下，还用以下各项刺激细胞：LPS(1ng/ml用于人类巨噬细胞；10ng/ml用于人类成纤维细胞、RA膜细胞以及HEK；100ng/ml用于MEF和BMDM；以及10ng/ml用于HEK)、PAM3(10ng/ml用于人类巨噬细胞、人类成纤维细胞、以及HEK；100ng/ml用于MEF和BMDM)、鼠类IL-1(5ng/ml用于MEF)以及鼠类TNF-α(100ng/ml用于MEF)。除非另外具体说明，否则使用粗糙型LPS进行体外研究。
[0384] 对于腺病毒基因转移实验，将人类RA滑膜成纤维细胞与腺病毒载体以100的感染复数孵育，在2小时后洗涤，在完全培养基中培养24小时，然后刺激24小时，之后收集上清液。
[0385] 在说明的情况下，在刺激之前将细胞与10μg/ml抗CD14抗体、10μg/ml IK1受体拮抗剂、10μg/ml抗TLR2抗体、25μg/ml抗TLR4抗体、10μg/ml或25μg/ml同种型对照抗体、25μg/ml多粘菌素B、或1μg/ml msbB LPS一起在37℃预孵育30分钟。在说明的情况下，将重组生腱蛋白-C和FBG、以及LPS在添加到细胞中之前煮沸15分钟。
[0386] 在所有情况下，在整个实验时间阶段期间，在通过MTT细胞活力测定(英国普尔的西格玛公司(Sigma，Poole，UK))研究时细胞的活力没有受到显著影响。
[0387] 随后通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，根据制造商的说明书针对细胞因子TNF-α、IL-6以及IL-8的存在来研究上清液。在分光光度ELISA板读数器(芬兰万塔的Labsystems Multiscan Biochromic公司(Labsystems Multiscan Biochromic，Vantaa，Finland))上对吸光度进行读数并且使用Ascent软件程序(英国奥特林厄姆的赛默实验室系统公司(Thermo Labsystems，Altrincham，UK))分析。
[0388] 结果
[0389] 生腱蛋白-C诱导原代人类RA滑膜成纤维细胞和巨噬细胞中TNF-α、IL-6以及IL-8的合成。
[0390] 我们随后研究生腱蛋白-C是否可能激活先天免疫应答。使用生腱蛋白-C刺激原代人类巨噬细胞和RA滑膜成纤维细胞并且研究促炎性细胞因子TNF-α、IL-6以及IL-8的产生。使用细菌细胞壁组分LPS作为阳性对照。生腱蛋白-C诱导与LPS显著不同的细胞类型特异性细胞因子谱。它剂量依赖性地刺激人类巨噬细胞中TNF-α、IL-6以及IL-8的产生(图5a)。然而，在滑膜成纤维细胞中生腱蛋白-C仅诱导IL-6合成，而LPS诱导IL-6和IL-8这两者(图
5b)。LPS和生腱蛋白-C均不诱导成纤维细胞中TNF-α的合成(数据未示)。生腱蛋白-C对人类巨噬细胞的IL-6(图5c)、IL-8和TNF-α以及滑膜成纤维细胞的IL-6(未示)的刺激具有热敏感性并且不受LPS抑制剂多粘菌素B影响。总之，这些结果提供强有力的证据表明生腱蛋白-C的细胞因子诱导不是由于LPS污染。
5b)。LPS和生腱蛋白-C均不诱导成纤维细胞中TNF-α的合成(数据未示)。生腱蛋白-C对人类巨噬细胞的IL-6(图5c)、IL-8和TNF-α以及滑膜成纤维细胞的IL-6(未示)的刺激具有热敏感性并且不受LPS抑制剂多粘菌素B影响。总之，这些结果提供强有力的证据表明生腱蛋白-C的细胞因子诱导不是由于LPS污染。
[0391] 纤维蛋白原样球状结构域(FBG)介导了生腱蛋白-C对细胞的激活。
[0392] 生腱蛋白-C是一种大的六聚体分子，它的每一个结构域与不同的细胞表面受体结合(Orend(2005)中所综述)。要了解生腱蛋白-C的作用机制将需要鉴定出哪一个或多个结构域对于促进细胞因子产生来说是关键的。我们合成了包含所述分子的不同结构域的重组蛋白(图10)。在大肠杆菌中制成每一个结构域，将所述结构域纯化(图11)，并且通过对纯蛋白进行鲎阿米巴样细胞裂解物测定发现其含有＜10pg/ml的LPS。生腱蛋白-C中只有一个结构域具有活性。纤维蛋白原样球状结构域(FBG)刺激人类巨噬细胞中TNF-α的合成(图6a)、人类巨噬细胞中IL-6和IL-8的合成(未示)以及RA滑膜成纤维细胞中的IL-6(未示)达到与全长生腱蛋白-C同样的程度。如同全长生腱蛋白-C，FBG不诱导RA滑膜成纤维细胞中IL-8的合成，而LPS却诱导(数据未示)。FBG诱导的细胞因子合成也具有热敏感性并且不受多粘菌素B影响(数据未示)。
[0393] 生腱蛋白-C的FBG结构域诱导人类RA滑膜中细胞因子的产生和小鼠的关节炎症。
[0394] 我们研究FBG是否可以促进来自RA患者的滑膜中炎症性细胞因子的表达。RA的这一组织模型(包含所有滑膜细胞类型的混合群体)自发地产生高水平的IL-6、IL-8以及TNF-α(Brennan(1989))(图6b)。FBG还提高了所有这些细胞因子的合成(图6b)。为了确定FBG是否可以在体内诱发炎症，向野生型小鼠关节内注射FBG。我们观测到对关节炎症的短暂的和剂量依赖性的刺激。在未注射的小鼠或接受PBS(图6c-e)或100ng FBG(数据未示)注射的小鼠中没有发生炎症或蛋白多糖丧失。在接受1μg FBG注射的小鼠中，观测到炎症细胞浸润(图6f)、轻度滑膜炎、血管翳形成(图6g)以及蛋白多糖丧失(图6h)。在接受3μg FBG注射的小鼠中看到相似的反应(数据未示)。在组织学定量时，在接受FBG注射的小鼠中观测到高水平的细胞浸润和渗出液以及软骨细胞死亡以及不太大量的软骨表面侵蚀和骨损伤(图6i)。
[0395] FBG介导的细胞因子合成依赖于Myd88
[0396] 包括纤维蛋白原(Smiley(2001))在内的许多DAMP已经被证实通过激活TLR刺激先天免疫应答。因此，我们研究TLR是否还可能介导生腱蛋白-C诱导的细胞因子产生。髓样分化因子88(MyD88)是为由除TLR3之外的所有TLR进行信号转导所需的(O′Neill(2008))。用表达显性负性MyD88的腺病毒感染滑膜成纤维细胞消除了FBG对IL-6的诱导，但是用GFP对照病毒感染却不是这样(图7a)。这些数据表明FBG诱导的炎症依赖于功能性MyD88。FBG的这一作用似乎不是由IL-1介导的，这是因为添加IL-1受体拮抗剂没有抑制对细胞因子的诱导(数据未示)。为了确认FBG作用具有MyD88依赖性，我们证实了FBG不刺激从具有MyD88基因中的靶向缺失的小鼠分离的胚胎成纤维细胞中细胞因子的合成。TLR2配体PAM3、TLR4配体LPS以及IL-1均经由MyD88进行信号转导。用这些进行的刺激在来自缺陷型小鼠的MEF中也被消除。然而，不经由MyD88进行信号转导的TNF-α不受影响(图7b)。野生型MyD88的重新转染恢复了这些细胞对FBG、PAM3、LPS以及IL-1的反应性(数据未示)。
[0397] FBG经由TLR4进行信号转导。
[0398] TLR对内源性配体表现出特异性；蛋白质由TLR2和TLR4之一或这两者识别(O′Neill(2008)中所综述)。针对TLR4的中和抗体抑制FBG和LPS诱导的人类巨噬细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的合成以及RA滑膜成纤维细胞中IL-6的合成，但是对TLR2配体PAM3的功能没有影响。针对TLR2的抗体抑制PAM3介导的细胞因子合成，但是对LPS或FBG诱导的细胞因子合成没有影响。同种型匹配对照对由任何配体诱导的细胞因子合成没有影响(人类巨噬细胞的TNF-α合成示于图8a中)。为了确认FBG作用具有TLR4依赖性，我们证实了FBG不刺激从具有TLR4基因中的靶向缺失的小鼠分离的胚胎成纤维细胞或巨噬细胞中细胞因子的合成。在从具有TLR2基因中的靶向缺失的小鼠分离的胚胎成纤维细胞或巨噬细胞中FBG介导的细胞因子合成不受影响。从TLR2缺陷型小鼠分离的细胞对PAM3无反应性，但是对LPS和IL-1具有反应性。从TLR4缺陷型小鼠分离的细胞对LPS无反应性，但是对PAM3和IL-1作出反应(图
8b、c)。此外，TLR4的表达是为FBG在体内的致关节炎性作用所需的；FBG能够在TLR2基因敲除小鼠中诱发关节炎症，但是在TLR4基因敲除小鼠中不能诱发(图12)。
8b、c)。此外，TLR4的表达是为FBG在体内的致关节炎性作用所需的；FBG能够在TLR2基因敲除小鼠中诱发关节炎症，但是在TLR4基因敲除小鼠中不能诱发(图12)。
[0399] FBG和LPS的不同的辅助受体需求
[0400] 经由TLR4进行的LPS信号转导是由包括可溶性蛋白质MD-2和GPI连接的细胞表面或可溶性CD14的受体复合物介导的(Fitzgerald(2004)中所综述)。我们随后研究了CD14和MD-2是否是为FBG对TLR4的激活所需的。在此作为阳性对照，我们研究了需要MD-2和CD14这两者的光滑型糖基化LPS的活性(Jiang(2005))。LPS介导的由人类巨噬细胞对IL-6、IL-8和TNF-α的合成以及由RA滑膜成纤维细胞对IL-6的合成由抗CD14抗体和源自于msbB突变型大肠杆菌的拮抗性LPS抑制，所述拮抗性LPS与LPS竞争结合MD-2(Coats(2007))。相反，不需要这些辅助受体来激活TLR2的PAM3和FBG介导的细胞因子合成不受抗CD14抗体或msbB突变型LPS影响(图8d示出了人类巨噬细胞的TNF-α合成)。这些数据表明CD14和MD-2都不是为FBG介导的细胞因子合成所需的。因此，虽然LPS和FBG这两者均经由激活TLR4来进行信号转导，但是它们可能具有不同的辅助受体需求。
[0401] 实施例5：对人类组织中生腱蛋白-C的作用和合成的抑制
[0402] 这个实施例研究了在人类RA滑膜中(1)阻止生腱蛋白-C的促炎性作用和(2)抑制生腱蛋白-C的表达的作用。
[0403] 方法
[0404] 肽合成
[0405] 由德国的Biogenes公司合成了构成整个FBG结构域的九个重叠肽(表2)。将肽在室温切割(切割混合物：90％三氟乙酸盐、5％硫代苯甲醚、3％乙二醇、2％苯甲醚)，通过反相高效液相色谱法纯化，并且通过MALDI TOF质谱分析来表征。肽的纯度是＞85％，如通过高效液相色谱法所测定。
[0406] 所述设施不能合成肽7，大概是因为阻止肽链延伸的二级结构的形成(如先前所报道(LaFleur(1997)))。
[0407]
[0408]
[0409] 表2：跨越人类生腱蛋白-C的整个FBG结构域的重叠肽
[0410] 患者样品和细胞培养
[0411] 从自接受关节置换手术的患者获得的滑膜中分离RA膜细胞(代表所有滑膜细胞类型的混合群体)(Brennan(1989))。将滑膜组织在含有5％胎牛血清(FCS)(GIBCO公司)、5mg/ml的IV型胶原酶(西格玛公司)以及015mg/ml的I型DNA酶(西格玛公司)的RPMI 1640(GIBCO公司)中消化，并且在37℃孵育2小时。
[0412] 在孵育后，经由尼龙网将组织吸移到无菌烧杯中。然后将细胞在完全培养基(补充有10％FCS的RPMI 1640)中洗涤三次。通过在补充有10％FBS、1μM谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及链霉素的DMEM(Bio-Whittaker公司)中进行选择来从RA膜细胞的混合群体中分离RA滑膜成纤维细胞。从外周血液(伦敦血库)中分离人类单核细胞并且在用100ng/ml的M-CSF分化4天后由单核细胞衍生巨噬细胞。
[0413] 所述研究是由当地Trust伦理委员会批准的，并且仅在收到来自患者的签署的知情同意书并且将组织匿名化以保护患者身份之后获得废弃的组织(关节置换手术后的滑膜)。
[0414] 细胞刺激和对细胞因子合成的评估
[0415] 在分离后立即将RA膜细胞在含有10％(v/v)FBS和100U/ml的青霉素/链霉素的RPMI 1640中以1×105个细胞/孔培养在96孔组织培养板中。在37℃将细胞在无添加的情况下孵育、与缓冲液对照(PBS、1％BSA、0.01％NaN3)、或与25μm、100μM或250μM的每一种FBG跨越肽一起孵育24小时。
[0416] 将滑膜成纤维细胞(仅在传代2次或3次时使用)以5×104个细胞的浓度接种到3.5cm的培养皿中。在无血清OptiMEM I中使用脂染胺2000(Lipofectamine 2000)(英杰公司)以10nM的最终浓度转染siRNA，持续4小时。使用针对人类生腱蛋白-C的两种不同的siRNA(s7069和s229491)(应用生物系统公司)。
[0417] s7069的siRNA序列是：(正义5′CGCGAGAACUUCUACCAAAtt 3′[SEQ ID NO：29]；反义5′UUUGGUAGAAGUUCUCGCGtc 3′[SEQ ID NO：30])，并且s229491的siRNA序列是(5′GGAAUAUGAAUAAAGAAGAtt 3′[SEQ ID NO：31]；反义5′UCUUCUUUAUUCAUAUUCCgg 3′[SEQ ID NO：32])。转染针对荧光素酶的siRNA(Dharmacon公司)作为非靶向对照。
[0418] 在转染后四小时之时，将培养基换成预平衡过的含有10％FBS(v/v)的杜氏改良伊格氏培养基并且将细胞再孵育48小时和72小时。然后在37℃用10ng/ml LPS将细胞刺激24小时。分别通过PCR和蛋白质印迹法来定量生腱蛋白-C的mRNA水平和蛋白质水平。使用QiaAmp RNA血液小型试剂盒(德国的快而精公司)从细胞中提取总RNA。使用III逆转录酶(英杰公司)和18聚体寡核苷酸dT(Eurofins MWG Operon公司)由等量的总RNA合成cDNA。
[0419] 通过δ-δct法，基于定量实时PCR，用TaqMan引物组人类生腱蛋白-C(Hs01115663-m1)和人类核糖体蛋白内源性对照(RPLPO)(4310879E)(应用生物系统公司)在Corbett Rotor-gene 6000机器(科贝特研究有限公司(Corbett Research Ltd))中分析基因表达。通过SDS PAGE和蛋白质印迹法，使用抗体MAB1908(密理博公司(Millipore))在细胞上清液和细胞裂解物中检测生腱蛋白-C蛋白质。
[0420] 在刺激之前将巨噬细胞在含有5％(v/v)FBS和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640中以1×105个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。在37℃将细胞在无添加的情况下孵育、与1.0μM FBG、1ng/ml LPS或1μM或20μM的FBG肽一起孵育24小时。在说明的情况下，将细胞与20μM的FBG肽一起预孵育15分钟。
[0421] 在整个实验时间阶段期间，在通过MTT细胞活力测定(英国普尔的西格玛公司)研究时细胞的活力没有受到显著影响。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，根据制造商的说明书(R&D系统公司)针对细胞因子TNF-α、IL-6以及IL-8的存在来研究上清液。在分光光度ELISA板读数器(芬兰万塔的Labsystems Multiscan Biochromic公司)上对吸光度进行读数并且使用Ascent软件程序(英国奥特林厄姆的赛默实验室系统公司)分析。
[0422] 统计方法
[0423] 使用GraphPad(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司)计算平均值、SD以及SEM。
[0424] 结果
[0425] 特定的FBG肽阻断RA膜培养物中细胞因子的合成
[0426] 肽抑制的方法已经成功地用于精确定位生腱蛋白-C的FBG结构域中的αvβ3整合素结合位点并且阻止响应于生腱蛋白-C的这个结构域的细胞粘附(Lafleur(1997)和Yokoyama(2000))。
[0427] 我们合成了跨越FBG的整个序列的一系列具有约30个氨基酸的8个重叠肽(表2)。测试肽阻断RA滑膜培养物中自发的细胞因子合成的能力。肽3和肽8抑制TNF和IL8的合成，但是任何其它肽不抑制(图15中所示的TNF)。肽3和肽8剂量依赖性地抑制细胞因子合成，最高浓度分别实现了95％和56％抑制(图16)。虽然肽5对TNF合成没有影响，但是它剂量依赖性地阻断RA膜细胞中IL8的合成，最大抑制是81％(图16)。
[0428] 为了定位FBG内负责诱导细胞因子产生的活性结构域，我们用每一种FBG肽刺激原代人类巨噬细胞。肽1、肽5以及肽6均以剂量依赖性方式诱导细胞因子合成(图17)。
[0429] 为了确定任何肽是否可以阻断人类巨噬细胞中FBG诱导的细胞因子合成，在用完整FBG或LPS刺激之前将细胞与每一种FBG肽一起预孵育。肽5特异性阻断FBG介导的细胞因子合成，而肽8阻断响应于LPS和FBG这两者的细胞因子合成(图18)。
[0430] 肽8因此非特异性地阻断由任何刺激物诱导的细胞因子产生。这个结构域是FBG的整合素结合结构域，该结构域介导细胞粘附并且因此可以起作用以阻止细胞附着到组织培养板上。肽5特异性阻断FBG诱导的细胞因子合成，这表明了靶向这个结构域可用于阻止生腱蛋白-C诱发的炎症。
[0431] 使生腱蛋白-C基因表达沉默抑制了RA滑膜成纤维细胞中细胞因子的合成
[0432] 对抑制人类RA滑膜中生腱蛋白-C表达的作用进行研究已经鉴定出滑膜成纤维细胞为RA中生腱蛋白-C的主要来源(图1C)(Goh 2010)。
[0433] 在这些细胞中由siRNA介导的生腱蛋白-C表达的敲低已经被证实具有94％至96％的最大效率(图19)。与对照细胞相比，在经过生腱蛋白-C siRNA转染的细胞中，细胞因子合成的基础水平和LPS诱导的细胞因子产生分别被抑制了38％和44％(图19)。
[0434] 这些数据揭示了使RA滑膜成纤维细胞中的生腱蛋白-C沉默减少了促炎性细胞因子的合成并且表明了生腱蛋白-C表达的消除是抑制滑膜中的炎症的一种可行的策略。
[0435] 这一研究已经确定了阻断生腱蛋白-C活性(用肽)和生腱蛋白-C表达(用siRNA)减少了人类RA滑膜中炎症性细胞因子的合成。这些数据显示生腱蛋白-C阻断在治疗RA和其它炎症性疾病中具有潜在的临床益处。
[0436] 实施例6：体外瓜氨酸化
[0437] 将等体积的蛋白质和2×瓜氨酸化缓冲液(200mM Tris HCl(pH 7.4)、20mM CaCl2、10mM DTT)混合。添加每毫克底物蛋白8.75U兔骨骼PAD(产品编号：P1584，来自西格玛公司)并且在37℃孵育3小时或在50℃孵育2小时。通过由SDS PAGE的考马斯蓝染色可视化的尺寸变化或通过AMC检测来确认瓜氨酸化。
[0438] 图20中所示的结果证实了纯化的纤维蛋白原和FBG可以在体外被瓜氨酸化。
[0439] 纯化的全长生腱蛋白-C的体外瓜氨酸化由图21中的结果所证实。
[0440] 实施例7：对瓜氨酸化的蛋白质进行的AMC(抗经过修饰的瓜氨酸)检测
[0441] 使用来自抗瓜氨酸(经过修饰)检测试剂盒(密理博公司(目录：17-347))的方案检测瓜氨酸化。
[0442] A.硝化纤维素印迹制备
[0443] 1.运行SDS-PAGE并且转移到硝化纤维素。将印迹用水洗涤2次×5分钟。
[0444] 2.在室温将印迹在10ml的含0.1％卵白蛋白的TBS中孵育15分钟。
[0445] 3.用水洗涤2次×10分钟。
[0446] B.瓜氨酸残基的修饰
[0447] 1.将3ml试剂A和3ml试剂B混合。在临用前制备。
[0448] 2.在不透光的容器中将修饰缓冲液添加到印迹中，在37℃孵育5小时-7小时。
[0449] 3.将印迹在水中冲洗4次-5次。
[0450] C.检测修饰的瓜氨酸残基
[0451] 1.将印迹在新鲜制备的含3％脱脂奶粉的TBS中封闭30分钟-1小时。
[0452] 2.在搅拌下在4℃将印迹与抗经过修饰的瓜氨酸抗体在TBS-MLK中稀释的5ml-8ml的1∶1000稀释液一起孵育过夜(似乎与2小时-3小时的室温孵育同样起作用)。
[0453] 3.将印迹用水冲洗3次，然后洗涤1次×15分钟，然后3次×5分钟。
[0454] 4.在搅拌下在室温将印迹与山羊抗兔HRP缀合的IgG在TBS-MLK中的5ml-8ml的1∶5000稀释液一起孵育1小时。
[0455] 5.如步骤3中洗涤印迹。
[0456] 6.将印迹在TBS-0.05％Tween 20中洗涤3分钟-5分钟。
[0457] 7.在换水4次-5次中冲洗印迹。
[0458] 8.使用ECL-plus进行检测。
[0459] 图22示出了通过蛋白质印迹法对FBG和生腱蛋白-C的瓜氨酸化进行的确认。
[0460] 实施例8：FBG在体外由PAD瓜氨酸化
[0461] 图23示出了FBG在体外由PAD瓜氨酸化。具体来说，在考马斯蓝染色的SDS PAGE以及用抗经过修饰的瓜氨酸特异性抗体进行的蛋白质印迹中FBG的分子量增加表明了FBG以剂量依赖性和时间依赖性方式由rPAD2、hPAD2以及hPAD4瓜氨酸化。
[0462] 实施例9：证实了瓜氨酸化调节了生腱蛋白-C的促炎性活性
[0463] 如上文所述分离原代人类巨噬细胞，并且在刺激之前将所述巨噬细胞在含有5％(v/v)FBS和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640中以1×105个细胞/孔在96孔组织培养板中培养24小时。在37℃将细胞在无添加的情况下(UN)孵育、与不同浓度(μm)的原生FBG(nFBG)或cit FBG(cFBG)或单独的瓜氨酸化缓冲液(CIT)或cit缓冲液加上PAD酶(CIT+PAD)一起孵育24小时。
[0464] 在整个实验时间阶段期间，在通过MTT细胞活力测定(英国普尔的西格玛公司)研究时细胞的活力没有受到显著影响。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，根据制造商的说明书(R&D系统公司)针对细胞因子TNF-α的存在来研究上清液。在分光光度ELISA板读数器(芬兰万塔的Labsystems Multiscan Biochromic公司)上对吸光度进行读数并且使用Ascent软件程序(英国奥特林厄姆的赛默实验室系统公司)分析。
[0465] 图24示出了瓜氨酸化增强了由FBG刺激的细胞因子产生。
[0466] 实施例10：不同于健康对照，来自RA患者的血清与瓜氨酸化的生腱蛋白-C和瓜氨酸化的FBG反应
[0467] 瓜氨酸化的蛋白质的SDS PAGE
[0468] 使用1.0mm二维单个泳道孔将33.33μl的瓜氨酸化反应物(单独的cit-TNC或cit-TNC与cit-FBG的组合)上样到 Novex 4％-12％Bis-tris凝胶中。
[0469] 用RA血清进行的蛋白质印迹检测
[0470] 在电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素上，并且将膜封闭，然后切割成条(约0.7cm宽的最多8条)。将条与来自RA患者或正常健康个体的血清(在5％奶TBS-tween中1∶100稀释)一起孵育。在室温将条在15ml锥形离心管中在滚筒上孵育1小时，然后在管中用TBS-Tween洗涤3次×5分钟、1次×15分钟。然后在室温将条与二级小鼠抗人类Ig(1∶5000)一起孵育1小时，然后在培养皿中用TBS-tween洗涤3次×5分钟、1次×15分钟。最终将条与ECL试剂一起孵育并且暴露于胶片。
[0471] 图25A示出了原生的(nTNC)和瓜氨酸化的(cTNC)纯化的人类重组生腱蛋白-C的考马斯染色的凝胶(上图)和用AMC(抗经过修饰的瓜氨酸)试剂盒通过蛋白质印迹法所证实的生腱蛋白-C的瓜氨酸化(下图)。
[0472] 图25B示出了用来自RA患者(RA)或正常健康对照(NH)(n＝50)的血清探测的cTNC的代表性蛋白质印迹。使用任何血清在nTNC的印迹中没有观测到反应性(未示)。
[0473] 图26和图27示出了来自RA患者的一个子集的血清表现出与citTNC的反应性(参见每一个凝胶上泳道4中的RA患者样品)。
[0474] 图28示出了来自正常健康对照的血清没有表现出与citTNC的反应性。
[0475] 图29示出了针对瓜氨酸化的TNC和瓜氨酸化的FBG的RA血清反应性。使cTNC加上cFBG的蛋白质印迹共同在同一个孔中运行，用来自7名不同的RA患者的血清探测。观测到与全长TNC(320kD)反应，但不与FBG反应的患者子集(泳道4、5)或与瓜氨酸化的FBG(27kd)反应，但不与全长TNC反应的患者(泳道6)。
[0476] 在同一个泳道中用全长瓜氨酸化的TNC以及用瓜氨酸化的FBG进行电泳的凝胶显示出一些患者与全长TNC反应。与TNC反应的那些当中，只有一个子集还与FBG反应，因此它们根据定义必须识别不同的结构域。
[0477] 实施例11：通过LC-MS/MS限定瓜氨酸化的位点
[0478] 参考图30和表3，通过LC-MS/MS来鉴定瓜氨酸化的精氨酸残基。在17个精氨酸中，5个没有被瓜氨酸化，3个精氨酸没有由这一LC-MS/MS分析覆盖，并且9个精氨酸残基被修饰成瓜氨酸残基，而与用于瓜氨酸化的酶无关。
[0479]
[0480]
[0481] 表3
[0482] 实施例12：鉴定瓜氨酸化的抗体表位
[0483] 参考图31，评价20种RA血清和20种对照血清对包含瓜氨酸残基的6种环状FBG肽的抗体反应。
[0484] 所评价的肽如下：
[0485] R55：CVFLRRKNG-R-ENFYQNWC[SEQ ID NO：54]
[0486] CIT55：CVFLRRKNG-Cit-ENFYQNWC[SEQ ID NO：55]
[0487] R72：CAYAAGFGD-R-REEFWLGLC[SEQ ID NO：56]
[0488] CIT72：CAYAAGFGD-Cit-REEFWLGLC[SEQ ID NO：57]
[0489] R120：CFSVGDAKT-R-YKLKVEGYC[SEQ ID NO：58]
[0490] CIT120：CFSVGDAKT-Cit-YKLKVEGYC[SEQ ID NO：59]
[0491] R169/173：CKGAFWY-R-NCH-R-VNLMGRC[SEQ ID NO：60]
[0492] CIT169/173：CKGAFWY-Cit-NCH-Cit-VNLMGRC[SEQ ID NO：61]
[0493] R209/214/219/220：CEMKL-R-PSNF-R-NLEG-R-R-KRC[SEQ ID NO：62]
[0494] CIT209/214：CEMKL-Cit-PSNF-Cit-NLEGRRKRC[SEQ ID NO：63]
[0495] CIT219/220：CEMKLRPSNFRNLEG-Cit-Cit-KRC[SEQ ID NO：64]
[0496] 在RA血清中检测到对含有瓜氨酸的肽CIT55、CIT209/214以及CIT219/220的强抗体反应，但是在对照血清中没有检测到，并且没有观测到针对含有精氨酸的对照肽的反应。来自这一小群组的数据显示约35％的RA患者将针对CIT55表位呈阳性，20％针对CIT 209/
214呈阳性并且30％针对CIT219/220呈阳性，而健康对照中没有一个表现出阳性，所述阳性是使用正常组的第95个百分位数限定的。相同的计算可以用于与健康对照组相比诊断RA，并且可以预期这些组中类似的百分比。
214呈阳性并且30％针对CIT219/220呈阳性，而健康对照中没有一个表现出阳性，所述阳性是使用正常组的第95个百分位数限定的。相同的计算可以用于与健康对照组相比诊断RA，并且可以预期这些组中类似的百分比。
[0497] 这些数据将使得能够基于citFBG抗体阳性或citFBG阳性将患者分层。呈阳性的那些患者将是用被设计成靶向瓜氨酸化的FBG的活性的任何药剂进行治疗的候选者。不同表位的存在还告知了如何靶向citFBG，例如如果存在CIT55，那么治疗可以包括阻断FBG的免疫原性活性，但是如果整合素结合位点被瓜氨酸化，那么治疗可以包括阻断这个结构域的作用。
[0498] 实施例13：FBG的瓜氨酸化减少了HDF和RAF的细胞粘附
[0499] 参考图32，FBG对人类真皮成纤维细胞(HDF)和来自RA关节的滑膜成纤维细胞(RAF)具有促粘附性。FBG的瓜氨酸化减少了HDF和RAF的粘附。所述序列内已知结合整合素αvβ3的两个精氨酸被瓜氨酸化，因此减少的粘附可能是由于cFBG与整合素αvβ3的结合减少。Yokoyama等确定了FBG内的这一肽序列经由与细胞表面avb3整合素结合来介导细胞粘附。
在此证实了1)在体外在整合素结合位点处发生瓜氨酸化；2)这减少了细胞粘附；以及3)这在RASF中发生，意味着在RA关节中，FBG在这个位点处的瓜氨酸化可以减少RASF的粘附。这对于疾病进展来说可以具有许多意义，例如它可能促进细胞迁移(例如入侵到健康的关节组织中并且使健康关节组织降解)，以及它可能促进RASF增殖(因此维持滑膜增生)。
在此证实了1)在体外在整合素结合位点处发生瓜氨酸化；2)这减少了细胞粘附；以及3)这在RASF中发生，意味着在RA关节中，FBG在这个位点处的瓜氨酸化可以减少RASF的粘附。这对于疾病进展来说可以具有许多意义，例如它可能促进细胞迁移(例如入侵到健康的关节组织中并且使健康关节组织降解)，以及它可能促进RASF增殖(因此维持滑膜增生)。
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