抗SIRPα抗体及其使用方法
阅读：909发布：2020-09-17
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1.一种分离的抗信号调节蛋白a(SIRPA)抗体，其选择性结合SIRPA且下调在细胞表面上表达的SIRPA。
2.权利要求1的分离的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体结合人SIRPA的一种或多种多态变体。
3.权利要求1或2的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞表面水平，降低SIRPA的细胞内水平，降低SIRPA的总水平，或其任何组合。
4.权利要求1至3任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体诱导SIRPA降解，SIRPA切割，SIRPA内化，SIRPA脱落，SIRPA表达的下调，或其任何组合。
5.权利要求1至4任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体在体内降低SIRPA的细胞水平。
6.权利要求1至5任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体抑制SIRPA的细胞表面聚簇。
7.权利要求1至6任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体抑制一种或多种SIRPA活性。
8.权利要求1至7任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体抵消一种或多种选自下组的SIRPA活性：
(a)SIRPA结合一种或多种SIRPA配体，任选地，其中该一种或多种SIRPA配体选自由CD47，表面活性蛋白A和D和其任何组合组成的组；
(b)降低一种或多种选自下组的细胞的增殖：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1 NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1 NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2 NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；
(c)抑制一种或多种选自下组的细胞的迁移：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1 NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1 NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2 NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；
(d)抑制一种或多种选自下组的细胞的一种或多种功能：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1 NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1 NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2 NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；
(e)抑制一种或多种选自下组的类型的清除：凋亡神经元清除，神经组织残骸清除，功能失调的突触清除，非神经组织残骸清除，细菌清除，其他外来体清除，致病蛋白清除，致病肽清除，和肿瘤细胞清除；任选地，其中该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，且该肿瘤细胞来自选自下组的癌症：膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾细胞癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，纤维肉瘤和甲状腺癌；
(f)抑制通过小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的肿瘤细胞杀伤；
(g)抑制小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的抗肿瘤细胞增殖活性；
(h)调节一种或多种炎性受体的表达，任选地，其中该一种或多种炎性受体包含CD86且该一种或多种炎性受体在小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种上表达；
(i)促进或挽救免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的功能；
(j)提高免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；
(k)增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的数目；
(l)增强髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；
(m)增强非致瘤性髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的存活；
(n)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；
(o)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；
(p)增大肿瘤体积；
(q)提高肿瘤生长速率；和
(r)降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，TREM1，TREM2，CD39，CD73，CSF-1受体，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效。
9.权利要求1至8任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体诱导一种或多种选自下组的活性：
(a)增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；
(b)降低非致瘤性CD14+髓样细胞中SIRPA的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；
(c)减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；
(d)降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(e)降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(f)降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(g)降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(h)降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(i)降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(j)降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(k)降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；
(l)缩小肿瘤体积；
(m)提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；
(n)提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种或多种；
(o)提高一种或多种化学疗法药剂的功效，任选地，其中该一种或多种化学疗法药剂是吉西他滨(gemcitabine)，卡培他滨(capecitabine)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，多柔比星(doxorubicin) 表柔比星(epirubicin) 紫杉烷
(taxanes)，帕利他赛(paclitaxel) 多西他赛(docetaxel) 5-氟
尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂 和其任何组合；
(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的存在下T细胞的增殖；
(1)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中的表达CD33的免疫抑制非致瘤性髓样细胞和/或非致瘤性表达CD14的细胞。
10.权利要求1至9任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用。
11.权利要求10的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞水平并抑制
SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用。
12.权利要求1至9任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体阻断CD47与人SIRPA的结合。
13.权利要求1至9任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体选择性结合SIRPA且并不实质性阻断CD47与在细胞上表达的SIRPA的结合且进一步地，其中该抗体与SIRPA的结合降低该细胞表面上的SIRPA的水平，任选地，其中该SIRPA是人SIRPA。
14.权利要求13的抗SIRPA抗体，其中该抗体结合SIRPA的D1域，SIRPA的D2域，或SIRPA的D3域。
15.权利要求13或14的抗SIRPA抗体，其中该抗体(a)与包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL序列的抗体竞争。
16.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:
10的氨基酸序列的CDR2。
17.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含：
(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2；或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3；或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。
18.权利要求17的抗SIRPA抗体，其中该VH区包含：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:
10的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。
19.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:
11的氨基酸序列的CDR3。
20.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含包含图14A中所示的VH区的氨基酸序列的VH区；或包含与图14A的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少
92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VH区。
21.权利要求13至20任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VL区，该VL区包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2。
22.权利要求13至20任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VL区，该VL区包含：
(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。
23.权利要求22的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。
24.权利要求13至20任一项的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。
25.权利要求13至20任一项的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含图14B中所示的VL区的氨基酸序列；或包含与图14B的VL区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VH区。
26.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2。
27.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含：
a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。
28.权利要求27的抗SIRPA抗体，其中该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。
29.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区，该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3。
30.权利要求13至15任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含包含图14C的VH区的氨基酸序列的VH区；或包含与图14C的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性的VH区。
31.权利要求26至30任一项的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2。
32.权利要求26至30任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VL区，该VL区包含：
a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。
33.权利要求32的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:
13的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。
34.权利要求13至20任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VL区，该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。
35.权利要求26至30任一项的抗SIRPA抗体，其中该VL区包含图14D的VL区的氨基酸序列；或包含与图14D的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VL区。
36.权利要求13或14的分离的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA与一种或多种抗体竞争结合SIRPA，其中该抗体选自由8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8组成的组。
37.权利要求13或14的分离的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA与一种或多种选自由3F9，
9C2，8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8组成的组的抗体结合本质上相同的表位。
38.权利要求36或37的分离的抗SIRPA抗体，其中该抗体包含VH区和VL区，其中该VH区，该VL区，或二者包含选自由3F9，9C2，8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8组成的组的单克隆抗体的至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种CDR。
39.权利要求1至38任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
40.权利要求1至39任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体是人源化抗体。
41.权利要求1至40任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体是Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv或scFv片段。
42.权利要求1至41任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体是多价抗体。
43.权利要求1至42任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体属于IgG类，IgM类，或IgA类。
44.权利要求43的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体具有IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4同种型。
45.权利要求44的抗SIRPA抗体，其中该抗体结合抑制性Fc受体。
46.权利要求45的抗SIRPA抗体，其中该抑制性Fc受体是抑制性Fcγ受体IIB(Fcγ
RIIB)。
47.权利要求1至42任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体降低FcγR的细胞水平。
48.权利要求47的抗SIRPA抗体，其中该抗体降低FcγRIIB的细胞水平。
49.权利要求46的抗SIRPA抗体，其中：
(a)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，D265A，D270A，L234A，L235A，G237A，P238D，L328E，E233D，G237D，H268D，P271G，A330R，C226S，C229S，E233P，L234V，L234F，L235E，P331S，S267E，L328F，A330L，M252Y，S254T，T256E，N297Q，P238S，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，T394D，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的，或包含Fc区中的对应于甘氨酸236的位置处的氨基酸删除；
(b)该抗SIRPA抗体具有IgG1同种型且包含IgG2同种型重链恒定域1(CH1)和铰链区，任选地，其中该IgG2同种型CH1和铰链区包含ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列，且任选地，其中该抗体Fc区包含S267E氨基酸替代，L328F氨基酸替代，或二者，和/或N297A或N297Q氨基酸替代，其中该残基的编号是根据EU编号的；
(c)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，V309L，A330S，P331S，C214S，C232S，C233S，S267E，L328F，M252Y，S254T，T256E，H268E，N297A，N297Q，A330L，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；
(d)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：L235A，G237A，S228P，L236E，S267E，E318A，L328F，M252Y，S254T，T256E，E233P，F234V，L234A/F234A，S228P，S241P，L248E，T394D，N297A，N297Q，L235E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；或
(e)该抗SIRPA抗体具有杂合IgG2/4同种型，且任选地，其中该抗体包含包含人IgG2的氨基酸118至260和人IgG4的氨基酸261至447的氨基酸序列，其中该残基的编号是根据EU编号的。
50.权利要求44的抗SIRPA抗体，其中：
(a)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，N297Q，D270A，D265A，L234A，L235A，C226S，C229S，P238S，E233P，L234V，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，L234F，L235E，P331S，T394D，A330L，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；
(b)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，H268E，V309L，N297A，N297Q，A330S，P331S，C232S，C233S，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；或
(c)该抗SIRPA抗体具有IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：E233P，F234V，L234A/F234A，L235A，G237A，E318A，S228P，L236E，S241P，L248E，T394D，M252Y，S254T，T256E，N297A，N297Q，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
51.权利要求50的抗SIRPA抗体，其中：
(a)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：A330L，L234F，L235E，P331S，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；
(b)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；或
(c)该Fc区进一步包含根据EU编号的S228P氨基酸替代。
52.权利要求1至40任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体具有IgG4同种型。
53.权利要求40的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体包含在残基位置228处的S228P氨基酸替代，在残基位置234处的F234A氨基酸替代，和在残基位置235处的L235A氨基酸替代，其中该残基位置的编号是根据EU编号的。
54.权利要求1至53任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗体是双特异性抗体。
55.权利要求54的抗SIRPA抗体，其中该抗体识别第一和第二抗原，其中该第一抗原是SIRPA且该第二抗原是：
(a)推动穿过血脑屏障的转运的抗原；
(b)推动穿过血脑屏障的转运的抗原，该抗原选自下组：转铁蛋白受体(TR)，胰岛素受体(HIR)，胰岛素样生长因子受体(IGFR)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1和2(LPR-1和2)，白喉毒素受体，CRM197，美洲驼单域抗体，TMEM30(A)，蛋白转导域，TAT，Syn-B，穿膜肽(penetratin)，多精氨酸肽，angiopep肽，和ANG1005；
(c)致病因子，其选自由致病肽或蛋白或，致病核酸组成的组，其中该致病核酸是反义GGCCCC(G2C4)重复扩充RNA，该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽；和
(d)在免疫细胞上表达的配体和/或蛋白，其中该配体和/或蛋白选自下组：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，和磷酯酰丝氨酸；和在一种或多种肿瘤细胞上表达的蛋白，脂质，多糖，或糖脂。
56.权利要求1至55任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体是缀合的抗体。
57.权利要求56的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体与可检测标记，毒素，或治疗剂缀合。
58.权利要求57的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体与选自下组的毒素缀合：蓖麻毒素(ricin)，蓖麻毒素A链，多柔比星(doxorubicin)，道诺霉素(daunorubicin)，美登木素生物素(maytansinoid)，紫杉醇(taxol)，溴化乙锭(ethidium bromide)，丝裂霉素
(mitomycin)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(tenoposide)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，秋水仙碱(colchicines)，二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)，放线菌素(actinomycin)，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思豆毒素(abrin)，相思豆毒素A链，蒴莲根毒素(modeccin)A链，α帚曲霉素(sarcin)，白树毒素(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(retstrictocin)，酚霉素(phenomycin)，伊诺霉素(neomycin)，麻疯树毒素(curicin)，巴豆毒素(crotin)，卡里奇霉素
(calicheamicin)，肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂，糖皮质激素，奥利斯他汀(auristatin)，金霉素(auromycin)，钇(yttrium)，铋(bismuth)，卡贝他汀
(combrestatin)，倍癌霉素(duocarmycin)，多拉司他汀(dolastatin)，cc1065，和顺铂。
59.权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体，其中该抗SIRPA抗体与一种或多种特异性结合选自下组的致病蛋白的抗体组合使用：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，和其任何组合；或与一种或多种结合选自下组的免疫调节性蛋白的抗体组合使用：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，TREM1，TREM2，CD33，Siglec-5，Siglec-7，Siglec-9，Siglec-11，磷脂酰丝氨酸，致病核酸，反义GGCCCC(G2C4)重复扩充RNA，和其任何组合。
60.一种在有需要的个体中降低调节性T细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制树突细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制巨噬细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，急性髓样白血病(AML)细胞，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞，或慢性髓样白血病(CML)细胞的活性，功能，或存活的方法，该方法包括对该个体施用治疗有效量的与SIRPA结合或相互作用的药剂。
61.一种在有需要的个体中诱导或提高一种或多种免疫细胞的存活，成熟，功能，迁移，或增殖的方法，该方法包括对该个体施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平，抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用，或二者的药剂。
62.权利要求61的方法，其中该一种或多种免疫细胞选自下组：树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，小胶质细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，和其任何组合。
63.一种治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体至具有表达CD47的肿瘤的患者。
64.一种治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平的药剂。
65.权利要求64的方法，其中该药剂是权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体。
66.权利要求63，64，或65的方法，其中该方法进一步包括施用抑制PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73的治疗剂。
67.权利要求66的方法，其中该治疗剂是抑制PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/
4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73的抗体。
68.权利要求63，64，或65的方法，其进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体，和/或一种或多种标准或调查性抗癌疗法。
69.权利要求66的方法，其中该至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体与该抗SIRPA抗体组合施用。
70.权利要求66或67的方法，其中该至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体选自下组：抗PD-L1抗体，抗CTLA4抗体，抗PD-L2抗体，抗PD-1抗体，抗B7-H3抗体，抗B7-H4抗体，和抗HVEM抗体，抗B-和T-淋巴细胞衰减子(BTLA)抗体，抗杀伤抑制性受体(KIR)抗体，抗GAL9抗体，抗TIM-1抗体，抗TIM3抗体，抗TIM-4抗体，抗A2AR抗体，抗CD39抗体，抗CD73抗体，抗LAG-3抗体，抗磷酯酰丝氨酸抗体，抗CD27抗体，抗CD30抗体，抗TNFa抗体，抗CD33抗体，抗Siglec-5抗体，抗Siglec-7抗体，抗Siglec-9抗体，抗Siglec-11抗体，拮抗性抗TREM1抗体，拮抗性抗TREM2抗体，抗TIGIT抗体，抗VISTA抗体，抗CD2抗体，抗CD5抗体，和其任何组合。
71.权利要求66的方法，其中该一种或多种标准或调查性抗癌疗法选自下组：放射疗法，细胞毒性化学疗法，靶向疗法，伊马替尼(imatinib)疗法，曲妥珠单抗(trastuzuma)疗法，依那西普(etanercept)疗法，过继细胞转移(ACT)疗法，嵌合抗原受体T细胞转移(CAR-T)疗法，疫苗疗法，和细胞因子疗法。
72.权利要求63至71任一项的方法，其进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体。
73.权利要求72的方法，其中该至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体与该抗SIRPA抗体组合施用。
74.权利要求66至67的方法，其中该至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体选自下组：抗CCL2抗体，抗CSF-1抗体，抗IL-2抗体，和其任何组合。
75.权利要求63至74任一项的方法，其进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体。
76.权利要求66的方法，其中该至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体与该抗SIRPA抗体组合施用。
77.权利要求75或76的方法，其中该至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体选自下组：激动性抗CD40抗体，激动性抗OX40抗体，激动性抗ICOS抗体，激动性抗CD28抗体，激动性抗TREM1抗体，激动性抗TREM2抗体，激动性抗CD137/4-1BB抗体，激动性抗CD27抗体，激动性抗糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白GITR抗体，激动性抗CD30抗体，激动性抗BTLA抗体，激动性抗HVEM抗体，激动性抗CD2抗体，激动性抗CD5抗体，和其任何组合。
78.权利要求63至77任一项的方法，其进一步包括对该个体施用至少一种刺激性细胞因子，其任选为IFN-α4，IFN-β，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-8，CRP，IL-20家族成员，LIF，IFN-γ，OSM，CNTF，GM-CSF，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，CXCL10，IL-33，MCP-1，MIP-1-β，和其任何组合。
79.一种治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体至具有表达SIRPA的髓样谱系的癌细胞的患者。
80.一种治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体至具有癌症的受试者，其中该癌症选自下组：肉瘤，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，和纤维肉瘤。
81.一种治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体至具有癌症的受试者，其中该癌症选自下组：多形性成胶质细胞瘤；肾透明细胞癌；肾上腺皮质癌；膀胱尿路上皮癌；弥漫性大B细胞淋巴瘤；肺腺癌；胰腺腺癌，肾细胞癌，非霍奇金氏淋巴瘤，急性成淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性髓样白血病(CML)，多发性骨髓瘤，乳腺浸润癌，宫颈鳞状细胞癌，宫颈内(endocervical)腺癌，胆管癌，结肠腺癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，食管癌，头颈部鳞状细胞癌，肾嫌色细胞癌，肾乳头状细胞癌，低级胶质瘤，肝细胞癌，肺鳞状细胞癌，间皮瘤，卵巢浆液性囊腺癌，胰腺腺癌，嗜铬细胞瘤和副神经节细胞瘤，前列腺腺癌，直肠腺癌，皮肤黑色素瘤，胃腺癌，睾丸生殖细胞肿瘤，甲状腺癌，胸腺瘤，子宫体内膜癌，子宫癌肉瘤，和葡萄膜黑色素瘤。
82.权利要求80或81的方法，其中该抗SIRPA抗体与细胞毒剂缀合和/或诱导ADCC。
83.一种药学组合物，其包含权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体和生理上可接受的载剂。
84.权利要求1至58任一项的抗SIRPA抗体，供在治疗癌症中使用。
85.权利要求1至58任一项的抗体，供在制备用于治疗癌症的药物的方法中使用。
86.一种预防选自下组的疾病，病症，或损伤，降低选自下组的疾病，病症，或损伤的风险，或治疗选自下组的疾病，病症，或损伤的方法：痴呆，额颞叶痴呆，阿尔茨海默氏病，血管性痴呆，混合性痴呆，Tau病(taupathy)疾病，帕金森氏病，多发性硬化症，肌萎缩侧索硬化症，创伤性脑损伤，中风，额颞叶痴呆，脊髓损伤，亨廷顿氏病，感染，和癌症，该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平，抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用，或二者的药剂。
87.权利要求86的方法，其中该疾病，病症，或损伤是癌症且其中该药剂抑制一种或多种选自下组的SIRPA活性：
(a)促进免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关抑制嗜中性细胞，肿瘤相关抑制NK细胞，非致瘤性CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的增殖，成熟，迁移，分化，和/或功能；
(b)增强免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关抑制嗜中性细胞，肿瘤相关抑制NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；
(c)增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制性细胞和/或非致瘤性CD14+髓样细胞的数目；
(d)增强髓样衍生的抑制细胞(MDSC)和/或非致瘤性CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；
(e)提高肿瘤中或外周血液中促肿瘤细胞因子的表达，任选地，其中该促肿瘤细胞因子是TGF-β或IL-10；
(f)提高促肿瘤FoxP3+调节性T淋巴细胞的肿瘤浸润；
(g)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；
(h)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的浸润；
(i)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；
(j)降低NK细胞的肿瘤杀伤潜力；
(k)降低具有增强免疫应答的潜力的肿瘤特异性B淋巴细胞的浸润；
(l)增大肿瘤体积；
(m)降低肿瘤生长速率；
(n)提高转移；
(o)提高肿瘤复发的比率；
(p)降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效；
(q)抑制PLCγ/PKC/钙动员；和
(r)抑制PI3K/Akt，Ras/MAPK信号传导
88.权利要求86的方法，其中该疾病，病症，或损伤是癌症，且其中该药剂表现出一种或多种选自下组的SIRPA活性：
(a)增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；
(b)降低非致瘤性CD14+髓样细胞中CD33的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；
(c)减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；
(d)降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(e)降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(f)降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(g)降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(h)降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(i)降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(j)降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；
(k)降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；
(l)缩小肿瘤体积；
(m)提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；
(n)提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种多种；
(o)提高一种或多种化学疗法药剂的的功效，任选地，其中该一种或多种化学疗法药剂是吉西他滨，卡培他滨，蒽环类抗生素，多柔比星 表柔比星
紫杉烷，帕利他赛 多西他赛 5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺
卡铂 和其任何组合；
(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)存在下T细胞的增殖；
(q)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中表达CD33的免疫抑制髓样细胞和/或表达CD14的细胞。
89.权利要求87或88的方法，其中该癌症表达SIRPA或一种或多种SIRPA配体。
90.权利要求85的方法，其中该疾病，病症，或损伤选自下组：痴呆，额颞叶痴呆，阿尔茨海默氏病，血管性痴呆，混合性痴呆，Tau病(taupathy)疾病，帕金森氏病，多发性硬化症，肌萎缩侧索硬化症，创伤性脑损伤，中风，额颞叶痴呆，脊髓损伤，和亨廷顿氏病；且其中该药剂是下调SIRPA的抗SIRPA抗体。
91.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至55任一项的抗SIRPA抗体的VH区的核酸序列。
92.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至55任一项的抗SIRPA抗体的VL区的核酸序列。
93.一种表达载体，其包含权利要求91的多核苷酸或权利要求92的多核苷酸。
94.一种表达载体，其包含权利要求91的多核苷酸和权利要求92的多核苷酸。
95.一种宿主细胞，其包含权利要求91的多核苷酸或权利要求92的多核苷酸。
96.一种宿主细胞，其包含权利要求91的多核苷酸和权利要求92的多核苷酸。
97.一种宿主细胞，其包含权利要求93或94的表达载体。
98.一种生成抗SIRPA抗体的方法，该方法包括在该抗体表达的条件下培养权利要求95至97任一项的宿主细胞。
99.权利要求98的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
抗SIRPα抗体及其使用方法
[0001] 对相关申请的交叉援引
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发明领域
发明领域
[0005] 此发明涉及抗SIRPA抗体和此类抗体的治疗用途。
[0006] 发明背景
[0007] 吞噬细胞(诸如巨噬细胞(MΦ)和树突细胞(DC))通过调节细胞活化状态，增殖，和/或效应器功能的细胞表面受体的错综排列将健康细胞与异常细胞区分开。这些受体中的许多识别多种配体，这些配体标记不需要的细胞用于去除(所谓的“吃我”信号)或保护正常细胞免受破坏(所谓的“不要吃我”信号)。近年来，SIRPα—CD47轴已经在从癌细胞存活到造血细胞移植的成功植入的各种临床环境中作为巨噬细胞进行的程序性细胞去除的关键决定因素出现。影响此途径的治疗剂可满足改善与许多类型的人类癌症具有特别相关性的疾病的相关医学需求。
[0008] SIRPα(信号调节蛋白-α，SIRPA)属于SIRP家族的跨膜受体，其主要在髓样细胞谱系(包括MΦ，DC，粒细胞等)内表达，且特征在于胞外区含有两个近膜IgC域和一个远端IgV域。此家族中独特的是，SIRPA含有细胞内的，细胞质的免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)。一旦受体交联，酪氨酸磷酸化的ITIM位点募集并活化SHP磷酸酶以负调控细胞功能，诸如吞噬作用或炎性细胞因子释放。CD47作为SIRPA的主要配体，且其在大多数细胞类型(包括内皮/上皮细胞，白细胞，和红细胞)中的广泛表达提示其介导“不要吃我”信号以保护健康细胞免受吞噬细胞依赖性清除。为了支持此观点，数项研究显示将来自敲除CD47的小鼠的红细胞或白细胞过继转移至野生型接受者中导致CD47缺陷的细胞的快速清除。相反地，对接受人造血细胞的多个品系的免疫受损小鼠的定位遗传分析将NOD小鼠中的Sirpα等位基因鉴定为异种移植模型中成功植入的起因。随后的研究证明了仅在NOD小鼠中表达的SIRPA的等位基因变体保留了结合在人造血干细胞上表达的人CD47的能力，且从而，抑制巨噬细胞依赖性移植排斥。
[0009] SIRPA和CD47的受调控的表达确立了稳态控制机制以调节吞噬细胞活性。例如，凋亡细胞下调CD47的表达以促进定居巨噬细胞进行的吞噬而活细胞保持不受伤害。同样地，炎性刺激物(诸如LPS)减少MΦ和DC中的SIRPA表达以加强它们在炎症期间的活化。然而，如在癌症中所见，SIRPA和CD47表达的失调促成免疫相关疾病。相对于非癌性细胞，数种肿瘤显著增加CD47的表达，以便逃脱在正常情况下消除恶性细胞的免疫监视机制。临床前研究揭示同基因肿瘤模型(诸如B16F10黑色素瘤)中CD47的基因敲低足以抑制具有免疫能力的小鼠中的肿瘤生长。对移植至免疫受损的小鼠中的敲低CD47的人癌细胞系观察到类似的结果。或者，破坏SIRPA—CD47相互作用的生物药剂(诸如抗CD47抗体)也增强了小鼠模型中的肿瘤清除。当与商业性抗肿瘤抗原抗体(诸如曲妥珠单抗(trastuzumab)或利妥昔单抗(rituximab))组合时，相较于标准单一疗法，抗CD47抗体促进抗肿瘤应答的协同增加。然而，鉴于CD47的普遍表达，抗CD47抗体由于脱靶效应而面临严重的毒性负担，这限制了其治疗功效。虽然如此，这些研究确立了SIRPA-CD47途径在调控髓样细胞中的关键作用，在癌症免疫疗法中具有潜在应用。
[0010] 发明概述
[0011] 在某些方面中，本公开提供下调SIRPA的药剂，例如抗SIRPA抗体。此类药剂可用于治疗，预防与SIRPA表达，活性，或信号传导相关的疾病或病理，或降低与SIRPA表达，活性，或信号传导相关的疾病或病理的风险。在一些方面中，本公开涉及鉴定能够下调人巨噬细胞和树突细胞(dendrocyte)，以及表达SIRPA的细胞系上的SIRPA(即降低其水平)的抗SIRPA抗体。在一些方面中，本公开涉及拮抗免疫抑制性SIRPA-CD47相互作用并促进对表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的抗SIRPA抗体。在进一步的方面中，本公开提供通过非竞争性抑制破坏CD47结合的独特的SIRPA特异性抗体。
[0012] 因此，在一个方面中，本公开涉及选择性结合SIRPA并下调在细胞表面上表达的SIRPA的SIRPA抗体。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞表面水平，降低SIRPA的细胞内水平，降低SIRPA的总水平，或其任何组合。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体诱导SIRPA降解，SIRPA切割，SIRPA内化，SIRPA脱落，下调SIRPA表达，或其任何组合。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗体在体内降低SIRPA的细胞水平。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体抑制SIRPA的细胞表面聚簇。在可与任何前述实施方案组合的又一些实施方案中，该抗SIRPA抗体抑制一种或多种SIRPA活性；或抵消，一种或多种SIRPA活性，该活性可选自下组：(a)SIRPA结合一种或多种SIRPA配体，任选地，其中该一种或多种SIRPA配体选自由CD47，表面活性蛋白A和D和其任何组合组成的组；(b)降低一种或多种选自下组的细胞的增殖：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；(c)抑制一种或多种选自下组的细胞的迁移：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；(d)抑制一种或多种选自下组的细胞的一种或多种功能：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；(e)抑制一种或多种选自下组的类型的清除：凋亡神经元清除，神经组织残骸清除，功能失调的突触清除，非神经组织残骸清除，细菌清除，其他外来体清除，致病蛋白清除，致病肽清除，和肿瘤细胞清除；任选地，其中该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白
8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，且该肿瘤细胞来自选自下组的癌症：膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾细胞癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，纤维肉瘤和甲状腺癌；(f)抑制通过小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的肿瘤细胞杀伤；(g)抑制小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的抗肿瘤细胞增殖活性；(h)调节一种或多种炎性受体的表达，任选地，其中该一种或多种炎性受体包含CD86且该一种或多种炎性受体在小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种上表达；(i)促进或挽救免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的功能性；(j)提高免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；(k)增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴器样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的数目；(l)增强髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；(m)增强非致瘤性髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的存活；(n)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；(o)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；(p)增大肿瘤体积；(q)提高肿瘤生长速率；和(r)降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，TREM1，TREM2，CD39，CD73，CSF-1受体，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体诱导一种或多种选自下组的活性：(a)增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；(b)降低非致瘤性CD14+髓样细胞中SIRPA的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(c)减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(d)降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(e)降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(f)降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(g)降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(h)降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(i)降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(j)降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(k)降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；(l)缩小肿瘤体积；(m)提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；(n)提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种或多种；(o)提高一种或多种化疗剂的功效，任选地，其中该一种或多种化疗剂是吉西他滨，卡培他滨，蒽环类抗生素，多柔比星 表柔比星 紫杉烷，帕利他赛
多西他赛 5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂
和其任何组合；(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的存在下
T细胞的增殖；(1)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中的表达CD33的免疫抑制非致瘤性髓样细胞和/或非致瘤性表达CD14的细胞。
8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，且该肿瘤细胞来自选自下组的癌症：膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾细胞癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，纤维肉瘤和甲状腺癌；(f)抑制通过小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的肿瘤细胞杀伤；(g)抑制小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的抗肿瘤细胞增殖活性；(h)调节一种或多种炎性受体的表达，任选地，其中该一种或多种炎性受体包含CD86且该一种或多种炎性受体在小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种上表达；(i)促进或挽救免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的功能性；(j)提高免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；(k)增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴器样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的数目；(l)增强髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；(m)增强非致瘤性髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的存活；(n)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；(o)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；(p)增大肿瘤体积；(q)提高肿瘤生长速率；和(r)降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，TREM1，TREM2，CD39，CD73，CSF-1受体，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体诱导一种或多种选自下组的活性：(a)增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；(b)降低非致瘤性CD14+髓样细胞中SIRPA的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(c)减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(d)降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(e)降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(f)降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(g)降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(h)降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(i)降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(j)降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(k)降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；(l)缩小肿瘤体积；(m)提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；(n)提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种或多种；(o)提高一种或多种化疗剂的功效，任选地，其中该一种或多种化疗剂是吉西他滨，卡培他滨，蒽环类抗生素，多柔比星 表柔比星 紫杉烷，帕利他赛
多西他赛 5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂
和其任何组合；(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的存在下
T细胞的增殖；(1)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中的表达CD33的免疫抑制非致瘤性髓样细胞和/或非致瘤性表达CD14的细胞。
[0013] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞水平并抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体阻断CD47与人SIRPA的结合。
[0014] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗体选择性结合人SIRPA且并不实质性阻断CD47与在细胞上表达的人SIRPA的结合且进一步地，其中结合人SIRPA降低该细胞表面上的SIRPA的水平。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D1域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D2域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D3域。在一些实施方案中，此类抗SIRPA抗体与包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL序列的抗体竞争。在一些实施方案中，此类抗SIRPA抗体包含VH区，该VH区包含：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体包含VH区，该VH区包含：a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2；或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3；或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体包含VH区，该VH区包含：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体包含VH区，该VH区包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗体包含包含图14A中所示的VH区的氨基酸序列的VH区或包含与图14A的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VH区。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体包含VL区，该VL区包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方案中，该VL区包含：(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含图14B中所示的VL区的氨基酸序列；或包含与图14B的VL区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VL区。在一些实施方案中，该抗体包含降低在细胞表面上表达的FcγR的水平的Fc区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγRBII的水平的Fc区。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含图14B中所示的VL区的氨基酸序列；或包含与图14B的VL区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VL区。在一些实施方案中，该抗体包含降低在细胞表面上表达的FcγR的水平的Fc区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγRBII的水平的Fc区。
[0015] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗体选择性结合人SIRPA，而非鼠SIRPA，且并不实质性阻断CD47与在细胞上表达的人SIRPA的结合且进一步地，其中结合人SIRPA降低该细胞表面上的SIRPA的水平。在一些实施方案中，此类抗SIRPA抗体与包含包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL序列的抗体竞争。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D1域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D2域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D3域。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体包含VH区，该VH区包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方案中，该VH区包含：a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:
16的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:
17的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:
16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗体包含包含图14C的VH区的氨基酸序列的VH区；或包含与图14C的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少
99％序列同一性的VH区。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方案中，该VL区包含：a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含图14D的VL区的氨基酸序列；或包含与图14D的VL区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VL区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγR的水平的Fc区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγRBII的水平的Fc区。
16的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:
17的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:
16的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该VH区包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗体包含包含图14C的VH区的氨基酸序列的VH区；或包含与图14C的VH区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少
99％序列同一性的VH区。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方案中，该VL区包含：a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR1，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR2，或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于两处氨基酸替代的CDR3，或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约90％同一性的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1或包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR2；和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列及不多于一处氨基酸替代的CDR3。在一些实施方案中，该VL区包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该VL区包含图14D的VL区的氨基酸序列；或包含与图14D的VL区的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的VL区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγR的水平的Fc区。在一些实施方案中，该抗体包含降低细胞表面上的FcγRBII的水平的Fc区。
[0016] 在可与任何前述实施方案组合的又一方面中，本公开的分离的抗SIRPA抗体与一种或多种选自下组的抗体竞争结合SIRPA：3F9，9C2，8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D1域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D2域。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA(例如人SIRPA)的D3域。在一些实施方案中，该分离的抗SIRPA抗体与一种或多种选自由3F9，9C2，8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8组成的组的抗体结合本质上相同的表位。在一些实施方案中，该分离的抗SIRPA抗体包含VH区和VL区，其中该VH区，该VL区，或二者包含选自由3F9，9C2，8A9，8F4，1E2，7H9，和4D8组成的组的单克隆抗体的至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种CDR。
[0017] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体是单克隆抗体。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体是人源化抗体。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体是Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv或scFv片段；或多价抗体，属于IgG类，IgM类，或IgA类的抗体。
[0018] 在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体属于IgG类，IgM类，或IgA类。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体具有IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4同种型。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗体结合抑制性Fc受体。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抑制性Fc受体是抑制性Fcγ受体IIB(FcγRIIB)。在一些实施方案中，该抗体降低细胞表面上的FcγRIIB的水平。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中：(a)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，D265A，D270A，L234A，L235A，G237A，P238D，L328E，E233D，G237D，H268D，P271G，A330R，C226S，C229S，E233P，L234V，L234F，L235E，P331S，S267E，L328F，A330L，M252Y，S254T，T256E，N297Q，P238S，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，T394D，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的，或包含Fc区中的对应于甘氨酸236的位置处的氨基酸删除；(b)该抗SIRPA抗体具有IgG1同种型且包含IgG2同种型重链恒定域1(CH1)和铰链区，任选地，其中该IgG2同种型CH1和铰链区包含ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS
NTKVDKTVERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列，且任选地，其中该抗体Fc区包含S267E氨基酸替代，L328F氨基酸替代，或二者，和/或N297A或N297Q氨基酸替代，其中该残基的编是根据EU编号的；(c)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，V309L，A330S，P331S，C214S，C232S，C233S，S267E，L328F，M252Y，S254T，T256E，H268E，N297A，N297Q，A330L，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；(d)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：
L235A，G237A，S228P，L236E，S267E，E318A，L328F，M252Y，S254T，T256E，E233P，F234V，L234A/F234A，S228P，S241P，L248E，T394D，N297A，N297Q，L235E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(e)该抗SIRPA抗体具有杂合IgG2/4同种型，且任选地，其中该抗体包含包含人IgG2的氨基酸118至260和人IgG4的氨基酸261至447的氨基酸序列，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中：(a)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，N297Q，D270A，D265A，L234A，L235A，C226S，C229S，P238S，E233P，L234V，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，L234F，L235E，P331S，T394D，A330L，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；
(b)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，H268E，V309L，N297A，N297Q，A330S，P331S，C232S，C233S，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(c)该抗SIRPA抗体具有IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：E233P，F234V，L234A/F234A，L235A，G237A，E318A，S228P，L236E，S241P，L248E，T394D，M252Y，S254T，T256E，N297A，N297Q，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中：(a)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：A330L，L234F；
L235E，P331S，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；(b)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(c)该Fc区进一步包含根据EU或Kabat编号的S228P氨基酸替代。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗体具有IgG4同种型。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体包含在残基位置228处的S228P氨基酸替代，在残基位置234处的F234A氨基酸替代，和在残基位置
235处的L235A氨基酸替代，其中该残基位置的编号是根据EU或Kabat编号的。
NTKVDKTVERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列，且任选地，其中该抗体Fc区包含S267E氨基酸替代，L328F氨基酸替代，或二者，和/或N297A或N297Q氨基酸替代，其中该残基的编是根据EU编号的；(c)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，V309L，A330S，P331S，C214S，C232S，C233S，S267E，L328F，M252Y，S254T，T256E，H268E，N297A，N297Q，A330L，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；(d)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：
L235A，G237A，S228P，L236E，S267E，E318A，L328F，M252Y，S254T，T256E，E233P，F234V，L234A/F234A，S228P，S241P，L248E，T394D，N297A，N297Q，L235E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(e)该抗SIRPA抗体具有杂合IgG2/4同种型，且任选地，其中该抗体包含包含人IgG2的氨基酸118至260和人IgG4的氨基酸261至447的氨基酸序列，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中：(a)该抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，N297Q，D270A，D265A，L234A，L235A，C226S，C229S，P238S，E233P，L234V，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，L234F，L235E，P331S，T394D，A330L，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；
(b)该抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，H268E，V309L，N297A，N297Q，A330S，P331S，C232S，C233S，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(c)该抗SIRPA抗体具有IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：E233P，F234V，L234A/F234A，L235A，G237A，E318A，S228P，L236E，S241P，L248E，T394D，M252Y，S254T，T256E，N297A，N297Q，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中：(a)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：A330L，L234F；
L235E，P331S，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；(b)该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU或Kabat编号的；或(c)该Fc区进一步包含根据EU或Kabat编号的S228P氨基酸替代。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗体具有IgG4同种型。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该抗SIRPA抗体包含在残基位置228处的S228P氨基酸替代，在残基位置234处的F234A氨基酸替代，和在残基位置
235处的L235A氨基酸替代，其中该残基位置的编号是根据EU或Kabat编号的。
[0019] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体识别第一和第二抗原，其中该第一抗原是SIRPA且该第二抗原是：(a)推动穿过血脑屏障的转运的抗原；(b)选自下组的推动穿过血脑屏障的转运的抗原：转铁蛋白受体(TR)，胰岛素受体(HIR)，胰岛素样生长因子受体(IGFR)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1和2(LPR-1和2)，白喉毒素受体，CRM197，美洲驼单域抗体，TMEM30(A)，蛋白转导域，TAT，Syn-B，穿膜肽(penetratin)，多精氨酸肽，angiopep肽，和ANG1005；(c)致病因子，其选自由致病肽或蛋白或，致病核酸组成的组，其中该致病核酸是反义GGCCCC(G2C4)重复扩充RNA，该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽；和(d)在免疫细胞上表达的配体和/或蛋白，其中该配体和/或蛋白选自下组：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，和磷酯酰丝氨酸；和在一种或多种肿瘤细胞上表达的蛋白，脂质，多糖，或糖脂。
[0020] 在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该抗SIRPA抗体是缀合的抗体。例如，该抗SIRPA抗体可以与可检测标记，毒素，或治疗剂缀合。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体与选自下组的毒素缀合：蓖麻毒素，蓖麻毒素A链，多柔比星，道诺霉素，美登木生物碱，紫杉醇，溴化乙锭，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，二羟基蒽二酮，放线菌素，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思豆毒素，相思豆毒素A链，蒴莲根毒素A链，α帚曲霉素，白树毒素，丝林霉素，局限曲菌素，酚霉素，伊诺霉素，麻疯树毒素，巴豆毒素，卡里奇霉素，肥皂草抑制剂，糖皮质激素，奥利斯他汀，金霉素，钇，铋，卡贝他汀，倍癌霉素，多拉司他汀，cc1065，和顺铂。
[0021] 在可与任何前述实施方案组合的又一些实施方案中，该抗SIRPA抗体与一种或多种特异性结合选自下组的致病蛋白的抗体组合使用：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，和其任何组合；或与一种或多种结合选自下组的免疫调节性蛋白的抗体组合使用：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，TREM1，TREM2，CD33，Siglec-5，Siglec-7，Siglec-9，Siglec-11，磷脂酰丝氨酸，致病核酸，反义GGCCCC(G2C4)重复扩充RNA，和其任何组合。
[0022] 在又一方面中，本公开提供在有需要的个体中降低调节性T细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制树突细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制巨噬细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，急性髓样白血病(AML)细胞，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞，或慢性髓样白血病(CML)细胞的活性，功能性，或存活的方法，该方法包括对该个体施用治疗有效量的与SIRPA结合或相互作用的药剂，例如任何以上所述的实施方案的抗体。
[0023] 在另外的方面中，本公开提供在有需要的个体中诱导或提高一种或多种免疫细胞的存活，成熟，功能性，迁移，或增殖的方法，该方法包括对该个体施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平，抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用，或二者的药剂，例如任何以上所述的实施方案的抗体。在一些实施方案中，该一种或多种免疫细胞选自下组：树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，小胶质细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，和其任何组合。
[0024] 在另一个方面中，本公开提供治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的任何以上所述实施方案的抗SIRPA抗体至具有表达CD47的肿瘤的患者。
[0025] 在另外的方面中，本发明提供治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平的药剂，例如任何以上所述实施方案的抗SIRPA抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用抑制PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73的治疗剂。在一些实施方案中，该治疗剂是抑制PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73的抗体。
[0026] 在另外的方面中，本发明提供治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平的药剂，例如任何以上所述的实施方案的抗SIRPA抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体，和/或一种或多种标准或调查性抗癌疗法。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体与该抗SIRPA抗体组合施用。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合抑制性检查点分子的抗体选自下组：抗PD-L1抗体，抗CTLA4抗体，抗PD-L2抗体，抗PD-1抗体，抗B7-H3抗体，抗B7-H4抗体，和抗HVEM抗体，抗B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)抗体，抗杀伤抑制性受体(KIR)抗体，抗GAL9抗体，抗TIM-1抗体，抗TIM3抗体，抗TIM-4抗体，抗A2AR抗体，抗CD39抗体，抗CD73抗体，抗LAG-3抗体，抗磷酯酰丝氨酸抗体，抗CD27抗体，抗CD30抗体，抗TNFα抗体，抗CD33抗体，抗Siglec-5抗体，抗Siglec-7抗体，抗Siglec-9抗体，抗Siglec-11抗体，拮抗性抗TREM1抗体，拮抗性抗TREM2抗体，抗TIGIT抗体，抗VISTA抗体，抗CD2抗体，抗CD5抗体，和其任何组合。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该一种或多种标准或调查性抗癌疗法选自下组：放射疗法，细胞毒性化学疗法，靶向疗法，伊马替尼疗法，曲妥珠单抗疗法，依那西普疗法，过继细胞转移(ACT)疗法，嵌合抗原受体T细胞转移(CAR-T)疗法，疫苗疗法，和细胞因子疗法。
[0027] 在可与任何前述方法实施方案组合的一些实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体与任一个前述实施方案的抗SIRPA抗体组合施用。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合抑制性细胞因子的抗体选自下组：抗CCL2抗体，抗CSF-1抗体，抗IL-2抗体，和其任何组合。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体与任何前述实施方案的抗SIRPA抗体组合施用。在一些实施方案中，该至少一种特异性结合刺激性检查点蛋白的激动性抗体选自下组：激动性抗CD40抗体，激动性抗OX40抗体，激动性抗ICOS抗体，激动性抗CD28抗体，激动性抗TREM1抗体，激动性抗TREM2抗体，激动性抗CD137/4-1BB抗体，激动性抗CD27抗体，激动性抗糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白GITR抗体，激动性抗CD30抗体，激动性抗BTLA抗体，激动性抗HVEM抗体，激动性抗CD2抗体，激动性抗CD5抗体，和其任何组合。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用至少一种刺激性细胞因子。在一些实施方案中，该刺激性细胞因子选自下组：IFN-α4，IFN-β，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-8，CRP，IL-20家族成员，LIF，IFN-γ，OSM，CNTF，GM-CSF，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，CXCL10，IL-33，MCP-1，MIP-1-β，和其任何组合。
[0028] 在又一方面中，本公开提供治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的任一前述实施方案的抗SIRPA抗体至具有表达SIRPA的髓样谱系的癌细胞的受试者。
[0029] 在另一方面中，本公开提供治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的任一前述实施方案的抗SIRPA抗体至具有癌症的受试者，其中该癌症选自下组：肉瘤，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，和纤维肉瘤；或其中该癌症选自下组：多形性成胶质细胞瘤；肾透明细胞癌；肾上腺皮质癌；膀胱尿路上皮癌；弥漫性大B细胞淋巴瘤；肺腺癌；胰腺腺癌，肾细胞癌，非霍奇金氏淋巴瘤，急性成淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性髓样白血病(CML)，多发性骨髓瘤，乳腺浸润癌，宫颈鳞状细胞癌，宫颈内(endocervical)腺癌，胆管癌，结肠腺癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，食管癌，头颈部鳞状细胞癌，肾嫌色细胞癌，肾乳头状细胞癌，低级胶质瘤，肝细胞癌，肺鳞状细胞癌，间皮瘤，卵巢浆液性囊腺癌，胰腺腺癌，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，前列腺腺癌，直肠腺癌，皮肤黑色素瘤，胃腺癌，睾丸生殖细胞瘤，甲状腺癌，胸腺瘤，子宫体内膜癌，子宫癌肉瘤，和葡萄膜黑色素瘤。在一些实施方案中，该抗SIRPa抗体与细胞毒剂缀合和/或诱导ADCC。
[0030] 在一些实施方案中，本公开提供一种药学组合物，其包含任一前述实施方案的抗SIRPA抗体和生理上可接受的载剂。在一些实施方案中，本公开提供任一前述实施方案的抗SIRPA抗体，供在治疗癌症中使用；和/或供在制备用于治疗癌症的药物的方法中使用。
[0031] 在又一方面中，本公开提供预防选自下组的疾病，病症，或损伤，降低选自下组的疾病，病症，或损伤的风险，或治疗选自下组的疾病，病症，或损伤的方法：痴呆，额颞叶痴呆，阿尔茨海默氏病，血管性痴呆，混合性痴呆，Tau病疾病，帕金森氏病，多发性硬化症，肌萎缩侧索硬化症，创伤性脑损伤，中风，额颞叶痴呆，脊髓损伤，亨廷顿氏病，感染，和癌症，该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的降低SIRPA的细胞水平，抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用，或二者的药剂。在一些实施方案中，该疾病，病症，或损伤是癌症且其中该药剂抑制一种或多种选自下组的SIRPA活性：(a)促进免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关抑制嗜中性细胞，肿瘤相关抑制NK细胞，非致瘤性CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的增殖，成熟，迁移，分化，和/或功能性；(b)增强免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关抑制嗜中性细胞，肿瘤相关抑制NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；(c)增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制性细胞和/或非致瘤性CD14+髓样细胞的数目；(d)增强髓样衍生的抑制细胞(MDSC)和/或非致瘤性CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；(e)提高肿瘤中或外周血液中促肿瘤细胞因子的表达，任选地，其中该促肿瘤细胞因子是TGF-β或IL-10；(f)提高促肿瘤FoxP3+调节性T淋巴细胞的肿瘤浸润；(g)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；(h)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的浸润；(i)降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；(j)降低NK细胞的肿瘤杀伤潜力；(k)降低具有增强免疫应答的潜力的肿瘤特异性B淋巴细胞的浸润；(l)增大肿瘤体积；(m)提高肿瘤生长速率；(n)提高转移；(o)提高肿瘤复发的速率；(p)降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效；(q)抑制PLCγ/PKC/钙动员；和(r)抑制PI3K/Akt，Ras/MAPK信号传导。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，该疾病，病症，或损伤是癌症，且其中该药剂表现出一种或多种选自下组的SIRPA活性：(a)增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；(b)降低非致瘤性CD14+髓样细胞中CD33的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(c)减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；(d)降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(e)降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(f)降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(g)降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(h)降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(i)降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(j)降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；(k)降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；(l)缩小肿瘤体积；(m)提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；(n)提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种多种；(o)提高一种或多种化疗剂的功效，任选地，其中该一种或多种化疗剂是吉西他滨，卡培他滨，蒽环类抗生素，多柔比星表柔比星 紫杉烷，帕利他赛 多西他赛
5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂 和其任何
组合；(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)存在下T细胞的增殖；(q)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中表达CD33的免疫抑制髓样细胞和/或表达CD14的细胞。在一些实施方案中，该癌症表达SIRPA或一种或多种SIRPA配体。
5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂 和其任何
组合；(p)提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)存在下T细胞的增殖；(q)抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和(r)当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中表达CD33的免疫抑制髓样细胞和/或表达CD14的细胞。在一些实施方案中，该癌症表达SIRPA或一种或多种SIRPA配体。
[0032] 在又一方面中，本公开提供治疗，预防疾病，病症，或损伤，或降低疾病，病症或损伤的风险的方法，该方法包含下调SIRPA的药剂，其中该疾病，病症，或损伤选自下组：痴呆，额颞叶痴呆，阿尔茨海默氏病，血管性痴呆，混合性痴呆，Tau病疾病，帕金森氏病，多发性硬化症，肌萎缩侧索硬化症，创伤性脑损伤，中风，额颞叶痴呆，脊髓损伤，和亨廷顿氏病。在一些实施方案中，该药剂是下调SIRPA的抗SIRPA抗体，例如任一前述实施方案的。
[0033] 在又一方面中，本公开提供：包含编码任一本文所述实施方案的抗SIRPA抗体的VH区的核酸序列的多核苷酸；和/或包含编码任一本文所述实施方案的抗SIRPA抗体的VL区的核酸序列的多核苷酸。在又一实施方案中，本公开提供包含包含编码该VH区的核酸序列的多核苷酸的表达载体或包含包含编码该VL区的核酸序列的多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，本公开提供包含编码该VH区的多核苷酸和编码该VL区的的多核苷酸的表达载体。在另外的方面中，本公开提供包含包含编码该VH区的核酸序列的多核苷酸的宿主细胞或包含包含编码该VL区的核酸序列的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开提供包含编码该VH区的多核苷酸和编码该VL区的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开提供包含任一前述实施方案的表达载体的宿主细胞。在又一方面中，本公开提供生成抗SIRPA抗体的方法，该方法包括在该抗体表达的条件下培养任一前述实施方案的宿主细胞。
在一些实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在一些实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
[0035] 图1A显示两个最常见等位基因的人SIRPA蛋白之间的氨基酸序列比对(v1(SEQ ID NO:1和v2(SEQ ID NO:45))，其描述了配体结合域内的相异残基。登录号分别为NP542970和CAA71403。
[0036] 图1B显示人SIRPA v1蛋白(SEQ ID NO:1)和人SIRPB1蛋白(SEQ ID NO:46)之间的氨基酸序列比对，其描述该两种蛋白之间的同源性。登录号分别为NP542970和O00241。
[0037] 图2显示人SIRPA蛋白(SEQ ID NO:1)和小鼠SIRPA蛋白(SEQ ID NO:47)之间的氨基酸序列比对，其描述该两种蛋白之间的同源性。登录号分别为NP542970和Q6P6I8。
[0038] 图3A显示左侧图的FACS直方图为选择的SIRPA抗体结合啮齿动物中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)表达的人SIRPA(HuSIRPA)或小鼠SIRPA(MuSIRPA)。阴影直方图代表CHO-MuSIRPA细胞。黑色轮廓直方图代表CHO-HuSIRPA细胞。右侧图示表示结合HuSIRPA的SIRPA抗体与结合MuSIRPA的抗体相比的相对MFI值。结果表示为背景以上的倍数。将背景水平在y轴上设置为1。抗体mIgG是同种型阴性对照。图3B显示选择的SIRPA抗体结合原代人巨噬细胞的FACS直方图。抗体mIgG代表阴性同种型对照。阴影直方图代表仅用抗小鼠IgG第二抗体染色的细胞。黑色轮廓直方图代表SIRPA阳性细胞群。图3C显示指示抗SIRPA抗体结合重组可溶的HuSIRPA蛋白的表面等离子体共振传感图。固定在CM5芯片上的抗小鼠IgG抗体捕获抗SIRPA抗体，且His标记的可溶的HuSIRPA蛋白的连续稀释液流过该抗体。通过曲线拟合分析测定Kd值。图3D显示渐增浓度的抗SIRPA抗体与在CHO细胞上过表达的人SIRPA的结合。通过Graph Pad Prism将数据拟合至S形曲线来计算EC50值。
[0039] 图4A显示在存在抗SIRPA抗体(虚线直方图)或小鼠IgG1同种型对照(黑色实线轮廓直方图)的情况下重组可溶人CD47(HuCD47)结合CHO-HuSIRPA细胞的FACS直方图。His标记的HuCD47用PE-标记的抗HIS标签第二抗体来检测。作为阴性对照(阴影直方图)，在HuCD47的缺少下，CHO-HuSIRPA细胞用抗HIS标签PE第二抗体染色。图4B显示在所示抗SIRPA抗体或小鼠IgG1同种型对照的存在下，HuCD47结合CHO-HuSIRPA细胞的相对MFI值。通过将用HuCD47和抗体处理的样品的MFI值除以在HuCD47的缺少下用抗HIS标签PE染色的细胞的MFI值，将结果描绘为背景以上的倍数。
[0040] 图5A显示在基于细胞的报告测定中诱导人SIRPA依赖性萤光素酶表达。BWZ/NFAT萤光素酶报告细胞(BWZ)经工程化以稳定表达人SIRPA-DAP12嵌合体(BWZ-HuSIRPA)。用渐增浓度的平板结合的，重组HuCD47刺激细胞。仅表达HuSIRPA嵌合体的细胞以剂量依赖性方式诱导萤光素酶表达，如通过发光信号测量的。结果表示为背景以上的倍数。将背景水平在y轴上设置为1。图5B显示了在基于细胞的报道测定中阻断CD47的和非阻断CD47的抗SIRPA抗体影响HuSIRPA依赖性荧光素酶表达的能力。将BWZ-HuSIRPA细胞接种到具有或不具有平板结合的CD47蛋白的孔上。所有阻断CD47的抗体(1B3，12D6，1H11，5F7)有效地抑制发光信号。两种非阻断CD47的抗SIRPA抗体并不降低萤光素酶表达。结果表示为背景以上的倍数。将背景水平在y轴上设置为1。
[0041] 图6A显示在基于细胞的报告测定中诱导人SIRPA依赖性或人SIRPB1依赖性萤光素酶表达。用平板结合的，全长抗SIRPA抗体或mIgG1同种型对照刺激BWZ-HuSIRPA和BWZ-HuSIRPB1报告细胞。阻断CD47的抗SIRPA抗体活化表达SIRPA和表达SIRPB1的报告细胞二者，而非阻断的CD47的抗SIRPA抗体(3F9和9C2)仅特异性活化BWZ-HuSIRPA细胞。图6B显示结合重组可溶性HuSIRPA抗原或HuSIRPB1抗原的指示抗SIRPA抗体的表面等离子体共振传感图。固定在CM5芯片上的抗小鼠IgG抗体捕获抗SIRPA抗体，且等摩尔浓度的抗原流过该捕获的抗体。
[0042] 图7A显示响应抗体刺激的原代人巨噬细胞中的SIRPA受体下调。用可溶的全长同种型对照或可溶的全长抗SIRPA抗体处理细胞，且随后用结合不同表位仓的DyLight650缀合的抗SIRPA参考抗体(SA56-DyL650)染色。图7B显示在用非阻断CD47的抗体处理的原代人巨噬细胞中的SIRPA受体下调。为了比较，还用2种阻断CD47的抗体(12D6和5F7)处理巨噬细胞。结果表示为参考抗体结合的百分比，其通过将用抗SIRPA抗体处理的样品的MFI值除以用同种型对照处理的样品的MFI值。
[0043] 图8A建立了活细胞吞噬作用测定，其中巨噬细胞作为效应细胞，pHrodo标记的肿瘤细胞作为靶标。生物素化的扁豆凝集素(LCA)，结合甘露糖的凝集素，与抗生物素蛋白缀合的pHrodo红染料复合。然后，将LCA-pHrodo复合物与Raji细胞(人B细胞淋巴瘤系)混合，以便通过细胞膜上的结合LCA的碳水化合物结构用pHrodo涂覆细胞表面。单独或用抗CD20抗体调理的标记的Raji细胞(Raji-红)以2：1的比例与巨噬细胞混合，并温育2小时以允许细胞的吞噬作用。通过FACS分析计数CD14-APC+/PE+巨噬细胞的百分比来测量吞噬作用活性。图8B显示用非阻断CD47的抗SIRPA抗体处理的巨噬细胞的增强的吞噬作用活性。将巨噬细胞在具有5μg/mL的3F9，9C2，1B3(CD47阻断剂)，或同种型对照的2.5％FBS RPMI培养基中培养过夜。将单独的Raji-红的细胞或用抗CD20抗体调理的Raji-红的细胞以2:1的比例与巨噬细胞混合，并如先前所述的测定吞噬作用活性。图8C显示用阻断CD47的抗SIRPA抗体处理的巨噬细胞的增强的吞噬作用活性。将巨噬细胞在具有5μg/mL的12D6，9C5，1H11，5F7，1B3，3F9(CD47非阻断剂)或同种型对照的2.5％FBS RPMI培养基中培养过夜。如上所述的测量吞噬作用活性。
[0044] 图9A显示显示响应抗体刺激的原代人单核细胞中的SIRPA受体下调。用可溶的全长同种型对照或抗SIRPA抗体(3F9)处理细胞，且随后用结合不同表位仓的DyLight650缀合的抗SIRPA参考抗体(SA56-DyL650)染色。图9B显示了从2个健康供体(HD)分离的原代人单核细胞的呼吸爆发。用可溶的全长小鼠IgG1同种型对照或抗SIRPA抗体3F9和9C2刺激细胞。在所有试验中，通过用2μM荧光指示剂CM-H2DCFDA标记细胞来监测活性氧种类(ROS)的产生。图9C显示用非阻断CD47的抗体过夜刺激的原代人单核细胞的IL-8分泌。收集上清液，并如制造商(eBioscience)指导的通过标准ELISA方案来测量细胞因子浓度。
[0045] 图10A显示在huSIRPA-tg小鼠中通过FACS染色测量的外周血单核细胞(实线)和粒细胞(虚线)中的小鼠和人SIRPA的表达。用抗hSIRPα/β-APC(克隆SE5A5，Biolegend)来检测人SIRPA；用抗mSIRPα-APC(克隆p84，Biolegend)来检测小鼠SIRPA。同种型染色显示为阴影直方图。图10B显示了皮下植入了Raji B细胞淋巴瘤细胞的huSIRPA-tg小鼠的肿瘤体积测量。每组三只小鼠接受5x105或1x106个Raji细胞。通过卡尺测量每周两次测定实体肿瘤形成。图10C显示来自施用了10mg/kg的3F9(实线直方图)或同种型对照(阴影直方图)抗体的小鼠的外周血细胞中的huSIRPA表达。图10C的上图显示用商业抗抗hSIRPα/β-APC(克隆SE5A5，Biolegend)检测huSIRPA，抗hSIRPα/β-APC是一种结合不同于3F9的表位的抗体。图10C的下图显示了用内部生成的抗hSIRPα-DyLight 650(克隆9C2)检测huSIRPA，该抗hSIRPα-DyLight 650是一种结合与3F9相同的表位的抗体。图10D显示在体内抗体处理后脾细胞中huSIRPA表达的下调。图10D的上图显示用抗小鼠F4/80FITC和抗小鼠CD11b Pacific蓝染色的小鼠脾脏的单细胞悬浮液的门控策略。图10D的下图显示两种脾髓样群(F4/
80LoCD11bLo和F4/80HiCD11bHi)中的huSIRPA表达。实线直方图代表施用了同种型对照抗体的小鼠中的huSIRPA表达，而虚线直方图代表施用了3F9的小鼠中的huSIRPA表达。
80LoCD11bLo和F4/80HiCD11bHi)中的huSIRPA表达。实线直方图代表施用了同种型对照抗体的小鼠中的huSIRPA表达，而虚线直方图代表施用了3F9的小鼠中的huSIRPA表达。
[0046] 图11A显示在体内抗体处理后肿瘤相关髓样细胞中huSIRPA表达的下调。图11A的上图显示用抗小鼠F4/80FITC和抗小鼠CD11b Pacific蓝染色的肿瘤的单细胞悬浮液的门控策略。图11A的下图显示两种脾髓样群(F4/80+和CD11b+)中的huSIRPA表达。实线直方图代表施用了同种型对照抗体的小鼠中的huSIRPA表达，而虚线直方图代表施用了3F9的小鼠中的huSIRPA表达。图11B显示皮下注射到huSIRPA-tg小鼠中的Raji-萤光素酶淋巴瘤细胞的辐射值。在第10天，基于辐射值将小鼠随机分入治疗组或对照组，并以10mg/kg每3-4天i.p.注射3F9或小鼠IgG1抗体给药，直至研究结束。在给药开始后的肿瘤发光值用随机化当天的发光值校正，并通过线性回归分析显著性。
[0047] 图12A显示在体内抗体处理后从MDA-MB-231负荷肿瘤的人源化小鼠收获的huCD45+huCD14+细胞的huSIRPA表达下调。图12A的上图显示来自i.p注射同种型对照，3F9，或可瑞达(Keytruda)(派姆单抗，Merck)施用的小鼠的外周血huCD45+huCD14+细胞中的huSIRPA表达水平。图12A的下图显示来自i.p注射同种型对照，3F9，或可瑞达(派姆单抗，Merck)施用的小鼠中的肿瘤浸润性huCD45+huCD14+细胞中huSIRPA表达水平。图12B显示存在于来自i.p注射同种型对照，3F9，或可瑞达(派姆单抗，Merck)施用的小鼠中的外周血液(图12B，上图)中或肿瘤内(图12B，下图)的huCD45+huCD14+细胞的百分比。图12C提供的数据显示在用SIRPA抗体3F9给药后人源化小鼠血液中人CD45+细胞的百分比降低。针对供体，初始血液参数(CD45，CD33，CD3)，初始动物体重和初始肿瘤体积来校正数据。通过多元线性回归(Rlm()函数)与对照组(muIgG1)相比，***p<0.002。
[0048] 图13A绘制了植入来自各种脐带血供体(供体5031，5048，129)的人免疫干细胞的NSG小鼠中的平均肿瘤体积。将人源化小鼠皮下植入人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，并基于第-1天的肿瘤体积，huCD34+干细胞供体，随机化前的体重和随机化前的huC45+植入率，随机化为处理组和对照组。以40mg/kg每4天i.p.注射小鼠IgG1或3F9或以10mg/kg每5天i.p.注射可瑞达给药小鼠。灰色实线代表同种型对照处理的小鼠的平均肿瘤体积，黑色实线代表可瑞达处理的小鼠的平均肿瘤体积，黑色虚线代表3F9处理的小鼠的平均肿瘤体积。图13B绘制了huCD34+干细胞供体在人源化NSG小鼠中的平均肿瘤体积。图13B的上图显示植入了来自供体5031和5048的干细胞的处理和对照小鼠的平均肿瘤体积。图13B的下图显示植入了来自供体129的干细胞的处理和对照小鼠的平均肿瘤体积。灰色实线代表同种型对照处理的小鼠的平均肿瘤体积，黑色实线代表可瑞达处理小鼠的平均肿瘤体积，黑色虚线代表3F9处理小鼠的平均肿瘤体积。
[0049] 图14A列出了3F9的重链可变结构域的潜在人源化序列。人源化的序列基于IGHV3-23*01受体框架和IGHJ4*01连接区。图14A按出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 48-53。图
14B列出了3F9的轻链可变域的潜在人源化序列。人源化序列基于IGKV3-11*01受体框架和IGKJ2*01连接区。图14B按出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 54-60。图14C列出了9C2的重链可变域的潜在人源化序列。人源化序列基于IGHV1-46*01受体框架和IGHJ4*01连接区。图
14C按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:61，49和62-67。图14D列出了9C2的轻链可变域的潜在人源化序列。人源化的序列基于IGKV3-11*01受体框架和IGKJ2*01连接区。图14D按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:68，55和69-74。CDR序列以粗体表示。CDR定义是来自网站www.bioinf.org.uk/abs/的AbM。“b”注明包埋的侧链；“p”注明部分包埋的；“i”注明在VH和VL域之间的界面处的侧链。星号(*)说明人类和小鼠种系之间的序列差异。框架中潜在的另外突变在下面的序列中注明。在每个CDR序列下方注明CDR序列的潜在变化。这些可以防止天冬酰胺(N)脱酰胺基作用。
14B列出了3F9的轻链可变域的潜在人源化序列。人源化序列基于IGKV3-11*01受体框架和IGKJ2*01连接区。图14B按出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 54-60。图14C列出了9C2的重链可变域的潜在人源化序列。人源化序列基于IGHV1-46*01受体框架和IGHJ4*01连接区。图
14C按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:61，49和62-67。图14D列出了9C2的轻链可变域的潜在人源化序列。人源化的序列基于IGKV3-11*01受体框架和IGKJ2*01连接区。图14D按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:68，55和69-74。CDR序列以粗体表示。CDR定义是来自网站www.bioinf.org.uk/abs/的AbM。“b”注明包埋的侧链；“p”注明部分包埋的；“i”注明在VH和VL域之间的界面处的侧链。星号(*)说明人类和小鼠种系之间的序列差异。框架中潜在的另外突变在下面的序列中注明。在每个CDR序列下方注明CDR序列的潜在变化。这些可以防止天冬酰胺(N)脱酰胺基作用。
[0050] 图15A和15B显示通过用EndoS(16A)处理的3F9的去糖基化，且去糖基化对抗原识别无影响(16B)。
[0051] 图16提供的数据说明3F9的两种糖型相对于同种型对照处理的巨噬细胞显著下调SIRPA的表面表达，但相较于糖基化的形式，去糖基化的形式表现出部分还原的活性。
[0052] 图17A和17B提供的数据说明在用对照或3F9抗体处理的巨噬细胞上的FcγRIIIA(小图18A，CD16)和FcγRIIA/B(小图18B，CD32A/B)的表面表达水平。用于此分析的检测FcγRII的抗体不区分活化的受体(FcγRIIA)和抑制性受体(FcγRIIB)。
[0053] 图18提供的数据说明了使用糖基化和去糖基化的形式的3F9处理的巨噬细胞上的受体特异性抗体的FcγRIIA(左图)和FcγRIIB(右图)的细胞表面水平。
[0054] 发明详述
[0055] 术语
[0056] 如本文所用，除非另有明确规定，否则单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，关于“抗体”任选地包括两个或多个此类分子等的组合。
[0057] 如本文所用的术语“约”是指此技术领域中的技术人员容易知晓的各自值的通常误差范围。
[0058] 术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用且包含多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
[0059] 如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自实质性同种的抗体群的抗体，即，包含该群的个别抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体外(例如，含有自然发生的突变的或在产生单克隆抗体制剂期间出现的变体抗体)，此类变体通常以少量存在。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇的(表位)的不同抗体)相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示如获自实质性同种的抗体群的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，依照本发明所用的单克隆抗体可通过多种技术制造，该技术包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有全部和部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
[0060] “抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，诸如scFv分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0061] “结合与参考抗体相同的表位的抗体”或“具有与参考抗体相同的结合特异性的抗体”是指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更高的抗体，且相反地，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更高。结合相同表位的抗体可结合与参考抗体相同的表位，或可结合该表位的一部分。示例性竞争测定法在本文中提供。
[0062] 如本文所用的，“V-区”是指包含框架1，CDR1，框架2，CDR2，和框架3(包括CDR3和框架4)的区段的抗体可变区域，所述的区段由于在B细胞分化期间重链和轻链V-区基因的重排添加至V区段。
[0063] 如本文所用的，“互补决定区(CDR)”是指每条链中的三种高可变区(HVR)，该三种高可变区打断由轻和重链可变区建立的四个“框架区”。CDR是结合抗原的表位的主要贡献者。将每条链的CDR称为CDR1，CDR2，和CDR3，依次从N-端开始编号，且通过特定CDR所位于的链鉴定。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变域的CDR1。术语“CDR”可与“HVR”互换地使用。
[0064] CDR和框架区的氨基酸序列可使用本领域中的多种已知定义确定，例如，Kabat，Chothia，国际免疫遗传学数据库(IMGT)，和AbM(参见，例如，Johnson等,supra；Chothia和Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia C.等,1989,Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature342:877-883；Chothia C.等,1992,structural repertoire of the human VH segments,J.Mol.Biol.227:799-817；Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.1997,273(4))。抗原组合位点的定义也在下列中描述：Ruiz等，IMGT，国际免疫遗传学数据库,Nucleic Acids Res.28:219-221(2000)；和Lefranc,M.-P.IMGT,国际免疫遗传学数据库,Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；
MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,J.Mol.Biol.262(5):732-745(1996)；和Martin等,Proc.Natl
Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.203:121-153(1991)；
Pedersen等,Immunomethods 1:126(1992)；和Rees等,In Sternberg M.J.E.编,Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172,1996)。关于如通过Kabat编号确定的CDR是基于例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。Chothia CDR是如通过Chothia(参见例如Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:
901-917(1987))定义而确定的。
MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,J.Mol.Biol.262(5):732-745(1996)；和Martin等,Proc.Natl
Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.203:121-153(1991)；
Pedersen等,Immunomethods 1:126(1992)；和Rees等,In Sternberg M.J.E.编,Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172,1996)。关于如通过Kabat编号确定的CDR是基于例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。Chothia CDR是如通过Chothia(参见例如Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:
901-917(1987))定义而确定的。
[0065] “表位”或“抗原决定簇”是指抗体结合的抗原上的位点。表位可由连续氨基酸形成，或由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位典型地在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位典型地在用变性溶剂处理时丢失。表位典型地在独特的空间构像中包括至少3个，且更通常包括，至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构像的方法包括，例如，x-ray结晶学和2维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed(1996)。
[0066] “Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-端区，不包括天然免疫球蛋白的第一恒定区。该术语包括是指天然Fc区和变体Fc区。因此，天然免疫球蛋白背景中的“Fc区”典型地是指IgA，IgD，和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域，和这些域的N-端柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，天然Fc包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3和Cγ1和Cγ之间的铰链。在本领域中应理解的是Fc区的界限可变化，然而，通常限定人IgG重链Fc区包含残基C226或P230至其羧基端，其使用根据如Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中的EU索引的编号。例如，在产生或纯化抗体期间，或通过重组工程化编码抗体的重链的核酸，可去除Fc区的C-端赖氨酸(根据EU或，Kabat编号系统的残基447)。相应地，完整抗体的组合物可包含去除了所有K447残基的抗体群，未去除K447残基的抗体群，和具有有K447残基和无K447残基的抗体的混合物的抗体群。适用于本公开的抗体的天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。术语“Fc区”包括Fc区的天然存在的等位基因变体以及调节效应器功能的修饰。Fc区还包括不导致生物学功能改变的变体。例如，在无生物学功能的实质性丢失的情况下，可从免疫球蛋白的Fc区的N-端或C-端删除一个或多个氨基酸。
[0067] 术语“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。适用于本发明的FcR典型地是天然人FcR或变体。
[0068] “天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型抗免疫球蛋白)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。
[0069] “变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰，优选是一个或多个氨基酸替代，而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。选优地，相较于天然序列Fc区或相较于母本多肽的Fc区，变体Fc区在天然序列Fc区中或在母本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸替代，例如约1至约10个氨基酸替代，且优选为约1至约5个氨基酸替代。本文的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与母本多肽的Fc区持有至少约80％同一性，且最优选为与其持有至少约90％同一性，更优选为与其持有至少约95％同一性。
[0070] “拮抗物”抗体，或“抑制性”抗体是在抗体结合抗原后抑制或降低(例如，减少)抗原的一种或多种活性的抗体，诸如本公开的抗SIRPA抗体。在一些实施方案中，拮抗物抗体可阻断一种或多种配体与抗原的结合。在一些实施方案中，拮抗物抗体或抑制性抗体实质性或完全地抑制抗原的功能的一种或多种活性；和/或配体与抗原的结合。
[0071] 术语“平衡解离常数”缩写为(KD)，是指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1M-1)。平衡解离常数可使用任何方法测量。因此，在一些实施方案中，如在37℃通过使用生物传感器系统诸如 系统的表面等离子体共振分析测定的，本公开的抗体具有的KD少于约50nM，典型地少于约25nM，或少于10nM，例如，少于约5nM或少于约1nM且通常少于约100pM。在一些实施方案中，如以二价抗体测量的，本公开的抗体具有的KD少于5x10-5M，少于10-5M，少于5x10-6M，少于10-6M，少于5x 10-7M，少于10-7M，少于5x 10-8M，少于
10-8M，少于5x10-9M，少于10-9M，少于5x10-10M，少于10-10M，少于5x 10-11M，少于10-11M，少于
5x10-12M，少于10-12M，少于5x10-13M，少于10-13M，少于5x10-14M，少于10-14M，少于5x10-15M，或少于10-15M或更低。在本发明的背景中，“改善的”KD是指较低的KD。
10-8M，少于5x10-9M，少于10-9M，少于5x10-10M，少于10-10M，少于5x 10-11M，少于10-11M，少于
5x10-12M，少于10-12M，少于5x10-13M，少于10-13M，少于5x10-14M，少于10-14M，少于5x10-15M，或少于10-15M或更低。在本发明的背景中，“改善的”KD是指较低的KD。
[0072] 如本文所用的术语“二价分子”是指具有两个抗原结合位点的分子。在一些实施方案中，本发明的二价分子是二价抗体或其二价片段。在一些实施方案中，本发明的二价分子是二价抗体。在一些实施方案中，本发明的二价分子是IgG。通常，单克隆抗体具有二价基本结构。IgG和IgE仅具有一个二价单元，而IgA和IgM包含多个二价单元(分别为2和5个)，且因此具有较高的化合价。此二价增强抗体对抗原的亲合力。
[0073] 如本文所用的术语“二价结合”或“二价地结合”是指二价分子的两个抗原结合位点与其抗原的结合。优选地，二价分子的两个抗原结合位点享有相同的抗原特异性。
[0074] 如本文所用的术语“化合价”是指针对抗原的抗体的不同结合位点的数目。单价抗体包含针对抗原的一个结合位点。二价抗体包含针对同一抗原的两个结合位点。
[0075] 当提及蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗原或靶标或“特异性(或选择性)免疫反应”是指结合反应，由此抗体结合感兴趣的抗原或靶标。在本发明的背景中，该抗体典型地以比其对其它抗原的亲和力大至少100倍的KD结合SIRPA。在一些实施方案中，该抗体以比其对其它抗原的亲和力大至少100倍的KD结合人SIRPA。在一些实施方案中，该抗体结合小鼠和人SIRPA。因此，如本文所用的“特异性结合”或“选择性结合”不一定需要(即使其可包括)专一性结合。特异性结合靶标的抗体可具有的结合常数为至少约103M-1或104M-1，有时为约105M-1或106M-1，在其他情况中为约106M-1或107M-1，约108M-1至109M-1，或约1010M-111 -1
至10 M 或更高。多种形式的免疫测定法可用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。
例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York，用于描述可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件。
至10 M 或更高。多种形式的免疫测定法可用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。
例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York，用于描述可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件。
[0076] 本发明的抗SIRPA抗体“下调”在表达SIRPA的细胞的细胞表面上存在的SIRPA的水平。因此，如本公开中所用的“下调”是指抗体降低在表达SIRPA的细胞(例如人巨噬细胞)的细胞表面上存在的SIRPA的水平的能力。认为当相较于匹配同种型的对照抗体，在细胞表面上的SIRPA的水平降低至少75％至少80％，至少85％，或至少90％时，本发明的抗SIRPA抗体下调SIRPA。
[0077] “分离的”抗体(诸如本公开的抗SIRPa抗体)是已经经鉴定，分离和/或从其产生环境(例如天然地或重组地)的组分中回收的抗体。优选地，分离的多肽不结合来自其产生环境的所有其他污染物组分。来自其产生环境的污染物组分(诸如起因于重组转染的细胞的污染物组分)，是典型地干扰抗体的研究，诊断或治疗用途的材料，且可包括酶，激素，和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将会使该多肽纯化：(1)至大于按重量计的95％的抗体，如通过例如Lowry方法测定的，且在一些实施方案中，至大于按重量计的99％；(2)至足以利用旋转杯测序仪获得N-末端的或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或，优选地，银染的SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组T细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。通常地，然而，分离的多肽或抗体将会通过至少一个纯化步骤制备。
[0078] 在两个或多个多肽序列的背景中的术语“同一的”或百分比“同一性”是指当比较并对齐以在比较窗口或指定区域上进行最大对应时，在指定区内的相同的或具有规定百分比(例如，至少70％，至少75％，至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高)的相同的氨基酸残基的两个或多个序列或子序列同一性。出于测定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以多种方法进行，该方法包括使用公开可获得的计算机软件诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的方法。适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST2.0算法，其在Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。因此，出于此发明的目的，BLAST 2.0可以与所述的默认参数一起使用以确定核酸序列或多肽序列的百分比序列。
[0079] 本发明的某些方面的概述。
[0080] 本公开涉及结合SIRPA和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂(例如，抗SIRPA抗体)；制造和使用此类药剂(例如，抗SIRPA抗体)的方法；含有此类药剂(例如，抗SIRPA抗体)的药物组合物；编码此类药剂(例如，抗SIRPA抗体)的核酸；和含有编码此类药剂(例如，抗SIRPA抗体)的核酸的宿主细胞。
[0081] 降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的本公开的药剂是具有一种或多种下列特性的分子：(1)抑制或降低一种或多种SIRPA活性；(2)抑制或降低SIRPA与一种或多种其配体的结合的能力；(3)降低表达SIRPA的细胞中的SIRPA表达的能力(诸如在mRNA水平和/或在蛋白质水平)；(4)与SIRPA蛋白相互作用，结合，或识别SIRPA蛋白的能力；(5)与SIRPA蛋白特异性相互作用或结合的能力；和(6)治疗，减轻或预防本文所述或所预期的任何方面的疾病或病症的能力。
[0082] 抑制SIRPA的产生的例证性药剂包括，但不限于，特异性抑制SIRPA合成和/或释放的化合物，针对SIRPA的反义分子，或针对编码SIRPA的核酸的短干扰RNA(siRNA)分子。一种或多种SIRPA活性的额外的示例性药剂包括，但不限于，特异性结合SIRPA蛋白的抗SIRPA抗体，特异性抑制一种或多种SIRPA活性的化合物诸如小分子抑制剂和/或肽抑制剂，特异性抑制SIRPA结合一种或多种配体的化合物，SIRPA结构类似物，或结合SIRPA的RNA或DNA适配体。在一些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂是变构抑制剂。在一些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂是正构抑制剂。
[0083] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂是小分子抑制剂，包括但不限于，小肽或肽样分子，可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。小分子抑制剂可具有的分子量为约100至约20,000道尔顿(Da)，约500至约15,000Da，约1000至约10,000Da中的任一值。用于制造和测试小分子对一种或多种SIRPA活性的抑制作用的方法是本领域所熟知的，且此类方法可用于评定该小分子抑制剂对SIRPA活性的作用。例如，本文公开的任何方法和测定法可用于筛选降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的小分子抑制剂。
[0084] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂包含至少一种能够通过靶向编码SIRPA的核酸来阻断或降低功能性SIRPA的表达的反义分子。SIRPA的核酸序列在本领域中是已知的。例如，人SIRPA可具有如NCBI登录号NM_080792或Y10375.1中所示的核酸序列。小鼠SIRPA可具有如NCBI登录号BC062197中所示的核酸序列。制备反义寡核苷酸分子的方法是已知的，且此类方法可用于制备在不与其他多核苷酸交叉反应的情况下将会特异性结合一种或多种SIRPA mRNA的反义寡核苷酸。靶向的示例性位点包括，但不限于，起始密码子，5’调控区，编码序列(其包括任何保守共有区)，和3’非翻译区。在某些实施方案中，该反义寡核苷酸的长度为约10至约100个核苷酸，约15至约50个核苷酸，约18至约25个核苷酸，或更长。在某些实施方案中，该寡核苷酸进一步包含增强核酸酶抗性的化学修饰等，诸如，例如，本领域普通技术人员已知的硫代磷酸连接和2’-O-糖修饰。
[0085] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂包含至少一种能够通过靶向编码SIRPA的核酸来阻断或降低功能性SIRPA的表达的siRNA分子。用于制备siRNA分子的方法在本领域中是已知的，且此类方法可用于制备将会特异性靶向SIRPA mRNA而不与其他多核苷酸交叉反应的siRNA分子。siRNA分子可通过诸如典型固相寡核苷酸合成的方法生成，且通常将会并入化学修饰以增加半衰期和/或siRNA药剂的功效，和/或以获得更强的递送配制剂。可替换地，siRNA分子使用编码用于siRNA的细胞内转录的表达盒的载体来递送。
[0086] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂是RNA或DNA适配体，其结合SIRPA或按照自然法则与SIRPA相互作用，并阻断SIRPA和其配体中的一种或多种之间的相互作用。在某些实施方案中，该适配体包含至少一种结合成熟形式的SIRPA的RNA或DNA适配体。
[0087] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂包含至少一种Siglec-9结构类似物。术语“SIRPA结构类似物”是指具有相似三维结构作为SIRPA的结构的一部分且其在体外或体内生理条件下结合一种或多种CD3配体的化合物，其中该结合至少部分地抑制SIRPA生物学活性。合适的SIRPA结构类似物可通过SIRPA结合配体(诸如本公开的SIRPA配体)的分子模拟设计和合成。该SIRPA结构类似物可以是单体，二聚体，或相同或不同结构的任何期望的组合(以获得改善的亲和力和生物学作用)的更高级的多聚体。在一些实施方案中，该药剂结合或与SIRPA的氨基酸序列相互作用。
[0088] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂包含可溶性SIRPA受体蛋白，可溶性SIRPA-Fc融合蛋白。在某些实施方案中，此类药剂结合一种或多种SIRPA配体，并由此阻止SIRPA配体和SIRPA受体之间的相互作用。
[0089] 测定法
[0090] 降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂可使用本领域已知的方法来鉴定和/或表征，诸如，例如，放射性标记的抑制剂测定法，光学测定法，蛋白质结合测定法，生物化学筛选测定法，免疫测定法，质量位移测量测定法，荧光测定法，和/或荧光肽切割测定法。
[0091] 结合测定和其他测定
[0092] 在某些实施方案中，降低SIRPA的细胞水平和/或抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体之间的相互作用的药剂可通过本领域中熟知的用于检测SIRPA药剂候选物与SIRPA的相互作用和/或对SIRPA的结合亲和力的存在的技术。
[0093] 在某些实施方案中，与SIRPA相互作用的药剂可使用放射性标记的抑制剂测定法鉴定。例如，已知量的放射性标记药剂候选物可与已知量的固定化SIRPA和缓冲液温育。随后，固定化的SIRPA可用缓冲液洗涤，且可使用本领域中已知的技术测量固定化的SIRPA的放射性标记的SIRPA药剂候选物的剩余存在，诸如，例如，γ射线计数器。指示放射性标记物质的存在的测量可以指示放射性标记的药剂候选物能够与SIRPA相互作用和/或结合SIRPA。
[0094] 在某些实施方案中，与SIRPA相互作用的药剂可使用光学技术鉴定。检测SIRPA相互作用的药剂的示例性光学技术可包括，例如，使SIRPA附着至比色共振接枝表面，由此由于光必须采取的光学路径的变化而转变反射光的波长，且随后，当允许候选物药剂与SIRPA相互作用时测量反射光的波长的额外变化。例如，当药剂与SIRPA温育时，反射光的经测量的波长无变化可指示该药剂候选物不能够与SIRPA相互作用。当药剂候选物与SIRPA温育时，反射光的经测量的波长变化可指示该药剂候选物能够结合SIRPA和/或与SIRPA相互作用。
[0095] 在某些实施方案中，与SIRPA相互作用的药剂可使用蛋白质结合测定法来鉴定。用于检测SIRPA结合药剂的示例性蛋白质结合测定法可包括，例如，在药剂候选物的存在下免疫共沉淀SIRPA。例如，SIRPA可与缓冲液中的药剂候选物温育，且随后在本领域中已知的洗涤流程期间，特异性捕获SIRPA的固定化分子(诸如，例如抗SIRPA抗体)在药剂候选物的存在下可用于捕获SIRPA，且可与潜在的相互作用的药剂候选物结合SIRPA。随后，可释放SIRPA，其可能是相互作用的药剂候选物，且可基于药剂候选物的特性，通过技术，诸如，例如，质谱分析法和/或Western印迹来检测药剂候选物的存在。
[0096] 在某些实施方案中，与SIRPA相互作用的药剂可使用本领域中已知的生物化学和/或免疫测定测定法鉴定。示例性技术可包括，例如，使用技术，诸如，例如，Western印迹，免疫染色，和共免疫沉淀来定量测量SIRPA浓度和/或蛋白质半衰期的变化的测定法。例如，药剂候选物可与含有SIRPA的样品(诸如表达SIRPA的细胞)一起温育，且随后可以在过程研究期间的时间点测量SIRPA蛋白质量和/或细胞水平。相较于对照治疗，蛋白质量，细胞水平，和/或蛋白质半衰期的变化可指示SIRPA药剂候选物能够改变SIRPA半衰期和/或活性。
[0097] 在某些实施方案中，质量位移测量测定法可用于鉴定与SIRPA相互作用的药剂。示例性质量位移测量测定法可包括，例如，当药剂候选物与SIRPA相互作用时，通过测量SIRPA质量的变化，通过使用仪器，诸如，但不限于，质谱仪来检测强力和/或共价结合的SIRPA药剂的存在。例如，质量位移测量测定法可对完整蛋白和/或基于肽的分析进行，这取决于药剂候选物相互作用的性质。检测与向SIRPA添加所述药剂候选物相关的质量位移可指示药剂候选物可能够与SIRPA相互作用或以其他方式抑制SIRPA。此外，示例性质量位移测量测定法可包括，例如，当药剂候选物与SIRPA相互作用时，使用技术，诸如，例如，表面等离子体共振来检测与相应的药剂候选物质量相关的SIRPA质量的增加。例如，可测量光的反射指数的变化并与附着于传感器表面的SIRPA质量的变化关联。
[0098] 在某些实施方案中，化学交联测定法可用于鉴定与SIRPA相互作用的SIRPA药剂。例如，药剂候选物可与SIRPA在体内或体外与分子交联剂一起温育，所述分子交联剂能够将与SIRPA相互作用的药剂候选物与所述SIRPA分子共价连接。随后，技术，诸如，但不限于，质谱分析法和/或Western印迹，可用于鉴定可能可以与SIRPA相互作用或以其他方式抑制SIRPA的药剂候选物。例如，检测SIRPA与药剂候选物共价交叉连接可指示药剂候选物可能能够与SIRPA相互作用或以其他方式抑制SIRPA。
[0099] 在某些实施方案中，与SIRPA相互作用的药剂可使用荧光测定法鉴定。例如，已知量的荧光药剂候选物可与已知量的固定化的SIRPA和缓冲液温育。随后，固定化的SIRPA可用缓冲液洗涤，且固定化的SIRPA的剩余荧光SIRPA药剂候选物的存在可使用本领域中已知的技术测量，诸如，但不限于，荧光检测。指示荧光物质的存在的测量可指示荧光药剂候选物能够与SIRPA相互作用和/或结合SIRPA。
[0100] 本领域中已知的和本文所述(例如，实施例2-11)的测定法可用于鉴定和测试本公开的SIRPA药剂的生物学活性。在一些实施方案中，提供了用于测试SIRPA药剂调节一种或多种Siglec-9活性的能力的测定法。
[0101] 抗SIRPα(SIRPA)抗体
[0102] 本公开的某些抗SIRPA抗体的方面的简要概述
[0103] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有一种或多种拮抗性活性，该活性至少部分是由于该抗体下调细胞SIRPA的能力。在一些实施方案中，本公开的分离的SIRPA抗体选择性结合SIRPA和下调SIRPA。在一些实施方案中，该抗体并不阻断SIRPA配体例如CD47与在细胞上表达的SIRPA的结合。在可替代的实施方案中，该抗体阻断SIRPA配体例如CD47与SIRPA的结合。在一些实施方案中，该抗体是人抗体，人源化抗体，双特异性抗体，多价抗体，或嵌合抗体。在整个本公开中发现了此类抗体的示例性描述。在一些实施方案中，该抗体是识别第一抗原和第二抗原的双特异性抗体。
[0104] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体选择性结合人SIRPA，包括人等位基因变体，在本文中也称为“多态性”变体，但不是小鼠SIRPA，且不结合SIRPB。图1A显示两个最常见的等位基因的人SIRPA蛋白(v1和v2，登记号分别为NP542970和CAA71403)之间的氨基酸序列比对，描绘了配体结合域内的相异残基。因此，在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合存在于等位基因变体的人SIRPA中但不在SIRPB或小鼠SIRPA中的线性或构像表位。图1B显示人SIRPA v1蛋白和人SIRPB1蛋白(登记号分别为NP542970和O00241)之间的氨基酸序列比对，描绘了该两种蛋白之间的同源性。图2显示人SIRPA蛋白和小鼠SIRPA蛋白(登记号分别为NP542970和Q6P6I8)之间的氨基酸序列比对，描绘了该两种蛋白之间的同源性。在一些实施方案中，本公开的抗体选择性地结合人和小鼠SIRPA且不结合SIRPB。
[0105] SIRPA是单通I型膜蛋白。在人SIRPA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列内，细胞外域位于氨基酸残基31-373处；跨膜域位于氨基酸残基374-394处；且细胞内域位于氨基酸残基395-504处。
[0106] 人SIRPA包含Ig超家族(IgSF)域的单个V组和两个C1组，分别称为D1域，D2域，和D3域。D1域包含人SIRPA的氨基酸残基32-137；D2域包含人SIRPA的氨基酸残基148-247；且D3域包含人SIRPA的氨基酸残基254-348。
[0107] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合SIRPA的D1域。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合人SIRPA的D1域，该D1域包含SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基32-137。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D1域内的表位。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D1域内的表位，其中该表位包含选自由SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基32-137，氨基酸残基32-52，氨基酸残基55-121，氨基酸残基58-73，氨基酸残基68-83，氨基酸残基78-93，氨基酸残基88-103，氨基酸残基98-113，氨基酸残基108-123，和氨基酸残基118-133组成的组的氨基酸序列。
[0108] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合SIRPA的D2域。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合人SIRPA的D2域，该D2域包含SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基148-247。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D2域内的表位。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D2域内的表位，其中该表位包含选自由SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基148-247，氨基酸残基148-168，氨基酸残基158-173，氨基酸残基168-183，氨基酸残基170-228，氨基酸残基178-
193，氨基酸残基188-203，氨基酸残基198-213，氨基酸残基208-223，氨基酸残基218-233，和氨基酸残基228-243组成的组的氨基酸序列。
193，氨基酸残基188-203，氨基酸残基198-213，氨基酸残基208-223，氨基酸残基218-233，和氨基酸残基228-243组成的组的氨基酸序列。
[0109] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合SIRPA的D3域。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合人SIRPA的D3域，该D3域包含SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基254-348。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D3域内的表位。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合在人SIRPA的D3域内的表位，其中该表位包含选自由SEQ ID NO:1的人SIRPA氨基酸序列的氨基酸残基254-348，氨基酸残基254-274，氨基酸残基264-279，氨基酸残基274-289，氨基酸残基273-331，氨基酸残基281-
315，氨基酸残基281-337，氨基酸残基284-299，氨基酸残基294-309，氨基酸残基304-319，氨基酸残基314-329，氨基酸残基324-339，和氨基酸残基334-348组成的组的氨基酸序列。
315，氨基酸残基281-337，氨基酸残基284-299，氨基酸残基294-309，氨基酸残基304-319，氨基酸残基314-329，氨基酸残基324-339，和氨基酸残基334-348组成的组的氨基酸序列。
[0110] 在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA的D1域，例如，人SIRPA。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA的D2域，例如，人SIRPA。在一些实施方案中，该抗体结合SIRPA的D3域，例如，人SIRPA。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合由具有如在表2中命名为3F9的抗体的CDR的抗体结合的相同的SIRPA表位或部分SIRPA表位。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合由具有如表2中命名为9C2的抗体的CDR的抗体结合的相同SIRPA表位或部分SIRPA表位，其与3F9竞争结合SIRPA并结合与3F9相同的全部或部分表位。因此，在一些实施方案中，本公开的抗体结合由具有如在表2中命名为3F9的抗体的CDR的抗体结合的相同的SIRPA表位或部分SIRPA表位，且结合由具有如表2中命名为9C2的抗体的CDR的抗体结合的相同表位或部分SIRPA表位。
[0111] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体与3F9和9C2竞争结合人SIRPA。
[0112] 在优选的实施方案中，前述三个段落中的每个中的抗体不阻断CD47与SIRPA结合。
[0113] SIRPA下调
[0114] 本公开的某些方面涉及下调，即降低SIRPA的细胞水平的抗SIRPA抗体。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体在不抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体(例如CD47)之间的相互作用(例如，结合)的情况下降低SIRPA的细胞水平。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞水平且抑制SIRPA和一种或多种SIRPA配体(例如CD47)之间的相互作用(例如，结合)。
[0115] SIRPA的细胞水平可以指，但不限于，SIRPA的细胞表面水平，SIRPA的细胞内水平，和SIRPA的总水平。在一些实施方案中，SIRPA的细胞水平的降低包含SIRPA的细胞表面水平的降低。如本文所用的，抗SIRPA抗体降低SIRPA的细胞表面水平，如果其诱导降低25％或更多的SIRPA的细胞表面水平，如通过在体外基于细胞的测定法或如本文所述的或本领域已知的适合的体内模型测量，例如利用流式细胞术，诸如荧光激活的细胞分选术(FACS)，来测量SIRPA的细胞表面水平。在一些实施方案中，SIRPA的细胞水平的降低包含SIRPA的细胞内水平的降低。如本文所用的，抗SIRPA抗体降低Siglec-9的细胞内水平，如果其诱导25％或更多的SIRPA的细胞内水平的降低，如通过任何在体外基于细胞的测定法或本文所述的或本领域已知的适合的体内模型测量，例如免疫染色，Western印迹分析，免疫共沉淀，和细胞计数法。在一些实施方案中，SIRPA的细胞水平的降低包含SIRPA的总水平的降低。如本文所用的，抗SIRPA抗体降低SIRPA的总水平，如果其诱导降低25％或更多的SIRPA的总水平，如通过任何在体外基于细胞的测定法或本文所述的或本领域已知的适合的体内模型测量，例如免疫染色，Western印迹分析，免疫共沉淀，和细胞计数法。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体诱导SIRPA降解，SIRPA切割，SIRPA内化，SIRPA脱落，SIRPA表达的下调，或任何其组合。在一些实施方案中，SIRPA的细胞水平在原代细胞(例如，树突细胞，骨髓-衍生的树突细胞，单核细胞，小胶质细胞，和巨噬细胞)上或在利用SIRPA细胞测定法的细胞系上测量。
[0116] 在一些实施方案中，下调的抗SIRPA抗体具有的IC50为200nM或更低，典型的是100nM或更低(50％的在细胞表面上表达的SIRPA是下调的)，在37℃将人巨噬细胞暴露于该抗体4小时后。在一些实施方案中，SIRPA在暴露于本发明的抗体至少24小时后保持下调。可使用任何技术例如流式细胞术来分析细胞的SIRPA表面表达。
[0117] 在一些实施方案中，如相较于在缺少该抗SIRPA的情况下的SIRPA的细胞水平，本公开的抗SIRPA抗体将SIRPA的细胞水平降低至少25％，至少26％，至少27％，至少28％，至少29％，至少30％，至少31％，至少32％，至少33％，至少34％，至少35％，至少36％，至少37％，至少38％，至少39％，至少40％，至少41％，至少42％，至少43％，至少44％，至少45％，至少46％，至少47％，至少48％，至少49％，至少50％，至少51％，至少52％，至少53％，至少
54％，至少55％，至少56％，至少57％，至少58％，至少59％，至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少
71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少
88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或更多。
54％，至少55％，至少56％，至少57％，至少58％，至少59％，至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少
71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少
88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或更多。
[0118] 在可与前述段落中概述的任何下调活性组合的一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体抑制SIRPA的细胞表面簇集。
[0119] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体下调SIRPA，但不阻断结合SIRPA配体(例如CD47)与SIRPA的结合。在本发明的背景中，不阻断CD47与SIRPA的结合的抗体是指当该抗体与CD47和表达SIRPA的细胞一起温育时，不导致与SIRPA的结合的CD47的显著降低的抗体。在与SIRPA结合的CD47的背景中的“显著降低”是指相较于不结合SIRPA的同种型匹配的对照抗体的存在下与SIRPA结合的CD47，降低30％或更低，典型的是至少25％，至少20％，至少15％，或至少10％或更低的结合。用于评定阻断活性的例证性测定法在实施例中示出。例如，表达人SIRPA的细胞，例如，人巨噬细胞是经修饰以表达人SIRPA的细胞诸如CHO细胞，以105个细胞/孔铺板于96孔板，洗涤，且在100μl缓冲液中温育，用于含有1.0μg/ml的单克隆抗体或同种型对照的荧光激活细胞分选。然后洗涤细胞，并与可溶性人CD47在冰上温育
30分钟。然后分析细胞的表面结合的CD47。
30分钟。然后分析细胞的表面结合的CD47。
[0120] 可替换地，在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体下调SIRPA，但阻断CD47与SIRPA的结合。阻断CD47结合的抗体典型地阻断CD47结合50％或更多，典型地为75％，或90％或更多。
[0121] SIRPA活性的抑制
[0122] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体抑制SIRPA的一种或多种活性，所述活性包括，不限于：SIRPA结合一种或多种SIRPA配体，任选地其中该一种或多种SIRPA配体选自由CD47，表面活性蛋白A和D和其任何组合组成的组；降低一种或多种选自下组的细胞的增殖：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；抑制一种或多种选自下组的细胞的迁移：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；抑制一种或多种选自下组的细胞的一种或多种功能：树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，M1巨噬细胞，M1嗜中性细胞，M1NK细胞，活化的M1巨噬细胞，活化的M1嗜中性细胞，活化的M1NK细胞，M2巨噬细胞，M2嗜中性细胞，M2NK细胞，单核细胞，破骨细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，粒细胞，嗜中性细胞，小胶质细胞，M1小胶质细胞，活化的M1小胶质细胞，和M2小胶质细胞；抑制一种或多种选自下组的类型的清除：凋亡神经元清除，神经组织残骸清除，功能失调的突触清除，非神经组织残骸清除，细菌清除，其他外来体清除，致病蛋白清除，致病肽清除，和肿瘤细胞清除；任选地，其中该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽，且该肿瘤细胞来自选自下组的癌症：膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾细胞癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，纤维肉瘤和甲状腺癌；抑制通过小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的肿瘤细胞杀伤；抑制小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种的抗肿瘤细胞增殖活性；调节一种或多种炎性受体的表达，任选地，其中该一种或多种炎性受体包含CD86且该一种或多种炎性受体在小胶质细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，树突细胞，骨髓衍生的树突细胞，嗜中性细胞，T细胞，T辅助细胞，或细胞毒性T细胞中的一种或多种上表达；促进或挽救免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，和调节性T细胞中的一种或多种的功能性；提高免疫抑制树突细胞，免疫抑制巨噬细胞，免疫抑制嗜中性细胞，免疫抑制NK细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关嗜中性细胞，肿瘤相关NK细胞，非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞，和调节性T细胞中的一种或多种浸润至肿瘤中；增加肿瘤中，外周血液中，或其他淋巴样器官中的促肿瘤髓样/粒细胞免疫抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的数目；增强髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的促肿瘤活性；增强非致瘤性髓样衍生的抑制细胞和/或非致瘤性CD45+CD14+髓样细胞的存活；降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性T淋巴细胞的活化；降低具有肿瘤杀伤潜力的肿瘤特异性NK细胞的浸润；增大肿瘤体积；提高肿瘤生长速率；和降低一种或多种调节抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法的功效，任选地，其中该一种或多种免疫疗法是靶向一种或多种选自下组的靶蛋白的免疫疗法：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，TREM1，TREM2，CD39，CD73，CSF-1受体，和其任何组合，或一种或多种癌症疫苗的功效。
[0123] 在可与任何的其他上述实施方案组合的一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体诱导一种或多种选自下组的活性：增加肿瘤浸润性CD3+T细胞的数目；降低非致瘤性CD14+髓样细胞中SIRPA的细胞水平，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；减少非致瘤性CD14+髓样细胞的数目，任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞是肿瘤浸润性细胞，或任选地，其中该非致瘤性CD14+髓样细胞存在于血液中；降低一种或多种细胞中的PD-L1水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的PD-L2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的B7-H2水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的B7-H3水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的CD200R水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的CD163水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低一种或多种细胞中的CD206水平，任选地，其中该一种或多种细胞是非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)；降低实体肿瘤的肿瘤生长速率；缩小肿瘤体积；提高一种或多种PD-1抑制剂的功效；提高一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法的功效，任选地，其中该一种或多种检查点抑制剂疗法和/或免疫调节疗法靶向CTLA4，腺苷途径，PD-L1，PD-L2，OX40，TIM3，LAG3，或其任何组合中的一种或多种；提高一种或多种化疗剂的功效，任选地，其中该一种或多种化疗剂是吉西他滨(gemcitabine)，卡培他滨(capecitabine)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，多柔比星(doxorubicin) 表柔比星(epirubicin)紫杉烷(taxanes)，帕利他赛(paclitaxel) 多西他赛(docetaxel)
5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂 和其任何
组合；提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的存在下T细胞的增殖；抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中的表达CD33的免疫抑制非致瘤性髓样细胞和/或非致瘤性表达CD14的细胞。
5-氟尿嘧啶(5-FU)，环磷酰胺 卡铂 和其任何
组合；提高在非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的存在下T细胞的增殖；抑制非致瘤性髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，存活，和/或一种或多种功能；和当与化学或放射性毒素缀合时，杀伤实体肿瘤和相关血管中的表达CD33的免疫抑制非致瘤性髓样细胞和/或非致瘤性表达CD14的细胞。
[0124] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体降低调节性T细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制树突细胞，肿瘤嵌入的免疫抑制巨噬细胞，髓样衍生的抑制细胞，肿瘤相关巨噬细胞，急性髓样白血病(AML)细胞，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞，或慢性髓样白血病(CML)的活性，功能，或存活。
[0125] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体诱导或提高一种或多种免疫细胞的存活，成熟，功能，迁移，或增殖，例如，一种或多种免疫细胞选自下组：个体中的树突细胞，巨噬细胞，嗜中性细胞，NK细胞，小胶质细胞，T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，和其任何组合。
[0126] 如本文所用的，SIRPA的水平可指编码SIRPA的基因的表达水平；指一种或多种编码SIRPA的转录物的表达水平；指SIRPA蛋白的表达水平；和/或指存在于细胞内和/或细胞表面上的SIRPA蛋白的量。本领域已知的用于测量基因表达，转录，翻译的水平，和/或蛋白质丰度或定位的任何方法可用于测定SIRPA的水平。
[0127] 在一些实施方案中，本公开的分离的抗SIRPA抗体是鼠抗体。在一些实施方案中，本公开的分离的抗SIRPA抗体是人抗体，人源化抗体，双特异性抗体，单克隆抗体，多价抗体，或嵌合抗体。此类抗体地示例性描述可见于整个本公开中。
[0128] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体结合人SIRPA，该人SIRPA包括人等位基因的变体(图1A，登录号NP542970和CAA71403)。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体特异性结合灵长类动物SIRPA，该灵长类动物SIRPA包括人SIRPA。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体特异性结合人SIRPA和灵长类动物SIRPA二者。在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体特异性结合人SIRPA，并与鼠SIRPA交叉反应。
[0129] 下调SIRPA的不阻断CD47结合的抗体的HVR序列
[0130] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体下调SIRPA且不阻断CD47结合SIRPA。在一些实施方案中，此类抗体包含重链可变区，该重链可变区包含抗体3F9的如SEQ ID NO:11中所示的HVR3。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:11中所示的序列，其中1，2，3，4，或5个氨基酸被替代，例如保守性替代。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:11中所示的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:11中所示的序列，其中1，2，或3个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，相较于SEQ ID NO:11中所示的序列，该HVR3具有1或2个替代的氨基酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:11，1或2个氨基酸被删除。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少65％同一性或至少75％同一性。
[0131] 在一些实施方案中，本发明的抗SRPA抗体的重链可变区包含前述段落中所示的HVR3和抗体3F9的如表3中所示的HVR1和/或HVR2。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:9的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:9的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:10的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:10的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。
[0132] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:11的HVR3，SEQ ID NO:9的HVR1，和SEQ ID NO:10的HVR2。
[0133] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含抗体3F9的如表2中所示的HVR3。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:8中所示的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:8中所示的序列，其中1，2，或3个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，相较于SEQ ID NO:8中所示的序列，该HVR3具有1或2个替代的氨基酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:8，1或2个氨基酸被删除。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少65％同一性。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少
85％同一性。
85％同一性。
[0134] 在一些实施方案中，本发明的抗SRPA抗体的轻链可变区包含前述段落中所示的HVR3和HVR1和/或抗体3F9的如表2中所示的HVR2。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:6的序列，其中1，2，3，4，5，或6；或1，2，3，4，或5个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:6的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:6的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:7的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％，至少85％，同一性。
[0135] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:8的HVR3，SEQ ID NO:6的HVR1，和SEQ ID NO:7的HVR2。
[0136] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含抗体3F9的如表3中所示的HVR3，HVR2，和HVR1，该轻链可变区包含抗体3F9的如表2中所示的HVR3，HVR2，和HVR1。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含3F9的6种CDR，其中相较于3F9的相应HVR，至少一种HVR与3F9的HVR相差一个，两个，或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，此类抗体包含两种HVR，其相较于3F9的相应HVR，与3F9的相应HVR相差一个，两个，或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含三种HVR，其相较于3F9的相应HVR，与3F9的相应HVR相差一个，两个，或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含四种HVR，其相较于3F9的相应HVR，与3F9的相应HVR相差一个，两个，或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含五种HVR，其相较于3F9的相应HVR，与3F9的相应HVR相差一个，两个，或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，相较于3F9的相应HVR，该抗体在每种HVR中包含一个，两个，或3个氨基酸变化；或一个或两个氨基酸变化。
[0137] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含重链可变区，该重链可变区包含抗体9C2的如SEQ ID NO:17中所示的HVR3。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:17中所示的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:7中所示的序列，其中1，2，或3个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，相较于SEQ ID NO:17中所示的序列，该HVR3具有1或2个替代的氨基酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:17，1或2个氨基酸被删除。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少65％同一性。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性。
[0138] 在一些实施方案中，本发明的抗SRPA抗体的重链可变区包含前述段落中所示的HVR3和抗体9C2的如表3中所示的HVR1和/或HVR2。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:15的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:15的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:16的序列，其中1，2，
3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:16的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。
3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:16的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，或至少90％同一性。
[0139] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:17的HVR3，SEQ ID NO:15的HVR1，和SEQ ID NO:16的HVR2。
[0140] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含抗体9C2的如表2中所示的HVR3。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:14中所示的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR3包含SEQ ID NO:4中所示的序列，其中1，2，或3个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，相较于SEQ ID NO:14中所示的序列，该HVR3具有1或2个替代的氨基酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:14，1或2个氨基酸被删除。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少65％同一性。在一些实施方案中，该HVR3与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性。
[0141] 在一些实施方案中，本发明的抗SIRPA抗体的轻链可变区包含前述段落中所示的HVR3和抗体9C2的如表2中所示的HVR1和/或HVR2。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:12的序列，其中1，2，3，或4个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1包含SEQ ID NO:12的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR1与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％同一性，至少80％同一性，或至少90％同一性。在一些实施方案中，该HVR2包含SEQ ID NO:13的序列，其中1，2，或3个氨基酸；或1或2个氨基酸被替代，例如，保守性替代。在一些实施方案中，该HVR2与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少70％，至少85％同一性。
[0142] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:14的HVR3，SEQ ID NO:12的HVR1，和SEQ ID NO:13的HVR2。
[0143] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含抗体9C2的如表3中所示的HVR3，HVR2，和HVR1，该轻链可变区包含抗体9C2的如表2中所示的HVR3，HVR2，和HVR1。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含至少一种HVR，其相较于9C2的相应HVR，与9C2的HVR相差一个，两个或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，此类抗体包含两个HVR，其相较于9C2的相应HVR，与9C2的相应HVR相差一个，两个或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含三个HVR，其相较于9C2的相应HVR，与9C2的相应HVR相差一个，两个或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含四种HVR，其相较于9C2的相应HVR，与9C2的相应HVR相差一个，两个或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，该抗体包含五个HVR，其相较于9C2的相应HVR，与9C2的相应HVR相差一个，两个或三个氨基酸；或一个或两个氨基酸。在一些实施方案中，相较于9C2的相应HVR，该抗体在每种HVR中包含一个，两个，或三个氨基酸变化；或一个或两个氨基酸变化。
[0144] 在一些实施方案中，存在于来自3F9的轻链CDR2(SEQ ID NO:7)的N残基可由Q，S，A，或D替代。在一些实施方案中，表2中的来自3F9的轻链CDR3(SEQ ID NO:8)的N残基可由Q，S，A，或D替代。在一些情况中，轻链CDR2和CDR3二者中的N残基可由Q，S，A，或D替代。在一些实施方案中，来自3F9的轻链CDR3(SEQ ID NO:8)中的C可由A，S，或L替代。
[0145] 在一些实施方案中，存在于来自9C2的重链CDR1(SEQ ID NO:15)中的N残基可由Q，S，或A替代。在一些实施方案中，存在于来自9C2的重链CDR2(SEQ ID NO:16)中的一个或两个N残基可由Q，S，或A替代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:17的重链CDR3残基Asp-Gly(DG)的D可由A，S，或E替代。在一些实施方案中，来自9C2的轻链CDR2(SEQ ID NO:13)的N残基可由Q，S，D，或A替代。在一些实施方案中，来自9C2的轻链CDR3(SEQ ID NO:14)的N残基可由Q，S，D，或A替代。SEQ ID NO:14的轻链CDR3还可含有替代9C2轻链CDR3中的Trp残基的H，Y，或F残基。
[0146] 抗体框架
[0147] 本文所述的任何抗体进一步包括框架，优选为人免疫球蛋白框架。例如，在一些实施方案中，抗体包含如任何上述实施方案中的HVR且进一步包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。人免疫球蛋白框架可以是人抗体的一部分，或非人抗体可通过由一个或多个人框架区替代一个或多个内源框架来人源化。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等,J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；和Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和衍生自筛选的FR库的框架区(参见，例如，Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
[0148] 在一些实施方案中，本公开的抗体具有3F9的结合特异性且包含如上所述的重链HVR1，HVR2，和HVR3序列，且进一步，包含至少一种如图14A中所示的重链框架，例如，图14A的hSB-3F9-H1或hSB-3F9-H2序列。此语境中的“框架”是指FR1，FR2，FR3，和FR4序列，且不包括CDR序列。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体具有框架，该框架与图14A中所示的框架具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％氨基酸序列同一性，其中百分比同一性基于不包括CDR的FR1，FR2，FR3，和FR4序列来确定。
[0149] 在一些实施方案中，本公开的抗体具有3F9的结合特异性，且包含如上所述的轻链HVR1，HVR2，和HVR3序列，且进一步，包含至少一种如图14B中所示的轻链框架，例如，图14B的hSB-3F9-L1，hSB-3F9-L2，或hsB-3F9-L3序列。此语境中的“框架”是指FR1，FR2，FR3，和FR4序列，且不包括CDR序列。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体具有框架，该框架与图14B中所示的框架具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％氨基酸序列同一性，其中百分比同一性基于不包括CDR的FR1，FR2，FR3，和FR4序列来确定。
[0150] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含如前两段落所示的VH区和VL区。
[0151] 在一些实施方案中，本公开的抗体具有9C2的结合特异性，且包含如上所述的重链HVR1，HVR2，和HVR3序列，且进一步，包含至少一种图14C所示的重链框架，例如，图14C的hSB-9C2-H1，hSB-9C2-H2，hSB-9C2-H3，或hSB-9C2-H4序列。此语境中的“框架”是指FR1，FR2，FR3，和FR4序列，且不包括CDR序列。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体具有框架，该框架与图14C中所示的框架具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％氨基酸序列同一性，其中百分比同一性基于不包括CDR的FR1，FR2，FR3，和FR4序列来确定。
[0152] 在一些实施方案中，本公开的抗体具有3F9的结合特异性，且包含如上所述的轻链HVR1，HVR2，和HVR3序列，且进一步，包含至少一种图14D所示的轻链框架，例如，图14D的hSB-9C2-L1，hSB-9C2-L2，hSB-9C2-L3，或hSB-9C2-L序列。此语境中的“框架”是指FR1，FR2，FR3，和FR4序列，且不包括CDR序列。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体具有框架，该框架与图14D中所示的框架具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少
96％，至少97％，至少98％，或至少99％氨基酸序列同一性，其中百分比同一性基于不包括CDR的FR1，FR2，FR3，和FR4序列来确定。
96％，至少97％，至少98％，或至少99％氨基酸序列同一性，其中百分比同一性基于不包括CDR的FR1，FR2，FR3，和FR4序列来确定。
[0153] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含如前两段落所示的VH区和VL区。
[0154] 在一些实施方案中，本发明的抗SIRPA抗体包含一种或多种相对于图10A-10D中所示的CDR和框架区序列的替代。在一些实施方案中，替代是保守性替代。以下提供说明性替代：
[0155] 氨基酸替代
[0156]
[0157]
[0158] 在一些实施方案中，替代可以是非保守性替代。天然存在的残基基于常见的侧链性质分为下组：
[0159] (1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
[0160] (2)中性亲水性：cys，ser，thr；
[0161] (3)酸性：asp，glu；
[0162] (4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
[0163] (5)影响链的方向的残基：gly，pro；和
[0164] (6)芳香族：trp，tyr，phe。
[0165] 在一些实施方案中，非保守性替代需要将这些类别中的一个成员交换为另一个类别。
[0166] 未参与维持抗体的适当构像的任何半胱氨酸残基还可由通常为丝氨酸来替代，以改善分子的氧化稳定性并阻止异常交联。相反地，一个或多个半胱氨酸键可添加至抗体以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段时，诸如Fv片段)。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含在图14A-14D中所示的序列的一个或多个C残基处的替代。
[0167] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体还可包含在N残基的替代，该N残基是潜在脱酰胺基作用位点。在一些实施方案中，本发明的抗SIRPA抗体包含在图14A-14D中所示的序列的一个或多个N残基处的替代。
[0168] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含在W残基处的替代，因为W残基可能易于氧化。在一些实施方案中，该替代在图14A-14D中所示的序列的一个或多个W残基处。
[0169] 在一些实施方案中，含有Asp-Gly(DG)序列(其易受异天冬氨酸形成影响)的抗SIRPA抗体可具有替代Gly的A或S或替代Asp的E。
[0170] 抗SIRPA1抗体结合亲和力
[0171] 本公开的抗SIRPA可具有纳摩尔或甚至皮摩尔的针对SIRPA的亲和力。在某些实施方案中，该抗体的解离常数(KD)为约0.05至约100nM。例如，该抗体的KD为约100nM，约50nM，约10nM，约1nM，约900pM，约800pM，约790pM，约780pM，约770pM，约760pM，约750pM，约740pM，约730pM，约720pM，约710pM，约700pM，约650pM，约600pM，约590pM，约580pM，约570pM，约560pM，约550pM，约540pM，约530pM，约520pM，约510pM，约500pM，约450pM，约400pM，约350pM约300pM，约290pM，约280pM，约270pM，约260pM，约250pM，约240pM，约230pM，约220pM，约
210pM，约200pM，约150pM，约100pM，或约50pM中的任一值至约2pM，约5pM，约10pM，约15pM，约20pM，或约40pM中的任一值。
210pM，约200pM，约150pM，约100pM，或约50pM中的任一值至约2pM，约5pM，约10pM，约15pM，约20pM，或约40pM中的任一值。
[0172] 在一些实施方案中，抗SIRPA针对结合人SIRPA的KD可以为约200nM或更少，约100nM或更少，约50nM或更少，约20nM或更少，约10nM或更少，约1nM更少。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体针对人SIRPA的Kd为约100pM或更少或约50pM或更少，少于约10pM，或少于约1pM。在一些实施方案中，该结合亲和力在约1pM至约200nM的范围中。在一些实施方案中，该KD在约1pM至约100nM范围内。
[0173] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体针对人SIRPA的KD为少于15nM，少于14.5nM，少于14nM，少于13.5nM，少于13nM，少于12.9nM，少于12.8nM，少于12.7nM，少于12.6nM，少于
12.5nM，少于12.4nM，少于12.3nM，少于12.2nM，少于12.1nM，少于12nM，少于11.5nM，少于
11nM，少于10.9nM，少于10.8nM，少于10.7nM，少于10.6nM，少于10.5nM，少于10.4nM，少于
10.3nM，少于10.2nM，少于10.1nM，少于10nM，少于9.5nM，少于9nM，少于8.5nM，少于8nM，少于7.5nM，少于7nM，少于6.9nM，少于6.8nM，少于6.7nM，少于6.6nM，少于6.5nM，少于6.4nM，少于6.3nM，少于6.2nM，少于6.1nM，少于6nM，少于5.5nM，少于5nM，少于4.5nM，少于4nM，少于3.5nM，少于3.4nM，少于3.3nM，少于3.2nM，少于3.1nM，少于3nM，少于2.9nM，少于2.8nM，少于2.7nM，少于2.6nM，少于2.5nM，少于2.4nM，少于2.3nM，少于2.2nM，少于2.1nM，少于
2nM，少于1.9nM，少于1.8nM，少于1.7nM，少于1.6nM，少于1.5nM，少于1.4nM，少于1.3nM，少于1.2nM，少于1.1nM，少于1nM，少于0.95nM，或少于0.9nM。在一些实施方案中，解离常数的范围为约50nM至约100pM。
12.5nM，少于12.4nM，少于12.3nM，少于12.2nM，少于12.1nM，少于12nM，少于11.5nM，少于
11nM，少于10.9nM，少于10.8nM，少于10.7nM，少于10.6nM，少于10.5nM，少于10.4nM，少于
10.3nM，少于10.2nM，少于10.1nM，少于10nM，少于9.5nM，少于9nM，少于8.5nM，少于8nM，少于7.5nM，少于7nM，少于6.9nM，少于6.8nM，少于6.7nM，少于6.6nM，少于6.5nM，少于6.4nM，少于6.3nM，少于6.2nM，少于6.1nM，少于6nM，少于5.5nM，少于5nM，少于4.5nM，少于4nM，少于3.5nM，少于3.4nM，少于3.3nM，少于3.2nM，少于3.1nM，少于3nM，少于2.9nM，少于2.8nM，少于2.7nM，少于2.6nM，少于2.5nM，少于2.4nM，少于2.3nM，少于2.2nM，少于2.1nM，少于
2nM，少于1.9nM，少于1.8nM，少于1.7nM，少于1.6nM，少于1.5nM，少于1.4nM，少于1.3nM，少于1.2nM，少于1.1nM，少于1nM，少于0.95nM，或少于0.9nM。在一些实施方案中，解离常数的范围为约50nM至约100pM。
[0174] 解离常数可通过任何分析技术测定，包括任何生物化学或生物物理学技术诸如ELISA，表面等离子体共振(SPR)，生物层干涉量度法(参见，例如，ForteBio的Octet System)，等温滴定量热法(ITC)，差示扫描量热法(DSC)，圆二色性(CD)，停流分析，和比色法或荧光蛋白熔解分析。
[0175] 抗体片段
[0176] 本公开的某些方面涉及如本文所述的SIRPA抗体的片段，其中该片段保留SIRPA结合活性。在一些实施方案中，该抗体片段为Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv或scFv片段。在一些实施方案中，抗体片段以多价形式提供。
[0177] 多价抗体。
[0178] 在一些实施方案中，本发明的抗SIRPA抗体可以是多价形式，其比二价抗体更快地通过表达该抗体结合的抗原的细胞来内化。本公开的抗SIRPA抗体或其抗体片段可以是具有三个或多个抗原结合位点(例如，四价抗体)的多价抗体(其不同于IgM类)，其可以通过重组表达编码该抗体的多肽链的核酸来容易地产生。多价抗体可包含二聚化域和三个或更多个抗原结合位点。在典型的实施方案中，该二聚化域包含Fc区或铰链区。在此情况中，该抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在一些实施方案中，多价抗体含有三至八个，例如四个抗原结合位点。多价抗体含有至少一个多肽链(且优选为两个多肽链)，其中该一个或多个多肽链包含两个或更多个可变域。
[0179] 双特异性和多特异性抗体
[0180] 本公开的某些方面涉及双特异性抗体，或多特异性抗体，该双特异性抗体或多特异性抗体包含如本文所述的抗SIRPA抗体和结合第二抗原或第二SIRPA表位的抗体。双特异性和多特异性抗体可使用任何方法生成。
[0181] 在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体，其包含本公开中所述的抗SIRPA抗体的可变区和结合第二抗原的抗体。在一些实施方案中，该第二抗原是选自下组的蛋白：PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73。在一些实施方案中，该第二抗原是推动穿过血脑屏障的转运的抗原；推动穿过血脑屏障的转运的抗原选自下组:转铁蛋白受体(TR)，胰岛素受体(HIR)，胰岛素样生长因子受体(IGFR)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1和2(LPR-1和2)，白喉毒素受体，CRM197，美洲驼单域抗体，TMEM 30(A)，蛋白转导域，TAT，Syn-B，穿膜肽(penetratin)，多精氨酸肽，angiopep肽，和ANG1005；致病因子，其选自由致病肽或蛋白或，致病核酸组成的组，其中该致病核酸是反义GGCCCC(G2C4)重复扩充RNA，该致病蛋白选自下组：淀粉样蛋白β，寡聚淀粉样蛋白β，淀粉样蛋白β斑块，淀粉样蛋白前体蛋白或其片段，Tau，IAPP，α-突触核蛋白，TDP-43，FUS蛋白，C9orf72(染色体9开放阅读框72)，c9RAN蛋白，朊病毒蛋白，PrPSc，亨廷顿蛋白，降钙素，超氧化物歧化酶，共济失调蛋白，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，共济失调蛋白7，共济失调蛋白8，共济失调蛋白10，路易体，心房利钠因子，胰岛淀粉样蛋白多肽，胰岛素，载脂蛋白AI，血清淀粉样蛋白A，medin，促乳素，甲状腺素运载蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白，凝溶胶蛋白，角膜上皮蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，免疫球蛋白轻链AL，S-IBM蛋白，重复相关的非ATG(RAN)翻译产物，二肽重复(DPR)肽，甘氨酸-丙氨酸(GA)重复肽，甘氨酸-脯氨酸(GP)重复肽，甘氨酸-精氨酸(GR)重复肽，脯氨酸-丙氨酸(PA)重复肽，泛素，和脯氨酸-精氨酸(PR)重复肽；或在免疫细胞上表达的配体和/或蛋白，其中该配体和/或蛋白选自下组：PD1/PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，PD-L1，CTLA4，PD-L2，PD-1，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，CD73，和磷酯酰丝氨酸；和在一种或多种肿瘤细胞上表达的蛋白，脂质，多糖，或糖脂。
[0182] Fc区
[0183] 在一些实施方案中，本公开的抗体包含Fc区。例如，该抗体可以是IgG类，IgM类，或IgA类的。在一些实施方案中，该抗体具有IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4同种型。典型地，该Fc区是天然人Fc区或其变体。
[0184] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体保留结合Fcγ受体的能力。在一些实施方案中，此类抗体可具有导致SIRPA的聚簇和瞬时刺激的特征。此类抗体可随后通过诱导SIRPA降解，SIRPA脱敏，SIRPA切割，SIRPA内化，SIRPA脱落，SIRPA的溶酶体降解或以其他方式下调SIRPA作为SIRPA表达和/或SIRPA的一种或多种活性的较长期的抑制剂起作用。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体降低在细胞的表面上的Fcγ受体的水平。
[0185] 在一些实施方案中，该Fc区是结合受体诸如FcγRI，FcγRII，和FcγRIII亚类的Fc区，该受体包括这些受体的等位基因变体和可替换的拼接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质域中不同。活化性受体FcγRIIA在其细胞质域中含有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(“ITAM”)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(“ITIM”)。(参见，例如，M. Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。FcR还可增加抗体的血清半衰期。
[0186] Fc区可包括一种或多种影响Fc区的活性的突变，例如，影响结合Fc受体。
[0187] 在一些实施方案中，本公开的抗体结合抑制性Fc受体。在某些实施方案中，该抑制性Fc受体是抑制性Fcγ受体IIB(FcγIIB)。在一些实施方案中，本公开的抗体降低细胞表面上的抑制性Fcγ受体IIB的表达水平。在一些实施方案中，该Fc区含有一种或多种修饰。例如，在一些实施方案中，该Fc区含有一处或多处氨基酸替代(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在一些实施方案中，该一处或多处氨基酸替代选自V234A(Alegre等(1994)Transplantation 57:1537-1543.31；Xu等(2000)Cell Immunol 200:16-26)，G237A(Cole等(1999)Transplantation 68:563-571)，H268Q，V309L，A330S，P331S(US 2007/0148167；
Armour等(1999)Eur J Immunol 29:2613-2624；Armour等(2000)The Haematology Journal 1(增刊1):27；Armour等(2000)The Haematology Journal 1(增刊1):27)，C232S，和/或C233S(White等(2015)Cancer Cell 27:138-148)，S267E，L328F(Chu等(2008)Mol Immunol 45:3926-3933)，M252Y，S254T，和/或T256E，其中氨基酸位置根据EU或Kabat编号惯例编号。
Armour等(1999)Eur J Immunol 29:2613-2624；Armour等(2000)The Haematology Journal 1(增刊1):27；Armour等(2000)The Haematology Journal 1(增刊1):27)，C232S，和/或C233S(White等(2015)Cancer Cell 27:138-148)，S267E，L328F(Chu等(2008)Mol Immunol 45:3926-3933)，M252Y，S254T，和/或T256E，其中氨基酸位置根据EU或Kabat编号惯例编号。
[0188] 在一些实施方案中，具有带有一些实施方案中的重链恒定域的IgG2同种型的本发明的抗体，含有C127S或C2214S氨基酸替代，其中氨基酸位置根据EU或Kabat编号惯例编号(White等(2015)Cancer Cell 27:138-148；Lightle等(2010)PROTEIN SCIENCE 19:753-762；和WO2008079246)。
[0189] 在某些实施方案中，本公开的抗体具有IgG1同种型。在一些实施方案中，结合Fcγ受体的抗体结合抑制性Fc受体。在某些实施方案中，该抑制性Fc受体是抑制性Fcγ受体IIB(FcγIIB)。在一些实施方案中，本公开的抗体降低在细胞表面上表达的抑制性Fcγ受体IIB的水平。在一些实施方案中，Fc区含有一种或多种修饰。例如，在一些实施方案中，该Fc区含有一处或多处氨基酸替代(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在一些实施方案中，该一处或多处氨基酸替代选自N297A(Bolt S等(1993)Eur J Immunol 23:403-411)，D265A(Shields等(2001)R.J.Biol.Chem.276:6591-6604)，D270A，L234A，L235A(Hutchins等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984；Alegre等(1994)Transplantation 57:1537-1543.31；Xu等(2000)Cell Immunol200:16-26)，G237A(Alegre等(1994)Transplantation 57:1537-1543.31；Xu等(2000)Cell Immunol 200:16-26)，P238D，L328E，E233D，G237D，H268D，P271G，A330R，C226S，C229S，E233P，L234V，L234F，L235E(McEarchern等(2007)Blood 109:1185-1192)，P331S(Sazinsky等(2008)Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:20167-20172)，S267E，L328F，A330L，M252Y，S254T，T256E，N297Q，P238S，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，和/或T394D，其中氨基酸位置根据EU或Kabat编号惯例编号。
[0190] 在一些实施方案中，本公开的抗体具有IgG1同种型且包括IgG2同种型重链恒定域1(CH1)和铰链区(White等(2015)Cancer Cell 27:138-148)。在某些实施方案中，该IgG2同种型CH1和铰链区含有ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体Fc区含有S267E氨基酸替代，L328F氨基酸替代，或二者，和/或N297A或N297Q氨基酸替代，其中氨基酸位置根据EU或Kabat编号惯例编号。
[0191] 在一些实施方案中，抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，V309L，A330S，P331S，C214S，C232S，C233S，S267E，L328F，M252Y，S254T，T256E，H268E，N297A，N297Q，A330L，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的；
[0192] 在某些实施方案中，本公开的抗体具有IgG4同种型。在一些实施方案中，该抗体含有人IgG4恒定区且包含含有一处或多处氨基酸替代的Fc区(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在一些实施方案中，该一处或多处氨基酸替代选自L235A，G237A，S228P，L236E(Reddy等(2000)J Immunol,164:1925-1933)，S267E，E318A，L328F，M252Y，S254T，T256E，E233P，F234V，L234A/F234A，S228P，S241P，L248E，T394D，N297A，N297Q，L235E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0193] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有杂合IgG2/4同种型。在某些实施方案中，该抗体包含包含人IgG2的氨基酸118至260和人IgG4的氨基酸261至447的氨基酸序列，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0194] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有人或小鼠IgG1同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：N297A，N297Q，D270A，D265A，L234A，L235A，C226S，C229S，P238S，E233P，L234V，P238A，A327Q，A327G，P329A，K322A，L234F，L235E，P331S，T394D，A330L，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0195] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有IgG2同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：P238S，V234A，G237A，H268A，H268Q，H268E，V309L，N297A，N297Q，A330S，P331S，C232S，C233S，M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0196] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有IgG4同种型且包含Fc区中的一处或多处在选自下组的残基位置处的氨基酸替代：E233P，F234V，L234A/F234A，L235A，G237A，E318A，S228P，L236E，S241P，L248E，T394D，M252Y，S254T，T256E，N297A，N297Q，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0197] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含Fc区，该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：A330L，L234F；L235E，P331S，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0198] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含Fc区，该Fc区进一步包含一处或多处在选自下组的位置处的另外的氨基酸替代：M252Y，S254T，T256E，和其任何组合，其中该残基的编号是根据EU编号的。
[0199] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体包含Fc区，该Fc区进一步包含根据EU编号的S228P氨基酸替代。
[0200] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体具有IgG4同种型且包含在残基位置228处的S228P氨基酸替代，在残基位置234处的F234A氨基酸替代，和在残基位置235处的L235A氨基酸替代，其中该残基位置的编号是根据EU编号的。
[0201] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体可经修饰以调节效应器功能和/或以增加该抗体的血清半衰期。例如，恒定区上的Fc受体结合位点可经修饰或经突变以去除或降低对某些Fc受体(诸如FcγRI，FcγRII，和/或FcγRIII)的结合亲和力，以降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，通过去除抗体的Fc区的N-糖基化(例如，在IgG的CH2域中的)抑制该效应器功能。在一些实施方案中，通过修饰人IgG的区诸如233-236，297，和/或327-331来抑制该效应器功能，如PCT WO 99/58572和Armour等,Molecular Immunology 40:585-593(2003)；Reddy等,J.Immunology 164:1925-1933(2000)中描述的。在其他实施方案中，还可期望修饰本公开的抗SIRPA抗体以修饰效应器功能来增加对含有ITIM的FcγRIIb(CD32b)的结合选择性，以增加SIRPA抗体在相邻细胞上的聚簇，而不活化效应器功能诸如ADCC。
[0202] 在一些实施方案中，为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位并入抗体(尤其是抗体片段)中，如例如美国专利5,739,277所述的。如本文所用的，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子在体内的血清半衰期。
[0203] 其他氨基酸序列修饰
[0204] 还考虑了本公开的抗SIRPA抗体或其抗体片段的氨基酸序列修饰。例如，可期望改善抗体或抗体片段的结合亲和力和/或其他生物学性质。
[0205] 在一些实施方案中，另外的氨基酸序列可融合至抗SIRPA抗体的氨基末端或羧基末端。实例包括，但不限于，具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体，融合至细胞毒性多肽，或融合至增加抗体血清半衰期的酶或多肽。
[0206] 在一些实施方案中，本发明的抗体可经突变以改变抗体的原始糖基化样式，例如，通过删除或突变一个或多个位点以阻止通过某些碳水化合物部分的糖基化和/或添加一个或多个糖基化位点以引入期望的碳水化合物部分。
[0207] 抗体的糖基化典型是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺的侧链的酶促附着的识别序列。因此，在多肽中存在的这些三肽序列中的任一个产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)的附着。
[0208] 向抗体添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列来方便地完成，使得其含有上述三肽序列中的一种或多种(针对N-连接的糖基化位点)。该改变还可通过向原始抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基替代原始抗体的序列来进行(针对O-连接的糖基化位点)。
[0209] 其他抗体修饰
[0210] 本公开的抗SIRPA抗体，或其抗体片段，可进一步经修饰以含有另外的部分，例如，用于衍生化抗体的部分，与抗体缀合的药物部分等。适用于衍生化抗体的部分的实例是水溶性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如，丙三醇)，聚乙烯醇，和其混合物。聚乙二醇丙醛可由于其在水中的稳定性而在制造方面具有优势。聚合物可以具有任何分子量，且可以是支链或非支链的。附着至抗体的聚合物的数目可变化，且如果一个以上聚合物附着，则它们可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于以下考虑确定，该考虑包括，但不限于，待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否用于在限定条件下的疗法等。此类技术和其他适合的配制剂可公开在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Alfonso Gennaro,Ed.,Philadelphia College of Pharmacy and Science(2000)中。
[0211] 在一些实施方案中，细胞毒性剂或药物可与本发明的抗SIRPA抗体缀合，例如，用于治疗在细胞表面上表达SIRPA的癌症，诸如多发性骨髓瘤或其它癌症。公开的用于缀合抗体的技术在本领域中是已知的(参见，例如，Jane de Lartigue,OncLive July 5,2012；ADC Review on antibody-drug conjugates；和Ducry等(2010)Bioconjugate Chemistry 21(1):5-13)。在一些实施方案中，该抗SIRPA抗体与选自下组的毒素缀合：蓖麻毒素(ricin)，蓖麻毒素A链，多柔比星(doxorubicin)，道诺霉素(daunorubicin)，美登木生物碱(maytansinoid)，紫杉醇(taxol)，溴化乙锭(ethidium bromide)，丝裂霉素(mitomycin)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(tenoposide)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，秋水仙碱(colchicine)，二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)，放线菌素(actinomycin)，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思豆毒素(abrin)，相思豆毒素A链，蒴莲根毒素(modeccin)A链，α帚曲霉素(sarcin)，白树毒素(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(retstrictocin)，酚霉素(phenomycin)，伊诺霉素(neomycin)，麻疯树毒素(curicin)，巴豆毒素(crotin)，卡里奇霉素(calicheamicin)，肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂，糖皮质激素，奥利斯他汀(auristatin)，金霉素(auromycin)，钇(yttrium)，铋(bismuth)，卡贝他汀(combrestatin)，倍癌霉素(duocarmycin)，多拉司他汀(dolastatin)，cc1065，和顺铂。
[0212] 核酸，载体，和宿主细胞
[0213] 本公开的抗SIRPA抗体通常使用重组方法产生。相应地，在一些方面中，本发明提供：包含编码如本文所述的任何抗SIRPA抗体的核酸序列的经分离的核酸；包含此类核酸的载体和引入该核酸的宿主细胞，该载体和宿主细胞用于复制编码抗体的核酸和/或表达该抗体。此类核酸可编码含有该抗SIRPA抗体的VL的氨基酸序列和/或含有该抗SIRPA抗体的VH的氨基酸序列(例如，该抗体的轻和/或重链)。在一些实施方案中，该宿主细胞含有(1)载体，其含有编码VL氨基酸序列的多核苷酸和编码VH氨基酸序列的多核苷酸，或(2)含有编码VL氨基酸序列的多核苷酸的第一载体，和含有编码VH氨基酸序列的多核苷酸的第二载体。在一些实施方案中，该宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；或人细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。本公开的宿主细胞还包括，不限于，经分离的细胞，体外培养的细胞，和离体培养的细胞。
[0214] 在又一方面中，本发明提供制造如本文所述的抗SIRPA抗体的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达该抗体的条件下培养如前述段落中所述的宿主细胞。在一些实施方案中，随后将该抗体从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收。
[0215] 含有编码本公开的抗体或其片段的多核苷酸的适合的载体包括克隆载体和表达载体。虽然选择的克隆载体可根据预期使用的宿主细胞变化，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单个靶标，和/或可携带用于选择含有载体的克隆的标记物的基因。实例包括质粒和细菌病毒，例如，pUC18，pUC19，Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物，mpl8，mpl9，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌体DNA，和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商(诸如BioRad，Strategene，和Invitrogen)获得。
[0216] 表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其含有本公开的核酸。该表达载体可作为附加体或染色体DNA的整合部分在宿主细胞中复制。适合的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒，腺相关的病毒，逆转录病毒，和任何其它载体。
[0217] 用于表达如本文所述的抗SIRPA抗体的适合的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞两种。例如，抗SIRPA抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应器功能时。在表达后，该抗体可从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离，且可进一步纯化。或者，该宿主细胞可以是真核宿主细胞，包括真核微生物(诸如丝状真菌或酵母，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，这导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗体)，脊椎动物，无脊椎动物和植物细胞。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以连同昆虫细胞一起使用。植物细胞培养物也可用作宿主细胞。
[0218] 在一些实施方案中，脊椎动物宿主细胞用于产生本公开的抗SIRPA抗体。例如，哺乳动物细胞系诸如由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾细胞系(如，例如，Graham等,J.Gen Virol 36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(如，例如，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如,例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；且FS4细胞可用于表达抗SIRPA抗体。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。对于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
[0219] 使用抗SIRPA抗体的药物组合物和治疗
[0220] 药物组合物
[0221] 可将抗SIRPA抗体并入多种配制剂中用于通过该抗体与合适的药物可接受的载剂或稀释剂组合的治疗施用，且可配制成固定、半固体、液体或气体形式的制剂。此类配制剂的实例包括，不限于，片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，注射剂，吸入剂，凝胶剂，微球和气雾剂。取决于期望的配制剂，药物组合物可包括药物可接受的，非毒性稀释剂，其是通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择该稀释剂以便不影响组合的生物学活性。此类稀释剂的实例包括，不限于，蒸馏水，缓冲水，生理盐水，PBS，林格氏溶液，右旋糖溶液，和Hank氏溶液。本公开的配制剂或药物组合物可进一步包括其他载剂，佐剂，或非毒性的，非治疗性的，非免疫原性的稳定剂，赋形剂等。药物组合物还可包括接近生理条件的另外的物质，诸如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂，润湿剂和去垢剂。
[0222] 本公开的药物组合物还可包括多种稳定剂中的任一种，诸如例如抗氧化剂。当药物组合物包括多肽时，该多肽可与多种已知的化合物络合，所述化合物提高该多肽在体外的稳定性，或以其它方式提高其药理性质(例如，增加该多肽的半衰期，降低其毒性，和提高溶解度或摄取)。此类修饰或络合剂的实例包括，不限于，硫酸盐，葡糖酸盐，柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽还可与提高其在体内的属性的分子络合。此类分子包括，不限于，碳水化合物，多胺，氨基酸，其它肽，离子(例如，钠，钾，钙，镁，锰)，和脂质。
[0223] 适用于多种类型的施用的配制剂的又一些实例可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,第22版(2012)。
[0224] 对于口服施用，活性成分可以以固体剂量型式施用，诸如胶囊，片剂，和粉剂，或液体剂型，诸如酏剂，糖浆剂，和混悬剂。一种或多种活性成分可以与非活性成分和粉末状载剂一起包封在明胶胶囊中，诸如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，淀粉，纤维素或纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸，糖精钠，滑石粉，碳酸镁。可经添加以提供期望的颜色，味道，稳定性，缓冲容量、分散性或其他已知的期望特征的另外的非活性成分的实例是红氧化铁，硅胶，硫酸月桂酯钠，二氧化钛和可食用的白墨水。类似的稀释剂可用于制造压缩片剂。片剂和胶囊剂二者可制成缓释产物，以提供在数小时内连续释放药物。压缩片剂可以是糖包衣的或薄膜包衣的，以掩盖任何令人不愉快的味道并保护片剂免受空气影响，或是肠溶包衣的，以在胃肠道中选择性崩解。用于口服施用的液体剂量型式可含有着色剂和调味剂以增加患者接受度。
[0225] 适用于非肠道施用的配制剂包括使配制剂与预期接受者的血液等渗的水性和非水性，等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质，且水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂，和防腐剂。
[0226] 用于配制药物组合物的组分优选具有高纯度且基本上无潜在的有害污染物(例如，至少国家食品(NF)级别，通常为至少分析级别，且更典型为至少药物级别)。而且，意图用于体内使用的组合物通常是无菌的。就给定化合物必须在使用前合成的方面而言，所得产物典型地基本上无任何可能在合成或纯化过程中存在的潜在毒性剂，特别是任何内毒素。用于非肠道施用的组合物也是无菌的，基本上等渗且是在GMP条件下制造的。
[0227] 可以为了在脑或中枢神经系统中保留和稳定而优化配制剂。当将药剂施用到颅腔室中时，期望药剂保留在腔室中，而不是扩散或以其他方式穿过血脑屏障。稳定技术包括交联，多聚化或连接至基团诸如聚乙二醇，聚丙烯酰胺，中性蛋白质载体等，以便实现分子量的增加。
[0228] 用于增加保留的其他策略包括将抗体(例如本公开的抗SIRPA抗体)包埋在可生物降解或生物可侵蚀的植入物中。治疗性活性剂的释放速率可通过通过聚合物基质的转运速率和植入物的生物降解来控制。药物通过聚合物屏障的运输也将受到化合物溶解度，聚合物亲水性，聚合物交联程度，聚合物在吸水时膨胀以使聚合物屏障对药物更具渗透性，植入物的几何形状等影响。植入物的尺寸与选择作为植入位点的区域的大小和形状相当。植入物可以是颗粒，片，贴片，斑块，纤维，微胶囊等，且可具有与所选择的插入位点相容的任何大小或形状。
[0229] 植入物可具有通过聚合物基质分布的活性剂，或包封的活性剂，其中活性剂储库由聚合物基质包封。所采用的聚合物组合物的选择随着施用位点，期望的治疗时间，患者耐受性，待治疗疾病的性质等变化。聚合物的特征将会包括植入位点的生物可降解性，感兴趣的药剂的相容性，包封的容易性，生理环境中的半衰期。
[0230] 可采用的可生物降解的聚合物组合物可以是有机酯或醚，其在降解时产生生理学上可接受的降解产物，包括单体。可以使用酸酐，酰胺，原酸酯等，可独立地或与其它单体组合使用。聚合物是缩合聚合物。聚合物可以是交联的或非交联的。特别感兴趣的是羟基脂族羧酸(均聚物或共聚物)和多糖的聚合物。感兴趣的聚酯包括D-乳酸，L-乳酸，外消旋乳酸，乙醇酸，聚己酸内酯及其组合的聚合物。通过采用L-乳酸盐或D-乳酸盐，实现了缓慢生物降解的聚合物，而用外消旋物充分提高了降解。乙醇酸和乳酸的共聚物是特别令人感兴趣的，其中生物降解速率由乙醇酸与乳酸的比例控制。最快速降解的共聚物具有大致相等量的乙醇酸和乳酸，其中均聚物更耐降解。乙醇酸与乳酸的比例也将会影响植入物的脆性，其中对于更大的几何形状，期望更柔韧的植入物。感兴趣的多糖是藻酸钙和官能化纤维素，特别是羧甲基纤维素酯，其特征在于不溶于水，分子量为约5kD至500kD等。可生物降解的水凝胶也可用于本发明的植入物中。水凝胶典型是共聚物材料，其特征在于能够吸收液体。可采用的示例性可生物降解的水凝胶描述于：Heller in:Hydrogels in Medicine and Pharmacy,N.A.Peppes ed.,Vol.III,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1987,pp 137-149。
[0231] 含有本公开的抗SIRPA抗体的本公开的药物组合物可向有治疗需要的个体(优选是人)施用抗SIRPA抗体，该施用依据已知方法，诸如静脉内施用如推注或通过一段时间内的连续输注，通过肌肉内，腹膜内，脑脊液内(intracerobrospinal)，颅内，脊柱内，皮下，关节内，滑膜内，囊内，口服，局部，或吸入途径。
[0232] 本公开的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可变化，其取决于预期的特定用途。确定合适的剂量或施用途径完全在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人治疗的有效剂量提供了可靠的指导。有效剂量的种间缩放可遵循下列中描述的原理进行：Mordenti,J.和Chappell,W“. The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46。
[0233] 对于体内施用本公开的任何抗SIRPA抗体，正常剂量的量可从每天约10ng/kg直至约100mg/kg的个体的体重或更多，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天变化，其取决于施用途径。对于在数天或更长时间内的重复施用，其取决于待治疗的疾病，病症或病况的严重程度，治疗是持续的直至实现期望的症状抑制。
[0234] 示例性给药方案可包括施用初始剂量为约2mg/kg的抗SIRPA抗体，随后每隔一周施用约1mg/kg的每周维持剂量。其它剂量方案可以是有用的，取决于医师希望实现的药代动力学衰变的样式。例如，本文考虑每周给药个体一次至二十一次。在某些实施方案中，可使用约3μg/kg至约2mg/kg(诸如约3μg/kg，约10μg/kg，约30μg/kg，约100μg/kg，约300μg/kg，约1mg/kg，和约2/mg/kg)的给药范围。在某些实施方案中，给药频率为每天三次，每天两次，每天一次，每隔一天一次，每周一次，每两周一次，每四周一次，每五周一次，每六周一次，每七周一次，每八周一次，每九周一次，每十周一次，或每月一次，每两个月一次，每三个月一次或更长时间。通过常规技术和测定法可以容易地监测治疗进展。给药方案，包括施用的抗SIRPA抗体，可随着时间变化，与所用剂量无关。
[0235] 特定抗SIRPA抗体的剂量可以在已经给予一次或多次抗SIRPA抗体施用的个体中凭经验确定。给予个体递增剂量的抗SIRPA抗体。为了评定抗SIRPA抗体的效果，可监测本公开的疾病，病症，或病况(例如，癌症)的临床症状。
[0236] 本公开的抗SIRPA抗体的施用可以是连续的或间歇的，取决于，例如，接受者的生理情况，施用的目的是治疗性的或预防性的，或实践人员已知的其它因素。抗SIRPA抗体的施用可以在预选的时间段内实质上连续，或者可以是一系列间隔的剂量。
[0237] 在本公开的范围内，不同的配制剂对于不同的治疗和不同的病症是有效的，且旨在治疗特定器官或组织的施用可能需要以不同于另一种器官或组织的方式递送。而且，剂量可通过一次或多次分开的施用，或通过连续输注来施用。对于在数天或更长时间内的重复施用，取决于病况，治疗可以是持续直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定法可以容易地监测此疗法的进展。
[0238] 在本发明的一个方面中，下调SIRPA的药剂(例如，抗SIRPA抗体)用作治疗剂。此类药剂经施用用于在受试者中治疗，减轻，和/或预防与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的疾病或病状。治疗方案通过使用标准方法鉴定受试者(例如，罹患与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的疾病或病症(例如，癌症或其它瘤性病症)(或处于发展与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的疾病或病症的风险)的人患者)来进行。在一些实施方案中，具有与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的病状的细胞表达SIRPA配体，例如，CD47。在一些实施方案中，具有与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的病状的细胞表达SIRPA。
[0239] 如下面进一步详述的下调SIRPA的药剂，例如，抗SIRPA抗体可与用于治疗与SIRPA表达，活性和/或信号传导相关联的疾病或病状的另外的治疗剂组合使用。术语“组合(in combination)”和“联合(in conjunction)”在本公开中互换地使用。该另外的治疗剂可在下调SIRPA的药剂(例如，抗SIRPA抗体)之前，之后，或与下调SIRPA的药剂同时施用。
[0240] 在本公开的一个方面中，将抗SIRPA抗体制剂(例如，其包含降低SIRPA在细胞表面上的表达，但不实质上阻断配体(例如CD47)与SIRPA的结合的抗SIRPA抗体)施用至人受试者。施用该抗体可消除或抑制或干扰由配体结合(例如CD47结合)介导的SIRPA的表达，活性和/或信号传导功能。在一个实施方案中，与SIRPA表达相关联的疾病或病症为癌症。在一些实施方案中，将抗SIRPA抗体施用至具有表达SIRPA的癌症(诸如髓样细胞的血液增殖性病症)的患者。在典型的实施方案中，将抗SIRPA抗体施用至具有表达CD47的癌症的患者。
[0241] 在某些实施方案中，该癌症是鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)，非鳞状NSCLC，胶质瘤，胃肠癌，肾癌(例如透明细胞癌)，卵巢癌，肝癌，结直肠癌，子宫内膜癌，肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))，前列腺癌(例如激素不应性前列腺腺癌)，甲状腺癌，神经母细胞瘤，胰腺癌，成胶质细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤)，宫颈癌，胃癌，膀胱癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，和头颈癌(或癌瘤)，胃的癌，生殖细胞肿瘤，小儿肉瘤，鼻窦自然杀伤，黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，诸如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)，骨癌，皮肤癌，子宫癌，肛门癌，睾丸癌，输卵管的癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西氏肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症(其包括由石棉诱发的癌症)，病毒相关癌症(例如，人乳头瘤病毒(HPV)相关的肿瘤)，和衍生自两种主要血细胞谱系之任一的血液恶性肿瘤，即髓样细胞系(其产生粒细胞，红细胞，血小板，巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生B，T，NK和浆细胞)，诸如白血病，淋巴瘤，和骨髓瘤的所有类型，例如，急性，慢性，淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，诸如急性白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，和慢性骨髓性白血病(CML)，未分化的AML(M0)，成髓细胞白血病(M1)，成髓细胞白血病(M2；在细胞成熟的情况下)，前髓细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])，髓单核细胞性白血病(具有嗜酸性粒细胞增多症的M4或M4变体[M4E])，单核细胞性白血病(M5)，红细胞白血病(M6)，巨核细胞性白血病(M7)，孤立性粒细胞肉瘤，和绿色瘤；淋巴瘤，诸如霍奇金氏淋巴瘤(HL)，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，B细胞血液恶性肿瘤，例如，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞样淋巴瘤，单核细胞样B细胞淋巴瘤，粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤，间变性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤，成人T细胞淋巴瘤/白血病，套细胞淋巴瘤，血管成免疫细胞T细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠T细胞淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，前体T成淋巴细胞淋巴瘤，T成淋巴细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)，外周T细胞淋巴瘤，成淋巴细胞淋巴瘤，移植后淋巴组织增生性病症，真性组织细胞性淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，原发性积液淋巴瘤，成淋巴细胞淋巴瘤(LBL)，淋巴样谱系的造血肿瘤，急性成淋巴细胞白血病，弥漫大B细胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)，成免疫细胞大细胞淋巴瘤，前体B成淋巴细胞淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样真菌病或赛扎里综合征)，和具有瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，诸如IgG骨髓瘤，轻链骨髓瘤，非分泌性骨髓瘤，郁积性骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)，孤立性浆细胞瘤，和多发性骨髓瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，间充质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤，畸胎癌，中枢和周围神经肿瘤，包括星形细胞瘤，施旺细胞瘤；间充质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤，着色性干皮症，角化棘皮瘤，精原细胞瘤，甲状腺滤泡癌和畸胎癌，淋巴样谱系的造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症，诸如T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑回状细胞；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)优选为T细胞型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和成免疫细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈的癌症，肾癌，直肠癌，甲状腺的癌症；急性髓样淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本发明的抗SIRPA抗体还可用于治疗转移性癌症。
[0242] 在一些实施方案中，该癌症选自下组：肉瘤，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾盂癌，白血病，肺癌，黑色素瘤，淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌，和纤维肉瘤。
[0243] 在一些实施方案中，该癌症选自下组：多形性成胶质细胞瘤；肾透明细胞癌；肾上腺皮质癌；膀胱尿路上皮癌；弥漫性大B细胞淋巴瘤；肺腺癌；胰腺腺癌，肾细胞癌，非霍奇金氏淋巴瘤，急性成淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性髓样白血病(CML)，多发性骨髓瘤，乳腺浸润癌，宫颈鳞状细胞癌，宫颈内腺癌，胆管癌，结肠腺癌，弥漫大B细胞淋巴瘤，食管癌，头颈部鳞状细胞癌，肾嫌色细胞癌，肾乳头状细胞癌，低级胶质瘤，肝细胞癌，肺鳞状细胞癌，间皮瘤，卵巢浆液性囊腺癌，胰腺腺癌，嗜铬细胞瘤和副神经节细胞瘤，前列腺腺癌，直肠腺癌，皮肤黑色素瘤，胃腺癌，睾丸生殖细胞肿瘤，甲状腺癌，胸腺瘤，子宫体内膜癌，子宫癌肉瘤，和葡萄膜黑色素瘤。
[0244] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体可联合起检查点抑制剂作用的治疗剂一起施用。在一些实施方案中，该检查点抑制剂靶向PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，和CD73。在典型的实施方案中，该治疗剂是针对检查点抑制剂的抗体，该检查点抑制剂选自PD1，PDL1，CD40，OX40，ICOS，CD28，CD137/4-1BB，CD27，GITR，CTLA4，PD-L2，B7-H3，B7-H4，HVEM，LIGHT，BTLA，CD30，TIGIT，VISTA，KIR，GAL9，TIM1，TIM3，TIM4，A2AR，LAG3，DR-5，CD2，CD5，CD39，或CD73。在一些实施方案中，针对检查点抑制剂的抗体的组合与本发明的抗SIRPA抗体联合施用。
[0245] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体可与至少一种激动性抗体联合施用，该激动性抗体特异性结合刺激性检查点蛋白，例如，激动性抗CD40抗体，激动性抗OX40抗体，激动性抗ICOS抗体，激动性抗CD28抗体，激动性抗TREM1抗体，激动性抗TREM2抗体，激动性抗CD137/4-1BB抗体，激动性抗CD27抗体，激动性抗糖皮质激素诱导的TNFR-相关的蛋白GITR抗体，激动性抗CD30抗体，激动性抗BTLA抗体，激动性抗HVEM抗体，激动性抗CD2抗体，激动性抗CD5抗体，和其任何组合。
[0246] 在一些实施方案中，本发明的抗SIRPA抗体与放射疗法和/或化学治疗剂组合施用。化学治疗剂包括例如下面的组：抗代谢物/抗癌剂，诸如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶，氟尿苷，卡培他滨(capecitabine)，吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷(cytarabine))和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂(甲氨蝶呤，培美曲塞(pemetrexed)，巯嘌呤，硫鸟嘌呤，喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括天然产物诸如长春花生物碱(长春碱，长春新碱，和长春瑞滨(vinorelbine))，微管破坏剂诸如紫杉烷(taxane)(帕利他赛(paclitaxel)，多西他赛(docetaxel))，长春新碱，长春碱，诺考达唑(nocodazole)，埃博霉素(epothilones)，艾瑞布林(eribulin)和长春瑞滨(navelbine)；表鬼臼毒素(依托泊苷，替尼泊苷)；DNA损伤剂(放线菌素，安吖啶(amsacrine)，蒽环类抗生素，博来霉素(bleomycin)，白消安(busulfan)，喜树碱(camptothecin)，卡铂，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，顺铂，环磷酰胺，环磷酰胺(Cytoxan)，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，六甲基蜜胺奥沙利铂(hexamethylmelamineoxaliplatin)，异环磷酰胺(iphosphamide)，美法仑(melphalan)，双氯乙基甲胺(merchlorehtamine)，丝裂霉素(mitomycin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，亚硝基脲，光辉霉素(plicamycin)，甲基苄肼(procarbazine)，泰素(taxol)，泰索帝(taxotere)，替莫唑胺(temozolamide)，替尼泊苷，三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16))；DNA甲基转移酶抑制剂(氮杂胞苷)；抗生素诸如更生霉素(放线菌素D)，柔红霉素，多柔比星(阿霉素(adriamycin))，伊达比星(idarubicin)，蒽环类抗生素，米托蒽醌(mitoxantrone)，博来霉素，普卡霉素(普卡霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(L-门冬酰胺酶，其系统地代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖性/抗有丝分裂烷化剂诸如氮芥(双氯乙基甲胺，环磷酰胺和类似物，美法仑，苯丁酸氮芥)，乙撑亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基蜜胺奥沙利铂和塞替派(thiotepa))，烷基磺酸盐(白消安)，亚硝(基)脲(卡莫司汀
(carmustine)(BCNU)和类似物，链唑霉素(streptozocin)，三氮烯(triazene)(达卡巴嗪(DTIC))；抗增殖性/抗有丝分裂抗代谢物诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(顺铂，卡铂)，丙卡巴肼(procarbazine)，羟基脲，米托坦，氨鲁米特；激素，激素类似物(雌激素，他莫昔芬(tamoxifen)，戈舍瑞林(goserelin)，比卡鲁胺(bicalutamide)，尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)，阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素，合成性肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；溶纤维蛋白剂(诸如组织纤溶酶原激活物，链激酶和尿激酶)，阿司匹林，双嘧达莫(dipyridamole)，噻氯匹定(ticlopidine)，氯吡格雷(clopidogrel)，阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制(环孢霉素(cyclosporine)，他克莫司(tacrolimus)(FK-506)，西罗莫司
(sirolimus)(雷怕霉素(rapamycin))，硫唑嘌呤，麦考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470，金雀异黄素(genistein)，泊马度胺
(pomalidomide))和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，诸如阿柏西普(ziv-aflibercept)；成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；凋亡蛋白的抑制剂(IAP)拮抗物(birinapant)；组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(伏立诺他(vorinostat)，罗米地辛(romidepsin)，西达本胺(chidamide)，帕比司他(panobinostat)，mocetinostat，abexinostat，贝利司他(belinostat)，entinostat，resminostat，givinostat，quisinostat，SB939)；蛋白酶体抑制剂(ixazomib)；增血压素受体阻断剂；一氧化氮供体；
反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗，帕尼单抗(panitumumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，阿达木单抗(adalimumab)，戈利木单抗(golimumab)，英夫利昔单抗(infliximab)，利妥昔单抗，ocrelizumab，奥法木单抗(ofatumumab)，阿托珠单抗(obinutuzumab)，阿仑单抗(alemtuzumab)，阿昔单抗(abciximab)，atlizumab，达珠单抗(daclizumab)，狄迪诺塞麦(denosumab)，依法利珠单抗(efalizumab)，埃洛妥珠单抗(elotuzumab)，罗维珠单抗(rovelizumab)，鲁利单抗(ruplizumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab
ozogamicin)，brentuximb vedotin)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂(flavopiridol，roscovitine，bryostatin-1)和分化诱导剂(tretinoin)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)，安吖啶，喜树碱，柔红霉素，更生霉素，eniposide，表柔比星，依托泊苷，伊达比星，伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌，托泊替康，伊立替康)，皮质类固醇(可的松，地塞米松，氢化可的松，甲基强的松龙(methylpednisolone)，泼尼松(prednisone)，和泼尼松龙(prenisolone))；PARP抑制剂(尼拉帕利niraparib，奥拉帕尼(olaparib))；粘着斑激酶(FAK)抑制剂(defactinib(VS-6063)，VS-4718，VS-6062，GSK2256098)；生长因子信号转导激酶抑制剂(西地尼布(cediranib)，galunisertib，rociletinib，凡德他尼
(vandetanib，阿法替尼(afatinib)，EGF816，AZD4547)；c-Met抑制剂(苯扎米特(capmatinib)，INC280)；ALK抑制剂(色瑞替尼(ceritinib)，克唑替尼(crizotinib))；线粒体功能障碍诱导剂，毒素诸如霍乱毒素，蓖麻毒素，假单胞菌外毒素，百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素，或白喉毒素，和半胱天冬酶激活剂；和染色质干扰剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是B-Raf抑制剂，MEK抑制剂，VEGF抑制剂，VEGFR抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，抗有丝分裂剂，或其任何组合。
(carmustine)(BCNU)和类似物，链唑霉素(streptozocin)，三氮烯(triazene)(达卡巴嗪(DTIC))；抗增殖性/抗有丝分裂抗代谢物诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(顺铂，卡铂)，丙卡巴肼(procarbazine)，羟基脲，米托坦，氨鲁米特；激素，激素类似物(雌激素，他莫昔芬(tamoxifen)，戈舍瑞林(goserelin)，比卡鲁胺(bicalutamide)，尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)，阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素，合成性肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；溶纤维蛋白剂(诸如组织纤溶酶原激活物，链激酶和尿激酶)，阿司匹林，双嘧达莫(dipyridamole)，噻氯匹定(ticlopidine)，氯吡格雷(clopidogrel)，阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制(环孢霉素(cyclosporine)，他克莫司(tacrolimus)(FK-506)，西罗莫司
(sirolimus)(雷怕霉素(rapamycin))，硫唑嘌呤，麦考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470，金雀异黄素(genistein)，泊马度胺
(pomalidomide))和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，诸如阿柏西普(ziv-aflibercept)；成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；凋亡蛋白的抑制剂(IAP)拮抗物(birinapant)；组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(伏立诺他(vorinostat)，罗米地辛(romidepsin)，西达本胺(chidamide)，帕比司他(panobinostat)，mocetinostat，abexinostat，贝利司他(belinostat)，entinostat，resminostat，givinostat，quisinostat，SB939)；蛋白酶体抑制剂(ixazomib)；增血压素受体阻断剂；一氧化氮供体；
反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗，帕尼单抗(panitumumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，阿达木单抗(adalimumab)，戈利木单抗(golimumab)，英夫利昔单抗(infliximab)，利妥昔单抗，ocrelizumab，奥法木单抗(ofatumumab)，阿托珠单抗(obinutuzumab)，阿仑单抗(alemtuzumab)，阿昔单抗(abciximab)，atlizumab，达珠单抗(daclizumab)，狄迪诺塞麦(denosumab)，依法利珠单抗(efalizumab)，埃洛妥珠单抗(elotuzumab)，罗维珠单抗(rovelizumab)，鲁利单抗(ruplizumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab
ozogamicin)，brentuximb vedotin)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂(flavopiridol，roscovitine，bryostatin-1)和分化诱导剂(tretinoin)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)，安吖啶，喜树碱，柔红霉素，更生霉素，eniposide，表柔比星，依托泊苷，伊达比星，伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌，托泊替康，伊立替康)，皮质类固醇(可的松，地塞米松，氢化可的松，甲基强的松龙(methylpednisolone)，泼尼松(prednisone)，和泼尼松龙(prenisolone))；PARP抑制剂(尼拉帕利niraparib，奥拉帕尼(olaparib))；粘着斑激酶(FAK)抑制剂(defactinib(VS-6063)，VS-4718，VS-6062，GSK2256098)；生长因子信号转导激酶抑制剂(西地尼布(cediranib)，galunisertib，rociletinib，凡德他尼
(vandetanib，阿法替尼(afatinib)，EGF816，AZD4547)；c-Met抑制剂(苯扎米特(capmatinib)，INC280)；ALK抑制剂(色瑞替尼(ceritinib)，克唑替尼(crizotinib))；线粒体功能障碍诱导剂，毒素诸如霍乱毒素，蓖麻毒素，假单胞菌外毒素，百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素，或白喉毒素，和半胱天冬酶激活剂；和染色质干扰剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是B-Raf抑制剂，MEK抑制剂，VEGF抑制剂，VEGFR抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，抗有丝分裂剂，或其任何组合。
[0247] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体与过继细胞转移(ACT)疗法，嵌合抗原受体T细胞转移(CAR-T)疗法，疫苗疗法，和/或细胞因子疗法组合施用。
[0248] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体与至少一种特异性结合抑制性细胞因子(例如，抑制性细胞因子)的抗体(诸如抗CCL2抗体，抗CSF-1抗体，或抗IL-2抗体)组合施用。
[0249] 在一些实施方案中，本公开的抗SIRPA抗体与至少一种刺激性细胞因子组合施用。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，该至少一种刺激性细胞因子选自下组：
IFN-α4，IFN-β，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-8，CRP，IL-20家族成员，LIF，IFN-γ，OSM，CNTF，GM-CSF，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，CXCL10，IL-33，MCP-1，MIP-1-β，和其任何组合。
IFN-α4，IFN-β，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-8，CRP，IL-20家族成员，LIF，IFN-γ，OSM，CNTF，GM-CSF，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，CXCL10，IL-33，MCP-1，MIP-1-β，和其任何组合。
[0250] 在一些实施方案中，施用下调SIRPA的药剂(例如抗SIRPA抗体)至具有神经学病症的患者，或施用下调SIRPA的药剂(例如抗SIRPA抗体)以降低神经学病症风险，减慢神经学病症发病，或预防神经学病症。在一些实施方案中，该神经学病症是痴呆，包括额颞叶痴呆，阿尔茨海默氏病，或血管性痴呆。在一些实施方案中，该患者具有轻度认知功能障碍。
[0251] 在一些实施方案中，施用下调SIRPA的药剂(例如抗SIRPA抗体)至具有帕金森氏病，肌萎缩侧索硬化症，亨廷顿氏病，Tau病疾病，或多发性硬化症的患者。在一些实施方案中，施用该药剂至具有以下疾病的患者：克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)，正常压力性脑积水，Nasu-Hakola病，中风，感染，创伤性脑损伤，进行性核上性麻痹，拳击员痴呆(慢性创伤性脑病)，与17号染色体相关的帕金森病，Lytico-Bodig病(关岛型帕金森-痴呆综合症)，纠结主导型痴呆，神经节细胞胶质瘤和神经节细胞瘤，脑膜血管瘤，亚急性硬化性全脑炎，铅性脑病，结节性硬化症，哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)，脂褐质沉积症(lipofuscinosis)，匹克氏病(Pick’s disease)，皮质基底节变性，嗜银颗粒病(AGD)，额颞叶变性，路易体痴呆，多系统萎缩，Shy-Drager综合征，进行性核上性麻痹，或皮质基底神经节变性。实施例
[0253] 实施例1：抗SIRPA抗体的产生
[0254] 人SIRPA前蛋白的氨基酸序列如下列SEQ ID NO:1所示。人SIRPA含有位于SEQ ID NO:1的氨基残基1-30的信号肽。人SIRPA含有位于SEQ ID NO:1的氨基残基32-137的细胞外免疫球蛋白样可变型(IgV)域；位于SEQ ID NO:1的氨基残基148-247和254-348的另外的细胞外免疫球蛋白样恒定型(IgC)域序列；位于SEQ ID NO:1的氨基残基374-394的跨膜域；和位于SEQ ID NO:1的氨基残基395-504的细胞内域。
[0255] SIRPAv1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
[0256]
[0257]
[0258] SIRPA-CD47复合物的晶体结构分析将配体结合位点解析为连接SIRPA的IgV域中的β-折叠链的可变环。结合CD47的界面包含氨基酸残基S59-P65，L96-F104，和K123-D130。
[0259] 已经在人类中鉴定出SIRPA的多种多态性。两个最常见变体的氨基酸序列(称为SIRPA v1和v2)的比对通过双向blast(图1A)生成。由于序列中最多的变化位于配体结合位点之外，因此据报道两种SIRPA变体以相似亲和力结合CD47。可替换地，SIRP家族的另一成员，SIRPB1，与SIRPA共享高序列同源性但不能结合CD47。SIRPAv1和SIRPB1的氨基酸序列的比对通过双向blast生成(图1B)，且显示出两种蛋白的细胞外域(不包括前导序列)共享～90％同一性。然而，单一A57M替代足以使S59-P65配体结合界面重排以阻止SIRPB1结合CD47。此外，在人CD47识别仅由NOD小鼠表达的小鼠SIRPA的单一等位基因变体的情况下，CD47结合是高物种特异性的。人SIRPAv1和C57BL6SIRPA的氨基酸序列的比对通过双向blast生成(图2)，且显示出两种蛋白(不包括前导序列)的细胞外域共享～60％同一性。
[0260] 抗SIRPA抗体产生
[0261] 免疫程序
[0262] 快速引发方法：使用下列程序免疫四只50天龄雌性BALB/c小鼠。在19天的时间内给予含有人SIRPA抗原但无佐剂的一系列皮下水性注射剂。将小鼠圈养在来自Lab Products的通风架系统中。在第19天使全部四只小鼠安乐死，并收获淋巴细胞用于杂交瘤细胞系生成。
[0263] 标准方法：使用下列程序免疫四只50天龄雌性BALB/c或NZB/W小鼠。将小鼠圈养在来自Lab Products的通风架系统中。对小鼠以25μg蛋白抗原每只小鼠(总体积125μL每只小鼠)每3周腹膜内注射混合于CpG-ODN佐剂中的人SIRPA抗原。在第二次加强后7天通过隐静脉切口进行测试出血。该测试出血(免疫血清)通过间接ELISA测定法测试，以测定融合的最佳的两只应答小鼠。该小鼠可能需要第3次和第4次加强和加强后7天的另一次测试出血以评定融合前的滴度。当该抗体滴度足够高时，对该最佳的两只应答小鼠经由侧尾静脉给予最终的静脉内加强。在第IV次加强后四天，将小鼠安乐死用于融合。收获脾脏，且将从脾脏中分离的淋巴细胞用于融合过程中以产生杂交瘤。
[0264] 杂交瘤开发
[0265] 分离淋巴细胞且在聚乙二醇(PEG 1500)的存在下依照标准罗氏方案与鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合。使用单步克隆方法(HAT选择)培养融合的细胞。此方法使用基于半固体甲基纤维素的HAT选择性培养基以使杂交瘤选择与克隆组合成一个步骤。单一细胞衍生的杂交瘤在半固体培养基上生长以形成单克隆集落。在融合事件后十天，将948个所得的杂交瘤克隆转移至96孔组织培养板，并在含有HT的培养基中生长直至达到对数生长中期(5天)。
[0266] 杂交瘤筛选
[0267] 来自该948个杂交瘤的组织培养上清液通过间接ELISA利用筛选的抗原(初级筛选)测试，且使用山羊抗IgG/IgM(H&L)-HRP二抗探测IgG和IgM抗体二者，并用TMB底物显色。在此测定中，取>0.2OD的克隆进行下一轮测试。利用筛选的抗原再测试阳性培养物以确认分泌，利用不相关抗原(人转铁蛋白)以消除非特异性或“粘性”单抗并排除假阳性。所有感兴趣的克隆通过抗体捕获ELISA进行同种型分析以确定它们是IgG还是IgM同种型。
[0268] 杂交瘤细胞培养
[0269] 在转移至96孔板后，将感兴趣的杂交瘤细胞系在24孔培养板中维持培养32天。这期间称为稳定期并测试克隆是否保持稳定和分泌。在此稳定期间，临时冷冻的细胞系备份由所有感兴趣的克隆组成，保存在-80℃(可存活6个月)。在此期间，定期地测试杂交瘤的分泌和特异性。
[0270] 亚克隆
[0271] 对顶级杂交瘤细胞系(克隆)亚克隆以确保单克隆性。通过使用单步克隆系统再次铺板亲本克隆来进行亚克隆。将24至90个亚克隆转移至96孔培养板。通过间接ELISA和抗体捕获ELISA筛选亚克隆。采用每个亲本的顶级亚克隆用于培养中的扩增。对任何<50％克隆的亲本克隆进行了第二轮的亚克隆。
[0272] 然后，筛选结合SIRPA的抗体。测试结合人SIRPA阳性的抗体阻断配体结合的能力和抑制在多种细胞类型中配体诱导的SIRPA活性的能力。每种抗体的同种型和仓(bin)类别列于表1中。在表1中，“ND”是指尚未确定仓类别的抗体。
[0273] 表1：抗人SIRPA抗体的同种型和表位仓类别
[0274]AB ID 同种型 仓
3F9 mIgG1 3
9C2 mIgG1 3
8A9 mIgG 3
12D6 mIgG 1
8F4 mIgG 2
1E2 mIgG 2
7H9 mIgG 2
4D8 mIgG 3
3F9 mIgG1 3
9C2 mIgG1 3
8A9 mIgG 3
12D6 mIgG 1
8F4 mIgG 2
1E2 mIgG 2
7H9 mIgG 2
4D8 mIgG 3
[0275] 抗体重链和轻链可变域序列
[0276] 使用标准技术，测定编码生成的抗体的轻链可变和重链可变域的氨基酸序列。抗体的EU或Kabat轻链HVR序列示于表2-5中。抗体的EU或Kabat轻链HVR序列示于表2中。抗体的EU或Kabat重链HVR序列示于表3中。抗体的EU或Kabat轻链框架(FR)序列示于表4中。抗体的EU或Kabat重链框架(FR)序列示于表5中。
[0277] 3F9：重链可变域序列
[0278] EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDYGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKYTLYLQMSSLRSEDTALYYCARPPYDDYYGGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:2)
[0279] 3F9：轻链可变域序列
[0280] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHNRELPCTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)
[0281] 9C2：重链可变域序列
[0282] EFQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYSLTGYNMNWVKQSRGKSLEWIGNINPHYGSSTYNQNFKDKATLTVDKSSSAAYMQFNSLTSEDSAVYYCAREGYDGVFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:4)
[0283] 9C2：轻链可变域序列
[0284] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYVTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:5)
[0285] 8A9：重链可变域序列
[0286] QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSGYGKYDFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:35)
[0287] 8A9：轻链可变域序列
[0288] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHNWEIPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:36)
[0289] 8F4：重链可变域序列
[0290] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASDYTFTDYSMHWVKQAPGKDLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLEASASTAYLQINNLKNEDTATYFCARHGYPHYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:37)
[0291] 8F4：轻链可变域序列
[0292] DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVPTAVAWYQQKPGQSPKALIYLASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCLQHWNYPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:38)
[0293] 1E2：重链可变域序列
[0294] EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPAKRLEWVATISGSGGYTYYPDSMKGRFTISRDNAKDILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDPRYTTLYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:39)
[0295] 1E2：轻链可变域序列
[0296] NIMMTQSPSFLAVSAGEKVTMSCKSSQSIFSGSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQHLSSCTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:40)
[0297] 7H9：重链可变域序列
[0298] DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSISRGYDWHWIRHFPGNILEWMGYITYSGISNYNPSLKSRISITHDTSKNHFFLRLNSVTAEDTATYYCARGGGAWFTYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:41)
[0299] 7H9：轻链可变域序列
[0300] DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDSLHWYHQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSAGGSGSDFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:42)
[0301] 4D8：重链可变域序列
[0302] EVKLEESGGGLVKPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRGKTTNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSFSTEDTGIYYCTRRNWGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:43)
[0303] 4D8：轻链可变域序列
[0304] DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQTIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQTNSWPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:44)
[0305] 表2：抗SIRPA抗体的EU或Kabat轻链HVR序列
[0306]
[0307] 表3：抗SIRPA抗体的EU或Kabat重链HVR序列
[0308]
[0309] 表4：抗SIRPA抗体的EU或Kabat轻链框架序列
[0310]
[0311]
[0312] 表5：抗SIRPA抗体的EU或Kabat重链框架序列
[0313]
[0314] 实施例2：抗SIRPA抗体的表征
[0315] SIRPA抗体的初始表征涉及筛选它们结合在啮齿动物中国仓鼠卵巢细胞系上异位表达的人受体(此后称为CHO-huSIRPA)的能力，然后在原代人巨噬细胞上筛选。收获细胞，5
将细胞以10个细胞/孔铺板于96孔板中，洗涤，并在含有Fc阻断试剂和1.0μg/ml的指示单克隆抗体的100μl FACS缓冲液中温育。然后，将细胞洗涤两次并在冰上在含有以1:200稀释的缀合APC的第二抗体的FACS缓冲液中温育30分钟。将细胞在冰的FACS缓冲液中洗涤两次，并在BD FACS Canto上获得。用FlowJo(TreeStar)软件版本10.0.7进行平均荧光强度(MFI)值或％阳性细胞的数据分析和计算。
将细胞以10个细胞/孔铺板于96孔板中，洗涤，并在含有Fc阻断试剂和1.0μg/ml的指示单克隆抗体的100μl FACS缓冲液中温育。然后，将细胞洗涤两次并在冰上在含有以1:200稀释的缀合APC的第二抗体的FACS缓冲液中温育30分钟。将细胞在冰的FACS缓冲液中洗涤两次，并在BD FACS Canto上获得。用FlowJo(TreeStar)软件版本10.0.7进行平均荧光强度(MFI)值或％阳性细胞的数据分析和计算。
[0316] 如通过经由FACS分析检测的阳性SIRPA抗体染色指示的，几种抗体(例如3F9和9C2)表明与CHO-huSIRPA结合(黑色轮廓直方图)(图3A)。阴性同种型对照(未显示)并不结合细胞。同样地，3F9和9C2不结合高度过表达小鼠SIRPA(CHO-mSIRPA)的CHO细胞(图3A，阴影直方图)，这证实了该抗体对人抗原的特异性。重要的是，3F9和9C2还结合原代人巨噬细胞(图3B)，人巨噬细胞是用于体内功效的主要靶细胞群。由SIRPA抗体结合的细胞系的MFI值绘制于图3A中并列于表6中，且典型地显示背景以上水平的MFI值>100倍。
[0317] 表6：作为背景以上倍数(fold-over-background)列出的结合细胞表面受体的抗huSIRPA抗体的MFI值
[0318]AB ID CHO-HuSIRPα CHO-MuSIRPα
mIgG 1 1
1B3 129.9542 0.985036
3F9 136.6835 0.998266
9C2 127.6125 0.981093
9C5 89.64852 0.98305
12D6 128.3982 0.979942
1H11 149.9567 0.972255
mIgG 1 1
1B3 129.9542 0.985036
3F9 136.6835 0.998266
9C2 127.6125 0.981093
9C5 89.64852 0.98305
12D6 128.3982 0.979942
1H11 149.9567 0.972255
[0319] 用标准表面等离子体共振(SPR)技术获得3F9和9C2的抗原亲和力测量(图3C)。使用Biacore T200(GE)进行结合研究。使用标准NHS/EDC活化将抗小鼠IgG捕获抗体胺偶联至CM5传感器芯片。将SIRPA抗体在1x HBS-EP+运行缓冲液中稀释至50nM并捕获在传感器芯片表面上。将系列稀释的重组可溶的人SIRPA抗原注射到捕获的SIRPA抗体上以记录传感图迹线。通过减去来自参考细胞以及缓冲液注射的RU值来处理数据。结合曲线全局拟合至1：1相互作用模型以产生表7中列出的动力学常数。3F9和9C2结合单体人SIRPA抗原，KD分别为1.0x10-8和8.0x10-8M。
[0320] 表7：抗huSIRPA抗体的联合率，解离率，和平衡结合常数
[0321]AB ID kon koff KD
-1 -1
3F9 5.5e4(Ms) 5.7e-4s 10nM
9C2 5.4e4(Ms)-1 4.5e-3s-1 80nM
-1 -1
3F9 5.5e4(Ms) 5.7e-4s 10nM
9C2 5.4e4(Ms)-1 4.5e-3s-1 80nM
[0322] 还进行基于细胞的亲和力测量以确定3F9和9C2与细胞表面抗原的表观亲和力。将系列稀释的单克隆抗体添加至105个CHO-huSIRPA细胞，并允许获得在4℃的结合平衡。在添加荧光标记的第二抗体和简短的洗涤步骤后，经由FACS分析记录作为滴定抗体浓度的函数的MFI值(图3D)。用Graphpad Prism 6软件使用非线性回归分析拟合曲线。3F9和9C2的基于细胞的滴定实验分别产生2.6nM和1.6nM的EC50值。
[0323] 实施例3：鉴定阻断和非阻断CD47的SIRPA抗体
[0324] 鉴于SIRPA—CD47途径在抑制吞噬细胞效应器功能中的作用，迄今描述的所有拮抗性疗法依赖于竞争性抑制来阻断受体-配体相互作用。类似地，筛选本申请中的SIRPA抗体的阻断CD47与CHO-huSIRPA结合的能力。收获细胞，以105个细胞/孔铺板于96孔板中，洗涤，并在含有1.0μg/ml的指定单克隆抗体或同种型对照的100μl FACS缓冲液中温育。然后，洗涤细胞，并在冰上在含有250nM His标记的，可溶的人CD47的FACS缓冲液中温育30分钟。再次洗涤细胞，并用PE缀合的抗His标签单克隆抗体染色以检测表面结合的CD47。用FlowJo(TreeStar)软件版本10.0.7进行MFI值或％阳性细胞的数据分析和计算。
[0325] 如图4A中所示的，如通过阳性PE染色经由FACS分析指示的，可溶性CD47特异性结合CHO-huSIRPA细胞(黑色轮廓直方图)。在CD47-His缺失下，抗His标签抗体不能结合细胞(阴影直方图)。当CHO-huSIRPA细胞与指示的SIRPA抗体预温育时，几种克隆，例如12D6和1B3，表现出近似完全的阻断可溶性CD47结合(虚线直方图)。然而，3F9和9C2代表不抑制可溶性CD47结合CHO-huSIRPA细胞的两个独特的克隆。由可溶性CD47结合的细胞的MFI值绘制成图4B中的背景以上倍数，且证实3F9和9C2不干扰CD47相互作用。
[0326] 实施例4：SIRPA抗体调节SIRPA依赖性基因表达
[0327] 除了配体阻断，还使用在NFAT(活化的T-细胞的核因子)启动子的控制下的萤光素酶报告基因来筛选SIRPA抗体的抑制CD47诱导的基因表达的能力。细胞系BW5147.G.1.4(TIB48TM)，衍生自小鼠胸腺淋巴瘤T淋巴细胞，用Cignal Lenti NFAT-萤光素酶病毒(Qiagen)和表达人SIRPA-DAP12嵌合体的慢病毒感染，在该人SIRPA-DAP12嵌合体中SIRPA的细胞内ITIM基序由DAP12的细胞内ITIM基序替代。将可溶的人CD47蛋白在PBS中连续稀释并吸附在组织培养板上。洗涤后，将105个表达huSIRPA/DAP12嵌合体(BWZ-huSIRPA)的NFAT-萤光素酶报告细胞接种到平板上并在37℃过夜温育。通过向每个孔添加OneGlo试剂(Promega)并在室温在平板摇动器上温育样品3分钟来测量萤光素酶活性。使用BioTek SynergyTM酶标仪使用GEN5TM2.04软件来定量发光信号。
[0328] 如图5A中所示的，平板结合的人CD47以剂量依赖性方式在表达嵌合的人SIRPA/DAP12的报告细胞中诱导萤光素酶活性。重要的是，亲本BWZ报告细胞，其缺少SIRPA/DAP12表达，不激发应答CD47的发光信号，这证实了该嵌合受体模拟通过配体结合开始的信号传导事件。接下来，评定抗SIRPA抗体在BWZ-huSIRPA报告细胞中阻断CD47依赖性萤光素酶活性的能力。如上文所述的，将可溶的人CD47蛋白在PBS中稀释并吸附在96孔组织培养板上。洗涤后，105个BWZ-huSIRPA报告细胞与同种型对照抗体或指示抗SIRPA抗体一起接种在平板上并在37℃过夜温育。图5B表明了，依照先前描述的CD47结合测定，阻断CD47结合CHO-huSIRPA细胞的抗SIRPA抗体，诸如12D6和5F7，还在报告细胞中抑制CD47依赖性萤光素酶活性。同样地，不阻断CD47结合CHO-huSIRPA细胞的抗SIRPA抗体(诸如9C2和3F9)在BWZ-huSIRPA细胞中也不抑制CD47依赖性萤光素酶活性。此外，抗SIRPA抗体不诱导溶液中的信号传导，因为与可溶性SIRPA抗体一起温育的报告细胞在平板结合的CD47的缺少下不激发发光信号。
[0329] 实施例5：SIRPA特异性抗体的鉴定
[0330] SIRPA抗体的初始表征鉴定了一类能够结合原代人髓样细胞的阻断和非阻断CD47的抗体。然而，鉴于SIRPα和SIRPβ1(～90％同一性)之间的高序列同源性，SIRPA特异性结合仍然是理想的抗SIRPA先导抗体的关键特征。为了筛选SIRPA抗体对SIRPβ1的交叉反应性，用表达人SIRPβ1的慢病毒转导BWZ-NFAT/萤光素酶报告细胞。不同于SIRPα，SIRPβ1需要共表达DAP12衔接子用于全细胞表面定位。因此，还用分开表达人DAP12的慢病毒转导BWZ-huSIRPβ1细胞。为了测试萤光素酶活性，将选择的SIRPA抗体或同种型对照在10μg/mL的PBS中稀释并吸附在组织培养板上。洗涤后，将105个表达huSIRPA/DAP12嵌合体(BWZ-huSIRPA)或huSIRPβ1+DAP12(BWZ-huSIRPβ1)的NFAT-萤光素酶报告细胞接种在平板上并在37℃温育过夜。通过向每个孔中添加OneGlo试剂(Promega)并在室温在平板摇动器上温育样品3分钟来测量萤光素酶活性。使用BioTek SynergyTM酶标仪使用GEN5TM 2.04软件来定量发光信号。
[0331] 如图6A中所示的，平板结合的SIRPA抗体以与先前观察到的平板结合的CD47的相似程度在表达嵌合的人SIRPA/DAP12的报告细胞中诱导萤光素酶活性。然而，大部分SIRPA抗体还在BWZ-huSIRPβ1报告细胞中诱导萤光素酶活性，这指示这些抗体与SIRPα和SIRPβ1二者交叉反应。有趣的是，两种抗体克隆，3F9和9C2，特异性活化BWZ-huSIRPA细胞但不活化BWZ-huSIRPβ1，这暗示这2种克隆代表独特的SIRPA特异性抗体。为了证实此观察，用Biacore T200(GE)进行了基于SPR的结合研究。使用标准NHS/EDC活性将抗小鼠IgG捕获抗体胺偶联至CM5传感器芯片。将SIRPA抗体(3F9或9C2)在1x HBS-EP+运行缓冲液中稀释至50nM并捕获在传感器芯片表面上。将等摩尔浓度的重组可溶的人SIRPA抗原或人SIRPB1抗原注射到捕获的SIRPA抗体上以记录传感图迹线。通过减去来自参考细胞以及缓冲液注射中的RU值来处理数据。图6B中的传感图清楚地显示在捕获的抗体3F9和9C2上注射SIRPA抗原后响应单位的增加。相反地，在捕获的抗体上流动的SIRPB1抗原几乎不记录背景以上的结合反应。因此，来自图6A和6B的结果鉴定了克隆3F9和9C2为SIRPA特异性抗体。
[0332] 实施例6：SIRPA特异性抗体在人巨噬细胞中降低SIRPα的细胞表面表达
[0333] 经常观察到，靶向某些在免疫细胞的表面上表达的ITIM/ITAM受体的抗体可降低在单核细胞，巨噬细胞，树突细胞，嗜中性细胞，和/或小胶质细胞上的所述受体的表面水平。
[0334] 在原代人巨噬细胞(huMac)上评估抗SIRPA抗体降低SIRPα的细胞表面表达的能5
力。人单核细胞从健康供体的外周血液中分离并在体外分化成巨噬细胞。分化后，收获10个huMac，并将其与1-5μg/ml的同种型对照或可溶的抗SIRPA抗体一起接种至96孔组织培养板上。在4小时处理或过夜温育后，通过流式细胞术分析细胞的SIRPα表面表达。使用DyLight650缀合的抗人SIRPA抗体检测SIRPα表达，所述抗人SIRPA抗体属于与9C2和3F9不同的表位仓。
力。人单核细胞从健康供体的外周血液中分离并在体外分化成巨噬细胞。分化后，收获10个huMac，并将其与1-5μg/ml的同种型对照或可溶的抗SIRPA抗体一起接种至96孔组织培养板上。在4小时处理或过夜温育后，通过流式细胞术分析细胞的SIRPα表面表达。使用DyLight650缀合的抗人SIRPA抗体检测SIRPα表达，所述抗人SIRPA抗体属于与9C2和3F9不同的表位仓。
[0335] 如图7A中所示的，相对于同种型对照处理的巨噬细胞，SIRPA特异性抗体，3F9和9C2，使SIRPα表达显著降低～90％。FACS分析显示受体下调发生在抗体添加后的数小时内，且通过过夜处理维持。这与阻断CD47的抗体相反，例如1B3或3D2，其仅使受体表达降低50％或更少。由于抗体克隆3F9和9C2还是非阻断CD47的抗体，所以针对受体下调筛选其它非阻断CD47的抗体。图7B显示，在大多数情况中，非阻断CD47的抗体作为使SIRPα表达显著降低～90％或更多的一类。此外，与先前观察到的一致，通过比较，阻断CD47的抗体，在此实施例中为5F7和12D6，在受体下调方面不太有效。因此，图7A和7B建立了SIRPα的下调作为非配体阻断的SIRPA抗体的限定特征。通过降低受体表达，这些抗体通过非竞争性抑制来拮抗SIRPα—CD47信号传导途径，这是一种先前未在该领域中探索过的新机制。
[0336] 实施例7：SIRPα下调增强人巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用
[0337] 肿瘤细胞通过上调CD47来逃避免疫监视，从而向吞噬细胞传递抑制性信号。因此，拮抗性抗体抵消这种抑制以增强肿瘤细胞吞噬作用。为了测定SIRPA抗体是否通过受体下调来有效抑制SIRPα信号传导，基于pHrodo荧光的获得开发了肿瘤细胞吞噬作用测定法。红亲和素(Red Avidin，Invitrogen)是与pHrodo红染料缀合的链霉亲和素分子，其是在酸性环境中(诸如吞噬体)获得荧光的产荧光标记物。对于标记的靶肿瘤细胞，将500nM红亲和素与15nM生物素标记的小扁豆凝集素(LCA；Vector Labs)混合。然后，将红亲和素LCA复合物以1:1容积比率与250,000个Raji细胞混合在冰上的无血清的RPMI培养基中。LCA的糖结合性质将红亲和素与肿瘤细胞表面的碳水化合物结构联结起来。在简短的洗涤步骤后，将红亲和素-LCA-标记的Raji细胞与单核细胞衍生的人巨噬细胞混合在无血清的RPMI培养基中，并在37℃温育2小时。然后，收集巨噬细胞，并在冰上在含有阻断FcγR的抗体的FACS缓冲液中用抗CD14APC染色。通过计数APC/pHrodo-双阳性巨噬细胞的百分比来测量吞噬作用活性。作为对照，将未标记的Raji细胞与巨噬细胞混合以建立背景荧光。
[0338] 图8A(i-ii)确立了此测定的有效性。将单核细胞衍生的巨噬细胞以105个细胞/孔接种到96孔组织培养板上，并用同种型对照抗体过夜处理。第二天，将250,000个红亲和素标记的Raji细胞或未标记的Raji细胞与巨噬细胞混合2小时，且随后通过流式细胞术分析。图8A(i)中的直方图表明与未标记的细胞(阴影直方图)相比，当巨噬细胞与红亲和素标记的Raji细胞(实线黑色轮廓直方图)共培养时观察到的pHrodo-荧光的移动。然而，此移动的群体仅代表～5％的总CD14+巨噬细胞(图8Aii)。抗CD20抗体(利妥昔单抗)对红亲和素标记的Raji细胞的调理素作用改变pHrodo+巨噬细胞群，甚至进一步(虚线轮廓直方图)与抗体依赖性吞噬作用增强肿瘤细胞清除相一致。由于添加利妥昔单抗，pHrodo+巨噬细胞代表～
20％的总CD14+巨噬细胞，吞噬作用活性的近4倍的增加。
20％的总CD14+巨噬细胞，吞噬作用活性的近4倍的增加。
[0339] 为了测试SIRPA抗体，用指示候选抗体或同种型对照过夜处理巨噬细胞。第二天，将标记的Raji细胞添加至经处理的巨噬细胞，随后定量吞噬作用活性。如图8B中所示的，相较于同种型处理的巨噬细胞，3F9和9C2二者分别使CD14+/pHrodo+-巨噬细胞群增加2.5倍和1.5倍。相对于同种型处理的巨噬细胞，组合疗法(其中将利妥昔单抗调理的Raji细胞添加至3F9-或9C2-处理的巨噬细胞)进一步增强肿瘤细胞吞噬。然而，相较于未处理的细胞，利妥昔单抗单独使吞噬作用活性增加～4倍，利妥昔单抗+3F9或利妥昔单抗+9C2处理分别使吞噬作用增加7倍和6倍。由于3F9和9C2是不竞争性抑制CD47结合的SIRPA特异性抗体，所以图8C比较了用阻断CD47抗体对比非阻断CD47的抗体处理巨噬细胞的吞噬作用的活性。在阻断CD47的抗体中，仅12D6和5F7使肿瘤细胞摄取显著增加～30-40％，超过同种型处理的巨噬细胞。通过比较，3F9处理的巨噬细胞的吞噬作用活性增加2倍。因此，图8A-C的结果确立了抗体介导的巨噬细胞上的SIRPα的下调增强对肿瘤细胞的吞噬摄取。使SIRPA抗体与抗肿瘤抗原抗体组合进一步加强了通过效应细胞的肿瘤细胞清除。最后，比较竞争性抑制CD47相互作用的抗SIRPA抗体，和通过降低SIRPα表达来非竞争性抑制CD47结合的抗体，表明优异的刺激巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬的能力。
[0340] 实施例8：SIRPα下调活化原代人单核细胞
[0341] 尽管巨噬细胞可能是驱动肿瘤细胞清除以响应抗SIRPA疗法的主要效应细胞群，但SIRPA抗体将啮合表达SIRPα的多种髓样细胞谱系。这些细胞中有单核细胞，其存在于外周血液中，且因此，在体内抗体施用时，易于测定靶啮合。为了鉴定潜在的生物标记物，在抗体处理后，从健康供体的外周血液中分离原代单核细胞，并测定活性标记物。
[0342] 在单核细胞上验证抗SIRPA抗体降低SIRPα的表面表达的能力。分离后，将105个单核细胞与5μg/ml的同种型对照或可溶的抗SIRPA抗体一起接种到96孔组织培养板上。在过夜温育后，通过流式细胞术分析细胞的SIRPα表面表达。使用DyLight650缀合的抗人SIRPA抗体检测SIRPα表达，该抗人SIRPA抗体属于独特的表位仓。图9A显示相对于同种型对照处理的细胞，3F9使SIRPα的表面表达降低50％。尽管受体下调在单核细胞中似乎不如先前在巨噬细胞中观察到的强健，但是测定了单核细胞产生炎症介质，例如产生活性氧(ROS)和促炎细胞因子。为了检测ROS产生，将105个单核细胞与10μg/ml的同种型对照或可溶的抗SIRPA抗体一起接种到96孔组织培养板上。随后，用2μM的荧光染料(CM-H2DCFDA)标记细胞。在37℃抗体介导的刺激1小时后，在激发波长495nm和发射波长530nm处测量细胞中的相对荧光单位。通过减去仅在培养基中和/或与同种型对照抗体温育的标记细胞的背景荧光，获得经刺激的细胞的特定荧光指数。用BioTek SynergyTM酶标仪使用GEN5TM 2.04软件对平板读数。图9B显示SIRPA特异性抗体，3F9和9C2，刺激从2名健康供体中分离的单核细胞中的ROS产生。另外地，图9C显示105个用下调SIRPα的抗体处理过夜的单核细胞产生增加量的IL-8。因此，图9A-C的结果暗示，除了降低受体表面表达，抗SIRPA抗体还可使细胞向更活化的表型极化。
[0343] 实施例9：SIRPA特异性抗体在体内降低SIRPα的细胞表面表达
[0344] 为了测定抗SIRPA抗体在体外模型系统中是否降低受体的细胞表面表达，获得了在RAG2缺陷和IL2Rγ链缺陷背景中编码人SIRPA基因的人BAC转基因小鼠。通过流式细胞术在小鼠髓样细胞上分析huSIRPA的表达水平。如图10A中所示的，从小鼠外周血液中分离的单核细胞和粒细胞表达人SIRPA，以及内源性小鼠SIRPA。衍生自骨髓细胞的巨噬细胞和树突细胞还表达huSIRPA。因此，huSIRPA-tg小鼠如实地概括了人SIRPA在小鼠细胞中的表达样式。此外，为了测定huSIRPA是否保留其抑制性功能，huSIRPA-tg小鼠移植有过表达人CD47的Raji细胞，一种人B细胞淋巴瘤细胞系。如图10B中所示的，皮下施用Raji细胞导致实体肿瘤形成，这暗示了huSIRPA-tg小鼠支持CD47+人细胞的植入。
[0345] 为了测试在体内抗体介导的受体下调，huSIRPA-tg小鼠接受单次腹膜内(i.p.)注射10mg/kg的3F9(抗SIRPA抗体)或MOPC21(小鼠IgG1同种型对照)。第二天，从小鼠抽取血液样品到涂有肝素的收集管中并经处理用于FACS分析。另外地，还收获脾脏，并经处理用于FACS分析。简要地，将血液和脾细胞样品在ACK裂解缓冲液中温育5分钟以裂解红细胞，然后用冷PBS充分洗涤。然后，将细胞重悬在FACS缓冲液(PBS+2％FBS+Fc受体阻断溶液)中。外周血液髓样细胞用抗小鼠CD11b-Pacific蓝和，抗人SIRPα/β-APC(克隆SE5A5)或DyLight 650缀合的9C2之一染色，通过杂交瘤筛选鉴定人SIRPA特异性抗体。在BD FACS CANTOTM II血细胞计数器上获得数据(Becton Dickinson)，并用FlowJo软件分析。如图10C中所示的，用抗人SIRPα/β-APC标记的CD11b+血液单核细胞和粒细胞上的门控显示，当相较于同种型对照处理的小鼠时，3F9处理不能降低两种细胞类型上的huSIRPA的细胞表面水平。然而，3F9处理阻断9C2-DyLight 650结合外周血液细胞上的huSIRPA。由于3F9和9C2结合相同表位，所以此阻断证实了3F9占据外周血液细胞上的受体而不下调表达。
[0346] 还从同种对照处理的动物和3F9处理的动物中获得来自小鼠脾脏的单细胞悬浮液。脾细胞用抗小鼠CD11b-Pacific蓝，抗小鼠F4/80-FITC，和抗人SIRPα/β-APC(克隆SE5A5)染色。在BD FACS CANTOTM II血细胞计数器(Becton Dickinson)上获得数据，并用FlowJo软件分析。如图10D中所示的，基于F4/80和CD11b标志物在脾脏中鉴定了两种主要髓样细胞群：F4/80Lo CD11b+/-群(可能是红髓巨噬细胞)和F4/80Hi CD11bHi群。尽管两种群都表达huSIRPA，如在对照处理的小鼠中所证明的，3F9处理主要在F4/80Lo CD11b+/-细胞中下调huSIRPA表达。另外地，F4/80Lo CD11b-群仅在3F9处理的小鼠的脾脏中扩充。在F4/80Hi CD11bHi脾群中观察到huSIRPA的边缘减少。
[0347] 这些结果表明，当利用huSIRPA-tg小鼠时，抗SIRPA抗体在体内啮合huSIRPA并在功能上下调髓样细胞上的受体。该结果进一步表明huSIRPA抗体，3F9，啮合外周血液细胞和脾髓样细胞上的huSIRPA，但以细胞类型依赖性或背景依赖性方式内化受体。
[0348] 实施例10：抗SIRPA抗体在BAC转基因小鼠模型中的抗肿瘤作用
[0349] 用huSIRPA-tg小鼠进行预试验以评定抗SIRPA抗体的抗肿瘤作用。将12只huSIRPA-tg雌性小鼠，大约8-12周龄，在右侧单侧植入在Matrigel溶液中混合的500,000个Raji-萤光素酶细胞。在植入后7至10天开始监测肿瘤植入，通过卡尺测量肿瘤体积和生物发光成像。在第10天，当肿瘤达到大约体积为80-120mm3时，通过i.p.注射对小鼠施用D萤光素底物，并用体内成像系统成像。随后，基于来自Raji细胞的萤光素酶信号的平均辐射(光量子/秒/cm2/sr)值，将小鼠随机化为处理组或对照组(每组6只小鼠)。从第10天开始，在研究期间，小鼠接受10mg/kg的3F9(抗SIRPA)或小鼠IgG1对照抗体，2x/周i.p.注射。每日观察小鼠并使用电子秤每周称重两次。当对照组的平均肿瘤体积达到1500mm3时，研究结束。在研究终止时，收获肿瘤并经处理用于FACS分析。简要地，肿瘤样品用胶原酶在37℃处理30分钟。样品通过细胞滤器分离，并重悬于PBS中的2％FBS中。使用ACK裂解缓冲液裂解样品中的红细胞，然后细胞在PBS中的2％FBS中洗涤。使用血细胞计数器对细胞进行计数，且将一百万个细胞用荧光染料缀合的抗体在冰上染色30分钟，然后用PBS中的2％FBS洗涤。用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞。在FACS Canto(BD Biosciences)上分析所有染色的细胞，并用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。肿瘤浸润的髓样细胞用抗小鼠CD11b-Pacific蓝，抗小鼠F4/80-FITC，和抗人SIRPα/β-APC(克隆SE5A5)染色。如图11A中所示的，基于F4/80和CD11b标志物，鉴定两种主要髓样群：F4/80+CD11b+群(F4/80+细胞)和F4/80-CD11b+群(CD11b+细胞)。如同种型对照处理的小鼠中所示的，两种群体均表达huSIRPA。然而，3F9处理仅在F4/
80-CD11b+细胞中下调huSIRPA表达，然而在F4/80+CD11b+细胞中huSIRPA表达未降低。
80-CD11b+细胞中下调huSIRPA表达，然而在F4/80+CD11b+细胞中huSIRPA表达未降低。
[0350] 如图11B中所示的，当通过生物发光成像测量肿瘤负荷时，相较于媒介物对照处理的动物，施用抗SIRPA抗体，3F9，似乎在体内抑制肿瘤生长。平均辐射值的线性回归分析指示，当在第10天校正治疗前辐射值时，在第17天出现了近似显著的疗效趋势(p＝0.06)。这种趋势在随后的测量中继续(p值为0.16，0.77和0.18)，但鉴于肿瘤生长的可变性和可用的huSIRPA-tg小鼠的数目有限，此研究在统计学上不足以达到期望的显著性水平。
[0351] 实施例11：抗SIRPA抗体在人源化小鼠模型中的抗肿瘤作用
[0352] 免疫受损的雌性NSG小鼠(Jax)被植入人脐带血衍生的CD34+造血干细胞以重建人免疫细胞谱系(包括髓样和淋巴样细胞区室)，作为测量抗SIRPA抗体的免疫调节能力的平台。成熟人免疫细胞的成功植入定义为注射后12周外周血中>25％的huCD45+细胞。另外筛选人源化小鼠的外周血液中人CD14+，人CD11b+，和人CD33+细胞的高细胞计数。
[0353] 对于免疫-肿瘤学功效研究，将人源化小鼠在右侧皮下植入MDA-MB-231细胞，该MDA-MB-231细胞是响应在此模型系统中的检查点抑制剂疗法的三阴性人乳腺癌细胞系。当肿瘤变得明显时，通过电子卡尺测量预处理肿瘤体积，且当肿瘤体积在第-1天达到60-120mm3时，将小鼠随机化为处理组或对照组(每组12只小鼠)。从第0天开始，在研究期间，小鼠每4天接受i.p.注射40mg/kg的3F9(抗SIRPA)或小鼠IgG1对照抗体。在研究期间，第三组反而每5天接受i.p.注射10mg/kg的派姆单抗(可瑞达，Merck)。在给药开始后，每周两次记录体重，临床观察和电子卡尺测量。当对照组的平均肿瘤体积达到2000mm3时，结束该研究。
在终止时，收获血液，脾脏和肿瘤并经处理用于FACS分析。简要地，将肿瘤样品用胶原酶在
37℃处理30分钟。脾脏和肿瘤样品通过细胞滤器分离，并重悬于PBS中的2％FBS中。使用ACK裂解缓冲液裂解样品中的红细胞，然后细胞在PBS中的2％FBS中洗涤，并用荧光染料缀合的抗体在冰上染色30分钟。用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞。在FACS Canto(BD
Biosciences)上分析所有染色的细胞，并用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
在终止时，收获血液，脾脏和肿瘤并经处理用于FACS分析。简要地，将肿瘤样品用胶原酶在
37℃处理30分钟。脾脏和肿瘤样品通过细胞滤器分离，并重悬于PBS中的2％FBS中。使用ACK裂解缓冲液裂解样品中的红细胞，然后细胞在PBS中的2％FBS中洗涤，并用荧光染料缀合的抗体在冰上染色30分钟。用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞。在FACS Canto(BD
Biosciences)上分析所有染色的细胞，并用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
[0354] 如图12A中所示的，当相较于同种型对照处理的小鼠或可瑞达处理的小鼠时，用SIRPA抗体(3F9)处理降低了负荷肿瘤的人源化小鼠中的外周血液中的huCD45+huCD14+髓样细胞中SIRPA的细胞表面水平。然而，瘤内huCD45+huCD14+髓样细胞的SIRPA的细胞表面表达水平未降低。这些结果类似于先前在huSIRPA-tg小鼠中的观察，其中抗体介导的受体下调以细胞类型依赖性或背景依赖性方式出现。
[0355] 如图12B中所示的，当相较于同种型对照处理的小鼠或可瑞达处理的小鼠时，SIRPA抗体(3F9)处理降低了负荷肿瘤的人源化小鼠中外周血液huCD45+huCD14+髓样细胞的百分比。相反地，3F9和可瑞达二者增加瘤内huCD45+huCD14+髓样细胞的百分比。此外，相较于同种型对照组，3F9处理降低了负荷肿瘤的人源化小鼠的外周血液中的人CD45+白细胞的总体百分比(图12C)。
[0356] 为了解释在此模型系统中影响肿瘤生长的除了治疗方式以外的各种因素，利用R’s lm()函数进行多元线性回归分析来校正肿瘤体积的以下差异：1)huCD34+干细胞供体，2)第-1天时的肿瘤体积，3)随机化前的动物体重，和4)随机化前的huCD45+细胞的植入率。
图13A绘制了每个时间点的每组平均肿瘤体积。相较于同种型对照组，3F9和可瑞达两个处理组均在早期和晚期时间点显著降低肿瘤体积，尽管多半在第22天和第28天之间观察到该作用。如图13B中所示的，绘制huCD34+干细胞供体的肿瘤体积测量，显示相较于同种型对照，当用3F9或可瑞达处理时，植入了来自供体5031和5048的人免疫细胞的小鼠显著抑制肿瘤生长。相反地，相较于同种型对照组，植入了来自供体129的人免疫细胞的小鼠在任一处理组中未记录肿瘤体积的任何显著降低。然而，注意，来自供体129接受者的对照组中的平均肿瘤体积低于来自供体5031和5048的对照组。此类供体-至-供体在肿瘤生长中的可变性强调了在此平台中适当控制以充分解释结果的必要性。
图13A绘制了每个时间点的每组平均肿瘤体积。相较于同种型对照组，3F9和可瑞达两个处理组均在早期和晚期时间点显著降低肿瘤体积，尽管多半在第22天和第28天之间观察到该作用。如图13B中所示的，绘制huCD34+干细胞供体的肿瘤体积测量，显示相较于同种型对照，当用3F9或可瑞达处理时，植入了来自供体5031和5048的人免疫细胞的小鼠显著抑制肿瘤生长。相反地，相较于同种型对照组，植入了来自供体129的人免疫细胞的小鼠在任一处理组中未记录肿瘤体积的任何显著降低。然而，注意，来自供体129接受者的对照组中的平均肿瘤体积低于来自供体5031和5048的对照组。此类供体-至-供体在肿瘤生长中的可变性强调了在此平台中适当控制以充分解释结果的必要性。
[0357] 上述数据建立了SIRPA抗体，3F9，在体内啮合受体并诱导特定细胞群中SIRPA下调。循环和肿瘤浸润性免疫细胞的分析显示3F9处理降低外周血液中CD14+髓样细胞，伴随着肿瘤中CD14+细胞的增加。不同于可瑞达(其降低血液和肿瘤中的CD4+和CD8+T细胞)，3F9并不显著影响T细胞数目，这暗示了其主要作用于髓样区室。重要的是，在3F9情况下的受体下调和髓样细胞群中的变化与肿瘤生长的显著抑制(相较于可瑞达疗法)相关联。总之，这些研究支持抗SIRPA抗体作为治疗人癌症的治疗剂的临床前功效。
[0358] 实施例12：3F9和9C2的计算机模拟抗体人源化
[0359] 抗体人源化用于通过序列和结构关系转化在不同物种中产生的抗体以最佳地类似于人抗体，以防止人施用中的免疫原性。来自不同物种的抗体共享特有序列和结构特征，其允许将非人抗体的特异性决定区(SDR)移植到人抗体框架上。这导致保留非人抗体的特异性。人源化过程涉及鉴定非人抗体序列和特征，包括框架区和SDR。以下标准用于人源化抗体：1)非人抗体和已知的人抗体之间框架区的百分比相似性，2)非人抗体和已知的人抗体之间框架区的长度相似性，3)用于生成人抗体的框架区的基因，和4)人抗体框架在人源化中的先前使用，且用作治疗剂。框架区和SDR长度的相似性是重要的，因为差异可以生成可改变抗体特异性的抗体中的结构差异。已知用于产生人抗体的框架的特定基因对抗体的稳定性或特异性是有益的或有害的，因此选择性地使用或避免使用。最后，先前成功的人源化框架(包括人类治疗中使用的框架)，其具有良好的耐受性，良好的半衰期，可能是将来成功人源化的候选者。
[0360] 如图14A-D中所示的，鉴定了SIRPA抗体(3F9和9C2)的人源化轻和重链可变区序列。3F9重链可变域(hSB-3F9-H1；图14A)的第一人源化序列是“CDR-交换”，对人框架无变化。随后的人源化重链序列(hSB-3F9-H2)改变框架残基(相较于其上的序列，以粗体显示变化)。图14B中，hSB-3F9-L1是轻链可变域的“CDR交换”，对人框架无变化。随后的人源化轻链序列改变框架残基(相较于其上的序列，以粗体显示变化；灰色框入的残基来自先前版本)。来自3F9的轻链CDR还含有潜在的脱酰胺基作用位点(用#标记的)，该位点可由Q，S，A，或D替代。另外地，3F9的可变域在位置96处含有潜在的游离Cys，这可在制造过程中潜在导致问题。只要未改变抗原结合，此位点可由A，S，或L残基替代。在图14C中，hSB-9C2-H1是重链可变域的“CDR-交换”，对人框架无变化。随后的人源化重链序列改变框架残基(相较于其上的序列，以粗体显示变化；灰色框入的残基来自先前版本)。来自9C2的重链CDR还含有潜在的脱酰胺基作用位点(用#标记的)，该位点可用Q，S，或A替代。9C2在CDR-H3中还含有Asp-Gly(DG)序列(用@标记的)，其可能易受异天冬氨酸形成的影响。只要未改变抗原结合，此位点可由A，S，或E残基替代。在图14D中，hSB-9C2-L1是轻链可变域的“CDR-交换”，对人框架无变化。随后的人源化轻链序列改变框架残基(相较于其上的序列，以粗体显示变化；灰色框入的残基来自先前版本)。来自9C2的轻链CDR含有潜在的脱酰胺基作用位点(用#标记的)，其可由Q，S，D，或A替代。9C2还在CDR-L3中含有Trp残基(用^标记的)，其可能易受氧化影响。只要未改变抗原结合，此位点可由H，Y，或F残基替代。
[0361] 实施例13：抗SIRPA抗体结合位点的表位作图
[0362] 使用通过人SIRPA cDNA序列的鸟枪法诱变产生的丙氨酸扫描文库进行抗SIRPA抗体的表位作图。对编码C-末端V5表位标签的SIRPA表达构建体进行高通量丙氨酸扫描诱变(概述于Davidson和Doranz,2014,Immunology143:13-20中)以生成全面的突变文库。代表SIRPA细胞外结构域(氨基酸31-374)的每个残基经突变，大部分突变为丙氨酸，而丙氨酸密码子突变成丝氨酸。
[0363] 将排列在384孔微孔板中的SIRPA突变文库克隆单独地转染到HEK-293T细胞中，并使其表达22小时。抗体经消化以生成Fab，之后将细胞与在10％标准山羊血清(NGS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中稀释的Fab一起温育。在文库筛选之前，初级Fab浓度使用针对表达野生型SIRPA的细胞的独立免疫荧光滴定曲线来测定，以确保信号在线性检测范围内。使用10％NGS中的7.5μg/ml AlexaFluor488缀合的第二抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Westgrove，PA)来检测Fab。用PBS洗涤细胞两次，并重悬在含0.1％BSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的Cellstripper(Cellgro,Manassas,VA)中。在一些情况中，使用更高的严格条件，包括增加的pH，增加的温度，和增加的解离时间。使用Intellicyt高通量流式细胞术(HTFC，Intellicyt，Albuquerque，NM)检测平均细胞荧光。通过减去来自模拟转染的对照的信号，并针对来自野生型SIRPA转染的对照的信号归一化，相对于野生型SIRPA蛋白反应性，计算针对每个突变体克隆的Fab反应性。
[0364] 如果它们不支持测试Fab的反应性但是支持可商购的参考抗体(MAB4546(R&D系统)，或另外的抗SIRPA Fab)的反应性，则将文库克隆内的突变的残基鉴定为对于Fab结合表位是“关键的”。这种逆向筛选策略有助于排除局部错误折叠或具有表达缺陷的SIRPA突变体。
[0365] 实施例14：通过抗SIRPA抗体的FcγRIIB下调
[0366] 除了感兴趣的靶抗原，髓样谱系的细胞还表达多种能够结合治疗性抗体的Fc域的Fc受体。Fcγ受体(FcγR)构成介导Fc依赖性效应器功能的最佳表征和最有效的受体类别。FcγR包括ITAM相关的活化受体(FcγRI，FcγRIIA，和FcγRIIIA)和负荷ITIM的抑制性受体(FcγRIIB)，且在同一细胞上共表达活化的/抑制性受体建立了细胞活化的阈值。通常，通过免疫复合物连接活化的FcγR起始数种信号级联，其导致细胞活化并随后诱导效应器功能。这些活性在髓样细胞类型之间变化，但可能包括抗体依赖性细胞毒性，抗体依赖性细胞吞噬作用，以及上调数种促炎细胞因子和趋化因子等。相反地，免疫复合物对抑制性受体(FcγRIIB)的连接抵消了活化的FcγR的免疫刺激性信号，该信号支持组织稳态的维持。例如，数项研究建立了FcγRIIB的遗传敲除导致免疫复合物介导的炎症的鼠模型中增强的促炎巨噬细胞活性。由于FcγRIIB是唯一的具有抑制性活性的FcγR，因此它在通过骨髓细胞调节FcγR介导的炎症中起重要作用。在肿瘤微环境的背景下，FcγRIIB表达水平可测定肿瘤相关巨噬细胞的极化状态和体内巨噬细胞效应器功能的调节。
[0367] 为了评定FcγR是否参与抗SIRPA抗体在体外的活性，抗体3F9用EndoS(New England Biolabs)处理以去除Fc连接的聚糖。酶促反应完全切割碳水化合物结构，如图15A中的LCA印迹所示的，其检测Fc聚糖上的甘露糖残基。重要的是，去糖基化反应不影响抗原识别，因为3F9和去糖基化的3F9二者在基于细胞的结合测定中结合SIRPA相当(图15B)。随后地，将去糖基化的3F9降低原代人巨噬细胞(huMac)上SIRPA的细胞表面表达的能力与糖基化3F9进行比较。简要地，从两个健康供体(HD 1和HD 2)的外周血液中分离人单核细胞，并在体外分化成巨噬细胞。分化后，收获105个huMac，并接种到具有递增浓度的抗SIRPA抗体的96孔组织培养板上。在过夜温育后，通过流式细胞术分析细胞的SIRPA表面表达。使用DyLight650缀合的抗人SIRPA抗体检测受体表达，所述抗体属于与9C2和3F9不同的表位仓。
[0368] 如图16中所示的，相对于同种型对照处理的巨噬细胞，3F9的两种糖型均显著下调SIRPA的表面表达。然而，在两个供体中，相较于糖基化的抗体，去糖基化的3F9变体表现出部分降低的活性。例如，3F9分别在HD 1和HD 2中下调SIRPA表达多达90％和85％；而去糖基化的3F9分别在同一供体巨噬细胞中仅实现了70％和75％的受体下调。此发现暗示了抗SIRPA抗体诸如3F9需要FcγR啮合用于最大活性。
[0369] 为了确定哪种FcγR有助于3F9在体外的活性，将获自两名健康供体的单核细胞衍生的巨噬细胞用同种型对照抗体或抗SIRPA抗体(3F9)过夜处理，并测定FcγRIIIA(CD16)和FcγRIIA/B(CD32A/B)的表面表达水平。如图17A中所示的，相对于同种型对照处理的巨噬细胞，3F9处理适度地降低了FcγRIIIA的表面表达。相反地，相对于同种型对照处理的细胞，在3F9处理的巨噬细胞上FcγRIIA/B的实质下调是明显的(图17B)。
[0370] 由于用于测量FcγRII的表面水平的检测抗体(克隆FUN-2；Biolegend)不区分活化受体(FcγRIIA)和抑制性受体(FcγRIIB)，因此用受体特异性抗体重复该测定。如先前所述的，将获自两名健康供体的单核细胞衍生的巨噬细胞用同种型对照抗体或指示的3F9的糖型过夜处理。图18显示，相对于同种型对照处理的细胞，3F9显著下调在巨噬细胞中的FcγRIIA～70-85％。此作用取决于Fc结构域，因为抗体的去糖基化消除了受体下调。然而，当测定FcγRIIB的表面表达时，相对于同种型对照处理的巨噬细胞，3F9处理将抑制性受体的表达降低至接近不可检测的水平(图18)。甚至去糖基化形式的3F9表现出强烈的FcγRIIB下调，暗示了3F9的鼠IgG1同种型可优先与人FcγRIIB结合。不受理论束缚，通过靶向两个负荷ITIM的受体的下调(SIRPA和FcγRIIB)，3F9可使巨噬细胞极化为活化表型。在肿瘤生物学的背景下，将肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞从前肿瘤表型重编程为具有抗SIRPA抗体的抗肿瘤表型，因此代表了癌症免疫疗法的有希望的模式。
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