用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法
阅读：842发布：2020-09-16
专利汇可以提供用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涵盖靶向细胞因子递送的组合物和方法。本文公开的组合物包含连接至NKG2D配体或PD1配体的细胞因子，并且可以通过限制与免疫疗法相关的 副作用 来改进免疫疗法。本公开还涵盖使用NKG2D受体配体或PD1配体来募集细胞毒性淋巴细胞至靶细胞的组合物和方法。本文公开的组合物包含NKG2D受体配体和靶向分子，并且可以通过限制与免疫疗法相关的副作用来改进免疫疗法。，下面是用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.嵌合肽，所述嵌合肽包含与免疫细胞表面蛋白靶向配体连接的细胞因子。
2.权利要求1的嵌合肽，其中所述细胞因子是IL2亚家族的部分。
3.权利要求1的嵌合肽，其中所述细胞因子选自IL2、IL7、IL15、IL18、IL21及其突变体。
4.权利要求1的嵌合肽，其中所述细胞因子是白细胞介素-2（IL2）、突变的IL2或其变体。
5.权利要求4的嵌合肽，其中所述突变的IL2包含选自R38A、F42K和C125S的至少一种突变。
6.权利要求4的嵌合肽，其中所述IL2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
7.权利要求1的嵌合肽，其中所述细胞因子是IL1家族的部分。
8.权利要求1的嵌合肽，其中所述细胞因子是IL8或其突变体。
9.前述权利要求中任一项的嵌合肽，其中所述免疫细胞表面蛋白靶向配体是NKG2D配体。
10.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体。
11.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是对NKG2D受体具有高亲和力的抗体。
12.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体是KYK-1。
13.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体是KYK-1的scFv。
14.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体是KYK-2。
15.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体是KYK-2的scFv。
16.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列。
17.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。
18.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。
19.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。
20.权利要求12的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:
35和SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。
21.权利要求14的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:
37和SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。
22.权利要求13的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:
39或SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
23.权利要求15的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:
41或SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
24.权利要求9的嵌合肽，其中所述NKG2D配体是正痘病毒主要组织相容性复合物I类样蛋白（OMCP）或其部分。
25.权利要求24的嵌合肽，其中所述OMCP包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列或其部分。
26.权利要求24的嵌合肽，其中所述OMCP的部分包含OMCP的活化部分。
27.权利要求26的嵌合肽，其中所述OMCP的活化部分包含OMCP的H2B螺旋部分。
28.权利要求24-27中任一项的嵌合肽，其中所述细胞因子是肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的成员或其突变体。
29.权利要求28的嵌合肽，其中所述细胞因子选自TNF-α、OX40L、4-1BBL、CD40L、核因子κ-B配体的受体活化物（RANKL）、淋巴毒素-α（LTA）、淋巴毒素-β（LTB）、Fas配体（FASL）和CD27L。
30.权利要求29的嵌合肽，其中所述OX40L包含SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 61中所示的氨基酸序列。
31.权利要求29的嵌合肽，其中所述4-1BBL包含SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。
32.权利要求1-8中任一项的嵌合肽，其中所述免疫细胞表面蛋白靶向配体是PD1配体。
33.权利要求32的嵌合肽，其中所述PD1配体是抗体。
34.权利要求32的嵌合肽，其中所述PD1配体是PDL1或其部分。
35.权利要求32的嵌合肽，其中所述PD1配体是PDL2或其部分。
36.权利要求32的嵌合肽，其中所述PD1配体包含SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54或SEQ ID NO: 55中所示的氨基酸序列。
37.嵌合肽，所述嵌合肽包含与靶向分子连接的正痘病毒主要组织相容性复合物I类样蛋白（OMCP）或其部分。
38.权利要求37的嵌合肽，其中所述靶向分子结合细胞上表达的靶分子。
39.权利要求38的嵌合肽，其中所述靶分子是细胞表面上表达的蛋白。
40.权利要求39的嵌合肽，其中所述蛋白是受体。
41.权利要求38或39的嵌合肽，其中所述细胞选自癌细胞、血管内皮细胞、肿瘤相关的成纤维细胞和单核细胞。
42.权利要求37的嵌合肽，其中所述靶向分子是抗体。
43.权利要求42的嵌合肽，其中所述抗体结合肿瘤基质中存在的抗原。
44.权利要求42的嵌合肽，其中所述抗体结合间皮素。
45.权利要求42的嵌合肽，其中所述抗体结合癌胚抗原（CEA）。
46.权利要求37的嵌合肽，其中所述靶向分子是受体靶向的激动剂抗体。
47.权利要求37的嵌合肽，其中所述靶向分子是受体靶向的拮抗剂抗体。
48.权利要求37的嵌合肽，其中所述靶向分子是诱导TNF相关的细胞凋亡的靶向分子。
49.权利要求48的嵌合肽，其中所述靶向分子是4-1BB激动剂。
50.权利要求37-49中任一项的嵌合肽，其中所述OMCP包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列或其部分。
51.权利要求37-49中任一项的嵌合肽，其中所述OMCP的部分包含OMCP的活化部分。
52.权利要求51的嵌合肽，其中所述OMCP的活化部分包含OMCP的H2B螺旋。
53.前述权利要求中任一项的嵌合肽，其中所述接头是肽接头并且包含约20个至约30个氨基酸。
54.权利要求1-52中任一项的嵌合肽，其中所述接头包含选自(AAS)n、(AAAL)n (SEQ ID NO:68)、(GnS)n或(G2S)n的氨基酸序列，其中A是丙氨酸，S是丝氨酸，L是亮氨酸，并且G是甘氨酸，并且其中n是1-20、或1-10、或3-10的整数。
55.权利要求1-52中任一项的嵌合肽，其中所述接头包含选自FLAG标签和His标签的至少一种标签。
56.权利要求1-52中任一项的嵌合肽，其中所述接头包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
57.嵌合肽，其包含SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 46中所示的氨基酸序列。
58.嵌合肽，其包含SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 50中所示的氨基酸序列。
59.嵌合肽，其包含SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO: 67中所示的氨基酸序列。
60.核酸分子，其包含编码权利要求1-59中任一项的嵌合肽的序列。
61.药物组合物，其包含权利要求1-59中任一项的嵌合肽。
62.组合疗法，其包含权利要求61的药物组合物和PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
63.权利要求62的组合疗法，其中所述PD-1抑制剂是PD-1抗体。
64.权利要求63的组合疗法，其中所述PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗、
pidilizumab、REGN2810、PDR 001和MEDI0680。
65.权利要求62的组合疗法，其中所述PD-1抑制剂是PD-L1抗体。
66.权利要求65的组合疗法，其中所述PD-L1抗体选自度伐鲁单抗、阿维单抗、阿特朱单抗、或BMS-936559、或STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014和STI-A1015。
67.治疗诊断有癌症的主体的方法，其包括向所述主体施用权利要求61的药物组合物。
68.权利要求67的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌和血癌。
69.权利要求67的方法，其进一步包括施用权利要求62的组合疗法。
70.权利要求67-69中任一项的方法，其中所述组合物包含含有以下的嵌合肽：（i）连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分，（ii）连接至IL2或其突变体的抗NKG2D抗体，（iii）连接至IL2或其突变体的PDL1或PDL2，（iv）连接至OX40L或其突变体的OMCP或其部分，或（v）连接至4-1BBL或其突变体的OMCP或其部分。
71.递送细胞因子至靶细胞的方法，所述方法包括将靶细胞与权利要求1-59中任一项的嵌合肽接触。
72.权利要求71的方法，其中所述嵌合肽包含连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分。
73.权利要求71或权利要求72的方法，其中所述靶细胞是NK细胞或CD8+ CTL。
74.活化免疫细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞与权利要求1-59中任一项的嵌合肽接触。
75.权利要求74的方法，其中所述嵌合肽包含：（i）连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分，（ii）连接至IL2或其突变体的抗NKG2D抗体，（iii）连接至IL2或其突变体的PDL1或PDL2，（iv）连接至OX40L或其突变体的OMCP或其部分，或（v）连接至4-1BBL或其突变体的OMCP或其部分。
76.权利要求74或权利要求75的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞和CD8+ CTL。
77.权利要求76的方法，其中所述活化的NK细胞裂解肿瘤细胞。
78.权利要求74的方法，其中所述嵌合肽包含连接至IL15、IL18或其突变体的OMCP或其部分。
79.权利要求78的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。
80.治疗病毒感染的方法，所述方法包括向主体施用权利要求61的药物组合物。
81.权利要求80的方法，其中所述病毒感染由黄病毒引起。
82.权利要求81的方法，其中所述黄病毒是西尼罗河病毒（WNV）。
83.权利要求80-82中任一项的方法，其中所述组合物包含含有连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分的嵌合肽。
84.离体扩增淋巴细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-59中任一项的嵌合肽存在的情况下培养淋巴细胞。
85.权利要求84的方法，其中所述嵌合肽包含连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分。
86.改进主体中的过继性细胞免疫疗法的方法，所述方法包括向主体施用治疗组合物，所述治疗组合物包含已在权利要求1-59中任一项的嵌合肽存在的情况下培养的淋巴细胞。
87.权利要求86的方法，其中所述嵌合肽包含连接至IL2或其突变体的OMCP或其部分。
88.治疗主体中的肺癌的方法，所述方法包括向主体施用有效量的组合疗法，其中所述组合疗法包含（i）含有OMCP或其部分和IL2或其突变体的嵌合肽，和（ii）抗PD-1抗体。
用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法
[0001] 政府权利本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的AI073552、
AI019687、AI109948、HHSN272201200026C和HL113931政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。
AI019687、AI109948、HHSN272201200026C和HL113931政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。
[0002] 相关申请的引用本申请要求享有于2016年2月5日提交的美国临时申请号62/292,046、于2016年5月27
日提交的美国临时申请号62/342,630、于2016年6月14日提交的美国临时申请号62/350,
056和于2016年11月8日提交的美国临时申请号62/419,146的权益；其每一个公开内容以其
整体通过引用并入本文。
发明领域
日提交的美国临时申请号62/342,630、于2016年6月14日提交的美国临时申请号62/350,
056和于2016年11月8日提交的美国临时申请号62/419,146的权益；其每一个公开内容以其
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发明领域
[0003] 本公开包括用于靶向递送细胞因子和用于募集免疫细胞至靶细胞的组合物和方法。经过细胞因子和其他试剂的特异性递送，本文公开的组合物可以改进免疫疗法，并且在一些情况下限制与免疫疗法相关的副作用。
[0004] 发明背景高剂量白细胞介素2（IL2）的全身施用是免疫疗法最有效形式之一并且目前被FDA批准
用于治疗几种恶性肿瘤。该治疗的功效取决于活化细胞毒性淋巴细胞（CTL），例如天然杀伤细胞（NK）和CD8+ T淋巴细胞（CD8+ CTL）。临床试验已证实大约15％的部分或完全肿瘤反应，且高达5％的患者具有类似治愈的持久的长期反应。尽管在少数患者中有这些令人鼓舞的
结果，但由于诸如血压变化和肺或全身毛细血管渗漏的并发症，大多数患者不能获得益处
或过早地停止IL2治疗。认为IL2对血管内皮的直接作用导致大多数这些副作用。IL2的功效也受限于CD4+Foxp3+调节性T细胞（Tregs）的优先活化，其降低肿瘤免疫应答。由于这些原因，用高剂量IL2治疗在临床上已不再受到青睐。
用于治疗几种恶性肿瘤。该治疗的功效取决于活化细胞毒性淋巴细胞（CTL），例如天然杀伤细胞（NK）和CD8+ T淋巴细胞（CD8+ CTL）。临床试验已证实大约15％的部分或完全肿瘤反应，且高达5％的患者具有类似治愈的持久的长期反应。尽管在少数患者中有这些令人鼓舞的
结果，但由于诸如血压变化和肺或全身毛细血管渗漏的并发症，大多数患者不能获得益处
或过早地停止IL2治疗。认为IL2对血管内皮的直接作用导致大多数这些副作用。IL2的功效也受限于CD4+Foxp3+调节性T细胞（Tregs）的优先活化，其降低肿瘤免疫应答。由于这些原因，用高剂量IL2治疗在临床上已不再受到青睐。
[0005] 由于高亲和力三聚体αβγIL2受体（IL2R），其在基线时由血管内皮细胞和Tregs表达，因此发生IL2疗法的副作用和降低的功效。因此，CD4+Foxp3+Tregs和血管内皮在比NK细胞低得多的IL2剂量下被活化，NK细胞在静息时表达IL2R的较低亲和力βγ链。NK细胞在活化后确实表达IL2R的高亲和力α链，并且取决于该三聚体受体的峰溶细胞能力。已经描述了对IL2Rα具有降低的亲和力的IL2的突变形式，并提供了更有利的副作用概况。然而，由于CTL活化减少，它们还导致较低的功效和降低的治疗潜力。因此，本领域需要一种IL2形式，其可以优先结合并活化CTL而不活化Tregs和内皮细胞。这样的IL2衍生物可以克服这种临床障碍并导致更有效的免疫疗法且副作用更少。
[0007] 另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含NKG2D受体的配体和靶向分子。靶向分子将组合物导向靶细胞上的结合配偶体，并在配体特异性结合免疫细胞上的NKG2D受体
后募集免疫细胞。在一个实例中，配体是正痘病毒主要组织相容性复合物I类样蛋白
（OMCP）。靶向分子可以与配体连接或未连接，并与配体一起存在于单一组合物中，或者在分开的组合物中同时施用。
后募集免疫细胞。在一个实例中，配体是正痘病毒主要组织相容性复合物I类样蛋白
（OMCP）。靶向分子可以与配体连接或未连接，并与配体一起存在于单一组合物中，或者在分开的组合物中同时施用。
[0008] 在另一方面，本公开提供了将细胞因子递送至靶细胞的方法，其包括使靶细胞与包含与NKG2D配体连接的细胞因子的组合物接触。在仍另一个方面，本公开提供了活化免疫细胞的方法，其包括使免疫细胞与包含与NKG2D配体连接的促炎细胞因子的组合物接触。配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而活化细胞。
[0009] 在仍另一个方面，本公开提供了在特定靶细胞处募集和活化免疫细胞的方法，其包括提供包含NKG2D受体的配体和靶向分子的组合物。
[0010] 在仍又另一方面，本公开提供了治疗肿瘤的方法，其包括鉴定患有肿瘤的主体，并向主体施用治疗有效量的包含与NKG2D配体连接的促炎细胞因子的组合物。
[0011] 在不同的方面，本公开提供了治疗病毒感染的方法，其包括向主体施用治疗有效量的包含与NKG2D配体连接的促炎细胞因子的组合物。在其他方面，本公开提供了包含细胞因子肽和NKG2D配体肽的嵌合肽。
[0012] 在某些方面，本公开提供了包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。
[0013] 在另一方面，本公开提供了组合物，其包含与程序性细胞死亡蛋白1（PD1）配体连接的细胞因子。在一个具体的实施方案中，PD1配体是程序性细胞死亡配体1（PDL1）。在另一个具体的实施方案中，PD1配体是程序性细胞死亡配体2（PDL2）。
[0014] 在另一方面，本公开提供了将细胞因子递送至靶细胞的方法，其包括使靶细胞与包含与PD1配体连接的细胞因子的组合物接触。在仍另一方面，本公开提供了活化免疫细胞的方法，其包括使免疫细胞与包含与PD1配体连接的促炎细胞因子的组合物接触。配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而活化细胞。
[0015] 在仍又另一方面，本公开提供了治疗肿瘤的方法，其包括鉴定患有肿瘤的主体，并向主体施用治疗有效量的包含与PD1配体连接的促炎细胞因子的组合物。
[0016] 在不同的方面，本公开提供了治疗病毒感染的方法，其包括向主体施用治疗有效量的包含与PD1配体连接的促炎细胞因子的组合物。在其他方面，本公开提供了包含细胞因子肽和PD1配体肽的嵌合肽。
[0017] 在某些方面，本公开提供了包含细胞因子肽和抗PD1抗体的嵌合肽。
[0018] 在另一个不同方面，本公开提供了核酸分子，其包含编码本公开的嵌合肽的序列。
[0019] 在又另一个不同方面，本公开提供了包含本公开的嵌合肽的药物组合物。
[0020] 在仍又另一个不同方面，本公开提供了治疗诊断有癌症的主体的方法，其包括向主体施用本公开的药物组合物。
[0021] 另一方面是治疗肿瘤的方法，其通过（1）鉴定具有肿瘤的主体；和（2）向主体施用治疗有效量的本文所述的组合疗法。
[0022] 另一方面是治疗病毒感染的方法，其通过向主体施用治疗有效量的本文所述的组合疗法。
[0023] 在本文提供的各种方法的一些实施方案中，本公开的药物组合物与PD-1抑制剂组合施用。在某些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、
REGN2810、PDR001和MEDI0680。
REGN2810、PDR001和MEDI0680。
[0024] 在本文提供的各种方法的其他实施方案中，本公开的药物组合物与PD-L1抑制剂组合施用。在某些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是拮抗性抗体。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂选自度伐鲁单抗、阿维单抗、阿特朱单抗或BMS-936559、STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014和STI-A1015。
[0026] 图1A、图1B、图1C、图1D、图1E和图1F描绘了显示OMCP-mutIL2的产生和体外评价的图表、免疫印迹和图。（图1A）OMCP-mutIL2的图示结构。（图1B）与mutIL2和野生型IL2相比，OMCP-mutIL2的分子量。IL2、mutIL2和OMCP-mutIL2在哺乳动物细胞中产生，并且由于糖基化而具有更高的分子量。mutIL2的较低迁移带对应于未糖基化的蛋白质，这可能是由于产生细胞的裂解。基于分子量的差异，所有细胞因子和构建体以用如本文定义为1000 IU当量（IUe）的1 µl 4.4μM溶液的摩尔基础施用。这有效地允许IL2、mutIL2和OMCP-mutIL2之间的等摩尔比较，尽管分子量不同。（图1C，图1D）在100 IUe细胞因子或OMCP-mutIL2构建体中培养36小时后A/J淋巴细胞亚群的体外活化。（图1E，图1F）在1000 IUe/ml的细胞因子或OMCP-mutIL2构建体中培养5天后B6淋巴细胞亚群的增殖。图表代表每种条件3-6次重复。黑色=盐水；蓝色=wtIL2，红色=OMCP-mutIL2，绿色=mutIL2。
[0027] 图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G、图2H、图2I、图2J、图2K、图2L、图2M、图2N和图2O描绘了显示IL2和IL2构建体的体内给药的图和图像。施用wtIL2后的动物死亡率（图2A）和通过体重减轻（图2B）、腹水和胸膜液累积（代表性注射器-图2C；来自组中的所有小鼠的平均值-图2D）和（图2E）器官发炎评估的发病率。在抗AsialoGM1（实线）或兔IgG处理的（虚线）的A/J小鼠中施用高剂量wtIL2（图2F，图2G）、OMCP-mutIL2（图2H，图2I）和mutIL2（图
2J，图2K）后，动物死亡率（图2F，图2H，图2J）和通过体重减轻评估的发病率（图2G，图2I，图
2K）。用200,000 IUe的wtIL2、OMCP-mutIL2或mutIL2处理的小鼠中的体重减轻（图2L）、腹水（代表性注射器-图2M；组中所有小鼠的平均值-图2N）和器官炎症（图2O）。所有图表代表每种处理条件46只动物。ns p>.05; * p<.05; ** p<.01; *** p<.001；黑色=盐水；蓝色=
wtIL2，红色=OMCP-mutIL2，绿色=mutIL2。
2J，图2K）后，动物死亡率（图2F，图2H，图2J）和通过体重减轻评估的发病率（图2G，图2I，图
2K）。用200,000 IUe的wtIL2、OMCP-mutIL2或mutIL2处理的小鼠中的体重减轻（图2L）、腹水（代表性注射器-图2M；组中所有小鼠的平均值-图2N）和器官炎症（图2O）。所有图表代表每种处理条件46只动物。ns p>.05; * p<.05; ** p<.01; *** p<.001；黑色=盐水；蓝色=
wtIL2，红色=OMCP-mutIL2，绿色=mutIL2。
[0028] 图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图3I和图3J描绘了显示与体内IL2和IL2构建体施用相关的免疫学变化的图和图像。（图3A，图3B）在200,000 IUe的IL2（蓝色）、mutIL2（绿色）和OMCP-mutIL2（红色）的5天过程后的总脾细胞计数。（图3C）通过脾脏中的细胞计数（上图）和KLRG1上调（下图）测量的IL2、mutIL2、OMCP-mutIL2、高剂量IL2、高剂量mutIL2和IL2/抗IL2复合物后的NK细胞扩增和活化。（图3D）如通过脾脏中的细胞计数（上图）和ICOS上调（下图）以及（图3E）脾脏中的NK/Treg比率测量的CD4+Foxp3+Treg扩增和活化。用750,000 IUe的细胞因子或构建体处理的B6小鼠中的脾细胞（图3F，图3G）和NK细胞（图
3H）的扩增。B6小鼠脾脏中的Treg扩增和活化（图3I）以及NK:Treg比率（图3J）。所有图表代表每组5-10只小鼠的平均细胞计数±SEM。ns p>.05; * p<.05; ** p<.01; *** p<.001；黑
色=盐水；蓝色=wtIL2，红色=OMCP-mutIL2，绿色=mutIL2。
3H）的扩增。B6小鼠脾脏中的Treg扩增和活化（图3I）以及NK:Treg比率（图3J）。所有图表代表每组5-10只小鼠的平均细胞计数±SEM。ns p>.05; * p<.05; ** p<.01; *** p<.001；黑
色=盐水；蓝色=wtIL2，红色=OMCP-mutIL2，绿色=mutIL2。
[0029] 图4A、图4B、图4C、图4D和图4E描绘了显示细胞因子介导的肿瘤免疫疗法的图和图像。（图4A）静脉内注射后YAC-1淋巴瘤的体内细胞毒性。（图4B，图4C）在肿瘤注射后第5-10天以10个剂量给予的750,000 IUe细胞因子治疗的5天过程后的LLC肿瘤生长。在NK细胞耗尽的小鼠（图4D）或NKG2D缺乏的突变小鼠（图4E）中的LLC肿瘤生长。数据表示每组5-6只小鼠。ns p>.05; * p<.05; ** p<.01; *** p<.001；黑色=盐水；蓝色=wtIL2，红色=OMCP-
mutIL2，绿色=mutIL2。
mutIL2，绿色=mutIL2。
[0030] 图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I、图5J和图5K描绘了显示NK细胞中IL2信号传导的图和示意图。（图5A，图5B）i.v.注射1x106 IUe的荧光染料标记的细胞因子或构建体后的血清水平。（图5C）在细胞因子和五聚体OMCP介导的NKG2D交联存在的情况下NK细胞的脱粒，如通过以1000 IUe/ml的表面CD107a表达所测量的。通过增加细胞因子的剂量，来自A/J（图5D）或B6小鼠（图5E）的分离的NK细胞中的STAT5磷酸化。在通过1000 IUe/ml（图5F）或100 IUe/ml（图5G）的IL2或OMCP-mutIL2刺激15分钟后的STAT5磷酸化衰减。（图5H）提出的NK细胞和基质细胞之间竞争IL2的模型。（图5I）通过wtIL2和OMCP-mutIL2在其他脾细胞存在下的B5 NK细胞的STAT5磷酸化。（图5J）在竞争性脾细胞存在下，通过wtIL2和OMCP-mutIL2的野生型或NKG2D-/- NK细胞的STAT5磷酸化。（图5K）在用饱和浓度的大鼠抗小鼠CD25（克隆3C7）或大鼠IgG同种型对照处理的竞争性脾细胞存在下，如通过相对于盐水处理的对照的倍数变化所测量的野生型NK细胞的STAT5磷酸化。
[0031] 图6描绘了这样的图，其显示B6 NK细胞优先被低剂量OMCP-mutIL2活化，但是该选择性在最高剂量的细胞因子下或不存在由NK细胞的NKG2D表达时消失。左侧两个图显示B6
NK细胞，且右侧两个图显示BK NKG2D-/- NK细胞。
NK细胞，且右侧两个图显示BK NKG2D-/- NK细胞。
[0032] 图7A、图7B和图7C描绘了显示内脏的检查证实在200,000或750,000 IUe的wtIL2的5天过程后有限的食物消耗的图像。图7D描绘了显示与A/J品系不同，B6小鼠能够耐受更
高剂量的wtIL2且在750,000 IUe后仅具有适度的体重减轻的图。较高剂量的1,500,000
IUe IL2导致体重减轻增加。高于这种方案的剂量导致动物死亡。
高剂量的wtIL2且在750,000 IUe后仅具有适度的体重减轻的图。较高剂量的1,500,000
IUe IL2导致体重减轻增加。高于这种方案的剂量导致动物死亡。
[0033] 图8A描绘了显示用IL2/抗IL2抗体或高剂量mutIL2处理的A/J小鼠在治疗期间丧失显著重量的图。大多数IL2/抗IL2处理的小鼠在完全200,000 IUe给药后不能存活并且在
开始因此接受160,000-180,000 IUe的治疗后4天被处死。图8B描绘了显示在A/J脾中用
ULBP3-mutIL2和较低剂量的OMCP-mutIL2的NK扩增的图和流式细胞术图（上图）。NK活化，如通过在A/J脾脏中用200,000 IUe的mutIL2（绿色）或ULBP3-mutIL2（紫色）处理的NK细胞上的表面KLRG1表达所测量的（下图）。图8C和图8D描绘了这样的图，其显示与NK细胞的情况不同，在IL2、OMCP-mut-IL2或mutIL2处理的小鼠中，CD8+或CD4+ Foxp3- T细胞的很少扩增是明显的。图8E描绘了显示用高剂量mutIL2或IL2/抗IL2抗体复合物处理的B6小鼠的体重减轻
的图。图8F和图8G描绘了显示细胞因子处理的B6小鼠中CD8+或CD4+Foxp3- T细胞的扩增的
图。图表代表每组5-10只小鼠。
开始因此接受160,000-180,000 IUe的治疗后4天被处死。图8B描绘了显示在A/J脾中用
ULBP3-mutIL2和较低剂量的OMCP-mutIL2的NK扩增的图和流式细胞术图（上图）。NK活化，如通过在A/J脾脏中用200,000 IUe的mutIL2（绿色）或ULBP3-mutIL2（紫色）处理的NK细胞上的表面KLRG1表达所测量的（下图）。图8C和图8D描绘了这样的图，其显示与NK细胞的情况不同，在IL2、OMCP-mut-IL2或mutIL2处理的小鼠中，CD8+或CD4+ Foxp3- T细胞的很少扩增是明显的。图8E描绘了显示用高剂量mutIL2或IL2/抗IL2抗体复合物处理的B6小鼠的体重减轻
的图。图8F和图8G描绘了显示细胞因子处理的B6小鼠中CD8+或CD4+Foxp3- T细胞的扩增的
图。图表代表每组5-10只小鼠。
[0034] 图9A和图9B描绘了这样的图，其显示在经10次剂量给予的200,000 IUe细胞因子的5天过程后大量脾细胞对A/J肿瘤（例如LM2肺腺癌（图9A）或YAC-1淋巴瘤（图9B））的体外裂解。图9C显示以10次剂量经5天给予的750,000 IUe细胞因子或构建体处理的B6脾细胞对
LLC肺癌的体外裂解。
LLC肺癌的体外裂解。
[0035] 图10A描绘了流式细胞术图，其显示平板结合的抗NKG2D抗体（克隆A10）介导的NK脱粒增强，其中细胞因子以1000IUe/ml添加。图10B描绘了显示在100 IUe/ml OMCP-mut-
IL2或具有五聚体OMCP的mutIL2下培养的NK细胞上的CD69水平的流式细胞术图。
IL2或具有五聚体OMCP的mutIL2下培养的NK细胞上的CD69水平的流式细胞术图。
[0036] 图11A、图11B和图11C描绘了体内差异IL2结合和活化的示意图。（图11A）常规野生型IL2优先结合细胞，例如CD4+Foxp3+Tregs和血管内皮，这两者均表达IL2受体的高亲和力α链以及信号传导β和γ链。（图11B）IL2中的R38A和F42K突变降低了对IL2受体α链的亲和力。（图11C）通过将R38A/F42K IL2与高亲和力NKG2D配体OMCP连接，该细胞因子递送并结合至表达NKG2D的CTL（例如NK细胞和活化的CD8+ T细胞）增加。箭头宽度表示提出的IL2结合和/或信号传导强度。
[0037] 图12描绘了免疫疗法实验的实验设计的示意图。
[0038] 图13描绘了接种实验的实验设计的示意图。
[0039] 图14A和图14B描绘了显示小鼠的肺癌易感和抗性品系的图。（图14A）如肿瘤负荷所证明的，AJ和129小鼠品系对肺癌敏感，而B6和C3H小鼠品系对肺癌具有抗性，如肿瘤负荷所证明。（图14B）与来自各种小鼠品系的新鲜分离的NK细胞一起孵育时，B6和C3H NK细胞比AJ和129 NK细胞产生显著更多的LM2肺癌细胞裂解。
[0040] 图15描绘了显示在人类男性中，相对于“易感”患者，更大百分比的NK细胞似乎在“抗性”患者中产生TNFα的图。
[0041] 图16描绘了显示离体(ex vivo)细胞因子活化可逆转天然杀伤细胞功能障碍的图。当用IL2处理时，未显示癌细胞显著裂解的小鼠NK细胞（来自129和AJ品系的NK细胞）在裂解方面有效的多。来自抗癌品系的NK细胞也显示出特异性裂解的百分比增加。
[0042] 图17A、图17B、图17C、图17D、图17E和图17F描绘了显示在大量脾细胞中在37度下体外测试的荧光标记的构建体的结合的图。该构建体似乎仅结合NK细胞（表达NKG2D）。红线是OMCP-IL2构建体。（图17A）DX5+CD3- NK细胞；（图17B）CD4+CD3+ T细胞；（图17C）CD8+CD3+ T细胞；（图17D）CD11C+CD11b- DCs；（图17E）CD11c-CD11b+ Macs；（图17F）CD19+CD3- B细胞。
[0043] 图18描绘了IL2或IL2构建体的示意性给药方案。
[0044] 图19描绘了辐照后IL2或IL2构建体的示意性给药方案。
[0045] 图20A、图20B和图20C描绘了OMCP结构的图像和比对。（图20A）CPXV OMCP的带状图。示出二级结构要素，S代表β链，且H代表螺旋。平台结构域的α1/α2部分分别以青色和品红色表示。（图20B）MICA（PDB标识符1HYR）的α1/α2结构域的带状图，且为清楚起见移除了α3结构域。与NKG2D接触的残基显示为黄色。（图20C）OMCP与NKG2DLs的结构比对。将OMCPBR（CPXV-BR-018；GenBank登录号NP_619807；PDB标识符4FFE）和OMCPMP（X MPXV-ZAR_1979_005-
198；N3R；GenBank登录号AAY97396）的成熟序列与MICA（1HYR）、MICB（1JE6）、ULBP3（1KCG）和RAE-1β（1JFM）的胞外域序列比对。NKG2DL的已知NKG2D接触残基以黄色表示。通过图C中的黑框和图A和B中的黑色侧链示出可能被糖基化的Asn残基。OMCPbr=SEQ ID NO:13;
OMCPmpx=SEQ ID NO:14; MICA=SEQ ID NO:15; MICB=SEQ ID NO:16; ULBP3=SEQ ID NO:
17; 和RAE-1B=SEQ ID NO:18。
198；N3R；GenBank登录号AAY97396）的成熟序列与MICA（1HYR）、MICB（1JE6）、ULBP3（1KCG）和RAE-1β（1JFM）的胞外域序列比对。NKG2DL的已知NKG2D接触残基以黄色表示。通过图C中的黑框和图A和B中的黑色侧链示出可能被糖基化的Asn残基。OMCPbr=SEQ ID NO:13;
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[0046] 图21描绘了显示IL15的OMCP靶向递送的图。相比于等摩尔剂量的单独的裸露细胞因子(naked cytokine)，当通过OMCP递送IL15时，明显CD25的水平更高。
[0047] 图22描绘了显示OMCP中的D132R突变显著降低其NKG2D结合的图。测试了在mutIL2、OMCP-mutIL2和D132ROMCP-mutIL2存在下的NK扩增和活化。D132R突变改善了天然
杀伤细胞活化相对于单独细胞因子的优势。
杀伤细胞活化相对于单独细胞因子的优势。
[0048] 图23描绘了本发明的各种实施方案。1.描绘了与细胞因子连接的OMCP螺旋2。2.描述了组合物的聚乙二醇化。3.描绘了包含工程化聚糖的组合物。4.描述了各种接头长度和
组成。5.描绘了与细胞因子连接的抗体。例如Fab特异性NKG2D抗体。6.描绘了与细胞因子连接的NKG2DL。例如，MIC或ULBP。7描绘了与细胞因子连接的可选OMCP。例如，OMCP max可代表NKG2D结合的功能获得，而突变体OMCP可代表NKG2D结合的功能丧失。8.描绘了组合物中
OMCP的重新靶向。例如，OMCP可以针对NKG2A、NKG2C、NKG2E等。9.描绘了与细胞因子连接的其他病毒蛋白。例如，其他病毒蛋白也可以与免疫细胞上的受体结合。10.描绘了与突变细胞因子连接的OMCP。应理解，OMCP序列可来自各种来源，例如牛痘或猴痘。此外，可以使用OMCP和IL2的Fc嵌合体及其变体。
组成。5.描绘了与细胞因子连接的抗体。例如Fab特异性NKG2D抗体。6.描绘了与细胞因子连接的NKG2DL。例如，MIC或ULBP。7描绘了与细胞因子连接的可选OMCP。例如，OMCP max可代表NKG2D结合的功能获得，而突变体OMCP可代表NKG2D结合的功能丧失。8.描绘了组合物中
OMCP的重新靶向。例如，OMCP可以针对NKG2A、NKG2C、NKG2E等。9.描绘了与细胞因子连接的其他病毒蛋白。例如，其他病毒蛋白也可以与免疫细胞上的受体结合。10.描绘了与突变细胞因子连接的OMCP。应理解，OMCP序列可来自各种来源，例如牛痘或猴痘。此外，可以使用OMCP和IL2的Fc嵌合体及其变体。
[0049] 图24A和图24B描绘了与NKG2D复合的OMCP的结构。（图24A）与NKG2D结合的OMCP。A
OMCP以品红色着色，且NKG2D的启动子以青色（“A”）和黄色（“B”）着色。NKG2D主要与H2a螺旋接触，而NKG2DB与H2b接触。为促进交替晶体包装而引入的突变以红色显示。S193-S194键在每个NKG2D启动子上显示为球。推定的hNKG2D糖基化位点的天冬酰胺以橙色显示。OMCP的确认的N-聚糖位点的天冬酰胺显示为绿色（数据未显示）（图24B）OMCP-NKG2D之间界面的视图。OMCP的α2域显示在前面，且α1结构域显示在后面。显示OMCP和NKG2D，且卡通表示主链，接触残基的侧链显示为棒。氢键和盐桥用绿色虚线表示。
OMCP以品红色着色，且NKG2D的启动子以青色（“A”）和黄色（“B”）着色。NKG2D主要与H2a螺旋接触，而NKG2DB与H2b接触。为促进交替晶体包装而引入的突变以红色显示。S193-S194键在每个NKG2D启动子上显示为球。推定的hNKG2D糖基化位点的天冬酰胺以橙色显示。OMCP的确认的N-聚糖位点的天冬酰胺显示为绿色（数据未显示）（图24B）OMCP-NKG2D之间界面的视图。OMCP的α2域显示在前面，且α1结构域显示在后面。显示OMCP和NKG2D，且卡通表示主链，接触残基的侧链显示为棒。氢键和盐桥用绿色虚线表示。
[0050] 图25A、图25B和图25C描绘了OMCP和NKG2D的界面。（图25A）围绕D132R残基的OMCP-NKG2D结合界面的局部环境。D132R突变消除OMCP-NKG2D结合。（图25B）通过SPR的WT和（D132R）OMCP与NKG2D结合的代表性实验。在含有固定的生物素化的鼠NKG2D的流动池上以
50μl/min注射100nM的OMCP或（D132R）OMCP。（图25C）用OMCP四聚体（实线）、D132R四聚体（虚线）或WNV DIII四聚体对照（灰色直方图）染色用NKG2D、FCRL5或空载体转导的Ba/F3细胞。
三个独立实验的代表性结果。
50μl/min注射100nM的OMCP或（D132R）OMCP。（图25C）用OMCP四聚体（实线）、D132R四聚体（虚线）或WNV DIII四聚体对照（灰色直方图）染色用NKG2D、FCRL5或空载体转导的Ba/F3细胞。
三个独立实验的代表性结果。
[0051] 图26A、图26B、图26C和图26D描绘了人和鼠NKG2D的β5'-β5环（L2）中的差异。（图26A，图26B）mNKG2D（灰色）（PDBID：1HQ8）与OMCP-hNKG2D（黄色和青色）的结构的叠加。核心结合残基Y152（Y168）和Y199（Y215）是位置保守的，而核心结合残基M184（I200）不是。（图
26C）与β5'-β5环相互作用的OMCP（品红色）的表面表示。（图26D）M184和Q185的保守性。只有小鼠、大鼠、豚鼠和飞狐的NKG2D不同（未显示）。保护分数如由ConSurf服务器计算。人、猩猩、黑猩猩、长臂猿、猕猴-SEQ ID NO:19；绿猴-SEQ ID NO:20；狨猴-SEQ ID NO:21；小鼠-SEQ ID NO:22；大鼠-SEQ ID NO:23；豚鼠-SEQ ID NO:24；地松鼠-SEQ ID NO:25；鹿鼠-SEQ ID NO:26；裸鼹鼠-SEQ ID NO:27；草原田鼠-SEQ ID NO:28；欧洲鼩鼱-SEQ ID NO:29；星鼻鼹鼠-SEQ ID NO:30；中国仓鼠-SEQ ID NO:31；猫-SEQ ID NO:32。
26C）与β5'-β5环相互作用的OMCP（品红色）的表面表示。（图26D）M184和Q185的保守性。只有小鼠、大鼠、豚鼠和飞狐的NKG2D不同（未显示）。保护分数如由ConSurf服务器计算。人、猩猩、黑猩猩、长臂猿、猕猴-SEQ ID NO:19；绿猴-SEQ ID NO:20；狨猴-SEQ ID NO:21；小鼠-SEQ ID NO:22；大鼠-SEQ ID NO:23；豚鼠-SEQ ID NO:24；地松鼠-SEQ ID NO:25；鹿鼠-SEQ ID NO:26；裸鼹鼠-SEQ ID NO:27；草原田鼠-SEQ ID NO:28；欧洲鼩鼱-SEQ ID NO:29；星鼻鼹鼠-SEQ ID NO:30；中国仓鼠-SEQ ID NO:31；猫-SEQ ID NO:32。
[0052] 图27A、图27B、图27C、图27D、图27E、图27F、图27G、图27H和图27I描绘了新的NKG2D结合适应。NKG2D的表面表示以及OMCP、MICA和ULBP3的表面和卡通表示。NKG2DA和NKG2DB的埋藏表面区域分别以青色和黄色表示。显示了OMCP（品红色）、MICA（绿色）和ULBP3（橙色）的由NKG2D的埋藏表面区域。显示了NKG2D的核心结合残基和NKG2DL的NKG2D结合元件。NKG2D（图27A）和OMCP（图27B，图27C）结合相互作用。NKG2D（图27D）和MICA（图27E，图27F）结合相互作用。NKG2D（图27G）和ULBP3（图27H，图27I）结合相互作用。（图27J）通过NKG2DL的二级结构比对（PDBID：OMCP（4FFE）、MICA（1HYR）、MICB（1JE6）、ULBP3（1KCG）和RAE-1β（1JSK））。显示了OMCP（品红色）、MICA（绿色）、ULBP3（橙色）和RAE-1β（粗体和斜体）的接触残基。二级结构元素在序列上方注明（箭头指示β折叠，圆柱体指示α螺旋）。预测的聚糖位点以黑色突出显示。OMCPbr=SEQ ID NO:13; OMCPmpx=SEQ ID NO:14; MICA=SEQ ID NO:15; MICB=SEQ ID
NO:16; ULBP3=SEQ ID NO:17；和RAE-1B=SEQ ID NO:18。
NO:16; ULBP3=SEQ ID NO:17；和RAE-1B=SEQ ID NO:18。
[0053] 图28A、图28B、图28C、图28D和图28E描绘了由细胞缔合的OMCP对NK细胞的活化。描绘NKG2D与（图28A）宿主、（图28B）癌症诱导的、（图28C）病毒或（图28D）嵌合配体相互作用的模型。DAP10酪氨酸磷酸化（红色实心圆）显示导致NKG2D介导的信号传导的结合相互作用。（图28E）IL2活化的脾细胞用作针对稳定转导的Ba/F3细胞系的细胞毒性效应物。用200 U/ml的IL2活化脾细胞24小时。将标记的靶细胞与活化的脾细胞以10:1、20:1和40:1的效应
物：靶标比例共孵育4小时。通过使用流式细胞术通过CFSE标记的靶细胞掺入7AAD来测量杀伤。显示了来自五个独立实验的代表性数据。
物：靶标比例共孵育4小时。通过使用流式细胞术通过CFSE标记的靶细胞掺入7AAD来测量杀伤。显示了来自五个独立实验的代表性数据。
[0054] 图29A和图29B描绘了支持顺式肽构象的电子密度。hNKG2D的β5-β6环的立体视图。显示OMCP-hNKG2D结构（黄色）和单独的hNKG2D结构（灰色）的残基193-Ala-Ser-Ser-Phe-Lys-197 (SEQ ID NO:33)。OMCP-hNKG2D的2Fo-Fc图以2σ显示。
[0055] 图30A和图30B描绘了显示西尼罗河病毒（WNV）感染后的C57BI/6J小鼠的生存曲线的图。用WNV感染后，用OMCP-IL2、OMCP(D132R)-IL2、IL2、IL(38R/42A)或PBS处理小鼠。与用PBS或OMCP(D132R)-IL2处理后的0只小鼠相比，OMCP-IL2和IL2(38R/42A)的感染导致40％
的小鼠存活超过21天。
的小鼠存活超过21天。
[0056] 图31A、图31B、图31C和图31D描绘了流式细胞术数据，其显示OMCP-突变体IL2活化NK和CD8+ T细胞。图31A显示在OMCP突变体IL2组中相对较高比例的NK细胞是明显的。图31B显示与盐水（黑色）、IL2（蓝色）或突变体IL2（绿色）处理的相比，OMCP-突变体IL2处理的NK细胞（红色）中的穿孔素水平更高。图31C显示与NK细胞相似，与其他条件相比，用OMCP-突变体IL2处理的CD8+ T细胞中穿孔素的更高细胞内水平是明显的。图31D显示当在CD4+Foxp3+CD45RA- T 细胞上进行门控时，与其他条件相比，在IL2处理的外周血淋巴细胞培养物中相对较高比例的活化的CD25+CD127-调节性T细胞是明显的。
[0057] 图32描绘了各种IL18-OMCP构建体的示意图。制备三个版本，每个都具有与WT人IL-18、WT鼠IL-18或突变体人IL-18（其抑制其与IL-18BP的相互作用）连接的OMCP。
[0058] 图33描绘了显示IL18-OMCP活化NK细胞的流式细胞术图。将外周血淋巴细胞在4.4μM野生型IL18（蓝色）、OMCP-IL18（红色）或盐水（黑色）中培养48小时。如通过表面CD69表达测量的，相比于野生型IL18，通过OMCP-IL18的CD56+CD3-天然杀伤细胞的活化是优异的。
[0059] 图34描绘了用同种型抗体、抗PD-1抗体、OMCP-IL2和同种型抗体以及抗PD-1抗体和OMCP处理的小鼠群组的肺。
[0060] 图35显示了如从图34的小鼠群组的肺测量的肺重量。
[0061] 图36描绘了本发明的各种实施方案。1.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的全长PDL1或PDL2。2.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2衍生肽。
3.描绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述组合物是聚乙二醇化的。
4.描绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述组合物包含N-聚糖。5.描
绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述接头包括各种序列和各种长
度。6.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的PD1的Fab特异性抗体。7.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的各种PD1配体，包括PDL1或PDL2的突变形式。PDL1或PDL2可以突变以具有改善的结合亲和力或较弱的结合亲和力。8.描绘了包含与突变的细胞因子连
接的PDL1或PDL2的组合物。应理解，PDL1和PDL2序列可来自各种来源，例如人、小鼠或猴。此外，可以使用PDL1或PDL2和IL2的Fc嵌合体及其变体。
3.描绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述组合物是聚乙二醇化的。
4.描绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述组合物包含N-聚糖。5.描
绘了包含与细胞因子连接的PDL1或PDL2的组合物，其中所述接头包括各种序列和各种长
度。6.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的PD1的Fab特异性抗体。7.描绘了一种组合物，其包含与细胞因子连接的各种PD1配体，包括PDL1或PDL2的突变形式。PDL1或PDL2可以突变以具有改善的结合亲和力或较弱的结合亲和力。8.描绘了包含与突变的细胞因子连
接的PDL1或PDL2的组合物。应理解，PDL1和PDL2序列可来自各种来源，例如人、小鼠或猴。此外，可以使用PDL1或PDL2和IL2的Fc嵌合体及其变体。
[0062] 图37A、图37B、图37C、图37D和图37E描绘了显示用野生型IL-2（蓝色）或OMCP-mutIL-2（红色）体外扩增后的NK细胞生理学的图。图37A描绘了NK细胞的扩增。图37B描绘了NK细胞上的PD1表达。图37C描绘了NK细胞增殖。图37C描绘了NK细胞的生存力。图37E描绘了NK细胞上Tim3和Lag3表达的流式细胞术图。
[0063] 图38A、图38B、图38C、图38D和图38E描绘了显示用野生型IL-2（蓝色）或OMCP-mutIL-2（红色）体外扩增后的T细胞生理学的图。图38A描绘了T细胞的扩增。图38B描绘了T细胞上的PD1表达。图38C描绘了T细胞增殖。图38C描绘了T细胞的生存力。图38E描绘了T细胞上Tim3和Lag3表达的流式细胞术图。
[0064] 图39A、图39B、图39C和图39D描绘了显示抗NKG2D抗体介导的R38A/F42K突变体IL-2递送的图。在10U/ml时，OMCP-突变体IL-2表现出相对于抗体介导的递送增加的穿孔素水
平的趋势，但是它没有达到统计学显著性（图39A）。在100U/ml时，用2HL2和2LH2抗体处理的NK细胞合成与OMCP-mutIL-2处理的细胞一样多的穿孔素，但在1HL2和1LH2处理的NK细胞中
较低水平的穿孔素是明显的（图39B）。对于所有构建体，野生型IL-2处理的培养物中较高水平的CD25是明显的（图39C，图39D）。数据代表4-7个独立实验。*=p<0.05且ns=p>0.05。
平的趋势，但是它没有达到统计学显著性（图39A）。在100U/ml时，用2HL2和2LH2抗体处理的NK细胞合成与OMCP-mutIL-2处理的细胞一样多的穿孔素，但在1HL2和1LH2处理的NK细胞中
较低水平的穿孔素是明显的（图39B）。对于所有构建体，野生型IL-2处理的培养物中较高水平的CD25是明显的（图39C，图39D）。数据代表4-7个独立实验。*=p<0.05且ns=p>0.05。
[0065] 发明详述本文所述的某些组合物和方法提供通过NKG2D配体将细胞因子递送至确定的细胞。细
胞因子与特异性结合靶细胞上的NKG2D受体的NKG2D配体的融合产生了递送细胞因子的“地
址”。具体地，使用本文公开的发明，IL2通过抗NKG2D抗体直接靶向淋巴细胞，例如天然杀伤（NK）细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。然而，其他NKG2D配体，包括但不限于OMCP配体、ULBP1、ULBP2、ULBP3、H60、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、Rae-1γ、MICA、MICB、h-HLA-A，也可以用来代替抗NKG2D抗体。将IL2特异性递送至淋巴细胞将增强IL2的功效，这可导致剂量减少和相关毒性的显著降低。该方法可用于其他细胞因子，包括但不限于IL15，IL18，干扰素和肿瘤坏死家族成员，包括但不限于TNF-α、OX40L、4-1BB配体、TRAIL、Fas配体、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、CD30L、CD40L、CD27L和RANKL。
胞因子与特异性结合靶细胞上的NKG2D受体的NKG2D配体的融合产生了递送细胞因子的“地
址”。具体地，使用本文公开的发明，IL2通过抗NKG2D抗体直接靶向淋巴细胞，例如天然杀伤（NK）细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。然而，其他NKG2D配体，包括但不限于OMCP配体、ULBP1、ULBP2、ULBP3、H60、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、Rae-1γ、MICA、MICB、h-HLA-A，也可以用来代替抗NKG2D抗体。将IL2特异性递送至淋巴细胞将增强IL2的功效，这可导致剂量减少和相关毒性的显著降低。该方法可用于其他细胞因子，包括但不限于IL15，IL18，干扰素和肿瘤坏死家族成员，包括但不限于TNF-α、OX40L、4-1BB配体、TRAIL、Fas配体、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、CD30L、CD40L、CD27L和RANKL。
[0066] 本文所述的其他组合物和方法通过配体与NKG2D受体和靶向分子的组合提供NK细胞和CTL的活化和对特定细胞或组织的募集。具体地，在某些方面，使用本文公开的发明，NK细胞和CTL通过包含OMCP配体或其部分和靶向分子的组合物募集到靶细胞。靶向分子允许
NK细胞和CTL募集到特定靶细胞，其中OMCP配体或其部分提供NK细胞和CTL的募集，并且在
一些情况下提供活化，导致位点特异性应答。靶向分子可包括能够结合对处于疾病状态的
细胞或患病细胞周围的细胞外基质特异性的靶标的任何分子，包括但不限于受体配体和抗
体。以下详细描述本发明的具体方面。
NK细胞和CTL募集到特定靶细胞，其中OMCP配体或其部分提供NK细胞和CTL的募集，并且在
一些情况下提供活化，导致位点特异性应答。靶向分子可包括能够结合对处于疾病状态的
细胞或患病细胞周围的细胞外基质特异性的靶标的任何分子，包括但不限于受体配体和抗
体。以下详细描述本发明的具体方面。
[0067] I.组合物在一方面，本发明包括含有与免疫细胞表面蛋白靶向配体连接的细胞因子的组合物。
在一个具体方面，细胞因子与NKG2D配体连接。在另一方面，细胞因子与靶向PD1表面蛋白的配体连接。组合物可进一步包含将细胞因子连接至配体的接头。细胞因子、配体和接头在下面更详细地描述。应当理解，下文详细描述的任何细胞因子可以在下文所述的任何接头不
存在或存在下与下文详述的任何配体连接。在另一方面，本发明提供了编码细胞因子、配体和任选接头的核酸分子。
在一个具体方面，细胞因子与NKG2D配体连接。在另一方面，细胞因子与靶向PD1表面蛋白的配体连接。组合物可进一步包含将细胞因子连接至配体的接头。细胞因子、配体和接头在下面更详细地描述。应当理解，下文详细描述的任何细胞因子可以在下文所述的任何接头不
存在或存在下与下文详述的任何配体连接。在另一方面，本发明提供了编码细胞因子、配体和任选接头的核酸分子。
[0068] (a) 细胞因子如本文所用，“细胞因子”是在细胞信号传导中重要的小蛋白（ 5-20kDa）。细胞因子被
~
细胞释放并影响其他细胞和/或释放细胞因子的细胞的行为。细胞因子的非限制性实例包
括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子可由多种细胞产生，其包括但不限于免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞，内皮细胞，成纤维细胞和基质细胞。细胞因子可以由一种类型以上的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用，在免疫系统中尤为重要，调节体液和基于细胞的免疫反应之间的平衡，并调节细胞群的成熟、生长和反应。细胞因子在宿主对感染、免疫反应、炎症、创伤、败血症、癌症和繁殖的反应中是重要的。本发明的细胞因子可以是天然存在的细胞因子，或者可以是天然存在的细胞因子的突变形式。如本文所用，“天然存在的”，也可以称为野生型，包括等位基因变异。天然存在的细胞因子的突变形式或“突变体”是指对天然存在的序列进行的特定突变，以改变细胞因子的功能、活性和/或特异性。在一个实施方案中，突变可以增强细胞因子的功能、活性和/或特异性。在另一个实施方案中，突变可以降低细胞因子的功能、活性和/或特异性。突变可包括细胞因子的一个或多个氨基酸残基的缺失或添加。
~
细胞释放并影响其他细胞和/或释放细胞因子的细胞的行为。细胞因子的非限制性实例包
括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子可由多种细胞产生，其包括但不限于免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞，内皮细胞，成纤维细胞和基质细胞。细胞因子可以由一种类型以上的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用，在免疫系统中尤为重要，调节体液和基于细胞的免疫反应之间的平衡，并调节细胞群的成熟、生长和反应。细胞因子在宿主对感染、免疫反应、炎症、创伤、败血症、癌症和繁殖的反应中是重要的。本发明的细胞因子可以是天然存在的细胞因子，或者可以是天然存在的细胞因子的突变形式。如本文所用，“天然存在的”，也可以称为野生型，包括等位基因变异。天然存在的细胞因子的突变形式或“突变体”是指对天然存在的序列进行的特定突变，以改变细胞因子的功能、活性和/或特异性。在一个实施方案中，突变可以增强细胞因子的功能、活性和/或特异性。在另一个实施方案中，突变可以降低细胞因子的功能、活性和/或特异性。突变可包括细胞因子的一个或多个氨基酸残基的缺失或添加。
[0069] 细胞因子可以基于结构分类。例如，细胞因子可分为四种类型：四-α-螺旋束家族、IL1家族、IL17家族和半胱氨酸结细胞因子。四-α-螺旋束家族的成员具有具有四束α-螺旋的三维结构。该家族进一步分为三个亚家族：IL2亚家族、干扰素（IFN）亚家族和IL10亚家族。IL2亚家族是最大的并且包含几种非免疫细胞因子，包括但不限于促红细胞生成素（EPO）和促血小板生成素（TPO）。在某些实施方案中，组合物的细胞因子是来自四-α-螺旋束家族的细胞因子或其突变体。技术人员将能够确定四-α-螺旋束家族内的细胞因子。在其他实施方案中，组合物的细胞因子是IL2亚家族细胞因子或其突变体。IL2亚家族成员的非限
制性实例包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2或其突变体。在某些实施方案中，组合物的细胞因子是IL15或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46777.1、AAI00962.1或AAI00963.1找到全长人IL15氨基酸序列的序
列信息。可以使用例如GenBank登录号CR542007.1、KJ891469.1、NM_172175.2、NM_000585.4或CR541980.1找到全长人IL15 mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，IL15可以在多种物种中发现，并且鉴定IL15的类似物或同源物的方法是本领域已知的，如下文详细描述的。
制性实例包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2或其突变体。在某些实施方案中，组合物的细胞因子是IL15或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46777.1、AAI00962.1或AAI00963.1找到全长人IL15氨基酸序列的序
列信息。可以使用例如GenBank登录号CR542007.1、KJ891469.1、NM_172175.2、NM_000585.4或CR541980.1找到全长人IL15 mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，IL15可以在多种物种中发现，并且鉴定IL15的类似物或同源物的方法是本领域已知的，如下文详细描述的。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明的细胞因子是IL1家族细胞因子或其突变体。IL1家族是一组11种细胞因子，其在免疫和炎症反应的调节中起重要作用。通常，IL1细胞因子家族是调节和引发炎症反应的促炎细胞因子。IL1家族细胞因子的非限制性实例包括IL1α、
IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。IL1家族成员具有相似的基因结构。技术人员将能够确定IL1家族内的细胞因子。在某些实施方案中，组合物的细胞因子是IL18或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46771.1找到全长人IL18氨基
酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号KR710147.1、CR542001.1、CR541973.1或KJ897054.1找到全长人IL18 mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，IL18可以在多种物种中发现，并且鉴定IL18的类似物或同源物的方法是本领域已知的，如下文详细描述的。
IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。IL1家族成员具有相似的基因结构。技术人员将能够确定IL1家族内的细胞因子。在某些实施方案中，组合物的细胞因子是IL18或其突变体。可以使用例如GenBank登录号CAG46771.1找到全长人IL18氨基
酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号KR710147.1、CR542001.1、CR541973.1或KJ897054.1找到全长人IL18 mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，IL18可以在多种物种中发现，并且鉴定IL18的类似物或同源物的方法是本领域已知的，如下文详细描述的。
[0071] 在其他实施方案中，组合物的细胞因子是干扰素亚家族细胞因子或其突变体。干扰素因其通过保护细胞免受病毒感染来“干扰”病毒复制的能力而得名。IFN还具有其他功能：它们活化免疫细胞，例如天然杀伤细胞和巨噬细胞；它们借助于增加主要组织相容性复合物（MHC）抗原的表达通过上调抗原呈递来增加宿主防御。基于它们信号传导所经的受体类型，人干扰素已被分为三种主要类型：I型IFN、II型IFN和III型IFN。I型IFN结合称为IFN-α/β受体（IFNAR）的特异性细胞表面受体复合物，其由IFNAR1和IFNAR2链组成。存在于人中的I型干扰素的非限制性实例是IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω。因此，在某些实施方案中，组合物的细胞因子是1型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω的野生型和突变形式。II型IFN结合由IFNGR1和IFNGR2链组成的IFNGR。存在于人中的II型干扰素的非限制性实例是IFN-γ。因此，在某些实施方案中，组合物的细胞因子是II型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-γ的野生型和突变形式。III型IFN通过由IL10R2（也称为CRF2-4）和IFNLR1（也称为CRF2-12）组成的受体复合物进行信号传导。III型干扰素的非限制性实例包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3（也分别称为IL29、IL28A和IL28B）。因此，在某些实施方案中，组合物的细胞因子是III型IFN细胞因子或其突变体，包括但不限于IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的野生型和突变形式。
[0072] 在其他实施方案中，组合物的细胞因子是肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的成员或其突变体。TNFSF成员是主要由免疫细胞表达的促炎细胞因子，其诱导炎症状态并刺激免疫细胞功能。存在至少18种TNFSF同源物，包括但不限于TNF（TNFα）、CD40L（TNFSF5）、CD70（TNFSF7；CD27L）、EDA、FASL（TNFSF6；Fas配体）、LTA（TNFSF1；淋巴毒素-α）、LTB（TNFSF3；淋巴毒素-β）、TNFSF4（OX40L）、TNFSF8（CD153）、TNFSF9（4-1BBL）、TNFSF10（TRAIL）、TNFSF11（RANKL；核因子κ-B配体的受体活化物）、TNFSF12（TWEAK）、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。因此，在某些实施方案中，组合物的细胞因子是肿瘤坏死因子超家族的成员或其突变体，包括但不限于TNF（TNFα）、CD40L（TNFSF5）、CD70（TNFSF7；CD27L）、EDA、FASL（TNFSF6）、LTA（TNFSF1）、LTB（TNFSF3）、TNFSF4（OX40L）、TNFSF8（CD153）、TNFSF9（4-
1BBL）、TNFSF10（TRAIL）、TNFSF11（RANKL）、TNFSF12（TWEAK）、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。
1BBL）、TNFSF10（TRAIL）、TNFSF11（RANKL）、TNFSF12（TWEAK）、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。
[0073] 在某些实施方案中，组合物的细胞因子是OX40L、其片段或其突变体。可以使用例如GenBank登录号XP_016857719.1、XP_016857718.1、XP_016857717.1、XP_011508266.2、NP_001284491.1、NP_003317.1、CAG46830.1找到全长人OX40L氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号XR_001737396.1、XR_001737395.1、XR_001737394.1、XR_
001737393.1、XM_017002230.1、XM_017002229.1、XM_017002228.1、XM_011509964.2、NM_
001297562.1、NM_003326.4找到全长人OX40L mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，
OX40L可以在多种物种中发现，并且鉴定OX40L的类似物或同源物的方法是本领域已知的，
如下文详细描述的。
001737393.1、XM_017002230.1、XM_017002229.1、XM_017002228.1、XM_011509964.2、NM_
001297562.1、NM_003326.4找到全长人OX40L mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，
OX40L可以在多种物种中发现，并且鉴定OX40L的类似物或同源物的方法是本领域已知的，
如下文详细描述的。
[0074] 技术人员将理解，OX40L可存在于多种物种中。非限制性实例包括小鼠（NP_033478.1）、猪（NP_001020388.1）、牛（NP_001192644.1）、大鼠（NP_446004.1）、兔（NP_
001075454.1）、山羊（XP_013825644.1）、绵羊（XP_012042680.1）、鸡（XP_430147.2）、仓鼠（XP_007610839.1）和狗（XP_003639215.1）。应理解，本发明涉及OX40L在其他生物中的类似物，并且不限于人类似物。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。具体地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个
多肽或两个核酸序列的“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol.
215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如
Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与OX40L至少90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
001075454.1）、山羊（XP_013825644.1）、绵羊（XP_012042680.1）、鸡（XP_430147.2）、仓鼠（XP_007610839.1）和狗（XP_003639215.1）。应理解，本发明涉及OX40L在其他生物中的类似物，并且不限于人类似物。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。具体地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个
多肽或两个核酸序列的“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol.
215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如
Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与OX40L至少90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
[0075] 在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是OX40L的野生型序列。在一个具体实施方案中，细胞因子可含有野生型OX40L片段，例如SEQ ID NO:57
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片
段连接成连续肽。在一个具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的OX40L片段，例如
中所示的序列。在一个可选的实施方案中，组合物的细胞因子是OX40L
的突变序列。在一个实施方案中，突变是导致OX40L结合但抑制肿瘤坏死因子受体超家族成员4（TNFRSF4，也称为OX40，也称为CD134）的信号传导的突变。例如，相对于SEQ ID NO:56中的全长OX40L序列，突变可以是选自N166A和F180A的一个或多个突变。在一个具体实施方案中，相对于SEQ ID NO:56中的全长OX40L序列，突变形式的OX40L包含至少一个选自N166A和F180A的突变。在一个具体实施方案中，细胞因子可含有突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片
段连接成连续肽。在一个具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的突变的和未
突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。在另一个具体的实施方案中，细胞因子可以是通过接
头肽连接的突变的和未突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片
段连接成连续肽。在一个具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的OX40L片段，例如
中所示的序列。在一个可选的实施方案中，组合物的细胞因子是OX40L
的突变序列。在一个实施方案中，突变是导致OX40L结合但抑制肿瘤坏死因子受体超家族成员4（TNFRSF4，也称为OX40，也称为CD134）的信号传导的突变。例如，相对于SEQ ID NO:56中的全长OX40L序列，突变可以是选自N166A和F180A的一个或多个突变。在一个具体实施方案中，相对于SEQ ID NO:56中的全长OX40L序列，突变形式的OX40L包含至少一个选自N166A和F180A的突变。在一个具体实施方案中，细胞因子可含有突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片
段连接成连续肽。在一个具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的突变的和未
突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。在另一个具体的实施方案中，细胞因子可以是通过接
头肽连接的突变的和未突变的OX40L片段，例如
中所示的序列。
[0076] 在某些实施方案中，组合物的细胞因子是4-1BBL、其片段或其突变体。可以使用例如GenBank登录号NP_003802.1找到全长人4-1BBL氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号NM_003811.3找到全长人4-1BBL mRNA序列的序列信息。技术人员将理解，可以在多种物种中发现4-1BBL，并且鉴定4-1BBL的类似物或同源物的方法是本领域已知的，
如下文详细描述的。
如下文详细描述的。
[0077] 技术人员将理解，可以在多种物种中发现4-1BBL。非限制性实例包括小鼠（NP_033430.1）、猪（XP_003480863.1）、牛（NP_001306831.1）、大鼠（NP_852049.1）、兔（XP_
008251123.1）、山羊（XP_013820683.1）、绵羊（XP_014951136.1）、仓鼠（XP_007627369.1）和狗（XP_005633029.1）。应理解，本发明涉及其他生物中4-1BBL的类似物，并且不限于人类似物。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。特别地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个多肽或两个核酸序列的
“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与4-1BBL至少90、91、92、93、
94、95、96、97、98、99或100％同源。
008251123.1）、山羊（XP_013820683.1）、绵羊（XP_014951136.1）、仓鼠（XP_007627369.1）和狗（XP_005633029.1）。应理解，本发明涉及其他生物中4-1BBL的类似物，并且不限于人类似物。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。特别地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个多肽或两个核酸序列的
“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与4-1BBL至少90、91、92、93、
94、95、96、97、98、99或100％同源。
[0078] 在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是4-1BBL的野生型序列。在一个具体实施方案中，细胞因子可含有野生型4-1BBL片段，例如
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片段连接成连续肽。在一个
具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的4-1BBL片段，例如
中所示的序列。在一个可选的实施方案中，组合物的细胞因子是4-1BBL的突变序列。在
一个实施方案中，突变是影响4-1BBL与其受体肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9，也称为4-1BB，也称为CD137）之间的结合亲和力的突变。
中所示的序列。在某些实施方案中，这些片段可以通过接头片段连接成连续肽。在一个
具体实施方案中，细胞因子可以是通过接头肽连接的4-1BBL片段，例如
中所示的序列。在一个可选的实施方案中，组合物的细胞因子是4-1BBL的突变序列。在
一个实施方案中，突变是影响4-1BBL与其受体肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9，也称为4-1BB，也称为CD137）之间的结合亲和力的突变。
[0079] 在某些实施方案中，本发明的细胞因子是白细胞介素或其突变体。大多数白细胞介素由辅助CD4 T淋巴细胞以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。白细胞介素可促进T淋巴细胞和B淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。白细胞介素的非限制性实例包括IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36。因此，在某些实施方案中，组合物的细胞因子是白细胞介素或其突变体，包括但不限于IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36的野生型和突变形式。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2或其突变体。IL2是诱导响应性T细胞增殖的淋巴因子。此外，它作为生长因子和抗体产生刺激物通过受体特异性结合作用于一些B细胞。IL2蛋白作为单糖
基化多肽分泌，并且信号序列的切割是其活性所必需的。IL2的结构包含一束4个螺旋（称为A-D），侧接2个较短的螺旋和几个定义不明确的环。螺旋A中的残基和螺旋A和B之间的环区域中的残基对于受体结合是重要的。二级结构分析表明与IL4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激
因子（GMCSF）的相似性。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2或其变体。变体可以是截短的或突变的IL2。可以使用例如GenBank登录号AAA59140.1或AAH70338.1找到全长
人IL2氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号BC070338.1或M22005.1找到全
长人IL2 mRNA序列的序列信息。
基化多肽分泌，并且信号序列的切割是其活性所必需的。IL2的结构包含一束4个螺旋（称为A-D），侧接2个较短的螺旋和几个定义不明确的环。螺旋A中的残基和螺旋A和B之间的环区域中的残基对于受体结合是重要的。二级结构分析表明与IL4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激
因子（GMCSF）的相似性。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2或其变体。变体可以是截短的或突变的IL2。可以使用例如GenBank登录号AAA59140.1或AAH70338.1找到全长
人IL2氨基酸序列的序列信息。可以使用例如GenBank登录号BC070338.1或M22005.1找到全
长人IL2 mRNA序列的序列信息。
[0080] 技术人员将理解IL2可以在多种物种中发现。非限制性实例包括小鼠（AAI16874.1）、猪（NP_999026.1）、牛（AAQ10670.1）、大鼠（EDM01295.1）、兔（AAC23838.1）、山羊（AAQ10671.1）、绵羊（ABK41601.1）、鸡（AAV35056.1）、仓鼠（ERE88380.1）和狗（AAA68969.1）。应理解，本发明涉及IL2在其他生物中的类似物，并且不限于人类似物。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确
定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。特别地，使用Karlin和Altschul的算法
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个多肽或两个核酸序列的
“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与IL2至少90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99或100％同源。
定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹配。特别地，使用Karlin和Altschul的算法
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993)确定两个多肽或两个核酸序列的
“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与IL2至少90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99或100％同源。
[0081] 在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2的野生型序列，例如中所示的序列。在一个可选的实施方案中，细胞因子是IL2的突变形式。在一个实施方
案中，突变是引起IL2优先结合受体IL2βγ的突变。在另一个实施方案中，突变是改变IL2功能使得IL2对IL2受体α（IL2Rα）具有降低的亲和力的突变。例如，突变可以是选自相对于SEQ ID NO:5的R38A、F42K和/或C125S的一种或多种突变。可以包括C125S突变以减少蛋白聚集。
在一个具体实施方案中，IL2的突变形式包含至少一个选自相对于SEQ ID NO:5的R38A、
F42K和C125S的突变。在另一个具体实施方案中，IL2的突变形式包含相对于SEQ ID NO:5的突变R38A、F42K和C125S。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2的突变序列，例如
中所示的序列。
案中，突变是引起IL2优先结合受体IL2βγ的突变。在另一个实施方案中，突变是改变IL2功能使得IL2对IL2受体α（IL2Rα）具有降低的亲和力的突变。例如，突变可以是选自相对于SEQ ID NO:5的R38A、F42K和/或C125S的一种或多种突变。可以包括C125S突变以减少蛋白聚集。
在一个具体实施方案中，IL2的突变形式包含至少一个选自相对于SEQ ID NO:5的R38A、
F42K和C125S的突变。在另一个具体实施方案中，IL2的突变形式包含相对于SEQ ID NO:5的突变R38A、F42K和C125S。在一个具体实施方案中，组合物的细胞因子是IL2的突变序列，例如
中所示的序列。
[0082] 在一个可选的方面，毒素代替细胞因子。术语“毒素”是指植物、动物、微生物（包括但不限于细菌、病毒、真菌、立克次体或原生动物）的有毒物质或产物，或感染性物质，或重组或合成的分子，无论其来源和生产方法如何。毒素可以是小分子、肽或蛋白，其能够在与生物大分子（例如酶或细胞受体）相互作用的身体组织接触或被其吸收时引起疾病。毒素可以是“生物毒素”，其用于明确地鉴定来自生物来源的毒素。生物毒素可进一步分为真菌生物毒素、或短霉菌毒素、微生物生物毒素、植物生物毒素、短植物毒素和动物生物毒素。生物毒素的非限制性实例包括：由蓝细菌产生的蓝藻毒素，例如微囊藻毒素、节球藻毒素、变性毒素-a、柱胞藻毒素、鞘丝藻毒素-a、蛤蚌毒素、脂多糖、海兔毒素、BMAA；由鞭毛藻产生的dinotoxins，例如石房蛤毒素和膝沟藻毒素；坏死毒素，例如由隐居褐蛛或“小提琴背”蜘蛛、大多数响尾蛇和毒蛇、鼓腹毒蛇、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)产生；神经毒素，例如由黑寡妇蜘蛛、大多数蝎子、箱形水母、眼镜蛇、鸡心螺、蓝圈章鱼，有毒的鱼、青蛙、沙群海葵、珊瑚、各种不同类型的藻类、蓝细菌和鞭毛藻产生的，例如肉毒杆菌毒素（例如，肉毒杆菌素）、破伤风毒素、河豚毒素、氯毒素、芋螺毒素、变性毒素-a、银环蛇毒素、杨桃毒素(caramboxin)、箭毒(curare)；肌肉毒素，例如发现于蛇和蜥蜴毒液；和细胞毒素，例如蓖麻毒素（来自蓖麻子）、蜂毒（来自蜜蜂）和T-2霉菌毒素（来自某些有毒蘑菇）。在某些实施方案中，毒素是细胞毒素。在一个实施方案中，细胞毒素选自蓖麻毒素、蜂毒和T-2霉菌毒素。在一个具体实施方案中，毒素是蓖麻毒素。
[0083] 在某些实施方案中，可以使本发明的细胞因子或毒素聚乙二醇化用于改善的全身半衰期和降低的剂量频率。在一个实施方案中，可以将PEG添加至细胞因子或毒素。因此，本发明的组合物可包含含有PEG的细胞因子或毒素。在一个实施方案中，PEG可以选自PEG-
10K、PEG-20K和PEG-40K。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并
入本文。仍进一步地，可以修饰本发明的细胞因子或毒素以除去T细胞表位。T细胞表位可以是向主体施用组合物时的免疫原性问题的原因。通过他们向T细胞的呈递，它们活化抗药物抗体开发的过程。T细胞表位的临床前筛选可以在计算机中进行，然后进行体外和体内验
证。T细胞表位作图工具如EpiMatrix可以是免疫反应的高度准确的预测者。故意去除T细胞表位可降低免疫原性。通过降低其免疫原性来改善本发明组合物的安全性和功效的其他方
法包括人源化和聚乙二醇化。
10K、PEG-20K和PEG-40K。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并
入本文。仍进一步地，可以修饰本发明的细胞因子或毒素以除去T细胞表位。T细胞表位可以是向主体施用组合物时的免疫原性问题的原因。通过他们向T细胞的呈递，它们活化抗药物抗体开发的过程。T细胞表位的临床前筛选可以在计算机中进行，然后进行体外和体内验
证。T细胞表位作图工具如EpiMatrix可以是免疫反应的高度准确的预测者。故意去除T细胞表位可降低免疫原性。通过降低其免疫原性来改善本发明组合物的安全性和功效的其他方
法包括人源化和聚乙二醇化。
[0084] （b）配体如本文所用，“配体”是特异性结合靶细胞上的受体并且不是与配体连接的细胞因子的
相应结合配偶体的蛋白。配体可以来自真核生物、原核生物或病毒。在某些实施方案中，配体可以来自病毒。短语“特异性结合”在本文中是指配体与靶蛋白结合的亲和力（Kd）在至少
0.1 mM至1 pM的范围内，或在至少0.1 pM至200 nM的范围内，或在至少0.1 pM至10 nM的范围内。解离常数（Kd）测量较大物体可逆地分离（解离）成较小组分的倾向。解离常数是缔合常数的倒数。解离常数可用于描述配体（L）和靶蛋白（P）之间的亲和力。因此，Kd =（[P]x[L]）/[C]，其中C是配体-靶蛋白复合物，并且其中[P]、[L]和[C]分别代表蛋白、配体和复合物的摩尔浓度。确定配体是否与靶蛋白结合的方法是本领域已知的。例如，参见Rossi和
Taylor, Nature Protocols 2011; 6: 365-387。
相应结合配偶体的蛋白。配体可以来自真核生物、原核生物或病毒。在某些实施方案中，配体可以来自病毒。短语“特异性结合”在本文中是指配体与靶蛋白结合的亲和力（Kd）在至少
0.1 mM至1 pM的范围内，或在至少0.1 pM至200 nM的范围内，或在至少0.1 pM至10 nM的范围内。解离常数（Kd）测量较大物体可逆地分离（解离）成较小组分的倾向。解离常数是缔合常数的倒数。解离常数可用于描述配体（L）和靶蛋白（P）之间的亲和力。因此，Kd =（[P]x[L]）/[C]，其中C是配体-靶蛋白复合物，并且其中[P]、[L]和[C]分别代表蛋白、配体和复合物的摩尔浓度。确定配体是否与靶蛋白结合的方法是本领域已知的。例如，参见Rossi和
Taylor, Nature Protocols 2011; 6: 365-387。
[0085] 配体可通过其与靶细胞上的受体结合而触发信号。受体是蛋白分子，其可以嵌入细胞的质膜表面，所述细胞接收来自细胞外部的化学信号。当这些化学信号与受体结合时，它们会引起某种形式的细胞/组织反应。在优选的实施方案中，靶细胞是免疫细胞。因此，组合物的配体与免疫细胞上表达的受体结合。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。因此，在某些实施方案中，免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，免疫细胞是天然杀伤细胞或T淋巴细胞。在免疫细胞上表达的受体的非限制性实例包括主要组织相容性复合物（MHC；例如MHCI、MHCII和
MHCIII）、toll样受体（TLR；例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13）、CD94/NKG2家族受体、内皮素受体、信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体家族。因此，在某些实施方案中，靶细胞上的受体包括但不限于主要组织相容性复合物（MHC；例如MHCI、MHCII和MHCIII）、toll样受体（TLR；例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13）、CD94/NKG2家族受体、内皮素受体、信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体家族。在一个具体实施方案中，靶细胞上的受体是CD94/NKG2家族受体。在另一个具体的实施方案中，组合物的配体特异性结合在天然杀伤（NK）细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）上表达的受体。在优选的实施方案中，组合物的配体不特异性结合血管内皮细胞或调节性T细胞（Tregs）上的受体。
MHCIII）、toll样受体（TLR；例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13）、CD94/NKG2家族受体、内皮素受体、信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体家族。因此，在某些实施方案中，靶细胞上的受体包括但不限于主要组织相容性复合物（MHC；例如MHCI、MHCII和MHCIII）、toll样受体（TLR；例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13）、CD94/NKG2家族受体、内皮素受体、信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体家族。在一个具体实施方案中，靶细胞上的受体是CD94/NKG2家族受体。在另一个具体的实施方案中，组合物的配体特异性结合在天然杀伤（NK）细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）上表达的受体。在优选的实施方案中，组合物的配体不特异性结合血管内皮细胞或调节性T细胞（Tregs）上的受体。
[0086] 在NK细胞和CTL上表达的受体可以是CD94/NKG2家族受体或KLRG1。KLRG1（杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1）是人中由KLRG1基因编码的蛋白。CD94/NKG2家族受体是C型凝集素受体家族，其主要在NK细胞表面和CD8+ T淋巴细胞亚群中表达。这些受体刺激或抑
制NK细胞的细胞毒活性，因此它们根据其功能分为活化受体和抑制受体。CD94/NKG2识别
MHC I类相关糖蛋白。CD94/NKG2家族包括七个成员：NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H。因此，在某些实施方案中，本发明的配体特异性结合选自NKG2A、NKG2B、
NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H的受体。NKG2受体是II型跨膜蛋白，其与CD94分子二聚化。CD94含有短的胞质域且它负责信号转导。因此，NKG2受体形成二硫键键合的异二聚体。
NKG2D代表例外，它是同二聚体。NKG2A和NKG2B受体传递抑制信号。NKG2C、NKG2E和NKG2H是活化受体。NKG2D也是活化受体，但它与衔接蛋白DAP10偶联，所述衔接蛋白DAP10携带信号传导基序YINM（SEQ ID NO:34）。Src或Jak激酶使DAP10磷酸化，其然后可与PI(3)K的p85亚基或衔接分子Grb2缔合。该信号传导触发肌动蛋白改组（细胞极化）和脱粒。NKG2F受体功能尚未阐明。
制NK细胞的细胞毒活性，因此它们根据其功能分为活化受体和抑制受体。CD94/NKG2识别
MHC I类相关糖蛋白。CD94/NKG2家族包括七个成员：NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H。因此，在某些实施方案中，本发明的配体特异性结合选自NKG2A、NKG2B、
NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H的受体。NKG2受体是II型跨膜蛋白，其与CD94分子二聚化。CD94含有短的胞质域且它负责信号转导。因此，NKG2受体形成二硫键键合的异二聚体。
NKG2D代表例外，它是同二聚体。NKG2A和NKG2B受体传递抑制信号。NKG2C、NKG2E和NKG2H是活化受体。NKG2D也是活化受体，但它与衔接蛋白DAP10偶联，所述衔接蛋白DAP10携带信号传导基序YINM（SEQ ID NO:34）。Src或Jak激酶使DAP10磷酸化，其然后可与PI(3)K的p85亚基或衔接分子Grb2缔合。该信号传导触发肌动蛋白改组（细胞极化）和脱粒。NKG2F受体功能尚未阐明。
[0087] 在一个具体实施方案中，组合物的配体特异性结合NKG2D受体。NKG2D是在NK细胞和CD8+ T细胞（αβ和γδ）上发现的活化受体。NKG2D的结构由两个二硫化物连接的II型跨膜蛋白组成，其具有不能转导信号的短细胞内结构域。NKG2D对CD8+ T细胞的功能是发送共刺激信号以活化它们。在一个实施方案中，结合NKG2D的配体可以是抗NKG2D抗体。“抗-NKG2D”包括特异性结合NKG2D内表位的所有抗体。术语“抗体”包括术语“单克隆抗体”。“单克隆抗体”是指衍生自单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。单克隆抗体可以使用例如本领域熟知的杂交瘤技术以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这些
技术和本领域中容易已知的其他技术的组合来生产。“抗体”进一步是指功能性单克隆抗体或其免疫学有效片段；例如其Fab、Fab'或F(ab’)2片段。只要蛋白保留特异性结合其预期靶标的能力，它就包括在术语“抗体”中。定义“抗体”中还包括例如具有该特异性的抗体的单链形式，通常称为Fv区。这些scFv由通过接头连接的重链和轻链可变区构成。制备和使用
scFv的方法是本领域已知的。另外，定义“抗体”中包括单结构域抗体，通常称为sdAb，其是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb抗体可以源自骆驼科动物（VHH片段）或软骨鱼类（VNAR片段）。如本文所用，“人源化抗体”包括抗NKG2D抗体，其通过改变具有非人互补决定区（“CDR”）的抗体的序列部分或全部由衍生自人抗体种系的氨基酸序列序列构成。
最简单的这种改变可以简单地由用人抗体的恒定区取代鼠恒定区组成，从而产生人/鼠嵌
合体，其可具有足够低的免疫原性以在药学使用上可接受。然而，优选地，抗体的可变区和甚至CDR也通过本领域现在熟知的技术来人源化。可变区的框架区被相应的人框架区取代，使得非人CDR基本上完整，或者甚至用衍生自人基因组的序列替换CDR。CDR也可以随机突
变，使得在完全人种系框架区或基本上为人的框架区的背景下维持或增强对NKG2D的结合
活性和亲和力。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是Fab、Fab'或F(ab’)2片段。
技术和本领域中容易已知的其他技术的组合来生产。“抗体”进一步是指功能性单克隆抗体或其免疫学有效片段；例如其Fab、Fab'或F(ab’)2片段。只要蛋白保留特异性结合其预期靶标的能力，它就包括在术语“抗体”中。定义“抗体”中还包括例如具有该特异性的抗体的单链形式，通常称为Fv区。这些scFv由通过接头连接的重链和轻链可变区构成。制备和使用
scFv的方法是本领域已知的。另外，定义“抗体”中包括单结构域抗体，通常称为sdAb，其是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb抗体可以源自骆驼科动物（VHH片段）或软骨鱼类（VNAR片段）。如本文所用，“人源化抗体”包括抗NKG2D抗体，其通过改变具有非人互补决定区（“CDR”）的抗体的序列部分或全部由衍生自人抗体种系的氨基酸序列序列构成。
最简单的这种改变可以简单地由用人抗体的恒定区取代鼠恒定区组成，从而产生人/鼠嵌
合体，其可具有足够低的免疫原性以在药学使用上可接受。然而，优选地，抗体的可变区和甚至CDR也通过本领域现在熟知的技术来人源化。可变区的框架区被相应的人框架区取代，使得非人CDR基本上完整，或者甚至用衍生自人基因组的序列替换CDR。CDR也可以随机突
变，使得在完全人种系框架区或基本上为人的框架区的背景下维持或增强对NKG2D的结合
活性和亲和力。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是Fab、Fab'或F(ab’)2片段。
[0088] 在一个具体的实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1或KYK-2，如Kwong等人，J Mol Biol. 2008 Dec 31;384(5):1143-56中所述。KYK-1的轻链包含
中所示的氨基酸序列和KYK-1的重链包含
中所示的氨基酸序列。KYK-2的轻链包含
中所示的氨基酸序列和KYK-2的重链包含
中所示的氨基酸序列。
中所示的氨基酸序列和KYK-1的重链包含
中所示的氨基酸序列。KYK-2的轻链包含
中所示的氨基酸序列和KYK-2的重链包含
中所示的氨基酸序列。
[0089] 在另一个具体实施方案中，抗NKG2D抗体是衍生自KYK-1的scFv。例如，KYK-1 scFv包含中所示的氨基酸序列。或者，KYK-1 scFv包含
中所示的氨基酸序列。
中所示的氨基酸序列。
[0090] 在另一个具体的实施方案中，抗NKG2D抗体是衍生自KYK-2的scFv。例如，KYK-2 scFv包含
中所示的氨基酸序列。或者，KYK-2 scFv包含
中所示的氨基酸序列。
中所示的氨基酸序列。或者，KYK-2 scFv包含
中所示的氨基酸序列。
[0091] 如上所述，在不存在或存在本文所述的任何接头的情况下，各种KYK-1和KYK-2抗体或其scFv可与本文公开的任何细胞因子组合，以提供本发明的组合物或嵌合肽。还应理
解，KYK-1和KYK-2抗体是适用于本组合物的抗体的实例和本领域技术人员基于本公开将理
解，其他抗NKG2D抗体也是合适的。
解，KYK-1和KYK-2抗体是适用于本组合物的抗体的实例和本领域技术人员基于本公开将理
解，其他抗NKG2D抗体也是合适的。
[0092] 在另一个实施方案中，与NKG2D结合的配体共享MHC I类相关的α1α2超结构域，其构成与NKG2D相互作用的共同位点。与NKG2D结合的配体的非限制性实例包括MHC I类相关糖蛋白，例如MIC家族蛋白（即MICA，MICB）、UL16结合家族蛋白（即ULBP1、ULBP2、ULPB3、ULBP4、ULBP5、ULBP6）、维甲酸早期诱导基因1（Rael）样蛋白（即Rae1α、Rae1β、Rae1γ、Rae1δ、Rae1ε）、H60蛋白家族成员（即H60a、H60b、H60c）、h-HLA-A、以及小鼠中的Mult1和OMCP。在某些实施方案中，配体是MHC I类相关的糖蛋白。在其他实施方案中，本发明的配体选自
MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1α、Rae1β、Rae1γ、Rae1δ、Rae1ε、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1和OMCP。在一个实施方案中，配体是UL16结合家族蛋白或MIC家族蛋白。在一个具体实施方案中，配体选自ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和
ULBP6。在另一个具体实施方案中，配体是ULBP3。在一个具体实施方案中，配体是OMCP或其变体。变体可以是截短的或突变的OMCP，其具有与全长OMCP大致相同的结合亲和力。在一个实施方案中，变体可以是截短的或突变的OMCP，其具有相对于全长OMCP的结合亲和力略低
的结合亲和力。在另一个实施方案中，变体是截短的或突变的OMCP，其具有相对于全长OMCP的结合亲和力略高的结合亲和力。测定配体与靶蛋白的结合亲和力的方法是本领域已知的
并且如上所述。OMCP以约0.1至约5nM的结合亲和力特异性结合NKG2D。例如，OMCP以约为
0.2nM的结合亲和力特异性结合人NKG2D，和以约为3nM的结合亲和力特异性结合小鼠
NKG2D。在优选的实施方案中，OMCP或其变体以约1000nM至约0.1nM的结合亲和力结合人
NKG2D。在某些实施方案中，OMCP或其变体以约100nM至约0.1nM、约10nM至约0.1nM、或约1nM至约0.1nM的结合亲和力结合人NKG2D。在其他实施方案中，OMCP或其变体以约1000nM至约
1nM、或约1000nM至约10nM、或约1000nM至约100nM的结合亲和力结合人NKG2D。在仍其他实施方案中，OMCP或其变体以约100nM至约1nM、或约100nM至10nM的结合亲和力结合人NKG2D。
例如，OMCP或其变体以约1000 nM、约500 nM、约100 nM、约50 nM、约10 nM、约9 nM、约8 nM、约7 nM、约6 nM、约5 nM、约4 nM、约3 nM、约2 nM、约1 nM、约0.9 nM、约0.8 nM、约0.7 nM、约0.6 nM、约0.5 nM、约0.4 nM、约0.3 nM、约0.2 nM或约0.1 nM的结合亲和力与人NKG2D结合。在另一个实施方案中，变体是截短的或突变的OMCP，其对除NKG2D之外的一种或多种
NKG2家族受体具有结合亲和力。例如，变体是截短的或突变的OMCP，其对一种或多种选自
NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F和NKG2H的NKG2家族受体具有结合亲和力。可以通过基于结构的知识合理地选择对OMCP的突变，或者可以通过基于选择的诱变来鉴定对OMCP的突
变。在某些实施方案中，可以合理地选择突变以在OMCP-NKG2D界面中发生以增强或降低结
合亲和力。参与在OMCP-NKG2D界面处结合的氨基酸描述于实施例中。
MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1α、Rae1β、Rae1γ、Rae1δ、Rae1ε、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1和OMCP。在一个实施方案中，配体是UL16结合家族蛋白或MIC家族蛋白。在一个具体实施方案中，配体选自ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和
ULBP6。在另一个具体实施方案中，配体是ULBP3。在一个具体实施方案中，配体是OMCP或其变体。变体可以是截短的或突变的OMCP，其具有与全长OMCP大致相同的结合亲和力。在一个实施方案中，变体可以是截短的或突变的OMCP，其具有相对于全长OMCP的结合亲和力略低
的结合亲和力。在另一个实施方案中，变体是截短的或突变的OMCP，其具有相对于全长OMCP的结合亲和力略高的结合亲和力。测定配体与靶蛋白的结合亲和力的方法是本领域已知的
并且如上所述。OMCP以约0.1至约5nM的结合亲和力特异性结合NKG2D。例如，OMCP以约为
0.2nM的结合亲和力特异性结合人NKG2D，和以约为3nM的结合亲和力特异性结合小鼠
NKG2D。在优选的实施方案中，OMCP或其变体以约1000nM至约0.1nM的结合亲和力结合人
NKG2D。在某些实施方案中，OMCP或其变体以约100nM至约0.1nM、约10nM至约0.1nM、或约1nM至约0.1nM的结合亲和力结合人NKG2D。在其他实施方案中，OMCP或其变体以约1000nM至约
1nM、或约1000nM至约10nM、或约1000nM至约100nM的结合亲和力结合人NKG2D。在仍其他实施方案中，OMCP或其变体以约100nM至约1nM、或约100nM至10nM的结合亲和力结合人NKG2D。
例如，OMCP或其变体以约1000 nM、约500 nM、约100 nM、约50 nM、约10 nM、约9 nM、约8 nM、约7 nM、约6 nM、约5 nM、约4 nM、约3 nM、约2 nM、约1 nM、约0.9 nM、约0.8 nM、约0.7 nM、约0.6 nM、约0.5 nM、约0.4 nM、约0.3 nM、约0.2 nM或约0.1 nM的结合亲和力与人NKG2D结合。在另一个实施方案中，变体是截短的或突变的OMCP，其对除NKG2D之外的一种或多种
NKG2家族受体具有结合亲和力。例如，变体是截短的或突变的OMCP，其对一种或多种选自
NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F和NKG2H的NKG2家族受体具有结合亲和力。可以通过基于结构的知识合理地选择对OMCP的突变，或者可以通过基于选择的诱变来鉴定对OMCP的突
变。在某些实施方案中，可以合理地选择突变以在OMCP-NKG2D界面中发生以增强或降低结
合亲和力。参与在OMCP-NKG2D界面处结合的氨基酸描述于实施例中。
[0093] OMCP的结构由类MHCI样α1/α2平台结构域组成（图20A）。OMCP的平台结构域已被修整为仅具有六链β折叠，且具有较短的侧翼螺旋。OMCP α1结构域（H1）的螺旋是连续的，而α2结构域的螺旋分裂成两个区域（H2a和H2b）。螺旋侧接六链β折叠并共同形成定义MHC蛋白的特征平台。与其他NKG2DL一样（图20B），OMCP的α螺旋靠近在一起，并因此没有用于结合肽或其他配体如抗原呈递MHC平台结构域的沟。OMCP在S5和H2b之间含有一个二硫键，并且该二硫键在大多数NKG2DL中是保守的（图20C）。在某些实施方案中，本发明的配体包含一个或多个MHC I类相关糖蛋白的α螺旋。在其他实施方案中，本发明的配体由MHC I类相关糖蛋白的一个或多个α螺旋组成。更具体地，本发明的配体包含MHC I类相关糖蛋白的α1结构域（H1）、α2结构域（H2）、H2a、H2b或其组合。或者，本发明的配体由MHC I类相关糖蛋白的α1结构域（H1）、α2结构域（H2）、H2a、H2b或其组合组成。在一个具体实施方案中，本发明的配体包含MHC I类相关糖蛋白的α2结构域（H2）。在另一个具体的实施方案中，本发明的配体由MHC I类相关糖蛋白的α2结构域（H2）组成。技术人员将能够确定其他MHC I类相关糖蛋白中α螺旋的位置，例如，使用序列比对（参见图20C，其从Lazear等人J Virol 2013; 87(2): 840-850中复制，该文章以其整体通过引用并入本文）。在一个实施方案中，本发明的配体包含OMCP的一个或多个α螺旋。在另一个实施方案中，本发明的配体包含OMCP的α1结构域（H1）、α2结构域（H2）、H2a、H2b或其组合。在又另一个实施方案中，本发明的配体包含OMCP的α2结构域（H2）。在一个具体实施方案中，本发明的配体由OMCP的一个或多个α螺旋组成。在另一个具体实施方案中，本发明的配体由OMCP的α1结构域（H1）、α2结构域（H2）、H2a、H2b或其组合组成。在仍另一个具体实施方案中，本发明的配体由OMCP的α2结构域（H2）组成。
[0094] 可以使用例如GenBank登录号4FFE_Z、4FFE_Y或4FFE_X找到全长OMCP氨基酸序列的序列信息。技术人员将理解，OMCP的同源物可以在其他物种或病毒中发现。例如，参见
Lefkowitz等人，Nucleic Acids Res 2005; 33: D311-316（其以其整体通过引用并入本
文），其描述了牛痘和猴痘病毒株之间的十八种OMCP变体。在一个实施方案中，OMCP来自正痘病毒。在一个具体实施方案中，OMCP来自牛痘病毒或猴痘病毒。在另一个具体的实施方案中，OMCP来自牛痘病毒的布莱顿红毒株。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同
源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹
配。具体地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,
1993)确定两个多肽或两个核酸序列的“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST
核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped
BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与OMCP至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
Lefkowitz等人，Nucleic Acids Res 2005; 33: D311-316（其以其整体通过引用并入本
文），其描述了牛痘和猴痘病毒株之间的十八种OMCP变体。在一个实施方案中，OMCP来自正痘病毒。在一个具体实施方案中，OMCP来自牛痘病毒或猴痘病毒。在另一个具体的实施方案中，OMCP来自牛痘病毒的布莱顿红毒株。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现同
源物。例如，序列相似性可以通过常规算法确定，其通常允许引入少量空位以实现最佳匹
配。具体地，使用Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,
1993)确定两个多肽或两个核酸序列的“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序进行BLAST
核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样，可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)所述，使用Gapped
BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的默认参数。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与OMCP至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
[0095] 技术人员将理解，OMCP的结构同源物可以在其他物种或病毒中发现。结构同源物可以是结构上相关但序列是远端同源物的蛋白。例如，OMCP对内源性NKG2D具有低序列同一性，但是发现OMCP基于结构同源性将与NKG2D结合。通过本领域已知的方法可以在其他物种中发现结构同源物。例如，蛋白结构预测可以通过各种数据库确定，例如Phyre和Phyre2。此类数据库产生可靠的蛋白模型，其可用于确定结构同源物。Phyre2中的主要结果表提供了
置信度估计值、图像和三维预测模型的链接以及源自蛋白结构分类数据库（SCOP）或蛋白数据库（PDB）的信息，这取决于检测到的模板的来源。对于每个匹配，链接将用户带到用户序列和已知三维结构的序列之间比对的详细视图。更多细节参见www.sbg.bio.ic.ac.uk/
phyre2/。通常，结构同源物与OMCP将具有至少50、51、52、53、54、55、56、57、58或59％的置信度。在一个实施方案中，结构同源物与OMCP将具有至少60、61、62、63、64、65、66、67、68或
69％的置信度。在另一个实施方案中，结构同源物与OMCP将具有至少70、71、72、73、74、75、
76、77、78或79％的置信度。在仍另一个实施方案中，结构同源物与OMCP具有至少80、81、82、
83、64、85、86、87、88或89％的置信度。在仍又另一个实施方案中，结构同源物可以与OMCP具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的置信度。可以使用PDB ID：4PDC找到OMCP-人NKG2D的结构信息。
置信度估计值、图像和三维预测模型的链接以及源自蛋白结构分类数据库（SCOP）或蛋白数据库（PDB）的信息，这取决于检测到的模板的来源。对于每个匹配，链接将用户带到用户序列和已知三维结构的序列之间比对的详细视图。更多细节参见www.sbg.bio.ic.ac.uk/
phyre2/。通常，结构同源物与OMCP将具有至少50、51、52、53、54、55、56、57、58或59％的置信度。在一个实施方案中，结构同源物与OMCP将具有至少60、61、62、63、64、65、66、67、68或
69％的置信度。在另一个实施方案中，结构同源物与OMCP将具有至少70、71、72、73、74、75、
76、77、78或79％的置信度。在仍另一个实施方案中，结构同源物与OMCP具有至少80、81、82、
83、64、85、86、87、88或89％的置信度。在仍又另一个实施方案中，结构同源物可以与OMCP具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的置信度。可以使用PDB ID：4PDC找到OMCP-人NKG2D的结构信息。
[0096] 在一个具体实施方案中，组合物的配体是OMCP的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是OMCP序列，其与SEQ ID NO:7具有
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:7具有80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约
85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%的同一性。
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:7具有80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约
85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%的同一性。
[0097] 在另一个具体的实施方案中，组合物的配体是OMCP的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是OMCP序列，其与SEQ ID NO:13具有
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:13具有80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约
97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:13具有80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约
97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0098] 在仍另一个具体实施方案中，组合物的配体是OMCP序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是OMCP序列，其与SEQ ID NO:14具有
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:14具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:14具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0099] 在一个可选的方面，免疫细胞上表达的受体可以是PD1。PD1，也称为程序性细胞死亡蛋白1和CD279（分化簇279），是人中由PDCD1基因编码的蛋白。PD1是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，并且在T细胞和原B细胞上表达。PD1结合两种配体PDL1和PDL2。PD1作为免疫检查点发挥功能，通过阻止T细胞的活化在下调免疫系统中起重要作用。在某些实施方案中，组合物的配体特异性结合PD1。在一个实施方案中，特异性结合PD1的配体可以是抗PD1抗体。“抗PD1”包括特异性结合PD1内表位的所有抗体。术语“抗体”如上所述。在另一个实施方案中，特异性结合PD1的配体可以是PDL1或PDL2。PDL1（程序性死亡配体1也称为分化簇274（CD274））或B7同源物1（B7-H1），是人中由CD274基因编码的蛋白。PDL1与其在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现的受体PD1结合，以调节活化或抑制。如由解离常数Kd定义的PDL1和PD1之间的亲和力是770nM。PDL2（程序性死亡配体2，也称为分化簇273（CD273）或B7DC）是人中由PDCD1LG2基因编码的蛋白。PDL2也与PD1受体结合。如由解离常数Kd定义的PDL2和PD1之间的亲和力是590nM。
[0100] 例如，可以使用NCBI登录号NM_014143、NM_001267706、NR_052005、NM_001314029找到全长PDL1 mRNA的序列信息，和可以使用例如NCBI登录号NP_001300958、NP_001254635、NP_054862找到全长氨基酸序列。技术人员将理解，PDL1的同源物可以在其他物种中发现。在一个具体实施方案中，PDL1衍生自智人（homo sapiens）。序列相似性可以通过传统算法确定，例如上文针对OMCP所描述的。具体地，使用BLASTN、BLASTX和Gapped BLAST程序使用默认参数确定两个多肽或两个核酸序列的“百分比同一性”。更多细节参见
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与PDL1至少90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99或100％同源。
www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与PDL1至少90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99或100％同源。
[0101] 在一个具体实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，其与SEQ ID NO:51具
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:51具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:51具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0102] 在仍另一个具体实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，其与SEQ ID NO:52具
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:52具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:52具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0103] 在仍另一个具体实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是PDL1的序列，其与SEQ ID NO:53具
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:53具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:53具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0104] 例如，可以使用NCBI登录号NM_025239和XM_005251600找到全长PDL2 mRNA的序列信息，并且可以使用例如NCBI登录号NP_079515和XP_005251657找到全长氨基酸序列。技术人员将理解，PDL1的同源物可以在其他物种中发现。在一个具体实施方案中，PDL2衍生自智人（homo sapiens）。序列相似性可以通过传统算法确定，例如上文针对OMCP所描述的。具体地，使用BLASTN、BLASTX和Gapped BLAST程序使用默认参数确定两个多肽或两个核酸序列
的“百分比同一性”。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与PDL2至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
的“百分比同一性”。更多细节参见www.ncbi.nlm.nih.gov。通常，同源物将具有至少80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％的同源性。在另一个实施方案中，序列可以与PDL2至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源。
[0105] 在一个具体实施方案中，组合物的配体是PDL2的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是PDL2的序列，其与SEQ ID NO:54具
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:54具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:54具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0106] 在另一个具体的实施方案中，组合物的配体是PDL2的序列，例如中所示的序列。在一个实施方案中，组合物的配体是PDL2的序列，其与SEQ ID NO:54具
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:54具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
有至少80％的同一性。例如，配体可以与SEQ ID NO:54具有约80%、约81%、约82%、约83%、约
84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100％的同一性。
[0107] 在另一方面，组合物的配体可以是糖皮质激素诱导的TNFR相关（GITR）配体（GITRL）。由GITRL的GITR活化影响效应T细胞和调节性T细胞的活性，从而参与针对肿瘤和感染因子的免疫应答的发展以及自身免疫和炎性疾病。GITR触发刺激T效应子活性并抑制
Treg活性。GITR抑制可以改善自身免疫/炎性疾病，而GITR活化可以治疗病毒、细菌和寄生虫感染，以及增强针对肿瘤的免疫应答。GITRL是一种II型跨膜蛋白，其在抗原呈递细胞
（APC）和内皮细胞上以高水平表达。
Treg活性。GITR抑制可以改善自身免疫/炎性疾病，而GITR活化可以治疗病毒、细菌和寄生虫感染，以及增强针对肿瘤的免疫应答。GITRL是一种II型跨膜蛋白，其在抗原呈递细胞
（APC）和内皮细胞上以高水平表达。
[0108] 在某些实施方案中，修饰本发明的配体用于改善的全身半衰期和降低的剂量频率。在一个实施方案中，可以将N-聚糖添加到配体中。虽然生物功能通常由蛋白组分决定，但碳水化合物可在分子稳定性、溶解度、体内活性、血清半衰期和免疫原性中起作用。特别是碳水化合物的唾液酸组分可以延长蛋白治疗剂的血清半衰期。因此，可以将新的N-连接
的糖基化共有序列引入肽骨架中的所需位置以产生具有增加的含唾液酸的碳水化合物的
蛋白，从而由于更长的血清半衰期而增加体内活性。在另一个实施方案中，可以将PEG加入配体中。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的组合物可包含含有PEG和/或以个或多个N-聚糖的配体。在一个实施方案
中，PEG选自PEG-10K、PEG-20K和PEG-40K。仍进一步地，可以修饰本发明的配体以除去T细胞表位。T细胞表位可以是向主体施用组合物时免疫原性问题的原因。通过它们向T细胞的呈
递，它们活化了抗药物抗体开发的过程。T细胞表位的临床前筛选可以在计算机中进行，然后进行体外和体内验证。T细胞表位作图工具如EpiMatrix可以是免疫反应的高度准确的预
测者。故意去除T细胞表位可降低免疫原性。通过降低其免疫原性来改善本发明组合物的安全性和功效的其他方法包括人源化和聚乙二醇化。
的糖基化共有序列引入肽骨架中的所需位置以产生具有增加的含唾液酸的碳水化合物的
蛋白，从而由于更长的血清半衰期而增加体内活性。在另一个实施方案中，可以将PEG加入配体中。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的组合物可包含含有PEG和/或以个或多个N-聚糖的配体。在一个实施方案
中，PEG选自PEG-10K、PEG-20K和PEG-40K。仍进一步地，可以修饰本发明的配体以除去T细胞表位。T细胞表位可以是向主体施用组合物时免疫原性问题的原因。通过它们向T细胞的呈
递，它们活化了抗药物抗体开发的过程。T细胞表位的临床前筛选可以在计算机中进行，然后进行体外和体内验证。T细胞表位作图工具如EpiMatrix可以是免疫反应的高度准确的预
测者。故意去除T细胞表位可降低免疫原性。通过降低其免疫原性来改善本发明组合物的安全性和功效的其他方法包括人源化和聚乙二醇化。
[0109] （c）接头在一方面，本发明的组合物还包含接头。接头可用于将细胞因子连接至配体。应理解，
将细胞因子与配体连接不会不利地影响细胞因子或配体的功能。合适的接头包括用于偶联
细胞因子和配体的氨基酸链和用反应基官能化的烷基链或其组合。
将细胞因子与配体连接不会不利地影响细胞因子或配体的功能。合适的接头包括用于偶联
细胞因子和配体的氨基酸链和用反应基官能化的烷基链或其组合。
[0110] 在一个实施方案中，接头可包括氨基酸侧链，称为肽接头。氨基酸残基接头通常是至少一个残基，且可以是50个或更多个残基，但是单独不与靶蛋白特异性结合。在一个实施方案中，接头可以是约1至约10个氨基酸。在另一个实施方案中，接头可以是约10至约20个氨基酸。在仍另一个实施方案中，接头可以是约20至约30个氨基酸。在仍还另一个实施方案中，接头可以是约30至约40个氨基酸。在不同的实施方案中，接头可以是约40至约50个氨基酸。在其他实施方案中，接头可以多于50个氨基酸。例如，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个具体实施方案中，接头为约20至约30个氨基酸。在另一个具体实施方案中，接头是约26个氨基酸。
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个具体实施方案中，接头为约20至约30个氨基酸。在另一个具体实施方案中，接头是约26个氨基酸。
[0111] 任何氨基酸残基可用于接头，条件是接头不与靶蛋白特异性结合。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。例如，接头可以是(AAS)n、(AAAL)n (SEQ ID NO:68)、(GnS)n或(G2S)n，其中A是丙氨酸，S是丝氨酸，L是亮氨酸，且G是甘氨酸，并且其中n是1-20、或1-10或3-10的整数。因此，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。因此，在某些实施方案中，接头包括但不限于(AAS)n、(AAAL)n (SEQ ID NO:68)、(GnS)n或(G2S)n，其中A是丙氨酸，S是丝氨酸，L是亮氨酸，且G是甘氨酸，并且其中n是1-20、或1-10、或3-10的整数。接头可包含一个或多个表位标签。例如，接头可包含1、2、3、4、5、6、7或8个表位标签。在一个具体实施方案中，接头包含2个表位标签。表位标签的非限制性实例包括FLAG标签（DYKDDDK表位（SEQ ID NO:9））、HA标签（YPYDVPDYA表位（SEQ ID NO:10））、His标签（6x-His或8x-His）、Myc标签（EQKLISEEDL表位（SEQ ID NO:11））和V5标签（GKPIPNPLLGLDST表位（SEQ ID NO:12））。在一个实施方案中，接头可包含至少一种选自FLAG标签和His标签的标签。在一个具体实施方案中，接头包含FLAG标签和His标签。在另一个具体实施方案中，接头包含SEQ ID NO:8
(GSSGSSDYKDDDDKHHHHHHHHGSSGSS)中所示的序列。
(GSSGSSDYKDDDDKHHHHHHHHGSSGSS)中所示的序列。
[0112] 在另一个实施方案中，烷基链连接基团可以通过将末端氨基或末端羧基与烷基链上的官能团（例如羧基或活化酯）反应而与细胞因子偶联。随后，通过使烷基链上的第二官能团与配体上的适当基团反应，将配体连接到烷基链上以完成复合物的形成。烷基链上的
第二官能团选自与配体上的官能团反应但不与细胞因子反应的取代基。例如，当配体掺入
官能团如羧基或活化酯时，烷基链连接基团的第二官能团可以是氨基，或反之亦然。应理
解，缀合物的形成可能需要保护和去保护存在的官能团，以避免形成不希望的产物。使用有机合成领域中常见的保护基团、试剂和方案完成保护和去保护。具体地，可以使用固相肽合成中采用的保护和去保护技术。将理解连接基团可以可选地首先与配体偶联，然后与细胞
因子偶联。
第二官能团选自与配体上的官能团反应但不与细胞因子反应的取代基。例如，当配体掺入
官能团如羧基或活化酯时，烷基链连接基团的第二官能团可以是氨基，或反之亦然。应理
解，缀合物的形成可能需要保护和去保护存在的官能团，以避免形成不希望的产物。使用有机合成领域中常见的保护基团、试剂和方案完成保护和去保护。具体地，可以使用固相肽合成中采用的保护和去保护技术。将理解连接基团可以可选地首先与配体偶联，然后与细胞
因子偶联。
[0113] 烷基链的可选化学连接基团是聚乙二醇（PEG），其以与上述烷基链相同的方式官能化。这种接头可以称为异双官能PEG接头或同双官能PEG接头。异双官能PEG接头的非限制性实例包括：O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(生物素基氨基)乙基]八乙二醇；O-(2-氨基乙基)-
O'-(2-羧乙基)聚乙二醇盐酸盐Mp 3000；O-(2-氨基乙基)-O'-(2-羧乙基)聚乙二醇5,000盐酸盐Mp 5,000；O-(2-氨基乙基)聚乙二醇3,000 Mp 3,000；O-(2-氨基乙基)-O'-(2-(琥珀酰氨基)乙基)聚乙二醇盐酸盐Mp 10,000；O-(2-叠氮基乙基)七乙二醇；O-[2-(生物素基氨基)乙基]-O'-(2-羧乙基)十一乙二醇；21-[D(+)-生物基氨基]-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十
一烷酸；O-(2-羧乙基)-O'-[2-(Fmoc-氨基)-乙基]二十七乙二醇；O-(2-羧乙基)-O'-(2-巯基乙基)七乙二醇；O-(3-羧丙基)-O'-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-聚乙二醇Mw 3000；O-(3-羧丙基)-O'-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-聚乙二醇Mw 5000；O-[N-(3-马来酰亚胺基
丙酰基)氨基乙基]-O'-[3-(N-琥珀酰亚胺基氧基)-3-氧代丙基]二十七乙二醇；和O-[2-
(3-三苯甲硫基丙氨基)乙基]聚乙二醇Mp 3,000。同双官能PEG接头的非限制性实例包括：
MAL-PEG-MAL(双官能马来酰亚胺PEG马来酰亚胺)；OPSS-PEG-OPSS(OPSS：正吡啶基二硫化
物；PDP-PEG-PDP)；HS-PEG-SH(双官能硫醇PEG硫醇)；SG-PEG-SG(双官能PEG琥珀酰亚胺基戊二酸NHS酯)；SS-PEG-SS(双官能PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸NHS酯)；GAS-PEG-GAS(双官能
PEG琥珀酰亚胺酯NHS-PEG-NHS)；SAS-PEG-SAS(双官能PEG琥珀酰亚胺酯NHS-PEG-NHS)；胺-PEG-胺(双官能PEG胺NH2-PEG-NH2)；AC-PEG-AC(双官能丙烯酸酯PEG丙烯酸酯)；ACA-PEG-
ACA(双官能可聚合PEG丙烯酸酯丙烯酰胺)；环氧化物-PEG-环氧化物(双官能PEG环氧化物
或EP)；NPC-PEG-NPC(双官能NPC PEG，硝基苯基碳酸酯)；醛-PEG-醛(ALD-PEG-ALD，双官能PEG丙醛)；AA-PEG-AA(酸-PEG-酸，AA-乙酸或羧甲基)；GA-PEG-GA(酸-PEG-酸，GA：戊二酸)；
SA-PEG-SA(双官能PEG羧酸-琥珀酸)；GAA-PEG-GAA(双官能PEG羧酸，戊二酰胺酸)；SAA-
PEG-SAA(双官能PEG羧酸，琥珀酰胺酸)；叠氮化物-PEG-叠氮化物(双官能PEG叠氮化物，N3-PEG-N3)；炔烃-PEG-炔烃(双官能炔烃或乙炔PEG)；生物素-PEG-生物素(双官能生物素PEG
接头)；硅烷-PEG-硅烷(双官能硅烷PEG)；酰肼-PEG-酰肼(双官能PEG酰肼)；甲苯磺酸-PEG-甲苯磺酸酯(双官能PEG对甲苯磺酰基)；和氯化物-PEG-氯化物(双官能PEG卤化物)。
O'-(2-羧乙基)聚乙二醇盐酸盐Mp 3000；O-(2-氨基乙基)-O'-(2-羧乙基)聚乙二醇5,000盐酸盐Mp 5,000；O-(2-氨基乙基)聚乙二醇3,000 Mp 3,000；O-(2-氨基乙基)-O'-(2-(琥珀酰氨基)乙基)聚乙二醇盐酸盐Mp 10,000；O-(2-叠氮基乙基)七乙二醇；O-[2-(生物素基氨基)乙基]-O'-(2-羧乙基)十一乙二醇；21-[D(+)-生物基氨基]-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十
一烷酸；O-(2-羧乙基)-O'-[2-(Fmoc-氨基)-乙基]二十七乙二醇；O-(2-羧乙基)-O'-(2-巯基乙基)七乙二醇；O-(3-羧丙基)-O'-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-聚乙二醇Mw 3000；O-(3-羧丙基)-O'-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-聚乙二醇Mw 5000；O-[N-(3-马来酰亚胺基
丙酰基)氨基乙基]-O'-[3-(N-琥珀酰亚胺基氧基)-3-氧代丙基]二十七乙二醇；和O-[2-
(3-三苯甲硫基丙氨基)乙基]聚乙二醇Mp 3,000。同双官能PEG接头的非限制性实例包括：
MAL-PEG-MAL(双官能马来酰亚胺PEG马来酰亚胺)；OPSS-PEG-OPSS(OPSS：正吡啶基二硫化
物；PDP-PEG-PDP)；HS-PEG-SH(双官能硫醇PEG硫醇)；SG-PEG-SG(双官能PEG琥珀酰亚胺基戊二酸NHS酯)；SS-PEG-SS(双官能PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸NHS酯)；GAS-PEG-GAS(双官能
PEG琥珀酰亚胺酯NHS-PEG-NHS)；SAS-PEG-SAS(双官能PEG琥珀酰亚胺酯NHS-PEG-NHS)；胺-PEG-胺(双官能PEG胺NH2-PEG-NH2)；AC-PEG-AC(双官能丙烯酸酯PEG丙烯酸酯)；ACA-PEG-
ACA(双官能可聚合PEG丙烯酸酯丙烯酰胺)；环氧化物-PEG-环氧化物(双官能PEG环氧化物
或EP)；NPC-PEG-NPC(双官能NPC PEG，硝基苯基碳酸酯)；醛-PEG-醛(ALD-PEG-ALD，双官能PEG丙醛)；AA-PEG-AA(酸-PEG-酸，AA-乙酸或羧甲基)；GA-PEG-GA(酸-PEG-酸，GA：戊二酸)；
SA-PEG-SA(双官能PEG羧酸-琥珀酸)；GAA-PEG-GAA(双官能PEG羧酸，戊二酰胺酸)；SAA-
PEG-SAA(双官能PEG羧酸，琥珀酰胺酸)；叠氮化物-PEG-叠氮化物(双官能PEG叠氮化物，N3-PEG-N3)；炔烃-PEG-炔烃(双官能炔烃或乙炔PEG)；生物素-PEG-生物素(双官能生物素PEG
接头)；硅烷-PEG-硅烷(双官能硅烷PEG)；酰肼-PEG-酰肼(双官能PEG酰肼)；甲苯磺酸-PEG-甲苯磺酸酯(双官能PEG对甲苯磺酰基)；和氯化物-PEG-氯化物(双官能PEG卤化物)。
[0114] 在某些实施方案中，可以修饰本发明的接头用于改善的全身半衰期和降低的剂量频率。在一个实施方案中，将N-聚糖添加至接头。虽然生物功能通常由蛋白组分决定，但碳水化合物可在分子稳定性、溶解度、体内活性、血清半衰期和免疫原性中起作用。特别是碳水化合物的唾液酸组分可以延长蛋白治疗剂的血清半衰期。因此，可以将新的N-连接的糖
基化共有序列引入肽骨架中的所需位置以产生具有增加的含唾液酸的碳水化合物的蛋白，
从而由于更长的血清半衰期而增加体内活性。在另一个实施方案中，将PEG加入接头中。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of
Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的组合物包含含有PEG和/或一个或多个N-聚糖的配体。在一个实施方案中，PEG选自PEG-10K、PEG-20K和PEG-40K。
基化共有序列引入肽骨架中的所需位置以产生具有增加的含唾液酸的碳水化合物的蛋白，
从而由于更长的血清半衰期而增加体内活性。在另一个实施方案中，将PEG加入接头中。将PEG与蛋白缀合的方法是本领域的标准方法。例如，参见Kolate等人，Journal of
Controlled Release 2014; 192(28): 67-81，其以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的组合物包含含有PEG和/或一个或多个N-聚糖的配体。在一个实施方案中，PEG选自PEG-10K、PEG-20K和PEG-40K。
[0115] 本发明的另一方面涉及交联本发明的肽以改善其药代动力学、免疫原性、诊断和/或治疗属性。交联涉及经在本发明的细胞因子和配体上的合适位点（例如，伯胺、巯基）处的化学反应通过共价键连接两个分子。在一个实施方案中，细胞因子和配体可以交联在一起。
交联剂可在细胞因子和配体之间形成可切割或不可切割的接头。在细胞因子和配体之间形
成不可切割接头的交联剂可包含基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。根据本发明，据
说这种不可切割的接头衍生自基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。包含基于马来酰亚
胺的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷甲酸酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧基-（6-酰氨基己酸酯），其为SMCC的“长链”类似物（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-（α-马来酰亚胺基乙酰氧基）-琥珀酰亚胺酯[AMAS]、琥珀酰亚胺基-6-（β-马来酰亚胺丙酰胺基）己酸酯（SMPH）、N-琥珀酰亚胺基4-（对马来酰亚胺基苯基）-丁酸酯（SMPB）和N-（对马来酰亚胺基苯基）异氰酸酯（PMPI）。这些交联剂形成衍生自基于马来酰亚胺的部分的不可切割的接头。包含基于卤代乙酰基的部分的交
联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-（碘乙酰基）-氨基苯甲酸酯（SIAB）、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯（SIA）、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯（SBA）和N-琥珀酰亚胺基3-（溴乙酰氨基）丙酸酯（SBAP）。
这些交联剂形成衍生自基于卤代乙酰基的部分的不可切割的接头。在细胞因子和配体之间
形成不可切割接头的交联剂可包括N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-（2-吡啶基二硫代）-甲苯（SMPT）、N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）-丁酸酯（SDPB）、2-亚氨基噻吩或乙酰基琥珀酸酐。
交联剂可在细胞因子和配体之间形成可切割或不可切割的接头。在细胞因子和配体之间形
成不可切割接头的交联剂可包含基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。根据本发明，据
说这种不可切割的接头衍生自基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。包含基于马来酰亚
胺的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷甲酸酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧基-（6-酰氨基己酸酯），其为SMCC的“长链”类似物（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-（α-马来酰亚胺基乙酰氧基）-琥珀酰亚胺酯[AMAS]、琥珀酰亚胺基-6-（β-马来酰亚胺丙酰胺基）己酸酯（SMPH）、N-琥珀酰亚胺基4-（对马来酰亚胺基苯基）-丁酸酯（SMPB）和N-（对马来酰亚胺基苯基）异氰酸酯（PMPI）。这些交联剂形成衍生自基于马来酰亚胺的部分的不可切割的接头。包含基于卤代乙酰基的部分的交
联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-（碘乙酰基）-氨基苯甲酸酯（SIAB）、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯（SIA）、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯（SBA）和N-琥珀酰亚胺基3-（溴乙酰氨基）丙酸酯（SBAP）。
这些交联剂形成衍生自基于卤代乙酰基的部分的不可切割的接头。在细胞因子和配体之间
形成不可切割接头的交联剂可包括N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-（2-吡啶基二硫代）-甲苯（SMPT）、N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）-丁酸酯（SDPB）、2-亚氨基噻吩或乙酰基琥珀酸酐。
[0116] （d）嵌合肽在另一方面，本发明包括嵌合肽，其包含细胞因子肽和NKG2D配体肽。在一个可选方面，
本发明包括嵌合肽，其包含细胞因子肽和PD1配体肽。应当理解，“配体肽”可与“配体”互换使用，且“细胞因子肽”可与“细胞因子”互换使用，用于本文描述适用于本发明组合物和方法的各种细胞因子和配体的目的。在某些实施方案中，细胞因子肽在IL2亚家族中。更具体地，细胞因子肽选自IL2、IL7、IL15和IL21。在一个具体实施方案中，细胞因子肽是IL15或其突变体。在另一个具体的实施方案中，细胞因子肽是IL2或其突变体。在另一个实施方案中，细胞因子肽是突变体IL2，其包含至少一种选自R38A、F42K和C125S的突变。在一个具体实施方案中，细胞因子肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在其他实施方案
中，细胞因子肽在IL1家族中。更具体地，细胞因子肽选自IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。在一个具体实施方案中，细胞因子肽是IL18或其突变体。
本发明包括嵌合肽，其包含细胞因子肽和PD1配体肽。应当理解，“配体肽”可与“配体”互换使用，且“细胞因子肽”可与“细胞因子”互换使用，用于本文描述适用于本发明组合物和方法的各种细胞因子和配体的目的。在某些实施方案中，细胞因子肽在IL2亚家族中。更具体地，细胞因子肽选自IL2、IL7、IL15和IL21。在一个具体实施方案中，细胞因子肽是IL15或其突变体。在另一个具体的实施方案中，细胞因子肽是IL2或其突变体。在另一个实施方案中，细胞因子肽是突变体IL2，其包含至少一种选自R38A、F42K和C125S的突变。在一个具体实施方案中，细胞因子肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在其他实施方案
中，细胞因子肽在IL1家族中。更具体地，细胞因子肽选自IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。在一个具体实施方案中，细胞因子肽是IL18或其突变体。
[0117] 在某些实施方案中，细胞因子肽在肿瘤坏死因子配体超家族（TNFSF）中。更具体地，细胞因子肽选自TNF-α、OX40L、4-1BB配体、TRAIL、Fas配体、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、CD30L、CD40L、CD27L和RANKL。在一个具体实施方案中，细胞因子肽是OX40L或其突变体。在另一个具体实施方案中，细胞因子肽含有OX40L片段。在一个具体实施方案中，OX40L片段包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，OX40L片段可以通过接头肽连接成连续构建体。在一个具体实施方案中，含有OX40L片段的构建体包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，细胞因子肽是包含至少一种选自N166A和F180A的突变
体的突变体OX40L。在一个具体实施方案中，细胞因子含有突变体OX40L片段，其含有至少一种选自N166A和F180A的突变体。在一个具体实施方案中，突变体OX40L片段包含SEQ ID NO:
59所示的氨基酸序列。在某些具体的实施方案中，突变体OX40L片段或突变体和未突变的
OX40L片段可以通过接头肽连接成连续构建体。在一个具体实施方案中，含有突变体和未突变的OX40L片段的构建体包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在可选的
具体实施方案中，细胞因子肽是4-1BBL或其突变体。在另一个具体的实施方案中，细胞因子肽含有4-1BBL片段。在一个具体实施方案中，4-1BBL片段包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸
序列。在某些具体的实施方案中，4-1BBL片段可以通过接头肽连接成连续构建体。在一个具体实施方案中，含有4-1BBL片段的构建体包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。在某些实
施方案中，细胞因子肽是突变体4-1BBL。在某些实施方案中，细胞因子含有突变体4-1BBL片段。在某些实施方案中，突变体4-1BBL片段或突变体和未突变的4-1BBL片段可以通过接头
肽连接成连续构建体。
体的突变体OX40L。在一个具体实施方案中，细胞因子含有突变体OX40L片段，其含有至少一种选自N166A和F180A的突变体。在一个具体实施方案中，突变体OX40L片段包含SEQ ID NO:
59所示的氨基酸序列。在某些具体的实施方案中，突变体OX40L片段或突变体和未突变的
OX40L片段可以通过接头肽连接成连续构建体。在一个具体实施方案中，含有突变体和未突变的OX40L片段的构建体包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在可选的
具体实施方案中，细胞因子肽是4-1BBL或其突变体。在另一个具体的实施方案中，细胞因子肽含有4-1BBL片段。在一个具体实施方案中，4-1BBL片段包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸
序列。在某些具体的实施方案中，4-1BBL片段可以通过接头肽连接成连续构建体。在一个具体实施方案中，含有4-1BBL片段的构建体包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。在某些实
施方案中，细胞因子肽是突变体4-1BBL。在某些实施方案中，细胞因子含有突变体4-1BBL片段。在某些实施方案中，突变体4-1BBL片段或突变体和未突变的4-1BBL片段可以通过接头
肽连接成连续构建体。
[0118] 在某些实施方案中，NKG2D配体肽是抗NKG2D抗体。在另一个实施方案中，NKG2D配体肽是MHC I类相关糖蛋白。在另一个实施方案中，配体肽是OMCP、其部分或其突变体。在一个实施方案中，配体肽结合NK细胞和CD8+ CTL上表达的受体。在一个具体实施方案中，配体肽结合NKG2D受体。在某些实施方案中，配体肽包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或其
能够结合NKG2D受体的部分。
能够结合NKG2D受体的部分。
[0119] 在某些实施方案中，PD1配体肽是抗PD1抗体。在另一个实施方案中，PD1配体肽是PDL1、其部分或其突变体。在仍另一个实施方案中，PD1配体肽是PDL2、其部分或其突变体。
在一个实施方案中，配体肽结合在T细胞、NK细胞和巨噬细胞上表达的受体。在一个具体实施方案中，配体肽结合PD1受体。在某些实施方案中，配体肽包含SEQ ID NO:48或SEQ ID
NO:50所示的氨基酸序列或其能够结合PD1受体的部分。
在一个实施方案中，配体肽结合在T细胞、NK细胞和巨噬细胞上表达的受体。在一个具体实施方案中，配体肽结合PD1受体。在某些实施方案中，配体肽包含SEQ ID NO:48或SEQ ID
NO:50所示的氨基酸序列或其能够结合PD1受体的部分。
[0120] 在其他实施方案中，嵌合肽还包含接头肽。在某些实施方案中，接头肽包含选自(AAS)n、(AAAL)n (SEQ ID NO:68)、(GnS)n或(G2S)n的氨基酸序列，其中A是丙氨酸，S丝氨酸，L是亮氨酸，且G是甘氨酸，并且其中n是1-20、或1-10、或3-10的整数。在不同的实施方案中，接头肽包含至少一个选自FLAG标签和His标签的标签。在一个实施方案中，接头肽为约20至约30个氨基酸。在一个具体实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0121] 本发明还包括编码如本文所述的嵌合肽的核酸分子。另外，本发明包括含有如本文所述的嵌合肽的药物组合物。药物组合物在第I(h)部分中有更详细的描述。
[0122] 本公开的嵌合肽可任选地包含信号肽和/或纯化部分。当存在时，通常信号肽位于嵌合肽的N-末端，并且纯化部分位于嵌合肽的C-末端。或者，信号肽和纯化部分都在嵌合肽的N-末端。信号肽的选择可以并且将根据多种因素而变化，包括但不限于所需的细胞位置和细胞类型。编码信号肽的合适的多核苷酸序列是本领域已知的，由其编码的多肽序列也是如此。
在一个具体实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:69 (MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETG)。
类似地，纯化部分的选择可以并且将会变化。合适的纯化部分是本领域已知的，编码它们的多核苷酸序列也是如此。通常，信号肽和/或纯化部分在加工过程中被切除，并且不包括在用于药物组合物的最终嵌合肽中。
在一个具体实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:69 (MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETG)。
类似地，纯化部分的选择可以并且将会变化。合适的纯化部分是本领域已知的，编码它们的多核苷酸序列也是如此。通常，信号肽和/或纯化部分在加工过程中被切除，并且不包括在用于药物组合物的最终嵌合肽中。
[0123] 本公开还涵盖包含能够编码本公开的嵌合肽的核酸序列的载体。如本文所用，“载体”定义为用作转移遗传物质的媒介物的核酸分子。载体包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，转座因子，病毒（噬菌体、动物病毒和植物病毒）和人工染色体（例如YAC），例如逆转录病毒载体（例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体（MoMLV）、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等），慢病毒载体（例如衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等），腺病毒（Ad）载体，包括其复制型、复制缺陷型及其无肠形(gutless form)，腺相关病毒（AAV）载体，猿猴病毒40（SV-40）载体，牛乳头瘤病毒载体，EB病毒，疱疹病毒载体，痘苗病毒载体，Harvey鼠肉瘤病毒载体，小鼠乳腺肿瘤病毒载体，劳斯肉瘤病毒载体。可以使用病毒载体或通过非病毒转移方法将编码本公开的嵌合肽的表达载体递送至细胞。适于将核酸引入细胞的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、弹状病毒和疱疹病毒。非病毒核酸转移方法包括裸核酸、脂质体和蛋白/核酸缀合物。引入细胞的编码本公开的嵌合肽的表达构建体可以是线性的或环状的，可以是单链或
双链的，并且可以是DNA、RNA或其任何修饰或其组合。本公开还涵盖包含载体的细胞系，所述载体包含能够编码本公开的嵌合肽的核酸序列。在一些实施方案中，细胞系是无限增殖
化细胞系。
双链的，并且可以是DNA、RNA或其任何修饰或其组合。本公开还涵盖包含载体的细胞系，所述载体包含能够编码本公开的嵌合肽的核酸序列。在一些实施方案中，细胞系是无限增殖
化细胞系。
[0124] （e）靶向分子如本文所用，“靶向分子”是能够结合对处于疾病状态的细胞或对患病细胞周围的细胞
外基质特异性的靶标的分子。在一些情况下，靶向分子结合在细胞上表达的靶分子实体。靶向分子可以是能够这种缔合或结合的任何分子，包括但不限于受体配体和抗体。各种类型
的靶向分子是本领域技术人员已知的。例如，受体配体与细胞表面上表达的靶受体结合。靶向分子还可以包括其他分子，例如干扰素α、β和γ。靶向分子的其他实例包括抗体，包括针对TNF受体的激动剂和拮抗剂抗体、针对肿瘤基质中存在的抗原的抗体、针对间皮素的抗体和针对癌胚抗原的抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法产生针对特定抗原靶标的抗
体，包括先前在本公开中讨论的那些方法。在某些方面，靶向分子可仅包括分子的一部分，例如配体或抗体的结合部分。靶向分子可以通过如本公开中讨论的接头与配体连接。本发
明的靶向分子可以通过本领域技术人员已知的方法产生。
外基质特异性的靶标的分子。在一些情况下，靶向分子结合在细胞上表达的靶分子实体。靶向分子可以是能够这种缔合或结合的任何分子，包括但不限于受体配体和抗体。各种类型
的靶向分子是本领域技术人员已知的。例如，受体配体与细胞表面上表达的靶受体结合。靶向分子还可以包括其他分子，例如干扰素α、β和γ。靶向分子的其他实例包括抗体，包括针对TNF受体的激动剂和拮抗剂抗体、针对肿瘤基质中存在的抗原的抗体、针对间皮素的抗体和针对癌胚抗原的抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法产生针对特定抗原靶标的抗
体，包括先前在本公开中讨论的那些方法。在某些方面，靶向分子可仅包括分子的一部分，例如配体或抗体的结合部分。靶向分子可以通过如本公开中讨论的接头与配体连接。本发
明的靶向分子可以通过本领域技术人员已知的方法产生。
[0125] （f）组合疗法如本文所用，“组合”意指包括可以单独施用的疗法，例如，单独配制用于单独施用（例
如，可以在药剂盒中提供），和可以在单一制剂中一起施用的疗法（即，“共制剂”）。本文提供的多肽与一种或多种活性治疗剂的组合可以顺序（例如，其中在一种或多种其他药剂之前
施用一种药剂）或同时（例如，其中两种或更多种药剂在相同时间或约相同时间施用）施用或应用。在一些实施方案中，施用是顺序的。在其他实施方案中，施用是同时的。无论两种或更多种药剂是顺序施用还是同时施用，为了本公开的目的，它们被认为是组合施用。
如，可以在药剂盒中提供），和可以在单一制剂中一起施用的疗法（即，“共制剂”）。本文提供的多肽与一种或多种活性治疗剂的组合可以顺序（例如，其中在一种或多种其他药剂之前
施用一种药剂）或同时（例如，其中两种或更多种药剂在相同时间或约相同时间施用）施用或应用。在一些实施方案中，施用是顺序的。在其他实施方案中，施用是同时的。无论两种或更多种药剂是顺序施用还是同时施用，为了本公开的目的，它们被认为是组合施用。
[0126] 因此，本文所述多肽的方法和用途可以在另一种治疗之前，基本上同时或之后实施，并且可以补充其他形式的治疗。
[0127] 在一个方面，本文提供组合疗法，其包括如本文所述的组合物和PD-1抑制剂。“PD-1抑制剂”是指降低、抑制、阻断、消除或干扰PD-1（例如，程序性细胞死亡蛋白1；PD-1
（CD279）；G1：145559515）（包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物（例如小鼠）和与PD-1具有至少一个共同表位的类似物）活性或表达的部分（例如，化合物、核酸、多肽、抗体）。PD-1抑制剂包括分子和大分子，诸如例如化合物、核酸、多肽、抗体、肽体、双抗体、微抗体、纳米抗体、单链可变片段（scFv）及其功能片段或变体。在本文所述的具体实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。PD-1抑制剂（包括抗PD-1抗体）可以拮抗PD-1活性或表达。抗PD-1抗体可以是如本文所述的单克隆或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，抗PD-1抗体是多克隆抗体。0)。
（CD279）；G1：145559515）（包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物（例如小鼠）和与PD-1具有至少一个共同表位的类似物）活性或表达的部分（例如，化合物、核酸、多肽、抗体）。PD-1抑制剂包括分子和大分子，诸如例如化合物、核酸、多肽、抗体、肽体、双抗体、微抗体、纳米抗体、单链可变片段（scFv）及其功能片段或变体。在本文所述的具体实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。PD-1抑制剂（包括抗PD-1抗体）可以拮抗PD-1活性或表达。抗PD-1抗体可以是如本文所述的单克隆或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，抗PD-1抗体是多克隆抗体。0)。
[0128] 在一个实施方案中，PD-1抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、AMP-224、REGN2810、PDR001和MEDI0680。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是pidilizumab。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是REGN2810。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是PDR001。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是MEDI0680。
[0129] 在一个方面，本发明包括组合疗法，其包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如与本文提供的NKG2D配体连接的本文提供的细胞因子的组合物。组合物可进一步包含如本文所
述的接头，以将细胞因子与本文提供的配体连接。例如，细胞因子可以是IL1家族细胞因子，包括本文所述的那些（例如，IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。例如，细胞因子可以是IL2亚家族细胞因子，例如IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一些实施方案中，细胞因子是IL2。在其他实施方案中，细胞因子是IL2的突变体
R38A/F42K形式。例如，细胞因子可以是如本文所述的干扰素（例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IL10R2或IFNLR1）。在另一个实例中，细胞因子是白细胞介素，例如但不限于IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36。在另一个实例中，细胞因子是TNFSF家族的成员，例如但不限于TNF(TNFα)、CD40L (TNFSF5)、CD70 (TNFSF7)、EDA、FASLG (TNFSF6)、LTA (TNFSF1)、LTB (TNFSF3)、TNFSF4 (OX40L)、TNFSF8 (CD153)、TNFSF9 (4-1BBL)、TNFSF10 (TRAIL)、
TNFSF11 (RANKL)、TNFSF12 (TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。例如，NKG2D配体可以是如本文所述的NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F或NKG2H。配体可选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1或OMCP。在某些实施方案中，NKG2D配体是如本文所述的OMCP（例如，SEQ ID NO:7、13或14）。
述的接头，以将细胞因子与本文提供的配体连接。例如，细胞因子可以是IL1家族细胞因子，包括本文所述的那些（例如，IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。例如，细胞因子可以是IL2亚家族细胞因子，例如IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一些实施方案中，细胞因子是IL2。在其他实施方案中，细胞因子是IL2的突变体
R38A/F42K形式。例如，细胞因子可以是如本文所述的干扰素（例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IL10R2或IFNLR1）。在另一个实例中，细胞因子是白细胞介素，例如但不限于IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36。在另一个实例中，细胞因子是TNFSF家族的成员，例如但不限于TNF(TNFα)、CD40L (TNFSF5)、CD70 (TNFSF7)、EDA、FASLG (TNFSF6)、LTA (TNFSF1)、LTB (TNFSF3)、TNFSF4 (OX40L)、TNFSF8 (CD153)、TNFSF9 (4-1BBL)、TNFSF10 (TRAIL)、
TNFSF11 (RANKL)、TNFSF12 (TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。例如，NKG2D配体可以是如本文所述的NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F或NKG2H。配体可选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1或OMCP。在某些实施方案中，NKG2D配体是如本文所述的OMCP（例如，SEQ ID NO:7、13或14）。
[0130] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和靶向分子的组合物。OMCP可以与靶向分子连接，或者OMCP的部分可以与靶
向分子连接。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供
的OMCP或其部分和肿瘤坏死因子（TNF）家族成员的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF相关的凋亡诱导靶向分
子的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供
的OMCP或其部分和4-1BB配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB激动剂的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF-α的组合物。
在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部
分和OX40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和Fas配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒素-α（LT-a）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒
素-β（LT-b）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD27L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含OMCP和核因子κB靶向分子的受体活化剂（RANKL）的组合物。
向分子连接。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供
的OMCP或其部分和肿瘤坏死因子（TNF）家族成员的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF相关的凋亡诱导靶向分
子的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供
的OMCP或其部分和4-1BB配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB激动剂的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF-α的组合物。
在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部
分和OX40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和Fas配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒素-α（LT-a）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒
素-β（LT-b）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD27L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和包含OMCP和核因子κB靶向分子的受体活化剂（RANKL）的组合物。
[0131] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和与NKG2D配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv）连接的细胞因子。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和与NKG2D配体连接的细胞因子，其中NKG2D配体具有SEQ ID
NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列。
NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列。
[0132] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和本文所述的融合蛋白（例如NKG2D配体和细胞因子）。组合疗法可包括本文所述的PD-1抑制剂和具有SEQ ID NO:
43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的融合蛋白。
43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的融合蛋白。
[0133] 本文进一步提供了包括本文所述的PD-1抑制剂和嵌合肽的组合疗法。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-1抑制剂和嵌合肽，所述嵌合肽包含如本文所述的细
胞因子肽和如本文所述的NKG2D配体肽。在某些情况下，细胞因子肽可选自IL2、IL7、IL15、IL18、IL21及其突变体。在一个实施方案中，组合疗法的细胞因子肽是IL或其突变体（例如，SEQ ID NO:5或6）。本文所述组合疗法中嵌合肽的NKG2D配体包括本文提供的那些配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv）。在另一个实例中，组合疗法的嵌合肽的NKG2D配体具有SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42中所示的氨基酸序列。
胞因子肽和如本文所述的NKG2D配体肽。在某些情况下，细胞因子肽可选自IL2、IL7、IL15、IL18、IL21及其突变体。在一个实施方案中，组合疗法的细胞因子肽是IL或其突变体（例如，SEQ ID NO:5或6）。本文所述组合疗法中嵌合肽的NKG2D配体包括本文提供的那些配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv）。在另一个实例中，组合疗法的嵌合肽的NKG2D配体具有SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42中所示的氨基酸序列。
[0134] 在另一个实施方案中，本文提供组合疗法，其包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。细胞因子肽是如上所述的细胞因子。抗NKG2D抗体如
上所述。
上所述。
[0135] 在一个实施方案中，组合疗法包括OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包括OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0136] 在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0137] 在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-
2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案
中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案
中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0138] 在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFv、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFv，IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/
F42K形式。
F42K形式。
[0139] 在本发明的另一个方面，本文提供了组合疗法，其包括如本文所述的组合物和PD-L1抑制剂。术语“PD-L1抑制剂”是指降低、抑制、阻断、消除或干扰PD-L1（例如，程序性细胞死亡1配体；PD-L1（CD274）；G1：30088843）（包括人PD-L1的变体、同种型、物种同源物（例如，小鼠）和具有与PD-L1的至少一种共同表位的类似物）的活性、PD-L1与其受体的结合或PD-L1的表达的部分（例如，化合物、核酸、多肽、抗体）。PD-L1抑制剂包括分子和大分子，例如化合物（小分子化合物）、核酸、多肽、抗体、肽体、双抗体、微抗体、单结构域抗体或纳米抗体、单链可变片段（ScFv）及其片段或变体。在具体的实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
PD-L1抑制剂（包括抗PD-L1抗体）可以拮抗PD-L1活性、其与PD-1的结合或其表达。示例性PD-L1抑制剂包括但不限于度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维单抗、阿特朱单抗
(atezolizumab)、BMS-936559、STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014和STI-A1015。
PD-L1抑制剂（包括抗PD-L1抗体）可以拮抗PD-L1活性、其与PD-1的结合或其表达。示例性PD-L1抑制剂包括但不限于度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维单抗、阿特朱单抗
(atezolizumab)、BMS-936559、STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014和STI-A1015。
[0140] 在一个方面，本发明包括组合疗法，其包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含与本文提供的NKG2D配体连接的如本文提供的细胞因子的组合物。在一些实施方案中，PD-L1抑制
剂是度伐鲁单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特朱单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是BMS-936559。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014或STI-A1015。
剂是度伐鲁单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特朱单抗。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是BMS-936559。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是STI-A1010、STI-A1011、STI-A1012、STI-A1013、STI-A1014或STI-A1015。
[0141] 该组合物可进一步包含如本文所述的接头，以将细胞因子与本文提供的配体连接。细胞因子是本文所述的细胞因子。例如，细胞因子可以是IL1家族细胞因子，包括本文所述的那些（例如，IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38和IL33。
例如，细胞因子可以是IL2亚家族细胞因子，例如IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一些实施方案中，细胞因子是IL2。在其他实施方案中，细胞因子是IL2的突变体R38A/F42K形式。例如，细胞因子可以是如本文所述的干扰素（例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IL10R2或IFNLR1）。在另一个实例中，细胞因子是白细胞介素，例如但不限于IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36。在另一个实例中，细胞因子是TNFSF家族的成员，例如但不限于TNF(TNFα)、CD40L (TNFSF5)、CD70 (TNFSF7)、EDA、FASLG (TNFSF6)、LTA (TNFSF1)、LTB (TNFSF3)、TNFSF4 (OX40L)、TNFSF8 (CD153)、TNFSF9 (4-1BBL)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11
(RANKL)、TNFSF12 (TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。NKG2D配体如上所述。例如，配体可以是如本文所述的NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F或NKG2H。
配体可选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1或OMCP。在某些情况下，NKG2D配体是如本文所述的OMCP（例如，SEQ ID NO:
7、13或14）。
例如，细胞因子可以是IL2亚家族细胞因子，例如IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在一些实施方案中，细胞因子是IL2。在其他实施方案中，细胞因子是IL2的突变体R38A/F42K形式。例如，细胞因子可以是如本文所述的干扰素（例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IL10R2或IFNLR1）。在另一个实例中，细胞因子是白细胞介素，例如但不限于IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 (CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36。在另一个实例中，细胞因子是TNFSF家族的成员，例如但不限于TNF(TNFα)、CD40L (TNFSF5)、CD70 (TNFSF7)、EDA、FASLG (TNFSF6)、LTA (TNFSF1)、LTB (TNFSF3)、TNFSF4 (OX40L)、TNFSF8 (CD153)、TNFSF9 (4-1BBL)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11
(RANKL)、TNFSF12 (TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18。NKG2D配体如上所述。例如，配体可以是如本文所述的NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F或NKG2H。
配体可选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae1、H60a、H60b、H60c、h-HLA-A、Mult1或OMCP。在某些情况下，NKG2D配体是如本文所述的OMCP（例如，SEQ ID NO:
7、13或14）。
[0142] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和靶向分子的组合物。OMCP可以与靶向分子连接，或者OMCP的部分可以与靶
向分子连接。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和肿瘤坏死因子（TNF）家族成员的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF相关的凋亡诱导靶向
分子的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的
PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB激动剂的组合物。在一个实施方案
中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF-α的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和OX40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和
包含如本文提供的OMCP或其部分和Fas配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒素-α（LT-a）的组合物。
在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其
部分和淋巴毒素-β（LT-b）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD27L的组合物。在一个实
施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含OMCP和核因子κB靶向分子的受体
活化剂（RANKL）的组合物。
向分子连接。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和肿瘤坏死因子（TNF）家族成员的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF相关的凋亡诱导靶向
分子的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的
PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和4-1BB激动剂的组合物。在一个实施方案
中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和TNF-α的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和OX40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和
包含如本文提供的OMCP或其部分和Fas配体的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和淋巴毒素-α（LT-a）的组合物。
在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其
部分和淋巴毒素-β（LT-b）的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD40L的组合物。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含如本文提供的OMCP或其部分和CD27L的组合物。在一个实
施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和包含OMCP和核因子κB靶向分子的受体
活化剂（RANKL）的组合物。
[0143] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和与NKG2D配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv）连接的细胞因子。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和与NKG2D配体连接的细胞因子，其中NKG2D配体具有SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列。
[0144] 在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和本文所述的融合蛋白（例如NKG2D配体和细胞因子）。组合疗法可包括本文所述的PD-L1抑制剂和具有SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的融合蛋白。
[0145] 本文进一步提供了包括本文所述的PD-L1抑制剂和嵌合肽的组合疗法。在一个实施方案中，组合疗法包括本文所述的PD-L1抑制剂和嵌合肽，所述嵌合肽包括如本文所述的细胞因子肽和如本文所述的NKG2D配体肽。在某些情况下，细胞因子肽可选自IL2、IL7、
IL15、IL18、IL21及其突变体。在一个实施方案中，组合疗法的细胞因子肽是IL或其突变体（例如，SEQ ID NO:5或6）。本文所述组合疗法中嵌合肽的NKG2D配体包括本文提供的那些配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv。在另一个实例中，组合疗法的嵌合肽的NKG2D配体具有SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42中所示的氨基酸序列。
IL15、IL18、IL21及其突变体。在一个实施方案中，组合疗法的细胞因子肽是IL或其突变体（例如，SEQ ID NO:5或6）。本文所述组合疗法中嵌合肽的NKG2D配体包括本文提供的那些配体（例如，KYK-1、KYK-1的scFv、KYK-2或KYK-2的scFv。在另一个实例中，组合疗法的嵌合肽的NKG2D配体具有SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42中所示的氨基酸序列。
[0146] 在另一个实施方案中，本文提供了组合疗法，其包括本文提供的PD-L1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。细胞因子肽是如上所述的细胞因子。抗NKG2D抗体
如上所述。
如上所述。
[0147] 在另一个实施方案中，本文提供了组合疗法，其包括本文提供的PD-L1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。细胞因子肽是如上所述的细胞因子。抗NKG2D抗体
如上所述。
如上所述。
[0148] 在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-L1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0149] 在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-L1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0150] 在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0151] 在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFv、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFv、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
[0152] （g）优选实施方案通过非限制性实例，图23中描绘了本发明的几种优选组合物。1.描绘了包含与细胞因
子连接的OMCP的α2结构域（H2）的组合物。2.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所述组合物是聚乙二醇化的。3.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所
述组合物包含N-聚糖。4.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所述接头包括
各种序列和各种长度。5.描绘了包含与细胞因子连接的NKG2D的Fab特异性抗体的组合物。
6.描绘了包含与细胞因子连接的各种NKG2D配体的组合物。7.描绘了包含与细胞因子连接
的突变形式的OMCP的组合物，其中OMCP可以突变以具有改善的结合亲和力或更弱的结合亲
和力。8.描绘了包含与细胞因子连接的突变形式的OMCP的组合物，其中OMCP可以突变以对
其他NKG2受体具有结合亲和力。9.描绘了包含与细胞因子连接的病毒蛋白的组合物。例如，OMCP与NKG2D结合。另外，CPXV203与MHCI结合。10.描绘了包含与突变的细胞因子连接的
OMCP的组合物。应理解，OMCP序列可来自各种来源，例如牛痘或猴痘。此外，可以使用OMCP和IL2的Fc嵌合体及其变体。
子连接的OMCP的α2结构域（H2）的组合物。2.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所述组合物是聚乙二醇化的。3.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所
述组合物包含N-聚糖。4.描绘了包含与细胞因子连接的OMCP的组合物，其中所述接头包括
各种序列和各种长度。5.描绘了包含与细胞因子连接的NKG2D的Fab特异性抗体的组合物。
6.描绘了包含与细胞因子连接的各种NKG2D配体的组合物。7.描绘了包含与细胞因子连接
的突变形式的OMCP的组合物，其中OMCP可以突变以具有改善的结合亲和力或更弱的结合亲
和力。8.描绘了包含与细胞因子连接的突变形式的OMCP的组合物，其中OMCP可以突变以对
其他NKG2受体具有结合亲和力。9.描绘了包含与细胞因子连接的病毒蛋白的组合物。例如，OMCP与NKG2D结合。另外，CPXV203与MHCI结合。10.描绘了包含与突变的细胞因子连接的
OMCP的组合物。应理解，OMCP序列可来自各种来源，例如牛痘或猴痘。此外，可以使用OMCP和IL2的Fc嵌合体及其变体。
[0153] 在优选的实施方案中，组合物包含与OMCP连接的IL2、IL15或IL18。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与OMCP连接的IL2、IL15或IL18。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含约20至约30个氨基酸的肽接头与OMCP连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0154] 在优选的实施方案中，组合物包含与抗NKG2D抗体连接的IL2、IL15或IL18。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2、IL15或IL18。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含约20至约30个氨基酸的肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0155] 在不同的优选实施方案中，组合物包含与OMCP连接的IL2。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与OMCP连接的IL2。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含约20至约30个氨基酸的肽接头与OMCP连接的IL2。在仍还另一个优选的实施方
案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的IL2。在每个前述实
施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的IL2。在每个前述实
施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0156] 在不同的优选实施方案中，组合物包含与抗NKG2D抗体连接的IL2。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2。在仍另一个优选的实施
方案中，组合物包含通过包含约20至约30个氨基酸的肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2。在
仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与抗
NKG2D抗体连接的IL2。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突
变形式。
方案中，组合物包含通过包含约20至约30个氨基酸的肽接头与抗NKG2D抗体连接的IL2。在
仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过包含FLAG标签和His标签的肽接头与抗
NKG2D抗体连接的IL2。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突
变形式。
[0157] 在一个示例性实施方案中，NKG2D配体是抗NKG2D抗体或其scFv，例如KYK-1抗体、KYK-2抗体、KYK-1 scFv或KYK-2 scFv。在一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中抗NKG2D抗体是与mutIL2连接的KYK-1，并且包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列
或者可选地，包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列
。
在另一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中抗NKG2D抗体是与mutIL2连接
的KYK-2，并且包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列
或者可选地，包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列
。
或者可选地，包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列
。
在另一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中抗NKG2D抗体是与mutIL2连接
的KYK-2，并且包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列
或者可选地，包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列
。
[0158] 在一个示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:10所示的DNA序列。
[0159] 在另一个示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
[0160] 在优选的实施方案中，组合物包含与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片
段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽
接头与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建
体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L
的突变形式。
段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽
接头与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建
体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L
的突变形式。
[0161] 在优选的实施方案中，组合物包含与抗NKG2D抗体连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L
或4-1BBL或其片段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约
30个氨基酸的肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个
优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接
的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是
包含突变N166A和F180A的OX40L的突变形式。
或4-1BBL或其片段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约
30个氨基酸的肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个
优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接
的OX40L或4-1BBL或其片段构建体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是
包含突变N166A和F180A的OX40L的突变形式。
[0162] 在不同的优选实施方案中，组合物包含与OMCP连接的OX40L或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与OMCP连接的OX40L或其片段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与OMCP连接
的OX40L或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的OX40L或其片段构建体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L的突变形式。
的OX40L或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的OX40L或其片段构建体。在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L的突变形式。
[0163] 在优选的实施方案中，组合物包含与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段
构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接
头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物
包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段构建体。
在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L的突
变形式。
构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接
头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物
包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接的OX40L或其片段构建体。
在每个前述实施方案中，OX40L或其片段构建体可以是包含突变N166A和F180A的OX40L的突
变形式。
[0164] 在示例性的实施方案中，NKG2D配体是OMCP。在示例性的实施方案中，细胞因子是OX40L。在一个具体的示例性实施方案中，细胞因子是包含OX40L片段的构建体。在一个具体的示例性实施方案中，将OX40L片段组合成连续构建体。在一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中OMCP通过接头肽与OX40L构建体连接，并且包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列
。
在一个具体的示例性实施方案中，细胞因子是包含突变的OX40L片段的构建体，所述突
变的OX40L片段在氨基酸位置N166A和F180A处含有突变。在一个具体的示例性实施方案中，在具有或不具有未突变的OX40L片段的情况下，将突变的OX40L片段组合成连续构建体。在
一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中OMCP通过接头肽与突变的OX40L构建体连接，并且包含SEQ ID NO:63
中所示的氨基酸序列。
。
在一个具体的示例性实施方案中，细胞因子是包含突变的OX40L片段的构建体，所述突
变的OX40L片段在氨基酸位置N166A和F180A处含有突变。在一个具体的示例性实施方案中，在具有或不具有未突变的OX40L片段的情况下，将突变的OX40L片段组合成连续构建体。在
一个具体的示例性实施方案中，提供了嵌合肽，其中OMCP通过接头肽与突变的OX40L构建体连接，并且包含SEQ ID NO:63
中所示的氨基酸序列。
[0165] 在不同的优选实施方案中，组合物包含与OMCP连接的4-1BBL或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与OMCP连接的4-1BBL或其片段构建体。
在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与OMCP
连接的4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有
FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的4-1BBL或其片段构建体。
在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与OMCP
连接的4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有
FLAG标签和His标签的肽接头与OMCP连接的4-1BBL或其片段构建体。
[0166] 在不同的优选实施方案中，组合物包含与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段构建体。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段构建体。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸
的肽接头与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段
构建体。
的肽接头与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段构建体。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与抗NKG2D抗体连接的4-1BBL或其片段
构建体。
[0167] 在示例性的实施方案中，NKG2D配体是OMCP。在示例性的实施方案中，细胞因子是4-1BBL。在一个具体的示例性实施方案中，细胞因子是包含4-1BBL片段的构建体。在一个具体的示例性实施方案中，将4-1BBL片段组合入连续构建体中。在一个具体的示例性实施方
案中，提供了嵌合肽，其中OMCP通过接头肽与4-1BBL构建体连接，并且包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列
。
案中，提供了嵌合肽，其中OMCP通过接头肽与4-1BBL构建体连接，并且包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列
。
[0168] 在另一个优选的实施方案中，组合物包含OMCP或其部分和靶向分子。在另一个优选的实施方案中，OMCP或其部分通过接头连接靶向分子。在仍还另一个优选的实施方案中，OMCP的部分包含H2b OMCP的活化部分。在具体的优选实施方案中，OMCP的活化部分包含H2B螺旋。
[0169] 在另一个非限制性实例中，结合PD1受体的本发明的几个优选的组合物描绘在图36中。
[0170] 在优选的实施方案中，组合物包含与PDL1连接的IL2、IL15或IL18。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与PDL1连接的IL2、IL15或IL18。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与PDL1连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与PDL1连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0171] 在另一个优选的实施方案中，组合物包含与PDL2连接的IL2、IL15或IL18。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与PDL2连接的IL2、IL15或IL18。在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与PDL2连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有FLAG标签和His标签的肽接头与PDL2连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0172] 在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含与抗PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。在另一个优选的实施方案中，组合物包含通过肽接头与抗PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。
在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与抗
PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有
FLAG标签和His标签的肽接头与抗PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案
中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
在仍另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有约20至约30个氨基酸的肽接头与抗
PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。在仍还另一个优选的实施方案中，组合物包含通过含有
FLAG标签和His标签的肽接头与抗PD1抗体连接的IL2、IL15或IL18。在每个前述实施方案
中，IL2可以是包含突变R38A和F42K的IL2的突变形式。
[0173] 在一个示例性实施方案中，PD1配体是PDL1。在一个具体的示例性实施方案中，提供了一种嵌合肽，其中PD1配体是与mutIL2连接的PDL1并且包含
中所示的氨基酸序列。在具体的示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:47中所示
的DNA序列
。
中所示的氨基酸序列。在具体的示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:47中所示
的DNA序列
。
[0174] 在一个示例性实施方案中，PD1配体是PDL2。在一个具体的示例性实施方案，提供了一种嵌合肽，其中PD1配体是与mutIL2连接的PDL2并且包含
中所示的氨基酸序列。在具体的示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:49中所示
的DNA序列
中所示的氨基酸序列。在具体的示例性实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:49中所示
的DNA序列
[0175] （h）药物组合物本公开还提供了药物组合物。药物组合物可包含作为活性成分的上文详述的本发明的
组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。本文提供的药物组合物还可包含如本文所述的
组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。
组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。本文提供的药物组合物还可包含如本文所述的
组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。
[0176] 药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、pH调节剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂、掩味剂、调味剂或着色剂。用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型可根据药学科学的已知原理进行选择。
[0177] 在一个实施方案中，赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩的（即可塑性可变形的）或研磨脆性的。合适的可压缩稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素（MCC）、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯（即乙酸酯和丁酸酯混合酯）、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、羟基乙酸淀粉钠、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖一水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露醇、麦芽糖醇(malitol)、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖糊精和海藻糖。合适的研磨脆性的稀释剂的非限制性实例包括磷酸氢钙（无水或二水合物）、磷酸钙、碳酸钙和碳酸镁。
[0178] 在另一个实施方案中，赋形剂可以是粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖、多肽、寡肽及其组合。
[0179] 在另一个实施方案中，赋形剂可以是填充剂。合适的填充剂包括但不限于碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填充剂可以是硫酸钙（二盐基和三盐基的(di- and tri-basic)）、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、磷酸氢钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性的淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇。
[0181] 在各种实施方案中，赋形剂可以是pH调节剂。作为非限制性实例，pH调节剂可以是碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸或磷酸。
[0182] 在进一步的实施方案中，赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是非泡腾的或泡腾的。非泡腾崩解剂的合适实例包括但不限于淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉（其预胶化和改性淀粉），甜味剂，粘土，例如膨润土，微晶纤维素，藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，树胶，例如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、刺梧桐胶、pecitin和黄蓍胶。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合和碳酸氢钠以及酒石酸的组合。
[0183] 在仍另一个实施方案中，赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。合适的分散剂可包括但不限于淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素。
[0184] 在另一个可选的实施方案中，赋形剂可以是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，例如BHA、BHT、维生素A、维生素C、维生素E或棕榈酸视黄酯、柠檬酸、柠檬酸钠；螯合剂诸如EDTA或EGTA；和抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇或苯酚。
[0186] 在仍另一个实施方案中，赋形剂可以是掩味剂。掩味材料包括纤维素醚；聚乙二醇；聚乙烯醇；聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物；甘油单酯或甘油三酯；丙烯酸聚合物；丙烯酸聚合物与纤维素醚的混合物；邻苯二甲酸乙酸纤维素；及其组合。
[0187] 在可选的实施方案中，赋形剂可以是调味剂。调味剂可选自合成香料油和调味芳香剂和/或天然油，来自植物、叶、花、果实的提取物及其组合。
[0189] 组合物中赋形剂或赋形剂组合的重量分数可为组合物的总重量的约99％或更低、约97％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约45％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约2％或约1％或更低。
[0190] 该组合物可以配制成各种剂型，并通过许多不同的方法施用，所述方法将递送治疗有效量的活性成分。这些组合物可以以含有如所需的常规无毒的药学上可接受的载体、
助剂和媒介物的剂量单位制剂口服、肠胃外或局部施用。局部施用还可以涉及使用经皮施
用，例如透皮贴剂或离子电渗疗法装置。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内或胸骨内注射或输注技术。药物的配制在例如Gennaro, A. R., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (第18版, 1995)和
Liberman, H. A. 和 Lachman, L., 编辑, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel
Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)中讨论。
助剂和媒介物的剂量单位制剂口服、肠胃外或局部施用。局部施用还可以涉及使用经皮施
用，例如透皮贴剂或离子电渗疗法装置。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内或胸骨内注射或输注技术。药物的配制在例如Gennaro, A. R., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (第18版, 1995)和
Liberman, H. A. 和 Lachman, L., 编辑, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel
Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)中讨论。
[0191] 用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、粉剂、球丸和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性成分通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合，所述赋形剂的实例如上详述。口服制剂也可以作为水悬浮液、酏剂或糖浆施用。对于这些，活性成分可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂和（如果需要的话）乳化剂和/或悬浮剂、以及稀释剂如水、乙醇、甘油及其组合进行组合。
[0192] 对于肠胃外施用（包括皮下、皮内、静脉内、肌内和腹膜内），制剂可以是水溶液或油基溶液。水溶液可包括无菌稀释剂，例如水、盐水溶液，药学上可接受的多元醇，例如甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌和/或抗真菌剂，如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚，硫柳汞等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或用于调整张力的试剂，例如氯化钠、葡萄糖或多元醇如甘露醇或山梨糖醇。可以用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节水溶液的pH。油基溶液或悬浮液可进一步包含芝麻油、花生油、橄榄油或矿物油。
[0193] 对于局部（例如，经皮或经粘膜）施用，适合于渗透屏障的渗透剂通常包括在制剂中。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂、气溶胶喷雾剂、片剂或栓剂来完成，并且经皮施用可以通过本领域公知的软膏、药膏、凝胶、贴剂或霜剂。
[0194] 在某些实施方案中，将包含本发明化合物的组合物包封在合适的媒介物中，以有助于将化合物递送至靶细胞，增加组合物的稳定性，或使组合物的潜在毒性最小化。如本领域技术人员所理解的，各种媒介物适合于递送本发明的组合物。合适的结构化流体递送系
统的非限制性实例可包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状大分子和其他含磷脂的系统。将组合物掺入递送媒介物的方法是本领域已知的。
统的非限制性实例可包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状大分子和其他含磷脂的系统。将组合物掺入递送媒介物的方法是本领域已知的。
[0195] 在一个可选的实施方案中，可以采用脂质体递送媒介物。取决于实施方案，鉴于其结构和化学性质，脂质体适合于递送本发明的化合物。一般而言，脂质体是具有磷脂双层膜的球形囊泡。脂质体的脂质双层可以与其他双层（例如，细胞膜）融合，从而将脂质体的内容物递送至细胞。以这种方式，本发明的化合物可以通过包封在与靶细胞膜融合的脂质体中而选择性地递送至细胞。
[0196] 脂质体可以由多种不同类型的具有不同烃链长度的磷脂构成。磷脂通常包含通过甘油磷酸酯连接到各种极性基团之一的两种脂肪酸。合适的磷脂包括磷脂酸（PA）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、二磷脂酰甘油（DPG）、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）。包含磷脂的脂肪酸链的长度范围可以为约6至约26个碳原子，并且脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括（括号中呈现常用名）正十二烷酸酯（月桂酸酯）、正十四烷酸酯（肉豆蔻酸酯）、正十六烷酸酯（棕榈酸酯）、正十八烷酸酯（硬脂酸酯）、正二十烷酸酯（花生酸酯）、正二十二烷酸酯（山嵛酸酯）、正二十四烷酸酯（木蜡酸酯）、顺-
9-十六烯酸酯（棕榈油酸酯）、顺-9-十八烯酸酯（油酸酯）、顺,顺-9,12-十八碳二烯酸酯（亚油酸酯）、所有的顺-9,12,15-十八碳三烯酸酯（亚麻酸酯）和所有顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸酯（花生四烯酸酯）。磷脂的两个脂肪酸链可以相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS、二油酰PC、二硬脂酰PS、二硬脂酰PC、二肉豆蔻酰PS、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PG、硬脂酰基、油酰基PS、棕榈酰基、亚麻基PS等。
9-十六烯酸酯（棕榈油酸酯）、顺-9-十八烯酸酯（油酸酯）、顺,顺-9,12-十八碳二烯酸酯（亚油酸酯）、所有的顺-9,12,15-十八碳三烯酸酯（亚麻酸酯）和所有顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸酯（花生四烯酸酯）。磷脂的两个脂肪酸链可以相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS、二油酰PC、二硬脂酰PS、二硬脂酰PC、二肉豆蔻酰PS、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PG、硬脂酰基、油酰基PS、棕榈酰基、亚麻基PS等。
[0197] 磷脂可以来自任何天然来源，并且因此可以包含磷脂的混合物。例如，蛋黄富含PC、PG和PE，大豆含有PC、PE、PI和PA，和动物脑或脊髓富含PS。磷脂也可能来自合成来源。可以使用具有不同比例的各种磷脂的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可产生具有有利的活性
或活性稳定性特性的脂质体组合物。上述磷脂可以与阳离子脂质以最佳比例混合，所述阳
离子脂质例如N-(1-(2,3-二油酰基氧基(dioleolyoxy))丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、1,
1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐、3,3'-二庚基氧化碳菁碘化物、1,1'-
十二烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐、1,1'-二油基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁甲
磺酸盐、N-4- (二亚 油基氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物（N-4-
(delinoleylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide）或1,1-二亚油基-3,3,3',3'-四
甲基吲哚菁高氯酸盐。
或活性稳定性特性的脂质体组合物。上述磷脂可以与阳离子脂质以最佳比例混合，所述阳
离子脂质例如N-(1-(2,3-二油酰基氧基(dioleolyoxy))丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、1,
1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐、3,3'-二庚基氧化碳菁碘化物、1,1'-
十二烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐、1,1'-二油基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁甲
磺酸盐、N-4- (二亚 油基氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物（N-4-
(delinoleylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide）或1,1-二亚油基-3,3,3',3'-四
甲基吲哚菁高氯酸盐。
[0198] 脂质体可任选地包含鞘脂（其中鞘氨醇是甘油的结构对应物）和磷酸甘油酯的一种脂肪酸之一、或胆固醇（动物细胞膜的主要成分）。脂质体可任选地含有聚乙二醇化脂质，其是与聚乙二醇（PEG）的聚合物共价连接的脂质。PEG的尺寸范围可为约500至约10,000道尔顿。
[0200] 携带本发明的化合物（即，具有至少一种甲硫氨酸化合物）的脂质体可以通过任何已知的制备用于药物递送的脂质体的方法来制备，例如，在美国专利号4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,
064,655、5,077,211和5,264,618中详述的，其公开内容通过引用以其整体并入本文。例如，脂质体可以通过在水溶液中超声处理脂质、溶剂注射、脂质水合，反向蒸发或通过反复冷冻和解冻来冷冻干燥来制备。在优选的实施方案中，脂质体通过超声处理形成。脂质体可以是多层的（其像洋葱一样具有许多层）或单层的。脂质体可以是大的或小的。持续的高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。
064,655、5,077,211和5,264,618中详述的，其公开内容通过引用以其整体并入本文。例如，脂质体可以通过在水溶液中超声处理脂质、溶剂注射、脂质水合，反向蒸发或通过反复冷冻和解冻来冷冻干燥来制备。在优选的实施方案中，脂质体通过超声处理形成。脂质体可以是多层的（其像洋葱一样具有许多层）或单层的。脂质体可以是大的或小的。持续的高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。
[0202] 在另一个实施方案中，本发明的组合物可以作为微乳液递送至细胞。微乳液通常是透明的、热力学稳定的溶液，其包含水溶液、表面活性剂和“油”。这种情况下的“油”是超临界流体相。表面活性剂停留在油-水界面。各种表面活性剂中的任何一种都适合用于微乳液制剂，包括本文所述的那些或本领域另外已知的那些。适合用于本发明的含水微结构域
通常具有约5nm至约100nm的特征结构维度。这种尺寸的聚集体是可见光的差的散射体，且
因此，这些溶液是光学透明的。如技术人员所理解的，微乳液可以并且将具有多种不同的微观结构，包括球形、棒形或盘形聚集体。在一个实施方案中，该结构可以是胶束，其是最简单的微乳液结构，所述微乳液结构通常是球形或圆柱形物体。胶束就像水中的油滴，且反胶束就像油中的水滴。在一个可选的实施方案中，微乳液结构是薄片。它包括由表面活性剂的层分隔的水和油的连续层。微乳液的“油”最佳地包含磷脂。以上针对脂质体详述的任何磷脂都适用于涉及微乳液的实施方案。可以通过本领域公知的任何方法将本发明的组合物包封
在微乳液中。
通常具有约5nm至约100nm的特征结构维度。这种尺寸的聚集体是可见光的差的散射体，且
因此，这些溶液是光学透明的。如技术人员所理解的，微乳液可以并且将具有多种不同的微观结构，包括球形、棒形或盘形聚集体。在一个实施方案中，该结构可以是胶束，其是最简单的微乳液结构，所述微乳液结构通常是球形或圆柱形物体。胶束就像水中的油滴，且反胶束就像油中的水滴。在一个可选的实施方案中，微乳液结构是薄片。它包括由表面活性剂的层分隔的水和油的连续层。微乳液的“油”最佳地包含磷脂。以上针对脂质体详述的任何磷脂都适用于涉及微乳液的实施方案。可以通过本领域公知的任何方法将本发明的组合物包封
在微乳液中。
[0203] 在仍另一个实施方案中，本发明的组合物可以在树枝状大分子或树状物中递送。一般而言，树状物是分枝的树状分子，其中每个分枝是分子互连的链，其在一定长度之后分成两个新的分枝（分子）。这种分枝一直持续到树枝（分子）变得如此密集包装，以至于树冠形成一个球体。通常，树状物的性质由其表面的官能团决定。例如，亲水性端基（例如羧基）通常会形成水溶性树状物。或者，磷脂可以掺入树状物的表面中以促进跨皮肤的吸收。详述用于脂质体实施方案的任何磷脂都适合用于树状物实施方案。可以使用本领域公知的任何
方法制备树状物并将本发明的组合物包封在其中。例如，树状物可以通过反应步骤的迭代
序列产生，其中每次额外的迭代产生更高级的树状物。因此，它们具有规则的、高度分枝的
3D结构，且具有几乎均匀的尺寸和形状。此外，树状物的最终大小通常由合成期间使用的迭代步骤的数量控制。各种树状物尺寸适合用于本发明。通常，树状物的尺寸范围可以为约
1nm至约100nm。
方法制备树状物并将本发明的组合物包封在其中。例如，树状物可以通过反应步骤的迭代
序列产生，其中每次额外的迭代产生更高级的树状物。因此，它们具有规则的、高度分枝的
3D结构，且具有几乎均匀的尺寸和形状。此外，树状物的最终大小通常由合成期间使用的迭代步骤的数量控制。各种树状物尺寸适合用于本发明。通常，树状物的尺寸范围可以为约
1nm至约100nm。
[0204] II. 方法一方面，本发明包括将细胞因子递送至靶细胞的方法。该方法包括使靶细胞与包含与
配体连接的细胞因子的组合物接触，其中配体特异性结合靶细胞上的受体。另外，该方法包括使靶细胞与包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物接触。靶细胞可以是包含配体特异性
结合的靶受体的任何细胞。配体和特异性结合在部分I中描述。在某些实施方案中，靶细胞可以是免疫细胞。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，靶细胞是天然杀伤（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在其他实施方案中，靶细胞是表达NKG2D的细胞。表达NKG2D的细胞的非限制性实例包括天然杀伤（NK）细胞和CD8+ T细胞（αβ和γδ两者）。在仍其他实施方案中，靶细胞是表达PD1的细胞。表达PD1的细胞的非限制性实例包括NK细胞，CD8+ T细胞和骨髓细胞。在一些实施方案中，治疗方法包括包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗
PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供递送细胞因子至靶细胞的方法，其包括施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供递送细胞因子至靶细胞的方法，其包括施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞
因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1
抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗
PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，靶细胞是主体的靶细胞。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。如本文所用的术语“有效量”指足以导致期望结果的本文提供的药物组合物的量。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
配体连接的细胞因子的组合物接触，其中配体特异性结合靶细胞上的受体。另外，该方法包括使靶细胞与包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物接触。靶细胞可以是包含配体特异性
结合的靶受体的任何细胞。配体和特异性结合在部分I中描述。在某些实施方案中，靶细胞可以是免疫细胞。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，靶细胞是天然杀伤（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在其他实施方案中，靶细胞是表达NKG2D的细胞。表达NKG2D的细胞的非限制性实例包括天然杀伤（NK）细胞和CD8+ T细胞（αβ和γδ两者）。在仍其他实施方案中，靶细胞是表达PD1的细胞。表达PD1的细胞的非限制性实例包括NK细胞，CD8+ T细胞和骨髓细胞。在一些实施方案中，治疗方法包括包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗
PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供递送细胞因子至靶细胞的方法，其包括施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供递送细胞因子至靶细胞的方法，其包括施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞
因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1
抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗
PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，靶细胞是主体的靶细胞。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。如本文所用的术语“有效量”指足以导致期望结果的本文提供的药物组合物的量。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
[0205] 在另一方面，本发明包括活化免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞与包含与配体连接的细胞因子的组合物接触，其中所述配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而活
化细胞。另外，在一些实施方案中，该方法包括使免疫细胞与包含如第I部分所述的嵌合肽的组合物接触。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，免疫细胞是天然杀伤（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在仍其他实施方案中，靶细胞是表达PD1的细胞。表达PD1的细胞的非限制性实例包括NK细胞，CD8+ T细胞和骨髓细胞。为了促进免疫细胞的活化，细胞因子可以是促炎细胞因子。术语“促炎细胞因子”是促进全身性炎症的细胞因子。技术人员将能够确定是促炎性的那些细胞因子。在某些实施方案中，促炎细胞因子是IL1α、IL1β、IL2、IL3、IL6、IL7、IL9、IL12、IL15、IL17、IL18、IL21、IFNα、IFNγ、TNFα、MIF、G-CSF、GM-CSF、TNFalpha、CD40L、4-1BBL、OX40L、RANKL或其突变体。在一个实施方案中，促炎细胞因子是IL1家族细胞因子。在某些实施方案中，IL1家族细胞因子选自IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38、IL33及其突变体。在具体的实施方案中，促炎细胞因子选自IL2、IL7、IL15、IL18、IL21及其突变体。在另一个具体的实施方案中，促炎细胞因子选自IL2、IL15、IL18及其突变体。在示例性实施方案中，促炎细胞因子是IL2或其突变体。在其他的某些实施方案中，促炎细胞因子是TNFSF家族细胞因子。在某些实施方案中，TNFSF家族细胞因子选自TNFα、CD40L、4-1BBL、OX40L或RANKL。在另一个具体的实施方案中，促炎细胞因子选自OX40L或4-1BBL。在示例性实施方案中，促炎细胞因子是
OX40L或其突变体。在另一个示例性实施方案中，促炎细胞因子是4-1BBL或其突变体。免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞的裂解。因此，免疫细胞的活化可以通过测定肿瘤细胞裂解
的量来测量。在一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞约10%至约100%的裂
解。在另一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞约20%至约80%的裂解。在仍另一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞大于40%的裂解。例如，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞大于40%、大于45%、大于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%或大于99%的裂解。肿瘤细胞的裂解可以使用任何标准测定（例如半胱天冬酶测定、TUNEL和DNA片段化测定、细胞渗透性测定和Annexin V测定）测量。在一些实施方案中，治疗方法包括包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含
PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供活化免疫细胞的方法，其包括施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供活化免疫细胞的方法，其包括施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D
scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，免疫细胞是主体的免疫细胞。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
化细胞。另外，在一些实施方案中，该方法包括使免疫细胞与包含如第I部分所述的嵌合肽的组合物接触。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，免疫细胞是天然杀伤（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在仍其他实施方案中，靶细胞是表达PD1的细胞。表达PD1的细胞的非限制性实例包括NK细胞，CD8+ T细胞和骨髓细胞。为了促进免疫细胞的活化，细胞因子可以是促炎细胞因子。术语“促炎细胞因子”是促进全身性炎症的细胞因子。技术人员将能够确定是促炎性的那些细胞因子。在某些实施方案中，促炎细胞因子是IL1α、IL1β、IL2、IL3、IL6、IL7、IL9、IL12、IL15、IL17、IL18、IL21、IFNα、IFNγ、TNFα、MIF、G-CSF、GM-CSF、TNFalpha、CD40L、4-1BBL、OX40L、RANKL或其突变体。在一个实施方案中，促炎细胞因子是IL1家族细胞因子。在某些实施方案中，IL1家族细胞因子选自IL1α、IL1β、IL1Ra、IL18、IL36Ra、IL36α、IL37、IL36β、IL36γ、IL38、IL33及其突变体。在具体的实施方案中，促炎细胞因子选自IL2、IL7、IL15、IL18、IL21及其突变体。在另一个具体的实施方案中，促炎细胞因子选自IL2、IL15、IL18及其突变体。在示例性实施方案中，促炎细胞因子是IL2或其突变体。在其他的某些实施方案中，促炎细胞因子是TNFSF家族细胞因子。在某些实施方案中，TNFSF家族细胞因子选自TNFα、CD40L、4-1BBL、OX40L或RANKL。在另一个具体的实施方案中，促炎细胞因子选自OX40L或4-1BBL。在示例性实施方案中，促炎细胞因子是
OX40L或其突变体。在另一个示例性实施方案中，促炎细胞因子是4-1BBL或其突变体。免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞的裂解。因此，免疫细胞的活化可以通过测定肿瘤细胞裂解
的量来测量。在一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞约10%至约100%的裂
解。在另一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞约20%至约80%的裂解。在仍另一个实施方案中，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞大于40%的裂解。例如，免疫细胞的活化可以导致肿瘤细胞大于40%、大于45%、大于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%或大于99%的裂解。肿瘤细胞的裂解可以使用任何标准测定（例如半胱天冬酶测定、TUNEL和DNA片段化测定、细胞渗透性测定和Annexin V测定）测量。在一些实施方案中，治疗方法包括包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含
PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供活化免疫细胞的方法，其包括施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供活化免疫细胞的方法，其包括施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D
scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，免疫细胞是主体的免疫细胞。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
[0206] 在仍另一方面，本发明包括治疗肿瘤的方法。该方法包括鉴定具有肿瘤的主体和向主体施用包含与配体连接的细胞因子的组合物，其中所述配体特异性结合靶细胞上的受
体。另外，该方法包括向主体施用包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物。具体地，本发明人已经显示将细胞因子递送至靶细胞活化由组合物结合的细胞，其中活化的细胞特异性裂解
肿瘤细胞，从而减少了癌细胞的量。在一个具体实施方案中，细胞因子是如前段所述的促炎细胞因子。因此，本发明的组合物可用于治疗、稳定和预防主体中的癌症和相关疾病。“治疗、稳定或预防癌症”是指导致肿瘤大小或癌细胞数量减少，减缓或预防肿瘤大小增加或癌细胞增殖，增加肿瘤或其他癌症消失与其再现之间的无病存活时间，预防肿瘤或其他癌症
的初始或随后发生，或减少与肿瘤或其他癌症相关的不良症状。发明人已经表明，本发明的组合物活化由组合物结合的天然杀伤（NK）细胞，其中活化的NK细胞特异性裂解肿瘤细胞，从而减少肿瘤细胞的量。例如，当癌细胞“受到应激”时，NKG2D配体变得上调，使细胞易受NK细胞介导的裂解。在期望的实施方案中，在治疗中存活的肿瘤或癌细胞的百分比比肿瘤或
癌细胞的初始数量低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，如使用任何标准测定（例如半胱天冬酶测定、TUNEL和DNA片段化测定、细胞渗透性测定和Annexin V测定）所测量的。理想地，通过施用本发明的组合物诱导的肿瘤或癌细胞数量的减少是非肿瘤或非癌细胞数量的减少的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。理想地，本发明的方法导致肿瘤大小或癌细胞数量20、30、40、50、60、50、80、90或100%的降低，如使用标准方法所测定的。理想地，至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%的经治疗的主体具有其中肿瘤或癌症的所有证据均消失的完全缓解。理想地，肿瘤或癌症不再现或在至少1、2、3、4、5、10、
15或20年后再现。在一些实施方案中，方法还包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。
在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。 在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的肿瘤的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的肿瘤的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的
嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗
NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制
剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提
供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在具体的实施方案中，肿瘤是肺肿瘤。
体。另外，该方法包括向主体施用包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物。具体地，本发明人已经显示将细胞因子递送至靶细胞活化由组合物结合的细胞，其中活化的细胞特异性裂解
肿瘤细胞，从而减少了癌细胞的量。在一个具体实施方案中，细胞因子是如前段所述的促炎细胞因子。因此，本发明的组合物可用于治疗、稳定和预防主体中的癌症和相关疾病。“治疗、稳定或预防癌症”是指导致肿瘤大小或癌细胞数量减少，减缓或预防肿瘤大小增加或癌细胞增殖，增加肿瘤或其他癌症消失与其再现之间的无病存活时间，预防肿瘤或其他癌症
的初始或随后发生，或减少与肿瘤或其他癌症相关的不良症状。发明人已经表明，本发明的组合物活化由组合物结合的天然杀伤（NK）细胞，其中活化的NK细胞特异性裂解肿瘤细胞，从而减少肿瘤细胞的量。例如，当癌细胞“受到应激”时，NKG2D配体变得上调，使细胞易受NK细胞介导的裂解。在期望的实施方案中，在治疗中存活的肿瘤或癌细胞的百分比比肿瘤或
癌细胞的初始数量低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，如使用任何标准测定（例如半胱天冬酶测定、TUNEL和DNA片段化测定、细胞渗透性测定和Annexin V测定）所测量的。理想地，通过施用本发明的组合物诱导的肿瘤或癌细胞数量的减少是非肿瘤或非癌细胞数量的减少的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。理想地，本发明的方法导致肿瘤大小或癌细胞数量20、30、40、50、60、50、80、90或100%的降低，如使用标准方法所测定的。理想地，至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%的经治疗的主体具有其中肿瘤或癌症的所有证据均消失的完全缓解。理想地，肿瘤或癌症不再现或在至少1、2、3、4、5、10、
15或20年后再现。在一些实施方案中，方法还包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。
在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。 在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的肿瘤的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的肿瘤的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的
嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗
NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制
剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提
供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在具体的实施方案中，肿瘤是肺肿瘤。
[0207] 在另一方面，本发明包括抑制免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞与包含与配体连接的细胞因子的组合物接触，其中所述配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而抑
制细胞。另外，方法包括使免疫细胞与包含如第I部分所述的嵌合肽的组合物接触。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，免疫细胞是天然杀伤
（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在一个具体的实施方案中，免疫细胞表达NKG2D。在一个可选的具体实施方案中，免疫细胞表达PD1。为了促进免疫细胞的抑制，细胞因子可以是抗炎细胞因子。术语“抗炎细胞因子”是这样的细胞因子，其抵消炎症的各个方面，例如细胞活化或促炎细胞因子的产生，且因此有助于控制炎症反应的程度。技术人员将能够确定是抗炎性的
那些细胞因子。在某些实施方案中，抗炎细胞因子是IL4、IL5、IL10、IL11、IL13、IL16、IL35、IFNα、TGFβ、G-CSF或其突变体。在具体的实施方案中，抗炎细胞因子是IL10或其突变体。在另一个实施方案中，本发明包括杀死免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞与包含与配
体连接的毒素的组合物接触，其中所述配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而杀死细胞。
抑制或杀死免疫细胞可导致治疗、稳定和预防由过度活跃的免疫细胞引起的自身免疫疾
病。表达NKG2D的细胞和/或宿主NKG2DL的异常表达与糖尿病、乳糜泻和类风湿性关节炎有
关。例如，NK细胞可以识别胰腺β细胞并将其破坏。胰腺β细胞的破坏可能导致1型糖尿病。作为另一个实例，过度活跃的免疫细胞参与移植/移植物排斥。因此，本发明的组合物可用于治疗、稳定和预防主体的自身免疫疾病。在一个具体的实施方案中，自身免疫疾病是1型糖尿病。在另一个具体的实施方案中，自身免疫性疾病是移植或移植物排斥。在仍另一个具体的实施方案中，自身免疫疾病是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供抑制主体中的免疫细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供抑制主体中的免疫细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
制细胞。另外，方法包括使免疫细胞与包含如第I部分所述的嵌合肽的组合物接触。免疫细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，免疫细胞选自巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一个具体实施方案中，免疫细胞是天然杀伤
（NK）细胞和/或CD8+ T细胞。在一个具体的实施方案中，免疫细胞表达NKG2D。在一个可选的具体实施方案中，免疫细胞表达PD1。为了促进免疫细胞的抑制，细胞因子可以是抗炎细胞因子。术语“抗炎细胞因子”是这样的细胞因子，其抵消炎症的各个方面，例如细胞活化或促炎细胞因子的产生，且因此有助于控制炎症反应的程度。技术人员将能够确定是抗炎性的
那些细胞因子。在某些实施方案中，抗炎细胞因子是IL4、IL5、IL10、IL11、IL13、IL16、IL35、IFNα、TGFβ、G-CSF或其突变体。在具体的实施方案中，抗炎细胞因子是IL10或其突变体。在另一个实施方案中，本发明包括杀死免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞与包含与配
体连接的毒素的组合物接触，其中所述配体特异性结合免疫细胞上的受体，从而杀死细胞。
抑制或杀死免疫细胞可导致治疗、稳定和预防由过度活跃的免疫细胞引起的自身免疫疾
病。表达NKG2D的细胞和/或宿主NKG2DL的异常表达与糖尿病、乳糜泻和类风湿性关节炎有
关。例如，NK细胞可以识别胰腺β细胞并将其破坏。胰腺β细胞的破坏可能导致1型糖尿病。作为另一个实例，过度活跃的免疫细胞参与移植/移植物排斥。因此，本发明的组合物可用于治疗、稳定和预防主体的自身免疫疾病。在一个具体的实施方案中，自身免疫疾病是1型糖尿病。在另一个具体的实施方案中，自身免疫性疾病是移植或移植物排斥。在仍另一个具体的实施方案中，自身免疫疾病是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供抑制主体中的免疫细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供抑制主体中的免疫细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
[0208] 在仍还另一个方面，本发明包括治疗感染的方法，其包括施用包含与配体连接的细胞因子的组合物。例如，包含与配体连接的细胞因子的组合物可以特异性结合免疫细胞，然后将其活化以靶向并裂解感染的宿主细胞。另外，该方法包括向主体施用包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物。如本文所用的术语“感染”包括在主体中或主体上存在病原体，如果所述病原体的生长被抑制，这将导致对主体有益。因此，除了提及病原体的存在之外，术语“感染”还指不想要的正常菌群。如本文所用的术语“病原体”是指可以产生疾病的传染因子。传染因子的非限制性实例包括在主体中引起疾病的病毒、细菌、朊病毒、真菌、类病毒或寄生虫。在一个具体的实施方案中，感染由病原体诸如细菌或病毒引起。在某些实施方案
中，感染是细胞内感染。在一个实施方案中，感染是病毒感染。在另一个实施方案中，病毒感染由黄病毒引起。黄病毒属是黄病毒科中病毒的一个属。黄病毒的非限制性实例包括
Gadget的Gully病毒、卡达姆病毒、夸赛纳森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、蜱传脑炎病毒、绵羊跳跃病病毒、阿罗阿病毒、登革热病毒1-4、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、墨累山谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科百拉病毒群、科科百拉病毒、巴加扎病毒、伊列乌斯病毒、以色列火鸡脑膜炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒、塞皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿蝠白细胞脑炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、丙型肝炎病毒，例如丙型肝炎病毒基因型1-6，以及GB病毒A和B。在某个实施方案中，黄病毒可选自西尼罗河病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和黄热病病毒。在一个具体的实施方案中，病毒感染由西尼罗河病毒引起。在某些实施方案中，病原体，更具体而言病毒，可以诱导NKG2D结合的蛋白的表达。因此，包含与配体连接的细胞因子的组合物可以特异性结合NK细胞，然后将其活化以靶向并裂解表达NKG2D的感染的宿主细胞。
在另一个实施方案中，包含与配体连接的细胞因子的组合物可以活化细胞毒性T淋巴细胞，其经其他靶向杀伤的机制来识别感染的细胞。在一些实施方案中，方法还包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些其他实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-
1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的感染的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的感染的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包
含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含
OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白
和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋
白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
中，感染是细胞内感染。在一个实施方案中，感染是病毒感染。在另一个实施方案中，病毒感染由黄病毒引起。黄病毒属是黄病毒科中病毒的一个属。黄病毒的非限制性实例包括
Gadget的Gully病毒、卡达姆病毒、夸赛纳森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、蜱传脑炎病毒、绵羊跳跃病病毒、阿罗阿病毒、登革热病毒1-4、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、墨累山谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科百拉病毒群、科科百拉病毒、巴加扎病毒、伊列乌斯病毒、以色列火鸡脑膜炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒、塞皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿蝠白细胞脑炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、丙型肝炎病毒，例如丙型肝炎病毒基因型1-6，以及GB病毒A和B。在某个实施方案中，黄病毒可选自西尼罗河病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和黄热病病毒。在一个具体的实施方案中，病毒感染由西尼罗河病毒引起。在某些实施方案中，病原体，更具体而言病毒，可以诱导NKG2D结合的蛋白的表达。因此，包含与配体连接的细胞因子的组合物可以特异性结合NK细胞，然后将其活化以靶向并裂解表达NKG2D的感染的宿主细胞。
在另一个实施方案中，包含与配体连接的细胞因子的组合物可以活化细胞毒性T淋巴细胞，其经其他靶向杀伤的机制来识别感染的细胞。在一些实施方案中，方法还包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一些其他实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-
1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的感染的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供治疗主体中的感染的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包
含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含
OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白
和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋
白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
[0209] 在不同的方面，本发明包括减缓与辐射暴露或淋巴毒性物质相关的免疫抑制的方法，所述方法包括施用包含与配体连接的细胞因子的组合物。此外，该方法包括施用包含如部分I中所述的嵌合肽的组合物。此外，本发明的组合物可以用于提高HIV阳性主体中的CD4计数。例如，本发明的组合物可以用于活化可以帮助恢复主体的免疫系统的免疫细胞。在一些实施方案中，方法还包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。
在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组
合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗
PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供减缓主体中与辐射暴露或淋巴毒性物质相关的免疫抑制的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供减缓主体中与辐射暴露或淋巴毒性物质相关的免疫抑制的方法，其包括向主体施用本文提供的组
合疗法。在一个实施方案中，免疫抑制与辐射暴露相关。在另一个实施方案中，免疫抑制与淋巴毒性物质相关。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞
因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1
抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗
PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
在一些实施方案中，该方法还包括施用如本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组
合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗
PD-L1抗体。在一个实施方案中，本文提供减缓主体中与辐射暴露或淋巴毒性物质相关的免疫抑制的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，本文提供减缓主体中与辐射暴露或淋巴毒性物质相关的免疫抑制的方法，其包括向主体施用本文提供的组
合疗法。在一个实施方案中，免疫抑制与辐射暴露相关。在另一个实施方案中，免疫抑制与淋巴毒性物质相关。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞
因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1
抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗
PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。
在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
[0210] 在可选的方面，本发明包括佐剂在疫苗组合物中的使用方法。在一个实施方案中，本文提供在主体中接种的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。在一些实施方案中，在主体中的接种方法包括施用包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一个实施方案中，本文提供在主体中接种的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些
实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。
在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。
在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。
在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。在具体的实施方案中，主体是人。
[0211] 在其他方面，本文提供用于扩增CD8+记忆细胞的本发明的组合物。在一个实施方案中，本文提供在主体中扩增CD8+ T细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合物。
在一个实施方案中，本文提供在主体中扩增CD8+ T细胞的方法，所述方法还包括施用
包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一个实施方案中，本文提供在主体中扩增CD8+ T细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含
OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接
头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。
在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
在一个实施方案中，本文提供在主体中扩增CD8+ T细胞的方法，所述方法还包括施用
包含PD1配体和细胞因子的嵌合肽。在另一个实施方案中，嵌合肽还包含接头。在一个实施方案中，PD1配体是PDL1。在另一个实施方案中，PD1配体是PDL2。在仍另一个实施方案中，PD1配体是对PD1特异性的抗体。在另一个实施方案中，细胞因子是IL2。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在一个实施方案中，本文提供在主体中扩增CD8+ T细胞的方法，其包括向主体施用本文提供的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括本文提供的PD-1抑制剂和包含细胞因子肽和抗NKG2D抗体的嵌合肽。在某些实施方案中，细胞因子肽是上文所述的细胞因子。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体如上文所述。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2融合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含
OMCP-IL2融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，组合疗法包含OMCP-IL2嵌合蛋白和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，嵌合蛋白还包含接头。在其他实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D抗体、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-1。在其他实施方案中，抗NKG2D抗体是KYK-2。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D抗体和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接
头。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和PD1抑制剂。在一些实施方案中，组合疗法包含抗NKG2D scFV、IL2和抗PD1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-1 scFv。在其他实施方案中，抗NKG2D scFv是KYK-2 scFv。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为嵌合多肽提供。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗NKG2D scFv和IL2作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，IL2是IL2的突变体R38A/F42K形式。在某些实施方案中，主体有其需要。在某些实施方案中，向主体施用有效量的组合疗法。
在具体的实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，主体是患有癌症或肿瘤的主体。在具体的实施方案中，癌症或肿瘤是肺癌或肿瘤。
[0212] 在其他方面，本公开提供离体扩增细胞毒性淋巴细胞的方法。该方法包括在本文提供的组合物存在下培养淋巴细胞。淋巴细胞可以衍生自公开可获得的细胞系，例如ATCCTM细胞系。或者，可以从主体中分离淋巴细胞。淋巴细胞可以从单个主体或多个主体获得。多个是指至少两个（例如，多于一个）主体。当获得的淋巴细胞来自多个主体时，它们的关系可以是自体的、同基因的、异基因的或异种的。具体地，淋巴细胞可以在部分I中描述的嵌合肽存在下培养。在某些实施方案中，嵌合肽包含与IL2或其突变体连接的OMCP或其片段。在其他实施方案中，嵌合肽包含与突变体IL2连接的OMCP。在另一方面，本公开提供了改善主体的过继性细胞免疫疗法的方法。该方法包括向主体施用治疗组合物，所述治疗组合物包含
已经在本文提供的组合物存在下培养的分离的细胞毒性淋巴细胞。如本文所用，“过继性细胞免疫疗法”，也称为“ACI”，是基于淋巴细胞的免疫疗法，其中淋巴细胞取自主体并被刺激和/或遗传操作。在群体扩增后，然后将淋巴细胞转移回主体内。因此，本公开的方法可用于治疗其中期望增加淋巴细胞数量的疾病或病症。例如，癌症和慢性病毒感染。关于病毒感
染，病毒特异性T细胞的ACI可以恢复主体中的病毒特异性免疫以预防或治疗病毒性疾病。
因此，病毒特异性T细胞可用于在移植后重建抗病毒免疫和/或治疗活动性病毒感染。在一
个实施方案中，接受T细胞用于治疗或预防病毒感染的主体可以是免疫缺陷的。
已经在本文提供的组合物存在下培养的分离的细胞毒性淋巴细胞。如本文所用，“过继性细胞免疫疗法”，也称为“ACI”，是基于淋巴细胞的免疫疗法，其中淋巴细胞取自主体并被刺激和/或遗传操作。在群体扩增后，然后将淋巴细胞转移回主体内。因此，本公开的方法可用于治疗其中期望增加淋巴细胞数量的疾病或病症。例如，癌症和慢性病毒感染。关于病毒感
染，病毒特异性T细胞的ACI可以恢复主体中的病毒特异性免疫以预防或治疗病毒性疾病。
因此，病毒特异性T细胞可用于在移植后重建抗病毒免疫和/或治疗活动性病毒感染。在一
个实施方案中，接受T细胞用于治疗或预防病毒感染的主体可以是免疫缺陷的。
[0213] （a）施用在某些方面，可以将药理学有效量的本发明组合物施用于主体。使用标准有效技术进
行施用包括外周（即不通过施用至中枢神经系统）或局部至中枢神经系统。外周施用包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用。局部施用，包括直接至中枢神经系统（CNS）包括但不限于通过腰椎、心室内或器官实质内导管或使用手术植入的控释制剂。单采法(Pheresis)可用于递送本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过输注（连续或推注）施用。
行施用包括外周（即不通过施用至中枢神经系统）或局部至中枢神经系统。外周施用包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用。局部施用，包括直接至中枢神经系统（CNS）包括但不限于通过腰椎、心室内或器官实质内导管或使用手术植入的控释制剂。单采法(Pheresis)可用于递送本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过输注（连续或推注）施用。
[0214] 有效施用的药物组合物被有意地设计成适合于所选择的施用方式，和适当地使用药学上可接受的赋形剂，例如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton
Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3，最新版（以其整体通过引用并入本文）提供了从业者通常已知的制剂技术概要。
Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3，最新版（以其整体通过引用并入本文）提供了从业者通常已知的制剂技术概要。
[0215] 通过静脉内或腹膜内或皮下注射的有效外周全身递送是对活体患者施用的优选方法。用于这种注射的合适媒介物是直截了当的。然而，另外，也可以通过鼻气雾剂或栓剂通过粘膜进行施用。用于这种施用方式的合适制剂是公知的，并且通常包括促进跨膜转移
的表面活性剂。此类表面活性剂通常衍生自类固醇或者是阳离子脂质，例如N-[1-(2,3-二
油酰基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA）或各种化合物，例如胆固醇半琥珀酸盐、磷脂酰基甘油等。
的表面活性剂。此类表面活性剂通常衍生自类固醇或者是阳离子脂质，例如N-[1-(2,3-二
油酰基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA）或各种化合物，例如胆固醇半琥珀酸盐、磷脂酰基甘油等。
[0216] 对于治疗应用，将治疗有效量的本发明组合物施用给主体。“治疗有效量”是足以产生可测量反应的治疗组合物的量（例如，免疫刺激、抗血管生成反应、细胞毒性反应、肿瘤消退、免疫遏制、免疫抑制、感染减少）。可以改变本发明治疗组合物中活性成分的实际剂量水平，以便施用有效实现特定主体所需治疗反应的量的活性化合物。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、被治疗主体的肿瘤大小和寿命、自身免疫疾病、感染和身体状况和先前病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下增加剂量。确定和调整治疗有效剂
量，以及评估何时以及如何进行这种调整，是医学领域普通技术人员已知的。在一个方面，典型的剂量含有约10 IU/kg至约1,000,000 IU/kg的本文所述的细胞因子。在一个实施方
案中，典型剂量含有约10 IU/kg至约100 IU/kg。在另一个实施方案中，典型剂量含有约100 IU/kg至约1,000 IU/kg。在仍另一个实施方案中，典型剂量含有约1,000 IU/kg至约10,000 IU/kg。在仍还另一个实施方案中，典型剂量含有约10,000 IU/kg至约100,000 IU/kg。在不同的实施方案中，典型剂量含有约100,000 IU/kg至约1,000,000 IU/kg。在某些实施方案
中，典型剂量含有约500,000 IU/kg至约1,000,000 IU/kg。在其他实施方案中，典型剂量含有约100,000 IU/kg至约500,000 IU/kg。可选地，典型剂量含有约50,000 IU/kg至约100,
000 IU/kg。在另一个实施方案中，典型剂量含有约10,000 IU/kg至约50,000 IU/kg。在仍另一个实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约10,000 IU/kg。在一个具体实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约200,000 IU/kg。在另一个具体实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约500,000 IU/kg。在仍另一个具体实施方案中，典型剂量含有约50,
000 IU/kg至约500,000 IU/kg。在仍还另一个具体实施方案中，典型剂量含有约250,000
IU/kg至约750,000 IU/kg。
量，以及评估何时以及如何进行这种调整，是医学领域普通技术人员已知的。在一个方面，典型的剂量含有约10 IU/kg至约1,000,000 IU/kg的本文所述的细胞因子。在一个实施方
案中，典型剂量含有约10 IU/kg至约100 IU/kg。在另一个实施方案中，典型剂量含有约100 IU/kg至约1,000 IU/kg。在仍另一个实施方案中，典型剂量含有约1,000 IU/kg至约10,000 IU/kg。在仍还另一个实施方案中，典型剂量含有约10,000 IU/kg至约100,000 IU/kg。在不同的实施方案中，典型剂量含有约100,000 IU/kg至约1,000,000 IU/kg。在某些实施方案
中，典型剂量含有约500,000 IU/kg至约1,000,000 IU/kg。在其他实施方案中，典型剂量含有约100,000 IU/kg至约500,000 IU/kg。可选地，典型剂量含有约50,000 IU/kg至约100,
000 IU/kg。在另一个实施方案中，典型剂量含有约10,000 IU/kg至约50,000 IU/kg。在仍另一个实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约10,000 IU/kg。在一个具体实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约200,000 IU/kg。在另一个具体实施方案中，典型剂量含有约5,000 IU/kg至约500,000 IU/kg。在仍另一个具体实施方案中，典型剂量含有约50,
000 IU/kg至约500,000 IU/kg。在仍还另一个具体实施方案中，典型剂量含有约250,000
IU/kg至约750,000 IU/kg。
[0217] 给药频率可以是每天一次、两次、三次或更多次，或者每周或每月一次、两次、三次或更多次，根据有效治疗症状或疾病的需要。在某些实施方案中，给药频率可以是每日一次、两次或三次。例如，可以每24小时、每12小时或每8小时施用一个剂量。在一个具体实施方案中，给药频率可以是每天两次。
[0218] 治疗持续时间可以是从一次性施用的单一剂量到终生的治疗剂治疗过程。治疗持续时间可以并且将根据主体和待治疗的癌症或自身免疫疾病或感染而变化。例如，治疗持
续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。或者，治疗持续时间可以是1周、2周、3周、4周、5周或6周。可选地，治疗持续时间可以是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。在仍另一个实施方案中，治疗持续时间可以是1年、2年、3年、4年、5年或大于5年。还考虑施用可以在一段时间内是频繁的，然后施用可以在一段时间内是间隔开的。例如，治疗持续时间可以是5天，然后9天无治疗，然后再治疗5天。
续时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。或者，治疗持续时间可以是1周、2周、3周、4周、5周或6周。可选地，治疗持续时间可以是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。在仍另一个实施方案中，治疗持续时间可以是1年、2年、3年、4年、5年或大于5年。还考虑施用可以在一段时间内是频繁的，然后施用可以在一段时间内是间隔开的。例如，治疗持续时间可以是5天，然后9天无治疗，然后再治疗5天。
[0219] 相对于疾病本身和治疗持续时间的治疗的施用时机将由病例周围的情况决定。治疗可以立即开始，例如在诊断时，或者可以在手术后开始治疗。治疗可以在医院或诊所本身中开始，或者在出院后或在门诊诊所看到后晚些时候开始。
[0220] 此外，用如上所述的组合物治疗可以与本文所述的PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的施用一起（例如，顺序或同时）在施用方案中开始。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以作为关于有此需要的患者体重的量度的量存在。例如，在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约以下的量存在：0.1 mg/kg至约50 mg/kg、0.1 mg/kg至约40 mg/kg、0.1 mg/kg至约30 mg/kg、
0.1 mg/kg至约25 mg/kg、0.1 mg/kg至约20 mg/kg、0.1 mg/kg至约15 mg/kg、0.1 mg/kg至约10 mg/kg、0.1 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.1 mg/kg至约5 mg/kg、0.1 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.1 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约以下的量存在：0.5 mg/kg至约50 mg/kg、0.5 mg/kg至约40 mg/kg、0.5 mg/kg至约30 mg/kg、0.5 mg/kg至约25
mg/kg、0.5 mg/kg至约20 mg/kg、0.5 mg/kg至约15 mg/kg、0.5 mg/kg至约10 mg/kg、0.5 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.5 mg/kg至约5 mg/kg、0.5 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.5 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约0.5 mg/kg至约5 mg/kg或约0.1 mg/kg至约10 mg/kg的量存在。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约0.1 mg/kg至约20 mg/kg或约
0.1 mg/kg至约30 mg/kg的量存在。
0.1 mg/kg至约25 mg/kg、0.1 mg/kg至约20 mg/kg、0.1 mg/kg至约15 mg/kg、0.1 mg/kg至约10 mg/kg、0.1 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.1 mg/kg至约5 mg/kg、0.1 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.1 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约以下的量存在：0.5 mg/kg至约50 mg/kg、0.5 mg/kg至约40 mg/kg、0.5 mg/kg至约30 mg/kg、0.5 mg/kg至约25
mg/kg、0.5 mg/kg至约20 mg/kg、0.5 mg/kg至约15 mg/kg、0.5 mg/kg至约10 mg/kg、0.5 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.5 mg/kg至约5 mg/kg、0.5 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.5 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约0.5 mg/kg至约5 mg/kg或约0.1 mg/kg至约10 mg/kg的量存在。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约0.1 mg/kg至约20 mg/kg或约
0.1 mg/kg至约30 mg/kg的量存在。
[0221] 在仍其他实施方案中，在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约以下的量存在：0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg或50 mg/kg。PD-L1抗体可以以约以下的量存在：1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg或30 mg/kg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂以约：3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或30mg/kg的量存在。
[0222] 在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、75 mg、80 mg、90 mg、100 mg、150 mg或200 mg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：250 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1000 mg、1100 mg、1200 mg、
1300 mg、1400 mg、1500 mg、1600 mg、1700 mg、1800 mg、1900 mg或2000 mg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约1000mg至约2000mg的量存在。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg至约10 mg、10 mg至约20 mg、25 mg至约50 mg、30 mg至约60 mg、40 mg至约50 mg、50 mg至约100 mg、75 mg至约150 mg、100 mg至约
200 mg、200 mg至约500 mg、500 mg至约1000 mg、1000 mg至约1200 mg、1000 mg至约1500 mg、1200 mg至约1500 mg或1500至约2000 mg。
1300 mg、1400 mg、1500 mg、1600 mg、1700 mg、1800 mg、1900 mg或2000 mg。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约1000mg至约2000mg的量存在。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg至约10 mg、10 mg至约20 mg、25 mg至约50 mg、30 mg至约60 mg、40 mg至约50 mg、50 mg至约100 mg、75 mg至约150 mg、100 mg至约
200 mg、200 mg至约500 mg、500 mg至约1000 mg、1000 mg至约1200 mg、1000 mg至约1500 mg、1200 mg至约1500 mg或1500至约2000 mg。
[0223] 在一些实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或500 mg/mL。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg/mL至约10 mg/mL、5 mg/mL至约10 mg/mL、5 mg/mL至约15 mg/mL、10 mg/mL至约
25 mg/mL; 20 mg/mL至约30 mg/mL; 25 mg/mL至约50 mg/mL或50 mg/mL至约100 mg/mL。
25 mg/mL; 20 mg/mL至约30 mg/mL; 25 mg/mL至约50 mg/mL或50 mg/mL至约100 mg/mL。
[0224] 在某些情况下，治疗有效量的PD-L1抑制剂被确定为如提供有PD-L1抑制剂的包装说明书中提供的量。术语包装说明书是指通常包含在由FDA或美国以外的国家的类似管理
机构批准的商业药品包装中的说明书，其包含关于与使用这些药物相关的例如用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
机构批准的商业药品包装中的说明书，其包含关于与使用这些药物相关的例如用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
[0225] 在一些实施方案中，PD-1抑制剂以关于有此需要的患者的体重的量度的量存在。例如，在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约以下的量存在：0.1 mg/kg至约30 mg/kg、0.1 mg/kg至约25 mg/kg、0.1 mg/kg至约20 mg/kg、0.1 mg/kg至约15 mg/kg、0.1 mg/kg至约10 mg/kg、0.1 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.1 mg/kg至约5 mg/kg、0.1 mg/kg至约2.5 mg/kg或约
0.1 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约以下的量存在：0.5 mg/kg至约30 mg/kg、0.5 mg/kg至约25 mg/kg、0.5 mg/kg至约20 mg/kg、0.5 mg/kg至约15 mg/kg、
0.5 mg/kg至约10 mg/kg、0.5 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.5 mg/kg至约5 mg/kg、0.5 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.5 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约0.5mg/kg至约5mg/kg或约0.1mg/kg至约10mg/kg的量存在。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约0.5mg/kg至约15mg/kg或约0.1mg/kg至约20mg/kg的量存在。
0.1 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约以下的量存在：0.5 mg/kg至约30 mg/kg、0.5 mg/kg至约25 mg/kg、0.5 mg/kg至约20 mg/kg、0.5 mg/kg至约15 mg/kg、
0.5 mg/kg至约10 mg/kg、0.5 mg/kg至约7.5 mg/kg、0.5 mg/kg至约5 mg/kg、0.5 mg/kg至约2.5 mg/kg或约0.5 mg/kg至约1 mg/kg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约0.5mg/kg至约5mg/kg或约0.1mg/kg至约10mg/kg的量存在。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约0.5mg/kg至约15mg/kg或约0.1mg/kg至约20mg/kg的量存在。
[0226] 在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约以下的量存在：0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg或30 mg/kg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂以约：1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg或5 mg/kg的量存在。
[0227] 在一些实施方案中，PD-1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、75 mg、80 mg、90 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1000 mg、1100 mg、1200 mg、1300 mg、1400 mg、1500 mg、1600 mg、1700 mg、1800 mg、1900 mg或
2000 mg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg至约10
mg、10 mg至约20 mg、25 mg至约50 mg、30 mg至约60 mg、40 mg至约50 mg、50 mg至约100 mg、75 mg至约150 mg、100 mg至约200 mg、200 mg至约500 mg、500 mg至约1000 mg、1000 mg至约1200 mg、1000 mg至约1500 mg、1200 mg至约1500 mg或1500 mg至约2000 mg。
2000 mg。在一些实施方案中，PD-1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg至约10
mg、10 mg至约20 mg、25 mg至约50 mg、30 mg至约60 mg、40 mg至约50 mg、50 mg至约100 mg、75 mg至约150 mg、100 mg至约200 mg、200 mg至约500 mg、500 mg至约1000 mg、1000 mg至约1200 mg、1000 mg至约1500 mg、1200 mg至约1500 mg或1500 mg至约2000 mg。
[0228] 在一些实施方案中，PD-1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或500 mg/mL。在一个实施方案中，PD-1抑制剂在组合疗法中以约以下的量存在：1 mg/mL至约10 mg/mL、5 mg/mL至约10 mg/mL、5 mg/mL至约15 mg/mL、10 mg/mL至约25 mg/mL; 20 mg/mL至约30 mg/mL; 25 mg/mL至约50 mg/mL或50 mg/mL至约100 mg/mL。
[0229] 在某些情况下，治疗有效量的PD-1抑制剂被确定为提供有PD-1抑制剂的包装说明书中提供的量。
[0230] 本文所述的组合疗法的协同效应可允许使用较低剂量的组合的一种或多种组分（例如，本文所述的组合物和PD-1或PD-L1抑制剂）。协同效应可以允许以较低频率施用至少一种施用的治疗（例如，本文所述的组合物和PD-1或PD-L1抑制剂）给患有本文所述的疾病、病症或病况的主体。这种较低的剂量和降低的施用频率可以降低与向主体施用至少一种治
疗（例如，本发明所述的组合物和PD-1或PD-L1抑制剂）相关的毒性且不会降低治疗效果。如本文所述的协同效应可以避免或减少与使用本文所述任一种疗法相关的不利或不想要的
副作用。
疗（例如，本发明所述的组合物和PD-1或PD-L1抑制剂）相关的毒性且不会降低治疗效果。如本文所述的协同效应可以避免或减少与使用本文所述任一种疗法相关的不利或不想要的
副作用。
[0231] 尽管前述方法对于施用本发明的组合物或组合疗法似乎是最方便和最合适和有效的，但是通过适当的改变，可以采用其它有效的施用技术，例如心室内施用、经皮施用和口服施用，只要本文使用适当的制剂。
[0233] （b）肿瘤本发明的组合物可用于治疗或识别衍生自赘生物或癌症的肿瘤的方法中。赘生物可能
是恶性的或良性的，癌症可能是原发性或转移性的；赘生物或癌症可能是早期或晚期。可以治疗的赘生物或癌症的非限制性实例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺
皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤（儿童小脑或大脑的）、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤（小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤）、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌（儿童期、胃肠的）、原发性不明原因的癌、中枢神经系统淋巴瘤（原发性）、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肿瘤家族中的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤（儿童期）、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌（眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤）、胆囊癌、胃癌（胃癌）、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤（儿童颅外、性腺外、卵巢）、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤（成人、儿童脑干、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑）、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌（肝癌）、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤（儿童期）、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌（肾细胞癌）、喉癌、白血病（急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性骨髓性、毛细胞）、唇癌和口腔癌、肝癌（原发性）、肺癌（非小细胞、小细胞）、淋巴瘤（AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统）、巨球蛋白血症
(Waldenström)、骨的恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤（儿童期）、黑色素瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤（成人恶性、儿童期）、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征（儿童期）、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓性白血病（慢性）、髓性白血病（成人急性、儿童急性）、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病（慢性）、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌（表面上皮-间质瘤）、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰腺癌（胰岛细胞）、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤（儿童期）、垂体腺瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌（肾癌）、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤（儿童期）、唾液腺癌、肉瘤（尤文氏肿瘤家族、卡波西、软组织、子宫）、塞扎里氏综合征、皮肤癌（非黑色素瘤、黑色素瘤）、皮肤癌（梅克尔细胞）、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿原发性鳞状颈癌（转移性）、胃癌、幕上原始神经外胚叶肿瘤（儿童期）、T细胞淋巴瘤（皮肤）、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤（儿童期）、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌（儿童期）、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤（妊娠）、未知原发部位（成人、儿童期）、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌（子宫内膜）、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤（儿童期）、外阴癌、Waldenström巨球蛋白血症和肾母细胞瘤（儿童期）。在某些实施方案中，赘生物或癌症可选自黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌和血癌。在一个实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是肾细胞癌。在一个实施方案中，肿瘤是肺癌（例如，NSCLC）。在另一个实施方案中，肿瘤是本文所述的血癌。如本文所用，“血癌”是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症。血癌主要有三类：白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。白血病的四大类别是：急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和慢性髓性白血病（CML）。淋巴瘤分为两类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。大多数非霍奇金淋巴瘤是B细胞淋巴瘤，并且要么快速生长（高级），要么缓慢生长（低级别）。有14种类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤。其余为T细胞淋巴瘤，以不同的癌性白细胞或淋巴细胞命名。因为骨髓瘤经常发生在骨髓中的许多部位，所以它通常被称为多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法包括施用本文提供的组合疗
法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-
1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
是恶性的或良性的，癌症可能是原发性或转移性的；赘生物或癌症可能是早期或晚期。可以治疗的赘生物或癌症的非限制性实例包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺
皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤（儿童小脑或大脑的）、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤（小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤）、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌（儿童期、胃肠的）、原发性不明原因的癌、中枢神经系统淋巴瘤（原发性）、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肿瘤家族中的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤（儿童期）、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌（眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤）、胆囊癌、胃癌（胃癌）、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤（儿童颅外、性腺外、卵巢）、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤（成人、儿童脑干、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑）、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌（肝癌）、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤（儿童期）、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌（肾细胞癌）、喉癌、白血病（急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性骨髓性、毛细胞）、唇癌和口腔癌、肝癌（原发性）、肺癌（非小细胞、小细胞）、淋巴瘤（AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统）、巨球蛋白血症
(Waldenström)、骨的恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤（儿童期）、黑色素瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤（成人恶性、儿童期）、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征（儿童期）、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓性白血病（慢性）、髓性白血病（成人急性、儿童急性）、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病（慢性）、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌（表面上皮-间质瘤）、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰腺癌（胰岛细胞）、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤（儿童期）、垂体腺瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌（肾癌）、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤（儿童期）、唾液腺癌、肉瘤（尤文氏肿瘤家族、卡波西、软组织、子宫）、塞扎里氏综合征、皮肤癌（非黑色素瘤、黑色素瘤）、皮肤癌（梅克尔细胞）、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿原发性鳞状颈癌（转移性）、胃癌、幕上原始神经外胚叶肿瘤（儿童期）、T细胞淋巴瘤（皮肤）、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤（儿童期）、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌（儿童期）、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤（妊娠）、未知原发部位（成人、儿童期）、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌（子宫内膜）、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤（儿童期）、外阴癌、Waldenström巨球蛋白血症和肾母细胞瘤（儿童期）。在某些实施方案中，赘生物或癌症可选自黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌和血癌。在一个实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是肾细胞癌。在一个实施方案中，肿瘤是肺癌（例如，NSCLC）。在另一个实施方案中，肿瘤是本文所述的血癌。如本文所用，“血癌”是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症。血癌主要有三类：白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。白血病的四大类别是：急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和慢性髓性白血病（CML）。淋巴瘤分为两类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。大多数非霍奇金淋巴瘤是B细胞淋巴瘤，并且要么快速生长（高级），要么缓慢生长（低级别）。有14种类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤。其余为T细胞淋巴瘤，以不同的癌性白细胞或淋巴细胞命名。因为骨髓瘤经常发生在骨髓中的许多部位，所以它通常被称为多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法包括施用本文提供的组合疗
法。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-1抑制剂。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-
1抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
[0234] （c）主体合适的主体包括人、家畜动物、伴侣动物、实验动物或动物园动物。在一个实施方案中，
主体可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，主体可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在仍另一个实施方案中，主体可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物，例如狗、猫、兔和鸟。在仍另一个实施方案中，主体可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”是指可以在动物园中发现的动物。这些动物可包括非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在一个具体实施方案中，动物是实验动物。实验动物的非限制性实例可包括啮齿动物、犬科动
物、猫科动物和非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物是啮齿动物。啮齿动物的非限制性实例可包括小鼠、大鼠、豚鼠等。在优选的实施方案中，主体是人。
实施例
主体可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，主体可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在仍另一个实施方案中，主体可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物，例如狗、猫、兔和鸟。在仍另一个实施方案中，主体可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”是指可以在动物园中发现的动物。这些动物可包括非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在一个具体实施方案中，动物是实验动物。实验动物的非限制性实例可包括啮齿动物、犬科动
物、猫科动物和非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物是啮齿动物。啮齿动物的非限制性实例可包括小鼠、大鼠、豚鼠等。在优选的实施方案中，主体是人。
实施例
[0235] 包括以下实施例以证明优选本发明的实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并因此可
以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得
相同或相似的结果。
以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得
相同或相似的结果。
[0236] 实施例1-6介绍IL2Rα链用于捕获细胞表面的IL2，以促进随后与受体的信号传导部分即IL2Rβγ链结
合。静息细胞毒性淋巴细胞，例如天然杀伤（NK）和CD8+ T细胞，在细胞表面不表达明显的IL2Rα，因此不被低水平的IL2活化1。然而，IL2Rα在初始活化后在该群体上表达，并且是最
2
大细胞毒性淋巴细胞扩增所必需的 。高剂量IL2可诱导所有细胞毒性淋巴细胞的活化，并
被批准用于治疗具有约15％部分或完全肿瘤反应的几种恶性肿瘤3-5。由于调节性T细胞
（Tregs）的活化和并发症诸如严重的血压改变、一般性毛细血管渗漏和由于血管内皮活化导致的末梢器官衰竭，大多数患者不能从这种治疗中受益6,3,7 。血管内皮和Tregs均表达IL2R
8
α，并因此相对于细胞毒性淋巴细胞优先被IL2活化 。降低IL2剂量可以改善副作用，但也会降低疗效。IL2的突变形式，例如具有在38位丙氨酸取代精氨酸（R38A）和/或在42位赖氨酸取代苯丙氨酸（F42K）的那些突变形式，降低了IL2对IL2Rα的亲和力，从而消除了许多副作用9。此类IL2a突变体还可降低免疫疗法的功效2。在不存在IL2Rα反应性的情况下可以优先活化细胞毒性淋巴细胞的IL2形式对于临床应用是非常有利的。
合。静息细胞毒性淋巴细胞，例如天然杀伤（NK）和CD8+ T细胞，在细胞表面不表达明显的IL2Rα，因此不被低水平的IL2活化1。然而，IL2Rα在初始活化后在该群体上表达，并且是最
2
大细胞毒性淋巴细胞扩增所必需的 。高剂量IL2可诱导所有细胞毒性淋巴细胞的活化，并
被批准用于治疗具有约15％部分或完全肿瘤反应的几种恶性肿瘤3-5。由于调节性T细胞
（Tregs）的活化和并发症诸如严重的血压改变、一般性毛细血管渗漏和由于血管内皮活化导致的末梢器官衰竭，大多数患者不能从这种治疗中受益6,3,7 。血管内皮和Tregs均表达IL2R
8
α，并因此相对于细胞毒性淋巴细胞优先被IL2活化 。降低IL2剂量可以改善副作用，但也会降低疗效。IL2的突变形式，例如具有在38位丙氨酸取代精氨酸（R38A）和/或在42位赖氨酸取代苯丙氨酸（F42K）的那些突变形式，降低了IL2对IL2Rα的亲和力，从而消除了许多副作用9。此类IL2a突变体还可降低免疫疗法的功效2。在不存在IL2Rα反应性的情况下可以优先活化细胞毒性淋巴细胞的IL2形式对于临床应用是非常有利的。
[0237] NKG2D识别由恶性或病毒转化的细胞表达的MHC I类相关的应激配体10。在所有活化免疫受体中，NKG2D对细胞毒性淋巴细胞具有最高的特异性，因为它在鼠和人NK细胞以及活化的CD8+ T细胞上组成型表达11。因此，已经争论肿瘤和病毒感染的细胞利用脱落的
NKG2D配体作为免疫逃避的机制12,13。天花主要组织相容性复合物I类样蛋白或OMCP是由猴痘和牛痘病毒感染的细胞脱落的NKG2D配体诱饵。它不是由天花或痘苗病毒表达，因此不被那些用天花疫苗免疫的人识别。由于OMCP以任何已知配体的最高亲和力结合人和鼠NKG2D，我们认为它可能作为理想的靶向载体发挥功能，以最佳地将IL2递送至细胞毒性淋巴细
胞14,15。在这里，我们描述了融合蛋白的构建和功能，该融合蛋白被设计用于向表达NKG2D的淋巴细胞递送IL2Rα突变体15。我们证明该构建体克服了与IL2Rα结合区突变相关的降低的功效，同时保持了有利的安全性概况。该融合蛋白的全身施用改善了针对实体瘤和液体瘤
的免疫疗法。因此，靶向递送IL2可以安全地用于最大程度地活化表达NKG2D的淋巴细胞，例如NK细胞，以优化免疫疗法而没有全身副作用。
NKG2D配体作为免疫逃避的机制12,13。天花主要组织相容性复合物I类样蛋白或OMCP是由猴痘和牛痘病毒感染的细胞脱落的NKG2D配体诱饵。它不是由天花或痘苗病毒表达，因此不被那些用天花疫苗免疫的人识别。由于OMCP以任何已知配体的最高亲和力结合人和鼠NKG2D，我们认为它可能作为理想的靶向载体发挥功能，以最佳地将IL2递送至细胞毒性淋巴细
胞14,15。在这里，我们描述了融合蛋白的构建和功能，该融合蛋白被设计用于向表达NKG2D的淋巴细胞递送IL2Rα突变体15。我们证明该构建体克服了与IL2Rα结合区突变相关的降低的功效，同时保持了有利的安全性概况。该融合蛋白的全身施用改善了针对实体瘤和液体瘤
的免疫疗法。因此，靶向递送IL2可以安全地用于最大程度地活化表达NKG2D的淋巴细胞，例如NK细胞，以优化免疫疗法而没有全身副作用。
[0238] 实施例1. NKG2D靶向递送IL2突变体优先在体外活化细胞毒性淋巴细胞。
[0239] 为了克服表达IL2Rα的细胞的优先活化，我们设计了一种IL2融合蛋白，它可以通过NKG2D受体直接靶向细胞毒性淋巴细胞。该融合蛋白将高亲和力NKG2D配体OMCP与突变以
降低IL2Rα反应性的IL2组合。我们的构建体，称为OMCP-mutIL2，由通过柔性30个残基的接头与人IL2的133个氨基酸R38A/F42K突变形式（mutIL2）的N末端融合的152个残基OMCP蛋白组成（图1A-B）。首先评估构建体的体外结合能力。荧光标记的构建体的结合在37℃下在大量脾细胞中体外测试。图17显示该构建体似乎仅与表达NKG2D的NK细胞结合。该构建体不显示与CD4+CD3+ T细胞、CD8+CD3+ T细胞、CD11C+CD11B- DC、CD11c-CD11b+ Mac或CD19+CD3- B细胞的结合。
降低IL2Rα反应性的IL2组合。我们的构建体，称为OMCP-mutIL2，由通过柔性30个残基的接头与人IL2的133个氨基酸R38A/F42K突变形式（mutIL2）的N末端融合的152个残基OMCP蛋白组成（图1A-B）。首先评估构建体的体外结合能力。荧光标记的构建体的结合在37℃下在大量脾细胞中体外测试。图17显示该构建体似乎仅与表达NKG2D的NK细胞结合。该构建体不显示与CD4+CD3+ T细胞、CD8+CD3+ T细胞、CD11C+CD11B- DC、CD11c-CD11b+ Mac或CD19+CD3- B细胞的结合。
[0240] 我们先前已经证实了鼠NK细胞细胞毒性和肺癌免疫监视中的品系特异性差异16（和实施例7）。因此，我们开始研究OMCP-mut-IL2在来自两种不同小鼠品系（即，分别具有差的和稳健的NK功能的A/J和B6）的NK细胞活化中的功效。与野生型IL2（wtIL2）或mutIL2相比，OMCP-mutIL2在与100 IUe/ml细胞因子共培养36小时后强烈上调两种品系的NK细胞上
的CD69（图1C，左；图6，左面两幅图）16,17。在高浓度下，用OMCP-mut-IL2、wtIL2或mutIL2观察到CD69表达的类似增加（图6）。通过ICOS的上调测量的CD4+Foxp3+Tregs的活化仅在用wtII2时是明显的，但对于mutIL2或OMCP-mutIL2则不明显（图1C-D）。另一方面，CD8+和CD4+Foxp3-效应T细胞在36小时后未显示CD69的上调，即使在最高剂量的细胞因子下也是如此（图1C-D和数据未显示）。在5天的时间内更长暴露导致暴露于wtIL2和OMCP-mutIL2的NK和CD8+ T细胞的增殖（图1E-F）。重要的是，OMCP-mutIL2活化CD8+ T细胞和NK细胞等同于NKG2D-/-脾细胞中的mutIL2，表明增加的活化是由于OMCP靶向对携带NKG2D的细胞的影响（图1F；图6，右边的两幅图）。仅与wtIL2孵育导致CD4+Foxp3+Tregs和CD4+Foxp3-效应细胞增殖（图1E-F）。因此，暴露于OMCP-mutIL2导致优先的NK活化，其优于或等同于以剂量依赖性方式的wtIL2。CD8+ T细胞也可被活化，但需要长时间暴露于更高剂量的OMCP-mutIL2。
的CD69（图1C，左；图6，左面两幅图）16,17。在高浓度下，用OMCP-mut-IL2、wtIL2或mutIL2观察到CD69表达的类似增加（图6）。通过ICOS的上调测量的CD4+Foxp3+Tregs的活化仅在用wtII2时是明显的，但对于mutIL2或OMCP-mutIL2则不明显（图1C-D）。另一方面，CD8+和CD4+Foxp3-效应T细胞在36小时后未显示CD69的上调，即使在最高剂量的细胞因子下也是如此（图1C-D和数据未显示）。在5天的时间内更长暴露导致暴露于wtIL2和OMCP-mutIL2的NK和CD8+ T细胞的增殖（图1E-F）。重要的是，OMCP-mutIL2活化CD8+ T细胞和NK细胞等同于NKG2D-/-脾细胞中的mutIL2，表明增加的活化是由于OMCP靶向对携带NKG2D的细胞的影响（图1F；图6，右边的两幅图）。仅与wtIL2孵育导致CD4+Foxp3+Tregs和CD4+Foxp3-效应细胞增殖（图1E-F）。因此，暴露于OMCP-mutIL2导致优先的NK活化，其优于或等同于以剂量依赖性方式的wtIL2。CD8+ T细胞也可被活化，但需要长时间暴露于更高剂量的OMCP-mutIL2。
[0241] 实施例2. 低剂量细胞因子疗法提供了有利的安全性概况。
[0242] 剂量依赖性毒性可限制体内细胞因子的施用。为了模拟人免疫治疗方案，我们接下来在5天周期以10个剂量给予wtIL2来治疗A/J小鼠18。虽然A/J小鼠耐受750,000 IUe的
wtIL2，但是在较高剂量下显著的死亡率是明显的（图2A-B）。甚至在750,000 IUe剂量后，小鼠表现出极度痛苦、体重减轻、食物消耗减少、腹水和肝脏炎症（图2A-E；图7A-C）。这些副作用反映了与人中高剂量IL2治疗相关的毛细血管渗漏和痛苦7。用抗Asialo-GM1治疗改善了
A/J小鼠中由高剂量wtIL2（1,500,000 IUe）诱导的死亡率，但没有改善减轻体重，证实这种疗法的副作用可以独立于NK细胞发生（图2F-K）。与wtIL2的情况不同，在存在或不存在NK细胞的情况下，在1,500,000 IUe的OMCP-mutIL2或mutIL2后没有明显的动物死亡。仅在NK足
够的小鼠中发生1,500,000 IUe的OMCP-mutIL2后的动物体重减轻，表明我们的构建体的毒
性仅仅是由于免疫活化（图2F-K）。在A/J小鼠中，200,000 IUe的方案耐受良好，对所有细胞因子具有最小的体重减轻、痛苦或器官炎症（图2L-O）。然而，在该剂量下，wtIL2后胸腔积液和腹水的积聚仍然表明毛细血管渗漏，但OMCP-mutIL2或mutIL2不是如此。B6小鼠能够耐受更高剂量的wtIL2，但仍然在高于750,000 IUe具有显著的死亡率（图7D）。
wtIL2，但是在较高剂量下显著的死亡率是明显的（图2A-B）。甚至在750,000 IUe剂量后，小鼠表现出极度痛苦、体重减轻、食物消耗减少、腹水和肝脏炎症（图2A-E；图7A-C）。这些副作用反映了与人中高剂量IL2治疗相关的毛细血管渗漏和痛苦7。用抗Asialo-GM1治疗改善了
A/J小鼠中由高剂量wtIL2（1,500,000 IUe）诱导的死亡率，但没有改善减轻体重，证实这种疗法的副作用可以独立于NK细胞发生（图2F-K）。与wtIL2的情况不同，在存在或不存在NK细胞的情况下，在1,500,000 IUe的OMCP-mutIL2或mutIL2后没有明显的动物死亡。仅在NK足
够的小鼠中发生1,500,000 IUe的OMCP-mutIL2后的动物体重减轻，表明我们的构建体的毒
性仅仅是由于免疫活化（图2F-K）。在A/J小鼠中，200,000 IUe的方案耐受良好，对所有细胞因子具有最小的体重减轻、痛苦或器官炎症（图2L-O）。然而，在该剂量下，wtIL2后胸腔积液和腹水的积聚仍然表明毛细血管渗漏，但OMCP-mutIL2或mutIL2不是如此。B6小鼠能够耐受更高剂量的wtIL2，但仍然在高于750,000 IUe具有显著的死亡率（图7D）。
[0243] 实施例3. 与wtIL2或mutIL2相比，OMCP-mutIL2优先在体内扩增和活化NK细胞。
[0244] 为了评估与细胞因子治疗相关的免疫学变化，A/J小鼠接受200,000 IUe的细胞因子或构建体，其在5天内以10个相等的剂量给予。在第6天通过流式细胞术评估脾淋巴细胞。
相比于盐水处理的对照，wtIL2和OMCP-mutIL2都增加了淋巴细胞含量和脾大小（图3A-B）。
OMCP-mutIL2导致通过细胞性和表面KLRG1水平测量的NK细胞的显著扩增和活化（图3C）。在OMCP-mutIL2处理的小鼠中，NK细胞占所有脾淋巴细胞的近一半，与盐水或mutIL2处理的小鼠的总淋巴细胞计数平行或甚至超过（图3A对比图3C）。通过200,000 IUe的OMCP-mutIL2的NK扩增优于近毒性剂量的wtIL2（750,000 IU）、高剂量mutIL2（3,500,000 IUe）或与抗IL2
19
抗体复合的wtIL2（克隆MAB602）（图3C）。事实上，大多数小鼠不能耐受全部200,000 IUe的wtIL2/抗IL2抗体，并且由于动物痛苦和快速体重减轻，注射必须在160,000或180,000 IUe终止，且具有必要的动物死亡（图8A）。WtIL2导致了显著扩增CD4+Foxp3+Tregs，特别是A/J小鼠中的ICOS+亚群6，甚至当与抗IL2抗体复合时（图3D）。重要的是，与所有其他治疗条件相
20
比，已经描述为免疫治疗成功的预测因子 的NK/Treg比率在OMCP-mutIL2治疗的小鼠中显著增加（图3E）。OMCP-mutIL2对NK细胞的优异扩增甚至可以在wtIL2的1/2剂量下实现（图8B）。
然而，用 500倍更低亲和力的NKG2D配体ULBP3靶向NKG2D，改善了融合构建体的扩增功效，~
但与单独的mutII2相比仍然提供了优异的NK活化（图8B）。在wtIL2或OMCP-mutIL2治疗后，CD4+Foxp3-或CD8+ T淋巴细胞明显没有统计学上显著的增加，尽管CD8+ T细胞扩增的趋势
是明显的（图8C-D）。这些数据与在无特定病原体的小鼠中幼稚T淋巴细胞的流行，表达低水平的IL2受体和NKG2D一致。
相比于盐水处理的对照，wtIL2和OMCP-mutIL2都增加了淋巴细胞含量和脾大小（图3A-B）。
OMCP-mutIL2导致通过细胞性和表面KLRG1水平测量的NK细胞的显著扩增和活化（图3C）。在OMCP-mutIL2处理的小鼠中，NK细胞占所有脾淋巴细胞的近一半，与盐水或mutIL2处理的小鼠的总淋巴细胞计数平行或甚至超过（图3A对比图3C）。通过200,000 IUe的OMCP-mutIL2的NK扩增优于近毒性剂量的wtIL2（750,000 IU）、高剂量mutIL2（3,500,000 IUe）或与抗IL2
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抗体复合的wtIL2（克隆MAB602）（图3C）。事实上，大多数小鼠不能耐受全部200,000 IUe的wtIL2/抗IL2抗体，并且由于动物痛苦和快速体重减轻，注射必须在160,000或180,000 IUe终止，且具有必要的动物死亡（图8A）。WtIL2导致了显著扩增CD4+Foxp3+Tregs，特别是A/J小鼠中的ICOS+亚群6，甚至当与抗IL2抗体复合时（图3D）。重要的是，与所有其他治疗条件相
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比，已经描述为免疫治疗成功的预测因子 的NK/Treg比率在OMCP-mutIL2治疗的小鼠中显著增加（图3E）。OMCP-mutIL2对NK细胞的优异扩增甚至可以在wtIL2的1/2剂量下实现（图8B）。
然而，用 500倍更低亲和力的NKG2D配体ULBP3靶向NKG2D，改善了融合构建体的扩增功效，~
但与单独的mutII2相比仍然提供了优异的NK活化（图8B）。在wtIL2或OMCP-mutIL2治疗后，CD4+Foxp3-或CD8+ T淋巴细胞明显没有统计学上显著的增加，尽管CD8+ T细胞扩增的趋势
是明显的（图8C-D）。这些数据与在无特定病原体的小鼠中幼稚T淋巴细胞的流行，表达低水平的IL2受体和NKG2D一致。
[0245] 与A/J品系不同，在用200,000 IUe的wtIL2处理的B6小鼠中，淋巴细胞的少量免疫活化是明显的（数据未显示）。在该品系中在750,000 IUe的较高剂量下，OMCP-mutIL2比
wtIL2扩增NK细胞更活跃（图3F-H）。IL2/抗IL2抗体复合物阻止了Treg扩增，但是与A/J品系相似，这种治疗具有毒性，并且大多数B6小鼠不能耐受全部750,000 IUe剂量（图3I）。然而，OMCP-mutIL2在该剂量下耐受良好并且导致高NK/Treg比率（图3J）。在OMCP-mutIL2处理的B6 NKG2D-/- 突变体中没有明显的NK细胞扩增，证实了NKG2D在我们的构建体功能中的需要（数据未显示）。尽管在施用wtIL2后CD8+ T细胞扩增的趋势明显，但在任何治疗组中没有B6
CD8+或CD4+Foxp3- T细胞的统计学上显著的扩增是明显的（图8F-G）。在A/J和B6品系中获得了肺驻留淋巴细胞的相同数据（数据未显示）。
wtIL2扩增NK细胞更活跃（图3F-H）。IL2/抗IL2抗体复合物阻止了Treg扩增，但是与A/J品系相似，这种治疗具有毒性，并且大多数B6小鼠不能耐受全部750,000 IUe剂量（图3I）。然而，OMCP-mutIL2在该剂量下耐受良好并且导致高NK/Treg比率（图3J）。在OMCP-mutIL2处理的B6 NKG2D-/- 突变体中没有明显的NK细胞扩增，证实了NKG2D在我们的构建体功能中的需要（数据未显示）。尽管在施用wtIL2后CD8+ T细胞扩增的趋势明显，但在任何治疗组中没有B6
CD8+或CD4+Foxp3- T细胞的统计学上显著的扩增是明显的（图8F-G）。在A/J和B6品系中获得了肺驻留淋巴细胞的相同数据（数据未显示）。
[0246] 实施例4. 与wtIL2或mutIL2相比，OMCP-mutIL2优先扩增并活化人外周血淋巴细胞中的NK细胞。
[0247] 为了证明OMCP-mutIL2在人淋巴细胞内的有效性，将人外周血淋巴细胞在100 IUe的野生型IL2、IL2的R38A/F42K突变形式或OMCP-突变体IL2中共培养36小时。
[0248] NK细胞：通过流式细胞术分析细胞，并且在条件之间比较CD56+CD3- NK细胞的相对流行。在OMCP-突变体IL2组中相对较高比例的NK细胞是明显的（图31A）。与盐水（黑色）、IL2（蓝色）或突变体IL2（绿色）处理的NK细胞相比，OMCP-突变体IL2处理的NK细胞（红色）中的穿孔素水平更高（图31B）。
[0249] CD8+T细胞：与NK细胞相似，与其他条件相比，用OMCP-突变体IL2处理的CD8+ T细胞中穿孔素的细胞内水平更高是明显的（图31C）。
[0250] Tregs：当对CD4+Foxp3+CD45RA- T细胞进行门控时，与其他条件相比，在IL2处理的外周血淋巴细胞培养物中相对较高比例的活化的CD25+CD127-调节性T细胞是明显的（图
31D）。总之，该数据表明，与wtIL2或mutIL2相比，OMCP-mutIL2优先扩增并活化人外周血淋巴细胞中的NK细胞和CD8+细胞。重要的是，OMCP-mutIL2相对于IL2没有显著活化调节性T细胞。
31D）。总之，该数据表明，与wtIL2或mutIL2相比，OMCP-mutIL2优先扩增并活化人外周血淋巴细胞中的NK细胞和CD8+细胞。重要的是，OMCP-mutIL2相对于IL2没有显著活化调节性T细胞。
[0251] 实施例5. 用OMCP-mutIL2治疗在体内提供了对恶性肿瘤的优异免疫控制。
[0252] 与需要先前抗原遭遇以实现最佳抗原特异性肿瘤细胞毒性的T淋巴细胞不同，NK细胞可在不事先致敏的情况下介导天然细胞毒性。对于选择的恶性肿瘤如淋巴瘤和肺癌的
扩增，NK细胞也形成主要障碍16,17,21,22。与wtIL2或mutIL2相比，用OMCP-mutIL2处理A/J小鼠导致增加的体内清除和通过大量脾细胞的体外裂解YAC-1细胞（图4A，图9A-B）。与wtIL2或mutIL2相比，在750,000 IUe的OMCP-mutIL2后，B6小鼠中高度侵袭性Lewis肺癌（LLC）细胞系的生长减少是明显的。对于LLC细胞系，在OMCP-mutIL2处理的脾细胞中增加的细胞毒性
也是明显的（图4B-C；图9A-C）。在NKG2D-/-小鼠中或NK耗尽后丧失增强的免疫疗法（图4D-E）。在没有宿主NKG2D的情况下，mutIL2实际上增加了LLC生长的速率。因此，OMCP介导的mutIL2靶向为各种小鼠品系中的实体瘤和液体瘤提供了更安全和更有效的免疫疗法形式。
扩增，NK细胞也形成主要障碍16,17,21,22。与wtIL2或mutIL2相比，用OMCP-mutIL2处理A/J小鼠导致增加的体内清除和通过大量脾细胞的体外裂解YAC-1细胞（图4A，图9A-B）。与wtIL2或mutIL2相比，在750,000 IUe的OMCP-mutIL2后，B6小鼠中高度侵袭性Lewis肺癌（LLC）细胞系的生长减少是明显的。对于LLC细胞系，在OMCP-mutIL2处理的脾细胞中增加的细胞毒性
也是明显的（图4B-C；图9A-C）。在NKG2D-/-小鼠中或NK耗尽后丧失增强的免疫疗法（图4D-E）。在没有宿主NKG2D的情况下，mutIL2实际上增加了LLC生长的速率。因此，OMCP介导的mutIL2靶向为各种小鼠品系中的实体瘤和液体瘤提供了更安全和更有效的免疫疗法形式。
[0253] 实施例6. NKG2D靶向对IL2信号传导的影响。
[0254] 抗体-IL2缀合物或IL2/抗IL2抗体复合物通过延长血清半衰期的持续时间显示出相对于纯化的细胞因子的改善的生物学活性23,24。为了研究IL2与OMCP的连接是否增加血清半衰期，我们将500,000 IUe的荧光标记的wtIL2、mutIL2或OMCP-mutIL2注射到A/J和B6小
鼠中，并通过连续抽血监测血清清除率。尽管OMCP-mutIL2在早期时间点具有略高的血清浓度，但是在注射后一小时血液中检测不到所有构建体（图5A-B）。这明显短于抗体-IL2缀合物的所述11-14小时血清半衰期23。有趣的是，尽管注射了相同量的细胞因子，但在所有时间点，与A/J小鼠相比，在B6小鼠中检测到较低的细胞因子水平。该数据指出IL2清除中的品系特异性差异，并且可以解释为何B6小鼠能够耐受并且需要更高剂量的细胞因子用于NK扩
增。然而，基于该数据，构建体的延长循环不太可能导致OMCP-mutIL2相对于wtIL2的活性增加。
鼠中，并通过连续抽血监测血清清除率。尽管OMCP-mutIL2在早期时间点具有略高的血清浓度，但是在注射后一小时血液中检测不到所有构建体（图5A-B）。这明显短于抗体-IL2缀合物的所述11-14小时血清半衰期23。有趣的是，尽管注射了相同量的细胞因子，但在所有时间点，与A/J小鼠相比，在B6小鼠中检测到较低的细胞因子水平。该数据指出IL2清除中的品系特异性差异，并且可以解释为何B6小鼠能够耐受并且需要更高剂量的细胞因子用于NK扩
增。然而，基于该数据，构建体的延长循环不太可能导致OMCP-mutIL2相对于wtIL2的活性增加。
[0255] 我们接下来考虑了OMCP-mutIL2的优越性是通过NKG2D进行信号传导的结果的可能性，因为该受体的抗体介导的交联可以活化NK细胞（图10A）25。虽然向mutIL2中添加纯化的OMCP不会在体外或体内增加NK活化或扩增（数据未显示），但我们不期望单体配体交联
NKG2D。因此，我们直接比较了在1000 IUe OMCP-mutIL2、mutIL2和mutIL2与等摩尔浓度的五聚化OMCP组合的存在下的NK细胞活化。在五聚化的OMCP存在的情况下，如通过CD69上调
或脱粒所测量的，NK活化没有增加（图5C，图10B）。这表明NKG2D交联不是OMCP-mutIL2在生理浓度下增强的NK细胞活化的原因。
NKG2D。因此，我们直接比较了在1000 IUe OMCP-mutIL2、mutIL2和mutIL2与等摩尔浓度的五聚化OMCP组合的存在下的NK细胞活化。在五聚化的OMCP存在的情况下，如通过CD69上调
或脱粒所测量的，NK活化没有增加（图5C，图10B）。这表明NKG2D交联不是OMCP-mutIL2在生理浓度下增强的NK细胞活化的原因。
[0256] 为了评估IL2信号传导，我们接下来对体外新鲜分离的NK细胞进行15分钟细胞因子刺激后定量STAT5磷酸化。与B6 NK细胞相比，在所有测试的浓度下，A/J中较低水平的
STAT5磷酸化是明显的（图5D-E），表明A/J小鼠的淋巴细胞功能障碍可能至少部分是无效
IL2信号转导的结果。令人惊讶的是，对于B6和A/J NK细胞，wtIL2和OMCP-mutIL2显示出相同的剂量依赖性STAT5磷酸化模式（图5D-E）。在没有NKG2D反应性的情况下，OMCP-mutIL2未能比单独的mutIL2增加STAT5磷酸化。总之，这些数据表明IL2α反应性对于静息NK细胞中的峰值IL2信号传导是重要的，并且NKG2D结合可以有效地替代IL2介导的信号转导中的IL2Rα结合。然而，这些数据未能解释体内或大量脾细胞培养物中由OMCP-mutIL2的优异的NK活化（图1C-D，图3）。
STAT5磷酸化是明显的（图5D-E），表明A/J小鼠的淋巴细胞功能障碍可能至少部分是无效
IL2信号转导的结果。令人惊讶的是，对于B6和A/J NK细胞，wtIL2和OMCP-mutIL2显示出相同的剂量依赖性STAT5磷酸化模式（图5D-E）。在没有NKG2D反应性的情况下，OMCP-mutIL2未能比单独的mutIL2增加STAT5磷酸化。总之，这些数据表明IL2α反应性对于静息NK细胞中的峰值IL2信号传导是重要的，并且NKG2D结合可以有效地替代IL2介导的信号转导中的IL2Rα结合。然而，这些数据未能解释体内或大量脾细胞培养物中由OMCP-mutIL2的优异的NK活化（图1C-D，图3）。
[0257] IL2信号传导导致IL2/IL2R的内化，随后IL2和IL2Rβγ的降解。因此，OMCP-mutIL2与IL2受体和NKG2D的结合可以通过延长IL2信号传导而导致内化改变和NK细胞活化增强。为了测试这一点，我们刺激新鲜分离的NK细胞15分钟，用无细胞因子的培养基替换培养基，并监测STAT5磷酸化4小时。对于wtIL2和OMCP-mutIL2，磷酸-STAT5的相同衰减是明显的（图
5F-G）。因此，改变IL2信号传导的持续时间不是通过OMCP-mutIL2的优异NK活化的原因。
5F-G）。因此，改变IL2信号传导的持续时间不是通过OMCP-mutIL2的优异NK活化的原因。
[0258] 我们接下来考虑了OMCP-mutIL2的优异NK活化是细胞因子与竞争性基质细胞相互作用改变的结果的可能性（图5H）。实际上，在存在其他脾细胞的情况下，OMCP-mutIL2证明了NK STAT5磷酸化相对于wtIL2的剂量依赖性增强（图5I）。我们接下来探讨了通过基质细胞的IL2Rα表达与通过NK细胞的NKG2D表达之间对IL2信号转导的相互影响。为了实现这一
点，我们从野生型或NKG2D-/- B6小鼠中分离脾NK细胞，并将它们与耗尽NK细胞的野生型脾细胞组合。以1:20 NK：脾细胞比率重组培养物，类似于静息野生型B6小鼠中通常存在的比例。对于一些培养物，在与野生型NK细胞重组之前，用饱和浓度的IL2Rα阻断抗体（克隆3C7）处理NK细胞耗尽的脾细胞。然后用1000 IUe的wtIL2或OMCP-mutIL2刺激培养物15分钟。在
wtIL2存在下，STAT5磷酸化在NKG2D-/-或野生型NK细胞中是相同的（图5J，左侧两栏）。用OMCP-mutIL2培养的野生型NK细胞表现出相对于具有wtIL2的培养物的优异的STAT5磷酸
化。在用OMCP-mutIL2培养的NKG2D-/- NK细胞中，几乎没有明显的STAT5磷酸化（图5J，右侧两栏）。在存在竞争性脾细胞基质细胞的IL2Rα阻断的情况下，通过wtIL2的NK细胞STAT5磷酸化增加至与OMCP-mutIL2相当的水平（图5K）。总之，这些数据表明，通过“竞争”基质细胞的IL2-Ra表达限制了wtIL2对NK细胞的活化，并且这种竞争可以通过靶向NKG2D的IL2Rα结
合的受损的OMCP-mutIL2构建体而消除。
点，我们从野生型或NKG2D-/- B6小鼠中分离脾NK细胞，并将它们与耗尽NK细胞的野生型脾细胞组合。以1:20 NK：脾细胞比率重组培养物，类似于静息野生型B6小鼠中通常存在的比例。对于一些培养物，在与野生型NK细胞重组之前，用饱和浓度的IL2Rα阻断抗体（克隆3C7）处理NK细胞耗尽的脾细胞。然后用1000 IUe的wtIL2或OMCP-mutIL2刺激培养物15分钟。在
wtIL2存在下，STAT5磷酸化在NKG2D-/-或野生型NK细胞中是相同的（图5J，左侧两栏）。用OMCP-mutIL2培养的野生型NK细胞表现出相对于具有wtIL2的培养物的优异的STAT5磷酸
化。在用OMCP-mutIL2培养的NKG2D-/- NK细胞中，几乎没有明显的STAT5磷酸化（图5J，右侧两栏）。在存在竞争性脾细胞基质细胞的IL2Rα阻断的情况下，通过wtIL2的NK细胞STAT5磷酸化增加至与OMCP-mutIL2相当的水平（图5K）。总之，这些数据表明，通过“竞争”基质细胞的IL2-Ra表达限制了wtIL2对NK细胞的活化，并且这种竞争可以通过靶向NKG2D的IL2Rα结
合的受损的OMCP-mutIL2构建体而消除。
[0259] 实施例1-6的讨论。
[0260] 尽管IL2治疗最初显示出巨大的希望，但它受到Tregs活化和与血管内皮活化相关的毒副作用的限制。已经提出了几种策略来优先活化细胞毒性淋巴细胞。一种策略是产生
对IL2Rβ具有增加的亲和力的突变体，以消除对IL2Rα的偏好26,27。重要的是，这些IL2突变体保留了IL2Rα的野生型结合，因此仍然可被Treg细胞和血管内皮识别。我们的结果还表明，与表达IL2-Rα+的细胞的竞争限制了wtIL2对细胞毒性淋巴细胞的生物利用度。
对IL2Rβ具有增加的亲和力的突变体，以消除对IL2Rα的偏好26,27。重要的是，这些IL2突变体保留了IL2Rα的野生型结合，因此仍然可被Treg细胞和血管内皮识别。我们的结果还表明，与表达IL2-Rα+的细胞的竞争限制了wtIL2对细胞毒性淋巴细胞的生物利用度。
[0261] 另一种有希望的疗法涉及抗IL2抗体，其在空间上抑制wtIL2与IL2Rα的结1,28,29
合 。由于抗体的Fc区及潜在地由于来自IL2Rα表达细胞的wtIL2竞争减少，这种治疗可
以延长血清半衰期24。还设计了抗体-IL2融合蛋白以将IL2靶向特异性肿瘤抗原30,31。虽然提供个体化治疗的潜力，但这种抗体介导的IL2向肿瘤的递送取决于已知肿瘤相关抗原的
表达，即一种通常不存在的情况。该方法可能潜在地进一步受到肿瘤介导的靶抗原改变的
限制。
合 。由于抗体的Fc区及潜在地由于来自IL2Rα表达细胞的wtIL2竞争减少，这种治疗可
以延长血清半衰期24。还设计了抗体-IL2融合蛋白以将IL2靶向特异性肿瘤抗原30,31。虽然提供个体化治疗的潜力，但这种抗体介导的IL2向肿瘤的递送取决于已知肿瘤相关抗原的
表达，即一种通常不存在的情况。该方法可能潜在地进一步受到肿瘤介导的靶抗原改变的
限制。
[0262] 最后，已经广泛测试了对IL2Rα具有降低的亲和力的IL2突变体。与wtIL2相比，这些突变体可以超治疗剂量施用，而没有IL2Rα介导的毛细血管渗漏或全身毒性32。虽然这些突变体具有极好的安全性概况，但它们活化细胞毒性淋巴细胞差（图5C-E）33。我们的方法结合了上述几个概念以将IL2的安全形式直接靶向细胞毒性淋巴细胞而不是肿瘤。这通过用NKG2D替换IL2与IL2Rα的正常靶向来实现。与高亲和力NKG2D配体融合的IL2Rα缺陷型IL2的组合通过特异性扩增NK细胞而没有任何明显的Tregs活化或毛细血管渗漏而改善了先前的
策略。这些发现提供了一种潜在安全且高效的IL2形式的前景。
策略。这些发现提供了一种潜在安全且高效的IL2形式的前景。
[0263] 将近交实验动物的结果转化为人的一个限制是细胞因子反应性的天然多样性和淋巴细胞活化的环境依赖性阈值。先前的研究已经证明了离体杀伤肿瘤细胞和增强的长期
34
癌症免疫之间的相关性 。因此，任何潜在的治疗都需要考虑具有不同细胞毒性淋巴细胞活性水平的群体。因此，我们已经尝试通过使用已知对癌发生是高度抗性（B6）或易感（A/J）的两种品系的小鼠来模拟这种天然变异。例如，来自B6小鼠的NK细胞被wtIL2和极端剂量的
mutIL2活化。相反，IL2/抗IL2抗体复合物导致A/J而非B6小鼠中NK细胞的扩增。这些变化突出了将来自单一小鼠品系的结果转化成免疫学上不同的人的局限性。重要的是，OMCP-
mutIL2构建体能够扩增两种小鼠品系中的NK细胞，表明该疗法在具有不同NK功能和细胞因
子反应性的群体中可能是有效的。
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癌症免疫之间的相关性 。因此，任何潜在的治疗都需要考虑具有不同细胞毒性淋巴细胞活性水平的群体。因此，我们已经尝试通过使用已知对癌发生是高度抗性（B6）或易感（A/J）的两种品系的小鼠来模拟这种天然变异。例如，来自B6小鼠的NK细胞被wtIL2和极端剂量的
mutIL2活化。相反，IL2/抗IL2抗体复合物导致A/J而非B6小鼠中NK细胞的扩增。这些变化突出了将来自单一小鼠品系的结果转化成免疫学上不同的人的局限性。重要的是，OMCP-
mutIL2构建体能够扩增两种小鼠品系中的NK细胞，表明该疗法在具有不同NK功能和细胞因
子反应性的群体中可能是有效的。
[0264] 因为OMCP被描述为NKG2D的进化拮抗剂35，在肿瘤疗法时对该免疫受体的阻断可能被认为是适得其反的。尽管如此，甚至在已建立的肿瘤存在下，OMCP-mutIL2处理的小鼠中的天然细胞毒性和肿瘤清除也增强。这表明最小或短暂的NKG2D受体占有率和保存功能。可选地，最近的报道已经证明脱落的NKG2D配体实际上可以通过逆转由慢性激动接合施加的
NK脱敏来促进肿瘤免疫36。虽然我们没有通过单体或甚至五聚体OMCP检测NK活化或扩增，但是在肿瘤床内这种竞争性拮抗作用可能在NK活化中起矛盾的作用。此外，IL2可能上调NK迁移和肿瘤浸润所必需的受体。因此，OMCP-mutIL2介导的抗肿瘤免疫可能依赖于位于肿瘤床外的NK细胞而不经受局部肿瘤特异性耐受或无效能。此外，OMCP可能是理想的“靶向载体”，这是因为它与人NKG2D结合的高亲和力和长半衰期。
NK脱敏来促进肿瘤免疫36。虽然我们没有通过单体或甚至五聚体OMCP检测NK活化或扩增，但是在肿瘤床内这种竞争性拮抗作用可能在NK活化中起矛盾的作用。此外，IL2可能上调NK迁移和肿瘤浸润所必需的受体。因此，OMCP-mutIL2介导的抗肿瘤免疫可能依赖于位于肿瘤床外的NK细胞而不经受局部肿瘤特异性耐受或无效能。此外，OMCP可能是理想的“靶向载体”，这是因为它与人NKG2D结合的高亲和力和长半衰期。
[0265] 虽然来自两个独立的小鼠品系的NK细胞被OMCP-mutIL2活化，但我们没有检测到我们的构建体对CD8+ T细胞活化的全局扩增。这很可能是由于NKG2D仅在选择的CD8+ T细胞亚群（即记忆或活化的细胞毒性淋巴细胞）上表达的事实。基于在无特定病原体环境中培养的小鼠中这种细胞群的缺乏，OMCP-mutIL2介导的活化在我们的系统中受限于NK细胞。为
此，我们集中于肺癌和淋巴瘤的免疫疗法，其生长主要由NK细胞调节16,17,22,37。然而，当在体外以高浓度施用时，OMCP-mutIL2能够扩增CD8+ T细胞（图1E-F）。因此，可能的是，免疫刺激细胞因子的NKG2D靶向递送可以导致抗原特异性CD8+记忆细胞的扩增和/或活化，以在正常
免疫条件下的长期肿瘤免疫。
此，我们集中于肺癌和淋巴瘤的免疫疗法，其生长主要由NK细胞调节16,17,22,37。然而，当在体外以高浓度施用时，OMCP-mutIL2能够扩增CD8+ T细胞（图1E-F）。因此，可能的是，免疫刺激细胞因子的NKG2D靶向递送可以导致抗原特异性CD8+记忆细胞的扩增和/或活化，以在正常
免疫条件下的长期肿瘤免疫。
[0266] 实施例1-6的方法。
[0267] 细胞因子和构建体产生：将编码人IL2（1-133；C125S）和突变体IL2（1-133；R38A、F42K、C125S）的序列克隆到具有N-末端FLAG/六组氨酸标签的pFM1.2R38中。嵌合OMCP-mutIL2分子包含克隆到pFM1.2R载体中与C-末端FLAG/六组氨酸标签-突变体IL2（1-133；
R38A、F42K、C125S）框内克隆的全长OMCP（1-152）编码序列。通过瞬时转染入HEK293F
(Life_Technologies)表达蛋白。在转染后72小时和144小时回收上清液。上清液补充有5
mM咪唑和0.02％叠氮化钠，并通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）色谱（Qiagen）纯化。将纯化的蛋白缓冲液交换到盐水中并在液氮中快速冷冻。对于内部产生的野生型IL2和可从NCI贮库
(Frederick National Laboratory for Cancer Research)获得的Teceleukin (TecinTM)
记录了相等的体外和体内活性。因此，对于一些实验，这两种IL2制剂可互换使用。
R38A、F42K、C125S）框内克隆的全长OMCP（1-152）编码序列。通过瞬时转染入HEK293F
(Life_Technologies)表达蛋白。在转染后72小时和144小时回收上清液。上清液补充有5
mM咪唑和0.02％叠氮化钠，并通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）色谱（Qiagen）纯化。将纯化的蛋白缓冲液交换到盐水中并在液氮中快速冷冻。对于内部产生的野生型IL2和可从NCI贮库
(Frederick National Laboratory for Cancer Research)获得的Teceleukin (TecinTM)
记录了相等的体外和体内活性。因此，对于一些实验，这两种IL2制剂可互换使用。
[0268] 野生型IL2具有15x106 IU/mg的比活性39。因此，基于15.5kDa的分子量，4.4μM溶液相当于1000 IU/μl。基于该计算，所有细胞因子和构建体以1 µl的4.4μM溶液（定义为1000 IU当量（IUe从此处开始））的摩尔基础施用。尽管分子量有差异，这种系统允许IL2、mutIL2和OMCP-mutIL2之间的等摩尔比较。
[0269] 动物：A/J（8-12周）和C57BL/6J（6-9周）小鼠品系购自Jackson Laboratory (Bar -/-Harbor, Maine)。B6背景上的NKG2D 小鼠由Wayne Yokoyama友情提供并内部繁殖(Howard
Hughes Institute of Medicine于Washington University，于St. Louis)。将动物圈养在空气过滤笼中的屏障设施中，并允许自由获取食物和水。对于一些实验，用消耗浓度的抗
Asialo-GM1（50μl第-2天；25μl第-1天）或对照兔IgG（Wako Chemical Company）处理A/J小鼠。动物程序由Washington University School of Medicine, St. Louis, MO的动物研
究委员会批准。
Hughes Institute of Medicine于Washington University，于St. Louis)。将动物圈养在空气过滤笼中的屏障设施中，并允许自由获取食物和水。对于一些实验，用消耗浓度的抗
Asialo-GM1（50μl第-2天；25μl第-1天）或对照兔IgG（Wako Chemical Company）处理A/J小鼠。动物程序由Washington University School of Medicine, St. Louis, MO的动物研
究委员会批准。
[0270] 组织收获和体外培养：通过ACK缓冲液（Lonza，Walkersville，MD）在RBC裂解之前，通过70μm细胞过滤器压碎整个脾脏并通过40μm过滤器再过滤，获得脾细胞的单细胞悬浮液。在以与脾脏相同的方式处理之前，将肺在37℃下在1mg/ml胶原酶II (Fisher
Scientific)和5 U/ml DNaseI（Sigma-Aldridge）中消化90分钟。
Scientific)和5 U/ml DNaseI（Sigma-Aldridge）中消化90分钟。
[0271] 对于体外培养，将来自A/J、B6或NKG2D-/-小鼠的脾细胞以无菌方式提取并接种于12孔板中的完全培养基（RPMI1640，补充有10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇），以每孔每毫升5百万个细胞。如稿件中所述，用渐增剂量的人重组IL2、mutIL2、OMCP-mutIL2或OMCP处理细胞36小时。对于一些实验，在流式细胞术分析之前，用CFSE标记大量脾细胞并在1000 IUe/ml细胞因子中培养5天。对于NK分离实验，使用NK细胞分离试剂盒II或CD49b（DX5）阳性磁珠选择（均来自Miltenyi Biotech）处理大量脾细胞。对于STAT5磷酸化实验，分离的NK细胞在递增浓度的IL2或构建体中以100,000细胞/500μl刺激15分钟。对于评估NK细胞与脾基质相互作用的实验，用CFSE标记DX5阳性选择的NK细胞（用于固定和透化后的鉴定）并与NK耗尽的基质细胞重新组合。如稿件中所述，对于一些研究，将NKG2D-/- NK细胞与野生型脾细胞基质细胞组合。对于其他实验，在与NK细胞重组之前，用饱和浓度的抗-IL2α阻断抗体（克隆3C7）或同种型对照（均来自Biolegend）处理来自野生型B6小鼠的NK耗尽的脾细胞。对于此类竞争性STAT5磷酸化实验，将100,000个细胞重
悬浮于含有1,000 IU/ml wtIL2、mutIL2或OMCP-mut-IL2（新鲜制备并预热）的2μl完全培养基中。然后将细胞在37℃下孵育15分钟。
悬浮于含有1,000 IU/ml wtIL2、mutIL2或OMCP-mut-IL2（新鲜制备并预热）的2μl完全培养基中。然后将细胞在37℃下孵育15分钟。
[0272] 流式细胞术：使用饱和浓度的荧光染料缀合的抗体在4℃下在由含有2％ FBS和0.4 EDTA的PBS组成的FACS缓冲液中进行所有流式细胞术分析。所有抗体均为抗小鼠，且购自BD Bioscience或eBioscience，并由抗CD4（克隆GK1.5或RM4-5）、抗CD8（克隆53-6.7）、抗CD278（ICOS）（克隆：7E.17G9）、抗CD25（克隆PC61）、抗KLRG1（克隆2F1）、CD49b（整合素α2）（克隆DX5）、抗CD3e（克隆1452C11）、抗CD45（克隆30-F11）、抗CD69 PE（克隆H1.2F3）、抗GITR（克隆DTA-1）、抗Foxp3（克隆：FJK-16s）和抗Stat5（克隆47/Stat5；pY694）组成。将抗体与FITC、PE、PerCP-CyTM5.5、PE-Cyanine7、APC、APC-eFluor® 780、eFluor® 450或Alexa Fluor® 647缀合。
[0273] 通过多聚甲醛固定、甲醇透化和用AlexaFluor488-缀合的抗-Stat5（pY694）(pY694) (BD Pharmingen; 克隆612599)染色进行磷酸-STAT5评估。为了完成这一点，将分离的NK细胞或NK细胞与NK耗尽的脾细胞基质细胞的组合在IL2刺激15分钟后，固定在2％多
聚甲醛（PFA）中在37℃下持续10分钟。然后用冰冷的PBS洗涤细胞一次，并通过在冰上加入
0.5 ml/管90％甲醇进行透化1小时。用冰冷的PBS洗涤细胞一次（以除去甲醇），并在室温下用抗Stat5（pY694）抗体染色1小时，然后在PBS/0.5％胎牛血清中洗涤一次。
聚甲醛（PFA）中在37℃下持续10分钟。然后用冰冷的PBS洗涤细胞一次，并通过在冰上加入
0.5 ml/管90％甲醇进行透化1小时。用冰冷的PBS洗涤细胞一次（以除去甲醇），并在室温下用抗Stat5（pY694）抗体染色1小时，然后在PBS/0.5％胎牛血清中洗涤一次。
[0274] 体外细胞毒性：51通过将靶细胞与100 mCi铬酸钠51（PerkinElmer）孵育1小时来进行铬释放。将大量脾细胞用作效应细胞，并在圆底96孔板中在37℃下以确定的效应物：靶标比率与靶标孵育4小时。特异性裂解表示为（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发释放）X100％，且0％特异性裂解作为最低表达值。
[0275] 体内细胞因子注射：对于选择实验，小鼠接受作为经5天周期一天两次给予的十次相等剂量进行给予的200μl体积的细胞因子的腹膜内注射。如上所述，所有细胞因子都是以摩尔基础归一化为 IUe。对于选择实验，然后在第6天处死小鼠，并将器官固定在10％缓冲的福尔马林中用于组织学分析。对于其他实验，通过流式细胞术分析脾细胞和肺淋巴细胞
群。对于所有体内细胞因子处理实验，将动物称重（每天或每隔一天）并表示为从细胞因子治疗开始的％变化。
群。对于所有体内细胞因子处理实验，将动物称重（每天或每隔一天）并表示为从细胞因子治疗开始的％变化。
[0276] 为了评估血清浓度，将wtIL2、mutIL2或OMCP-mutIL2根据制造商的说明书，用Alexa Fluor® 647 (LifeTechnologies Inc.)标记。在指定的时间收集血清，并根据标准
曲线通过荧光检查确定细胞因子的浓度。
曲线通过荧光检查确定细胞因子的浓度。
[0277] 体内肿瘤研究：Lewis肺癌（LLC）细胞在100μl无菌盐水中以每只小鼠1 x 105个细胞皮下注射到B6或B6 NKG2D-/-小鼠中。一旦可见肿瘤变得明显，注射后第5天，如上所述开始5天的细胞因子治疗过程。使用卡尺进行横截面肿瘤直径的测量，并将肿瘤体积估计为4/3πr3。在注射后第24天或一旦它们达到20mm的最大肿瘤直径，处死小鼠。对于NK细胞耗竭，用抗NK1.1抗体（克隆PK136）或小鼠IgG同种型对照（均来自BioXcell）在第-2天以500 µg、在第-1天以250 µg和每周250 µg处理小鼠，持续实验的持续时间。对于淋巴瘤清除实验，如上所述，在5天的时期内用10剂量的细胞因子处理A/J小鼠，并在第6天以5 x 106细胞/小鼠静脉内注射用CFSE标记的YAC-1细胞。4小时后处死小鼠，将肺消化，并通过CFSE+细胞的正向和侧向散射分析确定YAC-1的活力。
[0278] 统计学：各种细胞因子治疗条件之间的脾和肺驻留淋巴细胞的比较通过非配对T检验及Welch氏校正进行，以解释不等方差或不相等的样本大小。通过使用Sidak-
Bonferroni校正在不同时间点在各种条件之间进行的多次非配对T检验来比较不同细胞因
子条件之间的肿瘤生长。以类似方式通过非配对T检验及Welch氏校正来评估STAT5磷酸化
的倍数变化。
Bonferroni校正在不同时间点在各种条件之间进行的多次非配对T检验来比较不同细胞因
子条件之间的肿瘤生长。以类似方式通过非配对T检验及Welch氏校正来评估STAT5磷酸化
的倍数变化。
[0279] 实施例1-6的参考文献。
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[0281] 实施例7-10的介绍由MHC I类（MHCI）介导的细胞内监视是关键的宿主免疫功能，且因此MHCI分子经常被
病毒靶向破坏或细胞内保留[1]。许多疱疹病毒编码至少一种阻止MHCI细胞表面表达的蛋
白[1,2]。然而，这种免疫逃避策略使受感染的细胞由于失去抑制信号而对NK细胞介导的裂解敏感[3]。病毒感染还导致由活化受体NKG2D识别的NKG2D配体（NKG2DL）的细胞表面展示，进一步使感染细胞易于发生NK细胞介导的裂解。因此，靶向MHCI表达的病毒通常也通过靶
向感染细胞上的NKG2DL来破坏NKG2D介导的细胞应答[4-7]。
病毒靶向破坏或细胞内保留[1]。许多疱疹病毒编码至少一种阻止MHCI细胞表面表达的蛋
白[1,2]。然而，这种免疫逃避策略使受感染的细胞由于失去抑制信号而对NK细胞介导的裂解敏感[3]。病毒感染还导致由活化受体NKG2D识别的NKG2D配体（NKG2DL）的细胞表面展示，进一步使感染细胞易于发生NK细胞介导的裂解。因此，靶向MHCI表达的病毒通常也通过靶
向感染细胞上的NKG2DL来破坏NKG2D介导的细胞应答[4-7]。
[0282] NKG2DL通常不在细胞表面上表达，但可以通过细胞应激诱导[8]。NKG2DL表达的具体触发因素尚不清楚，但NKG2DL在对几种病毒感染的应答中被上调[9-12]。尽管具有低序
列同一性，但NKG2DL包含一大组均被NKG2D识别的蛋白。NKG2DL包括人中的MIC（A和B）和
ULBP（1-6）家族以及小鼠中的MULT1和RAE-1（α-ε）和H60（a-c）家族[13]。NKG2DLs的冗余可能是由于配体组织特异性表达模式的组合以及对抗病毒NKG2D逃避策略的需要[14]。许多
病毒已经进化出抑制NKG2DL的细胞表面表达的机制作为干扰病毒感染的NKG2D监视的手
段。这种策略在β-和γ-疱疹病毒中最为明显，其中有4种鼠巨细胞病毒蛋白（m138、m145、m152、m155）[15-18]，两种人巨细胞病毒蛋白（UL16、UL142）[19,20]和一种卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒蛋白（K5）[21]已被证明阻断NKG2DL表面表达。这种逃避策略也在RNA病毒中发现，因为丙型肝炎病毒NS3/4a和人免疫缺陷病毒Nef蛋白也阻断了NKG2DL子集的表达[22,
23]。另外，人巨细胞病毒、1型单纯疱疹病毒和EB病毒各自也编码至少一种阻止MICB翻译的miRNA[24,25]。同样，JCV和BKV多瘤病毒用miRNA靶向ULBP3 [26]。然而，阻断受感染细胞上的NKG2DL表达是不完美的逃避策略，因为没有显示单个病毒蛋白或miRNA阻断所有NKG2DL
的表达。
列同一性，但NKG2DL包含一大组均被NKG2D识别的蛋白。NKG2DL包括人中的MIC（A和B）和
ULBP（1-6）家族以及小鼠中的MULT1和RAE-1（α-ε）和H60（a-c）家族[13]。NKG2DLs的冗余可能是由于配体组织特异性表达模式的组合以及对抗病毒NKG2D逃避策略的需要[14]。许多
病毒已经进化出抑制NKG2DL的细胞表面表达的机制作为干扰病毒感染的NKG2D监视的手
段。这种策略在β-和γ-疱疹病毒中最为明显，其中有4种鼠巨细胞病毒蛋白（m138、m145、m152、m155）[15-18]，两种人巨细胞病毒蛋白（UL16、UL142）[19,20]和一种卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒蛋白（K5）[21]已被证明阻断NKG2DL表面表达。这种逃避策略也在RNA病毒中发现，因为丙型肝炎病毒NS3/4a和人免疫缺陷病毒Nef蛋白也阻断了NKG2DL子集的表达[22,
23]。另外，人巨细胞病毒、1型单纯疱疹病毒和EB病毒各自也编码至少一种阻止MICB翻译的miRNA[24,25]。同样，JCV和BKV多瘤病毒用miRNA靶向ULBP3 [26]。然而，阻断受感染细胞上的NKG2DL表达是不完美的逃避策略，因为没有显示单个病毒蛋白或miRNA阻断所有NKG2DL
的表达。
[0283] 像几种疱疹病毒一样，牛痘病毒（CPXV）也破坏了MHCI表达。CPXV表达CPXV012和CPXV203，分别阻止TAP介导的肽转运和MHCI运输到细胞表面的两种蛋白[27-34]。鼠痘病
毒，一种相关的正痘病毒，诱导NKG2DL表达，并且NKG2D对于控制鼠痘病毒发病至关重要
[35]。另一种正痘病毒，猴痘病毒的感染，导致NK细胞的急剧扩增，但NK细胞功能受损[36]。
综上，这表明CPXV感染的细胞对NK细胞介导的裂解敏感。
毒，一种相关的正痘病毒，诱导NKG2DL表达，并且NKG2D对于控制鼠痘病毒发病至关重要
[35]。另一种正痘病毒，猴痘病毒的感染，导致NK细胞的急剧扩增，但NK细胞功能受损[36]。
综上，这表明CPXV感染的细胞对NK细胞介导的裂解敏感。
[0284] 与疱疹病毒不同，CPXV不靶向NKG2DL。相反，这种病毒通过编码NKG2DL的竞争性抑制剂，即正痘病毒MHC I类样蛋白（OMCP）直接靶向NKG2D[37,38]。OMCP是一种152个残基的蛋白，由感染细胞分泌并拮抗NKG2D介导的表达NKG2DL的靶细胞的杀伤[37]。OMCP在体内也起重要作用，且OMCP-空CPXV在小鼠感染模型中减弱（M. Sun等人，个人通信）。OMCP以等于或大于所有测试的鼠NKG2DL的亲和力与鼠NKG2D结合，并且以是NKG2DL的 5,000倍的亲和~
力与人NKG2D结合[37-40]。
力与人NKG2D结合[37-40]。
[0285] 尽管它们在序列同一性上存在差异，但所有已知的宿主NKG2DL都具有共同的结构特征[41,42]。NKG2DL含有MHCI样平台结构域，其由具有两个螺旋的八链β折叠构成[43-
47]。平台结构域被细分为α1和α2结构域，且每个结构域包含四个β链和一个α螺旋。与MHCI不同，NKG2DL平台结构域的螺旋之间的沟是封闭的，因此NKG2DL不结合肽。
47]。平台结构域被细分为α1和α2结构域，且每个结构域包含四个β链和一个α螺旋。与MHCI不同，NKG2DL平台结构域的螺旋之间的沟是封闭的，因此NKG2DL不结合肽。
[0286] 与宿主NKG2DL一样，OMCP也采用MHCI样平台结构域[38]。然而，OMCP的平台结构域已被修整为仅具有具有较短侧翼螺旋的六链β折叠。我们将α1结构域的螺旋称为H1，将α2结构域的不连续螺旋称为H2a和H2b。OMCP的H2a和H2b螺旋也重新排列，以相对于β折叠更平坦并且彼此分开。假设OMCP结构的这些差异对于OMCP与NKG2D的高亲和力结合是重要的。然而，仍然期望OMCP以与宿主NKG2DL相同的定向与NKG2D结合，即α螺旋在对称的NKG2D结合沟内对角定向。
[0287] 在这里，我们报道与牛痘病毒的Brighton Red毒株的OMCP结合的人NKG2D的2.0 Å-分辨率结构。该结构揭示了OMCP在NKG2D结合沟中相对于宿主NKG2DL的显著重新定向。
OMCP与NKG2D的界面高度互补，比宿主NKG2DL埋藏明显更大的表面积，并且在整个NKG2D结
合沟中保持连续。这种新的结合适应性和高亲和力使OMCP能够与高局部浓度的膜结合的宿
主NKG2DL竞争。我们进一步表明，NKG2D拮抗作用的机制需要分泌OMCP，以免导致NKG2D信号传导。
OMCP与NKG2D的界面高度互补，比宿主NKG2DL埋藏明显更大的表面积，并且在整个NKG2D结
合沟中保持连续。这种新的结合适应性和高亲和力使OMCP能够与高局部浓度的膜结合的宿
主NKG2DL竞争。我们进一步表明，NKG2D拮抗作用的机制需要分泌OMCP，以免导致NKG2D信号传导。
[0288] 实施例7. OMCP-NKG2D的结构测定。
[0289] 我们之前已经解析了单独OMCP的结构，并显示与宿主NKG2DL类似，OMCP采用MHCI样平台结构域[38]。尽管OMCP的结构域结构与宿主NKG2DL的总体相似性，但OMCP在假定的
NKG2D结合位点中具有几个显著的偏差，所述结合位点被假设对于OMCP与NKG2D的高亲和力
结合是重要的。为了进一步了解OMCP对NKG2D的异常高亲和力，我们结晶并解析了与人
NKG2D结合的OMCP的结构。
NKG2D结合位点中具有几个显著的偏差，所述结合位点被假设对于OMCP与NKG2D的高亲和力
结合是重要的。为了进一步了解OMCP对NKG2D的异常高亲和力，我们结晶并解析了与人
NKG2D结合的OMCP的结构。
[0290] 用OMCP和NKG2D进行的初始结晶试验产生～30种不同的结晶条件。随后的数据收集和多种低分辨率晶体形式的分子置换都产生类似的部分溶液，其中OMCP-NKG2D复合物的
交替片层由不确定的密度分开。在单独的OMCP的原始结构中，β折叠包装形成三聚体，且α螺旋定向远离中心[38]。在OMCP-NKG2D部分溶液中形成相同的OMCP三聚体，且NKG2D现在与向外的螺旋结合（数据未显示）。为了尝试改变晶格堆积，我们在OMCP的β折叠中引入了突变，这些突变被设计用于打破三聚体界面。这些突变位于OMCP自NKG2D结合位点的对面，以避免破坏OMCP-NKG2D结合。OMCP（Y23D，F95D）的突变形式在新的空间群中与NKG2D结晶，并且晶体衍射至2.0 Å （表1）（图24A）。
交替片层由不确定的密度分开。在单独的OMCP的原始结构中，β折叠包装形成三聚体，且α螺旋定向远离中心[38]。在OMCP-NKG2D部分溶液中形成相同的OMCP三聚体，且NKG2D现在与向外的螺旋结合（数据未显示）。为了尝试改变晶格堆积，我们在OMCP的β折叠中引入了突变，这些突变被设计用于打破三聚体界面。这些突变位于OMCP自NKG2D结合位点的对面，以避免破坏OMCP-NKG2D结合。OMCP（Y23D，F95D）的突变形式在新的空间群中与NKG2D结晶，并且晶体衍射至2.0 Å （表1）（图24A）。
[0291] 除OMCP中的Q108外，电子密度图在结构的所有链中都是连续且明确的。该残基位于OMCP最大环的中心，单独的OMCP结构中也不存在该残基的明确密度[38]。与NKG2D结合的OMCP结构与我们以前的单独OMCP结构没有显著差异，且所有原子的RMSD均为0.8 Å。同样，NKG2D也与以前的NKG2D结构类似，且RMSD范围为0.5-0.9 Å。NKG2D的β3-β4环是OMCP或
NKG2D中唯一显示平均以上B因子的区域。该环被认为是柔性的，并且在所有先前的NKG2D结构中具有平均以上的B因子[48]。有趣的是，我们的NKG2D结构中S193-S194之间的肽键具有其他NKG2D结构中未描述的顺式构象（图29）。
NKG2D中唯一显示平均以上B因子的区域。该环被认为是柔性的，并且在所有先前的NKG2D结构中具有平均以上的B因子[48]。有趣的是，我们的NKG2D结构中S193-S194之间的肽键具有其他NKG2D结构中未描述的顺式构象（图29）。
[0293] 假设OMCP结合通过宿主NKG2DL使用的NKG2D的相同表面，这是因为（i）OMCP与宿主NKG2DL竞争NKG2D和（ii）NKG2D的NKG2DL结合口袋内的突变改变OMCP结合亲和力[38]。OMCP的确使用与宿主NKG2DL相同的凹形结合口袋结合NKG2D（图24A）。OMCP主要使用其α2结构域的不连续螺旋H2a和H2b结合。H2a和H2b螺旋的位置使得结合位点内两个螺旋的每个表面暴露的侧链直接接触NKG2D（图24B）。在H2a和H2b之外仅发现两个接触，Ile49和Arg66。这两个残基都位于α1结构域内，但位于H1螺旋之外。
[0294] 十二个OMCP残基与十八个NKG2D残基接触，形成键型的混合物（表2）。每个NKG2D半位点中的三个残基被称为核心结合残基，因为它们与所有已知的宿主NKG2DL接触。NKG2D亚基A (NKG2DA)的核心残基（Tyr152，Tyr199，Met184）形成两个氢键并与OMCP残基形成广泛的疏水接触。NKG2DA的核心残基接触四个OMCP残基，且这些残基中最关键的是Phe122。Phe122与所有三个NKG2DA核心残基形成多个疏水接触，包括与Tyr152的π堆叠。Phe122还与Tyr152形成骨架-侧链氢键。有趣的是，OMCP是第一个不利用所有六个NKG2D核心结合残基
B B
的NKG2D配体，且只有NKG2D亚基B (NKG2D)的Met184和Tyr152接触OMCP。NKG2D Met184和
Tyr152各自与OMCP残基形成单个氢键和疏水接触。两个OMCP残基Trp127和Asp132与两个
NKG2D启动子接触。OMCP Trp127与NKG2DA的Lys50形成氢键，并与NKG2DB的Leu148、NKG2DA的Lys150和Ser151形成几个疏水接触。OMCP Asp132与NKG2DB的Tyr152形成氢键和与NKG2DA的Lys150形成盐桥（图25A）。
B B
的NKG2D配体，且只有NKG2D亚基B (NKG2D)的Met184和Tyr152接触OMCP。NKG2D Met184和
Tyr152各自与OMCP残基形成单个氢键和疏水接触。两个OMCP残基Trp127和Asp132与两个
NKG2D启动子接触。OMCP Trp127与NKG2DA的Lys50形成氢键，并与NKG2DB的Leu148、NKG2DA的Lys150和Ser151形成几个疏水接触。OMCP Asp132与NKG2DB的Tyr152形成氢键和与NKG2DA的Lys150形成盐桥（图25A）。
[0295] 由于OMCP-NKG2D相互作用的高亲和力，我们利用高通量体外选择方法来发现结合NKG2D的无效突变体（表3）。筛选结果将D132鉴定为破坏NKG2D结合的重要残基。然后我们产生突变D132R以试图完全消除NKG2D结合。令人惊讶的是，单独的D132R突变体不能以高于KD
35倍的浓度结合NKG2D（图25B），但不影响OMCP与表达FcRL5的细胞的结合（图25C）。该突变可能引起显著的空间冲突，以及破坏Asp132与NKG2DA Lys150和NKG2DB Tyr152的相互作用
（图25A）。
35倍的浓度结合NKG2D（图25B），但不影响OMCP与表达FcRL5的细胞的结合（图25C）。该突变可能引起显著的空间冲突，以及破坏Asp132与NKG2DA Lys150和NKG2DB Tyr152的相互作用
（图25A）。
[0296] 以前，相对于小鼠NKG2D，OMCP与人NKG2D的亲和力高14倍被定位于NKG2D的β5'-β5环（缩写为L2）中的三个氨基酸取代[38]。除了取代本身（I182V，M184I和Q185P）之外，NKG2D直向同源物之间的环的位置不同。与鼠NKG2D的L2相比，人NKG2D中的L2向凹结合腔的中心B
弯曲。将鼠NKG2D叠加到人NKG2D-OMCP结构上显示，NKG2D中OMCP和Met184（mNKG2D残基
I200）之间以及NKG2DA中Met184（I200）和Glu185（P201）之间的接触将由于鼠β5'-β5环的不同位置而改变（图26A-B）。这种改变将破坏与OMCP H2a中的三个残基、H2b中的三个残基和α
1结构域内的Arg66的接触。在L2的接触残基中，Met184在两个NKG2D中产生最显著的接触
（表2）（图26C）。关键的是，在GenBank中可获得的58个NKG2D序列中，54个保存在高亲和力人NKG2D中发现的Met184和Glu185（图26D）。
弯曲。将鼠NKG2D叠加到人NKG2D-OMCP结构上显示，NKG2D中OMCP和Met184（mNKG2D残基
I200）之间以及NKG2DA中Met184（I200）和Glu185（P201）之间的接触将由于鼠β5'-β5环的不同位置而改变（图26A-B）。这种改变将破坏与OMCP H2a中的三个残基、H2b中的三个残基和α
1结构域内的Arg66的接触。在L2的接触残基中，Met184在两个NKG2D中产生最显著的接触
（表2）（图26C）。关键的是，在GenBank中可获得的58个NKG2D序列中，54个保存在高亲和力人NKG2D中发现的Met184和Glu185（图26D）。
[0297] 已经描述了不同CPXV和MPXV毒株之间的18种OMCP变体[51]。在该研究中，我们从来自CPXV的Brighton Red毒株中结晶OMCP，其与其他17种OMCP变体（统称为OMCPmpx）的高度保守序列具有>60％的序列同一性。在观察到的12个OMCP接触残基中，9个与OMCPmpx相同。在剩余的接触中，所有三个都是保守的疏水取代（I49L，T118I和M135I）（图27）。OMCPmpx与NKG2D结合，且NKG2D接触残基的取代不太可能严重影响OMCPmpx对NKG2D的亲和力[37]。
[0298] 实施例9. 新的NKG2D结合适应。
[0299] 宿主NKG2DL具有低序列同一性但总体上相似的结构，且MHCI样平台结构域对角地跨越由NKG2D同型二聚体产生的对称结合沟来结合[13,41,52]。宿主配体与H1和S1-S2环接
触一个NKG2D半位点，并与H2b接触第二个NKG2D半位点。尽管具有类似的MHCI样折叠，但
OMCP以新的定向结合NKG2D结合沟，相对于宿主NKG2DL旋转～45°（图27）。不使用H1和S1-S2环状宿主配体，OMCP而是用H2a取代了这些接触。这种旋转导致OMCP的螺旋垂直于NKG2D结
合沟，而不是对角穿过它放置。
触一个NKG2D半位点，并与H2b接触第二个NKG2D半位点。尽管具有类似的MHCI样折叠，但
OMCP以新的定向结合NKG2D结合沟，相对于宿主NKG2DL旋转～45°（图27）。不使用H1和S1-S2环状宿主配体，OMCP而是用H2a取代了这些接触。这种旋转导致OMCP的螺旋垂直于NKG2D结
合沟，而不是对角穿过它放置。
[0300] H2a和H2b的两种独特重排使得OMCP定向成为可能。OMCP和宿主NKG2DL的α2螺旋是不连续的，且两个较短的螺旋相对于彼此铰接。对于宿主配体，H2a和H2b之间的角度是～
90°，将H2a定位在远离NKG2D界面的位置。相比之下，OMCP将螺旋之间的铰链角增加了～
20°，导致相对于OMCP的β折叠更扁平的α2螺旋。α2螺旋的扁平化允许H2a和H2b与NKG2D同型二聚体的凹形结合沟紧密互补（图24B）。α2螺旋与NKG2D的紧密配合体现在高形状中互补性（0.77）和埋藏表面积(2,612 Å2)。相反，宿主NKG2DL具有形状互补性，范围为0.63-0.72，且埋藏表面积范围为1,700-2,180 Å2[43,44,46]。
90°，将H2a定位在远离NKG2D界面的位置。相比之下，OMCP将螺旋之间的铰链角增加了～
20°，导致相对于OMCP的β折叠更扁平的α2螺旋。α2螺旋的扁平化允许H2a和H2b与NKG2D同型二聚体的凹形结合沟紧密互补（图24B）。α2螺旋与NKG2D的紧密配合体现在高形状中互补性（0.77）和埋藏表面积(2,612 Å2)。相反，宿主NKG2DL具有形状互补性，范围为0.63-0.72，且埋藏表面积范围为1,700-2,180 Å2[43,44,46]。
[0301] α2螺旋的第二个独特特征是H2a和H2b相对于彼此分离。该区域还包含将H2a和H2b完全分离成两个不同螺旋的平移。该平移对于NKG2D结合是至关重要的，因为它允许每个螺旋直接位于每个NKG2D单体的核心结合位点的中心（图27）。这在OMCP上创建了一个对称的结合位点，其识别由NKG2D二聚体产生的对称结合沟。OMCP和NKG2D结合之间的对称性与不
对称宿主配体与对称NKG2D结合沟的典型结合形成鲜明对比[52]。然而，OMCP-NKG2D相互作用中仍存在一个不对称要素，因为每个NKG2D半位点识别不同N-至C-末端定向的OMCP螺旋，再次证明了NKG2D刚性适应识别的灵活性[41,53]。
对称宿主配体与对称NKG2D结合沟的典型结合形成鲜明对比[52]。然而，OMCP-NKG2D相互作用中仍存在一个不对称要素，因为每个NKG2D半位点识别不同N-至C-末端定向的OMCP螺旋，再次证明了NKG2D刚性适应识别的灵活性[41,53]。
[0302] NKG2D与宿主NKG2DL之间的接触位点由两个集中在NKG2D和H1/S1-S2环和NKG2DL的H2b的核心结合位点的小片(patch)组成[41]。结果是，NKG2D与NKG2DL的界面是不连续
的，特别是在NKG2D结合沟的中心（图27）。由于OMCP的独特定向，H2a和H2b沿着整个NKG2D结合沟形成连续接触（图27）。OMCP Lys126、Trp127、Glu131和Asp132的侧链与NKG2D结合沟中心的残基接触，并桥接每个NKG2D单体上的核心结合位点（图24B）。特别地，OMCP Trp127朝向NKG2D二聚体的中心并与两个NKG2D单体上的残基形成疏水接触，有效地封闭结合界面中
的任何空隙。
的，特别是在NKG2D结合沟的中心（图27）。由于OMCP的独特定向，H2a和H2b沿着整个NKG2D结合沟形成连续接触（图27）。OMCP Lys126、Trp127、Glu131和Asp132的侧链与NKG2D结合沟中心的残基接触，并桥接每个NKG2D单体上的核心结合位点（图24B）。特别地，OMCP Trp127朝向NKG2D二聚体的中心并与两个NKG2D单体上的残基形成疏水接触，有效地封闭结合界面中
的任何空隙。
[0303] 实施例10. 配体结合后NKG2D的信号传导。
[0304] CPXV和MPXV感染的细胞分泌OMCP，其可以作为NKG2D拮抗剂[37]。这种免疫逃避策略让人联想到癌症诱导的NKG2DL脱落。一些癌细胞使用基质金属蛋白酶（MMP）从细胞表面蛋白水解切割NKG2DL，同时防止携带NKG2D的淋巴细胞靶向癌细胞，以及产生可溶性NKG2DL以反式抑制NKG2D。细胞相关的NKG2DL触发NKG2D效应子功能（图28A），而癌症诱导的可溶性NKG2DL阻断NKG2D功能（图28B）。与脱落的NKG2DL一样，OMCP是可溶的并且反式阻断NKG2D功能[37]（图28C）。与宿主NKG2DL不同，OMCP以新的定向结合NKG2D。因此，我们询问OMCP是否可以在细胞膜的背景下充当NKG2D激动剂，类似于宿主NKG2D配体。由于OMCP是分泌蛋白，因此通过使用来自Thy1.1的异源跨膜结构域构建人工细胞缔合的OMCP[37]（图28D）。为了测量NKG2D介导的细胞杀伤，我们用表达OMCP-Thy1.1构建体或宿主NKG2DL的逆转录病毒载体
稳定转导Ba/F3细胞。表达OMCP-Thy1.1的靶细胞等同于宿主NKG2DL转导的靶细胞被杀死，
表明尽管其结合定向改变，但细胞缔合的OMCP仍能够活化NKG2D信号传导（图28E）。因此，必须分泌OMCP，以免其活跃的NKG2D效应子本身起作用，尽管由于扩散可能导致功效丧失。
稳定转导Ba/F3细胞。表达OMCP-Thy1.1的靶细胞等同于宿主NKG2DL转导的靶细胞被杀死，
表明尽管其结合定向改变，但细胞缔合的OMCP仍能够活化NKG2D信号传导（图28E）。因此，必须分泌OMCP，以免其活跃的NKG2D效应子本身起作用，尽管由于扩散可能导致功效丧失。
[0305] 实施例7-10的讨论。
[0306] 虽然许多病毒通过试图在受感染细胞内保留多个宿主编码的NKG2D配体而采用了NKG2D破坏的一般机制，但CPXV和MPXV采用了直接靶向NKG2D的非常不同的方法。由于NKG2D是单态的，因此该机制具有显著优势，即需要单一蛋白来防止感染细胞的NKG2D识别。大量的序列分歧宿主NKG2DL及其相关的多态性被认为是由病原体编码的NKG2DL拮抗剂的选择
驱动的[14]。同样地，病毒NKG2L拮抗剂在不同的宿主NKG2DL的选择压力下处于适应的连续循环中。由于需要识别多个NKG2DL，NKG2D具有有限的突变空间以适应。NKG2D突变的有限能力是OMCP直接靶向NKG2D而非NKG2DL的另一个优势。
驱动的[14]。同样地，病毒NKG2L拮抗剂在不同的宿主NKG2DL的选择压力下处于适应的连续循环中。由于需要识别多个NKG2DL，NKG2D具有有限的突变空间以适应。NKG2D突变的有限能力是OMCP直接靶向NKG2D而非NKG2DL的另一个优势。
[0307] 与OMCP类似，一些癌细胞脱落宿主NKG2DL以产生它们自己的可溶性NKG2D拮抗剂。然而，该策略具有从癌细胞表面去除宿主NKG2DL的额外益处。相反，CPXV和MPXV缺乏阻断宿主NKG2DL表面表达的已知机制。然后，分泌的OMCP必须能够有效地竞争感染细胞上的多种
宿主NKG2DL的高局部浓度，以及从感染细胞扩散开。增加OMCP与宿主配体竞争能力的一种
可能方法是通过具有多个NKG2D结合结构域来增加OMCP的亲合力。然而，多聚体OMCP可以交联NKG2D并可能触发NKG2D介导的杀伤。因此，分泌的OMCP必须是单体的，以防止异常的
NKG2D信号传导。因此，为了弥补这些缺陷，OMCP必须具有能够有效地与细胞缔合的宿主
NKG2DL竞争的最高亲和力[37,38]。配体-受体相互作用的半衰期与生理竞争力密切相关
[55]。OMCP结合人和鼠NKG2D的半衰期分别为348和54秒，相比之下，对大部分NKG2DL的半衰期为1.5-18秒[38,44,56]。实际上，NKG2D的半衰期延长使得OMCP能够在鼠感染模型中有效地拮抗NKG2D介导的免疫（M.Sun等人，个人通信）。
宿主NKG2DL的高局部浓度，以及从感染细胞扩散开。增加OMCP与宿主配体竞争能力的一种
可能方法是通过具有多个NKG2D结合结构域来增加OMCP的亲合力。然而，多聚体OMCP可以交联NKG2D并可能触发NKG2D介导的杀伤。因此，分泌的OMCP必须是单体的，以防止异常的
NKG2D信号传导。因此，为了弥补这些缺陷，OMCP必须具有能够有效地与细胞缔合的宿主
NKG2DL竞争的最高亲和力[37,38]。配体-受体相互作用的半衰期与生理竞争力密切相关
[55]。OMCP结合人和鼠NKG2D的半衰期分别为348和54秒，相比之下，对大部分NKG2DL的半衰期为1.5-18秒[38,44,56]。实际上，NKG2D的半衰期延长使得OMCP能够在鼠感染模型中有效地拮抗NKG2D介导的免疫（M.Sun等人，个人通信）。
[0308] 为了理解OMCP对NKG2D的长半衰期的分子基础，我们之前已经确定了单独OMCP的结构，在这里，我们报告了与NKG2D结合的OMCP的结构。单独的OMCP结构与宿主NKG2D配体的结构非常相似，其含有非典型的MHC I样平台结构域。宿主NKG2D配体与其平台结构域的螺
旋结合，所述平台结构域在NKG2D的对称结合沟内对角定向。因此，预计OMCP是宿主NKG2D配体的病毒模拟物，并且类似地与NKG2D相互作用。
旋结合，所述平台结构域在NKG2D的对称结合沟内对角定向。因此，预计OMCP是宿主NKG2D配体的病毒模拟物，并且类似地与NKG2D相互作用。
[0309] OMCP-NKG2D的结构反而揭示了NKG2D结合沟中NKG2D配体的新方向。α2结构域螺旋内的改变允许OMCP将其螺旋垂直地布置在结合沟内。这种重新定向使H2a和H2b螺旋直接与
NKG2D的核心结合位点接触，并且还与NKG2D形成最大且最连续的结合界面。因为介导蛋白-蛋白相互作用的力（氢键、范德华力、疏水性相互作用）各自弱，因此具有高形状互补的大的连续界面允许蛋白之间累积的强相互作用。OMCP结合方向的这种变化揭示了宿主配体使用
的MHC I样平台如何通过病原体适应以增强NKG2D结合。
NKG2D的核心结合位点接触，并且还与NKG2D形成最大且最连续的结合界面。因为介导蛋白-蛋白相互作用的力（氢键、范德华力、疏水性相互作用）各自弱，因此具有高形状互补的大的连续界面允许蛋白之间累积的强相互作用。OMCP结合方向的这种变化揭示了宿主配体使用
的MHC I样平台如何通过病原体适应以增强NKG2D结合。
[0310] 由于宿主NKG2DL和OMCP具有类似的MHC I样平台，因此有理由怀疑为什么没有宿主配体进化出与NKG2D类似的高亲和力相互作用。一个可能的原因是必须仔细校准宿主的
免疫反应，以平衡保护免受自身免疫威胁的需要。由于NKG2DL在细胞表面上的表达对效应
子功能进行信号传导，即使细胞表面上的少量高亲和力宿主配体也可能引发免疫应答，并
且所产生的组织损伤可能对宿主有害。实际上，表达NKG2D的细胞和/或宿主NKG2DL的异常
表达已经与糖尿病、乳糜泻和类风湿性关节炎有关[57-60]。病毒不受自身免疫选择压力的限制。因此，CPXV和MPXV可以以尽可能高的亲和力自由进化病毒NKG2DL以最大化免疫逃避
潜力。
免疫反应，以平衡保护免受自身免疫威胁的需要。由于NKG2DL在细胞表面上的表达对效应
子功能进行信号传导，即使细胞表面上的少量高亲和力宿主配体也可能引发免疫应答，并
且所产生的组织损伤可能对宿主有害。实际上，表达NKG2D的细胞和/或宿主NKG2DL的异常
表达已经与糖尿病、乳糜泻和类风湿性关节炎有关[57-60]。病毒不受自身免疫选择压力的限制。因此，CPXV和MPXV可以以尽可能高的亲和力自由进化病毒NKG2DL以最大化免疫逃避
潜力。
[0311] 有趣的是，OMCP在连接到靶细胞膜时触发NKG2D信号传导，尽管OMCP相对于宿主NKG2DL具有新的定向。宿主NKG2DL与二聚体NKG2D的相互作用与MHC分子与其同源T细胞受
体（TCR）之间的相互作用具有广泛的结构相似性。在两种情况下，NKG2DL/MHC对角地位于由二聚体NKG2D/TCR产生的表面上。然而，有几个MHC-TCR复合物的实例，其如同OMCP-NKG2D，以非常规方向相互作用[61-65]。这些复合物中的几个涉及自身免疫MHC-TCR复合物，其在
MHC-TCR复合物的正常范围之外倾斜或旋转[61,65]。虽然这些受体可以在高MHC浓度下诱
导TCR信号传导，但它们未能组装特征性免疫突触[66]。当体外肽文库-MHC-TCR (H2-Ld-
42F3)筛选产生p3A1-H2-Ld-42F3复合物时，发现非常规结合的显著实例，其界面相对其他
H2-Ld-42F3复合物旋转 40°。这种旋转使TCR几乎与MHC肽结合沟平行，并使界面中心几乎
~
完全移位于MHCα螺旋之一上-一个与OMCP-NKG2D界面惊人相似的方向[65]。有趣的是，
p3A1-H2-Ld-42F3复合物不能诱导TCR信号传导[65]。因此，与OMCP/NKG2D不同，MHC相对于TCR的方向是信号传导的重要因素。
体（TCR）之间的相互作用具有广泛的结构相似性。在两种情况下，NKG2DL/MHC对角地位于由二聚体NKG2D/TCR产生的表面上。然而，有几个MHC-TCR复合物的实例，其如同OMCP-NKG2D，以非常规方向相互作用[61-65]。这些复合物中的几个涉及自身免疫MHC-TCR复合物，其在
MHC-TCR复合物的正常范围之外倾斜或旋转[61,65]。虽然这些受体可以在高MHC浓度下诱
导TCR信号传导，但它们未能组装特征性免疫突触[66]。当体外肽文库-MHC-TCR (H2-Ld-
42F3)筛选产生p3A1-H2-Ld-42F3复合物时，发现非常规结合的显著实例，其界面相对其他
H2-Ld-42F3复合物旋转 40°。这种旋转使TCR几乎与MHC肽结合沟平行，并使界面中心几乎
~
完全移位于MHCα螺旋之一上-一个与OMCP-NKG2D界面惊人相似的方向[65]。有趣的是，
p3A1-H2-Ld-42F3复合物不能诱导TCR信号传导[65]。因此，与OMCP/NKG2D不同，MHC相对于TCR的方向是信号传导的重要因素。
[0312] OMCP-NKG2D和p3A1-H2-Ld-42F3具有相反的信号传导结果，尽管具有非常相似的d
定向。TCR信号传导需要共受体分别与MHCII或MHCI的α2/β2或α3结构域结合。p3A1-H2-L -
42F3无法进行信号传导及其他非常规MHC-TCR复合物无法形成真正的免疫突触，这可能是
由于共同受体不能形成正确的信号传导四级结构[64，65,67]。不知晓通过NKG2D的信号传
导需要共受体刺激，并且大多数NKG2DL缺乏真正MHC分子的共受体结合α2/β2或α3结构域。
共同受体依赖性的这种差异可能解释了为何OMCP（当通过跨膜附着时）与具有非常规结合
定向的MHC-TCR复合物相比仍然能够刺激NKG2D-信号传导。此外，它表明NKG2D在细胞表面
的聚集是NKG2D介导的活化的主要决定因素。
定向。TCR信号传导需要共受体分别与MHCII或MHCI的α2/β2或α3结构域结合。p3A1-H2-L -
42F3无法进行信号传导及其他非常规MHC-TCR复合物无法形成真正的免疫突触，这可能是
由于共同受体不能形成正确的信号传导四级结构[64，65,67]。不知晓通过NKG2D的信号传
导需要共受体刺激，并且大多数NKG2DL缺乏真正MHC分子的共受体结合α2/β2或α3结构域。
共同受体依赖性的这种差异可能解释了为何OMCP（当通过跨膜附着时）与具有非常规结合
定向的MHC-TCR复合物相比仍然能够刺激NKG2D-信号传导。此外，它表明NKG2D在细胞表面
的聚集是NKG2D介导的活化的主要决定因素。
[0313] 实施例7-10的方法。
[0314] 鉴定结合NKG2D的无效突变体D132R。基于组合细胞表面展示的高通量体外选择方法用于鉴定结合NKG2D的无效突变体。使用易错PCR将OMCP序列是全局诱变，并通过重叠延
伸PCR将突变的扩增子剪接成无信号Thy1.1 cDNA。将与未突变的Thy1.1融合的突变OMCP的
该文库克隆到pMXs-IRES-EGFP逆转录病毒转移载体（Toshio Kitamura, University of
Tokyo友情馈赠）中以产生用于转导入Ba/F3细胞的分子文库。然后将转导物针对绿色荧光
和抗Thy1.1表达进行分选以产生细胞文库，其成员均具有OMCP的表面表达，过滤出产生移
码、提前终止密码子和无法折叠的OMCP的突变。使用NKG2D-四聚体对该OMCP文库针对NKG2D结合进行分选。通过有限稀释克隆分选的细胞并分析。扩增缺失或具有降低的NKG2D结合活性的细胞的逆转录病毒盒并测序。利用这种方法，我们将Asp132鉴定为NKG2D结合的关键残基。
伸PCR将突变的扩增子剪接成无信号Thy1.1 cDNA。将与未突变的Thy1.1融合的突变OMCP的
该文库克隆到pMXs-IRES-EGFP逆转录病毒转移载体（Toshio Kitamura, University of
Tokyo友情馈赠）中以产生用于转导入Ba/F3细胞的分子文库。然后将转导物针对绿色荧光
和抗Thy1.1表达进行分选以产生细胞文库，其成员均具有OMCP的表面表达，过滤出产生移
码、提前终止密码子和无法折叠的OMCP的突变。使用NKG2D-四聚体对该OMCP文库针对NKG2D结合进行分选。通过有限稀释克隆分选的细胞并分析。扩增缺失或具有降低的NKG2D结合活性的细胞的逆转录病毒盒并测序。利用这种方法，我们将Asp132鉴定为NKG2D结合的关键残基。
[0315] 蛋白表达和纯化。之前描述了OMCPBR和人NKG2D表达构建体[38]。(D132R) OMCPBR蛋白与WT OMCPBR相同地制备。（23D/95D）OMCP-NKG2D复合物通过氧化共重折叠从纯化的包涵体重构，如前所述[38]。将重折叠的蛋白用水缓慢稀释10倍，并使用Profinia仪器（Bio-Rad）在5 ml HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）上捕获。用50mM Tris，pH8.5、20mM NaCl洗涤捕获的蛋白，并用50mM Tris，pH8.5、250mM NaCl进行整体洗脱。然后浓缩洗脱的蛋白，并在Superdex S75柱（16/60；Amersham Biosciences）上通过凝胶过滤色谱进一步纯化。合并含有单分散的OMCP-NKG2D复合物（ 50KDa）的级分，并进行缓冲液交换到25mM乙酸铵pH7.4中。
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[0316] 结晶，数据收集和处理。通过在20℃下悬滴蒸汽扩散，通过划线接种到含有15％ PEG 3350、0.2M MgCl2、0.1M Bis-Tris pH 6.75的孔溶液中来生长天然蛋白晶体。直接在液氮浴中快速冷冻之前，用含有15％甘油的孔溶液对晶体进行冷冻保护。在Advanced
Light Source同步加速器（光束线4.2.2）收集衍射数据。在100 K和波长为1.00004 Å下收集天然（23D/95D）OMCP-hNKG2D晶体衍射数据。附加的衍射数据统计总结在表1中。使用
HKL2000[68]进行数据处理表明，晶体属于原始单斜空间群P21（空间群＃4）。晶体的不对称单元含有两个拷贝的（23D/95D）OMCP-hNKG2D复合物。
Light Source同步加速器（光束线4.2.2）收集衍射数据。在100 K和波长为1.00004 Å下收集天然（23D/95D）OMCP-hNKG2D晶体衍射数据。附加的衍射数据统计总结在表1中。使用
HKL2000[68]进行数据处理表明，晶体属于原始单斜空间群P21（空间群＃4）。晶体的不对称单元含有两个拷贝的（23D/95D）OMCP-hNKG2D复合物。
[0317] 模型构建和细化。人NKG2D（1MPU）[48]和OMCP（4FFE）[38]的结构被用作经Phenix分子置换的搜索模型[69]。使用Phenix和Coot[70]分别进行了重复细化和手动重建。2Fo-Fc和Fo-Fc图均用于手工构建和放置溶剂分子。最终模型产生的R工作为16.6％，R游离为
21.4％，所有反射的4％设置用于自由R因子交叉验证。还使用MOLPROBITY网络服务器[71]
测量了细化的进展。该模型的最终Ramachandran统计数据有98％偏好和0％的异常值。表1
总结了其他细化统计数据。使用程序PyMol[72]生成结构图像。
21.4％，所有反射的4％设置用于自由R因子交叉验证。还使用MOLPROBITY网络服务器[71]
测量了细化的进展。该模型的最终Ramachandran统计数据有98％偏好和0％的异常值。表1
总结了其他细化统计数据。使用程序PyMol[72]生成结构图像。
[0318] 结构分析。使用程序Ligplot+[73]、PISA[74]和SC[75]分析OMCP-NKG2D界面的接触残基、掩埋表面积和形状互补性。结构计划由SBGrid联盟编制[76]。使用ConSurf服务器[77-80]进行NKG2D保守性分析。用于Consurf分析的物种的GenBank编号是：人（30749494）、北方红毛猩猩(Borean orangutan)（21902299）、黑猩猩（57113989）、长臂猿（332232684）、猕猴（355785888）、绿猴（635063485）、普通狨猴（380848799）、小鼠（148667521）、褐鼠（149049263）、豚鼠（348569092）、地松鼠（532114387）、鹿鼠（589967905）、裸鼹鼠（512868733）、草原田鼠（532053033）、欧洲鼩鼱（505834608）、星鼻鼹(507978716)、中国仓鼠（537136230）和猫（410963826）。
[0319] 原子坐标。原子坐标（登录号4PDC）已经保存在Protein Data Bank, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (Rutgers University, New
Brunswick, NJ)。
Brunswick, NJ)。
[0320] 体外NK细胞杀伤测定。将来自C57BL/6小鼠的脾细胞用200 U/ml IL2预活化24小时，并在标准杀伤测定中用作针对稳定转导的Ba/F3细胞系的细胞毒效应物。将靶细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记并与活化的脾细胞在37℃、5％CO2下以10：1、20：1和40：
1的效应物：靶标比例共孵育4小时。如通过流式细胞术评估的，通过在CFSE+靶群体中掺入死细胞排阻染料7-氨基-放线菌素D（7AAD）来确定杀伤百分比。使用公式[（实验死亡％-背景死亡％）/（最大释放死亡％-背景死亡％）]×100计算特异性裂解百分比。C57BL/6小鼠获自National Cancer Institute (Charles River, MA)。将小鼠维持在无特定病原体的条
件下，并在8至12周龄之间使用。使用标准方案产生用于杀伤测定的脾细胞的单细胞悬浮液[81]。
1的效应物：靶标比例共孵育4小时。如通过流式细胞术评估的，通过在CFSE+靶群体中掺入死细胞排阻染料7-氨基-放线菌素D（7AAD）来确定杀伤百分比。使用公式[（实验死亡％-背景死亡％）/（最大释放死亡％-背景死亡％）]×100计算特异性裂解百分比。C57BL/6小鼠获自National Cancer Institute (Charles River, MA)。将小鼠维持在无特定病原体的条
件下，并在8至12周龄之间使用。使用标准方案产生用于杀伤测定的脾细胞的单细胞悬浮液[81]。
[0321] 实施例7-10的参考文献。
[0322] 实施例11. 具有功能不良的天然杀伤细胞的个体更容易患恶性肿瘤。
[0323] 图14A显示AJ和129是小鼠的肺癌易感品系，B6和C3H是基于AJ和129小鼠中发现的较大肿瘤负荷的小鼠的肺癌抗性品系。图14B显示当来自各种小鼠品系的NK细胞以不同比
例与LM2肺癌细胞一起孵育时，从B6和C3H小鼠（肺癌抗性品系）新鲜分离的NK细胞导致LM2肺癌细胞的裂解显著多于从AJ和129小鼠（肺癌易感品系）中新鲜分离的NK细胞。总之，这些数据表明，对肺癌具有抗性的小鼠品系具有更有效地裂解肺癌细胞的NK细胞。此外，易感品系具有功能差的NK细胞。
例与LM2肺癌细胞一起孵育时，从B6和C3H小鼠（肺癌抗性品系）新鲜分离的NK细胞导致LM2肺癌细胞的裂解显著多于从AJ和129小鼠（肺癌易感品系）中新鲜分离的NK细胞。总之，这些数据表明，对肺癌具有抗性的小鼠品系具有更有效地裂解肺癌细胞的NK细胞。此外，易感品系具有功能差的NK细胞。
[0324] 该数据还与人数据相关。图15显示更大百分比的NK细胞似乎相比于“易感”患者在“抗性”患者中产生TNFα。此外，已经显示肿瘤下调NK细胞的溶解能力，即使它们之前是高度功能性的。53因此，即使具有高度功能性NK细胞的个体也可受益于增强NK细胞功能的治疗。
[0325] 值得注意的是，离体细胞因子活化可以逆转天然杀伤细胞的功能障碍。图16显示来自抗性（B6和C3H）和易感（AJ和129）小鼠品系的IL2活化的NK细胞可裂解LM2肺癌细胞。因此，当用IL2处理时，未显示癌细胞显著裂解的小鼠NK细胞（来自129和AJ品系的NK细胞）在裂解方面有效的多。来自抗癌品系的NK细胞也显示出特异性裂解的百分比增加。
[0326] 实施例12. OMCP-mutIL2介导体内免疫疗法。
[0327] 恶性肿瘤的免疫调节涉及多种细胞组分的复杂相互作用。已经在多个模型中显示CD4+Foxp3+ Tregs促进肿瘤特异性耐受并促进肿瘤生长4,16,17。NK细胞和CD8+ CTL有助于多种肿瘤的免疫调节，例如黑色素瘤12,18。其他肿瘤，如肺癌，几乎完全由NK细胞控制，而适应性免疫系统的贡献很小19,20（以及未发表的数据AS. Krupnick）。为了测试OMCP-mutIL2介导的免疫疗法，我们将依赖于表达模型肿瘤抗原卵清蛋白（MO5肿瘤细胞系）的B16黑色素瘤21。多项研究已证明NK细胞和CD8+ CTL在控制黑色素瘤生长中的作用22-24。因此，黑色素瘤模型在研究OMCP-mutIL2方面提供了实验优势，其可以活化两种类型的细胞（图1E-F）。对该肿瘤特异性的试剂，例如对于黑色素瘤肿瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2肽SVYDFFVWL（SEQ ID
NO:3）特异性的MHC I类限制性CD8+ T细胞受体的四聚体，可以容易地商购(Proimmune,
Sarasota, Fl.)。表达卵清蛋白的细胞系的使用还提供了研究对高免疫原性肽SIINFEKL
（SEQ ID NO:4）以及天然存在的肿瘤相关抗原例如酪氨酸酶相关蛋白2（其一般扩增具有低亲合力的T细胞）的免疫应答的优点25,26。
NO:3）特异性的MHC I类限制性CD8+ T细胞受体的四聚体，可以容易地商购(Proimmune,
Sarasota, Fl.)。表达卵清蛋白的细胞系的使用还提供了研究对高免疫原性肽SIINFEKL
（SEQ ID NO:4）以及天然存在的肿瘤相关抗原例如酪氨酸酶相关蛋白2（其一般扩增具有低亲合力的T细胞）的免疫应答的优点25,26。
[0328] 为了进行研究，将B6小鼠皮下注射1x106 MO5黑色素瘤细胞。肿瘤注射后一周，将小鼠分成4组（每组10只小鼠）并用每天两次注射以下来处理：野生型IL2（组＃1）；mutIL2（组＃2）；OMCP-mutIL2（组＃3）或；盐水（组＃4）（图12）。肿瘤生长之后每天测量直径4周，或直到其中一组产生直径>2cm的肿瘤。此时，将所有组中的小鼠处死用于分析。除肿瘤生长
+
外，还将通过流式细胞术评估肿瘤和引流腹股沟淋巴结的淋巴细胞浸润。我们将定量CD4
Foxp3+ Tregs的总数和活化状态（通过ICOS和GITR上调评估）。我们还将评估如通过IFN-γ产生和CD69上调测量的NK细胞数和活化。通过定量主要负责肿瘤清除的CD8+ T细胞和CD8+
CD44hiCD62L低效应细胞（EC）来评估抗原特异性CTL产生22,27,28。通过鉴定具有对卵清蛋白肽SIINFEKL（SEQ ID NO:4）或黑色素瘤特异性酪氨酸酶相关蛋白2肽SVYDFFVWL（SEQ ID NO:
3）（均为四聚体，来自Proimmune, Sarasota, Fl.）特异性的T细胞受体的CD8+ CTL来确定抗原特异性。通过TUNEL染色定量肿瘤细胞凋亡。
+
外，还将通过流式细胞术评估肿瘤和引流腹股沟淋巴结的淋巴细胞浸润。我们将定量CD4
Foxp3+ Tregs的总数和活化状态（通过ICOS和GITR上调评估）。我们还将评估如通过IFN-γ产生和CD69上调测量的NK细胞数和活化。通过定量主要负责肿瘤清除的CD8+ T细胞和CD8+
CD44hiCD62L低效应细胞（EC）来评估抗原特异性CTL产生22,27,28。通过鉴定具有对卵清蛋白肽SIINFEKL（SEQ ID NO:4）或黑色素瘤特异性酪氨酸酶相关蛋白2肽SVYDFFVWL（SEQ ID NO:
3）（均为四聚体，来自Proimmune, Sarasota, Fl.）特异性的T细胞受体的CD8+ CTL来确定抗原特异性。通过TUNEL染色定量肿瘤细胞凋亡。
[0329] 基于我们的体外肿瘤数据和体内表型分析，我们怀疑OMCP-mutIL2组将显示肿瘤+ + +
生长的减弱，且具有大量NK细胞，抗原特异性CTL，特别是CD8 EC，和较少的CD4 Foxp3
Tregs。如果证明事实是这样，我们将通过耗尽实验确定CD8+或NK CTL的相对作用。即使CTL增加，也可能不会改变MO5的增长。如果证明事实是这样，我们将更详细地观察CD4+Foxp3+Tregs或OMCP-mutIL2处理的小鼠中髓样衍生的抑制细胞的存在和活化。基于黑色素瘤数据，将使用类似方法测试另外的肿瘤。
生长的减弱，且具有大量NK细胞，抗原特异性CTL，特别是CD8 EC，和较少的CD4 Foxp3
Tregs。如果证明事实是这样，我们将通过耗尽实验确定CD8+或NK CTL的相对作用。即使CTL增加，也可能不会改变MO5的增长。如果证明事实是这样，我们将更详细地观察CD4+Foxp3+Tregs或OMCP-mutIL2处理的小鼠中髓样衍生的抑制细胞的存在和活化。基于黑色素瘤数据，将使用类似方法测试另外的肿瘤。
[0330] 实施例13. 用OMCP-mutIL2融合构建体处理后CD8+记忆T细胞产生。
[0331] 一旦通过其T细胞受体活化，幼稚CD8+ T细胞主要分化成具有溶细胞潜能的短寿命CD44hiCD62L低效应细胞（EC）。然而，一部分活化细胞分化为长寿命CD44hiCD62Lhi中枢记忆T细胞(CD8+ CMs)29-31。CD8+ CM充当用于细胞保护的抗原特异性储库，并且在再刺激时分化成具有溶细胞功能的CD8+ EC。CD8+ CM的耐久性使其成为离体生成和过继转移用于长期保
护的理想靶标31。在体内产生这种细胞群的可能性提供了超过离体系统的多个优点，包括建立对多种肿瘤相关抗原具有反应性的多克隆群并避免与供体单采和离体扩增相关的成本。
肿瘤抗原特异性CD8+ CM的体内扩增也可以消除对频繁的单采和细胞再次施用的需要。
护的理想靶标31。在体内产生这种细胞群的可能性提供了超过离体系统的多个优点，包括建立对多种肿瘤相关抗原具有反应性的多克隆群并避免与供体单采和离体扩增相关的成本。
肿瘤抗原特异性CD8+ CM的体内扩增也可以消除对频繁的单采和细胞再次施用的需要。
[0332] 高剂量IL2疗法导致CD4+Foxp3+Tregs和CD8+ T细胞的活化，但其对肿瘤相关抗原特异性CD8+ CM产生的影响是未知的。一些人已经证实，使用抗体耗尽，CD4+Foxp3+Tregs干扰肿瘤特异性CD8+ CM产生17,32，而其他人使用不同模型证明CD4+Foxp3+Treg耗尽损害CD8+记忆形成33,34。OMCP-mutIL2产生独特的免疫环境，其中维持CD4+Foxp3+Tregs但未积极扩增（图3）。虽+ 35然NKG2D不在静息的CD8 T细胞上表达，但它在活化后在该群体上被诱导 。因此，与mutIL2不同，OMCP-mutIL2导致CD8+ T细胞增殖的水平与NKG2D充足小鼠中的野生型IL2相当（图
1E-F）。然而，OMCP-mutII2对CD8+ T细胞记忆形成的影响是未知的，但对于基于该细胞群可赋予的长期肿瘤特异性免疫的破译是至关重要的。
1E-F）。然而，OMCP-mutII2对CD8+ T细胞记忆形成的影响是未知的，但对于基于该细胞群可赋予的长期肿瘤特异性免疫的破译是至关重要的。
[0333] 为了测试体内细胞因子刺激后的长期记忆形成，我们将利用辐射肿瘤细胞接种和细胞因子治疗的模型。为了实现这一点，我们将皮下注射1x107个致死辐射的（10Gy）MO5黑色素瘤细胞到C57BI/6小鼠中。然后在5天的过程中每天两次剂量用常规IL2（组＃1）、
mutIL2（组＃2）、OMCP-mutIL2（组＃3）或盐水（组＃4）处理受体小鼠（图13）。在感染后一至三个月的不同时间点处死小鼠（图13）。通过脾、外周淋巴结、肺和肝脏驻留的CD8+
CD44hiCD62Lhi CMs的表型分析来评估抗原特异性CD8+ CM形成。通过对卵清蛋白肽、
SIINFEKL (SEQ ID NO:4)或黑色素瘤特异性酪氨酸酶相关蛋白2肽SVYDFFVWL (SEQ ID
NO:3)（均来自Proimmune, Sarasota, Fl.）MHC I类染色确定抗原特异性。
mutIL2（组＃2）、OMCP-mutIL2（组＃3）或盐水（组＃4）处理受体小鼠（图13）。在感染后一至三个月的不同时间点处死小鼠（图13）。通过脾、外周淋巴结、肺和肝脏驻留的CD8+
CD44hiCD62Lhi CMs的表型分析来评估抗原特异性CD8+ CM形成。通过对卵清蛋白肽、
SIINFEKL (SEQ ID NO:4)或黑色素瘤特异性酪氨酸酶相关蛋白2肽SVYDFFVWL (SEQ ID
NO:3)（均来自Proimmune, Sarasota, Fl.）MHC I类染色确定抗原特异性。
[0334] 为了在一组单独的实验中测试这种接种方案的功能保护，来自上述四组的小鼠将不会处死用于表型分析，并且将重新注射活MO5黑色素瘤（皮下1×106细胞/小鼠）。黑色素+
瘤的生长将通过连续测量肿瘤直径评估。CD8 T 细胞对任何免疫保护的贡献将通过一部
分小鼠（克隆YTS 169.4, BioXcell Inc., West Lebanon, NH）中的CD8特异性抗体消除来评估。
瘤的生长将通过连续测量肿瘤直径评估。CD8 T 细胞对任何免疫保护的贡献将通过一部
分小鼠（克隆YTS 169.4, BioXcell Inc., West Lebanon, NH）中的CD8特异性抗体消除来评估。
[0335] 实施例14. OMCP-mutIL2融合构建体活化CTL的机制。
[0336] OMCP-mutIL2嵌合体对效应细胞功能的增强活化的机制理解对于优化该治疗剂是至关重要的。融合蛋白与IL2R和NKG2D的相互作用可能取决于若干因素，包括接头肽的长度（图1E-F）。因此，理解OMCP-mutIL2嵌合体介导的CTL活化的机制以允许优化构建体和设计未来免疫治疗方案是至关重要的。双结构域嵌合蛋白可能潜在地通过三种非互斥机制增加
表达NKG2D的细胞的活化。首要的是，OMCP-mutIL2构建体可以增加mutIL2与靶细胞结合的
亲合力。与mutIL2相比，这可能导致占据受体的数量增加和信号传导强度增加。另外，与
NKG2D和IL2R的双重结合可以降低受体内化的速率并增加IL2信号传导的持续时间。OMCP-
mutIL2构建体还可能通过活化IL2和NKG2D刺激途径改变由靶细胞的信号传导概况。这三种
非相互排斥的效应可以解释我们以NKG2D介导的方式活化我们的CTL构建体的增加。
表达NKG2D的细胞的活化。首要的是，OMCP-mutIL2构建体可以增加mutIL2与靶细胞结合的
亲合力。与mutIL2相比，这可能导致占据受体的数量增加和信号传导强度增加。另外，与
NKG2D和IL2R的双重结合可以降低受体内化的速率并增加IL2信号传导的持续时间。OMCP-
mutIL2构建体还可能通过活化IL2和NKG2D刺激途径改变由靶细胞的信号传导概况。这三种
非相互排斥的效应可以解释我们以NKG2D介导的方式活化我们的CTL构建体的增加。
[0337] 有几种方法可以直接（放射性标记，荧光）或间接（抗原排除）确定蛋白对细胞的亲合力38,39。我们计划使用KinExA40确定野生型IL2、mutIL2或OMCP-mutIL2对CD4+Foxp3+Tregs、NK细胞和CD8+ T淋巴细胞的亲合力。为此，我们将使用磁珠分离试剂盒 (Miltenyi Biotech, San Diego, Ca.)在C57BI/6背景上从野生型C57BI/6或NKG2D-/-小鼠的脾细胞中
分离细胞。将靶细胞在含有0.05% NaN3的培养基中的11个falcon管中以2倍连续稀释。第12管将只包含培养基。然后将OMCP-mutIL2或单独mutIL2添加到野生型或NKG2D-/-细胞的每个管中，并将细胞与细胞因子在4℃下旋转36小时。在36小时结束时，将细胞以2400rpm离心4分钟，并通过抗-IL2 ELISA测量上清液中存在的游离构建体。然后计算平衡解离常数（Kd）41。
这种方法的优点是可以测量细胞表面分子在生理密度下的亲合力，并且不需要标记，这可
以人为地降低抗体对其抗原的亲和力42,43。
分离细胞。将靶细胞在含有0.05% NaN3的培养基中的11个falcon管中以2倍连续稀释。第12管将只包含培养基。然后将OMCP-mutIL2或单独mutIL2添加到野生型或NKG2D-/-细胞的每个管中，并将细胞与细胞因子在4℃下旋转36小时。在36小时结束时，将细胞以2400rpm离心4分钟，并通过抗-IL2 ELISA测量上清液中存在的游离构建体。然后计算平衡解离常数（Kd）41。
这种方法的优点是可以测量细胞表面分子在生理密度下的亲合力，并且不需要标记，这可
以人为地降低抗体对其抗原的亲和力42,43。
[0338] 融合蛋白的双结构域结构可能显著增加在NKG2D+和IL2R+细胞表面上蛋白的半衰期。表面半衰期的任何增加都可能影响结合受体的内化和信号传导强度和持续时间。为了
解决受体的内化，我们将在一定范围的时间内将每种构建体与上述细胞类型一起孵育，并
使用如前所述的流式细胞术监测 IL2Rβγ和NKG2D的细胞表面表达的变化44。最感兴趣的将是每个构建体的信号传导概况。IL2-IL2R通过JAK-STAT途径进行信号传导，而NKG2D通过
DAP10/12途径进行信号传导。虽然是单体，可溶性OMCP不诱导NKG2D信号传导，但OMCP可在
45
局部集中在细胞表面上时进行信号传导 。因此，确定嵌合体是否能够通过IL2R和NKG2D诱
导双重信号传导至关重要。IL2介导的信号传导将通过对与构建体体外孵育的新鲜分离的
CD4+Foxp3+ Tregs、NK细胞或CD8+ T细胞中磷酸化的JAK1和JAK3的蛋白质印迹来评估46,47。
将通过DAP10或DAP12的免疫沉淀随后如前所述对磷酸酪氨酸进行蛋白质印迹来评估NKG2D
介导的信号传导48,49。
解决受体的内化，我们将在一定范围的时间内将每种构建体与上述细胞类型一起孵育，并
使用如前所述的流式细胞术监测 IL2Rβγ和NKG2D的细胞表面表达的变化44。最感兴趣的将是每个构建体的信号传导概况。IL2-IL2R通过JAK-STAT途径进行信号传导，而NKG2D通过
DAP10/12途径进行信号传导。虽然是单体，可溶性OMCP不诱导NKG2D信号传导，但OMCP可在
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局部集中在细胞表面上时进行信号传导 。因此，确定嵌合体是否能够通过IL2R和NKG2D诱
导双重信号传导至关重要。IL2介导的信号传导将通过对与构建体体外孵育的新鲜分离的
CD4+Foxp3+ Tregs、NK细胞或CD8+ T细胞中磷酸化的JAK1和JAK3的蛋白质印迹来评估46,47。
将通过DAP10或DAP12的免疫沉淀随后如前所述对磷酸酪氨酸进行蛋白质印迹来评估NKG2D
介导的信号传导48,49。
[0339] IL2和OMCP均以高亲和力与其同源受体相互作用；预计两种蛋白的融合将大大增强嵌合构建体对表达IL2R和NKG2D的细胞的亲合力。因此，构建体与两种细胞表面受体的拴系可导致减少的内化和增加的信号传导持续时间。结合这两种现象代表了体内增加NK细胞
增殖的最可能机制。通过NKG2D的信号传导依赖于受体聚类45。由于构建体是可溶的，尽管不太可能，但嵌合体还是可以聚簇NKG2D并诱导DAP10/12信号传导。然而，如果检测到DAP10/
12信号传导，我们将使用衍生自Vav1敲除小鼠的细胞研究这种信号传导在扩增NK细胞中的
重要性。Vav1是DAP10下游的信号介导物50。与DAP敲除相比，使用Vav1敲除具有使NKG2D表达保持完整的优点50。这将去除NKG2D信号传导组分，同时保持NKG2D依赖性靶向完整。更清楚地了解OMCP-IL2嵌合体依赖性扩增的作用机制将对进一步改进治疗剂是关键的。理解这些
参数将允许测试不同的构建体设计，主要在OMCP和IL2之间的接头长度上，以校准嵌合体的效果。
增殖的最可能机制。通过NKG2D的信号传导依赖于受体聚类45。由于构建体是可溶的，尽管不太可能，但嵌合体还是可以聚簇NKG2D并诱导DAP10/12信号传导。然而，如果检测到DAP10/
12信号传导，我们将使用衍生自Vav1敲除小鼠的细胞研究这种信号传导在扩增NK细胞中的
重要性。Vav1是DAP10下游的信号介导物50。与DAP敲除相比，使用Vav1敲除具有使NKG2D表达保持完整的优点50。这将去除NKG2D信号传导组分，同时保持NKG2D依赖性靶向完整。更清楚地了解OMCP-IL2嵌合体依赖性扩增的作用机制将对进一步改进治疗剂是关键的。理解这些
参数将允许测试不同的构建体设计，主要在OMCP和IL2之间的接头长度上，以校准嵌合体的效果。
[0340] 实施例15. 用IL2、R38A/F42K IL2或OMCP靶向的IL2构建体的体内免疫疗法。
[0341] 为了确定我们的构建体是否在恶性肿瘤的免疫调节以及病毒感染中起作用，我们将依赖于B16黑色素瘤和小鼠巨细胞病毒（MCMV）的体内模型。在一组实验中，B6小鼠皮下注射1x106个免疫原性差的B16黑色素瘤细胞系的细胞。肿瘤注射后一周，将小鼠分成13组（每组5只小鼠），用每天注射5次IL2、R38A/F42K IL2、OMCP融合构建体或盐水来处理，如图18和表4中所述。肿瘤生长之后每天测量直径持续4周或直到其中一组产生直径>2cm的肿瘤。此
时，将所有组中的小鼠处死进行分析。除肿瘤生长外，将通过流式细胞术评估肿瘤和引流腹股沟淋巴结的淋巴细胞浸润。我们将定量CD4+Foxp3+ Tregs的总数和活化状态（表示为肿瘤浸润淋巴细胞的％和％ ICOS+）。我们还将评估通过IFN-γ产生和CD69上调测量的NK细胞
数和活化。通过TUNEL染色评估肿瘤细胞凋亡。
时，将所有组中的小鼠处死进行分析。除肿瘤生长外，将通过流式细胞术评估肿瘤和引流腹股沟淋巴结的淋巴细胞浸润。我们将定量CD4+Foxp3+ Tregs的总数和活化状态（表示为肿瘤浸润淋巴细胞的％和％ ICOS+）。我们还将评估通过IFN-γ产生和CD69上调测量的NK细胞
数和活化。通过TUNEL染色评估肿瘤细胞凋亡。
[0342] 为了评估IL2在传染病模型中的治疗潜力，如前所述，B6小鼠将用亚致死剂量的MCMV (5x104)颗粒形成单位（PFU）感染29。感染后第1天，将小鼠分成13组（每组5只小鼠），每天注射5次IL2、R38A/F42K IL2、OMCP融合构建体或盐水来处理，如图18和表4所述。在感染后第6天，处死小鼠并通过标准噬斑测定确定脾和肺病毒载量。
[0343] 潜在的结果包括发现用纯IL2治疗对肿瘤生长或病毒载量几乎没有影响，因为我们期望看到Treg相对于CTL优先活化。我们怀疑，与野生型IL2相比，施用突变体R38A/F42K形式的IL2将导致较低的肿瘤和病毒负荷，这是由于CD4+Foxp3+ Tregs的活化较少。尽管如此，尽管Treg活化水平较低，但IL2和R38A/F42K IL2之间的肿瘤负荷可能是相同的，这是因为
IL2的突变形式也可以降低NK活化。潜在的结果包括发现与纯细胞因子相比，OMCP IL2构建体处理的小鼠具有较低的肿瘤负荷，并预测OMCP-R38A/F42K IL2将以最有利的副作用概况
显示出对免疫疗法的最佳功效。
IL2的突变形式也可以降低NK活化。潜在的结果包括发现与纯细胞因子相比，OMCP IL2构建体处理的小鼠具有较低的肿瘤负荷，并预测OMCP-R38A/F42K IL2将以最有利的副作用概况
显示出对免疫疗法的最佳功效。
[0344] 如果我们没有看到表达OMCP的IL2构建体的影响，我们将密切评估我们的混杂因素的数据，例如由于极端刺激导致的CTL过度死亡以及可能在全身器官如肝和肺中隔离
CTL。如果我们的假设得到支持并且在OMCP构建体处理后NK细胞被活化并且肿瘤生长减轻，我们将在NK耗尽（使用抗NK1.1克隆PK136，小鼠抗小鼠消耗抗体）和CD8耗尽（克隆YTS169，大鼠抗小鼠CD8+ T细胞消耗抗体）（均来自BioXcell, West Lebanon, NH）后重复这些实
验。基于这些结果，未来的工作将集中在原发性致癌模型中的免疫治疗。
CTL。如果我们的假设得到支持并且在OMCP构建体处理后NK细胞被活化并且肿瘤生长减轻，我们将在NK耗尽（使用抗NK1.1克隆PK136，小鼠抗小鼠消耗抗体）和CD8耗尽（克隆YTS169，大鼠抗小鼠CD8+ T细胞消耗抗体）（均来自BioXcell, West Lebanon, NH）后重复这些实
验。基于这些结果，未来的工作将集中在原发性致癌模型中的免疫治疗。
[0345] 实施例16. IL2、R38A/F42K IL2或OMCP靶向IL2构建体对辐射暴露后免疫抑制的影响。
[0346] 对于参与作战任务的人来说，亚致死辐射暴露是一种持续的风险。除了辐射诱导的DNA损伤的直接致癌作用外，亚致死辐射还会因淋巴细胞亚群选择性死亡而导致免疫损
+ lo
伤。CD8 T细胞和CD44 幼稚T细胞对辐射诱导的死亡特异性敏感，而NK细胞功能在照射后
显著下降。然而，CD4+25+ T细胞以及CD44hi记忆样T细胞在辐射后具有存活优势。CD4+25+ T细胞和CD8+CD44hi T细胞都可以下调免疫反应，解释为什么即使有限的辐射暴露也会导致
显著的免疫抑制。恢复免疫系统的药物干预可以减轻辐射中毒的发病率和死亡率。令人惊
讶的是，从未研究过IL2在减轻辐射诱导的变化中的作用。低亲和力IL2受体在骨髓驻留造
血干细胞和定型的NK祖细胞上表达。反过来，NK细胞可以在刺激时分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），这是一种可以帮助造血恢复的细胞因子。基于这一目标的这些数据，我们计划测试IL2或OMCP-IL2构建体在亚致死和致死照射后可以帮助造血恢复这一假设。
+ lo
伤。CD8 T细胞和CD44 幼稚T细胞对辐射诱导的死亡特异性敏感，而NK细胞功能在照射后
显著下降。然而，CD4+25+ T细胞以及CD44hi记忆样T细胞在辐射后具有存活优势。CD4+25+ T细胞和CD8+CD44hi T细胞都可以下调免疫反应，解释为什么即使有限的辐射暴露也会导致
显著的免疫抑制。恢复免疫系统的药物干预可以减轻辐射中毒的发病率和死亡率。令人惊
讶的是，从未研究过IL2在减轻辐射诱导的变化中的作用。低亲和力IL2受体在骨髓驻留造
血干细胞和定型的NK祖细胞上表达。反过来，NK细胞可以在刺激时分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），这是一种可以帮助造血恢复的细胞因子。基于这一目标的这些数据，我们计划测试IL2或OMCP-IL2构建体在亚致死和致死照射后可以帮助造血恢复这一假设。
[0347] 基于先前描述的辐射诱导的造血损伤和恢复模型，我们将用来自铯源的亚致死4.5或致死7.5Gy照射B6小鼠。在暴露的一小时内，将两种辐射剂量的小鼠随机分成如表4中所述的13个组，并用低、中等或高剂量的IL2、R38A/F42K IL2或表达OMPC的IL2构建体处理5天（图18）。一部分小鼠在照射后注射盐水（组13）（表4），并且未照射的未治疗的B6小鼠也将作为对照包括（组14）。在第6天，通过对通过浅表下颌静脉取样获得的外周血的流式细胞术分析来监测造血恢复。将分析样品中每毫升血液中NK细胞、T细胞、B细胞、粒细胞以及单核细胞和巨噬细胞的总数。由于90％的未治疗小鼠在暴露于7.5Gy后15-25天死亡，因此每天
将跟踪小鼠，并且将通过Kaplan-Meier分析比较每个治疗组中的存活曲线。7.5Gy组的濒死小鼠将仔细分析死因，通过流式细胞术和组织培养评估骨髓、脾脏和外周器官的感染以及
造血功能衰竭。由于预期亚致死4.5Gy组中的小鼠将长期存活，因此在暴露后一个月将它们处死，并且通过流式细胞术分析评估外周淋巴器官以及骨髓的造血恢复。
将跟踪小鼠，并且将通过Kaplan-Meier分析比较每个治疗组中的存活曲线。7.5Gy组的濒死小鼠将仔细分析死因，通过流式细胞术和组织培养评估骨髓、脾脏和外周器官的感染以及
造血功能衰竭。由于预期亚致死4.5Gy组中的小鼠将长期存活，因此在暴露后一个月将它们处死，并且通过流式细胞术分析评估外周淋巴器官以及骨髓的造血恢复。
[0348] 辐射相关的DNA损伤导致恶性转化。辐射暴露后，造血系统恶性肿瘤尤为突出。为了评估IL2或OMCP连接的IL2构建体在辐射暴露后促进清除造血系统恶性肿瘤的能力，我们
3
将用从铯源的4.5Gy的亚致死暴露处理B6小鼠。照射后两天，给小鼠i.p.注射10个RMA-S淋
巴瘤细胞并且三天后用低、中等或高剂量的IL2、R38A/F42K IL2或表达OMCP的IL2构建体治疗5天疗程（表4，图19）。未照射的B6小鼠也将作为对照（组14）包括在内。将跟踪小鼠的存活。
3
将用从铯源的4.5Gy的亚致死暴露处理B6小鼠。照射后两天，给小鼠i.p.注射10个RMA-S淋
巴瘤细胞并且三天后用低、中等或高剂量的IL2、R38A/F42K IL2或表达OMCP的IL2构建体治疗5天疗程（表4，图19）。未照射的B6小鼠也将作为对照（组14）包括在内。将跟踪小鼠的存活。
[0349] 我们预计单独的野生型IL2对免疫恢复的影响可以忽略不计，因为它很可能导致优先扩增CD4+Foxp3+ Tregs，其在照射后已经保存。然而，我们怀疑R38A/F42K IL2以及表达OMCP的IL2构建体将扩增外周血中的NK部分并且将有助于广泛的造血恢复，尽管间接地通
过分泌诸如GM-CSF的稳态细胞因子。如果我们检测到IL2和盐水治疗组之间的造血恢复没
有差异，我们将检查其他混杂因素，例如稳态增殖诱导的免疫系统改变以及IL2或表达OMCP的IL2构建体对这种增殖的影响。虽然每天给B6小鼠施用200,000 IU的IL2是不致命的，但
我们意识到面对照射时小鼠可能更虚弱。因此可能需要调整剂量。对于该实验的“功能”部分，我们计划特异性地利用充分建立的RMA-S淋巴瘤攻击模型，因为NK细胞在控制血液恶性肿瘤中的作用。这种已建立的测定将使我们能够获得快速的实验数据以推进这一目标。根
据这些数据，我们在未来也将利用初级致癌模型扩大这一目标。
过分泌诸如GM-CSF的稳态细胞因子。如果我们检测到IL2和盐水治疗组之间的造血恢复没
有差异，我们将检查其他混杂因素，例如稳态增殖诱导的免疫系统改变以及IL2或表达OMCP的IL2构建体对这种增殖的影响。虽然每天给B6小鼠施用200,000 IU的IL2是不致命的，但
我们意识到面对照射时小鼠可能更虚弱。因此可能需要调整剂量。对于该实验的“功能”部分，我们计划特异性地利用充分建立的RMA-S淋巴瘤攻击模型，因为NK细胞在控制血液恶性肿瘤中的作用。这种已建立的测定将使我们能够获得快速的实验数据以推进这一目标。根
据这些数据，我们在未来也将利用初级致癌模型扩大这一目标。
[0350] 实施例17. OMCP靶向递送IL15增强CD25上调。
[0351] 白细胞介素15（IL15）是与IL2具有结构相似性的细胞因子。与IL2一样，IL15与由IL2/IL15受体β链（CD122）和共同γ链（γ-C，CD132）组成的复合物结合并经其进行信号传导。IL15由病毒感染后的单核吞噬细胞（和一些其他细胞）分泌。IL15调节T和天然杀伤（NK）细胞的活化和增殖。IL15提供了在没有抗原的情况下维持记忆T细胞的存活信号。该细胞因子也与NK细胞发育有关。IL-15属于细胞因子的四个α-螺旋束家族。
[0352] 将OMCP与细胞因子IL15连接，并且检测了与单独的IL15相比其活化NK细胞的能力。通过CD25上调测量NK细胞活化。如图21中所示，当通过OMCP相比于单独的裸细胞因子以等摩尔剂量递送IL15时，更高水平的CD25是明显的。
[0353] 实施例18. OMCP靶向递送IL18增强NK细胞活化。
[0354] 将OMCP与WT人IL18、WT鼠IL18或突变体人IL18（其抑制其与IL18BP的相互作用）连接，并检查其活化NK细胞的能力（图32）。将外周血淋巴细胞在4.4μM野生型IL18（蓝色）、OMCP-IL18（红色）或盐水（黑色）中培养48小时。如通过表面CD69表达测量的，与野生型IL18相比，CD56+CD3-天然杀伤细胞的活化优于OMCP-IL18（图33）。该数据表明，相对于没有OMCP的IL18，将OMCP与IL18连接也增强NK细胞活化。
[0355] 实施例19. OMCP中的D132R突变显著降低其NKG2D结合。
[0356] 为了进一步测试靶向递送IL2中NKG2D结合的必要性，我们在mutIL2、OMCP-mutIL2和（D132R）OMCP-mutIL2存在下测试NK扩增和活化。D132R突变减少了天然杀伤细胞活化优于单独细胞因子的优势（图22）。因此，高亲和力NKG2D结合对通过IL2的靶向递送和淋巴细胞活化至关重要。
[0357] 实施例20. OMCP-IL2有效治疗西尼罗河病毒（WNV）引起的感染。
[0358] 评估了本发明的各种构建体治疗由西尼罗河病毒（WNV）引起的感染的能力。给予小鼠OMCP-IL2、OMCP的结合无效突变体、OMCP（D132R）-IL2、单独的IL2、单独的IL2（38R/
42A）和PBS。在用OMCP（D132R）-IL2和PBS处理后，所有小鼠在大约第11天死于感染。在用单独的IL2处理后，大约20％的小鼠存活至第21天。然而，用IL2（38R/42A）和OMCP-IL2处理导致约40％的小鼠存活超过21天（图30A）。这些结果一致地可重复，如图30B所示。
42A）和PBS。在用OMCP（D132R）-IL2和PBS处理后，所有小鼠在大约第11天死于感染。在用单独的IL2处理后，大约20％的小鼠存活至第21天。然而，用IL2（38R/42A）和OMCP-IL2处理导致约40％的小鼠存活超过21天（图30A）。这些结果一致地可重复，如图30B所示。
[0359] 实施例11-20的参考文献。
[0360] 实施例21. 抗NKG2D抗体介导的R38A/F42K突变体IL-2的递送。
[0361] 为了比较抗体介导的mutlL-2的递送与OMCP介导的mutlL-2的递送，基于所描述的KYK1和KYK2抗体的序列工程化了4个抗人NKG2D单链可变片段结构域(J Mol Biol 2008,
384(5), 1143-1156)。来自kyk1抗体的1HL2和1LH2以及来自kyk2抗体的2HL2和2LH2。OMCP、KYK1和KYK2的结合系数分别为0.1nM、27nM和6nM。
384(5), 1143-1156)。来自kyk1抗体的1HL2和1LH2以及来自kyk2抗体的2HL2和2LH2。OMCP、KYK1和KYK2的结合系数分别为0.1nM、27nM和6nM。
[0362] 将与OMCP-突变体IL-2、IgG-突变体IL-2、野生型IL-2连接的抗体和PBS对照与2.56
×10个外周血淋巴细胞在500μl培养基中以10U/ml或100U/ml细胞因子或构建体的终浓度
共培养。48小时后，与PBS对照相比，NK活化被评估为细胞内穿孔素的相对中值荧光强度。将CD4+CD45RA-Foxp3+活化评估为与PBS对照相比的表面CD25的相对中值荧光强度。
×10个外周血淋巴细胞在500μl培养基中以10U/ml或100U/ml细胞因子或构建体的终浓度
共培养。48小时后，与PBS对照相比，NK活化被评估为细胞内穿孔素的相对中值荧光强度。将CD4+CD45RA-Foxp3+活化评估为与PBS对照相比的表面CD25的相对中值荧光强度。
[0363] 在10 U/ml时，OMCP-突变体IL-2表现出比抗体介导的递送增加的穿孔素水平的趋势，但它没有达到统计学显著（图39）。在100U/ml时，用2HL2和2LH2抗体处理的NK细胞合成与OMCP-mutIL-2处理的细胞一样多的穿孔素，但在1HL2和1LH2处理的NK细胞中较低的穿孔
素水平是明显的。对于所有构建体，在野生型IL-2处理的培养物中CD25的水平较高是明显
的。因此，结果证明与NKG2D抗体连接的突变体IL-2和与突变体IL-2连接的OMCP表现相当。
素水平是明显的。对于所有构建体，在野生型IL-2处理的培养物中CD25的水平较高是明显
的。因此，结果证明与NKG2D抗体连接的突变体IL-2和与突变体IL-2连接的OMCP表现相当。
[0364] 实施例22. 使用OMCP-IL2和PD-1抑制剂的组合疗法。
[0365] 该实施例描述了OMCP-IL2与PD-1抗体组合的组合疗法的体内测试。
[0366] 通过尾静脉注射以每只小鼠100,000个Lewis肺癌细胞接种总计16只6-9周龄的C57BI/6小鼠，以诱导肿瘤细胞接种到肺中。随后将小鼠随机分成四组以接受以下治疗，其在细胞接种后5天开始：
第1组-抗体同种型对照，
第2组-抗PD-1抗体治疗，
第3组-抗体同种型对照加OMCP-IL2，
第4组-抗PD-1抗体加OMCP-IL2。
第1组-抗体同种型对照，
第2组-抗PD-1抗体治疗，
第3组-抗体同种型对照加OMCP-IL2，
第4组-抗PD-1抗体加OMCP-IL2。
[0367] 第1组-向小鼠腹膜内（i.p.）施用250 µg同种型对照抗体(Bioxcell克隆号2A3, 目录号BP0089)每周两次，持续两周，共计4个剂量（总共1000 µg）抗体。
[0368] 第2组-向小鼠i.p.施用250μg抗PD-1抗体(Bioxcell克隆号RMP1-14, 目录号BP0146)每周两次，持续两周，共计4个剂量（总共1000 µg）抗体。
[0369] 第3组-向小鼠i.p.施用（i）75,000 IUe OMCP-IL2融合蛋白，每天两次，持续五天，共计10个剂量（750,000 IUe）的OMCP-IL2融合蛋白；和（ii）250 µg同种型对照抗体(Bioxcell克隆号2A3, 目录号BP0089)每周两次，持续两周，共计4个剂量（总共1000 µg）抗体。
[0370] 第4组-向小鼠i.p.施用（i）75,000 IUe OMCP-IL2融合蛋白，每天两次，持续五天，共计10个剂量（750,000 IUe）的OMCP-IL2融合蛋白；和（ii）250μg抗PD-1抗体(Bioxcell克隆号RMP1-14, 目录号BP0146)每周两次，持续两周，共计4个剂量（总共1000 µg）抗体。
[0371] 在完成相应的治疗后将小鼠保留三周，此时将它们安乐死。
[0372] 因为肿瘤负荷可测量地增加肺的重量，所以肺重量被用作治疗功效的主要测量值。图34描绘了第1-4组小鼠群组的肺的照片且图35描绘了从第1-4组小鼠群组的肺测量的
肺重量。如图34和35所示，发现抗PD-1抗体和OMCP-IL2（第4组）的组合实际上消除了肺中的肿瘤生长，并且与单独的OMCP-IL2治疗（组3）或单独的抗PD-1抗体治疗（第2组）相比，协同地降低了肿瘤负荷。因此，组合疗法显示出比单独施用的每种组分令人惊奇地更大的功效。
肺重量。如图34和35所示，发现抗PD-1抗体和OMCP-IL2（第4组）的组合实际上消除了肺中的肿瘤生长，并且与单独的OMCP-IL2治疗（组3）或单独的抗PD-1抗体治疗（第2组）相比，协同地降低了肿瘤负荷。因此，组合疗法显示出比单独施用的每种组分令人惊奇地更大的功效。
[0373] 实施例23. PD1靶向递送IL2突变体优先在体外活化细胞毒性淋巴细胞。
[0374] 该实施例描述了PD1配体疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白相对于纯化的细胞因子的改进的免疫细胞活化。
[0375] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组，将脾细胞一式三份培养36小时：第1组-盐水对照，第2组-100 IUe/mL wt IL2，第3组-100 IUe/mL mut IL2，第4组-100 IUe/mL PDL1，第5组-100 IUe/mL PDL2，第6组-100 IUe/mL PDL1-mutIL2，第7组-100 IUe/mL PDL2-mutIL2。在36小时培养期后，根据标准方案将细胞染色用于流式细胞术，并评估细胞活化。
[0376] 细胞群将通过以下门控策略来定义：Tregs – CD45+CD3+CD4+Foxp3+, NK细胞 – CD45+CD3-CD49b+CD335+, Teff – CD45+CD3+CD8+。通过评估以下标志物是否被上调来进一步定义细胞活化：Tregs – ICOS, NK细胞 – CD69和KLRG1, Teff – CD69。
[0377] 潜在的结果包括通过用wtIL2、PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理显著活化NK细胞的发现。还可以通过用wtIL2、PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理来活化Teff细胞。这与Tregs形成对比，Tregs应该通过用wtIL2处理而不是用PDL1-mutIL2或PDL2-mutIL2处理来活化。
[0378] 这些结果表明，通过PD1配体融合蛋白将IL2疗法靶向PD1细胞显著增强IL2疗法在抗肿瘤细胞群如NK细胞和Teff细胞中的功效，同时避免活化免疫耐受性群体如Treg细胞。
[0379] 实施例24. PD1靶向递送IL2突变体在体外诱导细胞毒性淋巴细胞的增殖该实施例描述了PD1配体疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明通过PDL1-
mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白相对于纯化的细胞因子的改进的细胞毒性免疫细胞扩增。
mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白相对于纯化的细胞因子的改进的细胞毒性免疫细胞扩增。
[0380] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。在培养之前将脾细胞用CFSE染色。CFSE永久性地结合DNA，并通过随后细胞分裂的荧光减少提供细胞增殖的指示。染色的脾细胞会随后根据以下组一式三份培养6天：第1组 – 盐水对照，第2组 –
1000 IUe/mL wt IL2，第3组 – 1000 IUe/mL mut IL2，第4组 – 1000 IUe/mL PDL1，第5组– 1000 IUe/mL PDL2，第6组 – 1000 IUe/mL PDL1-mutIL2，第7组 – 1000 IUe/mL
PDL2-mutIL2。在6天培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞增殖。
1000 IUe/mL wt IL2，第3组 – 1000 IUe/mL mut IL2，第4组 – 1000 IUe/mL PDL1，第5组– 1000 IUe/mL PDL2，第6组 – 1000 IUe/mL PDL1-mutIL2，第7组 – 1000 IUe/mL
PDL2-mutIL2。在6天培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞增殖。
[0381] 细胞群将通过以下门控策略来定义：Tregs – CD45+CD3+CD4+Foxp3+, NK细胞 – CD45+CD3-CD49b+CD335+, Teff – CD45+CD3+CD8+。
[0382] 潜在的结果包括发现wtIL2、PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2将在NK细胞群中诱导显著增殖。我们还可以发现通过这些相同的处理组诱导Teff细胞增殖。然而，Treg细胞将仅通过wtIL2处理诱导增殖，并且将用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理保持相对静止。因此，相对于单独的wtIL2处理，PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理将显著增强NK细胞与Treg细胞比
率，其是免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
率，其是免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
[0383] 这些结果表明，通过PD1配体融合蛋白将IL2疗法靶向PD1细胞显著增强抗肿瘤细胞群如NK细胞和Teff细胞的增殖能力，同时避免活化免疫耐受性群体如Treg细胞。
[0384] 实施例25. PD1靶向递送突变体IL2增强淋巴细胞细胞毒性该实施例描述了PD1配体疗法的体外测试。具体地，该实施例将证明相对于纯化的细胞
因子，在用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
因子，在用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
[0385] 将使用总共6只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组，将大量脾细胞培养6天：第1组 – 盐水对照，第2组 – 1000 IUe/mL wt IL2，第3组 – 1000 IUe/mL mut IL2，第4组 – 1000 IUe/mL PDL1，第5组– 1000 IUe/mL PDL2，第6组 – 1000 IUe/mL PDL1-mutIL2，第7组 – 1000 IUe/mL PDL2-mutIL2。在6天培养期后，根据制造商的方案 (Cayman Chemical, 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit, 产品
编号600120)，使用试剂盒制备细胞用于针对K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测定。来自每组的脾细胞将以下列比例一式三份接种靶K562细胞：无靶细胞、15.6：1、31.25：1、62.5：1、
125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
编号600120)，使用试剂盒制备细胞用于针对K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测定。来自每组的脾细胞将以下列比例一式三份接种靶K562细胞：无靶细胞、15.6：1、31.25：1、62.5：1、
125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
[0386] 可能的结果包括发现与wtIL2孵育的脾细胞相对于盐水对照将具有针对靶细胞的增强的细胞毒性功能。我们进一步期望发现PDL1-muIL2和PDL2-mutIL2处理将进一步增强
脾细胞的细胞毒性。
脾细胞的细胞毒性。
[0387] 这些结果表明PD1配体IL2融合蛋白相对于wtIL2疗法增加脾细胞的细胞毒活性。这可能是脾细胞群中Treg活化减少的功能。这可以进一步是通过T细胞和NK细胞上的IL2受
体增强的融合蛋白的mutIL2部分的结合和信号传导的功能。
体增强的融合蛋白的mutIL2部分的结合和信号传导的功能。
[0388] 实施例26. 用PD1靶向疗法体内治疗后的肿瘤生长和存活该实施例描述了PD1配体疗法抑制肿瘤或癌症进展的体内概念证据。具体而言，该实施
例将证明在用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白相比于用纯化的细胞因子进行体内治
疗后改善的肿瘤生长和总体存活指标。
例将证明在用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2融合蛋白相比于用纯化的细胞因子进行体内治
疗后改善的肿瘤生长和总体存活指标。
[0389] 将使用总共50只6-9周龄的C57BI/6小鼠。将利用Lewis Lung Carcinoma在侧腹皮下注射小鼠，每只小鼠1×105个细胞。处理将在5天后开始，此时肿瘤已经充分生长以变得
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-wt IL2，第3组-mut IL2，第4组-PDL1-mutIL2，第5组-PDL2-mutIL2。
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-wt IL2，第3组-mut IL2，第4组-PDL1-mutIL2，第5组-PDL2-mutIL2。
[0390] 所有小鼠将按照他们的组每天两次以12小时间隔处理5天，总共10个剂量。第1组-对于所有处理，向小鼠腹膜内（i.p.）施用200μL盐水作为阴性对照。第2组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe wt IL2，处理后总共750,000 IUe wt IL2。第3组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe mut IL2，处理后总共750,000 IUe mut IL2。第4组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe PDL1-mutIL2，处理后总共750,000 IUe PDL1-
mutIL2。第5组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe PDL2-mutIL2，处理后总共750,
000 IUe PDL2-mutIL2。
mutIL2。第5组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe PDL2-mutIL2，处理后总共750,
000 IUe PDL2-mutIL2。
[0391] 将通过卡尺测量来测量所有肿瘤，并且在治疗期间每天测量小鼠重量。在治疗过程完成后，将每周三次测量小鼠重量和肿瘤。在整个研究中将监测小鼠的治疗处理的痛苦
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
[0392] 可能的结果包括这样的发现，与盐水对照相比，用wt IL2处理的小鼠将表现出相当大的生理痛苦，并且甚至可能由于血管渗漏综合征（VLS）而过早地因治疗本身死亡。与盐水对照相比，那些在治疗中存活的小鼠可能具有一些减弱的肿瘤生长和增加的存活。可能
的结果进一步包括这样的发现，用mutIL2处理的小鼠不具有VLS和相关的生理应激，但与盐水对照小鼠相比，肿瘤生长具有极少的或没有减弱。相比之下，可能的结果可能包括这样的发现，PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2的处理比盐水对照和wtIL2组将显著减弱肿瘤生长并增
加存活。
的结果进一步包括这样的发现，用mutIL2处理的小鼠不具有VLS和相关的生理应激，但与盐水对照小鼠相比，肿瘤生长具有极少的或没有减弱。相比之下，可能的结果可能包括这样的发现，PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2的处理比盐水对照和wtIL2组将显著减弱肿瘤生长并增
加存活。
[0393] 我们将通过免疫组织化学进一步分析残留肿瘤的淋巴细胞浸润。具体而言，我们将评估CD8+Teff细胞和NK细胞的肿瘤内浸润。此外，我们将通过TUNEL测定（Millipore
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理比盐水对照小鼠或wt IL2处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2处理比盐水对照小鼠或wt IL2处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
[0394] 这些结果提示，与单独的wt IL2或mut IL2细胞因子处理相比，PD1配体IL2融合蛋白，特别是PDL1-mutIL2和PDL2-mutIL2具有增加的治疗益处。通过将IL2处理靶向表达PD1
的细胞，与wt IL2处理相比，将减少意外的毒性和副作用。此外，PD1配体IL2融合蛋白增强了细胞毒性淋巴细胞的肿瘤内浸润，提示这些细胞群的靶向活化增加了这些细胞克服肿瘤
细胞免疫抑制的能力。
的细胞，与wt IL2处理相比，将减少意外的毒性和副作用。此外，PD1配体IL2融合蛋白增强了细胞毒性淋巴细胞的肿瘤内浸润，提示这些细胞群的靶向活化增加了这些细胞克服肿瘤
细胞免疫抑制的能力。
[0395] 实施例27. NKG2D靶向递送OX40L优先在体外活化细胞毒性淋巴细胞。
[0396] 该实施例描述了NKG2D靶向递送OX40L疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明OMCP-OX40L相对于纯化的细胞因子的改善的免疫细胞活化。该实施例将进一步证明
OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2对OX40L信号传导的抑制。
OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2对OX40L信号传导的抑制。
[0397] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组，将脾细胞一式三份培养36小时：第1组-盐水对照，第2组-100 IUe/mL OX40L，第3组-100
IUe/mL OX40L mut1，第4组-100 IUe/mL OX40L mut2，第5组-100 IUe/mL OMCP-OX40L，第6组-100 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-100 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在36小时培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞活化。
IUe/mL OX40L mut1，第4组-100 IUe/mL OX40L mut2，第5组-100 IUe/mL OMCP-OX40L，第6组-100 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-100 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在36小时培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞活化。
[0398] 细胞群将通过以下门控策略来定义：Tregs-CD45+CD3+CD4+Foxp3+，NK细胞-CD45+CD3-CD49b+CD335+，Teff-CD45+CD3+CD8+。通过评估以下标志物是否被上调来进一步定义
细胞活化：Tregs-ICOS，NK细胞-CD69和KLRG1，Teff-CD69。
细胞活化：Tregs-ICOS，NK细胞-CD69和KLRG1，Teff-CD69。
[0399] 可能的结果包括这样的发现，通过OX40L和OMCP-OX40L处理显著活化NK细胞。也可以通过用OX40L和OMCP-OX40L处理来活化Teff细胞。这与OX40L mut1、OX40L mut2、OMCP-
OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2相反，后者应该抑制NK细胞活化。此外，还可以通过用OX40L mut1、OX40L mut2、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2处理来抑制Teff细胞，其应该抑制NK细胞活化。
OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2相反，后者应该抑制NK细胞活化。此外，还可以通过用OX40L mut1、OX40L mut2、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2处理来抑制Teff细胞，其应该抑制NK细胞活化。
[0400] 这些结果提示，通过OMCP配体融合蛋白将OX40L疗法靶向表达NKG2D的细胞显著增强了OX40L治疗在抗肿瘤细胞群，如NK细胞和Teff细胞中的功效。
[0401] 实施例28. NKG2D靶向递送OX40L在体外诱导细胞毒性淋巴细胞的增殖该实施例描述了NKG2D靶向递送OX40L疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明
OMCP-OX40L相对于纯化的细胞因子改善的细胞毒性免疫细胞扩增。
OMCP-OX40L相对于纯化的细胞因子改善的细胞毒性免疫细胞扩增。
[0402] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。在培养之前用CFSE将脾细胞染色。CFSE永久性地结合DNA，并通过随着随后的细胞分裂减少的荧光提供细胞增殖的指示。染色的脾细胞随后会根据以下组一式三份培养6天：第1组-盐水对照，第2组-1000 IUe/mL OX40L，第3组-1000 IUe/mL OX40L mut1，第4组-1000 IUe/mL OX40L
mut2，第5组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L，第6组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-
1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在6天培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式
细胞术，并评估细胞增殖。
mut2，第5组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L，第6组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-
1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在6天培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式
细胞术，并评估细胞增殖。
[0403] 细胞群将通过以下门控策略来定义：Tregs-CD45+CD3+CD4+Foxp3+，NK细胞-CD45+CD3-CD49b+CD335+，Teff-CD45+CD3+CD8+。
[0404] 可能的结果包括这样的发现，OX40L和OMCP-OX40L将在NK细胞群中诱导显著增殖。我们还可以发现通过这些相同的处理组诱导Teff细胞增殖。然而，可能的结果可能包括这
样的发现，用OX40L mut1、OX40L mut2、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2处理不会诱导NK细胞或Teff细胞扩增。OMCP-OX40L处理将比单独的OX40L处理显著增强NK细胞与Treg细
胞比率，其为免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
样的发现，用OX40L mut1、OX40L mut2、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut2处理不会诱导NK细胞或Teff细胞扩增。OMCP-OX40L处理将比单独的OX40L处理显著增强NK细胞与Treg细
胞比率，其为免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
[0405] 这些结果提示，通过NKG2D配体融合蛋白将OX40L疗法靶向表达NKG2D的细胞显著增强抗肿瘤细胞群，如NK细胞和Teff细胞的增殖能力。
[0406] 实施例29. NKG2D靶向递送OX40L增强淋巴细胞的细胞毒性该实施例描述了NKG2D靶向递送OX40L疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明在
用OMCP-OX40L处理比纯化的细胞因子处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
用OMCP-OX40L处理比纯化的细胞因子处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
[0407] 将使用总共6只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组，将大量脾细胞培养6天：第1组-盐水对照，第2组-1000 IUe/mL OX40L，第3组-1000 IUe/mL OX40L mut1，第4组-1000 IUe/mL OX40L mut2，第5组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L，第6组-
1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在6天培养期后，根据制造商的方案（Cayman Chemical, 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit, 产品号 600120），使用试剂盒制备细胞用于针对K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测
定。来自每组的脾细胞将与靶K562细胞以下列比例一式三份接种：无靶细胞，15.6：1、
31.25：1、62.5：1、125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut1，第7组-1000 IUe/mL OMCP-OX40L mut2。在6天培养期后，根据制造商的方案（Cayman Chemical, 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit, 产品号 600120），使用试剂盒制备细胞用于针对K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测
定。来自每组的脾细胞将与靶K562细胞以下列比例一式三份接种：无靶细胞，15.6：1、
31.25：1、62.5：1、125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
[0408] 可能的结果包括这样的发现，与OX40L一起孵育的脾细胞相比于盐水、OX40L mut1和OX40L mut2对照具有增强的针对靶细胞的细胞毒性功能。可能的结果还包括这样的发
现，OMCP-OX40L处理将进一步增强脾细胞的细胞毒性。
现，OMCP-OX40L处理将进一步增强脾细胞的细胞毒性。
[0409] 这些结果提示NKG2D配体OX40L融合蛋白比OX40L疗法增加脾细胞毒性活性。这可能是通过T细胞和NK细胞上的OX40受体增强的融合蛋白的OX40L部分的结合和信号传导的
功能。
功能。
[0410] 实施例30. 用OMCP-OX40L靶向疗法体内治疗后肿瘤生长和存活该实施例描述了OMCP-OX40L疗法抑制肿瘤或癌症进展的体内概念证据。具体来说，该
实施例将证明在用OMCP-OX40L融合蛋白体内处理比用纯化的细胞因子处理后改善的肿瘤
生长和总体存活指标。
实施例将证明在用OMCP-OX40L融合蛋白体内处理比用纯化的细胞因子处理后改善的肿瘤
生长和总体存活指标。
[0411] 将使用总共70只6-9周龄的C57BI/6小鼠。将利用Lewis Lung Carcinoma在侧腹皮下注射小鼠，每只小鼠1×105个细胞。处理将在5天后开始，此时肿瘤已经充分生长以变得
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-OX40L，第3组-OX40L mut1，第4组-OX40L mut2，第5组-OMCP-OX40L，第6组-OMCP-OX40L mut1，第7组-
OMCP-OX40L mut2。
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-OX40L，第3组-OX40L mut1，第4组-OX40L mut2，第5组-OMCP-OX40L，第6组-OMCP-OX40L mut1，第7组-
OMCP-OX40L mut2。
[0412] 所有小鼠将按照他们的组每天两次以12小时间隔处理5天，总共10个剂量。第1组-对于所有处理，向小鼠腹膜内（i.p.）施用200μL盐水作为阴性对照。第2组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OX40L，处理后总共750,000 IUe OX40L。第3组-对于每个剂
量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OX40L mut 1，处理后总共750,000 IUe OX40L mut 1。第4组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OX40L mut 2，处理后总共750,000 IUe
OX40L mut 2。第5组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L，处理后总共
750,000 IUe OMCP-OX40L。第6组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L mut1，处理后总共750,000 IUe OMCP-OX40L mut1。对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L mut 2，处理后总共750,000 IUe OMCP-OX40L mut 2。
量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OX40L mut 1，处理后总共750,000 IUe OX40L mut 1。第4组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OX40L mut 2，处理后总共750,000 IUe
OX40L mut 2。第5组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L，处理后总共
750,000 IUe OMCP-OX40L。第6组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L mut1，处理后总共750,000 IUe OMCP-OX40L mut1。对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-OX40L mut 2，处理后总共750,000 IUe OMCP-OX40L mut 2。
[0413] 将通过卡尺测量来测量所有肿瘤，并且在治疗期间每天测量小鼠重量。在治疗过程完成后，将每周三次测量小鼠重量和肿瘤。在整个研究中将监测小鼠的治疗处理的痛苦
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
[0414] 可能的结果包括这样的发现，与盐水对照相比，用OX40L处理的小鼠可能具有一些减弱的肿瘤生长和增加的存活。可能的结果进一步包括这样的发现，与盐水对照小鼠相比，用OX40L mut 1或OX40L mut 2处理的小鼠肿瘤生长具有极少的或没有减弱。相比之下，可
能的结果可能包括这样的发现，OMCP-OX40L的处理比盐水、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut 2对照以及OX40L组将显著减弱肿瘤生长并增加存活。
能的结果可能包括这样的发现，OMCP-OX40L的处理比盐水、OMCP-OX40L mut1和OMCP-OX40L mut 2对照以及OX40L组将显著减弱肿瘤生长并增加存活。
[0415] 我们将通过免疫组织化学进一步分析残留肿瘤的淋巴细胞浸润。具体而言，我们将评估CD8+Teff细胞和NK细胞的肿瘤内浸润。此外，我们将通过TUNEL测定（Millipore
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用OMCP-OX40L处理比盐水对照小鼠或OX40L处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用OMCP-OX40L处理比盐水对照小鼠或OX40L处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
[0416] 这些结果提示，与单独的OX40L处理相比，NKG2D配体OX40L融合蛋白，特别是OMCP-OX40L具有增加的治疗益处。此外，NKG2D配体OX40L融合蛋白应该增强了细胞毒性淋巴细胞的肿瘤内浸润，提示这些细胞群的靶向活化增加了这些细胞克服肿瘤细胞免疫抑制的能力。
[0417] 实施例31. NKG2D靶向递送4-1BBL优先在体外活化细胞毒性淋巴细胞。
[0418] 该实施例描述了NKG2D靶向递送4-1BBL疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明OMCP-4-1BBL相对于纯化的细胞因子的改善的免疫细胞活化。
[0419] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组，将脾细胞一式三份培养36小时：第1组-盐水对照，第2组-100 IUe/mL4-1BBL，第3组-100
IUe/mL OMCP-4-1BBL。在36小时培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞活化。
IUe/mL OMCP-4-1BBL。在36小时培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞活化。
[0420] 细胞群将通过以下门控策略来定义Tregs-CD45+CD3+CD4+Foxp3+，NK细胞-CD45+CD3-CD49b+CD335+，Teff-CD45+CD3+CD8+。通过评估以下标志物是否被上调来进一步定义
细胞活化：Tregs-ICOS，NK细胞-CD69和KLRG1，Teff-CD69。
细胞活化：Tregs-ICOS，NK细胞-CD69和KLRG1，Teff-CD69。
[0421] 可能的结果包括这样的发现，通过4-1BBL和OMCP-4-1BBL处理显著活化NK细胞。也可以通过用-1BBL和OMCP-4-1BBL处理来活化Teff细胞。可能的结果进一步包括这样的发
现，OMCP-4-1BBL将显示出比单独的4-1BBL配体更强的NK活化和可能的Teff细胞活化。
现，OMCP-4-1BBL将显示出比单独的4-1BBL配体更强的NK活化和可能的Teff细胞活化。
[0422] 这些结果提示，通过OMCP配体融合蛋白将4-1BBL疗法靶向表达NKG2D的细胞显著增强了4-BBL疗法在抗肿瘤细胞群，如NK细胞和Teff细胞中的功效。
[0423] 实施例32. NKG2D靶向递送4-1BBL在体外诱导细胞毒性淋巴细胞的增殖该实施例描述了NKG2D靶向递送4-1BBL疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明
OMCP-4-1BBL相对于纯化的细胞因子的改善的细胞毒性免疫细胞扩增。
OMCP-4-1BBL相对于纯化的细胞因子的改善的细胞毒性免疫细胞扩增。
[0424] 将使用总共4只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。在培养之前将脾细胞用CFSE染色。CFSE永久性地结合DNA，并通过随着随后的细胞分裂减少的荧光提供细胞增殖的指示。染色的脾细胞随后会根据以下组一式三份培养6天：第1组-盐水对照，第2组-1000 IUe/mL 4-1BBL，第3组-1000 IUe/mL OMCP-4-BBL。在6天培养期后，根据标准方案对细胞进行染色用于流式细胞术，并评估细胞增殖。
[0425] 通过以下门控策略定义细胞群：Tregs-CD45+CD3+CD4+Foxp3+，NK细胞-CD45+CD3-CD49b+CD335+，Teff-CD45+CD3+CD8+。
[0426] 可能的结果包括这样的发现，4-1BBL和OMCP-4-1BBL将在NK细胞群中诱导显著增殖。我们还可以发现通过这些相同的处理组诱导Teff细胞增殖。可能的结果进一步包括这
样的发现，OMCP-4-1BBL处理比单独的4-1BBL处理显著增强NK细胞与Treg细胞比率，其为免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
样的发现，OMCP-4-1BBL处理比单独的4-1BBL处理显著增强NK细胞与Treg细胞比率，其为免疫细胞活化和癌症治疗反应的预后的标志物。
[0427] 这些结果提示，通过NKG2D配体融合蛋白将4-1BBL疗法靶向表达NKG2D的细胞显著增强了抗肿瘤细胞群，如NK细胞和Teff细胞的增殖能力。
[0428] 实施例33. NKG2D靶向递送4-1BBL增强淋巴细胞的细胞毒性该实施例描述了NKG2D靶向递送4-1BBL疗法的体外测试。具体而言，该实施例将证明用
OMCP-4-1BBL处理比用纯化的细胞因子处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
OMCP-4-1BBL处理比用纯化的细胞因子处理后改善的细胞毒性免疫细胞应答。
[0429] 将使用总共6只6-9周龄的C57BI/6小鼠来制备新鲜的脾细胞培养物。根据以下组将大量脾细胞培养6天：第1组-盐水对照，第2组-1000 IUe/mL 4-1BBL，第3组-1000 IUe/mL OMCP-4-1BBL。在6天培养期后，根据制造商的方案（Cayman Chemical, 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit, 产品号 600120），使用试剂盒制备细胞用于针对
K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测定。来自每组的脾细胞将与靶K562细胞以下列比例一式
三份接种：无靶细胞、15.6：1、31.25：1、62.5：1、125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
K562细胞的7-AAD/CFSE细胞毒性测定。来自每组的脾细胞将与靶K562细胞以下列比例一式
三份接种：无靶细胞、15.6：1、31.25：1、62.5：1、125：1、250：1、500：1。4小时后，将通过流式细胞术评估活的靶细胞与死亡靶细胞比率。
[0430] 可能的结果包括这样的发现，与4-1BBL孵育的脾细胞相比于盐水对照将具有增强的针对靶细胞的细胞毒性功能。可能的结果还包括这样的发现，OMCP-4-1BBL处理将进一步增强脾细胞的细胞毒性。
[0431] 这些结果提示NKG2D配体4-1BBL融合蛋白比4-1BBL疗法增加脾细胞的细胞毒活性。这可能是通过T细胞和NK细胞上的4-1BB受体增强的融合蛋白的4-1BBL部分的结合和信
号传导的功能。
号传导的功能。
[0432] 实施例34. 用OMCP-4-1BBL靶向疗法体内处理后肿瘤生长和存活该实施例描述了OMCP-4-1BBL疗法抑制肿瘤或癌症进展的体内概念证据。具体而言，该
实施例会证明在用OMCP-4-1BBL融合蛋白体内处理比用纯化的细胞因子处理后改善的肿瘤
生长和总体存活指标。
实施例会证明在用OMCP-4-1BBL融合蛋白体内处理比用纯化的细胞因子处理后改善的肿瘤
生长和总体存活指标。
[0433] 将使用总共30只6-9周龄的C57BI/6小鼠。将利用Lewis Lung Carcinoma在侧腹皮下注射小鼠，每只小鼠1×105个细胞。处理将在5天后开始，此时肿瘤已经充分生长以变得
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-4-1BBL，第3组-OMCP-4-1BBL。
可见和可测量。将获取初始肿瘤大小和小鼠重量，并将小鼠随机分成10只小鼠的组，使得组之间的初始肿瘤大小和小鼠重量相似。处理组如下：第1组-盐水对照，第2组-4-1BBL，第3组-OMCP-4-1BBL。
[0434] 所有小鼠将按照他们的组每天两次以12小时间隔处理5天，总共10个剂量。第1组-对于所有处理，向小鼠腹膜内（i.p.）施用200μL盐水作为阴性对照。第2组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe 4-1BBL，处理后总共750,000 IUe 4-1BBL。第3组-对于每个剂量，向小鼠i.p.施用75,000 IUe OMCP-4-1BBL，处理后总共750,000 IUe OMCP-4-1BBL。
[0435] 将通过卡尺测量来测量所有肿瘤，并且在治疗期间每天测量小鼠重量。在治疗过程完成后，将每周三次测量小鼠重量和肿瘤。在整个研究中将监测小鼠的治疗处理的痛苦
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
或其他影响的迹象。所有小鼠将在最大肿瘤直径为20mm时被安乐死，并且将保留肿瘤用于
后续分析。任何因已知或未知原因而过早死亡的小鼠将进行最终测量，并尽快收集组织。
[0436] 可能的结果包括这样的发现，与盐水对照相比，用4-1BBL处理的小鼠可能具有一些减弱的肿瘤生长和增加的存活。相比之下，可能的结果进一步包括这样的发现，OMCP-4-
1BBL的处理比盐水对照以及4-1BBL组将显著减弱肿瘤生长并增加存活。
1BBL的处理比盐水对照以及4-1BBL组将显著减弱肿瘤生长并增加存活。
[0437] 我们将通过免疫组织化学进一步分析残留肿瘤的淋巴细胞浸润。具体而言，我们将评估CD8+Teff细胞和NK细胞的肿瘤内浸润。此外，我们将通过TUNEL测定（Millipore
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用OMCP-4-1BBL处理比盐水对照小鼠或4-1BBL处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, 目录号 S7100）评估凋亡水
平。可能的结果包括这样的发现，用OMCP-4-1BBL处理比盐水对照小鼠或4-1BBL处理的小鼠显著增加CD8+Teff和NK细胞的肿瘤内浸润。
[0438] 这些结果提示，与单独的4-1BBL处理相比，NKG2D配体4-1BBL融合蛋白，特别是OMCP-4-1BBL具有增加的治疗益处。此外，NKG2D配体4-1BBL融合蛋白应该增强了细胞毒性
淋巴细胞的肿瘤内浸润，提示这些细胞群的靶向活化增加了这些细胞克服肿瘤细胞免疫抑
制的能力。
淋巴细胞的肿瘤内浸润，提示这些细胞群的靶向活化增加了这些细胞克服肿瘤细胞免疫抑
制的能力。
[0439] 实施例35. OMCP-IL2用于扩增离体细胞疗法培养物。
[0440] 进行实验以评估靶向细胞因子递送对体外细胞毒性淋巴细胞扩增的效用。所公开的嵌合肽，具体是OMCP-IL2，可用于扩增T细胞，例如CAR-T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。
这些疗法通常在IL2存在下离体培养以促进它们的扩增。进行实验以确定OMCP-IL2是否比
单独的IL2更好地扩增离体培养的淋巴细胞。
这些疗法通常在IL2存在下离体培养以促进它们的扩增。进行实验以确定OMCP-IL2是否比
单独的IL2更好地扩增离体培养的淋巴细胞。
[0441] 在该研究中，在平板结合的抗CD3和野生型IL-2或OMCP-mutIL-2的存在下以1000 IUe/ml培养2.5×106个C57BL/6脾细胞。72小时后除去CD3刺激，并且每隔一天补充含细胞
因子的培养基以避免培养基耗尽。在2周的过程中通过流式细胞术计数CD3+ T细胞和以及
NK1.1+CD3- NK细胞的总数和增殖（KI67表达）、生存力（通过排除生存力染料L34959染色）和耗尽（表面PD1表达）的表型标志物。在实验完成时（第13天），评估细胞的其他耗尽标志物，例如Lag3和Tim3。
因子的培养基以避免培养基耗尽。在2周的过程中通过流式细胞术计数CD3+ T细胞和以及
NK1.1+CD3- NK细胞的总数和增殖（KI67表达）、生存力（通过排除生存力染料L34959染色）和耗尽（表面PD1表达）的表型标志物。在实验完成时（第13天），评估细胞的其他耗尽标志物，例如Lag3和Tim3。
[0442] 结果证明用OMCP-mutIL-2比野生型IL-2扩增的培养物中T细胞和NK细胞的增加数量是明显的（图37，图38）。两种培养物之间相似的增殖水平是明显的，但OMCP-mutlL-2处理的细胞的生存力较高，这可能解释了细胞数量的增加。PD-1水平在NK和CD3+ T细胞中均增
加，但在OMCP-mutIL-2处理的细胞但不是野生型IL-2处理的细胞中培养的第6-9天显著降
低。其他耗尽标志物如Tim-2和Lag-3也在野生型IL-2处理的培养物中增加。因此，这些结果证明OMCP-mutIL2在淋巴细胞的离体扩增时比野生型IL2更有效。这对于疗法如过继性细胞
免疫疗法具有重要意义。过继性细胞免疫疗法是基于T细胞的免疫疗法，其中T细胞取自主
体并在体外刺激和/或遗传操作，然后转移回患者以对抗肿瘤或感染。
加，但在OMCP-mutIL-2处理的细胞但不是野生型IL-2处理的细胞中培养的第6-9天显著降
低。其他耗尽标志物如Tim-2和Lag-3也在野生型IL-2处理的培养物中增加。因此，这些结果证明OMCP-mutIL2在淋巴细胞的离体扩增时比野生型IL2更有效。这对于疗法如过继性细胞
免疫疗法具有重要意义。过继性细胞免疫疗法是基于T细胞的免疫疗法，其中T细胞取自主
体并在体外刺激和/或遗传操作，然后转移回患者以对抗肿瘤或感染。
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