一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒
阅读：1004发布：2020-07-08
专利汇可以提供一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因突变检测技术领域，具体公开了一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的 试剂 盒 ，通过精心设计、多次验证、筛选和优化，获得了基于Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针，可以检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因的8个功能性变异；从DNA提取到 荧光 PCR，到结果获取小于4小时，手头操作时间小于2小时。含有这些引物对和探针对的试剂盒具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99%以上等优点；本发明所述检测方法主要用于 他汀类药物 的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、 阿托伐他汀 、氟伐他汀、 瑞舒伐他汀 等。，下面是一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测SLCO1B1 rs2306283、SLCO1B1 rs4149056、APOE rs7412、APOE
rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的引物对和探针对；所述用于检测SLCO1B1 rs2306283的引物对如SEQ ID NO：1～2所示，探针对如SEQ ID NO：3～4所示；用于检测SLCO1B1 rs4149056的引物对如SEQ ID NO：5～6所示，探针对如SEQ ID NO：7～8所示；用于检测APOE rs7412的引物对如SEQ ID NO：9～10所示，探针对如SEQ ID NO：11～12所示；用于检测APOE rs429358的引物对如SEQ ID NO：13～14所示，探针对如SEQ ID NO：15～16所示；用于检测LDLR rs1433099的引物对如SEQ ID NO：17～18所示，探针对如SEQ ID NO：19～20所示；用于检测LDLR rs14158的引物对如SEQ ID NO：21～
22所示，探针对如SEQ ID NO：23～24所示；用于检测LDLR rs688的引物对如SEQ ID NO：25～26所示，探针对如SEQ ID NO：27～28所示；用于检测LDLR rs6511720的引物对如SEQ ID NO：29～30所示，探针对如SEQ ID NO：31～32所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×TaqMan Master Mix。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括野生型质控模板、突变型质控模板、杂合型质控模板。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各个引物对的浓度为0.5μM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：浓度为0.5μM、体积为0.5～1.25μL的用于检测SLCO1B1 rs2306283、SLCO1B1 rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的引物对，浓度为0.25μM、体积为0.125～0.625μL的用于检测SLCO1B1 rs2306283、SLCO1B1 rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的探针对，5～15μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应程序为（：i）95℃，10min；1个循环；（ii）95℃，10s；58℃，45s；40个循环（；iii）37℃，10s；1个循环。
一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及基因突变检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒。
背景技术
[0002] 他汀类药物是使用广泛的降脂药，能有效地防治心脑血管疾病，在美国超过25％的年纪大于45岁的人服用他汀类药物。在冠心病经皮支架植入术(PCI)后二级预防中，采用积极的他汀调脂治疗对冠心病防治有重要意义。
[0003] 他汀类药物随着剂量的升高，降低LDL的作用增强，但同时不良反应发生率也高。他汀类一个主要的毒副反应是肌病，有5～29％的患者会发生他汀引起的肌病(statin-induced myopathy，SIM)，主要表现为疲乏、无力、肌痛、肌肉痉挛、有的出现严重危害生命的横纹肌溶解(rhabdomyolysis)，引起患者死亡。肌病影响用药依从性，33％出现肌病的患者会自行停药，引起死亡、再次心梗等心血管事件的发生，对患者的生存构成严重的威胁。
根据基因诊断进行个体化用药可保障用药安全、节省医药开支，并已逐渐成为临床治疗的新趋势。
根据基因诊断进行个体化用药可保障用药安全、节省医药开支，并已逐渐成为临床治疗的新趋势。
[0004] 研究显示基因变异对他汀类药物个体差异有重要影响，大量研究表明APOE和LDLR基因变异严重影响他汀类药物疗效，而SLCO1B1基因变异与他汀引起的肌肉毒性有显著关联。SLCO1B1外显子6的T>C突变(rs4149056)可导致蛋白质第174位缬氨酸被丙氨酸代替，与服用辛伐他汀的患者发生肌痛相关。因此，携带C等位基因的人群服用他汀类药物可能发生肌痛的概率较高。美国FDA和美国临床药物基因组学实施联盟(CPIC)指南指出，SLCO1B1位点rs4149056T>C基因变异可增加辛伐他汀肌肉毒性，使用辛伐他汀前推荐作基因型检测。
[0005] 在药物基因组学权威数据库PharmGKB中显示LDLR基因突变rs6511720、rs1433099、rs14158和rs688不仅与冠心病的遗传易感性密切相关，还与他汀类的疗效有密切关系。rs1433099、rs14158和rs688与他汀类降脂作用显著关联，在不同的研究中结果一致。在不同种族，LDLR的2个常见变异rs1433099和rs6511720与心肌梗死有关，在不同研究中得到证实。全基因组关联性研究发现rs6511720还是主动脉夹层发病的易感基因突变位点。在多个研究中显示rs5925，rs688基因多态性与他汀类降脂作用显著关联。因为，rs688与rs5925、rs2738450和rs2738446处于高度连锁状态(LD>0.98)，所以可以用rs688代替rs5925、rs2738450和rs2738446。这从另外一个方面证实，rs688基因变异影响他汀类降脂作用。同样，rs14158与rs2738466处于连锁状态(LD＝1)，所以可以用rs14158代替rs2738466。在美国FDA药物标签注释中标明家族性高胆固醇血症患者需要检测LDLR基因型，指导阿托伐他汀、普伐他汀的用药。
[0006] APOE基因主要是与乳糜微粒和极低密度脂蛋白代谢的残余物结合，通过肝细胞表面LDL受体将脂质转入肝脏进行代谢。APOE的多态性主要有E2、E3、E4，同时有rs7412(C/C)和rs429358(C/C)基因型为APOE-E4型。有文献显示，E2型服用他汀类降脂效果较好，而E4服用他汀类降脂效果较差。另一项大型调查发现，在5745例受试者23个他汀类药物的候选基因中，只有APOE rs7412与阿托伐他汀的疗效有显著相关性。
[0007] 因此在临床上，对他汀类的精准用药，不仅要考虑疗效的个体差异，还要考虑毒副反应的个体差异，所以需要同时检测SLCO1B1、LDLR和APOE基因多态性。目前国内的武汉友芝友公司开发的SLCO1B1和APOE基因多态性检测试剂盒，没有包括对LDLR的基因型检测，并且该试剂盒采用四引物法ARMS-PCR，其采用凝胶电泳，耗时长，开管操作容易造成实验污染。金唯智自主开发的基因检测产品PGxOneTM包括SLCO1B1和LDLR，没有包括APOE的基因型检测，另外，在LDLR中仅包括rs5925和rs688。其他国内外针对他汀类的精准用药的基因型检测的产品主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。另外，这些方法所需的检测时间较长，耗费人力，从核酸提取到结果获取超过8小时，超过1天正常工作时间。荧光PCR法没有PCR后处理，大大节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。但传统的荧光PCR技术及产品往往只是针对单一位点设计，不能同时获得多个位点信息。
发明内容
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
[0010] 一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测SLCO1B1rs2306283、SLCO1B1rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的引物对和探针对；所述用于检测SLCO1B1rs2306283的引物对如SEQ ID NO：1～2所示，探针对如SEQ ID NO：3～4所示；用于检测SLCO1B1rs4149056的引物对如SEQ ID NO：5～6所示，探针对如SEQ ID NO：7～8所示；用于检测APOE rs7412的引物对如SEQ ID NO：9～10所示，探针对如SEQ ID NO：11～12所示；用于检测APOE rs429358的引物对如SEQ ID NO：13～14所示，探针对如SEQ ID NO：15～16所示；用于检测LDLR rs1433099的引物对如SEQ ID NO：17～18所示，探针对如SEQ ID NO：19～20所示；用于检测LDLR rs14158的引物对如SEQ ID NO：21～22所示，探针对如SEQ ID NO：23～24所示；用于检测LDLR rs688的引物对如SEQ ID NO：25～26所示，探针对如SEQ ID NO：27～28所示；用于检测LDLR rs6511720的引物对如SEQ ID NO：29～30所示，探针对如SEQ ID NO：31～32所示。
[0011] 发明人针对性的设计了多组引物对和探针对，其中，只有一组引物对和探针对能够特异性的同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变。
[0012] 优选地，所述试剂盒还包括2×TaqMan Master Mix。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括野生型质控模板、突变型质控模板、杂合型质控模板；更优选地，所述野生型质控模板，突变型质控模板、杂合型质控模板的制备如下：合成包含以上位点野生型和突变型的DNA片段，DNA片段被克隆到pBluescriptII SK(-)载体，转化大肠杆菌，对插入的DNA片段进行测序验证，正确后寄回甘油菌和5μg质粒干粉。
[0014] 优选地，所述试剂盒中各个引物对的浓度为0.5μM。
[0015] 本发明所述试剂盒适合应用于荧光定量PCR，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：浓度为0.5μM、体积为0.5～1.25μL的用于检测SLCO1B1rs2306283、SLCO1B1rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的引物对，浓度为0.25μM、体积为0.125～0.625μL的用于检测SLCO1B1rs2306283、SLCO1B1rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的探针对，5～15μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL。
[0016] 优选地，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
[0017] 本发明还提供所述试剂盒的应用，即利用所述试剂盒同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的方法，包括以下步骤：
[0018] S1.提取基因组DNA；S2.利用试剂盒中所述针对SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的探针对和引物对，对S1所述基因组DNA进行荧光定量PCR；S3.根据荧光定量PCR扩增结果进行结果判定；
[0019] 本发明针对每个位点分别设计了阳性突变型对照，杂合型对照，阴性野生型对照和空白无DNA模板对照。野生型应只检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)；纯合突变型应只检测出突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)；杂合型应检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)和突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)，而无模板阴性对照无平滑扩增曲线(Ct>38)。
[0020] 本发明所述PCR反应可以在ViiATM 7实时荧光定量PCR系统上进行，并使用2×TaqMan Master Mix。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022] 本发明提供了一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测SLCO1B1rs2306283、SLCO1B1rs4149056、APOE rs7412、APOE rs429358、LDLR rs1433099、LDLR rs14158、LDLR rs688、LDLR rs6511720位点的引物对和探针对，通过精心设计、多次验证、筛选和优化，获得了基于Taqman等位基因分辨分析法的特异性引物和探针，可以检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因的8个功能性变异；从DNA提取到荧光PCR，到结果获取小于4小时，手头操作时间小于2小时。含有这些引物对和探针对的试剂盒具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上等优点；本发明所述检测方法主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、瑞舒伐他汀等。附图说明
[0023] 图1是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*1B(rs2306283)位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断SLCO1B1*1B位点为纯合野生型(SLCO1B1*1B AA基因型)。
[0024] 图2是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*1B(rs2306283)位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断SLCO1B1*1B位点为杂合型(SLCO1B1*1B AG基因型)。
[0025] 图3是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*1B(rs2306283)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断SLCO1B1*1B位点为纯合突变型(SLCO1B1*1B GG基因型)。
[0026] 图4是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*5(rs4149056)位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断SLCO1B1*5位点为纯合野生型(SLCO1B1*5TT基因型)。
[0027] 图5是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*5(rs4149056)突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断SLCO1B1*5位点为杂合型(SLCO1B1*5TC基因型)。
[0028] 图6是实时荧光定量PCR检测SLCO1B1*5(rs4149056)突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断SLCO1B1*5位点为纯合突变型(SLCO1B1*5CC基因型)。
[0029] 图7是实时荧光定量PCR检测APOE rs7412位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs7412位点为纯合野生型(rs7412CC基因型)。
[0030] 图8是实时荧光定量PCR检测APOE rs7412突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs7412位点为杂合型(rs7412CT基因型)。
[0031] 图9是实时荧光定量PCR检测APOE rs7412突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs7412位点为纯合突变型(rs7412TT基因型)。
[0032] 图10是实时荧光定量PCR检测APOE rs429358位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs429358位点为纯合野生型(rs429358TT基因型)。
[0033] 图11是实时荧光定量PCR检测APOE rs429358突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs429358位点为杂合型(rs429358TC基因型)。
[0034] 图12是实时荧光定量PCR检测APOE rs429358突变位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs429358位点为纯合突变型(rs429358CC基因型)。
[0035] 图13是实时荧光定量PCR检测LDLR rs1433099位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs1433099位点为纯合野生型(rs1433099TT基因型)。
[0036] 图14是实时荧光定量PCR检测LDLR rs1433099突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs1433099位点为杂合型(rs1433099TC基因型)。
[0037] 图15是实时荧光定量PCR检测LDLR rs1433099突变位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs1433099位点为纯合突变型(rs1433099CC基因型)。
[0038] 图16是实时荧光定量PCR检测LDLR rs14158位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs14158位点为纯合野生型(rs14158GG基因型)。
[0039] 图17是实时荧光定量PCR检测LDLR rs14158突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs14158位点为杂合型(rs14158GA基因型)。
[0040] 图18是实时荧光定量PCR检测LDLR rs14158突变位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs14158位点为纯合突变型(rs14158AA基因型)。
[0041] 图19是实时荧光定量PCR检测LDLR rs688位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs688位点为纯合野生型(rs688CC基因型)。
[0042] 图20是实时荧光定量PCR检测LDLR rs688突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs688位点为杂合型(rs688CT基因型)。
[0043] 图21是实时荧光定量PCR检测LDLR rs688突变位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs688位点为纯合突变型(rs688TT基因型)。
[0044] 图22是实时荧光定量PCR检测LDLR rs6511720位点的扩增曲线，在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在VIC通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs6511720位点为纯合野生型(rs6511720GG基因型)。
[0045] 图23是实时荧光定量PCR检测LDLR rs6511720突变位点的扩增曲线，在VIC通道和FAM通道中均检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，判断rs6511720位点为杂合型(rs6511720GT基因型)。
[0046] 图24是实时荧光定量PCR检测LDLR rs6511720突变位点的扩增曲线，在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<32)，在FAM通道中无平滑扩增曲线(Ct>38)，判断rs6511720位点为纯合突变型(rs6511720TT基因型)。
具体实施方式
[0047] 下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
[0048] 实施例1引物和探针的设计
[0049] 特异性的基于Taqman等位基因分辨分析法的引物和探针见表1，同时表2和表3为另外两套基于Taqman等位基因分辨分析法的引物和探针，表2和表3所述引物和探针不能特异性检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变。
[0050] 表1 特异性引物和探针序列
[0051]
[0052]
[0053]
[0054] 表2 不能成功检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的引物和探针[0055]
[0056]
[0057] 实施例2荧光定量PCR检测过程
[0058] 1、采用8行×12列的96孔板设计，其中第1列到第8列分别检测8个临床样品，在第9列到12列装有相应阴性无DNA对照模板、野生型、突变型、杂合型质控模板，其具体设计如表4。
[0059] 表4 96孔PCR反应板的建议布局示例
[0060]
[0061] 注：S代表样本，S1到S8代表临床的8个样本；NTC代表没有装DNA样品的阴性对照孔W代表野生型质控模板；M代表突变型质控模板；H代表杂合型质控模板。
[0062] 其中，野生型质控模板，突变型质控模板、杂合型质控模板的制备如下：合成包含以上位点野生型和突变型的DNA片段，DNA片段被克隆到pBluescriptII SK(-)载体，转化大肠杆菌，对插入的DNA片段进行测序验证，正确后寄回甘油菌和5μg质粒干粉。
[0063] 2、根据表4的布局，对样品进行荧光定量PCR，具体过程如下：
[0064] (1)血液基因组DNA提取：使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为模板。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，即10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1mmol/L EDTA(PH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。
[0065] (2)特异性引物和荧光探针序列如表1所示(SEQ ID NO：1～32)。
[0066] (3)荧光定量PCR反应体系：(针对每个突变位点，其荧光定量PCR反应体系如表5，总体积25μL)(上海辉睿)在ViiATM 7实时荧光定量PCR系统上进行，使用Universal PCR Master Mix。
[0067] 表5 反应体系
[0068]成分 浓度 体积
PCR扩增模板(样品) 100ng/25μL
每条引物 0.5μM 0.5～1.25μL
每条探针 0.25μM 0.125～0.625μL
2×qPCR Master Mix 5～15μL
ddH2O 补至10～25μL
PCR扩增模板(样品) 100ng/25μL
每条引物 0.5μM 0.5～1.25μL
每条探针 0.25μM 0.125～0.625μL
2×qPCR Master Mix 5～15μL
ddH2O 补至10～25μL
[0069] 反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
[0070] (4)检测结果判定：
[0071] 如样品反应孔出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，阴性对照无平滑扩增曲线且循环数大于38为检测成功；如仅在野生等位基因探针所在的通道中检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如仅在突变等位基因探针所在的通道检出荧光扩增曲线且循环数小于35为纯合的，相应探针标记的基因型；如同时在野生等位基因探针和突变等位基因探针所在的通道中检出荧光扩增曲线且循环数小于35为杂合型。
[0072] 实施例3检测试剂盒的组装
[0073] 一种同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变的试剂盒，包含以下成分：浓度为0.5μM、体积为0.5～1.25μL的表1所述的各个引物(包括针对各个基因位点设计的正向引物和反向引物)，浓度为0.25μM、体积为0.125～0.625μL的表1所述的各个探针(包括针对各个基因位点设计的野生等位基因探针和突变等位基因探针)，5～15μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为10～25μL，反应体系总体积为10～25μL；野生型质控模板；突变型质控模板；杂合型质控模板。
[0074] 为了更简洁的说明上述试剂盒的组成，这里，给出一种组分实例，该试剂盒的成分如下：适当浓度和体积的样品基因组DNA，浓度为0.5μM、体积为0.5μL的表1所述的各个引物，浓度为0.25μM、体积为0.125μL的表1所述的各个探针，5μL 2×Taqman Master Mix，用双蒸水补足总体积为25μL。
[0075] 利用所述试剂盒进行同时检测SLCO1B1、APOE和LDLR基因多位点突变时，利用荧光定量PCR进行检测，所述荧光定量PCR的反应程序为：(i)95℃，10min；1个循环；(ii)95℃，10s；58℃，45s；40个循环；(iii)37℃，10s；1个循环。
[0076] 实施例4
[0077] 目前市面上在售的类似的基因多态性检测试剂盒与本发明检测方法和试剂盒的比较，结果如表6所示。
[0078] 表6本发明检测方法与多种市售试剂盒的比较
[0079]
[0080]
[0081] 实施例5临床样品检测
[0082] 选了510例冠心病患者，这些患者均使用他汀类药物治疗。用实施例4所述试剂盒检测这些患者的SLCO1B1*1B、SLCO1B1*5、APOE rs7412和rs429358、LDLR rs1433099、rs14158、rs688和rs6511720。并用Sanger测序的方法进行验证，计算阳性符合率和阴性符合率，结果如表7所示(针对具体的基因型，若患者例数小于30例，则对全部患者的全血进行测序，若患者例数大于30例，则选取其中的一部分患者全血作为测序样本，测序样本数均为30，例如，SLCO1B1*1B基因型为AA的患者为35例，在对其全血进行检测时，只选取30例作为检测样本，SLCO1B1*5基因型为CC的患者为8例，则对这8例患者的全血都进行检测)。
[0083] 表7 510例冠心病患者全血DNA检测结果统计
[0084]
[0085]
[0086] 表中，发生突变(突变型和杂合性)为阳性，野生型为阴性，阳性率和阴性率是Sanger测序检测结果例数/用于Sanger测序验证的例数的比值*％。
[0087] 阳性符合率(临床灵敏度)＝348/(2+348)＝99.4％；(左侧为示例数据)[0088] 阴性符合率(临床特异性)＝239/(239+1)＝99.5％；
[0089] 总符合率＝(348+239)/(348+2+1+239)＝99.4％。
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