靶向DEFA5抗体和用于诊断和治疗炎性肠病的测定方法
阅读：162发布：2020-09-07
专利汇可以提供靶向DEFA5抗体和用于诊断和治疗炎性肠病的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了靶向DEFA5 抗体 。靶向DEFA5抗体对DEFA5蛋白具有高度特异性，特别是对DEFA5蛋白的P、B和/或M结合位点的肽序列具有高度特异性。可将靶向DEFA5抗体掺入用于诊断和 治疗 患有炎性肠病的受试者的溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的测定。该测定可以在 试剂 盒 中提供。靶向DEFA5抗体可以用于测量从受试者收集的样品中的DEFA5或DEFA5表达的 水 平，并基于DEFA5或DEFA5表达的水平确定所述受试者是否患有溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的方法。治疗可以基于受试者是否患有溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的确定。，下面是靶向DEFA5抗体和用于诊断和治疗炎性肠病的测定方法专利的具体信息内容。
1. 一种在患有炎性肠病(IBD)或处于其风险下的患者中测量DEFA5蛋白的方法，所述
方法包括：
从所述患者获得样品；和
使用抗DEFA5抗体测量所述样品中DEFA5的表达和DEFA5的浓度中的至少一种。
2. 一种治疗患有炎性肠病(IBD)或处于其风险下的患者的方法，所述方法包括：
进行根据权利要求1在所述患者中测量DEFA5的方法；和
对所述患者进行干预以治疗克罗恩氏病。
3.权利要求1的方法，包括：将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏
病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度明显超
过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
4.权利要求2的方法，包括：将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏
病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度明显超
过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
5. 权利要求3-4中任何一项的方法，其中所述基准值为约1 ng/mL DEFA5。
6. 权利要求3-4中任何一项的方法，其中所述基准值为1 ng/mL DEFA5。
7.权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度超过
未患有克罗恩氏病的受试者典型的基准值。
8. 权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述样品中DEFA5的浓度超过约1 ng/mL。
9.权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述样品为肠组织，并且包括通过以下方法测
量DEFA5的浓度：用包含抗DEFA5抗体的抗DEFA5免疫染色剂对所述样品进行免疫染色；和测量所述样品中染色阳性的细胞百分比；其中所述样品中染色阳性的细胞百分比为至少20%。
10.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预对于治疗溃疡性结肠炎无效。
11.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预为给予药物，不包括手术。
12.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预为给予选自以下的药物：维生素补
充剂、抗炎药、皮质类固醇、泼尼松龙、甲基泼尼松龙，口服布地奈德、5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、抗TNF-α抗体、英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤、抗α4-整联蛋白抗体、那他珠单抗、维多珠单抗、抗白介素抗体、尤特克单抗、抗菌抗生素、环丙沙星、甲硝唑、抗胆碱能药、丙胺太林、双环胺、莨菪碱、胆汁酸螯合剂、消胆胺、考来替泊和考来维仑。
13.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预为给予选自以下的药物：维生素
B12、维生素D、钙、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤和那他珠单抗。
14.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预是肠内营养疗法。
15.权利要求2-4中任何一项的方法，其中所述干预为将所述受试者置于低脂饮食。
16. 一种治疗患有炎性肠病(IBD)或处于其风险下的患者的方法，所述方法包括：
进行根据权利要求1在所述患者中测量DEFA5的方法；和
对所述患者进行干预以治疗溃疡性结肠炎。
17.权利要求16的方法，包括：将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩
氏病的受试者典型的基准值进行比较，并且如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度未
明显超过基准值，则诊断为溃疡性结肠炎。
18. 权利要求16的方法，其中所述基准值为约1 ng/mL。
19. 权利要求16的方法，其中所述基准值为1 ng/mL。
20.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度低
于患有克罗恩氏病的受试者典型的基准值。
21. 权利要求20的方法，其中所述基准值为约1 ng/mL。
22. 权利要求20的方法，其中所述基准值为1 ng/mL。
23.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述样品中DEFA5的表达或浓度经测量显
著低于来自患有克罗恩氏病的受试者的对照样品中的表达或浓度。
24.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述样品为肠组织，并且包括通过以下方
法测量DEFA5的浓度：用包含抗DEFA5抗体的抗DEFA5免疫染色剂对所述样品进行免疫染色；
和测量所述样品中染色阳性的细胞百分比；其中所述样品中染色阳性的细胞百分比为少于
10%。
25.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述干预对于治疗克罗恩氏病无效。
26.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述干预为选自以下的手术：直肠结肠切
除术和回肠贮袋肛门吻合术。
27.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述干预为给予选自以下的药物：铁补充
剂、抗炎药、皮质类固醇、氢化可的松、可的松、泼尼松龙、5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、环孢菌素、抗TNF-α抗体、英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、甲氨蝶呤、抗α4-整联蛋白抗体、维多珠单抗、抗菌抗生素、环丙沙星、甲硝唑、栓剂美沙拉嗪、灌肠剂美沙拉嗪、奥沙拉嗪、巴沙拉嗪、灌肠剂布地奈德、他克莫司及任何前述的组合。
28.权利要求16-17中任何一项的方法，其中所述干预为给予选自以下的药物：环孢菌
素和戈利木单抗。
29. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体选自：来自ABCAM,
Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体[EPR14309(B)]；来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体(ab167591)；来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体[8C8] (目录号ab90802)；来自THERMO FISHER SCIENTIFIC INC.,
Waltham, MA的防御素5单克隆抗体(8C8) (目录号MA1-46026)；来自MILLIPORESIGMA,
Burlington, MA的抗α防御素-5 (DEFA5)抗体，克隆8C8 (目录号MABF31)；来自LSBIO,
Seattle, WA的防御素5抗体LS-C50934 (目录号LS-C50934-100)；来自NOVUS
BIOLOGICALS, Littleton, CO的防御素α5抗体(8C8) (目录号NB110-60002/NB110-
60002SS)；来自NOVUS BIOLOGICALS, Littleton, CO的防御素α5抗体(8C8) (目录号NBP1-
84282)；来自BIORBYT, Cambridge, United Kingdom的防御素α5抗体(目录号orb156565)；
来自BIOSS INC., Woburn, MA的防御素α5抗体(目录号bs-4313R)；来自GENETEX, INC.,
Irvine, CA的防御素α5抗体[N1C3] (目录号GTX116079)；来自ATLAS ANTIBODIES,
Bromma, Sweden的抗DEFA5抗体(HPA015775)；和来自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.,
Dallas, TX的α-防御素5抗体(目录号53997)。
30. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体是来自SANTA
CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Dallas, TX的α-防御素5抗体(目录号53997)。
31.权利要求1-4和12-13中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体是κ轻链多肽亚基。
32.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体对DEFA5表现出比
对以下蛋白中的一种或多种更高的亲和力：DEFA1、DEFA2、DEFA3、DEFA4和DEFA6。
33.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体对DEFA5表现出比
对DEFA1和DEFA6更高的亲和力。
34. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体对DEFA1和DEFA6
中的一者或两者的KDs (M)大于下列值之一：10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2和10−1。
35. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体对DEFA5的KDs (M)
小于下列值之一：10-12、10-11、10−10、10−9、10−8和10−7。
36.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体识别DEFA5上的P、B
和M结合位点中的一个或多个。
37. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体识别与SEQ ID
NO: 1的位置51-94具有至少90％序列同一性的表位结合区。
38. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体识别与SEQ ID
NO: 1的位置51-94具有100％序列同一性的表位结合区。
39. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体不识别与SEQ ID
NO: 1的位置1-49具有至少90％序列同一性的表位结合区。
40. 权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体不识别与SEQ ID
NO: 1的位置1-49具有100％序列同一性的表位结合区。
41.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体是哺乳动物抗体。
42.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体是抗人DEFA5抗体。
43.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体用作选自以下的测
定的一部分：放射免疫测定、免疫组织化学测定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析、ELISA测定、二维凝胶电泳、酶免疫测定、夹心免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫电泳测定。
44.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述抗DEFA5抗体用作酶联免疫吸附
测定（ELISA）的一部分。
45.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述样品是肠组织。
46.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述样品是粪便。
47.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述样品是血液。
48.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述样品是血清。
49.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述DEFA5是人DEFA5。
50.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中离体测量所述样品中DEFA5的表达或
DEFA5的浓度。
51.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中在体外测量所述样品中DEFA5的表达
或DEFA5的浓度。
52.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述患者患有IBD。
53.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述患者表现出严重腹泻、腹痛、疲
劳和体重减轻中的一种或多种。
54.权利要求1-4和16-17中任何一项的方法，其中所述患者表现出严重腹泻、腹痛、疲
劳和体重减轻。
55.用于测量样品中的DEFA5的试剂盒，该试剂盒包含：包含抗DEFA5抗体的测定；和样
品容器，其经配置以容纳选自以下的样品：粪便样品、血液样品、肠组织样品和血清样品。
56.权利要求55的试剂盒，其中所述试剂盒用于诊断炎性肠病。
57.权利要求55的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自以下的采样工具：粪便样品收集
器、血液样品收集器、血清样品收集器和肠组织收集器。
58.权利要求55的试剂盒，其包括采样工具，所述采样工具选自活检仪器、直肠灌洗试
剂盒、拭子、血液采样器和真空采血管。
59.一种在患有炎性肠病的受试者中诊断和治疗克罗恩氏病的方法，所述方法包括：
从所述患者获得样品；
使用对人DEFA5比对人DEFA1或人DEFA6具有更高亲和力的抗DEFA5抗体测量所述样品
中人DEFA5的浓度；
将所述样品中人DEFA5的浓度与未患克罗恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；
如果所述样品中DEFA5的浓度明显超过基准值，则诊断为克罗恩氏病；和
通过非手术干预治疗所述受试者的克罗恩氏病。
60.本文公开的新颖且非显而易见的实施方案和特征。
靶向DEFA5抗体和用于诊断和治疗炎性肠病的测定方法
[0002] 关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本发明在National Institute of Health授予的资助号R21DK095186、U54CA091408-
09S1、U54CA091408-09S2、U54RR026140、U54MD007593、UL1RR024975、UL1TR000445、
G12MD007586、U54CA163069、R24 DA036420和S10RR0254970下，在政府支持下进行。政府拥
有本发明的某些权利。
09S1、U54CA091408-09S2、U54RR026140、U54MD007593、UL1RR024975、UL1TR000445、
G12MD007586、U54CA163069、R24 DA036420和S10RR0254970下，在政府支持下进行。政府拥
有本发明的某些权利。
[0003] 在这种情况下，“政府”是指美利坚合众国政府。
[0004] 公开背景炎性肠病(IBD)为全部或部分消化道的慢性炎症。IBD的常见病因包括溃疡性结肠炎
(“UC”)和克罗恩氏病，也称为克罗恩氏结肠炎(“CD”或“CC”)。溃疡性结肠炎在大肠(即结肠和直肠)的最内衬里中引起慢性炎症和溃疡。克罗恩氏病引起消化道衬里的慢性炎症，其中
炎症超出衬里并进入受影响的组织。克罗恩氏病可影响小肠、大肠或这两者。
(“UC”)和克罗恩氏病，也称为克罗恩氏结肠炎(“CD”或“CC”)。溃疡性结肠炎在大肠(即结肠和直肠)的最内衬里中引起慢性炎症和溃疡。克罗恩氏病引起消化道衬里的慢性炎症，其中
炎症超出衬里并进入受影响的组织。克罗恩氏病可影响小肠、大肠或这两者。
[0005] UC和CD仅在美国就影响估计160万人，相关的年度健康护理费用超过63亿美元。尽管UC和CD两者均为IBD的类型，但UC或CD患者之间的差异具有重要意义。目前，临床医师为
了诊断CD和UC而对IBD患者使用不准确的组合分类(包括临床、内窥镜检查、放射学和组织
病理学)。尽管如此，在患有IBD的患者中区分UC或CD患者仍然具有太多挑战性，以致难以归
类为UC或CD的IBD患者的病例被归类为未定型结肠炎(“IC”)。尽管使用了应用临床、内窥镜检查、放射学和组织学工具的最先进分类系统，但仍有IBD患者的显著亚组被误诊或延迟了
正确诊断。实际上，据估计30%患有IBD的患者目前无法准确诊断为CD或UC。
了诊断CD和UC而对IBD患者使用不准确的组合分类(包括临床、内窥镜检查、放射学和组织
病理学)。尽管如此，在患有IBD的患者中区分UC或CD患者仍然具有太多挑战性，以致难以归
类为UC或CD的IBD患者的病例被归类为未定型结肠炎(“IC”)。尽管使用了应用临床、内窥镜检查、放射学和组织学工具的最先进分类系统，但仍有IBD患者的显著亚组被误诊或延迟了
正确诊断。实际上，据估计30%患有IBD的患者目前无法准确诊断为CD或UC。
[0006] 另外，在经受回肠贮袋肛门吻合术的结肠IDB病例中有15%被诊断为UC，随后将基于其术后随访、临床和组织病理学改变以及回肠贮袋中新生CD的发展将其初始诊断改为
CD。回肠贮袋肛门吻合术为一种通常适合于UC但不适合于CD的治疗，在手术切除结肠和直
肠之后恢复胃肠道的连续性，并涉及创建小肠贮袋以重建切除的直肠。
CD。回肠贮袋肛门吻合术为一种通常适合于UC但不适合于CD的治疗，在手术切除结肠和直
肠之后恢复胃肠道的连续性，并涉及创建小肠贮袋以重建切除的直肠。
[0008] 概述已经发现DEFA5蛋白(例如HD5)和DEFA5基因的表达可以用作确定患有IBD的患者是否
患有UC或CD的生物标志物。具体而言，已经鉴定并发现了抗DEFA5抗体，其对与DEFA5结合具
有高特异性而与其他防御素蛋白结合不是如此，这对于在受试者中鉴定DEFA5作为生物标
志物是非常有利的。
患有UC或CD的生物标志物。具体而言，已经鉴定并发现了抗DEFA5抗体，其对与DEFA5结合具
有高特异性而与其他防御素蛋白结合不是如此，这对于在受试者中鉴定DEFA5作为生物标
志物是非常有利的。
[0009] 在第一方面，公开了一种在患有炎性肠病(IBD)或处于炎性肠病(IBD)风险下的患者中测量DEFA5蛋白的方法。该方法包括使用抗DEFA5抗体测量来自受试者的样品中DEFA5
或DEFA5表达的水平。
或DEFA5表达的水平。
[0010] 在第二方面，公开了一种治疗患有IBD或处于IBD风险下的患者的方法。该方法包括使用抗DEFA5抗体测量来自受试者的样品中DEFA5或DEFA5表达的水平，和对患者进行干
预以治疗克罗恩氏病。该方法可以进一步包括将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与
未患克罗恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5
的浓度明显超过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
预以治疗克罗恩氏病。该方法可以进一步包括将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与
未患克罗恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5
的浓度明显超过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
[0011] 在第三方面，提供了一种诊断患有CD或处于CD风险下的受试者的方法，其包括使用抗DEFA5抗体测量来自受试者的样品中DEFA5或DEFA5表达的水平；将所述样品中DEFA5的
表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品
中DEFA5的表达或DEFA5的浓度明显超过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品
中DEFA5的表达或DEFA5的浓度明显超过基准值，则诊断为克罗恩氏病。
[0012] 在第四方面，公开了一种用于治疗患有UC或处于UC风险下的患者的方法。该方法包括进行根据第一方面的在患者中测量DEFA5的方法；和对患者进行干预以治疗溃疡性结
肠炎。该方法可以进一步包括将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏病
的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度不明显超
过基准值，则诊断为溃疡性结肠炎。
肠炎。该方法可以进一步包括将所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度与未患克罗恩氏病
的受试者典型的基准值进行比较；和如果所述样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度不明显超
过基准值，则诊断为溃疡性结肠炎。
[0013] 在第五方面，提供了一种用于测量样品中的DEFA5的试剂盒。该试剂盒包括含有抗DEFA5抗体的测定；和样品容器，其经配置以容纳选自以下的样品：粪便样品、血液样品、肠组织样品和血清样品。该试剂盒可以用于炎性肠病的诊断和随后的治疗。该试剂盒包含本
文作为免疫测定的一部分公开的任何抗DEFA5抗体。该抗体可以被标记、缀合、截短或以其
他方式修饰以在测定中起作用，如本领域已知的。该试剂盒可进一步包括样品容器和采样
工具中的一种或多种。该容器和采样工具可以被配置为收集和存储各种类型的样品，其包
括粪便样品、血液样品、血清样品、直肠灌洗样品和活检样品。采样工具可以是活检仪器、直肠灌洗试剂盒、拭子、血液采样器和真空采血管中的任何一种。
文作为免疫测定的一部分公开的任何抗DEFA5抗体。该抗体可以被标记、缀合、截短或以其
他方式修饰以在测定中起作用，如本领域已知的。该试剂盒可进一步包括样品容器和采样
工具中的一种或多种。该容器和采样工具可以被配置为收集和存储各种类型的样品，其包
括粪便样品、血液样品、血清样品、直肠灌洗样品和活检样品。采样工具可以是活检仪器、直肠灌洗试剂盒、拭子、血液采样器和真空采血管中的任何一种。
[0014] 在第六方面，提供了一种在患有炎性肠病的受试者中诊断和治疗克罗恩氏病的方法。该方法包括从所述患者获得样品；使用对人DEFA5比对人DEFA1或人DEFA6具有更高亲和
力的抗DEFA5抗体测量所述样品中人DEFA5的浓度；将所述样品中DEFA5的浓度与未患克罗
恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；如果所述样品中DEFA5的浓度明显超过基准值，则
诊断为克罗恩氏病；和通过非手术干预治疗所述受试者的克罗恩氏病。
力的抗DEFA5抗体测量所述样品中人DEFA5的浓度；将所述样品中DEFA5的浓度与未患克罗
恩氏病的受试者典型的基准值进行比较；如果所述样品中DEFA5的浓度明显超过基准值，则
诊断为克罗恩氏病；和通过非手术干预治疗所述受试者的克罗恩氏病。
[0015] 以上呈现简化的概述，以便提供所要求保护的主题的一些方面的基本理解。此概述不是广泛的综述。其并非旨在标识关键或重要的要素或者描绘所要求保护的主题的范
围。其唯一目的是以简化的形式呈现概念，作为稍后呈现的更详细描述的序言。
围。其唯一目的是以简化的形式呈现概念，作为稍后呈现的更详细描述的序言。
[0017] 图2A示出了DEFA5的一级序列与HD1和HD6的一级序列的比对。
[0018] 图2B是显示DEFA5抗体表位以将IBD患者血清中的前DEFA5与成熟蛋白区分开的示意图。
[0019] 图2C是用于检测IBD患者血清中的前DEFA5和成熟DEFA5的夹心ELISA的模型。
[0020] 图3A示出了21名被诊断为溃疡性结肠炎、未定型结肠炎或克罗恩氏病的受试者的初始诊断信息。
[0021] 图3B示出了在图3A的初始诊断信息之后9.4年重新评估的21名受试者的诊断信息。
[0022] 图4A-4C是来自用各种疗法治疗的患者的DEFA5组织样品的组织学染色。
[0023] 图4D是未改变其原始诊断的溃疡性结肠炎RPC和IPAA手术患者与那些从溃疡性结肠炎改变为重新的克罗恩氏病的患者的染色斑点计数的定量。
[0024] 图5A-5I示出了在平行切片上对于潘氏细胞(PC)的典型形态学外观的组织学染色，包括致密的顶端嗜酸性颗粒的存在。
[0025] 图6A-6J示出了PC、溶酶体和DEFA5的双重组织学染色。
[0026] 图7A示出了中度UC和CC样品中DEFA5转录物水平的定量。
[0028] 图7C示出了各种IBD疾病状态中的DEFA5水平。
[0030] 图8A-8F示出了结肠切除组织的代表性H＆E染色。
[0031] 图9A-9D示出了来自CC患者(A和B)和UC患者(C和D)的相邻正常和患病组织中DEFA5的IHC和H＆E染色。
[0032] 图10A-10C示出了IBD患者血清中DEFA5的检测和可获得的DEFA5抗体的特异性。
[0033] 图11A和11B示出了按性别和种族从IBD和非IBD患者收集的新鲜冷冻组织和血液样品的分布。
[0034] 详细描述除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开领域的
普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解的是，术语，比如在常用词典中定义的那
些，应解释为具有与其在说明书的上下文中的含义一致的含义，并且除非本文明确如此定
义，否则不应以理想化或过于正式的含义进行解释。为了简洁或清楚起见，可能不会详细描
述众所周知的功能或构造。
普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解的是，术语，比如在常用词典中定义的那
些，应解释为具有与其在说明书的上下文中的含义一致的含义，并且除非本文明确如此定
义，否则不应以理想化或过于正式的含义进行解释。为了简洁或清楚起见，可能不会详细描
述众所周知的功能或构造。
[0035] 本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在为限制性的。本文使用的单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指明。
[0036] 术语“基本上由……组成”意指除了所列举的要素之外，所要求保护的内容还可含有不会不利地影响所要求保护的内容对于本公开所述的其预期目的的可操作性的其他要
素(步骤、结构、成分、组件等)。该术语排除不利地影响所要求保护的内容对于本公开所述
的其预期目的的可操作性的这种其他要素，即使这种其他要素可能会增强所要求保护的内
容对于一些其他目的的可操作性。
素(步骤、结构、成分、组件等)。该术语排除不利地影响所要求保护的内容对于本公开所述
的其预期目的的可操作性的这种其他要素，即使这种其他要素可能会增强所要求保护的内
容对于一些其他目的的可操作性。
[0037] 术语“约”和“大约”通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受的误差或变化的程度。典型示例性的误差或变化的程度在给定值或值范围的20%之内，优选地在10%之内，和更优选地在5%之内。对于生物学系统，术语“约”是指可接受的误差的标准偏差，优选地不超过给定值的2倍。除非另外说明，否则该详细描述中的数量为近似的，这意味着
当没有明确说明时可推断出术语“约”或“大约”。
当没有明确说明时可推断出术语“约”或“大约”。
[0038] 本文使用的术语“个体”、“受试者”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，比如小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马、灵长类动物和人类。该术语可指定为雄性或雌性或两者，或者排除雄性或雌性。
[0039] 本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指在疾病状态或病症的临床表现发作之后开始的作用过程(比如给予化合物或药用组合物)，以消除或减少疾病状态或病症的这种临床表现。这种治疗不一定是绝对有用的。
[0040] 术语“第一”、“第二”等在本文中用于描述各种特征或要素，但是这些特征或要素不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个特征或要素与另一个特征或要素。因此，以下讨论的第一特征或要素可称为第二特征或要素，并且类似地，以下讨论的第二特征
或要素可称为第一特征或要素，而不背离本公开的讲授。
或要素可称为第一特征或要素，而不背离本公开的讲授。
[0041] DEFA5为一种小型杀微生物先天免疫系统蛋白，属于哺乳动物防御素肽的α防御素家族。DEFA5在各种组织中表达，并且特别是在粘膜表面上表达。DEFA5由基因DEFA5编码。
DEFA5参与宿主防御机制，并且在小肠(回肠)的潘氏细胞的分泌颗粒中高度表达。如同大多
数分泌蛋白一样，DEFA5作为前原-DEFA5 (1-94)合成，后者首先经受蛋白水解加工，变为非
活性的前-DEFA5 (20-94)、DEFA5 (23-94)和DEFA5 (29-94)。在组织内发现DEFA5 (23-94)
和DEFA5 (29-94)，而DEFA5 (20-94)为主要的细胞内形式。然后将前DEFA5加工成两种活性
或成熟形式，DEFA5 (56-94)和DEFA5 (63-94)，其中DEFA5 (63-94)为最丰富的形式。DEFA5
的这些成熟形式为富含半胱氨酸的宿主防御肽，发挥广谱抗微生物活性，并助于人类肠道
的先天免疫力。本文使用的DEFA5可指DEFA5的仅成熟形式。
DEFA5参与宿主防御机制，并且在小肠(回肠)的潘氏细胞的分泌颗粒中高度表达。如同大多
数分泌蛋白一样，DEFA5作为前原-DEFA5 (1-94)合成，后者首先经受蛋白水解加工，变为非
活性的前-DEFA5 (20-94)、DEFA5 (23-94)和DEFA5 (29-94)。在组织内发现DEFA5 (23-94)
和DEFA5 (29-94)，而DEFA5 (20-94)为主要的细胞内形式。然后将前DEFA5加工成两种活性
或成熟形式，DEFA5 (56-94)和DEFA5 (63-94)，其中DEFA5 (63-94)为最丰富的形式。DEFA5
的这些成熟形式为富含半胱氨酸的宿主防御肽，发挥广谱抗微生物活性，并助于人类肠道
的先天免疫力。本文使用的DEFA5可指DEFA5的仅成熟形式。
[0042] 本文描述了使用抗DEFA5抗体的方法，其中该抗DEFA5抗体被用于检测、测量和/或治疗患有IBD的患者。抗DEFA5抗体与DEFA5形成复合物，其在生理条件下相对稳定。特异性
结合的特征可在于平衡解离常数为至少约1x10-6 M或更小(例如，较小的KD表示更紧密的结
合)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如平衡透
析、表面等离子体共振等。但是，抗DEFA5抗体可与其他抗原(例如来自其他物种的DEFA5分
子)表现出交叉反应性。此外，如本文所用，结合DEFA5和一种或多种其他抗原的多特异性抗
体(例如，双特异性抗体)仍然被认为是抗DEFA5抗体。如本文所用，“抗DEFA5抗体”是在预期的结合条件(例如，生理条件)下与DEFA5形成稳定复合物的抗体。
结合的特征可在于平衡解离常数为至少约1x10-6 M或更小(例如，较小的KD表示更紧密的结
合)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如平衡透
析、表面等离子体共振等。但是，抗DEFA5抗体可与其他抗原(例如来自其他物种的DEFA5分
子)表现出交叉反应性。此外，如本文所用，结合DEFA5和一种或多种其他抗原的多特异性抗
体(例如，双特异性抗体)仍然被认为是抗DEFA5抗体。如本文所用，“抗DEFA5抗体”是在预期的结合条件(例如，生理条件)下与DEFA5形成稳定复合物的抗体。
[0043] 抗DEFA5抗体可以各种亲和力水平与DEFA5结合。抗DEFA5抗体的一个实施方案是高亲和力抗DEFA5抗体。术语“高亲和力”抗体是指与DEFA5具有至少10-10 M、优选10-11 M、甚至更优选10-12 M的结合亲和力的抗体，如通过表面等离子体共振例如BIACORE™或溶液-亲
和力ELISA测量的。
和力ELISA测量的。
[0044] 抗DEFA5抗体可以高亲和力与DEFA5结合(“高亲和力抗DEFA5抗体”)。如本文所用，“高亲和力抗DEFA5抗体”是具有高结合亲和力的抗体。“高结合亲和力”是指表位与单个互补位(抗原结合位点)结合的高强度。与具有较低亲和力的抗体相比，具有高结合亲和力的
抗体更快地与抗原结合，在测定中允许更高的灵敏度，并且更好地保持与互补位的结合。本
文所述的抗DEFA5抗体与DEFA5的结合亲和力可以至少低至10−7、10−8、10−9、10−10、10−11或10−12 KDs (M)或其任何范围或子值，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，或抗体、抗体结合片段或分子相互作用的平衡解离常数。可以通过获得特定抗体-抗原相互
作用的解离速率常数(koff值)以及特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数来计算平衡解
离。较低的KD值表示较高的结合亲和力。
抗体更快地与抗原结合，在测定中允许更高的灵敏度，并且更好地保持与互补位的结合。本
文所述的抗DEFA5抗体与DEFA5的结合亲和力可以至少低至10−7、10−8、10−9、10−10、10−11或10−12 KDs (M)或其任何范围或子值，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，或抗体、抗体结合片段或分子相互作用的平衡解离常数。可以通过获得特定抗体-抗原相互
作用的解离速率常数(koff值)以及特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数来计算平衡解
离。较低的KD值表示较高的结合亲和力。
[0045] 本文所述的抗DEFA5抗体也可以对DEFA5具有高特异性。“特异性”是指结合特定抗原而不结合其他抗原的能力。抗DEFA5抗体的一些实施方案显示出对DEFA5的亲和力超过对
一种或多种相关蛋白的显示出的亲和力；这样的相关蛋白可以包括DEFA1、DEFA2、DEFA3、
DEFA4和DEFA6中的一种或多种。这些是在多个物种中发现的相关嗜中性粒细胞防御素。典
型的人嗜中性粒细胞防御素1蛋白(DEFA1)描述于UniProt登录号P59665，其序列在本文中
以SEQ ID NO: 2提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素2蛋白(DEFA2)描述于UniProt登录号
P59665，其序列在本文中以SEQ ID NO: 3提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素3蛋白
(DEFA3)描述于UniProt登录号P59666，其序列在本文中以SEQ ID NO: 4提供。典型的人嗜
中性粒细胞防御素4蛋白(DEFA4)描述于UniProt登录号P12838，其序列在本文中以SEQ ID
NO: 5提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素6蛋白(DEFA6)描述于UniProt登录号P12838，其
序列在本文中以SEQ ID NO: 6提供。高特异性抗DEFA5抗体的其他实施方案显示出对DEFA5
比对DEFA1、DEFA6或两者更高的亲和力。在一个实施方案中，抗DEFA5抗体对DEFA5具有高特
异性，并且不结合或基本不结合HD1和HD6 (即，对其具有低或无结合亲和力)。抗DEFA5抗体
可对HD1和/或HD6具有大于约10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、10−1 KDs (M)或或其任何范围或子值的结合亲和力。抗DEFA5抗体对DEFA1和DEFA6中的一者或两者的KDs
(M)可大于下列值之一：10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2和10−1。抗DEFA5抗体可识别与SEQ ID NO: 1的位置51-94具有至少80%、85%、90%、92%、94%、96%或98%序列同一性的表位结合区。抗DEFA5抗体可以识别与SEQ ID NO: 1的位置51-94具有100%序列同一性的
表位结合区。抗DEFA5抗体的一些实施方案不识别与SEQ ID NO: 1的位置1-49具有至少
80%、85%、90%、92%、94%、96%或98%序列同一性的表位结合区。抗DEFA5抗体的具体实施方案不识别与SEQ ID NO: 1的位置1-49具有100%序列同一性的表位结合区。
一种或多种相关蛋白的显示出的亲和力；这样的相关蛋白可以包括DEFA1、DEFA2、DEFA3、
DEFA4和DEFA6中的一种或多种。这些是在多个物种中发现的相关嗜中性粒细胞防御素。典
型的人嗜中性粒细胞防御素1蛋白(DEFA1)描述于UniProt登录号P59665，其序列在本文中
以SEQ ID NO: 2提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素2蛋白(DEFA2)描述于UniProt登录号
P59665，其序列在本文中以SEQ ID NO: 3提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素3蛋白
(DEFA3)描述于UniProt登录号P59666，其序列在本文中以SEQ ID NO: 4提供。典型的人嗜
中性粒细胞防御素4蛋白(DEFA4)描述于UniProt登录号P12838，其序列在本文中以SEQ ID
NO: 5提供。典型的人嗜中性粒细胞防御素6蛋白(DEFA6)描述于UniProt登录号P12838，其
序列在本文中以SEQ ID NO: 6提供。高特异性抗DEFA5抗体的其他实施方案显示出对DEFA5
比对DEFA1、DEFA6或两者更高的亲和力。在一个实施方案中，抗DEFA5抗体对DEFA5具有高特
异性，并且不结合或基本不结合HD1和HD6 (即，对其具有低或无结合亲和力)。抗DEFA5抗体
可对HD1和/或HD6具有大于约10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、10−1 KDs (M)或或其任何范围或子值的结合亲和力。抗DEFA5抗体对DEFA1和DEFA6中的一者或两者的KDs
(M)可大于下列值之一：10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2和10−1。抗DEFA5抗体可识别与SEQ ID NO: 1的位置51-94具有至少80%、85%、90%、92%、94%、96%或98%序列同一性的表位结合区。抗DEFA5抗体可以识别与SEQ ID NO: 1的位置51-94具有100%序列同一性的
表位结合区。抗DEFA5抗体的一些实施方案不识别与SEQ ID NO: 1的位置1-49具有至少
80%、85%、90%、92%、94%、96%或98%序列同一性的表位结合区。抗DEFA5抗体的具体实施方案不识别与SEQ ID NO: 1的位置1-49具有100%序列同一性的表位结合区。
[0046] 可市购的抗DEFA5抗体的实例包括：来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体[EPR14309(B)]；来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素
抗体(ab167591)；来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体[8C8] (目
录号ab90802)；来自THERMO FISHER SCIENTIFIC INC., Waltham, MA的防御素5单克隆抗
体(8C8) (目录号MA1-46026)；来自MILLIPORESIGMA, Burlington, MA的抗α防御素-5
(DEFA5)抗体，克隆8C8 (目录号MABF31)；来自LSBIO, Seattle, WA的防御素5抗体LS-
C50934 (目录号LS-C50934-100)；来自NOVUS BIOLOGICALS, Littleton, CO的防御素α5抗
体(8C8) (目录号NB110-60002/NB110-60002SS)；来自NOVUS BIOLOGICALS, Littleton,
CO的防御素α5抗体(8C8) (目录号NBP1-84282)；来自BIORBYT, Cambridge, United
Kingdom的防御素α5抗体(目录号orb156565)；来自BIOSS INC., Woburn, MA的防御素α5抗
体(目录号bs-4313R)；来自GENETEX, INC., Irvine, CA的防御素α5抗体[N1C3] (目录号
GTX116079)；来自ATLAS ANTIBODIES, Bromma, Sweden的抗DEFA5抗体(HPA015775)；来自
R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN的DEFA5抗体(目录号972207.111或CSL 1450400)；和来自
SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Dallas, TX的α-防御素5抗体(目录号53997)等等。
抗体(ab167591)；来自ABCAM, Cambridge, United Kingdom的抗α5防御素抗体[8C8] (目
录号ab90802)；来自THERMO FISHER SCIENTIFIC INC., Waltham, MA的防御素5单克隆抗
体(8C8) (目录号MA1-46026)；来自MILLIPORESIGMA, Burlington, MA的抗α防御素-5
(DEFA5)抗体，克隆8C8 (目录号MABF31)；来自LSBIO, Seattle, WA的防御素5抗体LS-
C50934 (目录号LS-C50934-100)；来自NOVUS BIOLOGICALS, Littleton, CO的防御素α5抗
体(8C8) (目录号NB110-60002/NB110-60002SS)；来自NOVUS BIOLOGICALS, Littleton,
CO的防御素α5抗体(8C8) (目录号NBP1-84282)；来自BIORBYT, Cambridge, United
Kingdom的防御素α5抗体(目录号orb156565)；来自BIOSS INC., Woburn, MA的防御素α5抗
体(目录号bs-4313R)；来自GENETEX, INC., Irvine, CA的防御素α5抗体[N1C3] (目录号
GTX116079)；来自ATLAS ANTIBODIES, Bromma, Sweden的抗DEFA5抗体(HPA015775)；来自
R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN的DEFA5抗体(目录号972207.111或CSL 1450400)；和来自
SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Dallas, TX的α-防御素5抗体(目录号53997)等等。
[0047] 在一个实施方案中，抗DEFA5抗体是来自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Dallas, TX的α-防御素5抗体(目录号53997)。令人惊讶地，已经发现α-防御素5抗体(目录
号53997)对于测量样品中的DEFA5和DEFA5表达的水平特别有利。具体而言，α-防御素5抗体
(目录号53997)对DEFA5表现出高亲和力和高特异性，包括对HD5的高亲和力和高特异性以
及对其他防御素(例如HD1-HD4或HD6)的低至无的亲和力和特异性。抗DEFA5抗体可以是κ轻
链多肽亚基。在一些实施方案中，抗DEFA5抗体是哺乳动物抗体，例如人抗体或犬抗体。
号53997)对于测量样品中的DEFA5和DEFA5表达的水平特别有利。具体而言，α-防御素5抗体
(目录号53997)对DEFA5表现出高亲和力和高特异性，包括对HD5的高亲和力和高特异性以
及对其他防御素(例如HD1-HD4或HD6)的低至无的亲和力和特异性。抗DEFA5抗体可以是κ轻
链多肽亚基。在一些实施方案中，抗DEFA5抗体是哺乳动物抗体，例如人抗体或犬抗体。
[0048] 公开了一种诊断受试者的溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的方法。受试者可患有IBD。该方法包括使用抗DEFA5抗体测量来自受试者的样品中α-防御素5 (“DEFA5”)或DEFA5表达
的水平，和如果DEFA5的水平或表达指示患有克罗恩氏病的受试者，则诊断受试者为患有克
罗恩氏病；或如果DEFA5的水平或表达指示患有溃疡性结肠炎的受试者，则诊断受试者为患
有溃疡性结肠炎。样品可以从任何合适的来源中获取用于测量DEFA5浓度、DEFA5表达水平，
例如来自肠例如来自大肠或直肠的组织样品。在本公开中，术语“DEFA5的表达”应理解为意指DEFA5基因的表达；“DEFA5的水平”应理解为意指DEFA5蛋白的浓度。
的水平，和如果DEFA5的水平或表达指示患有克罗恩氏病的受试者，则诊断受试者为患有克
罗恩氏病；或如果DEFA5的水平或表达指示患有溃疡性结肠炎的受试者，则诊断受试者为患
有溃疡性结肠炎。样品可以从任何合适的来源中获取用于测量DEFA5浓度、DEFA5表达水平，
例如来自肠例如来自大肠或直肠的组织样品。在本公开中，术语“DEFA5的表达”应理解为意指DEFA5基因的表达；“DEFA5的水平”应理解为意指DEFA5蛋白的浓度。
[0049] 样品可取自患有IBD或处于其风险下的受试者。受试者可表现出一种或多种IBD的特征性症状，比如严重腹泻、腹痛、疲劳和体重减轻。在该方法的一些实施方案中，受试者表现出一种以上所述症状。在其他实施方案中，受试者表现出2、3或4种所述症状。
[0050] 已经发现DEFA5在患有UC和CD的受试者中差异表达。以这种方式使用，可以使用靶向DEFA5抗体来利用和测量DEFA5浓度和DEFA5表达，作为区分IBD患者的UC和CD的生物标志
物。由于回肠贮袋肛门吻合术在临床上在患有UC的患者中比在患有CD的患者中成功得多，
因此可以使用回肠贮袋肛门吻合术治疗被鉴定为具有指示UC的DEFA5水平或没有CD的患
者。确实，由于DEFA5仅由潘氏细胞产生，因此不会期望在结肠中发现分泌DEFA5的潘氏细
胞。已经发现在患有CC的受试者中大量发现了潘氏细胞(分泌DEFA5)。另一方面，被鉴定为
具有指示CD的DEFA5和DEFA5表达的水平的患者可以用用于CD的任何适合治疗来治疗。在一
个实施方案中，诊断步骤例如诊断患有UC或CD的受试者是任选的。
物。由于回肠贮袋肛门吻合术在临床上在患有UC的患者中比在患有CD的患者中成功得多，
因此可以使用回肠贮袋肛门吻合术治疗被鉴定为具有指示UC的DEFA5水平或没有CD的患
者。确实，由于DEFA5仅由潘氏细胞产生，因此不会期望在结肠中发现分泌DEFA5的潘氏细
胞。已经发现在患有CC的受试者中大量发现了潘氏细胞(分泌DEFA5)。另一方面，被鉴定为
具有指示CD的DEFA5和DEFA5表达的水平的患者可以用用于CD的任何适合治疗来治疗。在一
个实施方案中，诊断步骤例如诊断患有UC或CD的受试者是任选的。
[0051] 抗DEFA5抗体可以具有与如图2所示的DEFA5的P、B和M结合位点的每个或全部DEFA5序列互补的互补决定区(CDR)。如本文所用，“与...互补”意指CDR能够在预期的结合
条件(例如，生理条件)下与靶序列(例如，P、B或M结合位点)形成稳定的复合物。
条件(例如，生理条件)下与靶序列(例如，P、B或M结合位点)形成稳定的复合物。
[0052] 在另一个实施方案中，抗体可以是与互补于DEFA5的P、B和M结合位点的多肽序列具有一定程度同一性的抗体。例如，抗体可以与DEFA5的P、B和M结合位点的多肽序列的互补
多肽序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%同一性。
多肽序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%同一性。
[0053] 与其他α防御素相比，本文公开的抗体的一些实施方案更特异性地靶向DEFA5。图1说明了相对于丽春红S对照，可市购的DEFA5抗体对纯化的HD1-HD6蛋白的特异性的斑点印
迹。如本文所用，就其靶标而言，在抗体的上下文中使用的术语“特异性”或相似术语是指与靶抗原特异性结合的抗体(与其他抗原例如HD1、HD2、HD3、HD4和HD6相反)。本发明抗体的这种较高的DEFA5特异性将允许例如更容易和更准确测试来自受试者的样品中的DEFA5水平
或表达。
迹。如本文所用，就其靶标而言，在抗体的上下文中使用的术语“特异性”或相似术语是指与靶抗原特异性结合的抗体(与其他抗原例如HD1、HD2、HD3、HD4和HD6相反)。本发明抗体的这种较高的DEFA5特异性将允许例如更容易和更准确测试来自受试者的样品中的DEFA5水平
或表达。
[0054] 据信，在患有中度和重度CD的患者中DEFA5的激活途径可存在功能障碍，因此过量的非活性形式DEFA5是患有CD的患者中炎症的潜在机制。该过量的非活性形式DEFA5可导致
对上皮衬里的损害增加，甚至可能导致肠道菌群的水平和组成失调。
对上皮衬里的损害增加，甚至可能导致肠道菌群的水平和组成失调。
[0055] 方法可包括将DEFA5的水平与基准值进行比较的步骤。基准值可为基于在一个或多个被确定未患UC或CD的受试者群体中观察到的水平的集中趋势的量度。例如，基准值可
为在来自未患UC、未患CD或两者的受试者群体的样品中观察到的基因表达或蛋白浓度的平
均水平。群体可根据患者的地理位置、年龄、种族、性别和病史中的一项或多项来定义。基准值可考虑变化的量度和集中趋势的量度的组合。例如，基准值可为在给定肿瘤群体中观察
到的基因表达或蛋白浓度的平均水平，加上或减去误差幅度。基准可基于原始测量(比如每
百万次读取的每kb基因长度的mRNA或cDNA片段)或标准化测量(比如正常表达的%，或者与
组成型表达或广泛表达的基因(具有通常一致的表达)，比如β-肌动蛋白相比较的表达)。合
适的基准值的实例是约1 ng/mL DEFA5或恰好1 ng/mL DEFA5。
为在来自未患UC、未患CD或两者的受试者群体的样品中观察到的基因表达或蛋白浓度的平
均水平。群体可根据患者的地理位置、年龄、种族、性别和病史中的一项或多项来定义。基准值可考虑变化的量度和集中趋势的量度的组合。例如，基准值可为在给定肿瘤群体中观察
到的基因表达或蛋白浓度的平均水平，加上或减去误差幅度。基准可基于原始测量(比如每
百万次读取的每kb基因长度的mRNA或cDNA片段)或标准化测量(比如正常表达的%，或者与
组成型表达或广泛表达的基因(具有通常一致的表达)，比如β-肌动蛋白相比较的表达)。合
适的基准值的实例是约1 ng/mL DEFA5或恰好1 ng/mL DEFA5。
[0056] 基准还可通过分析与来自受试者的样品一起测量的对照样品来建立。合适的对照样品的实例为：来自未患UC的受试者的样品、来自未患CD的受试者的样品、来自患有UC (尽
管未患CD)的受试者的样品、来自患有CD (尽管未患UC)的受试者的样品、来自患有憩室炎
(尽管未患UC或CD)的受试者的样品和来自未患IBD的受试者的样品。在一些实施方案中，基
准值水平可为正常水平，比如下文所述。
管未患CD)的受试者的样品、来自患有CD (尽管未患UC)的受试者的样品、来自患有憩室炎
(尽管未患UC或CD)的受试者的样品和来自未患IBD的受试者的样品。在一些实施方案中，基
准值水平可为正常水平，比如下文所述。
[0057] 在一个实施方案中，在患有IBD的患者中差异诊断UC和CD的测定方法包括测量从患者获得的样品中存在的DEFA5或DEFA5表达的水平。组织中DEFA5或MMP-7浓度或表达的水
平可通过任何合适的肽分析来测量。例如，测量步骤可包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、阳
离子交换、NMR分析、全基因组转录组分析和质谱中的一种或多种。方法可包括将样品中
DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表达明显小于或明显
大于基准值，则作出诊断。例如，方法可包括将样品中DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表达明显大于基准值，则作出CD诊断。作为另一个实例，方
法可包括将样品中DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表
达不明显大于基准值，则作出UC诊断。样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度的测量可以在离
体或体外相同测量。
平可通过任何合适的肽分析来测量。例如，测量步骤可包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、阳
离子交换、NMR分析、全基因组转录组分析和质谱中的一种或多种。方法可包括将样品中
DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表达明显小于或明显
大于基准值，则作出诊断。例如，方法可包括将样品中DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表达明显大于基准值，则作出CD诊断。作为另一个实例，方
法可包括将样品中DEFA5的浓度或表达与基准进行比较，并且如果样品中DEFA5的浓度或表
达不明显大于基准值，则作出UC诊断。样品中DEFA5的表达或DEFA5的浓度的测量可以在离
体或体外相同测量。
[0058] 基于显著性的多种已知统计检验中的任何一种，可认为表达或浓度的差异为显著的。这些通常基于从取样群体进行的测量的集合，并且受群体规模和取样规模两者的影响。
这种统计检验为本领域众所周知的，并且本公开中不再进一步详述；可依靠外部参考来使
得本领域的技术人员能够确定统计显著性，比如Rosener’s Fundamentals of
Biostatistics, 8th ed. (2015), Cengage Learning, Boston, MA。
这种统计检验为本领域众所周知的，并且本公开中不再进一步详述；可依靠外部参考来使
得本领域的技术人员能够确定统计显著性，比如Rosener’s Fundamentals of
Biostatistics, 8th ed. (2015), Cengage Learning, Boston, MA。
[0059] 在一个实施方案中，在患有IBD的患者中差异诊断UC和CD的测定方法包括测量从患者获得的样品中存在的DEFA5或DEFA5表达的水平。可以通过使用本文公开的靶向DEFA5
抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量组织中的DEFA5或DEFA5表达的水平。该方法包括
如果DEFA5或DEFA5表达处于指示患者不患有CD的任何水平，例如小于DEFA5的5x正常水平，
或DEFA5或DEFA5表达的小于约5x-30x正常水平，则诊断患者为患有UC。在一个实施方案中，
如果DEFA5表达的水平低于每10 ng RNA小于3x106个DEFA5 mRNA转录物，则诊断患者为患
有UC。如果DEFA5表达水平处于指示患者患有CD的任何水平，例如每10 ng RNA约3x106至
1.2×108个DEFA5 mRNA转录物，则所述诊断可以诊断患者为患有CD。本文使用的DEFA5或
DEFA5表达的“正常水平”意指来自未患CD或UC的受试者或患有IBD (并且具体地讲为UC)的
受试者的消化道组织中DEFA5或DEFA5表达的水平。正常的DEFA5表达可指每10 ng RNA
1x105-9x105个DEFA5 mRNA转录物，或每10 ng RNA约6x105个DEFA5 mRNA转录物。
抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量组织中的DEFA5或DEFA5表达的水平。该方法包括
如果DEFA5或DEFA5表达处于指示患者不患有CD的任何水平，例如小于DEFA5的5x正常水平，
或DEFA5或DEFA5表达的小于约5x-30x正常水平，则诊断患者为患有UC。在一个实施方案中，
如果DEFA5表达的水平低于每10 ng RNA小于3x106个DEFA5 mRNA转录物，则诊断患者为患
有UC。如果DEFA5表达水平处于指示患者患有CD的任何水平，例如每10 ng RNA约3x106至
1.2×108个DEFA5 mRNA转录物，则所述诊断可以诊断患者为患有CD。本文使用的DEFA5或
DEFA5表达的“正常水平”意指来自未患CD或UC的受试者或患有IBD (并且具体地讲为UC)的
受试者的消化道组织中DEFA5或DEFA5表达的水平。正常的DEFA5表达可指每10 ng RNA
1x105-9x105个DEFA5 mRNA转录物，或每10 ng RNA约6x105个DEFA5 mRNA转录物。
[0060] 在一个实施方案中，测定方法包括关于DEFA5的活性和/或表达或者受DEFA5调控的多肽的活性和/或表达，确定受试者的状态。在一个实施方案中，这种方法包括用本文公
开的靶向DEFA5抗体确定来自受试者的样品中DEFA5或者受DEFA5调控的多肽的表达或活性
的水平。方法可进一步包括从受试者收集样品。如本文使用的，经受测试的生物样品为源自
受试者的样品，并且包括(但不限于)任何生物材料，比如体液。体液的实例包括(但不限于)
全血、血清、唾液、组织浸润物、胸腔积液、肺灌洗液、支气管肺泡灌洗液等。生物流体可为培养细胞的细胞培养基或上清液。例如，样品可为肠组织、粪便、血液或血清。在实施方案中，生物样品从受试者的结肠收集。
开的靶向DEFA5抗体确定来自受试者的样品中DEFA5或者受DEFA5调控的多肽的表达或活性
的水平。方法可进一步包括从受试者收集样品。如本文使用的，经受测试的生物样品为源自
受试者的样品，并且包括(但不限于)任何生物材料，比如体液。体液的实例包括(但不限于)
全血、血清、唾液、组织浸润物、胸腔积液、肺灌洗液、支气管肺泡灌洗液等。生物流体可为培养细胞的细胞培养基或上清液。例如，样品可为肠组织、粪便、血液或血清。在实施方案中，生物样品从受试者的结肠收集。
[0061] 该方法的一些实施方案包括通过选择性地对来自受试者的样品进行染色或着色并测量来自染色剂的信号来测量DEFA5的浓度。染色剂或染料可包含本文公开的任何抗
DEFA5抗体。染色剂或染料还可包含报告分子，比如比色基团、放射性核素、稳定同位素、荧光团、生色团、酶、磁性颗粒和量子点。然后可通过观察来自报告分子的信号来测量DEFA5的浓度，比如通过显微术、比色法、放射测量、荧光检查、趋磁性或前述的任何组合。在该方法的一个具体的实施方案中，通过用识别DEFA5的免疫染色剂对样品进行免疫染色并通过显
微术计数染色细胞的数量来测量DEFA5的浓度。该方法具有相对简单的优势，并且仅需要典
型临床实验室中已经存在的设备类型。可基于染色阳性的细胞阈值数量(比如至少10%、20%
和30%)作出诊断。如果DEFA5染色的细胞数量明显高于阈值，则可作出CD诊断；然而如果
DEFA5染色的细胞数量明显低于阈值，则可作出UC诊断。
DEFA5抗体。染色剂或染料还可包含报告分子，比如比色基团、放射性核素、稳定同位素、荧光团、生色团、酶、磁性颗粒和量子点。然后可通过观察来自报告分子的信号来测量DEFA5的浓度，比如通过显微术、比色法、放射测量、荧光检查、趋磁性或前述的任何组合。在该方法的一个具体的实施方案中，通过用识别DEFA5的免疫染色剂对样品进行免疫染色并通过显
微术计数染色细胞的数量来测量DEFA5的浓度。该方法具有相对简单的优势，并且仅需要典
型临床实验室中已经存在的设备类型。可基于染色阳性的细胞阈值数量(比如至少10%、20%
和30%)作出诊断。如果DEFA5染色的细胞数量明显高于阈值，则可作出CD诊断；然而如果
DEFA5染色的细胞数量明显低于阈值，则可作出UC诊断。
[0062] 其中DEFA5活性和/或表达与对照或基准值不同(增加或降低)或者由DEFA5调控的多肽的活性与对照或基准值相比较不同的那些受试者，确定患有与DEFA5活性增加或降低
相关或者以其为特征的疾病状态和病况，或者处于其风险下。
相关或者以其为特征的疾病状态和病况，或者处于其风险下。
[0063] 可用于确定样品中的表达或活性的水平的测定技术为已知的。这种测定方法包括(但不限于)放射免疫测定、逆转录酶PCR (RT-PCR)测定、免疫组织化学测定、原位杂交测
定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析、ELISA测定和蛋白质组学方法、二维凝胶电泳(2D电泳)和基于非凝胶的方法，比如质谱或蛋白质相互作用分析。测定还包括(但不限于)使用技术
比如放射免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心免疫测定、沉淀素
反应、凝胶扩散反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和免疫电泳测定的竞争和非竞争测定系统。对于免疫测定方法的实
例，参见美国专利第4845026号和美国专利第5006459号。本文公开的任何抗DEFA5抗体可以
在测定中。
定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析、ELISA测定和蛋白质组学方法、二维凝胶电泳(2D电泳)和基于非凝胶的方法，比如质谱或蛋白质相互作用分析。测定还包括(但不限于)使用技术
比如放射免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心免疫测定、沉淀素
反应、凝胶扩散反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和免疫电泳测定的竞争和非竞争测定系统。对于免疫测定方法的实
例，参见美国专利第4845026号和美国专利第5006459号。本文公开的任何抗DEFA5抗体可以
在测定中。
[0064] 可将抗DEFA5抗体掺入ELISA测定中以用于诊断方法。另外，通常制备报告抗体。报告抗体连接于可检测试剂，比如放射性、荧光或酶试剂，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸
酶。在ELISA的一个实施方案中，为了进行ELISA，将抗DEFA5抗体在结合抗体的固体支持物
上进行温育。然后通过与非特异性蛋白一起温育，覆盖皿上的任何游离蛋白结合位点。接下
来，将待分析的样品与固体支持物一起温育，在此期间抗DEFA5抗体结合DEFA5。未结合的样
品用缓冲液洗掉。引入特异性地针对抗原并与可检测试剂连接的报告抗体，导致报告抗体
与同抗原结合的任何抗体结合。然后洗掉未连接的报告抗体。然后加入用于检测报告抗体
的存在的试剂。然后测定可检测试剂以确定存在的抗原的量。在一个备选实施方案中，将抗
原与固体支持物一起温育，随后与一种或多种抗体一起温育，其中至少一种抗体包含可检
测试剂。定量结果可通过参考标准曲线获得。
酶。在ELISA的一个实施方案中，为了进行ELISA，将抗DEFA5抗体在结合抗体的固体支持物
上进行温育。然后通过与非特异性蛋白一起温育，覆盖皿上的任何游离蛋白结合位点。接下
来，将待分析的样品与固体支持物一起温育，在此期间抗DEFA5抗体结合DEFA5。未结合的样
品用缓冲液洗掉。引入特异性地针对抗原并与可检测试剂连接的报告抗体，导致报告抗体
与同抗原结合的任何抗体结合。然后洗掉未连接的报告抗体。然后加入用于检测报告抗体
的存在的试剂。然后测定可检测试剂以确定存在的抗原的量。在一个备选实施方案中，将抗
原与固体支持物一起温育，随后与一种或多种抗体一起温育，其中至少一种抗体包含可检
测试剂。定量结果可通过参考标准曲线获得。
[0065] 在患有IBD的患者中治疗IBD的方法可包括：(a) 用抗DEFA5抗体测量从患者获得的样品中存在的DEFA5或DEFA5表达的水平，借以获得DEFA5或DEFA5表达的水平；(b) 如果
DEFA5或DEFA5表达的水平处于指示患者未患CD的水平下，则用适合于UC的医学治疗来治疗
患者的IBD；如果DEFA5或DEFA5表达的水平处于指示患者患有CD的水平下，则用适合于CD的
医学治疗来治疗患者的IBD。
DEFA5或DEFA5表达的水平处于指示患者未患CD的水平下，则用适合于UC的医学治疗来治疗
患者的IBD；如果DEFA5或DEFA5表达的水平处于指示患者患有CD的水平下，则用适合于CD的
医学治疗来治疗患者的IBD。
[0066] 适合于UC的医学治疗包括回肠贮袋肛门吻合术或者给予药物或其盐。合适的药物可为以下一种或多种：铁补充剂；口服5-氨基水杨酸盐，比如美沙拉嗪、巴沙拉嗪和奥沙拉
嗪；抗炎药；皮质类固醇；免疫抑制剂，比如硫唑嘌呤、巯嘌呤、甲氨蝶呤和环孢菌素；抗TNF-α抗体，比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗；抗α4-整联蛋白抗体，比如维多珠单抗；以及抗菌抗生素，比如环丙沙星和甲硝唑。有时用于治疗UC的手术包括全直肠结肠切除
术和回肠贮袋肛门吻合术。注意，与UC形成对比，认为回肠贮袋肛门吻合术在用于治疗CD时
相对无效。还应该指出，环孢菌素和戈利木单抗尽管目前在美国被批准用于治疗UC，但目前
尚未批准用于治疗CD。该方法的一些实施方案涉及进行治疗UC有效但治疗CD无效或尚未得
到监管机构批准用于治疗CD的干预。
嗪；抗炎药；皮质类固醇；免疫抑制剂，比如硫唑嘌呤、巯嘌呤、甲氨蝶呤和环孢菌素；抗TNF-α抗体，比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗；抗α4-整联蛋白抗体，比如维多珠单抗；以及抗菌抗生素，比如环丙沙星和甲硝唑。有时用于治疗UC的手术包括全直肠结肠切除
术和回肠贮袋肛门吻合术。注意，与UC形成对比，认为回肠贮袋肛门吻合术在用于治疗CD时
相对无效。还应该指出，环孢菌素和戈利木单抗尽管目前在美国被批准用于治疗UC，但目前
尚未批准用于治疗CD。该方法的一些实施方案涉及进行治疗UC有效但治疗CD无效或尚未得
到监管机构批准用于治疗CD的干预。
[0067] 适合于CD的医学治疗包括给予药物或其盐。合适的药物包括：口服5-氨基水杨酸盐，比如美沙拉嗪；维生素补充剂，比如维生素B-12补充剂和维生素D补充剂；矿物质补充
剂，比如钙补充剂；抗炎药；皮质类固醇，比如泼尼松和布地奈德；免疫抑制剂，比如硫唑嘌呤、他克莫司、甲氨蝶呤和巯嘌呤；抗TNF-α抗体，比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和聚乙二醇结合赛妥珠单抗；抗α4-整联蛋白抗体，比如那他珠单抗和维多珠单抗；抗白介素抗体，比如尤特克单抗；以及抗菌抗生素，比如甲硝唑和环丙沙星。尽管聚乙二醇结合赛妥珠单抗、
甲氨蝶呤和那他珠单抗在美国批准用于治疗CD，但其目前尚未批准用于治疗UC。有时使用
手术方法来治疗重度CD病例。这种手术包括造口术、结肠造口术、回肠造口术、肠切除术、结肠切除术、直肠结肠切除术和狭窄成形术。在该方法的一些实施方案中，受试者使用对CD管
理有利但对UC管理不一定有利的饮食进行治疗。一种这样的饮食为低脂饮食。该方法的一
些实施方案涉及进行治疗CD有效但治疗UC无效或尚未得到监管机构批准用于治疗UC的干
预。干预可以是药物的给予，但不包括手术。药物的给予可以是选自以下的药物的给予：维
生素补充剂、抗炎药、皮质类固醇、泼尼松龙、甲基泼尼松龙，口服布地奈德、5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、抗TNF-α抗体、英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤、抗α4-整联蛋白抗体、那他珠单抗、维多珠单抗、抗白介素抗体、尤特克单抗、抗菌抗生素、环丙沙星、甲硝唑抗胆碱能药、丙胺太林、双环胺、莨菪碱、胆汁酸螯合剂、消胆胺、考来替泊和考来维仑。药物的给予可以是选自以下的药物、维生素或矿物质
的给予：维生素B12、维生素D、钙、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤和那他珠单抗。干预可以是肠内营养疗法，包括基本饮食和非基本饮食，例如通过鼻胃管饲喂。在一个实施方案
中，在可能被诊断为UC但在测量DEFA5或DEFA5表达水平时诊断为患有IC的患者中，DEFA5或
DEFA5表达的水平可升高至高于正常水平。这些患者可用任何适合于UC的医学治疗进行治
疗。干预可为使受试者接受低脂饮食或高纤维饮食。
剂，比如钙补充剂；抗炎药；皮质类固醇，比如泼尼松和布地奈德；免疫抑制剂，比如硫唑嘌呤、他克莫司、甲氨蝶呤和巯嘌呤；抗TNF-α抗体，比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和聚乙二醇结合赛妥珠单抗；抗α4-整联蛋白抗体，比如那他珠单抗和维多珠单抗；抗白介素抗体，比如尤特克单抗；以及抗菌抗生素，比如甲硝唑和环丙沙星。尽管聚乙二醇结合赛妥珠单抗、
甲氨蝶呤和那他珠单抗在美国批准用于治疗CD，但其目前尚未批准用于治疗UC。有时使用
手术方法来治疗重度CD病例。这种手术包括造口术、结肠造口术、回肠造口术、肠切除术、结肠切除术、直肠结肠切除术和狭窄成形术。在该方法的一些实施方案中，受试者使用对CD管
理有利但对UC管理不一定有利的饮食进行治疗。一种这样的饮食为低脂饮食。该方法的一
些实施方案涉及进行治疗CD有效但治疗UC无效或尚未得到监管机构批准用于治疗UC的干
预。干预可以是药物的给予，但不包括手术。药物的给予可以是选自以下的药物的给予：维
生素补充剂、抗炎药、皮质类固醇、泼尼松龙、甲基泼尼松龙，口服布地奈德、5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、抗TNF-α抗体、英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤、抗α4-整联蛋白抗体、那他珠单抗、维多珠单抗、抗白介素抗体、尤特克单抗、抗菌抗生素、环丙沙星、甲硝唑抗胆碱能药、丙胺太林、双环胺、莨菪碱、胆汁酸螯合剂、消胆胺、考来替泊和考来维仑。药物的给予可以是选自以下的药物、维生素或矿物质
的给予：维生素B12、维生素D、钙、聚乙二醇结合赛妥珠单抗、甲氨蝶呤和那他珠单抗。干预可以是肠内营养疗法，包括基本饮食和非基本饮食，例如通过鼻胃管饲喂。在一个实施方案
中，在可能被诊断为UC但在测量DEFA5或DEFA5表达水平时诊断为患有IC的患者中，DEFA5或
DEFA5表达的水平可升高至高于正常水平。这些患者可用任何适合于UC的医学治疗进行治
疗。干预可为使受试者接受低脂饮食或高纤维饮食。
[0068] 适合于UC的干预可以是选自以下药物的给予：铁补充剂、抗炎药、皮质类固醇、氢化可的松、可的松、泼尼松龙、5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、环孢菌素、抗TNF-α抗体、英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、甲氨蝶呤、抗α4-整联蛋白抗体、维多珠单抗、抗菌抗生素、环丙沙星、甲硝唑、栓剂美沙拉嗪、灌肠剂美沙拉嗪、奥沙拉嗪、巴沙拉嗪、灌肠剂布地奈德、他克莫司及任何前述的组合。适合于UC的干预可以是选自环孢菌素
和戈利木单抗的药物的给予。
和戈利木单抗的药物的给予。
[0069] 提供一种用于测量受试者的DEFA5的试剂盒。该试剂盒可用于以上提供的几种方法以及其他方法中。试剂盒可例如用于诊断炎性肠病。试剂盒包含用于测量DEFA5浓度和
DEFA5表达中的至少一种的测定。试剂盒可包括包含抗DEFA5抗体的测定；和样品容器，其经
配置以容纳选自以下的样品：粪便样品、血液样品、肠组织样品和血清样品。第一测定可以
包括选自以下的样品收集器：粪便样品收集器、血液样品收集器、血清样品收集器和肠组织
收集器。
DEFA5表达中的至少一种的测定。试剂盒可包括包含抗DEFA5抗体的测定；和样品容器，其经
配置以容纳选自以下的样品：粪便样品、血液样品、肠组织样品和血清样品。第一测定可以
包括选自以下的样品收集器：粪便样品收集器、血液样品收集器、血清样品收集器和肠组织
收集器。
[0070] 图1示出了相对于丽春红S对照，可市购的DEFA5抗体对纯化的HD1-HD6蛋白的特异性的斑点印迹。据信，本发明实施方案的靶向DEFA5抗体比这些可市购抗体具有更高的特异
性，使得例如不需要样品中的DEFA5的纯化或使其纯化最少。如本文所用，就其靶标而言，在抗体的上下文中使用的术语“特异性”或相似术语是指与靶抗原特异性结合的抗体(与其他
抗原例如HD1、HD2、HD3、HD4和HD6相反)。本发明抗体的这种较高的DEFA5特异性将允许例如更容易和更准确测试来自受试者的样品中的DEFA5水平或表达。
性，使得例如不需要样品中的DEFA5的纯化或使其纯化最少。如本文所用，就其靶标而言，在抗体的上下文中使用的术语“特异性”或相似术语是指与靶抗原特异性结合的抗体(与其他
抗原例如HD1、HD2、HD3、HD4和HD6相反)。本发明抗体的这种较高的DEFA5特异性将允许例如更容易和更准确测试来自受试者的样品中的DEFA5水平或表达。
[0071] 图2A示出了DEFA5的一级序列与HD1和HD6的一级序列的比对。图2B是显示DEFA5抗体表位以将IBD患者血清中的前DEFA5与成熟蛋白区分开的示意图。图2C是用于检测IBD患
者血清中的前DEFA5和成熟DEFA5的夹心ELISA的模型。图3A和3B示出了IBD临床环境中的诊
断不确定性和不准确性的问题。图3A显示21名IC患者被随访了大约十年。在10年期结束时，
仍无法将28.5%的患者划分为UC或CC的精确诊断。图3B显示了67名UC RPC手术患者，其在术
后9.4年(范围8-13年)平均随访后进行了后续重新评估。这些患者中有30%需要变更诊断为
重新的克罗恩氏病。
者血清中的前DEFA5和成熟DEFA5的夹心ELISA的模型。图3A和3B示出了IBD临床环境中的诊
断不确定性和不准确性的问题。图3A显示21名IC患者被随访了大约十年。在10年期结束时，
仍无法将28.5%的患者划分为UC或CC的精确诊断。图3B显示了67名UC RPC手术患者，其在术
后9.4年(范围8-13年)平均随访后进行了后续重新评估。这些患者中有30%需要变更诊断为
重新的克罗恩氏病。
[0072] 图4A-4D显示了DEFA5水平可用于确定患者对IPAA的候选资格。图4A显示了来自RPC手术患者的代表性结果，该患者在手术后没有改变诊断并且使用DEFA5 IHC进行了分子
测试。图B显示了来自UC RPC和IPAA手术患者的代表性结果，这些患者的确将诊断从UC改变
为重新的克罗恩氏病，使用DEFA5 IHC进行了分子测试。图4C显示了NL-回肠，对照。图4D显
示了未改变其原始诊断的UC RPC和IPAA手术患者与那些从UC改变为重新的克罗恩氏病的
患者的NEARAS DEFA5 IHC染色斑点计数的定量。(Ctrl 1 –染色对照，UC –溃疡性结肠炎，CC –克罗恩氏结肠炎，DV –憩室炎，DVL –憩室病)。
测试。图B显示了来自UC RPC和IPAA手术患者的代表性结果，这些患者的确将诊断从UC改变
为重新的克罗恩氏病，使用DEFA5 IHC进行了分子测试。图4C显示了NL-回肠，对照。图4D显
示了未改变其原始诊断的UC RPC和IPAA手术患者与那些从UC改变为重新的克罗恩氏病的
患者的NEARAS DEFA5 IHC染色斑点计数的定量。(Ctrl 1 –染色对照，UC –溃疡性结肠炎，CC –克罗恩氏结肠炎，DV –憩室炎，DVL –憩室病)。
[0073] 图5A-5I示出了在平行切片上对于潘氏细胞(PC)的典型形态学外观的组织学染色，包括致密的顶端嗜酸性颗粒的存在。上图：图5A，憩室炎(DV，无PC)；图5B，憩室病(DVL，无PC)；图5C，正常(NL-结肠，对照，无PC)。中图：图5D，UC (在一名患者中发现前驱PC，箭头)。图5E，CC，显示了遍布结肠基底隐窝(箭头)的大量PC。图5F，正常(NL-回肠，对照)，具有大量PC。下图：结肠中潘氏细胞标志物α-防御素5(DEFA5)和溶菌酶(LYZ)的IHC检测。图5G，NL-结肠；图5H，CC；和图5I，NL-回肠，对照。
[0074] 图6A-6J示出了在平行切片上对于潘氏细胞(PC)的典型形态学外观的H&E染色，包括致密的顶端嗜酸性颗粒的存在。上图：图6A，憩室炎(DV，无PC)；图6B，憩室病(DVL，无PC)；
图6C，正常(NL-结肠，对照，无PC)。中图：图6D，UC (在一名患者中发现前驱PC，箭头)。图6E，CC，显示了遍布结肠基底隐窝(箭头)的大量PC。图6F，正常(NL-回肠，对照)，具有大量PC。下图：结肠中潘氏细胞标志物α-防御素5(DEFA5)和溶菌酶(LYZ)的IHC检测。图6G，NL-结肠；图
6H，CC；和图6I，NL-回肠，对照。
图6C，正常(NL-结肠，对照，无PC)。中图：图6D，UC (在一名患者中发现前驱PC，箭头)。图6E，CC，显示了遍布结肠基底隐窝(箭头)的大量PC。图6F，正常(NL-回肠，对照)，具有大量PC。下图：结肠中潘氏细胞标志物α-防御素5(DEFA5)和溶菌酶(LYZ)的IHC检测。图6G，NL-结肠；图
6H，CC；和图6I，NL-回肠，对照。
[0075] 图7A-7J显示了PC、溶酶体和DEFA5的双重染色。示出了来自重新的克罗恩氏病(图7A和7D)和正常回肠/对照(图7G)的双重染色分析。垂直显示图像去卷积以评估溶菌酶特异
性永固红(图7B、7E和7H)和DEFA5α-特异性DAB (图7C、7F和7I)。缺少PC的正常结肠图像(图
7J)没有通过双重染色进一步处理。
性永固红(图7B、7E和7H)和DEFA5α-特异性DAB (图7C、7F和7I)。缺少PC的正常结肠图像(图
7J)没有通过双重染色进一步处理。
[0076] 工作实施例1工作实施例1表明，可通过使用本文所述的DEFA5抗体检查人的结肠切除术组织、结肠
活检和/或血清中的DEFA5水平，在分子上区分人UC和CC。此外，工作实施例1描绘了UC和CC
之间细微差异的潜在机制。准确区分CC与UC的能力是重大的和具有临床重要性，对于胃肠
病医师和结直肠外科医师尤其有意义，尤其是在决定是否需要对IBD患者进行恢复性直肠
结肠切除术手术之前。
活检和/或血清中的DEFA5水平，在分子上区分人UC和CC。此外，工作实施例1描绘了UC和CC
之间细微差异的潜在机制。准确区分CC与UC的能力是重大的和具有临床重要性，对于胃肠
病医师和结直肠外科医师尤其有意义，尤其是在决定是否需要对IBD患者进行恢复性直肠
结肠切除术手术之前。
[0077] 方法无法准确地区分克罗恩氏病(CC)与UC导致表示为IC的不准确诊断，这极大地影响了患
者的医疗和手术护理。在IC患者的试验队列中以及在接受RPC手术的UC患者中，对DEFA5表
达进行了初步评估。这显示了DEFA5水平以及在较小程度上DEFA6水平在CC患者样品中较
高。初步数据表明，在IC患者的组织或来自RPC手术UC患者(其实际上是CC)的那些中检测
DEFA5在那么否则被误诊的患者中更准确地将CC和UC区别开。
者的医疗和手术护理。在IC患者的试验队列中以及在接受RPC手术的UC患者中，对DEFA5表
达进行了初步评估。这显示了DEFA5水平以及在较小程度上DEFA6水平在CC患者样品中较
高。初步数据表明，在IC患者的组织或来自RPC手术UC患者(其实际上是CC)的那些中检测
DEFA5在那么否则被误诊的患者中更准确地将CC和UC区别开。
[0078] 临床样品为了显示IBD患者中异常的DEFA5表达是区分CC与UC的更可靠的诊断方法，探索了在诊
断为UC、CC和IC组织的IBD患者样品中检测DEFA5作为CC的生物标志物的潜力。图11A和图
11B示出了按性别和种族从IBD和非IBD患者收集的新鲜冷冻组织和血液样品的分布。图11A
示出了按女性、男性、白人和黑人对组织样品的分类，显示了组织样品(732个样品)，以及图
11B示出了作为女性、男性、白人和黑人对血清样品(186个样品)的分类。将样品储存在-80
摄氏度。对诊断为UC、CC和IC组织的患者样品进行免疫组织化学(IHC)和半定量RT-PCR，以
评估在诊断为UC、CC和IC组织的IBD患者样品中检测DEFA5作为CC的生物标志物的潜力。如
图11A和11B所示，收集了来自按种族和性别分布的IBD和健康个体的总共732个组织和186
个血清。这些组织是在Vanderbilt University Medical Center (VUMC)来自具有UC和CC
的明确和清楚诊断的同意成年人以及来自诊断为IC的那些的手术结肠切除术组织。这些患
者样品的收集已获得Meharry Medical College (MMC)和VUMC IRB Committees的批准。按
照IBD亚型的确立标准在MMC和VUMC由病理学组分析组织的整个厚度。对于每个样品，均回
顾性地回顾了与患者人口统计学、手术前后的变量、监视内窥镜和临床发现以及医疗和手
术治疗史相关的医学数据。实验样品取自结肠的各个部分。
断为UC、CC和IC组织的IBD患者样品中检测DEFA5作为CC的生物标志物的潜力。图11A和图
11B示出了按性别和种族从IBD和非IBD患者收集的新鲜冷冻组织和血液样品的分布。图11A
示出了按女性、男性、白人和黑人对组织样品的分类，显示了组织样品(732个样品)，以及图
11B示出了作为女性、男性、白人和黑人对血清样品(186个样品)的分类。将样品储存在-80
摄氏度。对诊断为UC、CC和IC组织的患者样品进行免疫组织化学(IHC)和半定量RT-PCR，以
评估在诊断为UC、CC和IC组织的IBD患者样品中检测DEFA5作为CC的生物标志物的潜力。如
图11A和11B所示，收集了来自按种族和性别分布的IBD和健康个体的总共732个组织和186
个血清。这些组织是在Vanderbilt University Medical Center (VUMC)来自具有UC和CC
的明确和清楚诊断的同意成年人以及来自诊断为IC的那些的手术结肠切除术组织。这些患
者样品的收集已获得Meharry Medical College (MMC)和VUMC IRB Committees的批准。按
照IBD亚型的确立标准在MMC和VUMC由病理学组分析组织的整个厚度。对于每个样品，均回
顾性地回顾了与患者人口统计学、手术前后的变量、监视内窥镜和临床发现以及医疗和手
术治疗史相关的医学数据。实验样品取自结肠的各个部分。
[0079] 对IBD患者的临床回顾性研究显示持续的诊断不确定性。
[0080] 在2000年和2007年之间，在VUMC的IBD中心对21名被诊断为IC的患者队列进行了回顾性研究，平均随访时间为8.7±3.7(范围4-14)年。在2014年，对这些患者进行了重新评
估，以确定诊断是分辨为UC还是CC。对最初的临床结果不了解的三名GI病理学家对每名患
者进行了重新评估，并且新诊断被呈现为主治医师之间的共识。病理学重新评估的结论是，
6名患者(28.5%)的诊断仍为IC，因为仍不能将其描述为UC或CC。同时43%和28.5%分别被分
辨为UC和CC(图3A)。在另一项回顾性研究中，在2001年和2008年之间，对120名具有“确定
性”UC的患者进行了RPC联合IPAA手术。在120名患者中，在具有功能可接受的贮袋的9.4
(范围8-13)年的平均随访时间后，对67名的诊断进行了重新评估。如图3B所示，最初的UC诊
断的30%改变为重新克罗恩氏病(重新CD)。总之，这强调了至少30%的IBD病例的持续诊断不
确定性，因此更需要更可靠的诊断程序。
估，以确定诊断是分辨为UC还是CC。对最初的临床结果不了解的三名GI病理学家对每名患
者进行了重新评估，并且新诊断被呈现为主治医师之间的共识。病理学重新评估的结论是，
6名患者(28.5%)的诊断仍为IC，因为仍不能将其描述为UC或CC。同时43%和28.5%分别被分
辨为UC和CC(图3A)。在另一项回顾性研究中，在2001年和2008年之间，对120名具有“确定
性”UC的患者进行了RPC联合IPAA手术。在120名患者中，在具有功能可接受的贮袋的9.4
(范围8-13)年的平均随访时间后，对67名的诊断进行了重新评估。如图3B所示，最初的UC诊
断的30%改变为重新克罗恩氏病(重新CD)。总之，这强调了至少30%的IBD病例的持续诊断不
确定性，因此更需要更可靠的诊断程序。
[0081] DEFA5在CC和UC中的差异表达。
[0082] 使用了两种方法，即训练和独立测试集，以识别在UC和CC中差异表达的基因或其产物。在训练测试集中，根据制造商的说明书(Affymetrix, Santa Clara, CA)，利用
Affymetrix基因表达阵列使用RNA进行全转录组微阵列，所述RNA从来自UC和CC患者(n=5)
的全厚度结肠样品中提取并合并。来自憩室炎的组织用作对照。这项分析表明，总共484个
基因是两种疾病之间上调或下调的抗微生物肽和粘蛋白。在使用微阵列技术(Affymetrix,
Santa Clara, CA)进行的测试集分析中，DEFA5水平增加最多：在CC中为UC的31倍(p<
7.23E-05)，表2。在独立的测试集中，使用专门靶向炎症基因的PCR阵列(NanoString
Technologies Inc., Seattle, WA)独立验证了基因表达概况分析。发现在来自具有与测
试集中相同疾病活动度的UC和CC患者的不同结肠样品中，DEFA5在CC中也增加至UC中的118
倍(p< 0.001)。表3。在微阵列和PCR阵列中均出现的唯一基因是DEFA5。在上调的基因中有
α-防御素5、其他抗微生物肽和粘蛋白(表2)。HD5增加最大：在CC为UC的31倍(在先前的测试中，HD5在CC中增加至UC中的118倍——表3)。表2中可见完整的微阵列结果列表。表2显示来
自AFFYMETRIX cDNA微阵列的靶标的列表。在微阵列中突出显示了总共484个基因，作为区
分UC与CC的潜在标志物。显示在两种疾病之间的最大倍数变化的基因是人类防御素5
(HD5)。
Affymetrix基因表达阵列使用RNA进行全转录组微阵列，所述RNA从来自UC和CC患者(n=5)
的全厚度结肠样品中提取并合并。来自憩室炎的组织用作对照。这项分析表明，总共484个
基因是两种疾病之间上调或下调的抗微生物肽和粘蛋白。在使用微阵列技术(Affymetrix,
Santa Clara, CA)进行的测试集分析中，DEFA5水平增加最多：在CC中为UC的31倍(p<
7.23E-05)，表2。在独立的测试集中，使用专门靶向炎症基因的PCR阵列(NanoString
Technologies Inc., Seattle, WA)独立验证了基因表达概况分析。发现在来自具有与测
试集中相同疾病活动度的UC和CC患者的不同结肠样品中，DEFA5在CC中也增加至UC中的118
倍(p< 0.001)。表3。在微阵列和PCR阵列中均出现的唯一基因是DEFA5。在上调的基因中有
α-防御素5、其他抗微生物肽和粘蛋白(表2)。HD5增加最大：在CC为UC的31倍(在先前的测试中，HD5在CC中增加至UC中的118倍——表3)。表2中可见完整的微阵列结果列表。表2显示来
自AFFYMETRIX cDNA微阵列的靶标的列表。在微阵列中突出显示了总共484个基因，作为区
分UC与CC的潜在标志物。显示在两种疾病之间的最大倍数变化的基因是人类防御素5
(HD5)。
[0083] 为了进一步验证这些数据，使用从中度CC和中度UC组织(n=3)提取的RNA，通过半定量RT-PCR评估了DEFA5表达。该分析证实，与UC相比，CC中的DEFA5 mRNA水平显著更高(图
7A, SEM, p< 0.03)。使用斑点印迹，使用从DEFA1-6转化细菌制备的细菌裂解物，筛选针对
重组DEFA5的可市购抗体。这导致发现了来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa
Cruz, CA)的单克隆抗体——α-防御素5抗体(目录号53997)，作为高特异性和高亲和力
DEFA5抗体用于测定中。接下来，通过蛋白质印迹评估DEFA5表达(对于每种疾病n≥10)(图
7B)，发现与来自所有其他疾病状态的那些组织相比，来自中度和重度CC患者的组织表达更
高水平的DEFA5 (图7C, p< 0.0001)。但是，由于将全厚度样品用于蛋白质印迹，因此样品
中DEFA5的总体丰度低。最后，使用FFPE切片通过IHC检查了中度IBD和对照组织中DEFA5的
表达。该分析还表明，CC组织(图7G)中的DEFA5水平高于DV、UC和正常(NL)对照组织(图7D、
7E和7F)中的DEFA5水平。DEFA5 IHC染色的定量显示，CC样品中DEFA5增加至UC样品中的5.6
倍(图7H, p<0.0001)。有趣的是，通过IHC对DEFA5的检测显示了单个结肠隐窝基底的局部
DEFA5染色。图7A-7H显示DEFA在IBD中异常表达。图7A显示通过半定量RT-PCR对中度UC和CC
样品中的DEFA5转录水平的定量，证实了中度CC中的DEFA5水平高于中度UC中的DEFA5水平
(p<0.05)。图7B是代表性的DEFA5蛋白质印迹，其显示与所有其他IBD疾病状态相比，中度和
重度CC中较高的DEFA5水平。β-肌动蛋白用作上样对照。图7C显示在各种IBD疾病状态中
DEFA5水平的图示(密度测定)。每个点代表DEFA5与β-肌动蛋白的比率。中度和重度CC的
DEFA5水平均显著高于所有其他疾病状态(p<0.0001)。图7D-7H示出了使用福尔马林固定的
石蜡包埋的(FFPE)薄切片进行的在结肠组织中DEFA5的代表性IHC染色——图7D显示憩室
病，无初级抗体对照；图7E显示中度憩室炎；图7F显示中度UC；图7G显示中度CC；和图7H显示中度UC相对于中度CC的DEFA5 IHC染色的定量水平。与UC相比，CC中DEFA5的水平增加(p<
0.0001)。这些图示的组织的放大倍数为40倍。
7A, SEM, p< 0.03)。使用斑点印迹，使用从DEFA1-6转化细菌制备的细菌裂解物，筛选针对
重组DEFA5的可市购抗体。这导致发现了来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa
Cruz, CA)的单克隆抗体——α-防御素5抗体(目录号53997)，作为高特异性和高亲和力
DEFA5抗体用于测定中。接下来，通过蛋白质印迹评估DEFA5表达(对于每种疾病n≥10)(图
7B)，发现与来自所有其他疾病状态的那些组织相比，来自中度和重度CC患者的组织表达更
高水平的DEFA5 (图7C, p< 0.0001)。但是，由于将全厚度样品用于蛋白质印迹，因此样品
中DEFA5的总体丰度低。最后，使用FFPE切片通过IHC检查了中度IBD和对照组织中DEFA5的
表达。该分析还表明，CC组织(图7G)中的DEFA5水平高于DV、UC和正常(NL)对照组织(图7D、
7E和7F)中的DEFA5水平。DEFA5 IHC染色的定量显示，CC样品中DEFA5增加至UC样品中的5.6
倍(图7H, p<0.0001)。有趣的是，通过IHC对DEFA5的检测显示了单个结肠隐窝基底的局部
DEFA5染色。图7A-7H显示DEFA在IBD中异常表达。图7A显示通过半定量RT-PCR对中度UC和CC
样品中的DEFA5转录水平的定量，证实了中度CC中的DEFA5水平高于中度UC中的DEFA5水平
(p<0.05)。图7B是代表性的DEFA5蛋白质印迹，其显示与所有其他IBD疾病状态相比，中度和
重度CC中较高的DEFA5水平。β-肌动蛋白用作上样对照。图7C显示在各种IBD疾病状态中
DEFA5水平的图示(密度测定)。每个点代表DEFA5与β-肌动蛋白的比率。中度和重度CC的
DEFA5水平均显著高于所有其他疾病状态(p<0.0001)。图7D-7H示出了使用福尔马林固定的
石蜡包埋的(FFPE)薄切片进行的在结肠组织中DEFA5的代表性IHC染色——图7D显示憩室
病，无初级抗体对照；图7E显示中度憩室炎；图7F显示中度UC；图7G显示中度CC；和图7H显示中度UC相对于中度CC的DEFA5 IHC染色的定量水平。与UC相比，CC中DEFA5的水平增加(p<
0.0001)。这些图示的组织的放大倍数为40倍。
[0084] IBD结肠切除术组织中DEFA5的检测与随访临床患者结果一致，作为CC的潜在选择性诊断工具。
[0085] 为了测试是否可以使用DEFA5的检测来将CC与UC区分开，并且这是否与患者的随访临床结果一致，通过IHC在来自21名IC患者(图3A)的组织中进行了DEFA5的检测。使用
Nikon Element Advanced Research Analysis Software (NEARAS)评估染色强度。根据
DEFA5染色强度，发现在6名IC诊断不变的患者中并且如下表1所示，3名患者显示出高DEFA5
染色并符合CC的最终诊断(红色圆圈)，而3名患者显示出低DEFA5染色并符合UC的最终诊断
(绿色圆圈)。
Nikon Element Advanced Research Analysis Software (NEARAS)评估染色强度。根据
DEFA5染色强度，发现在6名IC诊断不变的患者中并且如下表1所示，3名患者显示出高DEFA5
染色并符合CC的最终诊断(红色圆圈)，而3名患者显示出低DEFA5染色并符合UC的最终诊断
(绿色圆圈)。
[0086] 表1还对图3B中描述的经RPC和IPAA手术的诊断临床改变为重新CD的患者(n=20)和诊断没
有改变的那些患者(n=47)评估了DEFA5染色。图4示出了如本文所公开的DEFA5如何是用于
确定患者对IPAA的候选资格的工具。图4A显示了来自经RPC手术的诊断没有改变的患者的
结肠切除术组织。使用DEFA5 IHC对组织进行分子测试。图4B显示了来自经UC RPC和IPAA手
术的患者的结肠切除术组织，所述患者的诊断从UC改变为重新CD。使用DEFA5 IHC对组织进
行分子测试。图4C显示了NL-回肠，对照。图4D显示了定量以比较来自原始诊断没有改变的
经UC RPC和IPAA手术的患者的组织中的NEARAS DEFA5 IHC染色与来自诊断从UC改变为重
新CD的那些患者的组织中的NEARAS DEFA5 IHC染色(图11B)。(Ctrl 1 –对照，UC –溃疡性
结肠炎，CC –克罗恩氏结肠炎，DV –憩室炎，DVL –憩室病)。DEFA5 IHC揭示出诊断保持不变即UC的患者仅显示痕量的DEFA5水平(图4A和4D)，而那些诊断从UC临床改变为重新CD的患
者则显示出显著强(p<0.0001)的DEFA5染色(图4B和4D)。如所预期的，正常回肠对照组织中
的DEFA5染色高(图4C)。确定患者组织中DEFA5阳性预测值(PPV)的统计分析显示对于CC为
95.8%，对于UC仅为76.9%。卡方分析显示高水平的DEFA5与CC诊断之间具有显著相关性(p<
0.0001)。这些数据表明，DEFA5是准确区分CC与UC和可靠地将IC重新分类为CC和UC亚型的
候选诊断标志物。
有改变的那些患者(n=47)评估了DEFA5染色。图4示出了如本文所公开的DEFA5如何是用于
确定患者对IPAA的候选资格的工具。图4A显示了来自经RPC手术的诊断没有改变的患者的
结肠切除术组织。使用DEFA5 IHC对组织进行分子测试。图4B显示了来自经UC RPC和IPAA手
术的患者的结肠切除术组织，所述患者的诊断从UC改变为重新CD。使用DEFA5 IHC对组织进
行分子测试。图4C显示了NL-回肠，对照。图4D显示了定量以比较来自原始诊断没有改变的
经UC RPC和IPAA手术的患者的组织中的NEARAS DEFA5 IHC染色与来自诊断从UC改变为重
新CD的那些患者的组织中的NEARAS DEFA5 IHC染色(图11B)。(Ctrl 1 –对照，UC –溃疡性
结肠炎，CC –克罗恩氏结肠炎，DV –憩室炎，DVL –憩室病)。DEFA5 IHC揭示出诊断保持不变即UC的患者仅显示痕量的DEFA5水平(图4A和4D)，而那些诊断从UC临床改变为重新CD的患
者则显示出显著强(p<0.0001)的DEFA5染色(图4B和4D)。如所预期的，正常回肠对照组织中
的DEFA5染色高(图4C)。确定患者组织中DEFA5阳性预测值(PPV)的统计分析显示对于CC为
95.8%，对于UC仅为76.9%。卡方分析显示高水平的DEFA5与CC诊断之间具有显著相关性(p<
0.0001)。这些数据表明，DEFA5是准确区分CC与UC和可靠地将IC重新分类为CC和UC亚型的
候选诊断标志物。
[0087] 建立DEFA5抗体的特异性和选择性。
[0088] 尽管通过IHC在IBD组织中对DEFA5的检测(图4A-4D)与RT-PCR数据(图7A-7H)是一致的，但是可市购的抗体可表现出一些交叉反应性，尤其是与PC衍生的DEFA6。这促使我们
通过斑点印迹评估可市购的DEFA5抗体。来自Santa Cruz Biotechnology的DEFA5抗体(α-
防御素5抗体目录号sc-53997)被鉴定为DEFA5特异性抗体。对抗体与DEFA6的交叉反应性的
评估表明，该抗体强烈检测DEFA5，而在较小程度上检测DEFA6 (图10A)。考虑到针对这些蛋
白质的抗体可发生交叉反应的可能性，寻求鉴定DEFA5特异性抗体。从R&D Systems获得了
总共11种针对DEFA5的单克隆抗体，并评估了它们用作特异性DEFA5检测抗体的能力(图
10C)。从AVIVA System Biology Inc.获得DEFA5夹心ELISA试剂盒(OKEH01234)，以确定是
否可以在患者血清中检测到DEFA5。出乎意料的是，在来自有轻度CC和轻度UC活动度资料的
患者的血清中检测到DEFA5，发现来自CC的血清中的DEFA5高于UC患者，p< 0.05; R2=
0.9938 (图10B)。
通过斑点印迹评估可市购的DEFA5抗体。来自Santa Cruz Biotechnology的DEFA5抗体(α-
防御素5抗体目录号sc-53997)被鉴定为DEFA5特异性抗体。对抗体与DEFA6的交叉反应性的
评估表明，该抗体强烈检测DEFA5，而在较小程度上检测DEFA6 (图10A)。考虑到针对这些蛋
白质的抗体可发生交叉反应的可能性，寻求鉴定DEFA5特异性抗体。从R&D Systems获得了
总共11种针对DEFA5的单克隆抗体，并评估了它们用作特异性DEFA5检测抗体的能力(图
10C)。从AVIVA System Biology Inc.获得DEFA5夹心ELISA试剂盒(OKEH01234)，以确定是
否可以在患者血清中检测到DEFA5。出乎意料的是，在来自有轻度CC和轻度UC活动度资料的
患者的血清中检测到DEFA5，发现来自CC的血清中的DEFA5高于UC患者，p< 0.05; R2=
0.9938 (图10B)。
[0089] 预示性实施例2建立DEFA5抗体对夹心ELISA的特异性和选择性。
[0090] 据信，可通过使用DEFA6作为抗原来确定可市购的ELISA试剂盒的特异性。如果测试证明不是特异性的，则认为使用细菌中表达的DEFA5和DEFA6以及针对DEFA5的11种单克
隆抗体的免疫沉淀(IP)可以鉴定出那些可以与DEFA5特异性形成免疫复合物但不能与
DEFA6形成免疫复合物的抗体。据信，来自R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN的R&D Systems
DEFA5抗体(目录号972207.111或CSL 1450400)可以被生物素化并用作IP的检测抗体。据
信，检测抗体和最佳捕获抗体的组合开发出更特异性的夹心ELISA，以检测血清中的DEFA5。
总的来说，据信在细菌中表达的纯化的DEFA5可用于确定合适浓度的DEFA5抗体以用于稳健
的ELISA，并将其与市售ELISA试剂盒进行比较。
隆抗体的免疫沉淀(IP)可以鉴定出那些可以与DEFA5特异性形成免疫复合物但不能与
DEFA6形成免疫复合物的抗体。据信，来自R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN的R&D Systems
DEFA5抗体(目录号972207.111或CSL 1450400)可以被生物素化并用作IP的检测抗体。据
信，检测抗体和最佳捕获抗体的组合开发出更特异性的夹心ELISA，以检测血清中的DEFA5。
总的来说，据信在细菌中表达的纯化的DEFA5可用于确定合适浓度的DEFA5抗体以用于稳健
的ELISA，并将其与市售ELISA试剂盒进行比较。
[0091] 优化DEFA5夹心ELISA以检测来自IBD患者和正常受试者的血清中的DEFA5。
[0092] 由于未在IBD临床环境中使用DEFA5，因此该任务的目标是建立正常血液DEFA5参考区间水平，并将其与IBD患者血清中的值进行比较。如图10B所示，预见的是，可以通过夹
心ELISA在循环的人血清中检测到DEFA5，即在肠粘膜隐窝局部产生的蛋白质。收集了来自
跨越不同种族/民族和两种性别的117名IBD患者(40 UC、52 CC和25 IC)和69名非IBD对照
的血清(图11B)。92个受试者(46个CC和46个UC)的样品大小将用于使用具有80%统计功效和
5%显著性水平的两组之间比例的单尾检验来检测CC和UC阳性预测值之间19%的临床显著性
差异。这19%的差异代表CC组中具有阳性筛查试验的受试者确实患有该疾病的概率为96%，
而UC组受试者则为77%的阳性预测值。为了建立人血清中DEFA5的正常值，将使用MMC和VUMC
门诊的多达120份来自不同种族背景的男性的血清，以及类似数目的来自不同种族背景的
女性的血清。将来自被诊断出可能影响分析的疾病的那些患者的血清取消资格。将根据先
前建立的指南进行分析前的采样和定量分析以及DEFA5参考区间的定义、建立和验证。将来
自作为Vanderbilt Institute for Clinical and Translational Research (VICTR)的
部分的Clinical Chemistry Pathology Laboratories的VUMC Clinical Research
Center (CRC)的健康个体的血液样品进行分析。额外的血液样品将从健康的成年志愿者和
IBD患者处获得同意并收集，作为增加血清收集的一个持续过程(图11B)。
心ELISA在循环的人血清中检测到DEFA5，即在肠粘膜隐窝局部产生的蛋白质。收集了来自
跨越不同种族/民族和两种性别的117名IBD患者(40 UC、52 CC和25 IC)和69名非IBD对照
的血清(图11B)。92个受试者(46个CC和46个UC)的样品大小将用于使用具有80%统计功效和
5%显著性水平的两组之间比例的单尾检验来检测CC和UC阳性预测值之间19%的临床显著性
差异。这19%的差异代表CC组中具有阳性筛查试验的受试者确实患有该疾病的概率为96%，
而UC组受试者则为77%的阳性预测值。为了建立人血清中DEFA5的正常值，将使用MMC和VUMC
门诊的多达120份来自不同种族背景的男性的血清，以及类似数目的来自不同种族背景的
女性的血清。将来自被诊断出可能影响分析的疾病的那些患者的血清取消资格。将根据先
前建立的指南进行分析前的采样和定量分析以及DEFA5参考区间的定义、建立和验证。将来
自作为Vanderbilt Institute for Clinical and Translational Research (VICTR)的
部分的Clinical Chemistry Pathology Laboratories的VUMC Clinical Research
Center (CRC)的健康个体的血液样品进行分析。额外的血液样品将从健康的成年志愿者和
IBD患者处获得同意并收集，作为增加血清收集的一个持续过程(图11B)。
[0093] 通过IHC检测在福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE) IBD活检/组织中的DEFA5表达在先前的R21资助期间从IBD患者中收集了205个FFPE块。在这些样品中，有83个来自UC
患者，75个来自CC患者，以及47个来自IC患者。来自DV患者的组织将用作非IBD对照。来自这些样品的薄FFPE切片将在Translational Pathology Shared Resource (TPSR)处用抗
DEFA5抗体染色。IHC染色后，将使用Ariol SL-50数字高分辨率成像系统(Leica)对载玻片
进行数字扫描，并使用Vanderbilt University的Digital Histology Shared Resource
(DHSR)的Tissue IA软件对其进行定量。这将能够根据每个载玻片的染色强度和染色细胞
的百分比对它们进行评分。IHC结果的该数字分析将作为活检中DEFA5检测的附加或替代生
物测定。
患者，75个来自CC患者，以及47个来自IC患者。来自DV患者的组织将用作非IBD对照。来自这些样品的薄FFPE切片将在Translational Pathology Shared Resource (TPSR)处用抗
DEFA5抗体染色。IHC染色后，将使用Ariol SL-50数字高分辨率成像系统(Leica)对载玻片
进行数字扫描，并使用Vanderbilt University的Digital Histology Shared Resource
(DHSR)的Tissue IA软件对其进行定量。这将能够根据每个载玻片的染色强度和染色细胞
的百分比对它们进行评分。IHC结果的该数字分析将作为活检中DEFA5检测的附加或替代生
物测定。
[0094] 确定结肠粘膜组织中DEFA5的水平的差异是否与CC、UC或正常受试者的DEFA5循环水平相关。
[0095] 为了确定循环或分泌的DEFA5 (sDEFA5)的水平是否与其原位表达水平相关，将从这三组收集的活检样品用于分离mRNA，以通过实时PCR确定存在的DEFA5信使水平。如果可
能的话，来自CC活动区域与正常相邻组织的同时活检将告知我们血清水平是否表示活动性
疾病。为此，将检查正常相邻粘膜、活动性炎症粘膜和过渡区周围粘膜的活检样本中的
DEFA5 mRNA表达。功效分析表明，基于具有0.05 α水平的双侧检验，每组有30个受试者的病例组和对照组之间的流行率比较通常具有84%的功效来检测40%的差异(例如40%对比80%，
优势比6.0)。在流行率估计的精确度方面，当每组的样品大小为30时，单一比例的双侧95%
置信区间从预期50%的观察比率将为18%。基于检测两组之间差异表达的蛋白质，同时控制
错误发现率(FDR)，计算样品大小要求。该度量是对于特定蛋白质在病例中的蛋白质表达
(或倍数)与对照的比率。基于Jung SH, Bioinformatics 2005;21:3097的算法，可以检测
到等于1.5倍变化的效应大小(以超过80%的功效)。这假定0.001的FDR和双侧p值，并且基于
30个病例和30个对照的样品。为了确定sDEFA5作为活动性CC候选生物标志物的显著性并建
立具有预测准确性的模型，将使用模型例如具有正则化方法和用于特征鉴定的集成方法
(包括加强、装袋和随机森林分类器)的广义线性模型。
能的话，来自CC活动区域与正常相邻组织的同时活检将告知我们血清水平是否表示活动性
疾病。为此，将检查正常相邻粘膜、活动性炎症粘膜和过渡区周围粘膜的活检样本中的
DEFA5 mRNA表达。功效分析表明，基于具有0.05 α水平的双侧检验，每组有30个受试者的病例组和对照组之间的流行率比较通常具有84%的功效来检测40%的差异(例如40%对比80%，
优势比6.0)。在流行率估计的精确度方面，当每组的样品大小为30时，单一比例的双侧95%
置信区间从预期50%的观察比率将为18%。基于检测两组之间差异表达的蛋白质，同时控制
错误发现率(FDR)，计算样品大小要求。该度量是对于特定蛋白质在病例中的蛋白质表达
(或倍数)与对照的比率。基于Jung SH, Bioinformatics 2005;21:3097的算法，可以检测
到等于1.5倍变化的效应大小(以超过80%的功效)。这假定0.001的FDR和双侧p值，并且基于
30个病例和30个对照的样品。为了确定sDEFA5作为活动性CC候选生物标志物的显著性并建
立具有预测准确性的模型，将使用模型例如具有正则化方法和用于特征鉴定的集成方法
(包括加强、装袋和随机森林分类器)的广义线性模型。
[0096] 预期的结果、挑战和替代程序。
[0097] 据信将显示出检测出IBD患者的血清和组织中的DEFA5的DEFA5特异性测定。使用该测定，可在来自健康受试者的血清中对DEFA5确定和开发定量标准数值标准正常参考区
间(RI)值，并将其与IBD患者血清中的水平相关联。RI方法将基于针对无疾病的参考群体观
察到的实验室测试值的中心95%。根据初步数据，预计来自CC患者的组织和血清中DEFA5的
表达将比来自UC患者的那些高，并且所有具有IC的患者均可被重新分类为CC或UC患者。尽
管功效计算表明每疾病亚型46名患者，但将来自不同的种族背景的每种疾病多达100个患
者组织和血清用于验证DEFA5的检测作为血清CC的诊断工具。
间(RI)值，并将其与IBD患者血清中的水平相关联。RI方法将基于针对无疾病的参考群体观
察到的实验室测试值的中心95%。根据初步数据，预计来自CC患者的组织和血清中DEFA5的
表达将比来自UC患者的那些高，并且所有具有IC的患者均可被重新分类为CC或UC患者。尽
管功效计算表明每疾病亚型46名患者，但将来自不同的种族背景的每种疾病多达100个患
者组织和血清用于验证DEFA5的检测作为血清CC的诊断工具。
[0098] 虽然有可能的是，由于血清中DEFA5的水平相对低所致，测定的灵敏度可为差的，但通过使用碱性磷酸酶缀合的抗DEFA5单克隆抗体来验证测定，或者将测定修改为直接
ELISA或放射免疫测定。使用2,2'-联氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)作
为底物，过氧化物酶缀合的链霉抗生物素可用于开发DEFA5检测测定。据信，开发夹心测定
和抗体将避免与DEFA6的交叉反应。
ELISA或放射免疫测定。使用2,2'-联氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)作
为底物，过氧化物酶缀合的链霉抗生物素可用于开发DEFA5检测测定。据信，开发夹心测定
和抗体将避免与DEFA6的交叉反应。
[0099] 工作实施例3潘氏细胞是回肠上皮干细胞(ISC)的分化后代，它们支持ISC并在哺乳动物中提供抗菌
保护。尽管IBD易发炎，但是UC和CC在组织学上不同并且需要不同的外科治疗选择的观点表
明DEFA5和/或特定的促炎细胞因子在这些疾病的发病机理中起主要作用。据认为CC结肠切
除术样品中的DEFA5水平高是由于异常的化生性结肠隐窝PC引起的；并且来自UC和CC患者
的血清含有高水平的IBD亚型特异性促炎细胞因子。有充分的证据支持细菌肠毒素例如葡
萄球菌肠毒素C和霍乱毒素(Xiao-Chen Wan等人, 2008, Androutsellis-Theotokis A等
人, 2011)以及促炎细胞因子例如TNF-α、IL-1β和IFN-γ促进干细胞分化的可能性。然而，对于有或没有DEFA5的细菌肠毒素或促炎细胞因子是否是CC相对于UC的独特病理学特征的
基础，仍然知之甚少。据信，DEFA5、细菌肠毒素和/或某些CC相关的促炎细胞因子促进结肠
干细胞的分化/扩繁，以及与CC相关的独特病理学。为了测试这一假设并在缺乏CC的实际动
物模型的情况下，将两种不同的正常人结肠上皮细胞系(NCM460和NCM356)、来自内窥镜活
检组织的类结肠(colonoid)和/或类肠(enteroid)用于a)测试在存在或不存在细菌肠毒素
的情况下纯化DEFA5、DEFA6和DEFA1对化生性结肠PC形成的影响；b)评估CC-和UC-特异性细
胞因子对DEFA5分泌、ROS的产生和细胞存活力的影响。据信，DEFA5以及在较小程度上DEFA6
将促进CC特异性细胞因子的分泌和ROS的产生，但是减弱细胞存活力和组织损伤两者。还据
信，CC特异性细胞因子将促进DEFA5的合成/分泌，而UC特异性细胞因子将具有相反的作用。
保护。尽管IBD易发炎，但是UC和CC在组织学上不同并且需要不同的外科治疗选择的观点表
明DEFA5和/或特定的促炎细胞因子在这些疾病的发病机理中起主要作用。据认为CC结肠切
除术样品中的DEFA5水平高是由于异常的化生性结肠隐窝PC引起的；并且来自UC和CC患者
的血清含有高水平的IBD亚型特异性促炎细胞因子。有充分的证据支持细菌肠毒素例如葡
萄球菌肠毒素C和霍乱毒素(Xiao-Chen Wan等人, 2008, Androutsellis-Theotokis A等
人, 2011)以及促炎细胞因子例如TNF-α、IL-1β和IFN-γ促进干细胞分化的可能性。然而，对于有或没有DEFA5的细菌肠毒素或促炎细胞因子是否是CC相对于UC的独特病理学特征的
基础，仍然知之甚少。据信，DEFA5、细菌肠毒素和/或某些CC相关的促炎细胞因子促进结肠
干细胞的分化/扩繁，以及与CC相关的独特病理学。为了测试这一假设并在缺乏CC的实际动
物模型的情况下，将两种不同的正常人结肠上皮细胞系(NCM460和NCM356)、来自内窥镜活
检组织的类结肠(colonoid)和/或类肠(enteroid)用于a)测试在存在或不存在细菌肠毒素
的情况下纯化DEFA5、DEFA6和DEFA1对化生性结肠PC形成的影响；b)评估CC-和UC-特异性细
胞因子对DEFA5分泌、ROS的产生和细胞存活力的影响。据信，DEFA5以及在较小程度上DEFA6
将促进CC特异性细胞因子的分泌和ROS的产生，但是减弱细胞存活力和组织损伤两者。还据
信，CC特异性细胞因子将促进DEFA5的合成/分泌，而UC特异性细胞因子将具有相反的作用。
[0100] CC患者中异常表达的DEFA5是通过化生性结肠隐窝PC合成的。DEFA5主要由PC合成。因此，确定了CC患者结肠隐窝中是否存在PC，并验证CC和重新CD结肠切除术样品中发现
的DEFA5池是否起源于结肠上皮隐窝。如通过H&E染色所证实的，来自经RPC手术的具有重新
CD的患者的所有20个UC样品显示出结肠化生性隐窝PC的池(图8A-8C)。PC中溶菌酶的IHC染
色证实，CC结肠隐窝中的PC比UC中的PC丰度高(图8D-8F，箭头)。图8A-8C示出了结肠切除组
织的代表性H&E染色。8A，正常结肠(NLC)。8B，UC，零星的PC(箭头)。8C，CC，在隐窝中具有成熟的PC(箭头)。图8D-8F示出了结肠中DEFA5和溶菌酶的代表性IHC检测。8D，NLC。8E，UC (一名患者中散发性前驱PC)。8F，CC。放大倍数为40倍。
的DEFA5池是否起源于结肠上皮隐窝。如通过H&E染色所证实的，来自经RPC手术的具有重新
CD的患者的所有20个UC样品显示出结肠化生性隐窝PC的池(图8A-8C)。PC中溶菌酶的IHC染
色证实，CC结肠隐窝中的PC比UC中的PC丰度高(图8D-8F，箭头)。图8A-8C示出了结肠切除组
织的代表性H&E染色。8A，正常结肠(NLC)。8B，UC，零星的PC(箭头)。8C，CC，在隐窝中具有成熟的PC(箭头)。图8D-8F示出了结肠中DEFA5和溶菌酶的代表性IHC检测。8D，NLC。8E，UC (一名患者中散发性前驱PC)。8F，CC。放大倍数为40倍。
[0101] 通过对结肠切除术组织样品针对DEFA5和溶菌酶(LYZ)进行染色以检测PC，发现PC是DEFA5分泌细胞。发现CC样品中存在大量的隐窝PC(图6A和6D)。正常回肠组织用作对照
(图6G)。图6A-6I示出了DEFA5和溶菌酶在CC中的隐窝PC中共表达。用溶菌酶(6B、6E和6F)和
用DEFA5 (6C、6F和6I)对两名患者的重新克罗恩氏组织(6A和6D)和正常回肠(对照)(6G)进
行双重染色。合并的图像在6A、6D和6G中显示。为了确定PC是DEFA5分泌细胞，对结肠切除术组织样品针对DEFA5和溶菌酶(LYZ)进行染色以检测PC。在CC样品中发现大量的隐窝PC(图
6A和6D)。正常回肠组织用作对照(图6G)。
(图6G)。图6A-6I示出了DEFA5和溶菌酶在CC中的隐窝PC中共表达。用溶菌酶(6B、6E和6F)和
用DEFA5 (6C、6F和6I)对两名患者的重新克罗恩氏组织(6A和6D)和正常回肠(对照)(6G)进
行双重染色。合并的图像在6A、6D和6G中显示。为了确定PC是DEFA5分泌细胞，对结肠切除术组织样品针对DEFA5和溶菌酶(LYZ)进行染色以检测PC。在CC样品中发现大量的隐窝PC(图
6A和6D)。正常回肠组织用作对照(图6G)。
[0102] 图9A-9D示出了在相邻的IBD组织中DEFA5的存在。来自CC患者(9A和9B)和来自UC患者(图9C和9D)的相邻正常和患病组织中DEFA5的IHC和H&E染色。注意，在来自UC患者的疾
病和正常组织中，DEFA5染色并不明显。在来自CC的相邻正常组织中检测到DEFA5。考虑到正
常健康的结肠组织缺乏或具有稀疏PC，试图确定在CC和UC患者中，在与患病组织相邻的正
常组织中是否可以检测到DEFA5。针对DEFA5的IHC在来自CC患者的样品中在发炎的和正常
的相邻组织两者中在隐窝基底中显示阳性染色(图9A)。图9B描绘了H&E。考虑到DEFA5和PC
的共定位(图6)，有可能表明PC存在于CC患者的患病和正常相邻组织中，而不存在于来自UC
患者的组织中。然而，对于是什么引发这种IBD疾病亚型中出现PC仍然知之甚少。
病和正常组织中，DEFA5染色并不明显。在来自CC的相邻正常组织中检测到DEFA5。考虑到正
常健康的结肠组织缺乏或具有稀疏PC，试图确定在CC和UC患者中，在与患病组织相邻的正
常组织中是否可以检测到DEFA5。针对DEFA5的IHC在来自CC患者的样品中在发炎的和正常
的相邻组织两者中在隐窝基底中显示阳性染色(图9A)。图9B描绘了H&E。考虑到DEFA5和PC
的共定位(图6)，有可能表明PC存在于CC患者的患病和正常相邻组织中，而不存在于来自UC
患者的组织中。然而，对于是什么引发这种IBD疾病亚型中出现PC仍然知之甚少。
[0103] 应当理解，所公开的本发明实施方案的任何给定要素可以单一结构、单一步骤、单一物质等来体现。类似地，所公开的实施方案的给定要素可以多个结构、步骤、物质等来体
现。
现。
[0104] 前述描述说明并描述了本公开的过程、机器、制造、物质组成及其他讲授。另外，本公开仅显示和描述了所公开的过程、机器、制造、物质组成及其他讲授的某些实施方案，但如上所述，应当理解，本公开的讲授能够用于各种其他组合、修改和环境，并且能够在如本
文所表达的讲授的范围内与相关领域的普通技术人员的技能和/或知识相称地进行变化或
修改。上文所述的实施方案进一步旨在解释实践本公开的过程、机器、制造、物质组成及其
他讲授已知的某些最佳模式，并且使得本领域的其他技术人员能够在这种或其他实施方案
中利用本公开的讲授和伴随特定应用或用途所需的各种修改。因此，本公开的过程、机器、
制造、物质组成及其他讲授并不旨在限制本文公开的准确实施方案和实施例。提供本文的
任何小节标题仅是为了与37 C.F.R. § 1.77的建议保持一致，或者以其他方式提供组织排
列。这些标题不应限制或表征本文阐述的发明。
文所表达的讲授的范围内与相关领域的普通技术人员的技能和/或知识相称地进行变化或
修改。上文所述的实施方案进一步旨在解释实践本公开的过程、机器、制造、物质组成及其
他讲授已知的某些最佳模式，并且使得本领域的其他技术人员能够在这种或其他实施方案
中利用本公开的讲授和伴随特定应用或用途所需的各种修改。因此，本公开的过程、机器、
制造、物质组成及其他讲授并不旨在限制本文公开的准确实施方案和实施例。提供本文的
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