技术领域
[0001] 本
发明涉及对患者的肠内菌群进行分析来预测大建中汤效果的方法和确定给药量的方法。
背景技术
[0002] 西医疗法(利用合成药进行
疾病治疗)的情况下,通常通过生化学检查等来鉴定疾病,基本上无论患者的身体状况、体质等如何,对于相同疾病的患者选择相同的药剂。另一方面,中医疗法(利用中药进行治疗)的情况下,即使同样是
高血压病的患者,对于体质良好且相对有体
力的患者与高龄且怕冷症的患者开出不同的中药
处方。例如,前者的患者使用大柴胡汤,而后者的患者使用八味地黄丸。中药不像合成药那样仅为1种成分,而是使用组合了几种生药并用
水性
溶剂对其进行提取而得到的提取物,因此即使是相同的疾病也能根据患者的身体状况、体质、疾病的进展程度等选择适于该患者的药剂。例如,适于感冒的中药有9种(葛根汤、小柴胡汤、柴胡桂枝汤、麻黄汤、补中益气汤、五积散、参苏饮、升麻葛根汤、麻黄附子细辛汤),医生仔细观察患者的状态(脸色、
皮肤的光泽、舌的状态、有无怕冷、有无体力、有无气力等)来选择被认为适于该患者的中药。这些情况是作为统一的治疗法的西医疗法所没有的考虑方法。如作为中医疗法的入
门书籍的非
专利文献1所述那样,在中医疗法中将该诊断方法称为“辩证(syndrome differentiation)”,作为治疗的依据。
[0003] 然而,基于辩证(syndrome differentiation)进行的诊断方法与重视客观性的生化学检查值的西洋医学不同,由于依赖于医生的诊察技术而寻求基于丰富经验的技巧。例如,根据非专利文献2,大建中汤并非对所有的患者有效。因此,对于中药诊疗而言,不仅需要医生的诊察技术而且也期望能够预测有效性的客观性指标。
[0005] 非专利文献
[0006] 非专利文献1:《入門漢方医学》(入门中医学)日本东京医学会学术教育员会pp30-33
[0007] 非专利文献2《:漢方医学》(中医学)vol.38 No.1 pp30-31 2014
发明内容
[0008] 发明要解决的问题
[0009] 本发明的课题在于实现个性化治疗,所述个性化治疗不仅利用医生的诊察技术而且还使用客观性指标来提高中医疗法的有效性、杜绝无用的治疗以减轻对患者的负担,同时进一步在事前预测到对各患者适合的给药量。
[0010] 用于解决问题的方案
[0011] 本
发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现:大建中汤的起效容易度与特定的肠内细菌的存在比率存在相关性,从而完成了本发明。
[0012] 即,本发明为以下的(1)~(9)。
[0013] (1)一种预测大建中汤对患者的起效容易度的方法,其特征在于,所述方法包括以下的步骤(a)和步骤(b):
[0014] 步骤(a):对患者的肠内菌群进行分析,来确定患者的肠内的拟杆菌门(Bacteroidetes)与厚壁菌门(Firmicutes)之比(Bm/Fm比);
[0015] 步骤(b):与Bm/Fm比低于基准值时大建中汤容易起效、高于基准值时大建中汤不易起效的基准进行比较,来判断大建中汤对患者的起效容易度。
[0016] (2)一种预测大建中汤对患者的起效容易度的方法,其特征在于,所述方法包括以下的步骤(c)和步骤(d):
[0017] 步骤(c):对患者的肠内菌群进行分析,来确定患者的肠内的拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比);
[0018] 步骤(d):与Bk/Ck比低于基准值时大建中汤容易起效、高于基准值时大建中汤不易起效的基准进行比较,来判断大建中汤对患者的起效容易度。
[0019] (3)一种选择除大建中汤之外的中药的方法,其利用上述方法来预测大建中汤的起效容易度,并且对于判断为对大建中汤不易起效的患者选择除大建中汤之外的中药。
[0020] (4)一种确定对患者给予大建中汤的给药量的方法,其特征在于,所述方法包括以下的步骤(a)和步骤(e):
[0021] 步骤(a):对患者的肠内菌群进行分析,来确定患者的肠内的拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比);
[0022] 步骤(e):通过步骤(a)中确定的Bm/Fm比为比基准值低的值时减少对患者给予大建中汤的给药量、Bm/Fm比为高于基准值的值时增加对患者给予大建中汤的给药量,由此确定对患者给予大建中汤的给药量。
[0023] (5)一种确定对患者给予大建中汤的给药量的方法,其特征在于,所述方法包括以下的步骤(c)和步骤(f):
[0024] 步骤(c):对患者的肠内菌群进行分析,来确定患者的肠内的拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比);
[0025] 步骤(f):通过步骤(c)中确定的Bk/Ck比为比基准值低的值时减少对患者给予大建中汤的给药量、Bk/Ck比为高于基准值的值时增加对患者给予大建中汤的给药量,由此确定对患者给予大建中汤的给药量。
[0026] (6)一种用于预测大建中汤对患者的起效容易度的
试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:
[0027] 对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒、及
[0028] 记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系的资料。
[0029] (7)一种用于预测大建中汤对患者的起效容易度的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:
[0030] 对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒、及
[0031] 记载了拟杆菌纲与梭菌纲之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系的资料。
[0032] (8)一种用于确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:
[0033] 对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒、及
[0034] 记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与对患者给予大建中汤的给药量和起效困难度的关系的资料。
[0035] (9)一种用于确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:
[0036] 对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒、及
[0037] 记载了拟杆菌纲与梭菌纲之比、与对患者给予大建中汤的给药量的关系的资料。
[0038] 发明的效果
[0039] 根据本发明的方法能够基于客观性的数据确定大建中汤的有效性、给药量,因此能成为
精度更高的中药治疗,避免无用的治疗以减轻对患者的负担。
[0040] 另外,本发明的试剂盒能用于预测大建中汤对患者的起效容易度、确定给药量,因此非常有助于辅助使用了大建中汤的治疗、诊断。
附图说明
[0041] 图1是示出豚鼠的肠内的拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)、与大建中汤的起效容易度的相关性的附图。
[0042] 图2是示出豚鼠的肠内的拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比)、与大建中汤的起效容易度的相关性的附图。
[0043] 图3是示出豚鼠的肠内的疣微菌门(Verrucomicrobia)与厚壁菌门之比(Vm/Fm比)、与大建中汤的起效容易度的附图。
具体实施方式
[0044] 本发明所涉及的大建中汤是在对通常表1的组成的混合生药的提取物进行粉末化而成的物质(有时称为无麦芽糖大建中汤。)中配混了提取物的8倍量左右的粉末麦芽糖(麦芽糖的英文名:maltose)而成的物质。
[0045] [表1]
[0046]日文名(英文名) 配混量(g)
日本药典生姜(JP Processed GInger) 3~5
日本药典人参(JP Ginseng) 2~3
日本药典山椒(JP Zanthoxylum Fruit) 1~2
[0047] 作为大建中汤,还包括在上述组成中进一步加入容许作为药品添加物添加的成分并制剂
化成颗粒等的大建中汤制剂。作为进行了这样的制剂化的大建中汤制剂,例如可以列举出:由株式会社津村如津村大建中汤提取物颗粒(TJ-100:将日本药典生姜5g、日本药典人参3g、日本药典山椒2g的混合生药的提取液提取物进行粉末化的物质、与该提取物的8倍量的粉末麦芽糖的粉末进行混合而成的物质)那样以医疗用药品的形式市售的物质。
[0048] 上述容许作为医药品添加物添加的成分可列举出:
淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基
纤维素、玉米淀粉、无机盐等赋形剂、崩解剂、
表面活性剂、
润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、
着色剂、香料等。
[0049] 该大建中汤可以期待对腹部怕冷且
疼痛、有腹部胀满感、体力下降、腹壁薄且肠的蠕动弱的、所谓的胃肠蠕动降低了的患者产生效果。作为具体的疾病,可列举出便秘、肠道蠕动麻痹、克罗恩氏病、
炎症性肠疾病、溃疡性大肠炎、术后肠梗阻等。
[0050] 本发明的预测大建中汤对患者的效果的方法包括以下的(a)和(b)的步骤(以下将其称为“本发明效果预测方法”)。
[0051] 步骤(a):对患者的肠内菌群进行分析,来确定患者的肠内的拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比);
[0052] 步骤(b):与Bm/Fm比低于基准值时大建中汤容易起效、高于基准值时大建中汤不易起效的基准进行比较,来判断大建中汤对患者的起效容易度。
[0053] 在上述步骤(a)中,患者的肠内菌群的分析利用现有公知的分析方法进行即可。作为这样的现有公知的分析方法,例如可列举出:基于培养法、PCR法、下一代定序器进行的综合性
解析法等。
[0054] 具体而言肠内菌群的分析采集患者的
粪便,并利用培养法、分子
生物学方法等对其进行分析。在进行该分析时,至少能够检测出拟杆菌门与厚壁菌门的
微生物,只要能分析出现
频率等即可,但优选例如能够检测出以下的表2所示的微生物,能够分析这些微生物的出现频率。更具体而言,作为拟杆菌门的微生物,选择拟杆菌门拟杆菌纲(Bacteroidetes Bacteroidia),作为厚壁菌门的微生物,选择厚壁菌门杆菌纲(Firmicutes Bacilli)、厚壁菌门梭菌纲(Firmicutes Clostridia)、厚壁菌门产芽胞菌纲(Firmicutes Erysipelotrichi),基于这些微生物的出现频率来确定拟杆菌门与厚壁菌门之比即可。需要说明的是,表2所示的微生物、其遗传信息可以从ATCC等保藏机构、各种
数据库处获得。另外,若为本领域技术人员,则能够基于这些微生物、遗传信息容易地制备分析用的引物等。
[0055] [表2]
[0056]
[0057] 在上述步骤(b)中,对上述步骤(a)中确定的拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)、与基准值进行比较,并与Bm/Fm比低于基准值时大建中汤容易起效、高于基准值时大建中汤不易起效的基准进行比较,从而判断大建中汤对患者的起效容易度。
[0058] 具体而言,将大建中汤容易起效的基准值设为0.29,Bm/Fm比低于该值时判断为大建中汤容易起效。另外,将大建中汤不易起效的基准值设为0.4,Bm/Fm比高于该值时判断为大建中汤不易起效。
[0059] 需要说明的是,上述判断为大建中汤不易起效时,对于患者在除大建中汤之外的中药中选择适合患者的中药。例如,患者是胃肠蠕动降低了的患者时,中药可选择选自由大黄牡丹皮汤、润肠汤、桃核承气汤、防
风通圣散、调胃承气汤、大黄甘草汤、通导散、三黄泻心汤和麻子仁丸组成的组。
[0060] 以上说明的本发明效果预测方法可以使用包含以下那样的构成的用于预测大建中汤对患者的效果的试剂盒。
[0061] ·对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒
[0062] ·记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系的资料
[0063] 在上述试剂盒中,对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒可列举出:肠内菌群检查试剂盒(分子生理化学研究所制)或Mykinso(Saikinso制)等市售的试剂盒,包含样品采集容器、用于上述肠内菌群的分析的各种引物、各种试剂等的试剂盒等。
[0064] 另外,在上述试剂盒中,记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系的资料例如可列举出:在纸等上印刷有能够判断大建中汤容易起效或难以起效的Bm/Fm比、基于该比的图表等,或将这些数据存储于CD、DVD、USB
存储器、存储卡、
硬盘等
电子介质上的物质等。
[0065] 另外,基于上述步骤(a)中确定的拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比),能够在以下的步骤(e)中确定对患者给予大建中汤的给药量(以下将其称为“本发明给药量确定方法”)。
[0066] 步骤(e):通过步骤(a)中确定的Bm/Fm比为比基准值低的值时减少对患者给予大建中汤的给药量,Bm/Fm比为高于基准值的值时增加对患者给予大建中汤的给药量,由此确定对患者给予大建中汤的给药量。
[0067] 具体而言,将减少大建中汤的给药量的基准值设为0.29,Bm/Fm比低于该值时减少大建中汤的给药量。另外,将增加大建中汤的给药量的基准值设为0.4,Bm/Fm比高于该值时增加大建中汤的给药量。
[0068] 需要说明的是,成为大建中汤的基准的通常的给药量没有特别限定,根据使用的大建中汤的组成比、作为给药对象的患者的体重等进行适宜设定即可。例如,大建中汤的给药量例如若为津村大建中汤提取物颗粒(TJ-100:株式会社津村制),则日本人的成年男性的情况(平均体重60kg)为每1天15g,美国人的成年男性的情况(平均体重87kg)为每1天22g。
[0069] 对于具体的向患者给予大建中汤的给药量,例如,基于患者的体重而确定的1天给药量为15g时,对于Bm/Fm比低于0.29的患者给予半量的7.5g,对于Bm/Fm比高于0.4的患者给予倍量的30g。需要说明的是,对于Bm/Fm比高于0.4的患者通常与其给予倍量不如从除大建中汤之外的中药中选择适合患者的中药。
[0070] 以上说明的本发明给药量确定方法可以使用包含以下那样的构成的用于确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒。
[0071] ·对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒、及
[0072] ·记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与对患者给予大建中汤的给药量的关系的资料
[0073] 在上述试剂盒中,对患者的肠内菌群进行分析的试剂盒可以使用与上述试剂盒同样的物质。
[0074] 另外,上述试剂盒中,记载了拟杆菌门与厚壁菌门之比、与对患者给予大建中汤的给药量的关系的资料例如可列举出:在纸等上印刷有能够确定大建中汤的给药量的Bm/Fm比、基于该比的图表等,将这些数据存储于CD、DVD、USB存储器、存储卡、硬盘等电子介质上的物质等。
[0075] 需要说明的是,对于拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比),与拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)同样地与大建中汤的起效容易度、给药量具有相关性。
[0076] 因此,对于上述说明的本发明效果预测方法以及本发明给药量确定方法和用于这些方法的试剂盒,通过对患者的肠内菌群进行分析,确定拟杆菌纲与梭菌纲之比,基于拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)将各种基准值变更为拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比),就能够基于Bk/Ck比预测大建中汤的起效容易度、确定大建中汤的给药量。
[0077] 患者的肠内菌群的分析能够至少检测出拟杆菌纲与梭菌纲的微生物,能够分析出现频率等即可,但例如优选能够检测出表2所示的微生物、能够分析其出现频率。更具体而言,作为拟杆菌纲的微生物,选择拟杆菌门拟杆菌纲(Bacteroidetes Bacteroidia),作为梭菌纲的微生物,选择厚壁菌门梭菌纲(Firmicutes Clostridia),基于它们的出现频率来确定拟杆菌纲与梭菌纲之比即可。
[0078] 在本发明效果预测方法中将拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)替换为拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比)时,大建中汤容易起效的基准值为0.329,大建中汤不易起效的基准值为0.454。
[0079] 另外,在本发明给药量确定方法中将拟杆菌门与厚壁菌门之比(Bm/Fm比)替换为拟杆菌纲与梭菌纲之比(Bk/Ck比)时,减少大建中汤的给药量的基准值为0.329,增加大建中汤的给药量的基准值为0.454。
[0081] 以下列举实施例对本发明进行详细地说明,但本发明不限定于这些实施例。
[0082] 实施例1
[0083] 肠内菌群与大建中汤的起效容易度的关系:
[0084] (1)样品的制备
[0085] 使用预先驯化饲养的5~8周龄的Hartley系豚鼠(♂)151只作为样品。通过断头使这些豚鼠安乐死后,将从盲肠回收的内容物(粪便)用于以下的肠内菌群的分析。另外,摘取远端大肠,将其用于以下的Magnus试验。
[0086] (2)肠内菌群的分析
[0087] 利用公知的方法从上述(1)中回收的盲肠的内容物中提取了DNA。使用Advantage HF2(TAKARA BIO INC.制)对该DNA中所含的16SrDNA基因进行扩增。扩增后使用AMPure XP beads(Nippon Genetics制)对扩增物进行了纯化。
[0088] 使用Nextera XT Index Kit(Illumina,Inc.制)由上述得到的扩增物制备文库,使用MiSeq(Illumina,Inc.制)来确定
碱基序列,对不需要的序列适宜进行了
修剪。
[0089] 通过检索16SrRNA基因数据库(Greengenes the 16S rRNA Gene Database),对修剪后的碱基序列进行注释,按样品进行分类,对在门、纲等各水平下出现的频率(出现频率)进行了计数。
[0090] 豚鼠的肠内细菌大部分为拟杆菌门、厚壁菌门,特别是在拟杆菌纲和梭菌纲中占有全部菌群的78.4%(n=151例)。需要说明的是,将豚鼠的肠内细菌中的出现频率示于表3。
[0091] [表3]
[0092]
[0093] (3)Magnus试验
[0094] 基于论文(Jpn.J.Pharmacol.86,32-37(2001).)中记载的方法,使用上述(1)中摘取的远端大肠进行了以下那样的Magnus试验。
[0095] 对上述(1)中摘取的远端大肠沿纵向肌肉方向施加3g的负荷并悬挂在Magnus装置的Magnus管中,导入95%
氧气-5%二氧化
碳的混合气体和37℃的Krebs-Henseleit溶液。在试验中Magnus管在恒温槽中维持在32℃。
[0096] 导入Krebs-Henseleit溶液后60分钟(平衡化后),记录了远端大肠的长度。接着,添加10-6mol/L的乙酰胆碱溶液,记录了此时的远端大肠的收缩长度。然后,用Krebs-Henseleit溶液清洗远端大肠,然后添加利用日本药典中记载的方法制造的无麦芽糖大建中汤的悬浮液0.004~1.628mg/mL,记录了此时的远端大肠的收缩长度。
[0097] 另外,将导入乙酰胆碱溶液时的远端大肠的收缩长度作为100%,求出相对于此导入大建中汤时的对乙酰胆碱收缩率。接着,推测出假设EC50量给药时的每1个体的收缩率。需要说明的是,该EC50的大建中汤相当于假设人类在饭前服用5g(相当于将1天给药量15g分为3份时的1次量)的大建中汤(TJ-100:株式会社津村制)且直接达到大肠的情况下的浓度。
[0098] (4)结果
[0099] 基于上述(1)~(3)的结果,研究了由大建中汤导致的肠道的收缩率与肠内细菌之比、肠内细菌的量等之间的关系。
[0100] 图1中示出将由大建中汤导致的肠道的收缩率为37.024±5.093%的个体作为W组(week:起效差)、将52.142±5.065%的个体作为M组(middle:一般)、将68.556±5.359%的个体作为S组(strong:强)进行分类时的各组的Bm/Fm比。可知的是,W组的Bm/Fm比为0.4±0.1、M组为0.32±0.085、S组为0.29±0.07,越是收缩强的组Bm/Fm比越小。Welch’s t test检验W组与S组之间在统计学上具有显著差异(p<0.000267)。
[0101] 图2中示出将由大建中汤导致的肠道的收缩率为37.024±5.093%的个体作为W组(week:起效差)、将52.142±5.065%的个体作为M组(middle:一般)、将68.556±5.359%的个体作为S组(strong:强)进行分类时的各组的Bk/Ck比。可知的是,W组的Bk/Ck比为0.454±0.111、M组为0.362±0.096、S组为0.329±0.094,与Bm/Fm比同样地越是收缩强的组Bk/Ck比越小。Welch’s t test检验时W组与S组之间在统计学上具有显著差异(p<0.000262)。
[0102] 可知与Bm/Fm比同样地越是肠道的收缩强的组Bk/Ck越比小。需要说明的是,未观察到由大建中汤导致的肠道的收缩率、与除拟杆菌门与厚壁菌门及拟杆菌纲与梭菌纲之外的肠内细菌之比、肠内细菌的量等之间有相关性。将不具有相关性的肠内细菌的1例(疣微菌门与厚壁菌门之比(Vm/Fm比))示于图3。
[0103] 需要说明的是,人类的肠内菌群也已知拟杆菌门与梭菌门较多(Nature,Vol464,4 March 2010,doi:10.1038/nature08821),该结果可推测出人类也是同样的。
[0104] 由以上结果可知,大建中汤的起效容易度与Bm/Fm比、Bk/Ck比具有相关性。进而还可知,通过确定患者的Bm/Fm比、Bk/Ck比而可确定对患者给予大建中汤的给药量。此外,将Bm/Fm比低于0.29的情况确定为大建中汤容易起效,将Bm/Fm比高于0.4的情况确定为大建中汤不易起效。另外,将Bm/Fm比低于0.29的情况确定为减少大建中汤的给药量,将Bm/Fm比高于0.4的情况确定为增加大建中汤的给药量。进而,将Bk/Ck比低于0.329的情况确定为大建中汤容易起效,将Bk/Ck比高于0.454的情况确定为大建中汤不易起效。进而,将Bk/Ck比低于
0.329的情况确定为减少大建中汤的给药量,将Bk/Ck比高于0.454的情况确定为增加大建中汤的给药量。
[0105] 实施例2
[0106] 用于预测大建中汤对患者的起效容易度及确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒:
[0107] 将对市售的肠内菌群进行分析的试剂盒;以及印刷有拟杆菌门与厚壁菌门之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系、以及与对患者的给药量的关系的纸装入1个
包装内,从而制作了用于预测大建中汤对患者的起效容易度及确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒。
[0108] 通过使用该试剂盒,从而可有效地利用大建中汤对患者进行治疗。
[0109] 实施例3
[0110] 用于预测大建中汤对患者的起效容易度及确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒:
[0111] 将对市售的肠内菌群进行分析的试剂盒;以及印刷有拟杆菌纲与梭菌纲之比、与大建中汤对患者的起效容易度和起效困难度的关系、以及与对患者的给药量的关系的纸装入1个包装内,从而制作了用于预测大建中汤对患者的起效容易度及确定对患者给予大建中汤的给药量的试剂盒。
[0112] 产业上的可利用性
[0113] 本发明能用于治疗使用了大建中汤的患者。