用于认知功能发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938
阅读：348发布：2020-09-08
专利汇可以提供用于认知功能发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于促进幼年 哺乳动物 中健康和正常的认知功能的建立的罗伊氏乳杆菌DSM17938。特别地，本发明涉及罗伊氏乳杆菌DSM17938的用途，其用于促进对认知功能负责的脑结构(例如，皮层和海 马 )以及它们相关的神经途径的发育，和/或逆转停滞，和/或防止认知功能建立的停滞。人类或动物，特别是 胎儿 、早产或足月婴儿、学步儿或儿童或青年可以受益于本发明。，下面是用于认知功能发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938专利的具体信息内容。
1.罗伊氏乳杆菌DSM17938，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进在幼年哺乳动物中的认知功能的健康建立，和/或预防、或修复或降低认知功能损伤的严重度的罗伊氏乳杆菌DSM17938。
2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述幼年哺乳动物是动物。
3.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述幼年哺乳动物是人类胎儿、早产或足月婴儿、学步儿或儿童或青年。
4.权利要求1-3的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述幼年哺乳动物在子宫内、或在出生期间或出生之后经历了或正在经历IUGR，和/或有或被预测有低的、非常低的或极低的出生体重，小于胎龄，和/或正在遭受或遭受了认知功能损伤。
5.根据权利要求4所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述认知功能损伤是由于出生时的低氧血症-缺血。
6.根据前述权利要求任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向胎儿施用是通过向怀孕母亲施用。
7.根据权利要求6所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向怀孕母亲施用在她怀孕1、
2、3、4、5、6、7、8或9个月时开始，或对于预期的动物相当的时间施用。
8.根据权利要求1-5的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向幼年哺乳动物施用是直接的施用或间接的通过哺乳的母亲施用。
9.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向胎儿或婴儿的施用期持续至少一周，优选的两周，更优选的至少一个月。
10.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向学步儿或幼童的施用期持续至少4周，优选的2-12个月，更优选的至少18个月的时间。
11.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，对儿童的施用持续时间是直到该儿童4岁，优选的6岁，更优选的达到15岁，对青年的施用持续时间是直到成年早期20岁。
12.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938以其纯的形式，或稀释在水或母乳中，在食品增补剂中，或在奶补强剂中，或任何肠内的喂养，包括营养喂养期间的奶支持物，在婴儿配制食品中，或在基于奶的饮料中直接向婴儿或学步儿童施用。
13.根据权利要求12所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述婴儿配制食品是用于早产婴儿的配方奶、初始配方奶或后续配方奶或成长奶。
14.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，向怀孕或哺乳母亲或儿童或青年施用是口服，优选的在食物、饮料、食物增补剂或药物组合物中。
15.根据权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌
3 12 7 11
DSM17938以每日剂量1×10 到1×10 ，优选的1×10 到1×10 cfu(cfu＝菌落形成单位)被施用给婴儿、学步儿、儿童或青年。
16.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳
3 12
杆菌DSM17938作为包含1×10 到1×10 cfu/g干组合物的组合物被施用给怀孕或哺乳母亲，或婴儿，或学步儿或儿童或青年。
17.根据权利要求16所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述组合物包含进一步的成分或益生元，优选地选自菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链IOS)、低聚半乳糖(GOS)和牛乳低聚糖(CMOS)。
18.根据权利要求16或17所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述组合物还包含一种或更多种附加的益生菌。
19.根据权利要求18所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述一种或更多种其他益生菌优选地选自Bifidobacterium longum BB536(ATCC BAA-999)；Lactobacillus rhamnosus(CGMCC1.3724)、Bifidobacterium lactis(NCC2818)或其混合物。
20.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938已被灭活从而使得它为非复制性的。
21.根据前述权利要求任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进幼年哺乳动物中的认知、学习和/或记忆和/或心智表现。
22.根据前述权利要求任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进幼年哺乳动物中的注意力能力、知觉、执行能力、语言能力和情绪。
23.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于阻止和/或降低受损的学习能力，执行能力的受损或不良发育，记忆损伤，注意力困难，降低的智力，不良心智表现，情绪反常/扰动，或与不能沟通和例如孤独症的社会化相关的失调中任一项的严重度。
24.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于提高幼年哺乳动物的皮层和/或海马中GAP43、BDNF、GFAP或MBP的任一个的表达水平。
25.根据前述权利要求的任一项所述的罗伊氏乳杆菌DSM17938，其中，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进幼年哺乳动物的皮层和/或海马中髓鞘形成、神经元生长、神经元存活、神经元分化和神经元可塑性的任一项。
26.一种包含罗伊氏乳杆菌DSM17938的组合物，所述罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进幼年哺乳动物中认知功能的健康建立和/或修复、阻止或降低认知功能损伤的严重度。
27.根据权利要求2所述6的组合物，其中，所述组合物是食品增补剂、奶补强剂、初始婴儿配制食品、后续婴儿配制食品、成长奶或基于奶的饮料。
用于认知功能发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938
技术领域
背景技术
[0003] 中枢神经系统(CNS)特别是脑，驱动认知功能。脑皮层是哺乳动物脑的脑最外的一层神经组织，在注意力、知觉、思想、语言、高级认知(执行功能)和信息整合感官输入方面起到关键作用。它由达到六个水平层构成，就神经元和连通性而言每一层具有不同的组成。人类脑皮层厚度2-4mm(0.08-0.16英寸)。
[0004] 新皮质(也称为同形皮质)是脑皮层的系统发生上最新近的部分，分化成六个水平层；脑的更为古代的部分，海马(也称为原脑皮质)具有最多三个细胞层，被分为子区域。各个层中的神经元垂直地连接形成小的位通路，称为柱。不同的新皮质构造域区别在于这些层的深度、它们的优势细胞类型和其他因素例如神经化学标志物上不同。[Kandel，E.R.，et al.(2000)；Principles of Neural Science Fourth Edition，McGraw-Hill，USA，ISBN0-8385-7701-6，p.324]。
[0005] 与外周神经系统一起，CNS在行为控制中具有基础性的作用。体神经系统负责身体运动(处于有意识控制下)的协调。自主神经系统 在没有意识控制的情况下(心率，等等)维持身体活动的稳态。
[0006] 中枢神经系统发育和成熟是高度复杂的生命现象，其涉及许多生理学过程，包括，例如，神经元和胶质细胞生长和分化、神经元寻路和分枝，以及通过轴突生长和神经递质释放的内部神经元通信(神经信号)的建立。此外，虽然不是所有轴突都是有髓鞘的，髓鞘形成(胶质细胞的重要功能)是使轴突传递的电信号绝缘所必需的，从而
确保高效的信号传输，以及阻止邻近神经之间的串扰。[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)；Biology of Oligodendrocyte and Myelin in the Mammalian Central Nervous System，Physiological Reviews，81(2)：871-927]；[Deoni，S.C.et al.(2011)；
Mapping infant brain myelination with magnetic resonance imaging，J.Neurosci.，
31(2)：784-91].This process begins during pregnancy and continues up until and during adolescence/early adulthood(until20years old)[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)]；[Benton，D.(2010)；Neurodevelopment and neurodegeneration：are there critical stages for nutritional intervention？，Nutr.Rev.，68Suppl.1：S6-10]。
确保高效的信号传输，以及阻止邻近神经之间的串扰。[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)；Biology of Oligodendrocyte and Myelin in the Mammalian Central Nervous System，Physiological Reviews，81(2)：871-927]；[Deoni，S.C.et al.(2011)；
Mapping infant brain myelination with magnetic resonance imaging，J.Neurosci.，
31(2)：784-91].This process begins during pregnancy and continues up until and during adolescence/early adulthood(until20years old)[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)]；[Benton，D.(2010)；Neurodevelopment and neurodegeneration：are there critical stages for nutritional intervention？，Nutr.Rev.，68Suppl.1：S6-10]。
[0007] 神经元可塑性被定义为脑对于变化的要求连续地调整它的功能和结构组织的能 力[Nava，E.and Roder，B.(2011)；Adaptation and maladaptation insights from brain plasticity，Prog.Brain Res.，191：177-94]。在神经系统成熟方面，回顾是重要的。它对于脑的正确发挥功能是必不可少的，对于认知、学习和记忆是必需的。这些生理学过程所需的，或至少与之相关的一些神经元标志物，包括蛋白质和神经营养因子已经在文献中被鉴定和被研究[Huang，E.J.and Reichardt，L.F.(2001)；Neurotrophins：Roles in Neuronal Development and Function，Annu.Rev.Neurosci.，24：677-736]；[Denny，J.B.(2006)；Molecular Mechanisms，Biological Actions，and Neuropharmacology of the Growth-Associated Protein GAP43，Current Neuropharmacology，4：293-304]；[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)]；.[Musumeci，G.and Minichiello，L.(2011)；
BDNF-TrkB signalling in fear learning：from genetics to neural networks，Rev.Neurosci.，22(3)：303-15]；[Xiao，J.et al.(2009)；The role of neurotrophins in the regulation of myelin development，Neurosignals，17：265-276]and[Von Bohlen and Halbach，O.(2011)；Immunohistological markers for proliferative events，gliogenesis，and neurogenesis within the adult hippocampus，Cell Tissue Res.，
345(1)：1-19]。中枢神经系统在妊娠期间发育，然后在出生后的时间精炼为成熟的、有功能的网络。
BDNF-TrkB signalling in fear learning：from genetics to neural networks，Rev.Neurosci.，22(3)：303-15]；[Xiao，J.et al.(2009)；The role of neurotrophins in the regulation of myelin development，Neurosignals，17：265-276]and[Von Bohlen and Halbach，O.(2011)；Immunohistological markers for proliferative events，gliogenesis，and neurogenesis within the adult hippocampus，Cell Tissue Res.，
345(1)：1-19]。中枢神经系统在妊娠期间发育，然后在出生后的时间精炼为成熟的、有功能的网络。
[0008] 人类的脑发育在卵子授精之后不久开始。脑从外胚层发育。在第一个步骤中，神经管形成。它的隆起产生皮层、丘脑和下丘脑，中脑、小脑和延髓[Kaufmann，L.et al.(2007)]；[Johnson，M.(2005)；Kognitive Entwicklungsneuropsychologie，Developmental Cognitive Neuroscience，Gottingen：Hogrefe；(2ed.)Oxford：Blackwell Publishing]。脑干是脑的后部，通过颅神经提供了对面部和颈部的主动动作和感觉的神经支配。它包括延髓(末脑)、桥脑(后脑的部分)和中脑(中脑)。
[0009] 在人类胎儿中，大脑皮层发育得相当晚。在神经发生之后，神经元从内部部分(室性和亚室性区域)迁移到脑的特定区域(未来的皮层)。胶质细胞的网络生长，支持了这种细胞迁移。
[0010] 早熟的婴儿显示了在大脑皮层的认知触觉、视觉和听觉的初级感觉区域中、以及在大脑皮层的初级运动区域中非常基础的电活性。在后三个月，胎儿能够简单形式的学习，如习惯(降低它们的惊吓反应)重复的听觉刺激，例如在紧挨母亲腹部大声鼓掌。不考虑这些相当深奥的能力，婴儿带着仍然原始的大脑皮层来到这个世界，脑的这个复杂部分逐渐成熟，这解释了它们在生命第一年情绪和认知的成熟的大部分。[Lubsen，J.et al.(2011)；Microstructural and functional connectivity in the developing preterm brain，Seminars in Perinatology，35，34-43]。
[0011] 因而，CNS的不成熟或延迟成熟导致其调节的重要生物学功能的 建立延迟和不充分发挥功能。因而，大脑皮层的不成熟或延迟成熟可能引起延迟的和/或受损的学习能力，高级推理的损失或不良发展，注意力困难，语言发展的延迟，记忆和执行功能问题，降低的智力，以及因此不良的心智表现。也可能产生其他失调，例如，情绪失调，以及与不能正常沟通和社会化相关的失调(例如，孤独症，包括Asperger′s综合征)的结果。
[0012] 这可以在以下婴儿中观察到，例如：
[0013] -早产婴儿，低出生体重(＜2500g)，非常低和极低出生体重婴儿(＜1500g)和小于胎龄婴儿[Allen，M.C.(2008)；Neurodevelopmental outcomes ofpreterm infants，Curr.Opin Neurol.，21(2)：123-8]。
[0014] -经历了在妊娠期间任何有害事件(母亲吸烟、母亲用药、低胎盘质量、胎盘位置异常、母亲和胎儿的营养不良、母亲的过大压力/焦虑，等)之后发生的胎儿宫内生长迟缓(IUGR)的早熟或足月婴儿；[Gregory，A.et al.(2008)；Intrauterine Growth Restriction Affects the Preterm Infant ′ s Hippocampus，Pediatric Research，63(4)：438-443]。
[0015] -在例如出生时低氧血症-缺血或任何其他有害事件之后显示神经系统生长停滞的任何新生儿和幼儿[Barrett，R.D.et al.(2007)；Destruction and reconstruction：hypoxia and the developing brain，Birth Defects Res.C.Embryo Today，81：163-76]。
[0016] 因而，如果胎儿、新生儿或婴儿经历了中枢神经系统生长停滞，希望的是这种停滞被快速逆转，如果可能，或阻止更进一步的停滞，从而中枢神经系统发育“追上”正常水平，在之后的生活中生长中的胎儿或婴儿经历尽可能少的认知功能损伤。
[0017] 已知的是，营养在脑的神经元成熟中起到重要作用(在[Huppi，P.S.(2008)；Nutrition for the Brain，Pediatric Research，63(3)：229-231]中综述)。具体的，临床研究显示了必需的脂肪酸对于确保胎儿期和出生后的脑发育是关键的[Chang，
C.Y.et al.(2009)；Essential fatty acids and human brain，Acta Neurol.Taiwan，
18(4)：231-41]；[Alessandri， J.M.et al.(2004)；Polyunsaturated fatty acids in the central nervous system：evolution of concepts and nutritional implications throughout life，Reprod.Nutr.Dev.，44(6)：509-38]。
C.Y.et al.(2009)；Essential fatty acids and human brain，Acta Neurol.Taiwan，
18(4)：231-41]；[Alessandri， J.M.et al.(2004)；Polyunsaturated fatty acids in the central nervous system：evolution of concepts and nutritional implications throughout life，Reprod.Nutr.Dev.，44(6)：509-38]。
[0018] 早期的母乳喂养和更高的蛋白质摄取也显示了有益于婴儿的神经元成熟(综述见[Huppi，P.S.(2008)])。
[0019] 营养不良的结果可能是不可逆的，可能包括不良的认知发展、可教育性和将来的经济生产率。[Horton，R；(2008)The Lancet，Vol.371，Issue9608，page179；[Laus，M.F.et al.(2011)；Early postnatal protein-calorie malnutrition and cognition：a review of human and animal studies，Int.J.Environ.Res.Public Health.，8(2)：590-612]。
[0020] 因而，口服介入是积极影响神经系统发育的适当途径，以确保早产和足月新生儿、婴儿、学步儿、儿童或青年，或幼年动物的认知功能和心智表现的正常发育。
[0021] 由于神经元成熟开始于子宫内，围产期和产后介入符合有前景的方法，来确保对认知功能负责的脑部分，特别是大脑皮层和海马的健康发育和成熟。与针对儿童的介入相比，在妊娠/哺乳期间的介入在方便性和顺应性方面具有相当大的优势。
[0022] 在妊娠期间以及在新生儿生命的早期阶段，需要尽可能早的促进和支持认知功能的健康建立，和/或逆转停滞，和/或阻止认知功能建立的进一步延迟，此时神经系统正在快速成熟。中枢神经系统，特别是皮层的部分，发育直到青春期(15岁)，中枢神经系统在一生中适应，特别是皮层和海马[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)]；[Nosarti，C.et al.(2010)；Neurodevelopmental outcomes of preterm birth，Cambridge：Cambridge University Press]。由于在一生中脑的可塑性，需要在整个生命期的适当的营养支持[Benton，D.(2010)；Neurodevelopment and neurodegeneration：are there critical stages for nutritional intervention？，Nutr.Rev.，68Suppl1：S6-10]。
[0023] 科学文献报道了使用益生菌来积极地影响新生儿和婴儿的健康状 态，特别是，对于降低炎症，对抗感染，以及积极地影响大便习惯和胃肠运动性。近期的一般性综述参见[Dobrogosz，W.J.，Peacock，T.J.and Hassan，H.M.(2010)；Evolution of the probiotic Concept：From Conception to Validation and acceptance in Medical Science，Advances in Applied microbiology，72：1-41]。
[0024] 人类衍生的罗伊氏乳杆菌被认为是人类胃肠道的内源生物体，存在于胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上[Reuter，G.(2001)；The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine：composition and succession，Curr.Issues Intest.Microbiol，2：43-53] 和 [Valeur，N.et al.(2004)；Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC55730in the human
gastrointestinal tract，Appl.Environ.Microbiol.，70：1176-1181]。有许多关于罗伊氏乳杆菌作为对许多不同的状况有前景的疗法的报道，包括痢疾疾病[Saavedra，J.(2000)；
Am.J.Gastroenterol，95：S16-S18]、婴儿急腹痛[Savino，F.et al.(2007)；Lactobacillus reuteri(American Type Culture Collection Strain55730)versus simethicone in the treatment of infantile colic：a prospective randomized study，Pediatrics，
119：e124-e130]、湿 疹[Abrahamsson，T.R.et al.(2007)；Probiotics in prevention of IgE-associated eczema：a double-blind，randomized，placebo-controlled trial，J.Allergy Clin.Immunol.，119：1174-1180]以 及幽 门螺 杆菌 感染 [Imase，K.et al.(2007)；Lactobacillus reuteri tablets suppress Helicobacter pylori infection-a double-blind randomised placebo-controlled crossover clinical study，Kansenshogaku Zasshi，81：387-393]。对四种罗伊氏乳杆菌菌株DSM17938、ATCC PTA4659、ATCC PTA5289和ATCC PTA6475的新研究展现了这些菌株在小肠上皮细胞中和在新生小鼠的回肠中差异性地调节脂多糖诱导的炎症。
gastrointestinal tract，Appl.Environ.Microbiol.，70：1176-1181]。有许多关于罗伊氏乳杆菌作为对许多不同的状况有前景的疗法的报道，包括痢疾疾病[Saavedra，J.(2000)；
Am.J.Gastroenterol，95：S16-S18]、婴儿急腹痛[Savino，F.et al.(2007)；Lactobacillus reuteri(American Type Culture Collection Strain55730)versus simethicone in the treatment of infantile colic：a prospective randomized study，Pediatrics，
119：e124-e130]、湿 疹[Abrahamsson，T.R.et al.(2007)；Probiotics in prevention of IgE-associated eczema：a double-blind，randomized，placebo-controlled trial，J.Allergy Clin.Immunol.，119：1174-1180]以 及幽 门螺 杆菌 感染 [Imase，K.et al.(2007)；Lactobacillus reuteri tablets suppress Helicobacter pylori infection-a double-blind randomised placebo-controlled crossover clinical study，Kansenshogaku Zasshi，81：387-393]。对四种罗伊氏乳杆菌菌株DSM17938、ATCC PTA4659、ATCC PTA5289和ATCC PTA6475的新研究展现了这些菌株在小肠上皮细胞中和在新生小鼠的回肠中差异性地调节脂多糖诱导的炎症。
[0025] 在2008年报道的对三十名早产新生儿进行的双盲随机研究中[Indrio，F.et al.(2008)；The effects of probiotics on feeding tolerance， bowel habits，and gastrointestinal motility in preterm newborns，J.Pediatr.，152(6)：801-6]，接受罗伊氏乳杆菌ATCC55730的新生儿显示了与给与安慰剂的相比，显著降低反流和平均每日的哭闹时间，以及更多次数的大便。
[0026] 在对249名早产新生儿的更新的临床研究中[Romeo，M.G.et al，(2011)；Role of probiotics in the prevention of the enteric colonization by Candida in preterm newborns：incidence of late onset sepsis and neurological outcome，J.Perinatology，31：63-69]喂食罗伊氏乳杆菌ATCC55730的婴儿(施用6周)显示了念珠菌属物种的胃肠定殖的显著降低。对于接受益生菌补充的儿童，根据Hammersmith婴儿神经病学指南(Hammersmith Infant Neurological Examination，HINE)所衡量的，脓毒症事件数量的显著降低也伴随着更低发生率的异常神经病学结局。HINE衡量了婴儿的基础脑结构——小脑和脑干的反射和功能。这项研究中进行的测量是脑神经功能(面部表现、眼睛表现、听觉和视觉反应、呼吸和吞咽)、运动、话音、运动里程碑以及意识状态、兴奋状态和社会取向)。该测试是一种检测对基础脑功能的损害(例如，脑性麻痹所观察到的)的筛选方法。它不测量婴儿的注意力、学习、记忆或高级认知。
[0027] 迄今为止，还没有关于益生菌对脑认知功能发育的影响的报道。在生理学水平上，这转变为大脑皮层和其相关神经途径的健康发育和成熟，所述神经途径容许信息的有效传输以及在脑内对这些信息的处理。
[0028] 因而，需要在益生菌施用的领域的进一步发展，作为一种方法来改善幼年哺乳动物，包括早产和足月婴儿、婴儿、学步儿和儿童的健康状态。
[0029] 特别是，需要在幼年哺乳动物，特别包括早产和足月婴儿、婴儿、儿童和青年中支持正常认知功能的健康建立。
[0030] 需要支持幼小哺乳动物，特别包括早产和足月婴儿、婴儿和幼童 中学习和记忆、注意力、知觉、思维、情绪和推理的健康发育。
[0031] 需要防止或最小化幼年哺乳动物中认知损伤的严重度。这种认知损伤可能是延迟和/或受损的学习能力、推理丧失、记忆功能障碍、注意力困难(包括注意力短缺失调)、低智力和因此不良的心智表现的形式。这种认知损伤还可能是与不能正常沟通和社会化相关的失调的形式，例如，孤独症，包括Asperger′s综合征。
[0032] 需要积极影响幼年哺乳动物的脑中的神经元成熟，特别是，与认知功能相关的脑的结构。具体的，需要积极影响神经元生长、存活、可塑性和分化。
[0033] 需要通过支持髓鞘形成来积极影响脑中的信号传输。
[0034] 本发明应用于所有哺乳动物，包括动物和人类。
发明内容
[0035] 本发明涉及用于促进幼年哺乳动物中健康和正常的认知功能的建立的罗伊氏乳杆菌DSM17938。特别地，本发明涉及罗伊氏乳杆菌DSM17938的用途，罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进对认知功能负责的脑结构(例如，皮层和海马)以及它们相关的神经途径的发育，和/或逆转停滞，和/或防止认知功能建立的停滞。人类或动物，特别是胎儿、早产或足月婴儿、学步儿或儿童或青年可以受益于本发明。
[0036] 本发明特别有益于在子宫内、或在出生期间或出生之后经历了IUGR，或具有低、非常低或极低出生体重，小于胎龄，和/或遭受认知功能损伤，例如，受损的学习和记忆、缺少好奇心、不良的注意广度，和因此不良的心智表现，中枢神经系统生长停滞的那些婴儿。
[0037] 本发明人发现罗伊氏乳杆菌DSM17938的施用促进幼年哺乳动物中的神经元和神经胶质发育。它确保了健康的神经元生长、存活、分化和可塑性，以及促进轴突髓鞘形成。施用罗伊氏乳杆菌DSM17938可以提高幼年哺乳动物的皮层和/或海马中生长相关蛋白质
43 (GAP43)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达水平。
43 (GAP43)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达水平。
[0038] 罗伊氏乳杆菌DSM17938可以通过怀孕母亲施用给在子宫内的胎儿。
[0039] 罗伊氏乳杆菌DSM17938以它的纯的形式，或稀释在水或母乳中，在食品增补剂中，或在奶补强剂或在任何肠内的喂养，包括奶支持物中，在营养喂养期间，在婴儿配制食品中，或在基于奶的饮料中直接施用给婴儿或学步儿童。
[0040] 罗伊氏乳杆菌DSM17938可以以1×103到1×1012，优选的1×107到1×1011cfu(cfu＝菌落形成单位)的日剂量施用给婴儿、学步儿童或儿童。
[0041] 罗伊氏乳杆菌DSM17938可以施用给胎儿或婴儿持续至少一周，优选的两周，更优选的至少一个月。向学步儿或幼童施用可以是至少4周，优选的2-12个月，更优选的至少18个月。向更大的儿童或青年施用可以直到15岁或甚至20岁。
[0042] 本发明还涉及包含罗伊氏乳杆菌DSM17938的组合物，用于促进幼年哺乳动物的脑中健康和正常的认知功能的建立。本发明对于遭遇IUGR的那些幼年哺乳动物是特别有用的。
[0044] 图1在补充罗伊氏乳杆菌DSM17938的蛋白质限制的大鼠幼仔中Pro和成熟的脑衍生神经营养因子(BDNF)蛋白质水平。
[0045] A、B：海马
[0046] CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔在处死时(PND14)海马中的Pro(A)和成熟的(B)BDNF蛋白质水平。结果以任意单位表示，是中值±中值标准误差，n＝6。在每个图中，不带共同的字母的中值是不同的，P＜0.05。
[0047] C、D：皮层
[0048] CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔在处死时(PND14)皮层中的Pro(C)和成熟的(D)BDNF蛋白质水平。结果以任意单位表示，是中值±中值标准误差，n＝6。在每个图中，不带共同的字母的中值是不同的，P＜0.05。
[0049] 图2在补充罗伊氏乳杆菌DSM17938的蛋白质限制的大鼠幼仔中生长相关蛋白43(GAP43)蛋白质水平。
[0050] CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔在处死时(PND14)海马(A)和皮层(B)中的GAP43蛋白质水平。结果以任意单位表示，是中值±中值标准误差，n＝6。在每个图中，不带共同的字母的中值是不同的，P＜0.05。
[0051] 图3在补充罗伊氏乳杆菌DSM17938的蛋白质限制的大鼠幼仔中神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)蛋白质水平。
[0052] CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔在处死时(PND14)海马(A)和皮层(B)中测量GFAP水平。结果以任意单位表示，是中值±中值标准误差，n＝6。在每个图中，不带共同的字母的中值是不同的，P＜0.05。
[0053] 图4在补充罗伊氏乳杆菌DSM17938的蛋白质限制的大鼠幼仔中髓磷脂碱性蛋白(MBP)蛋白质水平。
[0054] CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔在处死时皮层中的MBP蛋白质水平。结果以任意单位表示，是中值±中值标准误差，n＝6。不带共同的字母的中值是不同的，p＜0.05。
[0055] 发明详细说明
[0056] 定义：
[0058] “益生菌”是指具有对宿主的健康或安宁的有益效果的微生物细胞制品或微生物细胞的成分[Salminen，S.et al.(1999)；Probiotics：how should they be defined，Trends Food Sci.Technol.10：107-10]。益生菌的定义一般是公认的并且符合WHO定义。益生菌可以包括微生物的唯一菌株、各种菌株的混合物和/或各种细菌种和属的混合物。
在混合物的情况下，单数的术语“益生菌”可以仍然用于指代益生菌混合物或制品。对于本发明来说，乳杆菌属的微生物被认为是益生菌。
在混合物的情况下，单数的术语“益生菌”可以仍然用于指代益生菌混合物或制品。对于本发明来说，乳杆菌属的微生物被认为是益生菌。
[0059] “益生元(Prebiotic)”一般是指不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激宿主的肠中存在的微生物的生长和/或活性来有益地影响宿主，由此试图改善宿主健康状态。
[0060] “早产婴儿”是指在37周妊娠之前出生的婴儿。
[0061] “足月婴儿”是指在37周妊娠之后出生的婴儿。
[0062] “学步儿”是指可以走路直到三岁的儿童。
[0063] “幼童(Young child)”是指从三岁到十岁的儿童。
[0064] “儿童”意味着小于十八岁。
[0066] 罗伊氏乳杆菌(Lactobaccilus reuteri)DSM17938在全文中称为罗伊氏乳杆菌，是Biogaia AB，Sweden所有的罗伊氏乳杆菌菌株，具有科学的菌株名称DSM17938，之前为罗伊氏乳杆菌ATCC55730。DSM标记是指DSMZ德国微生物和细胞保藏所(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)GmbH Inhoffenstr.7b，D-38124Braunschweig，Germany。DSM17938.Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr.7b D-38124Braunschweig-Germany。
[0067] 本发明提供了益生菌罗伊氏乳杆菌DSM17938，用于促进幼年哺乳动物中有效认知功能的健康建立。
[0068] 益生菌的施用可以通过母亲施用给胎儿。还可以直接地或通过母乳施用给早产或足月婴儿。也可以施用给一般低于十岁的幼童，或达 到十五岁的更大的儿童，或相当年龄的动物。
[0069] 罗伊氏乳杆菌施用给幼年哺乳动物，其可以是人类(胎儿、婴儿、学步儿童、或幼童)或动物，对认知功能的健康建立具有积极效果，容许与这些功能相关的神经系统正常成熟和发育。这种效果对于经历了例如，子宫内生长停滞(IUGR)的那些人是特别有益的，其可能在妊娠期间的任何有害事件之后发生(例如，母亲的主动或被动吸烟、母亲的服药，低胎盘质量，胎盘位置异常，母亲和/或胎儿的营养不良，等等)。
[0070] 本发明人发现本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物可以用于促进神经元和胶质细胞生长、存活、可塑性和分化。本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物促进轴突髓鞘形成和神经元可塑性。因而本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物的施用促进有效认知功能的建立，有效认知功能包括学习和记忆，以及因此的心智表现。这些效果已经在测量与这些生物过程相关的蛋白质表达水平的动物模型中展现了。
[0071] 因而，施用罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物对于经历了异常认知功能(认知功能损伤)的哺乳动物也具有效果。认知功能损伤可能跟随着，例如，任何应激情况，如，影响胎儿(子宫内)的那些，例如上述的IUGR，或影响新生儿的那些(出生时的低氧血症-缺血，氧气疗法和氧过多，炎症，胃肠外支持物的需要，等等)，或引起氧化压力的任何原因。
[0072] 在婴儿中，本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物可以用于保护中枢神经系统，特别是与有效认知功能的建立相关的脑的结构，即大脑皮层和它相关的神经途径，来对抗任何应激，例如，在神经元发育期期间发生的，因此来限制和/或防止应激诱导的神经元生长停滞和相关的认知功能损伤。
[0073] 因而，在本发明的情境中，当已经观察到CNS特别是脑的发育中的延迟时，可以施用罗伊氏乳杆菌。另外，在尚未观察到这种延迟时， 可以预防性地施用罗伊氏乳杆菌。
[0074] 通过施用根据本发明的罗伊氏乳杆菌，被治疗的受试者的脑，特别包括大脑皮层和它相关的神经途径健康地发育。更具体地，与轴突髓鞘形成、神经元生长和可塑性相关的许多蛋白质(所有这些对于学习和记忆是必不可少的)的表达被上调。因而，施用对于学习和记忆以及由此的心智表现具有积极影响。这样治疗的婴儿或学步儿或幼童或青年在出生后遭遇与认知功能损伤相关的病理的风险被降低了。这种损伤包括延迟和/或受损的学习能力、高级推理的丧失、无学习能力、注意力困难、低智力，和因此的不良心智表现。还可能产生与不能正常沟通和社会化相关的其他失调(例如，孤独症)。
[0075] 在以下段落中详细说明了就认知功能的有效建立而言，罗伊氏乳杆菌对哺乳动物中枢神经系统的健康发育的有益效果。
[0076] 益生菌的剂量：
[0077] 益生菌可以作为日剂量或以组合物的形式施用。施用给怀孕的或授乳母亲的罗伊6 12 8 11
氏乳杆菌的日剂量是1×10 到1×10 cfu，优选地1×10 到1×10 cfu(cfu＝菌落形成单
3 12 7 11
位)。适合于新生婴儿的日剂量从1×10 到1×10 ，优选地1×10 到1×10 cfu。
氏乳杆菌的日剂量是1×10 到1×10 cfu，优选地1×10 到1×10 cfu(cfu＝菌落形成单
3 12 7 11
位)。适合于新生婴儿的日剂量从1×10 到1×10 ，优选地1×10 到1×10 cfu。
[0078] 因而，罗伊氏乳杆菌可以在组合物中以大范围的百分比存在，以提供其传递所描3 12
述的有益效果。然而，优选地，罗伊氏乳杆菌在组合物中以相当于1×10 到1×10 cfu/g干组合物的数量存在。优选地或对于向怀孕或哺乳母亲或青年的施用或益生菌以相当于
4 11
1×10 到1×10 cfu/g的干组合物之间的数量存在。用于向新生儿、学步儿、和儿童施用的
6 9
每克干组合物中益生菌的数量可以是低于，优选的，1×10 到1×10，当然地，要遵循上述每日剂量。
述的有益效果。然而，优选地，罗伊氏乳杆菌在组合物中以相当于1×10 到1×10 cfu/g干组合物的数量存在。优选地或对于向怀孕或哺乳母亲或青年的施用或益生菌以相当于
4 11
1×10 到1×10 cfu/g的干组合物之间的数量存在。用于向新生儿、学步儿、和儿童施用的
6 9
每克干组合物中益生菌的数量可以是低于，优选的，1×10 到1×10，当然地，要遵循上述每日剂量。
[0079] 上述剂量包括所述细菌是活的、灭活的或死亡的，或甚至作为碎片例如DNA或细胞壁材料存在的可能性。换句话说，配方含有的细菌的数量以该细菌数量的菌落形成能力来表示，如同所有的细菌都是活 的，而不管它们实际上是活的、灭活的或死亡的、碎片的还是任意或所有这些状态的混合。
[0080] 施用方法：
[0081] (i)向怀孕母亲施用：
[0082] 组合物可以通过各种途径施用给怀孕母亲，只要它诱导组合物与女性的胃肠道之间的联系。优选地，所述组合物作为怀孕母亲的食物、饮料或食物增补剂的部分口服施用。组合物还可以在药物组合物中施用。优选地，施用是口服的。然而，在病理学的状况下或在使用肠内喂养时，组合物的施用可以添加在肠内喂养中。
[0083] (ii)向新生儿子代施用：
[0084] 罗伊氏乳杆菌还可以作为增补剂(例如，作为人乳补强剂增补剂)，或作为药物或营养组合物，或作为婴儿配方奶中的成分，直接向单独的子代口服施用(纯的，或稀释在例如水或母乳中)。如果子代是早产或具有低出生体重，这样的配方可以是婴儿″早产配方″，可以是"初始配方(starter formula)”或″后续配方(follow-on formula)”。配方还可以是低过敏原性(HA)配方，其中牛乳蛋白质是水解的。在实施例2中给出了这样的初始配方的实例。
[0085] (iii)向学步儿童、幼童和更大儿童，直到达约15岁，以及达到约20岁的青年施用：
[0086] 罗伊氏乳杆菌还可以以药物或营养组合物、成长奶(growing-up milk)、基于奶的饮料、食品增补剂、基于奶的酸乳酪、甜品和布丁、饼干和谷物棒、基于谷物和水果的饮料的形式，向学步儿童、幼童和青年施用。
[0087] (iv)向动物施用：
[0088] 罗伊氏乳杆菌还可以在水中，或以食品增补剂、药物或营养组合物、奶或宠物食物的形式向单独的动物口服施用。
[0089] 与其他化合物一起施用：
[0090] 罗伊氏乳杆菌可以单独施用(纯的，或稀释在水或奶中，包括例如母乳)，或在与其他化合物的混合物中施用(例如，食物增补剂、营养增补剂、药物、载体、调味品、易消化的或不易消化的成分)。维生素和矿物质是典型的食物增补剂的实例。在优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌在组合物例如婴儿配制食品中与增强对幼年哺乳动物的所述有益作用的其他化合物一起施用。这类协同性化合物可以是载体或基质，其促进罗伊氏乳杆菌递送至肠道，或者它们可以另外增强组合物对后代的肠神经系统的作用。这类化合物可以是协同地或单独地影响婴儿肠神经系统发育，和/或强化益生菌的作用的其他活性化合物。这类协同性化合物的实例是麦芽糊精。麦芽糊精的作用之一是提供益生菌的载体，增强其作用，以及防止聚集。
[0091] 本发明的可以包括在组合物特别是婴儿配制食品中的协同性化合物的其他实例是益生元化合物。益生元是不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激结肠中一种或有限种的细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主，从而改善宿主健康状态。这类成分在胃或小肠中不易被分解和吸收，因而完整通过到达结肠，在此它们被有益细菌选择性地发酵，在此意义上它们是不可消化的。益生元的实例包括某些低聚糖，例如，低聚果糖(FOS)、牛乳低聚糖(CMOS)和低聚半乳糖(GOS)。可以使用益生元的组合，例如，90％GOS和10％短链低聚果糖，例如，以商标 销售的产品，或10％菊粉，例如以商标 销售的产品。可以用于本发明的情境的益生元的其他实例包括获自奶或其他来源的低聚糖的组，任选地含有唾液酸、果糖、岩藻糖、半乳糖或甘露糖。优选的益生元有：低聚唾液糖(SOS)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚异麦芽糖(IMO)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯木聚糖(AXOS)、低聚甘露聚糖(MOS)、大豆低聚糖、葡糖基蔗糖(glycosylsucrose，GS)、乳蔗糖(lactosucrose，LS)、唾液基乳糖(SL)、岩藻糖基乳糖(FL)、乳糖-N-四糖(LNNT)、乳果糖(LA)、低聚异麦芽酮糖(PAO)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水 解产物、果胶、淀粉，和/或其水解产物。根据本发明的婴儿配制食品优选地进一步含有按照干组合物总重量的0.3到10％的数量的至少一种益生元。
[0093] 含有罗伊氏乳杆菌的组合物例如婴儿配制食品，可以含有数量不超过4.0、3.0或2.0g/100kcal，优选的1.8到2.0g/100kcal的蛋白质源。蛋白质的类型对于本发明不是关键的，只要满足了必需氨基酸含量的最低要求以及确保满意的生长，然而优选的是按蛋白质源重量的超过50％是乳清。在一个实施方式中，蛋白质含量在30％到80％乳清蛋白之间。因而，可以使用基于乳清、酪蛋白和其混合物的蛋白质源，以及基于大豆的蛋白质源。对于所涉及的乳清蛋白，蛋白质源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，可以包括按照任何期望比例的alpha-乳白蛋白和beta-乳球蛋白。
[0094] 蛋白质可以是完整的或水解的，或完整的和水解的蛋白质的混合物。人们可能希望的是提供部分地水解的蛋白质(水解度在2到20％之间)，例如，对于被认为处于发生牛奶过敏的风险中的婴儿。如果水解的蛋白质是期望的，水解过程可以按期望的和按照本领域已知的来进行。例如，可以通过在一个或更多个步骤中酶水解乳清来制备乳清蛋白水解产物。如果用作起始材料的乳清部分是基本上没有乳糖的，发现的是在水解过程期间蛋白质遭遇更少得多的赖氨酸阻断。这允许赖氨酸阻断的程度从按总赖氨酸重量的约15％降低到按赖氨酸重量的低于约10％；例如，按赖氨酸重量的约7％，其大大改善了蛋白质源的营养质量。
[0095] 组合物还可以包含碳水化物源和/或脂肪源。婴儿配制食品可以含有脂质源。脂质源可以是适合于在婴儿配制食品中使用的任何脂质或 脂肪。优选的脂肪源包括棕榈油精、高油酸葵花油和高油酸红花油。必需的脂肪酸、亚油酸和α-亚麻酸也可以添加，作为含有高数量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的少量的油，例如鱼油或微生物油。总起来，例如，脂肪含量优选地贡献配方的总能量的30到55％之间。脂肪源优选地具有约
5∶1到约15∶1，例如约8∶1到约10∶1的n-6比n-3的脂肪酸比例。
5∶1到约15∶1，例如约8∶1到约10∶1的n-6比n-3的脂肪酸比例。
[0096] 其他来源的碳水化物可以添加到营养组合物中。其优选地提供营养组合物的能量的约40％到约80％。可以使用任何适合的碳水化物，例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、淀粉糖浆干粉、麦芽糊精或其混合物。
[0097] 如果希望，可以添加额外的膳食纤维。如果添加，它优选地包含达到营养组合物的能量的约5％。膳食纤维可以来自任何适合的来源，包括，例如，大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜耳豆胶、阿拉伯树胶、低聚果糖或其混合物。适合的维生素和矿物质可以以符合适当指南的数量被包括在营养组合物中。
[0098] 可选地存在于婴儿配制食品中的矿物质、维生素和其他营养物的实例包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉毒碱。矿物质通常以盐形式添加。特定矿物质和其他维生素的存在和数量将根据预期的婴儿群体而变化。
[0099] 婴儿配制食品可以任选地含有可能具有有益效果的其他物质，例如，纤维、乳铁蛋白、核苷酸、核苷，等等。
[0100] 一种或更多种必需的长链脂肪酸(LC-PUFA)可以被包括在组合物中。可以添加的LC-PUFA的实例有二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。LC-PUFA可以以一定浓度添加，从而它们构成在组合物中存在的大于0.01％的脂肪酸。
[0101] 如果需要，一种或更多种食品级乳化剂可以被包括在营养组合物 中；例如，单甘油酯和双甘油酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和单甘油酯或双甘油酯，或其混合物。类似地，可以包括适合的盐和/或稳定剂。调味剂可以添加到组合物中。
[0102] 施用周期：
[0103] 施用的持续时间可以变化。虽然以相对短的施用持续时间预期了积极的效果(例如，对于新生儿在一到两周期间每天施用)，更长的持续时间被认为提供了增强的效果，或至少，在更大的婴儿(例如，三、五、八或十二个月)或在幼童(例如，达到4或6岁或甚至10岁的持续时间)中维持效果。施用可以继续直到儿童约十五岁或甚至约二十岁。对于向动物施用，适用相应的持续时间。
[0104] 一旦知道了怀孕，怀孕母亲可以开始服用罗伊氏乳杆菌。然而，施用持续时间也可以在妊娠开始之前开始，例如，如果该女性试图怀孕前开始。施用可以在妊娠开始后的任何时间开始。对于人类妊娠来说，可以在妊娠的相对晚期开始，优选的，在妊娠的第3、4、5、6、7、8或9个月开始，或对于其他哺乳动物在相应的时期，或者在预产期前两周。
[0105] 施用的时间可以是连续的(例如，直到和包括哺乳期直到断乳)或是不连续的。对于更为持续的效果，连续施用是优选的。然而，推测的是，不连续的模式(例如，在每个月的一周内，或在间隔的周数期间每天施用)可以对后代诱导积极的效果。
[0106] 施用可以覆盖妊娠期的至少一部分，或哺乳期的至少一部分，如果新生儿喝母乳，或在新生儿不喝母乳的情况下的相应时间。优选地，对怀孕母亲的施用持续时间基本上覆盖整个妊娠期，当然也可以更短。类似地，对哺乳母亲的施用持续时间优选地基本上覆盖整个哺乳期，当然这个时期也可以更短。
[0107] 优选地，对母亲的施用是每日服用(每日服用一次或两次)，或每周服用(每周服用一次或两次)。
[0108] 罗伊氏乳杆菌可以直接施用给婴儿。特别是如果母亲不母乳喂养或在她停止母乳喂养之后。然而，被母乳喂养的婴儿也可以通过直接施用来接受罗伊氏乳杆菌。
[0109] 优选地，向婴儿的施用是通过每日服用。例如，如果罗伊氏乳杆菌作为婴儿配制食品来施用，施用可以与每次喂食一起，即，对小于一岁的婴儿每天约四次到约六次，喂食的次数随年龄降低。对于超过一岁的婴儿，施用可以更少，每天一次或两次。对于学步儿和幼童，施用可以是每天的或每周的(每周服用一次或两次)。
[0110] 经由母乳喂养、或通过直接施用、或两种方法向婴儿施用可以持续直到六月龄，或甚至一岁或更大。因而，如果进行哺乳，罗伊氏乳杆菌可以在哺乳期间施用，或在部分或完全断乳之后施用。施用可以从婴儿持续到学步儿童期，甚至直到二十岁。
[0111] 罗伊氏乳杆菌施用的效果：
[0112] 施用给新生儿的罗伊氏乳杆菌促进有效认知功能的建立。在实施例1中详述的大鼠模型实验中，评估了罗伊氏乳杆菌施用对神经元成熟，具体是与高级认知功能相关的结构大脑皮层和海马中的神经元成熟的影响。
[0113] 在这个实验中，经历了母亲的饮食诱导的子宫内生长停滞的幼仔(PR组)，以及没有经历IUGR的幼仔(CTRL)从出生后2天起补充水(对照：即，CTRL-w和PR-w)或罗伊氏乳杆菌(PR-L.reuteri)。
[0114] 出生后2周，在处死时，通过皮层和海马中神经元标志物和神经营养因子的水平评估脑中的神经元发育。
[0115] 脑衍生的神经营养因子(BDNF)的提高的表达：
[0116] 脑衍生的神经营养因子(BDNF)是支持神经元的存活、生长和分化的神经营养因子[Huang，E.J.and Reichardt，L.F.(2001)]。文献中有许多报道将BDNF与学习和记忆联系起来[Aguiar，A.S.Jr.，et al. (2011)；Short bouts of mild-intensity physical exercise improve spatial learning and memory in aging rats：Involvement of hippocampal plasticity via AKT，CREB and BDNF signaling，Mech.Ageing Dev.，[付印前电子公开]]；
[0117] 评估处死时在幼仔的海马和皮层中BDNF(前体蛋白(PRO)，其随后蛋白水解裂解得到成熟形式(成熟的))的水平。结果在图1中显示。
[0118] 在PR-w幼仔中，在海马中，pro和成熟BDNF的水平维持在CTRL-w水平(图1A、B)，而与CTRL-w相比，在PR-w幼仔的皮层中成熟BDNF的水平稍微提高(图2B)。
[0119] 从PND2到PND14补充罗伊氏乳杆菌伴随着海马和皮层中pro和成熟BDNF的水平的显著提高。
[0120] 已经报道的是，在大鼠中学习和记忆功能障碍的药物诱发的改善与提高的BDNF表达水平相关[Dai，M.H.，et al.(2011)；Effect of venlafaxine on cognitive function and hippocampal brain-derived neurotrophic factor expression in rats with post-stroke depression，Zhejiang Da XueXueBao Yi Xue Ban，40(5)：527-34]。
[0121] 此外，已经报道的是，BDNF在海马塑性方面是重要的，其对学习和记忆有直接影响。[Aguiar，A.S.Jr.，et al.(2011)]。
[0122] BDNF表达水平在情绪方面也是重要的。[Hashimoto，K.(2010)；Brain-derived neurotrophic factor as a biomarker for mood disorders：an historical overview and future directions，Psychiatry Clin.Neurosci.，64(4)：341-57].Review.Erratum in：Psychiatry Clin Neurosci.2010Oct；64(5)：590。
[0123] 考虑这些数据和BDNF在神经元存活、生长和分化过程中的已知的作用，在当前动物模型中观察到的提高的表达水平可能会转化为在产后发育期间的生物学和认知益处和神经保护。
[0124] 生长相关蛋白43(GAP43)的提高的表达：
[0125] 生长相关蛋白(GAP43)是在发育期间在神经元生长锥中高度表达的生长和可 塑 性 蛋 白 [Mercken，M.et al.(1992)；Immunocytochemical detection of the growth-associated protein B-50by newly characterized monoclonal antibodies in human brain and muscle，J.Neurobiol.，23(3)：309-21]。它是神经元发育的标志物。[Denny，J.B.(2006)]。蛋白质的结构域所说明的各种相互作用被认为是它在突触可塑性、神经发生期间参与膜延伸、神经递质释放和长期增强作用方面起作用的基础 [Oestreicher，A.B.，et al.(1997)；B-50，the growth associated protein-43：
modulation of cell morphology and communication in the nervous system，Prog.Neurobiol.，53(6)：627-86]。
modulation of cell morphology and communication in the nervous system，Prog.Neurobiol.，53(6)：627-86]。
[0126] 此外，已经显示了GAP43对于记忆是重要的[Rekart，J.L.et al.(2005)；Hippocampal-dependent memory is impaired in heterozygous GAP43knockout mice，Hippocampus，15(1)：1-7]。
[0127] 近来报道的是，在妊娠期间的异氟烷暴露可能导致后代大鼠中出生后的空间记忆和学习损伤，这可以部分地由海马区中GAP43的下调所解释[Kong，F.J.et al.(2011)；Effects of isoflurane exposure during pregnancy on postnatal memory and
learning in offspring rats，Mol.Biol.Rep.，[Epub ahead ofprint]]。
learning in offspring rats，Mol.Biol.Rep.，[Epub ahead ofprint]]。
[0128] 在实施例1的动物模型中测量了GAP43的蛋白质表达水平，结果在图2中显示。在海马(图2A)和皮层(图2B)中测量了蛋白质水平。与CTRL-w相比，在PR-w幼仔的海马中GAP43的蛋白质水平显著地降低(P＝0.04)(图2A)，而在皮层中统计学上没有受影响(附图2B)。这反应了与对照相比，在PR-w幼仔的海马中降低的神经发生。
[0129] 从PND2到PND14补充罗伊氏乳杆菌显著地提高了两种脑部分中的GAP43蛋白质水平。这表明在神经元发育期间罗伊氏乳杆菌促进这些组织中神经发生的可能性，这可能在后续的生活期间转化为认知效 益。具体的，根据这些结果，以及我们所了解的关于GAP43在神经元成熟中的作用，我们可以确定，向幼年哺乳动物施用罗伊氏乳杆菌有助于海马和皮层中的神经元生长、存活、分化和可塑性，从而有助于学习和记忆，以及由此的心智表现。
[0130] GAP43对情绪调节也是重要的。近来，报道的是，在非人类灵长类中早期的亲代剥夺，在不存在随后的刺激的情况下，对有关突触功能和可塑性的基因的海马表达有长期影响。在狨猴模型中观察到的GAP43和血清素1A受体表达水平的降低与情绪失调中发现的是可比较的。据作者所说，这支持了这种可能性，后一种情绪失调反映了早期发育对疾病易感性的贡献[Law，A.J.et al.(2009)Early parental deprivation in the marmoset monkey produces long-term changes in hippocampal expression of genes involved in synaptic plasticity and implicated in mood disorder，Neuropsychopharmacology，May；34(6)：1381-94]。
[0131] 有趣地，GAP43的缺陷已经与孤独行为相联系[Zaccaria，K.J.，et al.(2010)；Resistance to change and vulnerability to stress：autistic-like features of GAP43-deficient mice，Genes Brain Behav.，9(8)：985-96]。
[0132] 因而，根据这一数据，人们可能猜测，根据本发明施用罗伊氏乳杆菌还可以帮助防止和/或减弱与GAP43相关的行为失调，例如孤独症和情绪失调。
[0133] GFAP(神经胶质纤丝酸性蛋白)和MBP(髓磷脂碱性蛋白)的提高的表达：
[0134] 在实施例1的动物模型中测量了神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达水平。结果在图3(GFAP，A为海马，B为皮层)和图4(MPB皮层)中显示。
[0135] 神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)是对于髓鞘形成、结构和维持，以及对于血脑屏障的适当功能重要的中间纤维蛋白[Eng，L.F.et al. (2000)；Glial fibrillary acidic protein：GFAP-thirty-one years (1969-2000)，Neurochem.Res.，25(9-10)：1439-51]。新近的报告显示，GFAP表达在出生后发育的早期阶段急剧提高[Kim，J.S.，et al.(2011)；
Differential patterns of nestin and glial fibrillary acidic protein expression in mouse hippocampus during postnatal development，J.Vet.Sci.，12(1)：1-6]。
Differential patterns of nestin and glial fibrillary acidic protein expression in mouse hippocampus during postnatal development，J.Vet.Sci.，12(1)：1-6]。
[0136] 髓磷脂碱性蛋白(MBP)是在神经的髓鞘形成过程中重要的蛋白质。
[0137] 在海马或在皮层中，GFAP的蛋白质水平不受蛋白质限制的影响(图3)。然而，通过罗伊氏乳杆菌补充，在两种脑部分中它显著提高了。这表明施用罗伊氏乳杆菌具有有益效果，与海马和皮层中GFAP的提高的表达水平相关，从而确保了髓鞘形成过程，维持神经元结构，以及血脑屏障的适当功能。
[0138] 髓鞘形成在人脑的发育期中起到关键作用，在完成之前，在出生后持续至少10到12年[Baumann，N.and Pham-Dinh，D.(2001)]。因而，髓鞘形成的发育速度决定了相关的脑功能的发育速度。
[0139] 髓鞘形成过程对于传递快速的神经信号传播是重要的，容许不同的脑区域内有效的组织连通性，改善对于认知、感觉和运动功能所需的连接独立的脑区的神经途径。
[0140] 因而，罗伊氏乳杆菌是新的营养解决方案，来在新生儿期促进脑的髓鞘形成发育过程。
[0141] 罗伊氏乳杆菌对髓鞘形成过程的这种效果通过MBP的提高的表达所证实，MBP是涉及神经的髓鞘形成过程的另一种蛋白质(图4)。
[0142] 实施例1中描述的实验的结果展现了，施用罗伊氏乳杆菌促进了皮层和海马中的神经元生长、存活、分化、可塑性。通过促进髓鞘形成和神经元可塑性，确保了正确的神经信号转导。因而，罗伊氏乳杆菌施用支持了认知功能的建立，特别是学习和记忆，以及由此的心智表现。
[0143] 罗伊氏乳杆菌的施用帮助阻止和/或降低认知功能损伤和/情绪反常/扰动的严重度。
[0144] 罗伊氏乳杆菌菌株是从母乳喂养的儿童的粪便微生物群中分离的益生菌。因而，对于尝试尽可能紧密地模拟母乳喂养儿童的微生物群的健康促进策略，施用罗伊氏乳杆菌，特别是向非母奶喂养儿童施用，可以提供与不在母乳喂养儿童中发现的其他菌株相比的优点。
[0145] 实施例1：
[0146] 动物研究(饲喂和处死)：
[0147] 动物试验在Office Vétérinaire Cantonal，Etat de Vaud认可的授权No.2120之下进行。从Harlan，Barcelona获得妊娠一周后的两月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠。在它们到达的当天，母鼠置于单独的笼子中，随机分为对照(CTRL)或蛋白质限制(PR)组。动物不限量得到食物和水，维持在12小时的光/暗周期下。
[0148] CTRL和PR母鼠的日粮在表1中详述。CTRL母鼠接受含有20％蛋白质(酪蛋白)的对照日粮，配合妊娠期间标准的大鼠蛋白质需要量(Reeves et al.，1993)。PR母鼠接受含有10％蛋白质(酪蛋白)的PR日粮。两种日粮是等热量的，蛋白质缺乏通过添加玉米淀粉来平衡。
[0149] 表1：对照(CTRL)和蛋白质限制(PR)AIN-93G日粮的组成日粮
[0150]
[0151]
[0152] CTRL和PR母鼠在妊娠和哺乳期间都接受它们各自的日粮，直到处死当天(产后14天(PND14))。
[0153] 在PND2，幼仔随机分配给来自同一实验组的母鼠，窝产仔数调节到每窝9只幼仔，每窝最少四到五只雄性。
[0154] 从PND2直到PND14，每天用手/吸移管饲喂的水或含罗伊氏乳杆菌溶液的增补剂分别施用给对照组或治疗组。增补剂的体积逐渐地调整来匹配大鼠幼仔的生长
(150μl/100g体重)。
(150μl/100g体重)。
[0155] 组别和日粮如下：
[0156] 1)CTRL-w：CTRL母鼠生出的CTRL幼仔，接受水的增补剂。
[0157] 2)PR-w：PR母鼠生出的PR幼仔，接受水的增补剂，
[0158] 3)PR-L.reuteri：PR母鼠生出的PR幼仔，接受冻干罗伊氏乳杆菌DSM17938的增9
补剂(1.10cfu/天)。
补剂(1.10cfu/天)。
[0159] 在PND14，来自CTRL和PR组的最多10只幼仔进行称重，在氟烷麻醉后通过断头术来处死。
[0160] 蛋白质表达水平的评估：
[0161] 在分离之后，来自每个组的PND14幼仔的海马和皮层用球形搅拌器Tissue Lyser II(Qiagen，USA)在PBS，pH7.4和完整的蛋白酶抑制物混合物(30mg组织每500μl溶液缓冲液，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)的溶液中均质化。测定蛋白质浓度(BCA，Bio Rad)。蛋白质(20-40微克，取决于评估的标志物)通过SDS-Page分离，转移到硝化纤维膜，随后在3％BSA中封闭。使用特异性抗体RbαBDNF(SantaCruz)、MseαGAP43/B50(Millipore)、MseαGFAP(Cell signaling)和MseαMBP(Millipore)评估BDNF(脑衍生的神经营养因子)、GAP43 (发育相关蛋白43)、GFAP(神经胶质纤丝酸性蛋白)和MBP(髓磷脂碱性蛋白)的相对水平。使用HRP-化学发光试剂(ECL plus，Amersham)进行检测，使用软件AIDA Basic来定量。
[0162] 统计：
[0163] 通过比较PR组和CTRL组来评估蛋白质限制的作用。通过比较PR-L.reuteri和PR组来评估罗伊氏乳杆菌补充的作用，通过比较PR-L.reuteri和CTRL组来评估最后向CTRL水平的恢复。非参数法用于分析数据。Wilcoxon秩和检验用于测试处理之间的差异。还获得了在其95％置信区间内配对式处理差异的Hodges-Lehmann估计。
[0164] 实施例2：
[0165] 下文给出了根据本发明使用的婴儿配制食品的组成的实例。仅通过举例的方式给出该组合物。蛋白质源是乳清蛋白和酪蛋白的常规混合。
[0166]
[0167]罗伊氏乳杆菌L.reuteri DSM 17938于2006年01月30日保存于德国DSM微生物菌
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