[0001]本发明涉及金属离子乳铁蛋白组合物的高压处理，尤其涉 及压力处理包含金属离子乳铁蛋白的组合物以维持或提高其保存性， 同时保持期望水平的金属离子结合度的方法。背景

[0002]提供具有有用保存期的安全产品的同时保持生物活性的 要求限制了在食品或其它可摄取的产品中递送生物活性组分(例如蛋 白质、脂质或其水解产物)。具有有用保存期的产品即具有良好的保存 性并且不易腐坏。

[0003]期望递送生物活性组分，这至少是因为这些组分在摄取时 具有生理活性，并能够具有积极的健康效益，其包括但不限于骨骼健 康、免疫效益、抗炎活性、心脏健康和癌症治疗的功效。

[0004]确保有用保存性的传统方法对食品等的生物活性具有消 极影响。特别是热处理的方法，对生产商业化的无菌生物活性产品并 非都适用。例如，对商业化乳制品中免疫球蛋白的分析显示尽管 60-75％的免疫球蛋白可在巴氏灭菌法处理后得以保存，但是在UHT 或罐装(蒸发处理)的牛奶中，免疫球蛋白的水平几乎可以忽略不计 (Li-Chan等人，1995)。通过使用比罐装产品稍低的温度加热可完成对 酸性食品的商用灭菌，但是在加热时，免疫球蛋白由于酸化而对变性 的敏感性有所加剧(Dominguez等人，2001)。

[0005]生物活性产品、成分和食品生产中的某些方法可导致部分 或全部丧失生物活性。就基于乳制品的成分和食品而言，可影响到生 物活性的涉及加热的步骤包括热巴氏灭菌法(thermal pasteurisation)、 匀浆化(homogenisation)、热化(thermalisation)、蒸发和干燥。就食品加 工而言，可影响生物活性的加热步骤的实例包括发酵前的热处理，UHT 处理、干馏、热填充和热包装。在食品生产过程中，生物活性组分通 常经历一道或者多道这样的加热步骤。这对于乳制品尤其如此，其中 处理通常包括最初的巴氏灭菌步骤，并且其典型地包括包装和销售前 的进一步加热步骤。Korhonen等人(1998)报道称，加热到60℃至90℃ 的温度范围使蛋白质变性，因此降低了生物活性蛋白的活性。

[0006]用巴氏灭菌乳所生产的产品的干燥可用于改善保存性，同 时损失高达40％的免疫球蛋白(Li-Chan，1995)，但是其商业应用限于 直接食用(例如奶片)或新鲜产品(例如酸乳酪)，其中干燥过的生物活性 成分不再进行后续加热。由干燥和加热所造成的损失可通过补充具有 所关注的生物活性的中间产品或最终产品来补偿，但是这可能增加末 端消费者的费用。

[0007]使用约350MPa以上压力的压力处理可使肉制品、蔬菜和 水果类产品(例如分别为熟火腿、鳄梨产品和果汁)的保存性达到商业 上可用的改进。然而，Huppertz等人(2002)报道称，高压使乳中的乳 清蛋白变性。此外，Korhonen等人(1998)报道称，在多数情况下，约 500MPa或以上压力的压力处理使蛋白质不可逆地变性。Felipe等人 (1997)报道了在500MPa压力下山羊乳中发生可测量水平的免疫球蛋 白变性。

[0008]Masuda等人(2001)报道称，大于等于400MPa的压力无法 用于改善牛初乳的保存性，因为这样的压力可使免疫球蛋白变性。

[0009]Tonello等人(1992)报道称，可使用200MPa压力处理2小 时来保持至少85％的免疫球蛋白活性，尽管初乳中的微生物含量仅下 降了2个对数周期(log cycle)。在63℃时同样的处理能够使微生物含 量下降到检测限以下(超过7个对数周期)，但会使至少50％的免疫球 蛋白活性丢失。

[0010]在特定pH值(Tomita等人，1994)下，出于特定目的(例如 酒或饮料；参见Tanaka等人，1991)，热处理是当前公认的用于各种 应用的乳铁蛋白溶液的商业化灭菌方法。尽管乳铁蛋白在低pH值(酸 性)下由于铁的亲和力降低而必然损失某些铁(Baker等人，2002)，但 是这种损失直到pH下降到4.0以下才会变得很明显(Groves，1960； Bluard-Deconinck等人，1978；Tweedie等人，1994；Parry和Brown， 1974)。然而，对于诸如饮料(pH3.8-4.0，85℃处理10分钟)和酸乳 酪(pH3.8-4.0，90℃处理10分钟)等多种重要的应用，推荐的热处理 所导致的铁(或定向的铁结合)损失会超过仅仅由于低pH所造成的铁 损失。此外，乳铁蛋白重新结合铁的能力会显著降低。在有利于化学 计量的铁结合的较高pH值下，乳铁蛋白热稳定性降低(Steijns和van Hooijdonk，2000)，并且在这样的pH值下，在热处理中也造成铁损失， 同时伴随着铁结合能力的损失。因此，热处理可限制铁乳铁蛋白(iron lactoferrin)在各种应用中的使用，不论是低pH值下的应用(例如酸乳 酪、果冻和酸性饮料)还是较宽pH范围下的应用(例如在中性pH下的 思木西(smoothies)和其它应用)。

[0011]存在对能够为诸如食品或其它可摄取产品等的生物活性 产品提供商业上可用的保存性，同时保持至少一种生物活性组分的生 物活性的处理方法的需求。

[0012]因此，本发明的目的旨在提供防止包含金属离子乳铁蛋白 的组合物中不想要的微生物的生长，同时保存期望水平的金属离子结 合度(metal ion binding)的改良或可供选择的方法，或者至少向公众提 供可用的选择。发明概述

[0013]因此，本发明的一方面涉及处理组合物以维持或提高其保 存性的方法，该方法包括(a)提供包含金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体 (functional variant)或片段的组合物，以及
(b)在可防止至少一种不想要的微生物的生长的处理压力下对所 述组合物进行压力处理。

[0014]本发明的另一个方面涉及处理组合物以维持或提高其保 存性的方法，该方法包括(a)提供包含金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段 的组合物，
(b)选择可防止至少一种不想要的微生物的生长的处理压力，以及
(c)在所述处理压力下对所述组合物进行压力处理。

[0015]本发明的另一个方面涉及处理组合物以维持或提高其保 存性的方法，其包括(a)提供包含金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段， 并且具有约3.0至约8.0或者更高的pH范围的组合物，以及
(b)在约350MPa至1000MPa的处理压力下，对所述组合物进行 压力处理。

[0016]本发明的另一个方面涉及处理组合物以维持或提高其保 存性的方法，该方法包括(a)提供包含金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段 以及一种或多种不想要的微生物，并且具有约3.0至约8.0或更高的 pH值范围的组合物，以及，
(b)在约350MPa至1000MPa之间选择可防止至少一种不想要的 微生物的生长并且使金属离子与乳铁蛋白或其功能性变体或片段的结 合至少保持在期望水平的处理压力，以及
(c)在所述处理压力下对所述组合物进行压力处理。

[0017]以下实施方案可涉及上文描述的任一方面。

[0018]在一实施方案中，所述组合物包含至少约0.1mg/ml，优选 为约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5 mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、 70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、200mg/ml、 400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、800mg/ml、900mg/ml 或1000mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段， 可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约0.1mg/ml至1000 mg/ml、约1mg/ml至1000mg/ml、约2mg/ml至1000mg/ml、约3mg/ml 至1000mg/ml、约4mg/ml至1000mg/ml、约5mg/ml至1000mg/ml、 约10mg/ml至1000mg/ml、约0.1mg/ml至100mg/ml、约1mg/ml 至100mg/ml、约2mg/ml至100mg/ml、约3mg/ml至100mg/ml、约 4mg/ml至100mg/ml、约5mg/ml至100mg/ml、以及约10mg/ml至 100mg/ml)。

[0019]在另一实施方案中，所述组合物或产品主要由或由金属离 子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段组成。

[0020]另一实施方案中，所述组合物或产品包含、主要由或由至 少约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、99％、99.5％或100％重量比的金属离子乳铁蛋白或 其金属离子功能性变体或片段组成，并且可用的范围可选自这些值中 的任意值之间(例如约0.01％至约100％、约0.05％至约100％、约0.1％ 至约100％、约0.5％至约100％、约1％至约100％、约5％至约100％、 约10％至约100％、约15％至约100％、约20％至约100％、约25％至 约100％、约30％至约100％、约35％至约100％、约40％至约100％、 约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至 约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、 约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至 约100％、约99％至约100％、约0.01％至约0.05％、约0.01％至约0.1％、 约0.01％至约0.5％、约0.01％至约1％、约0.01％至约5％、约0.01％ 至约10％、约0.01％至约15％、约0.01％至约20％、约0.01％至约25％、 约0.01％至约30％、约0.01％至约35％、约0.01％至约40％、约0.01％ 至约45％、约0.01％至约50％、约0.01％至约55％、约0.01％至约60％、 约0.01％至约65％、约0.01％至约70％、约0.01％至约75％、约0.01％ 至约80％、约0.01％至约85％、约0.01％至约90％、约0.01％至约95％、 约0.01％至约99％、以及约0.01％至约99.9％)。

[0021]在一实施方案中，向所述组合物或产品中加入主要由或由 金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段或其混合物组成的 组合物。即，将主要由或由金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变 体或片段或其混合物组成的组合物加入到组合物或产品中以增加金属 离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段或其混合物的浓度。

[0022]在一实施方案中，所述组合物包含一种或多种不想要的微 生物，例如一种或多种细菌(包括一种或多种益生菌)、一种或多种真 菌、一种或多种霉菌、一种或多种酵母菌、一种或多种藻类或其混合 物。应当理解，在一实施方案中，本文使用的方法优选地旨在防止至 少一种不想要的微生物的生长。然而，该方法通常是预防性方法，实 际上可能并没有任何不想要的微生物存在。在该情况下，使用所述方 法是为了维持或改善保存性，或是为了遵守食品安全要求、现行生产 质量管理规范或法规要求。无论是否存在不想要的微生物，本文所用 的压力处理方法使至少一种生物活性组分的活性至少保持在期望的水 平，并且该方法用于维持或提高保存性。

[0023]在一实施方案中，所述方法防止至少一种不想要的微生物 的生长，同时使金属离子饱和度(metal ion saturation)至少保持在期望 的水平。即，在基本上不影响存在的任何乳铁蛋白多肽或其功能性变 体或片段的金属离子饱和度的情况下，所述方法防止不想要的微生物 的生长。

[0024]在一实施方案中，金属离子是选自铝离子、钙离子、铜离 子、铬离子、钴离子、金离子、铁离子、锰离子、镁离子、铂离子、 钌离子、硒离子和锌离子的离子。金属离子优选为铁离子。

[0025]在一实施方案中，乳铁蛋白选自绵羊乳铁蛋白、山羊乳铁 蛋白、猪乳铁蛋白、小鼠乳铁蛋白、水牛乳铁蛋白、骆驼乳铁蛋白、 牦牛乳铁蛋白、马乳铁蛋白、驴乳铁蛋白、驼马(llama)乳铁蛋白、牛 乳铁蛋白或人乳铁蛋白或者其混合物。乳铁蛋白优选为牛乳铁蛋白。

[0026]在一实施方案中，乳铁蛋白是重组乳铁蛋白、合成乳铁蛋 白或天然乳铁蛋白或其混合物。

[0027]在一实施方案中，金属离子乳铁蛋白或其金属离子饱和功 能性变体或片段的金属离子饱和度至少为约5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、99.5％或100％。可用的范围可选自上述值中的任意值之间(例如 约5％至约100％、约10％至约100％、约15％至约100％、约20％至约 100％、约25％至约100％、约30％至约100％、约35％至约100％、约 40％至约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约 100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约 75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约 100％、约95％至约100％、以及约99％至约100％)。

[0028]在一实施方案中，金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性 变体或片段的金属离子饱和度至少为约105％、110％、115％、120％、 125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、 170％、175％、180％、185％、190％、195％或200％，可用的范围可选 自上述值中的任意值之间(例如约105％至约150％)。

[0029]在一实施方案中，组合物或产品提供了乳铁蛋白多肽或其 功能性变体或片段组，其中该组中至少约5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、 99.5％或100％可用的金属离子结合袋(binding pocket)与金属离子结 合，优选与铁离子结合，可用的范围可选自上述值中的任意值之间(例 如，约5％至约100％、约10％至约100％、约15％至约100％、约20％ 至约100％、约25％至约100％、约30％至约100％、约35％至约100％、 约40％至约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至 约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、 约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至 约100％、约95％至约100％、以及约99约100％)。

[0030]在一实施方案中，组合物或产品提供了乳铁蛋白多肽或其 功能性变体或片段组，其中该组中约100％可用的金属离子结合袋与金 属离子结合，优选与铁离子结合，其它的金属离子与非特异性结合位 点上的乳铁蛋白分子结合，使得乳铁蛋白基于化学计量是105％、 110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、 155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或 200％的金属离子。

[0031]可用的金属离子饱和度范围包括约25％至约200％、约30％ 至约200％、约35％至约200％、约40％至约200％、约45％至约200％、 约50％至约200％、约55％至约200％、约60％至约200％、约65％至 约200％、约70％至约200％、约75％至约200％、约80％至约200％、 约85％至约200％、约90％至约200％、约95％至约200％、以及约100％ 至约200％的金属离子饱和度。

[0032]在一实施方案中，处理后的金属离子饱和度值选自上述列 出的数值或范围。

[0033]在一实施方案中，金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性 片段的变体保持约至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的金属离子结合。

[0034]在一实施方案中，所述方法包括金属离子乳铁蛋白和至少 一种金属离子功能性变体或其片段的混合物的给药。

[0035]在一实施方案中，处理压力选自至少约350MPa、360MPa、 370MPa、380MPa、390MPa、400MPa、410MPa、420MPa、430MPa、 440MPa、450MPa、460MPa、470MPa、480MPa、490MPa、500MPa、 510MPa、520MPa、530MPa、540MPa、550MPa、560MPa、570MPa、 580MPa、590MPa、600MPa、610MPa、620MPa、630MPa、640MPa、 650MPa、660MPa、670MPa、680MPa、690MPa、700MPa、750MPa、 800MPa、850MPa、900MPa、950MPa和1000MPa或更高，可用的 范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约350MPa至约400MPa、 约350MPa至约450MPa、约350MPa至约500MPa、约350MPa至 约550MPa、约350MPa至约600MPa、约350MPa至约650MPa、 约350MPa至约700MPa、约350MPa至约750MPa、约350MPa至 约800MPa、约350MPa至约850MPa、约350MPa至约900MPa、 约350MPa至约950MPa、以及350MPa至约1000MPa、约400MPa 至约1000MPa、约450MPa至约1000MPa、约500MPa至约1000MPa、 约550MPa至约1000MPa、约600MPa至约1000MPa、约650MPa 至约1000MPa、约700MPa至约1000MPa、约750MPa至约1000MPa、 约800MPa至约1000MPa、约850MPa至约1000MPa、约900MPa 至约1000MPa、约950MPa至约1000MPa、约500MPa至约550MPa、 约500MPa至约600MPa、约500MPa至约650MPa、约500MPa至 约700MPa、约500MPa至约750MPa、约500MPa至约800MPa、 约550MPa至约800MPa、约600MPa至约800MPa、约650MPa至 约800MPa、约700MPa至约800MPa、约750MPa至约800MPa、 约400MPa至约800MPa、约400MPa至约750MPa、约400MPa至 约700MPa、约400MPa至约650MPa、约400MPa至约600MPa、 约450MPa至约800MPa、约450MPa至约750MPa、约450MPa至 约700MPa、约450MPa至约650MPa、约450MPa至约600MPa、 约500MPa至约800MPa、约500MPa至约750MPa、约500MPa至 约700MPa、约500MPa至约650MPa、约500MPa至约600MPa、 约525MPa至约675MPa、约550MPa至约650MPa、以及约575MPa 至约625MPa)。处理压力优选为至少约350MPa、400MPa、450MPa、 500MPa或600MPa。

[0036]在另一实施方案中，当所述组合物进行压力处理时，其pH 为至少约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6。8、6.9、 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0或更高，可 用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约pH3.0至约pH4.5、 约pH3.0至约pH5.0、约pH3.0至约pH5.5、约pH3.0至约pH6.0、 约pH3.0至约pH6.5、约pH至约pH7.0、约pH3.0至约pH7.5、约 pH3.0至约pH8.0、约pH3.1至约pH4.9、约pH3.2至约pH4.8、约 pH3.3至约pH4.7、约pH3.4至约pH4.6、约pH3.5至约pH4.5、约 pH3.6至约pH4.4、约pH3.7至约pH4.3、约pH3.8至约pH4.2、约 pH3.9至约pH4.1、约pH3.1至约pH8.0、约pH3.2至约pH8.0、约 pH3.3至约pH8.0、约pH3.4至约pH8.0、约pH3.5至约pH8.0、约 pH3.6至约pH8.0、约pH3.7至约pH8.0、约pH3.8至约pH8.0、约 pH3.9至约pH8.0、约pH4.0至约pH8.0、约pH4.5至约pH8.0、约 pH5.0至约pH8.0、约pH5.5至约pH8.0、约pH6.0至约pH8.0、约 pH6.5至约pH8.0、以及约pH7.0至约pH8.0)。或者，在另一实施方 案中，在进行压力处理前，将所述组合物的pH调节至上述列出的pH 或pH范围内。

[0037]在一实施方案中，在环境温度下使用所述方法。优选地， 在至少约0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、 40℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温度下进行压力处理，可用的范 围可选自上述值中的任意值之间(例如，约5℃至约40℃)。

[0038]在一实施方案中，可应用所述处理压力约1秒至约30分 钟的处理时间。所述处理时间优选地选自约1秒、5秒、10秒、20秒、 30秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270 秒或300秒或约0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分 钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9 分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40 分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟，并且可用的范围可选自 这些值中的任意值之间(例如，约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5 分钟或约2分钟至约4分钟)。

[0039]另一实施方案中，在处理时间内使处理压力基本上保持为 常数。在另一实施方案中，在处理时间内将处理压力从环境压力(通常 是大气压力)升高至处理压力，然后返回到环境压力。环境压力通常为 大气压力。

[0040]应当理解，在一实施方案中，上文列出的一段处理时间是 将压力从大气压力升高到处理压力然后返回到大气压力所用的时间。 从而，在一实施方案中，1分钟的处理时间是指在1分钟内将压力从 大气压力升高到处理压力，然后返回到大气压力。

[0041]应当理解，在另一实施方案中，上文列出的一段处理时间 是将压力维持在所述处理压力下的时间(“停留时间”)。从而，在一 实施方案中，1分钟的处理时间是指将压力维持在所述处理压力1分 钟。因此，在该实施方案中，0分钟处理时间(或“不停留”)是指将压 力升高至所述处理压力但是不停留，然后压力返回至大气压力。在该 实施方案中，优选的处理时间包括0分钟(不停留)、0.5分钟、1分钟、 1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5 分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分 钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。优选地，使所述压力维持约0分钟、 0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4 分钟、4.5分钟或5分钟，或者使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1 分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟或3分钟，或者约0分钟。

[0042]在一可供选择的实施方案中，总处理时间小于约0.5分钟、 1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5 分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、 8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。也就是说，将压力从环境压力 (通常为大气压力)升高然后返回至环境压力所用的时间小于约0.5分 钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、 4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8 分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。所述时间优选小于约8 分钟、优选小于约7分钟、优选小于约6分钟或优选小于约5分钟。

[0043]在另一实施方案中，所述组合物可以进行附加的压力处 理。处理压力可以从一处理压力变为另一处理压力，无需首先返回至 大气压力。每一压力处理可在单独的处理时间内进行。从而，在一实 施方案中，将压力从环境压力升高至第一处理压力维持第一处理时间， 然后将所述压力转变为第二处理压力维持第二处理时间。优选地，第 一处理时间比第二处理时间长。优选地，第一处理时间比第二处理时 间短。在另一实施方案中，在所述处理时间内将压力升高至第一处理 压力，然后再转变为第二处理压力。

[0044]在一实施方案中，使所述组合物并入产品前处于所述处理 压力下。在另一实施方案中，使所述组合物在并入产品后处于所述处 理压力下。从而，所述方法还包括使组合物在并入产品前或后处于所 述处理压力下。

[0045]在另一实施方案中，使所述组合物在包装前处于所述处理 压力下。在另一实施方案中，使所述组合物在包装后处于所述处理压 力下。从而，所述方法还包括使所述组合物在包装前或后处于所述处 理压力下。

[0046]在一实施方案中，处理压力为约600MPa，停留时间为约 0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。另一优选的实施方案中，处理压力 为约400MPa，停留时间小于约30分钟。

[0047]在一优选的实施方案中，处理压力为约350MPa至650 MPa，停留时间为约0分钟至约5分钟。所述组合物优选为酸乳酪。

[0048]在一优选的实施方案中，处理压力为约350MPa至650 MPa，停留时间为约0分钟至约5分钟。所述组合物优选为饮料

[0049]在一优选的实施方案中，处理压力为约350MPa至650 MPa，停留时间为约0分钟至5分钟。所述组合物优选为发酵饮料。

[0050]在一优选的实施方案中，处理压力为约350MPa至650 MPa，停留时间为约0分钟至5分钟。所述组合物优选为酸性饮料、 液体浓缩物(包括凝胶)或酸乳酪。

[0051]在一优选的实施方案中，处理压力为约350MPa至700 MPa，停留时间为约0分钟至30分钟，组合物的pH为约pH3.0至约 pH8.0，并且所述组合物为饮料(包括酸化饮料、中性饮料或碳酸饮料)、 酸乳酪或果冻。

[0052]在一实施方案中，所述组合物包含乳品蛋白质或乳品成 分。乳品蛋白组合物或乳品成分优选为重组的或新鲜的全脂乳、重组 的或新鲜的脱脂乳、复制的全脂或脱脂奶粉、脱脂乳浓缩物、脱脂乳 分离物、全脂或脱脂奶粉、脱脂乳渗余物(retentate)、炼乳、酪乳、超 滤乳渗余物(ultrafiltered milk retentate)、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白 分离物(MPI)、脱钙乳蛋白浓缩物、脱钙乳蛋白分离物、低脂乳、低脂 乳蛋白浓缩物、低脂乳蛋白分离物、初乳、初乳分馏物、初乳蛋白浓 缩物(CPC)、初乳乳蛋白浓缩物、初乳乳蛋白分离物，初乳乳清、初乳 乳清蛋白浓缩物，初乳乳清蛋白分离物、来自初乳的免疫球蛋白分馏 物、乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、甜乳清(sweet whey)、乳酸乳清、无机酸乳清、复制的乳清粉、超免疫乳、超免疫乳 蛋白浓缩物，超免疫乳蛋白分离物、超免疫乳清、超免疫乳清蛋白浓 缩物，超免疫乳清蛋白分离物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓缩 物，超免疫初乳乳蛋白分离物、超免疫初乳乳清、超免疫初乳乳清蛋 白浓缩物、超免疫初乳乳清蛋白分离物、得自任何乳或初乳工业生产 液流的组合物、得自通过任何乳或初乳工业生产液流的超滤或微滤所 获得的渗余物或渗透物(permeate)的组合物、或得自通过任何乳或初乳 工业生产液流的色谱分离所获得的穿透的或吸附的分馏物的组合物、 或这些组合物中任一组合物的全部或部分水解物、或其混合物。

[0053]所述乳品成分优选地源自奶牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、 水牛、骆驼、牦牛、马、驴、驼马或人、或者上述各种源乳品成分的 混合物。

[0054]在另一实施方案中，所述组合物或产品还包含选自溶菌 酶、免疫球蛋白、糖巨肽、包含至少约1％重量比的免疫球蛋白的组合 物、通过给动物接种以提高抗体水平所制备的产物、免疫乳及其混合 物的组分。

[0055]在另一实施方案中，所述组合物或产品还包含选自非极性 脂质和诸如磷脂、鞘脂、神经节苷脂、神经酰胺等的极性脂质以及其 混合物的组分。

[0056]在另一实施方案中，所述组合物或产品还包含至少约1％ 重量比的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含一种或多种的IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM。

[0057]在一实施方案中，所述组合物或产品为食品。所述食品优 选为酸性饮料或碳酸饮料。所述食品优选为包括凝固型(set)、搅拌型、 调味型、水果型以及益生菌型(probiotic)酸乳酪在内的酸乳酪，法国白 芝士(fromage frais)，新鲜优格芝士(petit suisse)，粗制脱脂酸奶干酪 (quarg)，发酵食品或饮料，酸化饮料或乳制品。所述食品优选为果冻。

[0058]在一实施方案中，所述组合物还包含选自乳酸菌 (Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠 菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、 丙酸杆菌(Propionibacterium)、肠球菌(Enterococcus)或芽胞杆菌 (Bacillus)或其混合物的益生微生物。

[0059]在一实施方案中，所述组合物还包含选自嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲 乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)、两歧双歧杆菌(Bifidiobacterium bifidum)、短 双歧杆菌(Bifidiobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、动物双歧杆菌subsp.Lactis(Bifidiobacterium animalis subsp. Lactis)、长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)、或嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)或其混合物的益生微生物。

[0060]在一实施方案中，所述组合物还包含选自鼠李糖乳杆菌 HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)(AGAL NM97/09514)、动物 双歧杆菌subsp.Lactis HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)(AGAL NM97/09513)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acdoophilus HN017)(AGAL NM97/09515)、鼠李糖乳杆菌HN067 (Lactobacillus rhamnosus HN067)(AGAL NM97/01925)(US6,379,663 中对其全部进行了描述)、约氏乳杆菌NCC533(Lactobacillus johnsonii NCC533)(La1)(CNCM I-1225)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosusGG)(ATCC 53103)、养乐多代田菌(Lactobacillus casei Shirota)(FERM-P4751)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidoohilus NCFM)(ATCC 700396)、植物乳杆菌299v(Lactobacillus plantarum 299v) (DSMZ 9843)、干酪乳杆菌DN114001(Lactobacillus casei DN114001)(CNCM I-1518)、唾液乳杆菌UCC4331(Lactobacillus salivarius UCC4331)(NCIMB 40829)、动物双歧杆菌subsp.Lactis BB12 (Bifidiobacterium animalis subsp.lactis BB12)(ATCC 27536和DSMZ 10140)、或婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)35624(NCIMB 41003)或其混合物的益生微生物。不想要的生物或益生微生物优选包 括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HN001、动物双歧杆菌subsp. Lactis HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)、嗜酸乳 杆菌(Lactobacillus acidophilus)HN017、或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) HN067或其混合物。

[0061]在一实施方案中，益生微生物是灭活的益生微生物。灭活 的益生微生物可以是不能存活的、不能存活但仍具有代谢活性的或死 亡的。

[0062]本发明的另一方面涉及根据本发明方法处理的或产生的 组合物或产品。

[0063]本发明的另一个方面涉及根据本发明方法处理的生产的 组合物或产品在食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、 营养品、医疗食品(medical food)、营养药品(nutraceutical)、药剂或药 物的制造中的用途。

[0064]在一实施方案中，所述用途为用于刺激骨骼生长、抑制骨 吸收、刺激软骨细胞增殖、刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞发育、 或治疗或预防骨骼、关节或软骨病症。

[0065]在一实施方案中，所述用途为用于抑制个体中肿瘤形成， 诱导个体中细胞凋亡、诱导个体中肿瘤细胞凋亡、抑制个体中血管生 成、抑制个体中肿瘤血管生成、维持或提高个体中的白细胞数和红细 胞数或两者之一、刺激个体中的免疫系统、提高个体中肿瘤内的Th1 和Th2细胞因子的产生、提高个体中肠内的Th1和Th2细胞因子的产 生、提高个体中体循环内Th1和Th2细胞因子的水平、提高个体中的 抗肿瘤免疫应答、提高个体对癌症治疗的应答性或提高个体中肿瘤对 癌症治疗的应答性。

[0066]在一实施方案中，所述用途为用于治疗或预防缺铁性贫血 或与怀孕有关的缺铁症、用于提高贫血患者的血红蛋白数或用于吸收 不良的肠更新(gut renewal)治疗。

[0067]本发明的另一方面涉及刺激骨骼生长、抑制骨吸收、刺激 软骨细胞增殖、刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞的发育、或治疗或 预防骨骼、关节或软骨病症的方法，该方法包括将本发明的组合物或 产品对有需要的个体给药。

[0068]本发明的另一个方面涉及抑制个体中肿瘤形成、诱导个体 中细胞凋亡、诱导个体中肿瘤细胞凋亡、抑制个体中血管生成、抑制 个体中肿瘤血管生成、维持或提高个体中的白细胞数和红细胞数或两 者之一、刺激个体中免疫系统、提高个体中肿瘤内的Th1和Th2细胞 因子产生、提高个体中肠内的Th1和Th2细胞因子产生、提高个体体 循环内Th1和Th2细胞因子水平、提高个体中的抗肿瘤免疫应答、提 高个体对癌症治疗的应答性的方法，该方法包括将本发明的组合物或 产品对有需要的个体给药。

[0069]本发明的另一方面涉及治疗或预防缺铁性贫血或与怀孕 有关的缺铁症、提高贫血患者的血红蛋白数或吸收不良的肠更新治疗 的方法，该方法包括将本发明的组合物或产品对有需要的个体给药。

[0070]其它方面涉及包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的金属离子 乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及小于约50,000cfu/ml的 微生物的压力处理的组合物；包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的金属 离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及小于约50,000 cfu/ml的微生物的压力处理的果冻；包含约0.1mg/ml至1000mg/ml 的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及小于约 50,000cfu/ml的微生物的压力处理的酸乳酪；包含约0.1mg/ml至1000 mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及小于 约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的饮料；包含约1mg/ml至1000 mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及小于 约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物；包含约1mg/ml至 1000mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及 小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的果冻；包含约1mg/ml至 1000mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段以及 小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的酸乳酪；或包含约1mg/ml 至1000mg/ml的金属离子乳铁蛋白或其金属离子功能性变体或片段 以及小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的饮料。

[0071]若有的话，本文将上文和下文中所引用的所有申请、专利 和出版物的全部公开内容引入作为参考。

[0072]本发明所公开的供参考的数字范围(例如，1至10)还旨在 将本范围内供参考的全部有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、 6.5、7、8、9和10)与本范围内任意有理数范围(例如，2至8、1.5至 5.5以及3.1至4.7)合并在一起，并且因此本发明所清楚公开的所有范 围的子范围是清楚公开的。仅列举具有特定意图的实例，并且认为所 列举的最低值和最高值之间全部可能的数值联合是以相似方式在本申 请中清楚声明的。

[0073]本发明广义而言包括本申请的说明书单独地或联合地指 出的或说明的所述部分、元素和特征，包括包括任意两个或两个以上 所述部分、元素或特征的任一部分、元素或特征或部分、元素和特征 的所有组合，其中本文提及的具体整数具有本发明涉及领域的已知等 同物，将该已知等同物视为与单独提出的整数一样被并入本发明中。附图的简要描述

[0074]图1为概述对照铁乳铁蛋白(FeLF)酸乳酪、热处理的FeLF 酸乳酪和压力处理(HPP)的FeLF酸乳酪的生产的流程图。

[0075]图2为概述标准(热处理的)酸性饮料、未处理的(对照)酸性 饮料和压力处理的酸性饮料的生产的流程图。

[0076]图3为概述对照(未处理的)FeLF果冻和压力处理的FeLF 果冻的生产的流程图。

[0077]图4为概述对照(未处理的)FeLF碳酸饮料和压力处理的 LF碳酸饮料的生产的流程图。发明的详细描述
1.定义

[0078]本说明书和权利要求中所用术语“包含”指“至少部分 由......组成”。当解释本说明书和权利要求中包含该术语的叙述时，在每 一叙述中以该术语起始的特征都必须存在，但是其它特征也可以存在。 诸如“包含(comprise)”和“包含(comprised)”的相关术语以相同方式来 解释。

[0079]术语“增强免疫系统”和“刺激免疫系统”(以及该术语的 不同时态)是指金属离子乳铁蛋白刺激抗原特异性细胞溶解活性(免疫 细胞的活性，尤其是细胞毒性T淋巴细胞的活性)和/或NK细胞活性 的产生的能力，改善对抗原的细胞免疫反应的能力(通过至少细胞毒性 T淋巴细胞的作用)，改善免疫保护的能力(通过至少恢复细胞毒性T 淋巴细胞的活性和/或NK细胞的活性以及增强细胞因子的产生)，恢复 免疫保护的能力(通过至少恢复或刺激细胞毒性T淋巴细胞的活性和/ 或NK细胞的活性以及增强细胞因子的产生)或产生促炎介质和免疫调 节介质(Th1和Th2细胞因子)的能力。

[0080]术语“功能性片段”是指天然产生或非天然产生的具有1 个或2个金属离子结合袋，并且能够在至少一个结合袋中结合金属离 子的部分乳铁蛋白多肽。可用的乳铁蛋白片段包括截短的乳铁蛋白多 肽、金属离子结合的乳铁蛋白水解物、包含N叶(N-lobe)结合袋的片 段(包括但不限于N叶序列)、包含C叶结合袋的片段(包括但不限于C 叶序列)以及下文所讨论的通过已知技术产生(通过人工或天然方法) 和鉴定的金属离子结合的片段。

[0081]术语“功能性变体”是指每个乳铁蛋白分子能够结合两个 金属离子的乳铁蛋白多肽的变体。

[0082]当用于涉及乳铁蛋白多肽、功能性变体或片段时，术语“糖 基化的”是指乳铁蛋白被天然产生或非天然产生的人或牛的糖基基团 全部或部分地糖基化。糖基化和非糖基化形式的乳铁蛋白是公知的(参 见Pierce等，(1991)；Metz-Boutigue等，(1984)；van Veen等，(2004))。

[0083]术语“提高个体的应答性”是指与不使用本发明方法的个 体相比，个体在肿瘤生长速率、肿瘤尺寸或疾病的临床症状上显示出 更大的下降。

[0084]术语“提高肿瘤的敏感性”是指肿瘤在肿瘤生长速率、肿 瘤尺寸上表现出更大的下降，或者肿瘤被根除，而没有使用本发明方 法处理的肿瘤未表现出这些效果。

[0085]术语“抑制肿瘤形成”是指肿瘤不形成，或肿瘤形成但并 不建立或生长，或肿瘤形成但保持很小、是良性的并且不癌变或转移， 或肿瘤生长更缓慢。可通过CT扫描和可用的肿瘤标记监控肿瘤的形 成。

[0086]术语“抑制肿瘤生长”是指根据本发明治疗的个体不形成 肿瘤，或存在于根据本发明治疗的个体中的一个或多个肿瘤在尺寸上 不生长或不癌变或不转移，或存在于根据本发明治疗的个体中的一个 或多个肿瘤的尺寸减小(优选减少了至少20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％或100％体积比)，或存在于根据本发明治疗的个体中 的一个或多个肿瘤被根除。可通过CT扫描和可用的肿瘤标记监控肿 瘤的尺寸。

[0087]本发明使用的术语“铁乳铁蛋白”和“铁饱和的乳铁蛋白” (还被称为“FeLF”)是指提供了铁结合袋组的铁部分或完全饱和的乳 铁蛋白多肽或其功能性变体或片段组，其中存在于该组中的至少约 5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的结合袋具有 铁离子结合。

[0088]术语“停留时间”涉及优选的实施方案，其中处理时间为 将压力维持在处理压力的时间。例如，1分钟的停留时间是指所述压 力在处理压力下维持1分钟。0分钟的停留时间(或“不停留”)是指将 所述压力升高至处理压力但不停留，然后再返回至环境压力(通常为大 气压)。在该实施方案中，优选的处理时间包括0分钟(不停留)、0.5 分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、 4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8 分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。应当理解，虽然不特意 使所述压力维持在处理压力，但是由于所使用设备的性质，可以有非 常短的停留期(可能若干毫秒)。这种非常短的停留期不太可能对所述 方法的实施具有实质上的影响。

[0089]本发明所使用的术语“保存性”是指随着时间的流逝，组 合物抑制不想要的微生物生长的能力。未热处理的组合物或者非如本 发明所提供的供选择的可接受方法处理的组合物不太可能具有商业上 可接受的保存性。关于维持保存性是指本发明的方法在延长压力处理 组合物的保存期上与热处理对照至少同样有效。关于提高(increasing) 或提高(increased)、或改善(improving)或改善(improved)保存性是指与 未处理组合物相比，所述组合物抑制不想要的微生物随着时间的流逝 生长的能力有所提高。提高的保存性优选地导致诸如延长的保存期和 提高的耐温度变化能力等性质。温度变化(例如从冷藏库中取出)能够 诱导任何残存的细菌的生长。

[0090]优选地，根据需氧菌平板数(APC)来测定保存性。APC是 用于估计样品中细菌密度的细菌计数方法，其还被称为总平板计数、 标准平板计数或总活菌计数。将样品采集、混合、稀释、并接种在适 于检测待研究细菌(例如，食品或乳品污染物，例如大肠杆菌 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌 (Salmonellae)、志贺菌(Shigellae)、大肠菌、酵母和霉菌、嗜温性孢子、 嗜热性孢子)的琼脂培养基中。APC的结果是1毫升接种并在32℃下 孵育72小时后的样品中产生的集落生成单位数(cfu/ml)。对于不含有 某些可存活的培养物的新鲜乳制品高度优选50,000cfu/ml或更小的 APC。具有50,000cfu/ml或更高的APC的产品不太可能具有可接受的 保存性，除非存在的生物体是特别适合于所述产品的生物体之一-后 一类型的产品实例包括酸乳酪或发酵产品，其中可存活培养物是合乎 需要的。

[0091]因此，在一实施方案中，优选的方法是其中在处理后的需 氧菌平板数(APC)小于或等于约100,000、75,000、50,000、25,000、 10,000、5,000、1,000、100或10集落生成单位每毫升(cfu/ml)的方法。 APC优选小于约50,000cfu/ml。

[0092]术语“乳铁蛋白”指任何非糖基化的或糖基化的包括诸如 下述的那些同源乳铁蛋白序列的野生型乳铁蛋白氨基酸序列。乳铁蛋 白多肽具有两个金属离子结合袋，因此能够以每乳铁蛋白分子对2个 金属离子的化学计量比与金属离子结合。一金属离子结合袋存在于乳 铁蛋白的N末端叶(N叶)，另一结合袋存在于C末端叶(C叶)(Moore 等，1997)。其中牛和人乳铁传递蛋白(乳铁蛋白的前体)、乳铁蛋白和 肽的经验证的序列可在Swiss-Prot中找到 (http://au.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-ful)。指示性乳铁蛋白多肽包括 登记号为P24627的牛乳铁传递蛋白前体、牛乳铁蛋白、登记号为 P02788的人乳铁传递蛋白前体以及人乳铁蛋白。

[0093]术语“金属离子饱和”和“金属离子结合”是指乳铁蛋白 多肽或其功能性变体或片段的离子结合袋中金属离子的结合。

[0094]术语“金属离子乳铁蛋白”和“金属离子饱和的乳铁蛋白” 是指提供了金属离子结合袋组的金属离子部分或完全饱和的乳铁蛋白 多肽组，其中存在于该组中的至少约5％、优选至少约25％的金属离 子结合袋具有金属离子键。应当理解，所述组可包含不同种的多肽； 例如某些分子未结合离子，其它的每个分子结合1个或2个离子。在 使用不同金属离子的情况下，某些分子可结合铁离子，而其它分子结 合不同的其它离子。

[0095]同样地，术语“金属离子乳铁蛋白片段”和“金属离子饱 和的乳铁蛋白片段”是指提供了金属离子结合袋组的金属离子部分或 完全饱和的乳铁蛋白多肽片段组，其中存在于该组中至少约5％、优选 至少约25％的金属离子结合袋具有金属离子键。

[0096]本发明可使用金属离子部分或完全饱和的乳铁蛋白多肽 和乳铁蛋白片段的混合物。在这样的实施方案中，金属离子结合袋组 由每个乳铁蛋白多肽的2个结合袋以及每个乳铁蛋白片段的取决于所 述片段本身的性质的1个或2个结合袋组成。

[0097]通过分光光度分析可测定饱和度(Brock和Arzabe，1976； Bates等人，1967；Bates等人，1973)。应当理解，在乳铁蛋白多肽之 间可发生金属离子交换。通过任何可用的方法可制备金属离子饱和的 乳铁蛋白。在一实施方案中，通过Law等人(1977)的方法可制备铁饱 和的乳铁蛋白。在另一实施方案中，通过Kawakami等人(1993)的方法 可制备铁饱和的乳铁蛋白。金属离子饱和的乳铁蛋白可通过使金属离 子与乳铁蛋白中的金属离子结合位点相结合的方法来制备，所述结合 位点包括诸如Fe结合袋的金属离子结合袋与乳铁蛋白分子或乳铁蛋 白片段上的其它非特异性结合位点。在优选的实施方案中，金属离子 仅与金属离子结合袋结合，除非在结合袋之间发生金属离子交换的过 程中，否则仅发生最低限度的非特异性结合或不发生非特异性结合。

[0098]在一实施方案中，存在于乳铁蛋白分子组中的至少约5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的金属离子结合袋具 有金属离子键，可用的范围可选自上述值中的任意值之间(例如，约5％ 至约100％、约10％至约100％、约15％至约100％、约20％至约100％、 约25％至约100％、约30％至约100％、约35％至约100％、约40％至 约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、 约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至 约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、 约95％至约100％、以及约99％至约100％)。在一实施方案中，金属 离子饱和的乳铁蛋白是超饱和的乳铁蛋白。

[0099]术语“口服”包括通过口服给药、含服给药、肠内给药和 胃内给药。

[0100]术语“定向的金属离子结合”和“定向的铁结合”指当金 属离子(例如铁)在结合袋中正确地配位时，与乳铁蛋白或功能性片段 结合的金属离子的立体有择性既不是结合袋内的部分结合，也不是非 特异性地表面结合。可存在金属离子在铁结合袋中结合但不完全配位 的情况，这可在光谱性质中显示出来。通过在465nm处具有铁乳铁蛋 白单峰的UV-VIS谱图说明了定向的铁结合。在一实施方案中，优选 定向的金属离子结合。在另一实施方案中，非定向的金属离子结合是 可接受的。

[0101]术语“肠胃外给药”包括但并不限于局部给药(包括对任意 真皮、表皮或粘膜表面给药)、皮下给药、静脉内给药、腹膜内给药、 肌内给药和肿瘤内给药(包括任何对肿瘤的直接给药)。

[0102]术语“药物可接受的载体”是指包括但不限于能够作为本 发明组合物的组分对个体进行给药的赋形剂、稀释剂或辅助剂的载体。 当以足以输送有效量的乳铁蛋白多肽或其功能性变体或片段的剂量进 行给药时，优选的载体不会降低组合物的活性并且不产生毒性。所述 制剂能够以口服、鼻内或肠胃外的方式进行给药。

[0103]术语“压力处理”指超高压力(UHP)处理。通常接受的这 类处理所使用的压力至少为100MPa。这也被称为“高压”处理、“高 静水压”(HHP)或“高压处理”(HPP)。“压力处理的”产品是那些经 UHP处理的产品；即，在至少100MPa，优选在至少约350MPa、400 MPa、450MPa、500MPa、600MPa、700MPa或800MPa(或在如上 所述的范围内的其它值)的压力下压力处理。

[0104]关于保持“期望水平”的金属离子饱和度或金属离子结合 度是指当根据本发明描述的方法处理组合物时，存在于该组合物中的 乳铁蛋白多肽或其功能性病体或片段的金属离子饱和度基本上不降 低。处理后的金属离子饱和度的水平优选至少为处理前金属离子饱和 度水平的约40％。即，与乳铁蛋白多肽或其变体或片段结合的金属离 子优选地保持至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、99％或100％。例如，对于包含100％的金属 离子饱和的乳铁蛋白的组合物，处理后，金属离子饱和度的水平优选 为至少约40％，优选至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，且优选的范围可选自这 些值中的任意值之间(例如，约40％至100％、约45％至100％、约50％ 至100％、约55％至100％、约60％至100％、约65％至100％、约70％ 至100％、约75％至100％、约80％至100％、约85％至100％、约90％ 至100％、约95％至100％、以及约99％至100％)。

[0105]术语“个体”是指动物，优选为哺乳动物，更优选为哺乳 伴侣动物(mammalian companion animal)或人。伴侣动物优选包括猫、 狗和马。

[0106]术语“超饱和的乳铁蛋白”指提供了金属离子结合袋组的 乳铁蛋白多肽或功能性片段组，其中足量的金属离子可用来填充100％ 的结合袋，且存在额外的金属离子并与乳铁蛋白多肽或功能性片段上 的非特异性结合位点相结合。换句话说，提供了化学计量过量的金属 离子。优选地，在包含超饱和的乳铁蛋白的本发明的组合物中不存在 游离的金属离子，尽管在结合袋之间、非特异性结合位点之间以及结 合袋和非特异性结合位点之间会发生金属离子交换。优选地，超饱和 的乳铁蛋白不会形成不能溶解的聚集体。在一实施方案中，超饱和的 乳铁蛋白为至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、 140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、 185％、190％、195％或200％金属离子饱和的，优选为铁离子饱和的。

[0107]术语“治疗”或其衍生词应被解释为其最广泛可能的涵义。 该术语不应被理解为暗示对个体进行治疗直至恢复健康。从而，“治疗” 广义上包括对症状发作或具体的疾病状态的严重性的改善和/或防止。 术语“治疗”在广义上还包括使敏感个体维持良好的健康状况以及对 疾病预防维持增强的持久力。

[0108]术语“不想要的微生物”指压力处理前可在组合物中的生 长全部微生物。虽然这种生长是不希望的，但是包括不能存活的微生 物、减毒微生物或已死亡的微生物在内的微生物以不生长状态的存在 可以是不影响结果的或者可以是希望的。

[0109]关于防止不想要的微生物的生长是指基本上减缓、延迟或 消灭诸如细菌(包括益生菌)、真菌、霉菌、酵母和藻类等微生物的生 长。微生物并不全是导致酸败的原因或其不都是病原体。能够通过视 觉检查或使用本领域公知的标准技术来评价不想要的微生物的生长， 所述标准技术包括但不限于显微镜法、染色法、PCR、细胞分选法等(参 见Lund等人，2000)。压力处理后，组合物的APC优选小于或等于约 100,000cfu/ml、75,000cfu/ml、50,000cfu/ml、25,000cfu/ml、10,000 cfu/ml、5,000cfu/ml、1,000cfu/ml、100cfu/ml或10cfu/ml，优选小 于约50,000cfu/ml。

[0110]如上所述，未热处理的或未压力处理的组合物不太可能具 有商业上可接受的保存性。换句话说，由于没有采取步骤来防止不想 要的微生物的生长，所以未处理组合物的保存性通常是不可接受的。 当采取这样的步骤处理后，所述保存性将得到改善。小于或等于约 100,000、75,000、50,000、25,000、10,000、5,000、1,000、100或10 集落生成单位每毫升(cfu/ml)，优选小于约50,000cfu/ml的处理后需氧 菌平板数(APC)，将减缓、延迟或消灭任何存在的生物体对保存性的 影响能力。结合低pH或结合冷藏(在低于约10℃，优选低于约4℃的 温度下贮存)或结合这两种方法，将进一步减缓、延迟或消灭其影响保 存性的能力。

[0111]在使用益生微生物的实施方案中，益生微生物的生长是不 想要的，但是益生微生物的存在是合乎需要的。因此，在这样的实施 方案中关于防止不想要的微生物的生长是指基本上减缓、延迟或消灭 不想要的益生微生物的生长。优选地，压力处理将减弱益生微生物， 或更优选地，杀灭益生微生物，同时保持至少期望水平的益生活性。

[0112]在一实施方案中，益生微生物是失活益生微生物，然而其 仍保持至少期望水平的益生活性。失活益生微生物可以是不能存活的、 不能存活但仍具有代谢活性的或死亡的，然而在所有的情况中，其仍 保持至少期望水平的益生活性。

[0113]在另一实施方案中，益生微生物在压力处理前是失活益生 微生物。本实施方案中的压力处理防止了其它不想要的微生物的生长， 同时使存在的益生因子保持益生活性。

[0114]术语“变体”指天然产生(例如等位基因变体)或非天然产 生(例如人工产生的突变体)的乳铁蛋白多肽或乳铁蛋白片段，其通过 增加、删除或取代一种或多种氨基酸而不同于给定物种(例如下文所列 出的)的乳铁蛋白多肽或其片段的主要野生型氨基酸序列。

[0115]通常，当根据下述实例进行测定时，多肽序列变体普遍具 有定性的生物活性。此外，这些多肽序列变体可共享至少约50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％ 或99％的同一性。术语“变体”的释义中还包括乳铁蛋白多肽的同源 物。同源物通常为来自不同物种的多肽，但是基本上共享与本文所公 开的相应多肽相同的生物功能或活性。

[0116]优选的变体多肽与牛或人乳铁蛋白优选地具有至少约 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，优选为至少约 90％、95％或99％的同一性。与本文所述的片段优选地具有至少约70％、 75％、80％、85％、90％、95％或99％，优选为至少约90％、95％或99％ 的同一性的变体片段包括但不限于人或牛乳铁蛋白的片段。通过使用 从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的BLAST软件(2.2.12 版；2005年8月28日)(Tatusova等人，(1999)；McGinnis等人，(2004)) 对备选氨基酸序列和诸如乳铁蛋白多肽或其片段等的本发明描述的序 列进行比较能够测定同一性。

[0117]在不显著改变其生物活性的情况下，对乳铁蛋白多肽序列 的一个或若干个氨基酸进行的保守置换也很有用。技术人员知道进行 表型无声氨基酸置换的方法(参见例如Bowie等人，(1990))。2.乳铁蛋白多肽

[0118]除了上文列出的乳铁蛋白多肽和片段外，已报道的并可用 于本发明方法中的乳铁蛋白氨基酸序列和mRNA序列的实例包括但 不限于人乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号NP_002334)和mRNA序列(登 记号NM_002343)；牛乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号NP_851341和 CAA38572)和mRNA序列(登记号X54801和NM_180998)；山羊乳铁 蛋白的氨基酸序列(登记号JC2323、CAA55517和AAA97958)和mRNA 序列(登记号U53857)；马乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号CAA09407) 和mRNA序列(登记号AJ010930)；猪乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号 NP_999527、AAL40161和AAP70487)和mRNA序列(登记号 NM_214362)；小鼠乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号NP_032548)和 mRNA序列(登记号NM_008522)；水牛乳铁蛋白的氨基酸序列(登记号 CAA06441)和mRNA序列(登记号AJ005203)；骆驼乳铁蛋白氨基酸序 列(登记号CAB53387)和mRNA序列(登记号AJ131674)。根据本发明， 可以使用野生型或变体形式的这些序列。被这些序列编码的多肽可以 采用公知技术从自然来源分离，或作为重组蛋白质产生或通过有机合 成产生。

[0119]产生可用的多肽和变体的方法是本领域公知的并将在下 文讨论。美国专利说明书US5,571,691、US5,571,697、US5,571,896、 US5,766,939、US5,849,881、US5,849,885、US5,861,491、US 5,919,913、US5,955,316、US6,066,469、US6,080,599、US6,100,054、 US6,111,081、US6,228,614、US6,277,817、US6,333,311、US6,455,687、 US6,569,831、US6,635,447、US2005-0064546和US 2005-0114911 报道了可用的重组乳铁蛋白多肽和片段，以及产生这些多肽和片段的 方法。

[0120]可用的变体还包括牛乳铁蛋白变体bLf-a和bLf-b(Tsuji 等人，(1989)；Yoshida等人，(1991))。可用的变体还包括糖基化和非 糖基化形式的乳铁蛋白(Pierce等人，(1991)；Metz-Boutigue等人， (1984)；van Veen等人，(2004))以及糖基化突变体(具有不同的糖基化 位点或不同的糖基侧链)。

[0121]可用的片段包括N-叶片段和C-叶片段(Baker等人，2002) 以及保留乳铁蛋白结合袋的任何其它乳铁蛋白多肽，例如截短的乳铁 蛋白多肽。

[0122]可用的截短的乳铁蛋白多肽包括截断约1至约300个氨基 酸的多肽，优选为约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、 125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、 185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、 245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300 个氨基酸或更多，以及包括在N末端、在C末端剪切或同时在N末端 和C末端截短的多肽，前提是截短的多肽保留至少一个N叶或C叶金 属离子结合袋。据报道，牛乳铁蛋白的残基Asp 60、Tyr 92、Tyr192、 His 253是N叶中的氨基酸金属离子配体。据报道，牛乳铁蛋白的残 基Asp 395、Tyr 433、Tyr 526、His 595是C叶中的氨基酸金属离子配 体(Karthikeyan等人，1999)。包含这些残基的任何片段都能够形成金 属离子结合袋。

[0123]根据本发明所使用的备选乳铁蛋白的变体或片段可以通 过下述技术产生，该技术包括但不限于野生型蛋白突变技术(对于此类 技术的讨论参见Sambrook等人(1989)和其它文献)，例如但不限于野 生型乳铁蛋白的位点定向诱变和所得到的多核苷酸的表达；产生可表 达的多核苷酸片段的技术，例如使用任意的或选定的引物的PCR技 术；野生型乳铁蛋白多肽或变体乳铁蛋白多肽全部或部分蛋白分解或 水解的技术；以及化学合成多肽的技术。可通过由乳铁蛋白DNA或 RNA、或其变体或片段表达为重组分子来制备乳铁蛋白的变体或片段。 编码乳铁蛋白变体或片段的核酸序列可以被插入到合适的载体中用于 在细胞中，包括真核细胞(例如但不限于曲霉菌(Aspergillus))或细菌细 胞(例如但不限于大肠杆菌)中的表达。使用已知的PCR技术，包括但 不限于易错PCR和DNA改组，可制备乳铁蛋白变体或片段。易错PCR 是在DNA聚合酶的低复制保真性下进行的PCR方法，得以在沿PCR 产物全长上得到高频率的点突变(Leung等人(1989)；Cadwell等人 (1992))。DNA改组是指具有不同但是高度相关的DNA序列的DNA 分子之间的体外强迫同源重组，这种重组是由基于序列同源性的DNA 分子随机片段，及后续的在PCR反应中通过引物延伸进行的交换固定 引起的(Stemmer(1994))。用于这类方法的合适的乳铁蛋白核酸序列包 括上述列出的那些，或者其可以通过已知方法产生，该方法包括，例 如，组织RNA分离物的反转录PCR(RT-PCR)。RT-PCR中合适的引物 可参考上述列出的mRNA序列进行设计。用于RT-PCR的商业试剂盒 是可得的(例如，来自美国Ambion公司的Cells-to-cDNATM试剂盒)。

[0124]还可通过公知的合成方法来产生乳铁蛋白的变体或片段 (例如，参见Kimmerlin等人，2005)。或者，乳铁蛋白多肽或其功能性 变体或片段能够通过已确立的合成Fmoc化学法来产生，如Viejo-Diaz 等人，(2003)所描述的人kaliocin-1和乳铁蛋白肽衍生的多肽；以及 Nguyen等人，(2005)所描述的牛乳铁蛋白肽多肽；以及van der Kraan 等人，(2004)所描述的Lactoferrampin和更短片段。

[0125]金属离子结合的乳铁蛋白变体或乳铁蛋白片段可通过已 知的分离金属离子结合的多肽技术来获得，包括但不限于金属亲和层 析法。备选的乳铁蛋白变体或片段可与游离的或固定的金属离子例如 Fe3+接触，并以适当的方式进行纯化。例如，备选的变体或片段可在 中性pH下与螯合在色谱基上的固定的金属离子接触，该色谱基中包 含亚氨基二乙酸或三(羧甲基)乙二胺配体。可通过降低所用缓冲液的 pH和离子强度从支持基质中洗脱并收集结合的变体或片段。根据本发 明描述的方法可制备金属离子结合的变体或片段。

[0126]通过选择乳铁蛋白的变体、片段和水解物并评价其功效测 定来获得乳铁蛋白的功能性变体、片段或水解物，所述功效测定被选 择用来检测期望的功效。

[0127]在一实施方案中，所述乳铁蛋白是任何哺乳动物的乳铁蛋 白，包括但不限于绵羊、山羊、猪、小鼠、水牛、骆驼、牦牛、马、 驴、驼马、牛或人乳铁蛋白。所述乳铁蛋白优选为牛乳铁蛋白。

[0128]在另一实施方案中，所述乳铁蛋白是任何重组的哺乳动物 乳铁蛋白，包括但不限于重组的绵羊、山羊、猪、小鼠、水牛、骆驼、 牦牛、马、驴、驼马、牛或人乳铁蛋白。所述乳铁蛋白优选为重组的 牛乳铁蛋白。重组的乳铁蛋白可以通过在无细胞表达体系中或在转基 因的动物、植物、真菌或细菌、或其它可用的物种中表达而生产。或 者，可使用已知的有机合成方法生产乳铁蛋白。

[0129]在另一实施方案中，从乳品，优选从绵羊乳、山羊乳、猪 乳、鼠乳、水牛乳、骆驼乳、牦牛乳、马乳、驴乳、驼马乳、牛乳或 人乳中分离所述乳铁蛋白。优选地，通过阳离子交换色谱法，然后通 过超滤和渗滤(diafiltration)从乳品中分离所述乳铁蛋白。3.从乳品中分离乳铁蛋白

[0130]以下是从牛乳中分离乳铁蛋白的示范流程。[013 ]新鲜的脱脂乳(7L，pH6.5)在4℃下以5ml/分钟的流速通 过用超纯水(milli Q water)平衡的300ml的S Sepharose Fast Flow柱。 用2.5倍床体积的水洗去未结合蛋白，并用约2.5倍床体积的浓度分别 为0.1M、0.35M和1.0M的氯化钠将结合蛋白逐步洗脱。收集1M氯 化钠洗脱所得的粉红乳铁蛋白条带作为单一片段，并用超纯水透析， 然后冻干。将该冻干粉溶解在25mM、pH6.5磷酸钠缓冲液中，并在 S Sepharose Fast Flow柱中，以3ml/分钟的流速、使用上述缓冲液中 至1 M的氯化钠梯度进行再层析。将含有经过凝胶电泳和反相HPLC 分析确定具有足够纯度的乳铁蛋白的片段合并在一起，透析并冻干。 在pH8.6、含0.15M氯化钾的80mM磷酸二钾溶液中，通过在 Sephacryl 300上进行凝胶过滤得到最终纯化的乳铁蛋白。合并所选择 的片段，用超纯水透析并冻干。HPLC分析结果和对铁离子饱和形式 的乳铁蛋白其光谱比值(280nm/465nm)为～19或更低的事实表明该制 备所得的乳铁蛋白纯度大于95％。
4.金属离子饱和的乳铁蛋白或去除金属离子的乳铁蛋白

[0132]通过向纯化乳铁蛋白在pH7.8并含有10mM的碳酸氢钠 的50mM Tris中的1％溶液中加入过量摩尔比为2∶1的5mM的次氮基 三乙酸铁(Foley和Bates(1987))来实现铁饱和。在4℃下，用100倍 体积的超纯水(更新两次)透析20小时，以除去过量的次氮基三乙酸铁。 然后可将所述铁负载的(全-(holo-))乳铁蛋白冻干。通过提供更少的金 属离子供体可获得不同的铁饱和度。

[0133]在4℃下，使用30倍体积的pH2.3、包含500mg/L EDTA 二钠的0.1M柠檬酸对1％的高度纯化乳铁蛋白样品的水溶液透析30h 来制备去除铁的(脱-(apo-))乳铁蛋白(Massons和Heremans(1966))。 用30倍体积的超纯水(更新一次)透析除去柠檬酸盐和EDTA，并将得 到的无色溶液冻干。

[0134]乳铁蛋白多肽能够含有铁离子(如在自然产生的乳铁蛋白 多肽中)或非铁金属离子(例如，铜离子、铬离子、钴离子、锰离子、 锌离子或镁离子)。例如，能够从由牛乳中分离的乳铁蛋白中除去铁， 然后加载其它类型的金属离子。例如，通过与上述加载铁相同的方法 能够实现加载铜。能够使用Ainscough等人的方法(1979)在乳铁蛋白上 加载其它金属离子。

[0135]在一实施方案中，金属离子是选自下列的离子：铝、钙、 铜、铬、钴、金、锰、镁、铂、钌、硒或锌离子、或其混合物。金属 离子优选为铁离子。

[0136]在本发明所使用的组合物的制备中，乳铁蛋白多肽或金属 离子结合的乳铁蛋白片段可以是单一种类或不同种类。例如，该多肽 或片段中，每个都能够含有不同数目的金属离子或不同种类的金属离 子；或该多肽的长度可以不同，例如，一些是全长多肽而一些是片段， 且该片段中每个都能代表全长多肽的特定部分。可以从自然来源或通 过不同种类乳铁蛋白多肽的混合来获得此种制剂。例如，通过对全长 乳铁蛋白多肽的蛋白酶消化(完全或部分)来制备不同长度乳铁蛋白多 肽的混合物。根据本领域公知的方法能够控制消化的程度，例如，通 过控制蛋白酶的用量或孵育时间，如下所述。完全消化产生全长乳铁 蛋白多肽的各种片段的混合物；部分消化产生全长乳铁蛋白多肽与各 种片段的混合物。5.乳铁蛋白片段或乳铁蛋白水解物的制备

[0137]通过选择合适的具有已知特异性裂解的酶，例如胰蛋白 酶、糜蛋白酶，并通过pH值、温度、孵育时间以及酶和底物的比例 来控制/限制蛋白水解能制备含有备选的功能性片段的水解物。使用特 异性内肽酶能够对这样分离的多肽进行精制。例如，在pH2.0、37℃ 下，通过胃蛋白酶对牛乳铁蛋白裂解45分钟(Facon和Skura，1996)或 在pH2.5、37℃下使用3％的酶(与底物的w/w比)裂解4h(Tomita等 人，1994)能产生牛乳铁蛋白肽。然后所述肽能够通过反相HPLC (Tomita等人，1994)或疏水相互作用色谱进行分离(Tomita等人，1994)。

[0138]或者，乳铁蛋白多肽能够通过已确立的合成Fmoc化学法 来产生，如Viejo-Diaz等人，(2003)所描述的人kaliocin-1和乳铁蛋白 肽衍生的多肽；以及Nguyen等人，(2005)描述的牛乳铁蛋白肽多肽； 以及van der Kraan等人，(2004)描述的lactoferrampin和短片段。

[0139]通常，SDS-PAGE可用于通过将水解物与分子量标准对比 来估计水解程度。大小排阻层析可用于分离水解物中的不同种类，并 估计分子量分布情况。

[0140]在优选的水解方法中，将牛乳铁蛋白以20mg/ml溶解在 50mM Tris、pH8.0、5mM的CaCl2中。按照酶和底物的重量比为1∶50 加入胰蛋白酶(Sigma T8642，TPCK处理的，来自牛胰腺的Type XII， 11700U/mg蛋白质)，混合物在25℃孵育3h。通过加入PMSF至终浓 度达到1mM来终止反应，用SDS-PAGE来监测消化的程度。在50mM Tris、0.15M NaCl、pH8.0的缓冲液中，用Sephacryl S300(Amersham GE)(90cm×2.6cm柱)对胰蛋白酶消化液(4mL)进行凝胶过滤。然后在S Sepharose fast Flow(Amersham GE)(15cm×1.6cm column)上，使用pH 6.5磷酸钠缓冲液并且盐梯度至1M NaCl对含有牛乳铁蛋白主要片段 的合适片段(Legrand等人，1984)实施阳离子交换色谱法。通过在上述 的Sephacryl S300上但使用10％v/v的醋酸做洗脱液的进一步凝胶过 滤完成C叶和N+C叶片段的最后分离(Mata等人，1994)。通过 SDS-PAGE和Edman N末端测序法确认了透析的(相对于超纯水)和冻 干的片段的同一性。

[0141]在另一方法中，通过如Superti等人，(2001)所述的在Vydac C18柱上的RP-HPLC对上述的胰蛋白酶的消化进行分离，并且回收对 应于C叶和N叶片段的高质量片段。通过MALADI MS确认其同一性。

[0142]在一实施方案中，本发明所用的水解物含有一种或多种金 属离子结合片段。6.金属离子饱和的乳铁蛋白的压力处理

[0143]本发明人指出，对包含金属离子乳铁蛋白的组合物或产品 在达到商业上可用的保存性，同时维持至少期望水平的金属离子结合 的条件下进行压力是可能的。

[0144]发明人发现，无论是为了商业上灭菌，还是为了延长铁负 载的乳铁蛋白溶液(或包含铁乳铁蛋白的产品)的保存期，高压处理的 使用允许在处理pH下保留与所述蛋白特异性结合的铁。压力处理通 常对蛋白结构的破坏也小得多，因此乳铁蛋白的铁结合能力(重新结合 铁的能力)相对未受损害。

[0145]下述实例显示，压力处理与热处理相比，对铁结合为约 15％和约100％饱和的铁结合乳铁蛋白的影响要小得多。评估条件是商 业上可用的压力处理和热处理的可接受条件；即，可接受的并被批准 用于灭菌的或改善保存性的条件。

[0146]建议将完全或部分铁饱和的乳铁蛋白用于治疗缺铁性贫 血(Bethell和Huang，2004；Huang等人，2004)、与怀孕有关的铁缺 乏症(Valenti等人，2005)以及作为用来增加贫血患者的血红蛋白计数 的药剂。由于在低膳食铁摄入和更年期女性骨骼矿物质密度降低之间 可能存在关联性(Medeiros等人，2002)，以及因为已证实乳铁蛋白是 骨合成代谢剂(bone anabolic agent)(Cornish等人，2004)，所以铁负载 的形式也可用于治疗骨骼病症，例如骨质疏松症。此外，铁乳铁蛋白 能够应用于吸收不良的肠更新治疗，这是由于铁负载形式的人和牛乳 铁蛋白均可使细胞培养中的肠细胞系增殖(Oguchi等人，1995)。

[0147]若干个专利说明书报道称，铁饱和的乳铁蛋白用于饮料、 食品和饲料的铁补充(参见Sakurai等人，2000；Dugas等人，2001； Dousako等人，1991；Tomita等人，1992；以及Tanaka等人，1991) 以及用做药剂(参见Nitsche，1991)。

[0148]与铁乳铁蛋白一样，其它金属离子的使用也是有益的。例 如，已报道的络乳铁蛋白(Ainscough等人，1979)，其同样可用作缓解 与糖尿病有关的症状的治疗剂(Chiang和Mao，2002)。

[0149]在一实施方案中，按照本发明的处理方法允许使用高压对 金属离子乳铁蛋白组合物进行商业灭菌(消除不想要的微生物的生 长)，其中组合物或产品的pH为约pH3.0至pH8.0，优选小于或等于 pH4.6。

[0150]在另一实施方案中，根据本发明的处理方法允许使用高压 来延长金属离子乳铁蛋白组合物的保存期(通过基本上减少或延迟不 想要的微生物的生长)，其中组合物或产品的pH为约pH3.0至pH8.0， 优选大于或等于pH4.6，或中性pH。

[0151]在另一实施方案中，使用pH与二氧化碳的合适组合在pH 3.0至pH8.0的所选范围下实现商业灭菌或改善包含金属离子乳铁蛋 白的组合物或产品的保存期是可能的。二氧化碳与pH的组合相当于 在较低pH下获得的效果(即，有效防止生长并且保持期望水平的金属 离子结合)。通过使用二氧化碳和pH控制(例如在碳酸饮料中)可实现 商业灭菌或延长保质期。

[0152]通过实例，按照本发明处理的组合物或产品可被传输至压 力处理的产品或成分中；被加入至不再进行后续热处理的产品或成分 中；或被加入至进行后续压力处理的产品或成分中。

[0153]因此，本发明涉及处理或产生上述含有乳铁蛋白的组合物 或产品。

[0154]尽管本发明不限于此，然而根据本发明的方法所使用的压 力处理优选包括如下步骤：(i)将待压力处理的组合物或产品放入压力容器的腔室中并密封 该腔室；
(ii)将所述腔室中的压力升至预设的压力(“处理压力”)；
(iii)使所述腔室在该压力下维持预设的时间，包括小于1分钟(即 “停留时间”)；
(iv)释放腔室中的压力；以及
(v)取出压力处理的组合物或产品。

[0155]可使用间歇处理或者连续处理设备遵照这样的方案进行。

[0156]应当理解，处理过程中，压力处理可能导致组合物或者产 品的温度波动。同样地，压力处理过程中所参考的优选温度是指压力 升高前组合物或产品的温度。

[0157]根据本发明确定合适的处理压力的一方法是选择组合物 或产品，并将其置于可控制不想要的微生物的处理压力下进行处理。 合适的处理压力为至少约100MPa的压力。如果有必要，为了评估的 目的，可用不想要的微生物接种组合物或产品。

[0158]根据本发明确定合适的处理压力的另一方法是选择组合 物或产品，并将其置于基本上不影响乳铁蛋白或其功能性变体或片段 的金属离子结合的处理压力下进行处理。

[0159]然后按照本发明所描述的对任何不想要的微生物的生长 或乳铁蛋白的金属离子结合或者两者进行测定。参见例如，Lund等人 (2000)的评价微生物生长的方法。7.乳制品及乳品成分

[0160]本发明的组合物或产品可以是，或可以包括乳制品或乳品 成分。

[0161]乳汁不仅是新生婴儿的全部营养来源，而且提供生理上生 物活性组分的丰富来源，因而被称为“天然药物”。除提供完整的营养 之外，乳还在青少年的成长、保护和治疗恢复中起到重要的作用。健 康的成年人通常仅需要乳的营养功效，但是对处于慢性疾病的疾病状 态中的成年人，源自乳的生物活性在疾病的预防和治疗方面可提供更 多。所述乳优选为绵羊乳、山羊乳、猪乳、小鼠乳、水牛乳、骆驼乳、 牦牛乳、马乳、驴乳、驼马乳、牛乳或人乳，以及更优选为牛乳。已 知乳品蛋白质是免疫刺激物。

[0162]初乳是在标准乳产生开始之前，分娩后立即产生的头乳 (pre-milk)。来自奶牛的最佳的初乳在产犊后的6小时内获得，但能够 在产犊后的两天里采集初乳。最佳的初乳与分娩约48小时后同一奶牛 的乳中所发现的相比通常含有两倍以上的乳固体物以及4倍的蛋白 质。最佳的初乳中的消化酶、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG 和IgM)、细胞活素、干扰素、生长因子、糖蛋白、富含脯氨酸的肽以 及维生素A、D、E和K的浓度均比标准乳高。可按照Elfstrand等人， 2002所描述的方法来制备初乳蛋白浓缩物(MPC)和初乳乳清蛋白浓缩 物(WPC)。

[0163]乳和初乳衍生物和其制造方法是本领域公知的。通常通过 联合离心(为了除去脂肪)、酪蛋白沉淀(使用酸或酶)、过滤(为了除去 乳糖、矿物质和水，或任选地除去蛋白质)、色谱法(为了纯化蛋白组 分)来获得这些衍生物，这些衍生物包括重组的或新鲜的全脂乳、重组 的或新鲜的脱脂乳、再生的全脂或脱脂奶粉、脱脂乳浓缩物、脱脂乳 分离物、全脂或脱脂奶粉、脱脂乳渗余物、炼乳、酪乳、超滤乳渗余 物、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、脱钙乳蛋白浓缩物、 脱钙乳蛋白分离物、低脂乳、低脂乳蛋白浓缩物、低脂乳蛋白分离物、 初乳、初乳分馏物、初乳蛋白浓缩物(CPC)、初乳乳蛋白浓缩物、初乳 乳蛋白分离物，初乳乳清、初乳乳清蛋白浓缩物，初乳乳清蛋白分离 物、来自初乳的免疫球蛋白分馏物、乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)、 乳清蛋白分离物(WPI)、甜乳清、乳酸乳清、无机酸乳清、再生的乳清 粉末、得自任何乳或初乳工业生产液流的组合物、得自任何乳或初乳 工业生产液流的超滤或微滤所获得的渗余物或渗透物的组合物、或得 自任何乳或初乳工业生产液流的色谱分离所获得的穿透的或吸附的分 馏物的组合物、或这些组合物中任一组合物的全部或部分水解物、或 其混合物。参见例如Dairy Processing Handbook(乳制品加工手册) (Tetra Pak Processing Systems，Lund，Sweden，1995)。其它的这类衍生物 包括上述的乳品蛋白组合物和乳品成分。

[0164]乳中发现的蛋白质包括免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、 IgG和IgM)、生长因子、牛血清白蛋白(BSA)、α-乳白蛋白、β-乳白蛋 白和大量酪蛋白，它们全部是磷蛋白。除酪蛋白以外，这些蛋白还存 在于乳清中。已知乳包含多种有丝分裂蛋白和可直接涉及骨再建的蛋 白。通过阳离子交换色谱法可从乳或乳清中回收生长因子(IGF-胰岛 素样生长因子、TGF-转化生长因子等)、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM)、BSA和某些β-乳白蛋白。某些生长因子作为中性 蛋白被回收。酪蛋白糖巨肽(CGMP)是可通过阴离子交换回收的的酸性 蛋白片断。骨桥蛋白是存在于所有体液中(包括乳)的高度磷酸化和糖 基化的蛋白质。

[0165]CGMP是在乳酪制作过程的粗质凝乳酶介导的酪蛋白凝固 步骤f通过凝乳酶的作用)中由κ-酪蛋白释放的肽，该肽存在于称作甜 乳清或乳酪乳清的乳清片段中。CGMP有时简单地被称作GMP(糖巨 肽)。乳酪乳清蛋白包含15％至20％的CGMP。如WO00/49885所报 道的，CGMP被提出作为一种乳中的骨健康促进成分。

[0166]通过用乳酸菌发酵或者通过在酪蛋白酸盐或农家干酪 (cottage cheese)和意大利乳清干酪的制造过程中，直接加入乳酸来生产 乳酸乳清。通过在酪蛋白酸盐制造过程中加入无机酸来生产无机酸乳 清。乳酸乳清和无机酸乳清不包含CGMP。这两种方法的原理是将pH 降至约4.6使酪蛋白沉淀，而不是使用凝乳酶的作用形成沉淀。因此， 任何未暴露在凝乳酶中的乳制品不含CGMP。

[0167]乳清是乳酪或酪蛋白制造的副产品，源自乳清的蛋白产品 可基于其蛋白含量进行分类，其包括含有至少30％蛋白的乳清蛋白浓 缩物(WPC)，至含有至少90％蛋白的乳清蛋白分离物(WPI)(Huffman， 1996：IDF，1998)。薄膜超滤和渗滤通常用于这类产品的制造，以便在 干燥前将乳清蛋白浓缩并纯化至25％-35％的固体，并且在本领域中将 源自薄膜超滤步骤的蛋白浓缩物称为渗余物。乳清蛋白是包含若干个 独立蛋白质(包括但不限于α-乳白蛋白、β-乳白蛋白、蛋白胨、免疫 球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、糖巨肽、生长因子(例如 TGFβ1和TGFβ2)、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和乳过氧化物酶)的集合 术语，在本发明中可包括全体乳清蛋白或其片段。Zadow(1992)和 Sienkiewicz等人(1990)描述了适于乳清的工业生产的方法。生产WPC 和WPI的方法是本领域公知的并且在US Dairy Export Council Reference Manual for U.S.Whey and Lactose Products，Chapter 7：Whey Products-Definition，Composition，Functions(美国乳品出口协会关于 美国乳清和乳糖产品的参考手册，第七章：乳清产品-定义、组合物、 功能)；Page，J.，Meyer，D.，Haines，B.，Lagrange，V.和Kenney，A.(Eds)， American Dairy Products Institute(美国乳制品研究所)，Elmhurst，IL， USA，(2004年6月)(还可从 http://www.usdec.org/files/pdfs/US08D_04.pdf在线获得)中对其进行了 讨论。还可参见Dairy Processing Handbook(乳制品加工手册)(Tetra Pak Processing Systems，Lund，Sweden，1995)。乳品蛋白质是公知的免 疫刺激物。

[0168]通过使用来自病原体的抗原免疫产生孕育乳(pregnant milk)的哺乳动物以提高该初乳和乳中的特异性抗体来制备超免疫乳 和超免疫初乳(参见Korhonen等人，2000中这类方法的综述)。根据上 文参考的公知方法可制备超免疫产品的蛋白浓缩物。超免疫乳和超免 疫初乳是公知的免疫刺激物(Korhonen等人，2000)。超免疫乳和超免 疫初乳可像普通的乳和初乳一样处理，产生下列衍生物，例如超免疫 乳蛋白浓缩物、超免疫乳蛋白分离物、超免疫乳清、超免疫乳清蛋白 浓缩物、超免疫乳清蛋白分离物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓 缩物、超免疫初乳乳蛋白分离物、超免疫初乳乳清、超免疫初乳乳清 蛋白浓缩物、或超免疫初乳乳清蛋白分离物，或其混合物。

[0169]通过实例，按照本发明处理的组合物或产品可传输至压力 处理的产品或成分中；加入至后续不再进行热处理的产品或成分中； 或加入至后续进行压力处理的产品或成分中。

[0170]为了降低对存在于按照本发明处理的组合物中的蛋白质 的不想要的影响，在所述组合物是液体的某些实施方案中，加入稳定 剂是合乎需要的。例如，为了稳定任意存在于该组合物中的酪蛋白。 因此，在一实施方案中，所述组合物还包含稳定剂，例如选自下列的 胶质：槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、肉桂胶、魔芋粉、β-葡聚糖、他拉 胶、阿拉伯树胶(gum Arabic)、结冷胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐胶、阿拉伯树胶(gum acacia)、壳 聚糖、arabinoglactins、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、或欧车前或其混合 物。稳定剂优选为果胶或羧甲基纤维素(CMC)。根据需要，按照本发 明的方法处理的组合物优选包含约0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、 0.25％、0.3％、0.35％w/v或更高的稳定剂。

[0171]为了使生物活性组分在约中性pH下稳定，在某些实施方 案中，一种或多种疏水性配体包含在所述组合物中是合乎需要的。疏 水性配体的存在允许生物活性组分在约pH7.0下，优选在约pH5.0至 pH8.0下进行压力处理，同时其所保持的活性水平比在缺少该配体下 易于获得的生物活性组分的活性水平高。不希望被理论限制，申请人 相信这些配体在该生物活性组分中与疏水袋结合，在压力处理过程中， 降低了其对变性的敏感性。因此，在某些实施方案中，所述组合物还 包含一种或多种选自下列的疏水性配体：十六酸、肉豆蔻酸、亚麻油 酸、共轭亚油酸(CLA)、一种或多种磷酯、一种或多种缩醛磷脂酰胆 碱、一种或多种鞘磷脂、一种或多种神经节苷酯、丁酸、一种或多种 ω-3脂肪酸(包括但不限于二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸 (DHA))、一种或多种植物甾醇、一种或多种植物甾醇酯、一种或多种 植物甾醇乙酸酯、一种或多种ω-6脂肪酸(包括但不限于鱼油)、脂溶 性疏水维生素(包括维生素A[视黄醇]和维生素D)、番茄红素、或十二 烷基硫酸钠或其混合物，这是合乎需要的。在本实施方案中，组合物 的pH优选为约5.0至8.0。

[0172]本发明使用的产品配方的实例包括饮料(包括酸化饮料和 碳酸饮料)、酸乳酪和果冻。这些产品可按照下文所述的方法配制，并 按照上文和实施例中所述的方法进行评价。

[0173]参照以下实施例，现对本发明的各个方面以非限制性的方 式来进行说明。实施例
1.乳铁蛋白溶液

[0174]乳铁蛋白(约15％的铁饱和度-天然饱和度水平)购自 Fonterra Co-operative Group limited(方塔拉合作集团有限公司)。

[0175]通过向乳铁蛋白在pH7.8并含有10mM碳酸氢钠的50 mM Tris-HCl中的1％溶液中加入过量摩尔比为2∶1的5mM的次氮基 三乙酸铁(Foley和Bates，1987)和来制备铁饱和的乳铁蛋白(～100％)。 在4℃下，用100倍体积的超纯水(更新两次)透析20小时，以除去过 量的试剂。然后将所述铁负载的(全-)乳铁蛋白冻干。

[0176]将用于压力处理和热处理的乳铁蛋白溶液在超纯水中配 制为6％(w/v)，用3M的NaOH或3M的HCL将pH调节至所需的值。 初次调节pH后，使溶液过夜进行平衡，最后再将溶液的pH重新调节 至所需的值。2.压力处理

[0177]将溶液移至Beckman Polyallomer Quick-sealTM离心管(内 径13mm，高51mm；Beckman Instruments，Inc.，Spinco division，Palo Alto，CA 94304)中，并将这些管子热密封。然后在环境温度中，在600 MPa的高压单位下对样品管处理5分钟、15分钟和30分钟。减压后， 将样品管切开，使用各种技术分析压力处理的样品和未处理的样品(对 照)。3.热处理

[0178]将等份(2ml)的乳铁蛋白溶液放入8ml的具螺旋帽的 Wheaton玻璃瓶中，盖紧盖子以确保密封。在37℃下，使每一样品系 列的管形瓶在水浴中分别预孵育5分钟。然后迅速将管形瓶移至设置 在所需温度的油浴中，震荡，从该点进行计时。在适当时间点将样品 管取出，立即置于冰上，确保管形瓶完全埋入冰中以快速冷却。将样 品在4℃下贮存直至分析。4.分析

[0179]通过下文所述的技术范围评价样品中由热处理或压力处 理引起的定性和定量变化。4.1PAGE测定法

[0180]根据Manderson等人(1998)所述，使用15％的凝胶进行还 原性和非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。4.2HPLC

[0181]用超纯水适当稀释样品并用反相HPLC进行分析，如 Palmano和Elgar(2002)所述。参照使用高纯牛乳铁蛋白制作的标准曲 线来进行定量。4.3ELISA

[0182]使用Bethyl试剂盒，按照制造商的说明书对适当稀释的样 品进行ELISA测定。4.4免疫亲和性

[0183]用Hepe缓冲液对样品进行适当稀释并用BiaCore测试仪 进行测定，如Indyk和Filonzi(2005)所述。参照使用高纯牛乳铁蛋白 制作的标准曲线来进行定量。4.5铁结合

[0184]通过在465nm处的吸光度来测定样品的铁饱和度水平。 使用次氮基三乙酸铁(FeNTA)分光光度滴定法(Bates等人1967；Brock 和Arzabe，1976)评价样品中的乳铁蛋白的铁结合能力。实施例1

[0185]如上文所述制备的6％(w/v)的天然(铁饱和度约为15％)乳 铁蛋白溶液是半透明的、带深橙色液体。脱乳铁蛋白的溶液(铁饱和度 约为0％)是透明的。天然乳铁蛋白在3.8-7.0的pH范围的热处理显示， 温和条件(例如在75℃下处理5分钟)引起测试溶液的颜色产生某些变 化，表明乳铁蛋白中的铁或定向铁结合的损失，该现象在低pH下尤 为明显(表1)。较高温度(在85℃至90℃下处理5分钟)导致在所述pH 范围内全部溶液的颜色几乎完全消失。在pH7.0下，所形成的厚沉降 表明乳铁蛋白的大量变性。表1：热处理作为pH的函数对天然乳铁蛋白的影响
处理条件：   pH：   3.3 3.8   4.0   5.2   7.0 对照   透明 ++   ++   +++   +++ 75℃/5分钟   透明 几乎透明   +   ++   ++ 85℃/5分钟   透明 透明   透明   透明   厚沉降 90℃/5分钟   透明 透明   透明   透明   厚沉降
“+”符号表示肉眼观察到的颜色深度。“+”符号越少表明铁结合越 少。

[0186]相反，在600MPa下压力处理高达45分钟，在任何样品 中未导致颜色变化或混浊，pH为3.8和4.0的那些样品除外，其中溶 液颜色变得更接近较高pH溶液的颜色(表2)，表明在这些低pH下， 定向的离子结合产生一定的再调整。这种在特定pH下的颜色变化可 能是由于压力引起的二氧化碳的“增溶作用”，使得重新平衡形成碳酸 氢盐，这将提供可与铁结合的碳酸盐离子。表2：压力处理作为pH的函数对天然乳铁蛋白的影响
 处理条件：   pH：   3.3     3.8     4.0     5.2     7.0  对照   透明     ++     ++     +++     +++  600MPa/5分钟   透明     +++     +++     +++     +++  600MPa/10分钟   透明     +++     +++     +++     +++  600MPa/30分钟   透明     +++     +++     +++     +++
 600MPa/45分钟   透明     +++     +++     +++     +++
“+”符号表示肉眼观察到的颜色深度。“+”符号越少表明铁结合越 少。
实施例2

[0187]如上文所述制备的6％(w/v)的100％铁饱和的乳铁蛋白溶 液是半透明的、暗红色液体。完全铁饱和的乳铁蛋白(约100％)在pH 3.8、pH4.8和pH7.0下的热处理(在85℃下处理10分钟以及在90℃ 下处理10分钟)使得颜色有所变浅(在pH3.8和pH4.8下)，这表明在 pH7.0的情况下，结合铁的损失、完全聚集以及可溶乳铁蛋白的损失 (数据未显示)。

[0188]相反，在600MPa下进行压力处理高达30分钟，对任何 溶液均未导致明显的颜色变化(表3)。表3：压力处理和热处理作为pH的函数对100％铁饱和的乳铁蛋白的 影响
 处理条件：     pH：     3.8     4.8  对照     暗红色     暗红色  600MPa/5分钟     暗红色     暗红色  600MPa/30分钟     暗红色     暗红色  85℃/10分钟     橙红色     橙红色  95℃/10分钟     橙红色     橙红色
实施例3

[0189]将完全铁饱和的乳铁蛋白溶液样品(约100％)调至pH7.0、 pH4.8或pH3.8，并在600MPa的高压下处理5分钟或30分钟，或 者在85℃下处理10分钟，或在95℃下处理10分钟。测定每一样品 的乳铁蛋白的完整性、结合的铁以及铁结合的能力。每一pH下未处 理的样品用作对照。在处理结果为形成沉降或不溶的聚集体的情况下， 将该样品于10℃下以8000×g离心30分钟，取上清液进行分析。

[0190]表4显示了HPLC结果。通过对峰的积分进行定量分析， 给出总的可溶的乳铁蛋白与未处理的对照相比的百分数。峰形用作变 性的定性指数。表4：用RP-HPLC测定热处理和压力处理对铁饱和的乳铁蛋白的影 响
pH3.8  pH4.8  pH7.0   对照 100  100  100   600MPa×5分钟 93  98  102   600MPa×30分钟 103  92  92   85℃×10分钟 92  82  0.3   90℃×10分钟 90  76  0.2
结果表达为每一pH下对照的a％

[0191]对于压力处理的样品，在所研究的pH范围下峰形或乳铁 蛋白的量几乎没有变化，而对于热处理的样品，在每一pH峰形具有 明显的变化，乳铁蛋白的损失较大。最为显著的是，在pH7.0下，乳 铁蛋白完全变性。

[0192]表5显示了BiaCore分析的结果表5：通过BiaCore分析评价的热处理和压力处理对铁饱和的乳铁蛋 白的影响
pH3.8  pH4.8  pH7.0  对照 100  100  100  600mPa×5分钟 104  127  99.2  600mPa×30分钟 99.7  93.5  102.9  85℃×10分钟 68.4  63.5  0.43  90℃×10分钟 65.3  65.9  0.28
结果表达为每一pH下对照的a％

[0193]表4和表5显示，压力处理在pH3.8、pH4.8和pH7.0下 基本上保持了铁饱和的乳铁蛋白的水平，然而热处理在所有pH，尤其 是中性PH值下均导致铁结合的乳铁蛋白损失。

[0194]通过非还原性和还原性SDS-PAGE分析样品(数据未显 示)。在所有的情况中，压力处理样品中的乳铁蛋白与未处理的对照相 比未显示变化。相反，热处理的样品中的乳铁蛋白均有所变化。例如， 在较低pH值下(3.8和4.8)，非还原性凝胶显示了聚集物无法穿过该凝 胶。该物质在还原后几乎不存在，这表明所述聚集是由热诱导的聚合 产生的。在pH7下，热处理样品中剩余的乳铁蛋白几乎无法测量。

[0195]铁饱和乳铁蛋白的对照溶液显示出光谱差异，该差异取决 于所述pH(数据未显示)。铁饱和乳铁蛋白母液的光谱(pH8.0，未调节) 是所报道的铁结合的转铁蛋白的具有代表性的光谱，铁结合的最大吸 收峰出现在465nm (Bates和Schlabach，1973)。值得注意的是，在每 一pH下，压力处理的样品的光谱与未处理的pH对照几乎完全相同。 由光谱测定的结合铁的量(在碳酸氢盐以及pH8.0的Tris缓冲液存在 下，465nm处的吸光率)与母液相同。因此压力处理在每一pH下不导 致铁结合或定向的铁结合发生变化。

[0196]相反，热处理样品的光谱与对照相比，显示出明显的差异 (数据未显示)。在pH3.8下，热处理样品的光谱在465nm处显示出减 小的吸光度，这表明铁结合乳铁蛋白的损失。然而在pH4.8下，热处 理样品的光谱图不同于对照(由于如上所述的样品的聚集使得pH7.0 样品的光谱无法记录)。这表明由于加热法产生某些不可逆的变化并且 使适当的铁结合受到损害。在上述所有情况中，进一步加入铁，如 FeNTA在所观察的光谱中不产生变化。实施例4

[0197]将6％w/v的完全铁饱和的乳铁蛋白溶液(约100％)的样品 调节至pH3.3、pH3.8、pH4.2、pH5.0、pH6.0、pH7.0或pH8.0， 并用大肠菌、酵母菌和霉菌进行接种。在600MPa下对样品进行压力处理且不停留、停留3分钟或停留15分钟，或者在85℃下热处 理10分钟或在90℃下热处理10分钟。未处理对照的微生物分析显示 酵母菌数和霉菌数为7.0×105cfu/ml，而在每一pH下，在所有压力处 理的乳铁蛋白中未检测出任何酵母菌和霉菌。表6显示了样品在pH 5.0至pH8.0的数据。对所有样品的HPLC分析(Palmano和Elgar，2000) 显示，在每一pH值下的压力处理对可定量的乳铁蛋白无影响(相对于 未处理的对照)，以及465nm处的吸光度测量显示，在pH5.0或更高 时，铁饱和度基本上为100％。RP-HPLC是总乳铁蛋白含量的测量法。 465nm的吸光度能够被用于测量存在于溶液中的完全铁饱和的乳铁 蛋白(FeLF)量。其中RP-HPLC测量法和源自465nm的测量法近乎相 同(mg/ml)，表示了溶液中约完全(100％)饱和的乳铁蛋白的浓度。
表6：FeLF溶液(6％w/v)调节至不同pH值并进行压力处理(600MPa， 不同的停留时间)或热处理(如表所示)后的微生物分析
样品描述 pH     大肠菌     (cfu/ml)     酵母菌和霉     菌(cfu/ml)    FeLF(mg/ml)    RP-HPLC    FeLF(mg/ml)    465nm处的    吸光度 未处理的 对照 7.0     ND     7.0×105    53.0    52.7 不停留 3分钟 15分钟 85℃/10 分钟 90℃/10 分钟 5.0     ND     ND     ND     NP     NP     ND     ND     ND     NP     NP    52.6    54.2    51.4    52.2    48.8    52.5    51.2    51.5    **    ** 不停留 3分钟 15分钟 85℃/10 6.0     ND     ND     ND     NP     ND     ND     ND     NP    51.7    54.6    52.8    5.2    52.1    50.1    52.3    7.62
分钟 90℃/10 分钟  NP  NP  1.33  ** 不停留 3分钟 15分钟 85℃/10 分钟 90℃/10 分钟 7.0  ND  ND  ND  NP  NP  ND  ND  ND  NP  NP  52.6  53.5  51.7  NQ  NQ  51.0  52.8  52.0  **  ** 不停留 3分钟 15分钟 85℃/10 分钟 90℃/10 分钟 8.0  ND  ND  ND  NP  NP  ND  ND  ND  NP  NP  52.2  50.5  52.8  NQ  NQ  49.5  53.2  55.0  **  **
ND＝未发现或未检出；NQ＝由于峰形表明乳铁蛋白的大幅度变性和聚 集而不可定量；NP＝未进行测试；**表明由于变性致使光谱不规则而 无法测定吸光度。
实施例5

[0198]将完全铁饱和(约100％)的乳铁蛋白(按上述方法制备)并入 酸乳酪(按照图1的方法制备)、饮料(按照图2的方法制备)，或果冻(按 照图3的方法制备)中。按照所述图所描述的来制备热处理样品、压力 处理样品和对照样品。从这些样品中提取乳铁蛋白用于完整性分析、 结合铁分析和铁结合能力分析。

[0199]简言之，在10℃下，将酸乳酪样品(约100g)以8000×g离 心30分钟。除去浮在上层的乳清，用pH6.5的0.1M磷酸二钠缓冲液 按照1∶1的比例进行稀释，并用NaOH将pH调节至pH6.5。用上述离 心法将形成的沉淀除去。将获得的上清液(约100-110mL)以2mL/分钟 加载到S Sepharose Big Beads(SPBB)的柱(1.6×20cm)中。

[0200]对于饮料样品，用超纯水将100mL饮料稀释到400mL， 并用NaOH将pH调至6.5。稀释后的样品(100mL)通过0.45μm的 PVDF膜(Millipore)过滤，将约80mL以2mL/分钟加载到S Sepharose Big Bead(SPBB)的柱(1.6×20cm)中。

[0201]对于果冻样品，用超纯水将约50g的果冻稀释至200mL， 搅拌均匀。稀释后的果冻样品(约100mL)通过0.45μm的PVDF膜 (Millipore)过滤，并将滤出液以2mL/分钟加载到S Sepharose Big Bead (SPBB)的柱(1.6×20cm)中。

[0202]按照下述方法对每一样品的分离柱进行处理。用pH6.5的 0.1M磷酸二钠缓冲液洗出未结合的物质。结合的蛋白质先用0.45M 的NaCl洗脱(直至在280nm和214nm处的吸光度达到基线)，然后用 1.5M的NaCl洗脱。反相HPLC(Palmano和Elgar，2000)对片段的分 析显示，事实上全部的乳铁蛋白都保存在1.5M的NaCl的洗脱液中， 对于酸乳酪或饮料样品其纯度为至少93％，或对果冻样品其纯度为至 少82％-88％。用超纯水对1.5M的NaCl洗脱的每一样品的片段进行 透析、冷干、并贮存在-30℃下直至分析。结果-铁结合

[0203]在生产后第14天，通过反相HPLC以及使用BiaCore分析 (Indyk和Filonzi，2005)的免疫测定法测定酸乳酪、饮料和果冻中的乳 铁蛋白量。使用分光光度滴定法来测定提取的乳铁蛋白的铁饱和度。 结果如表7所示。表7
 样品  Lf(mg/g)  (BiaCore)   Lf(mg/g)   (RP-HPLC)   Fe饱和度(％)  对照的酸乳酪  3.38   3.91   12  HPP的酸乳酪  2.99   4.05   17
热处理的酸乳酪 0.0004  0.079  ND 对照的饮料 2.45  3.42  78 HPP的饮料 1.9  3.10  83 热处理的饮料 0.23  ND  ND 对照的果冻 3.72  4.701  23 HPP的果冻 3.36  4.069  61
ND＝未测定；HPP＝压力处理。

[0204]上述结果显示，高压处理的应用样品保持了铁乳铁蛋白的 完整性，而热处理方法严重破坏了蛋白质。在所有测量的情况中，压 力处理的样品的铁离子饱和度约等于或大于相应对照的铁离子饱和 度，这表明压力处理能够保持铁饱和状态，甚至在特定的应用中改善 铁结合状态。热处理样品的乳铁蛋白浓度太低以及完整性太差以致于 无法保证乳铁蛋白的提取。在酸乳酪中观察到的低饱和度可能是由于 微生物与低pH的结合导致的铁的清除。在所有情况中，提取的乳铁 蛋白保持了完整的铁结合生物活性，且能与铁结合的饱和度超过 90％(数据未显示)。结果-微生物学

[0205]在1至2周内对饮料、果冻和酸乳酪进行微生物分析，如 表8至表10所示。结果表明，压力处理法可有效降低微生物数。表8：FeLF酸乳酪的微生物学
对测试的描述   对照   (cfu/ml)    热处理    (cfu/ml)    压力处理    (cfu/ml) 耐酸菌(acid tolerant)总数 (℃)   60    ＜10    10 蜡状芽孢杆菌(B.Cereus)数   ＜10   估计(EST)    ＜10EST    ＜10EST 直接平板法大肠菌群数   ＜1EST    ＜1EST    ＜1EST
凝固酶阳性葡萄球菌数   ＜10EST     ＜10EST     ＜10EST 酵母菌和霉菌数   ＜1EST     ＜1EST     ＜1EST 需氧菌平板数   130     ＜10EST     60EST 产气荚膜梭菌(Clostridia perfringens)数   ＜10EST     ＜10EST     ＜10EST 嗜温性孢子数   20EST     10EST     10EST 嗜热菌(Thermophiles)   50EST     30EST     30EST 大肠杆菌检测LSTMUG   ND     ND     ND 大肠杆菌检测LSTMUG   ND     ND     ND 李斯特氏菌(Listeria)   无     无     无 沙门氏菌(Salmonella)   无     无     无
ND＝未检出。
表9：FeLF酸性饮料的微生物学
对测试的描述   对照   (cfu/ml)   热处理   (cfu/ml)   压力处理   (cfu/ml) 耐酸菌总数(℃)   2.8×103   ＜10   10 蜡状芽孢杆菌数   ＜10EST   ＜10EST   ＜10EST 直接平板法大肠菌群数   ＜1EST   ＜1EST   ＜1EST 凝固酶阳性葡萄球菌数   ＜10EST   ＜10EST   ＜10EST 酵母菌和霉菌数   ＜1EST   ＜1EST   ＜1EST 需氧菌平板数   640   ＜10EST   60EST 产气荚膜梭菌计数   ＜10EST   ＜10EST   ＜10EST 嗜温性孢子计数   ＜10EST   ＜10EST   ＜10EST 嗜热菌   10EST   ＜10EST   ＜10EST 大肠杆菌检测LSTMUG   ND   ND   ND 大肠杆菌检测LSTMUG   ND   ND   ND 李斯特氏菌   无   无   无 沙门氏菌   无   无   无
ND＝未检出。
表10：FeLF果冻的微生物学
对测试的描述   对照   (cfu/ml)     压力处理     (cfu/ml) 耐酸菌总数(℃)   500霉菌     ＜10 蜡状芽孢杆菌数   ＜10EST     ＜10EST 直接平板法大肠菌群数   ＜1EST     ＜1EST 凝固酶阳性葡萄球菌数   ＜10EST     ＜10EST 酵母菌和霉菌数   ＜1EST     ＜1EST 需氧菌平板数   ＜10EST     ＜10EST 产气荚膜梭菌数   ＜10EST     ＜10EST 嗜温性孢子数   ＜10EST     ＜10EST 嗜热菌   ＜10EST     ＜10EST 大肠杆菌检测LSTMUG   ND     ND 大肠杆菌检测LSTMUG   ND     ND 李斯特氏菌   无     无 沙门氏菌   无     无
ND＝未检出。
实施例6

[0206]按照图4的方法制备的碳酸饮料含有4mg/ml的铁饱和的 冻干乳铁蛋白粉末。压力处理前，将饮料与大肠菌、酵母菌和霉菌接 触。对饮料不进行处理饮料或进行压力处理。用HPLC(Palmano和 E1gar，2000)和ELISA法分析饮料中的乳铁蛋白含量。结果显示，压 力处理对可定量的乳铁蛋白几乎无影响，但是其使大肠菌数、酵母菌 数和霉菌数以及APC数可以降低了5个对数周期(表11)。表11.在不同pH下配制并与大肠菌、酵母菌和霉菌接触的FeLF碳 酸饮料的微生物分析
 样品描述   大肠菌   (cfu/mL)   酵母菌和   霉菌   (cfu/mL)     APC     (cfu/mL)     FeLF     (mg/mL)     (HPLC)     FeLF     (mg/mL)     (ELISA)  pH4.5  未处理   8.0×105    ＜105     1.5×106     3.74     2.49  pH4.5  600MPa/3分钟   ND    ND     ND     3.81     1.83  pH6.0  未处理   1.6×106    1.0×105     1.7×105     3.79     2.36  pH6.0  600MPa/3分钟   ND    ND     ND     3.74     2.12
ND＝未检出
工业应用

[0207]本发明的方法可用于制备食品和健康产业中的金属离子 乳铁蛋白组合物。根据本发明生产的组合物和产品具有许多健康功效 和治疗用途，如上文所述。

[0208]本领域技术人员应理解，上文的描述仅通过示例进行说 明，而本发明并不限于这些示例。参考文献
Ainscough E W，Brodie A M和Plowman J E.The chromium，manganese， cobalt and copper complexes ofhuman lactoferrin (人乳铁蛋白的铬、锰、 钴和铜离子配合物).Inorganica Chimica Acta(1979)149-153.
Baker E，Baker H M，Kidd R D.Functional variations on a common structural framework(共同结构骨架上的功能性变体).Biochem.Cell Biol.(2002)80，27-34.
Bates G W和Schlabach M R.The reaction of ferric salts with transferring (三价铁盐与转铁蛋白的反应).J.Biological Chem.(1973)248(9)： 3228-3232.
Bates G W，Billups C，Saltman P.The kinetics and mechanism of iron(III) exchange between chelates and transferrin.I.The complexes of citrate and nitrilotriacetic acid(螯合物和转铁蛋白之间铁(III)交换的动力学和机理 I.柠檬酸盐与氨三乙酸的配合物).J.Biological Chem(1967).242(12) 2810-2815.
Bethell D R，Huang J.Recombinant human lactoferrin treatment for global health issues：iron deficiency and acute diarrhea(全球健康问题的 重组人乳铁蛋白治疗：铁缺乏症和急性腹泻).Biometals(2004)17(3)： 337-42.
Bluard-Deconinck J-M，Williams J，Evans RW，Van Snick J，Osinski PA， Masson PL.Iron-binding fragments from the N-terminal and C-terminal regions ofhuman lactoferrin(人乳铁蛋白N末端和C末端区域的铁结合 片段).Biochem J.(1978)171，321-327.
Bowie J U，Reidhaar-Olson JF，Lim WA，Sauer RT.Deciphering the message in protein sequences：tolerance to amino acid substitutions(蛋白 序列中的信息揭秘：对氨基酸替代的耐受性).Science.(1990) 247(4948)：1306-10.
Brock JH，Arzabe FR(1976)，Cleavage of diferric bovine transferrin into two monoferric fragments(二铁牛转铁蛋白裂解为两个单铁片段). FEBS Lett 69.63-66.
Cadwell，R.C.和G.F.Joyce.Randomzation of genes by PCR mutagenesis (PCR突变法随机选择基因).PCR Methods Appl.1992；2：28-33.
Chiang L-HC和Mao FCH(2002).Production of trivalent chromium complex compound useful for preparing milk product for controlling blood sugar involves addition of lactoferrin or whey protein to a trivalent chromium compound(用于制备可控制血糖的乳制品的三价铬配位化 合物的生产包括向三价铬配位化合物中加入乳铁蛋白或乳清蛋白). GB 2366799 A.
Cornish J，Callon K E，Naot D，Palmano K P，Banovic T，Bava U，Watson M，Lin J-M，Tong，PC，Chen Q，Chan VA，Reid HE，Fazzalari N，Baker HM，Baker EN，Haggarty NW，Gre y，AB，Reid IR.Lactoferrin is a potent regulator ofbone cell activity and increase bone formation in vivo(乳铁 蛋白是骨细胞活性的有效调节剂并且其在体内促进骨骼形成). Endocrinology(2004)145，4366-4374.
Dominguez E，Perez M D，Puyol P，Sanchez L，Calvo M，Effect of pH on antigen-binding activity of IgG from bovine colostrum upon heating(加热 时pH对牛初乳中的IgG的抗原结合活性的影响)，Journal of Dairy Research 2001(68)511-518.
Dousako S，Tanaka M，Tatsumi K，Tojima T(1991).Preparation of iron fortified beverages containing lactoferrin(含有乳铁蛋白的铁增强型饮 料的制备).EP 454084.
Dugas B，Goulard S et al.(2001).Composition containing an iron complexing protein and a precursor of nitrogen monoxide metabolism and/or a chemical donor of nitrogen monoxide and uses thereof(含有铁配 合蛋白和一氧化氮代谢前体和/或一氧化氮化学供体的组合物及其用 途).EP1303296 A1 030423.
Facon MJ，Skura BJ.Antibacterial activity of lactoferricin，lysozyme and EDTA against Salmonella enteritidis(乳铁蛋白肽，溶菌酶和EDTA对肠 炎沙门氏菌的抗菌活性).Int.Dairy J.1996，6(3)303-13.
Felipe X，Capellas M，Law A J R，Comparison of the effects of high-pressure treatment and heat pasteurization on the whey proteins in goat′s milk(高压处理和高温巴氏消毒法对羊奶乳清蛋白处理效果的比 较)，Journal of Agricultural and Food Chemistry 1997，45，627.
Foley A A，Bates G W.The purification of lactoferrin from human whey to batch extraction(分批提取从人乳清中提纯乳铁蛋白)，Analytical Biochemistry 1987，162(1)296-300.
Groves M L.The isolation of a red protein from milk(从乳中分离红色蛋 白质).J.American Chem.Soc.(1960)82，3345-3350.
Huang N，Huang J，Bethall D，Deeter SE，Berman RJ(2004). Lactoferrin protein with iron for treating iron deficiency and anaemia(用 于治疗铁缺乏症和贫血的含铁的乳铁蛋白蛋白质).WO200460392A1.
Huffman L M，Processing whey protein for use as a food ingredient(加工 乳清蛋白以用作食品成分)，Food Technology 1996，50(2)，49-52.
Huppertz T，Kelly A L，P.F.Fox，Effects of high pressure on constituents and properties of milk(高压对乳品中的组分和性质的影响). International Dairy Journal，2002，12，561-572.
Indyk H E和Filonzi E L，Determination of Lactoferrin in Bovine Milk， Colostrum and Infant Formula by Optical Biosensor Analysis(通过光学生 物传感器分析法测定牛乳、初乳和婴儿配方中的乳铁蛋白)， Intemational Dairy Journal，2005.05.15，待刊，自2005年1月28日可 在线获取自http://www.sciencedirect.com.
International Dairy Federation(国际乳品联合会)，“Whey.Proceedings of the Second International Whey Conference(乳清：第二届国际乳清会议 论文集)”，1998，Chicago，Illinois，USA.
Karthikeyan S，Sujata Sharma，Ashwani K.Sharma，M.Paramasivam， Savita Yadav，A.Srinivasan和Tej P.Singh，Structural variability and functional convergence in lactoferrins(乳铁蛋白的结构多样性和功能趋 同性)，Current Science(1999)77(2)：241
Kawakami H等人，Effect of lactoferrin on iron solubility under neutral conditions(乳铁蛋白对中性条件下铁的溶解性的影响).BiosScience Biotech Biochem 1993；57(8)1376-1377.
Kimmerlin T，Seebach D.100 years of peptide synthesis：ligation methods for peptide and protein synthesis with applications to beta-peptide assemblies(100年来的肽合成：可应用于β-肽装配的用于肽和蛋白质 合成的连接法).J Pept Res.2005 Feb；65(2)：229-60.
Korhonen H，Pihlanto-Leppala A，Rantamaki P，Tupasela T，Impact of processing on bioactive proteins and peptides(加工对生物活性蛋白质和 肽的影响)，Trends in Food Science and Technology 1998，9，307-319.
Law，B.A.和Reiter，B.，The isolation and bacteriostatic properties of lactoferrin from bovine milk whey(来自牛乳乳清的乳铁蛋白的分离和 抑菌性).J.Dairy Res.(1977)44：595-599.
Legrand D，Mazurier J，Metz-Boutigue M-H，Jolles J，Jo；；es P，Montreuil J 和Spik G(1984).Characterization and localization of an iron-binding 18-kDa glycopeptide isolated  from the N-terminal half of human lactotransferrin(从人乳铁传递蛋白的N末端分离的铁结合的18-kDa 糖肽的性质和定位).Biochimica et Biophysica acta 787，90-96.
Leung，D W，Chen，E.Y.，Goeddel，D.V.A Method for Random Mutagenesis of a Defined DNA Segment Using a Modified Polymerase Chain Reaction(使用修饰的聚合酶链反应使既定DNA片段产生随机 突变的方法).Technique 1989；1：11-15.
Li-Chan E，Kummer A，Losso J N，Kitts D D，Nakai S，Stability of bovine immunoglobulins to thermal treatment and processing(牛免疫球蛋白在 热处理和加工中的稳定性)，Food Research International 1995(28)9-16.
Lund，Barbara，M.；Baird-Parker，Tony C.；Gould，Grahame W.(Eds). Microbiological Safety and Quality of Food(食物的微生物安全和品质)， Volumes 1-2，(2000)Springer-Verlag.
Manderson GA，Hardman MJ和Creamer LK.Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of beta-lactoglobulin A，B，and C(热处 理对β-乳球蛋白A、B和C的构象和聚集的影响).J.Agric.Food Chem. (1998)46，5052-5061.
Masson PL，Heremans JF.Studies on lactoferrin，the iron-binding protein of secretions(对分泌物的乳铁蛋白和铁结合蛋白质的研究).Protides of the Biological Fluids 1966，14，115-24.
Masuda T，Rehinarudo H Y，Suzuki K，Sakai T，Morichi T，The effect of high hydrostatic pressure treatment on the preservability and the immunological activity of bovine colostrums(高流体静力压处理对牛初 乳的保存性和免疫活性的影响)，Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 2000(13)1323-1328.
McGinnis S.和Madden T.L.，(2004)“BLAST：at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools(BLAST：位于强大而且多样化 的序列分析工具的核心).”Nucleic Acids Res.32：W20-W25.
Medeiros DM，Plattner A，Jennings D，Stoecker B.Bone morpholgy， strength and density are compromised in iron-deficient rats and excerbated by calcium restriction(铁缺乏的小鼠中骨骼形态、强度和密 度损伤以及因钙限制导致的损伤加重).J.Nutrition(2002)132， 3135-3141.
Metz-Boutigue MH，Jolles J，Mazurier J，Schoentgen F，Legrand D，Spik G，Montreuil J，Jolles P.Human lactotransferrin：amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins(人乳铁传递蛋白：与其它 转铁蛋白的氨基酸序列和结构的比较).Eur J Biochem.1984；145(3)： 659-76.
Nguyen LT，Schibli DJ，Vogel J.Structural studies and model membrane interactions of two peptides derived from bovine lactoferricin(源自牛乳 铁蛋白肽的两种肽的结构研究和膜相互作用模型).Joumal of Peptide Science 2005，11(7)379-89.
Nitsche D(1991).Use of lactoferrin，optimally containing iron-for treatment of endo-toxaemia associated with for example，sepsis， gastrointestinal disorders，antibiotic therapy and liver disorders(最优选含 铁的乳铁蛋白的应用-用于治疗与诸如脓毒症、胃肠道病症、抗生素 治疗和肝病症相关的内毒血症).DE 4008033.
Oguchi S，Walker WA，Sanderson IR.Iron saturation alters the effect of lactoferrin on the proliferation and differentiation of human enterocytes (Cac0-2cells)(铁饱和度改变乳铁蛋白对人肠细胞(Cac0-2细胞)的增殖 和分化的影响).Biology of the Neonate(1995)67(5)330-9.
Palmano K P和Elgar D E，Detection and quantification of lactoferrin in bovine whey samples by reverse-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene(通过聚苯乙烯/二乙烯 基苯的反相高效液相色谱法检测并定量测定牛乳清样品中的乳铁蛋 白)，Journal of Chromatography A，2002，947，307-311.
Parry RM，Brown EM.Lactoferrin conformation and metal binding properties(乳铁蛋白的构象和金属结合性).In Advances in Experimental Medicine and Biology(1974)48，141-160.
Pierce A，Colavizza D，Benaissa M，Maes P，Tartar A，Montreuil J，Spik G. Molecular cloning and sequence analysis ofbovine lactotransferrin(牛乳 铁传递蛋白的分子克隆和序列分析).Eur J Biochem.1991；196(1)： 177-84.
Sakurai T，Uchida T，Sate K(2000).Iron-enhanced beverage，food products and feeds(铁含量增加的饮料、食品和饲料).JP 2000014355 A.
Sambrook，J；Fritsch E F；Maniatis T，(1989).Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册).Cold Spring Harbour Lab Press，Cold Spring Harbour，New York.
Sienkiewicz T，and Riedel C(Eds)“Whey and whey utilization(乳清和乳 清应用)”(Verlag，Germany，1990).
Steijns JM和van Hooijdonk ACM.Occurrence，structure，biochemical properties and technological characteristics of lactoferrin(乳铁蛋白的产 生、结构、生化性质和技术特征).British J Nutrition(2000)84，S11-S17.
Stemmer WP.DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitro recombination for molecular evolution(通过随机片段和重新装配进 行DNA改组：用于分子进化的体外重组).Proc Natl Acad Sci USA 1994； 91：10747-10751.
Superti F，Siciliano R，Rega B，Giansanti F，Valenti P，Antonini G(2001) Involvement of bovine lactoferrin metal saturation，sialic acid and protein fragments in the inhibition of rotavirus infection(牛乳铁蛋白金属饱和 度、唾液酸和蛋白片段在抑制轮状病毒感染中的作用).Biochim Biophya Acta 1528(2-3)107-15.
Tanaka M，Toshima T，Dosemari S，Tatsumi K(1991).Production of iron enriched drink(富铁饮料的生产).JP 3130060 A.
Tatusova，T.A.，Madden，T.L.，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-用于比较蛋 白质和核酸序列的新工具)”，FEMS Microbiol Lett.(1999)174： 247-250.
Tomita M，Takase，M，Wakabayashi H和Bellamy W(1994).Antimicrobial Peptides of Lactoferrin in Lactoferrin Structure and Function(乳铁蛋白 中的抗微生物多肽：结构和功能)，pp209-218.Eds TW Hutchens，SV Rumball，B Lonnerdal，Plenum Press，New York.
Tomita M，Tamura Y，Saito H，Nagameguri Y(1992).Iron agent， production of thereof and production of iron enriched food(铁制剂、铁制 剂的生产以及富铁食品的生产).JP4141067.
Tomita M，Wakabayashi H，Yamauchi K，Teraguchi S，Hayasawa H； Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk：production and applications(源自乳的牛乳铁蛋白和牛乳铁蛋白肽：生产和应用).
Biochemistry and Cell Biology 2002，80(1)109-12.
Tomita MY，Tamura YY，Miyakawa HK，Saito HK，Abe HY，Nagao ES (1994).Method for heat treatment of lactoferrin without losing physiological activities thereof(在不损失乳铁蛋白的生理活性的情况下 对其进行热处理的方法).US5340924.
Tonello C，Largeteau A，Jolibert F，Deschamps A，Demazeau G，Pressure effect on microorganisms and immunoglobulins of bovine colostrums(压 力对牛初乳中的微生物和免疫球蛋白的影响)，High Pressure and Biotechnology，Eds.C.Balny，R.Hayashi，K.Heremans，P.Masson.1992 (224)249-254.
Tsuji S，Hirata Y，Matsuoka K.Two apparent molecular forms of bovine lactoferrin(两种显性分子形式的牛乳铁蛋白).J Dairy Sci.1989； 72(5)：1130-6.
Tweedie J W，Bain HB，Day CL，Nicholson HH，Mead PL，Sheth B， Stowell，KM.Lactoferrin cDNA.Expression and In Vitro Mutagenesis(乳 铁蛋白cDNA的表达和体外突变).Advances in Experimental Medicine and Biology(1994)357，197-208.
Valenti P，Torcia F，Berlutti F，Pacifici E，Ebano V，Moscarini M和 Paesano R.Oral administration of lactoferrin increases hemoglobin and sideremia in pregnant women(口服给药的乳铁蛋白增加了怀孕妇女体 内的血红蛋白和sideremia).7th International Conference on Lactoferrin： Structure，Functions and Applications(第七届乳铁蛋白国际会议：结构、 功能和应用).Honolulu，Hawaii，October 16-19，2005.
van der Kraan MIA，Groenink J，Nazmi K，Veerman ECI，.Bolscher JGM， Nieuw Amerongen AV.Lactoferrampin：a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin (Lactoferrampin：牛乳铁蛋白的N1- 结构域中的新型抗微生物肽).Peptides 2004，25(2)177-83.
van Veen H A，Geerts M E，van Berkel P H，Nuijens J H.The role of N-linked glycosylation in the protection of human and bovine lactoferrin against tryptic proteolysis(N-糖基化在保护人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白不 受胰蛋白酶水解中的作用).Eur.J.Biochem.(2004)271(4)：678-684.
Viejo-Diaz M，Andrés MT，Pérez-Gil J，Sánchez M，Fierro J F.Potassium Efflux Induced by a New Lactoferrin-Derived Peptide Mimicking the Effect of Native Htman Lactoferrin on the Bacterial Cytoplasmic Membrane(通过模拟天然人乳铁蛋白对细菌细胞质膜的作用的新乳铁 蛋白衍生的肽诱导的钾流出).Biochemistry(Moscow)2003，68(2)217 -27.
Yoshida S和Xiuyn，Ye.Isolation of Lactoperoxidase and Lactoferrins from Bovine Milk Acid Whey by Carboxymethyl Cation Exchange Chromatography(通过羧甲基阳离子交换色谱法从牛乳酸性乳清中分 离乳过氧化物酶和乳铁蛋白).J Dairy Sci.1991；74：1439-1444.
Zadow J G(Ed)“Whey and Lactose Processing(乳清和乳糖加工)” (Elsevier Applied Science，London and New York，1992).