IL4/IL13结合重复蛋白及用途
阅读：698发布：2020-05-27
专利汇可以提供IL4/IL13结合重复蛋白及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且IL4／IL13-结合蛋白包括结合结构域，其抑制IL4／IL13结合IL4Ralpaha和常见的γ链复合物(1型)并抑制IL4结合IL4Ralpha和IL13Ralpha1复合物(2型)，并且抑制IL13结合IL13Ralpha1和／或IL13Ralpha2，用于 治疗 癌症、炎性 疾病 、和其它病理状态如过敏或 纤维 化病症，尤其是 肺 部病症。，下面是IL4/IL13结合重复蛋白及用途专利的具体信息内容。
1.包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域是锚蛋白重复结构域，所述结合蛋白结合人IL4，并且体外或体内抑制人IL4结合到IL4Ralpha上，并且其中所述锚蛋白重复结构域包括至少一个锚蛋白重复模块。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括两个或更多个锚蛋白重复模块。
3.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括氨基末端封端（N-cap）模块，其定位在包括选自SEQ ID NO: 2、171、和174的氨基酸序列的所述锚蛋白重复结构域的N-末端，并且包括羧基末端封端（C-cap）模块，其定位在具有选自SEQ ID NO:
3、103、172和175的氨基酸序列的所述锚蛋白重复结构域的C-末端。
4.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块包括选自SEQ ID NO:
1、31-40和42-90中的至少一种的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块包括串联的AR1模块、AR2模块和AR3模块，所述AR1模块包括选自SEQ ID NO: 1、31-40、42-46、82、85、和88的氨基酸序列；所述AR2模块包括选自SEQ ID NO: 1、47-61、83、86、和89的氨基酸序列；并且所述AR3模块包括选自SEQ ID NO: 1、62-78、84、87、和90的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白还包括串联的AR4模块，所述AR4模块包括选自SEQ ID NO: 1和79-81的氨基酸序列。
7.IL4结合蛋白，其包括选自SEQ ID NO: 91-93的氨基酸序列。
8.包括锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述结合蛋白与根据权利要求1-7中任一项所述的结合蛋白竞争对人IL4的结合。
9.包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域是锚蛋白重复结构域并且在体外或体内结合人IL13，抑制人IL13与人IL13Ralpha1和人IL13Ralpha2中的至少一种的结合，并且其中所述锚蛋白重复结构域包括至少一个锚蛋白重复模块。
10.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括两个或更多个锚蛋白重复模块。
11.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中所述结合结构域结合IL13 R130Q变体并抑制所述IL13 R130Q变体与人IL13Ralpha1和人IL13Ralpha2中的至少一种的结合。
12.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括串联排列的锚蛋白重复模块AR1，AR2、和AR3。
13.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括N-cap模块，其定位在具有选自SEQ ID NO: 2、171、和174的氨基酸序列的所述锚蛋白重复结构域的N-末端，并且包括C-cap模块，其定位在具有选自SEQ ID NO: 3、103、172和175的氨基酸序列的所述锚蛋白重复结构域的C-末端。
14.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块包括SEQ ID NO: 1、
108-161和168-170的氨基酸序列中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块包括串联的AR1模块、AR2模块和AR3模块，所述AR1模块包括选自SEQ ID NO: 1、108-125、156、157、和168的氨基酸序列；所述AR2模块包括选自SEQ ID NO: 1、126-143、158、159、和169的氨基酸序列；
并且所述AR3模块包括选自SEQ ID NO: 1、144-155、160、161、和170的氨基酸序列。
16.IL13结合蛋白，其包括选自SEQ ID NO: 94、162-167、和173的氨基酸序列。
17.包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域是锚蛋白重复结构域并且体外或体内结合人IL13，抑制人IL13与人IL13Ralpha1和人IL13Ralpha2中的至少一种的结合，所述锚蛋白重复结构域包括两个或更多个锚蛋白重复模块，并且所述锚蛋白重复结构域在SEQ ID NO:101的一个或多个残基6、9、10、13、17、20、96、99、103、104、106-109、111、和
112上结合人IL13。
18.根据权利要求17所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在SEQ ID NO:101的一个或多个残基106、107、和112上结合人IL13。
19.包括锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述结合蛋白与根据权利要求9-18中任一项所述的结合蛋白竞争对人IL13的结合。
20.包括第一结合结构域和第二结合结构域的结合蛋白，其中所述第一结合结构域是锚蛋白重复结构域，结合人IL4，并且体外或体内抑制人IL4与IL4Ralpha的结合，并且所述第二结合结构域是锚蛋白重复结构域并且体外或体内结合人IL13，抑制人IL13结合人IL13Ralpha1和人IL13Ralpha2中的至少一个，并且其中所述锚蛋白重复结构域包括至少一个锚蛋白重复模块。
21.包括第一结合结构域和第二结合结构域的结合蛋白，其中所述第一结合结构域是锚蛋白重复结构域，结合人IL4，并且体外或体内抑制人IL4与IL4Ralpha的结合，并且所述第二结合结构域是锚蛋白重复结构域，并且结合IL13 R130Q变体并抑制IL13 R130Q变体结合人IL13Ralpha1和人IL13Ralpha2中的至少一个，并且其中所述锚蛋白重复结构域包括至少一个锚蛋白重复模块。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白结合IL4或
IL13，具有通过表面等离振子共振测定的小于2nM的KD值。
23.结合蛋白，其包括IL4-结合锚蛋白重复结构域和IL13-结合锚蛋白重复结构域。
24.根据权利要求23所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包括结合至IL4的锚蛋白重复模块、定位在IL4-结合锚蛋白重复结构域N-末端的N-cap模块、定位在IL4-结合锚蛋白重复结构域C-末端的C-cap模块、结合至IL4的锚蛋白重复模块、定位在IL13-结合锚蛋白重复模块N-末端的N-cap模块、定位在IL13-结合锚蛋白重复模块C-末端的C-cap模块、以及接头，其中所述接头连接所述IL4-结合锚蛋白重复模块的C-cap模块和所述IL13-结合锚蛋白重复模块的N-cap模块或连接所述IL4-结合锚蛋白重复模块的N-cap模块和所述IL13-结合锚蛋白重复模块的C-cap模块。
25.根据权利要求24所述的结合蛋白，其中所述接头是GS接头。
26.结合蛋白，所述结合蛋白包括选自SEQ ID NO: 41、104、177和178的氨基酸序列。
27.结合蛋白，所述结合蛋白包括IL4-结合锚蛋白重复结构域，其具有所述氨基酸序列SEQ ID NO: 91，IL13-结合锚蛋白重复结构域，其具有所述氨基酸序列SEQ ID NO: 94，以及接头。
28.药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1-7、9-18、和20-27中任一项所述的结合蛋白，以及药用载体和/或稀释剂。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物适用于呼吸系统疾病的治疗。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述呼吸系统疾病为哮喘和肺部纤维化中的至少一种。
31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物适用于心血管病症、癌症、皮肤病、和纤维化病症的治疗。
32.根据权利要求28所述的药物组合物，其中配制所述组合物以使用喷雾器进行递送。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述组合物包括使用干粉装置进行递送的干粉制剂。
34.给药根据权利要求28所述的药物组合物的方法，其中所述给药途径选自关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式。
35.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括编码根据权利要求1-7、9-18、和20-27中任一项所述的结合蛋白的核苷酸序列。
36.分离的核酸载体，所述分离的核酸载体包含根据权利要求35所述的核酸分子。
37.分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包括根据权利要求35所述的分离的核酸分子，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自大肠杆菌、酵母、杆 状 病 毒、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、P3X63Ag8.653、和SP2/0-Ag14、骨髓瘤、以及淋巴瘤细胞中的至少一种。
39.用于制备结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述结合蛋白被表达并回收的条件下培养根据权利要求37所述的分离的宿主细胞。
40.包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域是锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白与根据权利要求1-7、9-18、和20-27中任一项所述的结合蛋白竞争对具有氨基酸序列SEQ ID NO: 4的IL4蛋白和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 101的IL13蛋白的结合。
41.结合蛋白，所述结合蛋白包括由核苷酸序列SEQ ID NO:176编码的氨基酸序列。
42.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括核苷酸序列SEQ ID NO: 176。
43.分离的核酸载体，所述分离的核酸载体包含根据权利要求42所述的核酸分子。
44.分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包括根据权利要求42所述的分离的核酸分子，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
45.根据权利要求44所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自大肠杆菌、酵母、杆 状 病 毒、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、P3X63Ag8.653、和SP2/0-Ag14、骨髓瘤、以及淋巴瘤细胞中的至少一种。
46.用于制备结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述结合蛋白被表达并回收的条件下培养根据权利要求44所述的分离的宿主细胞。
47.根据权利要求1-7、9-18、20-27、和41中任一项所述的结合结构域在制造用于治疗心血管病症、呼吸病症、癌症、皮肤病、和纤维化病症的药物中的用途。
48.权利要求47的用途，其用于治疗哮喘和肺部纤维化中的至少一种。
49.本文描述的任何发明。
IL4／IL13结合重复蛋白及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及包括结合结构域的重组结合蛋白，该结合结构域是重复蛋白，包括设计的模块重复单元并经选择以能够抑制IL4和IL13结合到它们的同源受体上，从而提供有用的和稳定的治疗蛋白。更具体地，本发明涉及双特异性IL4／IL13结合蛋白，其包括锚蛋白重复模块。
背景技术
[0002] 白介素4(人IL4，UniProt P05112)是一种129个氨基酸的细胞因子，其来源于对多种细胞类型具有多个生物学效应的T细胞和肥大细胞，所述细胞类型包括B-细胞、T-细胞和非淋巴细胞(包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞)。IL4是多效细胞因子并已经涉及与哮喘相关联的多种细胞响应，包括IgE生成、炎症、气道过敏、和杯状细胞增生(Perkins等人，J Allergy Clin Immunol118：410-9，2006；Pene等人，Proc Natl Acad Sci U S A85：6880-4，1988)。它在T-细胞和肥大细胞中的产生受到维持Th2-介导的响应的多种调节剂和细胞因子的调节。IL4信号转导经由两个受体复合物，I型受体复合物和II型受体复合物，进行介导。通过由一个IL-4Rα和一个IL13Rα1链组成的II型受体复合物介导的信号转导主要对IL4和IL13的共有生物学效应负责，并且IL4和IL13均可接触复合物的组分。I型受体复合物由IL-4Rα和常见的γ-链构成，它特异性地响应于IL4并介导不表达IL13αR1的T-细胞中的IL4响应(Idzerda等人，J Exp Med171：861-73，1990；Nelms等人，Annu Rev Immunol17：701-38，1999)。
[0003] 使用抗体中和IL4的效应或如IL4缺失小鼠的响应所示在TH2炎症的小鼠模型中抑制过敏原-特异性IgE并减轻嗜曙红细胞过多(Zhu和Paul，Blood112：1557-69，2008)、以及气道高反应性(AHR)(Heaton等人，Lancet365：142-9，2005)。相似地，可溶解的IL4受体已经用于抑制IL4信号转导并已经显示减少小鼠肺的过敏原-诱导的AHR以
及VCAM-1表达、粘液产生和嗜酸性粒细胞聚集(McKinley等人，J Immunol181：4089-97，
2008)。在人细胞中，IL4已经显示促使天然T辅助(Th0)淋巴细胞分化成TH2淋巴
细 胞(Breekveldt-Postma等 人，Curr Med Res Opin24：975-83，2008；Wraight等 人，Respirology7：133-9，2002)。TH2细胞已经显示分泌IL-4、IL-5、IL-9和IL13，但是不产生IFNγ，导致促炎TH2细胞因子失衡(Partridge，Ann Oncol17：183-4，2006)。用抑制受体结合的抗体中和IL4阻止T-细胞的分化((Idzerda等人，J Exp Med171：861-73，1990；
Nelms，Keegan等人，Annu Rev Immunol17：701-38，1999))。在编码IL4、IL4Ra、和IL13的基因中的多态性已经与哮喘相关联，事实上，IL4和IL4Ra多态性均与严重哮喘和哮喘的恶化相关联(Sandford等人，J Allergy Clin Immunol106：135-40，2000；Wenzel等人，Am J Respir Crit Care Med175：570-6，2007)。基于IL4在哮喘中表现出的中心作用，期望抑制IL4活性的生物治疗药物成为用于治疗哮喘和其它Th2-相关联的病变的有价值的手段。然而，利用可溶解的IL4受体的临床研究的结果令人失望，并且显示出在安慰剂组和治疗组之间哮喘恶化发生率的极小差异(Borish等人，J.Allergy Clin.Immunology107：963-70，
2001)。
及VCAM-1表达、粘液产生和嗜酸性粒细胞聚集(McKinley等人，J Immunol181：4089-97，
2008)。在人细胞中，IL4已经显示促使天然T辅助(Th0)淋巴细胞分化成TH2淋巴
细 胞(Breekveldt-Postma等 人，Curr Med Res Opin24：975-83，2008；Wraight等 人，Respirology7：133-9，2002)。TH2细胞已经显示分泌IL-4、IL-5、IL-9和IL13，但是不产生IFNγ，导致促炎TH2细胞因子失衡(Partridge，Ann Oncol17：183-4，2006)。用抑制受体结合的抗体中和IL4阻止T-细胞的分化((Idzerda等人，J Exp Med171：861-73，1990；
Nelms，Keegan等人，Annu Rev Immunol17：701-38，1999))。在编码IL4、IL4Ra、和IL13的基因中的多态性已经与哮喘相关联，事实上，IL4和IL4Ra多态性均与严重哮喘和哮喘的恶化相关联(Sandford等人，J Allergy Clin Immunol106：135-40，2000；Wenzel等人，Am J Respir Crit Care Med175：570-6，2007)。基于IL4在哮喘中表现出的中心作用，期望抑制IL4活性的生物治疗药物成为用于治疗哮喘和其它Th2-相关联的病变的有价值的手段。然而，利用可溶解的IL4受体的临床研究的结果令人失望，并且显示出在安慰剂组和治疗组之间哮喘恶化发生率的极小差异(Borish等人，J.Allergy Clin.Immunology107：963-70，
2001)。
[0004] 类似于IL4，白介素13(IL13)是从活化的人T淋巴细胞中鉴定出的细胞因子。经过过去的10年，多个报道已经展示了IL13在与哮喘相关联的多种细胞响应中的作
用，包括IgE生成、炎症、气道过敏、粘液产生和肺纤维化(Kasaian和Miller，Biochem Pharmacol76：147-55，2008)。它的产生受在正反馈回路中相互作用的多种调节剂和细胞因子的调节，从而维持Th2-介导的免疫应答。IL13信号转导主要由2型受体、IL13α1和IL-4Rα复合物介导。当存在时，2型复合物也由IL4结合活化(Wills-Karp，Immunological Reviews202：175-90，2004；LaPorte等人，Cell132：259-72，2008)。IL13Ralpha2是能够高亲和力地结合IL13的受体，并且可通过减弱IL13和IL4的作用或经由诱导TGF-β和肺纤维化的发展起到较大的功能作用。
用，包括IgE生成、炎症、气道过敏、粘液产生和肺纤维化(Kasaian和Miller，Biochem Pharmacol76：147-55，2008)。它的产生受在正反馈回路中相互作用的多种调节剂和细胞因子的调节，从而维持Th2-介导的免疫应答。IL13信号转导主要由2型受体、IL13α1和IL-4Rα复合物介导。当存在时，2型复合物也由IL4结合活化(Wills-Karp，Immunological Reviews202：175-90，2004；LaPorte等人，Cell132：259-72，2008)。IL13Ralpha2是能够高亲和力地结合IL13的受体，并且可通过减弱IL13和IL4的作用或经由诱导TGF-β和肺纤维化的发展起到较大的功能作用。
[0005] 多种体内数据支持IL13在哮喘发病中的作用。在过敏性呼吸疾病的食蟹猴模型中，抑制IL13作用的抗体已经显示减轻肺部炎症(Kasaian等人，J Pharmacol Exp Ther325：882-92，2008)。在人体内，提高的IL13水平能够在支气管组织、鼻灌洗液、和哮喘患者诱导的痰中测出。与哮喘相关联的遗传多态性已经在IL13基因座中被鉴定(Heinzmann等人，Hum Mol Genet9：549-59，2000)。此外，IL13似乎在包括表皮纤维化和特应性皮炎在内的其它特应性疾病中起到重要作用。抑制IL13活性的抗体或其它蛋白分子可为有价值的治疗药物，用于治疗哮喘和其它特应性疾病(Brightling等人，Clin Exp Allergy40：42-9)。
[0006] IL13和IL4的体内和体外数据合在一起表明能够抑制两种细胞因子作用的治疗药物可为治疗哮喘的有效药剂。
[0007] 本发明潜在的技术问题是鉴定能够单独或组合用于改善治疗与过敏性或特应性响应相关联的炎性病症、癌症、特应性疾病和其它病理状态(例如哮喘、嗜曙红细胞过多、和纤维化病症)、并且其中肺部功能受到影响的新型IL-4和IL-13拮抗剂(例如中和结合剂)，从而提供IL4、IL-13、或IL4和IL13中和分子的局部递送。
发明内容
[0008] 本发明涉及结合蛋白构建体，其包括IL4／IL13-结合锚蛋白重复结构(AR)蛋白，其能够结合IL4和IL13，并且抑制IL4和IL13的生物活性。如本文所例示的IL4和IL13抑制构建体由连接到一个IL13-结合AR重复结构域上的一个IL4-结合AR重复结构域构成。此类双特异性AR蛋白具有作为多种Th2介导疾病的生物治疗药物的用途，所述疾病包括与IL4和IL13的存在或生物活性相关联的哮喘和其它特应性疾病。
[0009] 本发明也涉及结合蛋白构建体，其包括IL4或IL13-结合锚蛋白重复结构(AR)蛋白，其能够结合IL4或IL13，并且抑制IL4或IL13的生物活性。如本文所例示的IL4或IL13抑制构建体由一个IL4-结合AR重复结构域或一个IL13-结合AR重复结构域构成。此类双特异性AR蛋白具有作为多种Th2介导疾病的生物治疗药物的用途，所述疾病包括与IL4或IL13的存在或生物活性相关联的哮喘和其它特应性疾病。
[0010] 本发明还涉及编码本发明的重组结合蛋白的核酸分子，以及包含一种或多种结合蛋白或核酸分子的药物组合物。
[0011] 本发明还涉及利用本发明的结合蛋白治疗炎性疾病、癌症、特应性疾病和其它病理状态、尤其是肺部病症如哮喘和导致肺部纤维化的那些病症的方法。在一个具体实施例中，能够单独或组合进行IL4-结合或IL13-结合的结合蛋白可用于预防性或治疗性处置以预防、改善、减轻或消除IL4和／或IL13介导疾病的症状或病理生理改变的方法中。治疗的具体方法为局部递送本发明的IL4-结合蛋白和／或IL-13-结合蛋白。在治疗方法的一个实施例中，IL4-结合蛋白和／或IL-13-结合蛋白作为雾化制剂施用。在一种局部递送方法中，将包含IL4-结合蛋白和／或IL-13-结合蛋白的雾化制剂施用于需要治疗的受试者的肺部隔室。以包含IL4-结合蛋白和／或IL-13-结合蛋白的预防性或治疗性处置向受试者提供治疗方法，其中受试者被诊断或疑似患有某一病症如哮喘、炎性病症、癌症、特应性疾病、或与过敏性或特应性响应相关联的其它病理状态例如(嗜曙红细胞过多)、以及纤维化病症、尤其是其中肺部功能受影响的病症。附图说明
[0012] 图1A是结合蛋白的带状示意图，示出N-和C-Cap以及包括多个AR的结合结构域[0013] 图1B是结合蛋白的带状示意图，示出完整的锚蛋白重复结构域，其包括一个N-Cap、两个锚蛋白重复模块和一个C-Cap。
[0014] 图2A是示出在雾化之前和之后30分钟时中和IL13和IL4依赖活性的图。通过A280评估雾化AR蛋白或保留在杯中的AR蛋白的浓度，并且使用IL13STAT6活化测定法测量活性；预雾化的AR蛋白(用方块符号表示)；雾化的AR蛋白(用三角符号表示)；和保留的AR蛋白(用菱形符号表示)。
[0015] 图2B是示出在雾化之前和之后30分钟时中和IL13和IL4依赖活性的图。通过A280评估雾化AR蛋白或保留在杯中的AR蛋白的浓度，并且使用IL4依赖HT2增殖测定法测量活性；预雾化的AR蛋白(用方块符号表示)；雾化的AR蛋白(用三角符号表示)；和保留的AR蛋白(用菱形符号表示)。
[0016] 图3示出AR蛋白11G11-21H2的粒度分布，其通过使用在PBS中制备成20mg／mL的AR蛋白11G11-21H2溶液的多级冲击进行评估。MMAD为2.84μm并且GSD为1.66μm。
[0017] 图4示出在经由气管内滴入多组小鼠(n=5)来加样并在不同时间点处死后的11G11-21H2血清、肺部组织或支气管灌洗液(BAL)浓度随时间的数据曲线图。
[0018] 图5示出经由气管内滴入加样的重复蛋白11G11或重复蛋白11G11-21H2在急性OVA致敏和激发模型中对OVA-诱导的乙酰甲胆碱气道高反应性的效应。非致敏
的、载体激发的(NSV)动物(用实心方块符号表示)；对照AR蛋白(用实心菱形符号
表示)；11G1120mg／kg(用方块符号表示)；21H220mg／kg(用实心圆圈符号表示)；
11G11-21H2AR蛋白，40mg／kg(用实心三角符号表示)。
的、载体激发的(NSV)动物(用实心方块符号表示)；对照AR蛋白(用实心菱形符号
表示)；11G1120mg／kg(用方块符号表示)；21H220mg／kg(用实心圆圈符号表示)；
11G11-21H2AR蛋白，40mg／kg(用实心三角符号表示)。
[0019] 图6是示出在急性OVA致敏和激发模型中不同AR构建体对卵清蛋白诱导的嗜酸性粒细胞聚集到Balb／C小鼠肺部的效应的柱图。11G11-21H2蛋白(标记为mCNTX413)的效应显著不同于单特异性AR蛋白21H2或单独的11G11。
[0020] 图7示出不同AR构建体(具有11G11-21H2，其标记为mCNTX413)对OVA诱导的嗜酸性粒细胞聚集到肺部的效应。
[0021] 图8是在结合蛋白6G9(上部)和IL13(下部)之间的复合物的带状图。箭头指示IL13结合蛋白在IL13结合时的“开口”。
[0022] 图9示出在IL13结合蛋白环处的相互作用。它示出相对于图8的后视图。
[0023] 图10示出在IL13结合蛋白沟处的相互作用。它示出相对于图8的顶视图。
[0024] 图11示出IL13结合蛋白6G9的氨基酸序列(SEQ ID NO：162)和锚蛋白重复结构的比对。用下划线示出在结合IL13时涉及的残基。也可涉及E114(斜体)。二级结构元件用字母“t”(β-转角)和“h”(螺旋)标示。
[0025] 图12示出人和食蟹猴IL13的序列对比。6G9表位残基用下划线示出。
[0026] 图13示出来自复合物的IL-13结构与结合蛋白6G9以及3个不同IL13抗体的重叠。
具体实施方式
[0027] 缩写
[0028] CCL17=趋化因子(CC-基序)配体17；ECD=细胞外域；IL=白介素；TARC=胸腺活化调节趋化因子；PBS=磷酸盐缓冲盐水；AR=锚蛋白重复结构；MEM=基本必需培养基，NEAA=非必需氨基酸，SPR=表面等离振子共振。
[0029] 定义
[0030] 术语“蛋白”是指多肽，其中至少部分多肽具有、或者能够；通过在其肽链内和／或肽链之间形成二级、三级、或四级结构来获得限定的三维结构。如果蛋白包括两个或更多个多肽，各个多肽链可非共价地或共价地相连，例如通过两个多肽间的二硫键相连。单个具有、或者能够通过形成二级或三级结构获得限定三维结构的一部分蛋白称为“蛋白结构域。”此类蛋白结构域是本领域技术人员熟知的。
[0031] 在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个，即，两个或更多个经由肽键相连的氨基酸组成的分子。优选地，多肽由超过八个经由肽键相连的氨基酸组成。
[0032] 术语“结合蛋白”是指包括一个或多个结合结构域的蛋白。在本发明的各种实施例中，结合蛋白包括两个、三个、或四个结合结构域。此外，任何此类结合蛋白可包括不是结合结构域的附加蛋白结构域、多聚化部分、多肽标签、多肽接头和／或单个半胱氨酸残基。多聚化部分的例子是成对以提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区、以及包含在两个此类多肽之间形成分子内二硫键的游离硫醇的亮氨酸拉链或多肽。游离硫醇存在于例如半胱氨酸残基上，其可用于缀合多肽的其它部分，例如通过使用本领域的技术人员熟知的马来酰亚胺化学作用进行。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。同样优选地，本发明结合蛋白的结合结构域具有不同的靶向特异性。非蛋白质性的原子如金属；活性物质、和非蛋白质性材料可与本发明的结合蛋白在有用的组合物中附接或缔合。
[0033] 如本文所用，术语“结合结构域”是指表现出与蛋白质支架相同或基本上相同的“折叠”(三维结构)并具有特性如结合目标分子的蛋白结构域。蛋白质支架将具有暴露的表面区域，其中氨基酸插入、取代或去除是高度可容忍的，其可经修饰以提供具有选择的、指定的或确定性能的结合结构域。结合结构域的其它特性可包括：靶向结合、阻止靶向结合或靶向活性、激活靶介导的反应、酶活性、和相关的其它性能。根椐期望性能的类型，普通技术人员将能够识别并执行筛选和／或选择具有期望性能的结合结构域的必需步骤。此种结合结构域可通过本领域已知的合理的、或者最常见的组合蛋白工程技术、技巧获得(Skerra，A.，J.Mol.Recog.13，167-187，2000；Binz，H.K.，Amstutz，P.and Plückthun，A.，Nat.Biotechnol.)23，1257-1268，2005)。例如具有选择性能的结合结构域可通过包括以下步骤的方法获得：(a)提供各种不同的蛋白结构域集合，它们表现出与下文进一步定义的蛋白质支架相同的折叠；以及(b)筛选所述各种不同的集合和／或从所述各种不同的集合中选择以获得至少一个具有所述性能的蛋白结构域。各种不同的蛋白结构域集合可通过根据使用的筛选和／或选择体系的多种方法提供，并且可包括使用本领域技术人员熟知的方法，诸如噬菌体展示或核糖体展示文库。
[0034] 如本文所述，结合结构域是“重复结构域”或“设计的重复结构域。”此种重复结构域可包括一个、两个、三个或更多个内部重复模块，它们将参与结合目标或其它特性。优选地，此种重复结构域还包括一个N-末端封端模块、两个至四个内部重复模块、和一个C-末端封端模块。优选地，所述结合结构域是一个锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域，其中重复模块序列来自天然蛋白(重复单元)或来源于天然重复单元(重复模块)的共有序列。因此，重复结构域可为天然存在的或可为形成的，诸如根据在专利公布WO02／20565中说明的发明方法获得的那些。
[0035] 根据本发明的结合蛋白可为“重复蛋白”或“设计的重复蛋白”，它们是指包括两个或更多个连续重复单元或模块的蛋白(图1A或1B)，它们是结构单元，每个具有相同的折叠，并且它们紧密地叠堆以形成具有共同疏水核心的结构。重复蛋白的重复单元的多层结构缺乏独立形成稳定蛋白结构域或具有特定功能活性的能力，其在2至25个或更多个重复单元(模块)之间的串联排列内装配并形成具有能够导致蛋白-蛋白相互作用的超螺旋结构的重复结构域。术语“折叠拓扑学”或“折叠”是指重复蛋白内的重复单元的三级结构。重复模块或重复单元是相对短的序列基序，通常长度为20至40个氨基酸残基。在多数情况下，重复单元将表现出高度的序列同一性(在对应位点具有相同的氨基酸残基)或序列相似性(氨基酸残基不同，但是具有相似的物理化学性能)，并且一些氨基酸残基可为在存在于天然存在蛋白质中的不同重复单元内的强保守性的关键残基。然而，只要保持共同的折叠拓扑结构，在不同重复单元之间通过氨基酸插入和／或去除、和／或取代造成的高度序列变异性将是可能的。
[0036] 术语“重复单元”是指包括一个或多个天然存在的重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在多个拷贝，并且其表现出限定的折叠拓扑结构，该结构对确定蛋白折叠的所有所述基序来说是共同的。此类重复单元包括框架残基和相互作用残基。此类重复单元的例子是犰狳重复单元、富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、三角形四肽重复单元、HEAT重复单元、和富含亮氨酸的变体重复单元。包含两个或更多个此类重复单元的天然存在的蛋白称为“天然存在的重复蛋白。”重复蛋白的各个重复单元的氨基酸序列在彼此比较时可具有显著数量的突变、取代、添加和／或去除，同时仍基本上保留重复单元的一般模式、或基序。
[0037] 术语“重复模块”是指设计的重复蛋白或结构域的重复氨基酸序列。在重复结构域中包括的每个重复模块来源于一个天然存在的重复蛋白家族的一个或多个重复单元，其中所述组的成员包括相似的重复单元。此类“重复模块”可包括在所有重复模块的所有拷贝中存在的氨基酸残基位点(“固定位点”)和具有不同或“随机”氨基酸残基的位点(“随机位点”)。此类重复模块的例子为犰狳重复模块、富含亮氨酸的重复模块、锚蛋白重复模块、三角形四肽重复模块、HEAT重复模块、和富含亮氨酸的变体重复模块。重复蛋白的各个重复单元／重复模块的氨基酸序列在彼此比较时可具有显著数量的突变、取代、添加和／或去除，同时仍基本上保留重复单元／重复模块的一般模式、或基序。
[0038] 术语“重复模块组”是指重复结构域中存在的重复模块总数。存在于重复结构域中的此类“重复模块组”包括两个或更多个连续重复模块，并且可在两个或更多个拷贝中只包括一种类型的重复模块，或者包括两种或更多种不同类型的模块，每种模块存在于一个或多个拷贝中。在重复模块组中，模块的顺序决定重复结构域的组成，并且其中重复结构域已经经选择以具有特定活性、重复结构域生物功能如结合结构域。重复结构域中的重复单元／模块本文将从多肽的N-末端向多肽的C-末端连续编号。
[0039] 术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复单元或重复模块中推导出的氨基酸序列。此类重复序列基序包括框架残基位点和目标相互作用残基位点。所述框架残基位点对应于重复单元(或模块)的框架残基位点。同样地，所述目标相互作用残基位点对应于重复单元(或模块)的目标相互作用残基位点。目标相互作用残基将一般沿着重复结构域的一个面定位。此种重复序列基序的例子是锚蛋白重复序列基序，如SEQ ID NO：1所示。
[0040] 术语“框架残基”涉及重复单元的氨基酸残基或重复模块的对应氨基酸残基，其有助于形成折叠拓扑结构，即，其有助于所述重复单元(或模块)的折叠，或者其有助于与相邻单元(或模块)的相互作用。此种辅助作用可为与重复单元(模块)中的其它残基的相互作用、或者对存在于α-螺旋或β-片层、或形成直链多肽或环的氨基酸序列中的多肽主链构象的影响。
[0041] 术语“目标相互作用残基”是指重复单元的氨基酸残基、或重复模块的对应氨基酸残基，它们可有助于重复单元(或模块)与目标物质的相互作用。此种辅助作用可为与目标物质的直接相互作用、或者对其它直接作用的残基的影响，例如通过稳定重复单元(或模块)的多肽的构象以产生或增强直接相互作用残基与所述目标的相互作用。此种框架和目标相互作用残基可通过分析结构数据进行鉴定，该结构数据通过物理化学方法如X-射线晶体学、核磁共振和／或CD光谱学方法获取，或者通过与已知的和相关的结构信息进行比较来获取，所述结构信息是结构生物学和／或生物信息学从业者熟知的。
[0042] 优选地，用于重复序列基序推导的重复单元／模块是同源重复单元，其中重复单元包括相同的结构基序，并且其中所述重复单元超过70％的框架残基是彼此相同的。优选地，所述重复单元超过80％的框架残基是相同的。最优选地，所述重复单元超过90％的框架残基是相同的。用于测定多肽之间的同一性百分比的计算机程序如Fasta、Blast或Gap是本领域的技术人员已知的。更优选地，用于重复序列基序推导的重复单元是获取自目标上选择的重复结构域的同源重复单元(例如如实例1所述)，并且具有相同的目标特异性。
[0043] 重复序列基序包括固定位点和随机位点。术语“随机位点”是指重复序列基序中的氨基酸位点，其中允许两个或更多个氨基酸在所述氨基酸位点上，例如其中允许通常二十个天然存在的氨基酸中的任何一个在所述氨基酸位点上，或者其中允许二十个天然存在的氨基酸中的大多数(例如除半胱氨酸之外的氨基酸、或者除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸)在所述氨基酸位点上。这些氨基酸可为本领域已知的修饰形式。最通常地，此类随机位点对应于目标相互作用残基的位点。然而，一些框架残基位点也可为随机的。
[0044] 术语“封端模块、”“封端单元”或“N-Cap”(用于N-末端封端模块)或“C-Cap”(用于C-末端封端模块)是指融合到重复结构域的N-或C-末端重复模块上的多肽，其中所述封端模块与邻近的重复单元形成牢固的三级相互作用，从而在不接触连续重复模块的侧面上提供遮蔽所述重复模块的疏水核心的帽，使之不接触溶剂。所述N-和／或C-末端封端模块可为或可来源于封端单元或存在于邻近重复单元的天然存在重复蛋白中的其它结构域。N-或C-Cap与邻近的重复单元形成牢固的三级相互作用。此类封端单元可与重复序列基序具有序列相似性。封端模块或封端重复结构在WO02／020565中有所描述并在本文中例示。
[0045] 术语“目标”是指分子、多肽或蛋白、碳水化合物、两个或更多个分子的复合物，它们可以分离形式存在或以生物形式驻留(例如在细胞或组织样本之上或之中)，并且可以多种形式存在，诸如天然存在的或非天然存在的化学修饰形式，例如通过磷酸化、乙酰化、或甲基化进行修饰，或者表现出损伤或交联的残基，其例如在与由天然或非天然过程引起的致电离辐射或反应性氧物质反应时可能出现。在本发明的具体应用中，目标是可溶解蛋白，它是一种细胞因子。
[0046] IL4、IL-4、或hIL4是指一种小细胞因子，人白介素4(UniProt P05112，SEQ ID NO：4)或其物种同源物。特别指明，物种同源物序列是指定的，例如食蟹猴IL4、cyno IL4、或cIL4(SEQ ID NO：5)。除了别的名称以外，该蛋白也称为B-细胞刺激因子1、B-细胞生长因子、BCGF1、BCGF-1、BSF1、BSF-1、或淋巴细胞刺激因子1。人成熟蛋白质表达为153个氨基酸的多肽(UniProt P05112)，它具有24个氨基酸的信号肽、单个N-连接糖基化位点、并且裂解产生具有三个链内的二硫键的129个氨基酸的成熟蛋白质(SEQ ID NO：1)。存在两种类型的IL4受体：1型和2型。1型是异源二聚体，其由IL4R-alpha(IL4RA，CD124，UniProt P24394并且其中SEQ ID NO：6表示其ECD)和常见的受体亚基g，CD132(IL2RG，UniProt P31785，SEQ ID NO：7)组成。2型受体是异源二聚体，其由IL4R-alpha和IL13R-alphal(IL13RA1，CD213a1，UniProt P78552，SEQ ID NO：8)组成。IL13(SEQ ID NO：
101)而非IL4通过结合IL13RA蛋白来结合2型受体。此外，IL13结合IL13RA2(SEQ ID NO：102)。
101)而非IL4通过结合IL13RA蛋白来结合2型受体。此外，IL13结合IL13RA2(SEQ ID NO：102)。
[0047] “共有氨基酸残基”是通过多个重复单元的结构和／或序列比对鉴定的、最频繁地出现在序列中的某一位点的氨基酸。如果两个或更多个，例如三个、三个或五个氨基酸残基以相似的概率出现在所述两个或更多个重复单元中，共有氨基酸可为其中一个最频繁出现的氨基酸或所述两个或更多个氨基酸残基的组合。
[0048] 如本文所用，术语在两个分子间的结合“亲和力”是指对相互作用强度的生物物理测量。如本文所用，术语“Kdis”或“KD”或“Kd”意指特定组合物-目标相互作用的解离速率。“KD”是解离速率(k2)，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”与缔合速率(k1)或“结合率(on-rate)(kon)”或“ka”的比率。因此，KD等于k2／k1或koff／kon或kd／ka，且以摩-6
尔浓度(M)表示。它遵循下列原则，即KD越小，结合越强。从而，10 M(或1μM)的KD与-9
10 M(或1nM)相比指示弱结合。KD可通过如本领域技术人员实施的表面等离振子共振或Kinexa方法进行测定。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。因此，亲和力的测量(例如KD、kon、koff)优选地用蛋白标准溶液和标准缓冲液进行。
尔浓度(M)表示。它遵循下列原则，即KD越小，结合越强。从而，10 M(或1μM)的KD与-9
10 M(或1nM)相比指示弱结合。KD可通过如本领域技术人员实施的表面等离振子共振或Kinexa方法进行测定。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。因此，亲和力的测量(例如KD、kon、koff)优选地用蛋白标准溶液和标准缓冲液进行。
[0049] 基于它们来源于与其它蛋白或肽的相互作用的生物活性选出的本发明重复蛋白可经进一步修饰以增强或赋予分子附加的生物物理或生物性能，诸如多肽标签、放射性同位元素、螯合剂、和多聚化结构域，它们可为蛋白质性的或非蛋白质性的。例如，保持在体内的能力可通过给蛋白加成某些生理上相容的聚合物或融合免疫球蛋白恒定区序列而得到增强。非蛋白质性聚合物分子的例子为羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧化烯。通过减少清除或增加再摄取来增强蛋白保持在体内能力的修饰称为“半衰期延长”修饰。
[0050] 术语“多肽标签”是指附接到多肽／蛋白上的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用于纯化、检测、或靶向所述多肽／蛋白，或者其中所述氨基酸序列改善多肽／蛋白的物理化学性能，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各个多肽标签、部分和／或结构域可彼此直接连接或经由多肽接头连接。这些多肽标签都是本领域熟知的，并且对本领域的技术人员来说是全部可用的。多肽标签的例子是小多肽序列，例如His、myc、FLAG、或Strep-标签或部分，诸如酶(例如像碱性磷酸酶这样的酶)，它们允许检测所述多肽／蛋白、或者可用于靶向的部分(诸如免疫球蛋白或其片段)和／或效应子分子。
[0051] 多聚化部分的例子是成对以提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区、以及包含在两个此类多肽之间形成分子内二硫键的游离硫醇的亮氨酸拉链或多肽。
[0052] 术语“多肽接头”是指一种氨基酸序列，其能够连接例如两个蛋白结构域、一个多肽标签与一个蛋白结构域、一个蛋白结构域与一个非多肽部分，例如聚乙二醇或两个序列标签。此类附加结构域、标签、非多肽部分和接头是相关领域技术人员已知的。多肽接头或重复模块之间的任何居间序列可为不影响模块的拓扑结构或折叠或者模块叠堆能力的任何序列。此类接头的具体例子是长度可变的柔性甘氨酸-丝氨酸-接头；优选地，所述接头具有介于2和16个氨基酸之间的长度、以及脯氨酸-苏氨酸接头。
[0053] 综述
[0054] 使用重复蛋白文库鉴定新型IL4和IL13结合蛋白，所述重复蛋白包括33个共有氨基酸的锚蛋白重复模块，其包含多种可能的相互作用残基(除半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸)。如本文所述，在多层重复模块中的随机位点上的氨基酸形成相互作用表面，其能够与多个目标高亲和力地结合(图1A和1B)。已经从可能的结合结构域文库中选择结合剂，所述结合结构域包括两个至四个AR模块，它们在特定残基位点具有不同氨基酸，并且其中重复结构域两侧为N-末端或C-末端模块。本发明的优选结合结构域是重复结构域或设计的重复结构域，优选地描述于WO02／20565；Binz，H.K.等人，2004，loc.cit.)中。
[0055] 在一个具体的实施例中，本发明涉及重组IL4结合蛋白，它包括具有对IL4的特异性的结合结构域，其选自包括一个或多个重复模块的重复蛋白文库，该重复模块具有AR序列基序
[0056] X1DX3X4GX6TPLHLAAX14X15GHLEIVEVLLKX27GADVNA(SEQ ID NO：1)，
[0057] 其中X1、X3、X4、X6、X14、和X15彼此独立地代表选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸残基。X27代表A、H、N、或Y；
[0058] 氨基酸序列的N-末端封端模块：
[0059] DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA(SEQ ID NO：2)；并且
[0060] C-末端封端模块具有氨基酸序列：
[0061] QDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN(SEQ ID NO：3)。
[0062] 术语“AR”是指锚蛋白重复模块并且“AR1”是指锚蛋白重复结构域的第一串联AR，术语“AR2”是指锚蛋白重复结构域的第二AR，术语“AR3”是指锚蛋白重复结构域的第三AR，并且术语“AR4”是指锚蛋白重复结构域的第四AR。当串联排列时，AR1模块是AR2模块的N-末端；AR2模块是AR3模块的N-末端，并且如果适用的话，AR3模块是AR4模块的N-末端，使得AR排列为AR1-AR2-AR3-AR4。AR不包括N-Cap或C-Cap序列，并且优选地每个AR具有N-Cap或C-Cap模块。应当理解，SEQ ID NO：2是N-Cap序列的例子，SEQ ID NO：3是C-Cap序列的例子，并且这些序列可按需进行修饰。
[0063] 在具体实施例中，本发明涉及重组IL13结合蛋白，它包括具有对IL13的特异性的结合结构域，其选自包括一个或多个重复模块的重复蛋白文库，该重复模块具有AR序列基序
[0064] X1DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA(SEQ ID NO：1)，
[0065] 其中X1、X2、X3、X4、X5、和X6彼此独立地代表选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸残基。X7代表A、H、N、和Y；
[0066] 氨基酸序列的N-末端封端模块(其中括号内的序列是指该位点的替代氨基酸)：
[0067] DL[D，G]KKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA(SEQ ID NO：174)；并且
[0068] C-末端封端模块具有氨基酸序列：
[0069] QDKFGKT[A，P][A，F]DI[A,S][A，I]DNG[H，N]ED[I，L]AE[I，V]LQK[A，L][A，N](SEQ ID NO：175)。
[0070] 除了取代在基于式N-Cap-[AR]n-C-Cap建立的文库中的不同位点上的残基外；鉴定的结合蛋白结构还包括遗传结合蛋白突变。可将遗传突变应用于本发明的任何结合蛋白，因为这些突变发生在对上文提及的结合结构域文库的所有结合蛋白来说共有的序列位点上。下文概述了本发明的结合结构域的特定残基的常见遗传改变。
[0071]
[0072]
[0073] N-Cap的位点1从Asp突变成Gly或Ala，从而有助于N-末端的甲硫氨酸残基加工，用于在大肠杆菌中的表达(Hirel等人，PNAS86：8247-82511989)。N-Cap的位点3从Gly突变成Asp，因为已经发现这一突变稳定重复蛋白共有序列，如WO2010／060748所述。因为框架的AR序列基序(SEQ ID NO：1)位点28是Gly，存在分离由序列Asn27-Gly28组成的AR蛋白的可能性。Asn-Gly二肽易发生去酰胺化反应(Geiger和Clarke J.Biol.Chem.252：785-794，1987)，并且因此分离的Asn-Gly序列的位点27可突变成His、Tyr或Ala以避免可能的去酰胺化。在一些情况下，在位点27处的残基变为Ala以减少蛋白区域的潜在免疫原性。最后，通过核糖体展示选择的目标结合AR蛋白以C-cap中的氨基酸序列Leu-Asn结尾。这个序列附接到AR蛋白上以提供用于亚克隆到表达载体中的限制性位点用于筛选。这些位点的优选氨基酸序列是Ala-Ala。
[0074] 本发明涉及包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域抑制IL13结合到IL13Ralpha1或IL13Ralpha2上或者抑制IL4结合到IL4RA上，并且其中所述结合蛋白和／或结合结构域在热诱导去折叠时具有高于40℃的变性中点温度(Tm)，并且当在37℃下以至多10g／L的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育1天时形成少于5％(重量／重量)的不溶解聚集体。在一个具体的实施例中，IL13结合蛋白由两个或三个重复模块构成，它们表示为SEQ ID NO：1，其前面是N-末端封端模块如SEQ ID NO：2或174，并且后面是C-末端封端模块如SEQ ID NO：3或175。
[0075] 本发明涉及包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域抑制IL4与IL4RA-7 -8 -9的结合。优选地，结合结构域与IL4的相互作用的KD低于10 M，低于10 M，低于10 M，或-10
者在某些实施例中低于10 M。用于测定蛋白-蛋白相互作用解离常数的方法，诸如基于表面等离振子共振(SPR)的技术，是本领域技术人员熟知的。
者在某些实施例中低于10 M。用于测定蛋白-蛋白相互作用解离常数的方法，诸如基于表面等离振子共振(SPR)的技术，是本领域技术人员熟知的。
[0076] 本发明也涉及包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域抑制IL13与IL13Ralpha1和／或IL13Ralpha2的结合。优选地，结合结构域与IL13的相互作用的KD低-7 -8 -9 -10于10 M，低于10 M，低于10 M，或者在某些实施例中低于10 M。用于测定蛋白-蛋白相互作用解离常数的方法，诸如基于表面等离振子共振(SPR)的技术，是本领域技术人员熟知的。
[0077] 优选地，结合蛋白和／或结合结构域在热诱导去折叠时具有高于45℃，更优选地高于50℃，更优选地高于55℃，并且最优选地高于60℃的变性中点温度(Tm)。本发明的结合蛋白或结合结构域在生理条件下具有限定的二级和三级结构。此种多肽的热诱导去折叠导致其三级和二级结构丧失，这可随后进行例如圆二向色性(CD)测量。结合蛋白或结合结构域的变性中点温度在热诱导去折叠时对应于在生理缓冲液中通过缓慢地将温度从10℃提高至约100℃来热变性所述蛋白或结构域时在协同转化中点的温度。在热诱导去折叠时测定变性中点温度是本领域的技术人员熟知的。结合蛋白或结合结构域的这种变性中点温度在热诱导去折叠时指示所述多肽的热稳定性。
[0078] 还优选地是结合蛋白和／或结合结构域在至多20g／L，优选地至多40g／L，更优选地至多60g／L，甚至更优选地至多80g／L，并且最优选地至多100g／L的浓度下，当在37℃水溶液中孵育超过5天，优选地超过10天，更优选地超过20天，更优选地超过40天，并且最优选地超过100天时形成少于5％(重量／重量)的不溶解聚集体。不溶解聚集体的形成可通过看得见的沉淀外观、凝胶过滤或动态光散射进行检测，其在不溶解聚集体形成时大幅提高。不溶解聚集体可通过在10,000xg下离心10分钟从蛋白样品中移除。优选地，结合蛋白和／或结合结构域在PBS中，在提及的37℃孵育条件下形成少于2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、或0.05％(重量／重量)的不溶解聚集体。不溶解聚集体的百分比可通过以下方法进行测定：从可溶解蛋白中分离不溶解聚集体，随后通过标准定量方法测定可溶解和不溶解级分中的蛋白量。
[0079] 生物活性
[0080] EC50值是物质如结合蛋白或结合结构域的浓度，该值是在一组特定条件下产生50％的完全的或预定的最大效应所需的值。当该效应妨碍或抑制活性时，将该值定义为产生50％的效应减少的抑制浓度(IC50)。IC50值可用于实验测定参数的体外抑制，例如从受试者或动物的细胞、组织、器官或体内释放的可检出量的病理标记或生物标记。此类测量可为对蛋白组合物活性的直接测量，或者可为对拟改变的生物活性的替代品或下游标记物的测量。
[0081] IL4与IL13共有多个生物活性。例如，IL4或IL13可引起B细胞中的IgE同种型转换(Tomkinson等人，200I J.Immunol.166：5792-5800)。另外，已经报道了在哮喘患者中提高的细胞表面CD23和血清CD23(sCD23)水平(Sanchez-Guererro等人，(1994)Allergy49：587-92；DiLorenzo等人，(1999)Allergy Asthma Proc.20.119-25)。此外，IL4或IL13能够上调B细胞和单核细胞上的MHC II类和低亲和力IgE受体(CD23)表达，这导致增强的抗原递呈并调节巨噬细胞功能(Tomkinson等人，同上)。重要地是，IL4或IL13能够增加内皮细胞上的VCAM-I表达，这有利于嗜酸性粒细胞(和T细胞)优先聚集到气道组织中(Tomkinson等人，同上)。IL4或IL13也能够增加气道粘液的分泌，其能够恶化气道反应性(Tomkinson等人，同上)。通过作用以阻止与IL13的那些不同的信号转导途径，IL4抑制剂／拮抗剂可用于抑制天然T-细胞分化成TH2细胞。
[0082] 本发明还涉及使用结合蛋白的方法，该结合蛋白具有所述IL4和IL13中和活性以抑制IL4和IL13介导的生物活性，包括但不限于：IgE生成；在B细胞或单核细胞上的CD23上调；在内皮细胞上的VCAM-I上调、嗜酸性粒细胞募集、TGFbeta诱导、增加的粘液分泌；由成纤维细胞增殖引起的纤维化、胶原合成、和细胞外基质重塑(Wynn TA等人，Nat Rev Immunol.2004；4：583-94)或刺激TGFbeta；以及刺激15-脂氧合酶活性并释放白三烯(例如LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4、和／或LTF4)。因此，IgE生成、从血液单核细胞中释放LTA4和LTB4、嗜酸性粒细胞募集、TGFbeta释放、增加的胶原合成、和细胞外基质重塑中的任何一项可用作本文所述的IL4或IL13结合蛋白的生物活性效应的量度。
[0083] IL13生物测定也包括癌细胞或前癌细胞类型如TF-1红白血病细胞的增殖。IL13中和作用能够被具体测量为IL13结合蛋白减少IL13结合到IL13R-alpha1或
IL13R-alpha2上的能力。
IL13R-alpha2上的能力。
[0084] 本发明的IL13结合组合物能够在某种程度上抑制IL13结合，或者本发明的IL4结合组合物能够在某种程度上抑制IL4结合，使得在IL13和IL13Ralpha2或IL13Ralpha22
之间的表观解离常数(Kd)、以及在IL4和IL4RA之间的表观离解常数(Kd)提高超过10 倍，
3 4 5 6
优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，并且最优选地超过10 倍。优选用于IL13-结合的是抑制IL13或人IL13R130Q蛋白变体的结合蛋白和／或结合结构域(IL13R130Q-Vladich等人，“IL13R130Q，a common variant associated with allergy and asthma，enhances effector mechanisms essential for human allergic inflammation”J Clin Invest.2005；115(3)：747-754)，其在体外特定条件下结合到IL13Ralpha2上，并且IC50值低于100nM，优选地低于10nM，还更优选地低于1.0nM。
之间的表观解离常数(Kd)、以及在IL4和IL4RA之间的表观离解常数(Kd)提高超过10 倍，
3 4 5 6
优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，并且最优选地超过10 倍。优选用于IL13-结合的是抑制IL13或人IL13R130Q蛋白变体的结合蛋白和／或结合结构域(IL13R130Q-Vladich等人，“IL13R130Q，a common variant associated with allergy and asthma，enhances effector mechanisms essential for human allergic inflammation”J Clin Invest.2005；115(3)：747-754)，其在体外特定条件下结合到IL13Ralpha2上，并且IC50值低于100nM，优选地低于10nM，还更优选地低于1.0nM。
[0085] IL4中和作用能够被具体测量为IL4结合蛋白减少IL4结合到IL4RA上的能力。本发明的IL4结合蛋白特征在于在表达2型IL4受体复合物的细胞如表达STAT6-bla报告基因的重组HEK细胞系中抑制IL4依赖的STAT6磷酸化的能力。IL4结合蛋白的特征还在于具有能够在具有1型IL4受体复合物的细胞中阻止或减少信号转导的附加性能，例如通过抑制天然T-细胞分化成Th2表型所展示的性能。IL4结合蛋白可阻止或减少对产生IL-4依赖的TARC的细胞的刺激，例如在67pM IL4存在下的A549细胞。本发明的IL4结合蛋白结合到人和食蟹猴属物种IL4同源蛋白上。
[0086] 当本发明的IL4结合蛋白联接到IL13结合蛋白上时，该组合物能够在某种程度上抑制IL13结合，使得在IL13和IL13Ralpha1或IL13Ralpha2之间的表观解离常数(Kd)提2 3 4 5
高超过10 倍，优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，并且最优选地
6
超过10 倍。优选的是抑制IL13或人IL13R130Q蛋白变体的结合蛋白和／或结合结构域(IL13R130Q，Vladich等人，J Clin Invest.2005；115(3)：747-754)，其在体外特定条件下结合到IL13Ralpha2上，并且IC50值低于100nM，优选地低于10nM，还更优选地低于1.0nM。
高超过10 倍，优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，更优选地超过10 倍，并且最优选地
6
超过10 倍。优选的是抑制IL13或人IL13R130Q蛋白变体的结合蛋白和／或结合结构域(IL13R130Q，Vladich等人，J Clin Invest.2005；115(3)：747-754)，其在体外特定条件下结合到IL13Ralpha2上，并且IC50值低于100nM，优选地低于10nM，还更优选地低于1.0nM。
[0087] 本发明的一个实施例是包括重复模块的结合蛋白，该重复模块能够阻止人IL4或IL4和IL13在HEK-Blue STAT-6细胞中活化STAT6的磷酸化，该细胞展示IL13Ralpha1和IL4RA蛋白，并且当被IL4或IL13活化时，诱导分泌报告蛋白，它是一种活性碱性磷酸酶，能够将底物转化成发色团。本发明的结合蛋白抑制IL4或IL4和IL13活化STAT6，在体外测定法中具有1nM或更小，并且优选地100pM或更小，还更优选10pM或更小的IC50。此外，本发明的结合蛋白抑制食蟹猴IL4或IL13结合到相同细胞上，IC50为5nM或更小，并且优选地为1nM或更小，并且此外，其中在工程化HEK-blue细胞中抑制STAT6的人IL4或IL13的IC50对食蟹猴同系物IL4或IL13的IC50的比率在体外测定法中为10或更小。本文有所描述的代表性测定法是本领域技术人员已知的。
[0088] 然而，胸腺活化调节趋化因子(TARC)被IL13上调(Imai等人，(1999)Int.Immunol.)11：81-88)，诱导TH2细胞 的迁移(Hijnen等 人，(2004)J.All.Clin.Immun.113(2)：334-40)并且在哮喘患者的气道中被上调(Leung等人，(2004)J.All.Clin.Immun.114(1)：199-202)；本发明的结合蛋白和／或结合结构域的一个实施例将抑制A549细胞的TARC生产，其在67pM IL4的存在下具有低于500pM，优选地低于100pM，还更优选地低于50pM的IC50值。
[0089] 组合物
[0090] 本发明的IL4-结合AR组合物符合结合蛋白式(N-Cap-[AR]n-C-Cap(I))，其具有-6两个或三个重复模块，所述模块具有结合到IL13上的亲和力，测得的KD为10 M或更小，KD-7 -8 -9
为10 M或更小，KD为10 M或更小，或者KD为10 M或更小，该结合蛋白分子由重复模块SEQ ID NO：1构成。在IL4-结合蛋白的一个实施例中，AR结构域包括一个重复模块，其具有的序列选自SEQ ID NO：31-81中的任何一个。
为10 M或更小，KD为10 M或更小，或者KD为10 M或更小，该结合蛋白分子由重复模块SEQ ID NO：1构成。在IL4-结合蛋白的一个实施例中，AR结构域包括一个重复模块，其具有的序列选自SEQ ID NO：31-81中的任何一个。
[0091] 在本发明的一个具体实施例中，IL4-结合蛋白，AR1序列选自SEQ ID NO：31-46；随后是第二设计的锚蛋白重复结构域(AR2)，其选自SEQ ID NO：47-61；并且任选地，其中第二设计的锚蛋白重复单元随后是第三设计的锚蛋白重复(AR3)单元，其选自SEQ ID NO：
62-78；并且任选地，AR3重复单元随后是AR4单元，其选自SEQ ID NO：79-81。
62-78；并且任选地，AR3重复单元随后是AR4单元，其选自SEQ ID NO：79-81。
[0092] 在一个具体实施例中，IL4结合蛋白包括一个锚蛋白重复模块与锚蛋白重复序列SEQ ID NO：53，其中所述重复模块前面是具有锚蛋白重复序列基序SEQ ID NO：36的重复模块和／或后面是具有锚蛋白重复序列基序SEQ ID NO：68的重复模块
[0093] 在一个具体实施例中，IL4结合蛋白包括一个锚蛋白重复模块与锚蛋白重复序列SEQ ID NO：56，其中所述重复模块前面是具有锚蛋白重复序列基序SEQ ID NO：39的重复模块和／或后面是具有锚蛋白重复序列基序SEQ ID NO：71的重复模块。
[0094] 在一个具体实施例中，IL4结合蛋白包括一个AR单元，其具有序列SEQ ID NO：59，其中所述重复模块前面是具有AR序列基序SEQ ID NO：43的重复模块和／或后面是具有AR序列基序SEQ ID NO：74的重复模块。
[0095] 在本文例示的其它实施例中，AR单元串联排列在表3通过指定的SEQ ID NO：示出，其对应于在结合蛋白中指定位点的AR序列基序。
[0096] 在一个实施例中，本发明是IL4结合蛋白，其中一个AR单元选自SEQ ID NO：31-81，它前面是N-Cap，其包括SEQ ID NO：2及其变体。该变体包括SEQ ID NO：1和与结合到IL4蛋白上的SEQ ID NO：31-81中的任何分子具有75％或更大同一性的分子。在另一个实施例中，本发明是IL4结合蛋白，其中一个AR单元选自SEQ ID NO：31-81，它后面是C-cap，其包括SEQ ID NO：3及其变体。
[0097] IL4结合蛋白具有结合结构域，其具有对包括AR单元序列的IL4的结合特异性，该单元序列选自SEQ ID NO：31-81，所述结合蛋白可具有经修饰用于以下目的的序列：改善在宿主细胞中的表达、减少一个或多个残基发生氧化的可能性、减少残基发生化学去酰胺化的可能性、减少施用结合蛋白的宿主发生免疫响应的可能性、和／或其中添加或修饰一个或多个残基以用于连接IL13结合蛋白与另一个蛋白或部分的目的。结合蛋白将保持结合特异性、亲和力、和在水溶液中的溶解度的生物物理特性并且无自聚集的趋势，并且具有大于45℃的熔融温度。
[0098] 本发明更具体地涵盖来源于共有序列(基序)或者在不同位点观察到特定氨基酸频率同一性(获取自重复单元的多序列比对)的IL4结合蛋白。例如，IL4结合蛋白可包括串联排列的锚蛋白重复模块AR1、AR2、和AR3，它们具有序列基序SEQ ID NO：1，并且其中AR1模块具有根据下式的氨基酸(其中括号内的序列是指该位点的替代氨基酸)：
[0099] X1D-[DW]-GX4TPLHLAA-[TD]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自T、V、I、L、S、A、E、F、H、K、和Y；X4选自D、F、L、I、N、E、S、Y、和T；并且X7选自H、N、和Y(SEQ ID NO：82)；
[0100] AR2模块具有下式给出的氨基酸序列：
[0101] X1D-X2X3-GX4TPLHLAA-[X5X6]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自S、I、D、Q、A、E、H、K、L、M、N、和V；X2X3选自AM、RM、AI、AS、NF、NI、NL、MN、WN、SQ、DD、DT、ET、和LF；X4选自D、M、L、F、I、N、W、和Y；X5X6选自VY、VE、FF、FV、AD、AT、DF、FD、VD、LY、YY、和WT，并且X7选自H、N、和Y(SEQ ID NO：83)；和
[0102] AR3模块具有下式给出的氨基酸序列：
[0103] X1D-X2X3-GF-TPLHLAA-X5X6-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自M、K、V、E、N、Q、T、S、和Y；X2X3选自FS、QT、LA、HH、SH、IL、IS、NL、MI、SN、RT、和LH；X5X6选自FY、FS、NF、VD、EF、FA、FF、FW、SY、YN、和YY；并且X7选自H、N、和Y(SEQ ID NO：84)。
[0104] 在另一个实施例中，IL4结合蛋白可包括串联排列的锚蛋白重复模块AR1、AR2、和AR3，它们具有序列基序SEQ ID NO：1，并且其中AR1模块具有根据下式的氨基酸：
[0105] TD-[DW]-GX4TPLHLAA-[TD]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X4选自D、F、L、I、N、E、Y、和T，并且X7选自H、N、和Y(AR1-F，SEQ ID NO：85)；
[0106] AR2模块具有下式给出的氨基酸序列：
[0107] X1D-[AM]-GX4TPLHLAA-[VY]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自S、I、D、Q、A、E、H、K、N、和V；X4选自D、M、L、F、I、和Y；并且X7选自H、N、和Y(AR2-F，SEQ ID NO：86)；并且[0108] AR3模块具有下式给出的氨基酸序列：
[0109] X1D-[X2X3]-G-F-TPLHLAA-[FY]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自M、K、V、E、N、T、S、和Y；X2X3选自FS、QT、LA、HH、SH、IL、IS、NL、MI、SN、RT、LH、和VH；并且X7选自H、N、和Y(AR3-F，SEQ ID NO：87)。
[0110] 基于优化的、活性IL4结合蛋白序列，本发明的IL4结合蛋白可包括串联排列的锚蛋白重复模块AR1、AR2、和AR3，它们具有序列基序SEQ ID NO：1，并且其中AR1模块具有根据下式的氨基酸：
[0111] [A，L，T]-DD-[S，W]-G-[D，I，Y]-TPLHLAA-[E，T]-DGHLEIVEVLLK-[A，H]-GADVNA(AR1-O)(SEQ ID NO：88)，后接如下式所示的AR2模块：
[0112] [A，N，Q]-D-[NL，RL，AI]-GDTPLHLAA-[WT，FV，LY]-GHLEIVEVLLK-[A，Y]-GADVNA(AR2-O)(SEQ ID NO：89)，后接如下式所示的AR3模块：
[0113] [T，V，Y]-D-[IS，LA，LH]-G-[F，I，V]-TPLHLAAF-[W，Y]-GHLEIVEVLLK-[A，H]-GADVNA(AR3-O)(SEQ ID NO：90)；其中括号内的选项代表可供选择的氨基酸残基或残基对。
[0114] 在一个优选的实施例中，IL4结合蛋白的结合结构域包括如本文所述并例示的N-封端模块和C-封端模块。
[0115] 本发明的IL13-结合AR组合物符合结合蛋白式(N-Cap-[AR]n-C-Cap(I))，其具有-6两个或三个重复模块，所述模块具有结合到IL13上的亲和力，测得的KD为10 M或更小，KD-7 -8 -9
为10 M或更小，KD为10 M或更小，或者KD为10 M或更小，该结合蛋白分子由重复模块SEQ ID NO：1构成。在IL4-结合蛋白的一个实施例中，AR结构域包括一个重复模块，其具有的序列选自SEQ ID NO：108-155中的任何一个。
为10 M或更小，KD为10 M或更小，或者KD为10 M或更小，该结合蛋白分子由重复模块SEQ ID NO：1构成。在IL4-结合蛋白的一个实施例中，AR结构域包括一个重复模块，其具有的序列选自SEQ ID NO：108-155中的任何一个。
[0116] 在本发明的一个具体实施例中，IL13-结合蛋白，AR1重复序列选自SEQ ID NO：108-125；随后是第二设计的锚蛋白重复结构域(AR2)，其选自SEQ ID NO：109-143；并且任选地，其中第二设计的锚蛋白重复单元任选地后接第三设计的锚蛋白重复结构域(AR3)，其选自SEQ ID NO：144-155。
[0117] 本发明更具体地涵盖来源于共有序列(基序)或者在不同位点观察到特定氨基酸频率同一性(获取自重复单元的多序列比对)的IL13结合蛋白。例如，IL13结合蛋白可包括串联排列的锚蛋白重复模块AR1、AR2、和AR3，它们具有序列基序SEQ ID NO：1，并且其中AR1模块具有根据下式的氨基酸序列：
[0118] X1DX2-X3-GSTPLHLAA-RH-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自T、A、F、E、I、K、M、S、R、V、W；X2选自D、E、H、I、K、M、S、T、和V；X3是F或Y；并且X7可为H、N、或Y(式AR1-C，SEQ ID NO：156)。
[0119] AR2模块具有根据下式的氨基酸序列；
[0120] X1DFIGDTPLHLAAY-X4-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自N、T、A、D、K、E、H、M、和F；X4可为H或R；并且X7可为H、N、或Y(式AR2-C，SEQ ID NO：158)；并且
[0121] AR3模块具有根据下式的氨基酸序列：
[0122] X1D-X2TGETPLHLAA-X5X6-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自D、S、T、K、E、和M；X2选自A、I、T、和V或者不存在；X5X6是一对残基，它们选自SM、HL、YH；并且X7可为H、N、或Y(式AR3-C，SEQ ID NO：160)；其中出现在括号中的残基可替代使用。
[0123] 在IL13-结合蛋白的一个实施例中，AR结构域包括一个重复模块，其具有的序列选自SEQ ID NO：108-155中的任何一个。在另一个实施例中，结合蛋白具有AR结构域、N-Cap和C-cap模块，该蛋白可使用本文提供的式进行构建，具有串联重复模块如N-Cap-[AR1-C：AR2-C：AR3-C]-C-cap，其中重复模块如SEQ ID NO：156、158和160所示；或者N-Cap-[AR1-F：AR2-F：AR3-F]-C-cap，其中重复模块如SEQ ID NO：157、159、和161所示；或者N-Cap-[AR1-O：AR2-O：AR3-O]-C-cap，其中重复模块如SEQ ID NO：168、169、和170所示；并且N-cap和C-cap分别如SEQ ID NO：2或171与SEQ ID NO：3和172所示，或者如本文所述的修饰，或者按需进行进一步的化学键合、生物加工等。
[0124] IL13结合蛋白包括至少一个重复结构域，其具有对IL13的结合特异性，包括的重复单元序列选自SEQ ID NO：108-155，所述结合蛋白可具有经修饰用于以下目的的序列：改善在宿主细胞中的表达、减少一个或多个残基发生氧化的可能性、减少残基发生化学去酰胺化的可能性、减少施用结合蛋白的宿主发生免疫响应的可能性、和／或其中添加或修饰一个或多个残基以用于连接IL13结合蛋白与另一个蛋白或部分的目的。结合蛋白将保持结合特异性、亲和力、和在水溶液中的溶解度的生物物理特性并且无自聚集的趋势，并且具有大于45℃的熔融温度。
[0125] 在一个实施例中，本发明是IL13结合蛋白，其中一个锚蛋白重复模块选自SEQ ID NO：108-155，它前面是N-Cap，其包括SEQ ID NO：2及其变体。变体包括SEQ ID NO：1和与结合到IL13蛋白和／或IL13R130Q上的SEQ ID NO：162-167中的任何分子具有75％或更大同一性的分子。在另一个实施例中，本发明是IL13结合蛋白，其中一个锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：162-167，它后面是C-cap，其包括SEQ ID NO：3及其变体。在本文例示的其它实施例中，AR单元串联排列在表4通过指定的SEQ ID NO：示出：其对应于在结合蛋白中指定位点的AR序列基序。
[0126] 在一个实施例中，本发明是IL13结合蛋白，其中一个AR单元选自SEQ ID NO：108-155，它前面是N-Cap，其包括SEQ ID NO：2及其变体。该变体包括SEQ ID NO：1和与结合到IL13蛋白上的SEQ ID NO：108-155中的任何分子具有75％或更大同一性的分子。
在另一个实施例中，本发明是IL13结合蛋白，其中一个AR单元选自SEQ ID NO：108-155，它后面是C-cap，其包括SEQ ID NO：3及其变体。
在另一个实施例中，本发明是IL13结合蛋白，其中一个AR单元选自SEQ ID NO：108-155，它后面是C-cap，其包括SEQ ID NO：3及其变体。
[0127] 具有选择的重复结构域、与IL13Ralpha2竞争对ILl3的结合的结合蛋白可通过本领域技术人员熟知的方法进行鉴定，例如竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)。此外，具有一个或多个修饰重复单元序列的修饰结合蛋白可利用与已知与IL13Ralpha2竞争的结合蛋白对IL13的竞争结合测试其活性。
[0128] 功能特性
[0129] 具有选择的重复结构域、与IL4RA竞争对IL4的结合的IL4结合蛋白或与IL13Ralpha1和IL13Ralpha2竞争对IL13的结合的IL13结合蛋白可通过本领域技术人员熟知的方法进行鉴定，例如竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)。此外，期望生成其中经修饰的IL4或IL13中和结合蛋白，其具有一个或多个修饰重复单元序列，该修饰结合蛋白的活性可利用修饰结合蛋白与未修饰蛋白的竞争结合进行测试。经修饰的IL4结合蛋白可与已知的IL4结合蛋白竞争对IL4的结合进行测试，并且经修饰的IL13结合蛋白可与已知与IL13Ralpha1和IL13Ralpha2竞争的IL13结合蛋白竞争对IL13的结合进行测试。
[0130] 在修饰结合蛋白的一个实施例中，所述重复结构域的重复模块的一个或多个氨基酸残基被在重复单元比对序列上的对应位点处存在的氨基酸残基取代。在一个方面，至多30％的氨基酸残基被取代，更多情况下，至多20％，并且甚至更多情况下，至多10％的氨基酸残基被取代。最优选地，被取代残基的来源是天然存在的重复单元。在另一个具体实施例中，氨基酸残基被不存在于重复单元的对应位点上的氨基酸取代。
[0131] 在其它实施例中，本文所述的任何IL4和／或IL13结合蛋白或结构域可共价结合到一个或多个附加部分上，包括例如改善在循环中的持久性或减少从体内消除(即，改善药代动力学)的部分、标记部分(例如荧光标记如荧光素、或放射性示踪剂)、有利于蛋白纯化的部分(例如小肽标签如His-或strep-标签)、提供效应子功能以改善治疗功效的部分(例如用于提供抗体-依赖的细胞介导的细胞毒性的抗体Fc部分)、毒性蛋白部分如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)或小分子毒剂如美登木素(maytansinoid)、卡奇霉素(calicheamicin)、或含铂DNA烷基化剂。改善的药代动力学可根据察知的治疗需求进行评估。常希望提高生物利用率和／或增加两次给药之间的时间，这可能通过增加蛋白在给药后在血清中保持可用的时间来达到。在一些情况下，希望改善蛋白随时间的血清浓度持续性(例如减小蛋白在给药后短时间内和在下次给药前短时间内的血清浓度差异)。减缓从血液中清除蛋白的部分包括羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、糖类(例如唾液酸)、耐受良好的蛋白部分(例如Fc片段或血清白蛋白)、和对丰富血清蛋白具有特异性与亲和力的结合结构域或肽，例如能够结合血清白蛋白的那些。
[0132] 核酸及用途
[0133] 在另一个实施例中，本发明涉及编码特定IL4和／或IL13结合蛋白的核酸分子及包括核酸分子的载体。一般来讲，细菌表达载体将含有(1)调控元件，其通常为病毒启动子或增强子序列形式，并且特征在于广泛的宿主和组织范围；(2)序列，其有利于DNA片段插入到载体内；和(3)编码最终蛋白的序列。载体将还可能包含(4)选择标记基因(例如，β-内酰胺酶基因)，其通常赋予对抗生素(例如氨苄青霉素)的抗性，从而使得能选择最初的阳性转化体；和(5)促进载体在细菌和哺乳动物宿主细胞中复制的序列、或者促进稳定插入到宿主基因组中的序列。将质粒复制起点包括在内以便在细菌如大肠杆菌中繁殖表达构建体，并且为了在Cos细胞中瞬时表达，将SV40复制起点包括在表达质粒中。此外，可使用合适的哺乳动物细胞系，其具有上述性能。
[0134] 因此，本发明设想在IL4和IL13结合蛋白重复结构域与蛋白及包括IL4和IL13结合重复蛋白的较复杂构建体的重组表达中使用的宿主细胞，其中宿主细胞将包括编码此类蛋白的核酸。可从培养物中纯化IL4和IL13结合蛋白，其中此类宿主细胞通过本领域已知的方法保持为分批或连续培养物。分离蛋白可与附加部分如标签一起表达，所述标签有利于纯化并且可随后在最终配制并包装蛋白用于其预期用途之前被除去。
[0135] IL4和IL13结合重复蛋白的配制和使用
[0136] 本发明的药物组合物包含一种或多种上文提到的结合蛋白(具体地讲，包括重复结构域的结合蛋白)、或编码该特定结合蛋白的核酸分子、以及任选地，药用载体和／或稀释剂。药用载体和／或稀释剂是本领域的技术人员已知的，并且在下文中详述。此外，本发明还包括诊断组合物，其包含一种或多种上文提到的结合蛋白，具体地讲，包括重复结构域的结合蛋白。其中对编码IL4和IL13结合蛋白的核酸进行递送，治疗载体的药物制剂可在可接受的稀释剂中包括载体、或者可包括其中置入载体的缓释基质。作为另外一种选择，如果整个载体可从重组细胞完整制备，例如逆转录病毒载体，则该药物制剂可包括产生该核酸递送系统的一个或多个细胞。
[0137] 本发明的药物组合物是包含IL4和IL13结合蛋白的稳定制剂，其可为磷酸盐缓冲盐水或混合盐溶液、或者保存溶液和制剂、在药用制剂中适于药用或兽医用的多用途保存制剂。合适的载体及其制剂，包含其它蛋白如人血清白蛋白在内，描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy《制药科学与实践》，第21版，Troy，D.B.编辑，美国宾西法尼亚州费城的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA)2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing《药物制造》第691-1092页，特别参见第958-989页。用于体内给药的制剂可为无菌或灭菌的。这通过无菌过滤膜过滤而容易地完成，但是也可使用其它方法，例如加热、气体或化学灭菌，或者通过对制剂的某些或全部组分进行电离辐射进行灭菌。
[0138] 可通过在从业者知识范围内的任何合适方法施用药物组合物，其中给药可由另一人完成或者可自己完成。给药途径可选自多种递送方法，包括但不限于：静脉内(I.V.)；肌内(I.M.)；皮下(S.C.)；经皮；经肺；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域熟知的其它方式。
[0139] 例如，可通过下列位点特异性施用到体室或体腔中：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式。
[0140] IL4和IL13结合蛋白可通过喷雾器如喷射式喷雾器或超声喷雾器直接施用于呼吸道。通常，在喷射雾化器中，用压缩空气源通过孔口产生高速喷气流。随着气体过了喷嘴后膨胀，有低压区域产生，从而通过与液体贮器连接的毛细管抽取蛋白的溶液。来自毛细管的液体流在其离开管时被剪切成不稳定的细丝或小滴，从而产生气溶胶。可以采用一系列构造、流速和挡板类型从给定的喷射雾化器产生所需性能特征。在超声雾化器中，用高频率电能产生振动机械能量，通常使用压电转换器。此能量直接地或通过耦合流体被传输到该蛋白制剂，从而产生包含蛋白的气溶胶。有利地，通过雾化器递送的蛋白颗粒具有小于约10μm的颗粒大小，优选地颗粒大小在约1μm至约5μm的范围内，最优选地为约2μm至约
3μm。
3μm。
[0141] 适应症
[0142] 本发明还提供治疗IL4和IL13介导的疾病和病症的新方法，具体地，呼吸性病症如哮喘和肺部纤维化、心血管病症、癌症、皮肤病、和纤维化病症。本发明提供高亲和力的IL4／IL13双特异性结合蛋白、以及编码它们的核酸，它们能够体外、体内、或原位抑制IL4的生物活性，包括但不限于抑制野生型或天然变体人IL4结合IL-4RA或其片段、抑制细胞上的IL4RA复合物在IL4的存在下的信号转导、并且预防或抑制IL4-依赖的天然T-细胞分化成Th2细胞。
[0143] 能够结合并中和IL13的结合蛋白具有一种或多种性能，其选自：抑制IL13结合人IL13受体α1(IL13Ralpha1)(UniProt.P78552)或其片段、抑制人IL13或人IL13的天然变体结合人IL13受体α2(IL13Ralpha2)(UniProt.Q14627)或其片段、预防或抑制人肿瘤细胞的人IL13-依赖性增殖、抑制人IL13-依赖的IgE生成、减少嗜酸性粒细胞浸润组织、并且该蛋白具有人IL13的特异性结合位点。
[0144] 在一个方面，治疗受疾病或病症折磨的人类患者的方法，所述疾病或病症选自可称为过敏性哮喘、重症哮喘、难治性哮喘、脆性哮喘、夜间哮喘、月经前哮喘、糖皮质激素抵抗型哮喘、糖皮质激素依赖型哮喘、阿司匹林诱发哮喘、成人发病哮喘、儿童哮喘、或运动诱发哮喘的哮喘形式；特应性疾病如特应性皮炎；过敏性鼻炎；克罗恩氏病；COPD；纤维化疾病或病症如特发性肺纤维化、进行性系统性硬化病、肝纤维化、辐射诱发纤维化、化学疗法诱发纤维化；肝肉芽肿；血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节疾病诸如何杰金氏(Hodgkins)病；B细胞慢性淋巴细胞白血病；该方法包括施用治疗有效量的IL4／IL13结合蛋白。
[0145] IL4／IL13-相关联的病症或疾病的例子包括但不限于选自以下一种或多种的病症：IgE-相关的疾病包括但不限于特应性疾病，例如由对IL4／IL13增敏引起的疾病(例如特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、和过敏病症如过敏性鼻炎及过敏性肠胃炎)；呼吸性疾病如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘(如由于例如年幼的孩子感染例如呼吸性合胞病毒(RSV)造成的哮喘))、慢性阻塞性肺病(COPD)、和涉及气道炎症的其它病症、嗜曙红细胞过多、纤维化和粘液产生过多，例如囊性纤维化和肺部纤维化、内吸性硬化症(SSc)、和特发性肺纤维化(IPF)与肉样瘤病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎间质肺病、特发性阻塞性细支气管炎伴机化性肺炎；淋巴细胞性间质性肺炎；朗格汉斯细胞肉芽肿；特发性肺含铁血黄素沉着症；急性支气管炎；肺泡蛋白沉着症；支气管扩张；肺不张；囊性纤维化；炎性和／或自体免疫疾病或病症、胃肠疾病或病症(例如炎性肠病(IBD)和嗜酸性食道炎(EE)、以及嗜酸性粒细胞介导的胃肠疾病、溃疡性结肠炎和／或克罗恩氏病)、肝脏疾病或病症(例如硬化症、原发性肝细胞癌)、和硬皮病；肿瘤或癌症(例如软组织或实体肿瘤)，例如白血病、恶性胶质瘤、和淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤；病毒感染(例如自HTLV-I)；其它器官的纤维化，例如肝脏纤维化(例如由肝炎B和／或C病毒引起的纤维化)；以及抑制1型保护免疫响应的表达(例如在接种疫苗期间)。
[0146] 治疗受试者的方法包括施用高亲和力IL4和IL13双特异性结合蛋白于受试者，其施用量有效地减少疾病或病症的一种或多种症状(例如施用量有效地减少一种或多种以下症状：呼吸症状(例如支气管缩小)、IgE水平、组胺或白三烯的释放或水平、或受试者体内的嗜酸性粒细胞趋化因子水平)。在预防性使用的情况下(例如用于预防、减少或延缓疾病或病症的一种或多种症状的发生或复发)，受试者可能具有或者可能不具有疾病或病症的一种或多种症状。
[0147] 在一个实施例中，高亲和力IL4和IL13双特异性结合蛋白抑制或减少与IL4或IL13相关联疾病的早期阶段相关联的一种或多种症状，例如“早期哮喘响应”或“EAR。”例如，在侵害(例如过敏原暴露)后约0.25至3小时至侵害(例如过敏原暴露)后约3小时，IL4和IL13双特异性结合蛋白减少与EAR相关联的一种或多种症状。与缺少IL4和IL13双特异性结合蛋白的受试者症状的水平或程度相比，IL4和IL13双特异性结合蛋白可减少或预防EAR的一种或多种症状。作为另外一种选择，IL4和IL13双特异性结合蛋白能够预防症状的大幅增加，例如与缺少IL4和IL13双特异性结合蛋白的受试者症状的水平或程度相比)，包括但不限于以下一种或多种：例如从气道肥大或嗜碱细胞中释放至少一种过敏调节剂如白三烯和／或组胺；提高至少一种过敏调节剂如白三烯和／或组胺的水平；支气管缩小；和／或气道浮肿。
[0148] 在其它实施例中，IL4和IL13双特异性结合蛋白抑制或减少与IL4或IL13相关联疾病的晚期阶段相关联的一种或多种症状，例如“晚期哮喘响应”或“LAR。”例如，IL13结合蛋白例如在侵害(例如过敏原暴露)后约3小时和至多约24小时减少与LAR相关联的一种或多种症状。例如，IL4和IL13双特异性结合蛋白可减少或预防LAR的一种或多种症状(例如与缺少结合蛋白的受试者症状的水平或程度相比)，例如以下一种或多种：气道反应性和／或炎性细胞如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和／或巨噬细胞在例如气道和／或支气管粘液中的聚集和／或活化。作为另外一种选择，例如与缺少IL4和IL13双特异性结合蛋白的受试者症状的水平或程度相比，IL4和IL13双特异性结合蛋白能够预防症状的大幅增加。
[0149] IL4和IL13双特异性结合蛋白可在与IL4／IL13-疾病或病症相关联的一种或多种症状的发生或复发之前、但是在与疾病或病症相关联的症状完全显现之前施用。在某些实施例中，将IL4和IL13双特异性结合蛋白在暴露于诱发或恶化IL4／IL13-相关联的疾病或病症的剂如过敏原、污染物、毒剂、感染和／或应力之前施用于受试者。在一些实施例中，IL4和IL13双特异性结合蛋白在暴露于诱发或恶化IL13-相关联的疾病或病症的剂之前、期间、或之后短时间内施用。例如，IL4和IL13双特异性结合蛋白可在暴露于诱发或恶化剂之前或之后1、5、10、25、或24小时；2、3、4、5、10、15、20、或30天；或4、5、6、7或8周、或更长的时间施用。通常IL4和IL13双特异性结合蛋白可在暴露于诱发或恶化剂之前或之后的24小时和2天之间的任何时间点施用。
[0150] 在本发明的另一个实施例中，如上所述抑制人IL4或IL13或天然存在变体的活性的IL4和IL13双特异性结合蛋白可与第二结合蛋白或小分子活性物质结合使用，该小分子活性物质能够附加地或协同地与IL4和IL13双特异性结合蛋白一起起作用或者通过互补机制起作用以改善一种或多种疾病症状或后遗症。例如，IL4结合蛋白是一种IL4拮抗剂，它能够与IL13结合蛋白一起施用。因为多种疾病病理学是多因素的，可通过组合抑制一个途径上的多个目标或不同途径上的多个目标的剂来改善功效。本发明的IL4和IL13双特异性结合蛋白的一个优点是将它们遗传连接在一起的能力，使得一个结合蛋白抑制一个目标并且第二结合蛋白抑制不同目标或多个目标。作为另外一种选择，可将特定半胱氨酸残基引入结合蛋白上的唯一位点，其不干扰结合并且用于直接联接小分子治疗剂。IL4和IL13双特异性结合蛋白与第二治疗剂的共同施用也是可能的。
[0151] 一个附加的实施例是根据本发明的结合蛋白在制造用于治疗IL4／IL13-相关联的疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症无限制地包括心血管病症、呼吸病症、癌症、皮肤病、和纤维化病症，并且更具体地，用于治疗哮喘和／或肺部纤维化。
[0152] 可与IL4和IL13双特异性结合蛋白共同施用和／或共同配制的优选附加治疗剂的例子包括：吸入性类固醇；β-激动剂，例如短期作用或长期作用β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；组合药物如 IgE抑制剂例如抗-IgE抗体(例如)；磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE4抑制剂)；黄嘌呤；抗胆碱药；肥大细胞-稳
定剂如色甘酸；IL4抑制剂(例如IL4抑制剂抗体、IL4融合受体或IL4突变蛋白)；IL-5抑制剂；嗜酸性粒细胞趋化因子／CCR3抑制剂；和抗组胺剂。此类组合可用于治疗哮喘和其它呼吸疾病。可与IL4和IL13双特异性结合蛋白共同施用和／或共同配制的治疗剂的附加例子包括以下一个或多个：TNF拮抗剂(例如TNF受体的可溶解片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd的TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，
))；TNF酶拮抗剂，例如TNFalpha转化酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGFbeta拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化疗剂如甲氨蝶呤、来氟米特、或西罗莫司(雷帕霉素)或它们的类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；和NFkB抑制剂等等。
定剂如色甘酸；IL4抑制剂(例如IL4抑制剂抗体、IL4融合受体或IL4突变蛋白)；IL-5抑制剂；嗜酸性粒细胞趋化因子／CCR3抑制剂；和抗组胺剂。此类组合可用于治疗哮喘和其它呼吸疾病。可与IL4和IL13双特异性结合蛋白共同施用和／或共同配制的治疗剂的附加例子包括以下一个或多个：TNF拮抗剂(例如TNF受体的可溶解片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd的TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，
))；TNF酶拮抗剂，例如TNFalpha转化酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGFbeta拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化疗剂如甲氨蝶呤、来氟米特、或西罗莫司(雷帕霉素)或它们的类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；和NFkB抑制剂等等。
[0153] 生产IL4和IL13结合蛋白的方法
[0154] 根据本发明的IL4和IL13双特异性结合蛋白可通过多个方法获取和／或进一步改变，例如核糖体展示(WO98／48008)、噬菌体表面展示(WO90／02809，
WO07／006665)(可能需要允许输出折叠蛋白的不同信号序列；Steiner，D.等人
JMB2008382(5)1211-1227)或细菌细胞表面展示(WO93／10214)、质粒展示(WO93／
08278)或使用共价RNA-重复蛋白杂交构建体(WO00／32823)、或细胞内表达并例如通过蛋白互补测定法选择或筛选(WO98／341120)。此类方法是本领域的技术人员已知的。
WO07／006665)(可能需要允许输出折叠蛋白的不同信号序列；Steiner，D.等人
JMB2008382(5)1211-1227)或细菌细胞表面展示(WO93／10214)、质粒展示(WO93／
08278)或使用共价RNA-重复蛋白杂交构建体(WO00／32823)、或细胞内表达并例如通过蛋白互补测定法选择或筛选(WO98／341120)。此类方法是本领域的技术人员已知的。
[0155] 用于选择、筛选、并表征根据本发明的结合蛋白的锚蛋白重复结构蛋白文库可根据本领域的技术人员已知的方案获取(WO02／020565，Binz，H.K.等人，JMB，332，489-503，2003，和Binz等人，2004，loc.cit)。此类用于选择人IL4和IL13特定结合蛋白的文库的使用在实例1中给出。与之相仿，如上所述的锚蛋白重复序列基序可用于构建锚蛋白重复结构蛋白文库，其可用于选择或筛选人IL4和／或IL13结合蛋白。此外，本发明的重复结构域可由根据本发明的重复模块和适当的封端模块组合装配(Forrer，P.等人，FEBS letters539，2-6，2003)，该装配使用标准重组DNA技术(例如WO02／020565，Binz等人，
2003，loc.cit.和Binz等人，2004，loc.cit)。
2003，loc.cit.和Binz等人，2004，loc.cit)。
[0156] 因为编码期望IL4和／或IL13结合重复模块的核酸从例如本文所述文库中鉴定，该文库包括以串联重复编码以形成结合结构域的设计重复模块；分离它们并用于形成表达载体，用作治疗药物或用于构建制备并纯化IL4和IL13双特异性结合结构域目的的宿主细胞。宿主细胞可为细菌、昆虫、植物、或哺乳动物细胞，和／或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2／0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞；或者可为任何衍生物、亚系、与前述细胞类型或细胞系相关的永生化或转化细胞。
[0157] 本发明不限于例子中所述的具体实施例。按照下述概要可使用并加工其它来源。
[0158] 实例
[0159] 下文公开的所有原料和试剂是本领域的技术人员已知的，并且是可商购获得的或者可使用熟知的技术制备。
[0160] 材料
[0161] 化学制品购自Fluka(Switzerland)。寡核苷酸来自Microsynth(Switzerland)。除非另行指出，DNA聚合酶、限制性酶和缓冲剂来自New England Biolabs(USA)或
Fermentas(Lithuania)。克隆和蛋白生产菌株是大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，USA)。使用的PBS包含137mM氯化钠、10mM磷酸盐、和2.7mM KCl，pH7.4
Fermentas(Lithuania)。克隆和蛋白生产菌株是大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，USA)。使用的PBS包含137mM氯化钠、10mM磷酸盐、和2.7mM KCl，pH7.4
[0162] 设计的锚蛋白重复结构蛋白文库
[0163] 描述了N2C和N3C设计的锚蛋白重复结构蛋白文库(WO02／20565；Binz等人，2003，loc.cit.；Binz 等 人，2004，Nat Biotechnol22：575-82，2004，Binz等 人，J Mol Biol332：489-503，2003)。N2C(例如2个锚蛋白重复模块)和N3C(例如3个锚蛋白重复模块)中的数字描述了存在于N-末端和C-末端封端模块之间的随机锚蛋白重复模块的数目。用于限定重复单元和模块内位点的命名基于Binz等人，2004，loc.cit.，具有以下修改：重复模块和重复单元的边界改变了一个氨基酸位点。例如，Binz等人，2004(loc.cit.)的重复模块的位点1对应于本公开重复模块的位点2(SEQ ID NO：1)，并且因此Binz等人，
2004，loc.cit.的重复模块或N-cap模块的位点33对应于如本文所述的随后的重复模块的位点1。所有DNA序列通过测序进行确认。
2004，loc.cit.的重复模块或N-cap模块的位点33对应于如本文所述的随后的重复模块的位点1。所有DNA序列通过测序进行确认。
[0164] 实例1：选择包括具有对IL4和IL13的结合特异性的重复结构域的结合蛋白
[0165] IL4-和IL13-结合特异性锚蛋白重复结构蛋白的选择通过核糖体展示(Hanes和Plückthun，loc.cit.)，使用重组人IL4靶蛋白(UniProt登录号：P05112，SEQ ID NO：4)和IL13蛋白进行。
[0166] 选择并筛选人IL4结合蛋白：
[0167] 用N2C和N3C AR蛋白文库对生物素酰化人IL4(Peprotech#200-04，大肠杆菌中产生的成熟蛋白质)进行总计九轮核糖体展示选择。前四轮是根据之前公布的方案的标准核糖体展示选择轮，其使用降低的目标浓度和提高的洗涤严格性以提高从第1轮到第4轮的选择压力(Binz，Amstutz，Kohl，Stumpp，Briand，Forrer，Grutter和Pluckthun，Nat Biotechnol22：575-82，2004；Zahnd等人，Nat Methods4：269-79，2007)。通过粗提物ELISA和粗提物细胞HEK/STAT6功能测定筛选在这四个初始轮后的集合以获得人IL4的结合剂。选择的结合剂为纳摩尔亲和力(KD)，这由单克隆(数据未示出)的SPR测量显示。
[0168] 为了特别富集较高亲和力的AR蛋白，在头四轮选择后进行具有提高的选择严格性的两轮解离率选择(每轮后接一个或两个标准选择轮)(Zahnd等人，J Biol Chem281：35167-75，2006)。
[0169] 在这六轮核糖体展示之后，获取自这些轮的单克隆通过粗提物细胞HEK/STAT6功能测定进行筛选以鉴定最可能的候选。将选择的AR蛋白的集合亚克隆进基于T5启动子的载体用于表达。在表达后，通过ELISA评估来自200个单独AR蛋白的粗制溶解物与重组IL4的结合及在HEK-STAT6细胞中IL4依赖的STAT6磷酸化的抑制。通过将编码特定AR蛋白的质粒转化到大肠杆菌XL-1蓝色细胞中制备溶解物。用单菌落接种在包含50ug／ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的Luria Bertam培养基(LB)中的1.2ml起始培养物。起始培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养过夜。在次日将一部分过夜培养物用作0.9mL LB的种菌。使用500uM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养4小时。离心收获细胞沉淀物并用50μl B-Per溶液(Pierce)使其裂解。
在将这些溶解物用于随后的筛选分析之前用PBS稀释它们。
在将这些溶解物用于随后的筛选分析之前用PBS稀释它们。
[0170] 为了评估与IL4的结合，将每个包含结合蛋白的溶解物的粗提物加到预涂覆有亲和素和生物素酰化IL4的Maxisorp ELISA板上并培养1小时。在充分洗涤后，结合的AR蛋白使用抗-RGS-His6-HRP标记物(34450，Qiagen)进行检测。
[0171] 在平行实验中，相同的200个单克隆大肠杆菌溶解物进行细胞抑制测定。使TM用HEK-Blue STAT-6细胞(Invivogen ，SanDiego，CA)测定每个粗提物样品的活性以评估它们抑制IL4依赖的STAT6活化的能力。如下刺激HEK-Blue STAT-6细胞：在第1
天，将细胞置于96-孔细胞培养板上8小时，细胞密度为在100μl细胞培养基(DMEM，具有4.5g／L葡萄糖(11995，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％加热灭活的FBS(10082，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10ug／mL杀稻瘟菌素S，肽核苷类抗TM
生素活性物质(Invivogen)，和100μg／mL Zeocin ，产自链霉菌属CL990的铜螯合糖
5
肽抗生素(Invivogen)中2.5×10 ／ml。在同一天，加入包含与50pg／ml(3.3pM)人
IL4(Peprotech)预混的稀释AR蛋白粗提物的100μl细胞培养基。板在37℃和5％CO2
TM
条件下培养过夜。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶 ，将30μl各个细胞上清液与80μl TM
Quanti-Blue (Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养1小时并使用板读数计读出620nm的吸光度。
天，将细胞置于96-孔细胞培养板上8小时，细胞密度为在100μl细胞培养基(DMEM，具有4.5g／L葡萄糖(11995，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％加热灭活的FBS(10082，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10ug／mL杀稻瘟菌素S，肽核苷类抗TM
生素活性物质(Invivogen)，和100μg／mL Zeocin ，产自链霉菌属CL990的铜螯合糖
5
肽抗生素(Invivogen)中2.5×10 ／ml。在同一天，加入包含与50pg／ml(3.3pM)人
IL4(Peprotech)预混的稀释AR蛋白粗提物的100μl细胞培养基。板在37℃和5％CO2
TM
条件下培养过夜。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶 ，将30μl各个细胞上清液与80μl TM
Quanti-Blue (Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养1小时并使用板读数计读出620nm的吸光度。
[0172] 因为初筛的200个克隆仅生成一些以高亲和力结合到IL4上的AR蛋白并有效地抑制信号转导，测试利用解离率选择在附加的多轮核糖体展示(第7、8、和9轮)后获得的5100个更多的AR蛋白的单克隆粗提物抑制如上所述IL4依赖的STAT6磷酸化的能力。在这一测定法中这些克隆的活性与基准AR蛋白，克隆C06_28E5，进行比较，该基准蛋白存在于第一轮筛选中，用于结合IL4，具有通过SPR显示的50pM的表观亲和力，并且抑制STAT6的产生，在3pM IL4的存在下具有3pM的IC50。因此，比较随后选择的克隆与基准的测试值以允许方便地选择附加的高效能候选。
[0173] 基于STAT6磷酸化筛选的结果，22个AR蛋白(SEQ ID NO：9-30)显示比基准更好的或相同的IL4抑制活性，选择它们进行进一步表征。
[0174] IL13-结合特异性锚蛋白重复结构蛋白的选择通过核糖体展示(Hanes和Plückthun，loc.cit.)，使用人IL13变体(R130Q)靶蛋白进行。IL13R130Q变体(R110Q，SEQ ID NO：1)是人IL13的变体，其已经与特应性患者联系起来(Arima等人，J.Aller.Clin.Immunol.)109：980-987，2002)。
[0175] 选择并筛选人IL13结合蛋白：
[0176] 用N2C和N3C AR文库在溶液中对人IL13R130Q(Peprotech)进行总计6轮核糖体展示选择。前四轮选择利用标准核糖体展示选择，使用降低的目标浓度和提高的洗涤严格性以提高从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人，Nature Biotech22：575-582，2004)。在四轮筛选后，使用ELISA型方法筛选集合以获得粗提物中人IL13的结合剂。选择的结合剂为纳摩尔亲和力，这由单克隆(数据未示出)的BIAcore测量显示。
[0177] 在第四轮核糖体展示选择后，将选择的结合蛋白集合克隆进基于T5启动子的表达载体中。在表达后，评估200个单个结合蛋白以粗提物形式与在亲和素板上捕集的人L-13R130Q的结合。在这些蛋白中，通过ELISA显示具有最高结合信号的32个结合蛋白被表达并通过固定金属离子亲和色谱(IMAC)纯化，并且筛选具有抑制IL13R13Q依赖的结合人IL13Rα2-Fc融合蛋白的能力的蛋白，使用ELISA型方法：候选结合蛋白(10nM或100nM最终浓度)与10nM生物素酰化人IL13R130Q预培养30分钟，将结合蛋白-IL13混合物加到预涂覆有IL13Rα2-Fc(R&D Systems)的Maxisorp ELISA板中并培养15分钟以捕获游离的生物素酰化IL13，并且使用链霉抗生物素蛋白-马辣根过氧化物酶进行检测。由结合蛋白产生的关联量的抑制通过与不加入结合蛋白的情况比较10nM生物素酰化IL13的测量信号进行评估。基于在10nM结合蛋白情况下这种筛选测定的结果(其与IL13R130Q克分子数相等)，选择IL13结合蛋白2F1作为所有其它筛选的基准。
[0178] 为了鉴定较高亲和力的人IL13结合剂，第四轮标准核糖体展示筛选(如上所述)的输出经受具有提高的选择严格性的解离率选择轮。进行最终的一轮标准选择以扩增并回收解离率选择的结合蛋白。粗提物如上所述再次进行对与IL13的结合的筛选，并且评估与2F1结合蛋白相关的信号。为了使高亲和力和低亲和力结合蛋白之间能够发生分化，选择
1∶10稀释的粗提物，因为它使得对IL13的结合比基准结合蛋白2F1更强的结合蛋白清楚地分化出来。用这种方法测定约700个结合蛋白克隆。
1∶10稀释的粗提物，因为它使得对IL13的结合比基准结合蛋白2F1更强的结合蛋白清楚地分化出来。用这种方法测定约700个结合蛋白克隆。
[0179] 在平行实验中，使用HEK-Blue STAT-6细胞(InVivogen，SanDiego，CA)评估对结合进行筛选的粗提物抑制IL13依赖的STAT6活化的能力。为了使高亲和力和低亲和力结合蛋白之间能够发生分化，选择最佳的粗提物稀释度(1∶5200)。在HEK-Blue STAT-6细胞中，IL13活化IL13Rα1：IL4R复合物(2型受体)用于诱导雏形碱性磷酸酶(SEAP)报道基因经由STAT-6信号转导途径的分泌。如下使用蛋白粗提物刺激HEK-Blue STAT-6细胞：在第1天，将细胞置于96-孔细胞培养板上24小时，细胞密度为在100uL细胞培养基(DMEM，具有4.5g／L葡萄糖(11995，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％加热灭活的FBS(10082，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10μg／mL杀稻瘟菌素(Invivogen)，和5
100μg／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×10 ／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)人IL13(Peprotech)预混的合适浓度AR蛋白的100μL细胞培养基加到细胞中。所述板在
37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40μL各个细胞上清液与160μL Quanti-Blue(Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。
100μg／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×10 ／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)人IL13(Peprotech)预混的合适浓度AR蛋白的100μL细胞培养基加到细胞中。所述板在
37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40μL各个细胞上清液与160μL Quanti-Blue(Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。
[0180] 通过评估700个测试的粗提物，将94个结合蛋白鉴定为显示比基准结合蛋白2F1更高的结合和抑制活性。HEK/STAT6和ELISA筛选数据针对彼此绘出曲线图以鉴定在筛选和活性测定中比基准结合蛋白2F1表现更好的结合蛋白(图2A和图2B)。在这一曲线图中，较低的HEK/STAT6信号指示通过IL13Ralpha1对IL13依赖的信号转导的较高抑制，并且增强的ELISA信号指示对IL13提高的亲和力。用在十字线交点处的实心三角形指示基准结合蛋白2F1。通过灰色阴影指示的位于右下象限(94)中的所有结合蛋白经鉴定用于进一步表征。
[0181] 实例2：IL4和IL13结合蛋白的表征
[0182] 选择用于进一步表征的22个AR蛋白使用基于T5-启动子的体系，在大肠杆菌细胞质中表达，并且经由固定金属离子亲和色谱(IMAC)进行纯化。简而言之，将AR蛋白转化到大肠杆菌XL-1蓝色细胞中并用于在Luria Bertani培养基(LB)中接种5ml起始培养物，该培养基包含50μg／ml氨苄青霉素和1％的葡萄糖。起始培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养过夜。在次日将过夜培养物用作050mL LB的种菌。在OD600=0.7的细胞密度下，使用500μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养4小时。通过离心收获细胞沉淀物。通过加入1mg／mL溶菌酶，50KU／mL DNAse I并在冰上超声处理30分钟裂解细胞。通过离心移除不溶解的部分。使用0.22μM过滤器过滤澄清的上清液。将这些上清液加载到填充有250μl Ni-NTA superflow树脂(Qiagen)的柱上。按照制造商的说明书进行纯化。包含20mM咪唑和10％甘油的20ml Tris缓冲盐溶液(TBS)用作洗涤缓冲液，并且包含250mM咪唑的600μl TBS用于从柱中洗脱AR蛋白。
[0183] 选择的人IL4结合AR蛋白的SEC
[0184] 通过尺寸排阻色谱法(SEC)，使用Superdex755／150柱(GE healthcare)和pH7.4的PBS移动相分析22个纯化的AR蛋白样品的聚集。每次运行以0.3mL／min的流
量注入10uL每个样品。使用伴白蛋白、卵清蛋白、碳酸酐酶、核糖核酸酶A、和抑肽酶蛋白标准物校准所述柱。通过在214nm的吸光度监测AR蛋白从柱中的洗脱。评估样品的洗脱特征以鉴定主要以单体形式洗脱的候选AR蛋白，该单体形式通过在适当体积处洗脱的15kDa蛋白(N2C文库)(N3C文库的18kDA蛋白)单峰证明，所述蛋白使用分子量标准物测定。表征的IL4-结合AR蛋白的生物物理性能的结果在表1中概述。
量注入10uL每个样品。使用伴白蛋白、卵清蛋白、碳酸酐酶、核糖核酸酶A、和抑肽酶蛋白标准物校准所述柱。通过在214nm的吸光度监测AR蛋白从柱中的洗脱。评估样品的洗脱特征以鉴定主要以单体形式洗脱的候选AR蛋白，该单体形式通过在适当体积处洗脱的15kDa蛋白(N2C文库)(N3C文库的18kDA蛋白)单峰证明，所述蛋白使用分子量标准物测定。表征的IL4-结合AR蛋白的生物物理性能的结果在表1中概述。
[0185] 纯化Hit AR蛋白的亲和力测定
[0186] 选择作为“hits”的纯化结合剂通过它们在ProteOn XPR-36仪器(Bio-Rad)上的亲和力分级。ProteOn是一种基于表面等离振子共振技术实时测量蛋白-蛋白相互作用的光学生物传感器仪器，类似于Biacore(GE)。如下实施快速实验方案：在一个GLC传感器芯片(Bio-Rad)上，亲和素(Thermo Scientific)利用如制造商所述的氨基偶联化学作用共价固定，密度为>5000RU。在一个流动池上，生物素酰化的IL4(Peprotech)固定至250RU的水平，而另一个流动池用作参照，仅固定亲和素。对于每个纯化AR蛋白，分析三个不同的浓度(25、12.5、6.25nM)，并且通过使用Langmuir1∶1模型拟合计算动力学参数。每个AR蛋白从这些测量中获得的ka、kd、和KD在表1中给出，其中E是对数底10。所得值用于根据AR蛋白的亲和力给它们分级。
[0187] 表1
[0188]AR蛋白 秒 ka(M-1S-1) kd(S-1) KD(pM) SEQ ID NO：
C06_6E9 宽峰单体 9.56E+05 7.16E-05 74.9 27
C06_28E5 单体 9.22E+05 4.61E-05 50 16
C06_19C3 单体 9.62E+05 9.73E-05 101 11
C06_17A11 单体 1.03E+06 1.40E-04 136 10
C06_6E9 宽峰单体 9.56E+05 7.16E-05 74.9 27
C06_28E5 单体 9.22E+05 4.61E-05 50 16
C06_19C3 单体 9.62E+05 9.73E-05 101 11
C06_17A11 单体 1.03E+06 1.40E-04 136 10
[0189]AR蛋白 秒 ka(M-1S-1) kd(S-1) KD(pM) SEQ ID NO：
C06_20B8 单体 2.02E+06 1.63E-04 80.9 13
C06_13A10 单体 2.52E+06 1.49E-04 59.2 9
C06_19F8 单体 3.66E+04 5.18E-05 1410 12
C06_26H2 二聚体肩峰 3.47E+06 2.47E-04 71.2 14
C06_28D4 多个峰 1.62E+06 1.38E-04 85.6 15
C06_42A11 单体 7.27E+05 5.43E-06 7.5 17
C06_42C7 单体 1.83E+06 1.79E-04 97.8 18
C06_43G2 单体 1.40E+06 5.98E-05 42.7 19
C06_44C12 单体 8.64E+05 3.77E-05 43.6 20
C06_44F6 单体 2.07E+06 2.00E-04 96.7 21
C06_48F3 单体 8.72E+05 1.51E-04 174 22
C06_50E5 单体 7.25E+05 1.26E-04 174 23
C06_53E9 单体 8.62E+05 2.81E-04 326 24
C06_53G6 单体 6.96E+05 5.11E-05 73.4 25
C06_54C2 单体 4.03E+05 1.61E-04 400 26
C06-14A4 宽峰单体 3.18E+05 2.73E-05 85.8 30
C06_24H1 宽峰 n.a. n.a. n.a. 28
C06_4A7 单体 n.a. n.a. n.a. 29
C06_20B8 单体 2.02E+06 1.63E-04 80.9 13
C06_13A10 单体 2.52E+06 1.49E-04 59.2 9
C06_19F8 单体 3.66E+04 5.18E-05 1410 12
C06_26H2 二聚体肩峰 3.47E+06 2.47E-04 71.2 14
C06_28D4 多个峰 1.62E+06 1.38E-04 85.6 15
C06_42A11 单体 7.27E+05 5.43E-06 7.5 17
C06_42C7 单体 1.83E+06 1.79E-04 97.8 18
C06_43G2 单体 1.40E+06 5.98E-05 42.7 19
C06_44C12 单体 8.64E+05 3.77E-05 43.6 20
C06_44F6 单体 2.07E+06 2.00E-04 96.7 21
C06_48F3 单体 8.72E+05 1.51E-04 174 22
C06_50E5 单体 7.25E+05 1.26E-04 174 23
C06_53E9 单体 8.62E+05 2.81E-04 326 24
C06_53G6 单体 6.96E+05 5.11E-05 73.4 25
C06_54C2 单体 4.03E+05 1.61E-04 400 26
C06-14A4 宽峰单体 3.18E+05 2.73E-05 85.8 30
C06_24H1 宽峰 n.a. n.a. n.a. 28
C06_4A7 单体 n.a. n.a. n.a. 29
[0190] AR蛋白组合物
[0191] 表现为表达蛋白的22个AR蛋白的组合物以SEQ ID NO：9-30给出。发现22个AR蛋白提供51个独有的AR模块，它们以SEQ ID NO：31-81给出。在一些情况下，在N-cap模块中发生突变，包括(基于SEQ ID NO：2)D1N、K5E、R11S、A12V、R19H、V28A、和A30V(单独的或组合的)。发现一个AR蛋白C06_26H2在C-cap中具有G16R(SEQ ID NO：3)。
[0193] 每个AR蛋白结合结构域的组合物在下表2中以对应的SEQ ID NO：，根据式AR1-AR2-AR3或AR1-AR2-AR3-AR4列出。
[0194] 表2：
[0195]AR蛋白 AR1SEQ ID NO： AR2SEQ ID NO： AR3SEQ ID NO： AR4SEQ ID NO：
C06_13A10 31 47 62
C06_13A10 31 47 62
[0196]C06_17A11 32 48 63
C06_19C3 33 49 63
C06_19F8 33 50 64
C06_20B8 34 51 65
C06_26H2 35 52 66 81
C06_28D4 34 53 67
C06_28E5 36 53 68
C06_42A11 37 54 69
C06_42C7 34 51 64
C06_43G2 38 55 70 80
C06_44C12 39 56 71
C06_44F6 39 57 72
C06_48F3 40 58 71
C06_50E5 33 49 63
C06_53E9 42 58 73
C06_53G6 43 59 74
C06_54C2 33 49 75
C06_6E9 44 60 76 79
C06_24H1 45 56 77
C06_4A7 46 61 78
C06_14A4 37 54 78
C06_19C3 33 49 63
C06_19F8 33 50 64
C06_20B8 34 51 65
C06_26H2 35 52 66 81
C06_28D4 34 53 67
C06_28E5 36 53 68
C06_42A11 37 54 69
C06_42C7 34 51 64
C06_43G2 38 55 70 80
C06_44C12 39 56 71
C06_44F6 39 57 72
C06_48F3 40 58 71
C06_50E5 33 49 63
C06_53E9 42 58 73
C06_53G6 43 59 74
C06_54C2 33 49 75
C06_6E9 44 60 76 79
C06_24H1 45 56 77
C06_4A7 46 61 78
C06_14A4 37 54 78
[0197] 在比较由15个独有序列(SEQ ID NO：31-46)表示的22个AR1模块时，优选在X1的T、在AR序列基序的X2的D、在X3的W、和在X6的D。在相邻可变位点(X2X3和X5X6)处的氨基酸对的使用也被制表，如下表(表3)所示。DW是X2X3最频繁出现的氨基酸对，并且TD是X5X6最频繁出现的氨基酸对。因此，AR1模块可通过氨基酸序列
[0198] X1D-[DW]-GX4TPLHLAA-[TD]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA表示，其中X1和X4选自如表4所示的残基，并且X7可为H、N、或Y(C-AR1，SEQ ID NO：82)。作为另外一种选择，AR1基序可选自由下式表示的氨基酸序列：
[0199] TD-[DW]-GX4TPLHLAA-[TD]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X4选自在表4中列出的残基，并且X7可为H、N、或Y(F-AR1，SEQ ID NO：85)。
[0200] 表3：
[0201]
[0202] 在比较由15个独有序列(SEQ ID NO：47-61)表示的22个AR2模块时，在AR序列基序的X1、X2、X3、X4、X5、或X6中任何一个处无显著残基(高于50％的频率)。在相邻可变位点(X2X3和X5X6)处的氨基酸对的使用也被制表，如下表(表4)所示。AM是X2X3最频繁出现的氨基酸对，并且VY是X5X6最频繁出现的氨基酸对。因此，AR2模块可通过以下序列表示：
[0203] X1D-[X2X3]-G X4TPLHLAA-[X5X6]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1、X2X3、X4、和X5X6选自在表4中示出的残基，并且X7可为H、N、或Y(C-AR2，SEQ ID NO：83)。作为另外一种选择，AR2基序可选自由下式表示的序列：
[0204] X1D-[AM]-GX4TPLHLAA-[VY]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1和X4选自表4中的残基，并且X7可为H、N、或Y(F-AR2，SEQ ID NO：86)。
[0205] 表4：
[0206]
[0207] 在比较由17个独有序列(SEQ ID NO：62-78)表示的22个AR3模块时，在AR序列基序的X1、X2、X3、或X6中任何一个处无显著残基(高于50％的频率)，然而，X4和X5是最频繁的F并且X5或X6中的至少一个是频繁的F或Y。在相邻可变位点(X2X3和X5X6)处的氨基酸对的使用也被制表，如下表(表5)所示。FY是X5X6最频繁出现的氨基酸对。因此，IL4-结合AR3模块可通过以下氨基酸序列表示：
[0208] X1D-[X2X3]-G-F-TPLHLAA-[X5X6]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1和X2X3、以及X5X6选自表5中的残基，并且X7可为H、N、或Y(C-AR3，SEQ ID NO：84)。作为另外一种选择，AR3基序可选自由下式表示的氨基酸序列
[0209] X1D-[X2X3]-G-F-TPLHLAA-[FY]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1和X2X3选自在表5中列出的残基，并且X7可为H、N、或Y(F-AR3，SEQ ID NO：87)。
[0210] 表5：
[0211]
[0212] 仅有3个AR4模块(SEQ ID NO：79-81)，并且此组无共有序列或聚焦序列式被采用。
[0213] 通过纯化AR蛋白进行IL4依赖的STAT6磷酸化的中和
[0214] 使用如上所述的HEK-Blue STAT-6细胞测定每个纯化AR蛋白的活性以评估它们抑制IL4依赖的STAT6活化的能力。评估每个候选的完全抑制曲线并且使用PRISM软件(GraphPad PRISM)，将吸光度数据作为AR蛋白浓度的函数对S形剂量效应绘出曲线图，用于测定3.3pM IL4的IC50值。这些AR蛋白获得的IC50值在1.3至235pM的范围内，这在表6中给出。
[0215] IL4结合的IL4RA竞争性结合
[0216] 为了生物素酰化IL4，重组人IL4(Peprotech)以4：1的比率，使用EZ-Link NHS-LC-Biotin(Pierce，#21336)在室温下生物素酰化2小时。蛋白在PBS中透析过夜以除去过多的生物素酰化试剂。食蟹猴IL4(SEQ ID NO：5)的竞争性结合使用以相同方式进行的分离蛋白生物素酰化实施。
[0217] IL4结合IL4RA的AR蛋白抑制使用IL4RA-Fc(R&D Systems)进行评估，其包含Gly24-His232，表示融合到人IgG1-Fc上并因此成为二硫键连接的同源二聚体的ECD(SEQ ID NO：5)。蛋白根据制造商规程结合到羧化的Luminex微球上。对于中和实验，将50μl的5000个IL4RA-Fc结合小珠加到96-孔过滤板(Millipore)的每个孔中。生物素酰化的人IL4与在Luminex Assay缓冲液(PBS，1％BSA，pH7.4)中适当稀释的AR蛋白混合以提供67pM IL4的最终浓度。板在室温下，在板摇动器上避光培养1小时，将板摇动器设定为剧烈摇动以避免小珠聚集。板使用真空歧管用150μl洗涤缓冲液(PBS，0.1％BSA，pH7.4.，
0.05％Tween-20)洗涤两次，随后加入50μl链霉抗生物素蛋白PE，浓度为25μg／mL，并且在室温下培养20分钟。再次洗涤板并加入150μl鞘液，并且将板置于摇动器上5分钟。
使用 100系统读板；将数据作为AR蛋白浓度的函数绘出曲线图。使用PRISM软
件(GraphPAD PRISM)，将数据拟合到S形剂量效应的式中确定IC50值(表6)。
0.05％Tween-20)洗涤两次，随后加入50μl链霉抗生物素蛋白PE，浓度为25μg／mL，并且在室温下培养20分钟。再次洗涤板并加入150μl鞘液，并且将板置于摇动器上5分钟。
使用 100系统读板；将数据作为AR蛋白浓度的函数绘出曲线图。使用PRISM软
件(GraphPAD PRISM)，将数据拟合到S形剂量效应的式中确定IC50值(表6)。
[0218] IL4-依赖的TARC生产
[0219] TARC是过敏性哮喘中Th2-介导的炎症的关键调节子。通过IL4体外刺激A549细胞导致产生TARC。这一测定法与上述HEK-STAT6测定法互补，因为它展示了抑制剂在初生细胞中阻止IL4信号转导的能力。如下测定每个AR蛋白在A549细胞中对IL4依赖的TARC5
产生的抑制：在第1天，细胞在96-孔培养板上，以2.5×10 ／mL的密度，在100μl细胞培养基(alphaMEM with GlutaMax，+10％加热灭活的FBS，1X丙酮酸钠，和1XMEM NEAA(Gibco)中培养过夜。这种培养基也用作测定培养基。在第2天，细胞用200μl培养基洗涤一次，并且用与合适浓度AR蛋白预混、包含200ng／ml(11nM)重组人TNF-α和67pM重组IL4
的200μl培养基刺激。该板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收获上清液并贮存
在-80℃用于进一步分析。使用制造商规程和1∶5稀释的样品，CCL17／TARC Duo Set ELISA试剂盒(RandDSystems)用于定量样品中的TARC的量。数据作为AR蛋白浓度的函数绘出曲线图，并且使用PRIZM软件(GraphPad PRISM)拟合到S形剂量效应中以测定IC50值(表6)。
产生的抑制：在第1天，细胞在96-孔培养板上，以2.5×10 ／mL的密度，在100μl细胞培养基(alphaMEM with GlutaMax，+10％加热灭活的FBS，1X丙酮酸钠，和1XMEM NEAA(Gibco)中培养过夜。这种培养基也用作测定培养基。在第2天，细胞用200μl培养基洗涤一次，并且用与合适浓度AR蛋白预混、包含200ng／ml(11nM)重组人TNF-α和67pM重组IL4
的200μl培养基刺激。该板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收获上清液并贮存
在-80℃用于进一步分析。使用制造商规程和1∶5稀释的样品，CCL17／TARC Duo Set ELISA试剂盒(RandDSystems)用于定量样品中的TARC的量。数据作为AR蛋白浓度的函数绘出曲线图，并且使用PRIZM软件(GraphPad PRISM)拟合到S形剂量效应中以测定IC50值(表6)。
[0220] 在RA-1细胞中的STAT6信号转导
[0221] 测定在STAT6-bla RA-1细胞中每个AR蛋白对IL4诱导的STAT6信号转导的抑制。 STAT6-bla RA-1细胞系包含在STAT6响应元件控制下稳定整合进
Ramos-1(RA-1)细胞中的β-内酰胺酶报道基因。与上述通过II型复合物转导信号的
HEK-Blue STAT6细胞相比，RA-1细胞通过I型复合物转导信号并且可用于确认通过I型复合物对IL4刺激的抑制。
Ramos-1(RA-1)细胞中的β-内酰胺酶报道基因。与上述通过II型复合物转导信号的
HEK-Blue STAT6细胞相比，RA-1细胞通过I型复合物转导信号并且可用于确认通过I型复合物对IL4刺激的抑制。
[0222] 根据制造商Invitrogen(目录号K1243)的推荐进行测定。在第1天，将RA-1细胞置于半区域黑色96-孔细胞培养板(具有透明底部)中，细胞密度在32μl测定缓冲液中为937,500个细胞／ml。对于无细胞对照孔，加入32μl测定缓冲液。制备CD40溶液(50μl原液，浓度为100μg／mL950测定缓冲液)并加入4μl到每个孔中(最终浓度为556ng／mL)以确保孔响应IL4。细胞以14xg离心30秒并置于37℃，5％CO2条件下16小时。在第2天，将4μl测定缓冲液加到包含10x浓度范围hIL4的细胞中以获得EC50。为了进行抑制研究，包含AR蛋白的10x抑制溶液与10x hIL4在EC80下预混并随后加到细胞中。hIL4的浓度为20.8pM。板以14xg离心30秒并置于37℃，5％CO2条件下5小时。随后，将8μl Live BLAzer-FRET B／G(CCF4-AM)溶液加到每个孔(由6μl溶液A，60μl溶液B，和934μl溶液C组成)中并在14xg下离心30秒。板避光在室温下培养2.5小时。
板在具有底部读数能力的Envision Machine上进行测量，其使用在409／20nm的激发滤光片和两个发射滤光片：一个在460／40nm，一个在530／30nm。也使用双重反射镜。为了分析荧光读数，从460nm和530nm中减去背景(无细胞孔的值)，并且测定460／530比率。随后将所述比率在GraphPad PRIZM软件中对浓度绘出曲线图以获得IC50值。
板在具有底部读数能力的Envision Machine上进行测量，其使用在409／20nm的激发滤光片和两个发射滤光片：一个在460／40nm，一个在530／30nm。也使用双重反射镜。为了分析荧光读数，从460nm和530nm中减去背景(无细胞孔的值)，并且测定460／530比率。随后将所述比率在GraphPad PRIZM软件中对浓度绘出曲线图以获得IC50值。
[0223] 表6：表征的IL4-结合AR蛋白的生物活性
[0224]
[0225]
[0226]
[0227] 在实例2中描述的生物物理和生物化学数据的组合(表1)用于选择9个AR蛋白分子用于优化，它们是C06_13A10、C06_20B8、C06_28E5、C06_42A11、C06_44C12、C06_44F6、C06_53G6、C06_43G2、和C06_6E9。选择这些AR蛋白是因为发现它们每个通过SEC是单体形式的，能够结合重组IL4，具有KD＜9.7E-11，在HEK-STAT6细胞中抑制IL4-依赖的信号转导，具有效能＞67pM，并且抑制重组IL4与IL4受体的结合，具有IC50＜66pM。十个前导AR蛋白经受进一步的细胞基测定以在附加的细胞基测定中确认IL4-依赖的信号转导抑制。
[0228] 选择AR蛋白C06_44C12、C06_53G6、和C06_28E5进行优化。
[0229] 候选结合蛋白的表达和纯化
[0230] 选择进行进一步表征的94个候选结合蛋白使用基于T5-启动子的体系进行表达，该体系允许大肠杆菌细胞质表达，并且经由固定金属离子亲和色谱(IMAC)进行纯化。简而言之，用结合蛋白表达质粒转化大肠杆菌XL-1蓝色细胞，并且其用于在Luria Bertani培养基(LB)中接种5ml起始培养物，该培养基包含50μg／mL氨苄青霉素和1％的葡萄糖。起始培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养过夜。过夜培养物用于接种包含50μg／mL氨苄青霉素的50mL LB。在OD600=0.7的细胞密度下，使用500μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。培养物在37℃，220rpm振荡条件下培养4小时。通过离心收获细胞沉淀物。通过加入1mg／mL溶菌酶并在冰上超声处理30分钟裂解细胞。通过离心移除不溶解的部分。使用0.22μM过滤器过滤澄清的上清液。将这些上清液加载到填充有250μL Ni-NTA superfow树脂(QIAgen)的柱上。按照制造商的说明书进行纯化。包含
20mM咪唑和10％甘油的20mL Tris缓冲盐溶液(TBS)用作洗涤缓冲液，并且包含250mM咪唑和10％甘油的600μL TBS用于洗脱结合蛋白。
20mM咪唑和10％甘油的20mL Tris缓冲盐溶液(TBS)用作洗涤缓冲液，并且包含250mM咪唑和10％甘油的600μL TBS用于洗脱结合蛋白。
[0231] 选择的人IL13结合蛋白的SEC
[0232] 通过尺寸排阻色谱法(SEC)，使用TOSOH G2000SWXL柱和PBS pH7.4移动相分析94个结合蛋白样品的聚集。每次运行以0.2mL／min的流量注入20μL每个样品。使用伴白蛋白、卵清蛋白、碳酸酐酶、核糖核酸酶A、和抑肽酶蛋白标准物校准所述柱。通过在214nm的吸光度监测结合蛋白从柱中的洗脱。评估样品的洗脱特征以鉴定主要以单体形式洗脱的候选结合蛋白。
[0233] IL13结合蛋白的热稳定性：
[0234] 选择的IL13-结合蛋白样品的熔融温度使用Thermofluor技术(Pantoliano等人，J Biomol Screening：6：429-440，2001)进行测量。Thermofluor是一种高通量的以蛋白质去折叠作为热量函数的动力学测量。当加热样品时，样品缓冲液中的ANS结合到一般包围在折叠分子内的疏水性区域，诱发染料荧光的增加。在纯化后(如上所述)，使用PD Multi-trap G25树脂(GE Healthcare)将每个样品交换到pH7.4的PBS缓冲液中，并且利用在280nm的吸光度估计浓度。样品浓度在1-50μM范围内。在37-95℃之间监测结合蛋白的去折叠，在连续斜坡模式中每隔0.5℃测量荧光。这些样品测得的熔融温度在54℃至＞95℃的范围内。多个样品未检出熔融，指示稳定性大于95℃或者蛋白浓度过低而无法精确测量荧光(数据未示出)。
[0235] IL13依赖的STAT6磷酸化的中和
[0236] 使用如上所述的HEK-Blue STAT-6细胞测定每个纯化结合蛋白的活性以评估它们抑制IL13依赖的STAT6活化的能力。评估每个候选的完全抑制曲线并且使用PRIZM软件(GraphPad PRIZM)，将吸光度数据作为结合蛋白浓度的函数对S形剂量效应绘出曲线图，用于测定IC50值(数据未示出)。
[0237] 单点亲和力筛选
[0238] 所有纯化结合蛋白的亲和力通过ProteOn(BioRad)，使用如下的快速亲和力筛选程序进行评估。在一个GLC传感器芯片(Biorad)上，亲和素利用如制造商所述的氨基偶联化学作用共价固定，密度为＞5000RU。在一个流动池上，固定生物素酰化IL13R130Q(Peprotech)至250RU的水平；第二流动池用作参照，仅固定亲和素。分析50nM浓度的每个纯化结合蛋白，并且通过使用Langmuir1∶1模型拟合估计动力学参数。所得值
5 s
用于根据表观亲和力分级结合蛋白。这些结合蛋白具有介于1.7和9.6×101／M 之间的-5 -4 -11
结合率(ka)，以及范围介于1.3×10 和1.1.×10 1／s之间的解离率(kd)，提供2.1x10-8
至1.7x10 M的KD。
5 s
用于根据表观亲和力分级结合蛋白。这些结合蛋白具有介于1.7和9.6×101／M 之间的-5 -4 -11
结合率(ka)，以及范围介于1.3×10 和1.1.×10 1／s之间的解离率(kd)，提供2.1x10-8
至1.7x10 M的KD。
[0239] 基于初筛结果，选择16个前导分子进行进一步表征。一组表现出从SEC洗脱出的大单体的16个前导结合蛋白具有亲和力(KD)＜1.5nM，抑制IL13依赖的STAT6磷酸化，具有比100pM更好的IC50并且通过Thermofluor分析具有大于50℃的Tm，选择它们如下所述进行较大规模的表达、纯化和表征。
[0240] 表达
[0241] 大肠杆菌XL-1Blue细胞用结合蛋白表达质粒进行转化。挑取单克隆并在37℃下在500mL包含羧苄青霉素的TB培养基中生长。当培养物密度达到介于0.7和1.0单位之间的A600时，用0.4mM IPTG诱导表达并在37℃下培养附加的4小时。离心回收细菌沉淀物并冻存直至使用。解冻冻存的细菌沉淀物并在pH7.5的50mM磷酸钠，500mM氯化钠，20mM咪唑并包含不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物中裂解。重悬浮的沉淀物经过超声处理并在JA-17转子离心机中，以17,000xg离心30分钟收集细菌碎片。过滤可溶解的溶解物并将2mL Ni-NTA树脂(Qiagen)加到每个溶解物中，随后在4℃下缓慢搅拌至少1小时以捕获His-标记的结合蛋白。将包含树脂的溶解物注入柱中并用8倍柱体积的pH7.5的50mM磷酸钠，500mM氯化钠和20mM咪唑洗涤。用8倍柱体积的pH7.5的50mM磷酸钠，500mM氯化钠(包含500mM咪唑)从树脂中洗脱His-标记的蛋白。通过尺寸排阻色谱法，使用在pH7.0的PBS中平衡的Superdex20026／60柱完成进一步纯化。
[0242] 前导结合蛋白的热稳定性
[0243] 16个候选结合蛋白的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)进行测量。对于Tm测量，DSC是比用于高通量筛选的Thermoflour分析更精确的分析方法。每个样品用pH7.4的PBS彻底透析并稀释至1mg／mL的浓度。使用配有自动取样机的VP DSC型仪器(Microcal)测量这些样品的熔融温度。以1℃／分钟的速率将样品从10℃加热至95℃。从样品扫描中减去在每个样品扫描之间收集的仅有缓冲液的扫描，从而计算积分基线。将数据拟合到双相去折叠模型中，并且在表7中给出结果。分析的结合蛋白表现出48℃至85℃的广泛熔融温度。
[0244] 人IL13的结合亲和力
[0245] 重组人IL13(Peprotech)使用磺基-NHS-LCLC-生物素在冰上进行最低限度的生物素酰化并脱盐进入实验运行缓冲液中，其包含10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4，0.01％Tween-20，和0.1mg／mL BSA。生物素酰化的IL13以三个不同的表面密度(约150、50、和25RU)，在三个不同的BIAcore SA(链霉抗生物素蛋白)传感器芯片上捕集。在三个不同密度的IL13表面上测试40nM(作为3倍倍比稀释的最高浓度)的每个结合蛋白样品。监测最高浓度的结合蛋白样品的解离相一小时。来自每个不同密度表面的响应数据进行全面拟合以取得对动力学和亲和力常数的估计，它们在下表7中提供。
[0246] 表7-结合蛋白的生物物理表征
[0247]
[0248] IL13依赖的活性的中和
[0249] 如上所述使用80pM IL13测定每个结合蛋白样品抑制IL13依赖的STAT6磷酸化的活性。数据在表7中示出。同样地，测定每个结合蛋白样品由来自食蟹猴的IL13刺激的抑制STAT6磷酸化的能力，从而证实与这一物种的交叉反应性，用于未来的毒理学和药代动力学研究。从大肠杆菌中表达并纯化重组食蟹猴IL13，其为一种SUMO-标记的融合蛋白。在准备进行抑制测定时，SUMO-标记随后从IL13中酶促裂解。如下测定食蟹猴IL13的中和：在第1天，将细胞置于96-孔细胞培养板上24小时，细胞密度为在100uL细胞培养基(DMEM，具有4.5g/L葡萄糖(11995，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％加热灭活的FBS(10082，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10μg／mL杀稻瘟菌素(Invivogen)，和
100μg／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×105／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)重组食蟹猴IL13预混的合适浓度AR蛋白的100μL细胞培养基加到细胞中。所述板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40μL各个细胞上清液与160μL Quanti-Blue (Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养
2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。食蟹猴IL13抑制的结果在下表8中给出。
100μg／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×105／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)重组食蟹猴IL13预混的合适浓度AR蛋白的100μL细胞培养基加到细胞中。所述板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40μL各个细胞上清液与160μL Quanti-Blue (Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养
2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。食蟹猴IL13抑制的结果在下表8中给出。
[0250] IL13依赖的TARC生产
[0251] 来自A549细胞(人肺部恶性肿瘤来源的细胞系)的TARC(CCL17)释放可用IL13刺激。
[0252] 如下测定每个结合蛋白在A549细胞中对IL13依赖的TARC产生的抑制：在第1天，6
将细胞置于96-孔培养板上，以1.0×10 ／mL的密度，在200μL细胞培养基(alphaMEM with GlutaMax，+10％加热灭活的FBS，1X丙酮酸钠，和1X MEM NEAA(Gibco))中过夜。这种培养基也用作测定培养基。在第2天，细胞用200μL培养基洗涤一次，并且用与合适浓度结合蛋白预混的、包含200ng/mL(11nM)重组人TNF-α和1ng／mL(80pM)重组IL13的200μL的培养基刺激。该板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收获上清液并贮存在-80℃用于进一步分析。使用一种试剂盒，根据制造商规程测量样品中的人CCL17／TARC Duo Set ELISA(R&D Systems)，并且其中样品以1∶5的稀释度使用。数据作为结合蛋白浓度的函数绘出曲线图，并且使用PRIZM软件(GraphPad PRISM)拟合到S形剂量效应中以测定IC50值(下表8)。
将细胞置于96-孔培养板上，以1.0×10 ／mL的密度，在200μL细胞培养基(alphaMEM with GlutaMax，+10％加热灭活的FBS，1X丙酮酸钠，和1X MEM NEAA(Gibco))中过夜。这种培养基也用作测定培养基。在第2天，细胞用200μL培养基洗涤一次，并且用与合适浓度结合蛋白预混的、包含200ng/mL(11nM)重组人TNF-α和1ng／mL(80pM)重组IL13的200μL的培养基刺激。该板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收获上清液并贮存在-80℃用于进一步分析。使用一种试剂盒，根据制造商规程测量样品中的人CCL17／TARC Duo Set ELISA(R&D Systems)，并且其中样品以1∶5的稀释度使用。数据作为结合蛋白浓度的函数绘出曲线图，并且使用PRIZM软件(GraphPad PRISM)拟合到S形剂量效应中以测定IC50值(下表8)。
[0253] IL13：IL13Rα2结合
[0254] 结合蛋白对IL13与Rα2结合的抑制使用根据制造商规程结合到羧化的Luminex微球上的IL13Rα2-Fc(R&D Systems)进行评估。为了生物素酰化IL13，重组人IL13R130Q(Peprotech)以4∶1的比率，使用EZ-Link NHS-LC-Biotin(Pierce，#21336)在室温下生物素酰化2小时。蛋白在PBS中透析过夜以除去过多的生物素酰化试剂。对于中和实验，将50μl的5000个IL13Rα2-Fc结合小珠加到96-孔过滤板(Millipore)的每个孔中。1ng／ml(80pM)的50μl生物素酰化人IL13与在Luminex测定缓冲液(PBS，1％BSA，pH7.4)中适当稀释的结合蛋白混合。板在室温下，在板摇动器上避光培养1小时，将板摇动器设定为剧烈摇动以避免小珠聚集。板使用真空歧管用150μl洗涤缓冲液(PBS，
1％BSA，pH7.4.，0.05％Tween-20)洗涤3次，随后加入50μl链霉抗生物素蛋白PE，浓度为25μg／mL，并且在室温下培养20分钟。再次洗涤板并加入100μl鞘液，并且将板置于摇动器上1分钟。使用 100系统读板；将数据作为结合蛋白浓度的函数绘出
曲线图。使用PRIZM软件(GraphPAD PRIZM)，将数据拟合到S形剂量效应的式中确定IC50值。前导结合蛋白的抑制常数在下表中列出。
1％BSA，pH7.4.，0.05％Tween-20)洗涤3次，随后加入50μl链霉抗生物素蛋白PE，浓度为25μg／mL，并且在室温下培养20分钟。再次洗涤板并加入100μl鞘液，并且将板置于摇动器上1分钟。使用 100系统读板；将数据作为结合蛋白浓度的函数绘出
曲线图。使用PRIZM软件(GraphPAD PRIZM)，将数据拟合到S形剂量效应的式中确定IC50值。前导结合蛋白的抑制常数在下表中列出。
[0255] 表8-IL13依赖的活性中和
[0256]
[0257]
[0258] AR蛋白组合物
[0259] 分析2F1和16个前导抗人IL13结合蛋白(其中每个结合蛋白符合(N-Cap)-(AR)n-(C-Cap)的形式，其中n＝2或3)的锚蛋白重复结构域序列。
[0260] 发现2F1和附加的16个结合蛋白提供46个不同的AR模块，它们在下文序列表中列出，其中点指示某个AR在其位点上存在的氨基酸对应于AR重复基序(SEQ ID NO：1)的对应氨基酸。在一些情况下，其中在选择的结合蛋白序列中观察到框架突变，它们被标明。在一些情况下，在核糖体展示选择过程中出现删除；这些删除用破折号(-)标明。结合蛋白
10A6仅包含2个AR。在所有情况下，C-Cap序列在最终AR的残基33后立即开始。
10A6仅包含2个AR。在所有情况下，C-Cap序列在最终AR的残基33后立即开始。
[0261] 每个结合蛋白的每个结合结构域串联AR单元(AR1-AR2-AR3)的组合物在下文(下表9)列出
[0262] 表9结合蛋白组合物
[0263]IL13结合蛋白 AR1SEQ ID NO： AR2SEQ ID NO： AR3SEQ ID NO：
6G9 109 127 144
7G11 110 128 145
9F8 111 129 145
10A6 112 130 不存在
5B9 113 131 146
7D2 114 132 147
6G11 115 133 148
7D7 116 134 149
5D12 117 135 150
5D2 118 136 145
7H3 119 137 145
5D3 120 138 145
5H7 121 139 151
9E11 122 140 152
6D4 123 141 153
7C6 124 142 154
2F1 125 143 155
6G9 109 127 144
7G11 110 128 145
9F8 111 129 145
10A6 112 130 不存在
5B9 113 131 146
7D2 114 132 147
6G11 115 133 148
7D7 116 134 149
5D12 117 135 150
5D2 118 136 145
7H3 119 137 145
5D3 120 138 145
5H7 121 139 151
9E11 122 140 152
6D4 123 141 153
7C6 124 142 154
2F1 125 143 155
[0264] 在比较由17个独有序列(SEQ ID NO：9-25)表示的AR1模块(下表10)时，优选在基序位点4(X3)的Y或F，在位点6(X4)的S，在位点14(X5)的R，在位点15(X6)的H，和在位点27(X7)的H或Y。
[0265] 因此，IL13结合AR1模块可通过下式表示
[0266] X1DX2-[F，Y]-GSTPLHLAA-RH-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自如下所示的残基，并且X7可为H、N、或Y(AR1-C，SEQ ID NO：156)。作为另外一种选择，AR1基序可选自由下式表示的氨基酸序列：
[0267] TDYGSTPLHLAARHGHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X7可为H、N、或Y(AR1-F，SEQ ID NO：157)。
[0268] 表10
[0269]
[0270] 在比较由17个独有序列(SEQ ID NO：127-143)表示的17个AR2模块时(下表11)，在X1处无显著残基(高于50％的频率)，然而，在AR序列基序的随机位点X3、X4、X5和X6处存在最频繁使用的氨基酸。在相邻可变位点(X2X3和X5X6)处的氨基酸对的使用也被制表，如下表所示。FI是X2X3最频繁出现的氨基酸对。因此，IL13-结合AR2模块可通过下式表示(其中括号内的残基是该位点的替代氨基酸)：
[0271] X1DFIG DTPLHLAAY-X6-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自N、T、A、D、K、E、H、M、和F；X6可为H或R；并且X7可为H、N、或Y(AR2-C，SEQ ID NO：158)。作为另外一种选择，AR2序列可选自由下式表示的氨基酸序列
[0272] [A，D，N，T，K]-DFIG DTPLHLAAY-[H，R]-GHLEIVEVLLK-[H，N，Y]-GADVNA(AR2，SEQ ID NO：159)。
[0273] 表11
[0274]
[0275] 在比较由12个独有序列(SEQ ID NO：144-155)表示的16个AR3模块时，在AR序列基序的X1、X2、X5、或X6中任何一个处无显著残基(高于50％的频率)，然而，X3是最频繁的T，并且X4是最频繁的E。在相邻可变位点(X2X3和X5X6)处的氨基酸对的使用也被制表，如下表所示。IT是X2X3最频繁出现的氨基酸对。SM是X5X6最频繁出现的氨基酸对。因此，IL13-结合AR3模块可通过以下氨基酸序列表示：
[0276] X1D-X2TG-E-TPLHLAA-[X5X6]-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1和X2选自下表12中的残基，并且X5X6选自氨基酸对SM、HL、和YH；并且X7可为H、N、或Y(AR3-C，SEQ ID NO：160)。作为另外一种选择，AR3基序可选自由下式表示的氨基酸序列：
[0277] X1D-IT-G-E-TPLHLAA-SM-GHLEIVEVLLKX7GADVNA，其中X1选自在下表12中列出的残基，并且X7可为H、N、或Y(AR3-F，SEQ ID NO：161)。
[0278] 表12
[0279]
[0280]
[0281] 实例3：前导分子的优化
[0282] 为了在优化选择的IL4-结合AR蛋白以用于大规模制造、配制、和稳定性，必须突变存在于SEQ ID NO：1的可变残基X1-X6中的多个残基。例如，纯化重组蛋白的氧化可导致产物异质性和活性丧失。未来减少这些修饰的风险，存在于可变序列中的Met残基突变成相似化学组成的氨基酸或那些存在于其它关联IL4结合AR蛋白的序列中的氨基酸。此外，制造多个突变以消除免疫原性的潜在位点，这通过存在的潜在T-细胞表位进行评估。最后，锚蛋白重复结构框架的随机氨基酸改变偶然地在用于核糖体展示选择的PCR步骤中产生。此类残基回复成设计的锚蛋白重复序列的共有序列。
[0283] AR蛋白C06_44C12通过突变AR2位点4(X3)，使其从Met突变成Leu进行工程化，从而避免在IL4结合位点中的潜在氧化。AR2和AR3的位点27(X7)从Tyr突变成Ala，从而消除基于相邻上游和下游残基分析的潜在T-细胞表位，并且去除潜在的去酰胺化位点。对C06_28E5进行相似的突变，将AR1和AR2的位点27从Tyr变成Ala。对于C06_53G6，N-cap的位点1从Asn变成Asp以恢复锚蛋白共有序列，并且如上所述将AR1的位点27从Tyr突变成Ala。
[0284] 在优化后，这三个蛋白基于基序式的AR模块(SEQ ID NO：1)是：
[0285] 表13
[0286]基序名称 位点编号 AR1 AR2 AR3
X1 1 A，L，T A，N，Q T，V，Y
X2X3 3-4 DS，DW NL，RL，AI IS，LA，LH
X4 6 D，I，Y D F，I，V
X5X6 14-15 ED，TD WT，FV，LY FY，FW
X7 27 A，H A，Y A，H
X1 1 A，L，T A，N，Q T，V，Y
X2X3 3-4 DS，DW NL，RL，AI IS，LA，LH
X4 6 D，I，Y D F，I，V
X5X6 14-15 ED，TD WT，FV，LY FY，FW
X7 27 A，H A，Y A，H
[0287] 本文描述的突变以单独或组合方式形成，用于确定每个突变对活性的效应。测定指定序列的工程化AR蛋白与重组IL4的结合、对IL4依赖的信号转导的抑制、SEC溶解度、并通过DSC测定熔融温度(表14)。
[0288] 表14.抗IL4AR蛋白优化的活性
[0289]
[0290] 用于优化的IL4结合蛋白的位点串联AR单元用AR式表示：
[0291] [A，L，T]-DD-[S，W]-G-[D，I，Y]-TPLHLAA-[E，T]-DGHLEIVEVLLK-[A，H]-GADVNA(AR1-O，SEQ ID NO：88)、
[0292] [A，N，Q]-D-[NL，RL，AI]-GDTPLHLAA-[WT,FV，LY]-GHLEIVEVLLK-[A，Y]-GADVNA(AR2-O，SEQ ID NO：89)、和
[0293] [T，V，Y]-D-[IS，LA，LH]-G-[F，I,V]-TPLHLAAF-[W，Y]-GHLEIVEVLLK-[A，H]-GADVNA(AR3-O，SEQ ID NO：90)；
[0294] 其中括号内的选项代表表现出期望生物活性的三个优化结合蛋白中可供选择的氨基酸残基或残基对。因此，可通过以指定顺序的串联定位用这些AR基序构建IL4结合蛋白。
[0295] IL13结合蛋白
[0296] 三个IL13-结合候选结合蛋白；7G11、6G9和9F8经选择用于蛋白优化，以供大规模制造、配制、和稳定性。每个候选通过多轮定点诱变进行修饰。
[0297] 设计已经发现一般来讲提高结合蛋白稳定性、降低可能的免疫原性、去除N-末端HIS标签、增强对N-末端甲硫氨酸的加工、或去除推定抗原结合位点中的氧化或去酰胺化可能位点的突变。引入所有最终分子的突变包括：N-Cap，位点3(G突变成D)，用于改善生物物理性能，将该突变引入所有前导候选分子并将C-cap的末端残基变成双丙氨酸。此外，发现候选6G9和9F8在模块中含有27Asn-Gly28二肽，并且因此取代了残基27。
[0298] 除了可遗传应用于所有结合蛋白的上述突变之外，引入对结合蛋白6G9、7G11、和9F8活性特异性的多个突变。纯化重组蛋白的氧化可导致产物异质性以及活性损失。为了减少这些修饰的风险，存在于锚蛋白重复模块6G9、9F8和7G11中的Met和Cys残基突变成相似化学组成的氨基酸或存在于其它IL13结合蛋白中的那些。另外，制造在这些结合蛋白的锚蛋白重复结构中的多个突变以去除通过T-细胞活化测定筛选表明的可能免疫原性位点。最后，对于在大肠杆菌(E.coli)中表达的蛋白，N-末端甲硫氨酸残基的加工可能受到紧接着N-末端甲硫氨酸的氨基酸的影响，Hirel等人，PNAS86：8247-82511989。期望这种甲硫氨酸残基的总体加工提高纯化产物的同质性。在N-Cap中，位点1从天冬氨酸变成甘氨酸或丙氨酸，从而确定是否N-末端甲硫氨酸残基当在无HIS标签的情况下表达时可进行高效的加工。在对6G9、9F8和7G11进行检查的特定重复模块位点中的结合蛋白特异性突变的概述在表15中示出。
[0299] 以单独或组合方式制造上述遗传和特异性突变，从而确定每个改变对活性的影响结果。测定工程化的结合蛋白与重组IL13的结合、对IL13依赖的信号转导的抑制、并通过DSC测定熔融温度。所有候选保持通过SEC确定的单体形式。在大多数情况下，突变体的活性和亲和力不与亲本分子有显著差异。三个亲本和最终优化的前导候选中每一个的性能在表15中示出。
[0300] 表15。
[0301]
[0302]
[0303] 前导候选的亲和力分析
[0304] 描述多种工程化结合蛋白分子与人IL13结合的完整动力学数据使用类似于上述用于单点亲和力分析的方法进行测量。简而言之，链霉抗生物素蛋白(Pierce)在ProteOn GLC芯片的所有六个通道上经由氨基偶联(pH5.0)固定至相似水平(～1800RUs)。生物素酰化的hIL13在不同通道上以不同的表面密度(600～100RUs)被捕集。在不同密度的IL13表面上测试起始于以3倍浓度梯度稀释的40nM的蛋白结合；注入缓冲液样品以监测基线稳定性。以100μl／min的流量监测每个结合蛋白样品的所有浓度的解离相一小时。来自不同密度表面的所有浓度梯度的响应数据全部拟合到1∶1的简单langmuir结合模型中以提取出动力学(kon，koff)和亲和力(KD)常数值，在表16中提供。
[0305] 未标记结合蛋白的纯化
[0306] 通过标准PCR方法将无HIS标签的结合蛋白亚克隆进pET27载体中并在BL21-GOLD(DE3)大肠杆菌菌株(Stratagene)中表达，该载体经修饰以包括不依赖连接酶的克隆位点。通过在30℃下加入1mM IPTG诱导表达，随后在Terrific培养基中进行表达。
在诱导后5小时通过离心收获细胞并冻存在-20℃。将冻存的细胞沉淀物重悬在pH6.4，包含20mM组氨酸的溶解缓冲液中，浓度为0.1g沉淀物／mL缓冲液。细胞溶解通过超声处理完成，并且溶解物通过以>15,000×g离心并通过0.45um过滤器过滤达到澄清。将在溶解缓冲液中澄清的溶解物加载到5mL HiTrap Q FF柱(GE Healthcare)上。从Q柱中以从溶解缓冲液至缓冲液B的线性梯度、20mM组氨酸(pH6.4)与600mM氯化钠，经过20倍柱体积洗脱结合蛋白。通过SDS-PAGE分析级分，并且收集包含结合蛋白的那些并加热到70℃保持20分钟，随后置于冰上30分钟。通过离心去除沉淀的污染蛋白。包含结合蛋白的沉淀步骤的上清液随后通过超滤浓缩并在Superdex7516／60柱(GE Healthcare)上用PBS作为移动相进行纯化。对于具有较低熔融温度的结合蛋白如9F8r3，略去在初始离子交换色谱步骤后的加热步骤。每个构建体的生物物理性能和生物活性测量在表16中概述。
在诱导后5小时通过离心收获细胞并冻存在-20℃。将冻存的细胞沉淀物重悬在pH6.4，包含20mM组氨酸的溶解缓冲液中，浓度为0.1g沉淀物／mL缓冲液。细胞溶解通过超声处理完成，并且溶解物通过以>15,000×g离心并通过0.45um过滤器过滤达到澄清。将在溶解缓冲液中澄清的溶解物加载到5mL HiTrap Q FF柱(GE Healthcare)上。从Q柱中以从溶解缓冲液至缓冲液B的线性梯度、20mM组氨酸(pH6.4)与600mM氯化钠，经过20倍柱体积洗脱结合蛋白。通过SDS-PAGE分析级分，并且收集包含结合蛋白的那些并加热到70℃保持20分钟，随后置于冰上30分钟。通过离心去除沉淀的污染蛋白。包含结合蛋白的沉淀步骤的上清液随后通过超滤浓缩并在Superdex7516／60柱(GE Healthcare)上用PBS作为移动相进行纯化。对于具有较低熔融温度的结合蛋白如9F8r3，略去在初始离子交换色谱步骤后的加热步骤。每个构建体的生物物理性能和生物活性测量在表16中概述。
[0307] 表16。
[0308]
[0309] 用于优化的IL13结合蛋白的位点串联AR单元用AR式表示：
[0310] [R，S，T]-D-[S，W]-[Y，F]-[D，G]-STPLHLAAR-[E，H]-GHLEIVEVLLKYGADVNA(AR1-O，SEQ ID NO：168)；
[0311] [A，F]-DFIGDTPLHLAAYRGHLEIVEVLLKYGADVNA(AR2-O，SEQ ID NO：169)、和[0312] [S，D]-D-[HG，IT]-G-[S，D]-TPLHLAA-[QI，ST]-GHLEIVEVLLKHGADVNA(AR3-O，SEQ ID NO：170)；
[0313] 其中括号内的选项代表表现出期望生物活性的三个优化结合蛋白中可供选择的氨基酸残基或残基对。因此，可通过以指定顺序的串联定位用这些AR基序构建IL13结合蛋白。根据式N-Cap-[AR]n-C-Cap的IL13结合蛋白另外包括一个N-Cap，其选自SEQ ID NO：2或其变体，例如通过式SEQ ID NO：171例示的那些，以及一个C-Cap，例如SEQ ID NO：3或
172或它们的变体。
172或它们的变体。
[0314] 实例4：二价AR蛋白构建体
[0315] 在实例3中描述的三个IL4-结合AR蛋白分子与以前发现的抗-IL13AR蛋白(称为6G9_V1(SEQ ID NO：94))组合以产生双特异性分子，其能够阻止人IL13和IL4的信号转导。合成每个AR蛋白的核酸序列以包括编码在2个AR蛋白之间的(GGGGS)4接头的序列。具有式(GGGGS)n的备选GS接头可用与接合AR蛋白。所述接头的长度可随对照结合结构域可用性、空间和所述分子的其它性能而变化。合成了总共6个双特异性AR蛋白代表连接至IL4结合蛋白N-末端或IL4结合蛋白C-末端的6G9(SEQ ID NO：95-100)以检验相对于彼此的所述AR蛋白的方向对活性的影响。每个编码核酸序列被克隆至所述表达载体中，并通过如上所述IMAC色谱法对所述单特异性AR蛋白进行纯化。
[0316] 评估所述双特异性AR蛋白结合至hIL13和IL4以及抑制IL13和IL4依赖的信号转导的能力。
[0317] 在HEK-Blue STAT-6细胞中，IL13活化IL13RA1：IL4R复合物(2型受体)用于诱导胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报道基因经由STAT-6信号转导途径的分泌。使用HEK-Blue STAT-6细胞用于IL13依赖的STAT6活化的测定法是可商购获得的(InVivogen，SanDiego，CA)。为了使高亲和力和低亲和力结合蛋白之间能够发生分化，选择最佳的粗提物稀释度(1∶5200)。如下使用蛋白粗提物刺激HEK-Blue STAT-6细胞：在第1天，将细胞置于96-孔细胞培养板上24小时，细胞密度为在100uL细胞培养基(DMEM，具有4.5g／L葡萄糖(11995，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％加热灭活的FBS(10082，Gibco／Invitrogen，Carlsbad，CA)，10微克／mL杀稻瘟菌素(Invivogen)，和100微
5
克／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×10 ／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)人
IL13(Peprotech)或食蟹猴IL13预混的合适浓度AR蛋白的100微升细胞培养基加到细胞中。所述板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40微升各个细胞上清液与160微升Quanti-Blue(Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。
5
克／mL Zeocin(Invivogen)中2.5×10 ／mL。在第2天，将包含与1ng／mL(80pM)人
IL13(Peprotech)或食蟹猴IL13预混的合适浓度AR蛋白的100微升细胞培养基加到细胞中。所述板在37℃和5％CO2条件下培养24小时。为了测量分泌的雏形碱性磷酸酶，将40微升各个细胞上清液与160微升Quanti-Blue(Invivogen)在透明的96-孔板中混合。将该板在37℃下培养2小时并使用板读数计读出650nm的吸光度。
[0318] 不论所述构建体的方向，所有所述双特异性AR蛋白保留了它们以高亲和力与hIL13和IL4(表17)结合的能力以及抑制ILl3和IL4依赖的信号传递(表18和19)的能力。
[0319] 表17：双特异性AR蛋白的生物物理性能
[0320]
[0321] 表18：通过双特异性AR蛋白中和IL13依赖的活性
[0322]
[0323] 表19：通过双特异性AR蛋白中和IL4依赖的活性
[0324]
[0325] 实例5：双特异性AR蛋白的优化
[0326] 除了在基于式N-Cap-[AR]n-C-cap建立的文库中的不同位点的残基的替换以及如上所述的那些突变，可掺入通用的AR蛋白突变。这些突变可应用于任何AR蛋白分子，其中这些突变位于在如下面表20中概述的所有AR蛋白共有序列的位点上。
[0327] 表20：蛋白突变
[0328]模块 位置 可能的残基 基本原理
N-Cap 1 G，A 加工N-末端甲硫氨酸
N-Cap 3 D 稳定AR蛋白
AR 27 Y，H 减少去酰胺化
C-Cap 27 A 去除限制性位点／恢复AR模块
C-Cap 28 A 去除限制性位点／恢复AR模块
N-Cap 1 G，A 加工N-末端甲硫氨酸
N-Cap 3 D 稳定AR蛋白
AR 27 Y，H 减少去酰胺化
C-Cap 27 A 去除限制性位点／恢复AR模块
C-Cap 28 A 去除限制性位点／恢复AR模块
[0329] 对于在大肠杆菌(E.coli)中表达的蛋白，N-末端甲硫氨酸残基的加工可能受到紧接着N-末端甲硫氨酸的氨基酸的影响(Hirel等人，Proc Natl Acad Sci U S A86：8247-51，1989)。期望这种甲硫氨酸残基的总体加工提高纯化产物的同质性。在N-Cap中，位点1从天冬氨酸变成甘氨酸或丙氨酸，从而确定是否N-末端甲硫氨酸残基当在无HIS标签的情况下表达时可进行高效的加工。N-cap的位点3从Gly突变成Asp，因为已经发现这一突变稳定AR蛋白共有序列，如WO201／0060748所述。所述AR模块的位点27的多样性限于所述AR蛋白文库设计中的Asn、Tyr或His(Binz等人Nature Biotech22：575-582，
2004)。因为框架的位点28是Gly，存在分离由序列27Asn-Gly28组成的AR蛋白的可能性。
Asn-Gly二肽易发生去酰胺化反应(Geiger和Clarke，J Biol Chem262：785-94，1987)。因此，分离的Asn-Gly序列的位点27一般来讲可突变为Tyr或His。此外，IL4-通过核糖体展示选择的目标结合AR蛋白以C-cap中的氨基酸序列Leu-Asn结尾。这个序列附接到AR蛋白上以提供用于亚克隆到表达载体中的限制性位点用于筛选。这些位点的优选氨基酸序列是Ala-Ala。C-cap已经经进一步突变以获得稳定性和优化表达特性(SEQ ID NO：103)。
2004)。因为框架的位点28是Gly，存在分离由序列27Asn-Gly28组成的AR蛋白的可能性。
Asn-Gly二肽易发生去酰胺化反应(Geiger和Clarke，J Biol Chem262：785-94，1987)。因此，分离的Asn-Gly序列的位点27一般来讲可突变为Tyr或His。此外，IL4-通过核糖体展示选择的目标结合AR蛋白以C-cap中的氨基酸序列Leu-Asn结尾。这个序列附接到AR蛋白上以提供用于亚克隆到表达载体中的限制性位点用于筛选。这些位点的优选氨基酸序列是Ala-Ala。C-cap已经经进一步突变以获得稳定性和优化表达特性(SEQ ID NO：103)。
[0330] 一个示例性的优化双特异性IL4／IL13结合蛋白以SEQ ID NO：104给出。
[0331] 实例6：生成抗小鼠IL4AR蛋白替代品
[0332] 由于人的和小鼠的IL4仅共有41％序列同一性，经选择抗人IL4的AR蛋白不太可能与小鼠IL4交叉反应。因此，为实现在小鼠模型中的研究(其中小鼠IL-4已被证明在哮喘的病理中发挥作用)，有必要选择以亚纳摩尔亲和力与小鼠IL4特异性地结合的AR蛋白。采用生物素酰化的小鼠IL4(Peprotech)随后在亲和素珠上捕获，用所述N2C和N3C AR蛋白文库完成五轮核糖体展示选择(Binz等人，Nat Biotechnol22：575-82，2004)。为了鉴定高亲和力结合剂，如下实施解离率选择方法：将生物素酰化的mIL4(5nM)与经核糖体展示的AR蛋白结合2或6小时，随后与作为竞争者的2.1mM未生物素酰化的IL4孵育4或16小时。在亲和素颗粒上捕获剩余的附接到生物素酰化的mIL4的慢解离率的AR蛋白。在标准条件下进行一轮附加的核糖体展示选择以富集所述高亲和力结合剂。利用纯化的AR蛋白对于MIL4依赖的HT2增殖的抑制作用来筛选选择的AR蛋白。采用制造商的建议(RPMI1640，2mM L-谷氨酰胺，1.5g／L碳酸氢钠，4.5g／L葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM丙酮酸钠，0.05mM2-巯基乙醇，100-200IU／ml IL-2，和10％FBS)培养HT2细胞、分离自小鼠TM
脾脏的T-淋巴细胞(ATCC，CRL-1841 )。对于增殖测定，将所述细胞从烧瓶中移出，在由不含IL-2的培养基组成的测定缓冲液中洗4次，以50μL中5.0×104细胞／mL的密度置于不透明底的96-孔板上。用74pM IL4和适宜浓度的AR蛋白处理细胞，在37℃、5％CO2下孵育48小时。细胞滴度(Cell Titer)Glo(Promega G7571)被添加至测试板(100μL)，加盖，在室温下放置在摇动器上40分钟。采用SpectraMax M5板读数计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)从顶部读数测量发光。以对于mIL4的亲和力、mIL4结合至IL4R的中和作用、mIL4依赖的HT2增殖的中和作用、热稳定性以及通过尺寸排阻色谱法的单分散性计，AR蛋白C06_21H2(SEQ ID NO：105)被选作mIL4结合的AR蛋白替代品用于体内工作。
脾脏的T-淋巴细胞(ATCC，CRL-1841 )。对于增殖测定，将所述细胞从烧瓶中移出，在由不含IL-2的培养基组成的测定缓冲液中洗4次，以50μL中5.0×104细胞／mL的密度置于不透明底的96-孔板上。用74pM IL4和适宜浓度的AR蛋白处理细胞，在37℃、5％CO2下孵育48小时。细胞滴度(Cell Titer)Glo(Promega G7571)被添加至测试板(100μL)，加盖，在室温下放置在摇动器上40分钟。采用SpectraMax M5板读数计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)从顶部读数测量发光。以对于mIL4的亲和力、mIL4结合至IL4R的中和作用、mIL4依赖的HT2增殖的中和作用、热稳定性以及通过尺寸排阻色谱法的单分散性计，AR蛋白C06_21H2(SEQ ID NO：105)被选作mIL4结合的AR蛋白替代品用于体内工作。
[0333] 双特异性活性
[0334] 为了测试在小鼠哮喘模型中IL4和IL13抑制的同时抑制效果，连接IC06_21H2和C02_11G11(SEQ ID NO：106)的双特异性AR蛋白、强效小鼠IL13抑制剂被工程化，以经由(GGGGS)4多肽接头连接C06_21H2的N-末端与C02_11G11的C-末端。如上所述，N-末端组氨酸标记被添加至N-末端以辅助纯化。
[0335] 实例7：11G11-21H2的雾化
[0336] 为了评估使用啮齿动物吸入系统经由雾化递送AR蛋白的可能，用双特异性AR蛋白(11G11-21H2)的替代品进行雾化稳定性研究。用连接至具有20psi的入口压力的压缩空气的Pari LC Plus喷射式喷雾器生成气溶胶。这产生～5L／min的输出气流。在PBS中制备成20mg／mL的11G1-21H2溶液制剂。使气溶胶定向通过大约24时的1.58-cm(直径)的输送管线。所述输送管线配有大约10L／min的送风稀释气流。气溶胶运输至24口鼻式啮齿动物暴露腔室的绕流中。所述腔室排气流速被调节至大约20L／min的体积流量，导致所述腔室对于环境条件稍微负压。气溶胶以1.0L／min的标称体积流量被收集至47-mm Zefluor过滤器上。回收自过滤器的样品用尺寸排阻色谱法(SEC)以及在280纳米的吸光度进行分析用以评估可能的聚集体和AR蛋白浓度。
[0337] 用Mercer式七级多级冲击取样器(IN-TOX Products，Inc.，Albuquerque，NM)测量粒度分布。如气溶胶浓度所需，以2L／min的标称流量在1至2分钟之间收集冲击取样样品。分析冲击取样数据以测定质量中值空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)。为了从过滤器提取所述样品，将它们卷起并放置在玻璃小瓶中。每个小瓶中加入四毫升的PBS。密封所述小瓶并放置在旋转器上以40rpm转45分钟。将样品转移至HPLC小瓶中用于分析。然后采用尺寸排阻色谱法(SEC)分析所述样品。分析显示在30分钟和1小时以浓缩气溶胶收集的雾化的AR蛋白11G11-21H2，主峰洗脱在6.09分钟处。在雾化后样品杯中残留的11G11-21H2的样品中；主峰洗脱在5.9分钟处。峰强度的增加证实了采用更长的雾化时间在样品浓度上的样品增加。
[0338] 如在前所述分别对所述样品进行了IL13和IL4依赖的Stat6以及IL4依赖的HT2增殖测定中的活性的测试。在测试之前，用A280评估雾化的AR蛋白浓度或保持在杯中的AR蛋白浓度，使用IL13STAT6激活测定(图2A)或IL4依赖的HT2增殖测定(图2B)测量其活性；预雾化的AR蛋白，方块符号；雾化的AR蛋白，三角符号；保留的AR蛋白，菱形符号。
这些实验显示所述双特异性AR蛋白构建体，11G11-21H2，通过SEC(证实)的单分散性并保留了两者的活性。在图3中显示的多级冲击数据表明所述雾化的AR蛋白11G11-21H2具有适于啮齿动物暴露的2.84μm的MMAD，1.66的几何标准偏差(GSD)。
这些实验显示所述双特异性AR蛋白构建体，11G11-21H2，通过SEC(证实)的单分散性并保留了两者的活性。在图3中显示的多级冲击数据表明所述雾化的AR蛋白11G11-21H2具有适于啮齿动物暴露的2.84μm的MMAD，1.66的几何标准偏差(GSD)。
[0339] 实例8：11G11-21H2的药代动力学特征
[0340] 在健康的或卵清蛋白致敏并用卵清蛋白激发以模拟哮喘肺部的小鼠中，对以4mg／kg、经由气管内滴入递送蛋白测定所述11G11-21H2的药代动力学特征。用3-5％异氟醚麻醉动物直至它们对挤脚没有反应并且对导管插入气管没有反应。将20标准或更小的导管插入气管，然后以平稳的方式将化合物滴入肺部。在单次滴入过程中输入溶液的体积大约为50μL。在以n=5小鼠／时间点的多个时间点处收集数据。使用AR蛋白特异性抗体通过ELISA从支气管肺泡灌洗(BAL)、肺组织匀浆和血清测定所述11G11-21H2构建体的浓度(图4)。在正常和患病小鼠中获得的药代动力学特征没有显著的差异，在小鼠支气管肺泡灌洗(BAL)和肺中预测的终末半衰期是～6-8小时。如通过血清浓度评估的总体内吸性暴露显著地低于在肺中获得的暴露。在tmax处，BAL水平平均大于40μg／ml而血清水平少于100ng／mL(相对于BAL浓度低大约400倍)。在BAL样品、肺组织匀浆或血清中用ELISA评估AR蛋白浓度。超过24小时的血清浓度低于所述测定的检测水平。
[0341] 用于对比，由于它们的小体积，通过静脉注射全身给药的AR蛋白以少于30分钟的半衰期从循环系统中清除(数据没有显示)。
[0342] 实例9：11G11-21H2的体内数据
[0343] 为了评价11G11-21H2对IL4和IL13依赖的体内结果的抑制作用，使用了小鼠急性OVA致敏和激发模型。简而言之，在第0天和第7天，8-10周大的雌性BALB／c小鼠采用腹膜内注射无菌水中的卵清蛋白(OVA，10微克)和铝氢氧化物(Alum，2mg)的混合物免疫。然后用卵清蛋白在鼻内激发小鼠2天，在14天开始，在16天处死用于分析。对于非致敏的组，仅用无菌水免疫小鼠并用PBS通过吸入进行处理(载体对照)。对于所有其他组，小鼠是OVA致敏的，用11G11(抗IL13AR蛋白)、21H2(抗IL4AR蛋白)、1G11-21H2(抗-IL4；抗IL13双特异性AR蛋白)或E3_5(非结合对照AR蛋白)以20mg/kg(单特异性)或40mg／
kg(双特异性)处理小鼠。每天1X经由气管内滴入递送11G11-21H2或E3_5，开始于OVA激发的前一天并至多至处死的前一天(13-16天)。最后一次OVA激发后的四十八小时，麻醉小鼠并通过全身体积描记法(Buxco)测试它们的肺部功能(对乙酰甲胆碱激发的反应)，然后立即处死。对BAL(1mL PBS)实施尸检以收集细胞，计算来自所有动物的液体、细胞数和差异，BAL上清液被冻存于-80℃。
kg(双特异性)处理小鼠。每天1X经由气管内滴入递送11G11-21H2或E3_5，开始于OVA激发的前一天并至多至处死的前一天(13-16天)。最后一次OVA激发后的四十八小时，麻醉小鼠并通过全身体积描记法(Buxco)测试它们的肺部功能(对乙酰甲胆碱激发的反应)，然后立即处死。对BAL(1mL PBS)实施尸检以收集细胞，计算来自所有动物的液体、细胞数和差异，BAL上清液被冻存于-80℃。
[0344] 如在图5中所示，11G11和11G11-21H2都抑制了响应于乙酰甲胆碱的OVA诱导的气道高反应性。此外使用mCNTX41311G11-21H2抑制OVA诱导的嗜酸性粒细胞募集到肺部阻断了IL4和IL13，与炎性疾病相关联的小鼠过敏原的标志如图6中所示。在这个模型中，嗜酸性粒细胞募集主要是TH2细胞因子(即IL4，IL13)依赖的。显示的数据是总细胞浸润的嗜酸性粒细胞百分比。
[0345] 实例10：IL13结合蛋白和食蟹猴IL-13的晶体结构
[0346] 介于IL13结合蛋白6G9(SEQ ID NO：162形成自SEQ ID NO：109，127和144中的ARs)和在双特异性IL4／IL13结合蛋白(SEQ ID NO：41，104和177)以及食蟹猴IL13中发现的所述复合物的晶体结构在 的分辨率下进行测定。已经鉴定了构象表位以及涉及靶识别的结合蛋白残基。
[0347] 使用以下缩写：HEPES：N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸；MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PEG：聚乙二醇；RMSD：均方根偏差；SEC：尺寸排阻色谱法；开发了结合蛋白6G9以高亲和力结合IL13，并通过其受体IL13Rα1／IL4Rα阻断信号。
[0348] 6G9以在皮摩尔的范围内的KD结合人IL13，并显示出对食蟹猴IL13的交叉反应性。为了深入了解其作用机制，结合蛋白6G9与食蟹猴IL13。形成复合物结晶。在 的分辨率下测定所述结构。
[0349] 蛋白
[0350] 带有N-末端SUMO标签的食蟹猴IL13在大肠杆菌(E.coli)中表达，用HisTrap纯化，SUMO标签裂解，以及在最终pH7.2的PBS缓冲液中SEC；Lot No.081126-CP00721y。
[0351] 复合物制备
[0352] 结合蛋白6G9在用20mM MES、pH6.5(缓冲液A)平衡的MonoQ HR5／5柱(GEHealthcare)上被进一步纯化。用40柱体积中的20mM MES，pH6.5，1M氯化钠(缓冲液B)的11-29％梯度进行洗脱。浓缩主峰组分并用于复合物形成。
[0353] 通过将6G9与过量IL13以摩尔比1∶1.1混合制备结合蛋白：IL13复合物，并在4℃孵育2小时。在Superdex200柱上的尺寸排阻色谱法(SEC)分离出未结合的物质。使用Amicon-Ultra5kDa装置将所述复合物浓缩在20mM HEPES pH7.5、100mM氯化钠中至
13.75mg／mL。
13.75mg／mL。
[0354] 结晶
[0355] 使用Oryx4机械手(robot)(Douglas Instruments)在20℃用蒸汽扩散方法进行所述复合物的结晶。所述实验由等体积的蛋白和储液组成，以坐滴形式在96-孔Corning3550板中。用PEGs套件(Qiagen)、内部筛选IH1和IH2、以及13.75mg／mL的蛋白复合物溶液实施初始筛选。板状叠层结晶出现自IH2条件A1-A4，其为0.1M乙酸钠缓冲液、pH4.5、18-25％PEG3350、以及0.2M的硫酸锂或0.2M硫酸铵。这些结晶被用于制备在
0.1M乙酸钠缓冲液、pH4.5、25％PEG3350、以及0.2M硫酸锂的稳定溶液中微籽晶矩阵筛选所用的微籽。使用0.2μL蛋白质，0.05μL微籽，0.15μL储液进行播种。稀释的蛋白复合物(4.8mg／mL)和50倍稀释的微籽被用于条件的优化。从0.1M乙酸钠、pH4.5、11％PEG3350、0.2M硫酸锂获得了X射线质量晶体。在表21中给出了所述晶体数据。
0.1M乙酸钠缓冲液、pH4.5、25％PEG3350、以及0.2M硫酸锂的稳定溶液中微籽晶矩阵筛选所用的微籽。使用0.2μL蛋白质，0.05μL微籽，0.15μL储液进行播种。稀释的蛋白复合物(4.8mg／mL)和50倍稀释的微籽被用于条件的优化。从0.1M乙酸钠、pH4.5、11％PEG3350、0.2M硫酸锂获得了X射线质量晶体。在表21中给出了所述晶体数据。
[0356] X射线数据收集和结构测定
[0357] 对于X射线数据收集，将晶体在包含0.1M乙酸钠、pH4.5、20％PEG3350、0.2M氯化锂、20％甘油的冷冻保护剂溶液中浸泡数秒，然后冻于液氮中。在瑞士光源同步加速器(Swiss Light Source synchrotron)上以超过180°晶体旋光度、每0.25°-图像0.25秒曝光收集衍射数据，并用程序XDS进行处理。X射线数据统计在表21中给出。
[0358] 表21.晶体数据，X射线数据和精化统计。
[0359]
[0360] 该 结 构 通 过 分 子 置 换 法 解 决。 结 合 蛋 白 6G9(DAR6G9XP01)和 人IL-13(I130062G02)的晶体结构被用作研究模型。用CCP4程序套件进行所有的晶体学计算。使用程序COOT进行模型调整。表21中给出精化统计结果。
[0361] 结合蛋白／IL13界面
[0362] 在图8中显示了所述复合物的晶体结构。结合蛋白6G9结合了IL13的螺旋A和D使得螺旋D契合所述结合蛋白分子的主沟。由所述锚蛋白重复结构的四个β-转角形成的脊契合螺旋A和D之间的空间。靶识别涉及所有4个β-转角和形成沟槽的5个螺旋中的4个。所述界面延伸并覆盖在每个分子上几乎
[0363] 与IL13的复合物中的结合蛋白结构和单独的结合蛋白结构的比较表明结合蛋白分子是相对刚性的。如图8所示在与靶(IL13)结合时，结合蛋白打开～3.5°。
[0364] 在脊处的分子间相互作用主要是疏水性的(图9)。它们涉及结合蛋白残基Ser45-Tyr46(β- 转 角 1)、Phe78-Ile79(β- 转 角 2)、Ile111-Va1112(β- 转 角 3)、Lys144-Phe145(β-转角4)。
[0365] 在结合蛋白的沟槽处的相互作用涉及疏水性的和带电的残基(图10)。与IL13的结合涉及了总计20个结合蛋白的残基，以 截断半径(图11)计。在IL13上的结合蛋白表位包括17个残基，10个来自螺旋D，7个来自螺旋A(图12)。在图12中所示序列与SEQ ID NO：101有1个残基的差异，因为所述序列的开始有个前导序列Pro残基(SEQ ID NO：101中没有)。
[0366] 在螺旋D的末端处的三个残基似乎有助于结合能的相当一部分：F107、R108和N113(每个氨基酸在位点上与在SEQ ID NO：101中的有1个氨基酸的差异，对于后者为F106、R107和N112)。后者提供了C-末端羧基基团，其形成了3个盐桥，对R23(两个)和R56(图10)。N113的侧链形成了3个氢键(对D44、S46、R56)以及与Y46的范德华力接触。显然，这个结合蛋白一定对作为IL13的C末端残基的N113的存在非常敏感。一个更短或更长的残基很可能会限制结合。
[0367] 6G9的中和作用是由于阻断IL13与受体链IL13Rα1的相互作用。从IL13：IL13Rα1：IL4Rα复合物的晶体结构可以判断6G9不干扰IL4Rα。
[0368] 静电相互作用
[0369] 虽然带电残基在相互作用中起显著作用，它们的分布是相当出人意料的。由于许多碱性残基，由螺旋A和D形成的IL13的结合表面是带正电的。然而结合蛋白的沟槽也在左(N-末端)半部分，即正好是其结合IL13的位置，带有正电荷。不知何故，所述中心簇(R23，R56，R90)的正电荷被IL13C-末端电荷和螺旋D的偶极所平衡。在沟槽中包括D77、D81、D110、E114、D143、D151和D155的酸性补丁对相互作用没有多少贡献。
[0370] 交叉反应性
[0371] 人和食蟹猴IL13仅有6个位点上的差异(图12)。其中之一，位点11，正好位于6G9表位。然而，这个残基(在人中为精氨酸，在食蟹猴中为赖氨酸)通过侧链的脂肪族部分与所述结合蛋白接触。因此，预期在人和食蟹猴IL13之间在结合方面没有差异。
[0372] 同样，在位点111的R/Q取代也不会影响结合。奇怪的是，残基111是螺旋D的C-末端部分中唯一不参与相互作用的残基(图12)。在食蟹猴IL13中和人IL13的天然变体中观察到在这个位点为Gln(在旧文献中，它被称为Q130)。总而言之，结合蛋白6G9与食蟹猴IL13和人IL13的两种变体的结合会一样好。
[0373] II13结构
[0374] IL13的结构可从先前确定的抗体复合物进行比较而获得。所有这些抗体在由螺旋A和D形成的表面与IL13结合。所述结构的重叠表明，在4-螺旋束中的螺旋排列方式在所有结构中是基本上相同的(图13)。在N-末端和C-末端的一些差异可能是由于与相应的受体分子的相互作用。注意到两个IL13抗体之间没有差异，其共享相同的CDRs。在结合蛋白复合物中的螺旋D中是直的，而它在抗体复合物中是明显弯曲的。所述角度偏差为约15°，其解释为在残基110上 的移位。
[0375] 与螺旋核心相反，连接螺旋的环AB和CD表现出大量的变异性。在本结构中，环CD是完全无序的。鉴于其灵活性，所述环的观察构象最有可能受晶体堆积影响，因为所述环不参与抗体的接触。
[0376] 所述IL13：结合蛋白6G9复合物的晶体结构显示这个结合蛋白识别IL13的螺旋A和D。所述表位与IL13抗体之一的几乎相同。N113的C-末端羧基基团是所述表位的要素。靶识别涉及形成所述沟槽的所有4个β-转角和5个螺旋中的4个。来自N-末端cap的
R23是必要的识别残基。在由β-转角形成的脊处的结合蛋白-IL13相互作用主要是疏水的。在沟槽处的相互作用是疏水性的和静电的。在结合IL13时，所述结合蛋白分子打开～
3.5°。
R23是必要的识别残基。在由β-转角形成的脊处的结合蛋白-IL13相互作用主要是疏水的。在沟槽处的相互作用是疏水性的和静电的。在结合IL13时，所述结合蛋白分子打开～
3.5°。
[0377] 序列比对表明对食蟹猴IL13确定的此处结合蛋白表位是保留在野生型人IL13和R111Q(aka R130Q)人变体中的。因此，预期结合蛋白6G9对这些种类有交叉反应性。结合蛋白6G9的中和作用是由于阻断IL13与受体链IL13Rα1的相互作用。6G9不干扰IL4Rα。结合至IL13的R108的醋酸根离子位于所述结合蛋白-IL13界面。这表明，不仅醋酸而且可能还有其它的阴离子，例如磷酸根，可通过所述结合蛋白对结合产生负面影响。
[0378] 序列表
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
[0383]
[0384]
[0385]
[0386]
[0387]
[0388]
[0389]
[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400] 注：SEQ ID NO：41、104、177、和178任选地在N-末端具有Met残基
[0401] IL13结合蛋白AR序列
[0402]
[0403]
[0404]
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409]
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