特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法
阅读：751发布：2021-08-25
专利汇可以提供特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本披露提供了结 合金 黄色葡萄球菌α毒素的 抗体 和 片段 的组合物、制造方法以及使用方法。更确切地说，本披露提供了抗体或 抗原 结合片段的VH CDR和VL CDR区序列。还披露了 预防 、 治疗 或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。，下面是特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法专利的具体信息内容。
1.一种纯化的/分离抗体或一种抗体的片段，其中该抗体或该片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，并且包括：
(a)VH CDR1，该VH CDR1包含与SEQ ID NO:7、10、13或69一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；
(b)VH CDR2，该VH CDR2包含与SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，以及
(c)VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3由SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71表示。
3.一种分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，并且包括：
(a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；
(b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；
(c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列；
(d)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；
(e)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73或77的氨基酸序列；以及
(f)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:7、8、9、1、2和3；SEQ ID NO:10、11、12、1、2和3；
SEQ ID NO:13、14、15、4、5和6；SEQ ID NO:7、17、18、1、2和3；SEQ ID NO:7、8、16、1、2和64；
SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和68；
SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和68；
SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、75、71、1、2和
68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、71、
1、77和74的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VH链结构域的三个CDR包含：
(a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；
(b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；以及(c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和
18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；
SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；
SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VL链结构域的三个CDR包含：
(a)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；
(b)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73或77的氨基酸序列；以及
(c)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、77和74的氨基酸序列。
9.一种分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，(ii)包含重链可变域，该重链可变域具有与SEQ ID NO:
20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90％的一致性，并且(iii)包含轻链可变域，该轻链可变域具有与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、
44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少90％的一致性。
10.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH和VL相应于SEQ ID NO:20和
19；SEQ ID NO；22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和
48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和
58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的氨基酸序列。
11.该分离抗体或其抗原结合片段，其中该该分离抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO 20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的重链可变域以及具有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的轻链可变域。
12.如权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH和VL相应于SEQ ID NO:20和
19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和
48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和
58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的氨基酸序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，并且具有一种或多种选自下组的特征，该组由以下各项组成：
(a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
(b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
(c)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
(d)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；以及
(e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段包括一种另外的药剂。
15.如权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中该另外的药剂是一种抗生素。
16.如权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段经由一种接头连接至治疗剂。
17.如权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段进一步包括一种诊断剂。
18.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中该诊断剂包括一种显像剂。
19.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中该诊断剂包括一种可检测标记物。
20.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段经由一种接头连接至该诊断剂。
21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该金黄色葡萄球菌毒素多肽是一种天然的毒素多肽。
22.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该金黄色葡萄球菌α毒素多肽包括SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
23.如权利要求A13所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞来自血液或肺。
24.如权利要求23所述的抗体或抗原结合片段，其中来自血液的该细胞是一种红细胞。
25.如权利要求13、23或24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞溶解是通过溶血体外试验或乳酸脱氢酶体外试验确定的。
26.如权利要求1至25中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。
27.如权利要求1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。
28.如权利要求1至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
29.如权利要求1至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
30.如权利要求13、28或29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该寡聚化的抑制是通过体外结合和/或电泳迁移率测定确定的。
31.一种组合物，包含如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
32.一种试剂盒，包含
(a)如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组
合物；
(b)用于使用该组合物的说明书或者用于获得使用该组合物的说明书的指导。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其中在该组合物中的抗体连接至一种固体支撑物。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中该固体支撑物是一种珠粒。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中该珠粒是一种琼脂糖凝胶珠。
36.如权利要求32至35中任一项所述的试剂盒，其中用于使用的这些说明书包括金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离、纯化、检测、和定量中的一项或多项。
37.如权利要求32至36中任一项所述的试剂盒，包含一种缓冲液、一种固体支撑物或者一种缓冲液与一种固体支撑物。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中该固体支撑物是珠粒、过滤器、膜和多孔板
(multiwall plate)中的一种或多种。
39.如权利要求37所述的试剂盒，包括一种适用于Western印迹的缓冲液和膜。
40.如权利要求37所述的试剂盒，包含一种上样缓冲液和一种洗脱缓冲液。
41.如权利要求37所述的试剂盒，包含一种适用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的缓冲
液。
42.一种用于预防、治疗或管理在受试者中的肺炎的方法，该方法包括：
将一种如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物以用于预防、治疗或管理肺炎有效的量给予至对其有需要的受试者。
43.如权利要求42所述的方法，是一种用于预防肺炎的方法。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至在SEQ ID NO:39之内的构象表位。
45.一种用于预防、治疗或管理在受试者中的皮肤感染病症的方法，该方法包括：将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以用于预防、治疗或管理该皮肤感染病症有效的量给予至对其有需要的受试者。
46.如权利要求45所述的方法，其中该皮肤感染病症是皮肤坏死。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中该皮肤感染病症包括皮肤的金黄色葡萄球菌感染。
48.如权利要求45至47中任一项所述的方法，是一种用于预防皮肤感染病症的方法。
49.一种用于预防、治疗或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法，该方法包括将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以减少该毒素多肽的寡聚化有效的量给予至对其有需要的受试者。
50.如权利要求49所述的方法，是一种用于预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。
51.一种用于预防、治疗或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法，该方法包括将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以减少红细胞溶解有效的量给予至对其有需要的受试者。
52.如权利要求51所述的方法，是一种用于预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中该红细胞是一种来自血液或肺的细胞。
54.如权利要求45至53中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段具有一种或多种选自下组的特征，该组由以下各项组成：
(a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
(b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
(c)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
(d)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；以及
(e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
55.如权利要求54所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至在SEQ ID NO:39之内的构象表位。
56.如权利要求42至55中任一项所述的方法，其中给予至受试者的抗体或抗原结合片段或组合物是根据如权利要求1至30中任一项或如权利要求31所述的组合物。
57.一种方法，包括：
将如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至细胞；并且
检测与给予该组合物至这些细胞相关的生物效应的存在、不存在或量。
58.一种方法，包括：
将如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至受试者；并且
检测在受试者中与该组合物的给予相关的生物效应的存在、不存在或量。
59.一种方法，包括：
将如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至受试者；并且
监测受试者的病症。
60.一种用于中和金黄色葡萄球菌α毒素多肽的方法，该方法通过将一种有效量的如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至对其有需要的受试者以中和该毒素多肽。
61.一种预防、治疗、或管理对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的病症的方法，该方法包括将有效量的如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至受试者从而预防、治疗或管理该病症。
62.一种治疗、预防、或减轻对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的失调的症状的方法，该方法包括将有效量的如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至受试者从而治疗、预防或减轻这些症状。
63.一种用于诊断在受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的病症的方法，该方法包括选择对诊断有需要的受试者，并且将诊断有效剂量的如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所述的组合物给予至受试者。
64.如权利要求42至63中任一项所述的方法，其中该受试者是一种家畜。
65.如权利要求42至63中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
66.一种用如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所
述的组合物以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制金黄色葡萄球菌α毒素寡聚体形成的方法。
67.如权利要求66所述的方法，其中金黄色葡萄球菌α毒素寡聚体形成的抑制抑制了活性成孔复合体的形成。
68.一种用如权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求31所
述的组合物以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低金黄色葡萄球菌α毒素的细胞溶解活性的方法，其中该细胞溶解活性是通过细胞溶解和/或溶血试验确定的。
69.一种免疫特异性地结合至具有SEQ ID NO:39的金黄色葡萄球菌α毒素的一个片段的分离抗体或其抗原结合片段。
70.如权利要求69所述的分离抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸261-272的一个片段。
71.如权利要求69或70所述的分离抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:39的残基T261、T263、N264、K266和K271接触。
72.如权利要求69或70所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸173-201的一个片段。
73.如权利要求69或72所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:39的残基N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200接触。
74.如权利要求69至73中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:39的残基T261、T263、N264、K266、K271、N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200接触。
75.一种免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素片段的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸248-277的一个片段。
76.一种免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段防止α毒素七聚体的形成，并且其中所述抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:39中的一种或多种选自下组的残基接触，该组由以下各项组成：T261、T263、N264、K266、K271、N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。
77.如权利要求42所述的方法，是一种用于治疗肺炎的方法。
78.如权利要求45至47中任一项所述的方法，是一种用于治疗皮肤感染病症的方法。
79.如权利要求49所述的方法，是一种用于治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。
80.如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗生素是万古霉素。
81.一种抑制α毒素寡聚体形成的方法，该方法包括使一种α毒素单体与免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素的一种分离抗体或其抗原结合片段接触，其中该抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:39中的一种或多种选自下组的残基接触，该组由以下各项组成：
T261、T263、N264、K266、K271、N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。
82.如权利要求81所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段与T261、T263、N264、K266和K271接触。
83.如权利要求82所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段进一步与N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200接触。
84.具有Fc变体区的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体包含SEQ ID NO:XX以及SEQ ID NO:YY。
特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法
[0001] 领域
[0002] 本技术涉及抗体部分，并且在某些实施例中涉及特异性结合至金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α毒素的抗体。
[0003] 背景
[0004] 金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性的、兼性需氧、形成簇的球菌细菌，一般定殖于健康人的鼻子和皮肤。在任何给定时间，大致20％-30％的人群被金黄色葡萄球菌定殖。金黄色葡萄球菌细菌(有时也称为“staph”、“Staph.aureus”、或“S.aureus”)被认为是引起轻微感染(例如，小脓疱、疖)和全身感染的机会致病菌。
[0005] 通常，粘膜和表皮屏障(皮肤)保护人体免于金黄色葡萄球菌感染。由于损伤(例如，烧伤、外伤、外科手术等等)造成的这些天然屏障的破坏显著增加了感染风险。损害免疫系统的疾病(例如，糖尿病、终末期肾病、癌症等等)也增加了感染风险。机会性金黄色葡萄球菌细菌感染可以变得严重，引起多种疾病或病症，其非限制性实例包括菌血症、蜂窝织炎、眼睑感染、食物中毒、关节感染、皮肤感染、烫伤样皮肤综合征、中毒性休克综合征、肺炎、骨髓炎、心内膜炎、脑膜炎以及脓肿形成。
[0007] 金黄色葡萄球菌表达多种毒力因子，包括荚膜多糖以及蛋白质毒素。经常与金黄色葡萄球菌感染相关的、是主要细胞毒剂的一种毒力因子是α毒素(还称为α-溶血素或Hla)，是一种由金黄色葡萄球菌的致病力最强的菌株产生的成孔且溶血的胞外蛋白。该毒素在易感细胞(例如白细胞、血小板、红细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、角质化细胞、成纤维细胞以及内皮细胞)的膜中形成七聚体孔。α毒素孔形成常导致细胞功能障碍或溶解。
[0008] 披露的简要概述
[0009] 在某些实施例中，提供了一种纯化或分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽。术语“α毒素多肽”、“α毒素单体”以及“α毒素寡聚体(例如七聚体)”在此分别称为“AT”、“AT单体”以及“AT寡聚体”。术语“可变重链”称为“VH”。术语“可变轻链”被称为“VL”。
[0010] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH CDR1，该VH CDR1包含与SEQ ID NO:7、10、13或69一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(b)VH CDR2，该VH CDR2包含与SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；以及(c)VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0011] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；
SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和
71一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和
71一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0012] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL CDR1，该VL CDR1包含与SEQ ID NO:1或4一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(b)VL CDR2，该VL CDR2包含与SEQ ID NO:2、5、73或77一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；以及(c)VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、
2、或3个氨基酸残基置换。
2、或3个氨基酸残基置换。
[0013] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，该VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、77和74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0014] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，在各自的CDR中包含与以下各项一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换：(a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；(b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；(c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列；(d)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；(e)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73、或77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0015] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3，该VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:7、8、9、1、2和3；SEQ ID NO:10、11、12、1、2和3；SEQ ID NO:13、14、15、4、5和6；SEQ ID NO:7、17、18、1、2和3；SEQ ID NO:7、8、16、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和68；SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、75、71、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、71、1、77和74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0016] 在一些实施例中，提供了含有一种分离抗体或其抗原结合片段的组合物，该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VH链结构域的三个CDR包括(a)含有SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列的VH CDR1；(b)含有SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列的VH CDR2；以及(c)含有SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、
66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具体实施例中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:
7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71。
66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具体实施例中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:
7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71。
[0017] 在某些实施例中还提供了含有一种分离抗体或其抗原结合片段的组合物，该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VL链结构域的三个CDR包括(a)含有SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列的VL CDR1；(b)含有SEQ ID NO:2、5、73、或77的氨基酸序列的VL CDR2；以及(c)含有SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列的VL CDR3。在具体实施例中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:
4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、
77和74。
4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、
77和74。
[0018] 在一些实施例中还提供了包含一种分离抗体或其抗原结合片段的组合物，该分离抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，(ii)包含重链可变域，该重链可变域包含与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90％的一致性，并且(iii)包含轻链可变域，该轻链可变域包含与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少90％的一致性。
[0019] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO 20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的重链可变域以及具有SEQ ID NO:19、
21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的轻链可变域。
21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的轻链可变域。
[0020] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中该VH和VL各自与SEQ ID NO:20和19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和
58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的VH和VL氨基酸序列一致或者与它们各自具有至少90％、95％或98％的一致性。
58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的VH和VL氨基酸序列一致或者与它们各自具有至少90％、95％或98％的一致性。
[0021] 在一些实施例中，一种分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下各项组成：(a)对于金黄色葡萄球菌α毒素多肽的大约13nM或更小的亲和力参数(KD)；(b)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％抑制金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化；以及(c)以至少50％、
60％、70％、80％、90％、或95％减少A549(肺上皮)溶解或THP-1(单核细胞)以及红细胞溶解，其中分离抗体或抗原结合片段与金黄色葡萄球菌毒素以大约1:1的摩尔比存在。
60％、70％、80％、90％、或95％减少A549(肺上皮)溶解或THP-1(单核细胞)以及红细胞溶解，其中分离抗体或抗原结合片段与金黄色葡萄球菌毒素以大约1:1的摩尔比存在。
[0022] 在一些实施例中，红细胞是来自血液的细胞。在某些实施例中，来自血液的细胞是红细胞。在一些实施例中，溶解是通过体外溶血试验确定的。在其他实施例中，溶解是通过体外乳酸脱氢酶释放试验确定的。这些试验进一步描述于下文，或者可以由本领域的普通技术人员常规地进行。
[0023] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包括一种诊断剂。在某些实施例中，诊断剂包括一种显像剂。在一些实施例中，诊断剂包括一种可检测标记物。在某些实施例中，该分离抗体或其抗原结合片段经由一种接头连接至该诊断剂。
[0024] 在一些实施例中，金黄色葡萄球菌α毒素多肽是一种天然毒素多肽。在一些实施例中，相对于天然毒素多肽，金黄色葡萄球菌α毒素多肽包括一个或多个氨基酸缺失、添加和/或置换(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸插入、缺失和/或置换)。在一些实施例中，金黄色葡萄球菌α毒素多肽是一种重组蛋白。在某些实施例中，金黄色葡萄球菌α毒素多肽包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或其片段。在某些其他实施例中，金黄色葡萄球菌α毒素多肽是多肽的减毒形式，如H35L，其中在野生型多肽的位置35处的组氨酸被亮氨酸替换，例如，如通过SEQ ID NO:40表示的。
[0025] 在某些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或其抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。在一些实施例中，分离抗体或分离抗体的抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或其抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。
[0026] 在某些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或其抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或其抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。在某些实施例中，寡聚化的抑制是通过体外结合和电泳迁移率测定确定的。
[0027] 在此还提供了试剂盒，这些试剂盒包括(a)含有分离抗体或其抗原结合片段的组合物，以及(b)用于使用该组合物的说明书或者用于获得使用该组合物的说明书的指导。在一些实施例中，在组合物中的抗体连接至一种固体支撑物。在某些实施例中，固体支撑物是一种珠粒，并且在一些实施例中，该珠粒是一种琼脂糖凝胶珠。在一些实施例中，使用说明书包括金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离、纯化、检测以及定量中的一项或多项。
[0028] 在某些实施例中，该试剂盒包括一种适用于Western印迹的缓冲液和膜。在一些实施例中，该试剂盒包含上样缓冲液和洗脱缓冲液。在某些实施例中，该试剂盒包含一种适用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的缓冲液。
[0029] 在此还提供了用于预防、治疗或管理在受试者中的肺炎的方法，该方法包括：将包含免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的抗体或其抗原结合片段的组合物以用于预防、治疗或管理肺炎有效的量给予至对其有需要的受试者。
[0030] 在一些实施例中，该方法预防肺炎。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至一种线性或构象表位，该线性或构象表位包含葡萄球菌α毒素多肽的氨基酸1至293或氨基酸51至293的一个或多个残基或者一部分或片段。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至一种片段，其中该抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:39的T261、T163、N264、K266和K271处具有接触残基。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至α毒素的一个片段，其中该抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200处具有另外的接触残基。
[0031] 在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T163、N264、K266和K271处具有接触残基。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39氨基酸261-272的片段。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39氨基酸248-277的片段。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO:39的氨基酸261-272的片段，或者结合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO:39的氨基酸248-277的片段。
[0032] 在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至一种片段，其中该抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:40的T261、T163、N264、K266和K271处具有接触残基。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至α毒素的一个片段，其中该抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:40的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200处具有另外的接触残基。
[0033] 在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:40的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T163、N264、K266和K271处具有接触残基。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:40的氨基酸261-272的片段。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:40的氨基酸248-277的片段。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至包含SEQ ID NO:40氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO:40氨基酸261-272的片段。
[0034] 在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至一个片段，该片段包含葡萄球菌α毒素多肽或葡萄球菌α毒素多肽变体的(1)氨基酸261-272，(2)氨基酸248-277或(3)氨基酸173-201和261-272，其中氨基酸261-272、氨基酸248-277或氨基酸173-201相应于与SEQ ID NO:39中的相应区域相同的氨基酸序列或者在具有SEQ ID NO:39中的相应区域的片段之内含有置换，其中这些置换不改变抗体或其抗原结合片段结合至α毒素多肽的能力。
[0035] 在一些实施例中提供了用于预防、治疗或管理受试者中的皮肤感染病症的一种方法，该方法包括：将包含根据本发明的免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的抗体或其抗原结合片段的组合物以用于预防、治疗或管理皮肤感染病症有效的量给予至对其有需要的受试者。在某些实施例中，皮肤感染病症是皮肤坏死。在一些实施例中，皮肤感染病症包括皮肤的金黄色葡萄球菌感染。在某些实施例中，该方法预防皮肤感染病症。
[0036] 在一些实施例中提供了用于预防、治疗或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的一种方法，该方法包括：将包含根据本发明的免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的抗体或其抗原结合片段的组合物以减少该毒素多肽的寡聚化有效的量给予至对其有需要的受试者。在某些实施例中，该方法预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症。
[0037] 在一些实施例中，提供了用于预防、治疗、或管理与透析治疗、高风险手术、肺炎、呼吸机相关性肺炎(VAP)、或在从先前的早先治疗或手术的医院出院之后的再感染相关的金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括将包含免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的抗体或其抗原结合片段的组合物给予至对其有需要的受试者。
[0038] 在一些实施例中还提供了用于预防、治疗或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的一种方法，该方法包括将包含免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的抗体或其抗原结合片段的组合物以减少细胞溶解有效的量给予至对其有需要的受试者。在某些实施例中，该方法预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症。在一些实施例中，该细胞是来自血液或肺的红细胞。
[0039] 在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至包含一个或多个残基的线性或构象表位。在某些实施例中，给予至受试者的组合物是根据在此所述的组合物中的任何一种。
[0040] 在某些实施例中还提供了这样一种方法，该方法包括：将在此所述的组合物给予至细胞；并且检测与给予组合物至这些细胞相关的生物效应的存在、不存在或量。在一些实施例中还提供了一种这样方法，该方法包括：将在此所述的组合物给予至受试者；并且检测受试者中与组合物的给予相关的生物效应的存在、不存在或量。在某些实施例中还提供了这样一种方法，该方法包括：将在此所述的组合物给予至受试者；并且监测受试者的病症。
[0041] 在一些实施例中还提供了通过将在此所述的有效量的任一种组合物给予至对其有需要的受试者以便中和毒素多肽而用于中和金黄色葡萄球菌α毒素多肽的方法。
[0042] 在某些实施例中还提供了预防、治疗、或管理在对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌感染介导的病症的方法，该方法包括将在此所述的有效量的任一种组合物给予至受试者以预防、治疗或管理该病症。在一些实施例中还提供了用于治疗、预防或减轻在对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素多肽介导的失调症状的方法，该方法包括将在此所述的有效量的任一种组合物给予至受试者以治疗、预防或减轻症状。
[0043] 在某些实施例中还提供了用于诊断受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的病症的方法，该方法包括选择对诊断有需要的受试者，并且将诊断有效剂量的在此所述的任何一种组合物给予至受试者。在一些实施例中，受试者是家畜，并且在某些实施例中，受试者是人。
[0045] 附图简要说明
[0046] 附图展示了在此的实施例并且不是限制性的。为了清晰和容易地说明，附图未按比例作出，并且在一些情况下，不同的方面可能被夸张或放大地显示以促进具体实施例的理解。
[0047] 图1A和1B图形展示了红细胞溶解被抗α毒素抗体抑制的百分比。实验细节和结果描述于实例3中。
[0048] 图2A和2B图形展示了人A549和THP-1细胞溶解被抗α毒素抗体抑制的百分比。实验细节和结果描述于实例3中。
[0049] 图3A和3B展示了在皮肤坏死模型中用抑制性抗金黄色葡萄球菌α毒素mAb的被动免疫的结果。将5只BALB/c小鼠的组用5mg/kg的抑制性mAb被动免疫，并且然后用金黄色葡萄球菌Wood感染并且监测病灶大小持续6天。图3A显示了感染6天后病灶大小的照片。图3B图形展示了随着感染时程的推移的病灶大小的减小。实验细节和结果描述于实例4中。
[0050] 图4-7图形展示了在肺炎模型中用在此所述的不同mAb被动免疫的小鼠的存活。图4展示了在用金黄色葡萄球菌USA300(3×108cfu)感染之前24小时用5mg/kg、15mg/kg和
45mg/kg纯化的12B8.19被动免疫的C57BL/6J小鼠的结果。
45mg/kg纯化的12B8.19被动免疫的C57BL/6J小鼠的结果。
[0051] 图5展示了在用金黄色葡萄球菌USA300(3×108cfu)感染之前24小时用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg纯化的2A3.1被动免疫的C57BL/6J小鼠的结果。
[0052] 图6展示了在用金黄色葡萄球菌USA300(3×108cfu)感染之前24小时用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg纯化的28F6.1被动免疫的C57BL/6J小鼠的结果。
[0053] 图7展示了在用金黄色葡萄球菌USA300(3×108cfu)感染之前24小时用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg纯化的10A7.5被动免疫的C57BL/6J小鼠的结果。实验细节和结果描述于实例5中。
[0054] 图8A和8B图形展示了在用全人型式的mAb 2A3.1(例如，2A3hu)或同种型对照(R347)被动免疫的小鼠中在肺(图8A)和肾(图8B)中的细菌分布。将C57BL/6J小鼠在用
USA300感染之前24小时用2A3hu(15mg/kg)被动免疫。还收集样品以测量细胞因子水平并且用于组织病理学分析。实验细节和结果描述于实例5中。
USA300感染之前24小时用2A3hu(15mg/kg)被动免疫。还收集样品以测量细胞因子水平并且用于组织病理学分析。实验细节和结果描述于实例5中。
[0055] 图9图形展示了在用mAb 2A3hu被动免疫之后炎性细胞因子产生的减少。圈起来的结果来自24小时时间点。实验细节和结果描述于实例6中。
[0056] 图10显示了用R347对照处理(参见图10左侧的顶部和底部照片)或用2A3hu处理(参见图10右侧的顶部和底部照片)的小鼠中肺部组织学的代表性照片。实验细节和结果描述于实例6中。
[0057] 图11图形展示了在此所述的抗AT(金黄色葡萄球菌α毒素)mAb不抑制天然α毒素(nAT)结合至存在于兔红细胞血影上的受体。实验细节和结果描述于实例8中。
[0058] 图12是展示被在此所述的抗体抑制七聚体形成的代表性western印迹。实验细节和结果描述于实例8中。
[0059] 图13A和13B展示了证实被在此所述的抗AT mAb抑制寡聚化的代表性western印迹，并且进一步展示了该抑制可以被消除(titrated)。实验细节和结果描述于实例8中。
[0060] 图14-16图形展示了在细胞溶解抑制试验中全人抗AT抗体的效力。全人型式的抗AT IgG抗体展现了类似于相应的嵌合抗AT IgG抗体的效力。将全人IgG抗体与嵌合IgG抗体在兔RBC(红细胞)溶解(图14)、A549细胞溶解(图15)和THP-1细胞溶解(图16)中的抑制活性进行比较。实验细节和结果描述于实例9中。
[0061] 图17A和17B图形展示了在皮肤坏死模型中在用抑制性抗金黄色葡萄球菌α毒素mAb QD20、QD37、LC10、QD33、2A3和对照R347被动免疫之后随着感染时程的推移的病灶大小的减少。将5只BALB/c小鼠的组用所示的1mg/kg(图17A)和0.5mg/kg(图17B)的抑制性mAb进行被动免疫，并且然后用金黄色葡萄球菌Wood感染并且监测病灶大小持续6天。
[0062] 图18图形展示了在肺炎模型中用mAb QD20、QD37、LC10、QD33、2A3和对照R347被动免疫的小鼠的存活。将小鼠在用金黄色葡萄球菌USA300(约2×108cfu)感染之前24小时用5mg/kg纯化mAb被动免疫。
[0063] 图19图形描绘了LC10 YTE结合至α毒素和LukF-PV的ELISA表征。将含有His-标签的α毒素或LukF-PV的细菌溶解产物包被在96孔的表面上。将LC10 YTE或小鼠抗His mAb添加至包被的孔中，并且孵育1h。如由抗His mAb的结合信号所示，α毒素和LukF-PV的表达水平是相似的，同时LC10 YTE仅显著地结合至α毒素而不是LukF-PV。
[0064] 图20显示了α毒素和LukF-PV蛋白的序列比对。α毒素与LukF-PV(UniProtKB/TrEMBL登录号B1Q018)共享25％的氨基酸序列一致性。氨基酸编号是基于成熟蛋白质。使用Clustal W的方法进行比对。通过加下划线突出显示区段aa 248-277。
[0065] 图21描绘了α毒素结构的卡通表示。A)α毒素的可溶性单体的模型化结构的卡通表示。α毒素的模型化单体结构是使用LukF-PV的晶体结构作为模板用Maestro 9.1(薛定谔(Schrodinger)公司)来构建的(蛋白质数据库(Protein Data Bank)入口1PVL)(佩德拉克(Pedelacq)，Maveyraud等人1999)。B)来自六聚体的α毒素原聚体(protomer)的晶体结构的卡通表示(蛋白质数据库入口7AHL)(宋(Song)，霍鲍(Hobaugh)等人1996)。aa 101-110示为蓝色，aa 224-231为橙色，并且aa 248-277为红色。
[0066] 图22是LC10 YTE Fab-α毒素复合体的带状图。α毒素分子是由该带状图的顶部部分中的带指示的。重链是由该带状图的底部部分中的黑色带指示的，并且轻链是由该带状图的底部部分中的浅色带指示的。
[0067] 图23是α毒素分子的七聚体和单体状态的卡通表示。a.在宿主细胞的表面上产生孔的蘑菇状的α毒素分子七聚体组装物。灰色和黑色区域相应于遮蔽在模型中的LC10 YTE接触残基。在遮蔽位置中存在的接触残基是阻止七聚体形成的一致的LC10。b.在孔形成之前(淡灰色)和之后(深灰色)的α毒素分子的重叠结构。
[0068] 图24图形表示了LC10在鼠的皮肤坏死模型中的治疗功效。将5只Balb/C小鼠的组用15mg/kg LC10或R347被动免疫，将Balb/C小鼠用2×108个金黄色葡萄球菌Wood进行鼻内感染。感染后(A)1小时、(B)3小时或(C)6小时，然后将小鼠用5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg LC10进行治疗，并且监测病灶大小持续6天。5只在细菌激发之前24小时被给予15mg/kg LC10或R347的组被包括为对照。
[0069] 图25图形表示了LC10在小鼠肺炎模型中的治疗功效。将10只C57BL/6小鼠的组用15mg/kg LC10或R347被动免疫，24小时后用2×108个金黄色葡萄球菌USA300进行鼻内激发。将10只C57BL/6小鼠的组用2×108个金黄色葡萄球菌USA300进行鼻内感染。感染后(A)1小时，(B)3小时或(C)6小时，然后将小鼠用5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg LC10治疗，并且监测存活持续7天。10只在细菌激发之前24小时被给予15mg/kg LC10或R347的组被包括为对照。
[0070] 图26图形表示了LC10在小鼠肺炎模型中的治疗功效。将10只C57BL/6小鼠的组用2×108个金黄色葡萄球菌USA300进行皮内感染。感染后一小时，以(A)15mg/kg(B)45mg/kg给予动物LC-10的单次腹膜内注射。动物的同期组群在感染后1h接受皮下万古霉素(VAN)。以一天两次间隔12小时(BID q 12)给予另外的VAN治疗，持续总共6次治疗。在感染后1h，将10只小鼠的对照组用15mg/kg R347治疗。监测存活持续7天。
[0071] 图27是协同作用的等效线图解法分析的图形显示，其中N>1：拮抗作用，N＝1：加性效应，N<1：协同作用。
[0072] 详细说明
[0073] 在此提供了结合至金黄色葡萄球菌α毒素的包括人、人源化和/或嵌合形式的抗体以及其片段、衍生物/偶联物和组合物。此类抗体对于检测和/或可视化α毒素可以是有用的，并且因此在试验和诊断方法中可以是有用的。在此所述的抗体还干扰α毒素七聚体形成，由此抑制活性成孔复合体的形成，并且因此对于治疗和预防方法可以是有用的。
[0074] 金黄色葡萄球菌是普遍存在的病原体，并且有时是其严重性范围为从轻微到致命的多种病症的致病因子。金黄色葡萄球菌产生大量的胞外蛋白和细胞相关蛋白，它们中的许多涉及发病，例如α毒素、β毒素、γ毒素、δ毒素、杀白细胞素、中毒性休克综合征毒素(TSST)、肠毒素类、凝固酶、蛋白A、纤维蛋白原、纤连蛋白结合蛋白等等。α毒素(例如由hla基因编码)是金黄色葡萄球菌的毒力因子之一，并且是由大多数病原性金黄色葡萄球菌菌株产生的。
[0075] 金黄色葡萄球菌感染相对难以治疗，并且在抗生素治疗之后可能发生侵袭性疾病和复发。另外，在医院环境(例如HA-MRSA或与医疗保健相关的)和非医院环境(例如CA-MRSA或与社区相关的)中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株已经变得更普遍，进一步使得金黄色葡萄球菌感染的治疗复杂化。在许多情况下，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株还对一种或多种其他抗生素有抗性，包括氨基糖苷类、四环素、氯霉素、大环内酯类以及林可酰胺类抗生素。
[0076] α毒素是一种成孔毒素并且在人类以及动物中具有溶解细胞、溶血、皮肤坏死以及致死活性。葡萄球菌α毒素被分泌为具有293个氨基酸的水溶性单链多肽，为大致34千道尔顿(kDa)。不受到理论的限制，人们认为存在着α毒素/靶标细胞相互作用的两种方法；(i)α毒素结合至在人血小板、单核细胞、内皮细胞、白细胞、肺泡细胞、巨噬细胞、角质化细胞、成纤维细胞、兔红细胞、以及其他细胞的细胞表面上的特异性的高亲和力受体(ADAM 10)(参见例如Wilke(威尔克)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)107:13473-13478(2010))，或者(ii)α毒素通过吸附至脂双层非特异性地相互作用。在毒素/细胞相互作用的任一模式中，七个α毒素单体分子寡聚化以形成1-2nm直径的七聚体跨膜通道。随后钾和核苷酸的流出以及钠和钙的流入导致渗透性溶解和/或多重继发作用，包括类二十烷酸产生、分泌过程、收缩功能障碍、细胞凋亡以及细胞因子的释放。人们认为由α毒素引起的细胞活性的破坏和细胞溶解促成了与金黄色葡萄球菌感染相关的病症和疾病。
[0077] 由金黄色葡萄球菌感染引起的一些常见病症的非限制性实例包括烧伤、蜂窝织炎、皮肤坏死、眼睑感染、食物中毒、关节感染、肺炎、皮肤感染、手术伤口感染、烫伤样皮肤综合征以及中毒性休克综合征。另外，它是在异物感染中常见的病原体，例如血管内的线(intravascular line)、起搏器、人工心脏瓣膜以及关节植入物。由金黄色葡萄球菌感染引起的一些病症或疾病进一步描述于下文。以下描述的一些或所有的病症和疾病可以涉及作为感染组分或者病症或疾病状态的介质的α毒素的直接作用，或者一些或所有的病症可以涉及α毒素的间接或继发作用(例如，原发性毒力因子导致与病症相关的主要症状或大多数症状，而α毒素通过它对细胞功能的破坏和细胞溶解活性起着进一步推进疾病的作用)。
[0078] 烧伤
[0079] 烧伤伤口常常最初是无菌的。然而，中度和重度烧伤通常损害针对感染的物理和免疫屏障(例如，皮肤的发疱、开裂或剥离)，导致流体和电解质类的丢失，并且引起局部或全身性生理功能障碍。受损皮肤与活细菌接触有时可以导致在损伤部位的混合定殖。感染可以被限制到烧伤表面上的无活力的碎片(“焦痂”)，或者定殖可以进展为全皮肤感染并且侵袭焦痂下的有活力的组织。更严重的感染可以到达皮肤下，进入淋巴系统和/或血液循环，并且发展为败血症。典型地，在定殖烧伤伤口感染处的病原体中发现金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可以破坏肉芽组织并且产生严重的败血症。
[0080] 皮肤和软组织感染
[0081] 蜂窝织炎
[0082] 蜂窝织炎是皮肤的急性感染，常常开始于可以在皮肤层下蔓延的表面感染。蜂窝织炎最常见地是由金黄色葡萄球菌结合化脓性链球菌的混合感染引起。蜂窝织炎可以导致全身感染。蜂窝织炎有时是协同性细菌性坏疽的一个方面。协同性细菌性坏疽典型地是由金黄色葡萄球菌和微需氧链球菌的混合物引起的。协同性细菌性坏疽引起坏死，并且治疗被限制为坏死组织的切除。病症常常是致命的。
[0083] 皮肤坏死
[0084] 皮肤坏死是皮肤和皮下组织的感染，容易跨越皮下组织内的筋膜面(fascial plane)蔓延。该病症引起皮肤的顶层和/或底层变得坏死，并且可以蔓延至在下面的组织和周围组织。
[0085] 坏死性筋膜炎
[0086] 坏死性筋膜炎被称为“食肉病”或“食肉细菌综合征”。坏死性筋膜炎可以由多种微生物感染引起(例如，I型，由混合细菌感染引起)或由单微生物感染引起(例如，II型，由细菌的单个病原菌株引起)。许多类型的细菌可以引起坏死性筋膜炎，这些细菌的非限制性实例包括A群链球菌(例如化脓性链球菌)、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、产气荚膜梭菌、以及脆弱拟杆菌。具有抑制的或受损的免疫系统的个体更可能遭受皮肤坏死(例如，坏死性筋膜炎)。
[0087] 历史上，A群链球菌被诊断为II型皮肤坏死感染的大多数病例的原因。然而，自2001年以来，已经观察到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为单微生物坏死性筋膜炎的原因具有增加的频率。感染局部地(有时在创伤部位)开始，可以是严重的(例如由于手术)、轻微的、或甚至不明显的。患者常常主诉剧烈的疼痛，这种疼痛相对于特定的皮肤外观可能是过度的。随着疾病的进展，组织常常在数小时内变得肿胀。腹泻和呕吐也是常见症状。
[0088] 如果细菌在组织深处，炎症的体征在感染早期可能不明显。如果细菌不在深处，炎症的体征例如发红和肿胀的或皮肤灼热非常快速地显示出来。皮肤颜色可以进展为紫色，并且可以形成水疱，伴随皮下组织的随后的坏死(例如，死亡)。具有坏死性筋膜炎的患者典型地会发热并且看起来病得很重。如果不治疗，已经记录了高达73％的死亡率。在没有适合的医疗救助的情况下，感染进展快速并且最终导致死亡。
[0089] 肺炎
[0090] 金黄色葡萄球菌还已经被诊断为葡萄球菌肺炎的原因。葡萄球菌肺炎导致肺部的炎症和肿胀，进而引起液体聚集在肺中。聚集在肺中的液体可以阻止氧气进入血流。患有流行性感冒的那些人具有发生细菌性肺炎的风险。在已经遭受流行性感冒的那些人中，金黄色葡萄球菌是细菌性肺炎的最常见的原因。葡萄球菌肺炎的常见症状包括咳嗽、呼吸困难以及发热。另外的症状包括疲劳、黄色或带血粘液、以及随着呼吸恶化的胸痛。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)逐渐被诊断为在葡萄球菌肺炎中鉴定的菌株。
[0091] 手术伤口感染
[0092] 手术伤口常常深深地穿入身体。因此如果伤口变得被感染，此类伤口的感染对患者造成重大风险。金黄色葡萄球菌时往往是手术伤口中的感染的致病因子。金黄色葡萄球菌非常善于侵入手术伤口，缝合伤口可以被引起正常皮肤感染少得多的金黄色葡萄球菌细胞感染。侵入手术伤口可以导致严重的金黄色葡萄球菌败血症。由金黄色葡萄球菌侵入血流的侵袭可以导致内部器官(特别是心脏瓣膜和骨)的种植(seeding)和感染，引起全身性疾病，例如心内膜炎和骨髓炎。
[0093] 烫伤样皮肤综合征
[0094] 如果不是致病因子的话，金黄色葡萄球菌可能是“烫伤样皮肤综合征”(还被称为“葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征”)、“中毒性皮肤坏死”、“局限性大疱性脓疱病”、“里特病(Ritter's disease)”以及“莱尔病(Lyell's disease)”的主要致病因子。烫伤样皮肤综合征频繁发生于大龄儿童中，典型地发生于由产生表皮松解外毒素(例如，表皮剥脱毒素A和B，有时被称为烫伤样皮肤综合征毒素)的金黄色葡萄球菌菌株的繁盛(flowering)所导致的爆发中，这些表皮松解外毒素导致表皮层内的分离。外毒素之一是由细菌染色体编码的，并且另一种是由质粒编码的。外毒素是切割桥粒芯糖蛋白-1的蛋白酶，桥粒芯糖蛋白-1通常将皮肤的颗粒层和棘层(spinosum layer)保持在一起。
[0095] 细菌可以最初仅感染一个较小的病灶，然而，毒素破坏细胞间连接，蔓延表皮层，并且允许感染渗透皮肤外层，产生象征疾病的脱屑。皮肤外层的脱落通常暴露下面的正常皮肤，但是如果不进行适当治疗，在过程中的液体丢失可以在幼儿中产生严重的损伤。
[0096] 中毒性休克综合征
[0097] 中毒性休克综合征(TSS)是由产生所谓的“中毒性休克综合征毒素”的金黄色葡萄球菌菌株引起的。该疾病可以由金黄色葡萄球菌在任何部位的感染引起，但是常常错误地被认为仅仅是使用卫生棉的女性专有的疾病。该疾病涉及毒血症和败血症，并且可以是致命的。
[0098] 中毒性休克综合征的症状取决于基本病因而不同。由于细菌金黄色葡萄球菌的感染引起的TSS典型地另外表现在其他方面健康的具有高热的个体中，伴有低血压、不适以及意识错乱，可以快速进展至昏呆(stupor)、昏迷、以及多器官衰竭。常常在疾病的早期病程中见到的特征性皮疹类似于晒斑，并且可以累及身体的任何区域，包括嘴唇、嘴、眼睛、手掌以及脚底。在最初的感染猛攻(onslaught)中存活的患者中，在10-14天之后皮疹脱屑、或剥落。
[0099] 如上所指出的，由于金黄色葡萄球菌的耐多药菌株的增加，越来越多数目的常用于治疗金黄色葡萄球菌感染的抗生素不再控制或消除耐甲氧西林以及耐多药的金黄色葡萄球菌的感染。针对在此所述的金黄色葡萄球菌α毒素的抗体可以帮助降低感染的严重性，并且还可以辅助从感染宿主清除、防止(预防性地)或减少病原性金黄色葡萄球菌。
[0100] 抗体
[0101] 如在此使用的，术语“一种抗体”、“多种抗体”(还被称为“免疫球蛋白”)以及“抗原结合片段”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少两种不同的表位结合片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼科(camelid)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现所希望的生物活性的抗体片段(例如抗原结合部分)、二硫键连接的Fv(dsFv)、以及抗独特型(anti-Id)抗体(包括例如针对在此提供的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体、以及任何上述各项的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合部位的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)，Am，Em，以及Km(1、2或3))。抗体可以衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴子、猪、马、兔、狗、猫、小鼠、等等，或者其他动物，例如禽类(例如，鸡)。
[0102] 天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规律性间隔的链间二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，之后跟随多个恒定域(CH)。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)并且在另一端具有一个恒定域(CL)。轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链的可变域与重链的可变域对齐。基于轻链恒定区的氨基酸序列，轻链被分类为λ链或κ链。κ轻链的可变域在此还可以表示为VK。
[0103] 在此提供的抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体或氨基酸变体，人的、人源化的、翻译后修饰的、嵌合的或融合的抗体、免疫偶联物、以及其功能性片段。抗体可以在Fc区中被修饰，并且某些修饰可以提供所希望的效应子功能或血清半衰期。
[0104] 具有本发明的抗α毒素抗体以及片段的一种或多种生物特征(例如效力，α毒素亲和力、效应子功能、直系同源物结合亲和力、中和、α毒素七聚体形成的抑制、等等)的抗体也是期望的。抗α毒素抗体和片段可以用于诊断和/或治疗和/或减轻和/或预防如上所述的在哺乳动物中的与金黄色葡萄球菌相关的疾病的一种或多种症状。
[0105] 在此提供了一种含有抗α毒素抗体或片段以及载体的组合物。出于治疗金黄色葡萄球菌相关疾病的目的，可以将组合物给予对这种治疗有需要的患者，其中组合物可以包含一种或多种抗α毒素抗体和/或其片段。还提供了含有如在此呈现的抗α毒素抗体或其片段以及载体的制剂。在一些实施例中，该制剂是含有药学上可接受载体的预防性的或治疗性的制剂。
[0106] 在某些实施例中，这里提供的方法用于治疗在哺乳动物中的与金黄色葡萄球菌相关的和/或α毒素相关的疾病/病症和/或预防和/或减轻该疾病或病症的一种或多种症状，该方法包括将治疗有效量的抗α毒素抗体或片段给予至哺乳动物。可以如医师所指导进行短期(急性)或慢性的、或间歇性地给予抗体预防性或治疗性组合物。
[0107] 在某些实施例中，制造的物品(例如在无菌剂型和/或在试剂盒中)包含至少一种抗α毒素抗体或片段。含有抗α毒素抗体或片段的试剂盒可以发现例如用于金黄色葡萄球菌细胞杀伤测定、用于从细胞纯化或免疫沉淀α毒素的用途。例如，为了分离和纯化α毒素，试剂盒可以含有连接至珠粒的抗α毒素抗体或片段(例如，琼脂糖凝胶珠)。试剂盒可以含有用于在ELISA或Western印迹中体外检测和定量金黄色葡萄球菌和/或α毒素的抗体。对于检测有用的这样一种抗体可以提供有一种标记物，例如荧光或放射性标记。
[0108] 术语
[0109] 应当理解的是，在此提供的方法不限于特定的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当指出，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/个”(“a”，“an”)和“该”包括单数和复数指示物，除非在上下文中另有明确规定。
[0110] 特异性结合α毒素多肽(例如，α毒素单体)的分离抗体、或其抗原结合片段在此是指单数形式的“抗α毒素抗体或片段”以及复数形式的“抗α毒素抗体或片段”。α毒素多肽有时称为α溶血素。α毒素在寡聚化为七聚体之后在细胞膜中形成孔，其中寡聚化的多肽有时统称为“α毒素孔”或“α毒素七聚体”。
[0111] 常常在此通过公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及氨基酸。同样，常常通过普遍接受的单字母密码提及核苷酸。
[0112] 除非另外指明，在抗体的可变域、互补决定区(CDR)以及框架区(FR)中的氨基酸的编号遵循如在Kabat(卡巴特)等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白质的序列)，Public Health Service,5th Ed.(公共卫生署第五次编写)，National Institutes of Health(国立卫生研究院)，Bethesda(贝塞斯达)，Maryland(马里兰州)(1991)中提出的Kabat定义。使用这个编号系统，相应于可变域的FR或CDR的缩短、或插入，实际的线性氨基酸序列可以含有较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b、和82c，等等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区的比对而对给定的抗体确定残基的Kabat编号。框架残基的最大比对常常需要在编号系统中的有待用于Fv区的“间隔”残基插入。另外，由于种间或等位基因差异，在任何给定的Kabat位点编号处的某些个别残基的身份可以从抗体链到抗体链而不同。
[0113] 抗α毒素抗体以及片段
[0114] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段是被分离和/或纯化和/或无热原的。在此使用的术语“纯化”是指已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的感兴趣分子。因此，在一些实施例中，提供的抗体是一种纯化的抗体，其中它已经从其天然环境的一种或多种组分分离。如在此使用的术语“分离抗体”是指基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体分子的抗体(例如，特异性结合至α毒素的分离抗体是基本上没有特异性结合不同于α毒素的抗原的抗体)。双或多特异性抗体分子是在基本上没有其他抗体分子时的分离抗体。因此，在一些实施例中，提供的抗体是分离抗体，其中它们已经从具有不同特异性的抗体分离。分离抗体可以是单克隆抗体。然而，特异性结合至金黄色葡萄球菌α毒素的同种型或变体的表位的分离抗体可以具有与例如来自其他物种(例如葡萄球菌种类同系物)的其他相关抗原的交叉反应性。如提供的分离抗体可以基本上没有一种或多种其他细胞材料。在一些实施例中，“分离的”单克隆抗体的组合被提供，并且涉及具有不同特异性并被组合在定义的组合物中的抗体。在此将更详细地描述抗α毒素抗体或片段的产生和纯化/分离的方法。
[0115] 呈现的分离抗体包括在此披露的抗体氨基酸序列，这些抗体氨基酸序列可以由任何适合的多核苷酸编码。分离抗体有时是以配制的形式提供的。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段结合金黄色葡萄球菌α毒素并且由此部分或基本上改变α毒素的至少一种生物活性，例如寡聚化为活性七聚体复合体。
[0116] 抗α毒素抗体或片段常常免疫特异性地结合至对α毒素蛋白、肽、亚基、片段、部分、寡聚体或其任何组合为特异的一种或多种表位，并且通常不特异性地结合至其他多肽。术语“寡聚体”或“α毒素寡聚体”是指形成功能性孔(例如7个α毒素单体)的α毒素单体(例如，2个单体、3个单体、4个单体、5个单体、6个单体或7个单体)的结合。表位可以包括含有α毒素蛋白的至少一部分的至少一个抗体结合区。如在此使用的术语“表位”是指能够结合至抗体的蛋白质决定簇。表位通常包括诸如氨基酸和/或糖侧链的分子的化学活性表面基团，并且通常具有特定的三维结构特征、以及特定的化学特征(例如电荷、极性、碱性、酸性、疏水性等等)。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂的存在下，与前者(而不是后者)的结合消失。在一些实施例中，识别的表位干扰活性七聚体的形成(例如，抑制α毒素单体寡聚化为活性七聚体复合体)。
[0117] 在某些实施例中，表位是由涉及α毒素七聚体复合体形成的α毒素蛋白的至少一部分组成的。指定的表位可以包括α毒素蛋白的连续氨基酸的至少3个氨基酸残基乃至整个指定部分中的至少一个氨基酸序列的任何组合。在一些实施例中，表位是α毒素蛋白的连续氨基酸中的至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基、至少13个氨基酸残基、至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基乃至整个指定部分。在某些其他实施例中，表位包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续氨基酸残基。在另外的实施例中，包含在表位之内的氨基酸残基涉及α毒素七聚体复合体形成。在某些实施例中，接触残基包括T261、T263、N264、K266和K271。在其他实施例中，接触残基包括SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。在另外的实施例中，接触残基包括SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T263、N264、K266和K271。在某些实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸261-272。在其他实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸248-277。在其他实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸173-201以及261-272。
[0118] 因此，在具体实施例中，分离/纯化的抗α毒素抗体和片段免疫特异性地结合至包含根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列的分子和/或包含根据SEQ ID NO:40的氨基酸序列的分子。在某些实施例中，抗α毒素抗体和片段还结合来自不同物种的α毒素同系物或直系同源物，或者结合至SEQ ID NO:39的氨基酸序列的变体，其中在位置35处的组氨酸被亮氨酸替换或被相应于本领域的普通技术人员已知的H35突变的其他氨基酸替换。
[0119] 可变区
[0120] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段是从亲本抗体制备的。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含在亲本抗体中。如在此使用的，术语“亲本抗体”是指由用于制备在此定义的变体或衍生物的氨基酸序列编码的抗体。亲本多肽可以包含天然抗体序列(即，天然存在的，包括天然存在的等位基因变体)或天然存在序列的具有事先存在的氨基酸序列修饰(例如其他插入、缺失和/或置换)的抗体序列。亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。在具体实施例中，抗α毒素抗体和片段是亲本抗体的变体。如在此使用的，术语“变体”是指借助在亲本抗体序列中添加、缺失和/或置换一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列上不同于“亲本”抗α毒素抗体或片段氨基酸序列的抗α毒素抗体或片段。
[0121] 抗体的抗原结合部分包含保留特异性结合至抗原(例如α毒素)能力的抗体一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段完成。包含在术语抗体“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的Fv片段VL和VH结构域组成，(v)dAb片段，由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH常常由分离的基因编码，可以使用重组方法通过使它们能够被制造为单一蛋白质链的合成接头而将它们结合，该单一蛋白质链中的VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体还被包含在术语“抗体”和抗体的“抗原结合部分”之内。可以使用已知的技术获得这些抗体片段，并且这些片段能以与完整抗体相同的方式筛选其结合活性。可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶裂解或化学裂解而产生抗原结合部分。
[0122] 本发明的抗α毒素抗体和片段包含至少一个抗原结合域。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有SEQ ID NO:
19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的VL。在又另一个实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的VL。参见实例11，表7表示如在此呈现的VH和VL序列，这些VH和VL序列能以形成抗α毒素抗体或片段的任何组合存在，或者以形成本发明的mAb的一种组合存在。在一些实施例中，VH选自SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62。在不同的实施例中，VL选自EQ ID NO:19、21、23、25、
27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63。某些VH和VL核苷酸序列呈现于实例11、表8中。
19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的VL。在又另一个实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的VL。参见实例11，表7表示如在此呈现的VH和VL序列，这些VH和VL序列能以形成抗α毒素抗体或片段的任何组合存在，或者以形成本发明的mAb的一种组合存在。在一些实施例中，VH选自SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62。在不同的实施例中，VL选自EQ ID NO:19、21、23、25、
27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63。某些VH和VL核苷酸序列呈现于实例11、表8中。
[0123] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中该VH和VL具有由SEQ ID NO:20和19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和
58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63表示的氨基酸序列。
58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63表示的氨基酸序列。
[0124] 实例11的表1-7提供了用于在此呈现的抗体和片段的某些实施例的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、以及互补决定区(CDR)。在某些实施例中，抗α毒素抗体和片段包括具有与披露于表7中的VH和/或VL序列的至少一者的给定百分比一致性的VH和/或VL。如在此使用的，术语“序列一致性百分比(％)”(也包括“同源性”)被定义为在比对序列和(如果需要的话)引入空位(以便获得最大的百分比序列一致性)并且不将任何保守性置换考虑为序列一致性的部分之后，在候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与在参考序列(例如亲本抗体序列)中的氨基酸残基或核苷酸一致的百分比。除了手动外，可以借助于本领域已知的局部同源性算法或借助于使用这些算法的计算机程序(威斯康星州，麦迪逊市，科学驱动路
575号(575Science Drive)，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N以及TFASTA)而产生用于比较的序列的最优比对。
575号(575Science Drive)，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N以及TFASTA)而产生用于比较的序列的最优比对。
[0125] 在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含这样一种VH氨基酸序列，该VH氨基酸序列包含与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的一致性，或包含与其100％的一致性。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含这样一种VH氨基酸序列，该VH氨基酸序列与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致，或100％一致。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列中的1-10个保守性置换。在某些实施例中，包含具有与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的给定百分比一致性的VH氨基酸序列的抗α毒素抗体或片段具有一种或多种选自下组的特征(以下更详细描述)，该组由以下各项组成：
[0126] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0127] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0128] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0129] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；
[0130] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0131] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段以由解离常数(KD)表征的亲和力而结合抗原(例如α毒素)，该解离常数在大约0.01nM至大约50nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nN、5nM、10nM、20nM、30nM、或40nM的范围内。
[0132] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含这样一种VL氨基酸序列，该VL氨基酸序列与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致，或100％一致。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含这样一种VL氨基酸序列，该VL氨基酸序列与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％一致，或100％一致。在不同的实施例中，抗α毒素抗体或片段包含在SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列中的1-
10个保守性置换。在某些实施例中，包含具有与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、
50、52、54、56、58、60或63的给定百分比一致性的VL氨基酸序列的抗α毒素抗体或片段具有一种或多种选自下组的特征(以下更详细描述)，该组由以下各项组成：
96％、97％、98％、99％一致，或100％一致。在不同的实施例中，抗α毒素抗体或片段包含在SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列中的1-
10个保守性置换。在某些实施例中，包含具有与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、
50、52、54、56、58、60或63的给定百分比一致性的VL氨基酸序列的抗α毒素抗体或片段具有一种或多种选自下组的特征(以下更详细描述)，该组由以下各项组成：
[0133] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0134] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0135] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0136] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；
[0137] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0138] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段以由解离常数(KD)表征的亲和力而结合抗原(例如α毒素)，该解离常数在大约0.01nM至大约50nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nN、5nM、10nM、20nM、30nM、或40nM的范围内。
[0139] 在具体实施例中，抗体或抗体片段免疫特异性地结合至α毒素，并且包含重链可变域，该重链可变域包括与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90％的一致性，并且包含轻链可变域，该轻链可变域具有与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少
90％的一致性，其中抗体具有抑制一种或多种α毒素毒素单体彼此结合的活性(例如，抑制寡聚化)。
90％的一致性，其中抗体具有抑制一种或多种α毒素毒素单体彼此结合的活性(例如，抑制寡聚化)。
[0140] 互补决定区
[0141] 当可变域(VH和VL)包含抗原结合区时，变异性不是通过抗体的可变域均匀分布的。它被集中在轻链(VL或VK)和重链(VH)可变域两者中的称为互补决定区(CDR)的区段中。可变域的更高保守性的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含由三个CDR连接的四个FR，这四个FR大体上采用β片层构型，这三个CDR形成连接β片层结构的环并且在一些情况下形成β片层结构的部分。在每个链中的CDR由FR紧密靠近地保持在一起，与来自另一条链的CDR促成了抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat(卡巴特)等人，上文)。
重链的三个CDR被指定为VH-CDR1、VH CDR2、和VH-CDR-3，而轻链的三个CDR被指定为VL-CDR1、VL-CDR2、和Vl-CDR3。在此使用Kabat编号系统。像这样，VH-CDR1大致开始于氨基酸31(即，在第一个半胱氨酸残基之后大致9个残基处)，包括大致5-7个氨基酸，并且结束于下一个丝氨酸残基。VH-CDR2开始于在CDR-H1末端之后的第十五个残基，包括大致16-19个氨基酸，并且结束于下一个甘氨酸残基。VH-CDR3开始于在VH-CDR2末端之后的大致第三十个氨基酸残基处；包括大致13-15个氨基酸；并且结束于序列M-D-V。VL-CDR1大致在残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大致10-15个残基；并且结束于序列Y-V-S。VL-CDR2开始于在VL-CDR1末端之后大致第十六个残基处，并且包括大致7个残基。VL-CDR3开始于在VH-CDR2末端之后的大致第三十三个残基处；包括大致7-11个残基并且结束于序列T-I-L。注意CDR从抗体到抗体相当不同(并且通过限定将不展现与Kabat共有序列的同源性)。
重链的三个CDR被指定为VH-CDR1、VH CDR2、和VH-CDR-3，而轻链的三个CDR被指定为VL-CDR1、VL-CDR2、和Vl-CDR3。在此使用Kabat编号系统。像这样，VH-CDR1大致开始于氨基酸31(即，在第一个半胱氨酸残基之后大致9个残基处)，包括大致5-7个氨基酸，并且结束于下一个丝氨酸残基。VH-CDR2开始于在CDR-H1末端之后的第十五个残基，包括大致16-19个氨基酸，并且结束于下一个甘氨酸残基。VH-CDR3开始于在VH-CDR2末端之后的大致第三十个氨基酸残基处；包括大致13-15个氨基酸；并且结束于序列M-D-V。VL-CDR1大致在残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大致10-15个残基；并且结束于序列Y-V-S。VL-CDR2开始于在VL-CDR1末端之后大致第十六个残基处，并且包括大致7个残基。VL-CDR3开始于在VH-CDR2末端之后的大致第三十三个残基处；包括大致7-11个残基并且结束于序列T-I-L。注意CDR从抗体到抗体相当不同(并且通过限定将不展现与Kabat共有序列的同源性)。
[0142] 本发明的抗α毒素抗体和片段包含至少一个抗原结合域，该抗原结合域包含至少一个互补决定区(CDR1、CDR2或CDR3)。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有至少一个VH CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)的VH。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包括含有至少一个VL CDR(例如，CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3)的VL。
[0143] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含：(a)VH CDR1，该VH CDR1包含与SEQ ID NO:7、10、13或69一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(b)VH CDR2，该VH CDR2包含与SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；以及(c)VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0144] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；
SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和
71一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和
71一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0145] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL CDR1，该VL CDR1包含与SEQ ID NO:1或4一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(b)VL CDR2，该VL CDR2包含与SEQ ID NO:2、5、73或77一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；以及(c)VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、
2、或3个氨基酸残基置换。
2、或3个氨基酸残基置换。
[0146] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，该VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、77和74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0147] 在一些实施例中，免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，在各自的CDR中包含与以下各项一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换：(a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；(b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；(c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列；(d)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；(e)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73、或77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0148] 在具体实施例中，分离抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、以及VL CDR3，在各自的CDR中包含与SEQ ID NO:7、8、9、1、2和3；SEQ ID NO:10、11、12、1、2和3；SEQ ID NO:13、14、15、4、5和6；SEQ ID NO:7、17、18、1、2和3；SEQ ID NO:
7、8、16、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、
8、67、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、
65、1、2和68；SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、
75、71、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、71、1、77和74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
7、8、16、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、
8、67、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、
65、1、2和68；SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、
75、71、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、71、1、77和74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0149] 在一些实施例中，提供了一种含有分离抗体或其抗原结合片段的组合物，该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VH链结构域的三个CDR包括(a)含有SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列的VH CDR1；(b)含有SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列的VH CDR2；以及(c)含有SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、
66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具体实施例中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:
7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71。
66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具体实施例中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:
7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71。
[0150] 在某些实施例中还提供了含有一种分离抗体或其抗原结合片段的组合物，该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VL链结构域的三个CDR包括(a)含有SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列的VL CDR1；(b)含有SEQ ID NO:2、5、73、或77的氨基酸序列的VL CDR2；以及(c)含有SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列的VL CDR3。在具体实施例中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:
4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、
77和74。
4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、
77和74。
[0151] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段免疫特异性地结合金黄色葡萄球菌α毒素，并且包含(a)VH CDR1，该VH CDR1包含与SEQ ID NO:7、10、13或69一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(b)VH CDR2，该VH CDR2包含与SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；以及(c)VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；(d)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；(e)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73、或77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列，并且具有选自下组的一种或多种特征(以下更详细描述)，该组由以下各项组成：：
[0152] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0153] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0154] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0155] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；
[0156] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0157] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段以由解离常数(KD)表征的亲和力而结合抗原(例如α毒素)，该解离常数在大约0.01nM至大约50nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nN、5nM、10nM、20nM、30nM、或40nM的范围内。
[0158] 实例11、表1-7提供了本发明抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的序列。表9提供了VH和VL CDR的总结。这些区域能以各种组合而组合，因为每个CDR区可以被独立选择用于给定的抗体。表7展示了可以被选择用于每个区的不同序列。在某些实施例中，VL CDR3序列能以任何组合存在，从而形成本发明的抗α毒素抗体或片段。在某些实施例中，如在表9中所描绘，VH CDR1选自SEQ ID NO:7、10、13或69，VH CDR2选自SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75，并且VH CDR3选自SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78。在一些实施例中，如在表9中所描绘，VL CDR1选自SEQ ID NO:1或4，VL CDR2选自SEQ ID NO:2、5、73、或77，并且VL CDR3选自SEQ ID NO:3、6、64、68或74。
[0159] VH CDR3和VL CDR3结构域在针对抗原的抗体结合特异性/亲和力中起作用。因此，在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段或其抗原结合片段包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。在不同的实施例中，抗α毒素抗体或片段包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。抗α毒素抗体和片段的剩余部分(例如CDR1、CDR2、VH、VL，等等)可以包含在此披露的特定序列或者已知序列，前提是这些抗α毒素抗体和片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素。
[0160] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制α毒素寡聚化。
[0161] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制α毒素寡聚化。
[0162] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段减少或抑制细胞因子的释放。
[0163] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段减少或抑制细胞因子的释放。
[0164] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段减轻或消除皮肤坏死。
[0165] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段减轻或消除皮肤坏死。
[0166] 抗α毒素抗体和片段常常包含与在此所述的氨基酸序列基本上相同的一个或多个氨基酸序列。基本上相同的氨基酸序列包括含有保守性氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守性氨基酸置换是指一个第一氨基酸被一个第二氨基酸替换，该第二氨基酸具有与第一氨基酸的化学和/或物理性质相似的化学和/或物理性质(例如，电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)。保守性置换包括将一个氨基酸用在以下组中的另一个氨基酸替换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)以及组氨酸(H)；天冬氨酸(D)以及谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)以及甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
[0167] 框架区
[0168] 重链和轻链的可变域各自包含四个框架区(通常为FR1、FR2、FR3、FR4或可替代地为FW1、FW2、FW3、FW4)，是可变域的更高保守性的部分。重链的四个框架区在此被指定为VH-FW1、VH-FW2、VH-FW3和VH-FW4，并且轻链的四个框架区在此被指定为VL-FWl、VL-FW2、VL-FW3和VH-FW4。在此使用了Kabat编号系统，并且像这样，VH-FW1开始于位置1并且大约在氨基酸30处结束，VH-FW2大致是从氨基酸36至49，VH-FW3大致是从氨基酸66至94，并且VH-FW4大致为氨基酸103至113。VL-FW1开始于氨基酸1并且在大致氨基酸23处结束，VL-FW2大致是从氨基酸35至49，VL-FW3大致是从氨基酸57至88，并且VL-FW4大致是从氨基酸98至107。在某些实施例中，框架区包含根据Kabat编号系统的置换，例如在VL-FW1中106A处的插入。除了天然存在的置换之外，FR残基的一种或多种改变(例如，置换)也可以被引入抗α毒素抗体或片段中。在某些实施例中，这些改变导致针对抗α毒素的抗体结合亲和力的改进或优化。可以被修饰的框架区残基的非限制性实例包括非共价直接结合抗原、与CDR的构象相互作用/影响CDR构象、和/或参与VL-VH界面的那些残基。
[0169] 在某些实施例中，框架区可以包含一个或多个氨基酸变化，用于“种系化(germlining)”的目的。例如，将所选择的抗体重链和轻链的氨基酸序列与种系重链和轻链氨基酸序列进行比较，并且其中所选择的VL和/或VH链的某些框架残基不同于种系构型(例如，由于用来制备噬菌体文库的免疫球蛋白基因的体细胞突变)，可能希望的是使所选择抗体的改变的框架残基“回复突变”为种系构型(即，改变所选择的抗体的框架氨基酸序列，使得它们与种系框架氨基酸序列相同)。框架残基的这种“回复突变”(或“种系化”)可以通过用于引入特定突变的标准分子生物学方法完成(例如，定点诱变；PCR介导的诱变，等等)。在一些实施例中，可变的轻链和/或重链框架残基被回复突变。在某些实施例中，呈现的分离抗体或其抗原结合片段的可变重链被回复突变。在某些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段的可变重链包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个回复突变。
[0170] 在某些实施例中，在此呈现的抗α毒素抗体或片段的VH可以包含FR1、FR2、FR3和/或FR4，该FR1、FR2、FR3和/或FR4具有与在SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62内的相应框架区从大约65％至大约100％的氨基酸序列一致性(即，抗体X的FR1相比于抗体Y的FR1)。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR至少
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致或100％一致的VH FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含与VH SEQ ID NO:20、22、24、26、
28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％一致或100％一致的VH FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致或100％一致的VH FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含与VH SEQ ID NO:20、22、24、26、
28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％一致或100％一致的VH FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。
[0171] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以包含VH FR(FR1、FR2、FR3和/或FR4)，该VH FR包含与VH SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR包含1、2或3个氨基酸置换。具体而言，VH的FR1、FR2、FR3或FR4可以各自具有与VH SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、
49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR1、FR2、FR3或FR4一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR1、FR2、FR3或FR4包含1、2或3个氨基酸置换。
49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR1、FR2、FR3或FR4一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR1、FR2、FR3或FR4包含1、2或3个氨基酸置换。
[0172] 在某些实施例中，在此提供的抗α毒素抗体或片段的VL可以包含FR1、FR2、FR3和/或FR4，该FR1、FR2、FR3和/或FR4具有与在VL SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63之内的相应框架区的氨基酸序列一致性(即，抗体X的FR1相比于抗体Y的FR1)(例如，从大约65％至大约100％序列一致性)。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含与VL SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致或100％一致的VL FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含与VL SEQ ID NO:19、21、23、
25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％一致或100％一致的VL FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。
25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％一致或100％一致的VL FR氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。
[0173] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含VL FR(FR1、FR2、FR3和/或FR4)，该VL FR包含与VL SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR包含1、2或3个氨基酸置换。具体而言，VL的FR1、FR2、FR3或FR4可以各自具有与VH SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR1、FR2、FR3或FR4一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR1、FR2、FR3或FR4包含1、2或3个氨基酸置换。
[0174] 在某些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合α毒素并且包含VH FR(FR1、FR2、FR3和/或FR4)和/或VL FR(FR1、FR2、FR3和/或FR4)，该VH FR包含与VH SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相应FR一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR包含1、2或3个氨基酸置换，该VL FR包含与VL SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相应FR一致的氨基酸序列或相对于它们的相应FR包含1、2或3个氨基酸置换，其中该抗体具有一种或多种选自下组的特征(以下更详细描述)，该组由以下各项组成：
[0175] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0176] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0177] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0178] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；
[0179] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0180] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段以由解离常数(KD)表征的亲和力而结合抗原(例如α毒素)，该解离常数在大约0.01nM至大约50nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nN、5nM、10nM、20nM、30nM、或40nM的范围内。
[0181] 编码抗α毒素抗体和片段的核苷酸序列
[0182] 除了以上所述的氨基酸序列之外，另外提供了相应于这些氨基酸序列并且编码在此披露的人的、人源化的和/或嵌合的抗体的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含编码在此所述的抗α毒素抗体或片段或其片段的核苷酸序列。这些包括但不限于编码以上提及的氨基酸序列的核苷酸序列。核苷酸序列提供于实例11、表8中。因此，还提供了编码包括在此所述的抗体的CDR和FR的VH和VL框架区的多核苷酸序列以及用于它们在细胞(例如哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。使用多核苷酸制造抗α毒素抗体或片段的方法更详细地描述于下文。
[0183] 还包括在严谨或较低严谨性的杂交条件(例如，如在此定义的)下与编码抗α毒素抗体或片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。如在此使用的术语“严谨性”是指杂交实验的实验条件(例如，温度和盐浓度)，指示在两个核酸之间的同源性的程度；严谨性越高，两个核酸之间的同源性百分比越高。
[0184] 严谨杂交条件包括但不限于：在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下杂交至过滤器结合的DNA，随后在大约50℃-65℃在0.2X SSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次；高度严谨条件例如在6X SSC中、在大约45℃下杂交至过滤器结合的DNA，随后在大约65℃在0.1X SSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次；或者任何其他已知的严谨杂交条件。
[0185] 在某些实施例中，核酸或其片段可以编码抗α毒素抗体或片段并且在严谨条件下与包含编码SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交。
[0186] 在某些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致。在一些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37或38的核苷酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含这样一种核苷酸序列，该核苷酸序列包括与编码SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、
52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少大约90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少大约90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
[0187] 在某些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的VH氨基酸序列的VH核苷酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:30、32、34、36或38的VH核苷酸序列至少大约65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段是由编码VH的核苷酸序列编码的，该编码VH的核苷酸序列包括与编码SEQ ID NO:20、22、24、26、28、
41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的核苷酸序列至少大约90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段是由编码VH的核苷酸序列编码的，该编码VH的核苷酸序列包括与编码SEQ ID NO:20、22、24、26、28、
41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的核苷酸序列至少大约90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
[0188] 在某些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的VL氨基酸序列的VL核苷酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，多核苷酸序列可以包含编码抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:29、31、33、35或37的VL核苷酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段是由编码VL的核苷酸序列编码的，该编码VL的核苷酸序列包括与编码EQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
[0189] 在具体实施例中，多核苷酸序列可以包含编码与VH氨基酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，以及编码与VL氨基酸序列至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的抗α毒素抗体或片段的核苷酸序列，其中VH和VL序列表示为SEQ ID NO:20和19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63。
[0190] 基本上一致的序列可以是多态性序列，即在一个种群中的可替代序列或等位基因。等位基因差异可以小到一个碱基对。基本上一致的序列还可以包含诱变序列，包括含有沉默突变的序列。突变可以包含一个或多个残基改变、一个或多个残基的缺失、或一个或多个另外的残基的插入。
[0191] 可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸以及确定的多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体核苷酸序列是已知的，编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装，简言之，涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接、以及然后通过PCR进行连接的寡核苷酸的扩增。
[0192] 编码抗体的多核苷酸还可以从来自适合来源的核酸产生。如果包含编码具体抗体的核酸的克隆是不可获得的，但是抗体分子的序列是已知的，则编码该免疫球蛋白的核酸可以化学合成或通过使用合成引物(这些合成引物与序列的3'和5'端可杂交)的PCR扩增或者通过使用寡核苷酸探针(对于特定的基因序列具有特异性，以便从cDNA文库鉴定编码抗体的cDNA克隆)的克隆(例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆)而从适合来源(例如，抗体cDNA文库、或产生自表达抗体的任何组织或细胞的cDNA文库或从它们分离的核酸、有时为polyA+RNA，这些细胞例如被选择为表达抗体的杂交瘤细胞)获得。可以使用本领域已知的任何方法，进而将通过PCR产生的扩增核酸克隆进可复制的克隆载体中。
[0193] 一旦确定抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，可以使用用于操纵核苷酸序列的本领域中的已知方法(例如重组DNA技术、定点诱变、PCR、等等)来操纵抗体的核苷酸序列，从而产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失、和/或插入。
[0194] 如在此使用的，术语“严谨条件”是指用于杂交和洗涤的条件。用于杂交反应温度条件优化的方法对于本领域的技术人员是已知的。水性和非水性方法描述于参考文献中并且可以使用任何一种。严谨杂交条件的非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤一次或多次。严谨杂交条件的另一个实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在55℃下洗涤一次或多次。严谨杂交条件的另外的实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在60℃下洗涤一次或多次。
经常地，严谨杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。更经常地，严谨条件是在0.5M磷酸钠、7％SDS、在65℃，随后在0.2X SSC、1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。还可以用某些有机溶剂(例如甲酰胺)的添加来改变(即，降低)严谨杂交温度。有机溶剂，像甲酰胺，降低了双链多核苷酸的热稳定性，使得杂交可以在较低温度下进行，同时仍然保持严谨条件并且延长可能不耐热的核酸的使用寿命。
经常地，严谨杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。更经常地，严谨条件是在0.5M磷酸钠、7％SDS、在65℃，随后在0.2X SSC、1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。还可以用某些有机溶剂(例如甲酰胺)的添加来改变(即，降低)严谨杂交温度。有机溶剂，像甲酰胺，降低了双链多核苷酸的热稳定性，使得杂交可以在较低温度下进行，同时仍然保持严谨条件并且延长可能不耐热的核酸的使用寿命。
[0195] 如在此使用的，短语“杂交”或其语法变体，是指在低、中、或高严谨性条件下，或在核酸合成条件下，将第一核酸分子结合至第二核酸分子。杂交可以包括第一核酸分子结合至第二核酸分子的情况，其中该第一和第二核酸分子是互补的。如在此使用的，相比于杂交至不具有互补序列的核酸分子，“特异性杂交”是指在引物的核酸合成条件下优先杂交至具有与引物互补的序列的核酸分子。例如，特异性杂交包括引物与目标核酸序列的杂交，该目标核酸序列与该引物互补。
[0196] 在一些实施例中，引物可以包括可能与固相核酸引物杂交序列互补或基本上与固相核酸引物序列互补(例如，当比对时，与引物杂交序列互补物大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上一致)的核苷酸序列。引物可以包含与固相核酸引物杂交序列不互补或基本上不互补的核苷酸亚序列(例如，在与固相引物杂交序列互补或基本上互补的引物中的核苷酸亚序列的3’或5’端处)。
94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上一致)的核苷酸序列。引物可以包含与固相核酸引物杂交序列不互补或基本上不互补的核苷酸亚序列(例如，在与固相引物杂交序列互补或基本上互补的引物中的核苷酸亚序列的3’或5’端处)。
[0197] 在某些实施例中引物可以包含修饰，例如肌苷、脱碱基位点、锁核酸、小沟结合剂、双链体稳定剂(例如，吖啶、亚精胺)、Tm修饰剂或改变引物或探针的结合特性的任何修饰剂。
[0198] 在某些实施例中，引物可以包含可检测的分子或实体(例如，荧光团、放射性同位素、比色剂、颗粒、酶等等)。当希望时，可以使用本领域的技术人员已知的任何方法修饰核酸以便包括可检测标记物。在在此所述的任何过程中，可以将标记物掺入作为合成的一部分、或在使用引物之前将其添加。可以在液相中或在固相上进行标记物的掺入。在一些实施例中，可检测标记物对于目标的检测可以是有用的。在一些实施例中，可检测标记物对于目标核酸的定量可以是有用的(例如，确定核酸的特定序列或种类的拷贝数)。任何适用于检测系统中的相互作用或生物活性的可检测标记物可以由技术人员适当地选择并使用。可检测标记物的实例是荧光标记物，例如荧光素、罗丹明、以及其他(例如，Anantha(阿南塔)等人，Biochemistry(《生物化学》)(1998)37:2709 2714；以及Qu(曲)&Chaires，Methods Enzymol.(《酶学方法》)(2000)321:353 369)；放射性同位素(例如，125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd、和127Xe)；光散射标记物(例如，美国专利号6,214,560，标记物可商购于Genicon科学公司(Genicon Sciences Corporation)，加利福尼亚州(California)；化学发光标记物和酶底物(例如二氧杂环丁烷和吖啶酯)，酶标记物或蛋白质标记物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或其颜色变体、萤光素酶、过氧化物酶)；其他发色标记物或染料(例如，菁蓝)、以及其他辅因子或生物分子，例如地高辛配基、链霉亲和素(strepdavidin)、生物素(例如，结合对的成员，比如像生物素与亲和素))、亲和捕获部分(affinity capture moiety)等等。在一些实施例中，可以用亲和捕获部分来标记引物。还包含在可检测标记物中的是对用于质谱(例如，基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱和电喷射(ES)质谱)检测的质量修饰有用的那些标记物。
[0199] 引物还可以是指与目标核酸的亚序列或另一个引物杂交的多核苷酸序列，并且促进引物、目标核酸或两者的检测，例如正如分子信标。如在此使用的术语“分子信标”是指可检测分子，其中该分子的可检测特性仅是在某些特定条件下是可检测的，由此使得它能够作为特异性的和信息性的信号起作用。可检测特性的非限制性实例是光学特性、电性能、磁性能、化学特性以及通过已知大小的开口的时间或速度。
[0200] 在一些实施例中，分子信标可以是能够形成茎环结构的单链寡核苷酸，其中环序列可以与感兴趣的目标核酸序列互补，并且侧翼为能形成茎的短互补臂。可以将寡核苷酸在一端用荧光团标记并且在另一端用淬灭剂分子标记。在茎环构象中，类似于在荧光共振能量转移、或FRET中所见到的，来自激发的荧光团的能量通过远程偶极-偶极耦合作用而被转移至淬灭剂，并且作为热而不是光而被释放。当环序列杂交至特定目标序列时，分子的两端分开，并且来自激发的荧光团的能量被发射为光，产生可检测信号。分子信标提供了附加的优势，即，由于未杂交探针的自淬灭性质，过量探针的去除是不必要的。在一些实施例中，分子信标探针可以被设计为在通过调节环-靶标杂交和茎形成的相对强度而区别或容许环与靶序列之间的错配。如在此所提及的术语“错配核苷酸”或“错配”是指在那个位置或那些位置与靶序列不互补的核苷酸。探针可以具有至少一个错配，但还可以具有2、3、4、5、6或7或更多个错配核苷酸。
[0201] 抗α毒素抗体和片段的生物特征
[0202] 一种抗体可以具有与在此所述的抗体一致或相似的一种或多种特征，并且经常具有使它区别于结合至相同抗原α毒素的其他抗体的一种或多种生物特征。如在此使用的，抗体的“生物特征”是指生物化学的结合和功能特征的任何一种或多种，可以用来选择用于治疗、研究、以及诊断用途的抗体。例如，抗α毒素抗体和片段可以在例如表位结合、靶向、亲和性、中和、以及抑制寡聚化或七聚体孔复合体形成方面相同或不同。
[0203] 抗α毒素抗体或片段的生物化学特征包括但不限于等电点(pI)和解链温度(Tm)。抗α毒素抗体或片段的结合特征包括但不限于结合特异性；解离常数(Kd)、或它的倒数缔合常数(Ka)、或它的分量kon或koff率；它结合的表位；在α毒素的不同形式和/或制品(例如，重组的、天然的、乙酰化的)之间区分的能力以及结合可溶的和/或固定的抗原的能力。在此呈现的抗体的功能特征包括但不限于α毒素受体结合的抑制、α毒素寡聚化的抑制、由响应于α毒素表达或活性的级联反应诱导的基因表达的抑制、表达α毒素的细胞的耗尽、表达α毒素的细胞的生长抑制、α毒素的定位的抑制，以及在与金黄色葡萄球菌、α毒素或金黄色葡萄球菌和α毒素相关的一种或多种疾病或病症中的保护。在此描述了抗α毒素抗体和片段的特征以及用于修饰和微调那些特征的方法。用于测量抗体特征的方法在本领域是已知的，其中一些详述于下文。
[0204] 结合特征
[0205] 如上所述，抗α毒素抗体或片段专有地或相对于其他多肽优先地免疫特异性地结合蛋白质、肽、亚基、片段、部分或其任何组合的至少一个特定表位或抗原决定簇。如在此使用的术语“表位”或“抗原决定簇”是指能够结合至抗体的蛋白质决定簇，其中在此的术语“结合”经常涉及特异性结合。这些蛋白质决定簇或表位经常包括分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团，这些基团常常具有特定的三维结构特征，并且常常具有特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂的存在下，与前者(而不是后者)的结合消失。如在此使用的术语“非连续表位”是指在从蛋白质的一级序列中的至少两个分开的区域形成的蛋白质抗原上的构象表位。
[0206] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素以及它的与α毒素寡聚化相关的抗原性片段。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段免疫特异性地结合至α毒素、或SEQ ID NO:39或40的至少任何三个连续氨基酸。在一些实施例中，表位是α毒素蛋白的连续氨基酸中的至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基或至少9个氨基酸残基乃至整个指定部分。在某些实施例中，接触残基包含T261、T263、N264、K266和K271。在其他实施例中，接触残基包括SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。在另外的实施例中，接触残基包括SEQ ID NO:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T263、N264、K266和K271。在某些实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸261-272。在其他实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸248-277。在其他实施例中，与抗体或其抗原结合片段接触的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸173-201以及261-272。
[0207] 在不同实施例中，抗α毒素抗体或它的与α毒素寡聚化相关的片段免疫特异性地结合具有与SEQ ID NO:39或40的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的一致性或100％的一致性的α毒素多肽或其抗原性片段。抗α毒素抗体或片段有时可以免疫特异性地结合至具有与SEQ ID NO:39或40的氨基酸序列至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性或100％的一致性的α毒素多肽或其抗原性片段。
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性或100％的一致性的α毒素多肽或其抗原性片段。
[0208] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以结合在物种间保守的表位。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段结合金黄色葡萄球菌α毒素和来自其他细菌种类的α毒素同系物或直系同源物以及它们的抗原性片段。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以结合至一种或多种α毒素直系同源物和或同种型。在具体实施例中，抗α毒素抗体或片段结合至来自具有α毒素同系物或直系同源物的一种或多种细菌种类的α毒素以及它的与α毒素寡聚化相关的抗原性片段。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以结合在葡萄球菌属或其他密切相关细菌之内的表位，该表位在α毒素同系物和/或同种型和/或构象变体和/或亚型上。
[0209] 在抗原与抗体之间的相互作用常常与其他非共价的蛋白质-蛋白质相互作用相同。通常，四种类型的结合相互作用存在于抗原和抗体之间。(i)氢键，(ii)分散力，(iii)在路易斯酸与路易斯碱之间的静电力，以及(iv)疏水相互作用。疏水相互作用是抗体-抗原相互作用的重要的驱动力，并且是基于经由非极性基团的水的排斥而不是分子的吸引。然而，某些物理力也促进抗原-抗体结合，例如表位形状与不同的抗体结合部位的配合或互补。其他材料和抗原可以与抗体发生交叉反应，由此竞争可获得的游离抗体。
[0210] 在抗原与抗体之间的结合的亲和常数和特异性的测量常常是确定使用抗α毒素抗体和片段的治疗、诊断和研究方法的效力的一个要素。“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如在此使用的“结合亲和力”是指反映在结合对成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(Kd)表示，计算为比率koff/kon。可以通过本领域已知的常见方法测量亲和力，包括在此所述和示例的那些(例如，BiaCore方法)。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向易于解离，而高亲和力抗体通常较快结合抗原并且倾向于较长地保持结合。多种测量结合亲和力的方法在本领域是已知的，出于本技术的目的而可以使用它们中的任何一种。
[0211] 抗α毒素抗体或片段有时具有对α毒素表位的结合亲和力，该结合亲和力由1×10-2M或更小、1×10-3M或更小、1×10-4M或更小、1×10-5M或更小、1×10-6M或更小、1×10-7M或更小、1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、1×10-11M或更小、1×10-12M或更小、
1×10-13M或更小、1×10-14M或更小或1×10-15M或更小的解离常数(Kd)表征。例如，Kd可以是从1×10-15M至1×10-2M、从1×10-14M至1×10-10M、从1×10-9M至1×10-5M以及从1×10-4M至1×10-2M。
1×10-13M或更小、1×10-14M或更小或1×10-15M或更小的解离常数(Kd)表征。例如，Kd可以是从1×10-15M至1×10-2M、从1×10-14M至1×10-10M、从1×10-9M至1×10-5M以及从1×10-4M至1×10-2M。
[0212] 在某些实施例中，抗α毒素抗体和片段是高亲和力抗体。“高亲和力抗体”表示以小于10-8M(例如，10-9M、10-10M、等等)的亲和力结合至α毒素表位的抗体。
[0213] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段被描述为具有特定摩尔浓度的或更佳的结合亲和力。当在此使用“或更佳”时，是指较强的结合，由较小的数字Kd值表示。例如，对于一种抗原具有“0.6nM或更佳”的亲和力的抗体，对于该抗原的抗体的亲和力是<0.6nM，即，0.59nM、0.58nM、0.57nM等等、或任何小于0.6nM的值。
[0214] 在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段的亲和力是就缔合常数(Ka)而言进行描述的，计算为比率kon/koff。在这种情况下，对于α毒素表位，本发明的抗α毒素抗体和片段具2 -1 3 -1 -1 5 -1 6 -1
有包括1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更
大、1×107M-1或更大、1×108M-1或更大、1×109M-1或更大、1×1010M-1或更大1×1011M-1或更大
1×1012M-1或更大、1×1013M-1或更大、1×1014M-1或更大或者1×1015M-1或更大的缔合常数的结合亲和力。例如，Ka可以是从1×102M-1至1×107M-1、从1×107M-1至1×1010M-1、以及从1×
1010M-1至1×1015M-1。
有包括1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更大、1×10M 或更
大、1×107M-1或更大、1×108M-1或更大、1×109M-1或更大、1×1010M-1或更大1×1011M-1或更大
1×1012M-1或更大、1×1013M-1或更大、1×1014M-1或更大或者1×1015M-1或更大的缔合常数的结合亲和力。例如，Ka可以是从1×102M-1至1×107M-1、从1×107M-1至1×1010M-1、以及从1×
1010M-1至1×1015M-1。
[0215] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段从α毒素表位解离的速率可能是有意义的。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段能以小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、或小于10-5s-1的koff结合至α毒素。在一些实施例中，抗α毒素抗体和片段与α毒素表位缔合的速率可以比Kd或Ka的值更有意义。在这种情况下，本发明的抗α毒素抗体和片段以至少10-4M-1s-1、至少5×10-4M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5
6 -1 -1 7 -1 -1
×10M s 、至少10M s 的kon比率结合至α毒素。
6 -1 -1 7 -1 -1
×10M s 、至少10M s 的kon比率结合至α毒素。
[0216] 结合亲和力的确定可以使用在实例部分(参见实例1)中进一步描述的特定技术以及本领域已知的方法来测量。这种方法的一个实例包括通过用感兴趣的抗体的Fab型式以及它的抗原来进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)而测量解离常数“Kd”，该放射性标记抗原结合测定如由以下测定所描述，该测定通过在未标记抗原的逐步增高剂量系列(titration series)的存在下平衡Fab与(125I)-标记抗原的最小浓度、然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗体而测量Fab对抗原的溶液结合亲和力。为了建立该测定的条件，将微量滴定板(Dynex)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获性抗Fab抗体(Cappel Labs)过夜包被，并且随后在室温(大致23℃)用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭两至五个小时。
在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣Fab的连续稀释物进行混合。然后将感兴趣的Fab孵育过夜；然而，孵育可以连续持续较长的时期(例如，65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板，以用于在室温孵育(例如，持续一小时)。然后将溶液去除并且将板用在PBS中的0.1％吐温20(Tween-20)洗涤八次。当板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MicroScint-20；Packard)，并且将板在Topcountγ计数器
(Packard)上计数，持续十分钟。选择给出小于或等于20％的最大结合的各个Fab的浓度以供在竞争性结合测定中使用。
在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣Fab的连续稀释物进行混合。然后将感兴趣的Fab孵育过夜；然而，孵育可以连续持续较长的时期(例如，65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板，以用于在室温孵育(例如，持续一小时)。然后将溶液去除并且将板用在PBS中的0.1％吐温20(Tween-20)洗涤八次。当板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MicroScint-20；Packard)，并且将板在Topcountγ计数器
(Packard)上计数，持续十分钟。选择给出小于或等于20％的最大结合的各个Fab的浓度以供在竞争性结合测定中使用。
[0217] 在另一种情况下，可以通过使用表面等离子体共振测定来测量Kd值，该测定可以例如使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)在25℃用在约10个反应单位(response unit，RU)的固定抗原CM5芯片来进行。简言之，在这种方法的一个实例中，根据供应商的说明书，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore公司)用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用pH 4.8的110mM醋酸钠稀释为5μg/微升(约0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注入从而获得偶联蛋白的大致10个反应单位(RU)。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，在25℃将Fab的两倍连续稀释物(0.78nM至
500nM)以大致25μl/min的流速注入具有0.05％吐温20(Tween 20)(PBST)的PBS中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔结合模型(BIAcore评估软件，3.2版本)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。
500nM)以大致25μl/min的流速注入具有0.05％吐温20(Tween 20)(PBST)的PBS中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔结合模型(BIAcore评估软件，3.2版本)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。
[0218] 如果通过以上的表面等离子体共振测定所得缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可以通过使用荧光淬灭技术来确定，例如，该荧光淬灭技术测量在25℃、在抗原渐增浓度的存在下在PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发波长＝295nm；发射波长＝340nm，16nm带通)的增加或降低，如用分光计(例如配备有流动停止的分光光度计(Aviv仪器公司)或具有搅拌红色比色皿(stir red cuvette)的8000-系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic公司))测量的。根据这项技术的“结合速率”(“on-rate”)或“缔合的速率”(“rate of association”)或“kon”也可以使用如上所述的BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)用以上所述的相同的表面等离子体共振技术来确定。
[0219] 适用于确定所呈现的分离抗体或其抗原结合片段或其改变/突变的衍生物(以下讨论)的结合特征的方法和试剂在本领域中是已知的和/或是可商购的。被设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如， A100，和 2000仪器；Biacore International AB，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)。
[0220] 在一些实施例中，可以将结合测定作为直接结合测定或者作为竞争结合测定而进行。可以使用标准ELISA或标准流式细胞术测定来检测结合。在直接结合测定中，测试了候选抗体与α毒素抗原的结合。在另一方面，竞争结合测定评定了候选抗体与已知的抗α毒素抗体或片段或其他结合α毒素的化合物(例如，受体、抑制剂)竞争的能力。通常，任何允许抗体与能被检测的α毒素结合的方法被包含在用于检测和测量抗体的结合特征的技术的范围内。还可以采用这些方法来筛选提供所希望的特征的那些的一组抗体。
[0221] 在某些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至α毒素并且具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下各项组成：
[0222] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0223] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0224] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0225] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；
[0226] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0227] 在一些实施例中，分离抗体或其抗原结合片段以由解离常数(KD)表征的亲和力而结合抗原(例如α毒素)，该解离常数在大约0.01nM至大约50nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nN、5nM、10nM、20nM、30nM、或40nM的范围内。
[0228] 功能特征
[0229] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段改变α毒素和/或表达α毒素的细胞的生物特性。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段通过结合至多肽以及抑制α毒素单体组装成跨膜孔(例如，α毒素七聚体)而中和α毒素的生物活性。可以用本领域已知的、在一些情况下使用可商购试剂的方法来进行中和测定。α毒素的中和常常是用1×10-6M或更小、1×10-7M或更小、1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小以及1×10-11M或更小的IC50来度量的。在某些实施例中，当免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素的抗体或抗原结合片段是在如实例3-6中所述的浓度时发生中和。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段中和α毒素寡聚化并形成跨膜孔的能力。术语“抑制浓度50％”(缩写为“IC50”)表示用于抑制剂靶向的分子的给定活性(例如，形成跨膜孔七聚体复合体的α毒素寡聚化)的50％抑制所需要的抑制剂(例如，在此提供的抗α毒素抗体或片段)的浓度。较低的IC50值通常相应于更有效的抑制剂。
[0230] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段抑制α毒素的一种或多种生物活性。如在此使用的术语“抑制”是指任何统计学显著的生物活性的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的降低。在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段以至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％抑制α毒素的一种或多种生物活性。
[0231] 在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以耗尽由病原性金黄色葡萄球菌分泌的α毒素。在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以实现由金黄色葡萄球菌分泌的α毒素的至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、或大约100％的耗尽。在具体实施例中，几乎所有可检测的分泌的α毒素从金黄色葡萄球菌感染的细胞耗尽。
[0232] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以体外抑制刺激的α毒素活性(例如，受体结合、寡聚化)和/或表达或分泌α毒素的细胞的增殖。抗α毒素抗体或片段有时以至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％或至少大约75％抑制体外α毒素活性，即金黄色葡萄球菌致病性。用于测量细胞增殖、致病性以及α溶血素活性的方法在本领域是已知的。
[0233] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段可以抑制一种或多种可诱导基因的表达，这些可诱导基因直接或间接响应于由金黄色葡萄球菌感染和/或α毒素表达和功能所创造的环境。在具体实施例中，抗α毒素抗体或片段以至少20％、以至少30％、以至少40％、以至少50％、以至少60％、以至少70％、以至少80％、以至少90％、以至少100％、以至少120％、以至少140％、以至少160％、以至少180％、或以至少200％抑制一种或多种可诱导基因的表达，这些可诱导基因直接或间接响应于由金黄色葡萄球菌和/或α毒素表达和功能所创造的环境。
[0234] 抗α毒素抗体和片段的产生
[0235] 以下描述了用于产生抗体的示例性技术。用于产生抗体的α毒素抗原可以是例如包含涉及寡聚化的α毒素肽序列的肽片段。可以使用包含SEQ ID NO:39的天然金黄色葡萄球菌毒素或包含SEQ ID NO:40的突变体α毒素、变体或抗原性片段而产生针对α毒素的抗体。表达并分泌α毒素的金黄色葡萄球菌细胞还可以用来产生抗体。α毒素的核苷酸和氨基酸序列的实例是可获得的，如提供于例如表10中。可以使用标准重组DNA技术，以来自细菌或真核细胞的分离形式重组地产生α毒素。α毒素可以被表达为带标签(例如，表位标签)的蛋白或其他融合蛋白(例如，GST融合)，以便促进在不同测定中的分离和鉴定。结合至不同标签和融合序列的抗体或结合蛋白是可获得的，如下文详尽阐述。也可以使用其他形式的产生抗体有用的α毒素。
[0236] 不同的标签多肽和它们的对应的抗体在本领域是已知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；flu HA标签多肽及其抗体12CA5；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体。FLAG-肽被抗FLAG-M2单克隆抗体识别。可以通过免疫亲和层析进行含FLAG肽的蛋白质的纯化，该免疫亲和层析使用包含共价连接至琼脂糖的抗FLAG M2单克隆抗体的亲和基质。
其他标签多肽包括KT3表位肽；α-微管蛋白表位肽；以及T7基因10蛋白肽标签。
其他标签多肽包括KT3表位肽；α-微管蛋白表位肽；以及T7基因10蛋白肽标签。
[0237] 可以通过本领域已知的不同程序而产生针对感兴趣抗原的多克隆抗体。例如，可以将α毒素多肽或其免疫原性片段给予至不同的宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、等等，从而诱导含有对抗原具有特异性的多克隆抗体的血清的产生。取决于宿主物种，可以而使用不同的佐剂来增加免疫应答，并且这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(Freund's)(完全的和不完全的)、矿物胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂)、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及潜在有用的人用佐剂(例如BCG(卡介苗))以及短小棒状杆菌。此类佐剂在本领域也是已知的。
[0238] 可以通过相关抗原和佐剂的多重皮下(sc)或腹膜内(ip)注射而在动物中产生多克隆抗体。可以有用的是将相关抗原(尤其是在使用合成肽时)结合至一种在有待免疫的物种中为免疫原性的蛋白质。例如，可以使用双功能剂或衍生剂(反应基团)，例如活化酯(通过半胱氨酸或赖氨酸残基的结合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，将抗原结合至钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂。结合物还可以作为融合蛋白产生于重组细胞培养物中。
[0239] 典型地，通过将适当浓度的抗原或结合物与佐剂进行组合并且将溶液在多个部位注射而针对抗原、免疫原性结合物、或衍生物使动物免疫。还可以如在实例1中所述进行免疫(免疫/杂交瘤产生)。
[0240] 可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体、以及噬菌体展示技术、或其组合。在此所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同种或分离的抗体的群体中获得的一种抗体，例如单独的抗体，这些抗体包括除了可能天然存在的突变(可能以少量存在)之外的相同的群体。单克隆抗体类在多特异性的工程化抗体的情况下针对单个抗原位点或多个抗原位点是高度特异性的。而且，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对该抗原上的相同决定簇的。除了它们的特异性之外，单克隆抗体是有利的，因为它们可以在不被其他抗体污染的情况下被合成。修饰词“单克隆”不应当被理解为需要通过任何特定的方法而产生抗体。以下是用于产生单克隆抗体的代表性方法的描述(不是旨在为限制性的)，并且可以用来产生例如单克隆哺乳动物的、嵌合的、人源化的、人的结构域、双抗体(diabody)、疫苗体(vaccibody)、线性和多特异性抗体。
[0241] 用于使用杂交瘤技术产生并筛选特异性抗体的方法在本领域是常规的和已知的。在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物(例如仓鼠)如上所述被免疫从而引出淋巴细胞，这些淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合至用于免疫的抗原的抗体。可替代地，淋巴细胞可以被体外免疫。在免疫之后，分离淋巴细胞，并且然后使用适合的融合剂或融合配偶体(例如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合从而形成杂交瘤细胞。在某些实施例中，选择的骨髓瘤细胞是有效融合、支持由所选择的抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生、并且对针对未融合的亲代细胞而选择的选择性培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。在一方面，骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，例如衍生自从美国加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的、以及从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA)可获得的SP-2和衍生物如X63-Ag8-653细胞的那些鼠类骨髓瘤系。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已经被描述用于人单克隆抗体的产生。
[0242] 一旦产生具有所希望的特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞被鉴定，则可以通过有限稀释程序而将这些克隆进行亚克隆并且通过标准方法使其生长。用于这个目的的适合的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在一种动物中体内生长为腹水瘤，例如通过将细胞腹膜内(i.p.)注射进入小鼠。
[0243] 将由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规抗体纯化程序(例如，如亲和力层析(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖凝胶)或离子交换层析、亲和标签、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、等等)而从培养基、腹水液、或血清适当地分离。在下文更详细地描述示例性的纯化方法。
[0244] 重组DNA技术
[0245] 用于使用重组DNA技术而产生和筛选特异性抗体的方法在本领域是常规的和已知的。可以容易地使用常规程序(例如，通过使用能够特异结合至编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)将编码单克隆抗体的DNA分离和/或测序。一旦分离，可以将DNA放在表达载体中，进而将其转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不以另外的方式产生抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。如下对于通过噬菌体展示和抗体人源化所产生的抗体所述的，可以从除了杂交瘤之外的产生抗α毒素抗体或片段的一种或多种来源获得用于重组抗体的DNA或基因材料。
[0246] 抗体或其变体的重组表达常常需要包含编码抗体的多核苷酸的表达载体的构建。在此提供了可复制的载体，这些载体包含可操作地连接至启动子的编码抗体分子、抗体重链或轻链、抗体的重链或轻链可变域或其部分、或者重链或轻链CDR的核苷酸序列。此类载体可以包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列，并且可以将抗体可变域克隆到这种载体中，以用于表达整个重链、整个轻链、或整个重链和轻链两者。
[0247] 一旦通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。因此，在此提供了包含可操作地连接至异源性启动子的编码在此的所呈现的分离抗体或其抗原结合片段或其片段、或其重链或轻链、或其部分、或单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在某些用于表达双链抗体的实施例中，可以将编码重链和轻链的载体在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
[0248] 作为表达重组抗体的宿主的可获得的哺乳动物细胞系在本领域是已知的，并且包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特有的和特异性的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的抗体或其部分的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化、以及磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。在某些实施例中，通过使人淋巴细胞永生化而产生的人细胞系可以用来重组产生单克隆抗体。在一些实施例中，可以使用人细胞系PER.C6.(Crucell，荷兰)以重组方式产生单克隆抗体。
[0249] 可以用作表达重组抗体的宿主的另外的细胞系包括但不限于昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，粉纹夜蛾Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)，毕赤酵母属，US7326681；等等)、植物细胞(US20080066200)；以及鸡细胞。
[0250] 在某些实施例中，在此呈现的抗体被表达在具有抗体稳定表达的细胞系中。稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。例如，可以产生稳定表达抗体分子的细胞系。可以用适当的包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点，等等)和选择标记基因的工程化载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许将质粒稳定整合进其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩充成细胞系。用于以高产量产生稳定细胞系的方法在本领域是已知的，并且试剂通常是可商购的。
[0251] 在某些实施例中，在此呈现的抗体被表达于具有抗体的瞬时表达的细胞系中。瞬时转染是这样一种方法：在该方法中将核酸引入一种细胞但不整合入那种细胞的基因组或染色体DNA中。核酸常常被维持为细胞中的染色体外因子，例如，作为附加体。附加体的核酸的转录过程不受影响，并且由附加体的核酸编码的蛋白质被产生。
[0252] 可以被稳定或瞬时转染的细胞系被维持在导致单克隆抗体表达和产生的、本领域已知的细胞培养基和条件中。在某些实施例中，哺乳动物细胞培养基是基于可商购的培养基配方，包括例如DMEM或汉姆氏(Ham's)F12。在一些实施例中，将细胞培养基进行改变以支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如在此使用的术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配方”是指在多细胞生物或组织以外的人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩充的营养液。可以将细胞培养基进行优化以用于特定的细胞培养用途，包括例如，被配制为促进细胞生长的细胞培养物生长培养基，或者被配制为促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素(nutrient)、成分(ingredient)、以及组分(component)在此可互换地使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。
[0253] 在不同的实施例中，使用补料分批法维持细胞系。如在此使用的“补料分批法”是指在首先用基础培养基培养之后，用另外的营养素供应给补料分批细胞培养物的方法。例如，补料分批法可以包括根据所确定的补料时间表在给定时期内添加补充培养基。因而，“补料分批细胞培养”是这样一种细胞培养：最初将细胞(典型地为哺乳动物细胞)和培养基供应至培养容器，并且在培养期间，连续地或以不连续递增方式将另外的培养营养素馈送至培养物，伴随或不伴随在培养终止之前的定期的细胞和/或产物的收获。
[0254] 使用的细胞培养基以及其中包含的营养素在本领域是已知的。在一些实施例中，细胞培养基包含基础培养基以及产生改良的基础培养基的至少一种水解产物，例如基于大豆的水解产物、基于酵母的水解产物、或这两种类型的水解产物的组合。另外的营养素可以有时候仅包含基础培养基，例如浓缩的基础培养基，或者可以仅包含水解产物、或浓缩的水解产物。适合的基础培养基包括但不限于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、DME/F12、极限必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-极限必需培养基(α-MEM)、格拉斯哥极限必需培养基(G-MEM)、PF CHO(参见，例如，用于无蛋白质的CHO细胞(SAFC生物科学公司)的CHO无蛋白质培TM
养基(西格玛)或EX-CELL 325PF CHO无血清培养基)、以及伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。可以用于在此的技术的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，粉末)(Gibco-Invitrogen#
31600)。在某些实施例中，基础培养基可以是无血清的，意味着该培养基包括不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或本领域已知的任何其他动物衍生的血清)或没有动物蛋白的培养基或化学限定培养基。
养基(西格玛)或EX-CELL 325PF CHO无血清培养基)、以及伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。可以用于在此的技术的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，粉末)(Gibco-Invitrogen#
31600)。在某些实施例中，基础培养基可以是无血清的，意味着该培养基包括不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或本领域已知的任何其他动物衍生的血清)或没有动物蛋白的培养基或化学限定培养基。
[0255] 可以改良基础培养基以便去除某些在标准基础培养基中发现的非营养组分，例如不同的无机和有机缓冲液、一种或多种表面活性剂、以及氯化钠。此类组分从基础细胞培养基的去除允许剩余营养组分的增加的浓度，并且可以改进总体的细胞生长和蛋白质表达。另外，可以根据细胞培养条件的要求，将省去的组分添加回到包含改良的基础细胞培养基的细胞培养基中。在某些实施例中，细胞培养基包含改良的基础细胞培养基以及至少一种以下营养素：铁源、重组生长因子；缓冲液；表面活性剂；渗透性调节剂；能源；以及非动物水解产物。另外，改良的细胞培养基可以任选地包含氨基酸、维生素、或氨基酸和维生素两者的组合。在一些培养基中，改良的基础培养基进一步包含谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。
[0256] 在一些实施例中，通过使用本领域已知的补料分批、分批、灌注的生物反应器工艺或连续进料生物反应器方法而大量地进行抗体产生。大规模生物反应器具有至少1000升的容量，有时大约1,000至100,000升的容量。这些生物反应器可以使用叶轮搅拌器来分布氧和营养素。小规模生物反应器通常是指在不大于大致100升的体积容量中的细胞培养，并且范围可以是从大约1升至大约100升。可替代地，一次性生物反应器(SUB)可以用于大规模或小规模培养。
[0257] 温度、pH、搅拌、通气以及接种密度可以取决于所使用的宿主细胞以及有待表达的重组蛋白而不同。例如，重组蛋白细胞培养可被维持在30℃与45℃之间的温度。可以在培养过程期间监测培养基的pH，以使得pH停留在最佳水平，对于某些宿主细胞该最佳水平可以是在6.0至8.0的pH范围内。叶轮驱使的混合可以用于搅拌的此类培养方法。叶轮的转速可以大致是50至200cm/秒叶尖速度，但可以取决于正被培养的宿主细胞的类型而使用本领域已知的其他气升或其他混合/曝气系统。提供充足的曝气从而在培养物维持中大致20％至80％的空气饱和度的溶解氧浓度，这个溶解氧浓度再次取决于正被培养的所选择的宿主细胞。可替代地，生物反应器可以直接将空气或氧气喷射到培养基中。存在供氧的其他方法，包括使用中空纤维膜曝气器的无泡曝气系统。
[0258] 噬菌体展示技术
[0259] 在一些实施例中，可以使用如本领域已知的技术将单克隆抗体或抗体片段从所产生的抗体噬菌体文库分离。在这样的方法中，抗α毒素抗体或片段可以通过重组组合抗体文库(有时为scFv噬菌体展示文库)的筛选而分离，这些文库是使用从衍生自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNA制备的。用于制备和筛选此类文库的方法学在本领域是已知的。
[0260] 抗体纯化和分离
[0261] 一旦抗体分子已经通过重组或杂交瘤表达而产生，可以通过本领域任何已知的用于免疫球蛋白分子纯化的方法将其纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换，特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力的亲和色谱，以及尺寸柱色谱(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。此外，本技术的抗体或其片段可以融合至以上所述的或者本领域另外已知的异源多肽序列(在此称为“标签”)，以便促进纯化。
[0262] 人源化抗体
[0263] 在某些实施例中，本技术的抗体是人源化抗体，是使用本领域已知的方法产生的。人源化抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体是这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这些链的另一部分与衍生自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这样的抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展现出所希望的生物活性即可。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”(“primatized”)抗体，这种“灵长类化”抗体包含从非人灵长类(例如，旧世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
[0264] 人抗体
[0265] 作为对人源化的替代方案，可以使用本领域已知的方法来产生人抗体。人抗体避免了一些与具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的问题。这种小鼠或大鼠衍生的蛋白质的存在可以导致抗体的快速清除或可以导致患者产生针对该抗体的免疫应答。为了避免小鼠或大鼠衍生的抗体的使用，可以通过将功能性人抗体基因座引入啮齿类动物、其他哺乳动物或动物而产生全人抗体，使得该啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生全人抗体。
[0266] 例如，现在可能的是生产能在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全套人抗体的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移至这种种系突变小鼠中将导致抗原激发后人抗体的产生。在实践中，使用已经被工程化为含有高达但小于1000kb大小的种系的小鼠 品系，配置人重链基因座和κ轻链基因座的片段。 品系可从Amgen公司商购(弗里蒙特，加利
福尼亚州)。
福尼亚州)。
[0267] 小鼠 品系的产生以及在那些小鼠中产生的抗体在本领域是已知的。基本上，用感兴趣的抗原(例如，α毒素)免疫小鼠 品系，从超免疫小鼠回收淋
巴细胞(如B细胞)，并且将回收的淋巴细胞与髓系细胞系(myeloid-type cell line)融合，从而使用本领域已知的以上所述的技术制备永生杂交瘤细胞系。将这些杂交瘤细胞系进行筛选并且选择以便鉴定产生对感兴趣的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。
巴细胞(如B细胞)，并且将回收的淋巴细胞与髓系细胞系(myeloid-type cell line)融合，从而使用本领域已知的以上所述的技术制备永生杂交瘤细胞系。将这些杂交瘤细胞系进行筛选并且选择以便鉴定产生对感兴趣的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。
[0268] 在可替代的途径即微基因座(minilocus)途径中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)模拟外源Ig基因座。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、mu恒定区、以及通常一个第二恒定区(例如，γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。
[0269] 来自小鼠的人抗体的产生是本领域已知的，在这些小鼠中通过微细胞融合，已经导入大片的染色体、或整个染色体。另外，已经产生KMTM—小鼠，这些小鼠是Kirin's Tc小鼠与Medarex's微基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)以及Genpharm小鼠的κ链转基因。
[0270] 还可以通过体外方法衍生人抗体。适合的实例包括但不限于噬菌体展示(医学免疫公司(MedImmune，以前为CAT)、莫弗西斯生物公司(Morphosys)、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、亚力兄公司(Alexion，以前为Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(MedImmune(以前为CAT))、酵母展示、等等。可以使用噬菌体展示技术从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系体外产生人抗体和抗体片段。根据这项技术，抗体V结构域基因是以框内方式克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性的选择还导致编码展现那些特性的抗体的基因的选择。因而，噬菌体模拟B细胞的一些特性。能以多种型式进行噬菌体展示。若干V基因区段来源可以用于噬菌体展示。已经从衍生自免疫小鼠的脾脏的V基因的小随机组合文库分离抗恶唑酮抗体的不同阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因谱，并且可以遵循本领域已知的技术而基本上分离针对抗原(包括自身抗原)的不同阵列的抗体。如上所讨论，还可以由体外活化的B细胞产生人抗体。
[0271] 在免疫应答的成熟过程中，免疫球蛋白基因经历不同的修饰，包括在V、D和J基因区段之间的重组、同种型转换、以及可变区中的超突变。重组和体细胞超突变是产生抗体多样性和亲和力成熟的基础，但是它们还可以产生序列文库，这些序列文库可以使作为治疗剂的这种免疫球蛋白的商业生产有困难或者增加抗体的免疫原性风险。通常，虽然在框架区中的突变可以增加免疫原性的风险，CDR区中的突变可能促成改进的亲和力和功能。这种风险可以通过将框架突变回复为种系而降低，同时确保抗体的活性未受不利影响。多样化过程还可以产生一些结构文库，或这些结构文库可以存在于促成重链和轻链可变域的种系序列中。不论来源，可能希望的是将潜在的结构文库去除，这些结构文库可以导致产物的不稳定性、聚集、异质性、或者增加的免疫原性。不希望的文库的实例包括不成对的半胱氨酸(可以导致二硫键混乱或可变的巯基加合物形成)、N-连接糖基化位点(导致结构和活性的异质性)、以及脱酰胺作用(例如NG、NS)、异构化(DG)、氧化(暴露的甲硫氨酸)、以及水解(DP)位点。
[0272] 因此，为了降低免疫原性的风险并且改进在实例11、表1-8中披露的抗体的药学特性，可能希望的是将框架序列回复为种系、将CDR回复为种系、和/或去除结构倾向(structural liability)。因此，在一些实施例中，在特定的抗体在氨基酸水平上不同于其对应的种系序列的情况下，可以将抗体序列突变回种系序列。通过使用标准分子生物学技术，这种纠正突变可以在一个、二个、三个或更多个位置、或任何突变位置的组合处发生。
[0273] 另外的途径包括 技术(再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals))。 技术可以用来产生针对治疗感兴趣的靶标的全人单
克隆抗体，并且涉及一种转基因小鼠的产生，该转基因小鼠具有可操作地连接至内源性小鼠恒定区基因座的、包含人重链和轻链可变区的基因组，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码抗体重链和轻链的可变区的DNA被分离并且可操作地连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。然后在能够表达全人抗体的细胞中得以表达该DNA。参加，例如，美国专利号6,596,541。
克隆抗体，并且涉及一种转基因小鼠的产生，该转基因小鼠具有可操作地连接至内源性小鼠恒定区基因座的、包含人重链和轻链可变区的基因组，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码抗体重链和轻链的可变区的DNA被分离并且可操作地连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。然后在能够表达全人抗体的细胞中得以表达该DNA。参加，例如，美国专利号6,596,541。
[0274] 抗体片段
[0275] 在某些实施例中，本发明抗体是抗体片段或包含这些片段的抗体。抗体片段包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段。双抗体；线性抗体，单链抗体分子；以及多特异性抗体是从这些抗体片段形成的抗体。
[0276] 在传统上，这些片段是使用本领域已知的技术、经由完整抗体的蛋白水解消化而衍生的。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以表达在大肠杆菌中并且从其分泌，因而允许大量这些片段的容易生产。在一些实施例中，可以从以上讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可替代地，还可以将Fab'-SH片段直接从大肠杆菌回收，并且将其化学连接以形成F(ab')2片段。根据另一个途径，可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。其他用于产生抗体片段的技术是已知的。在一些实施例中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。在某些实施方案中，抗体不是Fab片段。Fv和scFv是具有缺乏恒定区的完整结合位点的唯一种类；因而，它们适用于在体内使用过程中减少非特异性结合。可以将scFv融合蛋白构建为在scFv的氨基端或羧基端产生效应蛋白融合。
[0277] 在某些实施例中，本发明的抗体是域抗体，例如相应于人抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的、包含抗体的小功能性结合单位的抗体。域抗体的实例包括但不限于从Domantis可获得的、对治疗靶标有特异性的那些域抗体。可以使用域抗体的可商购文库来鉴定抗α毒素抗体域抗体。在某些实施例中，抗α毒素抗体和片段包含α毒素功能性结合单位以及Fcγ受体功能性结合单位。
[0278] 在此的某些实施方案中，本发明的抗体是线性抗体。线性抗体包括一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该Fd区段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
[0279] 某些氨基酸序列修饰
[0280] 除了以上所述的人、人源化和/或嵌合抗体之外，本技术还包括包含一种或多种以下项的抗α毒素抗体或片段的另外的修饰以及它们的变体和其片段：在可变轻链(VL)结构域和/或可变重链(VH)结构域和/或Fc区中的氨基酸残基和/或多肽置换、添加和/或缺失，以及翻译后修饰。包括在这些修饰中的是其中抗体已经共价连接至一个部分的抗体结合物。适用于连接至抗体的部分包括但不限于蛋白质、肽、药物、标记物、以及细胞毒素。可以作出针对抗体的这些改变从而改变或微调抗体的特征(例如，生物化学的、结合和/或功能性的)，适用于治疗和/或诊断金黄色葡萄球菌相关的和/或α毒素介导的疾病。用于形成结合物、作出氨基酸和/或多肽改变以及翻译后修饰的方法在本领域是已知的，其中一些在下文详述。可以作出缺失、插入、以及置换的任何组合以获得最终的构建体，其条件是最终的构建体具有所希望的特征。
[0281] 针对抗体的氨基酸变化导致产生与在此所述的抗体序列或亲本抗体序列小于100％一致的序列。在某些实施例中，在这种情况下，抗体可以具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链可变域或片段的氨基酸序列大约25％至大约95％的序列一致性。因而，在一些实施例中，修饰的抗体可以具有这样一种氨基酸序列：该氨基酸序列具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链可变域或片段的氨基酸序列至少25％、35％、45％、55％、
65％、75％、80％、85％、90％、或95％的氨基酸序列一致性或相似性。在某些实施例中，改变的抗体具有这样一种氨基酸序列：该氨基酸序列具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链CDR1、CDR2、或CDR3或片段的氨基酸序列至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、
80％、85％、90％、或95％的氨基酸序列一致性或相似性。改变的抗体可以有时具有这样一种氨基酸序列：该氨基酸序列具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链FR1、FR2、FR3或FR4或片段的氨基酸序列至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、或
95％的氨基酸序列一致性或相似性。
65％、75％、80％、85％、90％、或95％的氨基酸序列一致性或相似性。在某些实施例中，改变的抗体具有这样一种氨基酸序列：该氨基酸序列具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链CDR1、CDR2、或CDR3或片段的氨基酸序列至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、
80％、85％、90％、或95％的氨基酸序列一致性或相似性。改变的抗体可以有时具有这样一种氨基酸序列：该氨基酸序列具有与如在此所述的抗α毒素抗体的重链或轻链FR1、FR2、FR3或FR4或片段的氨基酸序列至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、或
95％的氨基酸序列一致性或相似性。
[0282] 在某些实施例中，通过引入抗体的一个或多个可变区中的一种或多种氨基酸改变(例如，置换、缺失和/或添加)而产生改变的抗体。在不同实施例中，氨基酸改变被引入框架区。框架区残基的一种或多种改变可以导致对于抗原的抗体的结合亲和力的改进。当这些变化是针对人源化抗体(不同于CDR区，框架区可以来自不同的物种)做出时，尤其如此。要修饰的框架区残基的实例包括非共价直接结合抗原、与CDR的构象相互作用/影响CDR构象、和/或参与VL-VH界面的那些残基。在一些实施例中，可以改变从大约一个至大约五个框架残基。有时，甚至在没有任何高变区残基已被改变时，这可能足以产生适合于在临床前试验中使用的抗体突变体。然而，通常改变的抗体将包含另外的一种或多种高变区改变。在某些实施例中，可以随机改变高变区残基，尤其是在针对来自第二哺乳动物种类的抗原的抗α毒素抗体或片段的起始结合亲和力是使得如此随机产生的抗体可以容易地被筛选的情况下。
[0283] 一个有用的用于产生改变的抗体的程序称为“丙氨酸扫描诱变”。在这种方法中，一个或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基替换，从而改变氨基酸与α毒素的相互作用。然后，对于置换显示功能敏感度的那些高变区残基通过在(或针对)置换位点引入另外的或其他突变而被改善(refined)。因此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点被预先确定，本身突变的本性不需要预先确定。如在此所述，针对以此方式产生的Ala突变体的生物活性来筛选它们。
[0284] 在某些实施例中，置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得的被选择用于进一步开发的一种或多种变体相对于它们从其产生的亲本抗体而言将具有改进的生物特性。用于产生此类置换变体的方便的方式涉及使用噬菌体的亲和力成熟。简言之，若干高变区位点(6-7个位点)被突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。因而产生的抗体突变体被展示为来自丝状噬菌体颗粒的、作为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物融合的单价形式。然后，如在此披露，针对噬菌体展示突变体的生物活性(例如，结合亲和力)来筛选它们。
[0285] 在抗体序列中的突变可以包括置换、缺失(包括内部缺失)、添加(包括产生融合蛋白的添加)、或在氨基酸序列之内和/或邻近处的氨基酸残基的保守性置换，但是那导致“沉默”改变，导致这种改变产生功能相当的抗α毒素抗体或片段。可以在涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性的相似性的基础上做出保守性氨基酸置换。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、以及甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸；以及带负电荷的(酸性)氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。另外，甘氨酸和脯氨酸是能影响链取向的残基。非保守性置换将使得必需将这些类别之一的成员与另一类别中的成员交换。此外，如果希望的话，非典型氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为置换或添加而被引入抗体序列中。非典型氨基酸大体上包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者(designer)氨基酸(例如β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、N-α-甲基氨基酸、以及氨基酸类似物。
[0286] 在某些实施例中，不涉及维持抗α毒素抗体或片段的适当构象的任何半胱氨酸残基还可以被(通常用丝氨酸)置换以改进分子的氧化稳定性并且预防异常交联。相反，可以将半胱氨酸键添加至抗体以改进它的稳定性(特别是在抗体是诸如Fv片段的抗体片段的情况下)。
[0287] 在一些实施例中，可以将抗体修饰为产生融合蛋白，即融合至异源蛋白质、多肽或肽的抗体或其片段。在不同实施例中，融合至抗体部分的蛋白质是抗体导向酶-前体药物疗法(ADEPT)的酶组分。能被工程化为与抗体的融合蛋白的其他蛋白质或多肽的实例包括但不限于毒素(例如蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶Ⅰ、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、以及假单胞菌内毒素)。可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、以及单端孢霉烯类。
[0288] 可以通过已知的基因改组(gene-shuffling)、基序改组(motif-shuffling)、外显子改组、和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术产生另外的融合蛋白。可以采用DNA改组以改变抗体或其片段的特征(例如，具有较高亲和力以及较低的解离速率的抗体或其片段)。抗体可以进一步是如本领域已知的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。
[0289] 变体Fc区
[0290] 本发明还包括本发明的结合成员，以及尤其是具有修饰的IgG恒定域的本发明的抗体。具有多种功能特征(如在血清中的长半衰期和介导不同的效应子功能的能力)的人IgG类别的抗体被使用于本发明的某些实施例中(单克隆抗体：原理与应用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications)，威利-利斯公司(Wiley-Liss,Inc.)，第1章(1995))。人IgG类抗体被进一步分成以下4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。迄今为止，已经针对作为IgG类抗体的效应子功能的ADCC和CDC进行了大量的研究，并且据报道，在人IgG类的抗体中，IgG1亚类在人体内具有最高的ADCC活性和CDC活性(化学免疫学(Chemical Immunology)，65,88(1997))。
[0291] “抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”是指这样一种细胞介导的反应：其中非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤细胞(NK)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。在一个实施例中，这样的细胞是人细胞。虽然不希望被限制于任何具体的作用机制，但这些介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的初级细胞(NK细胞)表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达概述在Ravetch(拉文奇)和Kinet(基内特)，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)，9:457-92(1991)中。为了评定分子的ADCC活性，可以进行例如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes(克莱因斯)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院刊(美国))，95:652-656(1998)中披露的动物模型中进行评定。
[0292] “补体依赖的细胞毒作用”或“CDC”是指在补体的存在下分子启动补体活化和溶解靶标的能力。通过补体系统的第一成分(C1q)结合至与同源抗原复合的分子(例如，抗体)而启动补体活化途径。为了评定补体活化，可以进行如在Gazzano-Santaro等人，J.Immunol.Methods(《免疫学方法杂志》)，202:163(1996)中描述的CDC测定。
[0293] 人IgG1亚类抗体的ADCC活性和CDC活性的表达通常涉及抗体的Fc区结合至存在于效应细胞(例如杀伤细胞、自然杀伤细胞或活化的巨噬细胞)表面上的针对抗体的受体(下文称为“FcγR”)。不同的补体成分可以被结合。关于结合，已经提出在铰链区中的若干氨基酸残基以及抗体C区的第二结构域(下文称为“Cγ2结构域”)是重要的(Eur.J.Immunol.(《欧洲免疫学杂志》)，23,1098(1993)，Immunology(《免疫学》)，86,319(1995)，Chemical Immunology(《化学免疫学》)，65,88(1997))，并且在Cγ2结构域中的糖链(Chemical Immunology(《化学免疫学》)，65,88(1997))也是重要的。
[0294] “效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应子功能的白细胞。这些细胞至少表达FcγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV，并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。
[0295] 术语“Fc受体”或“FcR”用来描述结合至抗体Fc区的受体。在一个实施例中，FcR是天然序列人FcR。而且，在某些实施例中，FcR是结合IgG抗体的一种FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII、和FcγRIV亚类的受体，这些受体包括等位基因变体以及这些受体的选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，两者具有主要在其胞质结构域上不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见 Annu.Rev.Immunol.《( 免疫学年度评论》)，15:203-234(1997))。FcR被综述于Ravetch(拉文奇)和Kinet(基内特)，
Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年度评论》)，9:457-92(1991)；Capel(卡博尔)等人，
Immunomethods(《免疫方法》)，4:25-34(1994)；以及de Haas(德哈斯)等人，
J.Lab.Clin.Med.《( 实验室临床医学杂志》)，126:330-41(1995)中。由在此的术语“FcR”来涵盖其他的FcR，包括有待在将来鉴定的那些FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母源IgG转移至胎儿(Guyer(盖耶)等人，Immunol.(《免疫学》)，117:587(1976)以及Kim(金姆)等人，J.Immunol.(《免疫学杂志》)，24:249(1994))。
Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年度评论》)，9:457-92(1991)；Capel(卡博尔)等人，
Immunomethods(《免疫方法》)，4:25-34(1994)；以及de Haas(德哈斯)等人，
J.Lab.Clin.Med.《( 实验室临床医学杂志》)，126:330-41(1995)中。由在此的术语“FcR”来涵盖其他的FcR，包括有待在将来鉴定的那些FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母源IgG转移至胎儿(Guyer(盖耶)等人，Immunol.(《免疫学》)，117:587(1976)以及Kim(金姆)等人，J.Immunol.(《免疫学杂志》)，24:249(1994))。
[0296] 在某些实施例中，抗α毒素抗体或片段包含改变的Fc区(在此也被称为“变体Fc区”)，其中已经在Fc区做出一种或多种改变以便改变抗体的功能特性和/或药物代谢动力学特性。这样的改变可以导致Clq结合以及依赖补体的细胞毒作用(CDC)、或者对于IgG的FcγR结合的减少或增加。本技术涵盖在此所述的具有变体Fc区的抗体，其中已经做出变化以便改变效应子功能，从而提供所希望的效应。因此，在一些实施例中，抗α毒素抗体或片段包括变体Fc区(即，如下所讨论的已经改变的Fc区)。在此的包含变体Fc区的抗α毒素抗体和片段在这里还被称为“Fc变体抗体”。如在此使用的，天然的是指未修饰的亲本序列，并且包含天然Fc区的抗体在此被称为“天然Fc抗体”。在一些实施例中，如与天然Fc区相比的，变体Fc区展现出相似的诱导效应子功能的水平。在某些实施例中，如与天然Fc相比的，变体Fc区展现出较高的效应子功能的诱导作用。在某些实施例中，如与天然Fc相比的，变体Fc区展现出较低的效应子功能的诱导作用。在此详述了变体Fc区的一些具体实施例。用于测量效应子功能的方法在本领域是已知的。
[0297] 可以通过Fc区的变化而改良抗体的效应子功能，这些变化包括但不限于氨基酸置换、氨基酸添加、氨基酸缺失以及对于Fc氨基酸的翻译后修饰(例如，糖基化)的变化。以下所述的方法可以用来改变如在此所述的分离抗体或抗原结合片段的效应子功能，导致具有某些有利于预防或治疗具体的金黄色葡萄球菌相关疾病或病症的特性的抗体或抗原结合片段。
[0298] 在一些实施例中，制备了相对于天然Fc抗体的已经改变了对于Fc配体(例如Fc受体，C1q)的结合特性的Fc变体抗体。结合特性的实例包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(Kd)、解离和缔合速率(分别为koff和kon)、结合亲和力和/或抗体亲合力。在本领域已知的是平衡解离常数(Kd)被定义为koff/kon。在某些方面，相对于具有高Kd的抗体，包含具有低Kd的Fc变体区的抗体可能是更希望的。然而，在一些情况下，与Kd的值相比，kon或koff的值可以更加有意义。可以确定的是哪个动力学参数对于给定抗体应用是更重要的。
[0299] 在一些实施例中，如与天然Fc抗体相比的，Fc变体抗体展现出对于一种或多种Fc受体的改变的结合亲和力，这些Fc受体包括但不限于FcRn、FcγRI(CD64)(包括同种型FcγRIA、FcγRIB、和FcγRIC)；FcγRII(CD32，包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB、和FcγRIIC)；以及FcγRIII(CD16，包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIIB)。
[0300] 在某些实施例中，相对于天然Fc抗体，Fc变体抗体具有增强的对一种或多种Fc配体的结合。在某些实施例中，Fc变体抗体展现出增加或降低的对Fc配体的亲和力，该亲和力比天然Fc抗体所展现的对于Fc配体的亲和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或是在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在不同的实施例中，Fc变体抗体展现的对Fc配体的亲和力比天然Fc抗体所展现的对Fc配体的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％。在某些实施例中，Fc变体抗体具有增加的对Fc配体的亲和力。Fc变体抗体有时可以具有降低的对Fc配体的亲和力。
[0301] 在一些实施例中，Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcγRIIIA的结合。在一些实施例中，Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcγRIIB的结合。在某些实施例中，Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcγRIIIA和FcγRIIB两者的结合。在某些实施例中，与天然的Fc抗体相比，具有增强的对FcγRIIIA的结合的Fc变体抗体在结合FcγRIIB受体方面不具有伴随的增加。在某些实施例中，Fc变体抗体具有降低的对Fc受体FcγRIIIA的结合。Fc变体抗体有时可以具有降低的对Fc受体FcγRIIB的结合。在不同的实施例中，展现出改变的对FcγRIIIA和/或FcγRIIB的亲和力的Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcRn的结合。在一些实施例中，相对于天然Fc抗体，展现出改变的对FcγRIIIA和/或FcγRIIB的亲和力的Fc变体抗体具有改变的对C1q的结合。
[0302] 在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对FcγRIIIA受体的亲和力比天然Fc抗体所展现的对FcγRIIIA受体的亲和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在不同的实施例中，Fc变体抗体展现的对FcγRIIIA的亲和力比天然Fc抗体所展现的对FcγRIIIA的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％。
[0303] 在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对FcγRIIB受体的亲和力比天然Fc抗体所展现的对FcγRIIB受体的亲和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少
80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对FcγRIIB的亲和力比天然Fc抗体所展现的对FcγRIIB配体的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少
20％、至少10％、或至少5％。
80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对FcγRIIB的亲和力比天然Fc抗体所展现的对FcγRIIB配体的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少
20％、至少10％、或至少5％。
[0304] 在一些实施例中，相对于天然Fc抗体，Fc变体抗体展现出增加或降低的对C1q的亲和力。在一些实施例中，Fc变体抗体展现的对C1q受体的亲和力比天然Fc抗体所展现的对C1q受体的亲和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少
90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与
100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对C1q的亲和力比天然Fc抗体所展现的对C1q的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％。在不同的实施例中，展现出改变的出对C1q的亲和力的Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcRn的结合。在又另一个具体实施例中，相对于天然Fc抗体，展现改变的对C1q的亲和力的Fc变体抗体具有改变的对FcγRIIIA和/或FcγRIIB的结合。
90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍与10倍之间、或在5倍与50倍之间、或在25倍与
100倍之间、或在75倍与200倍之间、或在100倍与200倍之间。在某些实施例中，Fc变体抗体展现的对C1q的亲和力比天然Fc抗体所展现的对C1q的亲和力高或低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％。在不同的实施例中，展现出改变的出对C1q的亲和力的Fc变体抗体具有增强的对Fc受体FcRn的结合。在又另一个具体实施例中，相对于天然Fc抗体，展现改变的对C1q的亲和力的Fc变体抗体具有改变的对FcγRIIIA和/或FcγRIIB的结合。
[0305] 期望的是，通过用于确定一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的体外功能测定来表征Fc变体抗体。在某些实施例中，Fc变体抗体具有相似的结合特性，并且效应细胞如在基于体外测定中那样在体内模型(例如在此描述和披露的那些)中起作用。本技术不排除在基于体外的测定中未展现出所希望的表型但在体内展现出所希望的表型的Fc变体抗体。
[0306] 可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力而增加包含Fc区的蛋白质的血清半衰期。如在此使用的术语“抗体半衰期”表示一种抗体的药物代谢动力学特性，它是抗体分子在它们的给予之后的平均存活时间的量度。抗体半衰期可以表示为从患者(或其他哺乳动物)的身体或其特定区室(例如，如在血清中测量的，即循环半衰期)、或在其他组织中消除50％已知量的免疫球蛋白所需要的时间。从一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别到另一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别，半衰期可以不同。通常，抗体半衰期的增加导致循环中所给予抗体的平均停留时间(MRT)的增加。
[0307] 半衰期的增加允许给至患者的药物的量的减少以及给药频率的减少。半衰期的增加也可以是有益的，例如对于金黄色葡萄球菌相关的疾病或病症的预防、以及还有对于在患者一出院就经常发生的感染复发的预防。为了增加抗体的血清半衰期，如在本领域已知的，可以将补救受体结合表位结合到抗体(尤其是抗体片段)中。如在此使用的，术语“补救受体结合表位”是指导致IgG分子的体内血清半衰期的增加的、IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fc区的表位。具有增加的半衰期的抗体还可以通过修饰被鉴定为涉及Fc与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基而产生。另外，抗α毒素抗体或片段的半衰期可以通过用本领域所广泛使用的技术结合至PEG或白蛋白而增加。在一些实施例中，包含抗α毒素抗体的Fc变体区的抗体与包含天然Fc区的抗体相比具有增加大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约60％、大约65％、大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约100％、大约125％、大约150％或更多的半衰期。在一些实施例中，包含Fc变体区的抗体与包含天然Fc区的抗体相比具有增加大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约10倍、大约20倍、大约50倍或更多、或在2倍与10倍之间、或在5倍与25倍之间、或在15倍与50倍之间的半衰期。
[0308] 在一些实施例中，在此呈现的技术提供了Fc变体，其中Fc区包含在一个或多个选自下组的位置处的修饰(例如，氨基酸置换、氨基酸插入、氨基酸缺失)，该组由以下各项组成：如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、
292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、
341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443。任选地，Fc区可以包含在本领域已知的另外的和/或替代的位置处非天然存在的氨基酸残基。
292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、
341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443。任选地，Fc区可以包含在本领域已知的另外的和/或替代的位置处非天然存在的氨基酸残基。
[0309] 在某些实施例中，在此提供的是Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自下组的置换，该组由以下各项组成：如通过在Kabat中列出的EU索引来编号的234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、
235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、
240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、
247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、
263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、
265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、
269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、
296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、
299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、
327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、
329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、
331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、
331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、
370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W。任选地，Fc区可以包含本领域已知的另外的和/或替代的非天然存在的氨基酸残基。
235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、
240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、
247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、
263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、
265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、
269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、
296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、
299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、
327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、
329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、
331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、
331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、
370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W。任选地，Fc区可以包含本领域已知的另外的和/或替代的非天然存在的氨基酸残基。
[0310] 在不同实施例中，在此提供的是Fc变体抗体，其中Fc区包含在一个或多个选自下组的位置处的至少一种修饰(例如氨基酸置换、氨基酸插入、氨基酸缺失)，该组由234、235和331组成。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸选自由234F、235F、235Y、和331S组成的组。在此提供的是Fc变体，其中Fc区包含在选自由由239、330和332组成的组的一个或多个位置处的至少一种非天然存在的氨基酸。一些实施例中，非天然存在的氨基酸选自由239D、330L和332E组成的组。
[0311] 在一些实施例中，在此提供的是Fc变体抗体，其中Fc区包含在选自由252、254和256组成的组的一个或多个位置处的至少一种非天然存在的氨基酸。在某些实施例中，非天然存在的氨基酸选自由252Y、254T和256E组成的组，如在美国专利号7.083,784中所述，其内容通过引用以其全文结合在此。
[0312] 在某些实施例中，在此提供的是具有增加抗体的血清半衰期的Fc变体区的抗葡萄球菌α毒素抗体，其中该抗体具有以下重链和轻链序列：
[0313] 重链：LC10-IgG1-YTE
[0314]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGIGTAGDTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTGHYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:XX)。
[0315] 轻链：LC10-κ
[0316]DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:YY)
[0317] 在某些实施例中，由IgG抗体引出的效应子功能强烈取决于连接至蛋白质Fc区的碳水化物部分。因而，可以修改Fc区的糖基化以增强或降低效应子功能。因此，在一些实施例中，在此提供的抗α毒素抗体和片段的Fc区包含改变的氨基酸残基的糖基化。在某些实施例中，改变的氨基酸残基的糖基化导致降低的效应子功能。在某些实施例中，改变的氨基酸残基的糖基化导致增强的效应子功能。在一些实施例中，Fc区具有减少的岩藻糖基化。在某些实施例中，Fc区被无岩藻糖基化(afucosylated)。
[0318] 在一些实施例中，在此的Fc变体可以与如在本领域已知的其他已知的Fc变体组合。可以引入Fc结构域的其他修饰和/或置换和/或添加和/或缺失。
[0319] 糖基化
[0320] 除了糖基化的改变抗体的效应子功能的能力之外，修改的在可变区中的糖基化还可以改变抗体对于靶抗原的亲和力。在一些实施例中，在本发明抗体的可变区中的糖基化模式被修改。例如，可以制作无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。糖基化可以被改变为例如增加抗体对于靶抗原的亲和力。此类糖类修饰可以通过例如改变在抗体序列之内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，由此消除在那个位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。还可以进行一个或多个氨基酸置换，氨基酸置换导致存在于Fc区中的糖基化位点(例如，IgG的天冬酰胺297)的消除。此外，无糖基化的抗体可以在缺乏必要的糖基化机器(machinery)的细菌细胞中产生。
[0321] 抗体结合物
[0322] 在某些实施例中，使用本领域已知的方法将在此呈现的抗体结合或共价连接至一种物质。在一些实施例中，连接的物质是可检测标记物(在此还被称为报道分子)或固体支撑物。用于连接至抗体的适合的物质包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合微粒、生物细胞、病毒、荧光团、生色团、染料、毒素、半抗原、酶、抗体、抗体片段、放射性同位素、固体基质、半固体基质、及其组合。用于将另一种物质结合或共价连接至抗体的方法在本领域是已知的。
[0323] 使用的诊断方法
[0324] α毒素是一般仅在金黄色葡萄球菌的致病菌株中发现的毒力因子。α毒素有时结合至作为活性复合体结构的一部分的细胞表面受体。然而，寡聚化和跨膜孔(例如，α毒素七聚体)的形成可以在不结合至特异性受体的情况下发生。寡聚化α毒素在细胞功能障碍和细胞溶解(例如，跨膜孔的形成)中的作用促进侵入的金黄色葡萄球菌细菌的定殖。在此所述的抗体通过直接或间接识别在α毒素分子上的涉及α毒素单体-单体相互作用的区域而抑制α毒素单体组装或寡聚化为跨膜孔。
[0325] 在某些实施例中，在此呈现的抗α毒素抗体和片段以及组合物可以用于体内和/或体外诊断产生α毒素的金黄色葡萄球菌菌株和/或与α毒素相关的病症/疾病。这可以例如通过使有待测试的样品(任选地伴随对照样品)与抗体在允许抗体与α毒素之间的复合体形成的条件下接触来完成。然后检测复合体形成(例如，使用ELISA)。当使用测试样品连同对照样品时，检测在两种样品中的复合体，并且在样品之间复合体形成中的任何统计学显著性差异指示测试样品中金黄色葡萄球菌、α毒素或金黄色葡萄球菌与α毒素的存在。
[0326] 在一些实施例中，在此的技术提供了确定在疑似包含金黄色葡萄球菌和/或其他产生α毒素同系物的细菌的样品中产生α毒素的金黄色葡萄球菌菌株和/或α毒素的存在的方法，该方法包括将样品暴露于抗α毒素抗体或片段，并且确定抗体与样品中的α毒素的结合，其中抗体与样品中的α毒素的结合指示样品中金黄色葡萄球菌和/或α毒素的存在。在一些实施例中，该样品是生物样品。在某些实施例中，生物样品来自经历或疑似经历与金黄色葡萄球菌相关的疾病/病症的哺乳动物。
[0327] 在某些实施例中，可以使用体内诊断测定使用抗α毒素抗体或片段来检测金黄色葡萄球菌的生长和/或α毒素的过度表达。在一些实施例中，将抗α毒素抗体或片段添加至样品，其中抗体结合有待检测的α毒素并且用可检测标记物(例如，放射性同位素或荧光标记物)使其带标签，并且从外部扫描患者以便将标记物定位。
[0328] 可以在福尔马林固定的石蜡包埋的组织上进行FISH测定，例如INFORMTM(由亚利桑那州的Ventana公司出售)或PATHVISIONTM(威赛斯公司(Vysis)，伊利诺伊州)，从而确定在组织样品中的α毒素过度表达的程度(如果有的话)。
[0329] 在某些实施例中，抗α毒素抗体和片段可以用于检测组织样品、血液或血清中的α毒素(例如，可溶性α毒素)的方法中。在一些实施例中，该方法包括使来自疑似经历金黄色葡萄球菌α毒素介导的失调的哺乳动物的组织、血液或血清的测试样品与在此呈现的抗α毒素抗体或片段接触，并且检测测试样品中相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品的α毒素的增加。在一些实施例中，检测方法作为诊断金黄色葡萄球菌和/或α毒素介导的与在哺乳动物组织、血液或血清中的α毒素的增加相关的失调的方法是有用的。
[0330] 使用的治疗方法
[0331] 在某些实施例中，可以给予抗α毒素抗体或片段用于预防和/或治疗α毒素介导的病症。在此呈现的是预防、治疗、维持、改善、和/或抑制α毒素介导的疾病或病症的方法，其中这些方法包括给予在此提供的抗α毒素抗体和片段。
[0332] 致病性金黄色葡萄球菌α毒素介导的失调
[0333] 在某些实施例中，提供的是给予和使用如在此呈现的组合物和抗体的方法，以便治疗和预防广泛范围的致病性金黄色葡萄球菌介导的病症/疾病，这些病症/疾病包括慢性和急性病症两者，例如但不限于菌血症、烧伤、蜂窝织炎、皮肤坏死、眼睑感染、食物中毒、关节感染、新生儿结膜炎、骨髓炎、肺炎、皮肤感染、手术伤口感染、烫伤样皮肤综合征、心内膜炎、脑膜炎、脓肿形成和中毒性休克综合征。
[0334] CA-MRSA和HA-MRSA两者对传统的抗葡萄球菌β-内酰胺类抗生素(例如头孢氨苄)具有抗性。CA-MRSA具有较宽的抗微生物敏感性谱，包括对磺胺药物(像复方新诺明/甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑)、四环素(像多西环素和米诺环素)以及克林霉素，但是根据亨利福特医院研究(Henry Ford Hospital Study)现在认为用于治疗CA-MRSA的选择药物是万古霉素。HA-MRSA甚至对这些抗生素具有抗性，并且经常仅对万古霉素敏感。较新的药物，例如利奈唑胺(属于较新的噁唑烷酮类别)以及达托霉素，对抗CA-MRSA和HA-MRSA两者是有效的。
[0335] 在某些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以与相应于例如β-内酰胺类抗生素(例如头孢氨苄)、磺胺药物(像复方新诺明/甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑)、四环素(像多西环素和米诺环素)、克林霉素、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、替考拉宁、奎奴普丁/达福普汀(共杀素)、或替加环素的抗生素组合使用。
[0336] 药物制剂
[0337] 在某些实施例中，在此提供的抗α毒素抗体或片段可以与一种药学上可接受的载体配制为药物(治疗)组合物，并且可以通过本领域已知的多种方法来给予。给药路径和/或模式可以取决于所希望的结果而不同。如在此使用的，包含抗α毒素抗体或片段的药物制剂被称为该技术的制剂。术语“药学上可接受的载体”表示不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这样的制剂常规地可含有盐、缓冲液、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这样的药学上可接受的制剂常规地还可含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与该载体组合以促进应用。药物组合物的组分还能够与本技术的抗体并且与彼此以这样一种方式混合：该方式使得不存在会实质性地减损所希望的药物疗效的相互作用。
[0338] 本技术的治疗组合物可以配制成特定的剂量。可以调整给药方案以提供最优的所希望的反应(例如，治疗反应)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以给予单次推注，可以随着时间的过去给予若干个分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于剂量的给予和均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指用于有待治疗的受试者的、适合作为单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以与需要的药用载体相关的产生所希望的疗效的预定量的活性化合物。对于剂量单位形式的规格由以下项来指示并且直接取决于以下项：(a)抗α毒素抗体或片段的独特特征以及有待获得的具体疗效，以及(b)在配制这种用于治疗个体中的敏感性的抗α毒素抗体或片段的领域中的固有限制。
[0339] 本技术的治疗组合物可以被配制为用于特定的给药途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给药。这些制剂可以合宜地呈现为单位剂型，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于正在被治疗的受试者、以及特定的给药模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将大体上是产生疗效的组合物的量。
[0340] 治疗有效剂量
[0341] 能以适合的剂量和给药方案而给予在此所述的抗体制剂，并且这样的剂量和给药方案可以取决于有待治疗的疾病或病症。可以通过确定剂量和给药方案是否导致疗效或治疗终点而鉴定治疗有效剂量。
[0342] 制造物品和试剂盒
[0343] 在此提供的是包含用在此的液体制剂或冻干制剂填充的一个或多个容器的药物包或试剂盒。在一些实施例中，用在此的液体制剂填充的容器是预填充注射器。在具体实施例中，在此的制剂包括重组融合或化学结合至另一个部分的抗α毒素抗体和片段，该另一个部分包括但不限于异源蛋白质、异源多肽、异源肽、大分子、小分子、标记序列、诊断剂或可检测剂、治疗部分、药物部分、放射性金属离子、第二抗体、以及固体支撑物。在某些实施例中，将在此的制剂作为无菌液体而配制在单剂量小瓶中。在此的制剂有时被提供在预填充注射器中。
[0344] 在某些实施例中，还提供了包含抗α毒素抗体和片段的、对于不同目的(例如研究和诊断，包括用于将α毒素从细胞纯化或免疫沉淀、α毒素的检测，等等)有用的试剂盒。为了分离和纯化α毒素，试剂盒可以包含结合至珠粒的抗α毒素抗体或片段(例如琼脂糖凝胶珠)。可以提供含有用于体外检测和定量α毒素的抗体(例如在ELISA或Western印迹中)的试剂盒。正如制造物品，试剂盒包含容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。容器容纳包含至少一种如在此披露的抗α毒素抗体或片段的组合物。可以包括另外的含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的容器。标签或包装说明书可以提供组合物的说明以及用于预期体外或诊断用途的说明书。
[0345] 本技术还包括完成的包装的并且带标签的药物产品。这种制造物品包括在适当器皿或容器(例如，玻璃小瓶、预填充注射器或其他密封容器)中的适当的单位剂型。在一些实施例中，提供了作为包含抗α毒素抗体或片段的适合于肠胃外给药的无菌无颗粒溶液的单位剂型。在某些实施例中，提供了作为包含抗α毒素抗体或片段的适用于复原的无菌冻干粉的单位剂型。
[0346] 在一些实施例中，单位剂型适合于静脉内、肌内、鼻内、经口、局部或皮下递送。因此，该技术涵盖适用于各个递送路径的无菌溶液。该技术进一步涵盖适合于复原的无菌冻干粉。
[0347] 如同任何药物产品，包装材料和容器被设计为在储存和装运期间保护产品的稳定性。此外，在此的产品包括建议医师、技术员或患者关于如何适当预防或治疗讨论中的疾病或失调的供使用的说明书或其他信息材料。换言之，制造物品包括指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量、监测程序、以及其他监测信息)的说明书工具。
[0348] 确切地说，该技术提供了一种制造物品，包括包装材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、预填充注射器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封袋等等；以及包含在包装材料之内的药物剂的至少一个单位剂型，其中药物剂包括含有抗体的液体制剂。包装材料包括指示如何可以使用抗体来预防、治疗和/或管理一种或多种与疾病或失调相关的症状的说明书工具。
[0349] 实例
[0350] 在下文列出的实例展示了某些实施例并且不限制该技术。
[0351] 实例1：材料与方法
[0352] 用于实例2至实例9和实例11至实例13的材料和方法提供在下文。
[0353] 野生型(wt)金黄色葡萄球菌AT和非溶血性突变体H35L的克隆和表达
[0354] 来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC BAA1556的基因组DNA用来通过PCR扩增野生型α毒素(AT)基因。在使用Herculase II聚合酶(Stratagene)的50μl反应中，反应含有正向引物atatatgagctcgcagattctgatattaatattaaaacc(SEQ ID NO:41)、反向引物atatataagcttaatttgtcatttcttctttttccc(SEQ ID NO:42)、以及大致10ng的基因组DNA。将生成的片段用Sac I和Hind III消化，并且连接到pCold II DNA载体(TaKaRa)中，使其在具有N端六组氨酸(6X His)标签的框内。根据制造商的说明书，使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)通过野生型基因的定点诱变而产生H35L突变体。用于诱变的诱变引物是gataaagaaaatggcatgctcaaaaaagtattttatagttttatc(SEQ ID NO:43)和
gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc(SEQ ID NO:44)。
gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc(SEQ ID NO:44)。
[0355] 通过自动DNA测序证实野生型AT和ATH35L突变体的序列。野生型和H35L突变体α毒素表达在大肠杆菌菌株BL21中。将在LB加羧苄西林中生长的50ml过夜培养物以1:10稀释在500ml培养物中，并且使其在37℃生长至大约0.5的A600。将培养物移至15℃持续30分钟，并且然后添加1M IPTG以获得大约100mM的终浓度。将培养物在15℃孵育另外的24小时。通过离心收获细胞。
[0356] 重组体，具有his-标签的α毒素(rAT-his)的纯化
[0357] 将细菌细胞沉淀在冰上进行解冻，并且将其重悬浮于Ni-NTA缓冲液A(20mM磷酸钠，pH 7.2，300mM NaCl)中。通过在20,000psi微流化(Microfluidics Model M-110P)将细胞溶解，并且通过在4℃在27,000×g下离心10分钟将粗溶解产物澄清。在0.2μm-过滤后，将上清液加载到用Ni-NTA缓冲液A平衡的5ml Ni-NTA Superflow柱(凯杰公司(Qiagen))上。将rAT-his用300mM和500mM咪唑分级梯度洗脱，将各部分(fraction)以1mM的终浓度收集在含有EDTA的管中，并且将其透析在SP缓冲液A(50mM磷酸钠，pH 7.0，25mM NaCl，1mM EDTA)中。将透析液加载到在SP缓冲液A中的5ml HiTrap SP琼脂糖凝胶FF柱(通用电气医疗集团)，并且将rAT-his用至1M NaCl的分级梯度洗脱。将含有rAT-his的部分透析到具有1mM EDTA的1X PBS(pH 7.2)中，并且将等分部分在-80℃下冷冻。
[0358] 来自金黄色葡萄球菌的天然α毒素的纯化
[0359] 从金黄色葡萄球菌Wood菌株纯化天然α毒素(nAT)。使金黄色葡萄球菌Wood在大豆胰蛋白酶肉汤(TSB)中在37℃生长过夜，伴随振荡(例如，大约250RPM)。通过离心收获培养物上清液，然后用固体硫酸铵恢复75％的饱和度。在4℃搅拌3小时之后，通过在12,000x g持续45分钟的离心捕获沉淀物，将其重悬浮于SP缓冲液A(25mM乙酸钠，pH 5.2，20mM NaCl，1mM EDTA)中，并且针对SP缓冲液A在4℃透析过夜，伴随一次交换。通过在4℃在27,000x g下离心持续30分钟去除不溶性物质。过滤可溶性透析液(0.2μm)，并且将其加载到用SP缓冲液A平衡的10ml SP琼脂糖凝胶FF柱(通用电气医疗集团)上。将结合的nAT用至300mM NaCl的线性梯度洗脱，随后为在0.5M和1M NaCl时的步骤。将含有nAT的部分合并并且过夜透析到含有1mM EDTA的PBS(pH 7.2)中。为了最终处理，将透析液在具有1mM EDTA的1X PBS(pH
7.2)中以1.3ml/min的流速加载到HiPrep Sephacryl S-200高分辨柱(通用电气医疗集团)上。将含有nAT的部分合并、等分、并且在-80℃下冷冻。
7.2)中以1.3ml/min的流速加载到HiPrep Sephacryl S-200高分辨柱(通用电气医疗集团)上。将含有nAT的部分合并、等分、并且在-80℃下冷冻。
[0360] 免疫/杂交瘤产生
[0361] 遵循RIMMS免疫方案(Kilpatrick(克伯屈)等人(1997))，使八周龄VelocImmune小鼠在多个部位接受5轮的rATH35L的皮下注射。以2-3天的间隔经过13天的过程免疫小鼠。对于每一轮的免疫，首先用异氟烷(isofluorane)麻醉小鼠。将免疫原乳化在完全或不完全弗氏佐剂和TiterMax Gold佐剂中，并且将其以双侧的方式注射于颈背部、腋、小腿和腹股沟处。在第13天收集测试血液，并且用抗原ELISA测定。腹膜内给予小鼠预融合物加强(pre-fusion boost)，并且在第17天处死。将淋巴结淋巴细胞和脾细胞融合至骨髓瘤配偶体，从而产生稳定的杂交瘤。
[0362] 溶血性活性的中和
[0363] 在96孔板中，将五十微升的各个B细胞杂交瘤培养物上清液与重组体α毒素-His(rAT-his，0.1μg/ml终浓度)混合，随后添加在PBS中的50μl的5％兔红细胞(RBC)。对照孔仅含有RBC以及具有或不具有AT的培养基。将板在37℃孵育1小时，并且将完整的细胞通过离心而沉淀。将50μl的上清液转移至新的96孔板，并且用分光光度计测量A490。中和活性是相对于仅使用RBC和rAT-his的溶解来计算的，并且计算为：抑制％＝100x[100-(A490nAT+Ab)/(A490nAT无Ab)]。
[0364] 还测试了使用纯化的mAb的抑制。将抗AT mAb以在PBS中的大约80μg/mL添加至96孔板，并且将样品连续稀释(两倍)于PBS中，至50μL的终体积。非特异性IgG1(R347)被包括作为同种型对照。将二十五微升的mAb稀释物与在大约0.1μg/mL的25μL nAT(天然α毒素)混合于96孔圆底板中，随后添加50μL 5％RBC。如上计算溶血性活性的抑制。
[0365] 嵌合抗AT mAb的表达和纯化
[0366] 将澄清的鼠抗AT上清液(大致5L，@30-50mg/L)通过切向流过滤而浓缩。然后将浓缩的上清液依序通过五个5mL蛋白G HiTrap HP柱，并且将结合的IgG用pH 11.0的50mM碳酸氢钠洗脱，并且用1M磷酸将其中和至大致pH 7.0。将中和的材料依序加载到两个1mL HiTrap Q FF(通用电气医疗集团)柱上。将通过的含有IgG的流收集，并且将其透析到pH
7.2的PBS中。
7.2的PBS中。
[0367] A549溶解的中和
[0368] 将A549细胞维持在5％CO2 37℃培养箱中的补充有非必需氨基酸谷氨酰胺和10％的胎牛血清的RMPI中。将细胞用Hank’s平衡培养基(Hank’s balanced media)洗涤一次，并4
且以10/孔平板接种在RPMI、5％FBS中在50μl以下，然后在37℃用5％CO2孵育20小时。将抗AT mAb以80μg/mL添加至96孔板的RPMI中，并且将样品连续稀释(两倍)在RPMI中。无关的IgG1(R347)被包括为同种型对照。在单独的96孔板中，将30μl稀释抗体与30μl nAT混合(终浓度，5μg/ml)。将来自各孔的五十微升转移至含有贴壁的A549细胞的板。包括具有或不具有nAT的A549细胞的对照孔。将板在37℃用5％CO2孵育3小时，离心，并且将50μl上清液转移至新的96孔板。遵循制造商的方案，使用Cytotox 96非放射性测定试剂盒(Promega)，将细胞溶解测量为乳酸脱氢酶(LDH)的释放。从每个孔减去背景LDH，并且LDH释放的抑制被计算为：抑制％＝100x[100-(A590nAT+Ab)/(A590nAT无Ab)]。
且以10/孔平板接种在RPMI、5％FBS中在50μl以下，然后在37℃用5％CO2孵育20小时。将抗AT mAb以80μg/mL添加至96孔板的RPMI中，并且将样品连续稀释(两倍)在RPMI中。无关的IgG1(R347)被包括为同种型对照。在单独的96孔板中，将30μl稀释抗体与30μl nAT混合(终浓度，5μg/ml)。将来自各孔的五十微升转移至含有贴壁的A549细胞的板。包括具有或不具有nAT的A549细胞的对照孔。将板在37℃用5％CO2孵育3小时，离心，并且将50μl上清液转移至新的96孔板。遵循制造商的方案，使用Cytotox 96非放射性测定试剂盒(Promega)，将细胞溶解测量为乳酸脱氢酶(LDH)的释放。从每个孔减去背景LDH，并且LDH释放的抑制被计算为：抑制％＝100x[100-(A590nAT+Ab)/(A590nAT无Ab)]。
[0369] THP-1溶解的中和
[0370] 将THP-1细胞维持在5％CO2 37℃培养箱中在补充有非必需氨基酸(英杰公司(Invitrogen))2mM谷氨酰胺(英杰公司)和10％的胎牛血清(英杰公司)的RPMI培养基(英杰公司)中。将抗AT mAb以80μg/ml添加至96孔板的RPMI中，并且将样品连续稀释(两倍)在RPMI中，至50μL的终体积。无关的IgG1(R347)被包括为同种型对照。将二十五微升的mAb稀释物与25μl最终达1.5μg/ml的天然α毒素(nAT)混合，随后将50μl经RMPI洗涤的THP-1细胞
6
(10 个细胞/ml，在具有10％FBS的RPMI中)添加在96孔板中。对照孔由单独的或具有nAT的THP-1细胞组成。将板在5％CO2 37℃培养箱中孵育3小时，离心，并且将50μl上清液转移至新的96孔板。遵循制造商的说明书，使用Cytotox 96非放射性测定试剂盒(Promega)，将细胞溶解测量为乳酸脱氢酶(LDH)的释放。如上所述计算LDH释放的抑制。
6
(10 个细胞/ml，在具有10％FBS的RPMI中)添加在96孔板中。对照孔由单独的或具有nAT的THP-1细胞组成。将板在5％CO2 37℃培养箱中孵育3小时，离心，并且将50μl上清液转移至新的96孔板。遵循制造商的说明书，使用Cytotox 96非放射性测定试剂盒(Promega)，将细胞溶解测量为乳酸脱氢酶(LDH)的释放。如上所述计算LDH释放的抑制。
[0371] 抗AT IgG mAb的克隆和作为全人mAb的表达
[0372] 使用Dynabeads mRNA Direct Kit(英杰公司)分离五种杂交瘤克隆2A3、10A7、12B8、25E9和28F6的mRNA。使用SuperScript III(英杰公司)逆转录酶和七聚体随机引物合成cDNA的第一链。使用Ig引物组(Novagen，目录号69830)通过PCR扩增人Ig VL(κ)和VH。将PCR扩增的VL和VH产物克隆到TOPO TA载体(Invitrogen(英杰)pCR2.1-TOPO)中，并进行测序。将来自每个杂交瘤的VH和VL(κ)通过PCR进行再扩增，添加用于克隆到IgG.κ.pOE载体的限制性内切酶位点，其中VL被克隆在与人c-κ融合的BssHII/BsiWI位点，而VH被克隆在与人IgG-1重链恒定区融合的BsrGI/SalI位点。将所生成的pOE质粒通过DNA测序来验证。
[0373] 抗α毒素mAb表达和纯化
[0374] 使用无内毒素质粒大量提取试剂盒(Endofree Plasmid Maxi kit，Qiagen(凯杰公司))来制备pOE构建体的质粒DNA。使用293fectin试剂(英杰公司)将pOE质粒转染到在Freestyle 293表达培养基(GIBCO)中的293F悬浮细胞中。转染后6天和9天，收获培养基，并且使用蛋白A-琼脂糖凝胶柱(通用电气医疗集团)来纯化IgG。将含有峰值的IgG合并，透析到pH 7.4的PBS中，并且在-70℃储存。通过SDS-PAGE验证IgG蛋白的纯度。
[0375] 小鼠肺炎模型
[0376] 在感染前二十四小时，使10只7-9周龄的C57BL/6J小鼠(Harlan)的组经由腹膜内注射(i.p.)而接受在指示浓度下的0.5ml mAb。然后将动物用异氟烷麻醉，垂直保持，并且将在无菌PBS中的0.05ml金黄色葡萄球菌细菌悬液(1x 108CFU至3x 108CFU)接种在左右鼻孔中。将动物以仰卧位放置在笼中以用于恢复，并且每日观察两次，持续研究的时程。监测动物存活持续6天的最大值。
[0377] 可替代地，在细菌感染48小时之后使动物通过CO2吸入而安乐死。将肺和肾移至无菌PBS中，进行均质化，稀释，并且涂平板以用于细菌计数。使用对数秩检验确定死亡率研究的统计学显著性。使用方差分析和Dunnett事后检验来计算来自器官的细菌回收的显著性。
[0378] 皮肤坏死的小鼠模型
[0379] 将五只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(Harlan)的组在它们背部上剃毛，并且通过腹膜内注射而给予在图表上指示的浓度的0.5ml IgG。二十四小时后，通过皮下注射50μL的细菌悬液(1×108个金黄色葡萄球菌)而感染小鼠。每日两次监测动物的感染迹象，并且每天同时测量脓肿的大小。使用公式A＝L x W来计算病灶的面积。使用方差分析和Dunnett事后检验来确定统计学显著性。
[0380] 受体结合测定
[0381] 通过在接近于4℃、伴随恒定的搅拌下，将5mL的洗涤并浓缩的兔红细胞(RBC)在500mL溶解缓冲液(5mM磷酸盐，1mM EDTA，pH 7.4)中孵育来制备红细胞血影。然后通过在
15,000x g离心将血影移除，并且将其用溶解缓冲液洗涤3次。然后将它们在PBS中洗涤，并且重悬浮在3mL的终体积中。
15,000x g离心将血影移除，并且将其用溶解缓冲液洗涤3次。然后将它们在PBS中洗涤，并且重悬浮在3mL的终体积中。
[0382] 为了评定nAT结合至细胞膜，将RBC血影在PBS中稀释至大致0.2的OD600，并且将50μL涂覆在1/2-孔96孔板(Costar)上，然后在4℃孵育过夜。然后将液体从板移除，并且在4℃将孔用在PBS(pH 7.4)中的100μL的1％BSA封闭持续2小时，然后用PBS洗涤3次。将20摩尔过量的IgG与3μg/mL的nAT混合，并且将50μL添加至封闭的板。将板在4℃孵育2小时并且用PBS洗涤3次。将生物素标记的兔抗AT IgG以1mg/mL添加至孔，并且在4℃孵育1小时，洗涤3次，然后与链霉亲和素过氧化物酶结合物一起孵育(1:30,000，Jackson Immunoresearch(《杰克逊免疫研究》))。将孔洗涤3次，并且用Sure Blue Reserve(KPL公司)显色。使用酶标仪(Molecular Devices)读取A450，并且计算结合的％AT。％结合的AT＝100x(A450-AT+IgG/A450-AT单独)
[0383] 寡聚化测定
[0384] 使用Liposofast挤出机(艾维斯汀(Avestin)公司)以及具有100nm孔径的膜产生脂质体。将蛋黄磷脂酰胆碱(15mg，Avanti Polar Lipids)、蛋黄磷脂酰甘油(2.9mg，Avanti Polar Lipids)以及胆固醇(5.8mg，Avanti Polar Lipids)在氯仿中的混合物(5:1:4，摩尔比)在氮气流下在40℃干燥。然后将干燥的脂质膜用pH 7.4的3mL PBS(英杰公司)再水合，并且将其在37℃孵育30分钟。然后将样品剧烈涡旋，直至它形成均匀的悬浮液，并且然后使用干冰异丙醇浴和室温水使其经历3轮冻融。然后使溶液通过Liposofast挤出机21次。
[0385] 将AT(0.5μg)与纯化的IgG、5μL RBC血影以及PBS混合于22μL的终体积中，并且在37℃孵育45分钟。然后在37℃将样品溶解于5μL SDS-PAGE样品缓冲液中持续5分钟，并且使
10μL在4％-12％预制聚丙烯酰胺凝胶(英杰公司)中经受SDS-PAGE。然后将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素，用在PBS中的封闭剂酪蛋白(赛默科学(Thermo Scientific))封闭10分钟，并且在室温伴随恒定振荡下用兔抗AT IgG(2μg/mL)进行探测持续2小时。在用碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔2孵育1小时后检测AT带，并且使用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL公司)显色。
10μL在4％-12％预制聚丙烯酰胺凝胶(英杰公司)中经受SDS-PAGE。然后将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素，用在PBS中的封闭剂酪蛋白(赛默科学(Thermo Scientific))封闭10分钟，并且在室温伴随恒定振荡下用兔抗AT IgG(2μg/mL)进行探测持续2小时。在用碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔2孵育1小时后检测AT带，并且使用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL公司)显色。
[0386] 动力学速率和结合常数(KD)的测量
[0387] 使用在BIAcore 3000仪器(BIAcore公司)上的IgG-捕获测定型式测量抗AT IgG抗体结合至纯化的nAT的动力学速率常数(kon、koff)。简言之，根据制造商的说明书将大鼠抗小鼠IgG固定在CM5传感器芯片上。在传感器芯片上的捕获试剂的最终表面密度是大致2500个如在此所述的反应单位(RU)。还使用相同的固定方案并且省略nAT而在此传感器芯片上制备了参考流细胞表面。以20nM将抗AT IgG抗体制备在仪器缓冲液(HBS-EP缓冲液，包含0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA和0.005％P-20)连同nAT的两倍连续稀释物中。制得在大约0.78nM至大约50nM的范围内的在仪器缓冲液中的nAT连续稀释物。
[0388] 使用序贯方法用于动力学测量。首先将每种抗AT IgG以50μL/min的流速注射在捕获物和参考表面上。一旦捕获的IgG的结合已经被稳定，在两种表面上以50μL/min的流速注射单一浓度的nAT蛋白。使用所生成的结合反应曲线来确定缔合相数据。在注入nAT后，然后将流切换回仪器缓冲液持续10分钟从而允许收集解离相数据，随后为pH 1.5的10mM甘氨酸的1分钟脉冲以便在芯片上再生IgG捕获表面。针对所有的抗AT IgG，记录来自每个浓度的nAT的二重注射的结合反应。
[0389] 另外，贯穿注射系列，散布若干缓冲液注射。使用选择缓冲液注射连同参考细胞反应(通常称为“双重参照”)以便矫正注射伪影(injection artifacts)和/或非特异性结合相互作用的原始数据集(D.G.Myszka(米什卡)，Improving biosensor analysis(改进生物传感器分析).J.Mol.Recognit.(《分子识别杂志》)12(1999),279-284页)。然后将完全矫正的结合数据整体性地拟合至1:1结合模型(BIAevaluation 4.1软件，BIAcore公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)，该模型包含矫正质量转运限制结合的条目，该结合应该被检测到。这些分析确定了动力学速率(on，off)常数，然后据此将表观KD计算为koff/kon。
[0390] 在金黄色葡萄球菌感染的肺中的细胞因子水平的测量
[0391] 将七至九周龄C57BL/6J小鼠在用1.5x 108cfu USA300(BAA-1556，ATCC)经鼻内感染之前24小时用2A3.1hu(全人2A3.1)或R347(45mg/kg)通过腹膜内注射进行处理。在感染后四小时和二十四小时，使小鼠安乐死，并且将肺用1ml的PBS冲洗3次。将支气管肺泡灌洗液(BAL)在-70℃储存。根据制造商的说明书，使用7个促炎II型小鼠细胞因子试剂盒(Mesoscale，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(MD))将促炎细胞因子定量。细胞因子水平表示为pg/ml。
[0392] GST融合蛋白的克隆和表达
[0393] 通过PCR从以上所述的pColdII AT克隆扩增编码AT1-50和AT51-293的基因序列。反应包含10ng的AT-pColdII DNA和0.1mg的各个正向引物和反向引物(AT1-50-F，atattggatccgcagattctgatattaatattaaaac(SEQ ID NO:45)和AT1-50-R，
atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac(SEQ ID NO:46)；或AT51-293-F，
catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag(SEQ ID NO:47)和AT51-293-R，
catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc(SEQ ID NO:48))，以及根据制造商的说明书所使用的**PCR聚合酶(英杰公司)。将生成的PCR片段用BamHI和XhoI消化，并且连接到pGex 6P DNA载体(Stratagene)中，使其在具有N端谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的框内。通过自动DNA测序证实克隆的序列。
atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac(SEQ ID NO:46)；或AT51-293-F，
catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag(SEQ ID NO:47)和AT51-293-R，
catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc(SEQ ID NO:48))，以及根据制造商的说明书所使用的**PCR聚合酶(英杰公司)。将生成的PCR片段用BamHI和XhoI消化，并且连接到pGex 6P DNA载体(Stratagene)中，使其在具有N端谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的框内。通过自动DNA测序证实克隆的序列。
[0394] 用作为宿主的大肠杆菌的BL21(DE3)菌株完成片段的表达。从平板挑出一些集落并且将其在100mL LB+100μg/mL氨苄西林(西格玛化学公司)中孵育，并且在接近37℃下生长。将过夜培养物以1:100稀释为LB+100μg/mL氨苄西林的3x 1L培养物，并且伴随在大致250RPM的振荡下使其生长至大致0.8的OD600。然后通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达。将培养物在37℃下伴随振荡继续孵育2小时。通过离心收获细菌细胞，并且将其在-20℃冷冻。
[0395] 将细胞沉淀重悬浮于pH 7.4的100mL PBS(英杰公司)中，并且通过在20,000psi微流化(Microfluidics Model M-110P)将其溶解，并且将粗溶解产物通过在4℃在27,000x g下离心10分钟而澄清。将生成的上清液加载到GSTrap FF柱(通用电气医疗集团)上，并且遵循制造商的说明书将GST-AT1-50和GST-AT51-293的可溶部分进行纯化。从不溶性细胞沉淀纯化不溶性GST-AT51-293部分。在室温、伴随轻轻摇动下，将不溶性材料溶解在pH 7.4的25mM磷酸钠中的3M盐酸胍中，持续大约一小时。将溶解的材料用重折叠缓冲液A[pH 7.4的25mM磷酸钠，具有2M盐酸胍]稀释7倍。通过分步透析使GST-AT51-293重折叠。在4℃针对大致2M、1M、然后是0.5M的胍浓度透析每12-15小时之后，将等体积的重折叠缓冲液B[25mM磷酸钠，pH 7.4]添加至透析烧杯。然后将GST-AT51-293针对重折叠缓冲液B透析，持续24小时。通过离心澄清最终的透析液，并且如上所述将可溶部分在GSTrap柱上纯化。
[0396] 斑点印迹测定
[0397] 化学合成跨越氨基酸40至293的重叠肽(新英格兰肽公司(New England Peptide))。尝试AT1-50的合成但不成功。将α毒素(AT)、AT肽和AT片段(1μg)点在硝酸纤维素上，并且用在PBS中的封闭剂酪蛋白封闭10分钟。然后在室温使用2μg/mL的单独IgG探测印迹，持续3小时。将这些印迹洗涤，并且与碱性磷酸酯酶结合的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG(1:1000，Caltag实验室)一起孵育1小时，并且使用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL公司)显色。
[0398] LC10 YTE结合至α毒素和LukF-PV的ELISA表征
[0399] 将含带有His-标签的α毒素或LukF-PV的细菌溶解产物包被在96孔板的表面上，4℃过夜。将板用PBS/0.05％吐温20洗涤六次，并且在37℃用10％Superblock封闭缓冲液(Pierce，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL))封闭1小时。将LC10 YTE或2μg/ml的小鼠抗His mAb(R&D Systems，明尼阿波利斯(Minneapolis)，明尼苏达州(MN))添加至孔中，并且在室温孵育1h。然后将板用PBS/0.05％吐温20洗涤六次。分别使用抗人或抗小鼠IgG HRP结合物(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch laboratories,Inc.)，西格鲁(West Grove)，宾夕法尼亚州(PA))检测结合的LC10 YTE或小鼠抗His mAb。
[0400] 在α毒素与LukF-PV之间的嵌合变体的产生
[0401] 产生由α毒素的部分和LukF-PV组成的嵌合变体，以鉴定在α毒素上的LC10 YTE的结合区。通过基因合成产生编码在aa 1-51、aa 52-110、aa 111-147、aa 148-205、aa 204-241、或aa 248-293处的LukF-PV区的六种α毒素嵌合变体的DNA构建体。通过使用编码α毒素或LukF-PV的pET3d质粒(内部质粒)作为模板的重叠延伸PCR产生编码其他嵌合变体的DNA构建体。然后将所有的DNA构建体克隆到pET3d细菌表达载体(EMD化学品公司，费城
(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA))中，并且将其转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)(英杰公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))中。使用标准方案，使转化的BL21(DE3)细胞在MagicMedia大肠杆菌表达培养基(英杰公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))中生长从而表达变体蛋白。
(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA))中，并且将其转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)(英杰公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))中。使用标准方案，使转化的BL21(DE3)细胞在MagicMedia大肠杆菌表达培养基(英杰公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))中生长从而表达变体蛋白。
[0402] 使用ProteOn表征LC10 YTE与嵌合变体的结合特征
[0403] 使用ProteOn XPR36仪器(BioRad，海格立斯(Hercules)，加利福尼亚州(CA))对LC10 YTE与α毒素/LukF-PV嵌合变体的结合特征进行了研究。使用标准胺偶联将在10mM乙酸钠[pH 5.0]中的抗α毒素多克隆抗体(内部产生的抗体)以对于每个通道大约5000个反应单位(RU)固定至GLC生物传感器芯片的表面。将细菌溶解产物上清液中的α毒素/LukF-PV嵌合蛋白注射在固定的GLC表面上，从而获得大约200RU的捕获反应，未转化的细菌溶解产物上清液也在相同的条件下被注射而作为参考通道。将LC10 YTE样品制备在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)、0.005％吐温-20中，并且以90μL/min以典型范围从50nM至3.125nM的浓度注射持续150秒或180秒。使用600秒或800秒解离时间。还在LC10 YTE的注射后如下地监测嵌合变体的表达水平：使抗α毒素多克隆抗体以90μL/min在典型范围从50nM至3.125nM的浓度下流动持续150秒或180秒，其中解离时间为600秒或800秒。通过以100μL/min注射甘氨酸(10mM，pH 1.5)持续30秒将表面再生。将所有的传感图数据用ProteOn Manager 3.0.1软件处理。
[0404] 实例2：抗α毒素mAb产生
[0405] 抗α毒素(AT)单克隆抗体(mAb)是在VelocImmune小鼠中产生的，这种小鼠已经被遗传工程化为含有具有融合至小鼠恒定域的全人可变区的抗体谱。生成的抗体是人:小鼠嵌合体，通过将来自嵌合mAb的人可变域与来自克隆的人IgG-1的恒定区进行基因融合，该嵌合体容易地转化为全人IgG。将小鼠用在此所述的非溶血性AT突变体(ATH35L)免疫，并且使用标准方法产生杂交瘤。最初，通过抗原ELISA，发现大于1800份杂交瘤上清液含有结合重组AT(rAT-his)的IgG。然后通过在溶血试验中rAT-his介导的兔红细胞(RBC)溶解的抑制，将展现结合至rAT-his的杂交瘤上清液的活性进行筛选，从而使功能性mAb库减少至大约250个。然后将杂交瘤上清液针对IgG水平进行归一化，并且比较它们的抑制活性。选择十三种或最有力的rAT-his抑制剂用于有限稀释克隆，并且用于小规模的IgG表达和纯化。在这些克隆的筛选和随后的生物化学和体内表征之后，如下所述，VH和VL序列被进一步优化以产生另外的如在下表7中列出的抗体。
[0406] 实例3：细胞溶解活性的抑制
[0407] 在溶血试验中，比较了13种纯化的抗AT IgG的抑制活性。在溶血试验中，在恒定数量的nAT和兔红细胞的存在下，将纯化的抗AT mAb逐步增高剂量(titrated)。在恒定量的天然AT(nAT)和兔红细胞(RBC)的存在下，将mAb各自从20μg/mL降低剂量(titrated down)。通过到上清液中的血红蛋白释放来测量溶血。如下计算溶血抑制百分比(％)：抑制％＝100*[100-(A490nAT+Ab)/(A490nAT无Ab)]。证明十三种最有力的rAT-his抑制剂的代表性溶血试验显示于图1A和1B中。非特异性IgG对照(R347)被包括作为阴性对照。
[0408] 13种纯化的mAb中仅有7种(mAb；2A3.1、10A7.5、11D12.1、12B8.19、15B6.3、25E9.1和28F6.1)抑制nAT介导的RBC溶解(参见图1A和1B)。三种抗体(2A3.1、10A7.5和12B8.19)是有力的抑制剂，并且在1:1(IgG摩尔:AT摩尔)比率下展现对nAT介导的RBC溶解的大约80％抑制。这些结果表明产生的mAb可以抑制兔RBC中的孔形成。
[0409] 人红细胞不具有大量的针对AT的受体。因此，人RBC不如兔RBC对于nAT介导的溶解一样敏感，并且可能不是感染期间针对AT的主要目标。其他细胞类型(例如上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞)是在葡萄球菌感染期间针对nAT的效应更有意义的目标。在nAT介导的人细胞系A549(肺泡上皮细胞系)和THP-1(单核细胞系)的溶解中检查了纯化抗体的活性。在A549或THP-1细胞的存在下，将单克隆抗体类(mAb)针对nAT的恒定水平逐步增高剂量。通过乳酸脱氢酶(LDH)的释放以及如在此所述确定的LDH释放的抑制％来量化细胞溶解。结果以图形方式显示于图2A和2B中。抑制兔RBC溶解的mAb也抑制nAT介导的人A549和THP-1细胞两者的溶解(分别参见图2A和B)，除了11D12.1抑制A549细胞的溶解而对nAT介导的THP-1细胞的溶解没有影响之外。由这些mAb展现的有力的抗AT活性突出了这些抗体在感染期间抑制AT活性的潜在效用，由此限制葡萄球菌相关症状和疾病的进展。
[0410] 实例4：用抗AT mAb的被动免疫减少皮肤坏死病灶
[0411] 金黄色葡萄球菌是医院和社区两者中皮肤和软组织感染(SSTI)的主要原因，这些感染的时常特征为炎症、组织损伤以及脓液形成。AT可以在这些感染中起着导致高度炎症应答和组织损伤的作用，并且AT功能的抑制进而限制细菌引起严重疾病的能力。为了确定抗AT mAb在最小化、减少或消除金黄色葡萄球菌感染的影响中的有用性，在用金黄色葡萄球菌Wood皮下感染之前24小时将5只小鼠的组各自腹膜内(IP)注射7种抑制性mAb(例如，大约5mg/kg)以及IgG-1同种型对照(R347)。每天测量皮肤坏死病灶的大小，持续6天，并且用照相的方式进行记录，如在图3A中所示(第6天示于图3A中)。nAT功能的5种最有力的体外抑制剂(2A3.1、10A7.5、12B8.19、25E9.1和28F6.1)相对于R347对照显著减小了病灶大小，而在体外最小有力的mAb(11D12.1、15B6.3)相对于对照不具有对病灶大小的显著影响，如在图3A和3B所示。图3B图形展示了随着时间的过去的病灶大小的减小。2A3.1、10A7.5、12B8.19、25E9.1和28F6.1是体外AT功能的有力抑制剂，并且在SSTI的小鼠模型中还展现出有力的预防作用。在皮肤坏死模型中，还测试了另外的抗体，LC10、QD20、QD33、和QD37。在如上所述用金黄色葡萄球菌Wood皮下感染之前24小时将这些单克隆抗体以1mg/kg和0.5mg/kg腹膜内(IP)注射到每个组的五只小鼠中。结果显示于图17A和B中。P值是使用Dunnett事后检验计算的。对于1mg/kg实验，如与测试Ab相比的，对于R347对照的p值为p<0.0001。对于
0.5mg/kg实验，如与测试Ab相比的，对于R347对照的p值为p<0.05。
0.5mg/kg实验，如与测试Ab相比的，对于R347对照的p值为p<0.05。
[0412] 实例5：用抗AT mAb被动免疫增加在小鼠肺炎中的存活
[0413] 在小鼠肺炎模型中测试用产生的最有力的抗AT mAb进行的预防。在用金黄色葡萄球菌USA300(BAA-1556)鼻内感染之前二十四小时，将C57BL/6J小鼠用大约5mg/kg、大约15mg/kg、以及大约45mg/kg的2A3.1、10A7.5、12B8.19或28F6.1被动免疫。然后监测存活，持续6天，并且如在图4-7中所示将其与在45mg/kg的同种型对照(R347)进行比较。使用对数秩检验计算统计学显著性。图4图形展示了在用不同量的mAB 12B.19进行被动免疫之后在经过金黄色葡萄球菌感染过程中的存活百分比。图5图形展示了在用不同量的mAB 2A3.1进行被动免疫之后在经过金黄色葡萄球菌感染过程中的存活百分比。图6图形展示了在用不同量的mAB 28F6.1进行被动免疫之后在经过金黄色葡萄球菌感染过程中的存活百分比。图7图形展示了在用不同量的mAB 10A7.5进行被动免疫之后在经过金黄色葡萄球菌感染过程中的存活百分比。
[0414] 相对于对照，所有的抗AT抗体显示导致存活的显著改进，导致在45mg/kg剂量下至少90％存活(参见图4-7)。α毒素被认为是葡萄球菌肺炎中的关键的毒力决定因素。在此呈现的结果说明了有力的抑制性mAb的被动给予是用于疾病预防的有效途径。总之，在此呈现的动物研究支持AT在葡萄球菌疾病中的作用，并且提供了抑制AT功能以限制与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病严重性或甚至死亡的mAb的用途的支持。
[0415] 为了进一步表征在感染期间抗AT mAb对细菌数的影响，在用大致1.3x 108cfu的金黄色葡萄球菌USA300鼻内感染之前24小时将全人型式mAb 2A3.1(例如，2A3hu)预防性地递送至小鼠。感染后四十八小时，使小鼠安乐死，并且将它们的肺和肾收集并且进行处理以用于细菌计数(参见图8A和8B)。在感染后4和24小时之后，使小鼠安乐死，并且取样品以测量细胞因子产生(下文描述，并且见图9)并且用于组织病理学分析(下文描述，并且参见图10)。P值是使用Dunnett事后检验计算的。细菌计数的代表性结果呈现于图8A和8B中。2A3hu的预防性给予相对于R347对照导致在肺(见图8A)和肾(见图8B)两者中细菌数目的显著减少，指示AT功能的抑制可以限制疾病进展、增强清除并且还抑制入侵生物的全身性扩散。
[0416] 在肺炎模型中，还测试了另外的抗体，LC10、QD20、QD33、和QD37。在用大致2x 108cfu的金黄色葡萄球菌USA300鼻内(IN)感染之前24小时将这些单克隆抗体以5mg/kg腹膜内(IP)注射到每个组的十只小鼠中。这些实验的结果显示于图18中。P值是使用Dunnett事后检验计算的。对于与QD37相比的2A3mAb的p值是p＝0.0072；对于与LC10相比的2A3mAb的p值是p＝0.0523；对于与QD33相比的2A3mAb的p值是p＝0.0521。
[0417] 实例6：在肺炎模型中AT的抑制减少促炎细胞因子的产生
[0418] 金黄色葡萄球菌感染典型地伴随促炎细胞因子的过度产生，促炎细胞因子被认为导致了增加的免疫细胞活化和浸润，最终导致增加的充血和组织坏死(布贝克沃登伯格(Bubeck Wardenburg,J.)2007)。在小鼠肺炎模型中，金黄色葡萄球菌AT缺失突变体相对于其同基因的野生型金黄色葡萄球菌已经显示展现出降低的毒力。进一步证明的是，针对AT的主动和被动免疫减少了急性肺损伤的已知介质IL-1β的表达，并且保护小鼠免于严重的肺炎(布贝克沃登伯格(Bubeck Wardenburg,J.)2007；布贝克沃登伯格(Bubeck Wardenburg,J.)2008)。如上所见到的，这些结果表明，在金黄色葡萄球菌感染期间抑制AT可以减少促炎细胞因子的产生，并且因此限制过度细胞浸润，伴随的最终结果为较少的肺炎症状以及增强的细菌清除。
[0419] 为了测试这个假设，在用大致1.3x 108cfu的金黄色葡萄球菌USA300鼻内感染之前，将小鼠用2A3hu被动免疫。在感染后四和二十四小时，使小鼠安乐死，并且将一半的肺进行固定并制备用于苏木精和曙红染色和显微镜检，同时将支气管肺泡灌洗液从另一面收集并处理以确定细胞因子水平。在被动免疫之后的细胞因子产生的代表性结果显示于图9中。图10用照相的形式展示了用在此所述的mAb进行被动免疫的有效性。
[0420] 在感染后四小时，在R347和2A3hu处理的小鼠中的细胞因子水平相似，然而到感染后24小时后，在2A3hu处理的动物中IL-6、TNF-α、KC和IL-1β的水平全部降低，如在图9所示(参见在24小时时间点处圈出的结果)，指示2A3hu的预防性给予相对于对照导致检测到降低的细胞因子水平。这些数据由来自肺的组织病理学检查的结果支持，其中R347处理的小鼠具有突出的肺部炎症、坏死以及肺泡炎连同菌落的存在(参见图10中顶部左边和底部左边图片)。相比之下，2A3hu处理的动物具有限制的肺部炎症而无坏死、肺泡炎或可见的菌落(参见图10中顶部右边和底部右边图片)。在肺炎模型中的抗AT mAb的保护效应与减少的炎症应答相关，减少的炎症应答可以限制局部组织损伤并且促进细菌清除。
[0421] 实例7：结合动力学和竞争
[0422] 使用表面等离振子共振(SPR)来进行亲和力测量，从而进一步表征展现出蛋白质抑制活性的mAb。使用大鼠抗小鼠IgG将纯化的IgG捕获在传感器上，并且将芯片暴露至具有不同浓度的nAT的溶液。测量缔合和解离速率常数，从它们确定结合常数。抗体2A3.1、10A7.5、25E9.1和12B8.19具有相似的亲和力，分别具有601、504、337和485pM的KD值，而
28F6.1展现出13nM的KD值，如在下表中所示。KD被计算为koff/kon。
28F6.1展现出13nM的KD值，如在下表中所示。KD被计算为koff/kon。
[0423]
[0424] 还使用SPR进行竞争实验，其结果表明抗体2A3.1、10A7.5、25E9.1和12B8.19可能结合相同或相似的表位。
[0425] 对于mAbs QD20、LC10、QD33、QD37和2A3GL的IC50和Kd值显示如下
[0426]Ab IC50(μg/ml) Kd(nM)
QD20 0.16 0.087
LC10 0,12 0.17
QD33 0.09 0.33
QD37 0.17 0.18
2A3GL 0.48 1.44
QD20 0.16 0.087
LC10 0,12 0.17
QD33 0.09 0.33
QD37 0.17 0.18
2A3GL 0.48 1.44
[0427] 用0.1mg/ml的金黄色葡萄球菌α毒素使用RBC溶血试验计算IC50。
[0428] 实例8：抑制性mAb阻断抗SDS的七聚体的形成
[0429] 金黄色葡萄球菌α毒素(AT)被认为以多步过程溶解细胞，在该过程中，分泌的可溶性单体AT分子结合至细胞表面受体，或非特异性地吸附至细胞膜，在细胞表面上寡聚化为七聚体前孔(pre-pore)并且经历构象变化，导致介导随后的靶细胞溶解的14-链跨膜β-桶的形成。被在此所述的mAb抑制的机制被进一步被表征化以确定抑制性mAb在哪个步骤阻断AT功能。检验这些mAb防止AT结合至连接在96孔组织培养板上的兔RBC血影的能力。将96孔ELISA板用PBC包被，并且用2％BSA封闭。然后将血影与nAT+/-a 20摩尔过量的抗AT IgG一起孵育。然后用兔抗AT IgG检测nAT的结合，并且计算结合％；结合％＝100x[100-(A490nAT+mAb)/(A490nAT无mAb)]。在20摩尔IgG过量下，不存在nAT结合至兔RBC膜的抑制作用，如在图11中所示，指示这些抑制性mAb在受体结合的步骤中不起作用。
[0430] 除了细胞膜外，已经显示AT和其他成孔毒素易于在脂质体膜上组装并且形成孔。最初，在脂质体上测试抗AT IgG对AT七聚体形成的作用。在AT与用10倍摩尔过量的脂质体(脂质:AT，wt:wt)孵育后，在IgG的存在下，通过western印迹分析来检验七聚体形成，如在图12中所示。然后在37C将样品溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，并且通过western印迹分析来检测七聚体形成。抗SDS的七聚体存在于在图12泳道6和7(例如，分别为mAb9D7.3和无IgG的对照泳道)中显示的凝胶的顶部是很清楚的。所有的抑制性mAb去除七聚体形成，而无关的同种型对照(例如，泳道6；9D7.3)没有影响。寡聚化活性的抑制是在兔RBC血影上的寡聚化测定中使用mAb 2A3.1、10A7.5和12B8.19来证实的，如在图13A和13B中所示的代表性western印迹中所展示的。在与兔红细胞血影孵育并且通过SDS-PAGE检测七聚体形成之前，孵育AT伴随IgG的逐步增高剂量(titration)。mAb 2A3.1、10A7.5和12B8.19有效地抑制AT七聚体形成(甚至在1:1IgG:毒素比率下(摩尔:摩尔))，并且当这些mAb水平降低时寡聚化抑制效应被取消(titrated)(参见图13A和13B；七聚体以0.5:1和0.25:1的摩尔比出现)。这些结果表明，mAb 2A3.1、10A7.5和12B8.19通过抑制抗SDS的七聚体形成而预防AT介导的细胞溶解。
[0431] 实例9：全人IgG的转化
[0432] 全人IgG包括基因融合至人IgG-1恒定域的、来自在此所述的嵌合mAb的重链(VH)和轻链(VL)的可变域。将来自各个嵌合mAb的VH和VL进行克隆、测序并且分别融合至人IgG-1VH和人κ恒定域。生成的全人IgG-1s显示为保留负责任的人可变区以及感兴趣mAb的结合特性。将全人抗体进行表达、纯化，并且将它们的活性与来自VelocImmune小鼠杂交瘤的嵌合mAb进行比较。除了25E9.1hu之外，全人mAb与原始的嵌合体相比在抑制RBC、A549和THP-1细胞溶解方面展现出相似的效力，它变得比原始的25E9.1嵌合体显著更有力。图14-16图形展示了在红细胞(RBC；见图14)、A549细胞(见图15)和THP-1细胞(见图16)中LDH释放的抑制(细胞溶解的特征)。人25E9.1mAb(例如，25E9.1hu)的效力的增加可能是由于在含有2种相异的抗AT IgG分子的原始杂交瘤中的混合细胞群体所致，其中仅有一种可能已经具有抑制nAT功能的活性。因此，对于原始嵌合体mAb的体积摩尔浓度计算和活性测量可能不具有直接相关性。
[0433] 实例10：针对特异性结合至金黄色葡萄球菌α毒素的抗体的代表性氨基酸和核苷酸序列
[0434] 表1：针对mAb 2A3.1、10A7.5、12B8.19和25E9.1的VL CDR序列
[0435]SEQ ID NO: 描述 序列
SEQ ID NO:1 VL CDR1 RASQSISSWLA
SEQ ID NO:2 VL CDR2 KASSLES
SEQ ID NO:3 VL CDR3 QQYNSYWT
SEQ ID NO:1 VL CDR1 RASQSISSWLA
SEQ ID NO:2 VL CDR2 KASSLES
SEQ ID NO:3 VL CDR3 QQYNSYWT
[0436] 表2：针对mAB 28F6.1的VL CDR序列
[0437]
[0438] 表3：针对mAb 2A3.1的VH CDR序列
[0439]SEQ ID NO: 描述 序列
SEQ ID NO:7 VH CDR1 SYDMH
SEQ ID NO:8 VH CDR2 GIGTAGDTYYPGSVKG
SEQ ID NO:9 VH CDR3 DNYSSTGGYYGMDV
SEQ ID NO:7 VH CDR1 SYDMH
SEQ ID NO:8 VH CDR2 GIGTAGDTYYPGSVKG
SEQ ID NO:9 VH CDR3 DNYSSTGGYYGMDV
[0440] 表4：针对mAb 10A7.5和12B8.19的VH CDR序列
[0441]SEQ ID NO: 描述 序列
SEQ ID NO:10 VH CDR1 RYDMH
SEQ ID NO:11 VH CDR2 VIGTDGDTYYPGSVKG
SEQ ID NO:12 VH CDR3 DRYSSSNHYNGMDV
SEQ ID NO:10 VH CDR1 RYDMH
SEQ ID NO:11 VH CDR2 VIGTDGDTYYPGSVKG
SEQ ID NO:12 VH CDR3 DRYSSSNHYNGMDV
[0442] 表5：针对mAb 28F6.1的VH CDR序列
[0443]
[0444] 表6：针对mAb 25E9.1的VH CDR序列
[0445]
[0446] 表7：针对抗α毒素mAb的VL和VH氨基酸序列
[0447]
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456] 表8：针对抗α毒素mAb的VL和VH核苷酸序列
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461] 表9：VL和VH CDR总结表
[0462]
[0463] 表10：α毒素氨基酸序列
[0464]
[0465]
[0466] 实例11：抗葡萄球菌α毒素抗体结合区的作图
[0467] 将由α毒素的部分和LukF-PV组成的嵌合变体构建为鉴定相应于含有Fc变体的mAb LC10的抗体(LC10 YTE)所结合的α毒素片段。选择LukF-PV作为嵌合配偶体，因为它不被LC10 YTE识别(图19)，但与α毒素共享高的结构相似性(古奧(Gouaux)，E.,M.Hobaugh(霍鲍)，等人“alpha-Hemolysin,gamma-hemolysin,and leukocidin from Staphylococcus aureus:distant in sequence but similar in structure.”(“来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素、γ溶血素、以及杀白细胞素：序列上远离但结构上相似”)，Protein Sci(《蛋白质科学》)6(12):2631-5(1997)；Meesters(米斯特斯)，C.,A.Brack(布拉克)，等人“Structural characterization of the alpha-hemolysin monomer from Staphylococcus aureus.”(“来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素单体的结构表征”)，Proteins(《蛋白质》)75(1):118-26(2009))以及25％的序列一致性(图20)。通过系统性地用它们的相应LukF-PV对应物替换50个α毒素氨基酸(aa)，构建了一系列的嵌合变体。在选择的感兴趣的50aa区段之内的较短的区域也被替换(表11)。使用ProteOn仪器来分析LC10 YTE与这些变体的结合亲和力。LC10 YTE与变体的结合结果概述于表11中。
[0468] 表11：LC10 YTE与α毒素/LukF-PV嵌合变体的结合谱
[0469]
[0470]
[0471] *在50nM的抗α毒素多聚物(poly)的结合信号是在100RU以上。**在50nM的抗α毒素多聚物的结合信号是在100RU以下。
[0472] 除了KO_73-81之外，所有嵌合构建体可以按某一水平表达(表11)。LC10 YTE不结合至编码取代α毒素的aa 101-110(KO_52-110和KO_101-110)或aa 224-231(KO_204-241、KO_204-231和KO_224-231)的LukF-PV的变体。当分别替换aa 248-277(KO_248-277)或其较大区段aa 248-293(KO_248-293)时，LC10 YTE的结合被显著损害或完全被破坏。
[0473] 在某些情况下，与LC10 YTE结合的明显缺乏可以通过单独的展现不正确的折叠的α毒素/LukF-PV变体来解释。总体无能力正确折叠也可以解释KO 73-81的表达的明显缺乏的原因。另外，在α毒素与LukF-PV之间的氨基酸序列同源性在不同的区域基本上不同。例如，相应于α毒素的aa 179-193的区段与LukF-PV共享67％的一致性，而整个序列共享25％的一致性。因此，虽然在对换具有高度序列同源性的区域时没有看到对LC10 YTE结合的影响，这些区域仍可以潜在地含有LC10 YTE抗体与之结合的另外的序列。
[0474] 来自以上诱变分析的结果指示α毒素的aa 101-110、aa 224-231、和248-293三个区域的任一个被LukF-PV残基的替换损害了LC10 YTE结合，而替换剩余的aa区域没有显著影响。
[0475] 这三个区域代表在α毒素的三维结构中的两个不同位置。相应于aa 101-110和224-231的区段在空间上靠近，并且被定位在β-三明治结构域的一侧，而相应于aa 248-277的区段主要定位于“Rim”结构域上(Song(宋)，L.,M.R.Hobaugh(霍鲍)，等人，“Structure of staphylococcal alpha-hemolysin,a heptameric transmembrane pore.”(“葡萄球菌α溶血素的结构，七聚体的跨膜孔”)，Science(《科学》)274(5294):1859-66(1996))(图21)。
[0476] 相应于aa 248-277的区段显示对结合的影响，并且还包含被鉴定为包含aa 261-272的X射线结构的接触残基(其中T263、N264、和K266是真正的接触残基)(图20)。另外，晶体结构揭露了相应于aa 173-201的另一个区段，其中D183、W187、和N188是真正的接触残基(图20)。含有这个特定区段的嵌合变体(KO_148-205)仍然展现出对LC10 YTE的良好结合。
这可能归因于在α毒素与LukF-PV之间的这个特定区域的高度序列同源性(52％一致性和
63％的相似性)。在接触残基周围的氨基酸(aa 179-193)共享甚至更高的同源性(67％一致性)，而相比之下整个序列仅共享25％的一致性。
这可能归因于在α毒素与LukF-PV之间的这个特定区域的高度序列同源性(52％一致性和
63％的相似性)。在接触残基周围的氨基酸(aa 179-193)共享甚至更高的同源性(67％一致性)，而相比之下整个序列仅共享25％的一致性。
[0477] 使用基于诱变的途径，相应于aa 248-277的区段被鉴定为对于LC10 YTE的结合是重要的。这被进一步通过LC10 YTE/α毒素复合体结构的结构分析来证实。结构分析还揭示了在某些在aa 248-277片段之内的、存在于aa 261-272内的接触残基。
[0478] 如上所讨论，进行确定LC10 YTE mAb的接触残基的X射线晶体学实验。将纯化的α毒素(通过293的残基1)和LC10 YTE Fab分开进行浓缩。将几乎等摩尔量的这些蛋白质混合在一起，并且使溶液经受用Sephadex S75(通用电气医疗集团)柱的凝胶过滤色谱。洗脱峰包含结合至彼此的两种蛋白质分子。进一步的浓缩和结晶产生衍射至 的晶体。
[0479] 使用分子置换方法来解析复合体的结构。使用预先确定的、具有去除互补决定区的Fab结构(D25)作为用于LC10 YTE Fab的模板。使用从七聚体复合体(PDB Id.7AHL)衍生的具有一些截短的α毒素分子单体作为用于α毒素分子的模板。用于晶体学研究的α毒素分子的序列相应于SEQ ID NO:39的序列。使用来自CCP4程序套的Phaser程序来鉴定LC10 YTE-α毒素复合体的每个不对称单元中的两种复合体。使用来自CCP4程序套的Refmac程序进一步细化结构的模型。使用特定的晶体学程序“O”进行手工建造和迭代模型改进。
[0480] 发现Fab的重链和轻链两者与α毒素分子接触(图22)。具体而言，晶体学研究确定了对于重链和轻链两者的相应于以下项的在α毒素分子之内的接触残基：N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。另外，确定了轻链具有与T261、T263、N264、K266和K271的接触。互补位(paratope)鉴定为LC–W32(CDR1)、K50(CDR2)、Y91、A92、N93、Y94、W95(CDR3)；HC–D33(CDR1)、T53、A54、D56、Y58(CDR2)、D98、Y100、P102、T103、G104、H105、Y106(CDR3)。
[0481] 结合来自晶体学分析的结构数据的分子建模揭示，在从单体态到七聚体态的转换过程中多数α毒素结构保持不变。然而，显示关键结合区(其中接触残基被鉴定为T261、T263、N264、K266和K271)相应于参与七聚体形成的α毒素分子的一部分。当α毒素分子处于单体态时，这个关键区被紧凑折叠，该关键区在插入宿主细胞膜之前延伸为环(图23b)，并且最后在组装成七聚体态之后形成蘑菇状结构的茎(图23a)。在七聚体态中，如在图24a中所示的这个区将预期被遮蔽而免于被LC10 YTE抗体分子结合。
[0482] 实例12：抗葡萄球菌α毒素抗体的治疗效力
[0483] 以上讨论的结果描述了在预防中使用的抗AT mAb的效力。为了探讨这些mAb还可以起治疗作用的可能性，在皮肤坏死和肺炎模型两者中在治疗环境中测试了LC10的效力。在皮肤坏死模型中，在细菌激发之前24小时(预防)、以及在皮内注射后1、3或6小时后(治疗)给予LC10(IV)。监测在动物上的病灶大小持续6天。预防(-24小时)和感染后1或3小时后的治疗导致相对于阴性对照(R347)的病灶大小的减少(图24)。在这个模型中当感染后6小时递送LC10时，强的治疗益处丧失。这些结果指示LC10可以作为葡萄球菌性皮肤和软组织感染的有效疗法起作用。
[0484] 在肺炎模型中进行了相似的实验，其中在预防中或鼻内感染后1、3或6小时，将LC10递送至小鼠(IV)。如所预期的，预防性mAb给予导致完全的存活。(图25)虽然当感染后1、3或6小时给予LC10时不导致完全存活，当LC10以最高的LC10剂量用于感染后1小时的治疗中时，在死亡时间上的益处相对于阴性对照仍然存在。鉴于模型对高感染剂量以及迅速的死亡起始的要求，这些存活的改进指示在人感染期间的治疗改进可以出现。
[0485] 实例13：万古霉素与抗α毒素mAb LC-10组合的效力
[0486] 进行了这样的研究，该研究通过比较抗α毒素mAb和万古霉素单一疗法与组合疗法而评定在小鼠肺炎模型中抗α毒素mAb LC 10供在用万古霉素的辅助治疗中使用的潜力。
[0487] 将七周龄雌性C57BL/6J小鼠用2e8cfu(LD100)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300进行鼻内感染。将万古霉素和LC-10单独地逐步增高剂量以确定最佳的和次有效的剂量。为了在单一疗法或具有万古霉素的二联疗法中评估mAb，将小鼠在感染后一小时用LC-10的单一腹膜内剂量或阴性对照抗体R347(15mg/kg)进行治疗。在单一疗法或二联疗法中的万古霉素治疗在感染后1小时后起始，并且一日二次(BID)皮下给予3天。在第七天结束时确定所有治疗组的存活百分比。使用Mandel-Cox对数秩检验分析存活曲线。
[0488] 用万古霉素以200mg/kg/天或40mg/kg/天治疗分别导致90％和43％的存活。感染后使用在45mg/kg或15mg/kg的LC-10的单一疗法保护50％和33％的小鼠。(图26A和B)用LC-10的单一的次有效剂量(15mg/kg)与在40mg/kg的万古霉素的一日二次(BID)给药的组合疗法导致75％的动物存活。随着40mg/kg/天万古霉素与45mg/kg LC-10的组合，百分之九十的小鼠存活。在用万古霉素的单一疗法与用15mg/kg或45mg/kg LC-10的组合疗法之间的存活的差异是统计显著性的。(对应地p＝0.026而p＝0.015)。通过等效线图解法分析，万古霉素和LC-10的共同给药产生协同效应(图27)。
[0489] 实例14：具体实方式的实例
[0490] 在下文提供了某些实施方式的非限制性实例。
[0491] A1.一种分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包括：
[0492] (a)VH CDR1，该VH CDR1包含与SEQ ID NO:7、10、13或69一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换；
[0493] (b)VH CDR2，该VH CDR2包含与SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，以及
[0494] (c)VH CDR3，该VH CDR包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换。
[0495] A2.如实施例A1所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3由SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；
SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；
SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71表示。
SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和71；
SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71表示。
[0496] A3.一种分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，并且包括：
[0497] (a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；
[0498] (b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；
[0499] (c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列；
[0500] (d)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；
[0501] (e)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73或77的氨基酸序列；以及
[0502] (f)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0503] A4.如实施例A3所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:7、8、9、1、2和3；SEQ ID NO:10、11、12、1、2和3；SEQ ID NO:13、14、15、4、5和6；SEQ ID NO:7、17、18、1、2和3；SEQ ID NO:7、8、16、1、2和
64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和
68；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和
68；SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、75、71、1、
2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、
71、1、77和74的氨基酸序列。
64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和64；SEQ ID NO；7、8、66、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和
68；SEQ ID NO:7、8、67、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、78、1、2和64；SEQ ID NO:7、8、65、1、2和
68；SEQ ID NO:69、70、71、1、2和68；SEQ ID NO:7、8、72、1、73和74；SEQ ID NO:69、75、71、1、
2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、2和68；SEQ ID NO:69、75、76、1、77和74；SEQ ID NO:69、70、
71、1、77和74的氨基酸序列。
[0504] A5.如实施例A1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VH链结构域的三个CDR包含：
[0505] (a)VH CDR1，该VH CDR1包含SEQ ID NO:7、10、13或69的氨基酸序列；
[0506] (b)VH CDR2，该VH CDR2包含SEQ ID NO:8、11、14、17、70或75的氨基酸序列；以及[0507] (c)VH CDR3，该VH CDR3包含SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列。
[0508] A6.如实施例A5所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相应于SEQ ID NO:7、8和9；SEQ ID NO:10、11和12；SEQ ID NO:13、14和15；SEQ ID NO:7、17和18；SEQ ID NO:7、8和16；SEQ ID NO:7、8和65；SEQ ID NO:7、8和66；SEQ ID NO 7、8、和67；SEQ ID NO:7、8和78；SEQ ID NO:69、70和71；SEQ ID NO:7、8和72；SEQ ID NO:69、75和
71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列。
71；SEQ ID NO:69、75和76；或SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列。
[0509] A7.如实施例A1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段(i)包括含有三个CDR的VH链结构域以及含有三个CDR的VL链结构域；并且(ii)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，其中该VL链结构域的三个CDR包含：
[0510] (a)VL CDR1，该VL CDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列；
[0511] (b)VL CDR2，该VL CDR2包含SEQ ID NO:2、5、73或77的氨基酸序列；以及
[0512] (c)VL CDR3，该VL CDR3包含SEQ ID NO:3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0513] A8.如实施例A7所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相应于SEQ ID NO:1、2和3；SEQ ID NO:4、5和6；SEQ ID NO:1、2和64；SEQ ID NO:1、2和68；SEQ ID NO:1、73和74；或SEQ ID NO:1、77和74的氨基酸序列。
[0514] A9.一种分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，(ii)包含重链可变域，该重链可变域具有与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90％的一致性，并且(iii)包含轻链可变域，该轻链可变域具有与SEQ ID NO:19、21、23、25、
27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少90％的一致性。
27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的氨基酸序列至少90％的一致性。
[0515] A10.如实施例A9所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH和VL相应于SEQ ID NO:20和19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的氨基酸序列。
[0516] A11.该分离抗体或其抗原结合片段，其中该该分离抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO 20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的重链可变域以及具有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的轻链可变域。
[0517] A12.如实施例A11所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH和VL相应于SEQ ID NO:20和19；SEQ ID NO:22和21；SEQ ID NO:24和23；SEQ ID NO:26和25；SEQ ID NO:28和27；
SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和
54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和
54；SEQ ID NO:55和56；SEQ ID NO:57和58；SEQ ID NO:59和60；SEQ ID NO:61和58；SEQ ID NO:62和58；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:79和63的氨基酸序列。
[0518] A13.如实施例A1至A12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽，并且具有一种或多种选自下组的特征，该组由以下各项组成：
[0519] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0520] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0521] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0522] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；以及
[0523] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0524] A14.如实施例A1至A13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段包括一种另外的药剂。
[0525] A15.如实施例A14所述的抗体或抗原结合片段，其中该另外的药剂是一种抗生素。
[0526] A16.如实施例A14所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段经由一种接头连接至治疗剂。
[0527] A17.如实施例A1至A13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段进一步包括一种诊断剂。
[0528] A18.如实施例A17所述的抗体或抗原结合片段，其中该诊断剂包括一种显像剂。
[0529] A19.如实施例A17所述的抗体或抗原结合片段，其中该诊断剂包括一种可检测标记物。
[0530] A20.如实施例A17所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段经由一种接头连接至该诊断剂。
[0531] A21.如实施例A1至A20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该金黄色葡萄球菌毒素多肽是一种天然的毒素多肽。
[0532] A22.如实施例A1至A20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该金黄色葡萄球菌α毒素多肽包括SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
[0533] A23.如实施例A13所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞来自血液或肺。
[0534] A24.如实施例A23所述的抗体或抗原结合片段，其中来自血液的细胞是一种红细胞。
[0535] A25.如实施例A13、A23和A24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞溶解是通过溶血体外试验或乳酸脱氢酶体外试验确定的。
[0536] A26.如实施例A1至A25中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。
[0537] A27.如实施例A1至A26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段中和该金黄色葡萄球菌α毒素多肽。
[0538] A28.如实施例A1至A27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，该VH CDR3包含与SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
[0539] A29.如实施例A1至A28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该分离抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽并且包括VL CDR3，该VL CDR3包含与SEQ ID NO:3、6、64、68或74一致的氨基酸序列或相对于它们包含1、2、或3个氨基酸残基置换，其中该抗体或抗原结合片段抑制该金黄色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
[0540] A30.如实施例A13、A28和A29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该寡聚化的抑制是通过体外结合和/或电泳迁移率测定确定的。
[0541] D1.一种组合物，包含如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
[0542] B1.一种试剂盒，包含
[0543] (a)如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物；
[0544] (b)用于使用该组合物的说明书或者用于获得使用该组合物的说明书的指导。
[0545] B2.如实施例B1所述的试剂盒，其中在该组合物中的抗体连接至一种固体支撑物。
[0546] B3.如实施例B2所述的试剂盒，其中该固体支撑物是一种珠粒。
[0547] B4.如实施例B3所述的试剂盒，其中该珠粒是一种琼脂糖凝胶珠。
[0548] B5.如实施例B1至B4中任一项所述的试剂盒，其中供使用的这些说明书包括金黄色葡萄球菌α毒素多肽的分离、纯化、检测、和定量中的一项或多项。
[0549] B6.如实施例B1至B5中任一项所述的试剂盒，包括缓冲液、固体支撑物或者缓冲剂与固体支撑物。
[0550] B7.如实施例B6所述的试剂盒，其中该固体支撑物是珠粒、过滤器、膜和多孔板(multiwall plate)中的一种或多种。
[0551] B8.如实施例B6所述的试剂盒，包含一种适用于Western印迹的缓冲液和膜。
[0552] B9.如实施例B6所述的试剂盒，包含上样缓冲液和洗脱缓冲液。
[0553] B10.如实施例B6所述的试剂盒，包含适用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的缓冲液。
[0554] C1.一种用于预防、治疗或管理在受试者中的肺炎的方法，该方法包括：
[0555] 将一种如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物以用于预防、治疗或管理肺炎有效的量给予至对其有需要的受试者。
[0556] C2.如实施例C1所述的方法，是一种用于预防肺炎的方法。
[0557] C3.如实施例C1或C2所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至在SEQ ID NO:39之内的构象表位。
[0558] C4.一种用于预防、治疗或管理在受试者中的皮肤感染病症的方法，该方法包括：将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以用于预防、治疗或管理该皮肤感染病症有效的量给予至对其有需要的受试者。
[0559] C5.如实施例C4所述的方法，其中该皮肤感染病症是皮肤坏死。
[0560] C6.如实施例C4或C5所述的方法，其中该皮肤感染病症包括皮肤的金黄色葡萄球菌感染。
[0561] C7.如实施例C4至C6中任一项所述的方法，是一种用于预防皮肤感染病症的方法。
[0562] C8.一种用于预防、治疗或管理一种与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法，该方法包括将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以减少该毒素多肽的寡聚化有效的量给予至对其有需要的受试者。
[0563] C9.如实施例C8所述的方法，是一种用于预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。
[0564] C10.一种用于预防、治疗或管理与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法，该方法包括将免疫特异性地结合至金黄色葡萄球菌α毒素多肽的一种抗体或其抗原结合片段以减少红细胞溶解有效的量给予至对其有需要的受试者。
[0565] C11.如实施例C10所述的方法，是一种用于预防与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的方法。
[0566] C12.如实施例C10或C11所述的方法，其中该红细胞是一种来自血液或肺的细胞。
[0567] C13.如实施例C4至C12中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段具有一种或多种选自下组的特征，该组由以下各项组成：
[0568] (a)对于α毒素大约13nM或更小的亲和常数(KD)；
[0569] (b)结合至α毒素单体，但不抑制α毒素结合至α毒素受体；
[0570] (c)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％抑制α毒素寡聚体的形成；
[0571] (d)以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低α毒素的细胞溶解活性(例如，如通过细胞溶解和溶血试验所确定)；以及
[0572] (e)减少细胞浸润和促炎细胞因子释放(例如，在一种动物肺炎模型中)。
[0573] C14.如实施例C13所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合至在SEQ ID NO:39之内的构象表位。
[0574] C15.如实施例C1至C14中任一项所述的方法，其中给予至受试者的抗体或抗原结合片段或组合物是根据如实施例A1至A30中任一项或D1的。
[0575] C16.一种方法，包括：
[0576] 将如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至细胞；并且
[0577] 检测与给予该组合物至这些细胞相关的生物效应的存在、不存在或量。
[0578] C17.一种方法，包括：
[0579] 将如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至受试者；并且
[0580] 检测在受试者中与该组合物的给予相关的生物效应的存在、不存在或量。
[0581] C18.一种方法，包括：
[0582] 将如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至受试者；并且
[0583] 监测受试者的病症。
[0584] C19.一种用于中和金黄色葡萄球菌α毒素多肽的方法，该方法通过将有效量的如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至对其有需要的受试者来中和该毒素多肽。
[0585] C20.一种预防、治疗、或管理对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的病症的方法，该方法包括将有效量的如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至受试者从而预防、治疗或管理该病症。
[0586] C21.一种治疗、预防、或减轻对其有需要的受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的失调的症状的方法，该方法包括将有效量的如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至受试者从而治疗、预防或减轻这些症状。
[0587] C22.一种用于诊断在受试者中的由金黄色葡萄球菌α毒素介导的病症的方法，该方法包括选择对诊断有需要的受试者，并且将诊断有效剂量的如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物给予至受试者。
[0588] C23.如实施例C1至C22中任一项所述的方法，其中该受试者是一种家畜。
[0589] C24.如实施例C1至C22中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
[0590] C25.一种用如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物以至少50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制金黄色葡萄球菌α毒素寡聚体形成的方法。
[0591] C26.如C25所述的方法，其中金黄色葡萄球菌α毒素寡聚体的形成的抑制抑制了活性成孔复合体的形成。
[0592] C27.一种用如实施例A1至A30中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如实施例D1所述的组合物以至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％降低金黄色葡萄球菌α毒素的细胞溶解活性的方法，其中该细胞溶解活性是通过细胞溶解和/或溶血试验确定的。
[0593] ***
[0594] 在此参考的每个专利、专利申请、出版物以及文件的全文特此通过引用结合。以上专利、专利申请、出版物以及文件的引用不是承认前述的任一项是相关的现有技术，它也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
[0595] 可以在不偏离在此的基本方面的情况下而对前述内容作出修改。虽然本技术已经参考一个或多个特定实施例描述了大量的细节，本领域的普通技术人员将认识到可以对本申请中具体披露的实施例作出改变，然而这些修改和改进是在本技术的精神和范围之内。
[0596] 在此适当说明性地描述的该技术可以在缺乏未在此未明确披露的任何要素下实践。因此，例如，在在此的每种情况下，术语“包括”(“comprising”)、“主要由…组成”(“consisting essentially of”)、以及“由…组成”(“consisting of”)中的任何一个可以用另外两个术语替换。已经使用的术语和表述被用作描述的术语并且没有限制性，并且此类术语和表述的使用不排除所显示和描述的特征或其部分的任何等效物，并且在所要求的技术的范围之内不同的修改是可能的。术语“一种/一个”(“a”或“an”)可以是指它修饰的一个或多个要素(例如，“一种试剂”可以表示一种或多种试剂)，除非根据上下文清楚是要素之一还是一个以上的要素被描述。应当理解的是，虽然已经通过代表性实施例和任选特征明确披露了本技术，在此披露的概念的修改和变更可以被本领域普通技术人员采取，并且这样的修改和变更被认为是在本技术的范围之内。
[0597] 在此的某些实施例陈述于下列权利要求中。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| DNA免疫吸附剂及其制备方法 | 2020-05-11 | 262 |
| 犬粪抗原检测酶联免疫吸附试剂盒 | 2020-05-13 | 878 |
| 酶联免疫吸附试验加速仪 | 2020-05-14 | 816 |
| 一种血浆分离蛋白A免疫吸附装置 | 2020-05-14 | 426 |
| 一种免仪器酶联免疫吸附测定方法 | 2020-05-14 | 437 |
| 肌红蛋白免疫吸附剂及免疫吸附装置 | 2020-05-11 | 666 |
| 一种高灵敏度酶联免疫吸附分析方法 | 2020-05-14 | 940 |
| 一种磁性免疫吸附纤维及其制备方法 | 2020-05-15 | 585 |
| 酶联免疫吸附测定溶液系统 | 2020-05-15 | 701 |
| 酶联免疫吸附检测方法 | 2020-05-11 | 1007 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈