一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒
阅读：1036发布：2020-06-16
专利汇可以提供一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域检测 试剂 盒 ，特别是用于检测发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV）核衣壳蛋白（N蛋白）特异性 抗体 的多肽-酶联 免疫 吸附 试剂盒。本发明试剂盒包含预先包被人工合成SFTSV核衣壳蛋白线性B细胞 抗原 多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过 氧 化物酶（HRP）标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明试剂盒特异性高，重复性好，操作简便快捷，可广泛用于评估发热伴血小板减少综合征 病毒感染 情况。，下面是一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于试剂盒中包含包被发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液；预先包被抗原的酶标板制备方法如下：人工合成KKLKETGGDDWVKDTK、ASGKMSNSGSKRL、ERAETRL、LKVENYPP、GVSEATT和KMRGASKTEVYNSFRDP六段包含该病毒N蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，用包被缓冲液将各多肽稀释至10微克/毫升，每种多肽溶液各取2毫升，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次，每孔加入200微升含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。
一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗
技术领域
背景技术
[0002] 发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)也称新型布尼亚病毒，是布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，由蜱虫叮咬传播。该病毒为单股负链RNA病毒，其基因组由大片段(L)、中片段(M)、小片段(S)三个基因片段组成。核衣壳蛋白N由S片段编码，包裹基因组RNA，形成核糖核蛋白复合物，它在基因转录、复制以及病毒组装过程中起重要作用。N蛋白具有良好的抗原性，能够诱导机体产生特异性抗体。N蛋白上包含线性B细胞抗原决定簇位点，由连续的氨基酸序列组成，可以与由完整抗原诱导产生的抗体发生结合作用。因此可利用这些抗原表位来捕获特异性抗体，实现抗体检测。
[0003] 近年来，在辽宁、湖北、山东、河南、江苏、安徽、浙江等地均出现感染发热伴血小板减少综合征病毒的病例。发热伴血小板减少综合征病毒的患者临床上表现为起热急、乏力、恶心、呕吐等胃肠消化道症状，伴有血小板减少、白细胞减少，部分病例有头痛甚至出血等症状，少数重症患者因多器官衰竭而死亡，病死率约为10％。
[0004] 目前检测发热伴血小板减少综合征病毒的方法主要有免疫学检测法、核酸分子生物学检测法等，其中反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法依赖精密仪器，实验成本高；中和试验方法实验周期长，灵敏度和特异性较差。因此迫切需要建立快捷有效的对发热伴血小板减少综合征病毒感染情况进行评估的检测试剂盒。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，用于检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体，评估发热伴血小板减少综合征病毒感染情况，具有操作简便，速度快，重复性好，成本低，特异性强等优点，能被基层单位广泛使用。
[0006] 本发明是一种检测发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(N蛋白)特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，包含预先包被人工合成的发热伴血小板减少综合征病毒N蛋白线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。其主要技术方案如下：人工合成KKLKETGGDDWVKDTK、ASGKMSNSGSKRL、ERAETRL、LKVENYPP、GVSEATT和KMRGASKTEVYNSFRDP六段包含该病毒N蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，用包被缓冲液将各多肽稀释至10微克/毫升，每种多肽溶液各取2毫升，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。该板与待测样品37℃孵育1小时，可以结合样品中的特异性抗体。同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔。洗涤3次后，加入稀释5000倍的HRP酶标抗体，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次，加入酶底物邻苯二胺(OPD)显色，轻拍混匀后37℃孵育10分钟。每孔加入终止液50微升，震荡10秒混匀，用酶标仪测定490纳米的吸光度值。以P/N比值法判定结果，样品吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，小于2.1为阴性。
[0007] 本发明提供的检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，用于检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体。
[0008] 本发明提供的检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，用于评估发热伴血小板减少综合征病毒感染情况，应用于血清学和流行病学研究。
[0010] (1)根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白N的氨基酸序列，预测并确定该病毒N蛋白上的优势线性B细胞抗原决定簇位点。
[0011] (2)人工合成KKLKETGGDDWVKDTK、ASGKMSNSGSKRL、ERAETRL、LKVENYPP、GVSEATT和KMRGASKTEVYNSFRDP六段包含该病毒N蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，并鉴定纯度。
[0012] (3)将合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液分别稀释到10微克/毫升，各取1毫升多肽溶液进行混合，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存，即为预先包被好抗原的酶标板。
[0013] (4)本试剂盒中所含阴性对照血清为正常血清样本，阳性对照血清为明确感染该病毒的患者血清样本，并已通过实验验证。
[0014] (5)本试剂盒涉及的其他试剂配制方法如下：
[0016] 磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH 7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.9克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和0.2克氯化钾(KCl)，溶解混匀。
[0017] 封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
[0018] 样品稀释液：PBS中加入1％牛血清白蛋白及0.1％吐温-20，pH7.4。
[0019] 酶标抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。
[0020] 浓缩洗涤液：含有1％吐温-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涤时稀释10倍使用。
[0021] 酶底物A溶液：5.1克柠檬酸(C6H8O7·H2O)，18.4克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加水定容到1000毫升后混匀。
[0022] 酶底物B溶液：30％双氧水(H2O2)1毫升。
[0023] 酶底物C：邻苯二胺(OPD)粉末1克。
[0024] 终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升98％浓硫酸加入891.3毫升水中，混匀冷却。
[0025] (6)使用本发明试剂盒检测样本的具体方法如下：
[0026] 取出试剂盒中已经包被好发热伴血小板减少综合征病毒N蛋白线性B细胞抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。配置OPD显色液，称取酶底物C20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定490纳米处的吸光度值。使用P/N比值法判定结果，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，小于2.1为阴性。鉴定结果，样品1为阴性，其余为阳性(见附图2)。
[0027] 本发明的优点及积极效果：
[0028] (1)本发明试剂盒使用人工合成方法制备包含发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，纯度高，特异性好，直接瞄准相应抗体，避免其他物质引起的非特异性反应，减少假阳性，提高检测准确性；
[0029] (2)本发明试剂盒能够检测发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白特异性抗体，快速评估发热伴血小板减少综合征病毒感染；
[0030] (3)本发明试剂盒具有成本低、操作简便、速度快、特异性强等优点，能够被基层单位广泛使用。
附图说明
[0031] 图1为本发明试剂盒制备工艺流程图。
[0032] 图2为本发明试剂盒检测病例血清中特异性抗体的多肽-ELISA结果。
具体实施方式
[0034] 实施例1：发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白N的优势线性B细胞抗原多肽制备
[0035] 根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白N的氨基酸序列，预测并确定该病毒核衣壳蛋白上的优势线性B细胞抗原决定簇位点。人工合成包含N蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的六段多肽KKLKETGGDDWVKDTK、ASGKMSNSGSKRL、ERAETRL、LKVENYPP、GVSEATT和KMRGASKTEVYNSFRDP，纯化后纯度为95％以上。
[0036] 实施例2：预先包被多肽抗原的酶标板制备
[0037] 将合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液分别稀释到10微克/毫升，各取2毫升多肽溶液进行混合，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存备用。
[0038] 所述溶液配方如下：
[0039] 包被缓冲液(0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH 9.6)：1000毫升蒸馏水中加入1.59克碳酸钠(Na2CO3)和2.93克碳酸氢钠(NaHCO3)，溶解混匀。
[0040] 磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH 7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.9克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和0.2克氯化钾(KCl)，溶解混匀。
[0041] 封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
[0042] 实施例3：试剂盒中其他溶液制备
[0043] 样品稀释液：PBS中加入1％牛血清白蛋白及0.1％吐温-20，pH7.4。
[0044] 酶标抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。
[0045] 浓缩洗涤液：含有1％吐温-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涤时稀释10倍使用。
[0046] 酶底物A溶液：5.1克柠檬酸(C6H8O7·H2O)，18.4克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加水定容到1000毫升后混匀。
[0047] 酶底物B溶液：30％双氧水1毫升。
[0048] 酶底物C：邻苯二胺(OPD)粉末1克。
[0049] 终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升98％浓硫酸加入891.3毫升水中，混匀冷却。
[0050] 实施例4：使用该试剂盒检测样品中SFTSV N蛋白特异性抗体
[0051] 样品孵育：取出试剂盒中已经包被好SFTSV N蛋白抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各病患血清样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。
[0052] 二抗孵育：将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。
[0053] 显色读数：配置OPD显色液，称取酶底物C 20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零用酶标仪测定490纳米处的吸光度值。
[0054] 结果判定：P/N比值法，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。鉴定结果，样品1为阴性，其余为阳性，与现有试剂盒检测结果一致(见表1)。
[0055] 表1本试剂盒与现有试剂盒检测结果对比
[0056]
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