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一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法

阅读：128发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及粘膜免疫细胞领域，特别涉及一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法,该方法至少包括一次肠道以外部位的初次免疫与一次肠道部位的加强免疫，从而获得大量粘膜TRM，可以用于预防和治疗病原体的粘膜入侵。其中，肠道以外部位的初次免疫方式至少包括但不限于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻接种、雾化吸入接种、舌下接种。肠道部位的加强免疫方式包括但不限于直肠腔内接种、通过口服肠溶型疫苗进行小肠腔内接种。，下面是一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，该方法包括至少一次的肠道以外部位的初次免疫与至少一次的肠道部位的加强免疫，从而使得粘膜定居性记忆T细胞形成并增殖。
2.根据权利要求1所述一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，所述粘膜定居性记忆T细胞为直肠粘膜定居性记忆T细胞。
3.根据权利要求1所述一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，肠道以外部位的初次免疫方式包括但不限于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻接种、雾化吸入接种、舌下接种。
4.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，肠道部位的加强免疫方式包括但不限于直肠腔内接种、通过口服肠溶型疫苗进行小肠腔内接种。
5.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的过程中，初次免疫和加强免疫使用的免疫原来源包括但不限于艾滋病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒、轮状病毒、杯状病毒（诺如病毒与沙波病毒）、星状病毒、肠道腺病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、李斯特菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、埃希菌、志贺菌、沙门菌、克雷伯菌、变形杆菌、肠杆菌、沙雷菌、枸橼酸杆菌、摩根菌。
6.根据权利要求1所述一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，所述初次免疫和加强免疫过程中使用佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂。
7.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，所述肠道以外部位的初次免疫为滴鼻接种或雾化吸入接种，接种次数为2次。
8.根据权利要求1所述一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，直肠部位的加强免疫中接种次数为2次及以上。
9.根据权利要求1所述的的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，所述肠道以外部位初次免疫接种的疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合。
10.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，肠道部位加强免疫接种的疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合。
11.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，所述粘膜定居性记忆T细胞为HIV-1特异性的直肠粘膜定居性记忆T细胞，具体制备步骤为：使用免疫原gp120和佐剂CT接种免疫动物，初次免疫通过滴鼻接种，加强免疫通过直肠接种，疫苗免疫间隔为1周，免疫结束后的第4周，获取免疫动物的直肠淋巴细胞悬液，分离HIV-1特异性的直肠粘膜定居性记忆T细胞。
12.根据权利要求1所述的一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法，其特征在于，该方法包括一次的滴鼻接种的初次免疫，两次直肠腔内接种的加强免疫，可以同时诱导直肠、肺脏及生殖道粘膜定居性记忆T细胞的形成及增殖。

说明书全文

一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及粘膜免疫细胞领域，特别涉及一种诱导粘膜定居性记忆T细胞形成及增殖的方法。

背景技术

[0002] 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是严重威胁公共卫生安全的一类病毒。联合国艾滋病规划署(UNAIDS)公布的HIV-1流行数据显示，2017年全球范围内约有3690万人感染了HIV-1，其中有180万是新发病例，主要经性接触包括生殖道和直肠粘膜途径而感染与传播，特别是男男性接触者(Man who have sex with man,MSM)感染的比例迅速增加。流行病学调查显示，男男性传播HIV的风险为1/10-1/600，远高于异性传播风险1/200-1/1000，因此，阻断包括直肠粘膜在内的性途径传播是当下HIV预防性疫苗研究的关键所在。

[0003] 在过去的十年中，实施了多项HIV-1疫苗的大规模临床试验。例如2004年实施的艾滋病疫苗STEP II期临床试验，该疫苗以复制缺陷型腺病毒Ad5为疫苗载体，表达免疫原Gag-Nef-Pol，以期诱导机体产生系统T细胞应答。但由于疫苗组中具有高水平预存免疫的个体HIV的感染率反而增加，试验被提前终止。随后2009年启动的HVTN505疫苗临床试验，采用DNA疫苗初次免疫、Ad5载体疫苗(免疫原为Gag-Pol-Env)加强免疫的策略，以诱导系统T细胞应答为主，体液免疫应答为辅，仍未观察到疫苗的保护作用。2009年10月《新英格兰医学杂志》发表了在泰国实施的HIV疫苗RV144的临床试验成果。该研究始于2003年，有超过16000成年志愿者参与，使用重组金丝雀痘病毒载体疫苗ALVAC-HIV(免疫原为Gag-Pol-Env)初次免疫联合gp120蛋白(AIDSVAX B/E)加强免疫的策略，在疫苗组观察到31.2％的保护效果，保护机制主要在于诱导出中和抗体。

[0004] 上述疫苗临床试验的结果，促使我们反思究竟应该诱导什么样的免疫应答才能提供有效的保护性？同时，这些保护性免疫应答的效应部位究竟应该在哪里才能有效预防病原体感染？

[0005] 黏膜病毒感染机制的研究结果提示，感染早期(第一周内)病毒在黏膜局部数量少且组织适性弱，加之可供入侵的靶细胞又少，容易被黏膜组织局部的特异性免疫反应清除。新近报道的组织定居性记忆T细胞(Tissue Resident Memory T cell，TRM)相关研究显示，TRM长期定居在组织内不参与外周循环，发挥着重要的原位抗感染作用。一旦病原体入侵粘膜组织，TRM比效应记忆T细胞(Effector Memory T cell，TEM)反应更迅速，可立即识别树突状细胞呈递的抗原表位，快速分泌效应分子(细胞因子、穿孔素、颗粒酶)发挥抗感染的功能。TRM产生的细胞因子可直接通过溶细胞作用杀伤感染的细胞，它分泌的IFNγ还会触发多种天然免疫效应分子的表达。此外，TRM产生的IFN-γ、TNFα和IL-2等细胞因子还可迅速激活周围的NK细胞和树突状细胞，并通过诱导趋化因子表达而招募循环中的T细胞，B细胞和炎性单核细胞到组织局部，发挥联合抗感染作用。

[0006] 因此，获得大量肠道粘膜TRM可用于抵抗病原体经肠道感染。经典的疫苗接种方式(如：肌肉注射、皮内注射、皮下注射等)可以有效扩增体内效应记忆T细胞和中央记忆T细胞，但是系统免疫与粘膜免疫之间相对独立，经典的疫苗接种方式无法在动物模型上有效诱导粘膜TRM的形成及增殖。由于全身粘膜部位划分为不同的免疫隔室，导致单独某一粘膜部位的疫苗接种无法有效诱导其他粘膜部位的T细胞扩增，例如通过鼻粘膜接种难以在肠道部位诱导有效的T细胞增殖。而单纯通过肠道接种疫苗，面临着消化道耐受以及消化酶对免疫原酶解的挑战。因此，开发一种诱导粘膜TRM形成及增殖的方法，通过有效诱导粘膜T细胞增殖，从而获得大量粘膜TRM，可以用于预防和治疗病原体的粘膜入侵。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种有效诱导粘膜部位记忆性T细胞形成及增殖方法，从而获得大量粘膜定居性记忆T细胞以预防肠道病原体的入侵。

[0008] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，肠道以外部位的疫苗接种方式至少包括但不限于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻接种、雾化吸入接种、舌下接种等；肠道部位接种的方式包括但不限于直肠腔内接种、通过口服肠溶型疫苗进行小肠腔内接种等。

[0009] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，皮下接种、滴鼻接种或雾化吸入接种作为初次免疫、直肠内疫苗接种作为加强，以有效活化直肠内TRM的组合。

[0010] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，肠道外接种疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合等；肠道部位接种的疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合等。

[0011] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，疫苗免疫原来源包括但不限于艾滋病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒、轮状病毒、杯状病毒(诺如病毒与沙波病毒)、星状病毒、肠道腺病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、李斯特菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、埃希菌、志贺菌、沙门菌、克雷伯菌、变形杆菌、肠杆菌、沙雷菌、枸橼酸杆菌、摩根菌等。

[0012] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，佐剂包括但不限于铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂等。

[0013] 本发明所述疫苗与免疫技术可用于接种人以预防包括但不限于艾滋病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒、轮状病毒、杯状病毒(诺如病毒与沙波病毒)、星状病毒、肠道腺病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、李斯特菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、埃希菌、志贺菌、沙门菌、克雷伯菌、变形杆菌、肠杆菌、沙雷菌、枸橼酸杆菌、摩根菌等病原体的人间传播或降低所述病原体的致病性。

[0014] 在本发明的又一方面，提供了一种同时有效活化呼吸道、生殖道与直肠部位记忆性T细胞的疫苗组合接种方法，该组合方法至少包括一次直肠以外部位的初次免疫与一次直肠部位的加强免疫的疫苗接种，以预防呼吸道和/或生殖道和/或直肠部位传播的传染病。

[0015] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，直肠以外部位的疫苗接种方式至少包括但不限于滴鼻接种、雾化吸入接种、肌肉、皮下等，尤其以滴鼻接种或雾化吸入接种并接种2次及以上为优选；直肠部位接种以2次及以上为优选。

[0016] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，直肠外接种疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合等；直肠部位接种的疫苗形式包括但不限于重组质粒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活病毒与细菌疫苗以及不同疫苗形式组合等。

[0017] 在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，疫苗免疫原来源包括但不限于艾滋病毒、疱疹病毒、人乳头瘤病毒、梅毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道腺病毒、新型肠道病毒等。本发明所述疫苗与免疫技术可用于接种人以预防包括但不限于艾滋病毒、疱疹病毒、人乳头瘤病毒、梅毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道腺病毒、新型肠道病毒等病原体的人间传播或降低所述病原体的致病性。

[0018] 本发明所述的肠道以外部位的疫苗接种方式至少包括但不限于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻接种、雾化吸入接种、舌下接种等；肠道部位接种的方式包括但不限于直肠腔内接种、通过口服肠溶型疫苗进行小肠腔内接种等。

[0019] 本发明所述的免疫方法可同时在肺粘膜、生殖道粘膜、直肠粘膜局部诱导高水平抗原特异性的记忆T细胞应答，使其在预防和降低病原体粘膜感染中有应用前景。

[0020] 本发明的有益效果在于，所述诱导粘膜定居性记忆T细胞增殖的方法过程中，采用肠道以外部位初次免疫、肠道部位加强免疫的免疫方式，即系统免疫和粘膜免疫相结合的方式，同时诱导粘膜系统及肠道T细胞应答，相对于单独的系统免疫或粘膜免疫，能够更加有效的刺激粘膜定居性记忆T细胞增殖，诱导出高水平的抗原特异性的粘膜定居性记忆T细胞，使其在预防和降低病原体粘膜感染中有应用前景。附图说明

[0021] 图1所示为不同免疫程序对小鼠直肠粘膜特异性记忆T细胞的诱导效果。

[0022] 实验所用小鼠为6-8周龄C57/BL6，免疫原为模式抗原鸡卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)(A)和HIV-1膜蛋白的膜外区gp120(B)。(A)所示为流式细胞术检测OVA免疫后第4周(免疫记忆期)直肠抗原特异性TRM的比例。横坐标为不同的免疫接种方式，纵坐标为OVA所诱导的OVA257-264特异性TRM(CD45.1+细胞)的比例。(B)所示为酶联免疫斑点实验检测免疫后第4周的直肠粘膜特异性记忆T细胞应答。横坐标的对照组与实验组(gp120组)均采用滴鼻初免一周后直肠加强免疫的策略，只是gp120组采用免疫原gp120和佐剂霍乱毒素(Cholera Toxin，CT)免疫，而对照组无免疫原，仅采用佐剂CT免疫。纵坐标为每106个淋巴细胞中，在特异性抗原肽刺激下分泌IFN-γ的T细胞即斑点形成细胞(spotsformingcells，SFCs)。*表示p<0.05，***表示p<0.001。

[0023] 图2所示为小鼠活化的抗原特异性T细胞经异体过继给野生型小鼠后受体小鼠直肠粘膜特异性T细胞的浸润效果。

[0024] 采用流式细胞术检测直肠免疫后第7天受体小鼠直肠组织中特异性T细胞的比例。横坐标(上)为过继的活化特异性T细胞的组织来源，分别为脾脏、脾脏、外周血，横坐标(下)代表是否使用免疫原OVA进行直肠免疫，(+)代表使用OVA和CT免疫，(-)代表使用佐剂CT免疫。纵坐标为OVA257-264特异性T细胞(CD45.1+细胞)的比例。*表示p<0.05，***表示p<0.001。

[0025] 图3所示为不同初免策略对小鼠直肠抗原特异性记忆T细胞的诱导效果。

[0026] 采用流式细胞术检测免疫结束后第4周小鼠直肠组织中OVA257-264特异性T细胞的比例。横坐标为不同的初免策略，其中对照组采用佐剂CT免疫，实验组根据不同的初免策略(包括不同的免疫原类型、佐剂及免疫部位)进行分组。纵坐标为不同的免疫策略所诱导的OVA257-264特异性TRM(CD45.1+细胞)的比例。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

[0027] 图4所示为不同直肠加强免疫策略对小鼠直肠抗原特异性记忆T细胞的诱导效果及攻毒保护效果。

[0028] (A)所示为流式细胞术检测免疫后第4周(免疫记忆期)小鼠直肠OVA257-264特异性TRM的比例。横坐标为不同的直肠加强免疫策略，其中对照组采用佐剂CT免疫，实验组根据直肠加强免疫策略(包括不同的免疫原类型及佐剂)进行分组。纵坐标为不同免疫策略诱导的OVA257-264特异性TRM(CD45.1+细胞)的比例。(B)所示为表达OVA的重组李斯特菌(LM-OVA)直肠攻毒后第3天小鼠直肠组织细菌载量。横坐标为不同的直肠加强免疫策略(同图4A)，纵坐标为每个直肠组织所含有的LM-OVA的数量，即菌落形成单位(Colony Forming Unites，CFU)。**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

[0029] 图5所示为不同免疫程序对小鼠各组织部位粘膜特异性记忆T细胞的诱导效果。

[0030] (A)所示为流式细胞术检测OVA免疫后第4周小鼠直肠、生殖道、肺粘膜中抗原特异性记忆T细胞的比例。横坐标为不同的免疫接种方式，纵坐标为OVA所诱导的OVA257-264特异性TRM(CD45.1+细胞)的比例。(B)所示为酶联免疫斑点实验检测OVA免疫后第4周小鼠直肠、肺粘膜、脾脏中特异性记忆T细胞应答。横坐标为不同的免疫接种方式，纵坐标为每106个淋巴细胞中，在抗原特异性肽刺激下分泌IFN-γ的T细胞即斑点形成细胞(SpotsForming Cells，SFCs)。*表示p<0.05。具体实施方案

[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。阅读以下公开的实施方案的详细描述和所附权利要求后，本发明的这些和其它特征和优点将变得显而易见。

[0032] 实施例1：不同接种程序诱导粘膜直肠记忆T细胞的效果评价

[0033] 采用不同的免疫接种程序免疫C57/BL6小鼠，免疫原为模式抗原鸡卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，佐剂为霍乱毒素(Cholera Toxin，CT)，在完成免疫四周后(免疫记忆期)，评价不同接种程序诱导OVA257-264特异性直肠记忆T细胞的效果。本实验所用鸡卵清蛋白和霍乱毒素均购自Sigma公司。实验步骤如下：

[0034] (1)将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为5组，根据后续不同的免疫程序分别命名为直肠+直肠组、滴鼻+滴鼻组、滴鼻+生殖道组、滴鼻+直肠组、滴鼻+直肠+直肠组。

[0035] (2)在免疫前24小时，进行OT-Ⅰ细胞过继。使用磁珠(品牌：Stemcell，货号：19853)分选OT-Ⅰ小鼠的CD8+T细胞，表型为CD45.1阳性，每只C57BL/6小鼠过继2×105个OT-Ⅰ细胞，过继方式为眼眶静脉丛过继。OT-Ⅰ小鼠的CD8+T细胞具有特异性识别鸡卵清蛋白表位肽OVA257-264的TCR，在鸡卵清蛋白免疫后可以发生特异性T细胞应答，并且表达标记性分子CD45.1，便于检测。

[0036] (3)使用免疫原OVA和佐剂CT免疫小鼠，具体免疫程序如表1所示。鼻腔内滴入免疫操作前，每只小鼠采用腹腔注射100微升1％戊巴比妥麻醉。OVA接种剂量为10微克/只，CT接种剂量为1微克/只，两者混合后接种。根据接种部位不同，使用生理盐水调整接种体积，其中直肠腔内滴入体积为10微升，鼻腔内滴入体积为50微升，生殖道腔内滴入体积为10微升。疫苗免疫间隔为1周。

[0037] 表1不同接种程序诱导组织记忆T细胞的小鼠实验

[0038]

[0039] (4)最后一次免疫结束后的第4周，通过流式细胞术检测不同接种程序诱导直肠部位OVA257-264特异性记忆T细胞(即CD45.1+细胞)的比例。制备离体直肠组织的单细胞悬液，并且使用淋巴细胞分离液分选直肠组织淋巴细胞。对分离得到的淋巴细胞进行表面染色，使用的流式抗体分别为抗体分别为标记PerCP-CY5.5的抗小鼠CD3抗体(品牌：BD，货号：560527)，标记APC的抗小鼠CD8a抗体(品牌：BD，货号：561093)，标记FITC的抗小鼠CD45.1抗体(品牌：BD，货号：561871)。染色结束后，流式检测OVA257-264特异性T细胞(即CD45.1+细胞)占CD8+T细胞的比例。

[0040] 不同免疫程序对小鼠OVA257-264特异性的直肠记忆T细胞的诱导效果如图1A所示：直肠+直肠组、滴鼻+滴鼻组、滴鼻+生殖道组CD45.1+T细胞比例平均值接近或低于1％，显示OVA257-264特异性T细胞免疫应答弱；相比以上三组，滴鼻+直肠组在直肠部位OVA257-264特异性T细胞免疫应答得到提高，差异具有显著性，占CD8+T细胞的比例接近5％；滴鼻+直肠+直肠组直肠CD45.1+T细胞比例平均值接近12％，显示OVA257-264特异性T细胞免疫应答进一步提高。

[0041] 该实验证实，通过呼吸道接种疫苗初免，肠道部位接种疫苗加强免疫，可以有效诱导直肠定居性记忆T细胞。

[0042] 实施例2：“滴鼻初免、直肠加强”诱导gp120特异性直肠TRM的效果评价[0043] 采用HIV-1(AE2F株)膜蛋白的膜外区gp120蛋白和CT免疫小鼠，第一针通过滴鼻接种，第二针通过直肠接种。完成免疫4周后(免疫记忆期)，评价直肠部位gp120特异的直肠定居记忆T细胞的诱导效果。实验步骤如下：

[0044] (1)将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为2组，分别命名为对照组和gp120组。

[0045] (2)使用免疫原gp120和佐剂CT免疫小鼠，具体免疫程序如表2所示。鼻腔内滴入免疫操作前，每只小鼠采用腹腔注射100微升1％戊巴比妥麻醉。gp120接种剂量为10微克/只，CT接种剂量为1微克/只，两者混合后接种。根据接种部位不同，使用生理盐水调整接种体积，其中直肠腔内滴入体积为10微升，鼻腔内滴入体积为50微升。疫苗免疫间隔为1周。

[0046] 表2gp120蛋白诱导直肠记忆T细胞的小鼠实验

[0047]

[0048] (3)最后一次免疫结束后的第4周，采用酶联免疫斑点实验(Enzyme-linkedImmunospot Assay，ELISpot)评价直肠部位gp120特异性记忆T细胞的应答。同实施例1所述，获取直肠淋巴细胞悬液。使用小鼠IFN-γ的ELISPOT检测试剂盒(品牌：BD，货号：
551083)进行ELISPOT实验。用gp120蛋白肽库刺激直肠淋巴细胞20小时后，进行斑点显色并计数。每个阳性斑点代表抗原肽特异性T细胞，将刺激细胞产生的阳性点数进行加和，获得gp120特异性的T细胞数量。

[0049] 直肠定居的gp120特异性记忆T细胞应答的结果如图1B所示：每1×106淋巴细胞中，gp120组有超过500个阳性斑点，而对照组仅有70个左右。显示gp120组直肠定居特异性T细胞应答显著强于对照组。

[0050] 该实验证实，采用滴鼻初免联合肠道加强免疫的组合接种方法接种HIV-1膜蛋白疫苗，可以有效诱导HIV-1特异性的直肠定居性记忆T细胞。

[0051] 实施例3：循环活化T细胞在直肠免疫作用下向直肠组织浸润的效果评价[0052] 将滴鼻免疫活化的脾脏及外周血抗原特异性T细胞分选出来，过继给受体小鼠，评价抗原特异性T细胞向直肠组织的浸润效果。实验步骤如下：

[0053] (1)如实施例1中所述方法，对C57BL/6小鼠进行OT-Ⅰ细胞过继。

[0054] (2)采用免疫原OVA和佐剂CT经鼻腔内滴入免疫小鼠，免疫剂量同实施例1。

[0055] (3)免疫后第7天取小鼠脾脏和外周血，并分别通过磁珠分选(品牌：美天旎，货号：130-048-801)的方法分选OVA257-264特异性(即CD45.1+细胞)T细胞。分选获得的细胞作为后续实验的donor细胞。

[0056] (4)将分选获得的donor细胞(脾脏来源5×105、外周血来源2×104)，通过眼眶静脉丛分别过继到CD45.1阴性的野生型C57BL/6小鼠体内。

[0057] (5)过继24小时后，将过继了脾脏来源donor细胞的受体小鼠随机分为两组，第1组仅用佐剂CT进行直肠免疫，第2组使用免疫原OVA和佐剂CT进行直肠免疫。过继了外周血来源donor细胞的受体小鼠为第3组，使用免疫原OVA和佐剂CT进行直肠免疫。

[0058] (6)免疫结束后第7天，通过流式细胞术检测直肠OVA257-264特异性T细胞(即CD45.1+细胞)占CD8+T细胞的比例。流式检测方法同实施例1所述。

[0059] 小鼠活化的抗原特异性T细胞经异体过继给野生小鼠后，受体小鼠直肠特异性T细胞的浸润效果如图2所示：第2组和第3组均有较多特异性T细胞浸润，第1组仅有极少量特异性T细胞浸润，比例低于2％，显示循环内活化的T细胞可以在直肠免疫的作用下向直肠组织浸润，没有直肠免疫时，循环内活化的T细胞难以定居直肠并进一步形成TRM。

[0060] 该实验证实，任何可以诱导循环内活化T细胞的免疫策略，或者活化的特异性T细胞回输过继，联合直肠加强免疫，均可以诱导很好的直肠特异性T细胞应答。

[0061] 实施例4：不同的初免策略诱导肠道记忆T细胞的效果评价

[0062] 如实施例1中所述，根据滴鼻+直肠+直肠组免疫程序免疫小鼠。固定第二针和第三针的加强免疫策略为直肠腔内滴入，更换不同的初免策略，在最后一针免疫结束4周后(免疫记忆期)，评价不同的初免策略诱导肠道记忆T细胞的效果。实验步骤如下：

[0063] (1)将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为7组，根据后续初免策略不同分别命名为对照组和实验组(包括OVA+铝佐剂皮下组、OVA+CT皮下组、OVA+CT肌肉组、OVA+CT滴鼻组、rTTV-OVA滴鼻组、H9N2-OVA257-264滴鼻组)。

[0064] (2)在免疫前24小时，进行OT-Ⅰ细胞过继。同实施例1所述。

[0065] (3)采用不同的初免策略(包括不同的接种部位、佐剂和免疫原类型)免疫小鼠，具体免疫程序如表3所示。其中rTTV-OVA为表达OVA的重组天坛株痘苗载体，H9N2-OVA257-264为表达OVA表位肽OVA257-264的重组H9N2流感病毒载体。对照组采用霍乱毒素滴鼻初免。小鼠滴鼻前麻醉、接种剂量、接种体积、免疫间隔均如实施例1中所述。其中rTTV-OVA接种剂量为每只小鼠1×106PFU，PFU为噬斑形成单位；H9N2-OVA257-264接种剂量为1000TCID50/只，TCID50为半数组织培养感染剂量；OVA接种量为10微克/只，铝佐剂与OVA接种的体积比为1:1，霍乱毒素与鸡卵清蛋白接种质量比为1:10。

[0066] (4)初免后第1周和第2周用免疫原OVA和佐剂CT直肠腔内滴入免疫6组实验组小鼠，用佐剂CT直肠腔内滴入免疫对照组小鼠。

[0067] 表3不同初免策略诱导肠道记忆T细胞的小鼠实验

[0068]

[0069] (5)最后一针免疫结束后第4周，通过流式细胞术检测不同初免策略诱导OVA257-264特异性直肠记忆T细胞的效果。流式检测OVA257-264特异性T细胞(即CD45.1+细胞)的方法如实施例1中所述。

[0070] 不同初免策略诱导直肠部位OVA257-264特异性记忆T细胞的比例如图3所示：对照组未在直肠检测到CD45.1+T细胞。OVA+铝佐剂皮下组、OVA+CT皮下组、OVA+CT肌肉组、OVA+CT滴鼻组、rTTV-OVA滴鼻组、H9N2-OVA257-264滴鼻组均有较多CD45.1+T细胞，显示6组实验组均有较好的OVA257-264特异性T细胞免疫应答。

[0071] 该实验证实，采用不同的肠外接种部位、不同的佐剂、不同的疫苗载体对小鼠进行初次免疫，联合肠道加强免疫，均能有效诱导直肠定居性记忆T细胞。

[0072] 实施例5：采用不同的直肠加强免疫策略诱导肠道记忆T细胞的效果评价[0073] 如实施例1中所述，小鼠免疫程序为滴鼻+直肠组免疫。初免策略为免疫原OVA和佐剂CT滴鼻接种，加强免疫策略为不同免疫原的直肠接种(详见表4)，在完成免疫4周后(免疫记忆期)评价该免疫策略诱导组织特异性记忆T细胞效果。实验步骤如下：

[0074] (1)将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为5组，根据不同的直肠加强策略分别命名为：OVA+铝佐剂组(对照组)、OVA+CXCL10组、OVA+CT组、LM-OVA组。

[0075] (2)在免疫前24小时，进行OT-Ⅰ细胞过继。同实施例1所述。

[0076] (3)用免疫原OVA和佐剂CT滴鼻免疫各实验组小鼠，对照组采用佐剂CT滴鼻初免。麻醉和接种剂量同实施例1所述。

[0077] (4)初免结束后第7天采用不同的直肠加强策略免疫小鼠，具体免疫程序如表4所示。其中LM-OVA为表达OVA的重组李斯特菌载体疫苗。对照组用佐剂CT进行直肠加强。其中LM-OVA接种剂量为每只小鼠1×107CFU，OVA接种量为10微克/只，铝佐剂与OVA的接种体积比为1:1，霍乱毒素与OVA的接种质量比为1:10，CXCL10接种剂量为每只小鼠3微克。

[0078] (5)最后一针免疫结束后第4周，通过流式细胞术检测不同直肠加强免疫策略诱导OVA257-264特异性直肠记忆T细胞的效果。流式检测OVA257-264特异性T细胞(即CD45.1+细胞)的方法如实施例1中所述。

[0079] 表4不同直肠加强免疫策略诱导组织记忆T细胞的小鼠实验

[0080]

[0081] 不同直肠加强免疫策略诱导直肠部位OVA257-264特异性记忆T细胞的比例如图4A所示：对照组未在直肠部位检测到CD45.1+T细胞。相比对照组，OVA+铝佐剂组、OVA+CXCL10组、OVA+CT组、LM-OVA组均有较多CD45.1+T细胞，显示均有较好的直肠OVA257-264特异性T细胞免疫应答。

[0082] 该实验证实，采用肠外初次免疫联合肠道加强免疫的组合策略，使用不同的佐剂、不同的疫苗载体对小鼠进行肠道加强免疫，均能很好地诱导直肠定居性记忆T细胞。

[0083] 实施例6：不同直肠加强免疫策略的攻毒保护效果评价

[0084] 如实施例5中所述，根据表4免疫小鼠，在完成免疫四周后(免疫记忆期)，使用LM-OVA直肠腔内滴入对小鼠进行攻毒，攻毒剂量为每只小鼠1×109CFU，CFU为菌落形成单位。攻毒后第3天，取各组直肠组织进行匀浆处理，并将匀浆液梯度稀释滴加在脑心浸液琼脂板上培养至长出清晰菌落，菌落个数代表直肠组织细菌载量。

[0085] 不同直肠加强免疫策略的攻毒保护效果如图4B所示：相比对照组，OVA+铝佐剂组、OVA+CXCL10组、OVA+CT组、LM-OVA组均能显著降低直肠细菌载量。

[0086] 该实验证实，采用肠外初次免疫联合肠道加强免疫的组合接种方法，使用不同的佐剂、不同的疫苗载体对小鼠进行直肠加强免疫，均能有效抵抗直肠病原体感染。

[0087] 实施例7：不同接种程序诱导各粘膜部位记忆T细胞的效果评价

[0088] 采用不同的免疫接种程序免疫C57/BL6小鼠。免疫原为OVA，佐剂为CT(均购自Sigma公司)。在完成免疫四周后(免疫记忆期)，评价不同接种程序诱导直肠、生殖道、肺粘膜OVA257-264特异性记忆T细胞的效果。

[0089] 实验步骤如下：

[0090] (1)小鼠分组、OT-Ⅰ细胞过继及免疫流程同实施例1所述。

[0091] (2)最后一次免疫结束后的第4周，通过流式细胞术检测不同接种程序诱导直肠、生殖道、肺灌洗液中OVA257-264特异性记忆T细胞(即CD45.1+细胞)占CD8+T细胞比例。流式检测OVA257-264特异性T细胞的方法同实施例1所述。

[0092] 不同接种程序诱导各粘膜组织特异性记忆T细胞的比例结果如图5A所示：直肠+直肠组在直肠、生殖道、肺脏的特异性T细胞比例均低于3％；滴鼻+滴鼻组和滴鼻+生殖道组在直肠部位的CD45.1+T细胞比例低于2％，在肺部和生殖道可诱导较高比例的记忆T细胞；滴鼻+直肠组和滴鼻+直肠+直肠组在肺部可诱导较高比例的记忆T细胞，同时可提升直肠部位CD45.1+T细胞比例；滴鼻+直肠+直肠组在直肠和生殖道的应答强于滴鼻+直肠组，显示滴鼻+直肠+直肠组可同时有效诱导直肠、生殖道和肺粘膜的TRM。

[0093] 该实验证实，呼吸道初次免疫联合肠道加强免疫的组合接种方法，可以同时在肠道、生殖道和呼吸道诱导特异性记忆T细胞。

[0094] 实施例8：不同接种程序诱导各部位内源性记忆T细胞的效果评价

[0095] 采用不同的免疫接种程序免疫C57/BL6小鼠。免疫原为OVA，佐剂为CT(均购自Sigma公司)。在完成免疫四周后(免疫记忆期)，评价不同接种程序诱导直肠、肺粘膜、脾脏OVA257-264特异性记忆T细胞的效果。实验步骤如下：

[0096] (1)将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为5组，根据后续免疫程序不同分别命名为对照组和实验组(包括滴鼻+滴鼻组、滴鼻+直肠组、滴鼻+直肠+直肠组)。

[0097] (2)小鼠免疫。分别在第0周、第1周、第2周，采用不同的免疫接种程序对各组小鼠进行免疫，实验组免疫原均为OVA和CT，而对照组仅为CT。具体免疫程序如表5所示。麻醉操作、接种剂量、接种体积同实施例1所述。

[0098] 本实施例中小鼠不进行OT-Ⅰ细胞过继，以评价内源性特异性记忆T细胞的形成。

[0099] 表5不同接种程序诱导各部位内源性记忆T细胞的小鼠实验

[0100]

[0101] ND表示未进行任何处理。

[0102] (3)最后一次免疫结束后的第4周，采用酶联免疫斑点实验评价直肠、肺粘膜、脾脏OVA257-264特异性记忆T细胞的应答情况。酶联免疫斑点检测实验方法同实施例2所述。本实施例使用OVA257-264刺激淋巴细胞，肽的刺激浓度为5微克/毫升。

[0103] 不同接种程序诱导各部位内源性OVA257-264特异性记忆T细胞的效果如图5B所示：对照组未检测到阳性斑点；滴鼻+滴鼻组在直肠部位的阳性斑点数量低于20个/1×106淋巴细胞，在肺脏和脾脏可有效诱导记忆T细胞应答；相比滴鼻+滴鼻组，滴鼻+直肠组和滴鼻+直肠+直肠组可显著提升直肠部位阳性斑点数量，同时脾脏和肺粘膜阳性斑点数量略微降低，显示滴鼻+滴鼻组和滴鼻+直肠+直肠组可以同时有效诱导系统、肺粘膜和直肠粘膜的TRM。

[0104] 该实验证实，呼吸道初次免疫联合肠道加强免疫的组合接种方法，可以同时在肠道、呼吸道和脾脏诱导内源性特异性记忆T细胞。

[0105] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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